-
1. Einleitung
-
Das
Blut polarer Fische wird durch das Vorhandensein von Frostschutz-Peptiden
(antifreeze peptides, AFPs)) vor dem Gefrieren geschützt. Diese
Frostschutz-Peptide können
nach ihrem Aufbau in vier Typen klassifiziert werden (Davies und
Hew, 1990). Die AFPs vom Typ I sind reich an Alanin mit Threonin-
und Asparagin-Resten in regelmäßigen Abständen und
besitzen eine α-Helix-Konformation.
Die AFPs vom Typ II haben einen charakteristischen hohen (8%) Cystein-Gehalt.
Die AFPs vom Typ III sind kleine (etwa 64 Aminosäuren lange) kugelförmige Peptide.
Die letzte Gruppe, die Frostschutz-Glykoproteine, weisen ein wiederholtes
Tripeptid-Motiv auf, an welchem ein spezifisches Disaccharid hängt. Allen
diesen Peptiden ist die Eigenschaft einer nicht verbindenden Gefrierpunkt-Absenkung
und die Hemmung eines Eiskristallwachstums gemein. Diese Merkmale
können
bei der Veränderung
des Eiskristall-Zustands gefrorener Produkte angewendet werden.
Da es unwahrscheinlich ist, dass die Reinigung dieser Peptide aus
Fischblut jemals ein wirtschaftlich gangbares Verfahren sein wird,
war man auf der Suche nach einem Verfahren zur Massenproduktion
von AFPs unter Verwendung der modernen Biotechnologie.
-
Frühe Arbeiten
bei der Herstellung von Frostschutz-Peptiden in Mikroorganismen
konzentrierten sich auf die Expression von AFPs vom Typ I sowohl
in Hefe als auch in Escherichia coli (Warren et al., 1993, McKown
et al., 1991). Da E. coli die Fähigkeit
besitzt, Toxine zu erzeugen, wird dieses Bakterium nicht allgemein
als sicher (generally regarded as safe, GRAS) angesehen, was Probleme
hinsichtlich seiner Verwendung bei der Herstellung von AFPs, die
zur Anwendung in der Nahrungsmittelindustrie bestimmt sind, ergibt.
-
Hefestämme, wie
Saccharomyces cerevisiae, sind bekannt, die als GRAS-Organismen
angesehen werden, und die anders als E. coli, die Fähigkeit
besitzen, heterologe Proteine in das Wachstumsmedium zu sezernieren,
was eine nachfolgende Verarbeitung des Produkts erleichtert. Hefe
ist daher ein attraktiver Wirtsorganismus für die Herstellung einer Vielfalt
heterologer Proteine (Romanos et al., 1992).
-
Die
ersten Berichte bezüglich
einer AFP-Produktion in Hefe betreffen die intrazelluläre Akkumulation einer
Fusion eines synthetischen AFPs vom Typ I mit einem trunkierten
Staphylococ cus aureus-Protein A (Warren et al., 1993). Es wurde
behauptet, dass dieses Peptid die Hefe gegen die nachteiligen Auswirkungen des
Gefrierens schützt.
Eine extrazelluläre
Produktion von AFP vom Typ I als solches ist nicht beschrieben. Nichts
ist erwähnt
im Hinblick auf andere Typen von AFP.
-
In
diesem Labor wurden Hefe-Transformanten konstruiert, die einen Expressions-Vektor
tragen, welcher ein synthetisches Gen für ein natürliches AFP vom Typ I der Winterflunder
(Winter flounder) (HPLC6) enthält
(Driedonks et al., 1995), und dies ist in der nunmehr fallen gelassenen
PCT-Anmeldung WO 94/03617 der Anmelderin beschrieben. Die Sekretion
von aktivem monomeren AFP durch diese Hefen war nicht nachweisbar.
Der einzige Weg zum Erhalt einer signifikanten Eis-Rekristallisations-Hemmungs-Aktivität war, Multimere des
AFP vom Typ I zu exprimieren, die entworfen waren, um ihre nachfolgende
Prozessierung durch eine endogene Hefe-Protease zu ermöglichen,
um aktive Monomere zu ergeben (Driedonks et al., 1995). Obwohl er letztlich
die Produktion von aktivem AFP des Typs I ermöglichte, führte dieser Ansatz zur Sekretion
von teilweise prozessierten heterogenen Formen des multimeren AFP.
Die nachfolgende Behandlung zum Erhalt von aktivem Peptid als Monomer
wurde als für
die Zwecke einer industriellen Erzeugung inakzeptabel angesehen. Abgesehen
von den besonderen Bemühungen
und Kosten könnte
ein solcher Zusatz auch zu Problemen beim Erhalt einer Genehmigung
für die
Anwendung in Nahrungsmittel führen.
Dies ist erstens auf die Verwendung von Chemikalien zum Erhalt von
aktiven Monomeren, und zweitens auf die Expression nicht-nativer
Sequenzen zurückzuführen.
-
Es
schien daher unmöglich,
einen Organismus von Nahrungsmittelqualität für die Expression und Sekretion
von aktivem monomeren AFP auf einfache und effiziente Weise zu verwenden,
um ein industriell annehmbares Verfahren vorzusehen, welches in
der Nahrungsmittelproduktion anwendbar ist.
-
Beim
Versuch, diese Probleme, die sich durch die Expression von AFP vom
Typ I in Hefe ergeben, zu überwinden,
versuchten wir, AFPs vom Typ III aus Aalmutter (Ocean pout) in Hefe
zu exprimieren. Die AFPs vom Typ III sind kleine, kugelförmige Proteine,
und wir sahen dies als Grund dafür
an, dass sie für
die Expression in Hefe besser geeignet sein könnten als die α-Helix-förmigen AFPs
vom Typ I.
-
Die
AFPs vom Typ III findet man im Blut polarer Fische, wie Aalmutter
(Macrozoarces americanus) und Seewolf (wolffish) (Davies und Hew,
1990). Es wurde beschrieben, dass die Fraktionierung des Bluts von
Aalmutter das Vorhandensein von mindestens 12 verschiedenen AFP-Sorten
vom Typ III offenbarte (1, Hew et al., 1984, Davies
und Hew, 1990). Diese Peptide sind sehr homolog, und haben eine
mindestens 60% Aminosäuren-Identität gemeinsam,
und die Mutagenese in vitro zeigte eine Anhäufung von Oberflächen-Resten, die
allen Varianten des Aalmutter-AFP gemein war, welche zur Bindung
an Eis notwendig sind (Chao et al., 1994). Die negative Ladung der
Glutaminsäure
(Glu) an den Positionen 23 und 36 scheint an der thermischen Stabilität und der
thermischen Hysterese-Aktivität
des Polypeptids beteiligt zu sein (Li et al., 1991). Asparagin (Asn)
an der Position 14, Threonin (Thr) an der Position 18 und Glutamin
(Gln) an der Position 44, die nächsten drei
konservierten Aminosäuren,
scheinen ebenfalls Reste mit Schlüsselfunktion bei der Eisbindungs-Aktivität von AFP-III
zu sein (Chao et al., 1994).
-
Es
gelang uns, die HPLC-1-Variante von Aalmutter-AFP vom Typ III in
Hefe zu exprimieren, doch konnten wir keine Sekretion eines genügend aktiven
Monomers von Typ III-AFP erreichen. Somit wurden die oben erwähnten Probleme
offensichtlich nicht gelöst.
-
Außerdem stellten
wir fest, dass das von der Hefe erzeugte Typ III-AFP-HPLC-1 eine
unerwartet geringe spezifische Aktivität im Vergleich zu dem aus Aalmutter-Blut
isolierten AFP-Präparat
aufwies. Diese geringe Aktivität
könnte
möglicherweise
auf eine inkorrekte Faltung des Peptids, oder auf eine inhärent geringere spezifische
Aktivität
der HPLC-1-Variante zurückzuführen sein.
Es sah sicherlich nicht erfolgversprechend aus, diese Forschungslinie
zur Erzeugung von AFPs, die aktiver waren als jene, die man in der
Winterflunder gefunden hatte, weiterzuverfolgen.
-
Wir
fraktionierten auch von Aalmutter-Blut stammendes AFP in die verschiedenen
HPLC-Fraktionen und analysierten ihre Rekristallisationsaktivität, um festzustellen,
welche andere Fraktion als HPLC-1 potentiell für unsere gewünschte Anwendung
geeignet sein könnte.
HPLC-12 schien die einzige Fraktion der 12 AFP-Typ III-Fraktionen
zu sein, die bei der Rekristallisationshemmung bei den getesteten
Konzentrationen aktiv war. Somit stellten wir fest, dass HPLC-12
interessant sein könnte,
wenn es uns gelingen würde,
die Probleme bei seiner rekombinanten Herstellung, die man bei AFP-Typ
I und HPLC-1 von AFP-Typ III festgestellt hatte, zu überwinden.
-
Angesichts
der obigen Versuche mit sowohl AFP vom Typ I als auch mit AFP vom
Typ III fanden wir in der Folge ganz unerwartet heraus, dass die
Hefe-Expression von Nukleinsäure,
die für
die Aminosäure-Sequenz
codiert, welche für
Typ III-AFP-HPLC-12 festgestellt wurde, zu einem Produkt führt, welches
als Monomer exprimiert und sezerniert wird und keine verringerte
Aktivität
aufweist. Somit war ein eminent geeignetes Produktionsverfahren
unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie zur Herstellung reinen,
aktiven AFPs verfügbar.
-
Was
tatsächlich
zusätzlich
entdeckt wurde, war, dass rekombinantes HPLC-12, das von Hefe als
Monomer als solches sezerniert wurde, die hohe Frostschutz-Peptid-Aktivität einer
Mischung von aus dem Blut von Aalmutter isoliertem AFP aufweisen
kann. Diese Frostschutz-Aktivität
ist fast doppelt so hoch wie jene des Typ-I-AFP der Winterflunder.
Außerdem
ist das Produkt somit aktiver in Rekristallisationstests und für die gewünschten
Anwendungen viel mehr geeignet als andere AFPs.
-
Die
Aminosäure-Zusammensetzung,
Sequenzen und Nukleinsäure-Sequenzen verschiedener,
in der Natur vorkommender AFPs vom Typ III waren bereits bekannt.
Davies und Hew (1990) geben einen Überblick über diese und beziehen sich
auf Artikel von Li et al. aus dem Jahr 1985 und Hew et al aus dem
Jahr 1988 betreffend Sequenzen von HPLC-1, 4, 5–7, 9, 11 und 12, wie vom Aalmutter
auf Basis von cDNA-Klonen genomischer DNA von Fisch in Phagen bestimmt.
In Protein Science beschreiben Chao H et al. im Jahr 1994, wie eine
Isoform von Typ III-AFP-HPLC-12 synthetisch synthetisiert und in
E. coli für
zweidimensionale NMR-Untersuchungen exprimiert wird, um beim Verständnis der
Struktur/Funktions-Verhältnisse
bei Frostschutz-Proteinen mitzuhelfen und die Motive für die Eisbindung
zu definieren. Die Nukleinsäure
wird danach mutiert, um mutiertes Typ-III-AFP-Polypeptid zu erzeugen, wobei diese
Mutanten Prolin-Mutanten sind. Der thermische Hysterese-Wert von
nicht-mutiertem, rekombinantem HPLC-12 wurde mit aus Aalmutter isoliertem AFP,
d.h. Typ-III-AFP, verglichen. Es wurde beschrieben, dass die Aktivitätsprofile
innerhalb der Grenzen von Standardabweichungen nicht unterscheidbar
sind. Kein Vergleich mit anderen AFP-Typen ist erwähnt. Es
gibt keine Angabe eines abnorm hohen Wertes der thermischen Hysterese,
tatsächlich
ist überhaupt
kein Wert angeführt.
Nichts wird hinsichtlich irgendeiner Auswirkung auf Rekristallisationseigenschaften
gesagt. Wir weisen hiemit darauf hin, dass thermische Hysterese-Aktivitäten nicht
mit Rekristallisationseigenschaften verbunden sind. Thermische Hysterese-Werte zeigen die
Bindungsstärke
an und sind kein Maß für eine Frostschutz-Aktivität, wie ein
Rekristallisationstest. Beispiele sind bekannt von Proteinen, die
hohe Hysterese-Werte aufweisen, jedoch keine Auswirkung auf die
Rekristallisation, und umgekehrt haben, was das Fehlen einer Korrelation
zeigt.
-
Die
hohe AFP-Aktivität
des rekombinanten HPLC-12 war angesichts der für rekombinantes HPLC-1 erhaltenen
Resultate und angesichts dessen, was in AFPs betreffenden Publikationen
geoffenbart war, völlig unerwartet.
Thermische Hysterese-Werte von Typ III-AFP-Fraktionen, wie sie mittels
Sephadex-Säulen-Fraktionierung
von Aalmutter-AFPs vom Typ III, die aus dem Blut stammten, erhalten
wurden, sind im Hew et al.- Artikel aus dem Jahr 1984 in Tabelle
1 angeführt,
wie auch Werte für
Flunder-AFP (=Typ I) und AFP von einem Meeresfisch der Gattung Hemitripterus
americanus (Sea Raven) (=Typ II). Diese Werte wurden erhalten für Fraktionen,
die aus dem Blut der relevanten Spezies stammten, nicht durch rekombinante
DNA-Technologie. In den Aktivitäten
schienen zwischen den AFPs nur geringe Unterschiede zu bestehen,
wobei QAE-A das Aktivste war. QAE-A war eine von 5 verschiedenen
Varianten, die auf einer QAE-Sephadex-Säule getrennt werden konnten,
und es zeigte sich danach, dass es von HPLC-12 stammte. Die Unterschiede
sind jedoch als so gering beschrieben, dass sie unter die Abweichung
infolge Messungsveränderungen
fallen. Die Unterschiede in den thermischen Hysterese-Werten wurden
von Hew et al. selbst im selben Artikel eindeutig als irrelevant abgetan.
Sie stellen fest: „Der
Großteil
der Aalmutter-AFP wies eine thermische Hysterese auf, die mit jener, die
man für
anderes bekanntes AFGP und AFP fand, vergleichbar war." In späteren Publikationen
wird keine Erwähnung
thermischer Hysterese-Werte für
die verschiedenen Typen gemacht oder Vergleiche zwischen Typ I und
Typ III angeführt.
Nichts wird in Bezug auf Rekristallisations-Auswirkungen der verschiedenen
Fraktionen gelehrt oder angedeutet. Daher war nicht zu erwarten,
dass irgend ein einzelnes AFP vom Typ III eine viel höhere spezifische
Aktivität
für die
Hemmung des Eiskristall wachstums aufweisen würde als Winterflunder-AFP. Es
wurde auch nicht geoffenbart oder angedeutet, dass HPLC-12 eine
viel höhere
Aktivität
aufweist als irgendein AFP-Peptid vom Typ I oder ein anderes AFP-Peptid
vom Typ III.
-
Um
zu testen, ob die AFP-Aktivität
von Typ III-HPLC-12 höher
war, fraktionierten wir das aus dem Blut von Aalmutter stammende
AFP-Präparat
mittels HPLC, und wir testeten die einzelnen Peptid-Komponenten auf
ihre Fähigkeit,
das Eiskristallwachstum zu hemmen. Wir stellten fest, dass die HPLC-12-Variante
die höchste
spezifische Aktivität
aufwies. Die anderen Komponenten zeigten keine nachweisbare Aktivität bei einer
Konzentration, die gleich 10.0 mg Fisch-Typ-III-AFP pro ml war.
-
Somit
hatten wir ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids von reiner
Nahrungsmittelqualität
gefunden, das eine AFP-Aktivität
aufwies, die beinahe doppelt so hoch war wie jene des AFPs vom Typ
I. Da es im Gegensatz zum AFP vom Typ I als Monomer sezerniert werden
kann, ist es dadurch für
die Produktion in großem
Umfang ideal und erfordert viel weniger nachfolgendes Verarbeiten
als AFP vom Typ I, das über
rekombinante Technologie erzeugt wird. Außerdem bedeutet die Expression
als Monomer, dass ein Produkt erzeugt werden kann, das mit dem natürlich vorkommenden
Peptid im Blut von Aalmutter fast identisch ist. Ein solches Produkt
wird wegen seiner großen Ähnlichkeit
mit dem natürlich
vorkommenden AFP im nativen Organismus mit Lebensmittelqualität, dem Aalmutter,
leichter für
die Verwendung in Nahrungsmitteln zugelassen werden.
-
Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
es uns nun, erstmals in großtechnischem
Umfang mit geringen Kosten und großer Einfachheit rekombinante
Typ III-AFPs vom HPLC-12-Typ herzustellen, die eine inhärent höhere spezifische
Aktivität
haben als die Typ-I-AFPs der Winterflunder. Die erfindungsgemäßen Frostschutz-Peptide
vom Typ III sind wegen ihrer hohen spezifischen Rekristallisationshemmungs-Eigenschaften die
vielversprechendsten Anwärter
für eine
Anwendung in Nahrungsmittelprodukten, die für ein Einfrieren bestimmt sind,
wie Eiscreme und gefrorener Teig und andere gefrorene Bäckerei-Produkte.
-
Ein
zusätzlicher
Vorteil liegt darin, dass die Sekretion des Expressionsprodukts
als aktives Polypeptid, vorzugsweise als Monomer, nun in situ im
Nahrungsmittelerzeugungsprozess stattfinden kann, wodurch das Erfordernis
einer Zugabe des AFPs als solches eliminiert wird. Es kann nun möglich werden,
Fermentationsprodukte unter Verwendung einer Hefe zu erzeugen, die
ein Polypeptid, das im Wesentlichen dem Typ III-AFP-HPLC-12 entspricht,
im Fermentationsprozess sezernieren kann, wodurch eine Erzeugung
von Polypeptid, das im Wesentlichen dem Typ III-AFP-HPLC-12 entspricht,
in situ erfolgt, ohne dass zusätzliche
Schritte, wie Reinigung des Polypeptids und nachfolgendes Zusetzen
desselben im Nahrungsmittelerzeugungsprozess, erforderlich sind.
Auch die Entwicklung von Pflanzen, Früchten oder Gemüsen und
transgenen Tieren oder Teilen davon mit besseren Gefriereigenschaften
infolge der in situ-Expression eines Polypeptids, das im Wesentlichen
dem Typ III-AFP-HPLC-12 entspricht, ist nun möglich.
-
2. Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
eines verbesserten Produkts, wobei die Verbesserung in der Modifikation
von Eiskristall-Wachstumsprozessen liegt, die die Größen- und Form-Merkmale
von Eis, insbesondere bei erneutem Wachstum, beeinflussen, wodurch
beispielsweise ein potentieller Gefrierschaden minimiert wird, z.B.
durch Verhindern oder Hemmen der Eis-Rekristallisation des Produkts
nach dem Gefrieren, wobei das Verfahren das Zusetzen eines Polypeptids
oder Proteins mit einer Aminosäure-Sequenz,
die im Wesentlichen jener von AFP-Typ III-HPLC-12 entspricht, das
eine AFP-Aktivität
aufweist, die höher
als die von AFP-Typ I aus Winterflunder ist, zum nicht-verbesserten
Produkt, oder zu einem Ingrediens oder einer Mischung, die normalerweise
bei der Herstellung des nicht-verbesserten
Produkts verwendet wird, umfasst, wobei das Zusetzen von rekombinantem
Polypeptid oder Protein in einer Menge stattfindet, die ausreicht,
um das Eiskristallwachstum zu beeinflussen. Das Produkt kann ein
Nahrungsmittelprodukt oder ein biologisches Material sein. Das biologische
Material kann beispielsweise ein Tierorgan oder Gewebe oder ein
Pflanzenmaterial sein. Insbesondere kann rekombinantes Polypeptid
zugesetzt werden. Vorzugsweise hat das Polypeptid Nahrungsmittelqualität, um dem
Endprodukt Nahrungsmittelqualität
zu verleihen. Ein erfindungsgemäßes Verfahren,
bei welchem das Produkt ein Nahrungsmittelprodukt ist, ist bevorzugt. Eine
spezifische Ausführungsform
eines geeigneten Polypeptids ist ein Hefe-AFP, wie in den Beispielen
veranschaulicht. Zweckmäßig kann
ein er findungsgemäßes Herstellungsverfahren,
das auf die Herstellung eines verbesserten Produkts gerichtet ist,
welches verbesserte Gefriereigenschaften aufweist, das Zusetzen
eines AFPs umfassen, welches in einem neuen Polypeptid-Herstellungsverfahren
erhalten wird, welches an anderer Stelle in der Beschreibung erläutert ist.
-
Der
Ausdruck „ein
Polypeptid oder Protein mit einer Aminosäure-Sequenz, die im Wesentlichen
jener von AFP-Typ III-HPLC-12 entspricht, umfasst eine Aminosäure-Sequenz,
die gleich der aus Aalmutter isolierten Aminosäure-Sequenz von HPLC-12 ist,
und auch eine Aminosäure-Sequenz
aufweist, die sich in einer oder zwei Aminosäuren von der bekannten Aminosäure-Sequenz
unterscheidet, aber noch immer für
ein Polypeptid mit derselben AFP-Aktivität wie das
native Protein codiert. Die Mutationen oder Unterschiede dürfen nicht
in den Aminosäuren
sein, von welchen man weiß,
dass sie für
die Aktivität
des Polypeptids wesentlich sind. Prolin-Reste sind daher vorzugsweise
nicht deletiert oder ersetzt. Vorzugsweise sind jegliche Unterschiede
in der Aminosäure-Sequenz
stille Mutationen, wodurch die Substitutionen konservative Substitutionen
sind, die das Hydropathie-Profil des Polypeptids nicht verändern und
somit voraussichtlich die Polypeptid-Struktur und die Aktivität nicht
ernstlich beeinflussen, d.h. eine Aminosäure mit einer hydrophoben Seitenkette
wird vorzugsweise nur für
eine andere Aminosäure
mit einer hydrophoben Seitenkette getauscht, und eine Aminosäure mit
einer hydrophilen Seitenkette wird nur durch eine andere Aminosäure mit
einer hydrophilen Seitenkette ersetzt. Die Aminosäuren-Homologie
zwischen HPLC-12 und HPLC-1 ist weniger als 60%. Es ist zu erwarten, dass
eine Aminosäure-Sequenz,
die eine Homologie von über
60%, vorzugsweise mehr als 70%, und am meisten bevorzugt mehr als
80% aufweist, für
ein Polypeptid repräsentativ
ist, das Eigenschaften ähnlich
dem HPLC-12 aufweist, und somit auch als im Wesentlichen einem HPLC-12
entsprechend angesehen wird. Außerdem
sollte das von der Aminosäure-Sequenz
codierte Polypeptid zumindest die AFP-Aktivität von AFP-Typ I aus Winterflunder
aufweisen, und vorzugsweise mindestens die AFP-Aktivität von nativem
HPLC-12. Die AFP-Aktivität
kann durch Durchführung
von Vergleichen mit Rekristallisations-Tests bestimmt werden, wobei eine
Reihe von Verdünnungen
des zu bestimmenden Polypeptids und gleiche Mengen und Verdünnungen
des AFP-Typ I und/oder nativen HPLC-12, wie sie aus Aalmutter-Blut
erhalten werden, verwendet werden. Die Art, in welcher ein solcher
Rekristallisations-Test durchgeführt
und evaluiert werden kann, ist in den Beispielen veranschaulicht.
Ein Polypeptid, das irgendeines oder mehrere der oben erwähnten Charakteristika
aufweist, kann als im Wesentlichen dem HPLC-12 entsprechend angesehen
werden.
-
Es
ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines verbesserten Produkts
beschrieben, wobei die Verbesserung in verbesserten Eigenschaften
liegt infolge einer Modifizierung von Eiskristall-Wachstumsprozessen, die
die Größen- und
Form-Merkmale von Eis insbesondere beim erneuten Wachstum beeinflussen,
wodurch beispielsweise ein potentieller Gefrierschaden auf ein Minimum
reduziert wird, z.B. durch Verhindern oder Hemmen der Eis-Rekristallisation
des Produkts nach dem Gefrieren, wobei das Verfahren das Zusetzen
eines Wirtsorganismus, der rekombinantes Polypeptid oder Protein
von Nahrungsmittelqualität
mit einer Aminosäure-Sequenz,
die im Wesentlichen jener von AFP-Typ III-HPLC 12 entspricht, exprimieren kann,
zum nicht-verbesserten Produkt als solches oder zu einem Ingrediens
oder einer Mischung, die normalerweise bei der Herstellung des nichtverbesserten
Produkts verwendet wird, umfasst, wobei der Wirtsorganismus danach
Bedingungen ausgesetzt wird, so dass die für AFP-Typ III-HPLC 12 codierende
Nukleinsäure-Sequenz
im Produkt oder Ingrediens oder in der Mischung exprimiert wird,
indem ein Polypeptid-Erzeugungsverfahren, wie an anderer Stelle
in der Beschreibung beschrieben, zusätzlich zu den normalerweise
zur Herstellung des nicht-verbesserten Produkts unternommenen Schritten
durchgeführt
wird. Das Produkt kann zweckmäßig ein
Nahrungsmittelprodukt oder ein biologisches Material sein. Das biologische
Material kann beispielsweise ein Tier-Organ oder -Gewebe oder ein
Pflanzenmaterial sein. Insbesondere kann rekombinantes Polypeptid
zugesetzt werden. Vorzugsweise hat das Polypeptid Nahrungsmittelqualität, um dem
Endprodukt Nahrungsmittelqualität
zu verleihen. Ein Verfahren, bei welchem das zu verbessernde Produkt
ein Nahrungsmittelprodukt ist, ist bevorzugt. Eine spezifische Ausführungsform
eines geeigneten Polypeptids für
ein erfindungsgemäßes Verfahren
ist ein Hefe-AFP,
wie in den Beispielen veranschaulicht. Der Wirtsorganismus kann
während
des Herstellungsverfahrens oder danach entweder zerstört oder
beschädigt
werden, um das AFP-Polypeptid oder Protein in die Mischung oder
in das Ingrediens des Produkts oder in das Produkt an sich freizusetzen.
Eine solche Zerstörung
oder Beschädigung
kann auf eine Anzahl von dem Fachmann bekannte Weisen erfolgen,
wobei darauf geachtet werden muss, das Verfahren nicht unter zu
rauen Bedingungen auszuführen,
um einen Verlust an AFP-Aktivität
des Polypeptids oder Proteins zu verhindern. Alternativ kann beim
Herstellungsverfahren ein Wirtsorganismus verwendet werden, der
das AFP-Polypeptid oder Protein in das Ingrediens oder in die Mischung
oder in das Nahrungsmittelprodukt als solches sezernieren kann.
Beispielsweise kann eine Bäcker-Hefe
der Wirtsorganismus in einem Verfahren zur Herstellung eines Nahrungsmittelprodukts,
wie eines Bäckerei-Produkts, sein. Der
Produktionsprozess kann wie üblich
durchgeführt
werden, wobei der einzige Unterschied das Zusetzen einer anderen
Hefe ist, d.h. einer Hefe, die ein DNA-Konstrukt aufweist, das die
Expression und Sekretion eines Polypeptids oder Proteins, welches
im Wesentlichen Typ-III-AFP-HPLC-12 entspricht, im Teig vor oder
während
des Backens ermöglicht,
wodurch die Erzeugung eines Teiges oder eines gebackenen Produkts
mit verbesserten Gefriereigenschaften ermöglicht wird. Analog bilden
Verfahren, bei welchen Bakterien, wie Milchsäure-Bakterien, verwendet werden,
zweckmäßige Ausführungsformen
der Erfindung. Verfahren zur Käse-
und Jogurt-Herstellung und andere Nahrungsmittel-Herstellungsverfahren,
die eine Fermentation erfordern, fallen unter die Art von Verfahren,
die von der Erfindung erfasst sind.
-
Vorteilhaft
wird ein erfindungsgemäßes Herstellungsverfahren
zur Verbesserung von Produkten durchgeführt, ohne dass das Zusetzen
von Proteasen oder Chemikalien erforderlich ist, nachdem das rekombinante
Polypeptid oder Protein mit einer Aminosäure-Sequenz, die im Wesentlichen AFP-Typ
III-HPLC-12 entspricht, exprimiert oder sezerniert wurde, um das
AFP-Polypeptid oder Protein als monomeres Produkt zu erhalten.
-
Die
Verwendung eines Polypeptids oder Proteins mit einer Aminosäure-Sequenz,
die im Wesentlichen AFP-Typ III-HPLC-12 entspricht, in irgendeiner
der oben geoffenbarten Ausführungsformen
als Zusatz in einem Produkt zur Verbesserung dieses Produkts ist
beschrieben, wobei die Verbesserung in verbesserten Eigenschaften
einer Modifikation von Eiskristall-Wachstumsprozessen liegt, die
die Größen- und
Form-Merkmale von Eis, insbesondere bei erneutem Wachstum, beeinflussen,
wodurch beispielsweise ein potentieller Gefrierschaden minimiert
wird, z.B. durch Verhindern oder Hemmen der Eis-Rekristallisation
des Produkts nach dem Gefrieren, wobei die Verwendung auf an sich
für AFPs
bekannte Weise erfolgt, um eine höhere spezifische Frostschutz-Aktivität zu erhalten,
als sie mit Winterflunder-AFP erhältlich ist. Vorzugsweise ist
das Produkt ein Nahrungsmittelprodukt. Das Produkt kann zweckmäßig ein
biologisches Material sein. Das Protein oder Polypeptid kann ein
rekombinantes Protein oder Polypeptid sein.
-
Eine
bevorzugte Ausführungsform
des Verfahrens oder der Verwendung zur Verbesserung von Produkten
ist ein Verfahren oder eine Verwendung, wobei das Produkt ein zum
Gefrieren bestimmtes Produkt ist. Für Nahrungsmittelprodukte ist
Eiscreme ein geeignetes Beispiel. Wie oben angegeben, sind auch
Teig oder ein Bäckereiprodukt
von Interesse.
-
Nahrungsmittelprodukte
sind beschrieben, die rekombinantes Polypeptid oder Protein von
Nahrungsmittelqualität
mit einer Aminosäure-Sequenz,
die im Wesentlichen AFP-Typ III-HPLC-12 entspricht, in irgendeiner
der oben geoffenbarten Ausführungsformen
als Zusatz in einem Nahrungsmittelprodukt zur Verbesserung dieses
Produkts aufweisen, wobei die Verbesserung in verbesserten Eigenschaften
einer Modifikation von Eiskristall-Wachstumsprozessen liegt, die die Größen- und
Form-Merkmale von Eis, insbesondere bei erneutem Wachstum, beeinflussen,
wodurch beispielsweise ein potentieller Gefrierschaden minmiert
wird, z.B. durch Verhindern oder Hemmen der Eis-Rekristallisation
des Produkts nach dem Gefrieren. Ein solches Nahrungsmittelprodukt
weist keine natürlich
vorkommenden, essbaren Organismen, wie Aalmutter, auf, es weist
lediglich Sequenzen auf, die für
ein Polypeptid oder Protein mit einer Aminosäure-Sequenz codieren, die der
Aminosäure-Sequenz
von Aalmutter-HPLC 12 in Form und Anzahl, in welcher sie von Natur
aus im Aalmutter vorkommen, entsprechen. Eine geeignete Kategorie
von erfindungsgemäßen Produkten
sind nicht-tierische Produkte. Eine weitere geeignete Kategorie
ist die Kategorie der vom Menschen hergestellten Produkte. Pflanzenprodukte
sind ebenfalls geeignete Beispiele für erfindungsgemäße Produkte.
Erfindungsgemäße Nahrungsmittelprodukte
können
durch ein Verfahren oder eine Verwendung zur Verbesserung eines
Produkts in irgendeiner der oben beschriebenen Ausführungsformen
erhalten werden.
-
Insbesondere
ist auch ein Nahrungsmittelprodukt umfassend einen rekombinanten
Wirtsorganismus von Nahrungsmittelqualität mit verbesserter Gefriertoleranz
beansprucht, wobei die Verbesserung in verbesserten Eigenschaften
einer Modifikation von Eiskristall-Wachstumsprozessen liegt, die
die Größen- und Form-Merkmale von Eis,
insbesondere bei erneutem Wachstum, beeinflussen, wodurch beispielsweise
ein potentieller Gefrierschaden auf ein Minimum reduziert wird,
z.B. durch Verhindern oder Hemmen der Eis-Rekristallisation des
Produkts nach dem Gefrieren, wobei der Wirtsorganismus von Nahrungsmittelqualität ein rekombinantes
Polypeptid oder Protein von Nahrungsmittelqualität enthält und/oder davon umgeben ist,
welches eine Aminosäuresequenz
hat, die im Wesentlichen AFP-Typ III-HPLC-12 entspricht, in irgendeiner
der oben erwähnten
Ausführungsformen,
und/oder ein solches Polypeptid oder Protein vor dem Gefrieren exprimieren und/oder
sezernieren kann.
-
Geeignete
Ausführungsformen
eines solchen rekombinanten Wirtsorganismus sind nachfolgend im Verfahren
zur Polypeptid-Herstellung
beschrieben.
-
Ein
geeignetes Verfahren zur Herstellung rekombinanter Polypeptide oder
Proteine, die Eiskristall-Wachstums- und -Form-modifizierende Aktivität aufweisen,
sogenannte rekombinate Frostschutz-Peptide (AFP), die eine spezifische
Frostschutz-Aktivität
aufweisen, welche höher
ist als jene von Winterflunder-AFP, umfasst
- 1) Züchten
eines Wirtsorganismus von Nahrungsmittelqualität unter Bedingungen, bei welchen
die Expression mindestens einer für AFP codierenden Nukleinsäure-Sequenz
erfolgt oder induziert wird, wobei die Nukleinsäure-Sequenz aus einem DNA-Konstrukt
besteht, welches DNA-Konstrukt im nativen Wirtsorganismus nicht
vorhanden ist und welches DNA-Konstrukt in der angegebenen Reihenfolge
aufweist:
- (a) einen starken, gegebenenfalls induzierbaren Promotor, der
im Wirtsorganismus aktiv ist,
- (b) ein ATG-Start-Codon, das in einer fakultativen DNA-Signal-Sequenz
anwesend sein kann, welche das Protein, das vom Wirtsorganismus
während
der Expression der für
das AFP codierenden Nukleinsäure-Sequenz
von (c) unten erzeugt wird, sezernieren kann, welche Signalsequenz
zur AFP-codierenden Nukleinsäure-Sequenz
homolog oder heterolog sein kann und mit dem ATG-Start-Codon im
Leserahmen ist,
- (c) mindestens eine Nukleinsäure-Sequenz,
die für
eine Aminosäure-Sequenz
codiert, welche im Wesentlichen jener von AFP-Typ III-Protein HPLC 12 entspricht,
wobei die Nukleinsäure-Sequenz
mit dem ATG-Start-Codon im Leserahmen ist, und gegebenenfalls
- (d) ein Stop-Codon, das an das 3'-Ende der für das AFP codierenden Nukleinsäure-Sequenz
gebunden ist.
-
Das
Verfahren kann weiters das Sammeln des von der für AFP codierenden Nukleinsäure-Sequenz exprimierten
Produkts, welches durch weiteres Verarbeiten auf an sich bekannte
Weise erhalten wird, umfassen. Um die Sekretion des Expressionsprodukts
der Nukleinsäure-Sequenz,
die für
eine Aminosäure-Sequenz,
die im Wesentlichen jener von AFP-Typ III-Protein HPLC 12 entspricht,
zu erhalten, kann das DNA-Konstrukt weiters eine Signalsequenz für den Wirtsorganismus
aufweisen, welche die Sekretion durch den Wirt während der Züchtung des Wirts ermöglicht.
Der Wirtsorganismus ist zweckmäßig ein
Mikroorganismus. Geeignete Wirtsorganismen von Nahrungsmittelqualität sind Pilze,
wie Hefe, und Bakterien, wie Milchsäure-Bakterien. Die Hefezellen
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces
lactis, sind Beipiele für
eine geeignete Hefe-Wirtszelle. Ein Fachmann auf dem Gebiet der
Fermentationsprozesse bei der Nahrungsmittelerzeugung wird wissen,
welche Hefezellen geeignet sind, und welche Transformations- und
Expressionssysteme zur Verfügung
stehen (Romanos et al., Campbell und Duffus). Die Milchsäure-Bakterien Lactobacillus,
Streptococcus und Bifidobacterium sind ebenfalls Beispiele für geeignete
bakterielle Wirtsorganismen, von welchen viele Stämme bekannt
sind, und für
welche es geeignete Transformations- und Expressionssysteme gibt,
wie jedem Fachmann für
rekombinante DNA-Arbeit von Bakterien, die mit Molkereiprodukten
verbunden sind, bekannt ist (Gasson, 1993). Die FDA besitzt eine
Liste von Organismen von Nahrungsmittelqualität, die der Öffentlichkeit zur Verfügung steht.
Ein Fachmann kennt die Organismen, die als Nahrungsmittelqualität aufweisend
angesehen werden, d.h. GRAS (generally recognised as safe)-Status
haben. Insbesondere sind Organismen, die mit der Fermentation von
Nahrungsmittelprodukten und der Erzeugung von Molkereiprodukten
verbunden sind, geeignet.
-
Die
Bezeichnung „eine
Nukleinsäure-Sequenz,
die für
eine Aminosäure-Sequenz
codiert, welche im Wesentlichen jener von AFP-Typ III-Protein HPLC
12 entspricht",
umfasst jede Nukleinsäure,
die genau für
die Aminosäure-Sequenz
von nativem HPLC-12
von Aalmutter codiert. Eine solche Nukleinsäure-Sequenz kann infolge der
Degeneration des genetischen Codes, d.h. die Tatsache, dass verschiedene
Nukleinsäure-Codons für die selbe
Aminosäure
codieren, unterschiedlich sein. Außerdem kann auch eine Nukleinsäure-Sequenz, welche
für eine
Aminosäure-Sequenz
codiert, die sich in einer oder zwei Aminosäuren von der bekannten Aminosäure-Sequenz
unterscheidet, aber noch immer für
ein Polypeptid mit derselben AFP-Aktivität wie das native Protein codiert,
bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Mutationen
oder Unterschiede dürfen
nicht in Aminosäuren
vorliegen, von welchen man weiß,
dass sie für
die Aktivität
des Polypeptids wesentlich sind. Prolin-Reste werden daher vorzugsweise
nicht deletiert oder ersetzt. Vorzugsweise sind jegliche Unterschiede
in der Aminosäure-Sequenz
stille Mutationen, wobei die Substitutionen konservative Substitutionen sind,
die das Hydropathie-Profil des Polypeptids nicht verändern und
daher voraussichtlich die Polypeptid-Struktur und -Aktivität nicht
ernstlich beeinflussen, d.h. eine Aminosäure mit einer hydrophoben Seitenkette wird
vorzugsweise nur für
eine andere Aminosäure
mit einer hydrophoben Seitenkette ausgetauscht, und eine Aminosäure mit
einer hydrophilen Seitenkette wird nur durch eine andere Aminosäure mit
einer hydrophilen Seitenkette ersetzt. Die Aminosäure-Homologie
zwischen HPLC-12 und HPLC-1 ist weniger als 60%. Man kann erwarten,
dass eine Aminosäure-Sequenz,
die eine Homologie von mehr als 60%, vorzugsweise mehr als 70%,
und am meisten bevorzugt, mehr als 80% aufweist, repräsentativ
ist für
ein Polypeptid, das ähnliche Eigenschaften
wie HPLC-12 aufweist und somit als im Wesentlichen HPLC-12 entsprechend
angesehen werden kann. Der Ausdruck „im Wesentlichen entsprechend" umfasst somit Nukleinsäure-Sequenzen,
die für
Aminosäure-Sequenzen
codieren, welche mehr als 60% Homologie mit der Aminosäure-Sequenz
von nativem HPLC-12 aufweisen. Außerdem sollte das von der Aminosäure-Sequenz
codierte Polypeptid mindestens die AFP-Aktivität von AFP-Typ I aus Winterflunder,
und vorzugsweise mindestens die AFP-Aktivität von nativem HPLC-12, aufweisen.
Die AFP-Aktivität
kann durch Durchführung
von Vergleichen mit Rekristallisations- Tests bestimmt werden, wobei eine Reihe
von Verdünnungen
des zu bestimmenden Polypeptids und AFP-Typ I und/oder natives HPLC-12,
wie sie aus Aalmutter-Blut erhalten werden, in denselben Verdünnungen
wie das zu testende Polypeptid verwendet wird, d.h. Vergleich desselben
Gew./Vol. von Polypeptid oder Protein. Die Art, in welcher ein solcher
Rekristallisations-Test durchgeführt
und evaluiert werden kann, ist in den Beispielen veranschaulicht.
Ein Polypeptid, das irgendeines oder mehrere der oben erwähnten Charakteristika
aufweist, kann als im Wesentlichen dem HPLC-12 entsprechend angesehen
werden.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind das DNA-Konstrukt und die Bedingungen der Kultivierung
des Wirtsorganismus so, dass er ein monomeres Polypeptid mit einer
Aminosäure-Sequenz sezerniert,
die im Wesentlichen jener von AFP-Typ III-Protein HPLC 12 entspricht.
Das DNA-Konstrukt wird daher vorzugsweise nicht in Tandem ein Dimer
oder Multimer einer Aminosäure-Sequenz
exprimieren, die im Wesentlichen jener von AFP-Typ III-Protein HPLC 12 entspricht.
Die Produktion von Dimeren oder Multimeren erfordert zusätzliche,
nachfolgende Verarbeitungsschritte oder kann die Sekretion eines
aktiven Polypeptids verhindern. Vorzugsweise umfasst daher das DNA-Konstrukt
eine Nukleinsäure-Sequenz,
die für
eine Aminosäure-Sequenz,
welche im Wesentlichen jener von AFP-Typ III-Protein HPLC 12 entspricht,
in der monomeren Form codiert. Natürlich kann das DNA-Konstrukt mehrere
Kopien der Nukleinsäure-Sequenz
aufweisen, die für
eine Aminosäure-Sequenz,
welche im Wesentlichen jener von AFP-Typ III-Protein HPLC 12 entspricht,
in monomerer Form in Tandem codieren.
-
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein DNA-Konstrukt, bei welchem die Nukleinsäure-Sequenz,
die für
die im Wesentlichen AFP-Typ III HPLC 12 entsprechende Aminosäure-Sequenz
codiert, die bevorzugten Codons des Wirtsorganismus des Verfahrens
umfasst. Dies ist in Anbetracht der Tatsache, dass die Translationseffizienz
durch Vermeidung bestimmter Codons in bestimmten Wirtsorganismen
erhöht
wird, bevorzugt. Bevorzugte Codon-Verwendungen unterscheiden sich
in Prokaryoten, in Hefe und Pflanzen von der in der Winterflunder
gefundenen Codon-Verwendung. Beispielsweise machen die Codons GCA,
GCG und GCT zusammen mehr als 65% der Alanin-Codons bekannter Gene
von E. coli, S. cerevisiae und Z. mays aus, wogegen sie weniger
als 25% der Alanin-Codons eines Fisches, wie Winterflunder, ausmachen.
In ähnlicher
Weise ist dies der Fall für
die Threonin-Codons ACA, ACG und ACT (PCT/US90/02626). Die Codon-Verwendung,
die von Milchsäure-Bakterien
und Hefe bevorzugt ist, kann aus der für diese Mikroorganismen-Gruppen
spezifischen Literatur entnommen werden. Ein Fachmann auf dem Gebiet
der rekombinanten DNA-Technologie mit diesen besonderen Expressions-Organismen
weiß,
welche Codons bevorzugt sind.
-
Wenn
der Wirtsorganismus eine Hefe ist, umfasst eine bevorzugte Ausführungsform
des DNA-Konstrukts die DNA-Präsequenz
des α-mating-Faktors
von S. cerevisiae als Signal-Sequenz. Sie kann in einer weiteren
Ausführungsform
auch die Prosequenz des α-mating-Faktors
von S. cerevisiae zwischen der Präsequenz und der für AFP codierenden
Nukleinsäure-Sequenz
aufweisen, wobei die Präsequenz,
die Prosequenz und die für
AFP codierende Nukleinsäure-Sequenz
im selben Leserahmen sind. Alternativ umfasst, wenn der Wirtsorganismus
eine Hefe ist, eine bevorzugte Ausführungsform des DNA-Konstrukts
die Invertase-Signal-Sequenz von S. cerevisiae vor der für AFP codierenden
Nukleinsäure-Sequenz.
-
Wenn
der Wirtsorganismus eine Hefe ist, umfasst eine bevorzugte Ausführungsform
des DNA-Konstrukts den induzierbaren GAL7-Promotor oder einen konstitutiven GAPDH-Promotor
von Saccharomyces cerevisiae. Für
andere Wirtsorganismen geeignete Promotoren zum Einbau im DNA-Konstrukt
sind wohl bekannt.
-
Die
folgenden Literaturstellen werden zitiert, da sie Beispiele liefern
für mögliche Transformationssysteme
oder Elemente davon: für
Hefe Campbell und Duffus, für
Pflanzen PCT/US90/0626 und van den Elzen et al. (1985), und für Tiere
Hanahan (1988).
-
Vor
der vorliegenden Erfindung wurde kein im Wesentlichen isoliertes
und gereinigtes, rekombinantes Polypeptid oder Protein von Nahrungsmittelqualität erzeugt,
das im Wesentlichen gleich dem Typ-III-AFP-HPLC12 war, das eine
derartig hohe AFP-Aktivität aufweist.
Erstmalig wurde im Wesentlichen isoliertes, rekombinantes Polypeptid
oder Protein von Nahrungsmittelqualität hergestellt, das im Wesentlichen gleich
dem Typ III-AFP-HPLC-12 ist, welches eine AFP-Aktivität aufweist,
die höher
als jene der Winterflunder ist. Die Erfindung umfasst Nahrungsmittelprodukte,
die im Wesentlichen reines und isoliertes rekombinantes Polypeptid
oder Protein von Nahrungsmittelqualität aufweisen, welches verbesserte
Eigenschaften einer Modifikation von Eiskristall- Wachstumsprozessen aufweist, die die
Größen- und
Form-Merkmale von Eis, insbesondere bei erneutem Wachstum, beeinflussen,
wodurch beispielsweise ein potentieller Gefrierschaden minimiert
wird, z.B. durch Verhindern oder Hemmen der Eis-Rekristallisation
nach dem Gefrieren, sogenannte rekombinante Frostschutz-Peptide
(AFP), die eine AFP-Aktivität
aufweisen, welche höher
als die einer gleichen Menge an Winterflunder-AFP vom Typ-I ist,
wobei das Polypeptid oder Protein eine Aminosäure-Sequenz hat, die im Wesentlichen
jener des AFP-Typ III-Proteins HPLC 12 entspricht. Solche rekombinanten
Polypeptide, und insbesondere rekombinante Polypeptide oder Proteine,
die die obige modifizierte Aktivität, wie Eiskristall-Wachstums-inhibierende
Aktivität
aufweisen, so genannte rekombinante Frostschutz-Peptide (AFP), die eine
spezifische Frostschutz-Aktivität
aufweisen, die höher
als jene des Winterflunder-AFPs ist, können mit einem Verfahren, wie
hierin beschrieben, hergestellt werden.
-
2. Materialien und Methoden
-
2.1 Stämme und Wachstumsbedingungen.
-
E.
coli, Stamm JM109 (endA1, recA1 syrA96, thi, hsdR17, rk–,
mk+, relA1 supE44, Yanisch-Perron et al.,
1985) wurde zur Amplifikation von Plasmiden verwendet. S. cerevisiae,
Stamm SU50 (MATa, cir°,
leu2, his4, can1; Verbakel, 1991) wurde für die Transformation der multi-copy-Integrations-Plasmide
verwendet. E. coli-Transformanten wurden auf Luria-Agar-Platten
selektiert, die 100 μg
Ampicillin ml–1 enthielten,
Sambrook et al. (1989). Hefe-Stämme
wurden auf selektiven YNB-Platten gehalten (0,67% Difco Yeast Nitrogen
Base ohne Aminosäuren,
2% Glucose, 2% Agar), welche mit den essentiellen Aminosäuren supplementiert
war (Histidin 20 μg/ml,
Uracil 20 μg/ml).
Dasselbe flüssige
Medium wurde für
Vor-Kulturen verwendet, welche 48 h lang bei 30°C gezüchtet und 1:10 in YP-Medium
(1% Difco Hefe-Extrakt, 2% Difco Pepton), das 5% Galactose zur Induktion
des GAL7-Promotors enthielt, verdünnt wurden.
-
Plasmide
-
Die
relevanten Details der AFP-III-enthaltenden Plasmide sind in Tabelle
1 angeführt.
-
Transformation
-
Die
Transformation von JM109 erfolgte gemäß Chung et al. (1989). Die
Transformation der Hefe-Stämme
wurde mittels Elektroporation, vor allem wie von Becker et al. (1991)
be schrieben, durchgeführt. Die
Transformanten wurden auf selektiven YNB-Platten gewonnen. Ein Fachmann
auf dem Gebiet wird erkennen, dass verschiedene Transformationsmethoden
möglich
sind. Alternativen hängen
von dem zu transformierenden Organismus ab und sind in verschiedenen
Lehrbüchern,
wie Sambrook et al. (1989) und Campbell und Duffus (1988) gut dokumentiert.
-
Molekular-biologische
Verfahren
-
Restriktionsenzyme
und DNA-Modifikations-Enzyme wurden gemäß den Empfehlungen der Lieferfirma
angewendet.
-
Oligonukleotide
wurden auf einem Applied Biosystems 380A DNA-Synthesizer synthetisiert
und mittels Standard-Verfahren gereinigt.
-
Reinigung
von AFP-III
-
Das
AFP-III von Aalmutter, Macrozoarces americanus, wurde aus dem Blut
der in den Meeresküstengewässern von
Neufundland gefangenen Fische gereinigt. Die AFP-III-Probe wurde
durch Zentrifugieren des geronnenen Fisch-Serums, wie von Hew et
al. (1984) beschrieben, hergestellt.
-
Kationenaustausch-Chromatographie.
-
Kationenaustausch-Chromatographie
wurde auf einer Mono S-Säule (HR5/5,
Pharmacia Biotech) auf dem SMART-System (Pharmacia Biotech) durchgeführt. Der
Proben-Puffer war 10 mM Na2HPO4/NaH2PO4 (Merck), pH
6,0, und die Elution erfolgte mit einem linearen 0–0,5 M NaCl
(Merck) Gradienten, mit einer Strömung von 100 μl/min. Die
Peptide wurde unter Verwendung des μ Peak-Monitors (Pharmacia Biotech)
bei 214 und 280 nm detektiert. Die Fraktionen wurden unter Verwendung
des integrierten SMART-System-Fraktionskollektors gesammelt, wobei
das 214 nm-Signal überwacht
wurde, die System-Temperatur wurde auf 15°C eingestellt.
-
Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie.
-
Die
Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie
(RP-HPLC) wurde unter Verwendung einer μRPC C4/C18 SC2.1/10-Säule (Pharmacia
Biotech) auf dem SMART-System (Pharmacia Biotech) durchgeführt. Die
Probe wurde auf die Säule
in 0,06% Trifluoressigsäure
(TFA, Merck) in Milli Q-Wasser (Lösungsmittel A) aufgetragen
und unter Verwendung von 80% Acetonitril (Merck), 0,054 TFA in Milli
Q-Wasser (Lösungsmittel
B) eluiert. Der verwendete Standard-Gradient wurde wie folgt programmiert:
0 min 100% Lösungsmittel
A, 5 min 100% Lösungsmittel
A, 10 min 65% Lösungsmittel
A, 50 min 40% Lösungsmittel
A, 55 min 0% Lösungs mittel
A, 57,5 min 0% Lösungsmittel
A und zu 58 min 100% Lösungsmittel
A, mit einer Strömung
von 100 μl/min.
Die Peptide wurde mit dem μPeak-Monitor
(Pharmacia Biotech) bei drei Wellenlängen 214, 256 und 280 nm, detektiert.
Die Peaks wurden unter Überwachung
des 214 nm-Signals gesammelt, wobei der integrierte SMART-System-Fraktionskollektor
verwendet wurde, die System-Temperatur wurde auf 20°C eingestellt.
-
Die
AFP-III-Isoformen 1, 2 und 3 wurden mit Hilfe eines modifizierten
Gradienten getrennt: 0 min 100% Lösungsmittel A, 10 min 60% Lösungsmittel
A, 35 min 55% Lösungsmittel
A, 36 min 45% Lösungsmittel
A, 45 min 45% Lösungsmittel
A, 46 min 0% Lösungsmittel
A, 50 min 0% Lösungsmittel
A, 50,1 min 100% Lösungsmittel
A und 60 min 100% Lösungsmittel
A. Die Puffer und alle SMART-System-Details
sind dieselben wie jene, die mit dem Standard-Gradienten verwendet wurden.
-
Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese.
-
16%
Polyacrylamid Tricin-Gele (Novex) wurden auf einer Xcell-Elektrophorese-Zelle
(Novex) gemäß dem Protokoll
der Lieferfirma laufen lassen. Der Proben-Puffer stammte von Novex
und bestand aus 3,0 ml TRIS-HCl 3,0 M, 2,4 ml Glycerin, 0,8 g SDS,
1,5 ml 0,1% Coomassie-Blue G, 0,5 ml 0,1% Phenol-Rot und 5% β-Mercaptoethanol,
das Endvolumen wurde auf 10 ml mit destilliertem Wasser (pH=8,45)
eingestellt. Der Laufpuffer stammte auch von Novex und enthielt
12,1 g TRIS; 17,9 g Tricin und 1 g SDS in einem Gesamtvolumen von
1 Liter destilliertem Wasser, der pH-Wert war etwa pH 8,3. Das Gel
wurde unter Verwendung von 10% Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad)
gefärbt,
in einer Lösung
aus 40% Ethanol (Merck), 10% Essigsäure (Merck) und 50% destilliertem
Wasser gelöst,
diese Lösung
wurde in einer Mikrowelle 45 s lang erhitzt, danach wurden die Gele
15 min lang auf einer Rotationsschüttelvorrichtung gefärbt. Die
Gele wurden mit einer Lösung von
10% Ethanol (Merck), 7,5% Essigsäure
(Merck) und 82,5% destilliertem Wasser entfärbt. Im Fall einer Molekulargewichtsbestimmung
wurden vorgefärbte
MARK-12-Marker (Novex) verwendet.
-
Western Blots.
-
Novex-Tricin-Gele
wurden unter Verwendung von Trans-Blot-Transfer-Medium (Bio-Rad) auf dem Western-Transfer-Blot-Modul
(Novex) gemäß dem Protokoll
der Lieferfirma geblottet. Nach dem Blotten wurde die Membran mit
5% Magermilch in 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4 blockiert und
danach in 1% Magermilch in 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 0,1% Tween
20, pH 7,4 und einem monoklonalen Antiserum gegen Aalmutter-Frostschutz-Peptide
inkubiert. Zwei verschiedene Antikörper wurden erhalten (Geschenke
von M.M. Gani, Unilever Research, Colworth House Laboratory), einer
für die
Bestimmung der S-Gruppen, und der andere für die Bestimmung der Q-Gruppe.
Die Inkubation wurde über
Nacht bei Raumtemperatur unter sanftem Bewegen vorgenommen. Nicht
absorbierte Antikörper
wurden durch Waschen mit dem Inkubationspuffer (3 × 5 min)
entfernt. Die Membran wurde mit dem zweiten Antikörper (Ziegen-anti-Maus-IgG
(H+L), alkalischem Phosphatase-Konjugat; BioRad, Richmond) 2 h lang
bei Raumtemperatur inkubiert. Das Enzym wurde unter Verwendung von
BCIP/NBT (Biorad) entwickelt.
-
Trypsin-Verdau.
-
Für den Trysin-Verdau
wurde die Probe in 0,1 M NH4HCO3-Puffer,
pH 8,3, gelöst.
Trypsin (mit TPCK behandelt, Worthington, Millipore Corporation)
wurde in einem Enzym:Substrat-Verhältnis von 1:100 zugegeben.
Nach 30 Minuten wurde der pH-Wert überprüft, und dieselbe Menge Trypsin
wurde noch einmal zugesetzt. Die Inkubation wurde über Nacht
bei 37°C
durchgeführt.
Der Verdau wurde durch Zugabe von TFA gestoppt, um einen pH-Wert
von pH 2 zu ergeben. Die Peptide wurden mittels RP-HPLC auf dem
SMART-System (Pharmacia)
getrennt.
-
N-terminale Aminosäuren-Sequenz-Analyse.
-
Die
N-terminale Aminosäuren-Sequenz-Analyse
wurde auf einem LF 3000 Protein-Sequenzierer (Beckman) gemäß dem Protokoll
der Lieferfirma durchgeführt.
Die PTH-Derivate der Aminosäuren
wurden auf einem automatisierten RP-HPLC-System, System Gold (Beckman)
analysiert.
-
Protein-Bestimmung mittels
Aminosäure-Analysen.
-
Die
AFP-III-Proben wurden in 6 M HCl, das 1% Phenol enthielt, unter
Vakuum bei 110°C
24 h lang hydrolysiert und danach getrocknet. Die Analysen wurden
auf einem Alpha plus series 2-Aminosäure-Analysator
(Pharmacia Biotech) unter Verwendung des Protokolls der Lieferfirma
durchgeführt.
-
Rekristallisations-Test
-
Die
auf AFP-III-Aktivität
zu testenden Proben wurden mit Saccharose-Pulver gemischt, um eine
30 Vol.-% Saccharose-Lösung
zu erhalten. Ein Anteil dieser Lösung
wurde auf einen Mikroskop- Objektträger gegeben,
mit einem Deckglas bedeckt, um das Verdampfen zu verhindern und
auf einen Linkam THMS-Kühltisch gegeben,
mit einem Linkam CS 196-Kühlsystem
verbunden und von einem Linkam TMS 91-Steuergerät gesteuert. Diese Lösung wurde
auf –40
C rasch gekühlt
(„crash-cooled") (δ 99°C/min) und
danach auf –6°C erwärmt. Das
Wachstum von Eiskristallen wurde im Verlauf von 30 Minuten Inkubation
bei –6°C mikroskopisch untersucht.
-
Für die Untersuchung
von HPLC-gereinigten Peptiden wurden Proben von der RP-HPLC-Säule, die gereinigte
AFP-III-Isoformen enthielt, in einem Speed Vac-Konzentrator (Savant)
zweimal nach einem Rehydrations-Schritt in Milli Q-Wasser getrocknet.
Nach dem zweiten Trocknungsschritt wurden die Proben in 100 μl Milli Q-Wasser
gelöst,
und der pH-Wert wurde überprüft, um sicherzugehen,
dass das gesamte TFA aus dem RP-HPLC-Puffer-System entfernt worden
war. Die Proben wurden auf einen Absorptions-Wert von 0,700 bei λ=214 nm verdünnt, dies
entspricht einer etwa 0,1 μg/ml
Fisch-AFP-III-Lösung.
Um sicherzugehen, dass die Proben eine gleiche Menge an AFP-III
enthielten, wurden sie später
mittels Aminosäure-Analyse überprüft. Wenn
gereinigte Proben, AFP-III-Isoformen,
verwendet wurden, wurde ihre Reinheit mittels N-terminaler Aminosäure-Sequenz-Analyse überprüft.
-
Fed-batch-Fermentation.
-
Impfverfahren:
eine Kultur der geeigneten Transformante wurde in 25 ml minimalem
Medium wachsen lassen und über
Nacht bei 30°C
und 300 U/min gezüchtet.
Die Kultur wurde danach in einen 1000 ml Schüttelkolben transferiert, der
500 ml YP, das 2% Glucose enthielt, und über Nacht bei 30°C und 300
U/min gezüchtet.
Diese Kultur wurde als Inoculum für den fed-batch-Versuch verwendet.
-
Das
folgende batch-Medium wurde verwendet: 110 g Glucose.l H2O, mit entmineralisiertem Wasser auf 500
g gebracht. 25 g Trusoy, 50 g Hefe-Extrakt (Ohly), 10,5 g K2HPO4, 5 ml 1 000
X Egli Vitaminlösung,
50 ml 100 X Egli Tracer-Metalle (Egli, 1980), 0,25 g L-Histidin.HCl
(Sigma), 3 g MgSO4, 2 g Antischaummittel
auf 4500 gebracht mit entmineralisiertem Wasser. Die Glucose-Lösung wurde
einer Hitze-Sterilisation unterzogen, und die Vitaminlösung wurde
separat einer Filter-Sterilisation unterzogen. Alle anderen Komponenten
wurden im Fermenter einer Hitze-Sterilisation unterzogen. Die Temperatur
wurde auf 30°C
und der pH auf einen Wert von 5,0 reguliert. Der Fermenter wurde
beimpft, und die Zellen wurden mit einer Luftströmung von 2 l/min und einer
Rührergeschwindigkeit
von 600 U/min gezüchtet.
Nach 18 Stunden wurde die Einspeisungs-Phase begonnen.
-
Das
folgende Einspeise-Medium wurde verwendet: 1100 g Glucose.l H2O, mit entmineralisiertem Wasser auf 1750
g gebracht. 62,5 g Hefe-Extrakt (Ohly), 30 g K2HPO4, 5 ml 1000 X Egli Vitamin-Lösung, 50
ml 100 X Egli Tracer-Metalle (Egli, 1980), 6,25 g L-Histidin.HCl
(Sigma), 6,25 g MgSO4.7H2O,
2 g Antischaummittel auf 850 g gebracht mit entmineralisiertem Wasser.
Die Speisepumpe wurde auf einen konstanten RQ-Wert (Verhältnis von
erzeugten Mol CO2 und verbrauchten Mol O2 von 1,05 eingestellt, basierend auf Software-Tools,
wie von Keulers (1993) beschrieben. Die Kultur wurde nach 37 Stunden
geerntet.
-
Beispiel 1. Konstruktion
eines synthetischen Gens, das für
ein Typ III-AFP codiert
-
Eine
Nukleotid-Sequenz, die für
das HPLC-I-Frostschutz-Peptid codiert, optimiert für die Expression in
Saccharomyces cerevisia, wurde wie folgt konstruiert: ein Satz von
12 Oligonukleotiden wurde synthetisiert (invafp1, invafp2, invafp3,
invafp4, invafp5, invafp6, invafp7, invafp8, invafp9, invafp10,
invafp11 und invafp12), welche hauptsächlich die DNA-Sequenz des
reifen AFP aufwiesen, das in vorzugsweise verwendeten S. cerevisiae-Codons
exprimiert war. Das synthetische Gen wurde so entworfen, dass es
5'-Einzelstrang-Regionen enthielt,
die mit mit PstI und HindIII erzeugten klebrigen Enden kompatibel
waren. (2).
-
Für den Zusammenbau
des synthetischen AFP-Gens, wurden 50 pmol jedes der Oligonukleotide
in 12 μl
Wasser gelöst,
2 min lang bei 95°C
inkubiert und direkt auf Eis gegeben. Nach diesem Denaturierungsschritt wurden
die Oligonukleotide in einem Endvolumen von 20 μl, enthaltend die 2,5 mM ATP,
5 mM DTT und etwa 10 E Polynukleotidkinase, 40 min lang bei 37°C phosphoryliert,
worauf sie 2 min lang bei 95°C
denaturiert und auf Eis platziert wurden. 10 μl jedes phosphorylierten Oligonukleotids
wurden mit ihrem am meisten komplementären DNA-Oligonukleotid gemischt,
um eine Duplex-Bildung zu erhalten. Nach 2-minütiger Inkubation bei 95°C zwecks
Denaturierung wurde jeder Duplex langsam auf 30°C abgekühlt. Wiederum wurden 10 μl aller sechs
Duplex-Mischungen gepoolt und in einem Endvolumen von 100 μl, enthaltend
50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl2, 8 mM
DTT und 40 μg/ml
Gelatine und 10 E DNA-Ligase, 2 Stunden lang bei 20°C inkubiert.
Die Ligationsmischung wurde dann ausgefällt und in 30 μl TE-Puffer
wieder gelöst.
15 μl der
Mischung wurden auf ein 2% Agarose-Gel gegeben, und die DNA-Bande
der erwarteten Größe (etwa
224 Basenpaare) wurde aus dem Gel herausgeschnitten und schließlich durch
das Gene Clean II-Verfahren gemäß den Empfehlungen
der Lieferfirma gereinigt.
-
Das
erhaltene DNA-Fragment wurde dann in den mit PstI/HindIII linearisierten
Vektor pTZ19R (Pharmacia) ligiert und mittels Standard-Verfahren
in E. coli JM 109 transformiert. Die Plasmid-DNA von mehreren Transformanten
wurde mit dem geringfügig
modifizierten alkalische Lyse-mini-Präparationsverfahren („alkaline
lysis mini-preparation method")
isoliert und durch Restriktionsanalyse mit mehreren Enzymen analysiert. Die
Sequenz des in einem solchen Plasmid enthaltenen Inserts wurde durch
Sanger-Didesoxy-Sequenzierung des doppelsträngigen Plasmids (Sanger et
al., 1977) bestätigt.
Dieses intermediäre
Konstrukt, das die Codier-Region der synthetischen AFP-III-Kassette
enthielt, wurde pUR7700 genannt (3).
-
Beispiel 2. Konstruktion
von Hefe-Expressions-Vektoren, die ein synthethisches Gen, das für AFP-III-HPLC-1 codiert,
enthalten
-
Das
vom pUR7700 getragene synthetische AFP-III-Gen enthält keine
der für
die Expression dieses Peptids in Hefe benötigten Informationen. Um eine
Expression und Sekretion dieses Gens zu erlangen, müssen Konstrukte,
die die translationalen Fusionen des AFP-III-Gens mit einer geeigneten
Sekretions-Signal-Sequenz enthalten, hergestellt werden, und diese
Fusions-Sequenzen unter die Kontrolle eines Hefe-Gen-Promotors gebracht
werden.
-
Geeignete
Sekretions-Signal-Sequenzen können
aus einer Vielfalt von Genen selektiert werden, die für Proteine
codieren, welche von Hefe effizient sezerniert werden, beispielsweise
Invertase, die von SUC2 oder α-mating-Faktor,
codiert von MFα1
und MFα2.
Um eine geeignete Fusion mit der Invertase-Signal-Sequenz zu erhalten,
wurde ein PCR-Fragment erzeugt, das die Invertase-Signal-Sequenz, einen
Teil des GAL7-Promotors und eine geeignete Restriktionsenzym-Stelle
enthielt, um eine in frame-Fusion der Invertase-Signal-Sequenz mit
dem synthetischen AFP-III-Gen zu gewährleisten.
-
Um
dieses Fragment zu erhalten, wurde ein PCR-Primer, invafp14, mit
der folgenden Sequenz entworfen:
-
-
Dieser
Primer wurde als 3'-Primer
in einer PCR-Reaktion in Kombination mit dem 5'-Primer PG7 05 AF (Verbakel, 1991) verwendet,
welcher mit der im GAL7 Promotor gefundenen Sequenz hybridisiert.
Unter Verwendung von pUR2778-Plasmid-DNA als Matrize (4,
van Gorcom et al., 1991) erzeugte die Reaktion ein etwa 243 bp-Fragment.
Dieses Fragment wurde aus einem Agarose-Gel eluiert und mit dem
Gene Clean-Verfahren gemäß den Instruktionen
des Herstellers gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde danach mit
SacI und BamHI verdaut, und das resultierende, etwa 88 bp-Fragment
in die entsprechenden Stellen im Plasmid pTZ19R ligiert. Die Ligationsmischung
wurde durch Transformation in E. coli JM109 eingeführt, und Plasmid-DNA
aus einer Transformante wurde isoliert und sequenziert, um die Identität des klonierten
Inserts zu bestätigen.
Dieses Plasmid wurde als pUR7701 bezeichnet (5).
-
Um
eine in frame-Fusion der Invertase-Signal-Sequenz mit dem synthetischen
AFP-III-Gen zu erhalten, wurde pUR7700 mit NheI und HindIII verdaut
und das etwa 196 bp-Fragment isoliert und mit dem etwa 2911 bp-Fragment
ligiert, welches durch Verdau von pUR7701 mit NheI und HindIII gebildet
worden war. Das resultierende Plasmid wurde pUR7702 genannt (6).
-
Auf ähnliche
Weise wurde ein PCR-Fragment, das die α-mating-Faktor-pre-pro-Signal-Sequenz
enthielt, unter Verwendung des Primers MFαAFPIII als 3'-Primer erzeugt:
-
-
Ein
PCR-Fragment, das einen Teil des GAL7-Promotors und die gesamte
pre-pro-α-mating-Faktor-Codiersequenz
enthielt, wurde aus einer pUR2660 (WO 94/03617)-DNA-Matrize unter
Verwendung von MFαAFPIII
und PG7 05 AF als Primer erzeugt. pUR2660 enthält die pre-pro-α-mating-Faktor-Sequenz
unter der Kontrolle des GAL7-Promotors.
Das resultierende etwa 462 bp-Fragment wurde, wie oben beschrieben, gereinigt
und mit SacI und NheI verdaut. Das so erhaltene etwa 292 bp-Fragment
wurde in das etwa 3025 bp-Fragment
ligiert, das durch Verdau von pUR7702 mit SacI und NheI erhalten
worden war. Plasmid-DNA aus mehreren E. coli JM109-Transformanten, die
von dieser Ligation erhalten worden waren, wurden sequenziert, um
zu bestätigen,
dass das richtige Fragment kloniert worden war. Eines dieser Plasmide
wurde als pUR7703 bezeichnet (7).
-
Um
Plasmide zu konstruieren, die die AFP-III-Kassette in Hefe exprimieren
können,
wurden die synthetischen Gen-Signal-Sequenz-Fusionen in eine Vielfalt
von Hefe-Expressionsvektoren, wie folgt, eingeführt:
Das etwa 278 bp SacI/HindIII-Fragment
von pUR7702 und das etwa 488 bp SacI/HindIII-Fragment von pUR7703,
welche die Invertase bzw. α-mating-Faktor-Fusionen
zu AFP-III tragen, wurden unabhängig
voneinander unter Verwendung von Standard-Techniken in Hefe-Expressionsvektoren
kloniert, die auch mit SacI und HindIII verdaut worden waren. Diese
Expressionsvektoren tragen beide den S. cerevisiae-GAL7-Promotor,
so dass die Insertion von Genen an der SacI-Stelle eine Gal7-gerichtete
Transkription der insertierten Gene ermöglicht.
-
pUR7704
(8) wurde erzeugt durch Insertion der Invertase-Signal-Sequenz-AFP-III-Kassette
aus pUR7702 in den multicopy-ribosomalen DNA-Integrationsvektor
pUR2778, und pUR7706 (9) ist pUR2778, das die α-mating-Faktor
AFP-III-Kassette enthält,
abgeleitet aus pUR7703 und zwischen die SacI- und HindIII-Stellen
insertiert.
-
Beispiel 3. Expression
von AFP-III in S. cerevisiae
-
Die
Plasmide pUR7704 und pUR7706 wurden durch Verdau mit HpaI linearisiert,
welches die Integration der Plasmide auf die Hefe-rDNA-Region lenkt,
und danach unabhängig
voneinander in S. cerevisiae, Stamm SU50, durch Elektroporation
eingeführt.
Die Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit, in Abwesenheit von
Leucin zu wachsen, selektiert. Um die Expression der klonierten
AFP-III-Gene zu erreichen, wurden pUR7704 oder pUR7706 tragende
Transformanten zuerst 40 Stunden lang in flüssigem minimalem Medium bei
30°C gezüchtet und
danach 1:10 in frisch zubereitetem Induktionsmedium (Hefe-Extrakt
1%, Difco-Pepton 2%, Galactose 5%) verdünnt und bei 30°C weitere
48 Stunden lang inkubiert. Am Ende dieses Zeitraums wurden Proben
des Kultur-Überstands
auf ihre Fähigkeit,
das Wachstum von Eiskristallen zu hemmen, getestet.
-
Das
Wachstum von Eiskristallen wurde über den Verlauf einer 30-minütigen Inkubation
bei –6°C mikroskopisch
untersucht. Es war deutlich nachweisbar, dass Überstands-Proben, die aus Hefe
stammten, welche das synthetische AFP-III-Gen trug, eine hemmende
Wirkung auf das Eiskristall-Wachstum hatte, wenn sie mit ähnlichen
Kontroll-Proben verglichen wurden, die aus den Überständen von nicht-transformierten
Hefen oder von Hefen, die den Expressionvektor trugen, welchen aber
das synthetische AFP III-Gen fehlte, stammten. Jedoch war die Rekristallisations-Hemmungs-Aktivität des mit
Hefe erzeugten Materials wesentlich geringer als die einer äquivalenten
Menge des Fisch-AFP-Präparats.
-
Für eine weitere
Analyse des erzeugten Frostschutz-Peptids wurden 10 ml-Proben aus
der induzierten Kultur von pUR7704 und pUR7706-Transformanten 5
min lang bei 4000 U/min zentrifugiert und die Zellen und die Überstände gesammelt
und bei –20°C gelagert.
Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese wurde verwendet,
um die Proteine zu trennen, und das AFP wurde mittels Western Blot
unter Verwendung eines anti-AFP-spezifischen monoklonalen Antikörpers detektiert.
-
Das
Vorhandensein einer Bande mit einem apparenten Molekulargewicht
von 6,5 kD in den Überstands-Proben
von der pUR7704 und pUR7706 tragenden Hefe-Transformante zeigt deutlich,
dass diese Transformanten zur Produktion von AFP-III fähig sind.
Das Peptid wurde mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt, und die N-terminale Sequenz
wurde bestimmt. Diese Sequenz zeigte, dass das HPLC-1-Peptid von
der Hefe korrekt prozessiert und sezerniert war.
-
Beispiel 4. Identifizierung
des aktivsten Aalmutter-Frostschutz-Peptid-Subtyps.
-
Isoformen
von AFP-III wurden unter Verwendung eines zweistufigen Verfahrens
gereinigt. Zuerst wurde die Probe auf eine Kationen-Austausch-Mono-S-Säule geladen
und unter Verwendung des beschriebenen Gradienten eluiert. Das Elutionsmuster
ist in 10 gezeigt. Ein nicht-retardierter
Peak (der Q-Peak) und vier eluierte Peaks (S1 bis S4) wurden von
der Säule
isoliert. S1 stellt das Protein mit der niedrigsten Bindungskapazität an die
Mono-S-Kationen-Austausch-Säule
unter diesen Bedingungen dar, und S4 enthält das Protein mit der höchsten Bindungskapazität an die
Säule.
Die Peaks wurden gesammelt und auf eine RP-HPLC-Säule unter
Verwendung des beschriebenen Gradienten geladen. Das Chromatogramm
vom gesamten Material ist in 11 gezeigt.
Die Peaks sind die AFP-III-Isoformen und haben die Nummern 1 bis
12 gemäß ihrem
Verhalten auf dieser Säule
unter Verwendung der spezifisch angegebenen Bedingungen. Alle AFP-III-Isoformen eluieren
zwischen 25 und 45 Minuten. Die RP-HPLC-Chromatogramme der Q- und S1 bis S4-Fraktionen
sind in den 12 bis 16 gezeigt.
Die Fraktionen ergeben jeweils unterschiedliche AFP-III-Isoformen,
und welche AFP-Isoform in jedem Peak enthalten war, ist in Tabelle
2 zusammengefasst. Die von den Mono-S- und RP-HPLC-Säulen gesammelten
Fraktionen wurden mit Maus-anti-AFP-III-Antiserum getestet, und
alle Isoformen von S1 bis S4 ergaben eine positive Reaktion auf
das S-Typ-Antiserum, die Isoform 12 aus der Q-Gruppe reagierte positiv
auf das Q-Typ-Antiserum. Die N-terminale
Aminosäure-Sequenz
wurde aus fünf
der Isoformen bestimmt (Tabelle 3). Der AFP-III-HPLC-7-Peak war
mit Fisch-Lysozym verunreinigt, doch die anderen identifizierten
Aminosäure-Sequenzen konnten
auf die bekannten Sequenzen der AFP-III-Isoformen bezogen werden.
Gleiche Mengen der gereinigten Proteine wurden auf Frostschutz-Aktivität getestet.
-
Wie
durch den Rekristallisations-Hemmungs-Test gezeigt, wies nur die
HPLC-12-Isoform von AFP III eine signifikante Frostschutz-Aktivität auf. Um
dieses Ergebnis zu bestätigen,
wurden Aalmutter-AFP-III-Isoformen in Anwesenheit und Abwesenheit
der HPLC-12-Isoform rekonstituiert. Das vollständig rekonstituierte Peptid-Präparat behielt
die Aktivität
des rohen Fisch-Präparats
bei, wogegen das Präparat,
dem die HPLC-12-Isoform fehlte, eine stark reduzierte Frostschutz-Aktivität zeigte,
wie durch den Rekristallisationstest bewiesen.
-
Unter
Verwendung eines Trypsin-Verdaus der Isoform 12 wurde die gesamte
Aminosäure-Sequenz dieser
Isoform bestimmt. Es zeigte sich, dass die Sequenz mit jener, die
in der Literatur (Davies und Chow, 1990) beschrieben ist, identisch
ist.
-
Beispiel 5. Konstruktion
eines synthetischen Gens, das für
die HPLC-12-Variante von Typ-III-AFP codiert.
-
Eine
Nukleotid-Sequenz, die für
das HPLC-12-Frostschutz-Peptid codiert, verbunden mit der Invertase-Signal-Sequenz
und unter Codon-Verwendung, optimiert für die Expression in Saccharomyces
cerevisiae, wurde wie folgt konstruiert: ein Satz von 15 Oligonukleotiden
wurde synthetisiert (HPLC12.1, HPLC12.2, HPLC12.3, HPLC12.4, HPLC12.5,
HPLC12.6, HPLC12.7, HPLC12.8, HPLC12.9, HPLC12.10, HPLC12.11, HPLC12.12,
HPLC12.13, HPLC12.14 und HPLC12.15), welche hauptsächlich die
DNA-Sequenz des reifen AFP enthielten, das in vorzugsweise verwendeten
S. cerevisiae-Codons
exprimiert wird. Das synthetische Gen wurde so entworfen, dass es
Einzelstrang-Regionen enthält,
die mit von SacI und HindIII erzeugten klebrigen Enden kompatibel
sind (17).
-
Für den Zusammenbau
des synthetischen HPLC-12-Gens wurden 50 pmol von jedem der Oligonukleotide
in 12 μl
Wasser gelöst,
2 min lang bei 95°C
inkubiert und direkt auf Eis platziert. Nach diesem Denaturierungsschritt
wurden die Oligonukleotide in einem Endvolumen von 20 μl, enthaltend
2,5 mM ATP, 5 mM DTT und etwa 10 E Polynukleotid-Kinase, 40 min
lang bei 37°C
phosphoryliert, wonach sie 2 Minuten lang bei 95°C denaturiert und auf Eis platziert
wurden. 10 μl
jedes phosphorylierten Oligonukleotids wurden mit ihrem am meisten
komplementären
DNA-Oligonukleotid gemischt, um eine Duplex-Bildung zu erhalten.
Nach 2-minütiger
Inkubation bei 95°C
zwecks Denaturierung wurde jeder Duplex langsam auf 30°C abgekühlt. Wiederum wurden
10 μl aller
Duplex-Mischungen
gepoolt und in einem Endvolumen von 100 μl, enthaltend 50 mM Tris/HCl,
pH 7,5, 8 mM MgCl2, 8 mM DTT und 40 μg/ml Gelatine
und 10E DNA-Ligase, 2 Stunden lang bei 20°C inkubiert. Die Ligationsmischung
wurde dann ausgefällt
und in 30 μl
TE-Puffer wieder gelöst.
15 μl der Mischung
wurden auf ein 2% Agarose-Gel
gegeben, und die DNA-Bande der erwarteten Größe (etwa 291 Basenpaare) wurde
aus dem Gel herausgeschnitten und schließlich durch das Gene Clean
II-Verfahren gemäß den Empfehlungen
der Lieferfirma gereinigt.
-
Dieses
Fragment wurde mit einem Vektor-Fragment ligiert, das vom multi-copy-Integrationsvektor pUR2778
durch Verdau mit SacI und HindIII abgeleitet war. Die Sequenz des
Inserts wurde bestätigt,
und das resultierende Plasmid wurde pUR7718 genannt (18).
-
Das
Plasmid pUR7718 wurde durch Verdau mit HpaI, das die Integration
des Plasmids zur Hefe-rDNA-Region führt, linearisiert und danach
in S. cerevisiae, Stamm SU50, durch Elektroporation eingeführt. Die resultierenden
Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit, in Abwesenheit von
Leucin zu wachsen, selektiert.
-
Um
die Expression des klonierten HPLC-12-Gens zu erreichen, wurden
pUR7718 tragende Transformanten zuerst 40 Stunden lang in flüssigem minimalem
Medium bei 30°C
gezüchtet
und danach 1:10 in frisch zubereitetem Induktionsmedium (Hefe-Extrakt
1%, Difco-Pepton
2%, Galactose 5%) verdünnt
und bei 30°C weitere
48 Stunden lang inkubiert. Am Ende dieses Zeitraums wurden Proben
des Kultur-Überstands
auf ihre Fähigkeit,
das Wachstum von Eiskristallen zu hemmen, getestet.
-
Die
Ergebnisse (Rekristallisations-Test) zeigen deutlich, dass die Kulturüberstände einen
hohen Grad an Frostschutz-Aktivität aufwiesen. Ein Vergleich
dieser Ergebnisse mit jenen, die für die Hefe-Expression der HPLC-1-Variante
erhalten wurden, zeigte, dass der Überstand von der Transformante,
die den geringsten Grad der HPLC-12-Frostschutz-Aktivität erzeugte,
größer war
als jener von der besten HPLC-1-Transformante.
-
Eine
fed-batch-Fermentation wurde mit einer SU50-Transformante, die pUR7718
trug, durchgeführt. Am
Ende der Einspeise-Phase
wurden die Zellen durch 30-minütiges
Zentrifugieren mit 4650 U/min (7200 g) in einer Jouan LR 5.22-Zentrifuge
unter Verwendung von 1 l-Kübeln
geerntet. Der Überstand
wurde durch den Rekristallisations-Hemmungs-Test auf Frostschutz-Aktivität getestet.
Nicht verdünnter Überstand
verhindert deutlich das Kristallwachstum, was das Vorhandensein
großer
Mengen des aktiven Frostschutz-Peptids im Kultur-Überstand
beweist.
-
Ein
Western Blot des Überstands
aus dieser Fermentation zeigte, dass AFPIII-HPLC12-Material sezerniert
war. Das apparente Molekulargewicht der von Hefe erzeugten HPLC12
war gleich jenem des von Fisch erzeugten HPLC12. Reinigung und Aminosäure-Sequenzierung des
von Hefe erzeugten Peptids bestätigte,
dass dieses Material von dem von Aalmutter erzeugten HPLC12-Peptid
nicht unterscheidbar war.
-
Literaturstellen:
-
- Campbell, I und Duffus, J.H., (1988) Yeast,
a practical approach. IRL press, Oxford.
- Chao, H., Davies, P.L., Sykes, B.D. und Sonnichsen, (1993) Use
of proline mutants to help solve the NMR solution structure of Type
III antifreeze protein. Protein Science 2 1411–1428.
- Chao, H., Sonnichsen, F.D., DeLuca, C.I., Sykes, B.D. und Davies,
P.L. (1994) Structure-function relationships in the globular type
III antifreeze protein: identification of a cluster of surface residues
required for binding to ice. Protein Science 3 1760–1769.
- Chung, C.T., Niemela, S,L., Miller, R.H., (1989), One-step preparation
of competent E. coli: Transformation and storage of bacterial cells
in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86; 2172–2175.
- Davies, P. L. und Chow, H. L., (1990), Biochemistry of fish
antifreeze proteins, The FASEB. Journal 4 R2460–2468.
- Driedonks, R.A., Toschka, H.Y. Von Almkerk, J.W. Schäffers und
Verbakel, J.M.A. (1995) Expression and secretion of antifreeze peptides
in the yeast Saccharomyces cerevisiae Yeast 11.
- Egli, T. (1980), Wachstum von Methanol assimilierenden Hefen,
PhD Thesis, Zürich
Nr. 6538.
- van den Elzen et al. (1985) Plant Mol Biol., 5: 149–154.
- Erhart, E., Hollenberg, C. P., (1981), Curing of Saccharomyces
cerevisiae 2μm
DNA by transformation. Curr. Genet., 3, 83–89.
- Fletcher, G.L. Hew, C.L. Joshi, S.B. und Wu, Y. (1994) Antifreeze
polypeptide-expressing microorganisms useful in fermentation and
frozen storage of foods. US Patent application.
- Gasson, M.J., (1993), Progress and potential in the biotechnology
of lactic acid bacteria F.E.M.S. microbiology Reviews 12 3–20.
- Hanahan, (1988) Ann. Rev. Genetics 22: 479–519.
- Hew, C.L. Slaughter, D., Shashikant, B.J., Fletcher G.L. und
Ananthanarayanan V.S. (1984) Antifreeze peptides from the Newfoundland
Ocean Pout Macrozoarces americanus: presence of multiple and compositionally diverse
components. J. Comp Physiol B. 155, 81–88.
- Hew, C. L., Wang, N-C., Joshi, S., Fletcher, G. L., Scott, G.
K., Hayes, P. H., Buettner, B. und Davies, P. L., (1988), Multiple
genes provide the basis for antifreeze protein diversity and dosage
in Ocean Pout. J. Biol. Chem. 263, 12049–12055.
- Keulers, M., (1993) PhD -Dissertation, Technische Universität Eindhoven
- Li, X., Trinh, K. Y. und Hew, C. L. (1992), Expression and characterization
of an active and thermally more stable recombinant antifreeze polypeptide
from Ocean Pout, Macrozoarces americanus, in Escherichia coli: improved
expression by modification of the secondary structure of the mRNA.
Protein Engineering 4 995–1002.
- McKown, R.L. und Warren G.J. (1991) Enhanced survival of yeast;
expressing an antifreeze gene analogue after freezing. Cryobiology
28, 474–482.
- Romanos, M. A., Scorer, C. A. und Clare, J. J., (1992), Foreign
Gene expression in yeast: a review, Yeast 8 423–488.
- Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., (1989). Molecular
cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
- Sanger, F., Nicklen, S. und Coulson, A.R. (1977), DNA sequencing
with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:
5463–5467.
- Sonnichsen, F. D., Sykes, B. D., Chao, H. und Davies, P.L.,
(1993), The non-helical structure of antifreeze protein type III, Science
259, 1154–1157.
- Toschka H. Y., Verbakel, J.M., Almkerk J.W.. (1992), PCT-Patentanmeldung
WO94/03617 mit Priorität
vom 29. Juli 1992 der holländischen
Patentanmeldung 92202338.7 Process for producing Antifreeze Peptides
(AFP's).
- Van Gorcom, R. F. M., Hessing, J. G. M., Maat, J. und Verbakel,
J. M. A., (1991) Xylanase Production. Internationales Patent WO
91/19782.
- Verbakel, J. M. A., (1991), Heterologous gene expression in
the yeast Saccharomyces cerevisiae. PhD.-Dissertation, Universität Utrecht.
- Warren, G.J., Hague, C.M., Corroto, L.V. und Mueller, G.M. (1993)
Properties of engineered antifreeze peptides. FEBS Letters 321,
116–120.
- Yanisch-Perron, C., Viera, J., Messing, J., (1985), Improved
M13 phage cloning vectors and host strains: Nucleotide sequence
of the M13 mp18 and pUC19 vectors. Gene 33, 103–119.
-
Figurenbeschreibung
-
1 Isoformen
von Typ-III-AFP. Die umrandeten Bereiche stellen Bereiche der Identität dar, und
die schattierten Aminosäuren
sind jene, die als wichtig für
die Frostschutz-Eigenschaften des Peptids identifiziert wurden.
-
2 Synthetisches
Gen, das für
AFP-Typ-III-HPLC1 codiert.
-
3 Schematische
Darstellung der Konstruktion von pUR7700, einem Plasmid, das das
synthetische AFP-III-Gen trägt.
-
4 Restriktionskarte
des Hefe-Expressionsvektors pUR2778.
-
5 Schematische
Darstellung der Konstruktion von pUR7701, einem Plasmid, das die
Invertase-Signal-Sequenz trägt.
-
6 Schematische
Darstellung der Konstruktion von pUR7702, einem Plasmid, das das
synthetische AFP-III-Gen, in frame mit der Invertase-Signal-Sequenz
verbunden, trägt.
-
7 Schematische
Darstellung der Konstruktion von pUR7703, einem Plasmid, das das
synthetische AFP-III-Gen, mit der mating-Faktor-pre-pro-Sekretions-Signal-Sequenz
in frame fusioniert, trägt.
-
8 Schematische
Darstellung der Konstruktion des Plasmids pUR7704, einem multi-copy-rDNA-Integrations-Vektor,
der das synthetische AFP-III-Gen, in frame mit der Invertase-Signal-Sequenz
verbunden, trägt.
-
9 Schematische
Darstellung der Konstruktion des Plasmids pUR7706, einem multi-copy-rDNA-Integrations-Vektor,
der das synthetische AFP-III-Gen, in frame mit der pre-pro-mating-Faktor-Signal-Sequenz verbunden,
trägt.
-
10 Das
Elutionsmuster von Aalmutter-Frostschutz-Peptiden von einer Mono-S-Säule.
-
11 Chromatogramm
von Frostschutz-Peptiden, mittels Umkehrphasen-HPLC getrennt.
-
12 Chromatogramm
von Mono-S-S1-Frostschutz-Peptiden, mittels Umkehrphasen-HPLC getrennt.
-
13 Chromatogramm
von Mono-S-S2-Frostschutz-Peptiden, mittels Umkehrphasen-HPLC getrennt.
-
14 Chromatogramm
von Mono-S-S3-Frostschutz-Peptiden, mittels Umkehrphasen-HPLC getrennt.
-
15 Chromatogramm
von Mono-S-S4-Frostschutz-Peptiden, mittels Umkehrphasen-HPLC getrennt.
-
16 Chromatogramm
von Mono-S-S1-Frostschutz-Peptiden, mittels Umkehrphasen-HPLC getrennt.
-
17 Synthetisches
Gen, das für
Typ-III-AFP-HPLC12-Invertase-Signal-Sequenz-Fusionsprotein codiert.
-
18 Schematische
Darstellung von Plasmid pUR7718.
-
Tabelle
1 AFP-III
enthaltende Plasmide
-
Tabelle
2: Mono-S-Fraktionen enthaltende AFP-III-3 Isoformen
-
Tabelle
3: N-terminale
Aminosäure-Sequenz
von AFP-III-Isoformen Lysozym von Aalmutter, das zuvor als AFP-3-Isoform
7 bezeichnete Peptid:
-
Tabelle
4: Aminosäuren-Sequenz
tryptischer Peptide von AFP-III-Isoform
Nr. 12.
