DE3905865A1 - Bacillus thuringiensis gene und toxine - Google Patents
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Description
Bacillus thuringiensis (B. t.) ist ein sporulierendes Bakterium,
das am Ende des vegetativen Stadiums des Wachstums ein proteinartiges
kristallines delta-Endotoxin produziert. Bei der Einnahme
durch bestimmte Insekten erzeugt dieses Endotoxin toxische Wirkungen,
die einen Stillstand der Nahrungsaufnahme, Fehlfunktion des
Gastrointestinal-Traktes, Austrocknen und letztendlich den Tod zur
Folge haben. Das delta-Endotoxin stammt im allgemeinen von einem
Plasmid und wird als inaktive Vorstufe oder Protoxin mit einem Molekular
gewicht von 130 000 bis 140 000 Dalton hergestellt (Calabrese,
Canad. J. Microbiol. 26 (1980) 1006). Normalerweise findet
im Insektendarm als Ergebnis der Einwirkung der Darm-Proteasen
eine proteolytische Spaltung statt, wobei etwa die zum C-terminalen
Ende gelegene Hälfte sowie möglicherweise einige Aminosäuren
am N-terminalen Ende entfernt werden. Diese Spaltung ist erforderlich,
um das aktive Toxin mit einem Molekulargewicht von 65 000
bis 70 000 Dalton herzustellen (Tyrrel et al, J. Bacteriology 145
(1981) 1052).
Eine große Zahl von Unterarten (Subvarietäten) von B. t. sind
identifiziert worden. Obwohl die meisten davon eine spezifischere
oder erhöhte Toxizität gegenüber Insekten der Ordnung Lepidoptera
zeigen, konnte belegt werden, daß eine begrenzte Zahl von ihnen
auch toxisch gegenüber Insekten anderer Klassen sind. Beispielsweise
weist B. t. israelensis Toxizität gegenüber Diptera-
(Zweiflügler-)Larven (Moskitos und Schwarze Fliegen) auf. Außerdem
wurden jüngst zwei andere Unterarten identifiziert, die Toxizität
gegenüber Coleoptera-Larven zeigen (Hofte et al, Nuc. Acid. Res.
15 (17) (1987) 7183).
Obwohl viel Arbeit in der Herstellung verkürzter Toxine und Strukturgene,
die für diese kodieren, geleistet wurde, scheint weniger
über die Fähigkeit der delta-Endotoxine von B. t., Punktmutationen
im aktiven oder toxischen Bereich der Endotoxin-Sequenz zu überstehen,
und über die Wirkung solcher Mutationen auf die Aktivität
des Toxinmoleküls bekannt zu sein.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Mutanten des
aktiven Abschnitts der delta-Endotoxine von B. t. bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung
von Mutationen, die wirksam sind in der gezielten Bildung
einer dem B. t.-Endotoxin gleichen Aktivität sowohl in abgespaltenen
delta-Endotoxin-Formen als auch in solchen voller Länge.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Mutationen
bereitzustellen, die die insektizide Aktivität von B. t.-
delta-Endotoxin-Strukturen erhöhen.
Nach der zufälligen Bildung vereinzelter und vielfacher Punktmutationen
in vielen hundert DNA-Strängen, die für einen großen Abschnitt
des aktiven Teils eines repräsentativen B. t.-Endotoxins
kodiert, das insektizide Aktivität gegen Lepidoptera aufweist,
wurden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durch Rekombinations
verfahren verschiedene Mutanten von B. t.-Endotoxinen
isoliert und hergestellt, die die charakteristische insektizide
Aktivität gegen Lepidoptera zeigen, die auch das B. t.-delta-Endotoxin
des Wild-Typs aufweist. Darüberhinaus deutet es sich an, daß
die Codons, die für jede beliebige andere natürliche Aminosäure
kodieren, an diesen entdeckten Mutationspunkten substituiert werden
können, um das aktive Endotoxin-Protein herzustellen. Es wurde
auch gefunden, daß eine Anzahl der zufälligen Mutationen zu einer
höheren insektiziden Aktivität führen. Eine solche Aktivität kann
beispielsweise in dem Test an dem Tabak-Knospenwurm (Heliothis
virescens) oder dem Test an Trichoplusia ni (Kohlspinner), wie sie
nachfolgend beschrieben werden, gezeigt werden. In vielen Fällen
war dieser Anstieg insofern ganz bemerkenswert, als eine Aktivität
erreicht wurde, die wenigstens zweimal oder ein mehrfaches
größer ist als die Aktivität der Ausgangs-Endotoxinstruktur. Vielfach-
Mutationen (üblicherweise zwei oder drei Aminosäuren pro mutiertem
DNA-Strang) wurden auch einzeln und in verschiedenen Kombinationen
bewertet, um bestimmte noch wirkungsvollere Mutationen
und deren Kombinationen zu identifizieren. Es wurde auch herausgefunden,
daß die Mutationen im Rahmen der vorliegenden Erfindung
mit einer Ausnahme innerhalb der Aminosäuresequenz-Bereiche liegen,
die in hohem Maße bei einer großen Vielzahl von B. t.-delta-
Endotoxinen des Wild-Typs erhalten bleiben. Es deutet sich also
die allgemeine Anwendbarkeit der durch die Erfindung bereitgestellten
Mutationen auf eine große Vielzahl von Endotoxinstrukturen
an, in denen solche erhaltenen Bereiche insektizide B. t.-Endotoxine
ergeben.
Insbesondere wird auf die Aminosäure-Sequenz und deren Numerierung
in der weiter unten folgenden Tabelle A verwiesen. Die in der Tabelle
angegebene Aminosäure-Sequenz beginnt mit dem Rest Methionin
(Met) an Position Nr. 1 und dem N-Ende des in Tabelle A gezeigten,
gegen Lepidoptera aktiven repräsentativen Endotoxins. Es wurde gefunden,
daß das B. t.-Endotoxin-Protein, das sonst insektizide Aktivität
gegen Lepidoptera-Insekten in der Weise wie native B. t.-
Endotoxine aufweist, wenn diese innerhalb des aktiven Abschnitts
eine Aminosäure-Restsequenz enthalten, die die gleiche ist wie
oder im wesentlichen homolog ist zu der in Tabelle A gezeigten Sequenz
für die 116 Aminosäure-Reste umfassende Sequenz der Positionen
einschließlich 90 bis einschließlich 205 (auch Aminosäure-
Positionen m-1 bis m-116), eine oder mehrere Reste der folgenden
Aminosäuren an den angegebenen oder äquivalent homologen Positionen
aufweisen kann, wobei die Zahlen der m-Positionen in Klammern
unter Bezugnahme auf die 116 Aminosäure-Reste umfassende Sequenz
angegeben sind:
- a) an Position 94 (Position m-5 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz jede natürliche Position, die durch den genetischen Code kodiert wird, mit Ausnahme von Asn;
- b) an Position 95 (Position m-6 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Gln;
- c) an Position 101 (Position m-12 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Glu;
- d) an Position 105 (Position m-16 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Asn;
- e) an Position 116 (Position m-27 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Glu;
- f) an Position 119 (Position m-30 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Ala;
- g) an Position 122 (Position m-33 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Thr;
- h) an Position 123 (Position m-34 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Asn;
- i) an Position 125 (Position m-36 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Ala;
- j) an Position 130 (Position m-41 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Met;
- k) an Position 184 (Position m-95 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Phe;
- l) an Position 187 (Position m-98 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Ala;
- m) an Position 188 (Position m-99 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Thr;
- n) an Position 194 (Position m-105 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Asn;
- o) an Position 201 (Position m-112 der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz) jede derartige natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Gly;
Darüberhinaus schließt die Erfindung, ebenfalls unter Bezugnahme
auf die numerierte Aminosäure-Sequenz in Tabelle A, den Wechsel
der Aminosäure Asn an der Aminosäure-Position 4 zu jeder anderen
natürlichen Aminosäure ein, die durch den genetischen Code kodiert
wird.
Im nachfolgenden wird wiederum auf die gesamte Vollsequenz Bezug
genommen, wie sie in Tabelle A gezeigt wird, wie auch auf die 116
Reste umfassenden Sequenz. In Hinblick auf die Aminosäure-Reste,
die erfindungsgemäß innerhalb der 116 Reste umfassenden Sequenz
bereitgestellt werden, ist es in Übereinstimmung mit der Erfindung
bevorzugt, daß eine solche Sequenz durch eine oder mehrere der
nachfolgend genannten Aminosäure-Reste an den genannten Positionen
charakterisiert ist:
- a) Lys an Position 94 (Position 5 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- b) Lys an Position 95 (Position 6 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- c) Lys an Position 101 (Position 12 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- d) Tyr an Position 105 (Position 16 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- e) Lys oder Arg, bevorzugter Arg, an Position 116 (Position 27 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- f) Thr an Position 119 (Position 30 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- g) Ile an Position 122 (Position 33 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- h) Tyr an Position 123 (Position 34 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- i) Val an Position 125 (Position 36 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- j) Ile an Position 130 (Position 41 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- k) Ile an Position 184 (Position 95 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- l) Thr an Position 187 (Position 98 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- m) Ser an Position 188 (Position 99 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- n) Lys an Position 194 (Position 105 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
- o) Asp an Position 201 (Position 112 der 116 Reste umfassenden Sequenz);
Wenn der Rest Asn an der Aminosäure-Position 4 ausgetauscht wird,
ist es bevorzugt, daß er gegen Tyr getauscht wird.
Tabelle A am Ende dieser Beschreibung zeigt eine Nucleotid-Sequenz
und die resultierende davon abgeleitete Aminosäure-Sequenz, die
für die Herstellung des B. t.-delta-Endotoxins in der Natur verantwortlich
ist. Mit einer Ausnahme wurde die Nucleotid-Sequenz
aus einem delta-Endotoxin produzierenden Plasmid erhalten, das in
B. t. wuhanensis gefunden wurde. Insbesondere stammt das gesamte
Strukturgen, das tatsächlich für das Endotoxin selbst kodiert, aus
B. t. wuhanensis. Die eine Ausnahme besteht darin, daß die vor Methionin
(Met) stehende Sequenz am Anfang des Strukturgens aus einem
Endotoxin produzierenden Gen stammt, das in B. t. kurstaki HD-
1 gefunden wurde. Letzteres wird das 5,3 Kb umfassende Plasmid aus
HD-1 der Hind III-Klasse genannt. Diese am oberen Ende des Gens
stehende Frequenz enthält die native ribosomale Bindungsstelle
(Ribosomal Binding Site (RBS)) des Endotoxin produzierenden B. t.
kurstaki HD-1-Plasmids. Die am oberen Ende des Gens gelegene Sequenz,
die die ribosomale Bindungsstelle enthält, wie sie in B. t.
wuhanensis gefunden wurde, unterscheidet sich wenig von der in Tabelle
A abgebildeten Sequenz für B. t. kurstaki. Die Unterschiede
werden später in der Beschreibung angegeben. Es ist allerdings zu
berücksichtigen, daß sowohl das Nucleotid als auch die Aminosäure-
Sequenzen in den jeweiligen Strukturgenen von B. t. wuhanensis und
B. t. kurstaki HD-1 vom Anfang der Endotoxin-Sequenz den ganzen
aktiven Abschnitt hindurch bis wenigstens zur Kpn I-Stelle, wie
sie in Tabelle A angegeben ist, identisch sind. Die Kpn I-Stelle
liegt im Protoxin-Abschnitt. Folglich wird der aus der Spaltung
nach Aufnahme durch das Insekt resultierende aktive Toxin-Abschnitt
sowohl für das aus B. t. wuhanensis als auch für das aus
B. t. kurstaki HD-1 stammende Endotoxin derselbe sein. In Tabelle
A sind die Aminosäuren für das Endotoxin-Protein, die als Resultat
der Expression des Strukturgens produziert werden, mit positiven
Zahlen 1 bis 1181 (unter der jeweiligen Aminosäure angegeben) angegeben.
Die Aminosäuren im untranslatierten Bereich in der Kette
vor dem 1-Met-Rest sind mit negativen Zahlen in rückwärtiger (oder
Ketten aufwärts) Richtung numeriert, wobei die Stop-Signale als
eine Aminosäure-Position gezählt sind. Nucleotide im Strukturgen
sind (nicht in Klammern) oberhalb der Reihe numeriert, in der sie
erscheinen. Die letzte Ziffer in der Bezifferung steht oberhalb
des Nucleotids, auf das die Nummer zutrifft. Nucleotide im
untranslatierten Bereich der auch die ribosomale Bindungsstelle
einschließt, sind negativ numeriert, wobei die Numerierung vom
initiierenden ATG-Codon (für den Rest 1-Met) rückwärts zählt.
Innerhalb der oben angegebenen numerierten Sequenzen ist ein Teil
mit den Bezeichnungen m-1 bis m-116 für die Aminosäuren und n-1
bis n-348 für diese Aminosäuren kodierenden Nucleotide separat
oder unter-numeriert. So wird besonders ein in hohem Maße gleichbleibender
Abschnitt bezeichnet, in dem - wie gefunden wurde - die
meisten der durch die Erfindung induzierten Mutationen liegen. Bestimmte
Restriktions-Stellen in der Nucleotid-Sequenz in Tabelle A
werden durch eine Linie oberhalb der Nucleotide angezeigt, die an
den Restriktions-Stellen beteiligt sind. In einer Fußnote wird die
spezielle Stelle bezeichnet. Der toxische Teil des in Tabelle A
gezeigten Endotoxins, wie er schon aus dem Stand der Technik bekannt
ist, schließt die Aminosäure-Sequenz ein, die bei der Aminosäure-
Position 1 (Met) beginnt und sich bis zur Aminosäure-Position
610 (Thr) erstreckt. In Hinblick auf die Natur der gesamten
in Tabelle A gezeigten DNA-Sequenz und zum leichteren Verständnis
der nachfolgenden Beschreibung ist anzumerken, daß die DNA- und
Aminosäure-Sequenzen, beginnend mit dem untranslatierten Teil in
Zeile 1 von Tabelle A und fortlaufend bis zur Kpn I-Stelle etwa
bei den Aminosäure-Positionen 724 bis 725 und auch Teile davon als
von B. t. kurstaki HD-1 (dem 5,3 Kb umfassenden Plasmid der Hind
III-Klasse) bezeichnet werden können und auch so bezeichnet werden.
Fig. 1 zeigt eine Genkarte der allgemeinen Arbeits-Plasmide prAK
und prAK-3, wie sie in verschiedenen Stufen in Zusammenhang mit
der Erfindung verwendet wurden. Fig. 1 umfaßt die DNA, die für
das abgespaltene B. t.-Endotoxin kodiert, das von B. t. kurstaki
HD-1 erhalten wurde und insektizide Aktivität gegenüber Lepidoptera
aufweist.
Fig. 2 zeigt eine Genkarte des Plasmids pB8rII, die die DNA umfaßt,
die für das abgespaltene B. t.-Endotoxin-Protein etwas
größerer Länge kodiert als das, für das prAK kodiert. Dieses wurde
ebenfalls aus B. t. kurstaki DH-1 erhalten und weist ebenfalls insektizide
Aktivität gegen Lepidoptera auf.
Die Fig. 3a und 3b zeigen zwei repräsentative doppelsträngige
DNA-Stränge, die zur Durchführung der sogenannten "Codon-Spin-Experimente"
synthetisiert werden können und auch nützlich sind für
die bequeme Einführung der gewünschten Mutationen in eine für das
B. t.-Endotoxin kodierende DNA-Sequenz.
Fig. 4 zeigt eine Genkarte des Plasmids pBT210, die die DNA umfaßt,
die für das native Endotoxin aus B. t. wuhanensis in voller
Länge kodiert. Dieses Endotoxin hat in seinem aktiven Abschnitt
genau die gleiche Aminosäure-Sequenz wie das Endotoxin aus B. t.
kurstaki HD-I, für das die Plasmide prAK und pB8rII kodieren.
Fig. 5 zeigt eine abgekürzte Genkarte des Plasmids prAK-9 zusammen
mit einer vergrößerten Abbildung eines daraus entnommenen Abschnitts.
Das Plasmid prAK-9 ist ansonsten im einzelnen dem Plasmid
prAK-3 sehr ähnlich. Der genannte Abschnitt und Unterabschnitte
davon in den Stamm-Plasmiden sind ausgesprochen nützlich
zur Durchführung der sogenannten "Codon-Spin-Experimente" und darüber
hinaus für die Einführung von Mutationen gemäß der Erfindung.
Das Plasmid prAK wurde in E. coli JM 103 bei der Agricultural Research
Culture Collection (NRRL), Peria, Illinois (USA), am 19.
Februar 1988 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL
B-18 329.
Das Plasmid pB8rII wurde in E. coli JM 103 bei der Agricultural
Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois (USA), am 19.
Februar 1988 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL
B-18 331.
Das Plasmid pBT210 wurde in E. coli JM 103 bei der Agricultural
Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois (USA), am 19.
Februar 1988 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL
B-18 330.
Wie bereits angegeben, können die Punkt-Mutationen gemäß der Erfindung
auf Endotoxin-Protein-Sequenzen angewandt werden, die von
den Arten und Unterarten von Bacillus thuringiensis produziert
werden. Diese Sequenzen weisen insektizide Aktivität gegen Larven
von Lepidoptera auf, wenn sie die oben angegebene, 116 Aminosäure-
Reste umfassende konservative Sequenz oder eine Sequenz, die mit
dieser in hohem Maße homolog ist, oder eine damit im wesentlichen
äquivalente Sequenz enthalten. Dies schließ Endotoxin-Protein-Sequenzen
ein, die vom Typ her die natürliche volle Länge aufweisen
oder im wesentlichen die volle Länge aufweisen. Eingeschlossen
sind auch solche Sequenzen, von denen durch Entfernung des gesamten,
zum Ende liegenden Protoxins oder eines Teils davon oder
eines inaktiven Abschnitts davon ein Teil abgetrennt wurde. Eingeschlossen
sind sogar solche Sequenzen, aus denen ein Teil vom zum
C-terminalen Ende liegenden Ende bis hinein in den aktiven Abschnitt
des Endotoxins abgetrennt wurde.
Wie sich bereits daraus deutlich ergibt, haben die Endotoxine aus
B. t. kurstaki und B. t. wuhanensis beide den identischen, 116
Aminosäure-Reste umfassenden konservativen Abschnitt. Andere Endotoxine
haben dieselbe, 116 Aminosäure-Reste umfassende Sequenz
oder ein dazu weitgehend homologes Äquivalent, oder es kann erwartet
werden, daß sie dieses aufweisen. Es ist beispielsweise bekannt,
daß sich aus Endotoxinen aus B. t. sotto, B. t. kurstaki
HD-73-Stamm und B. t. galleriae Endotoxine mit der identischen,
116 Aminosäure-Rest umfassenden Sequenz erhalten lassen, wenn
auch einige von diesen Endotoxinen zumindest in gewissem Umfang,
in Einzelfällen auch signifikant, sowohl hinsichtlich des Anteils
des toxischen Abschnitts des Endotoxins als auch hinsichtlich des
Protoxin-Abschnitts unterschiedlich sind. Andere Endotoxine, beispielsweise
solche von B. t. kurstaki HD-1 Dipel (ein kommerziell
erhältlicher Unterstamm), enthalten eine ausgetauschte Aminosäure
in der genannten 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz (m-59
ist Leu; dieser Rest wird kodiert TTG) und enthalten andere Änderungen,
Streichungen und/oder Zufügungen in anderen Teilen der Sequenz.
Diese und andere Sequenzen, von denen herausgefunden wurde,
daß sie einen oder mehrere Änderungen in der Sequenz, aber eine
Homologie in den Aminosäure-Resten von wenigstens 70% im Vergleich
mit der genannten, 116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz
aufweisen, können einen oder mehrere mutationsbedingte Änderungen
gemäß der Erfindung aufweisen, die an den Aminosäure-Resten in der
Sequenz durchgeführt wurden, wobei diese identisch der Aminosäure
in der 116 Aminosäure-Reste umfassenden, nicht mutierten Sequenz
entsprechen. Dies ist insbesondere dann möglich, wenn die auszutauschende
Aminosäure auf jeder ihrer Seiten zwei und bevorzugt
vier andere Aminosäure-Reste aufweist, die ebenfalls identisch den
Resten in der 116 Aminosäure-Rest umfassenden Sequenz entsprechen.
Es entspricht ebenfalls der Erfindung, daß die erfindungsgemäßen
Mutationen an entsprechenden Aminosäure-Resten in homologer Serie
durchgeführt werden können, die im wesentlichen Streichungen oder
Hinzufügungen in der Weise enthalten, daß die Sequenz selbst kürzer
oder länger ist als die angegebene 116 Aminosäure-Reste umfassende
Sequenz. In solchen Fällen bleibt die Numerierung, wie sie
in der 116 Aminosäure-Reste umfassenden Referenz-Sequenz gewählt
wurde, bestehen, so daß Streichungen in der zu ändernden Sequenz
so gezählt werden, als ob die Reste tatsächlich noch präsent seien
und Hinzufügungen in der zu ändernden Sequenz einfach nicht gezählt
werden. Es kann davon gesprochen werden, daß die Zuordnung
der Positionen der Aminosäuren unabhängig von Streichungen oder
Hinzufügungen in solch einer homologen Sequenz gemacht wurden.
Vorzugsweise sind die homologen Aminosäure-Sequenzen, in die die
mutativen Änderungen gemäß der Erfindung eingebaut werden, diejenigen,
für die eine DNA kodiert, zu der eine DNA entweder aus dem
rechtsläufigen oder dem gegenläufigen Strang (oder einem doppelten
Strang) der mit der Position n-1 beginnenden und sich bis zur Position
n-348 in Tabelle A erstreckenden DNA unter strengen Hybridisierungs
bedingungen hybridisiert, wenn für die Aminosäure-Reste
der zu mutierenden homologen Sequenz, die denen in der oben bezeichneten,
116 Aminosäure-Reste umfassenden Sequenz entsprechen,
dasselbe Codon kodiert wie für die entsprechende Aminosäure in der
Referenz-Sequenz. Verfahren zur Herstellung einer solchen Leit-Hy
bridisierungsprobe sind im Stand der Technik bekannt. Strenge Hy
bridisierungsbedingungen sind Bedingungen, bei denen die Hybridisierung
bei 60°C in einem 2,5 X-Kochsalz-Citrat-Puffer (SSC-Puffer)
durchgeführt wird und die Probe danach nur noch bei 37°C und
reduzierter Puffer-Konzentration gespült wird, was die durchgeführten
Hybridisierungsschritte nicht beeinträchtigt.
Bevorzugt werden die Mutationen in Aminosäure-Sequenzen durchgeführt,
die nicht mehr als 1, 2 oder 3 Unterschiede der Aminosäure-
Reste von den Aminosäuren in der 116 Aminosäure-Reste umfassenden
Referenz-Sequenz aufweisen. Am meisten bevorzugt ist eine Sequenz,
die mit der Referenz-Sequenz identisch ist.
Im Stand der Technik wurde bereits festgestellt, daß die 116-Aminosäure-
Reste umfassende Referenz-Sequenz ein Abschnitt in anderer
Weise im wesentlichen modifizierter oder verschiedener Endotoxin-
Protein-Sequenzen sein kann, die insektizide Aktivität gegen Larven
von Lepidoptera aufweisen. Andere Modifikationen außerhalb der
Referenz-Sequenz werden ganz sicher als Kenntnisse der Offenbarung
des Standes der Technik unentdeckt sein. Die Sequenzen, die den
erforderlichen mutierten Sequenz-Abschnitt abgrenzen, der dem 116
Aminosäure-Reste umfassenden Referenzabschnitt analog ist, können
also in großem Umfang variieren und müssen nur so beschaffen sein,
daß sie das insektizid aktive Endotoxin-Protein bereitstellen können,
wie es beispielsweise im Rahmen der insektiziden Aktivität
gegen den Tabak-Knospenwurm gezeigt wurde. So kann die Aminosäure-
Sequenz, die im Strang vor dem mutierten Abschnitt liegt, gekürzt
sein oder verlängert sein oder selbst in Bezug auf die in Tabelle
A gezeigte Sequenz mutiert sein. Sie beginnt aber im allgemeinen
mit dem Rest Methionin und ist - besonders bevorzugt - in hohem
Maße (70%) homolog oder identisch mit der in Tabelle A gezeigten
Sequenz, obwohl es offensichtlich ist, daß eine solche Sequenz gegebenenfalls
auch die bevorzugte Mutante in der 4-Position enthalten
kann, wie sie ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt
wird. In gleicher Weise kann der Abschnitt, der im
Strang unterhalb des gewünschten mutierten Sequenz-Abschnitts
liegt, in weitem Umfang variieren und kann in Relation zu seinem
Anteil in Tabelle A bis zu dem Punkt, an dem die Spaltung im Insektendarm
stattfindet, verkürzt oder verlängert sein. Der Abschnitt
kann natürlich (oder braucht auch nicht) darüber hinaus in
der Weise ausgedehnt sein, daß ein Protoxin oder ein inaktiver Abschnitt
gebildet wird, der im Insektendarm unter Bildung eines insektizid
aktiven Protein-Toxins abgespalten wird.
DNA umfassende Sequenzen, die für die mutanten Endotoxine kodieren,
wie sie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden,
werden unter Kontrolle geeigneter Regulator-Sequenzen in
Plasmide eingebaut, wobei Expressions-Vektoren gebildet werden,
die zur Produktion des Endotoxins in Zellen transformiert oder
übertragen werden. Die Herstellung von Endotoxinen durch solche
biotechnologischen Rekombinations-Techniken schließt - im Gegensatz
zu beispielsweise der Herstellung von Arzneimitteln durch
solche Techniken - wenig oder gar keine Aufarbeitung zur Reinigung
des Endotoxins ein. Die Zellen, in denen das Endotoxin hergestellt
wird, können lysiert werden. Es war jedoch in der Vergangenheit in
der kommerziellen Produktion von B. t.-Endotoxinen charakteristisch,
einfach den gesamten Gehalt des Kultur- oder Fermentations-
Systems, das in der Herstelllung des Endprodukts verwendet
wurde, einzusetzen. Üblicherweise geschah dies nach Trocknen auch
mit konventionellen Mitteln, beispielsweise Niedertemperatur-
Sprühtrocknen, wie es im Stand der Technik bekannt ist. In Abhängigkeit
vom Produkt können verschiedene Stoffe zur Verbesserung
der Produkt-Stabilität zugesetzt werden, wie dies ebenfalls bekannt
ist. Darüber hinaus können proteinartige Stoffe, sofern sie
nicht in ausreichenden Mengen im Fermentationssystem zugegen sind,
unabhängig voneinander mit dem Produkt vermischt werden, um die
Stabilität zu erhöhen. Dies ist ebenfalls bekannt und betrifft
beispielsweise Sojabohnen-Pulver oder entfettetes Sojabohnen-Pulver.
Während die Endotoxine biotechnologisch in einer Vielzahl von
transformierten oder transfektierten Zellsystemen hergestellt werden
können, ist es im allgemeinen bevorzugt, entweder Bakterienzellen
des gram-negativen oder des gram-positiven Typs zu transformieren
oder transfektieren. Eine bevorzugte Art gram-negativer
Bakterien ist E. coli, mit dem schon große Erfahrung im Bereich
der Biotechnologie erzielt werden konnte und für das eine große
Vielzahl geeigneter und operativ funktioneller Plasmide und Transfer-
Expressionsvektor-Systeme bekannt und erhältlich sind.
Pseudomonas fluorescens stellt einen anderen Typ gram-negativer
Bakterien dar, in die Plasmide, die Endotoxin-Sequenzen tragen,
eingeschleust wurden.
Wie in der vorliegenden Anmeldung gezeigt wird, können Endotoxin
produzierende Gene regulatorische Sequenzen, wie insbesondere Sequenzen
mit ribosomalen Bindungsstellen einschließen. Diese haben
ihren Ursprung in B. t., wenn sie zur Expression in im wesentlichen
heterologe Bakterienzellen, wie beispielsweise Zellen von E. coli,
eingeschleust werden. Da Bakterien vom Typ "Bacillus" eine Umgebung
schaffen, die für die mutanten Endotoxine der Erfindung ziemlich
nahe verwandt der nativen Umgebung ist, liegt es insbesondere
im Rahmen der vorliegenden Erfindung und ist durch diese beabsichtigt,
Bakterien des Tys "Bacillus" mit Expressions-Vektoren zu
transformieren oder zu transreflektieren, die die DNA umfassen, die
für die mutanten Endotoxine gemäß der Erfindung kodieren. Anschauliche
Beispiele solcher Bacillus-Zellen von besonderem Interesse
sind B. t.-Zellen, B. cereus-Zellen und B. subtilis-Zellen. Eine
deutlich verbessere Verfahrensweise zur Transformierung von Bacillus-
Zellen, insbesondere B. t.-Zellen, wurde kürzlich gefunden
und ist in der anhängigen britischen Patentanmeldung 87 29 726 beschrieben.
Zell-Typen die für die Transformation durch das Verfahren
geeignet sind, schließen cry-minus-Typen, beispielsweise die
bekannten B. t. kurstaki cry B-Zellen ein, die keine Plasmide haben,
sowie Bacillus-Zellen des Wild-Typs, wie beispielsweise native
B. t.-Zellen, die Endotoxin produzierende Plasmide enthalten.
Plasmide, die für die Einschleusung in Bacillus-Zellen, wie beispielsweise
B. t.-Zellen geeignet sind, sind bekannt. Darunter
fällt beispielsweise das Plasmid pBC16.1 (Kreft et al, Molec. Gen.
Genet. (1978) 162 59) sowie seine Stammplasmide, die unter Einsatz
herkömmlicher Rekombinations-Techniken in der Weise verwendet oder
modifiziert werden können, daß sie die für das mutante Endotoxin
kodierenden Sequenz gemäß der Erfindung enthalten können. Wie aus
dem Stand der Technik bekannt ist, produzieren Bacillus-Zellen in
charakteristischer Weise Endotoxin in gewünschten Mengen nur im
Stadium ihrer Sporenbildung (Sporulierung). Folglich läßt man sie
bis zu diesem Stadium wachsen, um in möglichst guter Weise die als
Insektizid nützlichen Produkte zu erhalten. Die Plasmide oder Ex
pressionsvektoren, die durch die Erfindung bereitgestellt werden
und DNA für die mutanten Endotoxine tragen, können in Bacillus-
Zellen eingeschleust werden, die entweder keine Endotoxin produzierenden
Plasmide enthalten oder schon ein oder mehrere solcher
Plasmide enthalten. Während die mutanten Endotoxine der Erfindung
in charakteristischer Weise Aktivität gegen Lepidoptera zeigen,
können die Produkte auch Endotoxin-Aktivität gegen Insekten anderer
Klassen aufweisen. Dies kann darauf zurückzuführen sein, daß
eine solche Aktivität schon in dem Stamm-Endotoxin vor der Mutation
existierte. Es kann aber auch ein Resultat anderer zulässiger
Sequenz-Änderungen sein. In jedem Fall liegt es im Bereich der
vorliegenden Erfindung, Bacillus-Zellen mit Plasmiden gemäß der
Erfindung zu transformieren, die gegen Lepidoptera toxische Endotoxine
produzieren, wenn solche Zellen Plasmide für die Produktion
von Endotoxinen tragen, die im wesentlichen nicht wirksam gegen
Lepidoptera sind, um im Sporenbildungs-Stadium Endotoxine herzustellen,
die die Bereitstellung breiterer Bereiche insektizider
Wirksamkeit vereinen. Beispielsweise können Plasmide, die DNA-Sequenzen
tragen, die für ein mutiertes Endotoxin kodieren, zur
Transformierung von B. t. israeliensis oder B. t. tenebrionis verwendet
werden, die für sich im wesentlichen nicht wirksam gegen
Lepidoptera sind.
Während die vorliegende Erfindung sowohl unter Bezugnahme auf die
verkürzten Endotoxin-Proteine als auch unter Bezugnahme auf die
nativen Endotoxin-Proteine voller Länge dargelegt wurde, ist es im
allgemeinen bevorzugt, wenn man die mutanten Endotoxine - wie oben
beschrieben - unmittelbar als Insektizide verwendet, Sequenzen
voller Länge einzusetzen oder herzustellen, die dieselben sind,
wie die natürlichen Sequenzen oder diesen wenigstens im Hinblick
auf die Möglichkeit nachgeahmt sind, eine Falt-Fähigkeit eines Endotoxin-
Proteins zu erreichen, die der von dessen natürlicher Fähigkeit
ähnlich ist, oder eine verbesserte Falt-Wirkung über die
gesamte Länge zu erreichen.
Mutante DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch
in das Genom einer Pflanze insertiert werden. In solchen Fällen
ist es bevorzugt, daß die mutierten Sequenzen des verkürzten Typs
eingesetzt werden, obwohl die Sequenzen voller Länge ebenfalls
geeignet sind. Jedes geeignete Verfahren kann in vorteilhafter
Weise für die Einschleusung der Endotoxin-Sequenzen in das Genom
der Wirtspflanze verwendet werden. Geeignete Methoden sind
beispielsweise die Methode über das Ti-Plasmid von Agrobacterium
tumefaciens, Elektroporierung (electroporation), Elektrotransformation,
Mikro-Injektion, virale Transfektion oder die Verwendung
von Chemikalien, die die freie DNA-Aufnahme induzieren oder erhöhen,
und dergleichen. Solche Verfahrensweisen und deren Verwendung
in der Transformation von Pflanzen sind dem Fachmann wohlbekannt.
Vorzugsweise wird die DNA-Sequenz, die für das mutante Endotoxin
kodiert, mit geeigneten Regulator-Sequenzen vereinigt, beispielsweise
Operator- und 3′-Regulator-Sequenzen, die in Pflanzen funktionell
sind. Die gesamte Sequenz wird dann in einen Vektor vom
Expressions-Typ eingeschleust. Eine derartige Transformation von
Pflanzenzellen und nachfolgende Regeneration der Zellentwicklung
in die gesamten Pflanzen ermöglicht, daß die für das mutante Endotoxin
kodierende DNA-Sequenz stabiler und permanenter Teil des
Pflanzen-Genoms wird. Es wird dann von einer Generation an die
nächste über Mitose und Meiose weitergegeben und führt auf die Expression
hin zu einem für Insekten toxischen Protein. Dadurch wird
die Pflanze mit vererbbarer Insekten-Resistenz ausgestattet.
Zwei sehr ähnliche Vektoren (prAk) und prAK-3) wurden in der erfindungsgemäßen
Arbeit als Quelle der B. t.-delta-Endotoxin-Sequenz
zur Mutation verwendet. Sie bilden darüber hinaus Vehikel für die
Produktion und Bewertung der B. t.-Endotoxin-Mutanten. Die Plasmide
prAK und prAK-3 sind in Fig. 1 wiedergegeben. Es sind die
relevanten Einzelheiten des Vektors prAK dargestellt. Außerdem ist
die geringfügige Variation dieses Vektors angegeben, die in prAK-3
existiert. Grundsätzlich sind die Plasmide prAK und prAK-3 in
vollem Umfang leistungsfähige Expressionsvektoren für E. coli. Jeder
Vektor schließt ein Ampicillin-Resistenz-Gen, einen Replikationsursprung
und Operator-Sequenzen ein, einschließlich eines E.
coli-Promoters.
Wie in Fig. 1 durch die dicken dunklen Linien und Kästen angegeben,
schließt der Vektor prAK in korrekter Leserahmen-Koordination
mit dem Promoter eine DNA-Sequenz ein, die in dem Wild-Typ-Stamm
HD-1 von B. t. kurstaki gefunden wird. Die dicke schwarze Linie
stellt die ursprüngliche Sequenz dar, die gekürzt wurde und für
ein gekürztes natives B. t.-delta-Endotoxin kodiert, das sich von
der Aminosäure-Position 1 (Met) bis zur Position 610 (Thr) in Tabelle
A und weiter in den Protoxin-Abschnitt erstreckt und mit der
Aminosäure 723 (Leu) endet. Am in Strangrichtung unteren Ende der
dicken dunklen Linien stellt ein kleiner Abschnitt, der in Fig. 1
als offener dicker Kasten dargestellt ist, eine kurze DNA-Sequenz
mit 54 Basepaaren dar, die sich an das Basepaar-Triplett anschießt,
das für den Rest 723 (Leu) kodiert und dieser folgt unmittelbar
ein Stop-Signal. Diese Gesamtsequenz von 57 Basepaaren
(einschließlich des Stop-Signals) hat ihren Ursprung in dem wohl
bekannten Plasmid pBR322, das beim Konstruktiven Aufbau des Plasmids
prAK verwendet wurde. Folglich kodiert der Expressionsvektor
prAK (und produziert in E. coli) im wesentlichen ein verkürztes B. t.-
delta-Endotoxin-Fusionsprotein mit einer Gesamtzahl von 741
Aminosäuren, das zusammengesetzt ist unter Einschluß der 610 Aminosäuren
des nativen Protoxin-Abschnitts und der 18 Aminosäuren,
die ihren Ursprung in dem Plasmid pBR322 haben. Dieses verkürzte
B. t.-Endotoxin-Fusionsprotein weist eine hohe insektizide Wirksamkeit
auf und wurde dafür verwendet, die Mutanten dieses Proteins,
die während der erfindungsgemäßen Arbeit hergestellt wurden,
zu bewerten. Diese Aktivität ist im wesentlichen ununterscheidbar
von der eines voll gekürzten B. t.-delta-Endotoxin-Proteins, das
nur die 610 Aminosäuren des aktivierten Toxins (Aminosäuren 1 bis
610 in Tabelle A) aufweist.
In Fig. 1 ist die dicke dunkle Linie, die den größten Teil der
Sequenz darstellt, die für das gekürzte B. t.-Endotoxin-Fusionsprotein
kodiert, an ihrem zum oberen Ende der Sequenz liegenden
Ende mit einem dicken dunklen Kasten verbunden, der eine Sequenz
darstellt, die eine ribosomale Bindungsstelle (RBS) von B. t. einschließt.
Dieser Abschnitt, der auch in Tabelle A Zeile 1 und 2
dargestellt ist und die RBS enthält, hat etwa 47 Nucleotide, bevor
an seinem in Strangrichtung aufwärts gelegenen Ende eine Bam HI-
Spaltstelle beginnt. Diese wurde in früheren Plasmiden zur Verbindung
des Abschnitts mit dem E. coli-Promoter-Abschnitt eingeführt,
der in Fig. 1 mit einem Pfeil angezeigt ist. Die Promoter- und
RBS-Abschnitte sind in der Weise angeordnet und miteinander vereinigt,
daß sie in richtiger Leserahmen-Anordnung mit der für das
Endotoxin kodierenden Sequenz liegen. Die dicken dunklen Linien
und Kästen zusammen stellen also eine DNA dar, die ihren Ursprung
in B. t. kurstaki HD-1 hat.
Verschiedene andere Restriktionsstellen, die in Fig. 1 angegeben
sind, waren für die Strategie für die herkömmliche Entfernung und
Wiedereinsetzung von DNA-Abschnitten für Mutations-Experimente
ausschlaggebend. Diese anderen Restriktionsstellen sind die Nsi I-
Stelle (beginnend nach etwa nur 26 Nucleotiden nach dem Start der
für das Endotoxin kodierenden Sequenz), die beiden Xba I-Stellen
(siehe aber unten bezüglich prAK-3), sie Sst I-Stelle und die Hind
III-Stelle.
Wie oben angegeben, unterscheidet sich das Plasmid prAK-3- von dem
Plasmid prAK nur in einem einzigen unwesentlichen Punkt. Der Unterschied
besteht darin, daß die Xba I-Stelle (TCT AGA) bei den
Nucleotid-Positionen 292 bis 297 in Tabelle A unter Verwendung von
Standard-Techniken in "TCG CGA" geändert wurde. Dadurch wurde eine
Nru I-Stelle definiert. In der kodierten Aminosäure-Sequenz ergab
sich aus diesem Wechsel keine Änderung. Die Herstellung von prAK-3
wird in Schritt (a) von Beispiel 1 nachfolgend beschrieben. prAK-3
ist auch die erste Zwischenstufe für die Herstellung der anderen
Plasmide prAK-7 und prAK-9.
DNA-Abschnitte, die von Einzelstrang-DNA-Abschnitten unterschiedlicher
Längen der Plasmide prAK und prAK-3 abgeleitet wurden
(Stränge sowohl in rechter Laufrichtung als auch gegenläufige
Stränge) und in herkömmlicher Art mutiert wurden, beispielsweise
so, wie es in "Craick in Biotechniques, Jan/Feb 1985, Seite 12-
19; Use of Oligonucleotides for Site-Specific Mutagenesis", werden
der Einfachheit halber in dieser Beschreibung als M-2 und M-1 bezeichnet.
Als M-1 ist der 375 Basepaare umfassende Abschnitt zwischen
den beiden Xba I-Stellen in prAK und M-2 ist der Abschnitt
zwischen der Bam HI- und Xba I-Stelle in prAK-3, wie dies in Fig.
1 gezeigt ist.
Die Mutation zwischen den beiden Xba I-Stellen in Übereinstimmung
mit der Erfindung kann leicht unter Verwendung der Plasmide prAK-
7, prAK-8 oder prAK-9, wie sie in der Beschreibung offenbart werden,
erhalten werden. Synthetische doppelsträngige Oligonucleotide
werden analog zu den Verfahrensweisen, die in Beispiel 2 der vorliegenden
Anmeldung beschrieben sind, aufgebaut und verwendet.
Nach der Mutation werden die mutierten Einzelstrang-Abschnitte mit
herkömmlichen Mitteln wieder in Doppelstränge überführt: im Fall
der M-1-Mutanten wurden die resultierenden doppelsträngigen mutierten
Plasmide unter Verwendung von prAK als Mutationsvehikel in
Zellen von E. coli JM 103 überführt, auf einem YT-Agar, der 50 µg/ml
Ampicillin enthielt, ausgestrichen und über Nacht inkubiert.
Es wurde eine Vielzahl von Kolonien mit vielen verschiedenen Mutationen
in den Plasmiden erhalten, die die gleichen wie prAK waren,
mit Ausnahme der Mutationen.
Im Falle der M-2-Mutanten wurden die mutierten doppelsträngigen
Bereiche zwischen den Bam HI- und Xba-I-Stellen in den Mutationsvehikeln
unter Verwendung der Restriktions-Endonucleasen Bam HI
bzw. Xba I herausgeschnitten und in prAK-3-Vektoren eingebaut, die
mit den beiden gleichen Enzymen gespalten worden waren. Die resultierenden
prAK-3-Plasmide, die die M-2-Bereich-Mutante enthielten,
wurden in Zellen von E. coli JM 103 transformiert, auf YT-Agar,
der 50 µg/ml Ampicilin enthielt, ausgestrichen und über Nacht inkubiert.
Dabei wurde eine weitere Vielzahl von Kolonien erhalten,
die auch eine Vielzahl verschiedener Mutationen einschließen.
Der Test zum Nachweis der Aktivität der mutagenisierten Endotoxin-
Sequenzen, die mit DNA exprimiert wurden, die beispielsweise in E.
coli JM 103, oder E. coli SG 4044 enthalten waren (letzterer ist
öffentlich erhältlich bei der Agricultural Research Culture
Collection (NRRL), Peoria, Illinois (USA) unter der Hinterlegungs-
Nummer B-15 969), wurden entweder mit Hilfe des Tabak-Knospenwurm-
(TBW-)Tests oder mit Hilfe des T. ni-Tests durchgeführt, wie dies
in Beispiel A nachfolgend beschrieben wird. Die DNA der Mutanten
mit gegenüber dem nicht mutanten Standard-Endotoxin erhöhter Aktivität
wurden in den relevaten Mutations-Bereichen sequenziert, um
die Mutation im DNA-Strang und damit in der Protein-Sequenz zu bestimmen.
Mehr als 6000 verschiedene Kolonien mit Plasmiden, die
entweder mutagenisierte M-1-Bereiche oder mutagenisierte M-2-Bereiche
enthielten, wurden so bewertet und es wurde gefunden, daß
im allgemeinen zwischen 1 und 3 Änderungen der Aminosäure-Reste in
jedem Mutationsexperiment stattgefunden haben.
Die nachfolgende Tabelle B zeigt die up-Mutanten (up-mutants) die
unmittelbar als Ergebnis der Mutations-Experimente gefunden worden
warn, die Aminosäure-Position unter Bezugnahme auf die Positions-
Ziffern in Tabelle A, an der jede Mutation stattfand, jedes in dem
jeweiligen Mutanten mutierte Codon und die daraus resultierende
Änderung der Aminosäure an der angegebenen Position als Resultat
der Änderung des Codons.
In Tabelle B geben die mit einem Minus-Zeichen versehenen oder negativen
Zahlen der Aminosäure-Rest-Positionen Änderungen zwischen
der Bam HI-Stelle und der 1-Position (Met) am Beginn der Endotoxin-
Sequenz an. Solche Änderungen beeinflussen daher die Sequenz
des Endotoxins nicht, wie sie durch die mutante Sequenz kodiert
wird.
Die in Tabelle B benannten Mutanten wurden in allen drei Phasen
des Tabak-Knospenwurms-(TWB)-Tests bewertet. Die erhaltenen Ergebnisse
werden in der nachfolgenden Tabelle B-1 angegeben. Verschiedene
dieser Mutanten wurden auch in dem T. ni-Test bewertet; dessen
Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle B-2 angegeben.
In der nachfolgenden Tabelle B-1 gibt der untere Wert in der Toxizitäts-
Spalte den größeren Aktivitätswert an (vergleiche Beispiel
A zur Erklärung der Toxizitäts-Werte). Die Kontrollwerte
bezogen sich auf äquivalente E. coli JM 103-Zellen und E. coli SG
4044-Zellen, die nicht mit einem Plasmid transformiert worden waren.
Es ist festzustellen, daß die Angaben für alle Mutanten eine
wesentlich höhere Aktivität zeigten als für das gekürzte native
Endotoxin, das von einer äquivalenten Menge solcher Zellen hergestellt
wurde, die das Plasmid prAK enthielten.
| Mutante (vgl. Tabelle B) | |
| Toxizitätswert - Mittlere Toxizität | |
| p26-3 | |
| 2,75 | |
| p48a14 | 2,25 |
| p48c5 | 2,63 |
| p36a65 | 1,50 |
| p95a76 | 2,50 |
| p95a86 | 1,30 |
| p98c1 | 1,33 |
| p99c62 | 1,83 |
| p107c22 | 1,42 |
| p114a30 | 2,00 |
| Kontr. (JM103-Zellen) | 4,68 |
| prAK | 3,35 |
| Kontr. (SG4044-Zellen) | 4,12 |
| Mutante (vgl. Tabelle B) | |
| Relative Wirksamkeit | |
| p26-3 | |
| 217 | |
| p36a65 | 887 |
| p95a76 | 291 |
| p107c22 | 357 |
| p114a30 | 239 |
| Kontr. (SAN415) | 59 |
| pBT301 | 100 |
In der oben angegebenen Tabelle B-2 wurde der Standard-Mutante pBT
301, eine relative Wirksamkeit von 100 zugeordnet, ermittelt nach
dem LD₅₀-Wert. Eine detailliertere Beschreibung findet sich in
Beispiel A. Auf diese Weise gibt ein Wert der relativen Wirksamkeit
größer als 100 ein erhöhtes Toxizitäts-Level an, das durch
die Mutation hervorgerufen wurde.
In zusätzlichen Experimenten bei der Förderung der vorliegenden
Erfindung wurden bestimmte mutante DNA, die - wie die obige Tabelle
B zeigt - mehrere Mutationen aufweisen, analysiert, um die
Auswirkung der einzelnen oder Paar-Mutationen auf solche mehrfach
mutierten Abschnitte zu bestimmen. Eine solche Sub-Klonierung einzelner
Mutationen oder von Paaren von Mutationen, wurde unter Verwendung
einer Strategie durchgeführt, die die Isolation des Ziel-
Fragmentes mit der mehrfachen Mutation einschließt. Das Fragment
wurde dann an einer Restriktionsstelle innerhalb des Fragments geschnitten
und zwischen zwei mutierte Codons angeordnet. Die beiden
Hälften oder Fragment-Segmente wurden dann über ein Gel isoliert
und jedes mit nicht mutanten komplementären Hälften oder Fragment-
Segmenten gemischt, die durch ähnliches Schneiden derselben Fragmente
aus prAK erhalten worden waren. Der prAK-Vektor, der zur
Isolation des größeren komplementären Fragments auseinander geschnitten
worden war, wurde dann mit den beiden komplementären
Hälften gemischt, und alle drei DNA-Segmente wurden miteinander
verbunden. Dabei bildete sich ein modifiziertes prAK-Plasmid, das
die Punktmutation oder -mutationen enthielt, die in der Fragmenthälfte
angeordnet waren, die aus dem Klon mit der Mehrfach-Mutation
stammte.
Genauer gesagt, lag eine Schnittstelle für die Restriktions-Endonuclease
Xho II strategisch innerhalb bestimmter Segmente mit
Mehrfach-Mutationen, so daß die Isolation von Fragmenten möglich
wurde, die weniger als die Gesamtzahl an Mutationen in dem gesamten
Mutanten-Segment aufwiesen. Wie offensichtlich ist, kann
die Endonuclease Xho II auf eine Zahl von Segmenten mit Mehrfach-
Mutationen in Tabelle B angewendet werden, um Fragmente mit einer
einzelnen Punktmutationen und andere mit zwei Mutationen zu erhalten.
Plasmide mit Mehrfach-Mutationen wurden also zuerst mit den
Restriktions-Endonucleasen Nsi I und Sst I behandelt, und die resultierenden,
1430 Basepaare umfassenden Fragmente wurden durch
Gel-Isolation getrennt. Jedes dieser 1430 Basepaare umfassende
Fragmente wurde dann mit der Restriktions-Endonuclease Xho II behandelt
und die resultierenden 330 Basepaare (Nsi I/Xho II) und
1100 Basepaare (Xho II/Sst I) umfassenden Fragmente wurden für
jede Mehrfach-Mutante über ein Gel isoliert. Auf der anderen Seite
wurden nicht-mutierte Fragmente mit 330 und 1100 Basepaare und
das größere, etwa 4 Kb Nsi I/Sst I-Fragment aus prAK dann auf ähnliche
Weise erhalten. Im einzelnen wurden kleine Mengen des größeren
Segments mit den mutierten 330 bp-Fragment gemischt, und das
nicht-mutante 1100 bp-Fragment aus prAK und die resultierende Mischung
miteinander verbunden, wobei sich eine Anzahl von Mutanten-
Hybrid-Plasmiden von prAK bildete. In ähnlicher Weise wurden gewisse
Menge der größeren prAK-Segmente mit nicht-mutierten 330
bp-Fragmenten aus prAK gemischt und die mutanten 1100 bp-Fragmente
und diese DNA wurden miteinander verbunden, wobei sich eine
andere Serie mutanter Hybrid-Plasmide bildete. Die mutanten Hybrid-
Plasmide oder Klone, die sich aus der oben beschriebenen Vorgehensweise
ergaben, sind in der nachfolgenden Tabelle C zusammengefaßt.
Diese zeigt die drei kombinierten Segmente und die Mutationen
in den resultierenden Plasmiden, verglichen mit dem Plasmid
prAK.
In einem zweiten Durchgang der Herstellung von mutanten Hybrid-
Klonen unter Verwendung einer analogen Verfahrensweise, wie sie
auch zur Herstellung der Klone von Tabelle C angewendet worden
war, wurde eine Anzahl gemischter mutanter Kombinations-Plasmide
hergestellt. Dies geschah durch Kombination dreier Segmente nämlich
des großen Segments (etwa 4 kb) aus der Einwirkung von Nsi I
und Sst I auf prAK, des 330 bp umfassende Nsi I/Xho II-Fragments
aus einem der Klone von Tabelle B und des 1100 bp umfassenden Xho
II/Sst I-Fragments eines anderen Klons aus Tabelle B. Die mutanten
Hybrid-Klone, die sich aus diesem zweiten Durchgang ergaben, sind
in Tabelle D gezeigt. Es ist darauf hinzuweisen, daß die beiden
Plasmide, die sich bei diesem zweiten Durchgang ergaben, im
Vergleich zu dem Stammplasmid prAK 4 Änderungen in den Aminosäure-
Resten enthielten.
Die verschiedenen Hybrid-Mutanten aus den Tabellen C und D wurden
mit dem Tabak-Knospenwurm-Test gemäß Beispiel A bewertet. Die Bewertung
schloß die mutanten Klone von Tabelle B zum Vergleich (unter
anderem) der Wirkung ein, die sich bei der notwendigen Streichung
oder Entfernung einer oder beider Mutationen aus den Original-
Mutanten der Tabelle B ergibt. Die Ergebnisse der Bewertungen
der Toxizität und der insektiziden Aktivität werden in der nachfolgenden
Tabelle E gezeigt.
Folgendes ist dazu anzumerken:
- (1) Die niedrigere Marke in der Toxizitäts-Spalte gibt die höhere Aktivität an (vergleiche Beispiel A zur Erklärung der Werte); und
- (2) die Kontrollwerte beziehen sich auf eine äquivalente Menge von (E. coli) JM 103-Zellen und SG 4044-Zellen, die nicht mit irgendeinem Plasmid transformiert worden waren. Darüber hinaus ist anzumerken, daß die meisten, wenn nicht alle, bewerteten Mutanten in beiden Typen von E. coli-Zellen bewertet wurden. Aus den Mutanten ergeben sich die Angaben in den vorliegenden Tabellen, die sich auf die beiden Kontrollwerte beziehen und als ein Querschnitt der Resultate für die Mutanten angesehen werden können, die durch beide Zell-Typen exprimiert wurden.
| Mutanten (vgl. Tabellen B, C oder D) | |
| Toxizitätswert, Durchschnittl. Toxizität | |
| Kontr. | |
| 4,68 | |
| prAK | 3,35 |
| A | 2,05 |
| B | 2,90 |
| C | 2,68 |
| D | 3,40 |
| E | 2,50 |
| F | 3,00 |
| E. coli SG 4044 (Kontr.) | 4,12 |
| J | 2,25 |
| K | 2,06 |
| L | 2,08 |
| M | 3,10 |
| N | 2,73 |
| O | 2,70 |
| P | 1,00 |
| Q | 1,87 |
| R | 2,85 |
| S | 2,16 |
| T | 1,20 |
| U | 2,07 |
| 53 | 3,08 |
| 68 | 2,00 |
| 70 | 1,50 |
| 39 | 2,50 |
Die Erfindung schließt außerdem den Nachweis der Möglichkeit der
generellen Substitution von Aminosäure-Resten an den Aminosäure-
Positionen ein, an denen die ursprünglichen zufälligen Mutationen
der DNA zu Änderungen der Aminosäure-Reste führten. Dadurch wird
eine große Vielzahl neuer insektizid aktiver B. t.-Endotoxin-Proteine
bereitgestellt. Diese Möglichkeit wurde auf relativ einfachem
Wege nachgewiesen durch sogenannte "Codon-Spin"-Experimente,
in denen ausgewählte Codons, die an den anfänglichen Änderungen
durch Mutation beteiligt waren gegen Codons für die anderen natürlichen
Aminosäuren ausgetauscht wurden. Diese neuen Mutanten exprimierten
ein Endotoxin-Protein mit insektizider Aktivität gegen
den Tabak-Knospenwurm. Um solche Forschungen wirksamer durchführen
zu können, wurde eine Anzahl einzigartiger Plasmide des prAK-Typs
hergestellt, wobei man mit dem Plasmid prAK anfing und die Herstellung
beim Plasmid prAK-7 ihren Höhepunkt erreicht. Auch die
anderen dazwischen liegenden Plasmide, die aufeinanderfolgend in
der Reihenfolge ihrer Herstellung mit prAK-3, prAK-4, prAK-5 und
prAK-6 bezeichnet wurden, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben
hergestellt. Das in Fig. 2 gezeigte Plasmid pB8rII ist in jeder
Hinsicht identisch mit dem Plasmid prAK, mit der Ausnahme, daß es
DNA enthält, die für ein gekürztes Endotoxin kodiert, das ein wenig
länger ist als das, für das prAK kodiert und mit der weiteren
Ausnahme nicht aufeinanderfolgender Modifikationen in dem Stammplasmid,
die im Bereich ihrer Anbindung das Strang abwärts gelegene
Ende des gekürzten Endotoxin-Strukturgens der DNA durchgeführt
wurden, wobei das Strukturgen - wie in Fig. 2 gezeigt - die
Kpn I-Schnittstelle in dem nativen Gen zeigt, während in prAK die
Stelle gestrichen ist und das prAK-Strukturgen etwa an der früheren
Position der Schnittstelle endet. Das Plasmid prAK-7 ist so
aufgebaut, daß es dieselbe Endotoxin-Aminosäure-Sequenz wie das
Plasmid prAK exprimiert. Seine DNA-Sequenz wurde jedoch modifiziert
und schließt nicht nur die Nru I-Schnittstelle von prAK-3
ein, sondern auch Hind III-, Mst II- und BssH II-Schnittstellen.
Darüber hinaus wurde die Hind III-Schnittstelle, die ursprünglich
in prAK gefunden wurde, vorzugsweise entfernt. Wie genauer in Beispiel
1 angegeben wird, kann die aufeinanderfolgende Herstellung
von prAK-7 aus prAK und die Einführung oder Streichung einer
Schnittstelle in jedem Schritt wie folgt zusammengefaßt werden:
prAK → prAK-3 (plus Nru I)
prAK-3 → prAK-4 (plus Hind III)
prAK-4 → prAK-5 (plus Mst II)
prAK-5 → prAK-6 (plus BssH II)
prAK-6 → prAK-7 (ursprüngliche Hind III-Schnittstelle gestrichen)
prAK-3 → prAK-4 (plus Hind III)
prAK-4 → prAK-5 (plus Mst II)
prAK-5 → prAK-6 (plus BssH II)
prAK-6 → prAK-7 (ursprüngliche Hind III-Schnittstelle gestrichen)
Die oben angegebenen Schnittstellen wurden etwa 40 Basepaare voneinander
entfernt eingeführt, so daß ein DNA-Syntheseautomat wirkungsvoll
eingesetzt werden konnte, um kleine doppelsträngige DNA-
Fragmente herzustellen, die an ihren beiden Enden mit Nucleotiden
enden, die die komplementären Reste zu den Resten der Restriktions-
Stellen darstellen, die in prAK-7 geschaffen werden sollen,
wenn diese mit den beiden relevanten Restriktions-Endonucleasen
gespalten werden sollen. Solche Fragmente konnten daher leicht in
prAK-7 durch standardisierte Schnitt- und Verbindungs-Verfahren
(vergleiche Beispiel P unten) substituiert werden. Dadurch wird
ein Plasmid bereitgestellt, das in der Lage ist, ein Endotoxin-
Protein zu exprimieren, das identisch mit dem von prAK ist mit der
Ausnahme, daß die Aminosäure-Änderungen, die durch das synthetisierte
Fragment kodiert werden, das in prAK-7 anstelle des korrespondierenden
Fragments in prAK-7 eingebaut wurde, wie dies in
Beispiel 2 gezeigt wird.
Fig. 3A und 3B stellen zwei schmal doppelsträngige DNA-Fragmente
dar, die in Übereinstimmung mit der oben beschriebenen "Codon-
Spin-Strategie" hergestellt wurden und in den Hind III/Mst II-
Abschnitt in prAK-7 eingesetzt werden. Das in Fig. 3A gezeigte
doppelsträngige Fragment war dafür bestimmt, eine beliebige Aminosäure
an der Aminosäure-Position 116 in den gekürzten B. t.-Endotoxinen
zu produzieren, die durch die prAK-Plasmide bei geeigneter
Auswahl des XXX-Codons in Übereinstimmung mit dem genetischen Code
exprimiert werden. In gleicher Weise war das in Fig. 3B doppelsträngige
Fragment dazu bestimmt, eine Aminosäure an der Aminosäure-
Position 119 in den gekürzten B. t.-Endotoxinen, die durch
die prAK-Plasmide durch geeignete Auswahl des XXX-Codons in diesem
Fragment hergestellt wurden. Wie ersichtlich ist, können die anderen
doppelsträngigen Fragmente, die für die Substitution in den
Spe I/Nru I-Abschnitt erforderlich sind (eine Fragment-Spanne von
etwa 115 Basepaaren, die auch durch automatisierte DNA-Synthese-
Maschinen herstellbar ist), der Nru I/Hind III-Abschnitt und der
Mst II/BssH II-Abschnitt in prAK-7 und dazu bestimmt sind, für
alle Aminosäuren an allen Mutationspunkten, die in diesen Abschnitten
gefunden werden, zu kodieren, durch analoge Standard-
Verfahrensweisen hergestellt werden. Die verbleibenden 18 von den
19 natürlichen Aminosäure-Änderungen oder Mutationen, die an jedem
Mutationspunkt zwischen den Nru I und BssH II-Schnittstellen
durchgeführt werden, können leicht in prAK-7 unter Verwendung des
Plasmids prAK-7 hergestellt werden.
Um alle Punkte der Mutation innerhalb der 116 Aminosäure-Reste umfassenden
Sequenz zum bequemen "Spinnen" (spinnig) der relevanten
Codons zu erfassen, kann das Plasmid prAK-7 zur Herstellung des
Plasmids prAK-8 verwendet werden, das seinerseits letztlich zur
Herstellung von prAK-9 verwendet wird, wie dies in Beispiel 1 beschrieben
wird. In Fig. 5 werden alle relevanten Restriktionsstellen,
wie sie sich letztlich in prAK-9 angesammelt haben, in
einem herausgeschnittenen gedehnten Abschnitt des Plasmids prAK-9
gezeigt. Die in Fig. 5 gezeigte Spe I-Stelle ist ebenfalls eine
einzigartige Schnittstelle, die auch schon in prAK, prAK-3 usw.
vorhanden war. Wie ebenfalls festzustellen ist, können die Plasmide
prAK-7, prAK-8 und prAK-9 verwendet werden, um Mehrfach-Mutations-
Änderungen zwischen jedes beliebige Paar von Restriktionsstellen
einzuführen und/oder DNA herzustellen, die für wenigstens
eine Änderung im Bereich zwischen zwei oder mehreren solcher
Stellen kodiert. Auf diesem Wege können eine große Vielzahl von
Mehrfach-Mutations-Kombinationen, die aber auch die ursprünglichen
Punkt-Mutationen, wie sie in Übereinstimmung mit der Erfindung gefunden
wurden, einschließen, hergestellt werden. Auf diesem Wege
lassen sich eine große Vielzahl neuer insektizid aktiver B. t.-Endotoxin-
Proteine herstellen.
Wie ebenfalls anzumerken ist, sind Plasmide, wie beispielsweise
prAK-7, prAK-8 und prAK-9 Plasmide, die in vollem Umfang in der
Lage sind, ein oder mehrere beliebige Codons innerhalb jedes beliebigen
Paars von Restriktionsstellen in diesen Plasmiden zu ändern.
Soweit Änderungen im Bereich zwischen einer oder zwei, jedoch
weniger als drei derartiger Stellen erwünscht sind, können
Plasmide wie beispielsweise prAK-4 oder prAK-5 verwendet werden,
wenn sie die gewünschten Stellen der Änderungen einschließen, vorzugsweise
nach Entfernung der ursprünglichen Hind III-Schnittstelle
in prAK. Wenn solche Plasmide nicht geeignet sind, ist
festzuhalten, daß ein Plasmid des Typs prAK, das eine oder mehrere
derartiger Stellen enthält, in bequemer Weise dadurch hergestellt
werden kann, daß man die Auswahl für die Einführung der zur Modifikation
von prAK verwendeten Restriktionsstellen-Paare in der
Herstellung von prAK-9 variiert oder begrenzt. Damit stellt die
Erfindung auch eine Vielzahl neuer Plasmide bereit, die für die
Herstellung von Mutanten und Mutanten-Kombinationen in Übereinstimmung
mit der Erfindung wertvoll sind und die eine oder mehrere
der Restriktionsstellen-Paare enthalten, die letztlich in prAK-9
hergestellt werden.
Wie ebenfalls festzustellen ist, kann eine DNA, die eine oder mehrere
solche Restriktionsstellen-Paare umfaßt, vor oder nach einer
Modifikation, die dazu führt, daß sie eine oder mehrere Mutationen
in Übereinstimmung mit der Erfindung enthält, aus den Plasmiden
des prAK-Typs herausgeschnitten werden. Dies geschieht durch
Schneiden an Restriktionsstellen, die außerhalb der gewünschten
Mutationsregion(en) liegen und die entsprechend in einem anderen
Plasmid für ein B. t.-Endotoxin gefunden werden. Das herausgeschnittene
DNA-Segment wird dann in ein derartiges anderes B. t.-
Endotoxin-Plasmid eingesetzt (Verknüpfung mit Standard-Methoden),
das in ähnlicher Weise herausgeschnitten worden war. Auf diesem
Wege können derartige andere Plasmide bequem modifiziert oder zum
Zwecke der unmittelbaren Einsetzung der erfindungsgemäßen Mutationen
verändert werden.
Um die durch die Erfindung bereitgestellten Mutationen in eine für
ein Endotoxin kodierende Sequenz voller Länge einzuschleusen,
wurde aus Gründen der Bequemlichkeit und leichten Verfügbarkeit zu
der Zeit ein Plasmid verwendet, das das DNA-Strukturgen für das
delta-Endotoxin von B. t. wuhanensis enthielt. Dieses Plasmid pBT
210 ist in Fig. 4 gezeig. Das Plasmid pBT 210 enthält das Endotoxin-
Strukturgen aus B. t. wuhanensis wie es durch die dicke
dunkle Linie in Fig. 4 angegeben wird, in voller Länge. Es enthält
außerdem analog zu Fig. 1 eine Sequenz, die die ribosomale
Bindungsstelle von B. t. enthält und die zusammen mit dem Strukturgen
aus B. t. wuhanensis erhalten worden war; diese ist in Fig.
4 durch den dunklen Kasten angegeben. Das Plasmid pBT 210 ist
ein voll funktionsfähiger E. coli-Expressionsvektor, der dasselbe
E. coli-Promotersystem wie die prAK-Plasmide, einen E. coli-Replikations
ursprung (nicht gezeigt) und ein Gen für Chloramphenicol-
Resistenz wie dies in Fig. 4 angegeben ist, umfaßt. Die Pfeile in
Fig. 4 zeigen die Lese-Richtung des B. t. wuhanensis-Gens bei
Kontrolle durch den E. coli-Promoter und durch das Gen für die
Chloramphenicol-Resistenz. Aufgrund der vorhandenen Sequenz-Informationen
ist das gesamte Operon (Strukturgen, von B. t. abgeleiteter
ribosomaler Bindungssequenz-Abschnitt und E. coli-Promoter/
Operator-Sequenz) sehr ähnlich und nur insignifikant verschieden
von dem Operon des Plasmids prAK. Insbesondere ist die DNA,
die für die 610 Aminosäure-Reste des aktiven Abschnitts des B. t.-
Endotoxins (Tabelle A) kodiert und sich in den Protoxin-Bereich
wenigstens etwa bis zu Kpn I-Schnittstelle, wie sie in Fig. 4
für das Plasmid pBT 210 gezeigt ist, erstreckt, identisch mit der
entsprechenden DNA-Sequenz in dem Plasmid prAK. Im DNA-Bereich
strangabwärts von der Kpn I-Schnittstelle im B. t.-Strukturgen in
pBT 210 bis zum Ende dieses Strukturgens finden sich unbekannte
aber geringfügige Unterschiede, verglichen mit dem entsprechenden
Abschnitt des B. t. kurstaki HD-1-Gens, das bei der Herstellung
von prAK gekürzt wurde. Diese Unterschiede lassen sich durch Behandeln
mit Restriktions-Endonucleasen und Kartieren der Genabschnitte
(mapping) herausfinden. Das Plasmid pBT 210 kodiert für
ein Endotoxin voller Länge, wie es in Tabelle A gezeigt ist und
ist vollständig homolog im aktiven Bereich (und auch wenigstens im
Bereich der Aminosäuren, die bis zu der Kpn I-Schnittstelle für
das delta-Endotoxin aus B. t. kurstaki HD-1 in den Klonen prAK und
pB8rII produziert werden). Das Plasmid weist außerdem im wesentlichen
Homologie im Anteil des Protoxin-Abschnitts auf. Letztlich
ist die ribosomale Bindungsstelle in pBT 210 identisch mit der in
prAK. Darüber hinaus ist die gesamte DNA, die die ribosomale Bindungsstelle
(RBS) einschließt und sich strangaufwärts vom Bereich
unmittelbar vor dem einleitenden Aminosäure-Rest Met zurück über
die Bam HI-Schnittstelle unter Einschluß des Promoter-Abschnitts
erstreckt, die gleiche wie in pBT 210 und in prAK, mit der Ausnahme,
daß in pBT 210 zwei Nucleotid-Änderungen unmittelbar vor
der Bam HI-Schnittstelle zu finden sind (CC anstelle von GT wie in
prAK), und daß drei Nucleotide (TTT), wie sie in prAK unmittelbar
nach den beiden Nucleotiden gefunden werden, im pBT 210 gestrichen
sind. Diese Unterschiede resultieren jedoch eher aus den unterschiedlichen
Verfahrensweisen der Verbindung der Stränge beim Vereinigen
der RBS-Abschnitte aus B. t. mit dem E. coli-Promoter-Abschnitt
über die Bam HI-Schnittstelle. Das Plasmid pBT 210 kann
zur Herstellung des Mutanten B. t.-delta-Endotoxin-Proteins voller
Länge, das eine oder mehrere Änderungen der Aminosäuren, wie sie
durch die vorliegende Erfindung bewirkt werden, aufweist, verwendet
werden. Die Nsi I-Schnittstelle, die beiden Xba- I-Schnittstellen,
die Sst I-Schnittstelle und erste der beiden strangabwärts
erscheinenden Hind III-Schnittstellen, die in Fig. 4 für pBT 210
gezeigt werden, entsprechen denselben Schnittstellen, die in Fig.
1 für prAK gezeigt werden. Die DNA für beide Plasmide in dieser
Region ist identisch, wie dies oben ausgeführt wurde.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
Die Untersuchungen wurden an Second-Instar-Larven durchgeführt.
Alle Insekten wurden während des Test-Zeitraums in Klimakammern
unter Standardbedingungen der Temperatur, Feuchtigkeit usw. gehalten
und wurden mit einer standardisierten künstlichen Nahrung gefüttert.
Die Testsubstanzen wurden den Insekten als Teil der Nahrung
verabreicht, wobei jede Konzentration der Testverbindung einer
Charge von 20 Insekten verabreicht wurde. Die Insekten wurden
für einen Zeitraum von 7 Tagen nach der Behandlung überwacht. Nach
dieser Zeit wurde der LD₅₀-Wert für die jeweiligen Insekten aufgenommen:
Der LD₅₀-Wert kann definiert werden als eine Abschätzung
der Stoff-Dosis, die erforderlich ist, um eine Sterblichkeit von
50% der Test-Lebewesen zu induzieren. Die Endergebnisse sind als
relative Wirksamkeit angegeben, die wie folgt definiert ist:
Unter Einsatz der oben beschriebenen Verfahrensweise können die
absoluten LD₅₀-Werte erhalten werden, worin die Interpretation der
Ergebnisse einfach darin besteht, daß alle relativen Wirksamkeits-
Werte, die über dem Standard-Wert liegen eine Aktivität angeben,
die höher ist als die der Standardverbindung. Darüber hinaus ist
eine Verbindung mit einer relativen Wirksamkeit von z. B. 400,
wenn sie mit einer Standardverbindung mit der relativen Wirksamkeit
von 100 verglichen wird, 4mal so aktiv wie die Standardverbindung.
Der Standard mit einer relativen Wirksamkeit von 100 in dem oben
beschriebenen Test war das Plasmid pBT 301. Dieses Plasmid enthält
die delta-Endotoxin-Sequenz des Wild-Typs in voller Länge und ist
identisch mit pBT 210 mit der Ausnahme, daß es zwei E. coli-Promotoren
enthält, die jeder für sich identisch mit dem sind, der in
pBT 210 enthalten ist.
Folgende Kontroll-Proben wurden in dem oben beschriebenen Test
verwendet:
- (a) CAG 629; dies ist ein E. coli-Stamm, der keine delta-Endotoxin produzierenden Plasmide enthält und für sich keine insektizide Aktivität aufweist (Geschenk von C.A. Gross, Department of Bacteriology, University of Wisconsin);
- (b) SAN 415; ein im Handel erhältliches B. t-Insektizid, das unter dem registrierten Warennamen JAVELIN® erhältlich ist.
Der durchgeführte TBW-Test wurde grundsätzlich von Dulmage et al,
(1971) J. Invertebr. Path. 18 240-245 beschrieben. Der Test
wurde mit Proben durchgeführt, die dreifach in klare Kunststoffbecher
von einer Unze gefüllt waren. Jeder Becher enthielt eine Second-
Instar-Tabak-Knospenwurm-Larve (TBW-Larve; vier bis fünf Tage
alt, durchschnittliches Gewicht: 1,6 g). Die Proben wurden mit 15
ml Nahrung (enthaltend das Nährpulver, Vitaminpulver, Agar und andere
Bestandteile) vereinigt, wie dies beschrieben ist in Dulmage
et al, USDA Technical Bulletin No. 1528:1-5 (1976). Das Futter
wurde gleichmäßig auf drei Becher aufgeteilt, die man dann eine
halbe Stunde lang kühlen ließ. Ein TBW wurde unter Verwendung einer
Kamelhaarbürste (Größe: 00) in jeden Becher eingesetzt und die
Deckel wurden sicher aufgesetzt. Diese Proben wurden dann bei
27°C und 50% relativer Feuchtigkeit für vier bis fünf Tage in
einen Inkubator gestellt. Die Zahlen der nach Größe geordneten
Gruppen, die zur Bewertung des TBW-Toxizitäts-Tests verwendet wurden,
entsprechen den Gewichtsbereichen, die in der nachfolgenden
Tabelle angegeben sind:
Die in der obigen Tabelle angegebene "Größenzahl" ist unmittelbar
den angegebenen Toxizitäts-Werten gleichzusetzen. Es wurde das Gewicht
der Larve nach jedem Test bestimmt und jeder Larve wurde ein
Toxizitäts-Wert zugeordnet, der gleich der Größen-Zahl war, die
dem Gewichtsbereich entsprach, in den das Gewicht der Larve fiel.
Unter Berücksichtigung der unten angegebenen Ausnahmen wurden allen
toten Larven eine Größen-Zahl bzw. ein Toxizitäts-Wert von Null
zugeordnet. Die Toxizitäts-Werte aus der Wiederholung aller
Experimente wurden gemittelt, wobei die nachfolgend angegebenen
Ergebnisse erzielt wurden. Üblicherweise beruhten alle Ergebnisse
auf wenigstens 30 Wiederholungen des Experiments.
Die Becher wurden geöffnet, sobald Tabak-Knospenwürmer (TBWs) unterschiedlicher
Größenbereiche gefunden wurden. Diese TBWs wurden
solange gewogen, bis je ein TBW gefunden wurde, der in die einzelnen
Gewichts-Bereiche fiel. Die Probenbecher mit den TBWs in einem
gegebenen Gewichtsbereich wurden dann mit der entsprechenden
Größenzahl markiert. Diese wurden dann in aufsteigender Reihenfolge
auf dem Labortisch angeordnet. Die verbliebenen Proben wurden
dann durch visuellen Vergleich der Größe mit den gewogenen
TBW-Proben eingeordnet, und die jeweilige Größen-Zahl wurde auf
einem Bewertungsbogen eingetragen. Tote Larven wurden mit dem Zeichen
"+" protokolliert und mit der Bewertung Null versehen. Von
toten Larven, die eine hellrosa Farbe hatten, oder verflüssigt erschienen,
wurde angenommen, daß sie aus Gründen eingegangen waren,
die nicht mit der Verabreichung des delta-Endotoxins zusammenhingen.
Diese Larven wurden mit dem Zeichen "*" bewertet und bei den
Ergebnissen nicht mitgezählt.
Die Standard-Probenmenge von 1 ml einer PrAK-Kultur, die auf drei
Becher aufgeteilt worden war, ergab eine Wachstums-Verlangsamung
mitten in den Bereichen der Toxizitäts-Werte. Daher war der Test
nützlich in der Unterscheidung der Klone mit erhöhter Toxizität
von denen mit reduzierter oder gleicher Toxizität verglichen mit
den nicht-mutanten Stamm-Klonen. Der Test ergab eine Dosis-Response,
die von der Menge an prAK-Kultur abhing, die in den Test-
Behälter gefüllt worden war. Je größer daher die Menge an prAK-
enthaltenden Bakterien bei Zusatz zu den Proben war, umso größer
war dann auch der Toxizitätsgrad gegenüber den TBW bei der Beobachtung.
Die Dosis-Response-Kurve für prAK lieferte wertvolle Hinweise
bei der Bewertung der Frage, welche Klone toxischer waren
als die nicht-mutanten Stamm-Klone. Die folgende Tabelle gibt die
Dosis-Response der prAK enthaltenden Bakterien an:
Auf der Grundlage der obigen Bewertung wurden alle Kulturen unter
Verwendung von 1 ml Zusatz der Reihe nach unter Bezugnahme auf die
erhaltenen Gruppen-Zahlen getestet, um über einen weiten Bereich
eine Feststellung der Kulturen zu erlauben, die - bezogen auf prAK
(und andere nicht-mutante Plasmide) - eine größere oder geringere
Aktivität als ein Standard hatten.
Das Nährpulver, das in dem TBW-Test verwendet wurde, wurde aus den
nachfolgenden Komponenten in folgenden Gewichtsteilen (g) zusammengemischt:
Sojabohnenmehl: 1103,4; Weizenkeim: 429,4; Wesson-
Salzmischung: 292,4; Saccharose: 164,2; Methyl-p-Benzoat: 24,6;
und Sorbinsäure: 14,8.
Das in dem TBW-Test verwendete Vitaminpulver wurde aus den nachfolgend
angegebenen Komponenten in folgenden Gewichtsverhältnissen
(g) gemischt: Kalciumpantothenat: 12,0; Nicotinamid: 6,0; Riboflavin:
3,0; Folsäure: 3,0; Thiamin HCl: 1,5; Pyridoxin HCl: 1,5;
Biotin: 0,12 und Vitamin B₁₂: 6,0.
Die nachfolgend beschriebenen drei Screening-Anwendungen des TBW-
Tests (1. Serie, 2. Serie und Verdünnungsserie) wurden in den unterschiedlichen
Stadien der Bewertung eingesetzt, worauf in der
Beschreibung nachfolgend Bezug genommen wird:
1. Test (Primary Assay):
Mengen von 1 ml aus den 18 h-Kulturen zweier separater Klone wurden mit dem TBW-Nährmaterial in einem konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen vereint und gleichmäßig auf drei Becher verteilt (1 TBW pro Becher). Diese Proben wurden im Vergleich mit Kontrollproben des Wild-Typs von mit prAK oder pBT 210 transformierten und untransformierten Zellen bewertet, die in derselben Weise hergestellt worden waren.
Mengen von 1 ml aus den 18 h-Kulturen zweier separater Klone wurden mit dem TBW-Nährmaterial in einem konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen vereint und gleichmäßig auf drei Becher verteilt (1 TBW pro Becher). Diese Proben wurden im Vergleich mit Kontrollproben des Wild-Typs von mit prAK oder pBT 210 transformierten und untransformierten Zellen bewertet, die in derselben Weise hergestellt worden waren.
2. Test (Secondary Assay):
Proben, die erhöhte Toxizität gegenüber den TBWs in dem ersten Test zeigten, wurden einem zweiten Test unterworfen. Ausgewählte Mutanten-Kolonien wurden von den Hinweisplatten in YT/Amp-Brühe (1 Kolonie pro Kultur) inokuliert. Zehn 1 ml-Proben wurden zusammen mit geeigneten Kontrollproben bewertet. Klone, die erhöhte Toxizität gegenüber den TBWs zeigten, wurden als "wahrscheinlich durch Mutation verbessert (probable up-mutants)" bezeichnet und ein drittes Mal bewertet. Die Proben, die die positive Bewertung ein weiteres Mal wiederholten, wurden als "durch Mutation aufgewertet (up-mutants)" bezeichnet und in einem Verdünnungs-Test nochmals bewertet, um ihre erhöhte Aktivität gegenüber dem Ausgangs-Wild-Typ genauer zu bestimmen.
Proben, die erhöhte Toxizität gegenüber den TBWs in dem ersten Test zeigten, wurden einem zweiten Test unterworfen. Ausgewählte Mutanten-Kolonien wurden von den Hinweisplatten in YT/Amp-Brühe (1 Kolonie pro Kultur) inokuliert. Zehn 1 ml-Proben wurden zusammen mit geeigneten Kontrollproben bewertet. Klone, die erhöhte Toxizität gegenüber den TBWs zeigten, wurden als "wahrscheinlich durch Mutation verbessert (probable up-mutants)" bezeichnet und ein drittes Mal bewertet. Die Proben, die die positive Bewertung ein weiteres Mal wiederholten, wurden als "durch Mutation aufgewertet (up-mutants)" bezeichnet und in einem Verdünnungs-Test nochmals bewertet, um ihre erhöhte Aktivität gegenüber dem Ausgangs-Wild-Typ genauer zu bestimmen.
Verdünnungstest:
Mutanten, von denen die Bestätigung erhalten worden war, daß sie eine Verbesserung gegenüber den nicht-mutanten Konstrukten zeigten, wurden in einem weiteren TBW-Test in einer Verdünnungsserie getestet. Diese basierte auf dem Trockengewicht lyophilisierter Bakterienzellen, die entweder das Toxin der Mutante oder das des Wild-Typs aus prAK- oder pBT 210-Klonen enthielten, die man hatte 18 h wachsen lassen. Die Zellen waren vor der Lyophilisierung pelletiert worden. Die Proben wurden dreifach mit jeder der nachfolgend angegebenen Verdünnungen in einem Endvolumen von 15 ml angesetzt: 167 µg/ml, 67 µg/ml und 33 µg/ml. An dem Protein dieser Mutante wurde je eine SDS-PAGE-Analyse und eine Western- (Immunoblot-)Analyse durchgeführt; üblicherweise wurden pro Durchgang 75 µg Zelltrockengewicht verwendet. Die Ergebnisse der Verdünnungsreihe bestätigten im wesentlichen die Resultate der vorangehenden Tests und werden weiter nicht mehr angegeben oder in den nachfolgenden Tabellen, die die biologischen Ergebnisse zusammenfassen, bewertet.
Mutanten, von denen die Bestätigung erhalten worden war, daß sie eine Verbesserung gegenüber den nicht-mutanten Konstrukten zeigten, wurden in einem weiteren TBW-Test in einer Verdünnungsserie getestet. Diese basierte auf dem Trockengewicht lyophilisierter Bakterienzellen, die entweder das Toxin der Mutante oder das des Wild-Typs aus prAK- oder pBT 210-Klonen enthielten, die man hatte 18 h wachsen lassen. Die Zellen waren vor der Lyophilisierung pelletiert worden. Die Proben wurden dreifach mit jeder der nachfolgend angegebenen Verdünnungen in einem Endvolumen von 15 ml angesetzt: 167 µg/ml, 67 µg/ml und 33 µg/ml. An dem Protein dieser Mutante wurde je eine SDS-PAGE-Analyse und eine Western- (Immunoblot-)Analyse durchgeführt; üblicherweise wurden pro Durchgang 75 µg Zelltrockengewicht verwendet. Die Ergebnisse der Verdünnungsreihe bestätigten im wesentlichen die Resultate der vorangehenden Tests und werden weiter nicht mehr angegeben oder in den nachfolgenden Tabellen, die die biologischen Ergebnisse zusammenfassen, bewertet.
In den nachfolgenden numerierten Beispielen und darüber hinaus in
der vorliegenden Beschreibung wurden die folgenden üblichen oder
Standard-Labor-Verfahren eingesetzt, so weit dies im einzelnen angegeben
ist oder anderweitig erforderlich ist und so weit der
Text nicht im einzelnen was anderes angibt.
E. coli SG 4044 und JM 103 waren Wirte für alle Plasmid-Konstrukte.
Der Stamm E. coli JM 103 und die Phagen M 18 und MP 19
wurden von den "New England biolabs" erhalten. Diese Bakterienstämme
ließ man auf YT-Medium (5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Bactotrypton,
5 g/l NaCl), wachsen. Das Medium wurde mit 50 mg/l Ampicillin
zum Wachstum von Zelle ergänzt, die prAK oder Derivate dieses
Plasmids enthielten, und mit 20 mg/ml Chloramphenicol für Zellen,
die pBT 210 oder Derivate dieses Plasmids enthielten.
Die Herstellung von rekombinanten Phagen, die von M 13 abgeleitet
waren und die Isolation der Phagen-DNA wurde unter Einsatz schon
früher beschriebener Methoden durchgeführt (Messing, J. (1983) Methods
Enzymol. 101:20-78).
Synthetische Oligonucleotide wurden in einer automatisierten Synthese
mit einem "Applied Biosystems 380 A Synthese-Gerät (Applied
Biosystems Foster City, CA)" hergestellt.
Nach Abschluß des Cyclus erfolgten die Reinigungsschritte wie
nachfolgend beschrieben. Das synthetische Oligonucleotid wurde
durch Zusatz des gleichen Volumens Ammoniumhydroxid-Lösung und
Inkubation bei 55°C über Nacht deblockiert. Nach Entfernen des
Ammoniumhydroxids durch mehrfaches Geschwindigkeits-Vakuum-Zentrifugieren
und Resuspendieren in destilliertem Wasser wurde das
Oligonucleotid durch Harnstoff-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
(Harnstoff-PAGE; Urea-PAGE) weiter gereinigt. Um die Banden sichtbar
zu machen, wurde das Gel auf eine Doppelschicht-Chromatographieplatte
gelegt, die mit einer Saran®-Hülle versehen war. Das
Oligonucleotid wurde mit kurzwelligem UV-Licht beleuchtet. Danach
wurde der das Oligonucleotid enthaltende Bereich des Gels mit einer
Rasierklinge herausgeschnitten, und das Oligonucleotid wurde
von dem Gel mit 0,5 M Ammoniumacetat und 1 mM EDTA bei einem pH-
Wert von 8,0 und 37°C über Nacht unter Rühren eluiert. Nach dem
Eluieren wurden die Gel-Fragmente bei 6 000 Upm in einem JA 20-Rotor
pelletiert, und der das eluierte Oligonucleotid enthaltende
Überstand wurde in ein frisches Röhrchen überführt. Durch Fällung
mit ETOH wurde das Oligonucleotid aufkonzentriert und durch Absorption
bei 260 nm quantifiziert. 200 pmol des Oligonucleotids
wurden mit Kinase umgesetzt. Dies geschah durch Reaktion in einem
Volumen von 40 µl mit 2 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase in Gegenwart
von 0,05 mM ATP.
- (A) E. coli JM 103 oder SG 4044, die für die Transformation von DNA geeignet sind, wurden nach einer allgemein üblichen Verfahrensweise hergestellt, die in "Cohen, S.N., Chang, A.C.P. und Hsu, L. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USSA 69 : 2110-2114" beschrieben ist. Für die auf bestimmte Stellen gerichteten Oligonucleotid- Mutagenese-Experimente wurde heteroduplizierte rekombinante Phagen- DNA (M 13; 60 ng) zu 0,2 ml der Zellen zugesetzt und 15 Minuten lang bei 0°C gehalten. Die Zellen wurden nach folgenden zwei Minuten bei 42°C gehalten, und 30 µl dieser Mischung wurden 3 ml YT-Brühe, die 0,7% Bacto-Agar enthielt, der bei 42°C gehalten worden war, um einer Verfestigung vorzubeugen, zugesetzt. Außerdem wurden 0,2 ml einer frisch zubereiteten, über Nacht gehaltenen Kultur von JM 103 oder SG 4044 zugesetzt. Die Mischung wurde sofort auf eine YT-Agar-Platte aufgesprüht (YT-Brühe plus 1,5% Bacto-Agar), und die (umgekehrten) Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
- (B) Plasmid-DNA (100 ng) aus Mutagenese-Experimenten oder anderen Verknüpfungen unter Einschluß von prAK oder pBT 210-Vektoren, wie sie oben beschrieben wurden, wurden 0,2 ml der Zellen (JM 103 oder SG 4044) zugesetzt und die Mischung 30 Minuten lang bei 0°C gehalten. Die Zellen wurden nachfolgend zwei Minuten bei 42°C gehalten und wieder in ein Eisbad gegeben. Mengen von 2 µl bis 200 µl wurden auf YT-Agar ausgestrichen, der 50 µg/ml Ampicillin für Klone enthielt, die von prAK abstammen, und 20 µg/ml Chloramphenicol für Klone enthielt, die von pBT 210 abstammen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
Alle Restriktions-Enzyme wurden durch Bethesda Research Labs
(Gaithersburg, MD) oder durch New England Biolabs geliefert. Die
Inkubationsbedingungen wurden so gewählt, wie es durch die Hersteller
empfohlen wird.
- (A) Die Lösungen zur Verknüpfung der DNA (20 µl) enthielten 60 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreit(ol), 50 µM ATP, 20 nM DNA- Enden und 20 Einheiten T4-DNA-Ligase (Hersteller: New England Biolabs; sie wiesen einen pH-Wert von 7,5 auf. Die Inkubationszeit lag bei 4 Stunden bei 14°C.
- (B) Die Verknüpfungs-Reaktionen von drei Fragmenten wurden angesetzt mit Lösungen, in denen die Fragmente in einem Molverhältnis von 1 : 1 : 1 bei einer Konzentration von 0,04 pmole in jedem Reaktions- Volumen von 20 µl zugegen waren. Die Inkubationszeit betrug 4 Stunden bei 16°C, wenn nur ein "sticky end" zu verknüpfen war (beispielsweise eine interne Xho II-Schnittstelle) bzw. über Nacht, wenn ein "blunt end" zu verknüpfen war (beispielsweise eine FnuD2-Schnittstelle). T4-Ligase (Hersteller: New England Biolabs; NEB) wurde in einer Konzentration von 10 Einheiten pro µl Reaktionsvolumen verwendet (NEB-Definition).
Die DNA-Sequenzierung der delta-Endotoxin-Gene und ihrer Derivate
wurde mit Hilfe des Kettenend-Verfahrens (chain termination method)
von Heidecker et al. durchgeführt; vergleiche Heidecker, G.,
Messing, J., and Gronenborn, B. (1980) Gene 10 : 68-73.
1 µg des Plasmids pB8rII (siehe Fig. 2; vergleiche wie obige Beschreibung)
und die replikative Form der DNA aus den gut bekannten
M 13-Phagen-Klonierungs-Vektoren MP 18 und MP 19 wurden gleichzeitig
mit den Restriktions-Endonucleasen Bam HI (8 Einheiten) und
Kpn I (10 Einheiten) 60 Minuten lang bei 37°C in 100 mM
Natriumchlorid-Pufferlösung umgesetzt, die auch 6 mM Tris-HCl (pH
7,9), 6 mM MgCl₂ und 100 µg/ml Rinderserumalbumin enthielt. Die
gewünschten Fragmente aus den resultierenden DNA-Mischungen wurden
dadurch gereinigt, daß man die gesamte Mischung über ein 1% präparatives
Agarosegel laufen ließ, um die Fragmente der Größe nach
zu trennen. Die Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid
und Beleuchten mit langwelligem UV-Licht sichtbar gemacht. Das
Gelfragment, das die gewünschte DNA enthielt, wurde herausgeschnitten
und die DNA wurde durch Elektrophorese in Dialyse-Röhrchen
eluiert. Das Bam HI/Kpn I-Fragment aus pB8rII wurde in das aus MP
18 und MP 19 herausgeschnittene Bam HI/Kpn I-Fragment eingesetzt.
Die Vektoren wurden über ein Gel gereinigt, in dem man sie stundenlang
bei 14°C mit einem Gesamtvolumen von 20 l inkubierte, das
60 mM Tris-HCl (pH 7,5)), 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreit(ol), 50 mM
ATP und 20 nM DNA-Enden enthielt. Die resultierende DNA wurde in
E. coli JM 103-Zellen (vergleiche Beispiel P-4) transformiert, mit
der Abwandlung, daß die YT-Platten Isopropyl-Thiogalctosid (IPTG)
und 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-D-Galactosid (X gal), enthielt; beide
Chemikalien wurden von der Sigma Chemical Company geliefert.
Rekombinante Phagen (enthalten das DNA-Insert aus pB8rII) führen
unter diesen Bedingungen zu klaren Plaquen, während MP 18 und MP
19 blaue Plaquen ergeben. Die klaren Plaquen wurden 2 ml E. Coli
JM 103-Zellen in YT-Brühe zugesetzt und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Nach dem von J. Messing in J. Methods Enzymol. (1983),
101 : 20-78 beschriebenen Verfahrensweise wurde aus dem Phagen einzelsträngige
DNA hergestellt. Diese gewünschten Klone, die die
großen, aber einzelsträngigen DNA-Bruchstücke (inserts) aus pBr8II
wurden unter Verwendung von Agarose-Gel-Elektrophorese aufgrund
ihrer geringeren Mobilität verglichen mit MP 18 und MP 19, identifiziert.
Die Sequenzierung eines Teils dieser Klone, die die Endotoxin-
DNA einschlossen, durch das Verfahren des Dideoxy-Ketten-Abbruchs
(dideoxy chain termination method) bestätigte die Gegenwart
der Endotoxin-DNA und zeigte, daß MP 18 den gegenläufigen Strang
der DNA aufgenommen und daß MP 19 den gleichläufigen Strang der
DNA aufgenommen hatten. Beide wurden somit wiedergefunden.
Ein 26 Basen umfassendes gegenläufiges Oligonucleotid mit der Sequenz
5′ GTC CTT CTA ATC GCG AAA TGG CTT GG 3′
wurde durch Festphasen-Synthese in dem automatischen DNA-Synthesiser
hergestellt und mit T4-Polynucleotid-Kinase und ATP entsprechend
der Beschreibung in "Maniatis et al., Molecular Cloning
(1982): A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y." umgesetzt. In einem Gesamtvolumen von 60 µl
wurde eine Mischung aus 0,4 µg des rekombinanten Phagen MP 19, der
den Strang entsprechend der Endotoxin-Richtung enthielt, 20 mM
Tris-HCl, (pH 7,5), 7 mM MgCl₂ und 1 mM Dithiothreit(ol), 50 mM
Natriumchlorid und 10 ng des 26 Basen umfassenden gegenläufigen
Oligonucleotids 15 Minuten lang auf 68°C erwärmt, dann 10 Minuten
bei 37°C und danach bei 0°C gehalten. Die Mischung, die die rekombinante
DNA aus MP 19, verknüpft mit dem mutagenen Oligonucelotid
enthielt, wurde dann unter Zusatz von je 0,2 mM dATP, dCTP,
dTTP und dGTP, 1 mM ATP, 4 Einheiten DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment
(Hersteller: New England Biolabs), 0,5 µg E. coli-Einzelstrang-
Bindungsprotein (Hersteller: Pharmacia, Piscataway, N.J.)
und 20 Einheiten T4-DNA-Ligase (Hersteller: New England Biolabs)
behandelt. Die resultierende Mischung wurde 4 Stunden lang bei 14
°C zur Polymerisation und Verknüpfung inkubiert. Die resultierende
kreisförmige doppelsträngige heteroduplizierte DNA wurde in E.
coli JM 103 transformiert und - wie in Beispiel P-4 beschrieben -
ausgestrichen. 20 individueller Plaquen wurden dann ausgewählt und
die Einzelstrang-DNA aus dem Phagen wie bei Maniatis a.a.O. beschrieben,
isoliert. Die DNA aus dem Phagen von den 20 Plaquen
wurden jeweils in einem Gesamtvolumen von 20 l aufgenommen, das 50
mm Tris-HCl, (pH 8,0), 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 ng des oben beschriebenen
26 Basen umfassenden gegenläufigen Oligonucleotids und
0,2 µg verschiedener kreisförmiger einsträngiger Phagen-DNA-Moleküle
enthielt. Die jeweilgien Volumina wurden 15 Minuten lang auf
68°C erhitzt und danach 10 Minuten lang bei 37°C gehalten. Die
Restriktions-Endonuclease Nru I (8 Einheiten) wurde zu jeder der
resultierenden Mischung zugesetzt und die Inkubation 1 Stunde lang
bei 37°C fortgesetzt. Die jeweiligen Mischungen wurden auf 0,8%
Agarose-Gel der Elektrophorese unterworfen. Etwa 10% der Proben
enthielten eine DNA, die als lineare DNA wanderte und damit die
Identifikation der positiven Klone erlaubte, die die gewünschte
Nru I-Schnittstelle enthielten. Die positiven Klone wurde in E.
coli JM 103 transformiert, um eine Reinigung zu erzielen. Die DNA
zwischen den Bam HI- und Xba I-Schnittstellen in den positiven
Klonen wurde herausgeschnitten (nach Verknüpfung mit M 13 sequenzierenden
Oligonucleotiden und Polymerisation unter Bildung von
Doppelsträngen wie dies oben für das Nru I-Oligonucleotid beschrieben
wurde). Das Herausschneiden wurde durch gleichzeitige
Behandlung mit den Endonucleasen für diese Schnittstellen durchgeführt.
Die DNA wurde anschließend (gemäß Beispiel P-6A) mit dem
großen Fragment verknüpft (etwa 5004 Basepaare und unter Auslassung
des etwa 749 Basepaare umfassenden Fragments zwischen der Bam
HI-Schnittstelle und der zweiten Xba I-Schnittstelle im prAK).
Letzteres war enthalten und über ein Gel gereinigt worden nach
vollständiger Umsetzung von prAK gleichzeitig mit den beiden selben
Restriktions-Enzymen. Alle Umsetzungen wurden unter Zug 26986 00070 552 001000280000000200012000285912687500040 0002003905865 00004 26867rundelegung
üblicher Methoden durchgeführt und dabei das Plasmid prAK-3
gebildet.
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen
Schritt (a) wurde die einzelsträngige Phagen-DNA, die in Schritt
(a) erhalten worden war, mit einem 25 Basen umfassenden in gegenläufiger
Richtung synthetisierten Oligonucleotid verknüpft, das
die Sequenz
5′ CCA CTC TCT AAA GCT TTC TGC GTA A 3′
aufwies. Diese Sequenz ist geeignet, die Hind III-Schnittstelle
zwischen die Nucleotid-Positionen 327 und 351 in der Nucleotid-Sequenz
von Tabelle A einzuführen. Positive Klone, die nun sowohl
die gewünschte Nru I-Schnittstelle als auch die Hind III-Schnittstelle
aufwiesen, wurden in einer Häufigkeit von etwa 6,8% identifiziert.
Dies geschah durch Spaltung mit der Nuclease Hind III
und nachfolgende Bewertung. Die Klone wurden dazu verwendet, prAK-
4 herzustellen. Dies geschah durch Verknüpfung des Bam HI/Cba I-
Fragments mit den neuen Schnittstellen des großen, 5004 Basepaare
umfassenden Fragments aus prAK in der Weise, wie dies in Schritt
(a) angegeben ist.
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen
Schritt (a) wurde die einzelsträngige Phagen-DNA, die in Schritt
(b) erhalten worden war, mit einem 26 Basen umfassenden in gegenläufiger
Richtung synthetisierten Oligonucleotid verknüpft, das
die Sequenz
5′ GCA TCT CTT CCC TTA GGG CTG GAT TA 3′
aufwies. Diese Sequenz ist geeignet, die Mst II-Schnittstelle zwischen
die Nucleotid-Positionen 366 und 391 in der Nucleotid-Sequenz
von Tabelle A einzuführen. Positive Klone, die nun alle drei
gewünschten Schnittstellen (Nru I, Hind III und Mst II) aufwiesen,
wurden in einer Häufigkeit von etwa 9,1% identifiziert. Dies geschah
durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym Mst II und nachfolgende
Bewertung. Die Klone wurden dazu verwendet, prAK-5 herzustellen.
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen
Schritt (a) wurden die positiven doppelsträngigen Phagenklone aus
dem obigen Schritt (c) in einzelsträngige Phagen-DNA umgewandelt
und mit einem 26 Basen umfassenden, in gegenläufiger Richtung synthetisierten
Oligonucleotid verknüpft, das die nachfolgende Sequenz
aufwies:
5′ GCG GTT GTA AGC GCG CTG TTC ATG TC 3′
Diese Sequenz ist geeignet, die Bss HII-Schnittstelle zwischen die
Nucleotid-Positionen 406 und 431 in der Nucleotidsequenz von Tabelle
A einzufügen. Positive Klone, die nun alle 4 Schnittstellen
enthalten, die letztendlich in prAK-7 erwünscht sind, wurden in
einer Häufigkeit von etwa 12,5% durch Spaltung mit dem Enzym Bss
HII und anschließende Bewertung identifiziert. Sie wurden zur Herstellung
von prAK-6 verwendet.
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen
Schritt (a) wurde die einzelsträngige Phagen-DNA, die in Schritt
(d) erhalten worden war, mit einem 26 Basen umfassenden in gegenläufiger
Richtung synthetisierten Oligonucleotid verknüpft, das
die Sequenz
5′ TAC AGT CCT AAA TCT TCC GGA CTG TA 3′
aufwies. Diese Sequenz ist geeignet, die Hind III-Schnittstelle
zwischen den Nucleotid-Positionen 1682 und 1707 in der Nucleotid-
Sequenz von Tabelle A zu eliminieren. Positive Klone, die nun die
gesamte, für prAK-7 gewünschte Sequenz darstellen, wurden in einer
Häufigkeit von etwa 2,8% identifiziert. Dies geschah durch Screening
der replikativen Form (doppelsträngig) der rekombinanten Phagen-
DNA mit Restriktions-Endonucleasen auf einen Verlust Hind III-
Schnittstelle zwischen den Nucleotidpositionen 1682 und 1707. Doppelsträngige
DNA die von dem Mutanten isoliert worden war, wurde
zur Herstellung von prAK-7 verwendet.
Um ein Plasmid (prAK-9) mit geeigneten charakteristischen und
richtig angeordneten Restriktionsstellen zur Durchführung der "Codon-
Spin-Experimente" an anderen Mutationsstellen zwischen den
beiden Xba I-Stellen bereitzustellen, können in der prAK-Plasmid-
Serie weitere Plasmide entwickelt werden. Dies geschieht in Analogie
zu den nachfolgend beschriebenen Verfahrensschritten und führt
zu einem Plasmid prAK-8 und - von diesem ausgehend - zu prAK-9.
Dies wird in den nachfolgenden Schritten (f) und (g) angegeben.
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen
Schritt (a) wurde die einzelsträngige Phagen-DNA, die in Schritt
(e) erhalten worden war, mit einem 27 Basen umfassenden in gegenläufiger
Richtung synthetisierten Oligonucleotid verknüpft, das
die Sequenz
5′ TCC CCA CCT TTG GCC AAA CAC TGA AAC 3′
aufwies. Diese Sequenz ist geeignet, eine Bal I-Restriktions-
Stelle ungefähr bei der Nucleotid-Position 534 in der Nucleotid-
Sequenz von Tabelle A einzuführen. Positive Klone (prAK-8), die
nun alle fünf gewünschten Schnittstellen (Nru I, Hind III, Mst II,
Bss HII und Bal I) aufweisen und die Hind III-Schnittstelle nicht
enthalten, die bei der Herstellung von prAK-7 entfernt wurde, wurden
in der im obigen Schritt (a) beschriebenen Weise identifi
ziert.
Nach im wesentlichen dem gleichen Gesamtverfahren wie im obigen
Schritt (a) wurde die einzelsträngige Phagen-DNA, die in Schritt
(f) erhalten worden war, mit einem 30 Basen umfassenden in gegenläufiger
Richtung synthetisierten Oligonucleotid verknüpft, das
die Sequenz
5′ GTT GCC AAT AAG ACG CGT TAA ATC ATT ATA 3′
aufwies. Diese Sequenz ist geeignet, die Mlu I-Schnittstelle zwischen
die Nucleotid-Positionen 588 und 595 in der Nucleotid-Sequenz
von Tabelle A einzuführen. Positive Klone, die nun alle
sechs gewünschten Restriktionsstellen (Nru I, Hind III, Mst II,
Bss HII, Bal I und Mlu I) aufweisen, und die Hind III-Schnittstelle
nicht enthalten, die bei der Herstellung von prAK-7 entfernt
wurde, werden in der im obigen Schritt (a) beschriebenen
Weise identifiziert und als "Plasmid prAK-9)" bezeichnet. Wie offensichtlich
ist, lassen sich DNA ("Cassette-DNA") die für die
Substitution zwischen den Bal I- und Mlu I-Schnittstellen in prAK-
9 geeignet sind, in geeigneter Weise kodieren, um alle möglichen
Codon-Variationen und Aminosäure-Variationen an den mutierten
Aminosäure-Positionen 184, 187, 188 und 194 einzuführen.
In gleicher Weise lassen sich auch DNA ("Cassette-DNA"), die für
die Substitution zwischen der Mlu I-Schnittstelle und der zweiten
Xba I-Schnittstelle geeignet sind, in geeigneter Weise kodieren,
um alle möglichen Codon-Variationen und Aminosäure-Variationen an
den mutierten Aminosäure-Positionen 201 und 204 einzufügen.
Fig. 5 zeigt eine schematische Wiedergabe der besonderen Restriktions-
Stellen, die zwischen den beiden ursprünglichen Xba I-
Schnittstellen in prAK einführbar sind; die erste dieser beiden
Xba I-Schnittstellen ist in prAK-9 nun die Nru I-Schnittstelle.
Das Unterstreichen in den gegenläufigen Oligonucleotiden (vergleiche
die einzelnen Schritte des obigen Beispiels 1) zeigt, daß an
dieser Stelle eine Änderung oder Änderungen eingeführt wurden.
- (A) Einzelsträngige Oligonucleotide, die die Sequenz jedes der beiden in den Fig. 3A und 3B gezeigten Stränge haben, wurden wie in Beispiel P-3 beschrieben hergestellt. Dazu wurde der DNA- Syntheseapparat (DNA synthesizer) verwendet, der darauf programmiert war, zufällig alle Nucleotide A, T, C und G an jeder der X- Positionen in jedem in Fig. 3A gezeigten Strang einzuführen. Eine Gesamtmenge von etwa 200 µg (nach Reinigung) DNA wurde durch diese Verfahrensweise bei jedem Lauf hergestellt. Solche Einzelstränge geben eine Familie von Oligonucleotiden wieder, die bis auf die X-Positionen jedes Strangs identisch sind. 10 pmol des Strangs (rechtläufig und gegenläufig für jeden Codon-Spin) wurden in der Masse kombiniert und durch Erwärmen auf 68°C über 10 Minuten verknüpft, dann 10 Minuten bei 37°C gehalten, auf Raumtemperatur abgekühlt und auf Eis gelagert. Es wurde angenommen, daß die resultierende Masse doppelsträngiger Oligomerer, die der in Fig. 3A gezeigten DNA entspricht, an den XXX-Positionen (Aminosäure- Position 116) jede Kombination enthält, die durch den genetischen Code erlaubt ist, einschließlich Stopsignale und mehreren, aber variablen Anzahlen von Codons für jede der zwanzig natürlichen Aminosäuren, einschließlich Stopsignalen. 1 pmol dieser doppelsträngigen Oligomeren oder Cassetten (cassettes) wurden dann mit T4 Polynucleotid-Kinase (Hersteller: New England Biolabs) umgesetzt und in der Masse mit dem größeren Fragment gemischt, das in zehnfach geringerer molarer Konzentration zugegen war und erhalten worden war durch Isolierung über ein Gel nach gleichzeitiger Spaltung des Plasmids prAK-7 mit den Restriktions-Endonucleasen Hind III und Mst II in 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 100 µg/ml BSA. Die resultierende Mischung wurde einer Verknüpfungsreaktion in Übereinstimmung mit Beispiel P-6 (A) unterworfen. Ein aliquoter Teil (5 µl) der resultierenden Verknüpfungsmischung wurde dann zur Transformation von E. coli JM 103 unter den Bedingungen des Beispiels P-4 (B) eingesetzt. Eine Anzahl (200) der resultierenden transformierten Zellen wurden einzeln im TBW-Test und im T. ni-Test (ohne vorherige Kenntniss, welches Codon in der Position XXX in dem jeweiligen besonderen Klon vorhanden ist) unterworfen. Es wurde dabei eine gewisse Aktivität gefunden, die ziemlich gut zeigt, daß alle ver schiedenen Mutanten zu einem insektizid aktiven Protein-Produkt führten, das eine Aktivität aufwies, die wenigstens etwa im Bereich des (verkürzten) Kontroll-Endotoxins lag. Ebenfalls ergaben sich Mutanten, deren Aktivität klar (um den Faktor 5 gegenüber dem Kontrollwert) darüber lag.
Davor wurden zufällige Zellen aus der Transformation ebenso selektiert,
ausgestrichen und Kolonien wie in Beispiel P-1 gezüchtet,
um Plasmid-DNA für die DNA-Sequenz-Analyse durch Klonierung des
Bam HI/Xba I-Fragments in die Sequenz-Vektoren MP 18 und MP 19,
die mit denselben Enzymen behandelt worden waren, zu isolieren.
Die DNA im Bereich jedes der elf in der Position 116 mutierten Mutanten
und die identifizierten, in der Wirkung verbesserten Mutanten,
wurden dann sequenziert, um die Aminosäure-Reste zu bestimmen,
für die an der Position 116 kodiert wird. Es wurde gefunden,
daß eine der beiden verbesserten Mutanten (up-mutants) die ursprüngliche
verbesserte Mutante war (116-Lys, aber kodiert durch
AAA). Die andere verbesserte Mutante (up-mutant) wurde als 116-Arg
identifiziert; hierfür kodierte CGT. Es wurde herausgefunden, daß
einer der anderen Klone der native Klon mit 116-Glu war (wofür allerdings
GAA kodierte). Sieben der anderen leichten Mutanten waren
die folgenden (in Klammer ist die Kodierung angegeben): 116-Ile
(ATT), 116-Cys (TGC), 116-Leu (CTC), 116-Asp (GAT), 116-Asn (AAC),
116-Ile (ATT) und 116-Gly (GGA).
Alle waren nur einfach vertreten mit Ausnahme des neuen 116-Ile
(ATT), der durch zwei der Klone wiedergegeben war. Die letzten
Klone kodierten für 116-Stop (TGA).
- (B) Verfahrensweise aus Teil (A) dieses Beispiels 2 wurde für die Aminosäure-Position 119 unter Verwendung der DNA wiederholt, die in Fig. 3B gezeigt ist. Wieder ergab die zufällige Bewertung einer großen Zahl von resultierenden Klonen eine Aktivität im TBW- Test und im T. ni-Test und zeigten damit ziemlich deutlich, daß alle mutanten Klone aus dieser Gruppe aktiv waren. Der Prozentanteil inaktiver Moleküle war näherungsweise gleich dem Wert, der für die Häufigkeit der Stop-Codons UAA, UAG und UGA von der zufälligen Eingabe der Nucleotide in die XXX-Position durch die Maschine erwartet würde. Es wurde herausgefunden, daß sieben zufällig selektierte individuelle Klone eine Aktivität aufweisen, die annäherungsweise wenigstens so groß ist wie die des Endotoxins mit der verkürzten nativen Sequenz, wie es durch prAK produziert wird. Keines war jedoch eine verbesserte Mutante (up mutant) im Sinne des willkürlichen Standards. Eine Sequenzierung der sieben individuellen Klone zeigte, daß sie alle unterschiedliche und nur einmal vorhanden waren. Die Positionen der geänderten Aminosäuren bzw. ihre Kodierung (in Klammern) ist wie folgt: 119-Leu (CTA), 119-Tyr (TAC), 119-Asp (GAT), 119-His (CAT), 119-Pro (CCA), 119-Ile (ATT) und 119-Ser (TCT).
Das Plasmid pBT 210 (1 µg) wurde gleichzeitig mit den Restrikti
onsendonucleasen Bam HI (8 Einheiten) und Sst I (8 Einheiten) 60
Minuten lang in 100 mM Natriumchlorid-Pufferlösung behandelt, die
auch 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl₂ und 100 µg/ml Rinderserumalbumin
enthielt. Das größere Fragment von etwa 7180 Basepaaren
wurde zur Verwendung als Vektor über ein Gel gereinigt.
Dann wurde ein 1 µg des Plasmids prAK-26-3 (mit den Mutationen Ala
→Thr Nr. 119, Met→Ile Nr. 130 und Gly→Asp Nr. 201)
auch gleichzeitig mit den Restriktionsendonucleoasen Bam HI (8 Einheiten)
und Sst I (8 Einheiten) 60 Minuten in 100 mM Natriumchlorid-
Pufferlösung behandelt, die auch
6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl₂ und 100 µg/ml Rinderserumalbumin
enthielt. Das kleinere Fragment von etwa 1428 Basepaaren, das
die Mutationen wie auch den B. t.-RBS-Abschnitt enthielt, wurde
über ein Gel gereinigt. Dieses Fragment wurde in einer Menge von
etwa 0,06 pmol zur Verknüpfung mit 0,02 pmol des 7180 Basepaare
umfassenden Vektor-Fragments, das wie oben beschrieben erhalten
worden war, kombiniert und zusammen in 20 l eines Ligations-
Mediums vereint, das 60 mM Tris-HCl (ph 7,5), 10 mM MgCl₂ 1 mM
Dithiothreit(ol), 50 M ATP und 20 Einheiten T4 DNA-Ligase
enthielt. Die resultierende Mischung wurde 4 Stunden bei 14°C inkubiert.
Das resultierende Plasmid, genannt pBt 26-3 wurde in E.
coli JM 103 durch Zusatz von 5 µl der Ligationsmischung zu 0,2 ml
der E. coli JM 103 enthaltenden Flüssigkeit transformiert. Die Mischung
wurde anfänglich 30 Minuten bei 0°C gehalten, danach 2 Minuten
bei 42°C pulsiert und dann wieder auf Eis gebracht. Verschiedene
Mengen (2 µl, 20 µl und 180 µl) der resultierenden Mischung
wurden dann sofort auf YT-Agarplatten mit 20 µg/ml Chloramphenicol
(YT-Brühe plus 1,5% Bacto-Agar) aufgesprüht. Die Platten
wurden umgekehrt bei 37°C über Nacht inkubiert. Nur eine transformierte
Zelle mit Chloramphenicol-Resistenz konnte auf diesen
Platten wachsen. Chloramphenicol-resistente Kolonien wurden bei 37°C
über Nacht in Flüssigkeitskultur gezüchtet, und einer Plasmid-
DNA wurde zur Restriktions-Behandlung (restriction digestion) mit
EcoRI-Reagentien und zur DNA-Sequenzierung hergestellt, um
tatsächlich die Gegenwart von Punkt-Mutationen zu bestimmen. Erfolgreiche
Transformanten, die das Plasmid pBT 26-3 enthielten,
wurden dann im TBW-Test und im T. ni-Test bewertet.
Bei Vorgehen analog zu dem oben beschriebenen Beispiel 3 wurden
die nachfolgend angegebenen weiteren mutanten Endotoxine voller
Länge hergestellt und im TWB-Test und im T. ni-Test bewertet. Die
nachfolgende Tabelle F gibt die so hergestellten Plasmide/
Zellsysteme an, die die zusätzlichen mutanten Endotoxine voller
Länge produzieren. Alle Angaben enthalten auch die ungefähren
Ergebnisse ihrer Bewertung im TWB-Test. In der Tabelle sind auch
die ungefähren Ergebnisse enthalten, die in diesem Test für das
Produkt des obigen Beispiels 3 erhalten wurden, sowie für das native
Endotoxin aus B. t. wuhanensis, das in E. coli JM 103 produziert
wurde, und eine Kontrollsubstanz, die aus untransformierten
JM 103-Zellen stammt.
Das Plasmid pBT 210 (1 µg) wurde gleichzeitig mit den Restrikti
onsendonucleasen Bam HI (8 Einheiten) und Sst I (8 Einheiten) behandelt.
Das resultierende, 7180 Basepaare umfassende große Fragment
wurde über ein Gel isoliert. In einer Serie getrennter Versuche
wurde jedes (1 µg) der Plasmide prAK, prAK-E, p26-3, p36a65
und p95a86 ebenfalls gleichzeitig mit den Restriktionsendonucleasen
Bam HI (8 Einheiten) und Sst I (8 Einheiten) behandelt. Jedes
der resultierenden 1428 Basepaare enthaltende Fragment einschließlich
eines Abschnitts einer verkürzten für ein Endotoxin kodierenden
Sequenz wurde über ein Gel isoliert. Jede Menge dieser 1428
Basepaare umfassende Fragment wurde dann separat mit der Restrik
tionsendonuclease Fnu D2 (4 Einheiten in 6 mM NaCl, 6 mM Tris HCl
(pH 7,4), 6 mM MgCl₂, 6 mM 2-Mercaptoethanol und 100 µg/ml Rinderserumalbumin)
behandelt. Die Restriktionsendonuclease Fnu D2 (auch
bekannt als Acc 2) schneidet jedes der verschiedenen 1428 bp Bam HI/Sst I-
Fragmente nur einmal und zwar in ein 640 bp Bam Hi/Fnu D2-
Fragment und ein 788 bp Fnu D2/Sst I-Fragment. Die verschiedenen
Fragmente jedes Experiments wurden über Agarosegel-Elektrophorese
gereinigt.
Auf diesem Weg wurde eine Anzahl von verschiedenen 640 bp Bam HI/Fnu D2-
Fragmenten und eine Anzahl von verschiedenen 788 bp Fnu D2/Sst I-
Fragmenten erhalten. Durch Auswählen eines Fragments aus
jedem dieser beiden Serien und Verknüpfen (vergleiche Beispiel P-6
B) mit dem größeren 7180 bp-Fragment, das aus pBT 210 erhalten
worden war, ließ sich eine Zahl neuer Plasmide herstellen, die
verschiedene mutante B. t.-Endotoxin-Gene voller Länge enthalten.
Die so erhaltenen neuen Plasmide, die in der nachfolgenden Tabelle
G identifiziert sind, wurden dann zur Transformation von E. coli
JM 103 entsprechend der Vorgehensweise von Beispiel P-4 (A) eingesetzt.
Die resultierenden Zellen wurden hinsichtlich der Produktion
von B. t.-Endotoxin im TBW-Test gemäß Beispiel A bewertet.
Die ungefähren Ergebnisse diese Tests sind ebenfalls in Tabelle G
angegeben. Verschiedene der transformierten, Plasmide enthaltenden
Zellen, wie sie in den Tabellen F und G beschrieben sind, wurden
auch im T. ni-Test bewertet. Die Ergebnisse sind weiter unten in
Tabelle H angegeben.
Zellen, die mit DNA transformiert worden waren, die für eine mutante
Endotoxin-Sequenz kodiert, wurden in einem Fermenter unter
bekannten und für diese Zwecke Standardbedingungen gezüchtet. Der
gesamte Fermenterinhalt wurde am Ende der Zellenwachstumsperiode und
unmittelbar vor der Produktgewinnung, auf eine Temperatur von ungefähr
70 bis 80°C erhitzt. Diese Temperatur wurde 10 Minuten
aufrecht erhalten, bevor der Fermenter abgekühlt wurde. Sie ist
ausreichend zur Inaktivierung der rekombinanten Mikroorganismen,
ohne die biologische Aktivität des Endotoxin-Proteins zu beeinträchtigen.
Der Fermenterinhalt wurde dann unter vermindertem
Druck verdampft, um das Volumen auf ein Drittel des vorangegangenen
Volumens aufzukonzentrieren. Das resultierende Konzentrat
wurde dann bei einem Einlaßdruck von etwa 2000 psi getrocknet, wobei
ein aufgeheizter Gegenluftstrom mit einer Einlaßtemperatur von
140 bis 160°C und einer Auslaßtemperatur von 20-50°C eingesetzt
wurde.
Das resultierende Pulver wurde mit einem Träger gemischt, beispielsweise
mit entfettetem Sojabohnenmehl, wobei sich ein benetzbares
Konzentrat bildete. Geeignete Mengenverhältnisse der Komponenten
hängen im allgemeinen von der gewünschten Stärke des Endprodukts
ab, können jedoch beispielsweise bei 60 : 40 (Gewichtsteile
Pulver zu Träger) liegen. Das resultierende Konzentrat enthält
vorzugsweise 0,4 bis 10%, noch mehr bevorzugt 0,8 bis 8%
aktiven Bestandteil, angegeben als Spuren oder Endotoxin-Protein.
Das benetzbare Pulver wird in geeigneter Weise mit Wasser verdünnt,
wie es im Stand der Technik für die Sprühanwendung bekannt
ist.
Die besonders bevorzugten Mutationen gemäß der Erfindung schließen
solche an den Positionen 116 (Lys oder Arg), 119 (Thr), 130 (Ile)
und 188 (Ser) ein. Kombinationen davon schließen eine oder mehrere
der genannten Mutationen ein, wie sie beispielsweise in pBT26-3,
pBT-106, pBT-68, pBT-C, pBT-67 und pBT-70 zu finden sind. Einige
von den genannten finden sich in Tabelle G. Ebenfalls von bevorzugtem
Interesse sind die einzelnen und kombinierten Mutationen in
p36a65, insbesondere für die gekürzten Endotoxine.
Die Mutationen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung
an der Aminosäure-Position 4 gefunden werden und erlaubt
sind, sind von Interesse, da sie in einen Abschnitt von 25 Aminosäuren
fallen (Positionen 1 bis einschließlich 25 in Tabelle A),
von dem postuliert wird, daß er auch einen Prä-Toxin- oder Protoxin-
Abschnitt des Endotoxins bildet, der im Darm durch eine Protease
abgespalten wird, wobei sich das aktive Endotoxin oder das
aktivere Endotoxin bildet. Die in Position 4 erlaubten Mutationen
sind also relevant für die Endotoxin-Sequenzen, die die genannten
25 Aminosäuren umfassen, oder im wesentlichen (mindestens 70%)
Homologie damit aufweisen. Sie sind - genauer gesagt - relevant für
solche Endotoxine, die in diesem Bereich eine DNA kodiert, die vor
der Mutation in 4-Position hybridisieren würde, und unter stringenten
Bedingungen für eine DNA, die die in Tabelle A gezeigte Sequenz
für die Nucleotid-Positionen von der Nucleotid-Position 1
bis einschließlich zur Nucleotid-Position 75 aufweist, unabhängig
von Streichungen und Zusätzen und unter äquivalenter Kodierung
entsprechender Aminosäuren, wie sie vorstehend im Zusammenhang
mit dem entscheidenden, 116 Aminosäurereste umfassenden Sequenzbereich
diskutiert wurden.
Die durch die erfindungsgemäßen Arbeiten entdeckte Mutation an der
Aminosäure-Position 217, wie sie in der obigen Tabelle B wiedergegeben
ist und in der vorliegenden Beschreibung an anderer Stelle
gewürdigt wurde, zeigt - wie angenommen wird - daß alle natürlich
kodierten Aminosäuren an dieser Position in aktiven Endotoxinen
mit der in Tabelle A gezeigten relevanten Sequenz stehen können.
Diese Sequenz erstreckt sich vom Ende der 116 Aminosäuren umfassenden
Referenz-Sequenz bis einschließlich zur Aminosäure-Position
217. Entsprechend liegt der Fall, in dem die Aminosäure an Position
217 in einer solchen Sequenz oder einer äquivalenten Sequenz
eine beliebige natürlich kodierte Aminosäure mit Ausnahme von Arg
ist, im Bereich der vorliegenden Erfindung. Da allerdings die angegebene
Mutation in Position 217 zu weniger interessanten Ergebnissen
führte, ist diese Position hauptsächlich von Interesse in
Kombination mit anderen Mutationen, die in der vorliegenden Anmeldung
offenbart sind, und gibt an, daß Position 217 in Endotoxinen,
in denen natürlicherweise Arg an dieser Position erscheint, verändert
werden kann.
Claims (25)
1. Strukturgen, umfassend eine DNA, die für ein Endotoxin-Protein
mit toxischer Aktivität gegen Insekten kodiert, wobei die DNA
einen Abschnitt einschließt, der für eine Aminosäure-Sequenz kodiert,
die im wesentlichen Homologie mit der 116 Aminosäuren umfassenden
Sequenz zeigt, die bei der Position m-1 beginnt und sich
bis zur Position m-116 in Tabelle A erstreckt, wobei sich die Positions-
Zahlen auf eine derartige homologe Sequenz unabhängig von
Streichungen oder Zusätzen beziehen, worin die DNA in der Weise
modifiziert ist, daß sie für eine oder mehrere der nachfolgend
genannten Aminosäuren an den angegebenen Aminosäure-Bezugspositionen
kodiert:
- (a) an Position m-5 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn;
- (b) an Position m-6 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Gln;
- (c) an Position m-12 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Glu;
- (d) an Position m-16 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn;
- (e) an Position m-27 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Glu;
- (f) an Position m-30 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala;
- (g) an Position m-33 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Thr;
- (h) an Position m-34 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn;
- (i) an Position m-36 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala;
- (j) an Position m-41 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Met;
- (k) an Position m-95 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Phe;
- (l) an Position m-98 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala;
- (m) an Position m-99 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Thr;
- (n) an Position m-105 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn; und
- (o) an Position m-112 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Gly.
2. Strukturgen nach Anspruch 1, worin die Homologie zwischen der
Aminosäure-Sequenz, für die der Abschnitt der DNA des Strukturgens
kodiert, und der 116 Aminosäuren umfassenden Sequenz, die bei Position
m-1 beginnt und sich bis zur Position m-116 in Tabelle A
erstreckt, wenigstens 70% ist.
3. Strukturgen nach Anspruch 1 oder 2, worin die DNA so modifiziert
worden ist, daß sie für eine oder mehrere der nachfolgend
angegebenen Aminosäuren an den angegebenen Aminosäure-Bezugspositionen
kodiert:
- (a) an Position m-5 Lys;
- (b) an Position m-6 Lys;
- (c) an Position m-12 Lys;
- (d) an Position m-16 Tyr;
- (e) an Position m-27 Lys oder Arg;
- (f) an Position m-30 Thr;
- (g) an Position m-33 Ile;
- (h) an Position m-34 Tyr;
- (i) an Position m-36 Val;
- (j) an Position m-41 Ile;
- (k) an Position m-95 Ile;
- (l) an Position m-98 Thr;
- (m) an Position m-99 Ser;
- (n) an Position m-105 Lys; und
- (o) an Position m-112 Asp.
4. Strukturgen nach Anspruch 3, worin die DNA in der Weise modifiziert
wurde, daß sie eine Änderung an einer oder beiden Aminosäure-
Bezugspositionen m-27 und m-30 einschließt.
5. Strukturgen nach Ansprüchen 1 bis 4, worin der DNA-Abschnitt
ohne eine der in den Ansprüchen 1 bis 4 spezifizierten Modifikationen
unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zu einem 348
Nucleotide umfassenden Oligomer hybridisiert, das die in Tabelle A
abgebildete Nucleotid-Sequenz aufweist, die bei Position n-1 beginnt
und sich bis zur Nucleotid-Position n-348 erstreckt.
6. Strukturgen nach Anspruch 5, worin der DNA-Abschnitt vor jeder
Modifikation, wie sie in den Ansprüchen 1 bis 4 spezifiziert ist,
für die 116 Aminosäuren umfassende Sequenz von Tabelle A kodiert
die bei Position m-1 beginnt und sich bis zur Position m-116 er
streckt.
7. Strukturgen nach Anspruch 6, worin die für das Endotoxin kodierende
DNA eine DNA umfaßt, die für die Aminosäure-Sequenz in Tabelle A
kodiert, die bei der Aminosäure-Position 1 beginnt und
sich bis zur Aminosäure-Position 205 erstreckt.
8. Strukturgen umfassend eine DNA, die für ein Endotoxin-Protein
mit toxischer Aktivität gegen Insekten kodiert, wobei die DNA
einen Abschnitt aufweist, der für eine Aminosäure-Sequenz kodiert,
der im wesentlichen Homologie der Aminosäuren zu der 205 Aminosäuren
umfassenden Sequenz zeigt, die bei der Aminosäure-Position 1
beginnt und sich bis zur Aminosäure-Position 205 in Tabelle A erstreckt,
worin die Aminosäure in Position Nummer 4 eine beliebige
Aminosäure mit Ausnahme von Asn ist.
9. Strukturgen nach Anspruch 8, worin die Aminosäure in Position 4
Tyr ist.
10. Expressions-Vektor umfassend das Strukturgen nach einem der
Ansprüche 1 bis 9 unter Kontrolle einer DNA, die in der Weise
funktionsfähig ist, daß sie die Expression des Strukturgens in einem
bakteriellen Wirt bewirken kann.
11. Expressions-Vektor nach Anspruch 10, worin das Gen unter Kontrolle
einer DNA ist, die in der Weise funktionsfähig ist, daß sie
die Expression des Gens in E. coli bewirkt.
12. Expressions-Vektor nach Anspruch 10, worin das Gen unter Kontrolle
einer DNA ist, die in der Weise funktionsfähig ist, daß sie
die Expression des Gens in B. t. hervorruft.
13. Endotoxin-Protein mit toxischer Aktivität gegen Insekten, wobei
das Protein einen Aminosäure-Sequenz-Abschnitt umfaßt, der im
im wesentlichen Homologie mit der 116 Aminosäuren umfassenden Sequenz
aufweist, die bei Position m-1 beginnt und sich bis zur Position
m-116 in Tabelle A erstreckt, wobei die Positions-Zahlen auf eine
solche homologe Sequenz unabhängig von Streichungen oder Zufügungen
zutreffen, worin eine oder mehrere der folgenden Aminosäuren
an den angegebenen Aminosäure-Bezugspositionen stehen:
- (a) an Position m-5 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn;
- (b) an Position m-6 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Gln;
- (c) an Position m-12 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Glu;
- (d) an Position m-16 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn;
- (e) an Position m-27 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Glu;
- (f) an Position m-30 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala;
- (g) an Position m-33 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Thr;
- (h) an Position m-34 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn;
- (i) an Position m-36 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala;
- (j) an Position m-41 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Met;
- (k) an Position m-95 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Phe;
- (l) an Position m-98 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Ala;
- (m) an Position m-99 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Thr;
- (n) an Position m-105 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Asn; und
- (o) an Position m-112 jede natürliche Aminosäure, ausgenommen Gly.
14. Endotoxin-Protein nach Anspruch 13, worin die Homologie zwischen
dem Aminosäure-Sequenz-Abschnitt und der 116 Aminosäuren umfassenden
Sequenz, die bei Position m-1 beginnt und sich bis zur
Position m-116 in Tabelle A erstreckt, wenigstens 70% ist.
15. Endotoxin-Protein nach Anspruch 13 oder 14, worin für eine
oder mehrere der nachfolgend genannten Aminosäuren an den angegebenen
Aminosäure-Bezugspositionen kodiert wird:
- (a) an Position m-5 Lys;
- (b) an Position m-6 Lys;
- (c) an Position m-12 Lys;
- (d) an Position m-16 Tyr;
- (e) an Position m-27 Lys oder Arg;
- (f) an Position m-30 Thr;
- (g) an Position m-33 Ile;
- (h) an Position m-34 Tyr;
- (i) an Position m-36 Val;
- (j) an Position m-41 Ile;
- (k) an Position m-95 Ile;
- (l) an Position m-98 Thr;
- (m) an Position m-99 Ser;
- (n) an Position m-105 Lys; und
- (o) an Position m-112 Asp.
16. Endotoxin-Protein nach Anspruch 15, worin eine oder beide der
Aminosäuren an den Bezugspositionen m-27 und m-30 ausgewechselt
wurden.
17. Endotoxin-Protein, produziert mit Hilfe eines Gens nach Anspruch
8 oder 9.
18. Verfahren zur Herstellung eines Endotoxin-Proteins das folgende
Schritte umfaßt:
Transformieren oder Transfektieren einer Zelle mit einem Expressions- Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und
Züchten der resultierenden Zellen zur Produktion des Endotoxins.
Transformieren oder Transfektieren einer Zelle mit einem Expressions- Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und
Züchten der resultierenden Zellen zur Produktion des Endotoxins.
19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die transformierte oder
transfektierte Zelle eine Pflanzenzelle ist.
20. Verfahren nach Anspruch 18, worin die transformierte oder
transfektierte Zelle eine Bakterienzelle ist.
21. Pflanze umfassen Zellen, die ein Strukturgen nach einem der
Ansprüche 1 bis 9 enthalten.
22. Bakterienzelle, umfassend einen Expressionsvektor nach einem
der Ansprüche 10 bis 12.
23. DNA-Sequenz umfassend eine DNA, die die Sequenz von Nucleotid-
Position n-1 bis zur Nucleotid-Position n-348 gemäß Tabelle A auf
weist oder mutante Variationen davon, und die eine oder mehrere
voneinander räumlich getrennte Restriktionsstellen hat, die aus
der Gruppe Hind III, Mst II, Bssh II, Bal I und Mlu I aufweist,
wobei die Restriktionsstellen die Sequenz der Aminosäuren nicht
ändern, für die die DNA kodiert.
24. Insektizide Zusammensetzung, umfassend eine insektizid wirksame
Menge eines Proteins, das mit Hilfe einer DNA nach einem der
Ansprüche 1 bis 9 produziert wurde, zusammen mit einem für die
Landwirtschaft annehmbaren Träger.
25. Insektizide Zusammensetzung, umfassend eine insektizid wirksame
Menge eines Proteins, nach einem der Ansprüche 13 bis 17 zusammen
mit einem für die Landwirtschaft annehmbaren Träger.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16023388A | 1988-02-25 | 1988-02-25 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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