AT396940B - Neue endotoxin-proteine aus bacillus thuringiensis - Google Patents
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Description
AT 396 940 B
Bacillus thuringiensis (B. L) ist ein sporulierendes Bakterium, das am Ende des vegetativen Stadiums des Wachstums ein proteinartiges kristallines delta-Endotoxin produziert. Bei der Einnahme durch bestimmte Insekten erzeugt dieses Endotoxin toxische Wirkungen, die einen Stillstand der Nahrungsaufnahme, Fehlfunktion des Gastrointestinal-Traktes, Austrocknen und letztendlich den Tod zur Folge haben. Das delta-S Endotoxin stammt im allgemeinen von einem Plasmid und wird als inaktive Vorstufe oder Protoxin mit einem Molekulargewicht von 130.000 bis 140.000 Dalton hergestellt (Calabrese, Canad. J. MicrobioL 2£ (1980) 1006). Normalerweise findet im Insektendarm als Ergebnis der Einwirkung der Daim-Proteasen eine proteolytische Spaltung statt, wobei etwa die zum C-terminalen Ende gelegene Hälfte sowie möglicherweise einige Aminosäuren am N-terminalen Ende entfernt werden. Diese Spaltung ist erforderlich, um das aktive 10 Toxin mit einem Molekulargewicht von 65.000 bis 70.000 Dalton herzustellen (Tyrell et al., J. Bacteriology 145(1981) 1052).
Eine große Zahl von Unterarten (Subvarietäten) von B. t sind identifiziert worden. Obwohl die meisten davon eine spezifischere oder erhöhte Toxizität gegenüber Insekten der Ordnung Lepidoptera zeigen, konnte belegt werden, daß eine begrenzte Zahl von ihnen auch toxisch gegenüber Insekten anderer Klassen sind. 15 Beispielsweise weist B. t israelensis Toxizität gegenüber Diptera-(Zweiflügler-)Larven (Moskitos und Schwarze Fliegen) auf. Außerdem wurden jüngst zwei andere Unterarten identifiziert, die Toxizität gegenüber Coleoptera-Larven zeigen (Hofte et al., Nuc. Acid. Res. 15 (17) (1987) 7183).
Obwohl viel Arbeit in der Herstellung verkürzter Toxine und Strukturgene, die für diese kodieren, geleistet wurde, scheint weniger über die Fähigkeit der delta-Endotoxine von B. L, Punktmutationen im aktiven 20 oder toxischen Bereich der Endotoxin-Sequenz zu überstehen, und über die Wirkung solcher Mutationen auf die
Aktivität des Toxinmoleküls bekannt zu sein.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Mutanten des aktiven Abschnitts der delta-Endotoxine von B. t. bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Mutationen, die wirksam sind in 25 der gezielten Bildung einer dem B. t.-Endotoxin gleichen Aktivität sowohl in abgespaltenen delta-Endotoxin-Formen als auch in solchen voller Länge.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Mutationen bereitzustellen, die die insektizide Aktivität von B. L-delta-Endotoxin-Strukturen erhöhen.
Nach der zufälligen Bildung vereinzelter und vielfacher Punktmutationen in vielen hundert DNA-30 Strängen, die für einen großen Abschnitt des aktiven Teils eines respräsentativen B. L-Endotoxins kodiert, das insektizide Aktivität gegen Lepidoptera aufweist, wurden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durch Rekombinationsverfahren verschiedene Mutanten von B. t.-Endotoxinen isoliert und hergestellt, die die charakteristische insektizide Aktivität gegen Lepidoptera zeigen, die auch das B. L-delta-Endotoxin des Wild-Typs aufweist. Darüberhinaus deutet es sich an, daß die Codons, die für jede beliebige 35 andere natürliche Aminosäure kodieren, an diesen entdeckten Mutationspunkten substituiert werden können, um das aktive Endotoxin-Protein herzustellen. Es wurde auch gefunden, daß eine Anzahl der zufälligen Mutationen zu einer höheren insektiziden Aktivität führen. Eine solche Aktivität kann beispielsweise in dem Test an dem Tabak-Knospenwurm (Heliothis virescens) oder dem Test an Trichoplusia ni (Kohlspinner), wie sie nachfolgend beschrieben werden, gezeigt werden. In vielen Fällen war dieser Anstieg insofern ganz 40 bemerkenswert, als eine Aktivität erreicht wurde, die wenigstens zweimal oder ein Mehrfaches größer ist als die Aktivität der Ausgangs-Endotoxinstruktur. Vielfach-Mutationen (üblicher Weise zwei oder drei Aminosäuren pro mutiertem DNA-Strang) wurden auch einzeln und in verschiedenen Kombinationen bewertet, um bestimmte noch wirkungsvollere Mutationen und deren Kombinationen zu identifizieren, Es wurde auch herausgefunden, daß die Mutationen im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit einer Ausnahme innerhalb der 45 Aminosäuresequenz-Bereiche liegen, die in hohem Maße bei einer großen Vielzahl von B. L-delta-Endotoxinen des Wild-Typs erhalten bleiben. Es deutet sich also die allgemeine Anwendbarkeit der durch die Erfindung bereitgestellten Mutationen auf eine große Vielzahl von Endotoxinstrukturen an, in denen solche erhaltenen Bereiche insektizide B. L-Endotoxine ergeben.
Insbesondere wird auf die Aminosäure-Sequenz und deren Numerierung in der weiter unten folgenden Figur 50 6 verwiesen. Die in der Figur 6 angegebene Aminosäure-Sequenz beginnt mit dem Rest Methionin (Met) an
Position No. 1 und dem N-Ende des in Figur 6 gezeigten, gegen Lepidoptera aktiven repräsentativen Endotoxins. Es wurde gefunden, daß das B. L-Endotoxin-Protein, das sonst insektizide Aktivität gegen Lepidoptera-Insekten in der Weise wie native B. L-Endotoxine aufweist, wenn diese innerhalb des aktiven Abschnitts eine Aminosäure-Restsequenz enthalten, die die gleiche ist wie oder im wesentlichen homolog ist 55 zu der in Figur 6 gezeigten Sequenz für die 116 Aminosäure-Reste umfassende Sequenz der Positionen einschließlich 90 bis einschließlich 205 (auch Aminosäure-Positionen m-1 bis m-116), eine oder mehrere Reste der folgenden Aminosäuren an den angegebenen oder äquivalent homologen Positionen aufweisen kann, wobei die Zahlen der m-Positionen in Klammem unter Bezugnahme auf die 116 Aminosäure-Reste umfassende Sequenz angegeben sind: a) an Position 94 (Position m-5 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz jede natürliche Aminosäure, die durch den genetischen Code kodiert wird, mit Ausnahme von Asn; -2- 60
AT396940B b) an Position 95 (Position m-6 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Gin; c) an Position 101 (Position m-12 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Glu; d) an Position 105 (Position m-16 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Asn; e) an Position 116 (Position m-27 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Glu; f) an Position 119 (Position m-30 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Ala; g) an Position 122 (Position m-33 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Thr; h) an Position 123 (Position m-34 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Asn; i) an Position 125 (Position m-36 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Ala; j) an Position 130 (Position m-41 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Met; k) an Position 184 (Position m-95 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Phe; l) an Position 187 (Position m-98 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Ala; m) an Position 188 (Position m-99 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Thr; n) an Position 194 (Position m-105 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme γοη Asn; o) an Position 201 (Position m-112 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Gly.
Darüberhinaus schließt die Erfindung, ebenfalls unter Bezugnahme auf die numerierte Aminosäurerest-Sequenz in Figur 6, den Wechsel der Aminosäure Asn an der Aminosäure-Position 4 zu jeder anderen natürlichen Aminosäure ein, die durch den genetischen Code kodiert wird.
Im nachfolgenden wird wiederum auf die gesamte Vollsequenz Bezug genommen, wie sie in Figur 6 gezeigt wird, wie auch auf die 116 Reste umfassende Sequenz. In Hinblick auf die Aminosäure-Reste, die erfindungsgemäß innerhalb der 116 Reste umfassenden Sequenz bereitgestellt werden, ist es in Übereinstimmung mit der Erfindung bevorzugt, daß eine solche Sequenz durch eine oder mehrere der nachfolgend genannten Aminosäure-Reste an den genannten Positionen charakterisiert ist: a) Lys an Position 94 (Position 5 der 116 Reste umfassenden Sequenz); b) Lys an Position 95 (Position 6 der 116 Reste umfassenden Sequenz); c) Lys an Position 101 (Position 12 der 116 Reste umfassenden Sequenz); d) Tyr an Position 105 (Position 16 der 116 Reste umfassenden Sequenz); e) Lys oder Arg, bevorzugter Arg, an Position 116 (Position 27 der 116 Reste umfassenden Sequenz); f) Thr an Position 119 (Position 30 der 116 Reste umfassenden Sequenz); g) Ile an Position 122 (Position 33 der 116 Reste umfassenden Sequenz); h) Tyr an Position 123 (Position 34 der 116 Reste umfassenden Sequenz); i) Val an Position 125 (Position 36 der 116 Reste umfassenden Sequenz); j) Ile an Position 130 (Position 41 der 116 Reste umfassenden Sequenz); k) Ile an Position 184 (Position 95 der 116 Reste umfassenden Sequenz); l) Thr an Position 187 (Position 98 der 116 Reste umfassenden Sequenz); m) Ser an Position 188 (Position 99 der 116 Reste umfassenden Sequenz); n) Lys an Position 194 (Position 105 der 116 Reste umfassenden Sequenz); o) Asp an Position 201 (Position 112 der 116 Reste umfassenden Sequenz).
Wenn der Rest Asn an der Aminosäure-Position 4 ausgetauscht wird, ist es bevorzugt, daß er gegen Tyr getauscht wird.
Figur 6 am Ende dieser Beschreibung zeigt eine Nucleotid-Sequenz und die resultierende davon abgeleitete Aminosäure-Sequenz, die für die Herstellung des B. t.-delta-Endotoxins in der Natur verantwortlich ist. Mit einer Ausnahme wurde die Nucleotid-Sequenz aus einem delta-Endotoxin produzierenden Plasmid erhalten, das in B. t wuhanensis gefunden wurde. Insbesondere stammt das gesamte Strukturgen, das tatsächlich für das Endotoxin selbst kodiert, aus B. t. wuhanensis. Die eine Ausnahme besteht darin, daß die vor Methionin (Met) stehende Sequenz am Anfang des Strukturgens aus einem Endotoxin produzierenden Gen stammt, das in B. L -3-
AT 396 940 B kurstaki HD-1 gefunden wurde. Letzteres wird das 5,3 Kb umfassende Plasmid aus HD-1 der Hind III-Klassc genannt Diese am oberen Ende des Gens stehende Frequenz enthält die native ribosomale Bindungsstelle (Ribosomal Binding Site (RBS)) des Endotoxin produzierenden B. L kurstaki HD-l-Plasmids. Die am oberen Ende des Gens gelegene Sequenz, die die ribosomale Bindungsstelle enthält wie sie in B. t wuhanensis gefunden wurde, unterscheidet sich wenig von der in Tabelle A abgebildeten Sequenz für B. t kurstaki. Die Unterschiede werden später in der Beschreibung angegeben. Es ist allerdings zu berücksichtigen, daß sowohl das Nucleotid als auch die Aminosäure-Sequenzen in den jeweiligen Strukturgenen von B. t wuhanensis und B. L kurstaki HD-1 vom Anfang der Endotoxin-Sequenz den ganzen aktiven Abschnitt hindurch bis wenigstens zur Kpn I-Stelle, wie sie in Figur 6 angegeben ist, identisch sind. Die Kpn I-Stelle liegt im Protoxin-Abschnitt. Folglich wird der aus der Spaltung nach Aufnahme durch das Insekt resultierende aktive Toxin-Abschnitt sowohl für das aus B. L wuhanensis als auch für das aus B. L kurstaki HD-1 stammende Endotoxin derselbe sein. In Figur 6 sind die Aminosäuren für das Endotoxin-Protein, die als Resultat der Expression des Strukturgens produziert werden, mit positiven Zahlen 1 bis 1181 (unter der jeweiligen Aminosäure angegeben) angegeben. Die Aminosäuren im untranslatierten Bereich in der Kette vor dem 1-Met-Rest sind mit negativen Zahlen in rückwärtiger (oder Ketten aufwärts) Richtung numeriert, wobei die Stop-Signale als eine Aminosäure-Position gezählt sind. Nucleotide im Strukturgen sind (nicht in Klammem) oberhalb der Reihe numeriert, in der sie erscheinen. Die letzte Ziffer in der Bezifferung steht oberhalb des Nucleotids, auf das die Nummer zutrifft. Nucleotide im untranslatierten Bereich der auch die ribosomale Bindungsstelle einschließt, sind negativ numeriert, wobei die Numerierung von initiierenden ATG-Codon (für den Rest 1-Met) rückwärts zählt.
Innerhalb der oben angegebenen numerierten Sequenzen ist ein Teil mit den Bezeichnungen m-1 bis m-116 für die Aminosäuren und n-1 bis n-348 für diese Aminosäuren kodierenden Nucleotide separat oder unternumeriert. So wird besonders ein in hohem Maße gleichbleibender Abschnitt bezeichnet, in dem · wie gefunden wurde - die meisten der durch die Erfindung induzierten Mutationen liegen. Bestimmte Restriktions-Stellen in der Nucleotid-Sequenz in Figur 6 werden durch eine Linie oberhalb der Nucleotide angezeigt, die an den Restriktions-Stellen beteiligt sind. In einer Fußnote wird die spezielle Stelle bezeichnet Der toxische Teil des in Figur 6 gezeigten Endotoxins, wie er schon aus dem Stand der Technik bekannt ist schließt die Aminosäure-Sequenz ein, die bei der Aminosäure-Position 1 (Met) beginnt und sich bis zur Aminosäure-Position 610 (Thr) erstreckt. In Hinblick auf die Natur der gesamten in Figur 6 gezeigten DNA-Sequenz und zum leichteren Verständnis der nachfolgenden Beschreibung ist anzumerken, daß die DNA- und Aminosäure-Sequenzen, beginnend mit dem untranslatierten Teil in Zeile 1 von Figur 6 und fortlaufend bis zur Kpn I-Stelle etwa bei den Aminosäure-Positionen 724 bis 725 und auch Teile davon als von B. t. kurstaki HD-1 (dem 5,3 Kb umfassenden Plasmid der Hind ΙΠ-Klasse) bezeichnet werden können und auch so bezeichnet werden.
Figur 1 zeigt eine Genkarte der allgemeinen Arbeits-Plasmide prAK und prAK-3, wie sie in verschiedenen Stufen in Zusammenhang mit der Erfindung verwendet wurden. Figur 1 umfaßt die DNA, die für das abgespaltene B. t-Endotoxin kodiert, das von B. t. kurstaki HD-1 erhalten wurde und insektizide Aktivität gegenüber Lepidoptera aufweist.
Figur 2 zeigt eine Genkarte des Plasmids pB8rII, die die DNA umfaßt, die für das abgespaltene B. L-Endotoxin-Protein etwas größerer Länge kodiert als das, für das prAK kodiert. Dieses wurde ebenfalls aus B. t kurstaki DH-1 erhalten und weist ebenfalls insektizide Aktivität gegen Lepidoptera auf.
Die Figuren 3a und 3b zeigen zwei repräsentative doppelsträngige DNA-Stränge, die zur Durchführung der sogenannten "Codon-Spin-Experimente" synthetisiert werden können und auch nützlich sind für die bequeme Einführung der gewünschten Mutationen in eine für das B. t-Endotoxin kodierende DNA-Sequenz.
Figur 4 zeigt eine Genkarte des Plasmids pBT210, die die DNA umfaßt, die für das native Endotoxin aus B. t wuhanensis in voller Länge kodiert. Dieses Endotoxin hat in seinem aktiven Abschnitt genau die gleiche Aminosäure-Sequenz wie das Endotoxin aus B. t. kurstaki HD-I, für das die Plasmide prAK und pB8rII kodieren.
Figur 5 zeigt eine abgekürzte Genkarte des Plasmids prAK-9 zusammen mit einer vergrößerten Abbildung eines daraus entnommenen Abschnitts. Das Plasmid prAK-9 ist ansonsten im einzelnen dem Plasmid prAK-3 sehr ähnlich. Der genannte Abschnitt und Unterabschnitte davon in den Stamm-Plasmiden sind ausgesprochen nützlich zur Durchführung der sogenannten "Codon-Spin-Experimente" und darüber hinaus für die Einführung von Mutationen gemäß der Erfindung.
Figuren 6(a) bis 6(f) zeigen eine Nucleotid-Sequenz (wie oben beschrieben) und die resultierende davon abgeleitete Aminosäure-Sequenz die für die Herstellung des B. L-delta-Endotoxins verantwortlich ist.
Das Plasmid prAK wurde in E. coli JM 103 bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois (USA), am 19. Februar 1988 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL B-18329.
Das Plasmid pB8rII wurde in E. coli JM 103 bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Preoria, Illinois (USA), am 19. Februar 1988 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL B-18330.
Das Plasmid pBT210 wurde in E. coli JM 103 bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Preoria, Illinois (USA), am 19. Februar 1988 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL B-18330.
Wie bereits angegeben, können die Punkt-Mutationen gemäß der Erfindung auf Endotoxin-Protein-Sequenzen angewandt werden, die von den Arten und Unterarten von Bacillus thuringiensis produziert werden. -4-
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Diese Sequenzen weisen insektizide Aktivität gegen Larven von Lepidoptera auf, wenn sie die oben angegebene, 116 Aminosäure-Reste umfassende konservative Sequenz oder eine Sequenz, die mit dieser in hohem Maße homolog ist, oder eine damit im wesentlichen äquivalente Sequenz enthalten. Dies schließt Endotoxin-Protein-Sequenzen ein, die vom Typ her die natürliche volle Länge aufweisen oder im wesentlichen die volle Länge auf weisen. Eingeschlossen sind auch solche Sequenzen, von denen durch Entfernung des gesamten, zum Ende liegenden Piotoxins oder eines Teils davon oder eines inaktiven Abschnitts davon ein Teil abgetrennt wurde. Eingeschlossen sind sogar solche Sequenzen, aus denen ein Teil vom zum C-terminalen Ende liegenden Ende bis hinein in den aktiven Abschnitt des Endotoxins abgetrennt wurde.
Wie sich bereits daraus deutlich ergibt, haben die Endotoxine aus B. L kurstaki und B. L wuhanensis beide den identischen, 116 Aminosäure-Reste umfassenden konservativen Abschnitt. Andere Endotoxine haben dieselbe, 116 Aminosäure-Reste umfassende Sequenz oder ein dazu weitgehend homologes Äquivalent, oder es kann erwartet werden, daß sie dieses aufweisen. Es ist beispielsweise bekannt, daß sich aus Endotoxinen aus B. t. sotto, B. L kurstaki HD-73-Stamm und B. L galleriae Endotoxine mit der identischen, 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz erhalten lassen, wenn auch einige von diesen Endotoxinen zumindest in gewissem Umfang, in Einzelfällen auch signifikant, sowohl hinsichtlich des Anteils des toxischen Abschnitts des Endotoxins als auch hinsichtlich des Protoxin-Abschnitts unterschiedlich sind. Andere Endotoxine, beispielsweise solche von B. t. kurstaki HD-1 Dipel (ein kommerziell erhältlicher Unterstamm), enthalten eine ausgetauschte Aminosäure in der genannten 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz (m-59 ist Leu; dieser Rest wird kodiert TTG) und enthalten andere Änderungen, Streichungen und/oder Zufügungen in anderen Teilen der Sequenz. Diese und andere Sequenzen, von denen herausgefunden wurde, daß sie einen oder mehrere Änderungen in der Sequenz, aber eine Homologie in den Aminsosäure-Resten von wenigstens 70 % im Vergleich mit der genannten, 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz aufweisen, können einen oder mehrere mutationsbedingte Änderungen gemäß der Erfindung aufweisen, die an den Aminosäure-Resten in der Sequenz durchgeführt wurden, wobei diese identisch der Aminosäure in der 116 Aminosäure-Reste umfassenden, nicht mutierten Sequenz entsprechen. Dies ist insbesondere dann möglich, wenn die auszutauschende Aminosäure auf jeder ihrer Seiten zwei und bevorzugt vier andere Aminosäure-Reste auf weist, die ebenfalls identisch den Resten in der 116 Aminosäure-Rest umfassenden Sequenz entsprechen.
Es entspricht ebenfalls der Erfindung, daß die erfindungsgemäßen Mutationen an entsprechenden Aminosäure-Resten in homologer Serie durchgeführt werden können, die im wesentlichen Streichungen oder Hinzufügungen in der Weise enthalten, daß die Sequenz selbst kürzer oder länger ist als die angegebene 116 Aminosäure-Reste umfassende Sequenz. In solchen Fällen bleibt die Numerierung, wie sie in der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Referenz-Sequenz gewählt wurde, bestehen, so daß Streichungen in der zu ändernden Sequenz so gezählt werden, als ob die Reste tatsächlich noch präsent seien und Hinzufügungen in der zu ändernden Sequenz einfach nicht gezählt werden. Es kann davon gesprochen werden, daß die Zuordnung der Positionen der Aminosäuren unabhängig von Streichungen oder Hinzufügungen in solch einer homologen Sequenz gemacht wurden.
Vorzugsweise sind die homologen Aminosäure-Sequenzen, in die die imitativen Änderungen gemäß der Erfindung eingebaut werden, diejenigen, für die eine DNA kodiert, zu der eine DNA entweder aus dem rechtsläufigen oder dem gegenläufigen Strang (oder einem doppelten Strang) der mit der Position n-1 beginnenden und sich bis zur Position n-348 in Figur 6 erstreckenden DNA unter strengen Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, wenn für die Aminosäure-Reste der zu mutierenden homologen Sequenz, die denen in der oben bezeichnten, 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz entsprechen, dasselbe Codon kodiert wie für die entsprechende Aminosäure in der Referenz-Sequenz. Verfahren zur Herstellung einer solchen Leit-Hybridisierungsprobe sind im Stand der Technik bekannt. Strenge Hybridisierungsbedingungen sind Bedingungen, bei denen die Hybridisierung bei 60 °C in einem 2,5 X-Kochsalz-Citrat-Puffer (SSC-Puffer) durchgeführt wird und die Probe danach nur noch bei 37 °C und reduzierter Puffer-Konzentration gespült wird, was die durchgeführten Hybridisierungsschritte nicht beeinträchtigt.
Bevorzugt werden die Mutationen in Aminosäure-Sequenzen durchgeführt, die nicht mehr als 1,2 oder 3 Unterschiede der Aminosäure-Reste von den Aminosäuren in der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Referenz-Sequenz aufweisen. Am meisten bevorzugt ist eine Sequenz, die mit der Referenz-Sequenz identisch ist.
Im Stand der Technik wurde bereits festgestellt, daß die 116-Aminosäure-Reste umfassende Referenz-Sequenz ein Abschnitt in anderer Weise im wesentlichen modifizierter oder verschiedener Endotoxin-Protein-Sequenzen sein kann, die insektizide Aktivität gegen Larven von Lepidoptera aufweisen. Andere Modifikationen außerhalb der Referenz-Sequenz werden ganz sicher als Kenntnisse der Offenbarung des Standes der Technik unentdeckt sein. Die Sequenzen, die den erforderlichen mutierten Sequenz-Abschnitt abgrenzen, der dem 116 Aminosäure-Reste umfassenden Referenzabschnitt analog ist, können also in großem Umfang variieren und müssen nur so beschaffen sein, daß sie das insektizid aktive Endotoxin-Protein bereitstellen können, wie es beispielsweise im Rahmen der insektiziden Aktivität gegen den Tabak-Knospenwurm gezeigt wurde. So kann die Aminosäure-Sequenz, die im Strang vor dem mutierten Abschnitt liegt, gekürzt sein oder verlängert sein oder selbst in Bezug auf die in Figur 6 gezeigte Sequenz mutiert sein. Sie -5-
AT396940B beginnt aber im allgemeinen mit dem Rest Methionin und ist - besonders bevorzugt · in hohem Maße (70 %) homolog oder identisch mit der in Figur 6 gezeigten Sequenz, obwohl es offensichtlich ist, daß eine solche Sequenz gegebenenfalls auch die bevorzugte Mutante in der 4-Position enthalten kann, wie sie ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird. In gleicher Weise kann der Abschnitt, der im Strang unterhalb des gewünschten mutierten Sequenz-Abschnitts liegt, in weitem Umfang variieren und kann in Relation zu seinem Anteil in Figur 6 bis zu dem Punkt, an dem die Spaltung im Insektendarm stattfindet, verkürzt oder verlängert sein. Der Abschnitt kann natürlich (oder braucht auch nicht) darüber hinaus in der Weise ausgedehnt sein, daß ein Protoxin oder ein inaktiver Abschnitt gebildet wird, der im Insektendarm unter Bildung eines insektizid aktiven Protein-Toxins abgespalten wird. DNA umfassende Sequenzen, die für die mutanten Endotoxine kodieren, wie sie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, werden unter Kontrolle geeigneter Regulator-Sequenzen in Plasmide eingebaut, wobei Expressions-Vektoren gebildet werden, die zur Produktion des Endotoxins in Zellen transformiert oder übertragen werden. Die Herstellung von Endotoxinen durch solche biotechnologischen Rekombinations-Techniken schließt - im Gegensatz zu beispielsweise der Herstellung von Arzneimitteln durch solche Techniken - wenig oder gar keine Aufarbeitung zur Reinigung des Endotoxins ein. Die Zellen, in denen das Endotoxin hergestellt wird, können lysiert werden. Es war jedoch in der Vergangenheit in der kommerziellen Produktion von B. t-Endotoxinen charakteristisch, einfach den gesamten Gehalt des Kulturoder Fermentations-Systems, das in der Herstellung des Endprodukts verwendet wurde, einzusetzen. Üblicherweise geschah dies nach Trocknen auch mit konventionellen Mitteln, beispielsweise Niedertemperatur-Sprühtrocknen, wie es im Stand der Technik bekannt ist. In Abhängigkeit vom Produkt können verschiedene Stoffe zur Verbesserung der Produkt-Stabilität zugesetzt werden, wie dies ebenfalls bekannt ist. Darüber hinaus können proteinartige Stoffe, sofern sie nicht in ausreichenden Mengen im Fermentationssystem zugegen sind, unabhängig voneinander mit dem Produkt vermischt werden, um die Stabilität zu erhöhen. Dies ist ebenfalls bekannt und betrifft beispielsweise Sojabohnen-Pulver oder entfettetes Sojabohnen-Pulver. Während die Endotoxine biotechnologisch in einer Vielzahl von transformierten oder transfektierten Zellsystemen hergestellt werden können, ist es im allgemeinen bevorzugt, entweder Bakterienzellen des gramnegativen oder des gram-positiven Typs zu transformieren oder transfeküeren. Eine bevorzugte Art gramnegativer Bakterien ist E. coli, mit dem schon große Erfahrung im Bereich der Biotechnologie erzielt werden konnte und für das eine große Vielzahl geeigneter und oparativ funktioneller Plasmide und Transfer-Expressionsvektor-Systeme bekannt und erhältlich sind.
Pseudomonas fluorescens stellt einen anderen Typ gram-negativer Bakterien dar, in die Plasmide, die Endotoxin-Sequenzen tragen, eingeschleust wurden.
Wie in der vorliegenden Anmeldung gezeigt wird, können Endotoxin produzierende Gene regulatorische Sequenzen, wie insbesondere Sequenzen mit ribosomalen Bindungsstellen einschließen. Diese haben ihren Ursprung in B. t wenn sie zur Expression in im wesentlichen heterologe Bakterienzellen, wie beispielsweise Zellen von E. coli, eingeschleust werden. Da Bakterien vom Typ "Bacillus" eine Umgebung schaffen, die für die mutanten Endotoxine der Erfindung ziemlich nahe verwandt der nativen Umgebung ist, liegt es insbesondere im Rahmen der vorliegenden Erfindung und ist durch diese beabsichtigt, Bakterien des Typs "Bacillus" mit Expressions-Vektoren zu transformieren oder zu transfektieren, die die DNA umfassen, die für die mutanten Endotoxine gemäß der Erfindung kodieren. Anschauliche Beispiele solcher Bacillus-Zellen von besonderem Interesse sind B. t-Zellen, B. cereus-Zellen und B. subtilis-Zellen. Eine deutlich verbesserte Verfahrensweise zur Transformierung von Bacillus-Zellen, insbesondere B. t.-Zellen, wurde kürzlich gefunden und ist in der anhängigen britischen Patentanmeldung 8729726 beschrieben. Zell-Typen die für die Transformation durch das Verfahren geeignet sind, schließen cry-minus-Typen, beispielsweise die bekannten B. L kurstaki cry B-Zellen ein, die keine Plasmide haben, sowie Bacillus-Zellen des Wild-Typs, wie beispielsweise native B. t.-Zellen, die Endotoxin produzierende Plasmide enthalten. Plasmide, die für die Einschleusung in Bacillus-Zellen, wie beispielsweise B. L-Zellen geeignet sind, sind bekannt. Darunter fällt beispielsweise das Plasmid pBC16.1 (Kreft et al„ Molec. Gen. Genet. (1978) 1£2 59) sowie seine Stammplasmide, die unter Einsatz herkömmlicher Rekombinations-Techniken in der Weise verwendet oder modifiziert werden können, daß sie die für das mutante Endotoxin kodierende Sequenz gemäß der Erfindung enthalten können. Wie aus dem Stand der Technik bekannt ist, produzieren Bacillus-Zellen in charakteristischer Weise Endotoxin in gewünschten Mengen nur im Stadium ihrer Sporenbildung (Sporulierung). Folglich läßt man sie bis zu diesem Stadium wachsen um in möglichst guter Weise die als Insektizid nützlichen Produkte zu erhalten. Die Plasmide oder Expressionsvektoren, die durch die Erfindung bereitgestellt werden und DNA für die mutanten Endotoxine tragen, können in Bacillus-Zellen eingeschleust werden, die entweder keine Endotoxin produzierenden Plasmide enthalten oder schon ein oder mehrere solcher Plasmide enthalten. Während die mutanten Endotoxine der Erfindung in charakteristischer Weise Aktivität gegen Lepidoptera zeigen, können die Produkte auch Endotoxin-Aktivität gegen Insekten anderer KlaSsen aufweisen. Dies kann darauf zurückzuführen sein, daß eine solche Aktivität schon in dem Stamm-Endotoxin vor der Mutation existierte. Es kann aber auch ein Resultat anderer zulässiger Sequenz-Änderungen sein. In jedem Fall liegt es im Bereich der vorliegenden Erfindung, Bacillus-Zellen mit Plasmiden gemäß der Erfindung zu transformieren, die gegen Lepidoptera toxische -6-
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Endotoxine produzieren, wenn solche Zellen-Plasmide für die Produktion von Endotoxinen tragen, die im wesentlichen nicht wirksam gegen Lepidoptera sind, um im Sporenbildungs-Stadium Endotoxine herzustellen, die die Bereitstellung breiter» Bereiche insektizider Wirksamkeit vereinen. Beispielsweise können Plasmide, die DNA-Sequenzen tragen, die für ein mutiertes Endotoxin kodieren, zur Transformierung von B. t israeliensis oder B. t. tenebrionis verwendet werden, die für sich im wesentlichen nicht wirksam gegen Lepidoptera sind. Während die vorliegende Erfindung sowohl unter Bezugnahme auf die verkürzten Endotoxin-Proteine als auch unter Bezugnahme auf die nativen Endotoxin-Proteine voller Länge dargelegt wurde, ist es im allgemeinen bevorzugt, wenn man die mutanten Endotoxine - wie oben beschrieben - unmittelbar als Insektizide verwendet, Sequenzen voller Länge einzusetzen oder herzustellen, die dieselben sind, wie die natürlichen Sequenzen oder diesen wenigstens im Hinblick auf die Möglichkeit nachgeahmt sind, eine Falt-Fähigkeit eines Endotoxin-Proteins zu erreichen, die der von dessen natürlicher Fähigkeit ähnlich ist, oder eine verbesserte Falt-Wirkung über die gesamte Länge zu erreichen.
Mutante DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch in das Genom einer Pflanze insertiert werden. In solchen Fällen ist es bevorzugt, daß die mutierten Sequenzen des verkürzten Typs eingesetzt werden, obwohl die Sequenzen voller Länge ebenfalls geeignet sind. Jedes geeignete Verfahren kann in vorteilhafter Weise für die Einschleusung der Endotoxin-Sequenzen in das Genom der Wirtspflanze verwendet werden. Geeignete Methoden sind beispielsweise die Methode über das Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, Elektropolierung (electroporation), Elektrotransformation, Mikro-Injektion, virale Transfektion oder die Verwendung von Chemikalien, die die freie DNA-Aufhahme induzieren oder erhöhen, und dergleichen. Solche Verfahrensweisen und deren Verwendung in der Transformation von Pflanzen sind dem Fachmann wohlbekannt. Vorzugsweise wird die DNA-Sequenz, die für das mutante Endotoxin kodiert, mit geeigneten Regulator-Sequenzen vereinigt, beispielsweise Operator- und 3'-Regulator-Sequenzen, die in Pflanzen funktionell sind. Die gesamte Sequenz wird dann in einen Vektor vom Expressions-Typ eingeschleust. Eine derartige Transformation von Pflanzenzellen und nachfolgende Regeneration der Zellentwicklung in die gesamten Pflanzen ermöglicht, daß die für das mutante Endotoxin kodierende DNA-Sequenz stabiler und permanenter Teü des Pflanzen-Genoms wird. Es wird dann von einer Generation an die nächste über Mitose und Meiose weitergegeben und führt auf die Expression hin zu einem für Insekten toxischen Protein. Dadurch wird die Pflanze mit vererbbarer Insekten-Resistenz ausgestattet
Zwei sehr ähnliche Vektoren (prAK und prAK-3) wurden in der erfindungsgemäßen Arbeit als Quelle der B. t-delta-Endotoxin-Sequenz zur Mutation verwendet Sie bilden darüber hinaus Vehikel für die Produktion und Bewertung der B. L-Endotoxin-Mutanten. Die Plasmide prAK und prAK-3 sind in Figur 1 wiedergegeben. Es sind die relevanten Einzelheiten des Vektors prAK dargestellt Außerdem ist die geringfügige Variation dieses Vektors angegeben, die in prAK-3 existiert. Grundsätzlich sind die Plasmide prAK und prAK-3 in vollem Umfang leistungsfähige Expressionsvektoren für E. coli. Jeder Vektor schließt ein Ampicillin-Resistenz-Gen, einen Replikationsursprung und Operator-Sequenzen ein, einschließlich eines E. coli-Promoters.
Wie in Figur 1 durch die dicken dunklen Linien und Kästen angegeben, schließt der Vektor prAK in korrekter Leserahmen-Koordination mit dem Promoter eine DNA-Sequenz ein, die in dem Wild-Typ-Stamm HD-1 von B. t kurstaki gefunden wird. Die dicke schwarze Linie stellt die ursprüngliche Sequenz dar, die gekürzt wurde und für ein gekürztes natives B. t-delta-Endotoxin kodiert, das sich von der Aminosäure-Position 1 (Met) bis zur Position 610 (Thr) in Figur 6 und weiter in den Protoxin-Abschnitt »streckt und mit der Aminosäure 723 (Leu) endet. Am in Strangrichtung unteren Ende der dicken dunklen Linien stellt ein kleiner Abschnitt, der in Figur 1 als offener dicker Kasten dargestellt ist, eine kurze DNA-Sequenz mit 54 Basepaaren dar, die sich an das Basepaar-Triplett anschießt, das für den Rest 723 (Leu) kodiert und dieser folgt unmittelbar ein Stop-Signal. Diese Gesamtsequenz von 57 Basepaaren (einschließlich des Stop-Signals) hat ihren Ursprung in dem wohl bekannten Plasmid pBR322, das beim konstruktiven Aufbau des Plasmids prAK verwendet wurde. Folglich kodiert der Expressionsvektor prAK (und produziert in E. coli) im wesentlichen ein verkürztes B. t.-delta-Endotoxin-Fusionsprotein mit einer Gesamtzahl von 741 Aminosäuren, das zusammengesetzt ist unter Einschluß der 610 Aminosäuren des nativen Protoxin-Abschnitts und der 18 Aminosäuren, die ihren Ursprung in dem Plasmid pBR322 haben. Dieses verkürzte B. t.-Endotoxin-Fusionsprotein weist eine hohe insektizide Wirksamkeit auf und wurde dafür verwendet, die Mutanten dieses Proteins, die während der erfindungsgemäßen Arbeit hergestellt wurden, zu bewerten. Diese Aktivität ist im wesentlichen ununterscheidbar von der eines voll gekürzten B. t.-delta-Endotoxin-proteins, das nur die 610 Aminosäuren des aktivierten Toxins (Aminosäuren 1 bis 610 in Figur 6) aufweist.
In Figur 1 ist die dicke dunkle Linie, die den größten Teil der Sequenz darstellt, die für das gekürzte B. t-Endotoxin-Fusionsprotein kodiert, an ihrem zum oberen Ende der Sequenz liegenden Ende mit einem dicken dunklen Kasten verbunden, der eine Sequenz darstellt, die eine iibosomale Bindungsstelle (RBS) von B. t. einschließt. Dieser Abschnitt, der auch in Figur 6, Zeile 1 und 2 dargestellt ist und die RBS enthält, hat etwa 47 Nucleoüde, bevor an seinem in Strangrichtung aufwärts gelegenen Ende eine Bam HI-Spaltstelle beginnt Diese wurde in früheren Plasmiden zur Verbindung des Abschnitts mit dem E. coli-Promoter-Abschnitt eingeführt, der in Figur 1 mit einem Pfeil angezeigt ist Die Promoter- und RBS-Abschnitte sind in der Weise angeordnet und miteinander vereinigt, daß sie in richtiger Leserahmen-Anordnung mit der für das Endotoxin -7-
AT396940B kodierenden Sequenz liegen. Die dicken dunklen Linien und Kästen zusammen stellen also eine DNA dar, die ihren Ursprung in B. t. kurstaki HD-1 hat.
Verschiedene andere Restriktionsstellen, die in Figur 1 angegeben sind, waren für die Strategie für die herkömmliche Entfernung und Wiedereinsetzung von DNA-Abschnitten für Mutations-Experimente ausschlaggebend. Diese anderen Restriktionsstellen sind die Nsi I-Stelle (beginnend nach etwa nur 26 Nucleotiden nach dem Start der für das Endotoxin kodierenden Sequenz), die beiden Xba I-Stellen (siehe aber unten bezüglich prAK-3), die Sst I-Stelle und die Hind ΙΠ-Stelle.
Wie oben angegeben, unterscheidet sich das Plasmid prAK-3 von dem Plasmid prAK nur in einem einzigen unwesentlichen Punkt. Der Unterschied besteht darin, daß die Xba I-Stelle (TCT AGA) bei den Nucleotid-Positionen 292 bis 297 in Figur 6 - unter Verwendung von Standard-Techniken in "TCG CGA" geändert wurde. Dadurch wurde eine Nru I-Stelle definiert. In der kodierten Aminosäure-Sequenz ergab sich aus diesem Wechsel keine Änderung. Die Herstellung von prAK-3 wird in Schritt (a) von Beispiel 1 nachfolgend beschrieben. prAK-3 ist auch die erste Zwischenstufe für die Herstellung der anderen Plasmide prAK-7 und prAK-9. DNA-Abschnitte, die von Einzelstrang-DNA-Abschnitten unterschiedlicher Längen der Plasmide prAK und prAK-3 abgeleitet wurden (Stränge sowohl in rechter Laufrichtung als auch gegenläufige Stränge) und in herkömmlicher Art mutiert wurden, beispielsweise so, wie es in "Craick in Biotechniques, Jan/Feb 1985, Seite 12 19; Use of Oligonucleotides for Site-Specific Mutagenesis", werden der Einfachheit halber in dieser Beschreibung als M-2 und M-l bezeichnet. Als M-l ist der 375 Basepaare umfassende Abschnitt zwischen den beiden Xba I-Stellen in prAK und M-2 ist der Abschnitt zwischen der Bam HI- und Xba I-Stelle in prAK-3, wie dies in Figur 1 gezeigt ist.
Die Mutation zwischen den beiden Xba I-Stellen in Übereinstimmung mit der Erfindung kann leicht unter Verwendung der Plasmide prAK-7, prAK-8 oder prAK-9, wie sie in der Beschreibung offenbart werden, erhalten werden. Synthetische doppelsträngige Oligonucleotide werden analog zu den Verfahrensweisen, die in Beispiel 2 beschrieben sind, aufgebaut und verwendet
Nach der Mutation werden die mutierten Einzelstrang-Abschnitte mit herkömmlichen Mitteln wieder in Doppelstränge überführt: im Fall der M-l-Mutanten wurden die resultierenden doppelsträngigen mutierten Plasmide unter Verwendung von prAK als Mutationsvehikel in Zellen von E. coli JM103 überführt, auf einem YT-Agar, der 50 pg/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen und über Nacht inkubiert. Es wurde eine Vielzahl von Kolonien mit vielen verschiedenen Mutationen in den Plasmiden erhalten, die die gleichen wie prAK waren, mit Ausnahme der Mutationen.
Im Falle der M-2-Mutanten wurden die mutierten doppelsträngigen Bereiche zwischen den Bam HI- und Xba-I-Stellen in den Mutationsvehikeln unter Verwendung der Restrikdons-Endonucleasen Bam HI bzw. Xba I herausgeschnitten und in prAK-3-Vektoren eingebaut, die mit den beiden gleichen Enzymen gespalten worden waren. Die resultierenden prAK-3-Plasmide, die die M-2-Bereich-Mutante enthielten, wurden in Zellen von E. coli JM 103 transformiert, auf YT-Agar, der 50 μg/ml Ampicilin enthielt, ausgestrichen und über Nacht inkubiert. Dabei wurde eine weitere Vielzahl von Kolonien erhalten, die auch eine Vielzahl verschiedener Mutationen einschließen.
Der Test zum Nachweis der Aktivität der mutagenisierten Endotoxin-Sequenzen, die mit DNA exprimiert wurden, die beispielsweise in E. coli JM 103, oder E. coli SG 4044 enthalten waren (letzterer ist öffentlich erhältlich bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois (USA) unter der Hinterlegungs-Nummer B-15969), wurden entweder mit Hilfe des Tabak-Knospenwurm(IBW-)Tests oder mit Hilfe des T. ni-Tests durchgeführt, wie dies in Beispiel A nachfolgend beschrieben wird. Die DNA der Mutanten mit gegenüber dem nicht mutanten Standard-Endotoxin erhöhter Aktivität wurden in den relevanten Mutations-Bereichen sequenziert, um die Mutation im DNA-Strang und damit in der Protein-Sequenz zu bestimmen. Mehr als 6.000 verschiedene Kolonien mit Plasmiden, die entweder mutagenisierte M-l-Bereiche oder mutagenisierte M-2-Bereiche enthielten, wurden so bewertet und es wurde gefunden, daß im allgemeinen zwischen 1 und 3 Änderungen der Aminosäure-Reste in jedem Mutationsexperiment stattgefunden haben.
Die nachfolgende Tabelle A zeigt die up-Mutanten, die unmittelbar als Ergebnis der Mutations-Experimente gefunden worden waren, die Aminosäure-Position unter Bezugnahme auf die Positions-Ziffern in Figur 6 an der jede Mutation stattfand, jedes in dem jeweiligen Mutanten mutierte Codon und die daraus resultierende Änderung der Aminosäure an der angegebenen Position als Resultat der Änderung des Codons.
In Tabelle A geben die mit einem Minus-Zeichen versehenen oder negativen Zahlen der Aminosäure-Rest-Positionen Änderungen zwischen dem Bam HI-Stelle und der 1-Position (Met) am Beginn der Endotoxin-Sequenz an. Solche Änderungen beeinflussen daher die Sequenz des Endotoxins nicht, wie sie durch die mutante Sequenz kodiert wird.
Die in Tabelle A benannten Mutanten wurden in allen drei Phasen des Tabak-Knospenwurm-(TWB-)Tests bewertet. Die erhaltenen Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle A-l angegeben. Verschiedene dieser Mutanten wurden auch in dem T. ni-Test bewertet; dessen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle A-2 angegeben. -8-
AT 396 940 B Tabelle A
Mutations- Mutante Position der Änderung im Endotoxin
Abschnitt Aminosäure Nucleinsäure Aminosäure
M-l p26-3 119 GCA in ACA Ala in Thr 130 ATG in ATA Met in Ile 201 GGCinGAC Gly in Asp M-l p48al4 101 GAA in AAA GluinLys 116 GAG in AAG Glu in Lys 217 CGTinCAT Arg in His M-l p48c5 116 GAG in AAG Glu in Lys 187 GCG in ACG Ala in Thr M-l p36a65 122 ACT in ATT Thr in Ile 125 GCA in GTA Ala in Val M-2 p95a76 123 AAT in TAT AsninTyr M-2 p95a86 188 ACTinTCT Thr in Ser M-2 p98cl 188 ACT in TCT Thr in Ser M-2 p99c62 204 ACA in ACT Thr in Thr 105 AAT in TAT Asn in Tyr 4 AAT in TAT AsninTyr M-2 pl07c22 194 AAT in AAA Asn in Lys 94 AAC in AAA Asn in Lys M-2 pl07c25 184 TTTin ATT Klein Ile -11 TTG in TAG M-2 pll4a30 95 CAA in AAA Gin in Lys -15 TAT in TAA
In der nachfolgenden Tabelle A-l gibt der untere Wert in der Toxizitäts-Spalte den größeren Aktivitätswert an (vergleiche Beispiel A zur Erklärung der Toxizitäts-Werte). Die Kontrollwerte bezogen sich auf äquivalente E. coli JM 103-Zellen und E. coli SG 4044-Zellen, die nicht mit einem Plasmid transformiert worden waren. Es ist festzustellen, daß die Angaben für alle Mutanten eine wesentlich höhere Aktivität zeigten als für das gekürzte native Endotoxin, das von einer äquivalenten Menge solcher Zellen hergestellt wurde, die das Plasmid prAK enthielten.
Tabelle A-l
Mutante (vgl. Tabelle A) Toxizitätswert - Mittlere Toxizität p26-3 2.75 p48al4 2.25 p48c5 2.63 p36a65 1.50 p95a76 2.50 p95a86 1.30 p98cl 1.33 p99c62 1.83 pl07c22 1.42 pll4a30 2.00 -9-
AT 396 940 B
Tabelle A-l (Fortsetzung
Mutante (vgl. Tabelle A) Toxizitätswert - Mittlere Toxizität
Kontr. (JM103-Zellen) 4.68 prAK 3.35 Kontr. (SG4044-Zellen) 4.12
Tabelle A-2
Mutante (vgl. Tabelle A) Relative Wirksamkeit p26-3 217 p36A65 887 p95a76 291 pl07c22 357 pll4a30 239 Kontr. (SAN415) 59 pBT301 100
In der oben angegebenen Tabelle A-2 wurde der Standard-Mutante pBT 301, eine relative Wirksamkeit von 100 zugeordnet, ermittelt nach dem LD5Q-Wert. Eine detailliertere Beschreibung findet sich in Beispiel A. Auf diese Weise gibt ein Wert der relativen Wirksamkeit größer als 100 ein erhöhtes Toxizitäts-Level an, das durch die Mutation hervorgerufen wurde.
In zusätzlichen Experimenten bei der Förderung der vorliegenden Erfindung wurden bestimmte mutante DNA, die - wie die obige Tabelle A zeigt - mehrere Mutationen aufweisen, analysiert, um die Auswirkung der einzelnen oder Paar-Mutationen auf solche mehrfach mutierten Abschnitte zu bestimmen. Eine solche Sub-Klonierung einzelner Mutationen oder von Paaren von Mutationen, wurde unter Verwendung einer Strategie durchgeführt, die die Isolation des Ziel-Fragments mit der mehrfachen Mutation einschließt. Das Fragment wurde dann an einer Restriktionsstelle innerhalb des Fragments geschnitten und zwischen zwei mutierte Codons angeordnet. Die beiden Hälften oder Fragment-Segmente wurden dann über ein Gel isoliert und jedes mit nicht mutanten komplementären Hälften oder Fragment-Segmenten gemischt, die durch ähnliches Schneiden derselben Fragmente aus prAK erhalten worden waren. Der prAK-Vektor, der zur Isolation des größeren komplementären Fragments auseinander geschnitten worden war, wurde dann mit den beiden komplementären Hälften gemischt, und alle drei DNA-Segmente wurden miteinander verbunden. Dabei bildete sich ein modifiziertes prAK-Plasmid, das die Punktmutation oder -mutationen enthielt, die in der Fragmenthälfte angeordnet waren, die aus dem Klon mit der Mehrfach-Mutation stammte.
Genauer gesagt, lag eine Schnittstelle für die Restriktions-Endonuclease Xho II strategisch innerhalb bestimmter Segmente mit Mehrfach-Mutationen, so daß die Isolation von Fragmenten möglich wurde, die weniger als die Gesamtzahl an Mutationen in dem gesamten Mutanten-Segment aufwiesen. Wie offensichtlich ist, kann die Endonuclease Xho II auf eine Zahl von Segmenten mit Mehrfach-Mutationen in Tabelle A angewendet werden, um Fragmente mit einer einzelnen Punktmutation und andere mit zwei Mutationen zu erhalten. Plasmide mit Mehrfach-Mutationen wurden also zuerst mit den Restriktions-Endonucleasen Nsi I und Sst I behandelt, und die resultierenden, 1.430 Basepaare umfassenden Fragmente wurden durch Gel-Isolation getrennt Jedes dieser 1.430 Basepaare umfassende Fragmente wurde dann mit der Restriktions-Endonuclease Xho Π behandelt und die resultierenden 330 Basepaare (Nsi I/Xho II) und 1.100 Basepaare (Xho Π/Sst I) umfassenden Fragmente wurden für jede Mehrfach-Mutante über ein Gel isoliert. Auf der anderen Seite wurden nicht-mutierte Fragmente mit 330 und 1.100 Basepaaren und das größere, etwa 4 Kb Nsi I/Sst I-Fragment aus prAK dann auf ähnliche Weise erhalten. Im einzelnen wurden kleine Mengen des größeren Segments mit den mutierten 330 bp-Fragment gemischt, und das nicht-mutante 1.100 bp-Fragment aus prAK und die resultierende Mischung miteinander verbunden, wobei sich eine Anzahl von Mutanten-Hybrid-Plasmiden von prAK bildete. In ähnlicher Weise wurden gewisse Mengen der größeren prAK-Segmente mit nicht-mutierten 330 bp-Fragmenten aus prAK gemischt und die mutanten 1.100 bp-Fragmente und diese DNA wurden miteinander verbunden, wobei sich eine andere Serie mutanter Hybrid-Plasmide bildete. Die mutanten Hybrid-Plasmide oder Klone, die sich aus der oben beschriebenen Vorgehensweise ergaben, sind in der nachfolgenden Tabelle B zusammengefaßt. Diese zeigt die drei kombinierten Segmente und die Mutationen in den resultierenden Plasmiden, verglichen mit dem Plasmid prAK. -10-
AT396940B Tabelle B
Neu gebildete prAK Vektor-Segment und Herkunft Herkunft d. Nsi I/Xho II-Segments 330 bp Herkunft d. Xho Π/Sst I-Segments llOObp Position der mutierten Aminosäure A prAK Nsi I/Sstl 4Kb p48al4 prAK GluinLys @ 101 GluinLys @ 116 B u p26-3 prAK AlainThr @ 119 C II p48c5 prAK GluinLys @ 116 D 1t prAK p48al4 Arg in His @ 217 E tt prAK p26-3 Met in Ile <® 130 GlyinAsp @ 201 F It prAK p48c5 AlainThr @ 187
In einem zweiten Durchgang der Herstellung von mutanten Hybrid-Klonen unter Verwendung einer analogen Verfahrensweise, wie sie auch zur Herstellung der Klone von Tabelle B angewendet worden war, wurde eine Anzahl gemischter mutanter Kombinations-Plasmide hergestellt. Dies geschah durch Kombination dreier Segmente nämlich des großen Segments (etwa 4 kb) aus der Einwirkung von Nsi I und Sst I auf prAK, des 330 bp umfassenden Nsi I/Xho Π-Fragments aus einem der Klone von Tabelle A und des 1.100 bp umfassenden Xho II/Sst I-Fragments eines anderen Klons aus Tabelle A. Die mutanten Hybrid-Klone, die sich aus diesem zweiten Durchgang ergaben, sind in Tabelle C gezeigt. Es ist darauf hinzuweisen, daß die beiden Plasmide, die sich bei diesem zweiten Durchgang ergaben, im Vergleich zu dem Stammplasmid prAK 4 Änderungen in den Aminosäure-Resten enthielten.
Neu gebildete prAK
Tabelle C Vektor-Segment Herkunft d. und Nsi I/Xho Herkunft II-Segments 330 bp
Herkunft d. Xho II/Sst I-Segments llOObp
Position der mutierten Aminosäure prAK-J prAK Nsi/Sst p48al4 p26-3 Glu in Lys @ 101 4 Kb Glu in Lys @ 116 Met in De @ 130 Gly in Asp @ 201 prAK-K 11 p48al4 p48c5 Glu in Lys @ 101 Glu in Lys 116 Ala in Thr <§ 187 prAK-L It p48c5 p26-3 GluinLys @ 116 Met in Ile <® 130 Gly in Asp @ 201 prAK-M n p26-3 p48al4 AlainThr @ 119 Arg in His @ 217 prAK-N n p26-3 p48c5 AlainThr @ 119 AlainThr @ 187 -11- AT396940B Tabelle C (Fortsetzung!
Neu gebildete prAK Vektor-Segment und Herkunft Herkunft d. Nsi I/Xho II-Segments 330 bp Herkunft d. Xho II/Sst I-Segments llOObp Position der mutierten Aminosäure prAK-0 n p48c5 p48al4 Glu in Lys @ 116 Arg in His @ 217 prAK-P n p26-3 p36a65 AlainThr @ 119 Thr in Ile @ 122 Alain Val @ 125 prAK-Q tt p48c5 p36a65 Glu in Lys @ 116 Thr in Ile @ 122 Ala in Val @ 125 prAK-R n p48al4 p36a65 Glu in Lys @ 101 Glu in Lys @ 116 Thr in Ile @ 122 Ala in Val @ 125 prAK-S tt p26-3 p95a86 AlainThr @ 119 Thr in Ser @ 188 prAK-T tt p48c5 p95a86 Glu in Lys @ 116 Thr in Ser @ 188 prAK-U tt p48al4 p95a86 Glu in Lys @ 101 Glu in Lys @ 116 Thr in Ser @ 188 prAK-53 tt p99c62 pl07c25 Asn in Tyr @ 105 Phe in Ile @ 184 prAK-68 n p99c62 p26-3 Asn in Tyr @ 105 Met in Ile @ 130 Gly in Asp @ 201 prAK-70 n p26-3 pl07c25 Alain Thr @ 119 Phe in Ile @ 184 prAK-39 · p99c62 p98cl Asn in Tyr @ 105 Thr in Ser @ 188
Die verschiedenen Hybrid-Mutanten aus den Tabellen B und C wurden mit dem Tabak-Knospenwurm-Test gemäß Beispiel A bewertet. Die Bewertung schloß die mutanten Klone von Tabelle A zum Vergleich (unter anderem) der Wirkung ein, die sich bei der notwendigen Streichung oder Entfernung einer oder beider Mutationen aus den Original-Mutanten der Tabelle A ergibt. Die Ergebnisse der Bewertungen der Toxizität und der insektiziden Aktivität werden in der nachfolgenden Tabelle D gezeigt.
Folgendes ist dazu anzumerken: (1) Die niedrigere Marke in der Toxizitäts-Spalte gibt die höhere Aktivität an (vergleiche Beispiel A zur Erklärung der Werte); und (2) die Kontrollwerte beziehen sich auf eine äquivalente Menge von (E. coli) JM 103-Zellen und SG 4044-Zellen, die nicht mit irgendeinem Plasmid transformiert worden waren. Darüber hinaus ist anzumerken, daß die meisten, wenn nicht alle, bewerteten Mutanten in beiden Typen von E. coli-Zellen bewertet wurden. Aus den Mutanten ergeben sich die Angaben in den vorliegenden Tabellen, die sich auf die beiden Kontrollwerte beziehen und als ein Querschnitt der Resultate für die Mutanten angesehen werden können, die durch beide Zell-Typen exprimiert wurden. -12-
AT396940B
Tabelle D
Mutanten (vgl. Tabellen B oder C) Toxizitätswert, Durchschnittl. Toxizität Kontr. 4.68 prAK 335 A 2.05 B 2.90 C 2.68 D 3.40 E 230 F 3.00 E.coü SG 4044 (Kontr.) 4.12 J 225 K 2.06 L 2.08 M 3.10 N 2.73 O 2.70 P 1.00 Q 1.87 R 2.85 S 2.16 T 130 U 2.07 53 3.08 68 2.00 70 130 39 230
Die Erfindung schließt außerdem den Nachweis der Möglichkeit der generellen Substitution von Aminosäure-Resten an den Aminosäure-Positionen ein, an denen die ursprünglichen zufälligen Mutationen der DNA zu Änderungen der Aminosäure-Reste führten. Dadurch wird eine große Vielzahl neuer insektizid aktiver B. t-Endotoxin-Proteine bereitgestellt. Diese Möglichkeit wurde auf relativ einfachem Wege nachgewiesen durch sogenannte "Codon-SphT-Experimente, in denen ausgewählte Codons, die an den anfänglichen Änderungen durch Mutation beteiligt waren gegen Codons für die anderen natürlichen Aminosäuren ausgetauscht wurden. Diese neuen Mutanten exprimierten ein Endotoxin-Protein mit insektizider Aktivität gegen den Tabak-Knospenwurm. Um solche Forschungen wirksamer durchführen zu können, wurde eine Anzahl einzigartiger Plasmide des prAK-Typs hergestellt, wobei man mit dem Plasmid prAK anfing und die Herstellung beim Plasmid prAK-7 ihren Höhepunkt erreicht. Auch die anderen dazwischen liegenden Plasmide, die aufeinanderfolgend in der Reihenfolge ihrer Herstellung mit prAK-3, prAK-4, prAK-5 und prAK-6 bezeichnet wurden, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Das in Figur 2 gezeigte Plasmid pB8rü ist in jeder Hinsicht identisch mit dem Plasmid prAK, mit der Ausnahme, daß es DNA enthält, die für ein gekürztes Endotoxin kodiert, das ein wenig länger ist als das, für das prAK kodiert und mit der weiteren Ausnahme nicht aufeinanderfolgender Modifikationen in dem Stammplasmid, die im Bereich ihrer Anbindung das Strang abwärts gelegene Ende des gekürzten Endotoxin-Strukturgens der DNA durchgeführt wurden, wobei das Strukturgen - wie in Figur 2 gezeigt - die Kpn I-Schnittstelle in dem nativen Gen zeigt, während in prAK die Stelle gestrichen ist und das prAK-Strukturgen etwa an der früheren Position der Schnittstelle endet Das Plasmid prAK-7 ist so aufgebaut, daß es dieselbe Endotoxin-Aminosäure-Sequenz wie das Plasmid prAK exprimiert Seine DNA-Sequenz wurde jedoch modifiziert und schließt nicht nur die Nru I-Schnittstelle von prAK-3 ein, sondern auch Hind III-, Mst Π- und BssH II-Schnittstellen. Darüber hinaus wurde die Hind III-Schnittstelle, die ursprünglich in prAK gefunden wurde, vorzugsweise entfernt Wie genauer in Beispiel 1 angegeben wird, kann die aufeinanderfolgende Herstellung von prAK-7 aus prAK und die Einführung oder Streichung einer Schnittstelle in jedem Schritt wie folgt zusammengefaßt werden: prAK -> prAK-3 (plus Nru I) prAK-3 -> prAK-4 (plus Hind ΠΙ) prAK-4 -> prAK-5 (plus Mst Π) -13-
AT 396 940 B prAK-5 prAK-6 > prAK-6 (plus BssH Π) > prAK-7 (ursprüngliche Hind ΙΠ-Schnittstelle gestrichen)
Die oben angegebenen Schnittstellen wurden etwa 40 Basepaare voneinander entfernt eingeführt, so daß ein 5 DNA-Syntheseautomat wirkungsvoll eingesetzt werden konnte, um kleine doppelsträngige DNA-Fragmente herzustellen, die an ihren beiden Enden mit Nucleotiden enden, die die komplementären Reste zu den Resten der Restriktions-Stellen darstellen, die in prAK-7 geschaffen werden sollen, wenn diese mit den beiden relevanten Restriktions-Endonucleasen gespalten werden sollen. Solche Fragmente konnten daher leicht in prAK-7 durch standardisierte Schnitt- und Verbindungs-Verfahren (vergleiche Beispiel P unten) substituiert werden. 10 Dadurch wird ein Plasmid bereitgestellt, das in der Lage ist, ein Endotoxin-Protein zu exprimieren, das identisch mit dem von prAK ist mit der Ausnahme, daß die Aminosäure-Änderungen, die durch das synthetisierte Fragment kodiert werden, das in prAK-7 anstelle des korrespondierenden Fragments in prAK-7 eingebaut wurde, wie dies in Beispiel 2 gezeigt wird.
Figuren 3 A und 3 B stellen zwei schmal doppelsträngige DNA-Fragmente dar, die in Übereinstimmung 15 mit der oben beschriebenen "Codon-Spin-Strategie" hergestellt wurden und in den Hind HI/Mst Π-Abschnitt in prAK-7 eingesetzt werden. Das in Figur 3 A gezeigte doppelsträngige Fragment war dafür bestimmt, eine beliebige Aminosäure an der Aminosäure-Position 116 in den gekürzten B. L-Endotoxinen zu produzieren, die durch die prAK-Plasmide bei geeigneter Auswahl des XXX-Codons in Übereinstimmung mit dem genetischen Code exprimiert werden. In gleicher Weise war das in Figur 3 B doppelsträngige Fragment dazu bestimmt, eine 20 Aminosäure an der Aminosäure-Position 119 in den gekürzten B. L-Endotoxinen, die durch die prAK-Plasmide durch geeignete Auswahl des XXX-Codons in diesem Fragment hergestellt wurden. Wie ersichtlich ist, können die anderen doppelsträngigen Fragmente, die für die Substitution in den Spe I/Nru I-Abschnitt erforderlich sind (eine Fragment-Spanne von etwa 115 Basepaaren, die auch durch automatisierte DNA-Synthese-Maschinen herstellbar ist), der Nru I/Hind ΙΠ-Abschnitt und der Mst Π/BssH Π-Abschnitt in 25 prAK-7 und dazu bestimmt sind, für alle Aminosäuren an allen Mutationspunkten, die in diesen Abschnitten gefunden werden, zu kodieren, durch analoge Standard-Verfahrensweisen hergestellt werden. Die verbleibenden 18 von den 19 natürlichen Aminosäure-Änderungen oder Mutationen, die an jedem Mutationspunkt zwischen den Nru I und BssH Π-Schnittstellen durchgeführt weiden, können leicht in prAK-7 unter Verwendung des Plasmids prAK-7 hergestellt werden. 30 Um alle Punkte der Mutation innerhalb der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz zum bequemen "Spinnen" (spinning) der relevanten Codons zu erfassen, kann das Plasmid prAK-7 zur Herstellung des Plasmids prAK-8 verwendet werden, das seinerseits letztlich zur Herstellung von prAK-9 verwendet wird, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wird. In Figur 5 werden alle relevanten Restriktionsstellen, wie sie sich letztlich in prAK-9 angesammelt haben, in einem herausgeschnittenen gedehnten Abschnitt des Plasmids 35 prAK-9 gezeigt Die in Figur 5 gezeigte Spe I-Stelle ist ebenfalls eine einzigartige Schnittstelle, die auch schon in prAK, prAK-3 usw. vorhanden war. Wie ebenfalls festzustellen ist, können die Plasmide prAK-7, prAK-8 und prAK-9 verwendet werden, um Mehrfach-Mutations-Änderungen zwischen jedes beliebige Paar von Restriktionsstellen einzuführen und/oder DNA herzustellen, die für wenigstens eine Änderung im Bereich zwischen zwei oder mehreren solcher Stellen kodiert Auf diesem Wege können eine große Vielzahl von 40 Mehrfach-Mutations-Kombinationen, die aber auch die ursprünglichen Punkt-Mutationen, wie sie in Übereinstimmung mit der Erfindung gefunden wurden, einschließen, hergestellt werden. Auf diesem Wege lassen sich eine große Vielzahl neuer insektizid aktiver B. t-Endotoxin-Proteine hersteilen.
Wie ebenfalls anzumerken ist, sind Plasmide, wie beispielsweise prAK-7, prAK-8 und prAK-9 Plasmide, die in vollem Umfang in der Lage sind, ein oder mehrere beliebige Codons innerhalb jedes beliebigen Paars von 45 Restriktionsstellen in diesen Plasmiden zu ändern. Soweit Änderungen im Bereich zwischen einer oder zwei, jedoch weniger als drei derartiger Stellen erwünscht sind, können Plasmide wie beispielsweise prAK-4 oder prAK-5 verwendet werden, wenn sie die gewünschten Stellen der Änderungen einschließen, vorzugsweise nach Entfernung der ursprünglichen Hind ΙΠ-Schnittstelle in prAK. Wenn solche Plasmide nicht geeignet sind, ist festzuhalten, daß ein Plasmid des Typs prAK, das eine oder mehrere derartiger Stellen enthält, in bequemer 50 Weise dadurch hergestellt werden kann, daß man die Auswahl für die Einführung der zur Modifikation von prAK verwendeten Restriktionsstellen-Paare in der Herstellung von prAK-9 variiert oder begrenzL Damit steUt die Erfindung auch eine Vielzahl neuer Plasmide bereit, die für die Herstellung von Mutanten und Mutanten-Kombinationen in Übereinstimmung mit der Erfindung wertvoll sind und die eine oder mehrere der Restriktionsstellen-Paare enthalten, die letztlich in prAK-9 hergestellt werden. 55 Wie ebenfalls festzustellen ist, kann eine DNA, die eine oder mehrere solche Restriktionsstellen-Paare umfaßt, vor oder nach einer Modifikation, die dazu führt, daß sie eine oder mehrere Mutationen in Übereinstimmung mit der Erfindung enthält, aus den Plasmiden des prAK-Typs herausgeschnitten werden. Dies geschieht durch Schneiden an Restriktionsstellen, die außerhalb der gewünschten Mutationsregion(en) liegen und die entsprechend in einem anderen Plasmid für ein B. t.-Endotoxin gefunden werden. Das 60 herausgeschnittene DNA-Segment wird dann in ein derartiges anderes B. t.-Endotoxin-Plasmid eingesetzt (Verknüpfung mit Standard-Methoden), das in ähnlicher Weise herausgeschnitten worden war. Auf diesem Wege können derartige andere Plasmide bequem modifiziert oder zum Zwecke der unmittelbaren Einsetzung -14-
AT 396 940 B der erfindungsgemäßen Mutationen verändert werden.
Um die durch die Erfindung bereitgestellten Mutationen in eine für ein Endotoxin kodierende Sequenz voller Länge einzuschleusen, wurde aus Gründen der Bequemlichkeit und leichten Verfügbarkeit zu der Zeit ein Plasmid verwendet, das das DNA-Strukturgen für das delta-Endotoxin von B. t. wuhanensis enthielt Dieses Plasmid pBT 210 ist in Figur 4 gezeigt Das Plasmid pBT 210 enthalt das Endotoxin-Strukturgen aus B. t wuhanensis wie es durch die dicke dunkle Linie in Figur 4 angegeben wird, in voller Länge. Es enthält außerdem analog zu Figur 1 eine Sequenz, die die ribosomale Bindungsstelle von B. t enthält und die zusammen mit dem Strukturgen aus B. t wuhanensis erhalten worden war, diese ist in Figur 4 durch den dunklen Kasten angegeben. Das Plasmid pBT 210 ist ein voll funktionsfähiger E. coli-Expressionsvektor, der dasselbe E. coli-Promotersystem wie die prAK-Plasmide, einen E. coli-Replikationsursprung (nicht gezeigt) und ein Gen für Chloramphenicol-Resistenz wie dies in Figur 4 angegeben ist, umfaßt Die Pfeile in Figur 4 zeigen die Lese-Richtung des B. t wuhanensis-Gens bei Kontrolle durch den E. coli-Promoter und durch das Gen für die Chloramphenicol-Resistenz. Aufgrund der vorhandenen Sequenz-Informationen ist das gesamte Operon (Strukturgen, von B. t abgeleiteter ribosomaler Bindungssequenz-Abschnitt und E. coli-Promoter/Operator-Sequenz) sehr ähnlich und nur insignifikat verschieden von dem Operon des Plasmids prAK. Insbesondere ist die DNA, die für die 610 Aminosäure-Reste des aktiven Abschnitts des B. t-Endotoxins (Figur 6) kodiert und sich in den Protoxin-Bereich wenigstens etwa bis zur Kpn I-Schnittstelle, wie sie in Figur 4 für das Plasmid pBT 210 gezeigt ist erstreckt identisch mit der entsprechenden DNA-Sequenz in dem Plasmid prAK. Im DNA-Bereich strangabwärts von der Kpn I-Schnittstelle im B. t-Strukturgen in pBT 210 bis zum Ende dieses Strukturgens finden sich unbekannte aber geringfügige Unterschiede, verglichen mit dem entsprechenden Abschnitt des B. t kurstaki HD-l-Gens, das bei der Herstellung von prAK gekürzt wurde. Diese Unterschiede lassen sich durch Behandeln mit Restriktions-Endonucleasen und Kartieren der Genabschnitte (mapping) herausfinden. Das Plasmid pBT 210 kodiert für ein Endotoxin voller Länge, wie es in Figur 6 gezeigt ist und ist vollständig homolog im aktiven Bereich (und auch wenigstens im Bereich der Aminosäuren, die bis zu der Kpn I-Schnittstelle für das delta-Endotoxin aus B. t. kurstaki HD-1 in den Klonen prAK und pBSrll produziert werden). Das Plasmid weist außerdem im wesentlichen Homologie im Anteil des Protoxin-Abschnitts auf. Letztlich ist die ribosomale Bindungsstelle in pBT 210 identisch mit der in prAK. Darüber hinaus ist die gesamte DNA, die die ribosomale Bindungsstelle (RBS) einschließt und sich strangaufwärts vom Bereich unmittelbar vor dem einleitenden Aminosäure-Rest Met zurück über die Bam HI-Schnittstelle unter Einschluß des Promoter-Abschnitts erstreckt, die gleiche wie in pBT 210 und in prAK, mit der Ausnahme, daß in pBT 210 zwei Nucleodd-Änderungen unmittelbar vor der Bam HI-Schnittstelle zu finden sind (CC anstelle von GT wie in prAK), und daß drei Nucleotide (TTT), wie sie in prAK unmittelbar nach den beiden Nucleotiden gefunden werden, im pBT 210 gestrichen sind. Diese Unterschiede resultieren jedoch eher aus den unterschiedlichen Verfahrensweisen der Verbindung der Stränge beim Vereinigen der RBS-Abschnitte aus B. L mit dem E. coli-Promoter-Abschnitt über die Bam HI-Schnittstelle. Das Plasmid pBT 210 kann zur Herstellung des Mutanten B. t.-delta-Endotoxin-Proteins voller Länge, das eine oder mehrere Änderungen der Aminosäuren, wie sie durch die vorliegende Erfindung bewirkt werden, aufweist, verwendet werden. Die Nsi I-Schnittstelle, die beiden Xba I-Schnittstellen, die Sst I-Schnittstelle und erste der beiden strangabwärts erscheinenden Hind III-Schnittstellen, die in Figur 4 für pBT 210 gezeigt werden, entsprechen denselben Schnittstellen, die in Figur 1 für prAK gezeigt werden. Die DNA für beide Plasmide in dieser Region ist identisch, wie dies oben ausgeführt wurde.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel A 1. Trichonlusia ni (T. niVTest
Die Untersuchungen wurden an Second-Instar-Larven durchgeführt. Alle Insekten wurden während des Test-Zeitraums in Klimakammern unter Standardbedingungen der Temperatur, Feuchtigkeit usw. gehalten und wurden mit einer standardisierten künstlichen Nahrung gefüttert. Die Testsubstanzen wurden den Insekten als Teil der Nahrung verabreicht, wobei jede Konzentration der Testverbindung einer Charge von 20 Insekten verabreicht wurde. Die Insekten wurden für einen Zeitraum von 7 Tagen nach der Behandlung überwacht Nach dieser Zeit wurde der LDso-Wert für die jeweiligen Insekten aufgenommen. Der LD50*Wert kann definiert werden als eine Abschätzung der Stoff-Dosis, die erforderlich ist, um eine Sterblichkeit von 50 % der Test-Lebewesen zu induzieren. Die Endergebnisse sind als relative Wirksamkeit angegeben, die wie folgt definiert ist: LD50 (Standardverbindung)
Relative Wirksamkeit=-x 100 LD50 (Testverbindung)
Unter Einsatz der oben beschriebenen Verfahrensweise können die absoluten LD50-Werte erhalten werden, worin die Interpretation der Ergebnisse einfach darin besteht daß alle relativen Wirksamkeits-Werte, die über -15-
AT396940B dem Standard-Wert liegen eine Aktivität angeben, die höher ist als die der Standardverbindung. Darüber hinaus ist eine Verbindung mit einer relativen Wirksamkeit von z. B. 400, wenn sie mit einer Standardverbindung mit der relativen Wirksamkeit von 100 verglichen wird, 4 mal so aktiv wie die Standardverbindung.
Der Standard mit einer relativen Wirksamkeit von 100 in dem oben beschriebenen Test war das Plasmid pBT 301. Dieses Plasmid enthält die delta-Endotoxin-Sequenz des Wild-Typs in voller Länge und ist identisch mit pBT 210 mit der Ausnahme, daß es zwei E. coli-Promotoren enthält, die jeder für sich identisch mit dem sind, der in pBT 210 enthalten ist
Folgende Kontroll-Proben wurden in dem oben beschriebenen Test verwendet: (a) CAG 629; dies ist ein E. coli-Stamm, der keine delta-Endotoxin produzierenden Plasmide enthält und für sich keine insektizide Aktivität aufweist (Geschenk von C. A. Gross, Department of Bacteriology, University of Wisconsin); (b) SAN 415; ein im Handel erhältliches B. t.-Insektizid, das unter dem registrierten Warennamen JAVELINr erhältlich ist. 2. Tabak-Knospenwurm-Test (TBW-Tesfl
Der durchgeführte TBW-Test wurde grundsätzlich von Dulmage et al., (1971) J. Invertebr. Path. IS 240 -245 beschrieben. Der Test wurde mit Proben durchgeführt, die dreifach in klare Kunststoffbecher von einer Unze gefüllt waren. Jeder Becher enthielt eine Second-Instar-Tabak-Knospenwurm-Larve (TBW-Larve; vier bis fünf Tage alt, durchschnittliches Gewicht: 1,6 g). Die Proben wurden mit 15 ml Nahrung (enthaltend das Nährpulver, Vitaminpulver, Agar und andere Bestandteile) vereinigt, wie dies beschrieben ist in Dulmage et al., USDA Technical Bulletin No. 1528:1-5 (1976). Das Futter wurde gleichmäßig auf drei Becher aufgeteilt, die man dann eine halbe Stunde lang kühlen ließ. Ein TBW wurde unter Verwendung einer Kamelhaarbürste (Größe: 00) in jeden Becher eingesetzt und die Deckel wurden sicher aufgesetzt. Diese Proben wurden dann bei 27 °C und 50 % relativer Feuchtigkeit für vier bis fünf Tage in einen Inkubator gestellt. Die Zahlen der nach Größe geordneten Gruppen, die zur Bewertung des TBW-Toxizitäts-Tests verwendet wurden, entsprechen den Gewichtsbereichen, die in der nachfolgenden Tabelle E angegeben sind.
Tabelle E
Größen-Zahl Gewichts-Bereich (mg) Durchschnitts-Gewicht (mg) 1.0 1.3 - 1.9 1.6 1.5 2.7 - 3.1 2.8 2.0 5.5 - 6.3 5.8 25 11.7 - 12.3 12.0 3.0 173 - 223 19.6 3.5 30.8 - 342 32.8 4.0 50.1 - 52.4 51.1 4.5 76.6 - 943 84.8 5.0 119.9 - 114.7 113.5 6.0 119.8 - 1343 >140.0
Die in der Tabelle E angegebene "Größenzahl" ist unmittelbar den angegebenen Toxizitäts-Werten gleichzusetzen. Es wurde das Gewicht der Larve nach jedem Test bestimmt und jeder Larve wurde ein Toxizitäts-Wert zugeordnet, der gleich der Größen-Zahl war, die dem Gewichtsbereich entsprach, in den das Gewicht der Larve fiel. Unter Berücksichtigung der unten angegebenen Ausnahmen wurde allen toten Larven eine Größen-Zahl bzw. ein Toxizitäts-Wert von Null zugeordnet. Die Toxizitäts-Werte aus der Wiederholung aller Experimente wurden gemittelt, wobei die nachfolgend angegebenen Ergebnisse erzielt wurden. "Üblicherweise beruhten alle Ergebnisse auf wenigstens 30 Wiederholungen des Experiments.
Die Becher wurden geöffnet, sobald Tabak-Knospenwürmer (TBWs) unterschiedlicher Größenbereiche gefunden wurden. Diese TBWs wurden solange gewogen, bis je ein TBW gefunden wurde, der in die einzelnen Gewichts-Bereiche fiel. Die Probenbecher mit den TBWs in einem gegebenen Gewichtsbereich wurden dann mit der entsprechenden Größenzahl markiert. Diese wurden dann in aufsteigender Reihenfolge auf dem Labortisch angeordnet. Die verbliebenen Proben wurden dann durch visuellen Vergleich der Größe mit den gewogenen TBW-Proben eingeordnet, und die jeweilige Größen-Zahl wurde auf einem Bewertungsbogen eingetragen. Tote Larven wurden mit dem Zeichen "+" protokolliert und mit der Bewertung Null versehen. Von toten Larven, die -16-
AT396940B eine hellrosa Farbe hatten, oder verflüssigt erschienen, wurde angenommen, daß sie aus Gründen eingegangen waren, die nicht mit der Verabreichung des delta-Endotoxins zusammenhingen. Diese Larven wurden mit dem Zeichen "*” bewertet und bei den Ergebnissen nicht mitgezählt.
Die Standard-Probenmenge von 1 ml einer prAK-Kultur, die auf drei Becher aufgeteilt worden war, ergab eine Wachstums-Verlangsamung mitten in den Bereichen der Toxizitats-Werte. Daher war der Test nützlich in der Unterscheidung der Klone mit erhöhter Toxizität von denen mit reduzierter oder gleicher Toxizität verglichen mit den nicht-mutanten Stamm-Klonen. Der Test ergab eine Dosis-Response, die von der Menge an prAK-Kultur abhing, die in den Test-Behälter gefüllt worden war. Je größer daher die Menge an prAK-enthaltenden Bakterien bei Zusatz zu den Proben war, umso größer war dann auch der Toxizitatsgrad gegenüber den TBW bei der Beobachtung. Die Dosis-Response-Kurve für prAK lieferte wertvolle Hinweise bei der Bewertung der Frage, welche Klone toxischer waren als die nicht-mutanten Stamm-Klone. Die folgende Tabelle gibt die Dosis-Response der prAK enthaltenden Bakterien an:
Zugesetzte prAK-Menge (ml) Toxizitätswerte 5 1,5 1JS 2,0 2 2 2,5 2$ 1 3 3 3,5 0,5 3 3,5 4 0,25 3,5 4 4
Auf der Grundlage der obigen Bewertung wurden alle Kulturen unter Verwendung von 1 ml Zusatz der Reihe nach unter Bezugnahme auf die erhaltenen Gruppen-Zahlen getestet, um über einen weiten Bereich eine Feststellung der Kulturen zu erlauben, die - bezogen auf prAK (und andere nicht-mutante Plasmide) - eine größere oder geringere Aktivität als ein Standard hatten.
Das Nährpulver, das in dem TBW-Test verwendet wurde, wurde aus den nachfolgenden Komponenten in folgenden Gewichtsteilen (g) zusammengemischt: Sojabohnenmehl: 1103,4; Weizenkeim: 429,4; Wesson-Salzmischung: 292,4; Saccharose: 164,2; Methyl-p-Benzoat: 24,6; und Sorbinsaure: 14,8.
Das in dem TBW-Test verwendete Vitaminpulver wurde aus den nachfolgend angegebenen Komponenten in folgenden Gewichtsverhältnissen (g) gemischt: Kalciumpantothenat: 12,0; Nicotinamid: 6,0; Riboflavin: 3,0; Folsäure: 3,0; Thiamin HCl: 1,5; Pyridoxin HCl: 1,5; Biotin: 0,12 und Vitamin B^: 6,0.
Die nachfolgend beschriebenen drei Screening-Anwendungen des TBW-Tests (1. Serie, 2. Serie und Verdünnungsserie) wurden in den unterschiedlichen Stadien der Bewertung eingesetzt, worauf in der Beschreibung nachfolgend Bezug genommen wird. 1. Test (Primary Assay): Mengen von 1 ml aus den 18 h-Kulturen zweier separater Klone wurden mit dem TBW-Nährmaterial in einem konischen 50 ml-Zentrifugenröhrchen vereint und gleichmäßig auf drei Becher verteilt (1 TBW pro Becher). Diese Proben wurden im Vergleich mit Kontrollproben des Wild-Typs von mit prAK oder pBT 210 transformierten und untransformierten Zellen bewertet, die in derselben Weise hergestellt worden waren. 2. Test (Secondary Assay): Proben, die erhöhte Toxizität gegenüber den TBWs in dem ersten Test zeigten, wurden einem zweiten Test unterworfen. Ausgewählte Mutanten-Kolonien wurden von den Hinweisplatten in YT/Amp-Brühe (1 Kolonie pro Kultur) inokuliert. Zehn 1 ml-Proben wurden zusammen mit geeigneten Kontrollproben bewertet.
Klone, die erhöhte Toxizität gegenüber den TBWs zeigten, wurden als "wahrscheinlich durch Mutation verbessert" bezeichnet und ein drittes Mal bewertet. Die Proben, die die positive Bewertung ein weiteres Mal wiederholten, wurden als "durch Mutation aufgewertet" bezeichnet und in einem Verdünnungs-Test nochmals bewertet, um ihre erhöhte Aktivität gegenüber dem Ausgangs-Wild-Typ genauer zu bestimmen.
Verdünnungstest: Mutanten, von denen die Bestätigung erhalten worden war, daß sie eine Verbesserung gegenüber den nicht-mutanten Konstrukten zeigten, wurden in einem weiteren TBW-Test in einer Verdünnungsserie getestet. Diese basierte auf dem Trockengewicht lyophilisierter Bakterienzellen, die entweder das Toxin der Mutante oder das des Wild-Typs aus prAK- oder pBT 210-Klonen enthielten, die man hatte 18 h wachsen lassen. Die Zellen waren vor der Lyophilisierung pelletiert worden. Die Proben wurden dreifach mit jeder der nachfolgend angegebenen Verdünnungen in einem Endvolumen von 15 ml angesetzt: 167 pg/ml, 67 μ^ιηΐ und 33 pg/ml. An dem Protein dieser Mutante wurde je eine SDS-PAGE-Analyse und eine Westem-(Immunoblot-)Analyse durchgeführt; üblicherweise wurden pro Durchgang 75 μg Zelltrockengewicht verwendet. Die Ergebnisse der Verdünnungsreihe bestätigten im wesentlichen die Resultate der -17-
AT 396 940 B vorangehenden Tests und werden weiter nicht mehr angegeben oder in den nachfolgenden Tabellen, die die biologischen Ergebnisse zusammenfassen, bewertet.
Beispiel P - übliche Vorgehensweise
In den nachfolgenden numerierten Beispielen und darüber hinaus in der vorliegend») Beschreibung wurden die folgenden üblichen oder Standard-Labor-Verfahren eingesetzt, so weit dies im einzelnen angegeben ist oder anderweitig erforderlich ist und so weit der Text nicht im einzelnen was anderes angibt.
Beispiel P-l:
Erhaltung und Wachstum der Bakterien- und Phagen-Stämme E. coli SG 4044 und JM103 waren Wirte für alle Plasmid-Konstrukte. Der Stamm E. coli JM 103 und die Phagen M18 und MP 19 wurden von den "New England biolabs" erhalten. Diese Bakterienstämme ließ man auf YT-Medium (5 g/1 Hefeextrakt, 10 g/1 Bactotrypton, 5 g/1 NaCl), wachs»!. Das Medium wurde mit 50 mg/1 Ampicillin zum Wachstum von Zelle ergänzt, die prAK oder Derivate dieses Plasmids enthielten, und mit 20 mg/ml Chloramphenicol für Zellen, die pBT 210 oder Derivate dieses Plasmids enthielten.
Beispiel P-2:
Vermehrung und Isolation der Phaeen-DNA
Die Herstellung von rekombinanten Phagen, die von M 13 abgeleitet waren und die Isolation der PhagenDNA wurde unter Einsatz schon früher beschriebener Methoden durchgeführt (Messing, J. (1983) Methods Enzymol. 101:20 - 78).
Beispiel P-3:
Herstellung synthetischer Oligonucleotide
Synthetische Oligonucleotide wurden in einer automatisierten Synthese mit einem "Applied Biosystems 380 A Synthese-Gerät (Applied Biosystems Foster City, CA)” hergestellt.
Nach Abschluß des Cyclus »folgten die Reinigungsschritte wie nachfolgend beschrieben. Das synthetische Oligonucleotid wurde durch Zusatz des gleichen Volumens Ammoniumhydroxid-Lösung und Inkubation bei 55 °C über Nacht deblockiert. Nach Entfernen des Ammoniumhydroxids durch mehrfaches Geschwindigkeits-Vakuum-Zentrifugieren und Resuspendieren in destilliertem Wasser wurde das Oligonucleotid durch Hamstoff-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (Hamstoff-PAGE; Urea-PAGE) weiter gereinigt. Um die Banden sichtbar zu machen, wurde das Gel auf eine Doppelschicht-Chromatographieplatte gelegt, die mit ein» SaranR-Hülle versehen war. Das Oligonucleotid wurde mit kurzwelligem UV-Licht beleuchtet Danach wurde der das Oligonucleotid enthaltende Bereich des Gels mit einer Rasierklinge herausgeschnitten, und das Oligonucleotid wurde von dem Gel mit 0,5 M Ammoniumacetat und 1 mM EDTA bei einem pH-Wert von 8,0 und 37 °C über Nacht unter Rühren eluiert Nach dem Eluieren wurden die Gel-Fragmente bei 6.000 Upm in einem JA 20-Rotor pelletiert und der das eluierte Oligonucleotid enthaltende Überstand wurde in ein frisches Röhrchen überführt. Durch Fällung mit ETOH wurde das Oligonucleotid aufkonzentriert und durch Absorption bei 260 nm quantifiziert. 200 pmol des Oligonucleotids wurden mit Kinase umgesetzt. Dies geschah durch Reaktion in einem Volumen von 40 μ1 mit 2 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase in Gegenwart von 0,05 mM ATP.
Beispiel P-4: DNA-Transformation von E. coli-Zellen (A) E. coli JM 103 oder SG 4044, die für die Transformation von DNA geeignet sind, wurden nach einer allgemein üblichen Verfahrensweise hergestellt, die in "Cohen, S. N., Chang, A. C. P. und Hsu, L. (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. USSA 69:2110-2114" beschrieben ist. Für die auf bestimmte Stellen gerichteten Oligonucleotid-Mutagenese-Experimente wurde heteroduplizierte rekombinante Phagen-DNA (M 13; 60 ng) zu 0,2 ml der Zellen zugesetzt und 15 Minuten lang bei 0 °C gehalten. Die Zellen wurden nach folgenden zwei Minuten bei 42 °C gehalten, und 30 μΐ dieser Mischung wurden 3 ml YT-Brühe, die 0,7 % Bacto-Agar enthielt, der bei 42 °C gehalten worden war, um einer Verfestigung vorzubeugen, zugesetzt. Außerdem wurden 0,2 ml einer frisch zubereiteten, über Nacht gehaltenen Kultur von JM 103 oder SG 4044 zugesetzt. Die Mischung wurde sofort auf eine YT-Agar-Platte aufgesprüht (YT-Brühe plus 1,5 % Bacto-Agar), und die (umgekehrten) Platten wurden über Nacht bei 37 °C irikubiert. (B) Plasmid-DNA (100 ng) aus Mutagenese-Experimenten oder anderen Verknüpfungen unter Einschluß von prAK- oder pBT 210-Vektoren, wie sie oben beschrieben wurden, wurden 0,2 ml der Zellen (JM 103 oder SG 4044) zugesetzt und die Mischung 30 Minuten lang bei 0 °C gehalten. Die Zellen wurden nachfolgend zwei Minuten bei 42 °C gehalten und wieder in ein Eisbad gegeben. Mengen von 2 μΐ bis 200 μΐ wurden auf YT-Agar ausgestrichen, der 50 μg/ml Ampicillin für Klone enthielt, die von prAK abstammen, und 20 μg/ml Chloramphenicol für Klone enthielt, die von pBT 210 abstammen. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. -18-
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Beispiel P-5:
Abbau (digesrionl mit Restriktions-Enzvmen
Alle Restriktions-Enzyme wurden durch Bethesda Research Labs (Gaithersburg, MD) oder durch New England Biolabs geliefert. Die Inkubationsbedingungen wurden so gewählt, wie es durch die Hersteller empfohlen wird.
Beispiel P-6:
Verknüpfung der DNA-Fragmente (A) Die Lösungen zur Verknüpfung der DNA (20 μΐ) enthielten 60 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,1 mM Dithiothreit(ol), 50 μΜ ATP, 20 nM DNA-Enden und 20 Einheiten T4-DNA-Ligase (Hersteller: New England Biolabs); sie wiesen einen pH-Wert von 7,5 auf.
Die Inkubationszeit lag bei 4 Stunden bei 14 °C. (B) Die Verknüpfungs-Reaktionen von drei Fragmenten wurden angesetzt mit Lösungen, in denen die Fragmente in einem Molverhältnis von 1:1:1 bei einer Konzentration von 0,04 pmole in jedem Reaktions-Volumen von 20 μΐ zugegen waren. Die Inkubationszeit betrug 4 Stunden bei 16 °C, wenn nur ein "sticky end" zu verknüpfen war (beispielsweise eine interne Xho II- S chnittsteile) bzw. über Nacht, wenn ein "blunt end” zu verknüpfen war (beispielsweise eine FnuD2-Schnittstelle). T4-Ligase (Hersteller: New England Biolabs; NEB) wurde in einer Konzentration von 10 Einheiten pro μΐ Reaktionsvolumen verwendet (NEB-Definition).
Beispiel P-7: DNA-Seauenzierung
Die DNA-Sequenzierung der delta-Endotoxin-Gene und ihrer Derivate wurde mit Hilfe des Kettenend-Verfahrens (chain termination method) von Heidecker et al. durchgeführt; vergleiche Heidecker, G., Messing, J., and Gronenbom, B. (1980) Gene 10:68-73.
Beispiel 1;
Herstellung der Vektoren prAK-3. prAK-4. prAK-5. prAK-6 und prAK-7
Schritt (a) Herstellung von prAK-3 1 pg des Plasmids pB8rII (siehe Figur 2; vergleiche wie obige Beschreibung) und die replikative Form der DNA aus den gut bekannten M 13-Phagen-Klonierungs-Vektoren MP 18 und MP 19 wurden gleichzeitig mit den Restriktions-Endonucleasen Bam HI (8 Einheiten) und Κρη I (10 Einheiten) 60 Minuten lang bei 37 °C in 100 mM Natriumchlorid-Pufferlösung umgesetzt, die auch 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 und 100 pg/ml Rinderserumalbumin enthielt. Die gewünschten Fragmente aus den resultierenden DNA-Mischungen wurden dadurch gereinigt, daß man die gesamte Mischung über ein 1 % präparatives Agarosegel laufen ließ, um die Fragmente der Größe nach zu trennen. Die Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid und Beleuchten mit langwelligem UV-Licht sichtbar gemacht Das Gelfragment, das die gewünschte DNA enthielt wurde herausgeschnitten und die DNA wurde durch Elektrophorese in Dialyse-Röhrchen eluiert. Das Bam HI/Kpn I-Fragment aus pB8rII wurde in das aus MP 18 und MP 19 herausgeschnittene Bam HI/Kpn I-Fragment eingesetzt Die Vektoren wurden über ein Gel gereinigt, in dem man sie stundenlang bei 14 °C mit einem Gesamtvolumen von 201 inkubierte, das 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgClj, 1 mM Dithiothreit(ol), 50 mM ATP und 20 nM DNA-Enden enthielt Die resultierende DNA wurde in E. coli JM 103-Zellen (vergleiche Beispiel P-4) transformiert, mit der Abwandlung, daß die YT-Platten Isopropyl-Thiogalctosid (IFTG) und 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-D-Galactosid (X gal), enthielt; beide Chemikalien wurden von der Sigma Chemical Company geliefert
Rekombinante Phagen (enthalten das DNA-Insert aus pB8rII) führen unter diesen Bedingungen zu klaren Plaquen, während MP 18 und MP 19 blaue Plaquen ergeben. Die klaren Plaquen wurden 2 ml E. coli JM 103-Zellen in YT-Briihe zugesetzt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Nach dem von J. Messing in J. Methods Enzymol. (1983), 101:20-78 beschriebenen Verfahrensweise wurde aus dem Phagen einzelsträngige DNA hergestellt. Diese gewünschten Klone, die die großen, aber einzelsträngigen DNA-Bruchstücke (inserts) aus pBr8II wurden unter Verwendung von Agarose-Gel-Elektrophorese aufgrund ihrer geringeren Mobilität verglichen mit MP 18 und MP 19, identifiziert. Die Sequenzierung eines Teils dieser Klone, die die EndotoxinDNA einschlossen, durch das Verfahren des Dideoxy-Ketten-Abbruchs (dideoxy chain termination method) bestätigte die Gegenwart der Endotoxin-DNA und zeigte, daß MP 18 den gegenläufigen Strang der DNA aufgenommen und daß MP 19 den gleichläufigen Strang der DNA aufgenommen hatten. Beide wurden somit wiedergefunden.
Ein 26 Basen umfassendes gegenläufiges Oligonucleotid mit der Sequenz 5' GTC CTT CTA ATC GCG AAA TGG CTT GG 3’ wurde durch Festphasen-Synthese in dem automatischen DNA-Sythesiser hergestellt und mit T4-Polynucleotid-Kinase und ATP entsprechend der Beschreibung in "Maniatis et al., Molecular Cloning -19-
AT396940B (1982): A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y." umgesetzt. In einem Gesamtvolumen von 60 μΐ wurde eine Mischung aus 0,4 pg des rekombinanten Phagen MP 19, der den Strang entsprechend der Endotoxin-Richtung enthielt, 20 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 7 mM MgCl2 und 1 mM Dithiothreit(ol), 50 mM Natriumchlorid und 10 ng des 26 Basen umfassenden gegenläufigen Oligonucleotids 15 Minuten lang auf 68 °C erwärmt, dann 10 Minuten bei 37 °C und danach bei 0 °C gehalten. Die Mischung, die die rekombinante DNA aus MP 19, verknüpft mit dem mutagenen Oligonucleotid enthielt, wurde dann unter Zusatz von je 0,2 mM dATP, dCIP, dTIP und dGTP, 1 mM ATP, 4 Einheiten DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment (Herstellen New England Biolabs), 0,5 pg E. coü-Einzelstrang-Bindungsprotein (Hersteller: Pharmacia, Piscataway, N. J.) und 20 Einheiten T4-DNA-Ligase (Herstellen New England Biolabs) behandelt Die resultierende Mischung wurde 4 Stunden lang bei 14 °C zur Polymerisation und Verknüpfung inkubiert Die resultierende kreisförmige doppelsträngige heteroduplizierte DNA wurde in E. coli JM 103 transformiert und - wie in Beispiel P-4 beschriebet - ausgestrichen. 20 individueller Plaquen wurden dann ausgewählt und die Einzelstrang-DNA aus dem Phagen wie bei Maniatis a.a.0. beschrieben, isoliert Die DNA aus dem Phagen von den 20 Plaquen wurden jeweils in einem Gesamtvolumen von 201 aufgenommen, das 50 mM Tris-HCl, (pH 8,0), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2> 10 ng des oben beschriebenen 26 Basen umfassenden gegenläufigen Oligonucleotids und 0,2 pg verschiedener kreisförmiger einsträngiger Phagen-DNA-Moleküle enthielt Die jeweiligen Volumina wurden 15 Minuten lang auf 68 °C erhitzt und danach 10 Minuten lang bei 37 °C gehalten. Die Restriküons-Endonuclease Nru I (8 Einheiten) wurde zu jeder der resultierenden Mischung zugesetzt und die Inkubation 1 Stunde lang bei 37 °C fortgesetzt. Die jeweiligen Mischungen wurden auf 0,8 % Agarose-Gel der Elektrophorese unterworfen. Etwa 10 % der Proben enthielten eine DNA, die als lineare DNA wanderte und damit die Identifikation der positiven Klone erlaubte, die die gewünschte Nru I-Schnittstelle enthielten. Die positiven Klone wurden in E. coli JM 103 transformiert, um eine Reinigung zu «zielen. Die DNA zwischen den Bam HI- und Xba I-Schnittstellen in den positiven Klonen wurde herausgeschnitten (nach Verknüpfung mit M 13 sequenzierenden Oligonucleotiden und Polymerisation unter Bildung von Doppelsträngen wie dies oben für das Nru I-Oligonucleotid beschrieben wurde). Das Herausschneiden wurde durch gleichzeitige Behandlung mit den Endonucleasen für diese Schnittstellen durchgeführt. Die DNA wurde anschließend (gemäß Beispiel P-6A) mit dem großen Fragment verknüpft (etwa 5004 Basepaare und unter Auslassung des etwa 749 Basepaare umfassenden Fragments zwischen der Bam HI-Schnittstelle und der zweiten Xba I-Schnittstelle im prAK). Letzteres war enthalten und über ein Gel gereinigt worden nach vollständiger Umsetzung von prAK gleichzeitig mit den beiden selben Restriktions-Enzymen. Alle Umsetzungen wurden unter Zugrundelegung üblicher Methoden durchgefuhrt und dabei das Plasmid prAK-3 gebildet
Schritt ftA Herstellung von urAK-4
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen Schritt (a) wurde die einzelsträngige Phagen-DNA, die in Schritt (a) erhalten worden war, mit einem 25 Basen umfassenden in gegenläufiger Richtung synthetisierten Oligonucleotid verknüpft, das die Sequenz 5’ CCA CTC TOT AAA ££T TTC TGC GTA A 3' aufwies. Diese Sequenz ist geeignet, die Hind HI-Schnittstelle zwischen die Nucleoüd-Positionen 327 und 351 in der Nucleotid-Sequenz von Figur 6 einzuführen. Positive Klone, die nun sowohl die gewünschte Nru I-Schnittstelle als auch die Hind ΠΙ-Schnittstelle aufwiesen, wurden in einer Häufigkeit von etwa 6,8 % identifiziert Dies geschah durch Spaltung mit der Nuclease Hind m und nachfolgende Bewertung. Die Klone wurden dazu verwendet, prAK-4 herzustellen. Dies geschah durch Verknüpfung des Bam Hl/Cba I-Fragments mit den neuen Schnittstellen des großen, 5004 Basepaare umfassenden Fragments aus prAK in der Weise, wie dies in Schritt (a) angegeben ist
Schritt (c) Herstellung von orAK-5
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen Schritt (a) wurde die einzelsträngige Phagen-DNA, die in Schritt (b) erhalten worden war, mit einem 26 Basen umfassenden in gegenläufiger Richtung synthetisierten Oligonucleotid verknüpft, das die Sequenz 5' GCA TCT CTT ££C TTA QQG CTG GAT TA 3' aufwies. Diese Sequenz ist geeignet, die Mst Π-Schnittstelle zwischen die Nucleotid-Positionen 366 und 391 in der Nucleotid-Sequenz von Figur 6 einzuführen. Positive Klone, die nun alle drei gewünschten Schnittstellen (Nru I, Hind ΙΠ und Mst Π) aufwiesen, wurden in einer Häufigkeit von etwa 9,1 % identifiziert Dies geschah durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym Mst II und nachfolgende Bewertung. Die Klone wurden dazu verwendet, prAK-5 herzustellen. -20-
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Schritt (d> Herstellung von prAK-6
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen Schritt (a) wurden die positiven doppelsträngigen Phagenklone aus dem obigen Schritt (c) in einzelsträngige Phagen-DNA umgewandelt und mit einem 26 Basen umfassenden, in gegenläufiger Richtung synthetisierten Oliginucleotid verknüpft, das die nachfolgende Sequenz aufwies: 5' GCG GTT GTA AGQ GCß CTG TTC ATG TC 3’
Diese Sequenz ist geeignet, die Bss HH-Schnittstelle zwischen die Nucleotid-Positionen 406 und 431 in der Nucleotidsequenz von Tabelle A einzufügen. Posititve Klone, die nun alle 4 Schnittstellen enthalten, die letztendlich in prAK-7 erwünscht sind, wurden in einer Häufigkeit von etwa 12,5 % durch Spaltung mit dem Enzym Bss HII und anschließende Bewertung identifiziert. Sie wurden zur Herstellung von prAK-6 verwendet
Schritt (e) Herstellung von prAK-7
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen Schritt (a) wurde die einzelsträngige Phagen-DNA, die in Schritt (d) erhalten worden war, mit einem 26 Basen umfassenden in gegenläufiger Richtung synthetisierten Oligonucleotid verknüpft, das die Sequenz 5' TAC AGT CCT AAA TCT TCC GGA CTG TA 3* auf wies. Diese Sequenz ist geeignet die Hind ΠΙ-Schnittstelle zwischen den Nucleotid-Positionen 1682 und 1707 in der Nucleotid-Sequenz von Tabelle A zu eliminieren. Positive Klone, die nun die gesamte, für prAK-7 gewünschte Sequenz darstellen, wurden in einer Häufigkeit von etwa 2,8 % identifiziert Dies geschah durch Screening der replikativen Form (doppelsträngig) der rekombinanten Phagen-DNA mit Restriktions-Endonucleasen auf einen Verlust Hind ΠΙ-Schnittstelle zwischen den Nucleotidpositionen 1682 und 1707. Doppelsträngige DNA die von dem Mutanten isoliert worden war, wurde zur Herstellung von prAK-7 verwendet
Um ein Plasmid (prAK-9) mit geeigneten charakteristischen und richtig angeordneten Restriktionsstellen zur Durchführung der "Codon-Spin-Experimente" an anderen Mutationsstellen zwischen den beiden Xba I-Stellen bereitzustellen, können in der prAK-Plasmid-Serie weitere Plasmide entwickelt werden. Dies geschieht in Analogie zu den nachfolgend beschriebenen Verfahrensschritten und führt zu einem Plasmid prAK-8 und - von diesem ausgehend - zu prAK-9. Dies wird in den nachfolgenden Schritten (f) und (g) angegeben.
Schritt ffl Herstellung von prAK-8
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen Schritt (a) wurde die einzelsträngige Phagen-DNA, die in Schritt (e) erhalten worden war, mit einem 27 Basen umfassenden in gegenläufiger Richtung synthetisierten Oligonucleotid verknüpft, das die Sequenz 5' TCC CCA CCT TTG £CC AAA CAC TGA AAC 3' aufwies. Diese Sequenz ist geeignet, eine Bai I-Restriktions-Stelle ungefähr bei der Nucleotid-Position 534 in der Nucleotid-Sequenz von Tabelle A einzuführen. Positive Klone (prAK-8), die nun alle fünf gewünschten Schnittstellen (Nru I, Hind ΠΙ, Mst II, Bss HII und Bai I) aufweisen und die Hind ΠΙ-Schnittstelle nicht enthalten, die bei der Herstellung von prAK-7 entfernt wurde, wurden in der im obigen Schritt (a) beschriebenen Weise identifiziert.
Schritt (g) Herstellung von prAK-9
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen Schritt (a) wurde die einzelsträngige Phagen-DNA, die in Schritt (f) erhalten worden war, mit einem 30 Basen umfassenden in gegenläufiger Richtung synthetisierten Oligonucleotid verknüpft, das die Sequenz 5' GTT GCC AAT AAG ACG CGT TAA ATC ATT ATA 3' aufwies. Diese Sequenz ist geeignet, die Mlu I-Schnittstelle zwischen die Nucleotid-Positionen 588 und 595 in der Nucleotid-Sequenz von Figur 6 einzuführen. Positive Klone, die nun alle sechs gewünschten Restriktionsstellen (Nru I, Hind III, Mst II, Bss HII, Bai I und Mlu I) aufweisen, und die Hind III-Schnittstelle nicht enthalten, die bei der Herstellung von prAK-7 entfernt wurde, werden in der im obigen Schritt (a) beschriebenen Weise identifiziert und als "Plasmid prAK-9" bezeichnet. Wie offensichtlich ist, lassen sich DNA ("Cassette-DNA") die für die Substitution zwischen den Bai I- und Mlu I-Schnittstellen in prAK-9 geeignet sind, in geeigneter Weise kodieren, um alle möglichen Codon-Variationen und Aminosäure- -21-
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Variationen an den mutierten Aminosäure-Positionen 184, 187, 188 und 194 einzuführen. In gleicher Weise lassen sich auch DNA ("Cassette-DNA"), die für die Substitution zwischen der Mlu I-Schnittstelle und der zweiten Xba I-Schnittstelle geeignet sind, in geeigneter Weise kodieren, um alle möglichen Codon-Variationen und Aminosäure-Variationen an den mutierten Aminosäure-Positionen 201 und 204 einzufugen.
Figur 5 zeigt eine schematische Wiedergabe der besonderen Restriktions-Stellen, die zwischen den beiden ursprünglichen Xba I-Schnittstellen in prAK einführbar sind; die erste dieser beiden Xba I-Schnittstellen ist in prAK-9 nun die Nru I-Schnittstelle.
Das Unterstreichen in den gegenläufigen Oligonucleotiden (vergleiche die einzelnen Schritte des obigen Beispiels 1) zeigt, daß an dieser Stelle eine Änderung oder Änderungen eingeführt wurden.
Beispiel 2
Codon-Spin-Experimente (A) Einzelsträngige Oligonucleotide, die die Sequenz jedes der beiden in den Figuren 3 A und 3 B gezeigten Strange haben, wurden wie in Beispiel P-3 beschrieben hergestellt. Dazu wurde der DNA-Syntheseapparat (DNA Synthesizer) verwendet, der darauf programmiert war, zufällig alle Nucleotide A, T, C und G an jeder der X-Positionen in jedem in Figur 3 A gezeigten Strang einzuführen. Eine Gesamtmenge von etwa 200 pg (nach Reinigung) DNA wurde durch diese Verfahrensweise bei jedem Lauf hergestellt. Solche Einzelstränge geben eine Familie von Oligonucleotiden wieder, die bis auf die X-Positionen jedes Strangs identisch sind. 10 pmol des Strangs (rechtläufig und gegenläufig für jeden Codon-Spin) wurden in der Masse kombiniert und durch Erwärmen auf 68 °C über 10 Minuten verknüpft, dann 10 Minuten bei 37 °C gehalten auf Raumtemperatur abgekühlt und auf Eis gelagert. Es wurde angenommen, daß die resultierende Masse doppelsträngiger Oligomerer, die der in Figur 3 A gezeigten DNA entspricht, an den XXX-Positionen (Aminosäure-Position 116) jede Kombination enthält, die durch den genetischen Code erlaubt ist, einschließlich Stopsignale und mehreren, aber variablen Anzahlen von Codons für jede der zwanzig natürlichen Aminosäuren, einschließlich Stopsignalen. 1 pmol dieser doppelsträngigen Oligomeren oder Cassetten (cassettes) wurden dann mit T4 Polynucleotid-Kinase (Hersteller: New England Biolabs) umgesetzt und in der Masse mit dem größeren Fragment gemischt, das in zehnfach geringerer molarer Konzentration zugegen war und erhalten worden war durch Isolierung über ein Gel nach gleichzeitiger Spaltung des Plasmids prAK-7 mit den Restriktions-Endonucleasen Hind ΙΠ und Mst Π in 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2,10 mM 2-Mercaptoethanol und 100 pg/ml BSA. Die resultierende Mischung wurde einer Verknüpfungsreaktion in Übereinstimmung mit Beispiel P-6 (A) unterworfen. Ein aliquoter Teil (5 μΐ) der resultierenden Verknüpfungsmischung wurde dann zur Transformation von E. coli JM 103 unter den Bedingungen des Beispiels P-4 (B) eingesetzt. Eine Anzahl (200) der resultierenden transformierten Zellen wurden einzeln im TBW-Test und im T. ni-Test (ohne vorherige Kenntnis, welches Codon in der Position XXX in dem jeweiligen besonderen Klon vorhanden ist) unterworfen. Es wurde dabei eine gewisse Aktivität gefunden, die ziemlich gut zeigt, daß alle verschiedenen Mutanten zu einem insektizid aktiven Protein-Produkt führten, das eine Aktivität aufwies, die wenigstens etwa im Bereich des (verkürzten) Kontroll-Endotoxins lag. Ebenfalls ergaben sich Mutanten, deren Aktivität klar (um den Faktor 5 gegenüber dem Kontrollwert) darüber lag.
Davor wurden zufällige Zellen aus der Transformation ebenso selektiert, ausgestrichen und Kolonien wie in Beispiel P-l gezüchtet, um Plasmid-DNA für die DNA-Sequenz-Analyse durch Klonierung des Barn Hl/Xba I-Fragments in die Sequenz-Vektoren MP 18 und MP 19, die mit denselben Enzymen behandelt worden waren, zu isolieren. Die DNA im Bereich jedes der elf in der Position 116 mutierten Mutanten und die identifizierten, in der Wirkung verbesserten Mutanten, wurden dann sequenziert, um die Aminosäure-Reste zu bestimmen, für die an der Position 116 kodiert wird. Es wurde gefunden, daß eine der beiden verbesserten Mutanten (up-mutants) die ursprüngliche verbesserte Mutante war (116-Lys, aber kodiert durch AAA). Die andere verbesserte Mutante (up-mutant) wurde als 116-Arg identifiziert; hierfür kodierte CGT. Es wurde herausgefunden, daß einer der anderen Klone der native Klon mit 116-Glu war (wofür allerdings GAA kodierte). Sieben der anderen leichten Mutanten waren die folgenden (in Klammer ist die Kodierung angegeben): 116-Ile (ATI), 116-Cys (TGC), 116-Leu (CTC), 116-Asp (GAT), 116-Asn (AAQ, 116-Ile (ATT) und 116-Gly (GGA).
Alle waren nur einfach vertreten mit Ausnahme des neuen 116-Ile (ATT), der durch zwei der Klone wiedergegeben war. Die letzten Klone kodierten für 116-Stop (TGA). (B) Verfahrensweise aus Teil (A) dieses Beispiels 2 wurde für die Aminosäure-Position 119 unter Verwendung der DNA wiederholt, die in Figur 3 B gezeigt ist. Wieder ergab die zufällige Bewertung einer großen Zahl von resultierenden Klonen eine Aktivität im TBW-Test und im T. ni-Test und zeigten damit ziemlich deutlich, daß alle mutanten Klone aus dieser Gruppe aktiv waren. Der Prozentanteil inaktiver Moleküle war näherungsweise gleich dem Wert, der für die Häufigkeit der Stop-Codons UAA, UAG und UGA γοη der zufälligen Eingabe der Nucleotide in die XXX-Position durch die Maschine erwartet würde. Es wurde herausgefunden, daß sieben zufällig selektierte individuelle Klone eine Aktivität aufweisen, die annäherungsweise wenigstens so groß ist wie die des Endotoxins mit der verkürzten nativen Sequenz, wie es durch prAK produziert wird. Keines war jedoch eine verbesserte Mutante (up mutant) im Sinne des -22-
AT 396 940 B willkürlichen Standards. Eine Sequenzierung der sieben individuellen Klone zeigte, daß sie alle unterschiedlich und nur einmal vorhanden waren. Die Positionen der geänderten Aminosäuren bzw. ihre Kodierung (in Klammem) ist wie folgt: 119-Leu (CTA), 119-Tyr (TAG), 119-Asp (GAT), 119-His (CAT), 119-Pro (CCA), 119-Ile (ATT) und 119-Ser (TCT).
Bsispisll
Mutantes B. t.-Endotoxin voller Länge
Das Plasmid pBT 210 (1 μ0) wurde gleichzeitig mit den Restriktionsendonucleasen Bam HI (8 Einheiten) und Sst 1 (8 Einheiten) 60 Minuten lang in 100 mM Natriumchlorid-Pufferlösung behandelt, die auch 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 und 100 ug/ml Rinderserumalbumin enthielt. Das größere Fragment von etwa 7180 Basepaaren wurde zur Verwendung als Vektor über ein Gel gereinigt.
Dann wurde ein 1 μg des Plasmids prAK-26-3 (mit den Mutationen Ala —> Thr No. 119, Met —> Ile No. 130 und Gly —> Asp No. 201) auch gleichzeitig mit den Restriktionsendonucleasen Bam HI (8 Einheiten) und Sst I (8 Einheiten) 60 Minuten in 100 mM Natriumchlorid-Pufferlösung behandelt, die auch 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 und 100 μg/ml Rinderserumalbumm enthielt. Das kleinere Fragment von etwa 1428 Basepaaren, das die Mutationen wie auch den B. t-RBS-Abschnitt enthielt, wurde über ein Gel gereinigt. Dieses Fragment wurde in einer Menge von etwa 0,06 pmol zur Verknüpfung mit 0,02 pmol des 7180 Basepaare umfassenden Vektor-Fragments, das wie oben beschrieben erhalten worden war, kombiniert und zusammen in 201 eines Ligations-Mediums vereint, das 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2,1 mM Dithiothreit(ol), 50 Μ ATP und 20 Einheiten T4 DNA-Ligase enthielt. Die resultierende Mischung wurde 4 Stunden bei 14 °C inkubiert. Das resultierende Plasmid, genannt pBT 26-3 wurde in E. coli JM 103 durch Zusatz von 5 μΐ der Ligationsmischung zu 0,2 ml der E. coli JM 103 enthaltenden Flüssigkeit transformiert. Die Mischung wurde anfänglich 30 Minuten bei 0 °C gehalten, danach 2 Minuten bei 42 °C pulsiert und dann wieder auf Eis gebracht Verschiedene Mengen (2 μΐ, 20 μΐ und 180 μΐ) der resultierenden Mischung wurden dann sofort auf YT-Agarplatten mit 20 ug/ml Chloramphenicol (YT-Brühe plus 1,5 % Bacto-Agar) aufgesprüht. Die Platten wurden umgekehrt bei 37 eC über Nacht inkubiert. Nur eine transformierte Zelle mit Chloramphenicol-Resistenz konnte auf diesen Platten wachsen. Chloramphenicol-resistente Kolonien wurden bei 37 °C über Nacht in Flüssigkeitskultur gezüchtet, und einer Plasmid-DNA wurde zur Restriktions-Behandlung (restriction digestion) mit EcoRI-Reagentien und zur DNA-Sequenzierung hergestellt, um tatsächlich die Gegenwart von Punkt-Mutationen zu bestimmen. Erfolgreiche Transformanten, die das Plasmid pBT 26-3 enthielten, wurden dann im TBW-Test und im T. ni-Test bewertet.
Bei Vorgehen analog zu dem oben beschriebenen Beispiel 3 wurden die nachfolgend angegebenen weiteren mutanten Endotoxine voller Länge hergestellt und im TWB-Test und im T. ni-Test bewertet. Die nachfolgende Tabelle F gibt die so hergestellten Plasmide/Zellsysteme an, die die zusätzlichen mutanten Endotoxine voller Länge produzieren. Alle Angaben enthalten auch die ungefähren Ergebnisse ihrer Bewertung im TWB-Test. In der Tabelle sind auch die ungefähren Ergebnisse enthalten, die in diesem Test für das Produkt des obigen Beispiels 3 erhalten wurden, sowie für das native Endotoxin aus B. t wuhanensis, das in E. coli JM 103 produziert wurde, und eine Kontrollsubstanz, die aus untransformierten JM 103-Zellen stammt.
Tabelle F
Beispiel Nr. Identifikation des neuen mutanten Plasmids voller Länge Herkunft der mutanten Bam Hl/Sst I Sequenz Tatsächliche betroffene Mutation(en) Toxizitäts- Wert (TBW-Test) 3 pBT26-3 prAK-26-3 119-Thr 130-Ile 201-Asp 1 3-A pBT36a65 prAK-36a6 122-Ile 125-Val 2 3-B pBT-C prAK-C 116-Lys 1 3-C pBT-E prAK-E 130-Ile 201-Asp 2 -23- AT 396 940 B Tabelle F (Fortsetzung)
Beispiel Nr. Identifikation des neuen mutanten Plasmids voller Länge Herkunft der mutanten Barn Hl/Sst I Sequenz Tatsächliche betroffene Mutation(en) Toxizitäts- Wert (TBW-Test) 3-D pBT-0 prAK-0 116-Lys 217-His 2 3-E pBT-R prAK-R 101-Lys 116-Lys 122-Ile 125-Val 2 3-F pBT98cl prAK-98cl 188-Ser 2 3-G pBT-B prAK-B 119-Thr 2 3-H pBT-D prAK-D 217-His 3 3-1 pBT-F prAK-F 187-Thr 2.5 3-J pBT-J prAK-J 101-Lys 116-Lys 130-Ile 201-Asp 3 3-K pBT-M prAK-M 119-Thr 217-His 2.5 3-L pBT-N prAK-N 119-Thr 187-Thr 3 3-M pBT-S prAK-S 119-Thr 188-Ser 1 3-N pBT-T prAK-T 116-Lys 188-Ser 1.5 3-0 pBT-U prAK-U 101-Lys 116-Lys 188-Ser 2 3-P pBT107c22 pl07c22 94-Lys 194-Lys 3 3-Q pBT99c62 p99c26 4-Thr 105-Tyr 204-Tyr 3 3-R pBT107c25 pl07c25 184-Ile 3 3-S pBT-A prAK-A 101-Lys 116-Lys 3 3-T pBT-K prAK-K 101-Lys 116-Lys 187-Thr 3 -24- AT 396 940 B Tabelle F (Fortsetzung
Beispiel Nr. Identifikation des neuen mutanten Plasmids voller Länge Herkunft der mutanten Bam ΗΙ/Sst I Sequenz Tatsächliche betroffene Mutation(en) Toxizitäts- Wert (TBW-Test) 3-U pBT-P prAK-P 119-Thr 122-Ile 125-Val 2.5 3-V pBT-Q prAK-Q 116-Lys 122-Ile 125-Val 3 3-W pBT39 prAK-39 105-Tyr 188-Ser 3 3-X pBT70 prAK-70 119-Thr 184-Ile 1 3-Y pBT68 prAK-68 105-Tyr 130-Ile 201-Asp 1 3-Z pBT53 prAK-53 105-Tyr 184-Ile 3 Kontrolle B.T. Wuhanensis - - 3 Kontrolle JM103 - - 4.7
Beisniel 4
Weitere mutante B. t-Endotoxine voller Länge
Das Plasmid pBT 210 (1 ßg) wurde gleichzeitig mit den Restriktionsendonucleasen Bam HI (8 Einheiten) und Sst I (8 Einheiten) behandelt. Das resultierende, 7180 Basepaare umfassende große Fragment wurde über ein Gel isoliert In einer Serie getrennter Versuche wurde jedes (1 pg) der Plasmide prAK, prAK-E, p26-3, p36a65 und p95a86 ebenfalls gleichzeitig mit den Restriktionsendonucleasen Bam HI (8 Einheiten) und Sst I (8 Einheiten) behandelt Jedes der resultierenden 1428 Basepaare enthaltende Fragment einschließlich eines Abschnitts einer verkürzten für ein Endotoxin kodierenden Sequenz wurde über ein Gel isoliert. Jede Menge dieser 1428 Basepaare umfassende Fragmente wurde dann separat mit der Restriktionsendonuclease Fnu D2 (4 Einheiten in 6 mM NaCl, 6 mM Tris HCl (pH 7,4), 6 mM MgCl2,6 mM 2-Mercaptoethanol und 100 pg/ml Rinderserumalbumin) behandelt Die Restriktionsendonuclease Fnu D2 (auch bekannt als Acc 2) schneidet jedes der verschiedenen 1428 bp Bam ΉΙ/Sst I-Fragmente nur einmal und zwar in ein 640 bp Bam m/Fnu D2-Fragment und ein 788 bp Fnu D2/Sst I-Fragment Die verschiedenen Fragmente jedes Experiments wurden über Agarosegel-Elektrophorese gereinigt
Auf diesem Wege wurde eine Anzahl von verschiedenen 640 bp Bam HI/Fnu D2-Fragmenten und eine Anzahl von verschiedenen 788 bp Fnu D2/Sst I-Fragmenten erhalten. Durch Auswählen eines Fragments aus jedem dieser beiden Serien und Verknüpfen (vergleiche Beispiel P-6 B) mit dem größeren 7180 bp-Fragment das aus pBT 210 erhalten worden war, ließ sich eine Zahl neuer Plasmide herstellen, die verschiedene mutante B. t.-Endotoxin-Gene voller Länge enthalten. Die so erhaltenen neuen Plasmide, die in der nachfolgenden Tabelle G identifiziert sind, wurden dann zur Transformation von E. coli JM 103 entsprechend der Vorgehensweise von Beispiel P-4 (A) eingesetzt. Die resultierenden Zellen wurden hinsichtlich der Produktion von B. L-Endotoxin im TBW-Test gemäß Beispiel A bewertet Die ungefähren Ergebnisse dieses Tests sind ebenfalls in Tabelle G -25-
AT396940B angegeben. Verschiedene der transformierten, Plasmide enthaltenden Zellen, wie sie in den Tabellen F und G beschrieben sind, wurden auch im T. ni-Test bewertet. Die Ergebnisse sind weiter unten in Tabelle H angegeben.
Tabelle G
Beispiel Test) Nr. Identifikation des neuen mutan-ten Plasmids voller Länge Herkunft Bam HI/Fnu D2-Fragment Herkunft FnuD2/ Sst I-Fragment Tatsächliche betroffene Mutation(en) Toxizitäts- Wert (TBW- 4-A 66 p36a65 p26-3 122-Be 125-Val 201-Asp 3 4-B 67 p26-3 p95a86 119-Thr 130-Be 188-Ser 1 4-C 74 p36a65 p95a86 122-Ile 125-Val 188-Ser 3 4-D 106 p26-3 prAK 119-Thr 130-Be 1 4-E 107 prAK p26-3 201-Asp 2.5 4-F 108 prAK-E prAK 130-Be 3
Tabelle H
Plasmid-Identifikation Plasmid aus Tabelle Relative Wirksamkeit pBTA F 391 pBTC F 299 pBT66 F 169 pBT107c25 F 254 pBTP F 340 pBTS F 255 pBT67 G 304 pBT106 G 367 Standard pBT301 100 Kontr. SAN415 59 Kontr. CAG629 0
Beispiel 5
Zellen, die mit DNA transformiert worden waren, die für eine mutante Endotoxin-Sequenz kodiert, wurden in einem Fermenter unter bekannten und für diese Zwecke Standardbedingungen gezüchtet. Der gesamte Feimenterinhalt wurde am Ende der Zellwachstumsperiode und unmittelbar vor der Produktgewinnung, auf eine Temperatur von ungefähr 70 bis 80 °C erhitzt. Diese Temperatur wurde 10 Minuten aufrecht erhalten, bevor der Fermenter abgekühlt wurde. Sie ist ausreichend zur Inaktivierung der rekombinanten Mikroorganismen, ohne die biologische Aktivität des Endotoxin-Proteins zu beeinträchtigen. Der Fermenterinhalt wurde dann unter vermindertem Druck verdampft, um das Volumen auf ein Drittel des vorangegangenen Volumens aufzukonzentrieren. Das resultierende Konzentrat wurde dann bei einem -26-
Claims (23)
- AT396940B Einlaßdruck von etwa 2000 psi getrocknet, wobei ein aufgeheizter Gegenluftstrom mit einer Einlaßtemperatur von 140 bis 160 °C und einer Auslaßtemperatur von 20 - 50 °C eingesetzt wurde. Das resultierende Pulver wurde mit einem Träger gemischt, beispielsweise mit entfettetem Sojabohnenmehl, wobei sich ein benetzbares Konzentrat bildete. Geeignete Mengenverhältnisse der Komponenten hängen im allgemeinen von der gewünschten Stärke des Endprodukts ab, können jedoch beispielsweise bei 60 : 40 (Gewichtsteile Pulver : Träger) liegen. Das resultierende Konzentrat enthält vorzugsweise 0,4 bis 10 %, noch mehr bevorzugt 0,8 bis 8 % aktiven Bestandteil, angegeben als Spuren oder Endotoxin-Protein. Das benetzbare Pulver wird in geeigneter Weise mit Wasser verdünnt, wie es im Stand der Technik für die Sprühanwendung bekannt ist Die besonders bevorzugten Mutationen gemäß der Erfindung schließen solche an den Positionen 116 (Lys oder Arg), 119 (Thr), 130 (Ile) und 188 (Ser) ein. Kombinationen davon schließen eine oder mehrere der genannten Mutationen ein, wie sie beispielsweise in pBT26-3, pBT-106, pBT-68, pBT-C, pBT-67 und pBT-70 zu finden sind. Einige von den genannten finden sich in Tabelle G. Ebenfalls von bevorzugtem Interesse sind die einzelnen und kombinierten Mutationen in p36a65, insbesondere für die gekürzten Endotoxine. Die Mutationen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung an der Aminosäure-Position 4 gefunden werden und erlaubt sind, sind von Interesse, da sie in einen Abschnitt von 25 Aminosäuren fallen (Positionen 1 bis einschließlich 25 in Figur 6), von dem postuliert wird, daß er auch einen Prä-Toxin- oder Protoxin-Abschnitt des Endotoxins bildet, der im Darm durch eine Protease abgespalten wird, wobei sich das aktive Endotoxin oder das aktivere Endotoxin bildet. Die in Position 4 erlaubten Mutationen sind also relevant für die Endotoxin-Sequenzen, die die genannten 25 Aminosäuren umfassen, oder im wesentlichen (mindestens 70 %) Homologie damit aufweisen. Sie sind - genauer gesagt - relevant für solche Endotoxine, die in diesem Bereich eine DNA kodiert, die vor der Mutation in 4-Position hybridisieren würde, und unter stringenten Bedingungen für eine DNA, die die in Figur 6 gezeigte Sequenz für die Nucleotid-Positionen von der Nueleotid-Position 1 bis einschließlich zur Nucleotid-Position 75 aufweist, unabhängig von Streichungen und Zusätzen und unter äquivalenter Kodierung entsprechender Aminosäuren, wie sie voranstehend im Zusammenhang mit dem entscheidenden, 116 Aminosäurereste umfassenden Sequenzbereich diskutiert wurden. Die durch die erfindungsgemäßen Arbeiten entdeckte Mutation an der Aminosäure-Position 217, wie sie in der obigen Tabelle A wiedergegeben ist und in der vorliegenden Beschreibung an anderer Stelle gewürdigt wurde, zeigt - wie angenommen wird - daß alle natürlich kodierten Aminosäuren an dieser Position in aktiven Endotoxinen mit der in Figur 6 gezeigten relevanten Sequenz stehen können. Diese Sequenz erstreckt sich vom Ende der 116 Aminosäuren umfassenden Referenz-Sequenz bis einschließlich zur Aminosäure-Position 217. Entsprechend liegt der Fall, in dem die Aminosäure an Position 217 in einer solchen Sequenz oder einer äquivalenten Sequenz eine beliebige natürlich kodierte Aminosäure mit Ausnahme von Arg ist, im Bereich der vorliegenden Erfindung. Da allerdings die angegebene Mutation in Position 217 zu weniger interessanten Ergebnissen führte, ist diese Position hauptsächlich von Interesse in Kombination mit anderen Mutationen, die in der vorliegenden Anmeldung offenbart sind, und gibt an, daß Position 217 in Endotoxinen, in denen natürlicherweise Arg an dieser Position erscheint, verändert werden kann. PATENTANSPRÜCHE 1. Strukturgen, umfassend eine DNA, die für ein Endotoxin-Protein mit toxischer Aktivität gegen Insekten kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA einen Abschnitt entschließt, der für eine Aminosäure-Sequenz kodiert, die im wesentlichen Homologie mit der 116 Aminosäuren umfassenden Sequenz zeigt, die bei der Position m-1 beginnt und sich bis zur Position m-116 in Figur 6 erstreckt, wobei sich die Positions-Zahlen auf eine derartige homologe Sequenz unabhängig von Streichungen oder Zusätzen beziehen, worin die DNA in der Weise modifiziert ist, daß sie für eine oder mehrere der nachfolgend genannten Aminosäuren an den angegebenen Aminosäure-Bezugspositionen kodiert; (a) an Position m-5 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn; (b) an Position m-6 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Gin; (c) an Position m-12 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Glu; (d) an Position m-16 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn; (e) an Position m-27 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Glu; (f) an Position m-30 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala; (g) an Position m-33 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Thr; -27- AT396940B (h) an Position m-34 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn; (i) an Position m-36 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala; (j) an Position m-41 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Met; (k) an Position m-95 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Phe; (l) an Position m-98 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala; (m) an Position m-99 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Tbr; (n) an Position m-105 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Am; und (o) an Position m-112 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Gly.
- 2. Strukturgen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Homologie zwischen der Aminosäure-Sequenz, für die der Abschnitt der DNA des Strukturgens kodiert, und der 116 Aminosäuren umfassenden Sequenz, die bei Position m-1 beginnt und sich bis zur Position m-116 in Figur 6 erstreckt, wenigstens 70 % ist
- 3. Strukturgen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA so modifiziert worden ist, daß sie für eine oder mehrere der nachfolgend angegebenen Aminosäuren an den angegebenen Aminosäure-Bezugspositionen kodiert; (a) an Position m-5 Lys; (b) an Position m-6 Lys; (c) an Position m-12 Lys; (d) an Position m-16 Tyr; (e) an Position m-27 Lys oder Arg; (f) an Position m-30 Thr; (g) an Position m-33 He; (h) an Position m-34 Tyr; (i) an Position m-36 Val; Cj) an Position m-41 He; (k) an Position m-95 He; (l) an Position m-98 Thr, (m) an Position m-99 Ser, (n) an Position m-105 Lys; und (o) an Position m-112 Asp.
- 4. Strukturgen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA in der Weise modifiziert wurde, daß sie eine Änderung an einer oder beiden Aminosäure-Bezugspositionen m-27 und m-30 einschließt.
- 5. Strukturgen nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der DNA-Abschnitt ohne eine der in den Ansprüchen 1 bis 4 spezifizierten Modifikationen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zu einem 348 Nucleotide umfassenden Oligomer hybridisiert, das die in Figur 6 abgebildete Nucleotid-Sequenz aufweist, die bei Position n-1 beginnt und sich bis zur Nucleotid-Position n-348 erstreckt
- 6. Strukturgen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der DNA-Abschnitt vor jeder Modifikation, wie sie in den Ansprüchen 1 bis 4 spezifiziert ist, für die 116 Aminosäuren umfassende Sequenz von Figur 6 kodiert, die bei Position m-1 beginnt und sich bis zur Position m-116 erstreckt
- 7. Strukturgen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Endotoxin kodierende DNA eine DNA umfaßt, die für die Aminosäure-Sequenz in Figur 6 kodiert, die bei der Aminosäure-Position 1 beginnt und sich bis zur Aminosäure-Position 205 erstreckt
- 8. Strukturgen umfassend eine DNA, die für ein Endotoxin-Protein mit toxischer Aktivität gegen Insekten kodiert dadurch gekennzeichnet, daß die DNA einen Abschnitt aufweist der für eine Aminosäure-Sequenz kodiert daß die im wesentlichen Homologie der Aminosäuren zu der 205 Aminosäuren umfassenden Sequenz zeigt die bei der Aminosäure-Position 1 beginnt und sich bis zur Aminosäure-Position 205 in Figur 6 erstreckt worin die Aminosäure in Position Nummer 4 eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Asn ist
- 9. Strukturgen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure in Position 4 Tyr ist
- 10. Expressions-Vektor umfassend das Strukturgen nach einem der Ansprüche 1 bis 9 unter Kontrolle einer DNA, die in der Weise funktionsfähig ist daß sie die Expression des Strukturgens in einem bakteriellen Wirt bewirken kann. -28- AT 396 940 B
- 11. Expressions-Vektor nach Anspruch 10, worin das Gen unter Kontrolle einer DNA ist, die in der Weise funktionsfähig ist, daß sie die Expression des Gens in E. coli bewirkt
- 12. Expressions-Vektor nach Anspruch 10, worin das Gen unter Kontrolle einer DNA ist, die in der Weise funktionsfähig ist, daß sie die Expression des Gens in Bacillus thuringiensis hervoiruft.
- 13. Endotoxin-Protein mit toxischer Aktivität gegen Insekten, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein einen Aminosäure-Sequenz-Abschnitt umfaßt, der im wesentlichen Homologie mit der 116 Aminosäuren umfassenden Sequenz aufweist, die bei Position m-1 beginnt und sich bis zur Position m-116 in Figur 6 erstreckt, wobei die Positions-Zahlen auf eine solche homologe Sequenz unabhängig von Streichungen oder Zufügungen zutreffen, worin eine oder mehrere der folgenden Aminosäuren an den angegebenen Aminosäure-Bezugspositionen stehen: (a) an Position m-5 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn; (b) an Position m-6 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Gin; (c) an Position m-12 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Glu; (d) an Position m-16 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn; (e) an Position m-27 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Glu; (f) an Position m-30 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala; (g) an Position m-33 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Thr; (h) an Position m-34 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn; (i) an Position m-36 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala; (j) an Position m-41 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Met; (k) an Position m-95 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Phe; (l) an Position m-98 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala; (m) an Position m-99 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Thr; (n) an Position m-105 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn; und (o) an Position m-112 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Gly.
- 14. Endotoxin-Protein nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Homologie zwischen dem Aminosäure-Sequenz-Abschnitt und der 116 Aminosäuren umfassenden Sequenz, die bei Position m-1 beginnt und sich bis zur Position m-116 in Figur 6 erstreckt, wenigstens 70 % ist.
- 15. Endotoxin-Protein nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß für eine oder mehrere der nachfolgend genannten Aminosäuren an den angegebenen Aminosäure-Bezugspositionen kodiert wird: (a) an Position m-5 Lys; (b) an Position m-6 Lys; (c) an Position m-12 Lys; (d) an Position m-16 Tyr, (e) an Position m-27 Lys oder Arg; (f) an Position m-30 Tyr, (g) an Position m-33 Ile; (h) an Position m-34 Ihr; (i) an Position m-36 Val; (j) an Position m-41 Ile; (k) an Position m-95 De; (l) an Position m-98 Thr; (m) an Position m-99 Ser; (n) an Position m-105 Lys; und (o) an Position m-112 Asp.
- 16. Endotoxin-Protein nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder beide der Aminosäuren an den Bezugspositionen m-27 und m-30 ausgewechselt wurden.
- 17. Verfahren zur Herstellung eines Endotoxin-Proteins gekennzeichnet durch die folgende Schritte: Transformieren oder Transfektieren einer Zelle mit einem Expressions-Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und Züchten der resultierenden Zellen zur Produktion des Endotoxins.
- 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die transformierte oder transfektierte Zelle eine Pflanzenzelle ist. -29- AT 396 940 B
- 19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die transformierte oder transfektierte Zelle eine Bakterienzelle ist.
- 20. Bakterienzelle, umfassend einen Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 10 bis 12.
- 21. DNA-Sequenz umfassend eine DNA, die die Sequenz von Nucleotid-Position n-1 bis zur Nucleotid-Position n-348 gemäß Figur 6 aufweist oder mutante Variationen davon, und die eine oder mehrere voneinander räumlich getrennte Restriktionsstellen hat, die aus der Gruppe Hind m, Mst Π, Bssh II, Bai I und Mlu I bestehen, wobei die Restriktionsstellen die Sequenz der Aminosäure nicht ändern, für die die DNA kodiert
- 22. Insektizide Zusammensetzung, gekennzeichnet durch eine insektizid wirksame Menge eines Proteins, das mit Hilfe einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9 produziert wurde, zusammen mit einem für die Landwirtschaft annehmbaren Träger.
- 23. Insektizide Zusammensetzung, gekennzeichnet durch eine insektizid wirksame Menge eines Proteins, nach einem der Ansprüche 13 bis 16 zusammen mit einem für die Landwirtschaft annehmbaren Träger. Hiezu 11 Blatt Zeichnungen -30-
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16023388A | 1988-02-25 | 1988-02-25 |
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