JPH06502077A - バシルス チュリンギエンシス（Ｂａｓｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） ｃｒｙＩＩＩＣ（ｂ）毒素遺伝子及び甲虫類昆虫に毒性のタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 パンルス　チ二すンギエンンス（Ｂａｓｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｊ ｓ）　ｃｒｙＩＩＩＣ（ｂ）毒素遺伝子及び甲虫類昆虫に毒性本発明は毘離バシ ルス　チュリンギエンシス株、その新規毒素をコードする遺伝子及びその遺伝子 により生成される殺虫性結晶タンパク質毒素、ならびに甲虫類昆虫にｔ性のタン パク質を含む殺虫性組成物に関する。

発明の背景 パンルス　チニリンギｘン／ス（Ｂａｓｉｌｌｕｓ　ｔｂｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ ｓ）（後文ではＢ、ｔ、“）はグラム−陽性土壌バクテリアであり、胞子分裂の 間にある種の目及び種の昆虫に特に毒性の結晶タンパク質を製造する。Ｂ、ｔ　 の多種多様の株が殺虫性結晶タンパク質含む組成物は、商業的に入手可能であり 、それらが特定の標的昆虫に非常に毒性であるが植物及び他の非禅的生物に無害 なので、環境的に受け入れらｎる殺虫剤として用いられてきた。

結晶タンパク質をコードする多くの遺伝子がＢｔ、のいくつかの株からクローニ ングさｎた。そのような遺伝子の再調査がＨ，ＨＯｆｔｅｅｔ　ａｌ、、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、、５３．Ｉ）］）、２４２−２５５　（１９８９）に 示されている。この参照文献は、Ｂ、ｔ　から得らｎる遺伝子及びタンパク質、 ならびにその利用に関する優れた概観を与え、Ｂｔ、遺伝子及びタンパク質に関 する命名及び分類表を採択し、広大な関連図書目録を有する。

Ｂ、ｔ、結晶タンパク質は昆虫において摂取後のみに毒性である。摂取後、昆虫 の牛腸のアルカリ性ｐＨ及びタンパク質分解酵素が結晶を溶解し、毒性成分を放 出させる。これらの毒性成分は牛腸細胞を崩壊させ、昆虫がものを食べるのを止 めさせ、結局死亡させる。実際Ｂ、ｔ　は、種々の昆虫有害生物を扱う場合に有 効で環境的に安全な殺虫剤であることがわかっている。

Ｈｏｆｔｅ　ｅｔ　ａｌ、により記されている通り、多数の殺虫性Ｂ。

ｔ１株が鱗翅類の目の昆虫、すなわち毛虫に対して活性である。他のＢ。

１８株は双翅類の目の昆虫、すなわちハエ及び蚊に対して、あるいは鱗翅類及び 双翅類の昆虫の両方に対して殺虫的に活性である。近年いくつかのＢ、ｔ　株が 甲虫類の目の昆虫、すなわちビートルに毒性の結晶タンパク質をｗ造することが 報告された。

甲虫類−毒性Ｂ、ｔ、株の最初の単離はＺ、ａｎｇｅｗ、Ｅｎｔ、。

ｅｔ　ａｌ、、により報告されている＋Ａ、Ｋｒｉｅｇ　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｎｚ、５ｃｈａｅｃｌｌ　ｉｎｇｓｋｄｅ、、Ｐｆ　Ｉ、ａｎｚｅｎｓｃｈｕ ｔｚ、Ｕｍｗｅｌｔｓｃｈｕｔｚ、５７．ｐｐ、１４５−１５０　（１９８４） 及び１９８８年８月２３日発行のＡ、Ｋｒｉｅｇ　ｅｔ　ａｌのＵ、Ｓ　特許４ ．７６６．２０３も参照せよ、、Ｂ、ｔ、Ｖａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓと指 定された株は、甲虫類の昆虫であるアゲラスチカアルニ（Ａｇｅｌａｓｔｊｃａ 　ａｌｎｊ）（ブルーアルダ−リーフビートル）及びレブチノタルサ　デセムリ ネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｅ　ｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌ　１ｎｅａｔａ）（コロ ラドボテドビートル）の幼虫に毒性であることが報告されている。Ｂ、ｔ、ｔｅ ｎｅｂｒｉｏｎｉＥ　ｓは約６５−７０キロダルトン（ｋＤａ）の殺虫性結晶タ ンパク質を製造すると報告されティる（Ｕ、Ｓ、特許４，７６６．２０３；に、 Ｂｅｒｎｈａｒｄ、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、、３３゜ｐｐ、 ２６１−２６５　（１９８６）も参照せよ）。

Ｖ、５ｅｋａｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４．ＤＩ）、７０３６−７０４０　（１９８７）は、Ｂ。

ｔ、、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの甲虫類−毒性結晶タンパク質に関する遺伝子の クローニング及び特性化を報告している。遺伝子の配列から推定されるタンパク 質の大きさは７３ｋＤａであるが、単離タンパク質は最初６５ｋＤａ成分を含ん ティた。Ｈｏｆ　ｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 、１５．　ｐ、７１８３　（１９８７）もＢ。

ｔ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓからクローニングされた遺伝子に関するＤＮＡ配列 を報告しており、遺伝子の配列は５ｅｋａｒ　ｅｔ　ａｌ。

ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

６、ｐｐ、６１−６６　（１９８８）はＢ、ｔ、ｔｅｎｅｏｒｉｏｎｉｓからク ローニングされた昆虫抑制遺伝子に関するＤＮＡ配列を開示し、配列は５ｅｋａ ｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）による報告と同一である。

クローニングされた遺伝子が潜在する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）及びシュードモナ ス　フルオレセ：／ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆ　Ｉｕｏｒｅｓｃｅｎｓ） 細胞は、コロラドボテドビートルの幼虫に対して毒性であることが見いだされた 。

１９９１年５月３０日付けのＮｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／ＳのＰＣＴｉ際公 開番号Ｗ０　９１１０７４８１は、基となる株により比較的低収量で最初に製造 されたものと同一の殺虫性タンパク質を高収率で製造するＢｔ、突然変異体につ き記載している。甲虫類−毒性Ｂ、ｔ。

ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ株の突然変異体が開示されている。

Ｂ、ｔ、Ｖａｒ、Ｓａｎ　ｄｉｅｇｏと指定された甲虫類−毒性株は、Ｃ，Ｈｅ ｒｒｎｓｔａｄｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ。

ｇｙ、４．　ｐｐ、３０５−３０８　（１９８６）により、種々の甲虫類昆虫に 対して毒性の６４ｋＤａ結晶タンパク質を製造することが報告されている。ビラ ルタ　ルテオラ（Ｐｙｒｒｈａｌｔａ　１ｕｔｅｏｌａ）（エルムリーフビート ル）に対する強い毒性：アントノムス　グランジス（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ　ｇ ｒａｎｃｉｉｓ）（ポールウイービル）、レプチノタルサ　デセムリ不アタ（Ｌ ｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｊｎｅａｔａ）（コロラドボテドビート ル）、オチオリンクススルカツス（○ｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　５ｕｌｃａｔｕ ｓ）（ブラックワインビートル）、テネブリオ　モリトル（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ　 ｍ。

１ｉｔｏｒ）（イエローミールワーム）及びハルチカ　トムバシナ（Ｈａｌｉｉ ｃａ　ｔｏｍｂａｃｉｎａ）に対する穏やかな毒性：ならびにジアブロチカ　ウ ンデンムブンクタタ（Ｄｉａｂｒｏｔ　ｉｃａ　ｕｎｄｅｃｊｍｐｕｎｃｔａｔ ａ）（ウェスタンスポッテドキューカンバービートル）に対する弱い毒性。

クローニングされたＢ、ｔ、Ｓａｎ　ｄＩｅｇｏの甲虫類毒素遺伝子のＤＮＡ配 列はＣ，Ｈｅｒｒｎｓｔａｄｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ。

５７、Ｄｐ、３７−４６　（１９８７）により報告されている：１９８８年９月 １３日発行のＨｅｒｒｎｓｔａｄｔ　ｅｔ　ａｌ、のＵＳ、特許４，７７１．１ ３１も参照せよ。Ｂ、ｔ、Ｓａｎ　ｄｉｅｇｏの毒素遺伝子の配列は、クローニ ングされたＢ、ｔ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの甲虫類毒素遺伝子に関して５ｅｋ ａｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）により報告されたものと同一である。

Ａ、Ｋｒｉｅｇ　ｅｔ　ａｌ８．Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｅｎｔ、、１０４゜ｔ、Ｓａｎ 　ｄｉｅｇｏがＢ、ｔ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ株と同一であることを報告して いる。

ＥＧ２１５８と指定された他の新規Ｂｔ１株が甲虫類昆虫に対して殺虫性である ７３ｋＤａ結晶タンパク質を製造することが、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、 　、　２１４．　Ｉ）Ｉ）、　３６５−３７２　（１９８８）　、及び１９９１ 年６月１８日発行の米国特許第５，０２４，８３７号においてＷ、Ｐ、Ｄｏｎｏ ｖａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　により報告されティる。Ｂ。

ｔ　株ＥＧ２１５８からの毒素−コード遺伝子をクローニングし、配列Ｓ甲虫類 毒素遺伝子に関する５ｅｋａｒ　ｅｔ　ａｔ、（１９８７）Ｉ：よる報告と同一 である。この甲虫類毒素遺伝子はＨＱｆｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、Ｒｅｖ、、５３．Ｄｐ、２４２−２５５（１９８９）によりｃｒｙＩ　Ｉ　 ＩＡ遺伝子と呼ばれている。

上記のＤｏｎｏｖａｎ　ｅｔ　ａｌ、米国特許第５．０２４，８３７号もＥＧ２ ４２４及びＥＧ２４２１と指定される雑種Ｂ、ｔ、ｖａｒ。

Ｋｕｒｓｔａｋｉ株につき記載しており、これらは鱗翅類昆虫及び甲虫類昆虫の 両方に活性である。これらの雑種株のビートル活性は接合ブラスミトドランスフ ァーによりＢ、ｔ　株ＥＧ２１５８がら移された甲虫類毒素プラスミドから生ず る。

１９８９年１月１０日発行のり、Ｋａｒａｍａｔａ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許第 ４．７９７．２７９号（ＥＰ−Ａ−０２２１０２４に対応）は、鱗翅類毒素遺伝 子を有するＢ、ｔ、ｖａｒ、Ｋｕｒｓｔａｋｉからのプラスミド、及び甲虫類毒 素遺伝子を有するＢ、ｔ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓからのプラスミドを含む雑種 Ｂ、ｔ、微生物を開示している。雑種Ｂ、ｔ、はＢ、ｔ、Ｋｕｒｓｔａｋｆ、な らびにＢ、ｔ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓにより製造される場合の特徴的な結晶タ ンパク質を製造する。

１９９０年３月２０日発行のＧａｅｒｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許第４， ９１０．０１６号（ＥＰ−Ａ−０３０３３７９に対応）は、Ｂ、ｔ、ＭＴ　１０ ４と同定される新規Ｂ、ｔ、単離物を開示しており、これは２つの目の昆虫、コ ロラドボテドビートル（甲虫類）及びキャベツルーバー（ｇ翅票）に対して殺虫 活性を有する。

１９８９年５月３１日公開のＬｕｂｒｉｚｏｌ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｉｎｃ、、の欧州特許出願公開番号０　３１８　１４３はＢ、ｔ、ｔｅｎｅｂｒ ｉｏｎｉｓからの完全な部分的修正遺伝子の特性化及び選択的発現、ならびにク ローニングされた遺伝子の宿主微生物へのトランスファーにより微生物が甲虫類 昆虫に対する毒性を有するタンパク質を製造できるようにすることにつき開示し ている。上記で議論したＨｅｒｒｎｓｔａｄｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ、４．ｐｐ：３０５−３０８　（１９８６）から複製されたＢ、 ｔ、Ｓａｎ　ｄｉｅｇＯに関する昆虫の生物学的定量データをまとめである。ま とめには、他の供給源からのＢ、ｔ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓに関するデータも 含まれ；Ｂ、ｔ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓがコロラドボテドビートルニ対する強 い毒性、ウェスタンコーンルートワーム（ディアブロチ力　ビルシフエラ（Ｄｉ ａｂｒｏｔｉｃａ　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ））ｌ：対する穏やかな毒性、及びサザ ンコーンルートワーム（ディアブロチ力　ウンデシムブンクタタ（Ｄｉａｂｒｏ ｔｉｃａ　ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ））に対する弱い毒性を示すことが 報告されている。

１９８９年６月１９日発行のＩｍｐｅｒｉａｌ　ＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔ ｒｉｅｓ　ＰＬＣの欧州特許出願公開番号０　３２４　２５４は、Ａ３０と同定 される新規Ｂ、ｔ、株を開示しており、それはコロラドボテドビートルの幼虫、 コーンルートワームの幼虫及びボールウイービルを含む甲虫類昆虫に対する殺虫 活性を有する。

１９９１年３月１２日発行のＰａｙｎｅ　ｅｔ　ａｌ、のＵ、Ｓ、　特許４，９ ９９，１９２（ＥＰ−Ａ−０３２８３８３に対応）は、Ｂ。

ｔ、ＰＳ４０Ｄ１と同定される新規Ｂ、ｔ、微生物を開示しており、そ株ＰＳ４ ０Ｄ１は血清型分類により血清変種（ｓｅｒｏｖａｒ）ｇａ８ｂ、ｍｏｒｒｉｓ ｏｎｉと同定されている。　。

１９９１年４月９日発行のＰａｙｎｅ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許第５゜００６． ３３６号（ＥＰ−Ａ−０３４６１１４に対応）は、ＰＳＩ２２Ｄ３と指定される 新規Ｂ、ｔ、単離物を開示しており、それは血清型分類により血清変種８ａ８ｂ 、ｍｏｒｒｉｓｏｎｊとされ、コロラドボテドビートルの幼虫に対して殺虫活性 を示す。

１９９０年１０月３０日発行のＰａｙｎｅ　ｅｔ　ａｌ、の米ＩＤ特ｉ第４，９ ６６．７６５号（ＥＰ−Ａ−０３３０３４２に対応）は、Ｂ、ｔ、ＰＳ８６Ｂ１ と同定される新規Ｂｔ、微生物を開示しており、それはコロラドボテドビートル に対する殺虫活性を有する。Ｂ、ｔ、株ＰＳ８６Ｂ１は血清型分類により、血清 変種ｔｏ１ｗｏｒｔｈｉと同定されている。

ｃｒｙＩＩＩＢ遺伝子のヌクレオチド配列及びそれがコードする甲虫類−毒性タ ンパク質は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｃｉｓ　Ｒｅｓ、１ｇ。

ｐ、１３０５　（１９！：ｔｏ）で５ｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、ｊ：より報告サレテ いるが、Ｂ、ｔ、供給源株は血清型分類によって亜種ｔｏ１ｗｏｒｔｈｌと固定 されたのみである。１９９１＊２月２６日発行の５ｉｃｋ　ｅｔ’ａ１．の米国 特許第４．９６８．１５５号（ＥＰ−Ａ−０３３７６０４に対応）は甲虫類−活 性Ｂｔ３株４３Ｆから得たＢ、ｔ　毒素遺伝子を開示しており、遺伝子配列はｃ ｒｙｌｌｌＢ遺伝子と同一であることがわかる。Ｂ、ｔ　株４３Ｆはコロラドボ テドビートル及びしｅＭＳ　Ｎ、Ｖ、の欧州特許出Ｂ第０３８２９９０号は、Ｄ Ｏラドボテドビートルの幼虫に対して殺虫活性を示すそれぞれ７４及び１２９ｋ Ｄａの結晶タンパク質を製造する２つの新規Ｂ、ｔ、株（ｂ　ｔ　ＧＳ　Ｉ２Ｏ ３及びｂｔＧｓＩ２４５）を開示している。７４ｋＤａのタンパク質を製造する 毒素遺伝子に関して報告されたＤＮＡ配列は、５ｉｃｋｅｔ　ａｌ　のｃｒｙｌ ｌｌＢ遺伝子の配列と同一であることがわかる。

１９９０年１１月１５日公開のＩｍｐｅｒｉａｌ　ＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓ ｔｒｉｅｓ　ＰＬＣのＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１３６５１は、鱗翅類昆虫 のみでなくディアブロチ力を含む甲虫類昆虫にも毒性であると言われる８１ｋＤ ａタンパク賀をコードする毒素遺伝子を含む新規Ｂ−ｔ、株を開示している。

１９９１年１０月８日発行のＡｒｏｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、のＵ。

Ｓ、特許５．０５５，２９３は、コーンルートワーム（ディアブロチ力）昆虫の 抑制のためのＢ、ラテロスボロウス（Ｂ、１ａｔｅｒｏｓｐｏｒＯＵＳ）の利用 を開示している。

前記の文献中で記載されている種々のＢ、ｔ、株は、甲虫類昆虫に対して殺虫活 性な結晶タンパク質を有すると報告されているが、いずれもウェスタンコーンル ートワーム（ディアブロチ力　ビルシフエラ　ビルシフエラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉ ｃａ　Ｖｉｒｇｉｆｅｒａ　ｖｊｒｇｉｆｅｒａ））、サザンフーンルートワー ム（ディアブロチ力　ウンデシムブンクタタ　ホワルジ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ 　ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ　ｈｏｗａｒｄｉ））及びノザンコーンルー トワーム（ディアブロチ力　パルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｂａｒｂｅｒｉ ））を含むジアブロチカ属（コーンルートワーム）の昆虫の幼虫及び成虫に対す る有意な、定量可能な毒性を示していない。

本発明のＢ、ｔ　株は、池の甲虫類昆虫の中でもディアブロチ力昆虫に対する定 量可能な殺虫活性を有するタンパク質毒素を発現する新規前本発明の１つの側面 は、図１に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド塩基配列を有し、後文で はｃｒｙｌ　ｒ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤＮＯ：ｌ）と呼ぶ精製及び単離甲 虫類毒素遺伝子に関する。Ｃｒ７１１１Ｃ（ｂ）遺伝子（配列１［ＮＯ：ｌ）は 図１に示すヌクレオチド塩基１４４から２０９９に延びるフード領域を有する。

本発明の他の側面は、ｃｒｙＩ　Ｉ　Ｉｃ　（ｂ）遺伝子により製造される殺虫 性タンパク質に関する。ＣｒｙｌＩｒＣ（ｂ）タンノくり質（配列ＩＤ　ＮＯ： ２）は、図１に示すｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤＮ０：ｌ）のヌ クレオチド配列のヌクレオチド塩基１４４から２０９９により推定されるアミノ 酸配列を有する。タンパク質は甲虫類の目の昆虫、特にコロラドボテドビートル 及びディアブフチカ属の昆虫に対する殺虫活性を示す。

本発明のさらに別の側面は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎａｌ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）に寄託され、受託番号ＮＲ ＲＬ　Ｂ−１８６５５を有し、Ｂ、ｔ。

株ＥＧ５１４４と指定されるＢ、ｔ、バクテリアの生物学的に純粋な培養物、及 びＮＲＲＬに寄託され、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８９２０を有し、Ｂ、ｔ、株 ＥＧ５１４５と指定される第２のバクテリアの生物学的に純粋な培養物に関する 。Ｂ、ｔ　株ＥＧ５１４４はｃｒｙＩ　Ｉ　ｒｃ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ ：１）を有し、殺虫性ＣｒｙＩＩＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２） を製造する野生型Ｂ、ｔ、株である。Ｂ、ｔ　株ＥＣ；５１４５も野生型Ｂ、ｔ 、株であり、その特性は下記にさらに詳細に記載するＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４の 特性と類似している。ｃｒｙｌ　Ｉ　ＴＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１） を有する他のＢ、ｔ　バクテリアの生物学的に純粋な培養物も本発明の範囲内で ある。

本発明のさらに別の側面は、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　 ＮＯ：２）、又はＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質を製造するＢ。

ｔ１株の発酵培養物を、農業的に許容し得る担体と組み合わせて含む殺虫性組成 物に関する。

本発明は、甲虫類昆虫を抑制する方法を含み、その方法はそのような昆虫のため の宿主植物に、殺虫的に有効量のＣｒｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質（配列 ｒＤ　ＮＯ：２）、又はＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質を製造するＢ、ｔ 、株の発酵培養物を適用することによる。方法は多様な甲虫類昆虫、例えばコロ ラドボテドビートル、日本ビートルの幼虫（白土（ｗｈｉｔｅ　ｇｒｕｂｓ）） 、メキシコビーンビートル及びコーンルートワームに適用できる。

本発明のさらに別の側面は、ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤＮｏ： 　１）を含む組み替えプラスミド、そのような組み替えプラスミドを用いて形質 変換されたバクテリアの生物学的に純粋な培養物に関しており、バクテリアは実 施例６に記載するＢ、ｔ、株ＥＧ７２３７などのＢ、ｔ、が好ましく、さらにｃ ｒｙＩＩＩｃ（ｂ）遺伝子により形質転換された植物にも関する。

図面の簡単な説明 図１は図１−１から１−３から成り、ｃｒｙｌＩＩｃ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　 ＮＯ：１）のヌクレオチド塩基配列及びＣｒｙＩＩ　ＩＣ（ｂ）タンパク！（配 列ＩＤ　ＮＯ：２）の推定アミノ酸配列を示す。

推定リポソーム結合部位（ＲＥＳ）を示す。５ｓｐｌ及びＨｉｎｄＴＩＩに関す る制限部位も示す。

図２はＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４　（１列）　、ＥＧ４９６１　（２列）、ＥＧ２ ８３８　（３列）及びＥＧ２１５８　（４列）のサイズ分別された本来のプラス ミドを含むエチジウムプロミド染色アガロースゲルの写真である。図２の左の数 字はＢ、ｔ　株ＥＧ５１４４のプラスミドの大体のサイズをメガダルトン（ＭＤ ａ）で示す。

図３はサイズ分別されたＤＮＡフラグメントをアガロースゲルからニトロセルロ ースフィルターに移し、フィルターを放射活性標識された２、４キロ塩基（ｋ　 ｂ）のｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢプローブとハイブリッド形成させ、フィルターをＸ− 線フィルムに暴露することに−って得たオートラジオグラムの写真である。アガ ロースゲルは制限酵素５ｓｐＩ、Ｈｌｎｄｌ［及びＥｃｏＲＩを用いて別々に消 化して得たＢ、ｔ　株ＥＧ２１５８、ＥＧ５１４４、ＥＧ２８３８及びＥＧ４９ ６１からのサイズ分別された全ＤＮＡフラグメントを含んだ。図３の左の数字は ｃｒｙＩＩＩＢプローブとハイブリッド形成したＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４制限フ ラグメントのサイズをｋｂで示す。５ｔｎｄ”と標識した列はサイズの標準であ る。

図４はＢｔ１株ＥＧ５１４４　（１列）、ＥＧ４９６１　（２列）、ＥＧ２１５ ８（３列）及びＥ０２８３Ｂ　（４列）から溶解された結晶タンパク質を示すク ーマシー染色ナトリウムドデンルサルフニート（ＳＤＳ”）ポリアクリルアミド ゲルの写真である。図４の左の数字はＢｔ。

株ＥＧ５１４４により製造された結晶タンパク質の大体のサイズをｋＤａで示す 。５列はタンパク質分子のサイズ［ｆｉを含む。

図５はプラスミドｐＥ０２７１の制限地図を示す。ｃｒｙＩＩＩｃ（ｂ）遺伝子 （配列ＩＤ　Ｎｏ　：　１）の位置及び配向を矢印で示す。プラスミドｐＥＧ２ ７１はｐＵｃ１８で印をつけたセグメントにより示されるＥ、ｃｏｌｉプラスミ ドｐＵｃ１８（Ａｐつを含むので、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ ）（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で機能する。

制限エンドヌクレアーゼ切断部位に関する略字は以下の通りである：Ｂａ＝Ｂａ ｍＨＩ　；　Ｂｇ＝Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ　；Ｈ＝Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　；Ｒ＝Ｅｃ ｏＲＩ　；　５＝ＳｐｈＩ　；及びＸ＝ＸｂａＩ０１キロ塩基の目盛りも示す。

図６は図５と並べ、同一の目盛りに基づいてプラスミドｐＥＧ２７２の制限地図 を示す。ｃｒｙｌＩＩｃ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）の位！及び配向は 図５に示されている矢印により示す。プラスミドｐＥＧ２７２はプラスミドｐＥ Ｇ２７１　（図５）から誘導され、ｐＮＮｌｏｌで記すセグメントにより示され 、ｐＥＧ２７１のＡｐｈＩ部位に挿入されたバシルス（Ｂａｃｉ］１ｕｓ）プラ スミドｐＮＮ１０１　（Ｃｍ’Ｔｃ’）を含み：このプラスミドはＢ、ｔ　にお いて機能する。略字は図５の場合と同様である。

図７はクーマシー染色５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真である。

ゲルはＢｔ９株ＥＧ５１４４　（１列）及びｐＥＧ２７２を含む組み替えＢ、ｔ 、株ＥＧ７２３７　（３列）により合成されるタンパク質のバンドを示す。２列 はタンパク質サイズの標準を含み、１列及び３列の両側の数字は、これらの株に より製造される結晶タンパク質の大体のサイズをｋＤａで示す。

好ましい態様の詳細な説明 ｃｒｙｌｌｌｃｃｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ１）及び田虫類−毒性ＣｒｙｌＩ 　ＩＣ（ｂ）結晶タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）の単離及び精製、ならびに Ｃｒｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質を製造する新規Ｂｔ７株ＥＧ５１４４の 特性化を実施例１−７にて詳細に記載する。殺虫性組成物におけるＢｔ９株ＥＧ ５１４４及びＣｒｙＴ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）　結晶タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２ ）の利用及び方法も実施例８−１１にて例示する。

本発明のｃｒｙＩＩＩ−型遺伝子であるｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列 ＩＤ　ＮＯ：ｌ）は図１に示すヌクレオチド塩基配列を有する。

ｃｒｙＩ　ＨＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯＯ１２のコード領域は図１に示す ヌクレオチド塩基位置１４４から位置２０９９に延びる。

ｃｒｙｌＩ　ＩＣ（ｂ）遺伝子コード領域のヌクレオチド塩基配列を先行技術の ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＡ遺伝子の対応するコード領域と比較すると、２個の遺伝子間 に有意な差が示される。ｃｒｙｌＩＩｃ（ｂ）遺伝子（配列ＴＤ　ＮＯ：１）は ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＡ遺伝子と７６％のみ相同である（位置的に同一）。

ｃｒｙｒ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子コード領域のヌクレオチド塩基配列を以前に発 見されたＢ、ｔ、株ＥＧ２８３８　（ＮＲＲＬ　受託番号Ｂ−１８６０３）から 得られるｃｒｙＩ　Ｉ　ｒＢ遺伝子の対応するコード領域と比較すると、ｃｒｙ ｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ＋１）はｃｒｙｒＩＩＢ遺伝子と９ ６％相同であることが示される（位置的に同一）。

ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）によりコードされる本 発明のＣｒｙｌＩＩ−型タンパク質であるＣｒｙｌｌＩＣ（ｂ）タンパク質は、 図１に示すアミノ酸配列（配列ＩＤ　ＮＯ：２）を有する。本開示においてＣｒ ｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）　”タンパク質”と言うのは、内容が他を示していなけれ ば”結晶タンパク質°、　“タンパク質毒素“、″殺虫性タンパク質”などとい う記載と同義である。ＣｒｙｌＩＩｃ臣　（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１） のＤＮＡ配列から推定されるＣｒｙＩＩＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ ：２）のサイズは７４゜２６５ダルトン（Ｄａ）である。

ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢ遺伝子の配列から推定されるＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＢタンパク質 のサイズは７４，２３７Ｄａである。ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＡ遺伝子によりコードさ れる先行技術のＣｒｙＩＩＩＡタンパク質の推定サイズは７３゜’　１１６Ｄａ である。

明らかなサイズの類似性にもかかわらず、Ｃｒｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク 質（配列ＩＤ　ＮＯ２）のアミノ酷配列と先行技術のＣｒｙｌ　ＩＩＡタンパク 質の配列を比較すると、２者の間に有意な差が示される。

ＣｒｙＩＩＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）はＣｒｙｒＩｒＡタン パク質と６８％のみ相同である（位置的同一アミノ酸）。ＣｒｙＩＩＩＣ（ｂ） タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）はＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＢタンパク質と９５％相 同である。しかし、Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）及びＣｒｙＩＩＩＢタンパク質の 明らかな相同性にもかかわらず、ＣｒｙＴＩＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　 ＮＯ：２）は、甲虫類の目の昆虫、特にディアブロチカ属の昆虫に関する殺虫活 性がＣｒｙｌｌＩＢタンパク質と比較して有意に向上していることに基づき、Ｃ ｒｙ■ｒ　ＩＢタンパク質とは異なるタンパク質であることが示された。Ｃｒｙ ＩＩＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）はＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＢタンパ ク質と異なりコーンルートワームの幼虫に対して定量可能な殺虫活性を示す。

本発明は、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ｒＤ　ＮＯ：２）の殺虫 活性と基本的に同一の殺虫活性を有するタンパク質を与えるＣｒｙ■Ｉ　ＩＣ（ ｂ）遺伝子（配列Ｉ［ＮＯ：１）の突然変異体及び組み替えあるいは遺伝的操作 誘導体、例えば切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄｖｅｒｓｉｏｎ）を含むものとする 。

ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）は、他のＢ、ｔ。

株中で類似の、又は密接に関連したｃｒｙＩＩｒ−型遺伝子を発見するためのＤ ＮＡハイブリッド形成プローブとしても有用である。ｃｒｙｉｌｌＣ（ｂ）遺伝 子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）、又はその一部あるいは誘導体はハイブリッド形成プ ローブとして用いるために、例えば放射活性標識を用い、従来の方法で標識する ことができる。その後、標Ｗ　Ｄ　Ｎ　Ａハイブリッド形成プローブを実施例に 記載する方法で用いることができる。

ｃｒｙＩＩＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）及び対応する殺虫性Ｃｒｙ ｌ　Ｔ　ＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）は、新規Ｂ、ｔ、ｉ離物 であるＢｔ９株ＥＧ５１４４中で最初に同定された。

Ｂ、ｔ　株ＥＧ、５１４４の特性は実施例でさらに十分に記載する。Ｂ。

ｔ１株ＥＧ５１４４のプラスミドアレー及び他の株特性を、以前に発見されたＢ ｔ９株ＥＧ２８３８及びＥＧ４９６１、ならびに先行技術のＢ、ｔ、株ＥＧ２１ ５８及びＢ、ｔ、Ｖａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ（又は同等物、Ｂ、ｔ、Ｖａ ｒ、Ｓａｎ　ｄｉｅｇｏ）の場合と比較すると、これらの甲虫類−毒性Ｂ、ｔ　 株がそれぞれ明白に異なることが示される。Ｂ、ｔ　株ＥＧ５１４４と共に単離 された別の野生型株であるＢ、ｔ　株ＥＧ５１４５のプラスミドアレーは、Ｂ、 ｔ、株ＥＧ５１４４のものと類似しており、Ｂ、ｔ　株ＥＧ５１４５は甲虫類昆 虫、例えば日本ビーｐル幼虫に対してＢ、ｔ　′ｆｔＦ、ＥＧ５１４４と同一の 殺虫活性を示す（実施例１１を参照）。

ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ＋１）は、クローニングされ たｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子の安定な保持及び発現を可能にする条件下で 適した宿主を形質転換するために、当該技術における熟練者に周知の方法を用い て多様な微生物宿主中に導入することができる。ＣｒｙｌＩＩｃ（ｂ）遺伝子（ 配列ＩＤ　ＮＯ：１）を発現させ、ＣｒｙＩＩｒＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ 　ＮＯ：２）の製造を可能にする適した宿主には、バシルス　チュリンギエンシ ス及び他のバシルス種、例えばＢ、ズブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｊｌｉｓ）又はＢ 、メガテリウム（：［３，ｍｅｇａｔｅｒ　ｉ　ｕｍ）が含まれる。ｃｒｙＩ　 ＩＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ｒＤ　ＮＯ：１）を含む遺伝的に変えられた、又は操 作された微生物は、同一微生物中に存在する他の毒素遺伝子も含むことができ、 これらの遺伝子がＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質と異なる殺虫性結晶タン パク質を同時に製造できることが明白でなければならない。

本開示に記載するバシルス株は従来の成長培地及び標準的発酵法を用いて培養す ることができる。ｃｒｙｌＩＩｃ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤＮ０・１）が潜伏して いるＢ、ｔ、株を、培１ｊＢ、ｔ、細胞が成長サイクルにおいてＣｒｙｌ　Ｉ　 ＩＣ（ｂ）結晶タンパク質（配列ＩＤＮ０：２）を形成する段階に達するまで、 実施例に記載の通りに発酵することができる。胞子発生（ｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕ ｓ）Ｂ、ｔ　株の場合、典型的に発酵は、胞子と共にＣｒｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ｂ ）結晶タンパク質が形成される胞子形成段階を通じて続けられる。その後典型的 にＢ、ｔ、発酵培養物の遠心、濾過などを行ってＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）結晶 タンパク質を含む発酵培養固体を培養物の水性ブロス部分から分離することによ り収穫する。

本開示において例とするＢ、ｔ、株は胞子形成種（胞子形成、又は胞子発生株） であるが、ｃｒｙＨＩｃ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　Ｎｏ：１）は非胞子発生バシ ルス株、すなわち胞子を製造することなく結晶タンパク質を製造する株において も用いることができる。本開示においてＢ、ｔ、株（ｃ　ｒｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）を含む）の“発酵培養物′と言うのは、胞子 形成り、ｔ、培養物、すなわちＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）結晶タンパク質と胞子 を含むＢ、ｔ　培養物、及び栄養段階の間に結晶タンパク質を製造した胞子発生 バシルス株、ならびｌ：ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：ｌ ）を含み、培養物が冥際に結晶タンパク質を製造する成長段階に達した非胞子発 生バシルス株を含むものとすると理解するべきである。

分離された発酵固体はいくらかの細胞破片、いくらかの完全な細胞及び残留発酵 培地固体と共に、生にＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）結晶タンパク質（配列ＩＤ　Ｎ Ｏ”２）及びＢ、ｔ、胞子である。必要なら結晶タンパク質を、例えばスクロー ス濃度勾配分別などの従来の方法により他の回その後溶液からタンパク質を沈澱 させることにより高純度のＣｒｙｌｌＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＴＤ　ＮＯ： ２）を得ることができる。

前記の通りＣｒｙ　Ｔ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）は、 コロラドボテドビートル、日本ビートル幼虫（自主）、メキシコビーンビートル などの甲虫類昆虫に対する有力な殺虫性化合物である。ＣｒｙｌｌｒＡ及びＣｒ ｙｒｒＴＢタンパク質と対照的にＣｒｙＩＩＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　 Ｎ○＝２）は、他の甲虫類−毒性Ｂ、ｔ。

結晶タンパク質により比較的影響されなかったディアブロチ力昆虫、例えばコー ンルートワームに対して測定できる殺虫活性を示す。Ｃｒｙ　ＩＩＩＣ（ｂ）タ ンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）は上記のような甲虫類昆虫の抑制に有用な殺虫 性調剤における活性成分として用いることができる。そのような殺虫性調剤又は 組成物は典型的に活性成分の他に農業的に許容し得る担体又は補薬を含み、当該 技術における熟練者に周知の方法で調製及び使用される。

Ｃｒｙｅｒ　ＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：　２）　ハ単Ｉ１１すし た形態又は精製された形態、例えば結晶タンパク質自身として殺虫性調剤中で用 いることができる。別の場合Ｃｒｙｌ　Ｉ　ｒｃ　（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ 　ＮＯ：２）は、ｃｒｙＩＩＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤＮｏ：　１）を有し、 Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質を製造することができるバシルス　チュリ ンギエンシスなどのバシルス株、又は他の微生物宿主の培養により得られる回収 発酵固体中で存在することができる。

適したバシルス宿主には、Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４及びＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４ から誘導された遺伝的に改良されたＢ、ｔ、株が含まれる。後ｕｇａｔｉｏｎ　 ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により得られ、Ｂｔ３株ＥＧ５１４４からの本来のｃｒｙ ｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子−含有プラスミドを含む。組み替えＤＮＡ法によって 得られ、クローニングされたｃｒｙｌＩＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１ ）を発現する組み替えプラスミドを含む、遺伝的操作又は形質転換されたＢ、ｔ 、株又は他の宿主微生物も用いることができる。

そのような形質転換生成物の例は、Ｂ、ｔ、株ＥＧ７２３７であり、これは組み 替えプラスミド上にクローニングされたｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列 ＩＤ　ＮＯ：１）を含む。

回収発酵固体は主に結晶タンパク質及び（胞子形成りｔ、盲生を用いた場合）胞 子を含み：細胞破片及び残留発酵培地固体も存在し得る。

ＣｒｙＩＩ　ＩＣ（ｂ）タンパク質を含む回収発酵固体は、必要なら殺虫性調剤 に挿入する前に乾燥することができる。

活性成分として殺虫性ＣｒｙＩＩＩＣ（ｂ）タンパク質（配列［）Ｎｏ：　２） を含む不発明の調剤又は組成物は、殺虫的有効量で通用することができ、その量 は例えば抑制するべき特定の甲虫類昆虫、処置するべき特定の植物又は作物、及 び殺虫活性組成物を適用する方法などの因子に依存して変化する。殺虫的有効量 の殺虫性調剤を本発明の昆虫抑制法において使用する。

殺虫性組成物は、殺虫活性成分と農業的に許容し得る所望の担体を配合すること により製造する。配合された組成物は粉剤又は顆粒材料、あるいは油（植物油又 は鉱油）又は水中の懸濁液又は油／水乳液、あるいは水和剤の形態であることが でき、又は農業的用途に適した他の担体材であることができ、当該技術において 周知である。″農業的に許容し得る担体”という用語は、殺虫剤配合法において 通常用いられるすべでの補薬、例えば不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着付 与剤、結合剤を含み；これらは殺虫剤配合における熟練者に周知である。

Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質（配列［）ＮＯ：２）及び１種類かそれ以 上の固体又は液体補薬を含む調剤は、例えば従来の配合法を用いた殺虫活性Ｃｒ ｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質成分と適した補薬の均一混合、配合及び／又 は粉砕により既知の方法で調製することができる。

本発明の殺虫性組成物は、標的甲虫類昆虫の環境、典型的な場合保護するべき植 物又は作物の葉の上に従来の方法で、好ましくは噴霧により適用する。他の適用 法、例えば粉剤散布、液剤散布、浸漬、土壌注入、種の被覆、冥土の被覆又は噴 霧なども可能であり、根又は茎に蔓延する昆虫の場合は必要である。これらの適 用法は当該技術において周知である。

後文で“毒性遺伝子″と呼ぶことがあるｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列 ＩＤ　ＮＯ：１）又はその機能的同等物は、多様な微生物宿主に導入することが できる。ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）が発現される と殺虫性ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）結晶タンパク質毒素（配列ＩＤ　ＮＯ：２） が製造される。適した宿主にはＢ、ｔ、及びバンルスの他の種、例えばＢ、ズブ チリス又はＢ　メガテリウムが含まれる。植物−コロニー形成、又は根−コロニ ー形ａ微生物もｃｒｙｌｌｌＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）の宿主とし て用いることができる。得られた形質転換生成物中で遺伝子を安定に保持して発 現させるこＩＤ　ＮＯ：１）を導入するために、当該技術における熟練者に周知 の多様な方法を利用することができる。

形質転換生成物、すなわち組み替えプラスミド中にクローニングされた遺伝子が 潜在する宿主微生物は従来の方法に従い、通常組み替えプラスミドを含む宿主微 生物のみを成長させる選択法を用いて単離する二々ができる。その後形質転換生 成物を殺虫活性に関して試験することができる。この場合もこれらの方法は標準 的方法である。

製造の目的で宿生細胞を選ぶ場合に特に興味深い特性には、宿主への遺伝子の導 入の容易さ、発現系の利用性、発現の効率、宿主におけるＣｒｙｒ　Ｔ　ＩＣ（ ｂ）殺虫性タンパク質の安定性及び補助的遺伝的可能性の存在が含まれる。殺虫 性ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤＮ０：１）を含む細胞宿主は、ｃ ｒｙＴ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子が発現され。

ＣｒｙｒｒＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）が製造サレル、典型的 に胞子形成のためのいずれの簡便な栄養培地中でも成長させることができる。結 晶タンパク質を含む胞子形成細胞をその後従来の方法、例えば遠心又は濾過によ り収穫することができる。

ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）を、遺伝子を発現し、 Ｃｒｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＴＤ　Ｎｏ：　２）　を製造する ことができる植物中に挿入し、昆虫の攻撃？二対する抵抗性を植物にさらに与え ることができる。ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤＮ０：１）を用い た植物の遺伝的操作は、植物の遺伝子工学における熟練者に周知の多様な形態及 び起源のＤＮＡ分子を用い、遺伝子を含む所望のＤＮＡを植物組織又はＭＢ胞に 導入することにより行うことができる。

８９　４７９に開示されている。

ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　Ｎｏ・１）、又はＣｒｙｌＩＩＣ （ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　Ｎｏ：２）を製造することができる変性ｃｒｙｒ 　ｆ　ｒｃ　（ｂ）遺伝子を含むＤＮＡは、アグロバクテリウム　ツメファシェ ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ、ｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）からのプラス ミドであるＴｉなどの感染性プラスミド、ウィルスあるいはＡ　ツメファシェン スなどのｍ＝物により、リンソーム又はリボソームの使用により、機械的方法を 用いた微量注入により、及び植物遺伝子工学における熟練者が慣れた他の方法に より植物細胞又は組織に直接与えることができる。

し・　当該技術における熟練者に周知の通り、遺伝子によりコードされるタンパ ク質を形成する種々のアミノ酸は通常１種類以上のコドンにより決定されるので 、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子のヌクレオチド塩基配列（配列ＩＤ　ＮＯ： １）中に変更が可能である。さらにｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）ヌクレオチド塩基 配列のコード領域において、遺伝子を発現してＣｒｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）殺虫 性タンパク質の機能的同等物を製造することができる変更又は切断があり得る。

本明細書を参照することにより当該技術における熟練者が不必要な実験を行うこ となく決定することができるこれらの変更は、特にフレイムされている主題と十 分に同等なので、添付フレイムの範囲内であると考えるべきである。

ここで本発明を以下の特定の非Ｍｗｉ的実施例に言及してさらに詳細に記載する 。実施例は当該技術において一般的に既知の方法に基づき、商新規Ｂ、ｔ、株Ｅ Ｇ５１４４は、実施例１に記載の方法に従って単離した。実施例１に記載の方法 は、新規Ｂｔ９株ＥＧ５１４５の単離にＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４及びＥＧ５１４ ５の単離米国及び国外を通じて、典型的に穀物貯蔵施設の種々の供給源から作物 粉試料を得た。作物粉を水性緩衝液に懸濁し、懸濁液を６０°Ｃに３０分間加熱 することにより作物粉試料を処理し、Ｂ、ｔ　などの耐熱性胞子形成バンルスー 型バクテリアをａ縮した。処理された粉懸濁液を水性緩衝液中で希釈し、希釈液 を寒天皿上に広げて作物粉からの個々のバクテリアを寒天皿の表面上でコロニー に成長させた。成長後、各コロニーの一部を寒天皿からニトロセルロースフィル ターに移した。フィルターをＮａＯＨで処理し、コロニーを溶解し、各コロニー からのＤＮＡをフィルター上に固定した。

ε、ｃｏｌｉに適用できる標準的方法がＢｔ、の場合に役立たないことがわかっ たので、コロニーハイブリッド形成法に使用するＢ、ｔコロニーの１に用いるた めに改良処理法を開発した。上記の処理の場合、Ｂ、ｔ、コロニーを確実に成長 の栄養期とし、ＮａＯＨを用いた溶解を受け易くするために、特別な条件が必要 であった。従って各コロニーの一部をニトロセルロースフィルターに移した後、 コロニーの側を上にして０．５％（Ｗ／　Ｖ　）のグルコースを含む寒天培地上 にフィルターを置いた。その後接されたコロニーを、寒天−グルコース培地上で ３０℃にて５時間成長させた。寒天培地中の０５％のグルコースの使用及び３０ ℃における５時間の成長サイクルは、Ｂ、ｔ、コロニーが栄養期にあり、従って 溶解を受け易いことを保証するのに重要であった。

クローニングされた甲虫類毒素遺伝子を、作物粉試料から、Ｂ、ｔ。

の他の新規及び希少甲虫類−毒性株を見いだすための特異的プローブとして用い た。正式にはＤｏｎｏｖａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．ＧｅｎＧｅｎｅｔ、、２ １４．Ｉ）Ｉ）、３６５−３７２　（１９８８）Ｉ：記載ノＢ。

ｔ１株ＥＣ２１５８のｃｒｙＣ遺伝子として知られているｃｒｙｌＩＩ八遺伝子 をへむ２．９ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ　ＤＮＡ制限フラグメントをコロニーハイブ リッド形成法においてプローブとして用いた。

ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＡ遺伝子全体を含む２．９ｋｂのＨｊｎｄＩＩＩ　ｃｒ７１１ ＩＡ　ＤＮＡフラグメントを［アルファーｐ　３２コーｄＡＴＰ及びフレノウ酵 素を用いて標準的方法により放射標識した。溶解された各コロニーからのＤＮＡ を含むニトロセルロースフィルターを、放射標識された２、９ｋｂのＨｉｎｃｌ ＩＩＩ　ｃｒｙｒｌｒＡ　ＤＮＡプローブを含む緩衝溶液中で６５℃にて１６時 間インキュベートし、コロニーからのＤＮＡと放射標識ｃｒｙ■Ｉ　ＩＡプロー ブからのＤＮＡをハイブリッド形成させた。ｃｒｙＩＩＩＡ　ＤＮＡプローブが 確実にｃｒｙＩＩｒＡ　ＤＮＡプローブと類似した遺伝子を含むコロニ〜からの ＤＮＡのみとハイブリッド形成するように６５°Ｃのハイブリッド形成温度を用 いた。

２．９ｋｂのｃｒｙＩＩＩＡプローブは、作物粉の種々の試料からの多くのＢ、 ｔ、コロニーとハイブリッド形成した。これらのコロニーを調べることにより、 予想に反してそれらがｃｒｙＩ　Ｉ　Ｉ−型遺伝子を含まないことが明らかにな った。これらのコロニーはｃｒｙＩ−型遺伝子を含んでいた。ｃｒｙＩ−型遺伝 子は、分子量が約１３ＱｋＤａの鱗翅遺伝子の配列といくつかのｃｒｙＩ−型遺 伝子の配列のコンピューター補助による比較は、ｃｒｙｌｌｌＡ遺伝子の３′− 末端がｃｒｙＩ−型遺伝子の一部と部分的に相同であることを明らかにした。こ の発見は、ｃｒｙｌｌＩＡ遺伝子の３°　−末端が２．９ｋｂのｃｒｙＩ　Ｉ　 ＩＡプローブとｃｒｙＩ−型遺伝子を含むＢｔ、コロニーとをハイブリツド形成 させたという信念を支持した。

この問題を改善するために、２．９ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ　ｃｒｙＩＩＴＡプロ ーブを酵素Ｘｂａｌで消化し、その３′　−末端を除いたｃｒ７１１ＩＡ遺伝子 を含む２．０ｋｂのＨｉｎｄｌＩ　Ｉ−ＸｂａＴフラグメントを精製した。２． ０ｋｂのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＸｂａＩフラグメントは、３′−切断ｃｒｙｌｌ ｌＡ遺伝子を含む。２．Ｏｋｂのフラグメントを用いてコロニーハイブリッド形 成実験を繰り返すと、それはｃｒＹＩ遺伝子−含有Ｂ、ｔ、コロニーとハイブリ ッド形成しなかった。

種々の場所からの作物粉試料からの約４８，０００のバンルスー型コロニーを、 放射標識された２、０ｋｂのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＸｂａｌＣｒｙＴＩＩＡプロ ーブを用いて精査した。イリノイの作物粉試料から、ｃｒｙｒＩＩＡプローブと 特異的にハイブリッド形成する唯一の新規３゜ｔ１株が発見された。新規株はＢ 、ｔ　株ＥＧ２８３８と指定され、ＮＲＲＬに受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８６０ ３として寄託した。

その後作物粉試料からのさらに約５０，０００のバシルスー型コロニーも放射標 識された２、０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂａｌ　ｃｒｙｌＩＩＡプローブを用 いてスクリーニングしたが、新規ｃｒｙＴ１１−型遺伝子を含む他の株の同定に 成功しなかった。

Ｂ、ｔ、株ＥＧ２８３８は甲虫類昆虫、特にコロラドボテドビートルに対して殺 虫活性であることが見いだされた。Ｂ、ｔ、株ＥＣ２８３８はサザンコーンルー トワームに関して実質的殺虫活性を持たなかった。

ｃｒｙｆ　Ｉ　ＩＢ遺伝子と指定された遺伝子がＢ、ｔ、株ＥＧ２８３８からａ Ｌ離され、そのヌクレオチド塩基配列が決定された。ｃｒｙＩＩＴＢ遺伝子は、 ６５１アミノ酸を含み推定サイズが７４，２３７ダルトンのＣｒｙｌｌｌＢタン パク質と指定される結晶タンパク質をコードした。

先行技術のＣｒｙｌ　Ｉ　ＴＡタンパク質のサイズは以前に７３．１１６ダルト ン（６４４アミノ酸）と推定された。ｃｒｙＩ　Ｉ　ＴＢ遺伝子はｃｒＶＩＩＩ Ａ遺伝子と７５％相同であり、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＢタンパク質はＣｒｙＩＩＩＡ タンパク質と６８％相同である。

世界中の種々の場所からの膨大な作物粉試料から同士というバシルスー型コロニ ーをＢ、ｔ、株ＥＧ２８３ｇから得たｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢプローブを用いてスク リーニングした。ｃｒｙｌｌｌＢプローブは放射標識ｃｒｙＩＩＩＡプローブに 関して上記で示した方法を用いて放射標識した。放射標識ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢプ ローブはＢ、ｔ、株ＥＧ２８３８からのＤＮＡの２．４ｋｂの５ｓｐｌ制限フラ グメントを含んだ。フラグメントはＢ、ｔ、株ＥＧ２８３８の甲虫類毒素ｃｒｙ Ｉ　Ｉ　ＩＢ遺伝子に関する完全タンパク質コード領域を含む。ついに、Ｂ、ｔ 、株ＥＧ５１４４及びＥＧ５１４５と指定される本発明のＢ、ｔ、株が、ｃｒｙ Ｉ　Ｉ　ＩＢプローブと特異的にハイブリッド形成するＢ、ｔ、コロニーを介し て作物粉試料から単離された。

Ｂ、ｔ、ＥＧ５１４４の特性化のために、いくつかの研究を行った。

一系列の研究を行い、その鞭毛の血清型を特性化した。別の研究を行い、Ｂ、ｔ 、株ＥＧ５１４４の本来のプラスミドのサイズを決定し、どのプラスミドが甲虫 類−活性殺虫性結晶タンパク質をコードする遺伝子を含むかを確定した。その後 、Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４からのサイズ分別全ＤＮＡ制限フラグメントを用いて ＤＮＡプロット分析を行い、ｃｒｙＩｌｌ−型遺伝子を含む他のＢ、ｔ、株から の類似の加工をした全ＤＮＡと比較し、Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４が独特の甲虫類 −活性毒素遺伝子を含むことを示した。さらに、それが製造する結晶タンパク質 を特性化し、Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４及びその結晶タンパク質に伴う殺虫活性を 測定することにより、Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４をさらに評価した。実施例２−７ はＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４及びその独特のｃｒｙＩｌｌ−型遺伝子の特性化の方 法を目的とし、実施例８−１１は不発明のｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配 列ＩＤ　Ｎ○：１）を含むＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４及びＢ、ｔ、株ＥＧ７２３７ の殺虫活性を目的とする。

実施例２ Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４の鞭毛の血清型の評価抗体媒介細胞凝集研究（Ｃｒａｒ ｇｉｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、’１ｍｍｕｎｏ１．，２１．ｐｐ、４１７　５１１ 　（１９３６））を用いてＢ。

ｔ６株ＥＧ５１４４に関する鞭毛血清型分類研究を行った。Ｂ、ｔ。

ｖａｒ、ｋｕｒｓｔａｋｉ、ｍｏｒｒｉｓｏｎｉ及びｔｏｌｗｏｒｔｈｉ型−株 及び新規甲虫類−活性Ｂ、、ｔ、株ＥＧ４９６１からの精製鞭毛を用いて鞭毛抗 体試薬を調製した。

研究はＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４及び他の甲虫類−活性Ｂ、ｔ、株ならびにいくつ かの普通のＢ、ｔ、型株のホルマリン−固定栄養細胞を含んで行い、そのそれぞ れを鞭毛抗体媒介細胞凝集に関して記録した。

他の甲ヨ類−活性Ｂｔ３株にはＢ、ｔ、ｖａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉ。

ｎｉｓ、Ｂ、ｔ、ｖａｒ、ｓａｎ　ｄｉｅｇｏ、Ｂ、ｔ、株ＥＣ２１５８（すべ てｃ　ｒ　ｙ　Ｉ　Ｉ　Ｔ　Ａ遺伝子を含む）：Ｂ、ｔ　株ＥＣ２８３８（ｃｒ ｙＴＩＩＢ遺伝子を含む）、及びＢ、ｔ、株ＥＧ４９６１　（ｃｒｙｌＩＩｃ（ ａ）遺伝子と指定される新規甲虫類毒素−コード遺伝子を含む）が含まれた。

Ｂ、ｔ、鞭毛型−株はＢ、ｔ、ｖａｒ／に＋、＋ｒｓｔａｋｉ　（ＨＤ−１、血 清型３ａｂ）、Ｂ、ｔ、ｖａｒ、ｍｏｒｒｊｓｏｎｉ　（ＨＤ−ｉ２、血清型８ ａｂ）及びＢ、ｔ、ｖａｒ、ｔｏｌｗｏｒｔｈｉ　（ＨＤ−１３、血清型９）で あった。

この研究の結果を表１に示す；　“十′は交差反応が起こったことを示し、−″ は交差反応が起こらなかったことを示す。

Ｂ、　ｔ、株ＥＧ５１４４　−　−　−　−Ｂ、ｔ、ｖｔｒ、ｔｅｎｅｂｒｉａ ｎｉｓ　−＋　−−Ｂ、　ｔ、　Ｖａｒ、　Ｓａｎ　ｄｉｅｇｏ　−＋　−−Ｂ 、　ｔ、株ＥＧ２１５ｇ　−＋　−−Ｂ４株ＥＧ２８３８　−　−　＋　− Ｂｔ１株ＥＧ４９６１　−　−　〒 他のＢ、ｔ、鞭毛型−株 Ｂ、　ｔ、　ｖａｒ、　ｋｕｒｓｔａｋｉ（ＨＤ−１）　＋　−−−Ｂ、　ｔ、 　Ｖａｒ、　ｍｏｒｒｉｓｏｎｉ（ＨＤ−１２）　”　−一表１の結果は、Ｂ、 ｔ　株ＥＧ５１４４の細胞がＢ、ｔ、Ｆ！：！−株ｋｕｒｓｔａｋｉ、ｍｏｒｒ ｉｓｏｎｉ及びｔｏＩＷＯｒｔｈｉ鞭毛抗体試薬との負の反応を与えることを示 す。Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４細胞は、ディアブロチカ毒性を示すことが見いださ れた新規甲虫類−活性株であるＢ、ｔ、株ＥＧ４９６１からの鞭毛試薬とも負の 反応を与える。

これらの結果はＢ、ｔ　株ＥＧ５１４４がｋｕｒｓｔａｋｉ、ｍａｒｒｉｓｏｎ ｉ又はｔｏｌｗｏｒｔｈｉ−型Ｂ、ｔ、株ではないことを示す。さらにまだ知ら れていないＢ、ｔ、、株ＥＧ５１４４の鞭毛血清型は、血清変種ｋｕｍａｍｏｔ ｏｅｎｓｉｓ　（血清型１８）として血清型分類されたＢ、ｔ、株ＥＧ４９６１ のものと明らかに異なる。Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４及びＢ、ｔ、株ＥＧ４９６１ の両方共、文献に記載されている他の甲虫類−毒性Ｂ、ｔ、株のものと異なる鞭 毛血清型を有すると思ＥＧ５１４４の本来のプラスミドのサイズ分別及びｃｒｙ ｌｌＩＢプローブ精査 Ｂ、ｔ、株は、周知のアガロースゲル電気泳動の方法によりサイズに従ってその プラスミドを分別することにより特性化することができる。

この方法は、リゾチーム及びＳＤＳを用いてＢ、ｔ、細胞を溶解し、アガロース ゲルを通ってライセードからプラスミドを電気泳動させ、ゲルをエチジウムプロ ミドで染色してプラスミドを視覚化することを含む。

ゲル中を比較的ゆっくり移動する比較的大きなプラスミドはゲルの上部に現れ、 小さいプラスミドはゲルの下部に向かって現れる。

図２のアガロースゲルは、Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４，４が白いバンドで示される通 り約１４５．９２．１２．１０及び５．５ＭＤａの本来のプラスミドを含むこと を示す。プラスミドのサイズは既知のサイズのプラスミド（示していない）との 比較により評価した。図２には示していないがＢ、ｔ、株ＥＧ５１４５は約１４ ５．９２．１２及び５．５ＭＤａ１７）本来のプラスミドを含む６Ｂ、ｔ、株Ｅ Ｇ５１４４中に見られたＩＯＭＤａの潜在プラスミドはＢ、ｔ、株ＥＧ５１４５ には存在しない。

図２はさらに、甲虫類−毒性Ｂ、ｔ、株ＥＧ４９６１が約１５０゜９５．７０， ５０，５及び１．５ＭＤａの本来のプラスミドを含み、甲虫類−毒性Ｂ、ｔ、株 ＥＧ２８３８が約１００，９０及び３７ＭＤａの本来のプラスミドを含むことを 示す。図２は甲虫類−毒性Ｂ、ｔ、株ＥＧ２１５ｇが約１５０．１０５．８８． ７２及び３５ＭＤａ（Ｄ本来のプラスミドを含むことも示す。Ｂ、ｔ、株ＥＧ４ ９６１の１５０及び１．５ＭＤａプラスミド及びＢ、ｔ、株ＥＧ２１５８の１５ ０ＭＤａプラスミドなどのプラスミドのあるものは、実際のゲル上で見えるが写 真では見ることができない。図２はＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４の本来のプラスミド のサイズがＢ、ｔ、株ＥＧ２１５８、ＥＧ２８３８及びＥＧ４９６１の本来のプ ラスミドのサイズと異なることを示している。従ってＢ。

ｔ１株ＥＧ５１４４は、これらのプラスミドアレー研究及び実施例２に記載した 血清型分類研究に基づき、他の甲虫類−毒性Ｂ、ｔ、株ＥＧ２１５８、ＥＧ２８ ３８及びＥＧ４９６１と異なる。同様にＢ、ｔ、株ＥＧ５１４５はプラスミドア レー研究に基づき上記の甲虫類−毒性Ｂ。

ｔ、株と異なると思われる。

図２で示したプラスミドを、５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃＢｉｏ１．．９ ８．　ｐｐ、５０３−５１７　（１９７，５）のプロット法を用いたプロッティ ングにより、アガロースゲルからニトロセルロースフィルターに移し、フィルタ ーを上記の通りに放射標識された２、　４ｋｂのｃｒｙＩＩＩＢ　ＤＮＡプロー ブとハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成後、フィルターをＸ−線フィル ムに暴露した。Ｘ−線フィルムを調べることにより、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢプロー ブがＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４の９２ＭＤａプラスミドと特異的にハイブリッド形 成することが確認された。この結果は、Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４の９２ＭＤａプ ラスミドがｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢ遺伝子と少なくとも部分的に相同なりＮＡ配列を 含むことを示し、９２ＭＤａプラスミドがｃｒｙＩＩＩ−型遺伝子を含むことを 確証している。Ｘ−線フィルムはｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢプローブが予想通りＢ、ｔ 、株ＥＣ；４９６１の９５ＭＤａプラスミド及びＢ、ｔ　株ＥＧ２８３８の１０ ０ＭＤａプラスミド、ならびにＢ、ｔ、株ＥＧ２１５８の８８Ｄａプラスミドに ハイブリッド形成することも示した。Ｂ、ｔ。

株ＥＧ２１５８の８８ＭＤａプラスミドは以前に甲虫類−毒素ｃｒｙＩＩＩＡ遺 伝子を含むことが示された（Ｄｏｎｏｖａｎ　ｅｔ　ａ　１．。

Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、２１４．ｐｐ、３６５−３７２　（１９８８） を参照）。発明者等は以前にＢ、ｔ、株ＥＣ２８３８の１００ＭＤａプラスミド が甲虫類毒素ｃｒｙＩＩＩＢ遺伝子を含み、Ｂ、ｔ、株ＥＧ４９６１の９５ＭＤ ａプラスミドが新規甲虫類毒素ｃｒｙＩＩＩＣ（ａ）遺伝子を含むことを決定し た。

Ｂｔ９株ＥＧ５１４４からの染色体及びプラスミドＤＮＡの両方（全ＤＮＡ）を 抽出し、別々の制限酵素５ｓｐｌＳＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ及びＥｃｏＲＩを用いて 消化した。消化したＤＮＡをアガロースゲルを通って電気泳動によりサイズ分別 し、その後フラグメントをエチジウムプロミドで染色することにより視覚化した 。比較のために、甲虫類−毒性Ｂｔ８株ＥＧ２１５８、ＥＧ２８３８及びＥＧ４ ９６１からの全ＤＮＡを同一の方法で加工した。得られた染色アガロースゲルを 調べることにより、それぞれ５ｓｐＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いた これらのＢ、ｔ、株からの全ＤＮＡの制限消化は、種々のサイズのＤＮＡフラグ メントを何百と与えることが示された。

サイズ分別ＤＮＡ制限フラグメントをプロッティングによりアガロースゲルから ニトロセルロースフィルターに移し、その後ｃｒｙＩＩＩ−型ＤＮＡハイブリッ ド形成プローブを用いて精査した。フィルターは、放射標識された２、４ｋｂの ｃｒｙＩＩＩＢ　ＤＮＡプローブを含む緩衝水溶液中で６５℃にてハイブリッド 形成させた。ハイブリッド形成後、フィルターをＸ−線フィルムに暴露し、オー トラジオダラムを形成した。

図３はオートラジオダラムの写真であり、左の数字はｃｒｙＩＩＩＢプローブと ハイブリッド形成したＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４のＤＮＡフラグメントのサイズを ｋｂで示す。これらのサイズはＨｉ’ｎｄＩＩｒで消化し、放射標識したファー ジラムダＤＮＡをサイズマーカーとして含む”５ｔｎｄ”と記した列との比較に より決定した。図３においてＥＧ２１５８、ＥＧ５１４４、ＥＧ２８３８及びＥ Ｇ４９６１と記した列は、各列の上部に示した制限酵素を用いて消化することに より得たこれらの各Ｂ、ｔ、株からのサイズ分別ＤＮＡフラグメントを含む。

図３中の各Ｂｔ１株に関する列において、黒いバンドはｃｒｙｅｒＩＢプローブ とハイブリッド形成したＤＮＡ制限フラグメントを示す。

図３を見て調べると、Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４のｃｒｙｌＩＩＢ−ハイブリッド 形成制限フラグメントのサイズがＢ、ｔ、株ＥＧ２１５８、ＥＧ２８３８及びＥ Ｇ４９６１のｃｒｙｌｌｌＢ−ハイブリッド形成フラグメントのサイズと明白に 異なることが示されている。

特＋：Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４の場合のｃｒｙｌＩＩＢ−ハイブリッド形成５ｓ ｐＩ制限フラグメントのサイズは３．４ｋｂであり、これハ他の３つのＢ、ｔ、 株の場合の対応する５ｓｐｌ制限フラグメントと異なる：Ｂ、ｔ、株ＥＧ２１５ ８の場合は２．８ｋｂであり；Ｂ、ｔ、株ＥＧ２８３８の場合は２．４ｋｂであ り；Ｂ、ｔ、株ＥＧ４９６１の場合は４．５及び６．Ｑｋｂである。Ｈｉｎｄｌ ＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いて得たＤＮＡ制限フラグメントの場合にも類似の差が 現れる。

これらの制限パターンの結果は、Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４がＢ、ｔ。

株ＥＧ２１５８、ＥＣ２８３８及びＥＣ４９６１のそれぞれｃｒｙｅｒｒＡ、ｃ ｒｙｌｌｌＢ及びｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ａ）遺伝子と異ｆ；ルｃｒｙＩＩＩ−型 遺伝子を含むことを示唆している。Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４のｃｒｙＴＩＩ−型 遺伝子は本発明者等によりｃｒｙｆｌｌｃ（ｂ）（配列ＩＤ　ＮＯ：１）と指定 された。

Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４及びＢｔ１株ＥＧ５１４５から全Ｄ　Ｎ　Ａを抽出し、 ６個の別の制限酵素（Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｌ　ＥｃｏＲＩ、Ａｃｃｒ、Ｄｒａｒ 、Ｓｓｐ　Ｌ　Ｘｂａ　Ｉ）を用いて消化し、アガロースゲル上のラグメントを プロッティングによりニトロセルロースフィルターに移シ、その後ｃｒｙｌＮ− 型ＤＮＡハイブリッド形成プローブ、特にｃｒｙｌｌｌＡを含むプローブを用い て精査した。ハイブリッド形成後、フィルターをＸ−線フィルムに暴露し、オー トラジオダラムを形成した。制限パターンの結果は、評価した２つのＢ、ｔ、株 、ＥＧ５１４４及ＵＥＧ５１４５に関して同一であり、２つの株が同一のｃｒｙ ｌ　ｒ　Ｉ−型遺伝子を含むことを示唆している。

Ｂｔ３株ＥＧ５１４４の結晶タンパク質の特性化Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４を室温 （約２１−２５℃）にてＤＳＭＧ胞子形胞子形成培養物子形成及び細胞溶解が起 こるまで（４−５日の成長）成長させた。ＤＳＭＧ培地は０．　４％（ｗ／ｖ） のＤｉｒｃｏ栄養ブロス、２５ｍＭのに２ＨＰＯ，，２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４， ０，５ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２．０．５ｍＭのＭｇＳＯ４，１０ＭＭのＦｅＳＯ ４，１０ＭＭのＭｎＣ１ｚ及び０．　５％（ｗ／ｖ）のグルコースである。Ｂｔ ０株ＥＧ５１４４の胞子形成培養物を顕微鏡により観察し、Ｂ、ｔ、胞子の他に 自由に浮遊する不規則を形の結晶が含まれることがわかった。実験によりＢ、ｔ 、結晶が通常特定の昆虫に毒性であり得るタンパク質を含むということが示され た。Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４の結晶の外観はＢ。

ｔ１株ＥＧ２１５８の平らな長方形の（又は菱形の）結晶と異なるが、Ｂ、ｔ、 株ＥＧ２８３８及びＥＣ４９６１の不規則な形の結晶のあるものと部分的に類似 している。

Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４の胞子形成培養物から胞子、結晶及び残留溶溶液で１回 、及びＴＥＴＸ　（１０ｍＭのトリスＨＣＩ、ｐＨ７，５，１ｍＭのＥＤＴＡ及 び０．００５％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ’Ｘ−１００を含む）で２回洗浄し、 ５０ｍｇ／ｍ＋の濃度でＴＥＴＸ中ニ懸濁した。固体混合物を溶解緩衝液（０， １４ＭのトリスＨＣＩ、ｐ）（６，８，２％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ、５％（ｖ／ｖ ）の２−メルカプトエタノール、１０％（Ｖ／Ｖ）のグリセロール及び０．１％ （ｖ　／　ｖ　）のブロモフェノールブルー）中で１００℃に５分間加熱するこ とにより、２５０μｇの遠心発酵培養物固体（結晶、胞子及びいくらかの細胞破 片を含む）から洗浄した結晶を特異的に溶解した。溶解した結晶タンパク質を５ ＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ分別した。サイズ分別後、タンパク質をクーマシー 染料を用いて染色して視覚化した。Ｂ、ｔ、株ＥＧ４９６１、ＥＣ２１５８及び ＥＣ２８３８の培養物を、比較のために同様の方法で加工した。

図４はこのタンパク質サイズ分別分析の結果を示し、左の数字はＢ。

ｔ１株ＥＧ５１４４により合成される結晶タンパク質のサイズをｋＤａで示す。

１列に示される通り、約７０ｋＤａの大きなタンパク質及び約３０ｋＤａの小さ いタンパク質がＢｔ１株ＥＧ５１４４胞子及び結晶を含む遠心発酵固体から溶解 された。Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４の約７０ｋＤａのタンパク質は、Ｂｔ０株ＥＧ ４９６１　（２列）、ＥＧ２１．）８（３列）の約７０ｋＤａの甲虫類−毒性結 晶タンパク質、ならびにＢ。

ｔ　株ＥＧ２８３８　（４列）の約７４ｋＤａの甲虫類〜毒性結晶タンパク質と サイズが類似であると思われる。

発明者等による以前の研究は、Ｂ、ｔ、株ＥＧ４９６１、ＥＧ２１５とを示した 。Ｂ、ｔ　株ＥＧ４９６１のＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ａ）タンパク質はｃｒｙｌＩ Ｊｃ（ａ）遺伝子によりコードされ、７４．３９３　Ｄ　ａの推定サイズを有す る。Ｂ、ｔ、株ＥＧ２１５８のＣｒｙＩＩｌ、Ａ、タンパク質はｃｒｙｒ　Ｉ　 ＩＡ遺伝子によりコードされ、７３．１１６Ｄａの推定サイズを有する。Ｂ、ｔ 　株ＥＧ２８３８のＣｒｙｌ　Ｉ　ｒＢタンパク質はｃｒｙｌＴＩＢ遺伝子によ りコードされ、７４．２３７Ｄａｃ′）ｉ定すイズを有する。実施例６に記載の 通り、新規ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子ＣＦ！Ｗ’ＪＩＤ　Ｎｏ　：　１） 　ニヨリａ造されるＢ、ｔ、ａＥＧ５Ｌ４４の甲虫類−毒性結晶タンパク質は、 ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＡ、ＣｒｙＩＩＩＢ及びＣｒｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ａ）タンパク 質と明らかに異なる。

Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４により製造される約３０ｋＤａの小さい結晶タンパク質 は、Ｂ、ｔ、株ＥＧ４９６１、ＥＣ２１５８及びＥＣ２８３８により製造される 小さい結晶タンパク質と大体類似のサイズである。

Ｂ、ｔ、株ＥＧ２１５８、ＥＣ２８３８及びＥＣ４９６１の約３０ｋＤａの小さ いタンパク質は、互いに関連していると思われ、いずれも甲虫類昆虫に対する測 定可能な殺虫活性を示すことが見いだされていない。

Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４の約３０ｋＤａのタンパク質が甲虫類昆虫に対する殺虫 活性を有すると言じる理由はない。

実施例４の方法に従い、ＤＮＡプロット分析をさらに行い、２．４ｋｂのｃｒｙ ＩＩＩＢ　ＤＮＡプローブがＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４　ＤＮＡの１個の７．Ｏｋ ｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ制限フラグメントに特異的にハイブリ、ド形成するこ とが明らかになった。この結果は、７．０ｋｂのフラグメントが完全ｃｒｙＩ　 Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子を含むことを示Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４の７．ＯｋｂのＥ 　ｃ　ｏＲＩ　−Ｘｂ　ａ　Ｉ７５グメントを単離し、７．０ｋｂのＥｃｏＲＩ −Ｘｂａｌ制限フラグメントにつき研究をし、フラグメントがｃｒｙＩ　Ｉ　Ｉ −型遺伝子、特にｃｒｙＩＩ）Ｃ（ｂ）遺伝子を含むことを確認した。実施例６ に示す方法は、ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ１）のヌクレ オチド塩基配列の決定を記載するものである。

ニング及び配列決定 前実施例で記載した７、０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを単離する ために、Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４からのサイズ−選択ＤＮＡＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ ｌ制限フラグメントを周知のＥ、ｃｏｌｉベクターであるｐＵｃ１８に連結する ことによりＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４のプラスミドライブラリを構築した。この方 法は、細胞の溶解及びその後のＤＮＡスプーリング（ｓｐｏｏ］ｊｎｇ）により 最初にＢ、ｔ　株ＥＧ５１４４から全ＤＮＡを得、その後金ＤＮＡをＥＣ０ＲＩ 及びＸｂａｌ制限酵素の両方を用いて二重消化し、消化されたＤＮＡをアガロー スゲルを通して電気泳動させ、４−１０ｋｂのＤＮＡのサイズ選択フラグメント を含むゲルスライスを切除し、サイズ選択ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限フラグメン トをアガロースゲルスライスから電気溶出する段階を含んで行った。これらのフ ラグメントを、やはりＥｃｏＲＩ及びＸｂａｌで消化したＥ、ｃｏｌｊプラスミ ドベクターｐｕｃ１８と混合した。ｐＵＣ１８ベクターはアンピシリン耐性（Ａ ｍｐＱのための遺伝子を有し、化ｐＵｃ１８ベクターからのＤＮＡサイズ−選択 制限フラグメントの混合物にＴ４　ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＰを加え、ｐＵｃ１ ８ベクターをＢ、ｔ　株ＥＧ５１４４制限フラグメントど連結させた。

その後プラスミドライブラリを、問題の遺伝子を欠いた宿主生物であるＥ、ｃｏ ｌｉ細胞中に、以下のようにして形質転換した。連結後ＤＮＡ混合物を、ＣａＣ ｌ２で処理して細胞がＤＮＡを取り上げるようにしたアンピンリン感応性Ｅ、ｃ ｏｌｊ宿主株であるＥ、ｃｏｌｊ株ＤＨ５αと共にインキュベートした。Ｅ、ｃ ｏｌｉ、特に株ＤＨ５αは組み替えプラスミドを用いて容易に形質転換され、Ｅ 、ｃｏｌｉ株ＤＨ５αはＢ、ｔ、結晶タンパク質のための遺伝子を自然には含ま ないので、これらを宿主株として用いた。ｐＵｃ１８はアンピシリンに対する耐 性を与えるので、組み替えプラスミドを得る宿主細胞はすべてアンピシリン耐性 となる。組み替えプラスミドに暴露した後、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主細胞をアンピシリ ンを含む寒天培地上に広げた。３７℃の温度で終夜インキュベーションした後、 組み替えプラスミドが潜在する細胞から数千のＥ。

ｃｏｌｉコロニーがアンピシリン−自存寒天上に成長した。その後これらのＥ、 ｃｏｌｉコロニーを、続（プローブによる精査のためにニトロセルロース上にブ ロッティングした。

その後プローブをＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４からのＤＮＡの７．　０ｋｂのＥｃｏ ＲＩ−Ｘｂａｌフラグメントを含む形質転換宿主コロニーと特異的に結合させる 条件下で、放射標識された２、４ｋｂのｃｒｙｒＩＩが２．４ｋｂのｃｒｙｌｌ ＩＢプローブと特異的にハイブリッド形成しイブリッド形成コロニーにつきさら に研究した。Ｅ、ｃｏｌｉ株ＥＧ７２３６はｐＥＧ２７１と指定する組み替えグ ラスミ下を含み、それはｐＵＣ１８及びＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４からのＤＮＡの 約７．Ｏｋｂの挿入ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限フラグメントを含んだ。ｃｒｙＩ Ｉ　ＩＢＢａ−ブはｐＥＧ２７１中の７．０ｋｂのＤＮＡフラグメント挿入片に 特異的にハイプリント形成した。ｐＥＧ２７１の制限地図を図５に示す。

ｐＥＧ２７１の７．Ｏｋｂのフラグメントは、２．４ｋｂ及び３．８ｋｂのＨ４ ｎｄＩＩＩフラグメント、及びｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢＢａ−ブと特異的にハイブリ ッド形成する４、０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントを含んだ。２．４ ｋｂのＨ４ｎｄｌｌＩフラグメントをＤＮＡ配列決定ベクターＭ１３ｍｐ１８中 にサブクローニングした。４．ＯｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントはＤ ＮＡ配列決定ベクターＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９中にサブクローニング した。

サブクローニングされた各ＤＮＡフラグメントの実質的部分のヌクレオチド塩基 配列を標準的サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ法を用いて決定した。サブク ローニングされた各フラグメントに関し、配列−特異的１７−ｍｅｒオリゴヌク レオチドブライマーを用いてＤＮＡ配列決定反応を開始させることにより両ＤＮ Ａ鎖を配列決定した。配列決定により、７．Ｏｋｂのフラグメントが読み取り枠 、及び特に新規ｃｒｙｌＩＩ−型遺伝子を含むことが明らかになった。ｃｒｙＩ 　Ｉ　ＩＣ（ｂ）（配列ＩＤ　ＮＯ：１）と指定されるこの新規遺伝子は、ｃｒ ｙＩ　Ｉ　ＩＡ遺伝子と有意に異なる。下記の通りｃｒｙｒ　Ｉ　ｒｃ　（ｂ） 遺伝子はＣｒｙＩＩＩＢ遺伝子とも明らかに異なる。

びｃｒｙｒｌｌｃ（ｂ）遺伝子によりコードされるＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タ ンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）の推定アミノ酸配列を図１に示す。

ｃｒｙｒ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　Ｎ○＝１）のタンパク質コード部 分を、位Ｍ１４４で始まり、位置２０９９で終わるヌクレオチドとして定義する 。推定リポソーム結合部位を図１−１にて”ＲＢＳ“と示す。ｃｒｙＩ　Ｉ　Ｉ Ｃ（ｂ）遺伝子によりコードされるＣｒｙｌ［Ｃ（ｂ）タンパクＭ（配列ＩＤ　 Ｎｏ　２）の、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列１［Ｎｏ：１）の読み取 り枠から推定されるサイズは、７４．２６５Ｄａ　（６５２アミノ酸）である。

５ＤＳ−ＰＡＧＥから決定されるＣｒｙＩＩＩＣ（ｂ）タンパク質の見掛けのサ イズは約７０ｋＤａであることに注意するべきである。従って本明細書において は、ＣｒｙＩＩＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）は約７０ｋＤａの サイズであるとする。

先行技術のＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＡタンパク質のサイズは以前に７３，１１６Ｄａ　 （６４４アミノ酸）と推定された。ＣｒｙｌｌＩＢタンパク質のサイズは以前に ７４．２３７Ｄａ　（６５１アミノ酸）と決定された。

ＤＮＡ配列決定により、ｃｒｙＩＩＩｃ（ｂ）遺伝子中にＨｉｎｄ１１１＃Ｉ限 部位が存在し、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子の下流に５ｓｐｌ制限部位が存 在することが明らかになった（それぞれ図１−２及び１−３を参照）。これらの 制限部位の位置を知ることにより、７．０ｋｂのフラグメント内のｃｒｙＩＩＩ ｃ （ｂ）遺伝子の位置及び配向を図５中で矢印で示す通りに正確に決定すｎ、”Ａ ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｎ　Ｓ ｍａｌｌ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、、”ＤＮＡ、３．ｐｐ。

４２１−４３６　（１９８４））のコンピュータープログラムを用い、ＣｒｙＩ ＩＩｃ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）とｃｒｙＩＩＩＢ及びｃｒｙｌ　Ｉ 　ＩＡ遺伝子の配列を比較し、それらのそれぞれＣｒｙＨｒｃ　（ｂ）　、Ｃｒ ｙｌ　Ｉ　ＩＢ及びＣｒｙＩＩＩＡタンパク質の推定アミノ酸配列を比較した。

ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　Ｎｏ、１）のヌクレオチド塩基配 列は、ｃｒｙＩＩＩＢ遺伝子のヌクレオチド塩基配列と９６％位置的に同一であ り、ｃｒｙｌＩＩＡ遺伝子のヌクレオチド塩基配列とは７６％のみ位置的に同一 である。従ってｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列［）ＮＯ：１）はｃｒｙ ｌ　Ｉ　ＩＢ及びｃｒｙＩ　ｒ　ＩＡ遺伝子と関連しているが、ｃｒｙｒ　Ｉ　 ＩＣ（ｂ）遺伝子はｃｒｙｒ　Ｔ　ＩＢ遺伝子と別であり、ｃｒｙＩＩＩ人遺伝 子とは実質的に異なることが明らかである。

ＣｒｙＩＩＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　Ｎｏ：　２）（７）Ｌ？アミノ酸 配列配列ＣｒｙｌｌＩＢタンパク質の推定アミノ酸配列と９５％位置的に同一で あるが、ＣｒｙＩＩＩＡタンパク質の推定アミノ酸配列とは６８％のみ位置的に 同一であることが見いだされた。これらの差は、下記に示す殺虫活性における差 と共にｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　Ｎｏ、１）によりコードさ れるＣｒｙ　Ｉ　Ｉ　ｒｃ　（ｂ）タンパク質がＣｒｙｌＩＩＢタンパク質又は ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＡタンパク質と異なるタンパク質であることを明白に示してい る。

さらに理論に束縛されることは望まないが、ＣｒｙＩＩＩＣ（ｂ）タンパク質（ 配列ＩＤ　ＮＯ：２）のアミノ酸配列と発明者等の知る他のＣｒｙｌ　Ｉ　Ｉ− 型タンパク質との比較に基づき、Ｃ，ｒｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質のコ ーンルートワーム毒性の増強に以下のアミノ酸残基が重要であると思われる。こ こでアミノ酸に関する受容されている略字の後の数字は図１に示す配列ＩＤ　Ｎ Ｏ：２と同定される配列中のアミノ酸の位置を示す：Ｈ４ｓ９、Ｈｉｓ２３１、 Ｇ１ｎ３３９．５ｅｒ３５２、Ａｓｎ４４６、Ｈｉｓ４４９、Ｖａ１４５０、Ｇ ］ｙ４５１、ｌ１ｅ５００及びＴｈｒ６２４゜いくつかの他のＣｒｙＩ　Ｉ　Ｉ タンパク質のアミノ酸配列の研究後、示された位置のアミノ酸が全く一貫してＣ ｒｙｌＩｒｃ　（ｂ）タンパク質に関して示されたアミノ酸と異なるアミノ酸を 示していたので、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２） のコーンルートワーム毒性に重要である可能性があるとしてこれらのアミノ酸残 基を選んだ。

同一の研究に基づき、以下のアミノ酸修正の１つ又はそれ以上を行うｃｒｙＩ　 Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）の特定部位の突然変異誘発が、得 られるタンパク質に関するコーンルートワーム毒性を向上又は増強するとも思わ れる：　Ｐｒｏ２１をＧａｙに；Ａｓｐ９７をＡｓｎに；Ｖａ１２８９をＩｌｅ に；５ｅｒ３５２をＰｈｅに；４１７１１ｅをＶａｌに；Ｐｂｅ４１９をＬｅｕ に；ＧＩｙ４５１をＳｅｒに：Ｉ　］　ｅ５９０をＬｅｕに；　Ｉ　］　ｅ６０ ０をＬｙｓに；Ｔｈｒ６２４をＬｙｓに。

当該技術において十分理解されている通り、特定部位の突然変異誘発又は遺伝子 切断などにより、Ｃｒｙｌ　Ｉ　ｒｃ　（ｂ）タンパク質（配列ＩＤＮ○：２） により示されるのと基本的に類似の殺虫活性（コーンルートワーム及び他の甲虫 類昆虫に対して）を有する毒性タンパク質を与えることができる他の変更をｃｒ ｙＴ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤＮ○、１）において行うことができる。

上記のようなｃｒｙＩＩＩｃ（ｂ）遺伝子（配列ＩＤ　Ｎｏ：１）及びＣｒｙＪ 　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）の変性物は、特許請求され ている本発明の範囲内とする。

実施例７ クローニングされたｃｒｙＩＩＩＣ（ｂ）遺伝子の発現ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ ）遺伝子（配列ＩＤ　ＮＯ：１）ｉ、：よるＣｒｙｌｌｌＣ（ｂ）タンパク質（ 配列ＩＤ　ＮＯ：２）の製造を決定する研究を行った。

表２はこれらの方法の間に用いられるＢｔ、及びＥ、ｃｏｌｉ株及びプラスミド の関連特性をまとめたものである。プラス（゛）は指定された要素、活性又は機 能の存在を示し、マイナス（−）はその不在を示す。“及び゛の指定はそれぞれ と共に用いた抗体に対するそれぞれ感応性及び耐性を示す。表中で用いた略字は 以下の意味を有する：Ａｍｐ（アンピシリン）；Ｃｍ（クロラムフェニコール） ；Ｃｒｙ（クリスタリフエラス）：Ｔｃ（テトラサイクリン）。

株　関連特性 Ｂ４　チュリンギエンシス ＨＤ７３−２６　Ｃｒｙ−１αｍ’ ＥＧ７２３７　ｐＥＧ２７２が潜在するＨＤ７３−２６（ｃ　ｒｙ　ｒ　Ｉ　Ｉ Ｃ（ｂ）　”）ＥＧ５１４４　ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）”Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＨ５α　Ｃｒｙ−１，Ａｍｐ’ ＧＭ２１６３　Ｃｒｙ−１Ａｍｐ’ ＥＧ７２３６　ｐＥＧ２７１が潜在するＤＨ５α（ｃｒｙＪ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）” ） プラスミド ｐＵｃ１８　Ａｍｐ’、Ｃｒｙ−１ Ｅ、ｃｏｌｉベクター ｐＮＮｌｏｌ　Ｃｍ゛、Ｔｃ’、Ｃｒｙ−、バンルスベクター ｐＥＧ２７１　Ａｍｐ’、ｐＵｃ１８のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位に連結したＢ 、ｔ、株ＥＧ５１４４の７．ＯｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ　ｃｒｙｌＪＩｃ（ ｂ）”７５グメントを含む組み替えｃｒｙｌ　Ｔ　ＩＣ（ｂ）“Ｅ、ｃｏｌｊプ ラスミド ｐＥＧ２７２　Ｔｃ’、Ｃｍ’、ｐＥＧ２７１の５ｐｈＩ部位に連結したバンル スベクターｐＮＮ１０１を含む（ｒｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）◆バンルスーＥ、ｃ ｏｌｉ組み替えプラスミド 実施例６で記載したプラスミドｐＥＧ２７１が潜在するＥ、ｃｏ１ｉ細胞を分析 し、７０ｋＤａのＣｒｙｒ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）結晶タンパク質を検出可能な量で製 造しないことが見いだされた。

実験により、クローニングされたＢ、ｔ、結晶遺伝子はＥ、ｃｏｌｉ中での発現 が少なく、Ｂｔ、中でそれらそれぞれの本来のプロモーター配列から多量に発現 されることが示された。実施例６に示すようにして構築され、図５に示す組み替 えプラスミドｐＥＧ２７１はＥ、ｃｏｌｉ中で複製されるがＢｔ、中で複製され ない。クローニングされたＣｒｙｒｌＩｃ（ｂ）遺伝子を多量に発現するために 、Ｂｔ、中で複製することができるバジルスベクターｐＮＮ１０１　（Ｔｃ’Ｃ ｍ’Ｃｒｙ−）をｐＥＧ２７１のＳｐｈ１部位に連結した。得られたプラスミド をｐＥＧ２７２と指定する。プラスミドｐＥ０２７２のａｔ＝及びその後のＢ。

ｔ、の形質転換のためのその利用の詳細を下記に記載する。

単離されたプラスミド１）ＥＧ２７１ＤＮＡを５ｐｂＩで消化し、その後やはり Ｓｐｈ　Ｉで消化したバシルスベクターｐＮＮ１０１と混合した。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＰを混合物に加え、ｐＥ０２７１をｐＮＮ１０１ ベクターの５ｐｂＩ部位に連結させた。

連結後、細胞がプラスミドＤＮＡを取り上げることができるように塩化カルシウ ムで処理したＥ、ｃｏｌｊ株ＤＨ５α細胞の懸濁液にＤＮＡ混合物を加えた。組 み替えプラスミドに暴露した後、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主細胞をテトラサイクリンを含 む寒天培地上に広げた。ｐＮＮｌｏｌのＳｐｈ１部位に連結されたｐＥＧ２７１ を含むプラスミドを取り上げた細しなかった細胞は成長しない。

１個のテトラサイクリン耐性コロニーからプラスミドを単離し、５ｐｈｌで消化 し、アガロースゲルを通してｉｉ気泳動させた。プラスミドは、それぞれプラス ミドｐＮＮ１０１及びｐＥ０２７１に対応する５、８ｋｂ及び９ｋｂの２種類の ５ｐｈＩ　ＤＮＡフラグメントを含んだ。このプラスミドをｐＥ０２７２と指定 した。ｐＥＧ２７２の制限地図を図６に示す。その後プラスミドｐＥＧ２７２を 用い、実施例６で以前に記載した塩化カルシウム法により受容性とされたＥ、ｃ ｏｌｉ株ＧＭ２１６３の細胞を形質転換した。Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ＠ＧＭ２１６３ はクリスタリフＪ、ラス陰性（Ｃｒｒ）及びアンピシリン感応性（Ａｍｐ“）株 であり、）　Ｍｏ１．、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、１９２．　ｐ＋）、２８８−２ ８９　（１９８３）におけるＭ、Ｇ、Ｍａｒｉｎｕｓ　ｅｔ　ａｌ、０）方法に より構築された。

その後形質転換されたｇ、ｃｏｌｉ株ＧＭ２１６３から上記の方法を用いてプラ スミドｐＥＧ２７２を単離した。単離されたプラスミドｐＥＧ２７２をエレクト ロポレーションにより次にＢ、ｔ、株ＨＤ７３−２６に形質転換した。Ｂ、ｔ、 株ＨＤ７３−２６の細胞はクリスタリフェラスー陰性（Ｃｒｙつ及びクロラムフ ェニコール感応性（Ｃｍ”）である。エレクトロポレーションを行うためのＢｉ ｏＲａｄ　ＧｅｎｅＰｕ］ｓｅｒＴｗ装置を用い、懸濁液中のＢ、ｔ、株ＨＤ７ ３−２６の細胞を誘導し、やはり混合物に加えられたｐＥＧ２７２を取り上げさ せた。

エレクトロポレーションの後、形質転換されたＥ、ｔ、細胞を５μｇのクロラム フェニコールを含む寒天培地上に広げ、３０℃で約１６−抱はクロラムフェニコ ール寒天培地上でコロニーに成長するが、プラスミドを吸収しなかった細胞は成 長しない。Ｂ、ｔ、、株ＥＧ７２３７と指定される１つのＣｍ’コロニーは、制 限パターンがｐＥＧ２７２（７）パターンと同一であるらしいプラスミドを含ん だ。

Ｂ、ｔ、株ＥＧ７２３７の細胞をクロラムフェニコール（３μｇ／ｍ１）を含む 胞子形成培地中２２−２５℃にて、胞子形成及び細胞溶解が起こるまで（４−５ 日）成長させた。顕微鏡試験により、Ｂ、ｔ、株ＥＧ７２３７の胞子形成培養物 は、胞子及び小さくて自由に浮遊する不規則な形の結晶を含むことが明らかにな った。これらの結晶は、類似の方法で調製したＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４の胞子形 成培養物の場合に観察される小さくて不規則な形の結晶と似ている。

Ｂ、ｔ、株ＥＧ７２３７の胞子形成発酵培養物からの胞子、結晶及び細胞破片を 遠心により収穫した。遠心ベレットをＩＮのＮａＣ１で１回、及びＴＥＴＸ（１ ０ｍＭのトリス、ＨＣＬ　ｐＨ７，５，１ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ 　ｖ　）のＴｒ　ｉ　ｔｏｎ’Ｘ−１００）　で２回洗浄し、ベレットを５０ｍ ｇベレット／ｍ１ＴＥＴＸの濃度でＴＥＴＸに懸濁した。

溶解緩衝液（０，１４Ｍのトリス、ｐＨ８，８，２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、５％ （ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール及び ０．　１％（Ｗ／Ｖ）のブロモフェノールブルー）中で１００℃にて５分間、遠 心懸濁液の一部（２５０μｇのベレット固体を含む）を加熱することにより、遠 心ベレット懸濁液中の結晶を溶解した。結晶が溶解した後、混合物を５ＤＳ−ポ リアクリルアミドゲルに適した。クーマノ−染色ゲルの写真を図７に示す。

図７のゲルの３列は、Ｂ、ｔ　株ＥＧ７２３７が約７０ｋＤａの大タンパク質及 び約３３ｋＤａの小タンパク質を製造したことを示す。これらのタンパク質は、 図７の１列に示され、Ｂ　ｔ　株ＥＧ７２３７と同一の方法で調製されたＢ、ｔ 　株ＥＧ５１４４により製造される約７０ｋＤａの大タンパク質及び約３０ｋＤ ａの小タンパク質とサイズが同一であることがわかった。この結果は、ｐＥＧ２ ７２の７．Ｏｋｂのフラグメントが２つの結晶タンパク質遺伝子：約７０ｋＤａ のタンパク質のための１つ及び約３０ｋＤａのタンパク質のための１つを含むこ とを示約７０ｋＤａのタンパク質をコードする遺伝子はｃｒｙＩ　ＩＩＣ（ｂ） 遺伝子であり、それがコードするタンパク質は殺虫性Ｃｒｙ■ＩＩＣ（ｂ）タン パク質である。ｃｒｙｘｒ　ＩＣ（ｂ）遺伝子（配列１０　Ｎｏ：１）のＤＮＡ 配列、及びそれに対応する推定タンパク質（配列ＪＤ　ＮＯ：２）に関するアミ ノ酸配列を図１に示す。

Ｂ、ｔ、株ＥＧ７２３７は、図７のタンパク質バンドから証明されるとおり、重 量に基づいてＢ、ｔ　株ＥＧ５１４４の約３倍多（の７０ｋＤａタンパク質を製 造した。組み替えＢ、ｔ、株ＥＧ７２３７における３０ｋＤａ小タンパク質の製 造もＢ、ｔ、　株ＥＧ５１４４と比較して増収下の実施例８−１１は、Ｂ、ｔ、 株ＥＧ５１４４、Ｂ、ｔ、株ＥＧ７２３７及びそれらの株により製造されるＣｒ ｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）タンパＢ、ｔ　株ＥＧ７２３７及びそのＣｒｙ　Ｉ　Ｉ 　ＩＣ（ｂ）タンパク質のサザンコーンルートワーム及びコロラドボテドビート ルに対する殺虫活性 Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ｂ）毒素タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）を製造するｃ ｒｙＩＩＩｃ（ｂ）遺伝子（配列Ｉ　Ｄ　Ｎｏ　：　１）を含む組み替より、ｔ 、株ＥＧ７２３７の殺虫活性を、サザンコーンルートワーム及びコロラドボテド ビートルに対して決定する。

比較のために、Ｂ、ｔ、株ＨＤ７３〜２６バツクグラウンドにおいてｃｒｙｌｌ Ｉ−型毒素遺伝子を含む他の２つの組み替えＢ、ｔ、株も生物学的定量研究に含 んだ。これらはＣｒｙｌｌｌＡｌ！素タンパク質を製造するｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＡ 遺伝子を含む組み替えＢ、ｔ、株ＥＧ７２３５、及びＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＢ毒素タ ンパク質を製造するｃｒｙｌｌｌＢ遺伝子を含む組み替えＢ、ｔ、株ＥＧ７２２ ５である。

３つのＢ、ｔ、株を胞子形成液体培地中３０℃にて、胞子形成及び細胞溶解が起 こるまで成長させた。微量濾過により発酵ブロスを濃縮した。

たＢ、ｔ、粉末を調製した。各Ｂ、ｔ、粉末中のＣｒｙＩ　Ｉ　Ｉ−型毒素タン パク質の量は、標準的５ＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて定量した。

Ｍａｒｒｏｎｅ　ｅｔ　ａｍ　、Ｊ、Ｅｃｏｎ、Ｅｎｔｏｍｏｌ、。

７８、ｐｐ、２９０−２９３　（１９８５）と類似であるがホルマリンを含まな い人工の食物の表面汚染により、第１令サザンコーンルートワーム幼虫の生物学 的定量を行った。各生物学的定量は８連続水希釈を含み、アリコートを生物学的 定量皿中の食物の表面に適用した。生物学的定量皿の２ｍｌのウェルのそれぞれ が１７５ｍｍ”の表面積の食物１ｍｌを含んだ。希釈剤（０，００５％のＴｒ　 ｉ　ｔｏｎ’Ｘ７１００水溶液）がＭ発した後、昆虫の幼虫を食物上に置き、２ ８℃でインキュベートした。

１投薬当たり３２の幼虫を試験した。７日後に死亡率を記録した。生物学的定量 研究において、希釈剤のみを含む標準もインキュベートした。

人工の食物をポテトフレークを加えたＢｉｏＳｅｒｖｅ’　ｓ　Ｎｏ。

９８３０昆虫食物に置換する以外は類似の方法を用い、第１令コロラドボテドビ ートル幼虫を試験した。１投薬当たり３２の幼虫を試験し、７日ではなく３日で 死亡率を記録した。

生物学的定量研究の結果を下表３に示し、試験した昆虫の５０％を殺すのに必要 なＣｒｙｌ　Ｉ　Ｉ−型タンパク質の濃度であるＰＬＣｓｏ値として殺虫活性を 報告する。試験した両方の昆虫に関して生物学的定量研究において１投薬当たり ４回の重複を用いた。重複生物学的定量のそれぞれからのデータをプロビット分 析（Ｒ，Ｊ、　Ｄａｕｍ、Ｂｕ　１１．　Ｅｎｔｏｍｏｌ、Ｓｏｃ、Ａｍ、、１ ６．Ｉ）ｐ、１０−１５　（１９７０））のために集め、希釈剤のみの場合の標 準死亡に関して死亡率を修正した（Ｗ、Ｓ、Ａｂｂｏｔｔ、Ｊ、Ｅｃｏｈ、Ｅｎ ｔｏｍｏｌ、、１８゜ｐｐ、２６５−２６７　（１９２５））。結果をＰ　Ｌ　 Ｃｉｏを与えるＣｒｙＩＩＩ−型タンパク質の投薬量（食物表面１ｍｍ”当たり のｎｇ　Ｃｒｙ［Ｉタンパク質として）として示す。９５％における信頼区間を ＰＬＣ５゜値の下の括弧内に示す。

行った。０．　１％のＴｒｉｔｏｎ”Ｘ−１００水溶液中に懸濁した既知の処理 濃度のＢ、ｔ、粉末中に大豆の葉を浸漬した。過剰の材料がしたたり落ちた後、 葉を乾燥させた。０．１％のＴｒ　ｉ　ｔｏｎ’Ｘ−１００に浸漬した葉を未処 理標準とした。２０の昆虫の幼虫を処理した葉と共にベトリ皿に閉じ込め、２５ ℃でインキュベートし、３日間食べさせ、その時点で死亡率を記録した。

生物学的定量研究の結果を下表４に示し、調べた昆虫の５０％を殺すのに必要な ＣｒｙＩＩＩ−型タンパク質の濃度であるＰＬＣｓ０値として殺虫活性を報告す る。データは表３に関して実施例８で記載した通りに扱った６結果をＰＬＣｓ。

を与えるＣｒｙＬＩＩ−型タンパク質の投薬量（ＣｒｙｒｌＩタンパク賀のｍｇ ／葉の浸漬に用いた溶液のｍｌで）として示す。９５％における信頼区間をＰＬ Ｃ５，ｌ値の改の括弧内に示す。

この生物学的定量研究の結果は、Ｃｒｙｌ　ｌ　Ｉｃ　（ｂ）１Ｂ累タンパクＮ 　（配列ＩＤ　Ｎｏ：　２）　をＨ造すルＢ、ｔ、株ＥＧ　７２３７ノ方がＣｒ ｙＩＩＩＢ−製造Ｂ、ｔ、株ＥＧ７２２５よりメキシコヒーンビートルに対して 有意に殺虫性が高いことを示す。ＣｒｙＩＩＩＡ毒素タンパク質を製造するＢ、 ｔ、株ＥＧ７２３５は、調べた最高投薬量において測定可能な殺虫活性を示さな かった。

これらの結果は、甲虫類の目の昆虫属に関して特定のＣｒｙｌＩＩ−型要素タン パク質の殺虫活性が大きく異なることをさらに証明している。

実施例１０ Ｂｔ９株ＥＧ５１４４のサザンコーンルートワームに対する殺虫活性 Ｂ、ｔ、株ＥＧ５１４４の殺虫活性をサザンコーンルートワームに対して評価し た。比較のためにＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（ａ）毒素タンパク質を製造するＢ、ｔ、 株ＥＧ４９６１を生物学的定量研究に含んだ。

この実施例におけるサザンコーンルートワームの生物学的定量法は、調べた昆虫 の５０％を殺すのに必要なＣｒｙｌ　Ｉ　Ｉ−型タンパク質の１度であるＰＬＣ ，０値の決定により行った。方法は前実施例で行った人工食物生物学的定量法に 類似し、１投薬当たり３２の第１令サザンコーンルートワーム幼虫を用いた。重 複生物学的定量のそれぞれからのデータをプロビット分析（Ｒ，Ｊ、Ｄａｕｍ、 Ｂｕｌ　１．Ｅｎｔｏｍｏｌ。

Ｓｏｃ、Ａｍ、、１６．ｐｐ、１０−１５　（１９７０））のために集め、希釈 剤のみの場合の標準死亡に関して死亡率を修正した（Ｗ、Ｓ、　Ａｂｂａｔ　ｔ 、Ｊ、Ｅｃｏｎ、Ｅｎｔｏｍｏｌ、、１８．ｐｐ、２６５−２６７　（１９２５ ））、結果をＰＬＣｓｏを与えるＣｒｙｌｌｌ−型タンパ質として）として２回 の別々の試験に関して示す。９５％における信頼区間をＰＬＣ５゜値の次の括弧 内に示す。試ｓ１では各投薬量たり４回の重複を用い、後日行った試験２では２ 回の重複を用いた。

この生物学的定量研究は、Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ−型タンパク質を製造するＢ、ｔ 、株ＥＧ５１４４及びＢ、、　ｔ、株ＥＧ４９６１の両方がサザンコーンルート ワームに対して定量可能な殺虫活性を与えることを示す。

実施例１１ Ｂ、ｔ　株ＥＧ５１４４の日本ビートル幼虫に対する殺虫活性Ｂ、ｔ、株ＥＧ５ １４４の殺虫活性を、白土（ポビリア　ジャポニカ（Ｐｏｐｉｌｌｊａ　Ｊａｐ ｏｎｉｃａ））としても知られる日本ビートル幼虫に対して評伍した。比較のた めに、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＡ毒素タンパク質を製造するＢ、ｔ、株ＥＣ２１５８及 びＣｒｙｌＩＩＢ毒素タンパク毒素タンパ石質、ｔ、株ＥＧ２８３８と共にＣｒ ｙ　Ｉ　Ｉ　ＩＣ（ａ）　ｌＩ素タンパク質を製造するＢ、ｔ、株ＥＧ４９６１ を生物学的定量研究に含んだ。

この実施例の生物学的定量法は、食物挿入分析におけるＣｒｙＩＩＩ−型タンパ ク質の１回投薬（食物１ｍｌ当たりＣｒｙＩＩＩ−型タンパク質１ｍｇ）におけ るスクリーニング分析である。希釈剤（０，００５％のＴｒ　ｉ　ｔｏｎ’Ｘ− １００の水溶液）中に懸濁した調べるべきＢ。

ｔ、粉末を１００ｍ１の熱い（５０”−６０°）液体人工食物（Ｊ、　Ｅｃｏｎ 、　Ｅｎｔｏｍｏｌ、　、　７９．　［）、　６６８−６７１　（１９８６）に おいてＬａｄｄ、Ｊｒ　により記載の昆虫食物に基づく）中に挿入した。

混合物をペトリ皿中で固化させ、その後この材料の直径が１９ｍｍの片をプラス チックの製氷皿の各ウェル中に置いた。皿のウェル当たり１匹の虫を導入し、ア ルミニウム箔を重ねた湿った発芽紙（ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｐａｐｅｒ）で ウェルを覆い、皿を２５℃に７日間保ってから死亡率を記録した。調べた昆虫は 第３令の日本ピートル虫である。この研究ではそれぞれ１６匹の昆虫を用いて２ 回の重複で行った。

このスクリーニング生物学的定量研究の結果を下表６に示し、殺虫ンＺ性を昆虫 の死亡率のパーセンテージとして報告し、死亡率は標準死亡（；関して修正し、 標準は食物片に希釈剤のみを挿入した場合である。結；はＣｒｙｌＩＩ−型タン パク質の１種類の投薬比で得た：食物１　ｍ　ｌ　”たり１ｍｇのＣｒｙｌＩＩ −型タンパク質、各Ｂ、ｔ、粉末中に存在ｊるＣｒｙｌｌｌ−型タンパク質のパ ーセントも表６に示す。

日本ピートル虫に対するＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４の殺虫性能は、そのＣｒｙ　Ｉ 　Ｉ　ＩＣ（ｂ）毒素タンパク質（配列ＩＤ　ＮＯ：２）と共に明らかにＢ、ｔ 、株ＥＧ４９６１及びそのＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ（ａ）タンノ＜り質より優れてい る。

Ｂ、ｔ、株ＥＧ２１５８及びＢ、ｔ、株ＥＧ２８３８と比較して、Ｂｔ０株ＥＧ ５１４４は日本ピートル虫に対する優れた殺虫性能を示した１その特性がＢ、ｔ 、株ＥＧ５１４４と類似しているＢ、ｔ、株ＥＧ５１４５は、日本ピートル虫に 対してＢ、ｔ、株ＥＧ５１４４と同等の殺虫活性を示すことが見いだされたが、 先物学的定量データはこの実施例１１に示していない。

微生物の寄託 本出願に対する特許が発行された場合に、興味を持った一般の人の材料の利用を 保証するために、本出願を出願する前に以下の微生物を、下表７に示す通り八Ｒ ５Ｐａｔｅｎｔ　Ｃｏ］］ｅｃｔｉｏｎ、Ａｇｒ６１６０４に寄託する ゝ　表７ Ｂ、ｔ、ＥＧ２１５８　、Ｂ−１８２１３１９８７年４月２９日Ｂ、ｔ、ＨＤ７ ３−２６　Ｂ−１８５０８１９８９年６月１２日’　Ｂ、ｔ、ＥＧ２８３８　Ｂ −１８６０３１９９０年２月８日’６　Ｂ、ｔ、ＥＧ５１４４　Ｂ−１８６５５ １９９０年５月２２日Ｂ、ｔ、ＥＧ７２３７　Ｂ−ｉ８７３６　１９９０年１０ 月１７日Ｅ、ｃｏｌｉＥＧ７２３６　Ｂ−１８６２２１９９０年６月６日ｉ　Ｅ 、ｔ、ＥＧ５１４５　Ｂ−１８９２０１９９１年１１月２１日これらの微生物寄 託は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約」の条 項に従フて行った。これらの寄託微生物の一般の人の利用性に対するすべての制 限は、本出願に基づ（特許の発行時に最終的に除去されるであろう。

本発明は、本発明の精神又はその必須の属性から逸脱することなく他の特別な形 態で具体化することができ、従って本発明の範囲を示す場合、前記の明細書より 添付する請求の範囲を参照するべきである。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：Ｄｏｎｏｖａｎ、Ｗｉ　］　］　ｉａｍ　Ｐ。

Ｒｕｐａｒ、Ｍａｒｋ　Ｊ。

５ｌａｎｅｙ、Ａｎｎｅｔｔ　Ｃ。

（ｉ　ｉ）発明の名称：バンルス　チュリンギエンシス　ｃｒｙｌｌｌＣ（ｂ） ！！素遺伝子及び甲虫類昆虫に毒性のタンパク質（ｊｊｊ）配列の数；２ （１ｖ）通信住所： （Ａ）宛名：Ｐａｎｊｔｃｈ　Ｓｃｈｗａｒｚｅ　Ｊａｃｏｂｓ＆　Ｎａｄｅｌ 　ｃｌｏ　、Ａ、Ｓ、Ｎａｄｅｌ（Ｂ）ストリート：１６０１　Ｍａｒｋｅｔ　 ５ｔｒｅｅｔ、３６ｔｂ　Ｆｌｏｏｒ （Ｃ）市：ＰｈｊＩａｄｅｌｐｂｉａ （Ｄ）州Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ （Ｅ）国・Ｕ、Ｓ、Ａ。

（Ｆ）郵便番号　１９１０３ （Ｖ）　コンピューター読み取り可能フオーム：（、へ）媒体の種類　フロンビ ーディスク（Ｂ）　コ＞ピュ　９　：　ＩＢＭ　ＰＣ互換性（Ｃ）オペレーティ ングンステム　ＰＣ−ＤＯ５／ＭＳ−ＤＯ９（Ｄ）ソフトウェア　Ｐａｔｅｎｔ ｌ＊　Ｒｅ１ｅａｓｅ　：ＩＱ、Ｖｅｒｓｉｏｎ　＝１，２５ （ｖｉ）本出願データ： （Ａ）出願番号・ （Ｂ）出願口・ ＜Ｃ＞分類： （ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号・ＵＳ　０７／６４９，５６２（Ｂ）出願臼：１９９１年１月３ １日 （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）名前：Ｅｇｏｌｆ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ（Ｂ）登６番号：　２７６３ ３ （Ｃ）参照／事件整理番号ニア２０５−２９　ＰＬ（］Ｘ）電気通信情報： （Ａ）ｉｉ話：２１５−７５７−１５９０（２）配列）Ｄ　Ｎｏ、１の情報・ （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ　２４３０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎮、二重 （Ｄ）形態学、環状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　ＣＤ５ （Ｂ）位Ｒ：　１４４．、．２０９９ ｘｉ）配列の記載、配列ＩＤ　ＮＯ：１ＣＣλＴＡＴ入Ｃ入入　ｃ’ｒｒλＴＣ ＡＧＧ入　λｃｃｃｃｃｃｃ入Ｔ　（：ＣＡＣ入入入Ｇλ入　Ｇ大入λＪＧ入入 τ入　λＧｊＱＧＴb；ＡｊｈＴ　６０ ＡＧＴＡＴＡＣＡＧＴ　ＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡ　ＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴ　：ＴＡ ＴＴＡＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＡＧＡＴ　ＧＧＴＡＡＡＣＣλ■@２２５９ λ入ＣＣＧτ入ＴＧＣ；　Ｔｒ入τ入τＴＧＡＣＴｒＴｒ入Ｔｒ入ＴＣ）ＪｒＣ ＣＴＧＣｒＣＣＴＡ入ｃＣＴｃλＧ入　ＧＡＡＧλλλ入Ａf　２コ１９ （２）配列ＩＤ　ＮＯ：２のｔｌ［： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ　６５２アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）形態学二線状 （１１）分子の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の記載：配列ＩＤ　ＮＯ：２：入ｓｎ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　 Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ｋｓｎ　Ｈｉｓ　入Ｓｎ　Ｇｌｌ’ｌ　Ｔｙｒ　ｐｒｏ　Ｌａ ｕ　入１ａ　入ｓｐ　八Tｎ ２０　２５　コ０ Ｐｒｏ　入ｉｎ　５ａｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　入ｓｎ　 Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　ｕｕ　入ｒｑ　Ｍａｔコ５　４０　４５ Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　入１ａ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　 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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、　ＡＵ、　 ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＲ，Ｎｏ、ＰＬ、ＲＵ （７２）発明者　スラニー、アネット・シーアメリカ合衆国ニュージャーシイ用 ０８６９０ハミルトンスクエア・ダンムーアコートサウス４

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．そのヌクレオチド塩基配列が図１に示すアミノ酸配列（配列１ＤＮＯ：２） をコードすることを特徴とする精製及び単離ｃｒｙＩＩＩＣ（ｂ）遺伝子。
2. ２．遺伝子が図１に示すヌクレオチド塩基配列（配列ＩＤＮＯ：１）中のヌクレ オチド塩基１４４−２０９９に延びるコード領域を有することをさらに特徴とす る、請求の範囲１に記載の精製及び単離ｃｒｙＩＩＩＣ（ｂ）遺伝子。
3. ３．請求の範囲１又は２に記載の遺伝子を含に組み替えプラスミド。
4. ４．請求の範囲１又は２に記載の遺伝子により製造される申虫類−毒性タンパク 質。
5. ５．請求の範囲３に記載の組み替えプラスミドを用いて形質転換されたバクテリ アの生物学的に純粋な培養物。
6. ６．さらにバクテリアがバシルスチュリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕ ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）であることを特徴とする、請求の範囲５に記載のバクテ リア。
7. ７．ＮＲＲＬに受託番号ＮＲＲＬＢ−１８７３６として寄託された、請求の範囲 ６に記載のバシルスチュリンギエンシスバクテリア。
8. ８．組成物が請求の範囲４に記載のタンパク質及び農業的に許容し得る担体を含 にことを特徴とする、殺虫剤組成物。
9. ９．組成物が請求の範囲５に記載のバクテリア、そのようなバクテリアにより製 造される甲虫類−毒性タンパク質及び農業的に許容し得る担体を含にことを特徴 とする殺虫剤組成物。
10. １０．植物が請求の範囲１又は２に記載の遺伝子を用いて形質転換されているこ とを特徴とする植物。
11. １１．遺伝子又はその一部がハイブリッド形成プローブとして用いるために標識 されていることをさらに特徴とする、請求の範囲２に記載のｃｒｙＩＩＩＣ（ｂ ）遺伝子。
12. １２．ＮＲＲＬに受託番号ＮＲＲＬＢ−１８６５５として寄託された、バシルス チュリンギエンシスバクテリアの生物学的に純粋な培養物。
13. １３．請求の範囲１２に記載のバシルスチュリンギエンシスバクテリアにより製 造され、図１に示すアミノ酸配列（配列ＩＤＮＯ：２）を有することを特徴とす る甲虫類−毒性タンパク質。
14. １４．組成物が請求の範囲１３に記載の甲虫類−毒性タンパク質を農業的に許容 し得る担体と組み合わせて含にことを特徴とする殺虫剤組成物。
15. １５．甲虫類−毒性タンパク貧がそのようなタンパク賃を製造したバシルスチュ リンギエンシスバクテリアを伴うことをさらに特徴とする、請求の範囲１４に記 載の殺虫剤組成物。
16. １６．殺虫的に有効量の請求の範囲４に記載の甲虫類−毒性タンパク質を昆虫の ための宿主植物に適用することを特徴とする、甲虫類昆虫の抑制法。
17. １７．甲虫類−毒性タンパク賞がそのようなタンパク質を製造したバシルスチュ リンギエンシスバクテリアを伴うことをさらに特徴とする、請求の範囲１６に記 載の方法。
18. １８．昆虫がコーンルートワーム、メキシコビーンビートル及び日本ビートル幼 虫からなる群より選ばれることをさらに特徴とする、請求の範囲１６に記載の方 法。
19. １９．殺虫的に有効量の請求の範囲１３に記載の甲虫類−毒性タンパク質を昆虫 のための宿主植物に適用することを特徴とする、甲虫類昆虫の抑制法。
20. ２０．甲虫類−毒性タンパク質がそのようなタンパク質を製造したバシルスチュ リンギエンシスバクテリアを伴うことをさらに特徴とする、請求の範囲１９に記 載の方法。
21. ２１．昆虫がコーンルートワーム、メキシコビーンビートル及び日本ピートル幼 虫からなる群より選ばれることをさらに特徴とする、請求の範囲１９に記載の方 法。
22. ２２．ＮＲＲＬに受け入れ番号ＮＲＲＬＢ−１８９２０として供託されたバシル スチュリンギエンシスバクテリアの生物学的に純粋な培養物。
23. ２３．組成物が請求の範囲１２又は２２に記載のバシルスチュリンギニンシスバ クテリアから得ることができる甲虫類−毒性タンパク質を農業的に許容し得る担 体と組み合わせて含にことを特徴とする、殺虫剤組成物。