<Desc/Clms Page number 1>
COMPOSES NOUVEAUX
Bacillus thuringiensis (mu.) est une bactérie sporulante qui produit une protéine cristalline, la delta-endotoxine (6-endotoxine) ä la fin du stade végétatif de la croissance. Cette endotoxine, par ingestion par certains insectes, produit des effets toxiques qui englobent la cessation de l'alimentation, le dérèglement gastro-intestinal, la déshydratation et aboutit à la mort. La 8-endotoxine est produite, généralement ä partir d'une source de plasmide, sous forme d'un précurseur inactif ou sous forme de protoxine ayant une masse moléculaire de 130 000-140 000 dal-
EMI1.1
tons [Calabrese, Canad, J. Microbiol. 26 (1980) 1006].
Le clivage protéolytique servant ä éliminer environ la moitié C-terminale et probablement plusieurs acides aminés ä l'extrémité N, se produit normalement dans l'intestin de l'insecte par suite de 11 action des protéases de l'intestin, et il est necessaire qu'il produise la toxine active d'une masse moleculaire de 65 000 ä 70 000d [Tyrell et coll., J.
Bacteriology 145 (1981) 1052].
Un grand nombre de sous-variétés de B. t. ont été identifiés. Bien que la plupart de celles-ci présentent une toxicité plus spécifique ou accrue aux insectes de l'ordre des lépidoptères, un nombre limité s'est régalement révélé etre toxique vis-a-vis des insectes d'autres classifications. Par exemple, B. t. israelensis est toxique vis-à-vis des larves de dipteres (moustiques et mouches noires) et deux autres sous-variétés qui revelent une toxicité vis-à- vis des larves de coléoptères ont été récemment identifiées [Hofte et coll., Nuc. Acid. Res. 15 (17) (1987) 7183].
Bien que de nombreux travaux aient été réalisés dans la production de toxines raccourcies et de gènes de structure codant pour celles-ci, il semble que l'on en sache moins ä propos de la capacité des 6-endotoxines de B. t. ä supporter des mutations ponctuelles dans la partie active ou toxique de la séquence d'endotoxine et sur l'effet de ces mutations
<Desc/Clms Page number 2>
sur l'activité des molécules de toxine.
Un but de la présente invention est de fournir de nouveaux mutants de la portion active des 6-endotoxines de B. t..
Un autre but de la présente invention est de fournir des mutations qui sont efficaces pour produire une activité analogue à l'endotoxine de B. t. ä la fois sous forme de 6- endotoxine tronquée et complète.
Un autre but de la présente invention est de fournir des mutations qui améliorent l'activité insecticide des structures de 6-endotoxine de B. t..
Selon la présente invention, on a, après avoir créé de façon aléatoire des mutations ponctuelles simples et multiples dans de nombreuses centaines de brins d'ADN codant pour une large section de la portion active d'une endotoxine de B. t. représentative, active comme insecticide contre les lépidoptères, isolé et produit par des techniques recombinantes plusieurs endotoxines de B. t. mutantes qui présentent l'activité insecticide caractéristique contre les lépido- pteres que possède la 6 endotoxine de B. t. de type sauvage.
De plus, ä ces points de mutation découverts, il est indiqué que les codons codant pour n'importe quel autre acide aminé naturel peuvent être remplacés pour produire une protéine d'endotoxine active. Un certain nombre des mutations aléatoires se sont également révélées produire un niveau superieur d'activité insecticide. Cette activité peut être démontrée, par exemple, dans l'étude de la noctuelle du tabac (Heliothis virescens) ou dans l'étude de Trichoplusia ni
EMI2.1
(arpenteuse du chou), comme il est decrit ci-dessous, et dans de nombreux cas cette augmentation a été tout ä fait remarquable en ce qu'elle réalisait une activité d'au moins deux ou plus de deux fois plus grande que celle de la structure de l'endotoxine parente.
Les mutations multiples (habitellement 2 ou 3 acides amines par brin d'ADN muté) ont également été évaluées individuellement et en différentes
<Desc/Clms Page number 3>
combinaisons pour identifier certaines mutations et combinaisons de celles-ci plus efficaces. Les mutations selon la présente invention, ä une exception près, se sont également avérées exister dans des sections de séquences d'acides aminés qui sont hautement conservées parmi une grande variété de 6-endotoxines de B. t. de type sauvage, ce qui indique donc la possibilité d'application générale des mutations fournies par l'invention ä une grande variété de structures d'endotoxine dans lesquelles ces zones conservées fournissent des endotoxines de B. t. insecticides.
Plus particulièrement, si l'on se réfère ä la séquence d'acides aminés et ä sa numérotation dans le tableau A cidessous (en commençant par la méthionine (MET), qui est en position numéro 1 et par l'extrémité N normale de l'endotoxine représentative active contre les lépidoptères indiquée sur le tableau A), on a découvert que la protéine d'endotoxine B. t., qui a autrement une activité insecticide contre les insectes lépidoptères ä la manière des endotoxines de B.
t. natives lorsqu'elle contient, dans la partie active, une séquence de résidu d'acides aminés, identique ou ayant une homologie substantielle avec celle indiquée sur le tableau A pour la séquence de résidu d'acides aminés 116 indiquée aux positions ä partir de la position 90 incluse et jusqu'à la position 205 incluse (également les positions d'acides amines m-1 ä m-116), peut comporter un ou plusieurs des résidus des acides aminés suivants aux positions homologues indiquées ou équivalentes (les numéros des positions m entre parenthèses étant une référence à ladite séquence de résidu d'acides aminés 116) : a) en position 94 (position m- 5 de ladite séquence d'acides aminés 116), n'importe quel acide aminé naturel pour laquelle code le code génétique, sauf Asn ;
b) en position 95 (position m-6 de ladite séquence d'acides aminés 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Gln ; c) en position 101 (position m-12 de ladite séquence d'acides aminés 116), n'importe quel acide
<Desc/Clms Page number 4>
aminé naturel de ce type, sauf Glu ; d) en position 105 (position m-16 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Asn e) en position 116 (m-27 de ladite sequence de residu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type sauf Glu ; f) en position 119 (position m-30 de ladite sequence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Ala ; g) en position 122 (position m-33 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Thr ;
h) en position 123 (position m-34 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide amine naturel de ce type, sauf Asn ; i) en position 125 (position m-36 de ladite sequence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Ala ; j) en position 130 (position m-41 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Met ; k) en position 184 (position m- 95 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Phe ; 1) en position 187 (position m-98 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide amine naturel de ce type, sauf Ala ; m) en position 188 (position m-99 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Thr ;
n) en position 194 (position m-105 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Asn ; et o) en position 201 (position m-112 de ladite sequence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Gly.
De plus, et en se référant de nouveau ä la séquence de résidu d'acides aminés numérotée indiquée sur le tableau A, l'invention inclut le changement dans l'acide aminé Asn ä la position d'acide aminé 4 en tout autre acide aminé naturel pour lequel code le code génétique.
En ce qui concerne les résidus d'acides aminés fournis par l'invention dans la séquence de résidu 116, on préfère, selon l'invention, que cette séquence soit caractérisée, en
<Desc/Clms Page number 5>
se référant de nouveau ä la séquence mature totale indiquée sur le tableau A (et également ä la séquence de residu 116), par un ou plusieurs des acides aminés suivants aux positions indiquées : a) Lys en position 94 (position 5 de la séquence de résidu 116) ; b) Lys en position 95 (position 6 de ladite séquence de résidu 116) ; c) Lys en position 101 (position 12 de ladite séquence de résidu 116) ; d) Tyr en position 105 (position 16 de ladite séquence de résidu 116) ; e) Lys ou Arg, de préférence Arg, en position 116 (position 27 de ladite séquence de résidu 116) ;
f) Thr en position 119 (position 30 de ladite séquence de résidu 116) ; g) Ile en position 122 (position 33 de ladite séquence de résidu 116) ; h) Tyr en position 123 (position 34 de ladite séquence de résidu 116) ; i) Val en position 125 (position 36 de ladite se- quence de résidu 116) ; j) Ile en position 130 (position 41 de ladite séquence de résidu 116) ; k) Ile en position 184 (position 95 de ladite séquence de résidu 116) ; 1) Thr en position 187 (position 98 de ladite séquence de résidu 116) ; m) Ser en position 188 (position 99 de ladite séquence de résidu 116) ; n) Lys en position 194 (position 105 de ladite séquence de résidu 116) ; et o) Asp en position 201 (position 112 de ladite séquence de résidu 116).
Lorsque le Asn en position d'acide aminé 4 est changé, il est de préférence changé en Tyr.
Le tableau A situé vers la fin de cette description présente une séquence de nucleotides et la séquence d'acides aminés deduite resultante relative ä la production de 5-en-
EMI5.1
dotoxine de B. t. dans la nature. A une exception près, la séquence de nucléotides a été obtenue ä partir d'un plasmide produisant de la 6-endotoxine trouvé dans B. t. wuhanensis.
En particulier, la totalité du gène de structure (codant en fait pour l'endotoxine elle-même) provient de B. t. wuhanensis et l'exception est que la séquence situee avant la methionine (Met) au début du gène de structure provient d'un gène produisant de 1'endotoxine decouvert dans B. t. kurstaki
<Desc/Clms Page number 6>
HD-l (que l'on appelle plasmide de la classe Hind III de 5, 3kb de HD-1), cette séquence amont contenant le site de liaison ribosomique natif (RBS) issu de ce plasmide produisant de l'endotoxine HD-1 de B. t. kurstaki. La séquence amont contenant le site de liaison ribosomique, telle qu'on la trouve dans B. t. wuhanensis, diffère peu de celle indiquée sur le tableau A pour kurstaki et les différences sont indiquées dans la suite.
Cependant, il faut garder présent ä l'esprit qu'à la fois la séquence de nucléotides et la séquence d'acides aminés dans les gènes de structure HD-1 de B. t. wuhanensis et dans B. t. kurstaki en question sont identiques ä partir du début de la sequence d'endotoxine, en passant par toute sa partie active, au moins jusqu'au site Kpn I indiqué au tableau A, ce site Kpn I étant dans la portion protoxine. Par conséquent, la partie de la toxine active résultant du clivage après l'ingestion par l'insecte
EMI6.1
sera la même pour les deux endotoxines HD-1 de B. t. wuhanen- sis et de B. t. kurstaki en question.
Sur le tableau A, les acides aminés pour la protéine d'endotoxine produits par suite de l'expression du gène de structure, sont numérotés positivement entre parenthèses de 1 à 1181 au-dessous de l'acide aminé. Ceux qui se trouvent dans la zone non traduite en amont du 1-Met sont numérotés négativement à l'envers ou vers l'amont (les signaux d'arrêt étant comptés comme étant une position d'acide amine). Les nucléotides dans le gène de structure sont numérotés (pas entre parentheses) au-dessus de la ligne dans laquelle ils apparaissent et le dernier chiffre du nombre se situe au-dessus du nucléotide auquel le nombre s'applique.
Les nucléotides dans la région non traduite qui contient le site de liaison ribosomique sont numérotés négativement ä l'envers ä partir du codon ATG d'initiation (pour le 1-Met). Dans les séquences numérotées indiquees ci-dessus, une portion de celles-ci est numérotée séparément ou sous-numérotée m-1 à m-116 pour les acides aminés et n-1 ä n-348 pour les nucléotides de ces
<Desc/Clms Page number 7>
acides aminés, pour indiquer plus particulièrement une région hautement conservée dans laquelle la plupart des mutations fournies par l'invention se sont révélées être situées.
Certains sites de restriction concernant la séquence de nucleotides dans le tableau A, sont indiqués par une ligne située au-dessus des nucléotides mis en jeu dans les sites de restriction, avec une désignation en renvoi du site particulier. La portion toxique de l'endotoxine représentée sur le tableau A, telle qu'elle est reconnue dans la technique, fait intervenir la séquence d'acides commençant ä la position d'acide aminé 1 (Met) et allant jusqu'à la position d'acide aminé 610 (Thr). Du fait de la séquence d'ADN totale représentée sur le tableau A, et afin de comprendre plus facilement la description suivante, on notera que l'ADN et les séquences d'acides aminés commençant par la portion non traduite par la ligne 1 du tableau A et s'étendant jusqu'au site Kpn I aux environs des positions d'acides amines 724- 725,
et de leurs portions, peuvent être considérés ici comme dérivant de B. t. kurstaki HD-1 (le plasmide de classe Hind III de 5, 3kb), et on s'y réfère ici de cette façon..
La figure 1 représente une carte des plasmides de travail généraux prAK et prAK-3 utilisés à divers stades ayant rapport avec l'invention et comprenant un ADN codant pour une endotoxine de B. t. tronquee, derivee de HD-1 de B. t. kurstaki et ayant une activité insecticide contre les 1épi- doptères.
La figure 2 represente une carte du plasmide pB8rII qui comprend un ADN codant pour une protéine d'endotoxine de B. t. tronquee de longueur légèrement plus grande que celle pour laquelle code prAK et dérivée également de HD-1 de B. t. kurstaki et ayant également une activité insecticide contre les lépidoptères.
Les figures 3a et 3b représentent deux brins d'ADN bicaténaires représentatifs qui peuvent etre synthétisés pour la mise en oeuvre de ce que l'on appelle des expériences de
<Desc/Clms Page number 8>
rotation du codon et qui sont également utiles pour introduire de façon commode les mutations souhaitées dans une se- quence d'ADN codant pour l'endotoxine de B.t.,
La figure 4 représente une carte du plasmide pBT210 qui comprend un ADN codant pour une endotoxine native complete issue de B. t. wuhanensis, cette endotoxine comportant une séquence d'acides aminés, dans sa portion active, identique ä celle de l'endotoxine issue de HD-1 de B. t. kurstaki pour laquelle codent prAK et pBSrII.
La figure 5 montre une carte abrégée du plasmide prAK-9 ainsi qu'un agrandissement d'une section éclatée de celuici, ledit prAK-9 étant autrement analogue en detail au plasmide prAK-3 et ladite section et lesdites sous-sections de celui-ci dans les plasmides parents étant commodément utiles pour mener des expériences de rotation du codon et introduire autrement des mutations telles que celles fournies par l'invention.
Le plasmide prAK a été déposé dans JM103 de E. coli aupres de l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, le 19 février 1988, et a reçu le nO de dé- pöt NRRL B-18329.
Le plasmide pB8rII a été déposé dans JM103 de E. coli auprès de l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, le 19 février 1988, et a reçu le nO da dé- pôt NRRL B-18331.
Le plasmide pBT210 a été déposé dans JM103 de E. coli auprès de l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, le 19 février 1988, et a reçu le n de dé- pôt NRRL B-18330.
Comme il est essentiellement indiqué, les mutations ponctuelles de l'invention peuvent etre appliquées ä des séquences de proteine d'endotoxine produites par des variétés et des sous-types de Bacillus thuringiensis, ces séquences ayant une activité insecticide contre les larves de lepido- pteres lorsqu'elles contiennent la séquence d'acides amines
<Desc/Clms Page number 9>
116 conservée indiquée ci-dessus ou une séquence qui est hautement homologue à celle-ci ou qui est essentiellement un équivalent de celle-ci, notamment les séquences d'endotoxine de protéine qui sont du type naturel complet ou essentiellement complet et celles qui sont tronquées par élimination de tout ou partie de la protoxine en aval ou d'une partie inactive de celle-ci,
et même celles qui peuvent être tronquées depuis l'extrémité C normale en amont en remontant jusqu'à la portion active de l'endotoxine. Comme il est déjà évi- dent, les endotoxines issues de B. t. kurstaki et de B. t. wuhanensis ont toutes deux une région conservée d'acides amines 116 identique et d'autres ont, ou on peut s'attendre ä ce qu'elles aient, la meme séquence d'acides amines 116 ou
EMI9.1
une séquence équivalente largement homogogue de celle-ci.
Par exemple, on sait déjà que les endotoxines issues de B. t. sotto, de HD-73 de B. t. kurstaki (souche) et de B. t. galle- riae produisent des endotoxines ayant la sequence d'acides aminés 116 identique, meme si certaines d'entre elles diffèrent au moins dans une certaine mesure, et dans certains cas de façon importante, ä la fois dans le restant de la portion toxique de l'endotoxine et dans la section de la protoxine.
D'autres, comme HD-1 de B. t. kurstaki Dipel (sous-souche du commerce) ont un changement d'acide amine dans la séquence d'acides amines 116 indiquée (m-59 est Leu pour lequel code TTG) et d'autres changements/deletions/additions dans d'autres portions de la séquence.
Celle-ci et d'autres dont on a trouve qu'elles avaient un seul changement ou des changements multiples, ä l'exception d'une homologie en acides aminés d'au moins environ 70% par rapport à ladite séquence d'acides aminés 116, peuvent comporter un ou plusieurs changements mutants de l'invention apportés aux acides aminés de celle-ci, qui correspondent de façon identique à l'acide aminé dans ladite séquence non mutee d'acides aminés 116, en particulier lorsque l'acide aminé à changer possède, sur chacun de ses cotes, 2 et de préférence 4 autres acides ami-
<Desc/Clms Page number 10>
nes qui correspondent aussi de façon identique à ceux de la séquence d'acides aminés 116.
On envisage aussi que les mutations de l'invention puissent etre apportees aux acides aminés correspondants dans des séries homologues qui contiennent essentiellement des délétions ou des additions telles que la sequence elle-meme soit plus courte ou plus longue que la séquence d'acides aminés 116 indiquée. Dans ces cas, la numérotation, telle qu'elle est employee dans la séquence d'acides aminés 116 de référence, sera conservée de telle manière que les délétions existant dans la séquence ä changer soient comptées comme étant réellement présentes et que les additions dans la séquences à changer ne soient simplement pas comptées. Par conséquent, on peut dire que l'attribution du positionnement des acides amines est rendu indépendante des délétions ou des additions dans une telle séquence homologue.
De préférence, les sequences d'acides aminés homologues dans lesquelles les changements mutants de l'invention peuvent être substitués sont celles pour lesquelles code l'ADN, en lequel l'ADN issu ou bien du brin (ou du double brin) sens ou anti-sens de l'ADN commençant ä la position n-1 et s'étendant jusqu'à la position n-348 dans le tableau A, s'hybridera dans des conditions d'hybridation rigoureuses lorsque la séquence homologue ä muter a ses acides aminés, qui correspondent ä ceux dans la séquence d'acides aminés 116 de référence, pour lesquels code le même codon que l'acide aminé correspondant dans la séquence de référence.
Les modes opératoires pour préparer une telle sonde d'hybridation marquee sont bien connus dans la technique. Les conditions d'hybridation rigoureuses sont celles dans lesquelles l'hybridation est effectuée à 600C dans un tampon de
EMI10.1
citrate salin 2, 5X (SSC), suivie simplement d'un ringage à 370C ä une concentration réduite en tampon pour ne pas affecter les hybridations qui ont lieu.
De préférence, les mutations sont faites dans des se-
<Desc/Clms Page number 11>
quences d'acides aminés qui ne possèdent pas plus de 1, 2 ou 3 différences d'acides aminés par rapport à ceux contenus dans la séquence de référence d'acides amines 116, mieux encore une sequence qui est identique ä la séquence de référence.
Il a déjà été indiqué clairement dans la technique que la séquence de référence d'acides aminés 116 peut former une
EMI11.1
portion de séquence de protéine endotoxine autrement essentiellement modifiées ou différentes qui ont une activité insecticide contre les larves de lépidoptères et d'autres modifications en dehors de la séquence de référence seront très certainement découvertes ä mesure que la connaissance dans la technique s'étend.
Par conséquent, les séquences bordant la portion de séquence mutée requise, qui est analogue ä la portion de référence d'acides aminés 116, peut varier dans une mesure considerable et n'a besoin que d'être suffisante pour fournir une protéine endotoxine ä activité insecticide, par exemple comme celle mise en évidence par l'activité insecticide contre la noctuelle du tabac.
Ainsi, la séquence d'acides amines en amont de la portion mutée peut etre raccourcie ou rallongee ou elle-même mutée par rapport ä la séquence représentée sur le tableau A, mais commencera généralement avec la méthionine et est de préférence hautement homologue (70%) ou identique ä celle indiguée sur le tableau A, bien qu'il soit évident qu'une telle séquence peut éventuellement aussi contenir le mutant préféré en position 4, comme le fournit aussi l'invention.
De même, la portion en aval de la portion de séquence mutée recherchée peut varier largement et être raccourcie ou rallongée par rapport au reste de celle-ci représentée sur le tableau A jusqu'à son point de clivage dans l'intestin de l'insecte, et peut bien entendu ou non etre davantage eten- due pour former une portion protoxine ou une portion inactive soumise à un clivage dans l'intestin de l'insecte pour fournir une toxine de protéine ä activite insecticide.
<Desc/Clms Page number 12>
Un ADN comprenant des sequences codant pour des endotoxines mutantes, telles que celles fournies par l'inven- tion, sera incorpore sous le controle de séquences régulatrices appropriées dans des plasmides pour former des vecteurs d'expression qui seront transformés ou transfectés dans des cellules pour produire l'endotoxine. La production d'endotoxines par de telles techniques biotechnologiques recombinantes, contrairement, par exemple, ä la production de medicaments par ces techniques, fait intervenir peu ou pas d'opérations conçues pour purifier l'endotoxine.
Les cellules dans lesquelles elle est produite peuvent être lysées, mais il est caractéristique, dans la production commerciale des endotoxines de B. t. dans le passe, d'employer simplement la totalité du contenu du système de culture ou de fermentation utilisé dans la production de produit final, habituellement après séchage par des moyens classiques, comme séchage par atomisation ä basse température, tel qu'on le connalt dans la technique.
Suivant le produit, on peut ajouter différentes matières pour améliorer la stabilite du produit, comme il est connu également, et on peut indépendam- ment mélanger au produit des matières protéinées, si elles ne sont pas présentes en quantités adéquates dans le Systeme de fermentation, pour améliorer la stabilité, comme il est connu également, par exemple de la poudre de soja ou de la poudre de soja dégraissée.
Tandis que les endotoxines peuvent etre produites par voie biotechnique dans une variété de systemes cellulaires transformés ou transfectés, on préfère généralement transformer ou transfecter des cellules bactériennes du type Gram-négatif ou Gram-positif. Un type préféré de bactérie Gram-négative est E. coli, avec laquelle une quantité considérable d'expériences en biotechnologie ont été réalisées et pour laquelle une grande variété de systèmes de plasmides convenables et opérationnels et de vecteurs d'expression de transfert sont connus et disponibles. Pseudomonas fluores-
<Desc/Clms Page number 13>
cens représente un autre type de bactérie Gram-negative dans laquelle des plasmides portant des séquences d'endotoxine ont été incorporés.
Comme il est démontré ici, les gènes produisant l'endotoxine peuvent inclure des séquences régu- latrices, comme particulièrement des séquences de sites de liaison ribosomique qui ont leur origine dans B. t. lors- qu'elles sont incorporées pour l'expression dans des cel- lules bactériennes essentiellement hétérologues, comme E. coli. Comme les bactéries de type Bacillus fournissent un environnement plus étroitement natif des endotoxines mu- tantes de l'invention, il est particulièrement inclus dans le cadre de cette invention et envisagé par celle-ci de transformer ou de transfecter des bactéries de type Bacillus avec des vecteurs d'expression comprenant l'ADN codant pour les endotoxines mutantes de cette invention.
Des exemples illustratifs de ces cellules de Bacillus présentant un inté- rêt particulier sont les cellules de B. t., les cellules de
B. cereus et les cellules de B. subtilis. Un mode opératoire grandement amélioré pour transformer les cellules de Bacil- lus, en particulier les cellules de B. t., a récemment été découvert et est décrit dans la demande de brevet britan- nique conjointe 8 729 726. Les types de cellule convenant pour la transformation par le procédé englobent les types "cry minus", comme les cellules connues cry B de B. t. kurs- taki qui ne possèdent pas de plasmides et les cellules de
Bacillus de type sauvage comme les cellules de B. t. natives qui portent des plasmides produisant de l'endotoxine.
Les plasmides convenant po ur être incorporés dans les cellules de Bacillus, comme les cellules de B. t., sont connues, par exemple le plasmide pBC16. 1 (Kreft et coll., Molec. Gen. Ge- net. [1978] 162 59) et ses plasmides parents qui peuvent être utilises ou modifiés au moyen des techniques recombi- nantes classiques servant ä porter les sequences codant pour l'endotoxine mutante de l'invention. Comme il est bien connu dans la technique, les cellules de Bacillus produisent de
<Desc/Clms Page number 14>
façon caractéristique de l'endotoxine en quantités souhaitées seulement ä leur stade de la sporulation et sont donc cultivées jusqu'à ce stade afin de permettre d'obtenir le mieux les produits utiles comme insecticides.
Par conséquent, les plasmides ou les vecteurs d'expression fournis par l'invention et portant l'ADN pour les endotoxines mutantes peuvent être incorpores dans des cellules de Bacillus qui sont dénuées de plasmides produisant de l'endotoxine ou bien qui contiennent déjà un ou plusieurs de ces plasmides.
Alors que les endotoxines mutantes de l'invention auront de façon caractéristique une activité contre les lépidoptères, elles pourront également posséder une activité contre d'autres classes d'insectes existant, dans l'endotoxine parente, avant la mutation ou par suite d'autres changements permis dans la séquence, et en tous cas il fait partie du cadre de l'invention de transformer des cellules de Bacillus avec les plasmides de l'invention produisant de l'endotoxine toxique pour les lépidoptères lorsque ces cellules portent des plasmides pour les endotoxines qui ne sont pratiquement pas efficaces contre les lépidoptères, afin de produire à la sporulation des endotoxines se combinant pour fournir des éventails plus larges d'activité insecticide.
Par exemple, les plasmides portant les séquences d'ADN codant pour les endotoxines mutées peuvent etre utilisés pour transformer
EMI14.1
B. t. israeliensis ou B. t. tenebrionis, qui, individuellement, ne sont pratiquement pas efficaces contre les lépido- ptères.
Bien que la presente invention ait été démontrée ä la fois par référence ä des protéines endotoxines de type tronque et de type natif complet, on préfère généralement, lorsqu'on utilise les endotoxines mutantes directement comme insecticides, comme il est décrit ci-dessus, employer ou produire des séquences complètes qui sont identiques ou qui imitent le type natif au moins en termes d'opportunité pour réaliser une aptitude de pliage de la protéine endotoxine
<Desc/Clms Page number 15>
analogue ä celle de son aptitude native, ou un effet de pliage complet amélioré.
Les séquences d'ADN mutantes selon la présente invention peuvent également etre insérées dans le génome d'un vé- getal. Dans ces cas, on préfère employer les séquences mutees du type tronqué, bien que les séquences completes conviennent aussi. Tout procédé convenable peut etre avantageusement employe pour cette incorporation des séquences d'endotoxine dans un genome de végéta1 hôte, comme, par exemple, par l'intermédiaire du plasmide Ti de Agrobacterium tumefaciens, par é1ectroporation, électrotransformation, microinjection, transfection virale ou au moyen de produits chimiques qui induisent ou qui augmentent l'absorption d'ADN libre, et analogue. Ces procédés et leur utilisation dans la transformation des végétaux sont bien connus de l'homme de métier.
De préférence, la séquence d'ADN codant pour l'endotoxine mutante sera associée aux séquences régulatrices appropriées, comme, par exemple, les séquences opérateur et régulatrice 3'qui sont fonctionnelles chez les végétaux, et la totalité sera incorporée dans un vecteur de type expression. Une telle transformation de cellules végétales, suivie de la régénération du développement des cellules en végétaux entiers, permet à la séquence d'ADN d'en-dotoxine mutante de devenir une partie stable et permanente du génome du végétal, comme celle qui passe d'une génération ä la suivante par mitose et méiose et qui, par expression, conduit ä une proteine toxique pour les insectes, en procurant au végétal une résistance aux insectes pouvant etre héritée.
On a utilisé dans nos travaux deux vecteurs très semblables (prAK et prAK-3) comme source de séquence de 8-kendo- toxine de B. t. pour la mutation et aussi pour fournir des véhicules pour la production et l'évaluation des mutants d'endotoxine de B. t.. Les plasmides prAK et prAK-3 sont représentés sur la figure 1 par l'illustration des détails pertinents de prAK et indication de la variation mineure qui
<Desc/Clms Page number 16>
EMI16.1
existe entre prAK-3 et prAK. En fait, les plasmides prAK et prAK-3 sont des vecteurs d'expression entièrement compétents pour E. coli et chacun inclut un gène de résistance ä l'am- picilline, une origine de réplication et des séquences opé- rateurs, comprenant un promoteur de E. coli.
Comme il est indique sur la figure 1, en traits noirs épais et en cases noires, le vecteur prAK inclut, dans la phase de lecture adéquate, une coordination avec le promoteur d'une séquence d'ADN que l'on trouve dans la souche HD-1 de B. t. kurstaki de type sauvage. Le trait noir épais représente la séquence mature qui a été raccourcie pour coder pour une 5-endotoxine de B. t. native tronquée s'étendant depuis l'acide aminé en position 1 (Met) jusqu'à la position 610 (Thr) dans le tableau A et s'étendant ensuite dans la portion protoxine pour se terminer par 1'acide aminé 723 (Leu).
A 1'extrémité aval de ce trait noir epais, une petite section représentée par une case epaisse ouverte sur la figure 1, représente une se- quence d'ADN courte de 54 paires de bases qui suit le triplet de paires de bases codant pour Leu-723 et qui est elle- meme immédiatement suivie d'un signal d'arret. Cette séquence s'étendant au total sur 57 paires de bases (y compris le signal d'arrêt) prend son origine dans le plasmide pBR322 bien connu qui a été utilisé dans la construction de prAK.
Par conséquent, le vecteur d'expression prAK code pour, et produit dans E. coli, essentiellement une protéine de fusion 5-endotoxine de B. t. tronquee ayant un total de 741 acides amines et composée des 610 acides aminés de la section protoxine native et de 18 acides aminés ayant leur origine dans pBR322. Cette protéine de fusion endotoxine de B. t. a un niveau eleve d'activité insecticide et a été utilisée dans le but d'évaluer les mutants de celle-ci produits dans nos travaux. Cette activité ne se distingue essentiellement pas de celle d'une protéine 6-endotoxine de B. t. entierement tron- queue ne possédant que les 610 acides amines de la toxine ac- tivée (acides aminés 1 ä 610 sur le tableau A).
<Desc/Clms Page number 17>
Le trait noir épais représentant la plupart de la se- quence codant pour la protéine de fusion endotoxine de B. t. tronquée est relié, à son extrémité amont sur la figure 1, ä une case noire épaisse representant une sequence qui inclut un site de liaison ribosomique (RBS) de Bt. Cette section (représentée aussi sur le tableau A, lignes 1 et 2), qui contient le RBS, possède environ 47 nucleotides avant de commencer ä son extrémité amont avec un site Bam HI (inséré dans les plasmides antérieurs pour lier la section avec la section promoteur de E. coli, indiquée par une flèche sur la figure 1). La section promoteur et la section RBS sont disposées et reliées pour etre en bonne coordination de phase de lecture avec la séquence codant pour l'endotoxine.
Par conséquent, les traits et les cases noirs épais représentent ensemble un ADN ayant son origine dans HD-1 de B. t. kurstaki.
Divers autres sites de restriction indiqués sur la figure 1 concernaient la stratégie de l'elimination et de la réinsertion classiques de sections d'ADN pour des expé- riences de mutation. Ces autres sites de restriction sont le site Nsi I (qui ne commence environ qu'au bout de 26 nucleotides ä partir du début de la séquence de codage de l'endotoxine), les deux sites Xba I (voir ci-dessous, toutefois, en ce qui concerne prAK-3), le site Sst I et le site Hind III.
Comme on l'a indique ci-dessus, prAK-3 ne diffère de prAK que sous un seul aspect mineur. Cette différence est que le site Xpa I (TCT AGA) aux positions des nucleotides 292 ä 297 du tableau A a été changé ä l'aide de techniques standards en TCG CGA, définissant ainsi un site Nru I. Aucun changement de la séquence d'acides amines codée n'a résulté de ce changement. La preparation de prAK-3 est décrite dans l'étape a) de l'exemple 1 ci-dessous. prAK-3 est également le premier intermédiaire de la preparation des autres plasmides prAK-7 et prAK-9.
<Desc/Clms Page number 18>
Des sections d'ADN, dérivées de différentes longueurs de sections d'ADN monoeaténaires issues de prAK et de prAK-3 (à la fois les brins sens et anti-sens) mutées d'une manière classique, comme décrite, par exemple, par Craick dans Bio-
EMI18.1
techniques, janvier/février 1985, pages 12-19 ;"Use of Oli- gonucleotides for Site-Specific Mutagenesis" (Utilisation des o1igonueléotides pour la mutagénèse spécifique aux sites), sont indiquees ici, pour des raisons de commodité, sous les noms de M-1 et M-2, M-l définissant la section de 375 paires de bases entre les deux sites Xba I dans prAK et M-2 étant la section entre les sites Bam HI et Xba I dans prAK-3 (comme l'indique la figure 1).
La mutation trouvée entre les deux sites Xba I selon l'invention peut facilement être obtenue au moyen des plasmides prAK-7, prAK-8 ou prKA-9 décrits ici et des oligonu- cleotides bicaténaires de synthèse construits et utilisés de façon analogue aux modes opératoires décrits dans l'exemple 2 ci-dessous.
Après la mutation, les parties monoeaténaires mutées sont rendues bicaténaires par des moyens classiques. Dans le cas des mutants M-l, utilisant prAK comme véhicule de la mutation, les plasmides mutés bicaténaires résultants ont été transformés en JM103 de E. coli, déposés sur de la gélose YT contenant 50 ug/ml d'ampicilline et incubes pendant une nuit pour donner une pluralité de colonies avec une variété de mutations différentes dans les plasmides identiques ä prKA, à l'exception des mutations.
Dans le cas des mutants M-2, la région bicaténaire mutée entre les sites Bam HI et Xba 1 dans les véhicules de la mutation a été excisée respectivement ä l'aide des endo- nueléases de restriction Bam HI et Xba I et ligaturée dans des vecteurs prKA-3 digérés avec les deux memes enzymes. Les plasmides prAK-3 contenant la région mutante M-2 résultante ont été transformés dans JM103 de E. coli, placés sur de la gelose YT avec 50 ug/ml d'ampicilline et incubés pendant une
<Desc/Clms Page number 19>
nuit pour donner une autre pluralité de colonies faisant intervenir une variété de mutations différentes.
On a réalisé des essais pour démontrer l'activité des séquences d'endotoxine mutagènes, exprimées ä partir d'un ADN contenu, par exemple, dans JM103 de E. coli ou dans SG4044 de E. coli (disponible publiquement aupres de l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, sous le numéro de depot B-15969) ou bien dans l'étude de la noctuelle du tabac (NT), ou bien dans l'étude de T. ni, ou dans les deux, comme le décrit l'exemple A ci-dessous. L'ADN des mutants présentant une activité accrue par rapport ä l'endotoxine non mutante standard a été sequence dans les zones de mutation applicables pour déterminer la mutation dans l'ADN et donc la séquence de la protéine.
Plus de 6000 colonies différenties avec des plasmides contenant soit des sections mutagènes M-l soit des sections mutagènes M-2 ont été ainsi évaluées et, d'une façon generale, on a constaté que de 1 ä 3 changements d'acides aminés avaient eu lieu dans chaque expérience de mutation.
Le tableau B ci-dessous identifie les mutants ascendants récupérés directement par suite des expériences de mutation, la position de l'acide aminé par rapport aux numeros de position attribués dans le tableau A à laquelle a eu lieu chaque mutation, chaque codon muté dans chaque mutant et le changement d'acide aminé resultant à la position indiquée par suite du changement de codon.
Dans le tableau B, les numéros des positions des acides aminés moins ou négatifs indiquent des changements entre le site Bam HI et la position Met numéro 1 au début de la séquence d'endotoxine, ces changements n'affectant donc pas la séquence de l'endotoxine pour laquelle code la séquence mutante.
Les mutants identifiés dans le tableau B ci-dessous ont été évalués dans les trois phases de l'étude de la NT en produisant les résultats indiqués ci-dessous dans le tableau
<Desc/Clms Page number 20>
B-1. Certains de ces mutants ont également été évalués dans l'étude de T. ni, dont les résultats sont illustrés ci-dessous sur le tableau B-2.
TABLEAU B
EMI20.1
<tb>
<tb> SECTION <SEP> POSITION <SEP> CHANGEMENT <SEP> DE <SEP> LA <SEP> ZONE
<tb> DE <SEP> MUTA-DE <SEP> L'ACIDE <SEP> D'ENDOTOXINE
<tb> TION <SEP> MUTANT <SEP> AMINE <SEP> ACIDE <SEP> NUCLEIQUE <SEP> ACIDE <SEP> AMINE
<tb> M-1 <SEP> p26-3 <SEP> 119 <SEP> GCA <SEP> à <SEP> ACA <SEP> Ala <SEP> à <SEP> Thr
<tb> 130 <SEP> ATG <SEP> à <SEP> ATA <SEP> Met <SEP> à <SEP> Ile
<tb> 201.
<SEP> GGC <SEP> à <SEP> GAC <SEP> Gly <SEP> à <SEP> Asp
<tb> M-1 <SEP> p48a14 <SEP> 101 <SEP> GAA <SEP> à <SEP> AAA <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys
<tb> 116 <SEP> GAG <SEP> ä <SEP> AAG <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys
<tb> 217 <SEP> CGT <SEP> ä <SEP> CAT <SEP> Arg <SEP> à <SEP> Mis
<tb> M-1 <SEP> p48c5 <SEP> 116 <SEP> GAG <SEP> à <SEP> AAG <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys
<tb> 187 <SEP> GCG <SEP> à <SEP> ACG <SEP> Ala <SEP> à <SEP> Thr
<tb> M-1 <SEP> p36a65 <SEP> 122 <SEP> ACT <SEP> à <SEP> ATT <SEP> Thr <SEP> à <SEP> Ile
<tb> 125 <SEP> GCA <SEP> à <SEP> GTA <SEP> Ala <SEP> à <SEP> Val
<tb> M-2 <SEP> p95a76 <SEP> 123 <SEP> AAT <SEP> à <SEP> TAT <SEP> Asn <SEP> à <SEP> Tyr
<tb> M-2 <SEP> p95a86 <SEP> 188 <SEP> ACT <SEP> à <SEP> TCT <SEP> Thr <SEP> à <SEP> Ser
<tb> M-2 <SEP> p98cl <SEP> 188 <SEP> ACT <SEP> à <SEP> TCT <SEP> Thr <SEP> à <SEP> Ser
<tb> K-2 <SEP> p99c62 <SEP>
204 <SEP> ACA <SEP> à <SEP> ACT <SEP> Thr <SEP> à <SEP> Thr
<tb> 105 <SEP> AAT <SEP> à <SEP> TAT <SEP> Asn <SEP> à <SEP> Tyr
<tb> 4 <SEP> AAT <SEP> à <SEP> TAT <SEP> Asn <SEP> ä <SEP> Tyr
<tb> M-2 <SEP> pl07c22 <SEP> 194 <SEP> AAT <SEP> à <SEP> AAA <SEP> Asn <SEP> à <SEP> Lys
<tb> 94 <SEP> AAC <SEP> à <SEP> AAA <SEP> Asn <SEP> à <SEP> Lys
<tb> M-2 <SEP> p107c25 <SEP> 184 <SEP> TTT <SEP> à <SEP> ATT <SEP> Phe <SEP> à <SEP> Ile
<tb> - <SEP> 11 <SEP> TTG <SEP> à <SEP> TAG <SEP> ----M-2 <SEP> p114a30 <SEP> 95 <SEP> CAA <SEP> à <SEP> AAA <SEP> Gln <SEP> à <SEP> Lys
<tb> - <SEP> 15 <SEP> TAT <SEP> à <SEP> TAA <SEP> -----
<tb>
Dans le tableau B-1 ci-dessous, le score le plus faible dans la colonne de toxicité indique le plus haut niveau d'activité (voir l'exemple A pour l'explication des scores de toxicité)
et les témoins ont impliqué une quantité équivalente de cellules JM103 de E. coli et de cellules SG4044 de E. coli n'ayant pas été transformées par un plasmide
<Desc/Clms Page number 21>
quelconque. On note que tous les mutants ont été indiqués comme étant substantiellement plus actifs que l'endotoxine native tronquée produite par une quantité äquivalente de ces cellules contenant le plasmide prAK.
TABLEAU B-1
EMI21.1
<tb>
<tb> MUTANT <SEP> AVEC <SEP> REFERENCE <SEP> SCORE <SEP> DE <SEP> TOXICITE
<tb> AU <SEP> TABLEAU <SEP> B <SEP> TOXICITE <SEP> MOYENNE
<tb> p26-3 <SEP> 2,75
<tb> p48a14 <SEP> 2, <SEP> 25
<tb> p48cS <SEP> 2,63
<tb> p36a65 <SEP> 1, <SEP> 50
<tb> p95a76 <SEP> 2, <SEP> 50
<tb> p95a86 <SEP> 1, <SEP> 30
<tb> p98cl <SEP> 1,33
<tb> p99c62 <SEP> 1, <SEP> 83
<tb> p107c22 <SEP> 1,42
<tb> p114a30 <SEP> 2, <SEP> 00
<tb> témoin <SEP> (cellules <SEP> JM103) <SEP> 4, <SEP> 68
<tb> prAK <SEP> 3,35
<tb> temoin. <SEP> (cellules <SEP> SG4044) <SEP> 4, <SEP> 12
<tb>
TABLEAU B-2
EMI21.2
<tb>
<tb> MUTANT.
<SEP> AVEC <SEP> REFERENCE <SEP> PUISSANCE
<tb> AU <SEP> TABLEAU <SEP> B <SEP> RELATIVE
<tb> p26-3 <SEP> 217
<tb> p36A65 <SEP> 887
<tb> p95a76 <SEP> 291
<tb> p107c22 <SEP> 357
<tb> p1l4a30 <SEP> 239
<tb> tenon <SEP> (SAN415) <SEP> 59
<tb> pBT301 <SEP> 100
<tb>
Sur le tableau B-2 ci-dessus, on attribue ä l'étalon pBT301 une puissance relative de 100, selon la DL50 (pour une description plus détaillée, voir l'exemple A), et ainsi toute valeur de puissance relative superieure ä celle-ci indique un niveau accru de toxicite provoquée par la mutation.
<Desc/Clms Page number 22>
Dans des travaux supplémentaires, destinés ä étendre l'invention, on a analysé certains des ADN mutants indiqués sur le tableau B ci-dessus comme impliquant des mutations multiples pour déterminer l'effet de mutations individuelles et de paires de mutations dans ces sections mutées multiples. Ce sous-clonage de mutations individuelles ou de paires de mutation a été réalisé au moyen d'une stratégie mettant en jeu l'isolement d'un fragment muté multiple cible, puis sa coupure au site de restriction interne du fragment et situé entre deux des codons mutés. Les deux moities ou segments de fragment ont été ensuite isolés sur gel et chacun a été mélangé avec les moitiés ou segments de fragment complémentaires non mutants obtenus par coupure analogue des mêmes fragments ä partir de prAK.
Le vecteur prAK qui a été coupé pour isoler le fragment complémentaire plus grand a été ensuite mélangé avec les deux moitiés complémentaires mélangées et les trois segments d'ADN ligaturés ensemble pour former un plasmide prAK modifié contenant la ou les mutations ponctuelles existant dans la moitié de fragment ayant son origine dans le clone mutant multiple.
Plus particulierement, un site pour l'endonucléase de restriction Xho 11 a été situé de façon stratégique dans certains segments mutants multiples de manière ä permettre l'isolement de fragments comportant moins que le nombre total de mutations dans le segment mutant total. Comme il ap-
EMI22.1
paralt ä l'evidence, l'utilisation de l'endonucléase Xho II a été applicable ä un certain nombre des segments mutants multiples du tableau B pour permettre d'obtenir des frag- ments ayant une seule mutation ponctuelle et d'autres avec deux mutations. Par consequent, les plasmides mutants multiples ont été d'abord traités avec les endonucleases de restriction Nsi I et Sst I et les fragments de 1430 paires de bases resultants séparees par isolement sur gel.
Chacun de ces fragments de 1430 bp a ensuite été traité avec l'endonucléase de restriction Xho II et les fragments résultants
<Desc/Clms Page number 23>
de 330 bp (Nsi I/Xho II) et de 1100 bp (Xho 11/Sst I) ont été isolés sur gel pour chaque mutant multiple. Les fragments non mutants de la contrepartie, de 330 et de 1100 bp, et le fragment de prAK plus grand, Nsi I/Sst I de 4kb environ, ont été obtenus de manière analogue.
Plus particulierement, de petites quantités du segment plus grand ont été mélangées avec le fragment de 330 bp muté et le fragment de 1100 bp de prAK non mute et le mélange résultant a. été ligaturé pour former une série de plasmides de prAK mutants hybrides. D'une manière analogue, des quantités de ces segments de prAK plus grands ont été mélangées avec les fragments de prAK de 300 bp non mutes et les fragments de 1100 bp mutants, et ces ADN ligaturés pour former une autre série de plasmides mutants hybrides. Les plasmides mutants hybrides ou les clones résultant de la stratégie indiquée cidessus sont résumés ci-dessous dans le tableau C qui donne les trois segments combines et les mutations dans le plasmide résultant comparé au plasmide prAK.
TABLEAU C
EMI23.1
<tb>
<tb> DESIGNATION <SEP> SEGMENT <SEP> SOURCE <SEP> DU <SEP> SOURCE <SEP> DU <SEP> POSITION
<tb> DU <SEP> prAK <SEP> NOU-DE <SEP> SEGMENT <SEP> SEGMENT <SEP> DE <SEP> L'ACIDE
<tb> VELLEMENT <SEP> VECTEUR <SEP> NsiI/XhoII <SEP> XhoII/SstI <SEP> AMINE <SEP> DE
<tb> FORME <SEP> ET <SEP> SOURCE <SEP> DE <SEP> 330 <SEP> bp <SEP> DE <SEP> 1100 <SEP> bp <SEP> MUTATION
<tb> A <SEP> prAK <SEP> NsiI/SstI <SEP> p48a14 <SEP> prAK <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 101
<tb> 4 <SEP> Kb <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 116
<tb> B"p26-3 <SEP> prAK <SEP> Ala <SEP> à. <SEP> Thr <SEP> en <SEP> 119
<tb> C"p48e5 <SEP> prAK <SEP> Glu <SEP> à.
<SEP> Lys <SEP> en <SEP> 116
<tb> D <SEP> " <SEP> prAK <SEP> p48a14 <SEP> Arg <SEP> à <SEP> His <SEP> en <SEP> 217
<tb> prAK <SEP> p26-3 <SEP> Met <SEP> à <SEP> Ile <SEP> en <SEP> 130
<tb> Gly <SEP> ä <SEP> Asp <SEP> en <SEP> 201
<tb> F <SEP> 1/prAK <SEP> p48c5 <SEP> Ala <SEP> à <SEP> Thr <SEP> en <SEP> 1B7
<tb>
Dans une seconde serie de preparations du clone mutant hybride, utilisant le meme mode opératoire analogue applique ä la preparation des clones du tableau C, une serie de plas-
<Desc/Clms Page number 24>
mides mutants de combinaison mélangées ont été préparés par la combinaison ä trois segments du grand segment (environ 4 kb) issu de la digestion de prAK avec Nsi I et Sst I,
d'un fragment Nsi I/Xho II de 330 bp issu de l'un des clones du tableau B et d'un fragment Xho II/Sst I de 100 bp issu d'un clone différent du tableau B. Les clones mutants hybrides resultants de cette seconde série sont indiqués ci-dessous au tableau D ; on notera que deux plasmides produits par le protocole de cette seconde série contenaient quatre changements d'acides aminés en comparaison du plasmide parent prAK.
<Desc/Clms Page number 25>
TABLEAU D
EMI25.1
<tb>
<tb> DESIGNATION <SEP> SEGMENT <SEP> SOURCE <SEP> DU <SEP> SOURCE <SEP> DU <SEP> POSITION
<tb> DU <SEP> prAK <SEP> NOU- <SEP> DE <SEP> SEGMENT <SEP> SEGMENT <SEP> DE <SEP> L'ACIDE
<tb> VELLEMENT <SEP> VECTEUR <SEP> NsiI/XhoII <SEP> XhoII/SstI <SEP> AMINE <SEP> DE
<tb> FORME <SEP> ET <SEP> SOURCE <SEP> DE <SEP> 330 <SEP> bp <SEP> DE <SEP> 1100 <SEP> bp <SEP> MUTATION
<tb> prAK-J <SEP> prAK <SEP> Nsi/Sst <SEP> p48a14 <SEP> p26-3 <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 101
<tb> 4 <SEP> Kb <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 116
<tb> Met <SEP> à <SEP> He <SEP> en <SEP> 130
<tb> Gly <SEP> à <SEP> Asp <SEP> en <SEP> 201
<tb> prAK-K"p48al4 <SEP> p48c5 <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 101
<tb> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 116
<tb> Ala <SEP> à <SEP> Thr <SEP> en <SEP> 187
<tb> prAK-L <SEP> 11
<SEP> p48c5 <SEP> p26-3 <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 116
<tb> Met <SEP> à <SEP> Ile <SEP> en <SEP> 130
<tb> Gly <SEP> à <SEP> Asp <SEP> en <SEP> 201
<tb> prAK-M"p26-3 <SEP> p48al4 <SEP> Ala <SEP> à <SEP> Thr <SEP> en <SEP> 119
<tb> Arg <SEP> a <SEP> His <SEP> en <SEP> 217
<tb> prAK-N"p26-3 <SEP> p48c5 <SEP> Ala <SEP> à <SEP> Thr <SEP> en <SEP> 119
<tb> Ala <SEP> a <SEP> Thr <SEP> en <SEP> 187
<tb> prAK-0 <SEP> " <SEP> p48c5 <SEP> p48a14 <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 116
<tb> Arg <SEP> à <SEP> His <SEP> en <SEP> 217
<tb> prAK-P <SEP> " <SEP> p26-3 <SEP> p36a65 <SEP> Ala <SEP> à <SEP> Thr <SEP> en <SEP> 119
<tb> Thr <SEP> a <SEP> Ile <SEP> en <SEP> 122
<tb> Ala <SEP> a <SEP> Val <SEP> en <SEP> 125
<tb> prAK-O <SEP> " <SEP> p48c5 <SEP> p36a65 <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 116
<tb> Thr <SEP> à <SEP> Ile <SEP> en <SEP> 122
<tb> Ala <SEP>
à <SEP> Val <SEP> en <SEP> 125
<tb> prAK-R <SEP> " <SEP> p48a14 <SEP> p36a65 <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 101
<tb> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 116
<tb> Thr <SEP> à <SEP> Ile <SEP> en <SEP> 122
<tb> Ala <SEP> à <SEP> Val <SEP> en <SEP> 125
<tb> prAK-S"p26-3 <SEP> p95a86 <SEP> Ala <SEP> à <SEP> Thr <SEP> en <SEP> 119
<tb> Thr <SEP> à <SEP> Seren <SEP> 188
<tb> prAK-T <SEP> " <SEP> p48c5 <SEP> p95a86 <SEP> Glu <SEP> à.
<SEP> Lys <SEP> en <SEP> 116
<tb> Thr <SEP> a <SEP> Seren <SEP> 188
<tb>
<Desc/Clms Page number 26>
TABLEAU D (SUITE)
EMI26.1
<tb>
<tb> DESIGNATION <SEP> SEGMENT <SEP> SOURCE <SEP> DU <SEP> SOURCE <SEP> DU <SEP> POSITION
<tb> DU <SEP> prAK <SEP> NOU- <SEP> DE <SEP> SEGMENT <SEP> SEGMENT <SEP> DE <SEP> L'ACIDE
<tb> VELLEMENT <SEP> VECTEUR <SEP> NsiI/XhoII <SEP> XhoII/SstI <SEP> AMINE <SEP> DE
<tb> FORME <SEP> ET <SEP> SOURCE <SEP> DE <SEP> 330 <SEP> bp <SEP> DE <SEP> 1100 <SEP> bp <SEP> MUTATION
<tb> prAK-U" <SEP> p48al4 <SEP> p95a86 <SEP> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 101
<tb> Glu <SEP> à <SEP> Lys <SEP> en <SEP> 116
<tb> Thr <SEP> à <SEP> Ser <SEP> en <SEP> 188
<tb> prAK-53 <SEP> " <SEP> p99c62 <SEP> p107c25 <SEP> Asn <SEP> à <SEP> Tyr <SEP> en <SEP> 105
<tb> Phe <SEP> à <SEP> Ile <SEP> en <SEP> 184
<tb> prAK-68"p99c62 <SEP> p26-3 <SEP> Asn <SEP> à
<SEP> Tyr <SEP> en <SEP> 105
<tb> Met <SEP> à <SEP> Ile <SEP> en <SEP> 130
<tb> Gly <SEP> à <SEP> Asp <SEP> en <SEP> 201
<tb> prAK-70 <SEP> " <SEP> p26-3 <SEP> p107c25 <SEP> Ala <SEP> ä <SEP> Thr <SEP> en <SEP> 119
<tb> Phe <SEP> à <SEP> Ile <SEP> en <SEP> 184
<tb> prAK-39"p99c62 <SEP> p98cl <SEP> Asn <SEP> ä <SEP> Tyr <SEP> en <SEP> 105
<tb> Thr <SEP> ä <SEP> Ser <SEP> en <SEP> 188
<tb>
Les divers mutants hybrides indiqués sur les tableaux C et D ont été évalués en fonction de l'étude de la noctuelle du tabac de l'exemple A et l'évaluation a inclu les clones mutants du tableau B à titre de comparaison, entre autres, de l'effet essentiellement d'une délétion ou d'une élimination d'une ou deux mutations des mutants d'origine du tableau B.
Les résultats de ces évaluations de toxicité ou d'activité insecticide ont été regroupés ci-dessous dans le tableau E, dans lequel on note que : 1) le score le plus faible dans la colonne de toxicité indique le niveau d'acti- vite le plus élevé (voir l'exemple A pour l'explication des scores) ;
et 2) les témoins font intervenir une quantité équivalente de cellules JM103 et de cellules SG4044 qui n'ont pas été transformées avec un plasmide quelconque, étant entendu que la plupart, voire la totalité, des mutants évalués dans ces deux types de cellules de E. coli et les résultats des mutants dans les tableaux de la présente description qui se réfèrent aux deux témoins doivent etre pris comme etant une moyenne des résultats pour les mutants
<Desc/Clms Page number 27>
EMI27.1
exprimée ä partir des deux types de cellules.
<Desc/Clms Page number 28>
EMI28.1
TABLEAU E
EMI28.2
<tb>
<tb> TABLEAU <SEP> E
<tb> Mutant <SEP> avec <SEP> référence <SEP> Score <SEP> de <SEP> toxicité
<tb> aux <SEP> tableaux <SEP> B, <SEP> C <SEP> ou <SEP> D <SEP> Toxicité <SEP> moyenne
<tb> Témoin <SEP> 4,68
<tb> prAK <SEP> 3, <SEP> 35
<tb> A <SEP> 2,05
<tb> B <SEP> 2, <SEP> 90
<tb> C <SEP> 2,68
<tb> D <SEP> 3,40
<tb> E <SEP> 2,50
<tb> F <SEP> 3, <SEP> 00
<tb> E. <SEP> coli <SEP> SG <SEP> 4044 <SEP> (témoin) <SEP> 4,12
<tb> J <SEP> 2,25
<tb> K <SEP> 2,06
<tb> L <SEP> 2, <SEP> 08
<tb> M <SEP> 3,10
<tb> N <SEP> 2,73
<tb> O <SEP> 2,70
<tb> P <SEP> 1,00
<tb> Q <SEP> 1,87
<tb> R <SEP> 2,85
<tb> R <SEP> :
<SEP> 2,85
<tb> S <SEP> 2,16
<tb> T <SEP> 1,20
<tb> U <SEP> 2, <SEP> 07
<tb> 53 <SEP> 3,08
<tb> 68 <SEP> 2,00
<tb> 70 <SEP> 1,50
<tb> 39 <SEP> 2,50
<tb>
<Desc/Clms Page number 29>
L'invention inclut en outre une démonstration de la ca- pacité de. la substitution générale des acides aminés aux positions des acides aminés auxquelles les mutations d'ADN aleatoires initiales ont produit des changements d'acides aminés, ce qui fournit une grande variété de nouvelles protéines endotoxines de B. t. a activite insecticide. Cette capacité a été démontrée avec une relative facilité par les expériences que l'on appelle "de rotation du codon" dans lesquelles des codons sélectionnés mis en jeu dans les changements de la mutation initiale ont été changés en codons pour les autres acides aminés naturels.
Ces nouveaux mutants ont exprimé une protéine endotoxine ayant une activité insecticide contre la noctuelle du tabac. Afin de conduire une telle étude plus efficacement, on a préparé une série de plasmides uniques du type prAK commençant essentiellement ä prAK et culminant dans le plasmide prAK-7, et les autres plasmides intermédiaires étant séquentiel1ement, dans l'ordre de la préparation, prAK-3, prAK-4, prAK-5 et prAK-6, comme le décrit l'exemple 1.
Le plasmide pB8rII représenté sur la figure 2 est identique, sous tous ses aspects, au plasmide prAK, sauf qu'il contient un ADN codant pour une endotoxine tronquée plutôt plus longue que celle pour laquelle code le prAK et ä l'exception de modifications sans conséquence dans le plasmide parent faites dans la zone de sa ligature ä l'extrémité aval du gene de structure d'endotoxine tronqué d'ADN, ce gène de structure, tel qu'il est représenté sur la figure 2, montrant le site Kpn I dans le gène natif, tandis que, dans prAK, le site a subi une dé-
EMI29.1
létion et le gène de structure prAK se termine environ ä la position précédente dudit site.
Le plasmide prAK-7 est conçu pour exprimer la meme séquence d'acides aminés d'endotoxine que le plasmide prAK, mais sa séquence d'ADN a ete modifiee pour inclure non seulement le site Nru I de prAK-3, mais
EMI29.2
egalement un site Hind III, Mst II et BssH II et, de plus, le site Hind III que lien trouve à l'origine dans prAK est
<Desc/Clms Page number 30>
de préférence éliminé.
Comme l'indique plus particulierement l'exemple 1, l'ordre séquentiel de préparation de prAK-3 à partir de prAK et l'addition ou la deletion d'un site dans chaque étape peuvent etre résumés de la manière suivante : prAK - prAK-3 (addition de Nru I) prAK-3 -----+ prAK-4 (addition de Hind III) prAK-4 ----- prAK-S (addition de Mst II) prAK-S -----+ prAK-6 (addition de BssH II) prAK-6 prAK-7 (délétion de Hind III initiale)
Les sites indiqués ci-dessus ont été introduits à une distance d'environ 40 paires de bases de sorte que l'on a pu utiliser efficacement un synthétiseur d'ADN automatise pour fabriquer de petits fragments d'ADN bicaténaires qui se terminent à leurs deux extrémités par des nucléotides représentant le résidu complémentaire des résidus du site de restriction a créer dans prAK-7 lorsqu'il est coupé avec les deux endonueléases de restriction appropriées.
Ces fragments ont donc pu etre facilement substitués dans prAK-7 par des procédures standard de coupure et de ligature (voir exemple P, ci-dessous) pour fournir un plasmide capable d'exprimer une protéine endotoxine identique ä celle de prAK, à l'exception des changements d'acides aminés pour lesquels code le fragment synthétisé substitue dans prAK-7 au fragment correspondant dans prAK-7, comme l'indique l'exemple 2 cidessous.
Les figures 3A et 3B représentent deux petits fragments d'ADN bicaténaires préparés selon la stratégie de rotation du codon ci-dessus ä substituer dans la section Hind III/Mst 11 dans prAK-7. Le fragment bicatenaire représenté sur la figure 3A a été conçu pour produire n'importe quel acide aminé à la position d'acide aminé 116 dans les endotoxines de B. t. tronquées exprimées par les plasmides prAK, par sélection appropriée du codon XXX en accord avec le code gene- tique.
De même, le fragment bicaténaire représenté sur la figure 3B a été conçu pour produire un acide aminé ä la po-
<Desc/Clms Page number 31>
sition d'acide aminé 119 dans les endotoxines de B. t. tron- quées produites par les plasmides prAK par sélection appropriée du codon XXX dans ce fragment. Comme on le voit, les autres fragments bicaténaires nécessaires pour la substitution dans le lieu Spe I/Nru I (une tranche de fragment d'environ 115 paires de bases que l'on peut aussi préparer par des synthétiseurs d'ADN automatisés), le lieu Nru I/Hind III et le lieu Mst II/BssH 11 dans prAK-7 et conçus pour coder pour tous les acides aminés en tous points de mutation trouvés dans ces sections peuvent être préparés par des modes opératoires standards analogues.
Ainsi, les 18 changements ou mutations d'acides aminés naturels sur les 19 ä faire en chaque point de mutation entre les sites Nru I et BssH II dans prAK-7 peuvent être faits facilement au moyen du plasmide prAK-7.
Pour couvrir tous les points de mutation de la séquence concernée des 116 acides aminés pour faire tourner de façon adéquate les codons adéquats, on peut utiliser le plasmide prAK-7 pour préparer le plasmide prAK-8 que l'on utilise enfin ä son tour pour préparer prAK-9, comme le décrit l'exemple 1. Sur la figure 5, tous les sites de restriction appropriés tels qu'ils sont finalement accumulés dans prAK-9 sont indiqués dans une section éclatée agrandie de prKA-9. Le site Spe I représenté sur la figure 5 est également un site unique qui était déjà présent dans prAK, prAK-3, etc.
Comme on l'appréciera également, les plasmides prAK-7, prAK-8 et prAK-9 peuvent être utilisés pour introduire de multiples changements mutationnels entre n'importe quelle paire de sites de restriction et/ou pour produire un ADN codant pour au moins un changement dans deux ou plus de deux de ces lieux, de telle manière qu'une grande variété de combinaisons de mutants multiples faisant intervenir des points de mutation initiaux trouvés en accord avec l'invention puissent etre construites pour produire une grande variété de nouvelles protéines endotoxines de B. t. ä activite insecti-
<Desc/Clms Page number 32>
cide.
On appréciera egalement que les plasmides comme prAK-7, prAK-8 et prAK-9 sont des plasmides totalement capables de changer un ou plusieurs codons quelconques dans tout lieu de paires de sites de restriction fourni dans ces plasmides.
Lorsque l'on souhaite des changements en un ou deux, mais moins de trois, de ces lieux, on peut utiliser des plasmides comme prAK-4 ou prAK-5 s'ils couvrent le lieu souhaitE des changements, de préférence après élimination du site Hind III d'origine dans prAK, et, si ces plasmides ne conviennent pas, on appreciera que l'on peut préparer un plasmide de type prAK contenant un ou plusieurs quelconques de ces lieux de façon classique en faisant varier ou en limitant la se- lection pour l'introduction des paires de sites de restriction utilisees pour modifier prAK lors de la production de prAK-9.
Par conséquent, l'invention fournit également une variété de nouveaux plasmides utiles pour la production de mutants et de combinaisons de mutants en accord avec l'invention et contenant un ou plusieurs quelconques des paires de sites de restriction finalement produits dans prAK-9.
Comme on l'appréciera également, un ADN comprenant une ou plusieurs quelconques de ces paires de sites de restriction peut etre excisé, avant ou après la modification, pour contenir une ou plusieurs mutations en accord avec l'invention, ä partir des plasmides de type prAK, par coupure aux sites de restriction qui se trouvent en dehors de la ou des regions de mutation souhaitées et que l'on trouve de facon correspondante dans un autre plasmide pour une endotoxine de B. t., puis par insertion (ligature par des moyens standards) du segment d'ADN excisé dans cet autre plasmide d'endotoxine de B. t. qui a été coupé de façon analogue, ce qui permet ainsi à ces autres plasmides d'entre modifiés commodément ou d'insérer directement les mutations de l'invention dans ceux-ci.
Dans le but d'incorporer des mutations fournies par
<Desc/Clms Page number 33>
EMI33.1
v > v v v - w v l'invention dans une séquence de codage d'endotoxine complate, on a utilise un plasmide incorporant le gène de structure d'ADN pour la 6-endotoxine de B. t. wuhanensis pour des raisons de commodité et de disponibilité immediate ä l'epoque. Ce plasmide, pBT210, est représenté sur la figure 4.
Le plasmide pBT210 incorpore le gène de structure d'endotoxine complet de B. t. wuhanensis comme l'indique le trait noir épais de la figure 4 et, par analogie avec la figure 1, incorpore également une séquence contenant un site de liai-
EMI33.2
son ribosomique de B. t. qui a été obtenu ä partir de B. t. wuhanensis avec le gène de structure et qui est représenté sur la figure 4 par la case noire. Le plasmide pBT210 est un vecteur d'expression de E. coli totalement compétent incluant le même système promoteur de E. coli que les plasmides prAK, une origine de réplication de E. coli (non représentée) et un gène pour la résistance au chloramphenicol comme 1'indique la figure 4.
Les flèches de la figure 4 représentent le sens de lecture du gène de B. t. wuhanensis sous le controle du promoteur de E. coli et du gène de résistance au chloramphenicol. En se basant sur 1'information sur les séquences en notre possession, on constate que la totalité de l'opéron (gène de structure, section de séquence de liaison ribosomique dérivée de B. t. et séquence promo- teur/opérateur de E. coli) est très analogue et ne diffère que de façon insignifiante de l'opéron dans le plasmide prAK. En particulier, l'ADN codant pour les 610 acides aminés de la partie active de l'endotoxine de B. t.
(tableau A) et s'étendant dans la région de protoxine au moins jusqu'à environ le site Kpn I représenté sur la figure 4 pour pBT210, est identique ä la séquence d'ADN correspondante dans le plasmide prAK. Dans la région d'ADN en aval du site Kpn I dans le gène de structure de B. t. dans pBT210 et jusqu'à la fin de ce gène de structure, il existe des differences inconnues mais mineures en comparaison de la section correspondante du gène HD-1 de B. t. kurstaki tronque lors de
<Desc/Clms Page number 34>
la production de prAK.
Ces différences ont été indiquées par une cartographie de restriction ä l'endonuc1éase. Le plasmide pBT210 code pour une endotoxine complète comme l'indique le tableau A et est entièrement homologue dans la portion active (et au moins sur les acides aminés produits jusqu'à son site Kpn I, jusqu'à la 6-endotoxine de HD-1 de B. t. kurstaki dans les clones prAK et pBSril) et possède une homologie importante dans le reste de la section de protoxine.
Finalement, le site de liaison ribosomique dans pBT210 est identique ä ce site dans prAK et l'ADN dans son ensemble incluant le site de liaison ribosomique (RBS) et s'étendant en amont depuis la position précédant immédiatement le Met d'initiation en remontant par le site Bam HI reliant la section promoteur est le même dans pBT210 et dans prAK, sauf que dans pBT210 il y a deux changements de nucléotides suivant immédiatement Bam HI (CC au lieu de GT comme dans prAK) et que trois nucléotides (TTT), tels que ceux que l'on trouve dans prAK immédiatement après ces deux nucléotides, on subit une délétion dans pBT210, ces différences ne provenant que d'une différence de stratégies de ligature lors de la liaison des sections RBS de B. t. à la section promoteur de E.
coli par l'intermédiaire d'un site Bam HI. Le plasmide pBT210 peut être utilise pour produire une protéine 6-endotoxine de B. t. mutante complète comportant un ou plusieurs quelconques des changements d'acides aminés fournis par la présente invention. Le site Nsi I, et deux sites Xba I, le site Sst I et le premier site Hind III apparaissant en aval représenté sur la figure 4 pour pBT210 correspondent aux memes sites représentés sur la figure 1 pour prAK (les ADN pour les deux plasmides dans cette région étant identiques comme on l'a indique ci-dessus).
EXEMPLE A 1. Etude de Trichoplusia ni (T. ni)
On a réalisé des essais sur des larves au second stade larvaire. Tous les insectes ont été maintenus dans des en-
<Desc/Clms Page number 35>
ceintes climatisées dans des conditions standards de température, d'humidité, etc, au cours de la période d'essai et ont été alimentés par un régime alimentaire artificiel standard. Les substances étudiées ont été données aux insectes dans l'alimentation, chaque concentration de substance étudiée étant administrée à un lot de 20 insectes. Les insectes ont été surveillés pendant une période de 7 jours apres le traitement, après quoi on a enregistré la DLSO des insectes.
La DLcss peut etre definie comme étant une estimation de la dose de substance nécessaire pour induire la mortalité chez 50% des sujets. Les résultats finals sont indiques en puissance relative, où puissance relative = DLsp de l'étalon x 100 DLso de l'expérience
En utilisant la technique ci-dessus, on peut obtenir les valeurs absolues des DL50, ce qui permet une interprétation simple des résultats, de sorte que toutes les valeurs de puissance relative supérieures ä celle de l'étalon indiquent une activité supérieure ä celle de l'etalon. En outre, une substance ayant une puissance relative de, par exemple 400, en comparaison d'un etalon de 100, est quatre fois plus active que l'étalon.
L'étalon, ayant une puissance relative de 100 dans l'essai ci-dessus, était ie plasmide pBT301, ce plasmide contenant une séquence de 8-endotoxine de type sauvage com- plete et etant identique à pBT210, à l'exception du fait qu'il contient deux promoteurs de E. coli, chacun d'eux étant individuellement le meme que celui contenu dans pBT210.
Les témoins utilises dans l'essai ci-dessus étaient : a) CAG 629 - une souche de E. coli ne contenant pas de plasmides produisant de la 6-endotoxine et n'ayant pas d'activité insecticide en soi (don de C A Gross, Department of Bacteriology, University of Wisconsin) ; b) SAN 415 - insecticide de B. t. du commerce, disponible
<Desc/Clms Page number 36>
sous la marque déposée JAVELIN.
2. Etude de la noctuelle du tabac (etude NT) L'etude NT employée etait pratiquement celle décrite par Dulmage et coll., (1971) J. Invertebr. Path. 18 240-245, et a été réalisée avec des échantillons préparés en trois exemplaires dans des capsules soufflées en matière plastique transparente de 29, 6 cm3, avec une larve de NT au second stade larvaire (âgée de 4 ä 5 jours, poids moyen 1, 6 g) dans chaque capsule. Les échantillons ont été combines avec 15 ml d'aliment (comprenant la poudre nutritive, la poudre de vitamine, de la gélose et d'autres ingrédients), tel que decrit par Dulmage et coll., USDA Technical Bulletin n 1528 : 1-5 (1976). L'alimentation a été divisée de façon égale entre les trois capsules qui ont été refroidies pendant 1/2 heure.
On a ajouté une NT (en utilisant une brosse en poil de chameau de taille 00) ä chaque capsule et on a fermé
EMI36.1
fixement les couvercles. Ces échantillons ont alors été places dans un incubateur ä 27OC, de 50% d'humidité relative, pendant 4 ä 5 jours. Les numéros de dimension de groupe uti- lisés dans le score de l'essai de toxicite de NT correspondent aux domaines de poids indiqués sur le tableau suivant.
EMI36.2
<tb>
<tb> TAILLE <SEP> DU <SEP> GROUPE <SEP> DOMAINE <SEP> DE <SEP> POIDS <SEP> POIDS <SEP> MOYEN
<tb> (mg) <SEP> (mg)
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 1,3- <SEP> 1,9 <SEP> 1,6
<tb> 1, <SEP> 5 <SEP> 27-3, <SEP> 1 <SEP> 218
<tb> 2, <SEP> 0 <SEP> 5,5- <SEP> 6,3 <SEP> 5,8
<tb> 2,5 <SEP> 11,7- <SEP> 12,3 <SEP> 12,0
<tb> 3, <SEP> 0 <SEP> 17, <SEP> 3- <SEP> 22, <SEP> 2 <SEP> 19".
<SEP> 6
<tb> 3, <SEP> 5 <SEP> 30, <SEP> 8- <SEP> 34, <SEP> 2 <SEP> 32, <SEP> 8
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> 50, <SEP> 1- <SEP> 52, <SEP> 4 <SEP> 51,1
<tb> 4, <SEP> 5 <SEP> 76, <SEP> 6- <SEP> 943 <SEP> 84, <SEP> 8
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 119,9-114,7 <SEP> 113,5
<tb> 6, <SEP> 0 <SEP> 119, <SEP> 8-134, <SEP> 3 <SEP> > 14070
<tb>
La "taille du groupe" indiquée ci-dessus correspond directement aux scores de toxicité rapportés ici. Par consé-
<Desc/Clms Page number 37>
quent, le poids de la larve après chaque essai a été déterminé et il lui a été attribué le score de toxicite egal au groupe correspondant au domaine de poids dans lequel se trouve son poids. Sauf indication contraire, ci-dessous, on a attribué ä toutes les larves mortes une taille de groupe et un score de toxicité de 0.
On a pris la moyenne des scores de toxicité de toutes les répétions pour obtenir les résultats rapportés ici et, typiquement, tous les résultats
EMI37.1
sont basés au moins sur 30 répétitions.
Les capsules ont été ouvertes jusqu'à ce que l'on localise des domaines de NT de différentes tailles. Ces NT ont été pesées jusqu'à ce que l'on localise une NT tombant dans chaque domaine de poids. Les capsules d'échantillon contenant la NT d'un domaine de poids donné ont été marques par le numéro de taille de groupe correspondant. Ces capsules ont été disposées en ordre croissant sur la paillasse du laboratoire. Les échantillons restants ont ensuite été notes par comparaison visuelle de leur taille avec les NT de l'échantillon pesé et se sont vu attribuer ce numéro de groupe sur une feuille de score. On a enregistré les larves mortes avec un "+" et on leur a attribué un score de zéro.
On a suspecté que les larves mortes qui étaient rose vif ou qui semblaient s'etre liquéfiées d'etre mortes de causes non liées à la S-endotoxine. On a noté ces larves avec un"*"et on ne les a pas comptées dans les résultats.
La taille d'échantillon étalon de 1 ml d'une culture de prAK répartie sur trois capsules a conduit ä un retard de croissance dans le milieu du domaine des scores de toxicité.
Par conséquent, l'étude a été utile pour distinguer les clones qui ont accru la toxicité de ceux ayant une toxicité réduite ou égale au parent non mutant. L'étude a produit un effet à la dose dépendant de la quantité de culture de prAK introduite dans l'étude. Par conséquent, plus la quantité des bactéries contenant prAK ajoutées aux échantillons était grande, plus on a observé un degre de toxicité élevé vis-à-
<Desc/Clms Page number 38>
vis de la NT. La courbe dose-effet de prAK a été utile pour évaluer le degré auquel les clones étaient plus toxiques que le parent non mutant.
Le tableau suivant illustre l'effet ä la dose des bactéries contenant prAK :
Quantité de culture
EMI38.1
<tb>
<tb> stationnaire <SEP> de <SEP> prAK <SEP> ajoutée <SEP> Scores <SEP> de <SEP> toxicité
<tb> 5 <SEP> ml <SEP> 1,5 <SEP> 1,5 <SEP> 2,0
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP> zo
<tb> 1 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3, <SEP> 5
<tb> ois <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 315 <SEP> 4
<tb> 0, <SEP> 25 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb>
EMI38.2
En se basant sur l'évaluation ci-dessus, on a étudié toutes les cultures en utilisant 1 ml de culture afin, en rapport avec les tailles des groupes obtenues, d'avoir une large gamme pour déterminer quelles étaient celles ayant une activité plus ou moins grande par rapport ä prAK (et ä d'autres plasmides non mutants) comme étalon.
La poudre nutritive utilisée dans l'étude NT a été mé-
EMI38.3
langée dans les proportions pondérales suivantes en grammes : farine de soja, 1103, 4 g ; germe de blé, 429, 4 g ; mélange de sel Wesson, 292, 4 g ; saccharose, 164, 2 g ; parabenzoate de méthyle, 24, 6 g ; et acide sorbique, 14, 8 g.
La poudre de vitamine utilisée dans l'étude NT a été mélangée dans les proportions pondérales suivantes en grammes : peutothenate de calcium, 12,0 g; nicotinamide, 6,0
EMI38.4
g ; riboflavine, 3, 0 g ; acide folique, 3, 0 g ; thiacine chlorhydrate, 1, 5 g ; pyridoxine chlorhydrate, 1, 5 g ; biotine, 0, 12 g ; et vitamine B12, 6, 0 g.
On a employé les trois applications de criblage suivantes de 1'4étudie (primaire, secondaire et dilutions en série) ä divers stades de l'évaluation et on s'y réfère dans cette description.
Etude primaire : on a combiné avec l'aliment des NT des parties aliquotes de 1 ml issues de cultures de 18 heures de 2 clones séparés, dans un tube de centrifugation conique de
<Desc/Clms Page number 39>
50 ml et on les a réparties uniformément dans trois capsules (avec 1 NT par capsule). Ces échantillons ont été évalués en même temps que des témoins de cellules transformées prAK ou pBT210 de type sauvage et de cellules non transformées préparées de la meme manière.
Etude secondaire : dans une seconde étude, on a crible les échantillons qui présentaient une toxicité accrue vis-ävis des NT dans l'étude primaire. Les colonies mutantes sélectionnées ont été inoculées ä partir des boîtes de bibliothèque dans un bouillon YT/Amp (une colonie par culture).
Dix échantillons de 1 ml ont été évalués en meme temps que les. temoins appropries. Les clones présentant une toxicité accrue pour les NT ont été qualifiés de "mutants ascendants probables" et ont été évalués une troisième fois. Ceux qui ont répété une troisième fois leur phénotype "ascendant" ont été identifiés comme "mutants ascendants" et évalués dans un dosage par dilutions en série pour déterminer plus précisément le niveau d'activité améliorés en fonction du type sauvage parent.
Etude par dilutions en série : les mutants qui. ont confirmé présenter un phénotype "ascendant" sur la construction non mutante ont été criblés dans l'etude NT dans une série de dilutions basée sur le poids sec des cellules bactériennes lyophilisées qui contenaient ou bien la toxine mutante ou bien la toxine de type sauvage des clones prAK ou pBT210 ayant été cultives pendant 18 heures (et les cellules en culot avant la lyophilisation).
Les échantillons ont été préparés en trois exemplaires ä chacune des dilutions suivantes dans un volume final de 15 ml : 167 u. g/ml, 67 ug/ml et 33 wgfml- On a realise sur la protéine de ces mutants une analyse SDS-PAGE et Western (immunoblot), typiquement à 75 ug de cellules en poids sec par ligne. Les résultats de l'étude par dilutions en série ont essentiellement confirme les résultats des études précédentes et ne sont pas présentés autrement ici, ni ne figurent dans les présents tableaux
<Desc/Clms Page number 40>
qui consignent les résultats biologiques sous forme de moyennes.
EXEMPLE P - PROCEDURES REGULIERES
Dans les exemples numérotés suivants ou ailleurs dans cette description, on a utilisé les procedures de laboratoire régulières et standards suivantes, là où elles sont citées dans la suite ou là où elles sont requises, à'moins que le texte n'indique le contraire.
Exemple P-l : Entretien et croissance de souches bactériennes et de phages
Les souches SG4044 et JM103 de E. coli ont été les
EMI40.1
hotes de toutes les constructions de plasmides. On a obtenu la souche JP103 de E. coli et le phage M18 et MP19 aupres des New England Biolabs. Ces souches bactériennes ont été cultivées dans un milieu YT (5 g/l d'extrait de levure, 10 g/l de bactotryptone, 5 g/l de NaCl). Le milieu a été com- plémenté avec 50 mg/l d'ampicilline pour la croissance des cellules contenant prAK ou des derives de ce plasmide et avec 20 mg/ml de chloramphénicol pour les cellules contenant pBT210 ou des dérivés de ce plasmide.
Exemple P-2 Propagation et isolement de l ' ADN du phage
On a effectué la préparation de stocks de phages recombinant dérivés de M13 et l'isolement de l'ADN du phage en employant les procédures décrites antérieurement (Messing, J. (1983) Methods Enzymol. 101 : 20-78).
Exemple P-3 préparation d'oligonucléotides synthétiques
On préparé les oligonucléotides synthétiques en utilisant une synthese automatisée avec une machine de synthèse d'ADN 380A de Applied Biosystems (Foster City, CA).
Les étapes de purification, une fois le cycle terminé, ont été les suivantes. L'oligonucléotide synthétique a été débloqué par addition d'un volume égal d'hydroxyde d'ammonium et incubation ä 550C pendant une nuit. Après élimina-
<Desc/Clms Page number 41>
tion de l'hydroxyde d'ammonium par cycles successifs de centrifugation sous vide ä grande vitesse et remises en suspension dans de l'eau distillée, on a encore purifié l'oli- gonucléotide par électrophorèse sur gel d'urée-polyacrylamide (urée-PAGE).
Pour visualiser la bande, on a placé le gel sur une plaque de chromatographie ä deux couches recouverte d'un emballage de Safrans et on a illuminé l'oli- gonucleotide avec une lumière ultraviolette ä ondes courtes.
Après avoir découpé la portion du gel contenant l'oligonucléotide avec une lame de rasoir, on a élué l'oligonucléoti-
EMI41.1
de sur le gel dans de l'acétate d'ammonium 0, 5M, de l'EDTA 1 mM, ä pH 8, 0, ä 37 C, pendant une nuit sous agitation. Après une nuit d'elution, on a rassemblé les fragments de gel en un culot ä 6000 t/min dans un rotor JA20 et on a transféré le surnageant combinant l'oligonucléotide élué dans un tube propre. On a utilisé une précipitation dans EtOH pour concentrer l'oligonucléotide et on l'a quantifié par absorbance ä une densité optique de 260.
On a soumis 200 pmoles de l'oligonucléotide ä de la kinase dans une réaction de 40 l avec 2 unités de polynucléotide-kinase T4 et 0, 05 mM d'ATP.
Exemple P-4 : Transformation par l'ADN de cellules de E. coli
A) On a préparé des cellules JP103 ou SG4044 de E. coli compétentes pour une transformation d'ADN par une procedure couramment utilisée (Cohen, S. N., Chang, A. C. P. et Hsu, L.
[1972], Proc. Natl. Acad. Sei. USSA 69 : 2110-2114). Pour les expériences de mutagenese des oligonucléotides dirigée vers un site on a ajouté 60 ng d'ADN de phage recombinant hetero- duplex (M13) ä 0, 2 ml de cellules compétentes et on a maintenu la température ä 0 C pendant 15 minutes. On a ensuite maintenu les cellules ä 420C pendant 2 minutes et on a adjouté 30 l de ce mélange ä 3 ml de bouillon YT contenant
EMI41.2
0, 7% de bactogélose maintenue ä 420c pour empecher la solidification et 0, 2 ml d'une culture fraiche préparée pendant
<Desc/Clms Page number 42>
la nuit de JM 103 ou de SG4044.
Le mélange a été immédia- tement étalé sur une bolte de gélose YT (bouillon YT plus 1, 5% de bactogélose) et les plaques (retournées) ont été incubées pendant une nuit ä 37 C.
B) On ajouté 100 ng d'ADN plasmide issu des expériences de mutagénèse ou de tout autre ligature faisant intervenir des vecteurs prAK ou pBT210 tels que décrit ici à 0, 2 ml de cellules compétentes (JP103 ou SG4044) et on a maintenu la température ä 0 C pendant 30 minutes. On a ensuite maintenu les cellules ä 420C pendant 2 minutes et on les a retournées sur un bain de glace. On a étalé des quantités de 2 u. l ä 200 l sur de la gélose YT contenant 50 g/ml d'ampicilline pour les clones ä base de prAK et 20 g/ml de chloramphénicol
EMI42.1
pour les clones à base de pBT210 et on a incube pendant une nuit ä 37 C.
Exemple P-5 : Digestion par les enzymes de restriction
On a, acheté toutes les enzymes de restriction ou bien auprès de Bethesda Research Labs (Gaithersburg, MD) ou auprès de New England Biolabs. Les conditions d'incubation ont été celles recommandées par le fabricant.
Exemple P-6 : Ligature des fragments d'ADN
A) Les reactions de ligature d'ADN (20 ul) contenaient 60 mM de Tris-HCl, pH 7, 5, 10 mM de MgCl2, 1 mM de dithiothréitol, 50 AM d'ATP, 20 nM d'extrémités d'ADN et 20 unités d'ADN-ligase T4 (New England Biolabs). L'incubation s'est faite ä 14 C pendant 4 heures.
B) On a mis en place trois ligatures de fragments avec des fragments en un rapport molaire de 1 : 1 : 1 en une concentration de 0, 04 pmole chacun dans un volume réactionnel de 20 lil. L'incubation s'est faite ä 16 C pendant 4 heures pour ne ligaturer qu'une extrémité cohésive (par exemple le site interne Xho II) ou pendant une nuit pour la ligature de n'importe quelle extrémiste inactive (par exemple un site
<Desc/Clms Page number 43>
FnuD2). On a utilise de la ligase T4 de New England Biolabs (NEB) ä une concentration de 10 unités (definition de NEB) par ul de volume réactionnel.
Exemple P-7 : Séquencage d'ADN
On a effectué le séquençage d'ADN des gènes de 8-endo- toxine et de leurs dérivés par la methode de terminaison des chalnes de Heidecker et coll. (Heidecker, G., Messing, J., et Gronenborn, B. [1980], Gene (10 : 68-73).
EXEMPLE 1 Préparation des vecteurs prAK-3, prAK-4, prAK-5, prAK-6 et prAK-7 Etape a) Préparation de prAK-3
1 gg du plasmide pB8rII (représenté sur la figure 2 et décrit ci-dessus) et la forme replicative d'ADN issue des vecteurs MP18 et MP19 de clonage du phage M13 bien connus ont été digérés simultanément avec les endonucléases de restriction Bam HI (8 unités) et Kpn 1 (10 unités) pendant 60 minutes à 370C dans une solution tampon de chlorure de sodium 100 mM contenant également 6 mM de Tris-HCl (pH 7, 9), 6 mM de MgC12, 100 tig/ml de sérumalbumine de boeuf.
Les fragments souhaités de ces melanges d'ADN résultants ont été purifiés par séparation du mélange entier selon les tailles sur gel d'agarose préparatif ä 1%. Les bandes ont été visualisées par coloration avec du bromure d'éthidium et illumination avec de la lumière ultraviolette ä ondes longues. Le fragment de gel contenant l'ADN recherché a été découpé et l'ADN élué par électrophorèse dans un tube de dialyse.
Le fragment Bam HI/Kpn I de pB8rII a été ligaturé dans les vecteurs coupés et purifiés par gel Bam HI/Kpn I de mp18 et mp19 par incubation pendant 4 heures ä 140C dans un volume
EMI43.1
total de 20 litres contenant 60 mM de Tris-HCl, pH 7, 5, 10 mM de MgC121 1 mM de dithiothréitol, 50 mM d'ATP, 20 nM d'extremities d'ADN. L'ADN résultant a été transformé en cellules JM103 de E. coli compétentes comme dans l'exemple P-4,
<Desc/Clms Page number 44>
sauf que les plaques de YT contenaient de l'isopropylthiogalactoside (IPTG) et du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galacto- side (X gal), toutes deux obtenues auprès de Sigma Chemical Company.
Comme le phage recombinant (contenant 11 insertion d'ADN découpée de pB8rII) rendra les plaques incolores dans ces conditions, tandis que M18 et M19 rendent les plaques bleues, les plaques incolores ont été ajoutées ä 2 ml de cellules JM 103 de E. coli dans du bouillon YT, incubées
EMI44.1
pendant une nuit ä 37 C et un ADN monocaténaire a été prepare ä partir du phage selon la procédure décrite par J.
Messing, J. Methods Enzymol. (1983), 101 : 20-78. Ces clones recherchés contenant les séquences d'insertion d'ADN grandes mais monocatenaires issues de pB8rII ont été identifiés par électrophorèse sur gel d'agarose en vertu de leur mobilité plus lente en comparaison de mp18 ou de mp19. Le séquençage d'une portion de ces clones qui incluait l'ADN d'endotoxine, par la méthode de terminaison des chaînes didésoxy, a confirmé la présence de l'ADN d'endotoxine et indiqué que mp18 avait acquis son brin anti-sens et que mp19 avait acquis son brin sens, tous deux ayant été récupérés.
Un oligonucléotide anti-sens ä 26 bases ayant la séquence S'GTC CTT CTA ATC GCG AAA TGG CTT GG3' a été préparé par synthèse en phase solide dans le synthétiseur d'ADN automatisé et soumis ä une kinase avec de la polynucléotide-kinase T4 et de l'ATP comme le décrivent Maniatis et coll., Molecular Cloning (1982) : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.
Y. Un mélange, de volume total 60 ul, contenant 0,4 g du phage recombinant mp19 contenant le brin sens d'endotoxine, 20 mM de Tris-HCl, pH 7, 5, 7 mM de MgCl2, 1 mM de dithiothréitol, 50 mM de chlorure de sodium et 10 ng de l'oligonucléotide anti-sens ä 26 bases a été chauffé ä 68 C pendant 15 minutes, puis ä 370C pendant 10 minutes, et placé ä 0 C.
Le mélange résultant, contenant l'ADN recombinant mp19 avec l'oligo mutagène traite a été ensuite additionné de
<Desc/Clms Page number 45>
EMI45.1
0, 2 mM chacun de dATP, de dCTP, de dTTP et de dGTP, 1 mM d'ATP, 4 unités de fragment Klenow d'ADN-polymerase I (de New England Biolabs), zog de protéine de fixation monocaténaire de E. coli (de Pharmacia, Piscataway, N. J.) et 20 unités d'ADN-ligase T4 (New England Biolabs). Le mélange résultant a été incubé ä 140C pendant 4 heures pour permettre la polymérisation et la ligature et l'ADN hétéroduplex bicaténaire circulaire résultant a été transforme en JM103 de E. coli et cultivé comme le décrit l'exemple P-4.
Vingt (20) plaques individuelles ont ensuite été sélectionnées et l'ADN monocaténaire a été isolé du phage comme le décrivent Maniatis et coll., cités ci-dessus. L'ADN du phage des 20 plaques, chacun en un volume total de 20 1 et contenant 50 mM de Tris-HCl, pH 8, 0, 50 mM de KC1,10 mM de Muge12, 10 ng de l'oligonucleotide anti-sens ä 26 bases indiqué ci-dessus et zig de molécules d'ADN de phage monocaténaire circulaire différentes ont chacun été chauffés ä 68 C pendant 15 minutes et placés ä 370C pendant 10 minutes.
L'endonucléase de restriction Nru I (8 unités) a été ajoutée ä chaque mélange résultant et on a poursuivi l'incubation ä 37 C pendant une heure. Le melange a été soumis ä une électrophorèse dans un gel d'agarose ä 0, 8%. Environ 10% des échantillons contenait de l'ADN migrant sous forme d'ADN lineaire pour permettre l'identification des clones positifs contenant le site Nru I recherche, et les clones positifs ont été transformés en JM103 de E. coli pour assurer la purification.
On a excisé l'ADN entre le site Bam HI et le site Xba I dans les clones p d-
EMI45.2
tifs (apres traitement avec l'oligo de séquençage m13 et po- lymérisation pour le rendre bicaténaire, comme on l'a décrit ci-dessus pour l'oligo Nru I) par coupure simultanée avec les endonucléases de ces sites et on l'a ligaturé (exemple P-6A) avec le grand fragment (environ 5004 paires de bases et ne comportant pas le fragment d'environ 749 bp entre le
EMI45.3
site Bam HI et le second site Xba I dans prAK) ayant été obtenu et purifie sur gel après digestion complète de prAK si-
<Desc/Clms Page number 46>
multanément avec les deux mêmes enzymes de restriction, le tout d'une manière classique, pour former le plasmide prAK- 3.
Etape b) Préparation de prAK-4
En suivant essentiellement l'ensemble de la procédure qui est analogue ä l'étape a) ci-dessus, l'ADN de phage monocaténaire obtenu dans l'étape a) a été traité en un oligonucleotide anti-sens synthétisé de 25 bases ayant la séquence
5'CCACTCTCTAAAGCTTTCTGCGTAA3, conçue pour introduire le site Hind III entre les nucleotides en positions nO 327 et 351 dans la séquence de nucléotides du tableau A.
Des clones positifs ayant maintenant les deux sites recherchés Nru I et Hind III ont été identifiés avec une fréquence d'environ 6, 6% par évaluation par clivage avec la nucléase Hind III et ont été utilisés pour préparer prAK-4 par ligature du fragment Bam HI/Xba I avec les nouveaux sites au grand fragment de 5004 bp issu de prAK, de la meme manière que dans l'étape a).
EtÅape c) Préparation de prAK-5
En suivant essentiellement l'ensemble de la procédure
EMI46.1
qui est analogue ä l'étape a), l'ADN de phage monocaténaire obtenu dans l'étape b) ci-dessus a été traité en un oligonucléotide anti-sens synthétisé de 26 bases ayant la séquence 51 GCATCTCTTCCCTTAGGCTGGATTA3, concue pour introduire le site Mst II entre les nucléotides en positions nO 366 et 391 dans la séquence de nucléotides du tableau A. Des clones positifs ayant maintenant les trois sites recherchés Nru I, Hind Ill et Mst 11 ont été identifiés ä une fréquence d'environ 9, 1% par évaluation par clivage avec l'enzyme de restriction Mst II et ont été utilisés pour préparer prAK-5.
Etape d) Préparation de prAK-6
En suivant essentiellement l'ensemble de la procédure
<Desc/Clms Page number 47>
qui est analogue ä l'étape a) ci-dessus, les clones de phages bicaténaires positifs de l'étape c) ci-dessus ont été transformés en ADN de phage monocaténaires et traités en un oligonucléotide anti-sens synthétisé de 26 bases ayant la séquence 5'GCGGTTGTAAGCGCGCTGTTCATGTC3, conçue pour introduire le site Bss HII entre les nucléotides en positions nO 406 et 431 dans la séquence des nucléotides du tableau A. Des clones positifs ayant maintenant les quatre sites finalement recherchés dans prAK-7 ont été identifiés à une fréquence d'environ 12, 5% par dévaluation par clivage avec l'enzyme Bss HII et ont été utilises pour préparer prAK-6.
Etape e) Préparation de prAK-7
En suivant essentiellement l'ensemble de la procédure qui est analogue ä l'étape a) ci-dessus, l'ADN de phage monocaténaire obtenu dans l'étape d) ci-dessus a été traite en un oligonucléotide anti-sens synthétisé de 26 bases ayant la séquence
EMI47.1
5'TACAGTCCTAAATCTTCCGGACTGTA3, conçue pour éliminer le site Hind III entre les nucleotides en positions nO 1682 et 1707 dans la séquence des nucleotides du tableau A. Des clones positifs représentant la séquence totale recherchée pour prAK-7 ont été identifiés à une fréquence d'environ 2, 8% par criblage par l'endonuclease de restriction de la forme replicative (bicaténaire) de l'ADN de phage recombinant pour la perte du site Hind III entre les nucléotides 1682 et 1707.
L'ADN bicatenaire isolé du mutant a été utilisé pour préparer prAK-7.
Pour terminer la préparation d'un plasmide (prAK-9). comportant des sites de restriction adéquats uniques et espaces pour réaliser des expériences de rotation du codon ä d'autres points de mutation entre les deux sites Xba I, on peut poursuivre de façon analogue le développement de la série de plasmides prAK selon les étapes suivantes pour prépa-
<Desc/Clms Page number 48>
rer un plasmide prAK-8, et ä partir de celui-ci prAK-9, comme l'indiquent ci-dessous les étapes f) et g).
Etape f) Preparation de prAK-8
En suivant essentiellement l'ensemble de la procedure qui est analogue à l'étape a) ci-dessus, l'ADN de phage mo- nocatenaire obtenu dans l'étape e) ci-dessus a été traite en un oligomere anti-sens synthétisé de 27 bases ayant la séquence : 5'TCCCCACCTTTGGCCAAACACTGAAAC 3' conçue pour introduire un site de restriction Bal I approximativement ä la position du nucleotide nO 534 dans la se- quence des nucléotides du tableau A.
Des clones positifs (prAK-8 comportant maintenant les cing sites recherchés Nru I, Hind Ill, Mst II, Bss HII et Bal I et ne comportant le site Hind III éliminé lors de la préparation de prAK-7) sont identifies de la même manière que dans l'etape a) ci-dessus.
Etape g) Préparation de prAK-9
En suivant essentiellement la procédure qui est ana-
EMI48.1
logue ä l'étape a) ci-dessus, l'ADN de phage monocaténaire obtenu dans l'étape f) ci-dessus a été traité en un oligo- mère anti-sens synthetise de 30 bases ayant la sequence :
5' GTTGCCAATAAGACGCGTTAAATCATTATA 3' conçue pour introduire un site de restriction Mlu I entre les nucleotides en positions n 588 et 595 dans la sequence des nucleotides du tableau A. Des clones positifs comportant maintenant les six sites de restriction recherches Nru I,
EMI48.2
Hind III, Mst II, Bss HII, Bal I et M1u I et ne comportant pas le site Hind III éliminé lors de la formation de prAK-7 sont identifiés de la même manière que dans l'étape a) et sont nommes plasmide prAK-9.
Comme on le voit, la cassette d'ADN convenant pour une substitution entre les sites Bal I et Mlu I dans prAK-9 peut être codee de façon appropriee pour introduire toutes les variations possibles des codons et des acides amines aux positions d'acides amines mutees 184,187, 188 et 194.
<Desc/Clms Page number 49>
D'une manière analogue, la cassette d'ADN convenant pour une substitution entre le site Mlu I et le second site Xba I peut être codée de façon appropriée pour introduire toutes les variations possibles des codons et des acides aminés aux positions d'acides aminés mutés 201 et 204.
La figure 5 est une représentation schématique des sites de restriction uniques que l'on peut introduire entre les deux sites Xba I initiaux trouvés dans prAK (le premier de ces sites Xba I dans prAK-9 étant maintenant le site Nru
EMI49.1
I).
Des oligonucléotides anti-sens indiqués ci-dessus dans les diverses étapes de l'exemple 2 ont été soulignés pour indiquer le ou les changements ä introduire.
EXEMPLE 2
Experiences de rotation du codon
A) Des oligonucléotides monocatenaires ayant les séquences de chacun des deux brins représentés sur les figures 3A et 3B ont été préparés comme le décrit l'exemple P-3 avec le synthétiseur d'ADN programmé pour insérer de façon aléatoire tous les nucléotides A, T, C et G ä chacune des positions X dans chacun des brins représentés sur la figure 3A.
Un total d'environ 200 pg (après purification) d'ADN de chaque essai sur la machine de ces monobrins (représentant une famille d'oligonucléotides identique, ä l'exception des positions X de chaque brin) ont été préparés par cette procédule. 10 pmoles de chaque brin, sens et anti-sens, pour chaque rotation de codon, ont été combinés en masse et
EMI49.2
traitéspar chauffage ä 6B0C pendant 10 minutes, puis ä 37 C pendant 10 minutes, refroidissement ä la température ambiante et placement sur de la glace.
La masse résultante d'oligomères bicaténaires épousant la forme de l'ADN représenté sur la figure 3A a été jugée contenir, aux positions XXX (position d'acide aminé 116) chaque combinaison permise par le code génétique, notamment des signaux darret et des nombres de codons multiples mais variables pour chacun des
<Desc/Clms Page number 50>
20 acides aminés naturels plus les signaux d'arret. 1 pmole de ces oligomeres ou cassettes bicaténaires ont été ensuite soumis ä une kinase ä l'aide de polynucléotide-kinase T4 de New England Biolabs et mélangés en masse avec le plus grand fragment (présent en concentration molaire 10 fois moins grande)
obtenu par isolement sur gel après le clivage simultané du plasmide prAK-7 avec les endonucléases de restriction Hind III et Mst II dans 100 mM de NaCl, 10 mM de
EMI50.1
Tris-HCl, pH 7, 5, 10 mM de MgC12, 10 mM de 2-mercaptoéthanol et 100 ug/ml de BSA, et le mélange resultant a été soumis ä une ligature selon l'exemple P-6 (A). Une portion aliquote de 5 lil du mélange de ligature résultant a ensuite été utilisée pour transformer JM103 de E. coli, dans les conditions de l'exemple P-4 (B).
On a soumis individuellement un nombre (200) des cellules transformées résultantes aux études sur NT et T. ni (sans connaissance prealabele de quel était le codon en XXX qui était dans un clone particulier) et on a trouvé qu'elles produisaient un niveau d'activité indiquant bien que tous les divers mutants avaient conduit à un produit protéinique à activité insecticide ayant une activité au moins environ égale ä celle de l'endotoxine tronquée témoin, les mutants ascendants transparents (5 X témoin) étant également indiqués.
Avant cela, on a egalement sélectionné des cellules aléatoires de la transformation, on les a mises dans des boites de culture et on a cultivé les colonies comme dans l'exemple P-1 pour isoler l'ADN plasmide pour l'analyse séquentielle d'ADN par clonage du fragment Bam HI/Xba I dans les vecteurs de séquençage mp18 et mp19 coupés avec les memes enzymes. L'ADN dans la région de chacune des 11 mutations en position 116 et des mutants ascendants identifiés a ensuite été sequence pour déterminer l'acide aminé pour lequel codait sa position 116. On a trouvé que l'un des deux mutants ascendants était le mutant ascendant initial (116-Lys, mais codé par AAA). On a trouvé que l'autre mutant ascendant était 116-Arg pour lequel codait CGT.
On a trouvé
<Desc/Clms Page number 51>
que l'un des autres clones était le 116-Glu natif (mais codé par GAA). Sept des autres mutants légers était 116-Ile (ATT), 116-Cys (TGC), 116-Leu (CTC), 116-Asp (GAT), 116-Asn (AAC), 116-Ile (ATT) et 116-Gly (GGA), tous uniques, sauf que le nouveau 116-Ile (ATT) était représenté par deux des clones. Les clones finals codaient pour 116-STOP (TGA).
B) On a répété la procédure de la partie A) de cet exemple 2 pour l'acide amine en position 119 en utilisant l'ADN représenté sur la figure 3B. Une fois encore, l'éva- luation aléatoire d'un grand nombre de clones résultants a produit un niveau d'activité dans les études sur NT et T. ni indiquant bien que tous les clones mutants dans le groupe total étaient actifs.
(Le pourcentage de molécules inactives était environ égal à ce que l'on attendrait pour la fréquence des codons d'arrêt UAA, UAG et UGA d'après les données aléatoires des nucléotides en position XXX faites par la machine.) Il a été indiqué que plusieurs clones individuels sélectionnés au hasard avaient chacun un niveau d'activité au moins environ égal à celle de l'endotoxine de la séquence native tronquée produite par prAK, mais qu'aucun n'était un mutant ascendant selon notre étalon arbitraire.
Le séquençage des sept clones individuels a montré qu'ils étaient tous differents et uniques, comme suit : 119-Leu (CTA), 119-Tyr (TAC), 119-Asp (GAT), 119-His (CAT), 119-Pro (CCA), 119-Ile (ATT) et 119-Ser (TCT).
EXEMPLE I
Endotoxine de B. t. mutante complete
Le plasmide pBT210 (1 gg) a été simultanément coupe avec les endonucléases de restriction Bam HI (8 unités) et Ssc I (8 unites) pendant 60 minutes dans une solution tampon de chlorure de sodium 100 mM contenant aussi 6 mM de Tris-
EMI51.1
HCl (pH 7, 9), 6 mM de MgC12 et 100 ug/ml de sérumalbumine de boeuf. Le plus grand fragment d'environ 7180 paires de bases a eté purifié sur gel pour être utilisé comme vecteur.
Ensuite, 1 lig de plasmide prAK-26-3 faisant intervenir les mu-
<Desc/Clms Page number 52>
tations Ala--+Thr en 119, Met--+Ile en 130 et Gly--+Asp en 201 a été également simultanément coupé avec les endonu-
EMI52.1
cléases de restriction Bam HI (8 unités) et Sst I (8 unités) dans une solution tampon de chlorure de sodium 100 mM contenant également 6 mM de Tris-HCl (pH 7, 9), 6 mM de MgC12 et 100 g/ml de sérumalbumine de boeuf.
Le plus petit fragment d'environ 1428 paires de bases contenant les mutations ainsi que la section RBS de B. t. a été purifié sur gel et ce fragment, en une quantité d'environ 0, 06 pmole, a été combiné pour une ligature avec 0, 02 pmole du fragment du vecteur de 7180 paires de bases obtenu ci-dessus et relié ensemble dans 20 1 de milieu de ligature contenant 60 mM de Tris-HCl, pH
EMI52.2
7, 5, 10 mM de MgCl, 1 mM de dithiothréitol, SOM d'ATP et 20 unités d'ADN-ligase T4, et le mélange résultant a été incubé pendant 4 heures ä 14 C.
Le plasmide résultant, désigné par pBt 26-3, a été transformé en JM103 de E. coli par addition de 5 lil dudit mélange de ligature ä 0, 2 ml de JM103 de E. coli compétente, maintien initialement à OOC pendant 30 mi- nutes, puis impulsion à 420C pendant 2 minutes et retour ä la glace. Différentes quantités (2 lit, 20 p. l et 180. p. l) du mélange résultant ont ensuite été immédiatement étalées sur des plaques de gélose YT avec 20 gg/ml de chloramphénicol (bouillon YT plus 1, 5% de bacto-gélose) et les plaques ont été incubées pendant une nuit ä 370C retournées. Seule une cellule transformée avec résistance au chloramphenicol a pu croître sur ces plaques.
Les colonies résistantes au chlo- ramphénicol ont été cultivées en culture liquide pendant une nuit ä 370C et un ADN plasmide a été préparé pour digestion de restriction avec des réactifs EcoRI et séquençage d'ADN pour déterminer reellement la présence des mutations ponc- tuelles. On a ensuite évalué, dans les etudes sur NT et T. ni, les transformants contenant le plasmide pBT 26-3 ayant réussi.
En procédant de manière analogue ä l'exemple 3 ci-des- . sus, on a préparé les endotoxines mutantes complètes addi-
<Desc/Clms Page number 53>
tionnelles suivantes et on les a évaluées dans les études sur NT et T. ni. Le tableau F ci-dessous indique les systemes plasmide/cellule produisant l'endotoxine mutante additionnelle complete qui ont ainsi été préparés, tous avec les résultats approximatifs de leur evaluation dans l'étude sur NT et les résultats approximatifs obtenus dans cette étude pour le produit de l'exemple 3 ci-dessus, l'endotoxine native de B. t. wuhanensis produite dans JM103 de E. coli et un témoin faisant intervenir des cellules JM103 non transfor-
EMI53.1
mees.
<Desc/Clms Page number 54>
TABLEAU F
EMI54.1
<tb>
<tb> Identification <SEP> Source <SEP> de
<tb> du <SEP> nouveau <SEP> sequence <SEP> Mutation <SEP> (s)
<tb> plasmide <SEP> mutante <SEP> réellement <SEP> Score <SEP> de
<tb> Exemple <SEP> mutant <SEP> Bam <SEP> HI/ <SEP> mise(s) <SEP> en <SEP> toxicité
<tb> n <SEP> complet <SEP> Sst <SEP> I <SEP> jeu <SEP> Essai <SEP> NT
<tb> 3 <SEP> pBT26-3 <SEP> prAK-26-3 <SEP> 119-Thr <SEP> 1
<tb> 130-Ile
<tb> 201-Asp
<tb> 3-A <SEP> pBT36a65 <SEP> prAK-36a6 <SEP> 122-Ile <SEP> 2
<tb> 125-Val
<tb> 3-B <SEP> pBT-C <SEP> $prAK-C <SEP> 116-Lys <SEP> 1
<tb> 3-C <SEP> pBT-E <SEP> prAK-E <SEP> 130-Ile <SEP> 2
<tb> 201-Asp
<tb> 3-D <SEP> pBT-0 <SEP> prAK-O <SEP> 116-Lys <SEP> 2
<tb> 217-His
<tb> 3-E <SEP> pBT-R <SEP> prAK-R <SEP> 101-Lys <SEP> 2
<tb> 116-Lys
<tb> 122-Ile
<tb> 125-Val
<tb> 3-F <SEP> pBT98c1 <SEP> prAK-98c1 <SEP> 188-Ser <SEP> 2
<tb> 3-G <SEP> pBT-B <SEP>
prAK-B <SEP> 119-Thr <SEP> 2
<tb> 3-H <SEP> pBT-D <SEP> prAK-D <SEP> 217-His <SEP> 3
<tb> 3-I <SEP> pBT-F <SEP> prAK-F <SEP> 187-Thr <SEP> 2,5
<tb> 3-J <SEP> pBT-J <SEP> prAK-J <SEP> 101-Lys <SEP> 3
<tb> 116-Lys
<tb> 130-Ile
<tb> 201-Asp
<tb> 3-K <SEP> pBT-M <SEP> prAK-M <SEP> 119-Thr <SEP> 2,5
<tb> 217-His
<tb> 3-L <SEP> pBT-N <SEP> prAK-N <SEP> 119-Thr <SEP> 3
<tb> 187-Thr
<tb> 3-M <SEP> pBT-S <SEP> prAK-S <SEP> 119-Thr <SEP> 1
<tb> 188-Ser
<tb>
<Desc/Clms Page number 55>
TABLEAU F (suite)
EMI55.1
<tb>
<tb> Identification <SEP> Source <SEP> de
<tb> du <SEP> nouveau <SEP> sequence <SEP> Mutation <SEP> (s)
<tb> plasmide <SEP> mutante <SEP> réellement <SEP> Score <SEP> de
<tb> Example <SEP> mutant <SEP> Bam <SEP> HI/ <SEP> mise(s)
<SEP> en <SEP> toxicité
<tb> n <SEP> complet <SEP> Sst <SEP> I <SEP> jeu <SEP> Essai <SEP> NT
<tb> 3-N <SEP> pBT-T <SEP> prAK-T <SEP> 116-Lys <SEP> 1,5
<tb> 188-Ser
<tb> 3-O <SEP> pBT-U <SEP> prAK-U <SEP> 101-Lys <SEP> 2
<tb> 116-Lys
<tb> 188-Ser
<tb> 3-P <SEP> pBT107c22 <SEP> p107c22 <SEP> 94-Lys <SEP> 3
<tb> 194-Lys
<tb> 3-Q <SEP> pBT99c62 <SEP> p99c26 <SEP> 4-Thr <SEP> 3
<tb> 105-Tyr
<tb> 204-Tyr
<tb> 3-R <SEP> pBT107c25 <SEP> p107c25 <SEP> 184-Ile <SEP> 3
<tb> 3-S <SEP> PBT-A <SEP> prAK-A <SEP> 101-Lys <SEP> 3
<tb> 116-Lys
<tb> 3-T <SEP> pBT-K <SEP> prAK-K <SEP> 101-Lys <SEP> 3
<tb> 116-Lys
<tb> 187-Thr
<tb> 3-U <SEP> pBT-P <SEP> prAK-P <SEP> 119-Thr <SEP> 2,
5
<tb> 122-Ile
<tb> 125-Val
<tb> 3-V <SEP> pBT-Q <SEP> prAK-Q <SEP> 116-Lys <SEP> 3
<tb> 122-Ile
<tb> 125-Val
<tb> 3-W <SEP> pBT39 <SEP> prAK-39 <SEP> 105-Tyr <SEP> 3
<tb> 188-Ser
<tb> 3-X <SEP> pBT70 <SEP> prAK-70 <SEP> 119-Thr <SEP> 1
<tb> 184-Ile
<tb> 3-Y <SEP> pBT68 <SEP> prAK-68 <SEP> 105-Tyr <SEP> 1
<tb> 130-Ile
<tb> 201-Asp
<tb>
<Desc/Clms Page number 56>
TABLEAU F (suite)
EMI56.1
<tb>
<tb> Identification <SEP> Source <SEP> de <SEP> :
<tb> du <SEP> nouveau <SEP> sequence <SEP> Mutation <SEP> (s)
<tb> plasmide <SEP> mutante <SEP> réellement <SEP> Score <SEP> de
<tb> Exemple <SEP> mutant <SEP> Bam <SEP> HI/ <SEP> mise <SEP> (s) <SEP> en <SEP> toxicité
<tb> n <SEP> complet <SEP> Sst <SEP> I <SEP> jeu <SEP> Essai <SEP> NT
<tb> 3-Z <SEP> pBT53 <SEP> prAK-53 <SEP> 105-Tyr <SEP> 3
<tb> 184-Ile
<tb> B.T. <SEP> - <SEP> - <SEP> 3
<tb> Wuhanensis
<tb> - <SEP> jet03 <SEP> - <SEP> - <SEP> 4. <SEP> 7
<tb>
EXEMPLE 4
Endotoxines de B. t. mutantes completes additionnelles
Le plasmide pBT210 (1 ug) a été digéré simultanément avec les endonucléases de restriction Bam HI (8 unités) et Sst I (8 unités) et le grand fragment de 7180 bp résultant a été isolé sur gel.
Dans une série d'expériences séparées on a également digéré simultanément chacun (1 gag) des plasmides prAK, prAK-E, p26-3, p36a65 et p95a86 avec les endonucléases de restriction Bam HI (8 unités) et Sst I (8 unités), et on a isolé sur gel chaque fragment de 1428 bp résultant comprenant une portion d'une séquence codante d'endotoxine tronquée. Chaque quantité de ces fragments de 1428 bp a ensuite été digérée séparément avec l'endonucléase de restriction Fnu D2 (4 unités dans 6 mM de NaCl, 6 mM de Tris-HCl (pH 7, 4), 6 mM de MgCl, 6 mM de 2-mercaptoethanol, 100 g/ml de sérumalbumine de boeuf).
L'endonucléase de restriction Fnu D2 (connue également sous le nom de Acc 2) ne coupe qu'une fois chacun des divers fragments Bam HI/Sst 1 de 1428 bp et coupe dans un fragment Bam HI/Fnu D2 de 640 bp et un fragment Fnu D2/Sst I de 788 bp, les différents fragments de chaque expérience étant purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose.
On a aussi obtenu une série de fragments différents Bam
<Desc/Clms Page number 57>
HI/Fnu D2 de 640 bp et une série de fragments différents Fnu D2/Sst I de 788 bp. En sélectionnant un fragment dans chacune de ces deux séries et en effectuant une ligature (exem- ple P-6B) avec le fragment plus grand de 7180 bp obtenu de pBT210, on a obtenu un certain nombre de nouveaux plasmides abritant différents gènes d'endotoxine de B. t. mutants complets.
Les nouveaux plasmides ainsi obtenus, identifiés ci-dessous dans le tableau G, ont ensuite été utilisés pour transformer JM103 de E. coli selon la procedure de l'exemple P-4 (A) et on a évalué les cellules résultantes pour la pro-
EMI57.1
duction d'endotoxine de B. dans l'étude NT de l'exemple A, les résultats approximatifs obtenus dans cette étude étant également consignés ci-dessous dans le tableau G.
Diverses cellules parmi les cellules transformees contenant les plasmides décrits dans les tableaux F et G ont également été évaluées dans l'etude sur T. ni, dont les résultats sont consignés dans le tableau H.
<Desc/Clms Page number 58>
TABLEAU G
EMI58.1
<tb>
<tb> IDENTIFICATION
<tb> DU <SEP> NOUVEAU <SEP> SOURCE <SEP> DE <SEP> SOURCE <SEP> DE
<tb> PLASMIDE <SEP> FRAGMENT <SEP> FRAGMENT <SEP> MUTATION <SEP> (S) <SEP> SCORE
<tb> EXEMPLE <SEP> MUTANT-.
<SEP> BAM <SEP> HI/FNU <SEP> D2/REELLEMENT <SEP> ESSAL
<tb> Ne <SEP> COMPLET <SEP> FNU <SEP> D2 <SEP> SST <SEP> I <SEP> MISE <SEP> (S) <SEP> ENJEU <SEP> NT
<tb> 4-A <SEP> 66 <SEP> p36a65 <SEP> p26-3 <SEP> 122-Ile <SEP> 3
<tb> 125-Val
<tb> 201-Asp
<tb> 4-B <SEP> 67 <SEP> p26-3 <SEP> p95a86 <SEP> 119-Thr <SEP> 1
<tb> 130-Ile
<tb> 188-Ser
<tb> 4-C <SEP> 74 <SEP> p36a65 <SEP> p95a86 <SEP> 122-Ile <SEP> 3
<tb> 125-Val
<tb> 188-Ser
<tb> 4-D <SEP> 106 <SEP> p26-3 <SEP> prAK <SEP> 119-Thr <SEP> 1
<tb> 130-Ile
<tb> 4-E <SEP> 107 <SEP> prAK <SEP> p26-3 <SEP> 201-Asp <SEP> 2.
<SEP> 5
<tb> 4-F <SEP> 108 <SEP> prAK-E <SEP> prAK <SEP> 130-Ile <SEP> 3
<tb>
TABLEAU H
EMI58.2
<tb>
<tb> IDENTIFICATION <SEP> TABLEAU <SEP> ACTIVITE
<tb> DU <SEP> PLASMIDE <SEP> SOURCE <SEP> RELATIVE
<tb> pBTA <SEP> F <SEP> 391
<tb> pBTC <SEP> F <SEP> 299
<tb> pBT66 <SEP> F <SEP> 169
<tb> pBT107c25 <SEP> F <SEP> 254
<tb> pBTP <SEP> F <SEP> 340
<tb> pBTS <SEP> F <SEP> 255
<tb> pBT67 <SEP> G <SEP> 304
<tb> pBT106 <SEP> G <SEP> 367
<tb> Etalon <SEP> pBT301 <SEP> 100
<tb> Temoin <SEP> SAN415 <SEP> 59
<tb> Témoin <SEP> CAG629 <SEP> 0
<tb>
<Desc/Clms Page number 59>
EXEMPLE 5
Les cellules transformées avec un ADN codant pour une séquence d'endotoxine mutante sont cultivees dans un fermenteur, dans des conditions connues et standards ä cet effet.
L'ensemble du contenu du fermenteur est soumis, ä la fin de la croissance cellulaire et immédiatement avant la récolte, ä une élévation de température jusqu'à environ 70-800C.
Cette température est maintenue pendant 10 minutes avant refroidissement et est suffisante pour inactiver les micro-organismes recombinants sans affecter l'activité biologique des protéines endotoxines. On évapore ensuite sous pression le contenu du fermenteur pour le concentrer au 1/3 du volume précédent et on soumet le concentré résultant ä un séchage par atomisation sous une pression d'insertion d'environ 13 790 kPa en utilisant une circulation d'air chauffé ä contre-courant avec une température d'entrée de 140-160 C et une température de sortie de 20-50oC. On mélange la poudre résultante avec un véhicule, comme du soja dégraissé, pour former un concentré mouillable.
Des rapports convenables de celui-ci dépendront entre autres de la concentration souhaitée du produit final, mais peuvent, par exemple, etre de 60 : 40 parties en poids de la poudre au véhicule. Le concentré résultant contient de préférence de 0, 4 ä 10%, et mieux encore de 0, 8 ä 8%, de substance active, en termes de spores ou de protéine endotoxine.
La poudre mouillable est avantageusement diluée avec de l'eau, comme il est connu dans la technique, pour être appliquée par pulvérisation.
<Desc/Clms Page number 60>
TABLE A
EMI60.1
<tb>
<tb> (a)-46
<tb> GG <SEP> ATC <SEP> CGT <SEP> TTT <SEP> AAA <SEP> TTG <SEP> TAG <SEP> TAA <SEP> TGA <SEP> AAA <SEP> ACA <SEP> GTA <SEP> TTA
<tb> Ile <SEP> Arg <SEP> Phe <SEP> Lys <SEP> Leu <SEP> *** <SEP> *** <SEP> *** <SEP> Lys <SEP> Thr <SEP> Val <SEP> Leu
<tb> TAT <SEP> CAT <SEP> AAT <SEP> GAA <SEP> TTG <SEP> GTA <SEP> TCT <SEP> TAA <SEP> TAA <SEP> AAG <SEP> AGA <SEP> TGG <SEP> AGG <SEP> TAA <SEP> CTT
<tb> Tyr <SEP> His <SEP> Asn <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Val <SEP> Ser <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Trp <SEP> Arg <SEP> *** <SEP> Leu
<tb> (-15)
<tb> 45
<tb> ATG <SEP> GAT <SEP> AAC <SEP> AAT <SEP> CCG <SEP> AAC <SEP> ATC <SEP> AAT <SEP> GAA <SEP> TGC <SEP> ATT <SEP> CCT <SEP> TAT <SEP> AAT <SEP> TGT
<tb> Met <SEP> Asp <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> Pro <SEP> Asn <SEP> Ile <SEP> Asn <SEP> Glu <SEP> Cys <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Tyr <SEP> Asn <SEP> Cys
<tb> (1) <SEP> (4) <SEP> (15)
<tb> TTA <SEP> AGT <SEP> AAC <SEP> CCT <SEP> GAA <SEP> GTA <SEP> GAA <SEP> GTA <SEP> TTA <SEP> GGT <SEP> GGA <SEP> GAA <SEP> AGA <SEP> ATA <SEP> GAA
<tb> Leu <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Pro <SEP> Glu <SEP> Val <SEP> Glu <SEP> Val <SEP> Leu <SEP> Gly <SEP> Gly <SEP> Glu <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Glu
<tb> ACT <SEP> GGT <SEP> TAC <SEP> ACC <SEP> CCA <SEP> ATC <SEP> GAT <SEP> ATT <SEP> TCC <SEP> TTG <SEP> TCG <SEP> CTA <SEP> ACG <SEP> CAA <SEP> TTT
<tb> Thr <SEP> Gly <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Pro <SEP> Ile <SEP> Asp <SEP> Ile <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Thr <SEP> Gln <SEP> Phe
<tb> (b)
<tb> CTT <SEP> TTG <SEP> AGT <SEP> GAA <SEP> TTT <SEP> GTT <SEP> CCC <SEP> GGT <SEP> GCT <SEP> GGA <SEP> TTT <SEP> GTG <SEP> TTA <SEP> GGA <SEP> CTA
<tb> Leu <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Val <SEP> Pro <SEP> Gly <SEP> Ala <SEP> Gly <SEP> Phe <SEP> Val <SEP> Leu <SEP> Gly <SEP> Leu
<tb> (60)
<tb> GTT <SEP> GAT <SEP> ATA <SEP> ATA <SEP> TGG <SEP> GGA <SEP> ATT <SEP> TTT <SEP> GGT <SEP> CCC <SEP> TCT <SEP> CAA <SEP> TGG <SEP> GAC <SEP> GCA
<tb> Val <SEP> Asp <SEP> Ile <SEP> Ile <SEP> Trp <SEP> Gly <SEP> Ile <SEP> Phe <SEP> Gly <SEP> Pro <SEP> Ser <SEP> Gln <SEP> Trp <SEP> Asp <SEP> Ala
<tb> n-1
<tb> TTT <SEP> CTT <SEP> GTA <SEP> CAA <SEP> ATT <SEP> GAA <SEP> CAG <SEP> TTA <SEP> ATT <SEP> AAC <SEP> CAA <SEP> AGA <SEP> ATA <SEP> GAA <SEP> GAA
<tb> Phe <SEP> Leu <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Glu <SEP> Gln <SEP> Leu <SEP> Ile <SEP> Asn <SEP> Gln <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Glu <SEP> Glu
<tb> (m-1)
<tb> (c), <SEP> 300
<tb> TTC <SEP> GCT <SEP> AGG <SEP> AAC <SEP> CAAGCC <SEP> ATT <SEP> TCT <SEP> AGA <SEP> TTA <SEP> GAA <SEP> GGA <SEP> CTA <SEP> AGC <SEP> AAT
<tb> Phe.
<SEP> Ala <SEP> Arg <SEP> Asn <SEP> Gln <SEP> Ala <SEP> Ile <SEP> Ser <SEP> Arg <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Asn
<tb> (100) <SEP> (105)
<tb> CTT <SEP> TAT <SEP> CAA <SEP> ATT <SEP> TAC <SEP> GCA <SEP> GAA <SEP> TCT <SEP> TTT <SEP> AGA <SEP> GAG <SEP> TGG <SEP> GAA <SEP> GCA <SEP> GAT
<tb> Leu <SEP> Tyr <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Tyr <SEP> Ala <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Glu <SEP> Trp <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Asp
<tb> CCT <SEP> ACT <SEP> AAT <SEP> CCA <SEP> GCA <SEP> TTA <SEP> AGA <SEP> GAA <SEP> GAG <SEP> ATG <SEP> CGT <SEP> ATT <SEP> CAA <SEP> TTC <SEP> AAT
<tb> Pro <SEP> Thr <SEP> Asn <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Met <SEP> Arg <SEP> lleGln <SEP> Phe <SEP> Asn
<tb> (135)
<tb>
Notes :
(a) est le site Bam HI (b) est le site Spe 1 (c) est le site Xba I
<Desc/Clms Page number 61>
EMI61.1
<tb>
<tb> GAC <SEP> ATG <SEP> AAC <SEP> AGT <SEP> GCC <SEP> CTT <SEP> ACA <SEP> ACC <SEP> GCT <SEP> ATT <SEP> CCT <SEP> CTT <SEP> TTT <SEP> GCA <SEP> GTT
<tb> Asp <SEP> Met <SEP> Asn <SEP> Ser <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Thr <SEP> Thr <SEP> Ala <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Leu <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Val
<tb> (140)
<tb> 495
<tb> CAA <SEP> AAT <SEP> TAT <SEP> CAA <SEP> GTT <SEP> CCT <SEP> CTT <SEP> TTA <SEP> TCA <SEP> GTA <SEP> TAT <SEP> GTT <SEP> CAA <SEP> GCT <SEP> GCA
<tb> Gln <SEP> Asn <SEP> Tyr <SEP> Gln <SEP> Val <SEP> Pro <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Ala <SEP> Ala
<tb> (165)
<tb> 523
<tb> AAT <SEP> TTA <SEP> CAT <SEP> TTA <SEP> TCA <SEP> GTT <SEP> TTG <SEP> AGA <SEP> GAT <SEP> GTT <SEP> TCA <SEP> GTG <SEP> TTT <SEP> GGA <SEP> CAA
<tb> Asn <SEP> Leu <SEP> Hjs <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> ASp <SEP> Val <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Phe <SEP> Gly <SEP> Gln
<tb> (180)
<tb> 549 <SEP> 577
<tb> AGG <SEP> TGG <SEP> GGA <SEP> TTT <SEP> GAT <SEP> GCC <SEP> GCG <SEP> ACT <SEP> ATC <SEP> AAT <SEP> AGT <SEP> CGT <SEP> TAT <SEP> AAT <SEP> GAT
<tb> Arg <SEP> Trp <SEP> Gly <SEP> Phe <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Ala <SEP> Thr <SEP> Ile <SEP> Asn <SEP> Ser <SEP> Arg <SEP> Tyr <SEP> Asn'Asp
<tb> (195)
<tb> 606 <SEP> n-348 <SEP> 624
<tb> TTA <SEP> ACT <SEP> AGG <SEP> CTT <SEP> ATT <SEP> GGC <SEP> AAC <SEP> TAT <SEP> ACA <SEP> GAT <SEP> CAT <SEP> GCT <SEP> GTA <SEP> CGC <SEP> TGG
<tb> Leu <SEP> Thr <SEP> Arg <SEP> Leu <SEP> Ile <SEP> Gly <SEP> Aan <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Asp <SEP> His <SEP> Ala <SEP> Val <SEP> Arg <SEP> Trp
<tb> (m-116) <SEP> (210)
<tb> (d).
<SEP> 675
<tb> TAC <SEP> AAT <SEP> ACG <SEP> GGA <SEP> TTA <SEP> GAG <SEP> CGT <SEP> GTA <SEP> TGG <SEP> GGA <SEP> CCG <SEP> GAT <SEP> TCT <SEP> AGA <SEP> GAT
<tb> Tyr <SEP> Asn <SEP> Thr <SEP> Gly <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Arg <SEP> Val <SEP> Trp <SEP> Gly <SEP> Pro <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Arg <SEP> Asp
<tb> (225)
<tb> TGG <SEP> ATA <SEP> AGA <SEP> TAT <SEP> AAT <SEP> CAA <SEP> TTT <SEP> AGA <SEP> AGA <SEP> GAA <SEP> TTA <SEP> ACA <SEP> CTA <SEP> ACT <SEP> GTA
<tb> Trp <SEP> Ile <SEP> Arg <SEP> Tyr <SEP> Asn <SEP> Gln <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Thr <SEP> Leu <SEP> Thr <SEP> Val
<tb> TTA <SEP> GAT <SEP> ATC <SEP> GTT <SEP> TCT <SEP> CTA <SEP> TTT <SEP> CCG <SEP> AAC <SEP> TÄT <SEP> GAT <SEP> AGT <SEP> AGA <SEP> ACG <SEP> TAT
<tb> Leu <SEP> Asp <SEP> Ile <SEP> Val <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Phe <SEP> Pro <SEP> Asn <SEP> Tyr <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Tyr
<tb> (255)
<tb> CCA <SEP> ATT <SEP> CGA <SEP> ACA <SEP> GTT <SEP> TCC <SEP> CAA <SEP> TTA <SEP> ACA <SEP> AGA <SEP> GAA <SEP> ATT <SEP> TAT <SEP> ACA <SEP> AAC
<tb> Pro <SEP> Ile <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Val <SEP> Ser <SEP> Gln <SEP> Leu <SEP> Thr <SEP> Arg <SEP> Glu <SEP> Ile <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Asn
<tb> CCA <SEP> GTA <SEP> TTA <SEP> GAA <SEP> AAT <SEP> TTT <SEP> GAT <SEP> GGT <SEP> AGT <SEP> TTT <SEP> CGA <SEP> GGC <SEP> TCG <SEP> GCT <SEP> CAG
<tb> Pro <SEP> Val <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Aan <SEP> Phe <SEP> Asp <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Ala <SEP> Gln
<tb> GGC <SEP> ATA <SEP> GAA <SEP> GGA <SEP> AGT <SEP> ATT <SEP> AGG <SEP> AGT <SEP> CCA <SEP> CAT <SEP> TTG <SEP> ATG <SEP> GAT <SEP> ATA <SEP> CTT
<tb> Gly <SEP> Ile <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Arg <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> His <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Asp <SEP> Ile <SEP>
Leu
<tb> AAC <SEP> AGT <SEP> ATA <SEP> ACC <SEP> ATC <SEP> TAT <SEP> ACG <SEP> GAT <SEP> GCT <SEP> CAT <SEP> AGA <SEP> GGA <SEP> GAA <SEP> TAT <SEP> TAT
<tb> Asn <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Thr <SEP> Ile <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> His <SEP> Arg <SEP> Gly <SEP> Glu <SEP> Tyr <SEP> Tyr
<tb> TGG <SEP> TCA <SEP> GGG <SEP> CAT <SEP> CAA <SEP> ATA <SEP> ATG <SEP> GCT <SEP> TCT <SEP> CCT <SEP> GTA <SEP> GGG <SEP> TTT <SEP> TCG <SEP> GGG
<tb> Trp <SEP> Ser <SEP> Gly <SEP> His <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Met <SEP> Ala <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Gly
<tb>
Note :
(d) est le site Xba I
<Desc/Clms Page number 62>
EMI62.1
<tb>
<tb> CCA <SEP> GAA <SEP> TTC <SEP> ACT <SEP> TTT <SEP> CCG <SEP> CTA <SEP> TAT <SEP> GGA <SEP> ACT <SEP> ATG <SEP> GGA <SEP> AAT <SEP> GCA <SEP> GCT
<tb> Pro <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Pro <SEP> Leu <SEP> Tyr <SEP> Gly <SEP> Thr <SEP> Met <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Ala <SEP> Ala
<tb> CCA <SEP> CAA <SEP> CAA <SEP> CGT <SEP> ATT <SEP> GTT <SEP> GCT <SEP> CAA <SEP> CTA <SEP> GGT <SEP> CAG <SEP> GGC <SEP> GTG <SEP> TAT <SEP> AGA
<tb> Pro <SEP> Gln <SEP> Gin <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Val <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> Leu <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Gly <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Arg
<tb> ACA <SEP> TTA <SEP> TCG <SEP> TCC <SEP> ACT <SEP> TTA <SEP> TAT <SEP> AGA <SEP> AGA <SEP> CCT <SEP> TTT <SEP> AAT <SEP> ATA <SEP> GGG <SEP> ATA
<tb> Thr <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Leu <SEP>
Tyr <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Phe <SEP> Asn <SEP> Ile <SEP> Gly <SEP> Ile
<tb> AAT <SEP> AAT <SEP> CAA <SEP> CAA <SEP> CTA <SEP> TCT <SEP> GTT <SEP> CTT <SEP> GAC <SEP> GGG <SEP> ACA <SEP> GAA <SEP> TTT <SEP> GCT <SEP> TAT
<tb> Asn <SEP> Asn <SEP> Gln <SEP> Gln <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Leu <SEP> Asp <SEP> Gly <SEP> Thr <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Tyr
<tb> GGA <SEP> ACC <SEP> TCC <SEP> TCA <SEP> AAT <SEP> TTG <SEP> CCA <SEP> TCC <SEP> GCT <SEP> GTA <SEP> TAC <SEP> AGA <SEP> AAA <SEP> AGC <SEP> GGA
<tb> Gly <SEP> Thr <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Aan <SEP> Leu <SEP> Pro <SEP> Ser <SEP> Ala <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Arg <SEP> Lys <SEP> Ser <SEP> Gly
<tb> ACG <SEP> GTA <SEP> GAT <SEP> TCG <SEP> CTG <SEP> GAT <SEP> GAA <SEP> ATA <SEP> CCG <SEP> CCA <SEP> CAG <SEP> AAT <SEP> AAC <SEP> AGC <SEP> GTG
<tb> Thr <SEP> Val <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Asp <SEP>
Glu <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Pro <SEP> Gln <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> Val
<tb> CCA <SEP> CCT <SEP> AGG <SEP> CAA <SEP> GGA <SEP> TTT <SEP> AGT <SEP> CAT <SEP> CGA <SEP> TTA <SEP> AGC <SEP> CAT <SEP> GTT <SEP> TCA <SEP> ATG
<tb> Pro <SEP> Pro <SEP> Arg <SEP> Gln <SEP> Gly <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> His <SEP> Arg <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> His <SEP> Val <SEP> Ser <SEP> Met
<tb> 1350
<tb> TTG <SEP> CGT <SEP> TCA <SEP> GGC <SEP> TTT <SEP> AGT <SEP> AAT <SEP> AGT <SEP> AGT <SEP> GTA <SEP> AGT <SEP> ATA <SEP> ATA <SEP> AGA <SEP> GCT
<tb> Phe <SEP> Arg <SEP> Ser <SEP> Gly <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Ile <SEP> Arg <SEP> Ala
<tb> (450)
<tb> CCT <SEP> ATG <SEP> TTC <SEP> TCT <SEP> TGG <SEP> ATA <SEP> CAT <SEP> CGT <SEP> AGT <SEP> GCT <SEP> GAA <SEP> TTT <SEP> AAT <SEP> AAT <SEP> ATA
<tb> Pro <SEP> Met <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Trp <SEP> Ile <SEP> His <SEP> Arg <SEP> Ser <SEP> Ala <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> Ile
<tb> ATT <SEP> CCT <SEP> TCA <SEP> TCA <SEP> CAA <SEP> ATT <SEP> ACA <SEP> CAA <SEP> ATA <SEP> CCT <SEP> TTA <SEP> ACA <SEP> AAA <SEP> TCT <SEP> ACT
<tb> Ile <SEP> Pro <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Gin <SEP> Ile <SEP> Thr <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Leu <SEP> Thr <SEP> Lys <SEP> Ser <SEP> Thr
<tb> AAT <SEP> CTT <SEP> GGC <SEP> TCT <SEP> GGA <SEP> ACT <SEP> TCT <SEP> GTC <SEP> GTT-AAA <SEP> GGA <SEP> CCA <SEP> GGA <SEP> TTT <SEP> ACA
<tb> Asn <SEP> Leu <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Gly <SEP> Thr <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Gly <SEP> Pro <SEP> Gly <SEP> Phe <SEP> Thr
<tb>
GGA <SEP> GGA <SEP> GAT <SEP> ATT <SEP> CTT <SEP> CGA <SEP> AGA <SEP> ACT <SEP> TCA <SEP> CCT <SEP> GGC <SEP> CAG <SEP> ATT <SEP> TCA <SEP> ACC
<tb> Gly <SEP> Gly <SEP> Äsp <SEP> Ile <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> Gly <SEP> Gin <SEP> Ile <SEP> Ser <SEP> Thr
<tb> TTA <SEP> AGA <SEP> GTA <SEP> AAT <SEP> ATT <SEP> ACT <SEP> GCA <SEP> CCA <SEP> TTA <SEP> TCA <SEP> CAA <SEP> AGA <SEP> TAT <SEP> CGG <SEP> GTA
<tb> Leu <SEP> Arg <SEP> Val <SEP> Asn <SEP> Ile <SEP> Thr <SEP> Ala <SEP> Pro <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Gln <SEP> Arg <SEP> Tyr <SEP> Arg <SEP> Val
<tb> AGA <SEP> ATT <SEP> CGC <SEP> TAC <SEP> GCT <SEP> TCT <SEP> ACC <SEP> ACA <SEP> AAT <SEP> TTA <SEP> CAA <SEP> TTC <SEP> CAT <SEP> ACA <SEP> TCA
<tb> Arg <SEP> Ile <SEP> Arg <SEP> Tyr <SEP> Ala <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Thr <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Gln <SEP> Phe <SEP> His <SEP> Thr <SEP> Ser
<tb>
ATT <SEP> GAC <SEP> GGA <SEP> AGA <SEP> CCT <SEP> ATT <SEP> AAT <SEP> CAG <SEP> GGG <SEP> AAT <SEP> TTT <SEP> TCA <SEP> GCA <SEP> ACT <SEP> ATG
<tb> Ile <SEP> Asp <SEP> Gly <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Ile <SEP> Asn <SEP> Gln <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Ala <SEP> Thr <SEP> Met
<tb> AGT <SEP> AGT <SEP> GGG <SEP> AGT <SEP> AAT <SEP> TTA <SEP> CAG <SEP> TCC <SEP> GGA <SEP> AGC <SEP> TTT <SEP> AGG <SEP> ACT <SEP> GTA <SEP> GGT
<tb> Ser <SEP> Ser <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Gln <SEP> Ser <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Val <SEP> Gly
<tb> TTT <SEP> ACT <SEP> ACT <SEP> CCG <SEP> TTT <SEP> AAC <SEP> TTT <SEP> TCA <SEP> AAT <SEP> GGA <SEP> TCA <SEP> AGT <SEP> GTA <SEP> TTT <SEP> ACG
<tb> Phe <SEP> Thr <SEP> Thr <SEP> Pro <SEP> Phe <SEP> Asn <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Phe <SEP> Thr
<tb>
<Desc/Clms Page number 63>
EMI63.1
<tb>
<tb> TTA <SEP> AGT <SEP> GCT <SEP> CAT <SEP> GTC <SEP> TTC <SEP> AAT <SEP> TCA <SEP> GGC <SEP> AAT <SEP> GAA <SEP> GTT <SEP> TAT <SEP> ATA <SEP> GAT
<tb> Leu <SEP> Ser <SEP> Ala <SEP> His <SEP> Val <SEP> Phe <SEP> Asn <SEP> Ser <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Glu <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Ile <SEP> Asp
<tb> CGA <SEP> ATT <SEP> GAA <SEP> TTT <SEP> GTT <SEP> CCG <SEP> GCA <SEP> GAA <SEP> GTA <SEP> ACC <SEP> TTT <SEP> GAG <SEP> GCA <SEP> GAA <SEP> TAT
<tb> Arg <SEP> Ile <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Val <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Glu <SEP> Val <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Glu <SEP> Tyr
<tb> (610)
<tb> GAT <SEP> TTA <SEP> GAA <SEP> AGA <SEP> GCA <SEP> CAA <SEP> AAG <SEP> GCG <SEP> GTG <SEP> AAT <SEP> GAG <SEP> CTG <SEP> TTT <SEP> ACT <SEP> TCT
<tb> Asp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Arg <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> Lys <SEP> Ala <SEP> Val <SEP> Asn <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Phe <SEP> Thr <SEP> Ser
<tb> TCC <SEP> AAT <SEP> CAA <SEP> ATC <SEP> GGG <SEP> TTA <SEP> AAA <SEP> ACA <SEP> GAT <SEP> GTG <SEP> ACG'GAT <SEP> TAT <SEP> CAT <SEP> ATT
<tb> Ser <SEP> Asn <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Gly <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Thr <SEP> Asp <SEP> Val <SEP> Thr <SEP> Asp <SEP> Tyr <SEP> His <SEP> Ite
<tb> GAT <SEP> CAA <SEP> GTA <SEP> TCC <SEP> AAT <SEP> TTA <SEP> GTT <SEP> GAG <SEP> TGT <SEP> TTA <SEP> TCT <SEP> GAT <SEP> GAA <SEP> TTT <SEP> TGT
<tb> ASp'GIn <SEP> Val <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Val <SEP> Glu <SEP> Cys <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Cys
<tb> CTG
<SEP> GAT <SEP> GAA <SEP> AAA <SEP> AAA <SEP> GAA <SEP> TTG <SEP> TCC <SEP> GAG <SEP> AAA <SEP> GTC <SEP> AAA <SEP> CAT <SEP> GCG <SEP> MG,
<tb> Leu <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Glu <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> His <SEP> Ala <SEP> Lys
<tb> CGA <SEP> CTT <SEP> AGT <SEP> GAT <SEP> GAG <SEP> CGG <SEP> AAT <SEP> TTA <SEP> CTT <SEP> CAA <SEP> GAT <SEP> CCA <SEP> AAC <SEP> TTT <SEP> AGA
<tb> Arg <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Arg <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Gln <SEP> Asp <SEP> Pro <SEP> Asn <SEP> Phe <SEP> Arg
<tb> GGG <SEP> ATC <SEP> AAT <SEP> AGA <SEP> CAA <SEP> CTA <SEP> GAC <SEP> CGT <SEP> GGC <SEP> TGG <SEP> AGA <SEP> GGA <SEP> AGT <SEP> ACG <SEP> GAT
<tb> Gly <SEP> Ile <SEP> Asn <SEP> Arg <SEP> Gin <SEP> Leu <SEP> Asp <SEP> Arg <SEP> Gly <SEP> Trp <SEP> Arg <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Asp
<tb> ATT
<SEP> ACC <SEP> ATC <SEP> CAA <SEP> GGA <SEP> GGC <SEP> GAT <SEP> GAC <SEP> GTA <SEP> TTC <SEP> AAA <SEP> GAG <SEP> AAT <SEP> TAC <SEP> GTT
<tb> Ile <SEP> Thr <SEP> Ile <SEP> Gin <SEP> Gly <SEP> Gly <SEP> Asp <SEP> Asp <SEP> Val <SEP> Phe <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Asn <SEP> Tyr <SEP> Val
<tb> (e)
<tb> ACG <SEP> CTA <SEP> TTG <SEP> GGT <SEP> ACC <SEP> TTT <SEP> GAT <SEP> GAG <SEP> TGC <SEP> TAT <SEP> CCA <SEP> ACG <SEP> TAT <SEP> TTA <SEP> TAT
<tb> Thr <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Gly <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Cys <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Leu <SEP> Tyr
<tb> (723)
<tb> 2250
<tb> CAA <SEP> AAA <SEP> ATA <SEP> GAT <SEP> GAG <SEP> TCG <SEP> AAA <SEP> TTA <SEP> AAA <SEP> GCC <SEP> TAT <SEP> ACC <SEP> CGT <SEP> TAC <SEP> CAA
<tb> Gln <SEP> Lys <SEP> Ile <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Lys <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Arg <SEP> Tyr <SEP> Gln
<tb> (750)
<tb> TTA <SEP> AGA <SEP> GGG <SEP> TAT <SEP> ATC <SEP> GAA <SEP> GAT <SEP> AGT <SEP> CAA <SEP> GAC <SEP> TTA <SEP> GAA <SEP> ATC <SEP> TAT <SEP> TTA
<tb> Leu <SEP> Arg <SEP> Gly <SEP> Tyr <SEP> Ile <SEP> Glu <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Gln <SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Ile <SEP> Tyr <SEP> Leu
<tb> ATT <SEP> CGC <SEP> TAC <SEP> AAT <SEP> GCC <SEP> AAA <SEP> CAC <SEP> GAA <SEP> ACA <SEP> GTA <SEP> AAT <SEP> GTG <SEP> CCA <SEP> GGT <SEP> ACG
<tb> Ile <SEP> Arg <SEP> Tyr <SEP> Asn <SEP> Ala <SEP> Lys <SEP> His <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Val <SEP> Asn <SEP> Val <SEP> Pro <SEP> Gly <SEP> Thr
<tb> GGT <SEP> TCC <SEP> TTA <SEP> TGG <SEP> CCG <SEP> CTT <SEP> TCA <SEP> GCC <SEP> CCA <SEP> AGT <SEP> CCA <SEP> ATC <SEP> GGA <SEP> AAA <SEP> TGT
<tb> Gly <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Trp <SEP> Pro <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Ala <SEP> Pro <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> Ile <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP>
Cys
<tb>
Note : (e) est le site- : Kpn 1
<Desc/Clms Page number 64>
EMI64.1
<tb>
<tb> GGA <SEP> GAA <SEP> CCG <SEP> AAT <SEP> CGA <SEP> TGC <SEP> GCA <SEP> CCA <SEP> CAA <SEP> CTT <SEP> GAA <SEP> TGG <SEP> AAT <SEP> CCA <SEP> GAT
<tb> Gly <SEP> Glu <SEP> Pro <SEP> Asn <SEP> Arg <SEP> Cys <SEP> Ala <SEP> Pro <SEP> Gln <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Trp <SEP> Asn <SEP> Pro <SEP> Asp
<tb> CTA <SEP> GAT <SEP> TGT <SEP> TCC <SEP> TGC <SEP> AGA <SEP> GAC <SEP> GGA <SEP> GAA <SEP> AAA <SEP> TGT <SEP> GCC <SEP> CAT <SEP> CAT <SEP> TCC
<tb> Leu <SEP> Asp <SEP> Cys <SEP> Ser <SEP> Cys <SEP> Arg <SEP> Asp <SEP> Gly <SEP> Glu <SEP> Lys <SEP> Cys <SEP> Ala <SEP> His <SEP> His <SEP> Ser
<tb> C <SEP> AT <SEP> CAT <SEP> TTC <SEP> TCC <SEP> TTG <SEP> GAC <SEP> ATT <SEP> GAT <SEP> GTT <SEP> GGA <SEP> rGT <SEP> ACA <SEP> GAC <SEP> TTA <SEP> AAT
<tb> His <SEP> His <SEP>
Phe <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Asp <SEP> Ile <SEP> Asp <SEP> Val <SEP> Gly <SEP> Cys <SEP> Thr <SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> Asn
<tb> (840)
<tb> GAG <SEP> GAC <SEP> TTA <SEP> GGT <SEP> GTA <SEP> TGG <SEP> GTG <SEP> ATA <SEP> TTC <SEP> AAG <SEP> ATT <SEP> AAG <SEP> ACG <SEP> CAA <SEP> GAT
<tb> Glu <SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> Gly <SEP> Val <SEP> Trp <SEP> Val <SEP> Ile <SEP> Phe <SEP> Lys <SEP> Ile <SEP> Lys <SEP> Thr <SEP> Gln <SEP> Asp
<tb> GGC <SEP> CAT <SEP> GCA <SEP> AGA <SEP> CTA <SEP> GGA <SEP> AAT <SEP> CTA <SEP> GAA <SEP> TTT <SEP> CTC <SEP> GAA <SEP> GAG <SEP> AAA <SEP> CCA
<tb> Gly <SEP> His <SEP> Ala <SEP> Arg <SEP> Leu <SEP> Gly <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Lys <SEP> Pro
<tb> TTA <SEP> GTA <SEP> GGA <SEP> GAA <SEP> GCA <SEP> CTA <SEP> GCT <SEP> CGT <SEP> GTG <SEP> AAA <SEP> AGA <SEP> GCG <SEP> GAG <SEP> AAA <SEP> AAA
<tb> Leu <SEP>
Val <SEP> Gly <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Ala <SEP> Arg <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Ala <SEP> Glu <SEP> Lys <SEP> Lys
<tb> 2700
<tb> TGG <SEP> AGA <SEP> GAC <SEP> AAA <SEP> CGT <SEP> GAA <SEP> AAA <SEP> TTG <SEP> GAA <SEP> TGG <SEP> GAA <SEP> ACA <SEP> AAT <SEP> ATT <SEP> GTT
<tb> Trp <SEP> Arg <SEP> Asp <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Glu <SEP> Lys <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Trp <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Asn <SEP> Ile <SEP> Val
<tb> (900)
<tb> TAT <SEP> AAA <SEP> GAG <SEP> GCA <SEP> AAA <SEP> GAA <SEP> TCT <SEP> GTA <SEP> GAT <SEP> GCT <SEP> TTA <SEP> TTT <SEP> GTA <SEP> AAC <SEP> TCT
<tb> Tyr <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Phe <SEP> Val <SEP> Asn <SEP> Ser
<tb> CAA <SEP> TAT <SEP> GAT <SEP> AGA <SEP> TTA <SEP> CAA <SEP> GCG <SEP> GAT <SEP> ACC <SEP> AAC <SEP> ATC <SEP> GCG <SEP> ATG <SEP> ATT <SEP> CAT
<tb> Gln <SEP> Tyr <SEP> Asp <SEP> Arg <SEP> Leu <SEP> Gln <SEP> Ala <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Asn <SEP> Ile <SEP> Ala <SEP> Met <SEP> Ile <SEP> His
<tb> GCG <SEP> GCA <SEP> GAT <SEP> AAA <SEP> CGC <SEP> GTT <SEP> CAT <SEP> AGC <SEP> ATT <SEP> CGA <SEP> GAA <SEP> GCT <SEP> TAT <SEP> CTG <SEP> CCT
<tb> Ala <SEP> Ala <SEP> Asp <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Val <SEP> His <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Arg <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Leu <SEP>
Pro
<tb> GAG <SEP> CTG <SEP> TCT <SEP> GTG <SEP> ATT <SEP> CCG <SEP> GGT <SEP> GTC <SEP> AAT <SEP> GCG <SEP> GCT <SEP> ATT <SEP> TTT <SEP> GAA <SEP> GAA
<tb> Glu <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Gly <SEP> Val <SEP> Asn <SEP> Ala <SEP> Ala <SEP> Ile <SEP> Phe <SEP> Glu <SEP> Glu.
<tb>
*TTA <SEP> GAA <SEP> GGG <SEP> CGT <SEP> ATT <SEP> TTC <SEP> ACT <SEP> GCA <SEP> TTC <SEP> TCC <SEP> CTA <SEP> TAT <SEP> GAT <SEP> GCG <SEP> AGA
<tb> Leu <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Phe <SEP> Thr <SEP> Ala <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Tyr <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Arg
<tb> AAT <SEP> GTC <SEP> ATT <SEP> AAA <SEP> AAT <SEP> GGT <SEP> GAT <SEP> TTT <SEP> AAT <SEP> AAT <SEP> GGC <SEP> TTA <SEP> TCC <SEP> TGC <SEP> TGG
<tb> Asn <SEP> Val <SEP> Ile <SEP> Lys <SEP> Asn <SEP> Gly <SEP> Asp <SEP> Phe <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> Gly <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Cys <SEP> Trp
<tb> AAC <SEP> GTG <SEP> AAA <SEP> GGG <SEP> CAT <SEP> GTA <SEP> GAT <SEP> GTA <SEP> GAA <SEP> GAA <SEP> CAA <SEP> AAC <SEP> AAC <SEP> CAC <SEP> CGT
<tb> Asn <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Gly <SEP> His <SEP> Val <SEP> Asp <SEP> Val <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Gln <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> His <SEP> Arg
<tb> TCG
<SEP> GTC <SEP> CTT <SEP> GTT <SEP> GTT <SEP> CCG <SEP> GAA <SEP> TGG <SEP> GAA <SEP> GCA <SEP> GAA <SEP> GTG <SEP> TCA <SEP> CAA <SEP> GAA
<tb> Ser <SEP> Val <SEP> Leu <SEP> Val <SEP> Val <SEP> Pro <SEP> Glu <SEP> Trp <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Glu <SEP> Val <SEP> Ser <SEP> Gln <SEP> Glu
<tb> GTT <SEP> CGT <SEP> GTC <SEP> TGT <SEP> CCG <SEP> GGT <SEP> CGT <SEP> GGC <SEP> TAT <SEP> ATC <SEP> CTT <SEP> CGT <SEP> GTC <SEP> ACA <SEP> GCG
<tb> Val <SEP> Arg <SEP> Val <SEP> Cys <SEP> Pro <SEP> Gly <SEP> Arg <SEP> Gly <SEP> Tyr <SEP> Ile <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Val <SEP> Thr <SEP> Ala
<tb>
<Desc/Clms Page number 65>
EMI65.1
<tb>
<tb> TAC <SEP> AAG <SEP> GAG'GGA <SEP> TAT <SEP> GGA <SEP> GAA <SEP> GGT <SEP> TGC <SEP> GTA <SEP> ACC <SEP> ATT <SEP> CAT <SEP> GAG <SEP> ATC
<tb> Tyr <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Tyr <SEP> Gly <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Cys <SEP> Val <SEP>
Thr <SEP> Ile <SEP> His <SEP> Glu <SEP> Ile
<tb> (t <SEP> 050)
<tb> GAG <SEP> AAC <SEP> AAT <SEP> ACA <SEP> GAC <SEP> GAA <SEP> CTG <SEP> AAG <SEP> TTT <SEP> AGC <SEP> AAC <SEP> TGT <SEP> GTA <SEP> GAA <SEP> GAG
<tb> Glu <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> Thr <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Cys <SEP> Val <SEP> Glu <SEP> Glu
<tb> 3240
<tb> GAA <SEP> GTA <SEP> TAT <SEP> CCA <SEP> AAC <SEP> AAC <SEP> ACG <SEP> GTA <SEP> ACG <SEP> TGT <SEP> AAT <SEP> GAT <SEP> TAT <SEP> ACT <SEP> GCG
<tb> Glu <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> Thr <SEP> Val <SEP> Thr <SEP> Cys <SEP> Asn <SEP> Asp <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Ala
<tb> (1080)
<tb> ACT <SEP> CAA <SEP> GAA <SEP> GAA <SEP> TAT <SEP> GAG <SEP> GGT <SEP> ACG <SEP> TAC <SEP> ACT <SEP> TCT <SEP> CGT <SEP> AAT <SEP> CGA <SEP> GGA
<tb> Thr <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Tyr <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Ser <SEP> Arg <SEP> Asn <SEP> Arg <SEP> Gly
<tb> TAT <SEP> GAC <SEP> GGA <SEP> GCT <SEP> TAT <SEP> GAA <SEP> AGC <SEP> AAT <SEP> TCT <SEP> TCT <SEP> GTA <SEP> CCA <SEP> GCT <SEP> GAT <SEP> TAT
<tb> Tyr <SEP> Asp <SEP> Gly <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Asp <SEP> Tyr
<tb> GCA <SEP> TCA <SEP> GCC <SEP> TAT <SEP> GAA <SEP> GAA <SEP> AAA <SEP> GCA <SEP> TAT <SEP> ACA <SEP> GAT <SEP> GGA <SEP> CGA <SEP> AGA <SEP> GAC
<tb> Ala <SEP> Ser <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Lys <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Asp <SEP> Gly <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP>
Asp
<tb> AAT <SEP> CCT <SEP> TGT <SEP> GAA <SEP> TCT <SEP> AAC <SEP> AGA <SEP> GGA <SEP> TAT <SEP> GGG <SEP> GAT <SEP> TAC <SEP> ACA <SEP> CCA <SEP> CTA
<tb> Asn <SEP> Pro <SEP> Cys <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Arg <SEP> Gly <SEP> Tyr <SEP> Gly <SEP> Asp <SEP> Tyr <SEP> Thr <SEP> Pro <SEP> Leu
<tb> CCA <SEP> GCT <SEP> GGC <SEP> TAT <SEP> GTG <SEP> ACA <SEP> AAA <SEP> GAA <SEP> TTA <SEP> GAG <SEP> TAC <SEP> TTC <SEP> CCA <SEP> GAA <SEP> ACC
<tb> Pro <SEP> Ala <SEP> Gly <SEP> Tyr <SEP> Val <SEP> Thr <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Tyr <SEP> Phe <SEP> Pro <SEP> Glu <SEP> Thr
<tb> GAT <SEP> AAG <SEP> GTA <SEP> TGG <SEP> ATT <SEP> GAG <SEP> ATC <SEP> GGA <SEP> GAA <SEP> ACG <SEP> GAA <SEP> GGA <SEP> ACA <SEP> TTC <SEP> ATT
<tb> Asp <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Trp <SEP> Ile <SEP> Glu <SEP> Ile <SEP> Gly <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP>
Ile
<tb> (1170)
<tb> GTG <SEP> GAT <SEP> AGC <SEP> GTG <SEP> GAA <SEP> TTA <SEP> CTC <SEP> CTT <SEP> ATG <SEP> GAG <SEP> GAA <SEP> TAG
<tb> Val <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> ***
<tb> (1181)
<tb>
Les mutations particuli rement pr f r es de l'invention englobent celles aux positions 116 (Lys ou Arg), 119 (Thr), 130 (Ile) et 188 (Ser) et les combinaisons incluant une ou plusieurs de celles-ci, comme celles que l'on trouve dans pBT26-3, pBT-106, pBT-68, pBT-C, pBT-67 et pBT-70 (certaines d'entre elles se trouvant sur le tableau G). Les mutations individuelles et combin es dans p36a65, en particulier pour les endotoxines tronqu es, pr sentent galement un int r t particulier.
Les mutations trouv es et permises selon l'invention en position d'acide amine 4 pr sentent un int r t car elles tombent dans une section de 25 acides amin s (positions 1 25 comprise, dans le tableau A), pour laquelle on a mis
<Desc/Clms Page number 66>
l'hypoth se qu'elle formait aussi une portion pr -toxine ou pro-toxine de l'endotoxine et qu'elle tait soumise un clivage par la prot ase dans l'intestin pour former l'endotoxine active ou une endotoxine plus active.
Par cons quent, les mutations permises en position 4 sont indiqu es comme tant appropri es aux s quences d'endotoxine comprenant lesdits 25 acides amin s ou ayant avec ceux-ci une homologie importante (d'au moins 70%), et tant plus particuli rement appropri es aux endotoxines codees dans cette r gion par un ADN qui s'hybriderait avant la mutation en position 4 et dans des conditions rigoureuses pour former un ADN ayant la s quence trouv e au tableau A pour les positions des nucl otides s' tendant du nucl otide en position 1 jusqu'au nucl otide en position 75 inclus, ind pendamment des d l tions et des additions et avec un codage equivalent des acides amin s correspondants, comme on l'a discut ci-dessus pour la zone de la s quence d'acides amin s 116 conserv e.
La mutation non couverte par nos travaux la position d'acide amin 217 et consign e au tableau B ci-dessus, et valu e comme on le voit ailleurs ici, est jug e indiquer que tous les acides amin s codes naturellement peuvent tre pr sents en cette position dans des endotoxines actives comportant la s quence appropri e, repr sent e sur le tableau A, qui s' tend depuis la fin de la s quence de r f rence d'acides amin s 116 jusqu'a la position d'acide amin 217 comprise. Par cons quent, la situation dans laquelle l'acide amin en position 217 dans une telle s quence ou un quivalent de celle-ci est n'importe quel acide amin cod naturellement, sauf Arg, est incluse dans le cadre de cette invention.
Cependant, comme la mutation indiqu e en position 217 a produit des r sultats moins int ressants, elle pr sente principalement un int r t en'combinaison avec les autres mutations d crites ici et indiquant que la position 217 peut changer dans des endotoxines dans lesquelles Arg se trouve naturellement cette position.