PL161726B1

PL161726B1 - Srodek owadobójczy PL PL PL PL

Info

Publication number: PL161726B1
Application number: PL89277925A
Authority: PL
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1988-02-25
Filing date: 1989-02-24
Publication date: 1993-07-30
Also published as: CN1037538A; IL89391A0; IL89391A; DE3905865A1; DK84589D0; PL277925A1; FR2627778B1; GB8904016D0; ZA891463B; NL8900481A; DK84589A; IE890589L; AU616945B2; AU3029789A; BE1001877A4; BR8900881A; PT89812A; HUT50507A; GB2216127B; HU209148B

Abstract

1 . Srodek ow adobójczy, znamienny tym, ze sklada sie z dopuszczalnego w rolnictwie nosnika i ow adobójczo s kutecznej ilosci bialka-endotoksyny, toksycznego dla owadów, zawierajacego sekwencje am inokw asów wykazujaca zasadnicza hom ologie z sekw encja 116 am inokw asów zaczynajaca sie w pozycji m -1 1 dochodzaca do pozycji m -1 16, wedlug tablicy 10, przy czym w takiej hom ologicznej sekwencji num ery pozycji przypisuje sie niezaleznie od wystepujacych w niej delecji lub addycji, a sekwencja ta obejmuje jeden lub wiecej nastepujacych am inokw asów w podanych pozycjach odn oszacych sie do am inokw asó w a) w pozycji m-5 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem Asn. b) w pozycji m -6 d ow oln y naturalny am inokw as z wyjatkiem G in, c) w pozycji m -12 dow oln y naturalny am inokw as z wyjatkiem G lu, d) w pozycji m-16 dow olnv naturalny am inokw as z wyjatkiem A sn, e) w pozycji m -27 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem G lu, f) w pozycji m-30 dow oln y naturalny am inokw as z wyjatkiem A la ,g ) w pozycji m-33 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem Thr. h) w pozycji m-34 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem A sn, i) w pozycji m-36 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem A la, j) w pozycji m-41 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem M et, k) w pozycji m-95 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem Phe, 1) w pozycji m-98 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem Ala, m) w pozycji m-99 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem Thr, n) w pozycji m -105 dow olny naturalny am inokwas z wyjatkiem A sn, oraz o) w pozycji m -1 12 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem Gly 5 Srodek ow adobójczy, znamienny tym, ze sklada sie z dopuszczalnego w rolnictwie nosnika i ow adobójczo skutecznej ilosci bialka-endotoksyny, w ytw orzonego przez D N A , kodujacy to bialko, który zawiera czesc kodujaca sekwencje am inokw asów wykazujaca zasadnicza hom ologie z sekwencja 116 am inokw asów zaczynajaca sie w pozycji m-1 i dochodzaca do pozycji m -1 16 wedlug Tablicy 10, przy czym num ery pozycji w takiej hom ologicznej sekwencji przypisuje sie niezaleznie od wystepujacych w niej delecji lub addycji a D N A jest tak zm odyfikow any, ze koduje jeden lub wiecej z nastepujacych am inokw asów we wskazanych pozycjach a) w pozycji m-5 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem A sn, b) w pozycji m -6 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem G in, c) w pozycji m-12 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem G lu, d) w pozycji m-16 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem A sn, e) w pozycji m-27 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem G lu, f) w pozycji m -30 dow oln y naturalny am inokw as z wyjatkiem A la, g) w pozycji m-33 dow olny naturalny am inokwas z wyjatkiem Thr, h) w pozycji m -34 dow oln y naturalny am inokw as z wyjatkiem A sn, i) w pozycji m-36 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem A la, j) w pozycji m-41 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem Met. k) w pozycji m-95 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem Phe, 1) w pozycji m-98 dow oln y naturalny am inokwas z wyjatkiem A la, m) w pozycji m-99 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem Thr, n) w pozycji m-105 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem A sn oraz o ) w pozycji m -112 dow olny naturalny am inokw as z wyjatkiem Gly PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek owadobójczy zawierający endotoksynę - białko toksyczne dla owadów.

Bacillus thuringiensis (B.t.) jest bakterią przetrwalnikową wytwarzającą krystaliczne białko -endotoksynę δ w końcowym wegetatywnym stadium wzrostu. Endotoksyna ta po spożyciu przez pewne owady wykazuje działanie toksyczne, którego objawem jest zanik łaknienia, zaburzenia zołądkowo-jelitowe, odwodnienie i na koniec śmierć, δ-endotoksyna powstaje, zazwyczaj ze źródła plazmidalnego, jako nieaktywny prekursor lub forma protoksynowa o masie cząsteczkowej 130000 - 140000 daltonów (Calabrese, Canad, J. Microbiol. 26 (1980), 1006). Rozszczepienie proteolityczne, prowadzące do usunięcia około połowy od końca C i ewentualnie szeregu aminokwasów od końca N, zachodzi zazwyczaj w jelicie owada w wyniku działania proteaz jelitowych, co jest niezbędne do powstania aktywnej toksyny o masie cząsteczkowej 65000 - 70000 (Tyrell i inni, J. Bacteriology 145 (1981), 1052).

Zidentyfikowano wiele pododmian B.t. Jakkolwiek większość z nich wykazuje bardziej swoistą lub zwiększoną toksyczność w odniesieniu do owadów rzędu motyli, wykazano, że pewna ograniczona ich liczba jest również toksyczna w stosunku do owadów innych grup. Tak np. B.t. isrealensis jest toksyczny w stosunku do larw owadów dwuskrzydłych (komarów i much), a ostatnio stwierdzono, ze dwie inne pododmiany wykazują toksyczność w stosunku do tęgopokrywych (Hoffe i inni, Nuc. Acid. Res. 15(17) (1987) (1783).

Jakkolwiek przeprowadzono wiele prac nad otrzymaniem skróconych toksyn i kodujących je genów strukturalnych, okazało się, ze wiedza odnośnie zdolności δ-endotoksyn B.t. do uodpornienia się na mutacje punktowe w aktywnej lub toksycznej części sekwencji endotoksyny oraz o wpływie takich mutacji na aktywność cząsteczek jest ograniczona.

Wynalazek dotyczy środka owadobójczego, który zawiera nowe mutanty aktywne części δ-endotoksyn B.t. o zwiększonym działaniu owadobójczym.

161 726

Po przypadkowym wytworzeniu jedno- lub wielopunktowych mutacji w wielu setkach nici DNA kodującego główną sekcję aktywnej części reprezentatywnej endotoksyny B.t. o działaniu owadobójczym w stosunku do Lepidoptera (motyli), wydziela się i wytwarza technikami rekombinacji szereg mutantowych endotoksyn B.t. wykazujących charakterystyczne działanie owadobójcze w stosunku do Lepidoptera właściwe dla naturalnych δ-endotoksyn B.t. Stwierdzono, że w tych odkrytych punktach mutacji kodony kodujące dowolny inny naturalny aminokwas można podstawiać uzyskując białko o działaniu endotoksynowym. Wykryto ponadto, że szereg przypadkowych mutacji wykazuje zwiększone działanie owadobójcze. Działanie takie można wykazać w próbach z gąsienicą żerującą na pękach tytoniu (Hetiothis virescens) oraz z miernicą kapustną (Trichoplusia ni), opisanych poniżej, przy czym w wielu przypadkach wzrost ten jest bardzo znaczny i uzyskuje się aktywność co najmniej dwa lub więcej razy wyzszą, niż w przypadku wyjściowej struktury endotoksynowej. Oceniono również mutacje wielokrotne (zazwyczaj 2 lub 3 aminokwasy na nić zmutowanego DNA), pojedynczo lub w różnych kombinacjach, w celu wyodrębnienia pewnych bardziej aktywnych mutacji i ich kombinacji.

Stwierdzono także, że mutacje wytworzone sposobem opisanym powyżej, z jednym wyjątkiem, występują w sekcjach sekwencji aminokwasów w wysokim stopniu zachowywanych w szeregu odmian naturalnych δ-endotoksyn B.t., co wykazuje ogólną odpowiedniość tych mutacji z szeregiem różnych struktur endotoksynowych, w których takie zachowane obszary zapewniają owadobójcze endotoksyny B.t.

W szczególności, w odniesieniu do sekwencji aminokwasów oraz ich numeracji w tabeli 10 ^poniżej (poczynając od metionm^y (ΜΕΤ'), k.tć>ra jest w ^pozycj^{i 1} i stanowi normatay ^N-k°nie^creprezentatywnej endotoksyny działającej na Lepidoptera, przedstawionej w tabeli 10), stwierdzono, ze białko endotoksyny B.t. o działaniu owadobójczym w stosunku do owadów Lepidoptera zbliżonym do naturalnych endotoksyn B.t., jeśli zawierają w części aktywnej sekwencję reszt aminokwasów taką samą lub zasadniczo homologiczną z sekwencją przedstawioną w tabeli 10 i odnoszącą się do sekwencji 116 reszt aminokwasów, począwszy od pozycji 90 aż do pozycji 205 włącznie (także aminokwasów od pozycji m-1 do m-116), mogą zawierać jedną lub więcej reszt następujących aminokwasów we wskazanych lub równoważnie homologicznych pozycjach (przy czym m-pozycje podane w nawiasach odnoszą się do sekwencji 116 reszt aminokwasów): a) w pozycji 94 (pozycja m-5 w sekwencji 116 aminokwasów) dowolny naturalny aminokwas kodowany przez kod genetyczny, z wyjątkiem Asn), b) w pozycji 95 (pozycja m-6 w sekwencji 116 aminokwasów) dowolny aminokwas naturalny z wyjątkiem Gin, c) w pozycji 101 (pozycja m-12 w sekwencji 116 aminokwasów) dowolny taki aminokwas naturalny z wyjątkiem Glu, d) w pozycji 105 (pozycja m-16 w sekwencji 116 aminokwasów) dowolny taki aminokwas naturalny z wyjątkiem Asn, e) w pozycji 116 (pozycja m-27 w sekwencji 116 aminokwasów) dowolny taki aminokwas naturalny z wyjątkiem Glu, f) w pozycji 119 (pozycja m-30 w sekwencji 116 aminokwasów) dowolny taki aminokwas naturalny z wyjątkiem Ala, g) w pozycji 122 (pozycja m-33 w sekwencji 116 reszt aminokwasów) dowolny taki aminokwas naturalny z wyjątkiem Thr, h) w pozycji 123 (pozycja m-34 w sekwencji 116 reszt (dowolny taki aminokwas naturalny z wyjątkiem Asn, i) w pozycji 125 (pozycja m-36 w sekwencji 116 reszt) dowolny taki aminokwas naturalny z wyjątkiem Ala, j) w pozycji 130 (pozycja m-41 w sekwencji 116 aminokwasów) dowolny taki aminokwas naturalny z wyjątkiem Met, k) w pozycji 184 (pozycja m-95 w sekwencji 116 reszt) dowolny taki aminokwas z wyjątkiem Phe, 1) w pozycji 187 (pozycja m-98 w sekwencji 116 reszt) dowolny taki aminokwas z wyjątkiem Ala, m) w pozycji 188 (pozycja m-99 w sekwencji 116 reszt) dowolny taki aminokwas naturalny z wyjątkiem Thr, n) w pozycji 194 (pozycja m-105 w sekwencji 116 reszt) dowolny taki aminokwas naturalny z wyjątkiem Asn oraz o) w pozycji 201 (pozycja m-112 w sekwencji 116 reszt) dowolny taki aminokwas naturalny z wyjątkiem Gly.

Dodatkowo, również w odniesieniu do ponumerowanej sekwencji reszt aminokwasów podanej w tabeli 10, wynalazek dotyczy również zamiany aminokwasu Asn w pozycji 4 na dowolny inny aminokwas naturalny kodowany przez kod genetyczny.

Odnośnie reszt aminokwasów w sekwencji 116 reszt zgodnie z wynalazkiem korzystne jest, aby sekwencja taka charakteryzowała się, również w odniesieniu do pełnej sekwencji dojrzałej przedstawionej w tabeli 10 (a także do sekwencji 116 reszt), obecnością jednego lub więcej następujących aminokwasów w podanych pozycjach: a) Lys w pozycji 94 (pozycja 5 w sekwencji 116 reszt), b) Lys

161 726 w pozycji 95 (pozycja 6 w sekwencji 116 reszt), c) Lys w pozycji 101 (pozycja 12 w sekwencji 116 reszt), d)Tyr w pozycji 105 (pozycja 16 w sekwencji 116 reszt), e) Lys lub Arg, a jeszcze korzystniej Arg, w pozycji 116) pozycja 27 w sekwencji 116 reszt), f)Thr w pozycji 119 (pozycja 30 w sekwencji 116 reszt), g) Ile w pozycji 122 (pozycja 33 w sekwencji 116 reszt), h) Tyr w pozycji 123 (pozycja 34 w sekwencji 116 reszt), i) Val w pozycji 125 (pozycja 36 w sekwencji 116 reszt), j) Ile w pozycji 130 (pozycja 41 w sekwencji 116 reszt), k) Ile w pozycji 184 (pozycja 95 w sekwencji 116 reszt), l)Thr w pozycji 187 (pozycja 98 w sekwencji 116 reszt), m) Ser w pozycji 188 (pozycja 99 w sekwencji 116 reszt), n) Lys w pozycji 194 (pozycja 105 w sekwencji 116 reszt) oraz o) Asp w pozycji 201 (pozycja 112 w sekwencji 116 reszt).

Jeśli Asn w pozycji aminokwasów 4 wymienia się, to korzystnie zastępuje się go przez Tyr.

W tabeli 10 pod koniec opisu przedstawiono sekwencję nukleotydów i wydedukowaną na ich podstawie sekwencję aminokwasów odnoszącą się do δ-endotoksyny wytwarzanej w naturze. Z jednym wyjątkiem sekwencję nukleotydów uzyskano z plazmidu wytwarzającego ó-endotoksynę, stwierdzonego w B.t. wuhanensis W szczególności pełny gen strukturalny (w rzeczywistości kodujący samą endotoksynę) pochodzi z B.t. wuhanensis, a wyjątek polega na tym, że sekwencja przed metioniną (Met) na początku genu strukturalnego pochodzi z genu wytwarzającego endotoksynę stwierdzonego w B.t. Kurstaki HD-1 (tak zwany plazmid z HD-1 z klasy Hind III o 5,3 Kb) i jest przednią sekwencją zawierającą miejsce wiązania rybosomowego (RBS) z plazmidu wytwarzającego endotoksynę z B.t. Kurstaki. Przednia sekwencja zawierająca miejsce wiązania rybosomowego stwierdzona w B.t. wuhanensis różni się nieznacznie od sekwencji podanej w tabeli 10, odnoszącej się do Kurstaki, przy czym różnice te zostaną wyszczególnione poniżej. Należy jednak zdawać sobie sprawę, ze sekwencje zarówno nukleotydów jak i aminokwasów w strukturalnych genach B.t. wuhanensis i B.t. Kurstaki HD-1 są identyczne od początku sekwencji edOotoksydy poprzezjej całą część aktywną co najmniej az do miejsca Κρη I wyszczególnionego w tabeli 10, przy czym miejsce Κρη I znajduje się w części protoksyny. Z tego względu aktywna część toksynowa powstała w wyniku rozszczepienia po przyjęciu przez owada będzie taka sama w przypadku toksyn pochodzących z B.t. wuhanensis i B t Kurstaki HD-1. W tabeli 10 aminokwasy białka endotoksyny wytworzonej w wyniku ekspresji genu strukturalnego ponumerowane są liczbami dodatnimi w nawiasach od 1do 1181 poniżej aminokwasów Aminokwasy w części nie podlegającej translacji, przed 1-Met ponumerowane są liczbami ujemnymi w kierunku do tyłu lub do góry (przy czym sygnały stopu liczy się tak jak pozycje aminokwasów) Nukleotydy wgedie strukturalnym ponumerowane są bez nawiasów ponad limą, w której występują, przy czym ostatnia cyfra w liczbie znajduje się nad nukleotydem, którego ta liczba dotyczy. Nukleotydy w obszarze niepodlegającym translacji, w którym znajduje się miejsce wiązania rybosomowego ponumerowane są do tyłu liczbami ujemnymi poczynając od kodonu inicjującego ATG (odnoszącego się do 1-Met). Wśród ponumerowanych sekwencji wyszczególnionych powyżej część ponumerowana jest oddzielnie liczbami od m-1 do m-116 w przypadku aminokwasów i od n-1 do n-348 dla nukleotydów odpowiadających tym aminokwasom, aby zaznaczyć dokładniej silnie zachowany obszar, w którym, jak stwierdzono, umiejscowiona jest większość mutacji uzyskanych sposobem według wynalazku. Pewne miejsca restrykcyjne związane z sekwencją nukleotydów w tabeli 10 przedstawione są limami ponad nukleotydami, których dotyczą te miejsca restrykcyjne, przy czym poszczególne miejsca są określone w odnośnikach. Część toksyczna endotoksyny przedstawionej w tabeli 10, zidentyfikowana uprzednio, obejmuje sekwencję aminokwasów zaczynającą się od pozycji aminokwasu 1 (Met) i rozciągającą się aż do pozycji aminokwasu 610 (Thr). W świetle budowy całkowitej sekwencji DNA przedstawionej w tabeli 10 oraz w celu łatwiejszego zrozumienia poniższego opisu, zwraca się uwagę, ze sekwencje DNA i aminokwasów zaczynające się w części nie objętej translacją w wierszu 1 w tabeli 10 i rozciągające się do miejsca Κρη I odpowiadającego w przybliżeniu pozycjom aminokwasów 724 - 725, a także ich części, mogą być i są również określane w opisie jako pochodzące z B.t. Kurstaki HD-1 (plazmid 5,4 Kb klasy Hind III).

Na figurze 1 przedstawiono mapę ogólnych plazmidów roboczych prAK i prAK—3 wykorzystywanych w różnych stadiach syntezy ed0otoksydy zawierających DNA kodujący skróconą endotoksynę B.t. pochodzącą z B t Kurstaki i wykazującą działanie owadobójcze w stosunku do Lepidoptera.

161 726

Na figurze 2 przedstawiono mapę plazmidu pB8rI 1 zawierającego DNA kodujący skrócone białko endotoksyny B.t. o nieco większej długości r.iz białko kodowane przez prAK, również pochodzące z B.t. Kurstaki HD-1 i również wykazujące działanie owadobójcze w stosunku do Lepidoptera.

Na figurze 3a i 3b przedstawiono dwa reprezentatywne pasma dwuniciowego DNA, które można zsyntetyzować w celu przeprowadzenia tak zwanych eksperymentów ze spinem kodonowym, przydatnych również w dogodnym wprowadzaniu pożądanych mutacji do sekwencji kodującej DNA endotoksyny B.t.

Na figurze 4 przedstawiono mapę plazmidu pBT210 zawierającego DNA kodujący pełnej długości rodzimą endotoksynę z B.t. wuhanensis, przy czym endotoksyna ta ma identyczną sekwencję aminokwasów w swej części aktywnej, jak endotoksyna z B.t. Kurstaki kodowana przez prAK i PB8-II.

Na figurze 5 przedstawiono uproszczoną mapę plazmidu pr AK-9 wraz z powiększeniem sekcji odbioru (take-out), przy czym plazmid ten jest pod innymi względami zbliżony w szczegółach do plazmidu prAK-3, przy czym wymieniona sekcja i jej podsekcje w plazmidach rodzimych mogą być z powodzeniem wykorzystywane przy prowadzeniu eksperymentów ze spinem kodonowym oraz wprowadzaniu w inny sposób mutacji.

Plazmid prAk zdeponowano w E. coli JM 103 w Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, dnia 19 lutego 1988, gdzie zarejestrowano go pod nrNRRL B-18329.

Plazmid pB8rII zdeponowano w E. coli JM 103 w Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, dnia 19 lutego 1988, gdzie zarejestrowano go pod nr NRRL B-18331.

Plazmid pBT210 zdeponowano w E. coli JM 103 w Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, dnia 19 lutego 1988, gdzie zarejestrowano go pod nrNRRL 8188330.

Jak to już podkreślono, mutacje punktowe wprowadzać można do sekwencji białka endotoksyny wytwarzanego przez odmiany i pododmiany Bacillus thuringiensis, przy czym sekwencje te wykazują działanie owadobójcze w odniesieniu do larw Lepidoptera, jeśli zawierają zachowaną sekwencję 116 aminokwasów opisaną powyżej, albo też sekwencję, która jest z nią wysoce homologiczna lub zasadniczo jej równoważna. Należą do nich sekwencje endotoksyn białkowych o naturalnej pełnej długości albo o zasadniczo pełnej długości, a także sekwencje skrócone poprzez usunięcie całości lub części tylnego fragmentu protoksynowego lub nieaktywnego, a nawet te, które mogą być skrócone od normalnego C-końca aż do aktywnej części endotoksyny.

Jak to już stwierdzono, endotoksyny z B.t. Kurstaki i B.t. Wuhanensis zawierają identyczny zachowany obszar 116 aminokwasów. Należy oczekiwać, ze inne endotoksyny zawierają lub mogą zawierać tą samą sekwencję 116 aminokwasów albo sekwencję stanowiącą wysoce homologiczny jej równoważnik. Tak np. wiadomo, ze endotoksyny z B.t. Sotto, B.t. Kurstaki szczep HD-73 oraz B.t. Galleriae wytwarzają endotoksyny z identyczną sekwencją 116 aminokwasów, nawet jeśli część z nich różni się co najmniej w pewnym stopniu, a nawet znacznie udziałem części toksycznej endotoksyny i części protoksynowej. Inne, takie jak B.t. Kurstaki HD-1 Dipel (podszczep handlowy) zawierają jedną zmianę w podanej sekwencji 116 aminokwasów (w m-59 jest Leu kodowana przez TTG), a także inne zmiany), delecje/addycje w innych częściach sekwencji. Stwierdzono, że te i inne odmiany zawierają jedną lub więcej zmian, z tym ze homologia aminokwasów co najmniej około 70% sekwencji 116 aminokwasów może zawierać jedną lub więcej zmian mutantowych wytworzonych sposobem według wynalazku, które to zmiany odpowiadają jednoznacznie aminokwasom w niezmutowanej sekwencji 116 aminokwasów, zwłaszcza wówczas, gdy aminokwas, który ma zostać zmieniony, zawiera po każdej ze stron po 2, a korzystnie po 4 inne aminokwasy, które również odpowiadają jednoznacznie aminokwasom w sekwencji 116 aminokwasów. Uważa się również, ze mutacji można dokonywać na odpowiednich aminokwasach w seriach homologicznych, które zawierają delecje lub addycje, tak ze sama sekwencja jest krótsza lub dłuzsza od podanej sekwencji 116 aminokwasów. W takich przypadkach stosuje się numerację odnoszącą się do sekwencji 116 aminokwasów, tak ze delecje występujące w zmienionej sekwencji uwzględnia tak, jakby istniały, natomiast addycji w zmienianej sekwencji po prostu się nie uwzględnia. Dlatego tez można powiedzieć, ze przypisanie miejsca aminokwasu w takich sekwencjach homologicznych wykonuje się niezależnie od występujących w nich delecji lub addycji.

161 726

Korzystnie do homologicznych sekwencji aminokwasów, do których wprowadzić można zmiany mutantowe należą te, które są kodowane przez DNA, z którym DNA pochodzący z nici sensownych lub nonsensownych, albo dwuniciowy DNA zaczynający się w pozycji n-1 i rozciągający się do pozycji n-348 w tabeli 10, będzie hybrydyzować w warunkach hybrydyzacji wymuszonej, gdy homologiczna sekwencja, która ma być zmutowana, zawiera aminokwasy odpowiadające aminokwasom we wzorcowej sekwencji 116 aminokwasów, kodowane przez ten sam kodon, który koduje odpowiednie aminokwasy w sekwencji wzorcowej. Sposoby wytwarzania takiej znaczonej sondy hybrydyzacyjnej są powszechnie znane. Warunki hybrydyzacji wymuszonej polegają na tym, że hybrydyzację przeprowadza się w temperaturze 60°C w 2,5X cytrynianie w roztworze soli (SSC) jako buforze, po czym stosuje się po prostu płukanie w 37°C przy zmniejszonym stężeniu buforu, które nie będzie wpływać na przebieg zachodzącej hybrydyzacji.

Korzystnie mutacje wykonuje się w sekwencjach aminokwasów zawierających nie więcej niz 1,2 lub 3 różnice w odniesieniu do aminokwasów w porównaniu z sekwencją wzorcową o 116 aminokwasach, a korzystnie w sekwencji, która jest identyczna z sekwencją wzorcową.

Z dotychczasowego stanu wiedzy wyraźnie wynika, że sekwencja wzorcowa 116 aminokwasów może stanowić część zasadniczo zmodyfikowanych lub różniących się w innych częściach sekwencji białka endotoksynowego, które wykazują działanie owadobójcze w stosunku do larw Lepidoptera, oraz że te inne modyfikacje poza obszarem sekwencji wzorcowej zostaną z pewnością wykryte, gdy wiedza w tej dziedzinie rozszerzy się. W związku z tym sekwencje graniczące z wymaganą zmutowaną częścią sekwencji stanowiącą analog części wzorcowej o 116 aminokwasach mogą różnić się w znacznym stopniu i wymagane jest jedynie to, aby zapewniały one działanie owadobójcze białka endotoksynowego, np. działanie owadobójcze w stosunku do larw żerujących na pąkach tytoniu. I tak sekwencja aminokwasów przed częścią zmutowaną może być skrócona lub wydłużona, albo zmutowana w stosunku do sekwencji przedstawionej w tabeli 10, z tym że zasadniczo powinna rozpoczynać się od metioniny, a najkorzystniej powinna być w znacznym stopniu (70%) homologiczna lub identyczna z sekwencją przedstawioną w tabeli 10, choć oczywiste jest, że sekwencja taka może również dodatkowo zawierać korzystny mutant w pozycji 4. Również część znajdująca się poza wymaganą sekwencją zmutowaną może zmieniać się w szerokim zakresie i być skrócona lub wydłużona w stosunku do jej odpowiednika przedstawionego w tabeli 10, aż do miejsca jej rozszczepienia w jelicie owada, i oczywiście może, choć nie musi, być dalej wydłużona i stanowić część protoksynową lub nieaktywną podatną na odszczepienie w jelicie owada, tak aby uzyskać owadobójczo czynną toksynę proteinową.

Sekwencje zawierające DNA kodujący mutantowe endotoksyny zgodnie ze sposobem według wynalazku można wprowadzać pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulujących do plazmidów z wytworzeniem wektorów ekspresji, które można transformować lub transfekować do komórek w celu wytworzenia endotoksyny. Wytwarzanie endotoksyn takimi rekombinantowymi technikami biotechnologicznymi w przeciwieństwie np. do wytwarzania leków takimi sposobami wymaga stosowania co najwyżej niewielkiej obróbki w celu oczyszczenia endotoksyny. Komórki, w których jest ona wytwarzana można poddawać lizie, z tym, ze w dotychczasowej przemysłowej produkcji endotoksyn B t. przyjęto po prostu wykorzystanie całej zawartości hodowli lub układu fermentacyjnego do wytwarzania ostatecznego produktu, zazwyczaj po wysuszeniu znanymi sposobami takimi jak suszenie rozpyłowe w niskiej temperaturze. W zależności od produktu różne materiały dodawać można w celu zwiększenia trwałości produktu, co jest powszechnie znane, a ponadto, co również jest znane, jeśli w układzie fermentacyjnym nie znajduje się odpowiednia ilość materiałów białkowych, to z produktem można wymieszać niezależnie w celu zwiększenia jego trwałości takie materiały jak np. mączka sojowa lub odtłuszczona mączka sojowa.

Jakkolwiek endotoksyny wytwarzać można metodami biotechnologii w szeregu układów transformowanych lub transfekowanych komórek, zazwyczaj korzystne jest transformowanie lub transfekowame komórek bakteryjnych gram-ujemnych lub gram-dodatnich. Jednym z korzystnych typów bakterii gram-ujemnych jest E. coli, z którym związane są znaczne doświadczenia w biotechnologu oraz dla którego znanych jest i dostępnych wiele różnych odpowiednich i operacyjnie funkcjonalnych układów plazmidów i transferowych wektorów ekspresji. Pseudomonas fluorescens reprezentuje inny typ bakterii gram-ujemnych, do których wprowadzać można plazmidy

161 726 niosące sekwencje endotoksyny. Jak to wykazano, geny wytwarzające endotoksynę mogą zawierać sekwencje regulujące takie jak w szczególności sekwencje miejsca wiązania rybosomowego, pochodzące od B.t., po wprowadzeniu w celu przeprowadzenia ekspresji do zasadniczo heterologicznych komórek bakteryjnych takich jak E. coli. Bakterie typu Bacillus stanowią i zapewniają środowisko bardziej zbliżone do naturalnego dla endotoksyn wytworzonych powyższym sposobem. Przykładowo do takich szczególnie interesujących komórek Bacillus należą komórki B.t., komórki B. cereus i komórki B.subtilis. Znacznie ulepszona technika transformacji komórek Bacillus, zwłaszcza komórek B.t., została ostatnio opracowana i opisana w zgłoszeniu patentowym brytyjskim nr 8 729 726. Do typów komórek nadających się do transformacji tym sposobem należą typy cry-minus takie jak znane komórki B.t. Kurstaki ery B nie zawierające plazmidów oraz naturalne komórki typu Bacillus, takie jak naturalne komórki B.t. zawierające plazmidy wytwarzające endotoksynę. Plazmidy nadające się do wprowadzania do komórek Bacillus, takich jak B.t., są znane, np. plazmid pBC16.1 (Kraft i inni, Molec Gen. Genet (1978), 162, 59) oraz jego plazmidy pochodne, które można stosować lub modyfikować z wykorzystaniem zwykłych technik rekombinantowych, tak aby były one nośnikami sekwencji kodujących mutantową endotoksynę.

Jak wiadomo, komórki Bacillus charakteryzują się tym, ze wytwarzają endotoksynę w pożądanych ilościach tylko w stadium sporulacji i z tego względu hoduje się je do tego właśnie stadium, aby uzyskać jak najwięcej produktów przydatnych jako środki owadobójcze. Z tego względu plazmidy lub wektory ekspresji wytworzone sposobem według wynalazku i zawierające DNA mutantowych endotoksyn można wprowadzać do komórek Bacillus, które albo nie zawierają plazmidów wytwarzających endotoksyny, albo juz zawierają jeden lub więcej takich plazmidów. Jakkolwiek mutantowe endotoksyny wytworzone sposobem według wynalazku wykazują specyficzną aktywność w stosunku do Lepidoptera, to objawiać się może również aktywność endotoksyn w stosunku do innych grup owadów spowodowana występowaniem endotoksyny rodzimej przed mutacją albo będąca wynikiem innych dozwolonych zmian sekwencji, przy czym w każdym przypadku wynalazek obejmuje swym zakresem transformację komórek Bacillus plazmidami wytwarzającymi endotoksynę działającą na Lepidoptera, jeśli komórki takie zawierają plazmidy wytwarzające endotoksyny zasadniczo nie działające skutecznie w stosunku do Lepidoptera, tak aby uzyskać w etapie sporulacji połączenie endotoksyn zapewniające szerszy zakres działania owadobójczego. Tak np. plazmidy niosące sekwencje DNA kodujące mutantową endotoksynę można stosować do transformacji B.t. Israeliensis lub B.t. Tenebrionis, które jako indywidua nie są zasadniczo skuteczne w stosunku do Lepidoptera.

Jakkolwiek sposób według wynalazku opisano w odniesieniu zarówno do skróconych jak i pełnej długości naturalnych białek endotoksynowych, to jeśli, jak to opisano powyżej, stosuje się mutantowe endotoksyny bezpośrednio jako środki owadobójcze, to wówczas zasadniczo korzystne jest wytwarzanie lub stosowanie sekwencji o większej długości, które są takie same lub imitują typ naturalny przynajmniej pod względem skłonności do uzyskania skłonności do pofałdowania białka endotoksynowego zbliżonej do skłonności białka naturalnego, albo uzyskanie ulepszonego efektu pofałdowania przy pełnej długości

Mutantowe sekwencje DNA wytworzone powyższym sposobem mogą być również wstawione do genomu roślinnego. W takich przypadkach korzystnejest, jeśli stosuje się sekwencje mutantowe typu skróconego, jakkolwiek możliwe jest również wykorzystanie sekwencji o pełniejszej długości. W celu takiego wprowadzenia sekwencji endotoksynowych do genomu rośliny jako gospodarza wykorzystać można z powodzeniem dowolny odpowiedni sposób, taki jak np. zastosowanie plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens, elektroporacja, elektrotransformacja, mikro-wtrysk, transfekcja wirusowa albo zastosowanie środków chemicznych, które indukują lub zwiększają wchłanianie wolnego DNA itp. Takie sposoby i ich wykorzystanie w transformacji roślin, są powszechnie znane specjalistom. Korzystnie sekwencję DNA kodującą endotoksynę mutantową asocjuje się z odpowiednimi sekwencjami regulującymi takimi jak np. sekwencje operatora i 3'-regulatorowa. funkcjonujące w roślinach, po czym całość wprowadza się do wektora ekspresji. Taka transformacja komórek roślinnych, po regeneracji rozwoju komórek w pełne rośliny, umożliwia to, ze sekwencja DNA mutantu endotoksyny staje się stałą i trwałą częścią genomu roślinnego, tak ze przechodzi ona od jednej generacji do następnej w wyniku mitozy i mejozy i w efekcie

161 726 9 ekspresji uzyskuje się białko toksyczne w stosunku do owadów, tak że powstaje roślina z wrodzoną odpornością na owady.

Dwa bardzo podobne wektory, prAK i prAK-3 wykorzystano jako źródło sekwencji δendotoksyny B.t. do mutacji oraz w celu uzyskania nośników do wytwarzania i oceny mutantów endotoksyny B.t. Plazmidy prAK i prAK-3 przedstawiono na fig. 1 podając istotne szczegóły prAK i wskazując ich mniej istotne warianty występujące w prAK-3. Zasadniczo plazmidy prAK i prAK-3 są w pełni kompetentnymi wektorami ekspresji dla E. coli i każdy z nich zawiera gen odporności na ampicihnę, źródło replikacji i sekwencje operatorowe, w tym promotor E. coli. Jak to zaznaczono na fig. 1 grubymi ciemnymi liniami i kwadratami, wektor prAK zawiera w prawidłowo odczytywanym porządku skoordynowanym z promotorem sekwencję DNA występującą w naturalnym B.t. Kurstaki, szczep HD-1. Gruba ciemna linia oznacza dojrzałą sekwencję, która została skrócona tak, aby kodować skróconą naturalną δ-endotoksynę B.t. rozciągającą się od pozycji 1 - Met do pozycji 610 - Thr w tabeli 10, a ponadto rozciągającą się na część protoksyny i kończącą się na aminokwasie 723 - Leu. Na końcu tej grubej ciemnej linii niewielka sekcja przedstawiona pustym grubym kwadratem na fig. 1 oznacza krótką sekwencję DNA 54 par zasad, która następuje po tryplecie par zasad kodujących 723-Leu, a po której z kolei następuje sygnał stopu. Ta sekwencja o łącznej długości 57 par zasad (wraz z sygnałem stopu) pochodzi z dobrze znanego plazmidu pBR322, który wykorzystano w konstrukcji prAK. Tak więc wektor ekspresji prAK koduje i wytwarza w E. coli zasadniczo skrócone połączone białko δ-endotoksyny B.t. zawierające łącznie 741 aminokwasów i złozone z 610 aminokwasów naturalnej sekcji protoksynowej oraz 18 aminokwasów pochodzących z pBR322. Takie skrócone połączone białko endotoksyny B.t. wykazuje wysoki poziom działania przeciw owadom, tak, ze zostało ono wykorzystane w ocenie wytworzonych jego mutantów. Pod względem aktywności jest ono praktycznie nie do odróżnienia od aktywowanej toksyny zawierającej całkowicie skrócone białko δ-endotoksyny B.t. o zaledwie 610 aminokwasach (aminokwasy 1 - 610 w tabeli 10).

Gruba ciemna linia przedstawiająca większość sekwencji kodującej skrócone połączone białko endotoksyny B.t. na fig. 1, związana jest na początku z ciemnym pełnym kwadratem reprezentującym sekwencję zawierającą miejsce wiązania rybosomowego (RBS) B.t. Taka sekcja (przedstawiona również w tabeli 10 w wierszach 1i 2), w skład której wchodzi RBS, zawiera około 47 nukleotydów przed rozpoczynającym się na jej drugim końcu miejscem Barn HI (wstawionym za pomocą uprzednio stosowanych plazmidów), które łączy tą sekcję z sekcją promotora E. coli (zaznaczoną strzałką na fig. 1). Promotor i sekcja RBS są ułożone i połączone tak, aby być w prawidłowo odczytywanym porządku skoordynowanym z sekwencją kodującą endotoksynę. Tak więc grube ciemne linie i kwadraty oznaczają razem DNA pochodzący od B.t. Kurstaki HD-1.

Różne inne miejsca restrykcyjne zaznaczone na fig. 1 były związane ze strategią konwencjonalnego usuwania i reinsercji sekcji DNA przy eksperymentach z mutacją. Do tych innych miejsc restrykcyjnych należy miejsce Nsi I (zaczynające się po około zaledwie 26 nukleotydach od startu sekwencji kodującej endotoksynę), dwa miejsca Xba I (patrz poniżej, jednak w odniesieniu do prAK-3), miejsce Sst I i miejsce Hind III.

Jak to zaznaczono powyżej, między prAK-3 i prAK występuje tylko jedna niewielka różnica. Różnica ta polega na tym, ze miejsce Xba I (TCT AGA) znajdujące się w pozycjach 292-297 w tabeli 10 zostało zmienione z wykorzystaniem standardowych technik w TCG CGA stanowiące miejsce Nru I. Zmiana ta me powoduje żadnej zmiany w kodowanej sekwencji aminokwasów. Wytwarzanie prAK-3 opisane jest w etapie a) przykładu I poniżej. prAK-3 jest również pierwszym półproduktem przy wytwarzaniu innych plazmidów. prAK-7 i prAK-9.

DNA w formie sekcji pochodzących z sekcji jn0doniciowego DNA o różnych długościach, z prAK i prAK-3 (zarówno z nici sensownych jak i nonsensownych) (mutowanych w konwencjonalny sposób taki, jak sposób opisany np przez Craicka w Biotechdiques Jan/Feb 1985, strony 12-19; „Zastosowanie ohgodukleot\Oów w miejscowo swoistej mutagenezie, oznaczone są dla wygody jako M-l i M-2, przy czym M-l oznacza sekcję o 375 parach zasad między dwoma miejscami Xba I w prAK, a M-2 oznacza sekcję między miejscami Barn HI i Xba I w prAk-3 (przedstawionymi na fig. 1).

161 726

Mutacje znalezione między dwoma miejscami Xba I można łatwo uzyskać stosując plazmidy prAK-7, prAK-8 lub prAK-9 ujawnione w opisie oraz syntetyczne dwuniciowe oligonukleotydy skonstruowane i zastosowane w sposób analogiczny do procedur opisanych w przykładzie II.

Po mutacji zmutowane jednoniciowe części przekształcono w dwuniciowe konwencjonalnymi sposobami. W przypadku mutantów M-l przy zastosowaniu prAK jako nośnika mutacji, uzyskanymi dwuniciowymi, zmutowanymi plazmidami stransformowano E. coli JM103, naniesiono na płytki z agarem YT zawierającym 50 jug/ml ampicyliny i inkubowano przez noc uzyskując szereg kolonii z wieloma różnymi mutacjami w plazmidach takich samych jak prAK, z wyjątkiem tego, ze występują w nich mutacje.

W przypadku mutantów M-2 zmutowany obszar między miejscami Bam HI i Xba I w nośnikach mutacji nacięto stosując odpowiednio endonukleazy restrykcyjne Barn Hi i Xba I, a następnie ligowano z wektorami prAk-3 trawionymi za pomocą tych samych dwóch enzymów. Uzyskanymi plazmidami prAK-3 zawierającymi zmutowany region M-2 transformowano E. coli JM 103, umieszczono na płytkach z agarem YT zawierającym 50/rg/ml ampicyliny i inkubowano przez noc uzyskując szereg innych kolonii zawierających wiele różnych mutacji.

Badania w celu wykazania aktywności zmutowanych sekwencji endotoksynowych uzyskanych w wyniku ekspresji z DNA zawartego np. w E. coli JM 103 lub E.coli SG4044 (dostępnych powszechnie z Agricultural Research Culture Collection (NRRL) Peona, Illinois i zarejestrowanej pod nr B-15969), przeprowadzono z wykorzystaniem próby z gąsienicą zerującą ną pąkach tytoniu (TB W) lub próby z T. ni., jak to opisano poniżej w przykładzie A. DNA mutantów wykazujących zwiększoną aktywność w porównaniu z wzorcową, niezmutowaną endotoksyną, sekwencjonowano w odpowiednich obszarach mutacji w celu ustalenia mutacji w DNA, a więc i w sekwencji białka. Oceniono w ten sposób ponad 6000 różnych kolonii z plazmidami zawierającymi zmutowane sekcje M-l lub M-2, stwierdzając, że w każdym doświadczeniu z mutacją zachodzą zasadniczo zmiany 1-3 aminokwasów.

W tabeli 1 poniżej przedstawiono mutanty wydzielone bezpośrednio w wyniku eksperymentów mutacyjnych, pozycję aminokwasu w odniesieniu do numerów pozycji podanych w tabeli 10, w których zaszła każda mutacja, każdy kodon zmutowany w każdym mutancie oraz zmiany aminokwasów zachodzące w podanych pozycjach w wyniku zmiany kodonów.

W tabeli 1 minusy lub ujemne liczby pozycji aminokwasów oznaczają zmiany w obszarze między miejscem Barn HI i pozycją 1-Met na początku sekwencji endotoksyny i z tego względu zmiany te nie wpływają na sekwencję endotoksyny kodowaną przez sekwencję mutanta.

Mutanty zidentyfikowane w tabeli 1 poniżej oceniano we wszystkich trzech fazach próby TBW, a uzyskane wyniki podano poniżej w tabeli 2. Szereg tych mutantów oceniano również w próbie T. ni, a uzyskane wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 3.

Tabela 1

Sekcja mutacji	Mutanl	Pozycja aminokwasu	Zmiana w obszarze endotoksyny
Kwas nukleinowy	Aminokwas
M-l	p26-3	119	GCA w ACA	Ala w Thr
		130	ATG w ATA	Met w Ile
		201	GGC w GAC	Gly w Asp
M-l	p48a!4	101	GAA w AAA	Glu w Lys
		116	GAG w AAG	Glu w Lys
		217	CGT w CAT	Arg w His
M-l	p48c5	116	GAG w AAG	Glu w Lys
		187	GCG w ACG	Ala w Thr
M-l	p36a65	122	ACT w ATT	Thr w Ile
		125	GCA w GTA	Ala w Val
M-2	p95a76	123	AAT w TAT	Asn w Tyr
M-2	P95a86	188	ACT wTCT	Thr w Ser
M-2	p98c 1	188	ACT w TCT	Thr w Ser
M-2	p99c62	204	ACA w ACT	Thr w Thr
		105	AAT w TAT	Asn w Tyr
		4	AAT w TAT	Asn w Tyr
M-2	P107c22	194	AAT w AAA	Asn w Lys
		94	AAC w AAA	Ans w Lys
M-2	pl07c25	184	11 1 w ATT	Phe w Ile
		-11	TTG w TAG
M-2	pl1^^30	95	CAA w AAA	Gin w Lys
		-15	TAT w TAA

161 726

W tabeli 2 poniżej nizsza ocena w kolumnie toksyczności oznacza wyzszy poziom aktywności (patrz przykład A, w którym wyjaśniono oceny toksyczności), a próby kontrolne dotyczą równoważnych ilości komórek E. coli JM 103 i komórek E. coli SG4044, nie transformowanych żadnym plazmidem. Należy zwrócić uwagę, ze jak stwierdzono wszystkie mutanty wykazywały zasadniczo większą aktywność niz skrócone endotoksyny naturalne wytworzone przez równoważną ilość komórek zawierających plazmid prAK.

Tabela 2

Mutant (oznakowanie jak w tabeli 1)	Ocena toksyczności Toksyczność średnia
p26,3	2,75
p48aI4	2,25
p48c5	2,63
p)6a65	1,50
p95a76	2,50
p95a86	1,30
p98cl	1,33
P99c62	1.83
PD7c22	1,42
pl l4a30	2,00
kontrolna (komórki JM 103)	4,68
prAK	3,35
kontrolna (komórki SG4044)	4,12

Tabela 3
p26-3	217
P36a65	887
p95a76	291
pl07c22	357
pl 14a30	239
kontrolna (SAN4I5)	59
pBT301	100

W tabeli 3 wzorcowi, pBT301 przypisano skuteczność względną 100, w oparciu o LD50 (pełniejszy opis przedstawiono w przykładzie A). W związku z tym jakakolwiek skuteczność względna większa niz dla wzorca oznacza zwiększenie poziomu toksyczności spowodowane przez mutację.

W dodatkowej pracy wykonanej w celu podbudowania wynalazku pewne mutantowe DNA przedstawione w tabeli 1 powyżej i zawierające szereg mutacji poddano analizie w celu zbadania roli poszczególnych mutacji i ich par w takich wielokrotnie zmutowanych sekcjach. Takie subklonowanie poszczególnych mutacji lub ich par przeprowadzono stosując strategię obejmującą wydzielanie jako obiektu wielokrotnie zmutowanego fragmentu, a następnie przecięcie go w miejscu restrykcyjnym usytuowanym wewnątrz fragmentu między dwoma zmutowanymi kodonami. Dwie połówki lub segmenty fragmentu wydzielano następnie na żelu i każdą z nich mieszano z niepoddanymi mutacji komplementarnymi połówkami lub segmentami fragmentu, uzyskanymi przez analogiczne przecięcie tych samych fragmentów z prAK. Wektor prAK, który przecięto w celu wydzielenia większego komplementarnego fragmentu, wymieszano następnie z dwoma wymieszanymi komplementarnymi połówkami 1 wszystkie 3 segmenty DNA ligowano ze sobą uzyskując zmodyfikowany plazmid prAK zawierający jedną lub więcej mutacji punktowych występujących w połówce fragmentu pochodzącej z wielomutantowego klonu. W szczególności miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną Xho II planowo umiejscowiono w pewnych segmentach wielomutanta, tak aby umożliwić wydzielanie fragmentów zawierających mniej mutacji niz pełny segment mutantowy Jak to jest oczywiste, zastosowanie endonulomutantowych wymienionych w tabeli 1, w celu uzyskania segmentów z jedną mutacją punktową oraz innych z dwoma mutacjami. I tak wielomutantowe plazmidy poddano najpierw działaniu endonukłeaz restrykcyjnych Nsi 11 Sstl, a uzyskane fragmenty o 1430 parach zasad rozdzielono przez wydzielanie na żelu. Każdy z takich fragmentów 1430 bp poddano następnie działaniu endonukleazy restrykcyjnej Xho II1 uzyskane fragmenty 330 bp (Nsi I/Xho II) i 1100bp(Xho II/Sst I) wydzielono

161 726 na żelu w przypadku każdego wielokrotnego mutanta. Podobnie otrzymano odpowiedniki bezmutantowych fragmentów o 300 i 1100 bp, a także większy fragment prAK, 4Kb Ns I/Sst I. W s^zc^zej^<jlnoścⁱ małe Uośti ^większe^go segmentu w^ymieszano ze zmutowanym fragmentem o ³30 b^poraz z bezmutantowym fragmentem prAK o 1100 bp, po czym uzyskaną mieszaninę ligowano uzyskując szereg hybrydowych, mutantowych plazmidów prAK.

W podobny sposób pewne ilości większych segmentów prAK wymieszano z bezmutantowymi fragmentami prAK o 300 bp fragmentami mutanta o 1100 bp, po czym przeprowadzono ligowanie DNA uzyskując kolejną serię hybrydowych,.mutantowych plazmidów. Hybrydowe, mutantowe plazmidy lub klony uzyskane w wyniku realizacji wyżej przedstawionej strategii, zestawiono w tabeli 4poniżej, gdzie podano trzy połączone segmenty oraz mutacje w uzyskanych plazmidach, w porównaniu z plazmidem prAK.

Tabela 4

Oznaczenie nowo powstałego prAK	Segment i źródło wektora	Źródło segmentu NsiI/XholI 330 bp	Zrodło segmentu XhoII/Sstl 1100 bp	Pozycja mutacji aminokwasu
A	prAK Nsil/Sstl 4 Kb	p48al4	prAK	Glu na Lys w 101 Glu na Lys w 116
B		p26-3	prAK	Ala na Thr w 119
C		p48c5	prAK	Glu na Lys w 116
D		prAK	p48al4	Arg na His w 217
E	— —	prAK	p26-3	Met na Ile w 130 Gly na Asp w 201
F		prAK	p48c5	Ala na Thr w 187

W drugiej rundzie wytwarzania hybrydowych klonów mutantowych z wykorzystaniem takiej samej procedury, którą zastosowano do wytwarzania klonów podanych w tabeli 4, otrzymano szereg mieszanych kombinowanych plazmidów mutantowych z kombinacji trzech segmentów -segmentu dużego (około 4 kb) uzyskanego w wyniku trawienia prAK za pomocą Nsi I i Sst I, fragmentu 330 bp Nsi I/X(ho II z jednego z klonów podanych w tabeli 1 oraz fragmentu 1100 bp Xho II)Sst I z innego klonu podanego w tabeli 1. Hybrydowe klony mutantowe uzyskane w tej drugiej rundzie eksperymentów przedstawiono poniżej w tabeli 5, przy czym należy zwrócić uwagę, że dwa plazmidy uzyskane w wyniku tej drugiej serii zawierały 4 zmiany aminokwasów w porównaniu z odpowiednim plazmidem prAK.

Tabela 5

Oznaczenie nowo powstałego prAK	Segment i źródło wektora	Źródło segmentu NsiI/XhoII 330 bp	Źródło segmentu XhoII/Sstl 11100 bp	Pozycja mutacji aminokwasu
1	2	3	4	5
prAK-J	prAK Nsi/Sst 4 kb	p48a14	p26-3	Glu na Lys w 101 Glu na Lys w 116 Met na Ile w 130 Gly na Asp w 201
prAK-K		p48al4	p48c5	Glu na Lys w 101 Glu na Lys w 116 Ala na Thr w 187
prAK-L		p48c5	p26-3	Glu na Lys w 116 Met na Ile w 130 Gly na Asp w 201
prAK-M		p26-3	p48a 14	Ala na Thr w 119 Arg na His w 217
prAK-N	—	p26-3	p48c5	Ala na Thr w 119 Ala na Thr w 187
prAK-0		p48c5	p48al4	Glu na Lys w 116 Arg na His w 217
prAK-P		p26-3	P36a65	Ala na Thr w 119 Thr na Ile w 122 Ala na Val w 125
prAK-Q		p48c5	p36a65	Glu na Lys w 116 Thr na Ile w 122 Ala na Val w 125

161 726

1	2	3	4	5
prAK-R		p48^l4	p3ća65	Glu na Lys w 101 Glu na Lys w 116 Thr na Ile w 122 Ala na Val w 125
prAK-S	——	p26-3	p95a86	Ala na Thr w 119 Thr na Ser w 188
prAK-T	—^-—	p48c5	p95a86	Glu na Lys w 116 Thr na Ser w 188
prAK-U		p48al4	p95a86	Glu na Lys w 101 Glu na Lys w 116 Thr na Ser w 188
prAK-53	—“—	p99c62	pl07c25	Asn na Tyr w 105 Phe na Ile w 184
prAK-68		p99c62	p26-3	Asn na Tyr w 105 Met na Ile w 130 Gly na Asp w 201
prAK-70	—“—	p26-3	pl07c25	Ala na Thr w 119 Phe na Ile w 184
prAK-39	— —	p99c62	p98cl	Asn na Tvr ά 105 Thr na Ser w 181

Różne mutanty hybrydowe wymienione w tabelach 4 i 5 oceniano z próbą z gąsienicą zerującą na pąkach tytoniu opisaną w przykładzie A, przy czym ocenie poddawano również klony mutantowe wymienione w tabeli 1 w celu porównania między innymi wpływu zasadniczo delecji lub usunięcia jednej lub dwóch mutacji z oryginalnych mutantów wymienionych w tabeli 1. Wyniki oceny toksyczności lub działania owadobójczego zestawiono poniżej w tabeli 6, przy czym należy zauważyć, ze 1) mzsza ocena w kolumnie toksyczności oznacza większy poziom aktywności (patrz przykład A wyjaśniający oceny) oraz 2) jako próby kontrolne zastosowano równoważne ilości komórek JM103 i SG4044 nie transformowanych żadnym plazmidem. Należy zwrócić uwagę, ze większość, jeśli me wyszystkie mutanty oceniano w obydwu typach komórek E. coli, a wyniki podane w tabeli dla mutantów odnoszące się do próbek kontrolnych należy uważać za wielkości średnie wyników uzyskanych w przypadku mutantów otrzymanych w ekspresji w obydwu typach komórek.

Tabela 6

Mutant w odniesieniu do tabel 1415	Ocena toksyczności Toksyczność średnia
Kontrolna	4,68
prAK	3,35
A	2,05
B	2,90
C	2,68
D	3,40
E	2,50
F	3,00
E. coli SG4044 (kontrolna)	4,12
J	2,25
K	2,06
L	2,08
M	3.10
N	2,73
O	2,70
P	1,00
Q	1,87
R	2,85
S	2,16
T	1,20
b	2,07
53	3,08
68	2,00
70	1,50
39	2,50

161 726

Możliwość substytucji aminokwasów w pozycjach, w których wyjściowe przypadkowe mutacje DNA spowodowały zmiany aminokwasów, dzięki czemu uzyskuje się wiele nowych owadobójczo czynnych białek endotoksyn B.t. można wykazać przeprowadzając względnie łatwe doświadczenia typu „kodon-spin“, w których wybrane kodony, których dotyczą wyjściowe zmiany mutacyjne,zmienia się na kodony innych naturalnych aminokwasów. W wyniku ekspresji takich nowych mutantów uzyskuje się białko endotoksynowe o działaniu owadobójczym w stosunku do gąsienicy żerującej na pąkach tytoniu. W celu przeprowadzenia takich badań w sposób bardziej efektywny przygotowano serię nowych plazmidów typu prAK, wychodząc zasadniczo z prAK i dochodząc do plazmidu prAK-7, poprzez plazmidy pośrednie otrzymywane kolejno w szeregu prAK-3, prAK-4, prAK-5 i prAK-6, jak to opisano w przykładzie I.

Plazmid pB8rII przedstawiony na fig. 2 jest pod wszelkimi względami identyczny z prAK, z tym że zawiera DNA kodujący skróconą endotoksynę nieco dłuższą niż kodowana przez plazmid pr AK oraz z wyjątkiem nieistotnych modyfikacji w plazmidzie rodzimym wykonanych w obszarze jego ligowania z zakończeniem DNA genu strukturalnego skróconej endotoksyny, przy czym ten strukturalny gen zawiera miejsce rozpoznawane przez Κρη I w genie natywnym, podczas gdy w prAK miejsce zostało wycięte, a gen strukturalny prAK kończy się w pobliżu, pierwszej pozycji tego miejsca. Plazmid prAK-7 przeznaczony jest do ekspresji z wytworzeniem tej samej sekwencji aminokwasów endotoksyny, co plazmid prAK, ale jego sekwencja DNA jest zmodyfikowana i zawiera nie tylko miejsce Nru Iz prAK-3, ale również miejsca Hind III, Mst III i BssH II, a ponadto miejsce Hind III występujące w wyjściowym prAK zostaje korzystnie usunięte. Jak to szczeg<Mowo przedstawiono w przykładzie I, kolejność etapów wytwarzania prAK-7 z prAK oraz addycje lub delecje miejsca w każdym etapie, można zestawić następująco:

prAK — prAK-3 (addycja Nru I) prAK-3 — prAK-4 (addycja Hind III) prAK-4 — prAK-5 (addycje Mst II) prAK-5 — prAK-6 (addycja BssH II) prAK-6 — prAK-7 (delecja wyjściowego Hind III)

Wyżej wskazane miejsca wprowadzano około 40 par zasad od siebie, tak że automatyczny syntetyzator DNA można było z powodzeniem wykorzystać do otrzymywania niewielkich fragmentów dwuniciowego DNA, które kończyły się na obydwu ich końcach nukleotydami reprezentującymi komplementarną resztę reszt miejsca restrykcji, które ma być wytworzone w prAK-7 przy rozcinaniu dwoma odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi. Dlatego też fragmenty takie można łatwo podstawić do prAK-7 wykorzystując standardowe procedury cięcia i ligowania (patrz przykład P poniżej) uzyskując plazmid zdolny do ekspresji białka endotoksyny identycznego z uzyskiwanym w wyniku ekspresji prAK z wyjątkiem zmian aminokwasów kodowanych przez zsyntetyzowany fragment podstawiony do prAK-7 za odpowiadający mu fragment w tym prAK-7, jak to przedstawiono w przykładzie II poniżej.

Na figurze 3A i 3B przedstawiono dwa krótkie fragmenty dwuniciowego DNA otrzymane zgodnie z powyższą strategią spinu kodonowego, do podstawienia w sekcji Hind ΙΙΙ/Mlst II w prAK-7. Dwuniciowy fragment przedstawiony na fig. 3A przeznaczony jest do tego, by uzyskiwać dowolny aminokwas w pozycji 116 w skróconej endotoksynie B.t. otrzymanej w wyniku ekspresji plazmidów prAK, w wyniku odpowiedniego doboru kodonu XXX, zgodnie z kodem genetycznym. Podobnie, fragment dwuniciowy przedstawiony na fig. 3B przeznaczony jest do wprowadzania aminokwasu w pozycji 119 w skróconej endotoksynie B.t. wytwarzanej przez plazmidy prAK, poprzez odpowiedni dobór kodonu XXX w tym fragmencie. Oczywiste jest, że inne fragmenty d wuniciowe niezbędne do podstawienia w miejscu Spe Ι/NJru I (fragment o rozstępie około 115 par zasad, który można wytwarzać w zautomatyzowanym syntetyzatorze DNA), w miejscu Nru I/Hind III i w miejscu Mst Π/BssH II w prAK-7, przeznaczone do kodowania wszystkich aminokwasów we wszystkich punktach mutacji występujących w tych sekcjach, można wytwarzać analogicznymi standardowymi metodami. W ten sposób w każdym punkcie mutacji między miejscami Nru I i BssH II w prAK-7 wykonać można zmiany lub mutacje pozostałych 18 spośród 19 naturalnych aminokwasów, wykorzystując plazmid prAK-7.

Aby objąć wszystkie punkty mutacji w sekwencji 116 aminokwasów, w celu dogodnego zamieniania odpowiednich kodonów, plazmid prAK-7 wykorzystać można do wytwarzania plaż161 726 midu prAK-8, który z kolei stosuje się ostatecznie do wytwarzania prAK-9, jak to opisano w przykładzie I. Na fig. 5 wszystkie odpowiednie miejsca restrykcyjne występujące ostatecznie w prAK-9 przedstawiono na powiększonej wyciętej sekcji prAK-9. Miejsce Spe I przedstawione na fig. 5 jest również wyjątkowym miejscem, które występowało także w prAK, prAK-3 itd. Oczywiste jest, ze plazmidy prAK-7, prAK-8 i prAK-9 stosować można do wprowadzania wielokrotnych zmian mutacyjnych między dowolną parę miejsc restrykcyjnych i/lub do wytwarzania DNA kodującego co najmniej jedną zmianę w dwóch lub więcej takich lokacjach, tak, że konstruować można wiele różnych kombinacji wielokrotnych mutantów obejmujących oryginalne punkty mutacji, uzyskując w ten sposób wiele różnych, nowych, owadobójczo-czynnych białek endotoksynowych B.t.

Jak to również jest zrozumiałe, plazmidy takie jak prAK-7, prAK-8 i prAK-9 są plazmidami w pełni nadającymi się do zmiany jednego lub kilku kodonów między dowolnymi lokacjami par miejsc restrykcyjnych występujących w tych plazmidach. Jeśli pożądane są zmiany w jednej lub w dwóch, ale w mniej niż trzech takich lokacjach, stosować można plazmidy takie jak prAK-4 lub prAK-5, jeśli zawierają one pożądane lokacje zmian, korzystnie po usunięciu wyjściowego miejsca Hind III w prAK, a jeśli plazmidy takie nie nadają się do tego, to zrozumiałe jest, że plazmid typu prAK zawierający dowolną jedną lub więcej takich lokacji można dogodnie otrzymać zmieniając lub ograniczając selekcję przy wprowadzaniu par miejsc restrykcyjnych, stosowaną przy modyfikacji prAK w czasie wytwarzania prAK-9.1 tak sposób według wynalazku dotyczy również wytwarzania szeregu nowych plazmidów nadających się do otrzymywania mutantów i kombinacji mutantów, zawierających dowolną jedną lub więcej par miejsc restrykcyjnych występujących w prAK-9.

Jak to również jest zrozumiałe, DNA zawierający dowolną jedną lub więcej takich par miejsc restrykcyjnych można wyciąć przed lub po modyfikacji wprowadzającej jedną lub więcej mutacji sposobem według wynalazku, z plazmidów typu prAK, przez rozcinanie w miejscach restrykcyjnych znajdujących się na zewnątrz pożądanych regionów mutacyjnych, które zostały odpowiednio stwierdzone w innym plazmidzie do ekspresji endotoksyny B. t., po czym wycięty segment DNA wstawia się stosując standardowe hgowanie do takiego innego plazmidu endotoksyny B. t, który został pocięty w podobny sposób, umożliwiając w ten sposób dogodną modyfikację takiego innego plazmidu, albo wstawiając do niego bezpośrednio uzyskane mutacje.

W celu wprowadzenia mutacji do pełnej długości sekwencji kodującej endotoksynę, zastosowano ze względu na wygodę i aktualnie łatwą dostępność plazmid zawierający gen strukturalny DNA 6- endotoksyny B. t. Wuhanensis. Plazmid ten, pBT210, przedstawiono na fig. 4. Plazmid pBT210 zawiera gen strukturalny endotoksyny pełnej długości z B. t. Wuhanensis, co zaznaczono grubą ciemną linią na fig. 4, oraz, przez analogię z fig. 1, zawiera również sekwencję z miejscem wiązania rybosomowego B. t., uzyskaną z B. t. Wuhanensis wraz ze strukturalnym genem, która zaznaczona jest na fig. 4 ciemnym kwadratem. Plazmid pBT210 jest w pełni właściwym wektorem ekspresji E. coli zawierającym ten sam system promotorowy E. coli, co plazmidy prAK, źródło replikacji E. coli (nie pokazane) oraz gen odporności na chloramfenikol, jak to pokazano na fig. 4. Strzałki na fig. 4 wskazują kierunek odczytu genu B. t. Wuhanensis pod kontrolą promotora E. coli i genu odporności na chloramfenikol. W oparciu o informacje odnośnie sekwencji można stwierdzić, ze pełny operon (gen strukturalny, sekcja sekwencji wiązącej rybosomy pochodząca z B. t. i sekwencja promotor (operator E. coli) jest bardzo podobny i tylko nieznacznie różni się od operonu w plazmidzie prAK. W szczególności DNA kodujący 610 aminokwasów aktywnej części endotoksyny B. t. (tabela 10) i rozciągający się do obszaru protoksyny co najmniej do punktu w pobliżu miejsca Κρη I przedstawionego na fig. 4 jest w pBt210 identyczny z odpowiednią sekwencją DNA w plazmidzie prAK. W obszarze DNA poza miejscem Κρη I w genie strukturalnym B. t. wpBt2I0aż do końca tego genu strukturalnego występują nieznane, choć nieznaczne różnice w porównaniu z odpowiednią sekcją genu B. t. kurstaki HD-1 skracaną przy otrzymywaniu prAK. Różnice te ustalono w wyniku mapowania endonukleaz restrykcyjnych. Plazmid pBT210 koduje pełnej długości endotoksynę przedstawioną w tabeli 10 i jest w pełni homologiczny w części aktywnej (i poprzez co najmniej aminokwasy wytworzone aż do jego miejsca Κρη I, δ - endotoksyną z B. t. kurstaki w klonach prAK i pB8rII), a ponadto wykazuje znaczną homologię w reszcie sekcji protoksyny. Na koniec można stwierdzić, ze miejsce wiązania rybosomowego w pBT210 jest identyczne z odpowiednim miejscem w prAK, a całość DNA rozciągającego się od miejsca tuż

161 726 przed początkowym Met do miejsca Barn HI łączącego sekcją promotora i obejmującego miejsce wiązania rybosomowego (RBS) jest taka sama w pBT210 i prAK. z tym, ze w pBT2I0 występują dwie zmiany nukleotydów bezpośrednio po miejscu Barn HI (CC, a nie GT jak w prAK), a trzy nukleotydy (Tl T) występujące w prAK bezpośrednio po wymienionych dwóch nukleotydach nie występują w pBT210, przy czym różnice te są po prostu spowodowane różnymi strategiami ligowania przy łączeniu sekcji RBS z B. t. z sekcją promotora E. coli, poprzez miejsce Barn HI. Plazmid pBT210 zastosować można do wytwarzania białka δ - endotoksyny B. t. o pełnej długości zawierającego dowolną jedną zmianę lub więcej zmian aminokwasów. Miejsce na Nsi I, dwa miejsca Xbal, miejsce Sst I oraz pierwsze pojawiające się miejsce Hind III, w pBT2I0, przedstawione na fig. 4 odpowiadają takim samym miejscom w prAK przedstawionym na fig. 1. Jak to zaznaczono powyżej, DNA w obydwu plazmidach w tym obszarze są identyczne.

Przykład A. 1. Próba z Trichopolusia ni (T. ni)

Testy przeprowadzono na larwach w drugim stadium rozwoju. Wszystkie owady trzymano w komorach klimatyzacyjnych w standardowych warunkach temperatury, wilgotności ltp. przez cały okres badań, karmiąc je standardowym sztucznym pokarmem. Badane substancje podawano owadom jako część pokarmu, przy czym badaną substancję o konkretnym stężeniu podawano jednej grupie 20 owadów. Owady obserwowano przez 7 dni po podaniu substancji, po czym wyznaczano wielkości LDso- LD50 można określić jako ocenę dawki niezbędnej do spowodowania śmierci 50% osobników. Wynik końcowy podawano jako skuteczność względną.

skuteczno^ść wz^ględna =

LD₅₀ wzorca LD50 badanej substancji

X 100

Powyższa metodyka umożliwia uzyskanie absolutnych wielkości LD50, dzięki czemu interpretacja wyników jest bardzo prosta. Wszystkie wielkości skuteczności względnej wyzsze od wielkości dla wzorca oznaczają aktywność większą niż w przypadku wzorca. I tak substancja o skuteczności względnej 400 w porównaniu z wzorcem o skuteczności 100 jest 4 razy bardziej aktywna niż wzorzec.

W powyższej próbie wzorcem o skuteczności względnej 100 był plazmid pBT301 zawierający naturalną sekwencję δ -endotoksyny pełnej długości, identyczny z pBT210, z tym ze zawiera dwa promotory E. coli, z których każdy był identyczny z promotorem w pBT210.

Jako próbki kontrolne w powyższym teście zastosowano:

a) CAG 629 - szczep E coli me zawierający plazmidów wytwarzających δ - endotoksynę i nie wykazujący działania owadobójczego (dar od C. A. Grossa, Department of Bacteriology, Umversity of Wisconsion);

b) SAN 415 - dostępny w handlu środek owadobójczy B t. otrzymywany pod zarejestrowaną nazwą handlową JAVELIN.

2. Próba z gąsienicą zerującą na pąkach tytoniu (próba TBW).

Próbę TBW przeprowadzono w sposób zasadniczo zbliżony do opisanego przez Dulmage'a i innych, (1971) J Invertebr. Path. 18, 240-245. Próbę wykonano na trzech próbkach, w jednouncjowych przeźroczystych dmuchanych kubeczkach plastikowych, po jednej larwie TBW w drugim stadium rozwoju (4-5 dni,średnia waga 1,6g) w każdym kubku. Dla każdej próby przygotowano po 15 ml pokarmu (składającego się ze sproszkowanej odzywki, proszku witaminowego, agaru i innych składników), w sposób opisany przez Dulmage'a 1 innych, USDA Technical Bulletm No. 1528:1-5 (1976). Pokarm rozdzielono w równych ilościach do trzech kubków. Kubki schłodzono przez pó, godziny Do każdego kubka wprowadzono jedną TBW za pomocą szczoteczki z włosia wielbłądziego o wymiarze 00, po czym dokładnie wciśnięto pokrywki. Kubki umieszczono następnie w inkubatorze w temperaturze 27°C, 50% wilgotności względnej, na 4-5 dni. Wartości liczbowe grup rozmiarowych wykorzystywane w ocenie próby toksyczności TBW odpowiadają zakresom wagi podanym w tabeli poniżej.

161 726

Grupa rozmiarowa	Zakres wagi (mg)	Waga średnia (mg)
1,0	1,3- 1,9	1,6
1,5	2,7- 3,1	2,8
2,0	5,5 - 6,3	5,8
2,5	117- 12,3	12,0
3,0	1^,^- 22,2	19,6
3,5	30,8 - 34,2	32,8
4,0	50,1 - 52,4	51,1
4,5	76,,6 - 94,3	84,8
5,0	119,8 - 114,7	113,5
6,0	119,8-134,3	140,0

Podana wyżej „grupa rozmiarowa odpowiada bezpośrednio zamieszczonej w opisie ocenie toksyczności. I tak po każdej próbie oznaczano wagę larwy i przypisywano stopień toksyczności równy grupie odpowiadającej zakresowi wagi, w którym przypadła waga tej larwy. Wyjątek, jak to opisano poniżej, stanowiło to, że wszystkim martwym larwom przypisywano grupę rozmiarową i stopień toksyczności zero. Stopnie toksyczności uzyskane dla wszystkich powtórek uśredniano uzyskując wyniki podane w opisie. Wszystkie wyniki są zazwyczaj oparte na co najmniej 30 powtórkach.

Kubki otwarto po ustaleniu zakresów różnych wielkości TBW. TBW ważono, aż w każdym zakresie wagi przypadała jedna larwa. Kubki zawierające TBW o podanym zakresie wagi znakowano następnie odpowiednim numerem grupy rozmiarowej. Kubki te uszeregowano we wzrastającym porządku na stole laboratoryjnym. Pozostałe próbki oceniano wzrokowo porównując wielkość ze zważonymi TBW i wpisywano odpowiedni numer grupy na arkuszu ocen. Larwy martwe oznaczano symbolem „ + “ przypisując im ocenę O. Uważano, że martwe larwy o barwie jasno różowej lub takie, które zaczęły rozpływać się, padły z powodów nie związanych z <5 - endotoksyną. larwy te oznaczano symbolem „ - “ i nie uwzględniano ich w wynikach.

W wyniku rozdzielenia standardowej próbki hodowli pr AK o wielkości 1 ml między 3 kubki następowało zahamowanie wzrostu stosownie do zakresu ocen toksyczności. Z tego względu próba była przydatna w celu odróżnienia klonów o zwiększonej toksyczności od tych, które wykazywały toksyczność zmniejszoną lub taką samą, jak niemutantowy przodek. Próba wykazywała reakcję na dawkę, zalezną od ilości użytej hodowli prAK. Im większa była ilość bakterii zawierających prAK dodanych do próbek, tym większy zaobserwowano stopień toksyczności w stosunku do TBW. Krzywa reakcji na dawkę dla danego prAK była przydatna w ocenie stopnia, w jakim klony były bardziej toksyczne niż niemutantowy przodek. Następująca tabela ilustruje reakcję na dawkę bakterii zawierających prAK.

Ilość do danej

stacjonarnej hodowli prAK	Ocena toksyczności
5 ml	1,5	1,5	2,0
2	2	2,5	2,5
1	3	3	3,5
0,5	3	3,5	4
0,25	3,5	4	4

W oparciu o powyższą ocenę poddano badaniu wszystkie hodowle (stosując po 1 ml każdej hodowli), aby umożliwić uzyskanie, na podstawie otrzymanych wielkości grup, wysokiego stopnia pewności, które mutanty wykazują większą, a które mniejszą aktywność w stosunku do prAK (i innych niemutantowych plazmidów) jako wzorca.

Sproszkowaną odżywkę stosowaną w próbie TBW uzyskano w wyniku wymieszania następujących składników w podanych proporcjach wagowych: mączka sojowa 1103,4g, kiełki pszenicy 429,4 g, mieszanka soli Wessona 292,4 g, sacharoza 164,2g, benzoesan metylu 24,6g oraz kwas sorbowy 14,8 g.

Proszek witaminowy stosowany w próbie TBW uzyskano w wyniku wymieszania następujących składników w podanych proporcjach wagowych: pantotenian wapniowy 12,0g, amid kwasu

161 726 nikotynowego 6,0g, ryboflawina 3,0 g, kwas foliowy 3,0 g, chlorowodorek tiaminy 1,5 g, chlorowodorek pirydoksyny l,5g, biotyna 0,12g oraz witamina Bu 6,0g.

W próbie TBW zastosowano trzy następujące sposoby selekcji (wstępną, szczegółową i kolejnych rozcieńczeń) na różnych stadiach oceny, powołując się na nie w opisie.

Ocena wstępna: próbki po 1ml z 18-godzinnych hodowli dwóch odrębnych klonów połączono z pokarmem dla TBW w 50-ml stożkowej probówce do wirowania, po czym całość rozdzielono równomiernie między trzy kubki (po jednej TBW w kubku). Próbki te oceniano w porównaniu z komórkami transformowanymi naturalnym prAK lub pBT2I0 oraz z komórkami nietransformowanymi przygotowanymi w taki sam sposób.

Próba szczegółowa: Próbki, które wykazały zwiększoną toksyczność w stosunku do TBW w próbie wstępnej, poddawano selekcji w próbie szczegółowej. Kolonie wybranych mutantów zaszczepiono z płytek zbiorczych na pożywce YT/Amp (jedna kolonia na hodowlę). Oceniano 10 próbek po 1 ml wraz z odpowiednimi próbkami kontrolnymi. Klony wykazujące zwiększoną toksyczność w stosunku do TBW określano jako „prawdopodobnie dodatnie mutanty* oceniając je następnie po raz trzeci. Te, które powtórzyły fenotyp „dodatni* po raz trzeci, określano jako „mutanty dodatniyy i oceniano w próbie kolejnych rozcieńczeń w celu dokładniejszego oznaczenia poziomu zwiększonej aktywności w stosunku do naturalnego przodka.

Próba kolejnych rozcieńczeń: Mutanty, odnośnie których potwierdzono, że wykazują fenotyp „dodali* w stosunku do konstrukcji niemutantowych, poddawano selekcji w próbie TBW metodą kolejnych rozcieńczeń, przyjmując za podstawę suchą masę liofilizowanych komórek bakteryjnych, które zawierały mutant lub naturalną toksynę z klonów prAK lub pBT210, hodowanych przez 18 godzin, a następnie pastylkowanych przed liofilizacją. Przygotowano po trzy próbki dla każdego z następujących rozcieńczeń (przy ostatecznej objętości 15 ml): 167 pg/ml, 67pg/ml i 33pg/ml. Białka z tych mutantów analizowano metodami SDS-PAGE i Westerna (immunoblotting), zazwyczaj w ilości 75 pg suchej masy komórek na linię. Wyniki uzyskane w próbie kolejnych rozcieńczeń w zasadzie potwierdziły wyniki prób poprzednich i jako takie zostały zacytowane w opisie lub podane w postaci wielkości średnich w tabelach, w których zestawiono wyniki badań biologicznych.

Przykład P - Procedury powtarzalne. W podanych poniżej przykładach oznaczonych liczbami oraz w innych przypadkach wspomnianych w opisie zastosowano następujące procedury powtarzalne lub standardowe, jeśli występują odniesienia do tych procedur albo też procedury takie są wymagane, chyba że tekst wskazuje inaczej.

Przykład P-l. Utrzymywanie i wzrost szczepów bakteryjnych i fagowych. Szczepy E. coli SG4044 i JM 103 były stosowane jako gospodarze we wszystkich konstrukcjach plazmidów. Szczep E. coli JM103 oraz fagi M18 i M19 otrzymano z New England biolabs. Te szczepy bakteryjne hodowano w ośrodku YT (5g/dm3 ekstraktu drożdżowego, 10 g/dm³ baktotryptonu i 5g/dm³NaCl). Do ośrodka dodawano 50mg/dm³ ampicyliny w przypadku hodowli komórek zawierających prAK lub pochodne tego plazmidu, albo 20 mg/dm³ chloramfenikolu w przypadku komórek zawierających pBT210 lub pochodne tego plazmidu.

Przykład P-2. Propagacja i wydzielanie fagowego DNA. Wytwarzanie Μ13 - pochodnych rekombinantowych rdzeni fagowych oraz wydzielanie fagowego DNA wykonywano z wykorzystaniem uprzednio opisanych procedur (Messing J., (1983), Methods Enzymól. 101:20-78).

Przykład P-3. Wytwarzanie syntetycznych oligonukleotydów. Syntetyczne oligonukleotydy otrzymywano z wykorzystaniem zautomatyzowanej syntezy w urządzeniu do syntezy DNA Applied Biosystems 380A (Foster City, CA).

Etapy oczyszczania po zakończeniu cyklu były następujące. Syntetyczny oligonukleotyd odblokowywano dodając równą objętość wodorotlenku amonowego, po czym prowadzono inkubację w 55°C przez noc. Po usunięciu wodorotlenku amonowego metodą cyklicznego wirowania próżniowego i redyspergowania w wodzie destylowanej oligonukleotyd oczyszczano dokładniej metodą elektroforezy w układzie mocznik-żel poliakrylamidowy (Urea-PAGE). W celu wizualizacji pasma żel umieszczano na płytce do chromatografii dwuwarstwowej pokrytej okładką z Saranu®, po czym oligonukleotyd naświetlano krótkofalowym światłem nadfioletowym. Po wycięciu części żelu zawierającej oligonukleotyd za pomocą ostrza żyletki oligonukleotyd eluowano z żelu za pomocą 0,5 M octanu amonowego, 1 mM EDTA, pH 8,0, w 37°C przez noc,

161 726 z mieszaniem. Po eluowaniu przez noc fragmenty żelu zbrylono stosując wirowanie z szybkością 6000 obrotów/minutę, rotor JA20, po czym ciecz znad osadu zawierającą wyeluowany oligonukleotyd przeniesiono do świeżej probówki. W celu zatężenia oligonukleotydu zastosowano wytrącanie etanolem, po czym oznaczano go ilościowo mierząc absorbancję przy O.D. 260. 200 pmoli oligonukleotydu kinazowano w 40/1 mieszaniny reakcyjnej z 2 jednostkami kinazy polinukleotydowej T4 i 0,05 mM ATP.

Przykład P-4. Transformacja DNA w komórkach E. coli.

A) E. coli JM 103 lub SG4044 jako składnik w celu przeprowadzenia transformacji DNA przygotowano w sposób opisany w powszechnie stosowanych procedurach (Cohen S.N., Chang A.C.P., Hsu L.,(1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110-2114). W przypadku miejscowo ukierunkowanej mutagenezy oligonukleotydów 60 ng DNA heterodupleksowego zrekombinowanego Faga (Μ 13) dodawano do 0,2 ml kompetentnych komórek, utrzymując temperaturę 0°C przez 15 minut. Komórki utrzymywano następnie w 42°C przez 2 minuty, po czym 30μ\ tej mieszaniny dodano do 3 ml pożywki YT zawierającej 0,7% baktoagaru (utrzymywanej w 42°C, aby zapobiec zestaleniu mieszaniny) i 0,2 ml świeżej (hodowanej przez noc) hodowli JM 103 lub SG4044. Mieszaninę natychmiast rozprowadzono na płytce agarowej YT (pożywka YT + 1,5% baktoagaru), po czym płytki (odwrócone) inkubowano przez noc w 37°C.

B) 100 ng plazmidowego DNA z eksperymentów mutagenezy lub jakichkolwiek innych ligowań z udziałem wektorów prAK lub pBT210, jak to opisano powyżej, dodano do 0,2 ml kompetentnych komćirek ^JM IO^{3 l}u^{b SG}4044, utrz^ymuj^ąc temperatur^ę 0°^{C p}rzez ³⁰ mmut. fomórh uttzjraywano następnie przez 2 minuty w 42°C, po czym ponownie zanurzono w łaźni z lodem. Ilości od 2/1 do 200/1 umieszczano na płytkach z agaru YT zawierających 50//g/ml ampicyliny w przypadku klonów opartych na prAK i 20//g/ml chloramfenikolu w przypadku klonów opartych napBT210, po czym inkubację prowadzono przez noc w 37°C.

Przykład P-5. Trawienie enzymem restrykcyjnym. Wszystkie enzymy restrykcyjne dostarczone zostały z Bethesda Research Labs (Gaithersburg, MD) lub z New England Biolabs. Warunki inkubacji były takie, jak zalecał to producent.

Przykład P-6. Ligowanie fragmentów DNA.

A) Mieszaniny reakcyjne do ligowania (20/1) zawierały 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCb, 1 mM ditiotrei tol, 50 pM ATP, 20 nM DNA termini (końcówki) i 20 jednostek ligazy DNA T4 (New England biolabs). Inkubację prowadzono w 14°C przez 4 godziny.

B) Ligowanie trzech fragmentów przeprowadzano stosując fragmenty w stosunku molowym 1:1:1, o stężeniach 0,04 pM każdy, w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20/1. Inkubację prowadzono w 16°C przez 4 godziny, gdy ligowano tylko lepkie końce (np. wewnętrzne miejsce Xho II) albo przez noc, gdy ligowano jak iś koniec tępy (np. miejsce FnuD2). Ligazę T4 z New England biolabs (NEB) stosowano w stężeniu 10 jednostek (oznaczenie NEB) na 1jł1 objętości mieszaniny reakcyjnej.

Przykład P-7. Sekwencjonowanie DNA. Sekwencjonowanie DNA genów δ - endotoksyny i ich pochodnych wykonywano metodą zakańczania łańcucha, Heideckera i innych (Heidecker G., Messing J, Gronenbom B. (1980) Gene 10:68-73).

Przykład I. Wytwarzanie wektorów prAK-3, prAK-4, prAK-5, prAK-6 i prAK-7.

Etap a) Wytwarzanie prAK-3. lpg plazmidu pB8rII (przedstawionego na fig. 2 i opisanego powyżej) oraz nadającą się do replikacji formę DNA z wektorów MP18 i MP19 klonujących dobrze znany fag M13 równocześnie trawiono za pomocą endonukleaz restrykcyjnych Barn HI (8 jednostek) i Κρη I (10 jednostek) przez 60 minut w 37°C w 100 mM roztworze buforowym chlorku sodowego zawierającym również 6mM Tris-HCl (pH 7,9), 6mM MgCb, lOO/pg^ml albuminy surowicy bydlęcej. Pożądane fragmenty z uzyskanych mieszanin DNA uzyskano i oczyszczano przepuszczając całą mieszaninę przez 1% preparatywny żel agarozowy w celu rozdzielenia pod względem wielkości. Pasma wizualizowano przez zabarwienie bromkiem etydiowym i naświetlanie długofalowym światłem nadfioletowym. Fragment żelu zawierający pożądany DNA wycięto, po czym DNA eluowano metodą elektroforezy w rurkach do dializy. Fragment Barn HLKCpn I z pB8rII ligowano z wyciętymi i oczyszczonymi na żelu wektorami mpl8 i mpl8 Barn ΗΙ/KCpn I, prowadząc inkubację przez 4 godziny w 14°C, w łącznej objętości 20/1, w mieszaninie zawierającej 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCk, 1 mM ditiotreitol, 50 mM ATP i 20 nM DTA termini. Uzyskany DNA transformowano w kompetentnych komórkach E. coli JM 103, jak w przykładzie

161 726

P-4, z tym że płytki YT zawierały tiogalaktozyd izopropylu (IPTG) i 5-bromo-4-chloro-3-indoliloD-galaktozyd (X gal), obydwa odczynniki otrzymane z Sigma Chemical Company. Ponieważ zrekombinowany fag zawierający insert DNA wycięty z pB8rl 1 będzie w tych warunkach dawał przezroczyste łysinki, a Ml8 i M19 dają łysinki w kolorze niebieskim, przezroczyste łysinki dodano do 2ml komórek E. coli JM 103 w pożywce YT i inkubowano w 37°C przez noc, po czym z fagu otrzymano jednoniciowy DNA postępując zgodnie z procedurą opisaną przez J. Messinga, J. Methods Enzymol. (1983), 101:20-78. Te pożądane klony zawierające duże, lecz jednoniciowe inserty DNA z pB8rII zidentyfikowano stosując elektroforezę na żelu agarozowym, ze względu na ich mniejszą ruchliwość w porównaniu do mpl8 lub mpl9 Sekwencjowanie części tych klonów, które zawierały DNA endotoksyny, metodą dwudezoksy-terminacji łańcucha potwierdziło obecność DNA endotoksyny oraz wykazało, że mp!8 zawiera jego nabytą nić nonsensowną, a MP-19 zawiera nabytą jego nić nonsensowną, przy czym obydwie te nici zostały wydzielone. Oligonukleotyd nonsensowny o 26 zasadach, zawierający sekwencję

5' GTC CTT CTA ATC GCG AAA TGG CTT GG3' otrzymano metodą syntezy w fazie stałej w zautomatyzowanym syntetyzatorze DNA, a następnie kinazowania z kinazą polinukleotydową T4 i ATP w sposób opisany przez Maniatisa i innych, Molecular Cloning (1982): A Laboratory Manuła; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. Mieszaninę o łącznej objętości 20//I zawierającą 0,4 pg zrekombinowanego faga mpl9 z nicią sensowną endotoksyny, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7mM MgCk, 1 mM ditiotreital, 50 mM chlorek sodowy i 10 ng oligonukleotydu nonsensownego o 26 zasadach, ogrzewano w 68°C przez 15 minut, a następnie w 37°C przez 10 minut i umieszczono w 0°C. Uzyskaną mieszaninę zawierającą zrekombinowany DNA mpl9 spiekany z mutagenicznym oligomerem poddano następnie obróbce dodając dATP, dCTP, dTTP i dGTP, każdy o stężeniu 0,2 mM, 1 mM ATP, 4 jednostki fragmentu Klenowa Polimerazy I DNA (z New England Biolabs), 0,5pg jednoniciowego białka wiążącego z E. coli (z Pharmacia, Piscataway, N. J.) i 20 jednostek ligazy DNA T4 (New England Biolabs). Uzyskaną mieszaninę inkubowano w 14°C przez 4 godziny w celu przeprowadzenia polimeryzacji i ligowania, a uzyskany kołowy, dwumciowy, heterodupleksowy DNA transformowano w E. coli JM103, a następnie umieszczono na płytkach w sposób opisany w przykładzie P-4. Z kolei wybrano 20 odrębnych łysinek i jednoniciowy DNA wydzielono z faga w sposób opisany przez Maniatisa i innych, patrz wyżej. DNA z faga z 20 łysinek, każdy w łącznej objętości 20 pl w mieszaninie zawierającej 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KC1,10 mM MgCb, 10 ng wyżej wspomnianego oligonukleotydu sensownego o 26 zasadach oraz 0,2pg różnych cząsteczek kołowego jednoniciowego DNA fagowego ogrzewano w 68°C przez 15 minut, a następnie umieszczono w 37°C na 10 minut. Do każdej z uzyskanych mieszanin dodano po 8 jednostek endonukleazy restrykcyjnej Nru I i uzyskane mieszaniny inkubowano w 37°C przez 1 godzinę. Mieszaniny poddano elektroforezie przez 0,8% żel agarozowy. Około 10% próbek zawierało migrujący DNA jako DNA liniowy, co umożliwiło identyfikację klonów dodatnich zawierających pożądane miejsce Nru 1, po czym dodatnie klony transformowano w E. coli JM 103 w celu ich oczyszczenia. DNA między miejscami Barn HI i Xba 1 w klonach dodatnich wycięto (po spiekaniu z sekwencjonującym oligomerem z ml3 i polimeryzacji w celu uzyskania produktu dwuniciowego, jak to opisano powyżej w przypadku oligomeru Nru I (przez równoczesne przecinanie endonukleazami tych miejsc i ligowano (patrz przykład P-6A) z dużym fragmentem (około 5004 par zasad, z opuszczonym fragmentem o około 749 bp między Barn HI i drugim miejscem Xba I w prAK), a następnie oczyszczano na żelu po całkowitym strawieniu prAK równocześnie tymi samymi dwoma enzymami restrykcyjnymi, w znany sposób, uzyskując plazmid prAK-3.

Etap b) Wytwarzanie prAK-4. Postępując zasadniczo zgodnie z procedurą ogólną taką jak w etapie a) powyżej, jednoniciowy fagowy DNA otrzymany w etapie a) spiekano z syntetycznym oligonukleotydem nonsensownym o sekwencji (25 zasad).

5' CCACTCTCTAAAGCTTTCTGCGTAAa' przeznaczonego do wprowadzania miejsca Hind III między pozycje nukleotydów 327 i 351 (według tabeli 10) w sekwencji nukleotydowej. Klony dodatnie zawierające obecnie pożądane miejsca zarówno Nru I jak i Hind III, zidentyfikowano z częstością występowania 6,6% na podstawie analitycznego rozszczepiania nukleazą Hind III. Zastosowano je do wytwarzania prAK-4 poprzez hgow^anie fragmento Barn HI/Xba I z now^ymⁱ mfojscamb z ^du^żym fragmentem o 5004 b^{p z p}rAK, w sposób taki jak w etapie a).

161 726 21

Etap c) Wytwarzanie prAK-5. Postępując zasadniczo zgodnie z procedurą ogólną taką jak w etapie a), jednoniciowy fagowy DNA otrzymany w etapie b) powyżej spiekano z syntetycznym oligonukleotydem nonsensownym o sekwencji (26 zasad).

5' GCATCTCTTCCCTTAGGGCTGGATTAa' przeznaczonym do wprowadzania miejsca Mst II między pozycje nukleotydów 366 i 391 (według tabeli 10) w sekwencji nukleotydowej. Stwierdzono, ze uzyskane dodatnie klony zawierają obecnie wszystkie trzy pożądane miejsca, Nru I, Hind III i Mst II, oraz że występują one z częstością około 9,1%, co potwierdziła ocena poprzez rozszczepianie enzymem restrykcyjnym Mst II. Klony te zastosowano do wytwarzania prAK-5.

Etap d) Wytwarzanie prAK-6. Postępując zasadniczo zgodnie z procedurą ogólną taką jak w etapie a) powyżej, dodatnie dwuniciowe klony fagowe z etapu c) powyżej przekształcono w jednoniciowy fagowy DNA i spiekano z syntetycznym oligonukleotydem nonsensownym o 26 zasadach, o sekwencji

5' GCGGTTGTAAGCGCGCTGTTCATGTCa’ przeznaczonej do wprowadzania miejsca Bss HII między pozycje nukleotydów o numerach 406 i 431 (według tabeli 10) w sekwencji nukleotydowej. Stwierdzono, że klony dodatnie zawierające wszystkie cztery miejsca wymagane ostatecznie w prAK-7 występują z częstością około 12,5%, co potwierdziła ocena poprzez rozszczepianie enzymem Bss HII. Klony te zastosowano do otrzymywania prAK-7.

Etap e) Wytwarzanie prAK-7. Postępując zasadniczo zgodnie z procedurą ogólną taką jak w etapie a powyżej, jednoniciowy fagowy DNA otrzymany w etapie d) powyżej spiekano z syntetycznym oligonukleotydem nonsensownym zawierającym 26 zasad w sekwencji

5' TACAGTCCTAAATCTTCCGGACTGTA3' przeznaczonym do eliminacji miejsca Hind III między pozycjami nukleotydów o numerach 1682 i 1707 (według tabeli 10) w sekwencji nukleotydowej. Stwierdzono, że dodatnie klony zawierające pełną sekwencję pożądaną w przypadku prAK-7 występują z częstotliwością około 2,8%, na podstawie selekcjonowania endonukleazą restrykcyjną ulegającej replikacji dwuniciowej formy zrekombinowanego DNA fagowego w celu ustalenia eliminacji miejsca Hind III między nukleotydami 1682 i 1707. Dwuniciowy DNA wydzielony z mutanta zastosowano do wytwarzania prAK-7.

Aby uzupełnić zbiór o plazmid (prAK-9) zawierający wyjątkowe i odpowiednio rozmieszczone miejsca restrykcyjne umożliwiające przeprowadzenie eksperymentów z zamianą kodonów (codon spin) w innych punktach mutacji między dwoma miejscami Xba I, kontynuować można otrzymywanie plazmidów z serii pr AK, zgodnie z opisanymi poniżej etapami, otrzymując plazmid prAK-8, a z niego plazmid prAK-9, jak to przedstawiono w etapach f) i g).

Etap f). Wytwarzanie prAK-8. Postępując zasadniczo zgodnie z procedurą ogólną taką jak w etapie a) powyżej, jednoniciowy DNA fagowy otrzymany w etapie e) powyżej spiekano z syntetycznym oligomerem nonsensownym zawierającym 27 zasad w sekwencji

5' TCCCCACCTTTGGCCAAACACTGAAAC3' przeznaczonym do wprowadzania miejsca restrykcyjnego Bal I w przybliżeniu w pozycji nukleotydu 534 (według tabeli 10) w sekwencji nukleotydowej. Klony dodatnie prAK-8 zawierające obecnie wszystkie 5 pożądanych miejsc, Nru I, Hind III, Mst II, BssHII i Bal I oraz pozbawione miejsca Hind III usuniętego przy wytwarzaniu prAK-7, identyfikuje się w sposób podany w etapie a) powyżej.

Etap g). Wytwarzanie prAK-9 Postępując zasadniczo zgodnie z procedurą taką jak w etapie a) powyżej, jednoniciowy fagowy DNA otrzymany w etapie f) powyżej spiekano z syntetycznym oligomerem nonsensownym zawierającym 30 zasad w sekwencji

5' GTTGCCA ATA AGACGCGTTAAATCATTATA₃' przeznaczonym do wprowadzania miejsca restrykcyjnego MIu I między pozycje nukleotydów o numerach 588-595 (według tabeli 10) w sekwencji nukleotydowej. Klony dodatnie zawierające obecnie wszystkie 6 pożądanych miejsc restrykcyjnych, Nru I, Hind III, Mst II, BssHII, Bal I i Mlu I, oraz pozbawione miejsca Hind III usuniętego przy wytwarzaniu prAK-7, zidentyfikowano w sposób opisany w etapie a) i oznaczono jako plazmid prAK-9.

161 726

Oczywiste jest, że kasetowy DNA odpowiedni do podstawienia między miejsca Bal I i Mlu I w prAK-9 może być odpowiednio kodowany, tak aby wprowadzić wszystkie możliwe warianty kodonów i aminokwasów w mutowanych pozycjach aminokwasów 184, 187, 188 i 194.

W analogiczny sposób kasetowy DNA odpowiedni do podstawienia między miejsce Mlu I i drugie miejsce Xba I może być odpowiednio kodowany, tak aby wprowadzić wszystkie możliwe warianty kodonów i aminokwasów w mutowanych pozycjach aminokwasów 201 i 204.

^Na figiirze 1 ^przedstawiono scliematycznie wyjątkowe mie^jsca restr^ykcyjne ^dające s^ię wpro^wadz^ić mię^dz^{y d}wa wyjśctówe miejsca ^Xba ^I stwierdzone w ^prAK, z tym ^że ^pierwsze z t^yc^h miejsc Xba I stanowi w prAK-9 miejsce Nru I.

Podkreślenia w oligonukleotydach podanych powyżej w różnych etapach przykładu I oznaczają zmianę lub zmiany, które mają być wprowadzone.

Przykład II. Doświadczenia ze zmianą kodonów (codon spin).

A) Jednoniciowe oligonukleotydy zawierające sekwencje każdej z dwóch nici przedstawione na fig. 3A i 3B, otrzymano sposobem opisanym w przykładzie P-3, w syntetyzatorze DNA zaprogramowanym tak, aby dokonać przypadkowej insercji każdego z nukleotydów A, T, C i G w każdej z pozycji X w każdej mci przedstawionej na fig. 3. W każdym doświadczeniu przeprowadzonym w tym urządzeniu otrzymano zgodnie z podaną procedurą łącznie po około 200 >zg (po oczyszczeniu) pojedynczych nici DNA reprezentujących grupę identycznych oligonukleotydów, z wyjątkiem pozycji X w każdej z nici. Po 10 pmoli każdej z nici, sensownej i nonsensownej, w przypadku każdej zamiany kodonów, połączono w masie i spiekano ogrzewając w 68°C przez 10 minut, a następnie w 37°C przez 10 minut, po czym schłodzono do temperatury pokojowej i umieszczono w lodzie. Stwierdzono, że uzyskana masa dwuniciowych oligomerów odpowiadających DNA przedstawionemu na fig. 3A zawiera w pozycjach XXX (pozycja aminokwasowa 116) dowolną kombinację dozwoloną przez kod genetyczny obejmującą sygnały stopu i liczne, choć różne ilości kodonów każdego z 20 naturalnych aminokwasów, 1 pmol takich dwuniciowych oligomerów czyli kaset kinazowano następnie z kinazą polinukleotydową T4 z New England biolabs i wymieszano w masie z większym fragmentem (wprowadzanym w dziesięciokrotnie mniejszym stężeniu molowym) otrzymanym w wyniku wydzielania na żelu po równoczesnym rozszczepianiu plazmidu prAK-7 endonukleazami restrykcyjnymi Hind III i Mst II w 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCL, pH7,5, 10 mM MgCb, 10 mM 2-merkaptoetanolem i 100/ug/ml BSA, po czym uzyskaną mieszaninę poddano ligowaniu zgodnie z przykładem P-6 (A). Próbkę 5μ\ uzyskanej mieszaniny ligacyjnej zastosowano do transformowania E. coli JM 103 w warunkach podanych w przykładzie P-4 (B). 200 uzyskanych transformowanych komórek poddano niezależnie badaniom w próbach TBW i T. ni (bez wcześniejszej identyfikacji, który kodon XXX był w danym klonie) stwierdzając, że uzyskany poziom aktywności wskazuje w przybliżeniu na to, że w przypadku wszystkich różnych mutantów uzyskuje się owadobójczo czynny produkt białkowy wykazujący aktywność co najmniej zbliżoną do aktywności kontrolnej skróconej endotoksyny, z tym ze występowały również wyraźne mutanty dodatnie o aktywności 5 razy większej od wzorca. Przed wykonaniem tych badań wybrano również przypadkowe komórki z transformacji, umieszczono je na płytkach i prowadzono hodowlę jak w przykładzie P-1 w celu wydzielenia plazmidowego DNA do analizy sekwencji DNA poprzez klonowanie fragmentu Barn HI/Xba I w sekwencjonujących wektorach mp 18 i mp 19 przeciętych tymi samymi enzymami. DNA z obszaru każdej z 11 takich mutacji w pozycji 116 w zidentyfikowanych dodatnich mutantach poddano następnie sekwencjonowaniu w celu zidentyfikowania aminokwasu kodowanego w pozycji 116. Stwierdzono, ze jeden z dwóch mutantów dodatnich był oryginalnym mutantem dodatnim z pozycją 116-Lys, ale kodowaną przez AAA. Drugim dodatnim mutantem był jak stwierdzono mutant 116-Arg kodowany przez CGT. Jeden z innych klonów zawierał jak stwierdzono naturalny 116-Glu, ale kodowany przez GAA. 7 innych mutantów lekkich zawierało 116-Ile (ATT), 116-Cys (TGC), 116-Leu (CTC), 116-Asp (GAT),

116-Ans (AAC), 116-Ile (ATT) i 116-Gly (GAA), przy czym były to wszystko klony wyjątkowe, z tym wyjątkiem, ze nowy 116-Ile (ATT) był reprezentowany przez dwa klony. Klony końcowe kodowały 116- STOP (TGA).

B) Procedurę z części A) przykładu II powtórzono dla pozycji aminokwasu 119 stosując DNA przedstawiony na fig. 3B. Również w tym przypadku statystyczna ocena dużej liczby uzyskanych klonów wykazała w próbach z TBW i T. ni poziom aktywności w pewnym stopniu wskazujący, że wszystkie klony mutantowe w zestawie były aktywne. Procent cząsteczek nieaktywnych był w przybliżeniu równy częstości występowania STOP - kodonów UAA, UAG i UGA, jakich należało

161 726 oczekiwać przy przypadkowym wytwarzaniu przez urządzenie nukleotydów, w pozycjach XXX. Każdy z siedmiu przypadkowo wybranych indywidualnych klonów wykazywał poziom aktywności w przybliżeniu co najmniej taki sam, jak naturalna endotoksyna o skróconej sekwencji wytwarzana przez prAK, przy czym żaden z nich nie był mutantem dodatnim w stosunku do arbitralnie przyjętego wzorca. Sekwencjonowanie siedmiu indywidualnych klonów wykazywało, ze wszystkie były różne i wyjątkowe. Były to 119-Leu (CTA), 119-Tyr (TAC), 119-Asp (GAT), 119-His (CAT), 119-Pro (CCA), 119-Ile (ATT) i 119-Ser (TCT).

Przykład III. Endotoksyna pełnej długości z mutanta B. t. 1 pg plazmidu pBT210 rozcięto równocześnie endonukleazami restrykcyjnymi Barn HI (8 jednostek) i Sst I (8 jednostek) przez 60 minut w 100 mM roztworze buforowym chlorku sodowego, zawierającym również 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6mM MgCb i KKI/ig/ml albuminy surowicy bydlęcej. Większy fragment o około 7180 parach zasad oczyszczono na żelu przed użyciem go jako wektor. Następnie 1/g plazmidu prAK-26-3 zawierającego mutacje Ala — Thr w 119, Met —Ile w 130 i Gly — Asp w 201 również rozcięto równocześnie endonukleazami restrykcyjnymi Barn HI (8 jednostek) i Sst I (8 jednostek) w 100 mM roztworze buforowym chlorku sodowego zawierającym również 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgC2 i lOO/jg^ml albuminy surowicy bydlęcej. Fragment mniejszy o około 1428 parach zasad zawierający mutacje oraz sekcję RBS B. t. oczyszczono na żelu, po czym fragment ten w ilości około 0,06 pmola połączono przez ligowanie z 0,02 pmolami fragmentu - wektora o 7180 parach zasad otrzymanego powyżej. Obydwa fragmenty połączono w 20/1 ośrodka ligacji zawierającego 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCU, 1 mM ditiotreitol, 50 m/Μ ATP i 20 jednostek ligazy DNA T4, po czym uzyskaną mieszaninę inkubowano przez 4 godziny w 14°C. Uzyskany plazmid oznaczony jako pBt 26-3 transformowano w E. coli JM 103 dodając 5/1 mieszaniny ligacyjnej do 0,2 ml kompetentnego E. coli JM 103, utrzymując początkowo temperaturę 0°C przez 30 minut, a następnie przenosząc mieszaninę na 2 minuty do 42°C i ponownie zanurzając ją w lodzie. Różne ilości (2/1, 20/1 i 180 /1) uzyskanej mieszaniny rozprowadzono natychmiast na płytkach z agaru YT zawierających 20/g/ml chloramfenikolu (bulion YT z dodatkiem 1,5% baktoagaru), po czym płytki inkubowano w 37°C przez noc po odwróceniu. Na płytkach tych mogły rozwijać się tylko transformowane komórki z odpornością na chloramfenikol. Kolonie odporne na chloramfenikol hodowano w ciekłym ośrodku przez noc w 37°C, po czym wydzielono plazmidowy DNA w celu restrykcyjnego trawienia reagentami EcoRI i sekwencjonowania DNA po to, by rzeczywiście ustalić obecność mutacji punktowych. Korzystne transformanty zawierające plazmid pBT 26-3 oceniano następnie w próbach z TBW i T. ni.

Postępując analogicznie, jak w przykładzie III powyżej, otrzymano następujące mutantowe endotoksyny pełnej długości, oceniając je następnie w próbach z TBW i T. ni. W tabeli 7 poniżej podano otrzymane w ten sposób układy plazmid/komórka wytwarzające mutantowe endotoksyny pełnej długości wraz z przybliżonymi wynikami ich oceny w próbie TBW, a także przybliżone wyniki uzyskane w tej próbie dla produktu z przykładu III, naturalnej endotoksyny B. t. Wuhanensis wytworzonej w E. coli JM 103 oraz endotoksyny kontrolnej wytwarzanej w nietransformowanych komórkach JM 103.

Tabela 7

Przykład nr	Określenie nowego (mutantowego plazmidu) pełnej długości	Żrorto
(mutantowej sekwencji) Bam ΗΙ/Sst I	Mutacje rzeczywiste	Stopień toksyczności w próbie TBW
1	2	3	4	5
III	pBT 26-3	prAK-26-3	n9-Thr 130-Ile 201-Asp	1
III-A	PBT36a65	prAK-36ać	122-Ile 125-Val	2
III-B	pBT-C	prAK-C	116-Lys	1
II I-C	pBT-E	prAK-E	130-Ile 201-Asp	2
III-D	pBT-O	prAK-0	116-Lys 217-His	2

161 726

1	2	3	4	5
III-E	pBT-R	prAK-R	101-Lys II6-L\s 122-lle 125-Val	2
III-F	pBT98cl	prAK-98cl	188-Ser	2
III-G	pBT-B	prAK-B	119-Tbr	2
III-H	pBT-D	prAK-D	217-His	3
III-I	pBT-F	prAK-F	187-Thr	2,5
III-J	pBT-J	prAK-J	101-Lys 116-Lys 130-Ile 201-Asp	3
III-K	pBT-M	prAK-M	119-Thr 217-His	2,5
III-L	pBT-N	prAK-N	119-Thr 187-Thr	3
III-M	pBT-S	prAK-S	119-Thr 188-Ser	1
III-N	pBT-T	prAK-T	116-Lys 188-Ser	1,5
III-O	pBT-U	prAK-U	101-Lys 116-Lys 188-Ser	2
III-P	pBT107c22	pl07c22	94-Lys 194-Lys	3
III-Q	pBT99c62	p99c62	4-Thr 105-Tyr 204-Tyr	3
III-R	pBT107c25	plO7c25	184-Ile	3
III-S	pBT-A	prAK-A	101-Lys 116-Lys	3
III-T	pBT-K	prAK-K	101-Lys 116-Lys 187-Thr	3
III-U	pBT-P	prAK-P	119-Thr 122-lIe 125-Val	2,5
III-V	pBT-Q	prAK-Q	116-Lys 122-Ile 125-Val	3
III-W	pBT39	prAK-39	105-Tyr 188-Ser	3
ΙΙΙ-Χ	pBT70	prAK-70	119-Thr 184-lle	1
III-Y	pBT68	prAK-68	105-Tyr 130-lle 201-Asp	1
II1-Z Kontrolna Kontrolna	pBT53 B t Wuhanensis JM103	prAK-53	105-Tyr 184-lle	3 3 4,7

Przykład IV. Mutantowe endotoksyny B. t. o jeszcze pełniejszej długości. lpzg plazmidu pBT210 trawiono równocześnie endonukleazami restrykcyjnymi Bam HI (8 jednostek) i Sst I (8 jednostek), a uzyskany duży fragment o 7180 bp wydzielono na żelu. W szeregu odrębnych doświadczeń po lpg plazmidów prAK, prAK-E, p26-3, p36a65 i p95a86 trawiono równocześnie endonukleazami restrykcyjnymi Bam HI (8 jednostek) i Sstl (8 jednostek), po czym każdy z uzyskanych fragmentów o 1428 bp zawierających część skróconej sekwencji kodującej endotoksynę wydzielono na żelu. Każdy z tych fragmentów o 1428 bp oddzielnie trawiono endonukteazą restrykcyjną Fnu D2 (4 jednostki w 6mM NaCl, 6mM Tris-HCl (pH 7,4), 6mM MgCk, 6mM 2-merkaptoetanolu, 100pg/ml albuminy surowicy bydlęcej). Endonukteaza restrykcyjna Fnu D2 (zwana również Acc 2) rozcina każdy z różnych fragmentów Barn ΗΙ/Sst I o 1428 bp tylko raz na fragment Bam HI/Fnu D2 o 640 bp i fragment Fnu D2/Sst o 788 bp. Różne fragmenty w każdym z doświadczeń oczyszczano metodą elektroforezy na żelu agarozowym.

161 726

Uzyskano w ten sposób szereg różnych fragmentów Bam Hi/Fnu D2 o 640 bp oraz szereg różnych fragmentów Fnu D2/Sst I o 788 bp. Wybierając po jednym fragmencie z każdej z tych dwóch serii i ligując (sposobem według przykładu P-6B) je z większym fragmentem uzyskanym z pBT210, zawierającym 7180 bp, otrzymano szereg nowych plazmidów niosących różne geny enotoksyny mutantowej B. t. pełnej długości. Otrzymane w ten sposób nowe plazmidy zidentyfikowane poniżej w tabeli 8, zastosowano następnie do transformowania E. coli JM 103, zgodnie z procedurą podaną w przykładzie P-4 (A), - a uzyskane komórki oceniano pod względem wytwarzania endotoksyny B. t. w próbie TB W opisanej w przykładzie A. Przybliżone wyniki uzyskane w tej próbie zamieszczono poniżej w tabeli 8. Różne transformowane komórki zawierające plazmidy wymienione w tabelach 7 i 8 oceniano również w próbie z T. ni. Uzyskane wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 9.

Tabela 8

Przykład nr	Określenie nowego (mutantowego plazmidu) pełnej długości	Źródło fragmentu Bam HI/Fnu D2	Źródło fragmentu Fnu D2/Sst I	Mutacje rzeczywiste	Ocena w próbie TBW
IV-A	66	p36a65	p26-3	122-Ile 125-Val 201-Asp	3
IV-B	67	p26-3	p95a86	119-Thr 130-Ile 188-Ser	1
IV-C	74	p36a65	p95a86	122-Ile 125-Val 188-Ser	3
IV-D	106	p26-3	prAK	119-Thr 130-Ile	1
IV-E	107	prAK	p26-3	201-Asp	2,5
IV-F	108	prAK-E	prAK	130-Ile	3

Tabela 9

Oznaczenie plazmidu	Tabela	Skuteczność względna
pBTA	7	391
pBTC	7	299
pBT66	7	169
pBT107c25	7	254
pBTP	7	340
pBTS	7	255
pBT67	8	304
pBT106	8	367
wzorzec pBT301		100
kontrolna SAN4I5		59
kontrolna CAG629		0

Przykład V. Komórki transformowane DNA kodującym sekwencję mutantowej endotoksyny hoduje się w fermentatorze w znanych, standardowych warunkach. Zawartość fermentatora pod koniec wzrostu komórek, bezpośrednio przed zbiorem, podgrzewa się do temperatury około 70-80°C. Temperaturę tą utrzymuje się przez 10 minut przed schłodzeniem w tym celu, aby zdezaktywować rekombinantowe drobnoustroje, przy czym nie wpływa to na aktywność biologiczną białek endotoksynowych. Zawartość fermentatora odparowuje się następnie pod zmniejszonym ciśnieniem w celu zatęzenia jej do 1/3 objętości wyjściowej, a uzyskany koncentrat suszy się rozpyłowo pod ciśnieniem wtrysku około 14MPa, z przeciwprądowym przepływem ogrzanego powietrza o temperaturze na wlocie 140-160°C, a na wylocie 20-50°C. Uzyskany proszek miesza się z nośnikiem takim jak dotłuszczona mączka sojowa uzyskując zwilżalny koncentrat. Odpowiednie stosunki składników w tym koncentracie zależą między innymi od pożądanej mocy produktu gotowego, z tym że stosunek wagowy proszku do nośnika może wynosić np. 60:40. Uzyskany

161 726 koncentrat korzystnie zawiera 0,4-10%, a jeszcze korzystniej 0,8-8% składnika aktywnego, w przeliczeniu na spory lub białko endotoksynowe. Do stosowania metodą oprysku proszek zwilzalny rozcieńcza się wodą w znany sposób.

Przykład VI. Wytwarza się suszony rozpylowo koncentrat surowej zmutowanej endotoksyny jak opisano w przykładzie V. Komórki E coli JM 103 transformuje się plazmidem pBT 26-3 (patrz przykład III, tabela 7), po czym transformowane komórki hoduje się i dalej traktuje jak opisano.

A. Koncentrat proszku zawiesinowego.

Koncentrat proszku zawiesinowego, który nadaje się do przechowywania przed użyciem, wytwarza się przez zmieszanie 40 części wagowych koncentratu suszonego rozpyłowo, wytworzonego jak powyżej z 60 częściami wagowymi odtłuszczonego proszku z ziarna sojowego. Sproszkowany koncentrat pakuje się i przechowuje stosując materiały opakowaniowe i procedury dobrze znane w technice.

B. Roztwór do oprysku.

Wodny roztwór przeznaczony do opryskiwania wytwarza się przez rozcieńczenie wodą koncentratu proszku zawiesinowego, wytworzonego jak powyżej w A, do stężenia około 20 g koncentratu na 11 wody.

Do korzystniejszych mutacji wytwarzanych sposobem według wynalazku należą mutacje w pozycjach 116 (Lys lub Arg), 119 (Thr), 130 (He) 1188 (Ser) oraz kombinacje zawierające jedną lub więcej mutacji, takie jak występujące w pBT26-3, pBT-106, pBT-68, pBT-C, pBT-67 i pBT-70. Pewne z tych mutacji podano w tabeli 8. Korzystne są również pojedyńcze i kombinowane mutacje w p36a65, zwłaszcza odnoszące się do endotoksyn skróconych.

Według wynalazku mutacje występujące i dopuszczalne w pozycji aminokwasów 4 są interesujące, gdyż przypadają one w sekwencji 25 aminokwasów (pozycje od 1 do 25 włącznie w tabeli 10), która, jak się uważa, tworzy również część pre-toksynową lub protoksynową endotoksyny i ulega rozszczepieniu pod wpływem proteazy w jelicie z wytworzeniem aktywnej endotoksyny lub bardziej aktywnej endotoksyny. W związku z tym mutacje dopuszczalne w pozycji 4 uznaje się za związane z sekwencjami endotoksyny obejmującymi wymienione 25 aminokwasów lub wykazujące w stosunku do nich zasadniczą homologię (co najmniej w 70%), a w szczególności związane z endotoksynami kodowanymi w tym obszarze przez DNA, który mógłby hybrydyzować przed wystąpieniem mutacji w pozycji 4, w wymuszonych warunkach, z DNA zawierającym sekwencję podaną w tabeli 10, odnoszącą się do pozycji nukleotydów, od pozycji nukleotydo 1 do pozycji nukleotydu 75 włącznie, niezależnie od delecji i addycji oraz z równoważnym kodowaniem odpowiednich aminokwasów, jak to uprzednio rozważono w odniesieniu do zachowanego obszaru sekwencji 116 aminokwasów.

Mutacja nie objęta badaniami, w pozycji aminokwasów 217, wymieniona w tabeli 2 i uważana za występującą w innym miejscu jest taka, iż można załozyć, ze wszystkie naturalnie kodowane aminokwasy mogą występować w tej pozycji w aktywnej endotoksynie zawierającej związaną sekwencję przedstawioną w tabeli 10, rozciągającą się od końca aminokwasu 116 w sekwencji odniesienia do pozycji aminokwasu 217 włącznie. W związku z tym przypadek, że aminokwasem w pozycji 217 w takiej sekwencji lub jej równoważniku jest dowolny naturalnie kodowany aminokwas z wyjątkiem Arg, jest objęty zakresem wynalazku. Ponieważ jednak wymieniona mutacja w pozycji 217 dała mniej interesujące wyniki, jest ona głównie interesująca w kombinacjach z innymi mutacjami ujawnionymi w opisie, oraz jako wskazówka, ze pozycja 217 może ulec zmianie w endotoksynach, w których w pozycji tej z natury występuje Arg.

161 726 27

Tabela 10 /a/ -46

GS

ΑΤΰ CGT TTT AAA TTG TAG TAA TGA AAA ACA GTA TTA

Ile

Arg Phe Lys

Leu <«

xxx xxx Lys

Thr

Val

Leu

TAT

CAT

AAT

GAA

TTG

GTA

TCT

TAA

AAG

AGA

TGG

AGG

TAA

CTT

Tyr His /-15/

Asn

Glu

Leu

Val

Ser

XXX

Lys

Arg

Trp

Arg

XXX

Leu

ATG

GAT

AAC

AAT

CCG

AAC

ATC

AAT

GAA

TGC

ATT

CCT

TAT

AAT

45 TGT

Met /1/

Asp

Asn

Asn /4/

Pro

Asn

Ile

Asn

GLu

Cys

Ile

Pro

Tyr

Asn

Cys /15/

TTA

AGT

AAC

CCT

GAA

GTA

GAA

GTA

TTA

GGT

GGA

GAA

AGA

ATA

CAA

Leu

Ser

Asn

Pio

Glu

Val

Glu

Val

Leu

Gly

Glu

Arg

Ile

Glu

ACT

GGT

TAC

ACC

CCA

ATC

GAT

ATT

TCC

TTG

TCG

CTA

ACG

CAA

TTT

Thr

Gly

Tyr

Thr

Pro

Ile

Asp

Ile

Ser

Leu

Ser

Leu

Thr

Gln

Phe

CTT

TTG

AGT

GAA

TTT

GTT

CCC

GGT

GCT

GGA

TTT

GTG

TTA

/b/ GGA ĆTG

Leu

Ser

Glu

Phe

Val

Pro

Gly

Ala

Gly

Phe

Val

Leu

Gly

Leu /60/

77ΓΤ

GAT

ATA

TGG

GGA

ATT

TTT

GGT

CCC

TCT

CAA

TGG

GAC

GCA

Val

Asp

Ile

Trp

Gly

Ile

Phe

Gly

Pro

Ser

Gln

Trp

Asp

Ala

TTT

CTT

GTA

CAA

ATT

GAA

CAG

TTA

ATT

AAC

CAA

AGA

ATA

n- GAA

1 GAA

Phe

Leu

Val

Gln

Ile

Glu

Gln

Leu

Ile

Asn

Gln

Arg

Xle

Glu

/m-\/

	/c/	300
TTC GCT AGG AAC CAA GCC ATT	TCT AGA	TTA GAA GGA CTA AGC AAT
Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile	Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn /100/ /105/
CTT TAT CAA ATT TAC GCA GAA	TCT TTT	AGA GAG TGG GAA GCA GAT
Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu	Ser Phe	Arg Glu Trp Glu ALa Asp
CCT ACT AAT CCA GCA TTA AGA	GAA GAG	ATG CGT ATT CAA TTC AAT
Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu Uwagi: /a/ oznacza miejsce Bian HI /b/ oznacza niejsce Spe I /c/ oznacza miejsce Xba 1	Met Arg Ile Gln Phe Asn /135/

161 726

GAC

ATG

AAC

AGT GCC CTT

ACA

ACC

GCT

ATT

CCT

CTT

TTT

GCA

GTT

Asp

Mat

Aen

Ser Ala Leu /140/

Thr

Ala

li·

Pro

Leu

Phe

Ala

7al

CAA

ATT

TAT

CAA GTT CCT

CTT

TTA

TCA

GTA

TAT

GTT

CAA

GCT

495 GCA

Gin

Asn

Tyr

Gin Val Pro

Leu

Ser

Val

Tyr

Val

Gin

Ala

/165/

523

ATT

TTA

CAT

TTA

TCA

GTT

TTG

AGA

GAT

GTT

TCA

GTG

TTT

GGA CAA

Asn

Leu

His

Leu

Ser

Val

Leu

Arg

Asp

Val

Ser

Val

Phe

Gly Gin /180/

AGG

TGG

549 GGA

TTT

GAT

GCC

GCG

ACT

ATC

AAT

AGT

577 CGT TAT

AAT GAT

Arg

Trp

Gly

Phe

Asp

Ala

ALa

Thr

Ile

Asn

Ser

Arg

Tyr

Asn Asp /195/

TTA

ACT

AGG

CTT

ATT

GGC

606 AAC

TAT

n-343 ACA GAT CAT

GCT

624 GTA

CGC TGG

Leu

Thr

Arg

Leu

Ile

Gly

Asn

Tyr

Thr

Asp

His

Ala

Val

Arg Trp

/m-116/ /210/ /&/ 675

TAC

AAT

ACG

GGA

TTA

GAG

CGT

GTA

TOG

GGA

CCG

GAT

TĆT

AGA GAT

Tyr

Asn

Thr

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Trp

Gly

Pro

Aap

Ser

Arg Asp /225/

TGG

ATA

AGA

TAT

AAT

CAA

TTT

AGA

GAA

TTA

ACA

CTA

ACT GTA

Trp

11·

Arg

Tyr

Asn

Gin

Phe

Arg

Glu

Leu

Thr

Leu

Thr Val

TTA

GAT

ATC

GTT

TCT

CTA

TTT

CCG

AAC

TAT

GAT

AGT

AGA

ACG TAT

Leu

Asp

Ile

Val

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn

Tyr

Asp

Ser

Arg

Thr Tyr

/255/

CCA

ATT

CGA

ACA

GTT

TCC

CAA

TTA

ACA

AGA

GAA

ATT

TAT

ACA

AAC

Pro

Ile

Arg

Thr

Val

Ser

GLn

Leu

Thr

Arg

Glu

Ile

Tyr

Thr

Asn

CCA

GTA

TTA

GAA

AAT

TTT

GAT

GGT

AGT

TTT

CGA

GGC

TCG

GCT

CAG

Pro

Val

Leu

Glu

Asn

Phe

Asp

Gly

Ser

Phe

Arg

Gly

Ser

Ala

Gin

GGC

ATA

GAA

GGA

AGT

ATT

AGG

AGT

CCA

CAT

GGT

ATG

GAT

ATA

CTT

Gly

Ile

Glu

GLy

Ser

Ile

Arg

Ser

Pro

His

Leu

Met

Aap

Ile

Leu

AAC

AGT

ATA

ACC

ATC

TAT

ACG

GAT

GCT

CAT

AGA

GGA

GAA

TAT

Asn

Ser

Ile

Thr

He

Tyr

Thr

Asp

Ala

His

Arg

GLy

Glu

Tyr Tyr

TGG

TCA

GGG

CAT

CAA

ATA

ATG

GCT

TCT

CCT

GTA

GGG

TTT

TCG

GGG

Trp

Ser

Gly

His

GLn

Ile

Met

Ala

Ser

Pro

Val

Gly

Phe

Ser Gly

Uwaga: /d/ oznacza miejsce Xba I

CCA

GAA

TTC

ACT

TTT

CCG

161 726 CTA TAT GGA ACT

ATG

• GGA

AAT

GCA

29 , GCT

Pro

Glu

Phe

Thr

Phe

Pro

Leu

Tyr

Gly

Tir

Met

Gly

Asn

Ala

Ata

CCA

CAA

CGT

ATT

GTT

GCT

CAA

CTA

GGT

CAG

GGC

GTG

TAT

AGA

Pro

Gln

Arg

Ile

7al

Ais

Gln

Leu

Gly

Gln

Gly

7al

Tyr

Arg

ACA

TTA

TCG

TCC

ACT

TTA

TAT

AGA

CCT

TTT

AAT

ATA

GGG

ATA

Thr

Leu

Ser

Thr

Leu

Tyr

Arg

Pro

Phe

Asn

Ile

Gly

ile

AAT

CAA

CTA

TCT

GTT

CTT

GAC

GGG

ACA

GAA

TTT

ACT

TAT

Asn

Gln

Leu

Ser

7al

Leu

Asp

Gly

Thr

Glu

Phe

Ais

Tyr

GGA

ACC

TCC

TCA

AAT

TTG

CCA

TCC

GCT

GTA

TAC

AGA

AAA

AGC

GGA

Gly

Thr

Ser

Asn

Leu

Pro

Ser

Ais

Val

Tyr

Acg

Lys

Ser

Gly

ACG

GTA

GAT

TCG

CTG

GAT

GAA

ATA

CCG

CCA

CAG

AAT

AAC

AGC

GTG

Thr

7al

Αβρ

Ser

Leu

Asp

Glu

Ile

Pro

Gln

Asn

7al

CCA

CCT

AGG

CAA

GGA

TTT

AGT

CAT

CGA

TTA

AGC

CAT

GTT

TCA

ATG

Pro

Arg

Gln

Gly

Phe

Ser

His

Arg

Leu

Ser

His

val

Ser

Met

1350

TTG

CGT

TCA

GGC

TTT

AGT

AAT

AGT

GTA

AGT

ATA

AGA GCT

Phe

Arg

Ser

Gly

Phe

Ser

Asn

Ser

7sl

Ser

Ile

Arg Ala /450/

CCT

ATG

TTC

TCT

TGG

ATA

CAT

CGT

AGT

GCT

GAA

TTT

AAT

ATA

Pro

Met

Phe

Ser

Trp

Ile

His

Arg

Ser

Ala

Glu

Phe

Asn

Ile

ATT

CCT

TCA

CAA

ATT

ACA

CAA

ATA

CCT

TTA

ACA

AAA

TCT

ACT

Ile

Pro

Ser

Gln

Ile

Thr

Gln

Ile

Pro

Leu

Thr

Lya

Ser

Thr

AAT

CTT

GGC

TCT

GGA

ACT

TCT

GTC

GTT

AAA

GGA

CCA

GGA

TTT

ACA

Asn

Leu

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

7al

Lys

Gly

Pro

Gly

Phe

Thr

GGA

GAT

ATT

CTT

CGA

AGA

ACT

TCA

CCT

GGC

CAG

ATT

TCA

ACC

Gly

Αβρ

Ile

Leu

Arg

Thr

Ser

Pro

Gly

Gln

He

Ser

Thr

TTA

AGA

GTA

AAT

ATT

ACT

GCA

CCA

TTA

TCA

CAA

AGA

ΤχΑΓ

CGG

GTA

Leu

Arg

Va!

Asn

Ile

Thr

Ala

Pro

Leu

Ser

Gln

Arg

Tyr

Arg

7al

AGA

ATT

CGC

TAC

GCT

TCT

ACC

ACA

AAT

TTA

CAA

TTC

CAT

ACA

TCA

Arg

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ser

Thr

Asn

Leu

Gln

Phe

His

Thr

Ser

ATT

GAC

GGA

AGA

CCT

ATT

AAT

CAG

GGG

AAT

TTT

TCA

GCA

ACT

ATG

Ile

Asp

Gly

Arg

Pro

Ile

Asn

Gln

Gly

Asn

Phe

Ser

ALa

Thr

Met

AGT

GGG

AGT

AAT

TTA

CAG

TCC

GGA

AGC

TTT

AGG

ACT

GTA

GGT

Ser

Gly

Ser

Asn

Leu

Gln

Ser

Gly

Ser

Phe

Arg

Thr

7al

Gly

161 726

TTT	ACT	ACT	CCG	TTT	AAC	TTT
Phe	Thr	Thr	Pro	Phe	Asn	Phe
TTA	AGT	GCT	CAT	GTC	TTC	AAT
Leu	Ser	Ala	His	aal	Phe	Asn
CGA	ATT	GAA	TTT	ATT	CCG	GCA
Arg	Ile	Glu	Phe	aai	Pro	Ala
GAT	TTA	GAA	AGA	GCA	CAA	AAG
Asp	Leu	Glu	Arg	Ala	Gln	Lys
TCC	AAT	CAA	ATC	nnn Iaju	TTA	AAA
Ser	Asn	Gln	Ile	GLy	Leu	Lys
GAT	CAA	GTA	TCC	AAT	TTA	GTT
Asp	C-Ln	Val	Ser	Asn	Leu	aal
CTG	GAT	GAA	AAA	AA'	GAA	TTG
Leu	Asp	Glu	Lys	Lys	Glu	Leu
CGA	CTT	AGT	GAT	GAG	CGG	AAT
Arg	Leu	Ser	A3p	Glu	Arg	Asn
GGG	ATC	AAT	AGA	CAA	CTA	GAC
GLy	Ile	Asn	Arg	Gln	Leu	Asp
ATT	ACC	ATC	CAA	GGA	GGC	GAT
Ile	Thr	Ile	Gln	GLy	GLy	Asp

TCA AAT GGA 'TCA AGT GTA TTT ACG

Ser Asn G^T Ser Ser Val Phe Thr

TCA TGC AAT GGA GTT T.AGC ATA GAT

Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp /ę/

ACG CTA TTG GGT ACC TTT GAT
Thr	Leu Leu Gly /723/	Thr	Phe	Asp
CAA	AAA ATA GAT	GAG	TCG	AAA
Gln	Lys He Asp	Glu	Ser	Lys
TTA	AGA GGG TAT	ATC	GAA	GAT
Leu	Arg Gly Tyr	Ile	Glu	Asp
ATT	CGC TAC AAT	GCC	AAA	CAC
Ile	Arg Tyr Asn	Ala	Lys	His
GGT	TCC TTA TGG	CCG	CTT	TCA
Gly	Ser Leu Trp	Pro	Leu	Ser

GAA	GTA	ACC	TTT	GAG	GCA	CA'	TAT
Glu	aal Thr Phe /610/	Glu	Ala	Hu	Tyr
GCG	GTG	AAT	GAG	CTG	TTT	ACT	TCT
Ala	aal	ASN	GLu	Leu	Phe	Thr	Ser
ACA	GAT	GTG	ACG	GAT	TAT	CAT	ATT
Thr	Asp	Val	Thr	Asp	Tyr	H.s	Ile
GAG	TGT	TTA	TCT	GAT	GAA	TTT	TGT
Glu	Cys	Leu	Ser	Asp	GLu	Phe	Cys
TCC	GAG	AAA	GTC	AA'	CAT		AAG
Ser	Glu	Lys	aal	Lys	His	Ala	Lys
TTA	CTT	CAA	GAT	CC A	AAC	TTT	AGA
Leu	Leu	Gln	Asp	Pro	Asn	Phe	Arg
CGT	GGC	TGG	AGA	GGA	AGT	ACG	GAT
Arg	Gly	Trp	Arg	Gly	Ser	Thr	Asp
GAC	GTA	TTC	AAA	GAG	AAT	TAC	GTT
Asp	aal	Phe	Lys	Glu	Asn	Tyr	aal
GAG	TGC	TAT	CC A	ACG	TAT	TTA	TAT
GLu	Cys	Tyr	Pro	Thr	Tyr	Leu	Tyr

2250

TTA	AAA	GCC	TAT	ACC	CGT	TAC	CAA
Leu	Lys	Ala	Tyr	'Tir	Arg	Tyr Gln /750/
AGT	CAA	GAC	TTA	GAA	ATC	TAT	TTA
Ser	Gln	Asp	Leu	Glu	Ile	Tyr	Leu
GAA	ACA	GTA	AAT	GTG	CCA	GIT	ACG
Glu	Thr	Val	Asn	aai	Pro	Gly	Thr
GCC	CC A	AGT	CCA	ATC	GGA	AAA	TGT
Ala	Pro	Ser	Pro	Ile	Gly	Lys	Cys

Uwaga: /e/ oznacza miejsce Κρη I

161 726

GGA

GAA

CCG

AAT

CGA

. TGC

i gca

, CCA

. CAA

, CTT

' GAA

TGG AAT

' CCA GAT

Gly

Glu

Pro

Asn

Arg

Cys

Ala

Pro

Gln

Leu

Glu

Trp

Asn

Pro

> Asp

C-TAi

GAT ¹

TGT ¹

TCC

TGC

SGA

GAC

GGA

GAA

AAA '

TGT

GCG

GAT '

CAT

TCC

Leu

Asp

Cys

Ser

Cys

Arg

Asp

Gly Glu

Lys

Cys

Ala

H.s

His

Ser

CAT

gat

TTC

TCC

TTG

GAC

ATT

GAT

GTT

GGA

TGT

ACA

GAC

TTA

AAT

His

Hi 3

Phe

Ser

Leu

Asp

Ile

Asp

Val

Gly

Cya

Thr

Asp

Leu Aan /840/

GAG

GAC

TTA

GGT

GTA

TGG

GTG

ATA

TTC

AAG

ATT

AAG

ACG

CAA

GAT

Glu

Asp

Leu

GLy

Val

Trp

Val

Ile

Phe

Lya

Ile

Lya

Thr

Gln

Asp

GGC

CAT

GCA

AGA

CTA

GGA

AAT

CTA

GAA

TTT

CTC

gaa

GAG

AAA

CCA

Gly

His

Ala

Arg

Leu

GLy

Asn

Leu

Glu

Phe

Leu

Glu

Lya

Pro

TTA

GTA

GGA

GAA

GCA

CTA

GCT

CGT

GTG

AAA

AGA

GCG

GAG

AAA

Leu

Val

Gly

Glu

Ala

Leu

Ala

Arg

Val

Lys

Arg

ALa

Glu

Lya 1

Lys 2700

TGG

AGA

GAC

AAA

CGT

GAA

AAA

TTG

GAA

TGG

GAA

ACA

AAT

ATT

GTT

Trp

^'g

Asp

Lys

Arg

Glu

Lys

Leu

Glu

Trp

Glu

Thr

Aan

Ile Val /900/

TAT

AAA

GAG

GCA

AAA

GAA

TCT

GTA

GAT

GCT

TTA

TTT

GTA

AAC

TCT

Tyr

Lys

Glu

Ala

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

Ala

Leu

Phe

Val

Asn

Ser

CAA

TAT

GAT

AGA

TTA

CAA

GCG

GAT

ACC

AAC

ATC

GCG

ATG

ATT

CAT

Gln

Tyr

Asp

Arg

Leu

Gln

Ala

Asp

Thr

Asn

Ile

Ala

Met

Ile

Hia

GGG

GCA

GAT

AAA

CGC

GTT

CAT

AGC

ATT

GCA

GAA

GCT

TAT

CTG

CCT

Ala

Asp

Lys

Arg

Val

His

Ser

Ile

Arg

Glu

Ala

Tyr

Leu

Pro

GAG

CTG

TCT

GTG

ATT

CCG

GGT

GTC

AAT

GCG

GCT

ATT

TTT

GAA

Glu

Leu

Ser

Val

Ile

Pro

Gly

Val

Asn

Ala

Ile

Phe

Glu

TTA

GAA

GGG

CGT

ATT

TTC

ACT

GCA

TTC

TCC

CTA

TAT

GAT

GCG

AGA

Leu

Glu

Gly

Arg

Ile

Phe

Thr

Ala

Phe

Ser

Leu

Tyr

Asp

Ala

Arg

AAT

GTC

ATT

AAA

AAT

GGT

GAT

TTT

AAT

GGC

TTA

TCC

TGC

TGG

Asn

Val

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Phe

Asn

Gly

Leu

Ser

Cys

Trp

AAC

GTG

AAA

GGG

CAT

GTA

gat

GTA

GAA

CAA

AAC

CAC

CGT

Asn

Val

Lys

GLy

H.3

Val

Asp

Val

Glu

Gln

Asn

His

Arg

TCG

GTC

CTT

GTT

CCG

GAA

TGG

GM

GCA

GAA

GTG

TCA

CAA

GAA

Ser

Val

Leu

Val

Pro

Glu

Trp

Glu

Ala

GLu

Val

Ser

Gln

Glu

GTT

CGT

GTC

TGT

CCG

GGT

CGT

GGC

TAT

ATC

CTT

CGT

GTC

ACA

GCG

Val

Arg

Val

Cys

Pro

Gly

Arg

Gly

Tyr

Ile

Leu

Arg

Val

Tlhr

A.a

161 726

TAC

AAG

GAG

GGA

TAT

GGA

GAA

GGT

TGC

GTA

ACC

ATT

CAT

GAG ATC

Tyr

Lys

Glu

GLy

Tyr

Gly

Glu

Gly

Cya

Val

Thr

Ile

His

Glu He

/1050/

GAG

AAC

AAT

ACA

GAC

GAA

CTG

AAG

TTT

AGC

AAC

TGT

GTA

GAA GAG

Glu

Aan

Asn

Thr

Asp

Glu

Leu

Lys

Phe

Ser

Asn

Cya

Val

Glu Glu

3240

GAA

GTA

TAT

CCA

AAC

ACG

GTA

ACG

TGT

AAT

GAT

TAT

ACT

GCG

Glu

Val

Tyr

Pro

Asn

Thr

Val

Thr

Cya

Asn

Asp

Tyr

Thr Ala /1080/

ACT

CAA

GAA

TAT

GAG

GGT

ACG

TAC

ACT

TCT

CGT

AAT

CGA

GGA

Thr

Gin

Glu

Tyr

Glu

Gly

Thr

Tyr

Thr

Ser

Arg

Asn

Arg

Gly

TAT

GAC

GGA

GCT

TAT

GAA

AGC

AAT

TCT

GTA

CCA

GCT

GAT

TAT

Tyr

Asp

Gly

Ala

Glu

Ser

Asn

Ser

Val

Pro

Ala

Asp

Tyr

GCA

TCA

GCC

TAT

GAA

AAA

GCA

TAT

ACA

GAT

GGA

CGA

AGA

GAC

Ala

Ser

Ala

Tyr

Glu

GLu

Lya

Ala

Tyr

Thr

Asp

Gly

Arg

Asp

AAT

CCT

TGT

GAA

TCT

AAC

AGA

GGA

TAT

GGG

GAT

TAC

ACA

CCA

CTA

Asn

Pro

Cya

Glu

Ser

Asn

Arg

Gly

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Thr

Pro

Leu

CCA

GCT

GGC

TAT

GTG

ACA

AAA

CAA

TTA

GAG

TAC

TTC

CCA

GAA

ACC

Pro

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

Lya

Glu

Leu

Glu

Tyr

Phe

Pro

Glu

Thr

GAT

AAG

GTA

TGG

ATT

GAG

ATC

GGA

GAA

ACG

GAA

GGA

ACA

TTC

ATT

Asp

Lya

Val

Trp

Ile

Glu

Ile

Gly

Glu

Thr

Glu

Gly

Thr

Phe

Ile

/^1170/

GTG	GAT	AGC	GTG	GAA	TTA	CTC	CTT	ATG	GAG GAA TAG
Val	Asp	Ser	Val	GLu	Leu	Leu	Leu	Met	Glu Glu /1181/

161 726

Barn j£>~^p__tnr n, i i pB8r ł>

Fig. 2

161 726

Oligomer do podstawiania pozycji 116

5' Hind III 3'Mst II

AGCTTTAGAXXXTGGGAAGCAGATCCTACTA ATCCAGCCC AATCIXXXACCCTTCGTCTAGGATGATTAGGTCGGGATT

3* 5'

Fig. 3A

Oligomer do podstawiania pozycji 119

5' Hind III 3' Mst II

AGCTTTAGAGAGTGGGAAXXXGATCCTACTAATCCAGCCC

AATCTCT(CC^<CCCTTXXX(^T)AGGAT(T/\TT>A(TGT(2(GT(3ATT

3'

5'

Fig. 3B

161 726

Fig. 4

161 726

h ·Η· ϊ Ι· I III

177 292 336 375 416 534 589 667

Fig. 5

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena I0 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Srodek owadobójczy, znamienny tym, ze składa się z dopuszczalnego w rolnictwie nośnika i owadobójczo skutecznej ilości białka-endotoksyn>. toksycznego dla owadów, zawierającego sekwencję aminokwasów wykazującą zasadniczą homologię z sekwencją 116 aminokwasów zaczynającą się w pozycji m-1 i dochodzącą do pozycji m-116. według tablicy 10, przy czym w takiej homologicznej sekwencji numery pozycji przypisuje się niezależnie od występujących w niej delecji lub addycji, a sekwencja ta obejmuje jeden lub więcej następujących aminokwasów w podanych pozycjach odnoszących się do aminokwasów: a) w pozycji m-5 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Asn, b) w pozycji m-6 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Gin, c) w pozycji m-12 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Glu, d) w pozycji m-16 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Asn, e) w pozycji m-27 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Glu, f) w pozycji m-30 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Ala, g) w pozycji m-33 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Thr, h) w pozycji m-34 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Asn, i) w pozycji m-36 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Ala, j) w pozycji m-41 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Met, k) w pozycji m-95 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Phe, 1) w pozycji m-98 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Ala, m) w pozycji m-99 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Thr, n) w pozycji m-105 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Asn, oraz o) w pozycji m-112 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Gly.
2. Srodek według zastrz. 1, znamienny tym, ze homologia między częścią sekwencji aminokwasów i sekwencją 116 aminokwasów zaczynającą się w pozycji m-1 i rozciągającą się do pozycji m-116 według tabeli 10, wynosi co najmniej 70%.
3. Srodek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze w sekwencji występuje jeden lub więcej aminokwasów w podanych pozycjach odnoszących się do aminokwasów: a) w pozycji m-5 Lys, b) w pozycji m-6 Lys, c) w pozycji m-12 Lys, d) w pozycji m-16 Tyr, e) w pozycji m-27 Lys lub Arg, f) w pozycji m-30 Thr, g) w pozycji m-33 Ile, h) w pozycji m-34 Tyr, i) w pozycji m-36 Val, j) w pozycji m-41 Ile, k) w pozycji m-95 Ile, 1) w pozycji m-98 Thr, m) w pozycji m-99 Ser, n) w pozycji m-105 Lys oraz o) w pozycji m-112 Asp.
4. Srodek według zastrz. 3, znamienny tym, ze jeden lub dwa aminokwasy w pozycjach m-27 i m-30 są zmienione.
5. Srodek owadobójczy, znamienny tym, że składa się z dopuszczalnego w rolnictwie nośnika i owadobójczo skutecznej ilości białka-endotoksyny, wytworzonego przez DNA, kodujący to białko, który zawiera część kodującą sekwencję aminokwasów wykazującą zasadniczą homologię z sekwencją 116 aminokwasów zaczynającą się w pozycji m-1 i dochodzącą do pozycji m-116 według Tablicy 10, przy czym numery pozycji w takiej homologicznej sekwencji przypisuje się niezależnie od występujących w niej delecji lub addycji a DNA jest tak zmodyfikowany, ze koduje jeden lub więcej z następujących aminokwasów we wskazanych pozycjach, a) w pozycji m-5 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Asn, b) w pozycji m-6 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Gin, c) w pozycji m-12 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Glu, d) w pozycji m-16 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Asn, e) w pozycji m-27 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Glu, f) w pozycji m-30 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Ala, g) w pozycji m-33 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Thr, h) w pozycji m-34 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Asn, i) w pozycji m-36 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Ala,j) w pozycji m-41 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Met, k) w pozycji m-95 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Phe, 1) w pozycji m-98 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Ala, m) w pozycji m-99 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Thr, n) w pozycji m-105 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Asn oraz o) w pozycji m-112 dowolny naturalny aminokwas z wyjątkiem Gly.

161 726
6. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, ze homologia pomiędzy sekwencją aminokwasów kodowaną przez część DNA wymienionego genu strukturalnego i sekwencją 116 aminokwasów zaczynającą się w pozycji m-1 i dochodzącą do pozycji m-116, według tabeli 10, wynosi co najmniej 70%.
7. ^Śro^de^k wedłu^g zastrz. ⁵ atoo ⁶, znamtenny tym, ze DNA jest ta^k zmod^^owan^ ze ^ko^duje jeden lub więcej z następujących aminokwasów we wskazanych pozycjach: a) w pozycji m-5 Lys, b) w pozycji m-6 Lys,c) w pozycji m-12 Lys, d) w pozycji m-16 Tyr,e) w pozycji m-27 Lys, lub Arg, f) w pozycji m-30 Thr, g) w pozycji m-33 Ile, h) w pozycji m-34, Tyr, i) w pozycji m-36 Val, j) w pozycji m-41 Ile, k) w pozycji m-95 Ile, 1) w pozycji m-98 Thr, m) w pozycji m-99 Ser, n) w pozycji m-105 Lys oraz o) w pozycji m-112 Asp.

⁸. ^Środek we^dłu^g zastrz. ^7, znaimenny t^ym, ze D^NA ^jest tak zmodyfikowany że w^prowa^dza zmianę jednego lub obu aminokwasów w pozycjach m-27 i m-30.

⁹. ^Środe^k we^dłu^g zastrz. ⁵ albo albo ⁷ altio ⁸, znaimenny t^ym, że cz^ęść D^NA ^bez ^żadnej modyfikacji wymienionej w zastrz. 5-8, hybrydyzuje w ostrych warunkach hybrydyzacji z 348 nukleotydowym oligomerem o sekwencji nukleotydów przedstawionej w tabeli 10 zaczynającej się w pozycji n-1 i dochodzącej do pozycji n-348.

¹⁰. ^Środek wedłu^g zastrz. znamtenny ^tym, ze cz^ęść D^NA prze^d modyfikacj^ą okre^śloną w zastrz. 5-8 koduje sekwencję 116 aminokwasów, według tabeli 10, zaczynającą się w pozycji m-1 i dochodzącą do pozycji m-116.

Π. ^Środek we^dłu^g zastrz. ^10, znaimenny tym, ze D^NA ^koduj^ąc^y endotoks^yn^ę o^bejmuje D^NA kodujący sekwencję aminokwasów według tabeli 10 zaczynającą się od aminokwasu 1 i dochodzącą do aminokwasu 205.

¹². ^Środek owa^dob^ójcz^y, znamtenny ^że wraz z ^dopuszczalnym w roteictwie noróikiem zawiera owadobójczo skuteczną ilość endotoksyny wytworzonej przez DNA kodujący to białko, który zawiera część kodującą sekwencję aminokwasów wykazującą zasadniczą homologię z sekwencją 205 aminokwasów zaczynającą się w pozycji 1 i dochodzącą do 205 aminokwasu, według tabeli 10, w której w pozycji 4 znajduje się dowolny aminokwas z wyjątkiem Asn.

¹³. ^Środek wedłu^g zastrz. ^12, znamtenny tym, ze w ^pozycj^{i 4} znajduje s^ię Tyr.

* * ♦