BRPI9912910B1 - método para controle de uma praga lagarta da raiz de milho - Google Patents

Abstract

patente de invenção: <b>"toxinas e genes pesticidas de cepas de bacillus laterosporus"<d>. são apresentadas e reivindicadas novas toxinas e genes obteníveis de isolados de bacillus laterosporus. em modalidades preferidas, os genes e toxinas de interesse são usados para controlar lagarta da raiz de milho do oeste.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA CONTROLE DE UMA PRAGA LAGARTA DA RAIZ DE MILHO".

Fundamentos da Invenção Insetos e outras pragas custam aos agricultores bilhões de dólares por ano em perdas na colheita e nos gastos para manter essas pragas sob controle. As perdas causadas por insetos nocivos nos meios de produção agrícola incluem a redução no rendimento da cultura, qualidade reduzida da cultura, e custos aumentados de colheita. A lagarta da raiz de milho (um inseto coleóptero nocivo) é uma praga de plantas séria. Prejuízos enormes ocorrem na cultura de milho nos Estados Unidos anualmente devido ao fato de as larvas da lagarta da raiz de milho (Diabrotica spp.) se alimentarem de raiz. Estimou-se que aproximadamente 9,3 milhões de acres de milho americano são infestados com um complexo de espécies da lagarta da raiz de milho anualmente. O complexo de espécies da lagarta da raiz de milho inclui a lagarta da raiz de milho do oeste (Diabrotica virgifera virgifera), a lagarta da raiz de milho do norte (Diabrotica barberi) e a lagarta da raiz de milho do sul (Diabrotica undecimpunc-tata howardi). O ciclo de vida de cada espécie Diabrotica é similar. Os ovos da lagarta da raiz de milho são depositados no solo. Larvas recém chocadas (primeiro instar) ficam na terra e se alimentam dos ramos mais curtos das raízes de milho. Fases posteriores das lagartas da raiz de milho do oeste e do norte invadem os tecidos mais internos da raiz que transportam água e elementos minerais para as plantas. Na maioria dos casos, as larvas migram para se alimentar da raiz mais recente. A abertura de túneis nas raízes pelas larvas resulta em danos que podem ser observados como manchas alongadas castanhas na superfície da raiz, partes ocas nas raízes ou vários graus de poda. As plantas com raízes podadas normalmente se deslocam depois de tempestades que são acompanhadas de chuvas pesadas e ventos fortes. As larvas da lagarta da raiz de milho do sul se alimentam das raízes de maneira semelhante à das larvas da lagarta da raiz de milho do norte. As larvas da lagarta da raiz de milho do sul também podem se alimentar do ponto de crescimento do talo apesar de ele ainda estar perto da linha do solo, o que pode fazer com que a planta murche e morra.

Depois de se alimentarem por cerca de 3 semanas, as larvas de lagarta da raiz de milho deixam as raízes e metamorfoseam-se em crisálidas no solo. Os besouros adultos emergem do solo e podem se alimentar do pólen de milho e muitos outros tipos de pólen, assim como da seda de milho. Alimentação de seda verde pode reduzir o nível de polinização, resultando em um grão pobre e baixo rendimento. O adulto da lagarta da raiz de milho do oeste se alimenta de folhas de milho, o que retarda o crescimento da planta e, em raras ocasiões, mata as plantas de algumas variedades de milho.

As larvas dessas espécies de Diabrotica que se alojam no solo se alimentam da raiz da planta de milho, formando ninhos. A formação de ninhos eventualmente reduz a produção de milho e sempre resulta na morte da planta. Alimentando-se da seda do milho, os besouros adultos reduzem a polinização e, portanto, prejudicam o rendimento de milho por planta. Além disso, adultos e larvas do gênero Diabrotica atacam culturas cucurbitáceas (pepino, melão, abóbora etc.) e muitas culturas vegetais e agrícolas em produção comercial assim como as que são cultivadas em jardins domésticos.

Estima-se que o custo anual com inseticidas para controlar a lagarta da raiz de milho e as perdas anuais de colheita causadas pelos danos da lagarta da raiz de milho ultrapassa um total de $1 bilhão nos Estados Unidos anualmente (Meycalf, R. L. [1986] in Methods forthe Study of Pest Diabrotica, Drysan, J, L. & T. A. Miller [Eds.], Springer-Verlag, New York, NY, pp. vii-xv). Aproximadamente $250 milhões em inseticidas são anualmente aplicados para controlar lagartas da raiz de milho nos Estados Unidos. No centro-oeste, foram aplicados $60 milhões e $40 milhões de inseticida em lowa e Nebraska, respectivamente, em 1990. Mesmo com o uso de inseticida, as lagartas causam cerca de $750 milhões de prejuízos anuais na colheita, o que faz delas a praga de inseto mais séria no centro-oeste. O controle da lagarta da raiz de milho foi parcialmente resolvido por métodos de cultivo, tais como rotação de cultura e aplicação de altos níveis de nitrogênio para estimular o crescimento de um sistema radicular casual. No entanto, conta-se mais pesadamente com inseticidas químicos para garantir o nível de controle desejado. Os inseticidas são associados ao solo ou incorporados no mesmo. As demandas econômicas da utilização de terras de plantio restringem o uso da rotação de culturas. Além disso, uma característica emergente de diapausa (ou invernada) de dois anos das lagartas da raiz de milho do norte está quebrando a rotação de culturas em algumas áreas. O uso de inseticidas para controlar a lagarta da raiz de milho também apresenta várias desvantagens. O uso contínuo de inseticidas possibilita o desenvolvimento de insetos resistentes. Situações tais como populações extremamente grandes de larvas, chuvas pesadas e aferição inadequada do equipamento de aplicação de inseticida podem resultar em controle pobre. O uso de inseticida sempre dá origem a preocupações com o meio ambiente tais como contaminação do solo e do abastecimento de águas da superfície e do subsolo. A população também se preocupado com a quantidade de químicos residuais que podem ser encontrados nos alimentos. Trabalhar com inseticidas também pode trazer riscos para aqueles que os aplicam. Portanto, pesticidas químicos sintéticos vêm sendo examinados cada vez mais, e de fato, por suas potenciais consequências ambientais tóxicas. Exemplos de pesticidas químicos sintéticos amplamente usados incluem os organocloros, por exemplo, DDT, mirex, kepone, lindane, aldrin, chlordane, aldicarb e dieldrin; os organofosfatos, por exemplo chlor-pyrifos, parathion, malathion e diazinon; e carbamatos. Restrições rigorosas novas sobre o uso de pesticidas e a eliminação de alguns pesticidas do mercado poderíam limitar opções econômicas e eficazes para o dispendioso controle de pragas.

Devido aos problemas associados com o uso de pesticidas químicos sintéticos orgânicos, há uma nítida necessidade de limitar o uso desses agentes e a necessidade de identificar agentes de controle alternativos. A substituição de pesticidas químicos sintéticos, ou a combinação desses agentes com pesticidas biológicos, podería reduzir os níveis de químicos tóxicos na atmosfera.

Um agente pesticida biológico que desfruta de crescente popularidade é o micróbio de terra Bacillus thuringiensis (B.t.). O micróbio de terra Bacillus thuringiensis {B.t.) é uma bactéria formadora de esporos, gram-positiva. A maioria das cepas de B.T. não exibem atividade pesticida. Algumas cepas de B.t. produzem, e podem ser caracterizadas por, inclusões de proteínas cristalinas paraesporais. Estas "δ-endotoxinas", que tipicamente têm atividade pesticida específica, são diferentes das exotoxinas, que têm uma faixa inespecífica de hospedeiros. Estas inclusões sempre aparecem microscopicamente como cristais de formatos distintos. As proteínas podem ser altamente tóxicas para pragas e específicas em sua atividade tóxica. Alguns genes de toxinas de B.t. foram isolados e seqüenciados. A clonagem e expressão do gene de uma proteína cristalina de B.t. em Esche-richia coli foram descritas na literatura publicada há mais de 15 anos (Schnepf, Η. E., H. R. Whiteley [1981] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2893-2897). Além disso, com o uso de técnicas de engenharia genética, estão sendo desenvolvidos novos métodos para a distribuição de toxinas de B.t. para ambientes agrícolas, incluindo o uso de plantas geneticamente construídas com genes de toxinas de B.t. para resistência a insetos e o uso de células microbianas intatas estabilizadas como veículos de distribuição de toxinas de B.t. (Gaertner, F. H., L. Kim [1988] TIBTECH 6:S4-S7). Assim, genes isolados de endotoxinas de B.t. estão se tornando comercialmente valiosos.

Até quinze anos atrás, o uso comercial de pesticidas à base de B.t. era largamente limitado a uma pequena faixa de pragas lepidópteras (lagartas). Preparações de esporos e cristais de B. thuringiensis subsp. kurstaki vêm sendo usadas há anos como inseticidas comerciais para pragas lepidópteras. Por exemplo, B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 produz uma δ-endotoxina cristalina que é tóxica para as larvas de inúmeros insetos lepidópteros.

Nos últimos anos, no entanto, pesquisadores descobriram pesticidas à base de B.t. com especificidades para uma faixa muito mais ampla de pragas. Por exemplo, outras espécies de B.t., a saber, israelensis e mor-risoni (a.k.a. tenebrionis, a.k.a. B.t. M-7) são usadas comercialmente para controlar insetos da ordem dos Dípteros e Coleópteros, respectivamente (Gaertner, F. H. [1989] "Cellular Delivery Systems for Inseticidal Proteins; Living and Non-Living Microorganisms", in Controlled Delivery of Crop Pro-tection Agents, R. M. Wilkins, ed., Taylor & Francis, New York e Londres, 1990, pp. 245-255). Veja também Couch, T. L. (1980) "Mosquito Pathogeni-city of Bacillus thuringiensis var. israelensis", Developments in Industrial Mi-crobiology 22:61-76; e Beegle, C. C. (1978) "Use of Entomogenous Bactéria in Agroecosystems", Developments in industrial Microbiology 20:97-104. Kri-eg, A., A. M. Huger, G. A. Langenbruch, W. Schnetter (1983) Z. ang. Ent. 96:500-508 descrevem Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, que é sabidamente ativo contra dois besouros da ordem os Coleópteros. Estes são o besouro da batata do Colorado, Liptinotarsa decemlineata, e Agelastica alni.

Recentemente, novas subespécies de B.t. foram identificadas, e genes responsáveis por proteínas ativas do tipo δ-endotoxina foram isoladas (Hòfte, H„ H. R. Whiteley [1989] Micobriological Reviews 52(2):242-255). Hófte e Whiteley classificaram os genes das proteínas cristalinas de B.t. em quatro classes principais. As classes são Cryl (específicos para Lepidópte-ros), Cryll (específicos para Lepidópteros e Dípteros), Crylll (específicos para Coleópteros) e CrylV (específicos para Dípteros). Foi relatada a descoberta de cepas especificamente tóxicas para outras pragas (Feitelson, J. S., J. Payne, L. Kim [1992] Bio/Technology 10:271-275). CryV foi proposta para designar uma classe de genes de toxina que são específicos para ne-matódeos. Lambert et al. (Lambert, B., L. Buysse, C. Decock, S. Jansens, C. Piens, B. Saey, J. Seurinck, K. van Audenhove, J. van Rie, A. van Vliet, M. Peferoen [1996] Appl. Environ. Microbiol. 62(1):80-86) e Shevelev et al. ([1993] FEBS Lett. 336:79-82) descrevem a caracterização de toxinas Cry9 ativas contra lepidópteros. Os Pedidos PCT publicados WO 94/05771 e WO 94/24264 também descrevem isolados de B.t. ativos contra pragas lepidóp-teras. Gleave et al. ([1991] JGM 138:55-62) e Smulevitch et al. ([1991] FEBS Lett. 293:25-26) também descrevem toxinas de B.t. Inúmeras outras classes de genes de B.t. foram agora identificadas. O esquema de nomenclatura e classificação de 1989 de Hófte & Whiteley para proteínas cristalinas teve por base a seqüência de aminoáci-dos deduzida e a faixa de hospedeiros da toxina. Esse sistema foi criado para cobrir 14 tipos diferentes de genes de toxinas que foram divididos em cinco classes principais. O número de genes de proteínas cristalinas se-qüenciadas de Bacillus thuríngiensis atualmente chega a mais de 50. Foi proposto um esquema de nomenclatura revisado que se baseia unicamente na identidade do aminoácido (Crickmore et al. [1996] Society for Inverte-brate Pathology, 29th Annual Meeting, lllrd International Colloquium on Bacillus thuríngiensis, University of Cordoba, Cordoba, Espanha, 1-6 de setembro de 1996, abstract). O "cry" mnemônico foi mantido para todos os genes de toxina exceto cytA e cytB, que continuam uma classe separada. Algarismos romanos foram trocados por algarismos arábicos na classe principal, e os parênteses na terceira classe foram removidos. Muitos dos nomes originais foram mantidos, com as exceções mencionadas, embora vários deles tenham sido reclassificados. Veja também "Revisions of the Nomenclature forthe Bacillus thuríngiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D. R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. van Rie, D. Lereclus, J. Baum e D. H. Dean, Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) vol. 62:807-813; e Crickmore, Zeigler, Feitelson, Schnepf, van Rie, Lereclus, Baum e Dean, "Bacillus thuríngiensis toxin nomenclature" (1999) http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/ Bt/index.html. Esse sistema usa as aplicações de software gratuitas CLUSTAL W e PHYLIP. 0 aplicativo NEIGHBOR no pacote PHYLIP usa um algoritmo de médias aritméticas (UPGMA).

Como resultado de extensa pesquisa e investimento de recursos, outras patentes foram concedidas para novos isolados de B.t. e novos usos dos isolados de B.t. Veja Feitelson et al., supra, para recapitulação. No entanto, a descoberta de novos isolados de B.t. e novos usos dos isolados de B.t. conhecidos continua uma técnica empírica e imprevisível.

Favret e Yousten ([1985] J. Invert. Path. 45:195-203) testaram a atividade inseticida de cepas de Bacillus laterosporus, mas concluíram que os baixos níveis de toxidez demonstrados por essas cepas indicam que essas cepas não são candidatos em potencial para agentes de biocontrole. Montaldi & Roth (172 J. Bac. 4; abril 1990; pp. 2168-2171) examinaram por microscopia eletrônica corpos paraesporais de esporângios de Bacillus laterosporus. Bone et al. (Patente US N° 5.045.314) relatam que os esporos de cepas selecionadas de B. laterosporus inibem a chocagem de ovos e/ou o desenvolvimento larval de um nematódeo parasita de animal. Aronson et al. (Patente US N° 5.055.293) descrevem um Bacillus laterosporus formador de esporos designado P5 (ATCC 53694). Bacillus laterosporus NRS-590 é aqui usado como controle negativo. Aronson et al. postulam que o B.l. P5 pode invadir larvas muito jovens de lagarta da raiz de milho causando dano imediato ou posterior ou que ele bloqueia a recepção ou resposta da lagarta da raiz de milho ao sinal da raiz de milho que a direciona para as raízes. Os documentos WO 94/21795 e WO 96/10083 descrevem toxinas que são significativamente ativas contra determinadas pragas. O documento WO 98/18932 descreve muitas classes novas de toxinas microbianas que são ativas contra vários tipos de insetos. Várias sondas e primers também estão apresentados naquele documento. Orlova et al. (64 Appl. Env. Micro., 7 de julho de 1998, pp. 2723-2725) relatam que as inclusões cristalinas de certas cepas de Bacillus laterosporus podem ser potencialmente usadas como candidatas ao controle de mosquitos.

Obstáculos ao sucesso do uso agrícola de toxinas de B.t. incluem o desenvolvimento de resistência a toxinas de B.t. pelos insetos. Além disso, certos insetos podem ser refratários aos efeitos de B.t. Estes últimos incluem insetos tais como gorgulho do algodão e agrótis negras ("black cu-tworm") bem como insetos adultos da maioria das espécies que até o presente não demonstraram sensibilidade aparente significativa a δ-endotoxinas de B.t. Embora estratégias de gerenciamento de resistência na tecnologia de plantas com transgenes de B.t. tenham se tornado de grande interesse, ainda existe uma grande necessidade de desenvolver genes que possam ser expressos de forma bem-sucedida a níveis adequados em plantas de maneira a resultar no controle eficaz de vários insetos.

Breve Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a materiais e métodos úteis no controle de pragas não-mamíferas e, particularmente, pragas de plantas. Em uma modalidade, a presente invenção fornece novas toxinas pesticidas e genes codificadores de toxina que são obteníveis de isolados de Bacillus laterosporus (BI). Em uma modalidade preferida, as pragas alvo são as lagartas da raiz de milho. As toxinas da presente invenção incluem toxinas solúveis lábeis sob calor que podem ser obtidas do sobrenadante de culturas das cepas de Bacillus laterosporus de interesse. As toxinas da presente invenção também incluem toxinas menores lábeis sob calor obteníveis dessas cepas. A presente invenção também fornece seqüências de nucleotídeo que codificam as toxinas da presente invenção. As seqüências de nucleotídeo da presente invenção codificam toxinas que são distintas de toxinas previamente descritas. As seqüências de nucleotídeo da presente invenção também podem ser usadas na identificação e caracterização de genes que codificam toxinas pesticidas.

Em uma modalidade da presente invenção, os isolados de Bacillus de interesse podem ser cultivados em condições que resultem em grande multiplicação do micróbio. Depois de tratamento dos micróbios para proporcionar ácido nucléico genômico de filamento simples, o DNA é caracterizado usando-se seqüências de nucleotídeo de acordo com a presente invenção. Fragmentos característicos de genes codificadores de toxina vão ser ampliados pelo procedimento, identificando assim a presença do(s) ge-ne(s) codificador(es) de toxina.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a plantas e células vegetais transformadas para produzir pelo menos uma das toxinas pesticidas da presente invenção para que as células vegetais transformadas expressem toxinas pesticidas em tecidos consumidos por pragas alvo. Além disso, misturas e/ou combinações de toxinas podem ser usadas de acordo com a presente invenção. A transformação de plantas com as construções genéticas aqui descritas pode ser realizada usando-se técnicas bastante conhecidas dos versados na técnica e tipicamente envolveríam a modificação do gene para otimizar a expressão da toxina nas plantas.

Breve Descrição das Seqüências SEQ ID N° 1 é uma sonda de MIS. SEQ ID N° 2 é uma sonda de WAR. SEQ ID N° 3 é um primer dianteiro de MIS. SEQ ID N° 4 é um primeiro reverso de MIS. SEQ ID N° 5 é uma seqüência de nucleotídeo proveniente do gene da toxina do tipo MIS da cepa MB438 de B.l. SEQ ID N° 6 é a seqüência de nucleotídeo do gene da toxina do tipo MIS da cepa MB438 de B.l. SEQ ID N° 7 é a seqüência de polipeptídio da toxina do tipo MIS da cepa MB438 de B.l. SEQ ID N° 8 é a seqüência de nucleotídeo do gene da toxina do tipo WAR da cepa MB438 de B.l. SEQ ID N° 9 é a seqüência de polipeptídio da toxina do tipo WAR da cepa MB438 de B.l. SEQ ID N° 10 é uma seqüência de nucleotídeo proveniente do gene da toxina do tipo MIS da cepa MB439 de B.l.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se a materiais e métodos úteis no controle de pragas não-mamíferas, e, particularmente, pragas de plantas. Em uma modalidade, a presente invenção fornece novas toxinas pesticidas e genes codificadores de toxina que são obteníveis de isolados de Bacillus laterosporus (B.I.). Em uma modalidade preferida, as pragas alvo são as lagartas da raiz de milho. As toxinas da presente invenção incluem toxinas solúveis lábeis sob calor que podem ser obtidas do sobrenadante de culturas das cepas de Bacillus laterosporus de interesse. Toxinas do tipo MIS e WAR obteníveis dessas cepas estão descritas mais detalhadamente abaixo. As toxinas da presente invenção também incluem toxinas menores lábeis sob calor obteníveis dessas cepas. A presente invenção também fornece seqüências de nucleotídeo que codificam as toxinas da presente invenção. As seqüências de nucleotídeo da presente invenção codificam toxinas que são distintas de toxinas previamente descritas. Outras seqüências de nucleotídeo da presente invenção também podem ser usadas em procedimentos de diagnóstico e análise que são bastante conhecidos na técnica. Por exemplo, as sondas, pri-mers e seqüências parciais podem ser usadas para identificação e caracterização de genes que codificam toxinas pesticidas.

Em uma modalidade da presente invenção, os isolados de Baci-llus de interesse podem ser cultivados em condições que resultem em grande multiplicação do micróbio. Depois de tratamento dos micróbios para proporcionar ácido nucléico genômico de filamento simples, o DNA é caracterizado usando-se seqüências de nucleotídeo de acordo com a presente invenção. Fragmentos característicos de genes codificadores de toxina vão ser ampliados pelo procedimento, identificando assim a presença do(s) ge-ne(s) codificador(es) de toxina.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a células vegetais transformadas para produzir pelo menos uma das toxinas pesticidas da presente invenção para que as células vegetais transformadas expressem toxinas pesticidas em tecidos consumidos por pragas alvo. Além disso, misturas e/ou combinações de toxinas podem ser usadas de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades preferidas, uma toxina do tipo MIS e uma toxina do tipo WAR são usadas em conjunto. A transformação de plantas com as construções genéticas aqui descritas pode ser realizada usando-se técnicas bastante conhecidas dos versados na técnica e tipicamente envolveríam a modificação do gene para otimizar a expressão da toxina nas plantas.

Isolados úteis de acordo com a presente invenção serão depositados na coleção permanente da Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, EUÂ. Os números de repositório das culturas são os seguintes: Cultura N° de repositório Data de depósito B.l. MB438 NRRL B-30085 21 de dezembro de 1998 BI MB439 NRRL B-30086 21 de dezembro de 1998 £ coii MR957 NRRL B-30048 14 de agosto de 1998 (clone de MB438) BI PS177C8 NRRL B-21867 24 de outubro de 1997 As culturas que foram depositadas segundo este pedido de patente foram depositadas em condições que garantem que o acesso às culturas esteja disponível durante a pendência deste pedido de patente a pessoas determinadas pelo Comissário de Marcas e Patentes segundo 37 CFR 1.14 e 35 U.S.C. 122. Os depósitos estarão disponíveis conforme exigido pela legislação de patentes estrangeiras em países onde forem depositadas cópias do presente pedido ou sua progênie. No entanto, deve ficar entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui licença para praticar a presente invenção em detrimento dos direitos de patente concedidos por ato governamental.

Além disso, os presentes depósitos de cultura ficarão armazenados e disponíveis para o público de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste para Depósito de Microorganismos, isto é, eles ficarão armazenados e todo o cuidado necessário para mantê-los viáveis e sem contaminação por um período de pelo menos cinco anos depois do pedido mais recente para o fornecimento de uma amostra do depósito e, em qualquer caso, por um período de pelo menos 30 (trinta) anos depois da data de depósito ou durante a vigência de qualquer patente que for concedida apresentando a(s) cultura(s). O depositante reconhece a obrigação de substituir o(s) depósito(s) caso o depositário não possa fornecer uma amostra quando solicitado, devido à condição de depósito. Todas as restrições sobre a disponibilidade para o público dos presentes depósitos de cultura serão irrevo-gavelmente anuladas quando da concessão de uma patente que as descreva.

Mutantes dos isolados aqui mencionados podem ser feitos por procedimentos bastante conhecidos na técnica. Por exemplo, um mutante asporogenoso pode ser obtido por mutagênese de um isolado em etilmetano sulfonato (EMS). Os mutantes podem ser feitos usando-se luz ultravioleta e nitrosoguanidina por procedimentos conhecidos na técnica.

Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a materiais e métodos que incluem primers e sondas de nucleotídeo para isolar, caracterizar e identificar genes de Bacillus codificando toxinas de proteínas que são ativas contra pragas não-mamíferas. As seqüências de nucleotídeo aqui descritas também podem ser usadas para identificar novos isolados pesticidas de Bacillus. A invenção refere-se ainda aos genes, isolados e toxinas identificados usando-se os métodos e materiais aqui descritos.

As novas toxinas e seqüências de polinucleotídeo fornecidas neste relatório são definidas de acordo com vários parâmetros. Uma característica das toxinas aqui descritas é a atividade pesticida. Em uma modalidade específica, estas toxinas possuem atividade contra lagarta da raiz de milho do oeste. As toxinas e genes da presente invenção podem ser ainda definidos por suas seqüências de aminoácidos e nucleotídeos. As seqüências das moléculas podem ser definidas em termos de homologia com certas seqüências exemplificadas bem como em termos da capacidade de hi-bridizar com algumas sondas e primers exemplificados ou ser ampliadas pelos mesmos.

Em uma modalidade preferida, o tipo MIS de toxinas da presente invenção tem um peso molecular de cerca de 70 a cerca de 100 kDa e, mais preferivelmente, as toxinas têm um tamanho de cerca de 80 kDa. Tipicamente, essas toxinas são solúveis e podem ser obtidas do sobrena-dante das culturas de Bacillus aqui descritas. Essas toxinas apresentam to-xidez contra pragas não-mamíferas. Em uma modalidade preferida, estas toxinas possuem atividade contra a lagarta da raiz de milho do oeste. As proteínas do tipo MIS também são úteis devido a sua capacidade de formar poros em células. Essas proteínas podem ser usadas com segundas entidades que incluem, por exemplo, outras proteínas. Quando usada com uma segunda entidade, a proteína do tipo MIS vai facilitar a entrada do segundo agente em uma célula-alvo. Em uma modalidade preferida, a proteína MIS interage com receptores de MIS em uma célula-alvo e provoca a formação de poros na célula-alvo. A segunda entidade pode ser uma toxina ou uma outra molécula cuja entrada na célula é desejada. A presente invenção refere-se ainda ao tipo WAR de toxinas tendo um tamanho de cerca de 30 - 50 kDa, e mais tipicamente um tamanho de cerca de 40 kDa. Tipicamente, essas toxinas são solúveis e podem ser obtidas do sobrenadante das culturas de Bacillus aqui descritas.

Os tipos MIS e WAR de toxinas da presente invenção podem ser identificados com os primers aqui descritos.

Um outro tipo singular de toxina foi identificado como sendo produzido pelas cepas de Bacillus da presente invenção. Essas toxinas são muito menores que as toxinas dos tipos MIS e WAR da presente invenção. Essas toxinas, como as toxinas dos tipos MIS e WAR, são lábeis sob calor. No entanto, essas toxinas estão na faixa de tamanho aproximado de cerca de 10 kDa a cerca de 1 kDa. Essas toxinas também são solúveis e podem ser obtidas dos sobrenadantes das culturas de Bacillus aqui descritas.

Com os ensinamentos fornecidos por esta invenção, o versado na técnica poderá facilmente produzir e usar as várias toxinas e seqüências de polinucleotídeo aqui descritas.

Genes e toxinas. Como aqui usado, os termos "toxina do tipo selvagem" e "gene do tipo selvagem" referem-se aos genes e toxinas naturalmente produzidos pelos isolados de interesse (MB438 e MB439). Os genes e toxinas da presente invenção incluem não apenas seqüências do tipo selvagem inteiras mas também fragmentos dessas seqüências, variantes, mutantes e proteínas de fusão que retêm a atividade pesticida característica das toxinas especificamente exemplificadas neste relatório. Por exemplo, a Patente US N° 5.605.793 descreve métodos para gerar diversidade molecular adicional usando reagrupamento de DNA depois de fragmentação aleatória. Além disso, deleções internas podem ser feitas nos genes e toxinas especificamente exemplificados neste relatório, desde que as toxinas modificadas preservem a atividade pesticida. Genes e toxinas quiméricos, produ- zidos por combinação de porções de mais de uma toxina ou gene de Baci-llus, também podem ser utilizados de acordo com os ensinamentos da presente invenção. Como aqui usado, os termos "variantes" ou "variações" de genes referem-se a seqüências de nucleotídeo que codificam as mesmas toxinas ou que codificam toxinas equivalentes tendo atividade pesticida. Como aqui usado, o termo "toxinas equivalentes" refere-se a toxinas tendo a mesma ou essencialmente a mesma atividade biológica que as toxinas exemplificadas contra as pragas-alvo. É evidente para o versado nesta técnica que genes codificando toxinas ativas podem ser identificados e obtidos por vários meios. Os genes específicos aqui exemplificados podem ser obtidos dos isolados depositados no depositário de culturas descrito acima. Esses genes, ou porções ou variantes dos mesmos, também podem ser construídos sinteticamente, por exemplo, pelo uso de um sintetizador de genes. Variações de genes podem ser facilmente construídas usando técnicas tradicionais para fazer mutações pontuais. Também, fragmentos desses genes podem ser feitos usando-se exonucleases ou endonucleases comercialmente disponíveis de acordo com procedimentos tradicionais. Por exemplo, enzimas tal como Bal31 ou muta-gênese direcionada para o sítio podem ser usadas para cortar sistematicamente nucleotídeos das extremidades desses genes. Também, genes que codificam fragmentos ativos podem ser obtidos usando-se uma variedade de enzimas de restrição. Proteases podem ser usadas para obter diretamente fragmentos ativos dessas toxinas.

Toxinas equivalentes e/ou genes codificando essas toxinas equivalentes podem ser derivados de isolados de Bacillus e/ou de bibliotecas de DNA usando os ensinamentos da presente invenção. Existem inúmeros métodos para obtenção das toxinas pesticidas da presente invenção. Por exemplo, anticorpos para as toxinas pesticidas aqui descritas e reivindicadas podem ser usados para identificar e isolar toxinas de uma mistura de proteínas. Especificamente, podem ser criados anticorpos para as porções das toxinas que são mais constantes e mais distintas de outras toxinas de Bacillus. Esses anticorpos podem ser então usados para identificar especifi- camente toxinas equivalentes com a atividade característica por imunopre-cipitação, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) ou análise da mancha do oeste. Anticorpos para as toxinas aqui descritas, ou para toxinas equivalentes, ou fragmentos dessas toxinas, podem ser facilmente prepara-> dos usando-se procedimentos tradicionais nesta técnica. Os genes que codificam essas toxinas podem ser assim obtidos do microorganismo.

Fragmentos e equivalentes que preservam a atividade pesticida das toxinas exemplificadas estão no escopo da presente invenção. Também, por causa da redundância do código genético, várias seqüências de l DNA diferentes podem codificar as seqüências de aminoácidos aqui apresentadas. O versado na técnica sabe como criar essas seqüências de DNA alternativas codificando as mesmas, ou essencialmente as mesmas, toxinas. Essas seqüências de DNA variantes estão no escopo da presente invenção. Como aqui usado, a referência "essencialmente a mesma" seqüência refere-' se a seqüências que têm substituições, deleções, adições ou inserções de aminoácidos que não afetam materialmente a atividade pesticida. Fragmentos preservando a atividade pesticida também estão incluídos nesta definição.

Um outro método para identificar as toxinas e genes da presente invenção é o uso de sondas de oligonucleotídeo. Essas sondas são seqüência de nucleotídeo detectáveis. As sondas oferecem um método rápido para identificar genes codificadores de toxinas da presente invenção. Os segmentos de nucleotídeo que são usados como sondas de acordo com a invenção podem ser sintetizados usando-se um sintetizador de DNA e procedimentos tradicionais.

Determinadas toxinas da presente invenção estão especificamente exemplificadas neste relatório. Como essas toxinas são simplesmente exemplificativas das toxinas da presente invenção, está claro que a presente invenção compreende toxinas variantes e equivalentes (e seqüências de nucleotídeo codificando toxinas equivalentes) com atividade pesticida igual ou semelhante a da toxina exemplificada. Toxinas equivalentes terão homologia de aminoácidos com uma toxina exemplificada. Toxinas equi- valentes terão homologia de aminoácido com uma toxina exemplificada. Esta identidade de aminoácidos será tipicamente maior que 60%, de preferência maior que 75%, mais preferivelmente maior que 80%, ainda mais preferivelmente maior que 90%, e pode ser maior que 95%. Estas identida-5 des são determinadas usando-se técnicas de alinhamento tradicionais, de preferência aquelas usadas por Crickmore et al. discutidas na seção Antecedentes do presente relatório. A homologia de aminoácidos será maior em regiões críticas da toxina que são responsáveis pela atividade biológica ou que estão envolvidas na determinação da configuração tridimensional que é ) essencialmente responsável pela atividade biológica. Neste contexto, certas substituições de aminoácidos são aceitáveis e podem ser esperadas se essas substituições ocorrerem em regiões que não sejam críticas para a atividade ou que sejam substituições de aminoácidos conservativas que não afetem a configuração tridimensional da molécula. Por exemplo, aminoáci-> dos podem ser colocados nas seguintes classes: não-polares, polares não-carregados, básicos e ácidos. Substituições conservativas por meio das quais um aminoácido de uma classe é substituído por um outro aminoácido do mesmo tipo estão no escopo da presente invenção desde que a substituição não altere materialmente a atividade biológica do composto. Listados i abaixo na Tabela encontram-se exemplos de aminoácidos pertencentes a cada uma das classes.

Tabela 1 Classe do aminoácido Exemplos de aminoácidos não-polar Ala, Vai, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp polar não-carregado Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin ácido Asp, Glu básico Lys, Arg, His Em alguns casos, substituições não-conservativas também podem ser feitas. O fator crítico é que essas substituições não devem reduzir de forma significativa a atividade biológica da toxina.

Como aqui usado, as expressões polinucleotídeos "isolados" e/ou toxinas "purificadas" referem-se a essas moléculas quando não asso- ciadas com as outras moléculas com as quais seriam encontradas na natureza. Assim, a expressão "isolado e purificado" significa a intervenção "humana" da forma aqui descrita. Toxinas e genes quiméricos também envolvem a "mão do homem".

Hospedeiros recombinantes. Os genes codificadores de toxinas da presente invenção podem ser introduzidos em uma ampla variedade de hospedeiros microbianos ou vegetais. A expressão do gene de toxina resulta, direta ou indiretamente, na produção e manutenção do pesticida. A transformação de hospedeiros vegetais é preferida. Dessa forma as pragas que se alimentam da planta recombinante que expressa a toxina entrarão em contato com a toxina. Com hospedeiros microbianos adequados, por exemplo Pseudomonas, os micróbios podem ser ampliados até o habitat da praga, onde vão proliferar e ser ingeridos. Com qualquer dos vários métodos, o resultado é o controle da praga. Alternativamente, o micróbio que hospeda o gene de toxina pode ser exterminado e tratado em condições que prolonguem a atividade da toxina e estabilizem a célula. A célula tratada, que preserva a atividade tóxica, pode ser então aplicada ao ambiente da praga-alvo. A toxina de Bacillus também pode ser aplicada introduzindo-se um gene via um vetor adequado em um hospedeiro microbiano e em seguida aplicando-se o hospedeiro ao ambiente no estado vivo.

Uma grande variedade de maneiras encontra-se à disposição para introduzir um gene de Bacillus codificando uma toxina em um hospedeiro em condições que permitem a expressão e manutenção estável do gene. Esses métodos são bastante conhecidos pelos versados na técnica e estão descritos, por exemplo, na Patente US N° 5.135.867, que está aqui incorporada a título de referência.

Genes sintéticos que são funcionalmente equivalentes às toxinas da presente invenção também podem ser usados para transformar hospedeiros. Métodos para a produção de genes sintéticos podem ser encontrados, por exemplo, na Patente US N° 5.380.831. Em modalidades preferidas, os genes da presente invenção são otimizados para expressão em plantas.

Tratamento de células. Como mencionado acima, células de Bacillus ou recombinantes expressando um toxina de Bacillus podem ser tratadas para prolongar a atividade da toxina e estabilizar a célula. A micro-cápsula pesticida que se forma compreende a toxina de Bacillus no interior de uma estrutura celular que fora estabilizada e vai proteger a toxina quando a microcápsula for aplicada ao ambiente da praga alvo. Células hospedeiras adequadas podem incluir procariotas ou eucariotas. Como hospedeiros, de particular interesse são os procariotas e os eucariotas inferiores, tais como fungos. A célula usualmente estará intata e estará substancialmente na forma proliferativa quando tratada, e não na forma de esporo. O tratamento da célula microbiana, por exemplo, um micróbio contendo o gene de toxina de Bacillus, pode ser por meios químicos ou físicos, ou por uma combinação de meios químicos e/ou físicos, contanto que a técnica não afete prejudicialmente as propriedades da toxina, nem diminua a capacidade celular de proteger a toxina. Métodos para tratamento de células microbianas estão descritos nas Patentes US N°s 4.695.455 e 4.695.462, que estão aqui incorporadas a título de referência. Métodos e formulações para controle de pragas O controle de pragas usando as toxinas e genes da presente invenção pode ser feito por vários métodos conhecidos pelos versados na técnica. Esses métodos incluem, por exemplo, a aplicação de isolados de Bacillus às pragas (ou seu habitat), a aplicação de micróbios recombinantes às pragas (ou seu habitat), e a transformação de plantas com genes que codificam as toxinas pesticidas da presente invenção. Transformações podem ser feitas pelos versados na técnica usando técnicas tradicionais. Materiais necessários para essas transformações estão descritos neste relatório ou encontram-se comercialmente disponíveis.

Grânulos de isca formulados contendo um atraente e as toxinas dos isolados de Bacillus, ou micróbios recombinantes compreendendo os genes obteníveis dos isolados de Bacillus aqui descritos, podem ser aplicados ao solo. Produto formulado também pode ser aplicado como revestimento de semente ou tratamento de raiz ou tratamento da planta inteira em estágios avançados do ciclo da cultura. Tratamentos da planta e do solo com células de Bacillus podem ser empregados como pós umectantes, grânulos ou poeiras, por misturação com vários materiais inertes tais como minerais inorgânicos (filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos e outros) ou materiais botânicos (espiga de milho em pó, casca de arroz, casca de noz e outros). As formulações podem incluir adjuvantes de espalhamento e aderência, agentes estabilizantes, outros aditivos pesticidas ou tensoativos. As formulações líquidas podem ser aquosas ou não-aquosas e empregadas como espumas, géis, suspensões, concentrados emulsificáveis ou outros. Os ingredientes podem incluir agentes reológicos, tensoativos, emulsifican-tes, dispersantes ou polímeros.

Como será observado pelo versado na técnica, a concentração pesticida vai variar amplamente dependendo da natureza da formulação particular, particularmente se ela for um concentrado ou se for usada diretamente. O pesticida estará presente em uma quantidade de pelo menos 1% em peso e pode de 100% em peso. As formulações secas terão de cerca de 1 - 95% em peso do pesticida ao passo que as formulações líquidas geralmente terão de cerca de 1 - 60% em peso dos sólidos na fase líquida. As formulações que contêm células geralmente terão de cerca de 102 a cerca de 104 células/mg. Essas formulações serão administradas a cerca de 50 mg (líquidos ou secos) -1 kg ou mais por hectare.

As formulações podem ser aplicadas ao ambiente da praga, por exemplo solo e folhagem, por aspersão, empoeiramento, aspersão ou outros.

Sondas de polinucleotídeo. Bem se sabe o DNA possui uma propriedade fundamental chamada complementaridade de bases. Na natureza, o DNA geralmente existe na forma de pares de filamentos anti-paralelos, as bases em cada filamento se projetam desse filamento em direção ao filamento oposto. A base adenina (A) em um filamento será sempre oposta à base timina (T) no outro filamento, a base guanina (G) será oposta à base citosina (C). As bases são mantidas opostas por sua capacidade de se ligar a hidrogênio desta maneira específica. Embora cada ligação indivi- dual seja relativamente fraca, o efeito de rede de muitas bases adjacentes ligadas a hidrogênio, junto com os efeitos de empilhamento de bases, é uma união estável dos dois filamentos complementares. Essas ligações podem ser rompidas por tratamentos tais como pH elevado ou temperatura elevada, > e essas condições resultam na dissociação, ou "desnaturação", dos dois filamentos. Se em seguida o DNA for colocado em condições que tornem termodinamicamente favoráveis as ligações hidrogênio das bases, os filamentos de DNA vão temperar, ou "hibridizar", e refazer o DNA de filamento duplo original. Se realizada em condições apropriadas, esta hibridização ) pode ser altamente específica. Isto é, somente filamentos com alto grau de complementaridade de bases vão ser capazes de formar estruturas de filamento duplo estáveis. A relação da especificidade de hibridização com as condições reacionais é bastante conhecida. Assim, hibridização pode ser usada para testar se dois pedaços de DNA são complementares em suas > seqüências de bases. É este mecanismo de hibridização que facilita o uso de sondas da presente invenção para detectar e caracterizar facilmente seqüências de DNA de interesse.

As sondas podem ser RNA, DNA ou PNA (ácido nucléico peptí-dico). A sonda normalmente terá pelo menos cerca de 10 bases, mais usu- i almente pelo menos cerca de 17 bases, e pode ter até cerca de 100 bases ou mais. Sondas mais compridas podem ser facilmente utilizadas, e tais sondas podem ter, por exemplo, várias quilobases de comprimento. A se-qüência da sonda é criada para ser pelo menos substancialmente complementar a uma porção de um gene codificando uma toxina de interesse. A sonda não precisa ter complementaridade perfeita com a seqüência na qual hibridiza. As sondas podem ser marcadas utilizando-se técnicas bastante conhecidas pelos versados na técnica.

Uma abordagem para o uso da presente invenção como sondas acarreta primeiro identificar, por análise de Southern blot de um banco de genes do isolado de Bacillus, todos os segmentos de DNA homólogos às seqüências de nucleotídeo descritas. Assim, é possível, sem a ajuda de análise biológica, conhecer antecipadamente a provável atividade de muitos dos novos isolados de Bacillus, e dos produtos dos genes individuais expressos por um dado isolado de Bacillus. Tal análise da sonda oferece um método rápido para identificar genes de toxinas inseticidas potencial e comercialmente valiosas nas múltiplas subespécies de Bacillus. > Um procedimento de hibridização útil de acordo com a presente invenção tipicamente inclui as etapas iniciais de isolamento da amostra de DNA de interesse e purificação da mesma quimicamente. Podem ser usadas bactérias lisadas ou ácido nucléico fracionado total isolado de bactérias. As células podem ser tratadas usando-se técnicas conhecidas para liberar seu ) DNA (e/ou RNA). A amostra de DNA pode ser cortada em pedaços com uma enzima de restrição apropriada. Os pedaços podem ser separados por tamanho por meio de eletroforese em um gel, usualmente agarose ou acrila-mida. Os pedaços de interesse podem ser transferidos para uma membrana imobilizante. > A técnica de hibridização particular não é essencial para a presente invenção. À medida em que forem feitos aperfeiçoamentos nas técnicas de hibridização, elas poderão ser facilmente aplicadas. A sonda e a amostra podem ser então combinadas em uma solução tamponada de hibridização e mantidas a uma temperatura apropriada i até que ocorra a têmpera. Em seguida, a membrana é lavada para eliminar materiais estranhos, deixando as moléculas da amostra e da sonda ligada tipicamente detectadas e quantificadas por auto-radiografia e/ou contagem de cintilação líquida. Como se sabe, se a molécula da sonda e a amostra de ácido nucléico hibridizarem formando uma ligação não-covalente forte entre as duas moléculas, pode-se razoavelmente presumir que a sonda e a amostra são essencialmente idênticas. O marcador detectável da sonda oferece um meio para determinar, de maneira conhecida, se a hibridização ocorreu.

No uso dos segmentos de nucleotídeo como sondas, a sonda particular é marcada com qualquer marcador adequado conhecido pelos versados na técnica, incluindo marcadores radioativos e não-radioativos. Marcadores radioativos típicos incluem 32P, 35S e outros. Marcadores não- radioativos incluem, por exemplo, ligandos tais como biotina ou tiroxina, bem como enzimas tais como hidrolases ou peroxidases, ou os vários qui-mioluminescentes tal como luciferina, ou compostos fluorescentes como flu-oresceína e seus derivados. As sondas podem feitas inerentemente fluores-} centes, como descrito no Pedido Internacional N° WO 93/16094. Vários graus de severidade de hibridização podem ser empregados. Quanto mais severas as condições, maior a complementaridade requerida para formação de dúplex. A severidade pode ser controlada pela temperatura, concentração da sonda, comprimento da sonda, resistência ) iônico, tempo e outros. De preferência, a hibridização é conduzida em condições de severidade moderada à alta por técnicas bastante conhecidas na literatura, como descrito, por exemplo, in Keller, G. Η., Μ. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, pp. 169-170. Esta informação está aqui incorporada a título de referência, j Como aqui usado, condições de "severidade moderada à alta" para hibridização refere-se a condições que atingem o mesmo, ou aproximadamente o mesmo, grau de especificidade de hibridização que as condições empregadas pelas requerentes. Exemplos de condições de severidade moderada à alta são fornecidos neste relatório. Especificamente, hibridiza-l ção de DNA imobilizado em Southern blots com sondas específicas para gene marcadas com 32P foi realizada por métodos tradicionais (Maniatis et al.). Em geral, hibridização e lavagens subsequentes foram realizadas em condições de severidade moderada à alta que permitiram a detecção de seqüências alvo com homologia para os genes de toxina exemplificados. Para quatro sondas de genes de DNA de filamento duplo, a hibridização foi realizada por uma noite a 20 - 25°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do DNA híbrido em 6X SSPE, 5X solução de Denhardt, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml DNA desnaturado. A temperatura de fusão é descrita pela fórmula a seguir (Beltz, G. A., K. A. Jacobs, T. H. Eickbush, P. T. Cherbas e F. C. Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman e K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285).

Tm = 81,5°C + 16,6 log[Na+] + 0,41 (% G + C) - 0,61 (% formami- da) - 600 / comprimento do dúplex em pares de bases.

As lavagens são tipicamente realizadas da seguinte maneira: (1) duas vezes à temperatura ambiente por 15 minutos em 1X SSPE, 0,1% SDS (lavagem em condições de baixa severidade). (2) uma vez a Tm - 20°C por 15 minutos em 0,2X SSPE, 0,1% SDS (lavagem em condições de severidade moderada).

Para sondas de oligonucleotídeo, a hibridização foi realizada por uma noite a 10 - 20°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do híbrido em 6X SSPE, 5X solução de Denhardt, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml de DNA des-naturado. A Tm para as sondas de oligonucleotídeo foi determinada pela seguinte fórmula: Tm (°C) = 2 (número de pares de bases T/A) + 4 (número de pares de bases G/C) (Suggs, S. V., T. Miyake, E. H. Kawashime, M. J. Johnson, K. Itakura & R. B. Wallace [1981] INC-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purifíed Genes, D. D. Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693).

As lavagens são tipicamente realizadas da seguinte maneira: (1) duas vezes à temperatura ambiente por 15 minutos em 1X SSPE, 0,1% SDS (lavagem em condições de baixa severidade). (2) uma vez a temperatura de hibridização por 15 minutos em 1X SSPE, 0,1% SDS (lavagem em condições de severidade moderada).

Em geral, o sal e/ou a temperatura podem ser alterados para alterar a severidade. Com um fragmento de DNA marcado, com um comprimento maior que cerca de 70 bases, pode-se usar as seguintes condições: baixa: 1 ou 2 X SSPE, temperatura ambiente baixa: 1 ou 2 X SSPE, 42°C moderada: 0,2X ou 1X SSPE, 65°C alta: 0.1XSSPE, 65°C. A formação de dúplex e a estabilidade dependem da complementaridade substancial entre os dois filamentos de um híbrido e, como observado acima, um certo grau de imperfeição no acasalamento pode ser tolerado. Portanto, as seqüências de sonda da presente invenção incluem mutações (tanto simples quanto múltiplas), deleções, inserções das se-qüências descritas, e combinações das mesmas, onde as mutações, inserções e deleções permitem a formação de híbridos estáveis com o polinucle-otídeo alvo de interesse. Mutações, inserções e deleções podem ser produ-i zidas em uma dada sequência de polinucleotídeo de muitas maneiras, e esses métodos são conhecidos pelo versado na técnica. Outros métodos serão conhecidos no futuro.

Assim, variantes por mutação, por inserção e por deleção das sequências de nucleotídeo apresentadas podem ser facilmente preparadas 1 por métodos que são bastante conhecidos pelos versados na técnica. Essas variantes podem ser usadas da mesma maneira que as seqüências de pri-mer exemplificadas contanto que as variantes tenham substancial homolo-gia de seqüência com a sequência original. Como aqui usado, substancial homologia de seqüência refere-se à homologia que seja suficiente para permitir que a sonda variante funcione com a mesma capacidade que a sonda original. De preferência, esta homologia é maior que 50%; mais preferivelmente, esta homologia é maior que 75%; e mais preferivelmente, esta homologia é maior que 90%. O grau de homologia ou identidade necessário para a variante funcionar com a capacidade desejada vai depender do uso pretendido da seqüência. O versado na técnica sabe como fazer variantes por mutação, por inserção e por deleção destinadas a melhorar o funcionamento da seqüência ou de alguma forma oferecer uma vantagem metodológica.

Tecnologia de PCR. Reação de Cadeia de Polimerase (PCR) é uma síntese forçada, enzimática, repetitiva, de uma seqüência de ácido nu-cléico. Este procedimento é bastante conhecido e comumente usado pelos versados na técnica (veja Mullis, Patentes US N°s 4.683.195, 4.683.202 e 4.800.159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim [1985] "Enzymatic Amplifi-cation of β-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Di-agnosis of Sickle Cell Anemia", Science 230:1350-1354). A PCR baseia-se na ampliação enzimática de um fragmento de DNA de interesse que é flan- queado por dois primers de oligonucleotídeo que hibridizam em filamentos opostos da sequência alvo. Os primers são orientados com as extremidades 3’ voltadas uma para a outra. Ciclos repetidos de desnaturação térmica do gabarito, têmpera dos primers para suas seqüências complementares, e 5 extensão dos primers temperados com um DNA polimerase resultam na ampliação do segmento definido pelas extremidades 5’ dos primers de PCR. Como o produto da extensão de cada primer pode servir como gabarito para o outro primer, cada ciclo essencialmente dobra a quantidade de fragmentos de DNA produzidos no ciclo anterior. Isto resulta no acúmulo exponencial do ) fragmento alvo específico em até vários milhões de vezes em poucas horas. Usando-se um DNA polimerase termoestável tal como Taq polimerase, que é isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus, o processo de ampliação pode ser completamente automatizado. Outras enzimas que podem ser usadas são conhecidas pelos versados na técnica, i As seqüências de DNA da presente invenção podem ser usadas como primers para ampliação por PCR. Quando se realiza uma ampliação por PCR, um certo grau de imperfeição no acasalamento entre primer e gabarito pode ser tolerado. Portanto, mutações, deleções e inserções (especialmente adições de nucleotídeos na extremidade 5’) dos primers exemplifi-i cados estão no escopo da presente invenção. Mutações, inserções e deleções podem ser produzidas em um dado primer por métodos conhecidos pelo versado na técnica.

Todas as referências aqui citadas estão aqui incorporadas a título de referência. A seguir são dados exemplos que ilustram procedimentos para a prática da invenção. Esses exemplos não devem ser interpretados como limitativos. Todas as percentagens estão em peso e todas as proporções das misturas de solventes estão em volume, a menos que de outra forma indicado.

Exemplo 1 - Cultivo de isolados de Bacfflus laterosoorus úteis de acordo com a invenção Cepas nativas de Bacillus laterosporus e recombinantes de B.t. expressando toxinas do tipo MIS e WAR de B.l. foram cultivados em meio líquido TB {+ glicerol) a 30°C e 300 rpm por 25 horas. As células foram pe-letizadas por centrifugação e os sobrenadantes ("SN") decantados e reservados. EDTA foi adicionado a 1 mM e as amostras armazenadas a -20°C. ) Amostras frescas foram usadas para bioensaios no mesmo dia da colheita. Amostras congeladas foram descongeladas a 4°C e centrifugadas para pe-letizar e eliminar quaisquer sólidos e foram então usadas para bioensaio ou fracionamento.

Exemplo 2 - Preparação de DNA genômico e análise de Southern blot ) DNA celular total foi preparado de várias cepas de Bacillus late- rosporus cultivadas a uma densidade ótica de 0,5 - 0,8 a 600 nm de luz visível em caldo Luria Bertani (LB). O DNA foi extraído usando o kit 'Qiagen Genomic-tip 500/G’ ou o ‘Genomic-Tip 20/G and Genomic DNA Buffer Set’ de acordo com o protocolo para bactérias gram-positivas (Qiagen Inc.; Va-> lencia, CA). DNA genômico total preparado foi digerido com várias enzimas de restrição, tratado por eletroforese em agarose gel 0,8%, e imobilizado em uma membrana de náilon reforçada usando métodos tradicionais (Maniatis, T., E. F. Fritsch, J. Sambrook [1982] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Novos genes i de toxina foram detectados usando-se sondas marcadas com 32P em hibridi-zações Southern padrão ou por métodos não-radioativos usando o sistema de marcação e detecção de ácido nucléico DIG (Boehringer Mannheim; In-dianapolis, IN).

A sonda de MIS, de aproximadamente 2,6 kbp, está mostrada na SEQ ID N° 1. A sonda de WAR, de aproximadamente 1,3 kbp, está mostrada na SEQ ID N° 2. Estas sondas podem ser preparadas de várias maneiras, incluindo o uso de unia "máquina de fazer genes", ou elas podem ser clonadas do isolado PS117C8 de B.t. e ampliadas por PCR com primers homólogos às extremidades 5’ e 3’ de cada gene respectivo. Neste último caso, fragmentos de DNA foram purificados em gel e aproximadamente 25 ng de cada fragmento de DNA foram aleatoriamente marcados com 32P para detecção radioativa. Aproximadamente 300 ng de cada fragmento de DNA foram aleatoriamente marcados com o kit "DIG High Prime" para detecção não-radioativa. A hibridização de DNA imobilizado com sondas aleatoriamente marcadas com 32P foi realizada em condições normais de formamida: 50% formamida, 5X SSPE, 5X solução de Denhardt, 2% SDS, 0,1 mg/ml a 5 42°C por uma noite. Manchas foram lavadas em condições de baixa severi- dade em 2X SSC, 0,1 % SDS a 42°C e expostas a uma película.

Mostrados abaixo na Tabela 2 estão os resultados do polimor-fismo de restrição do comprimento (RFLP) do DNA celular total das cepas MB438 e MB439 de Bacillus laterosporus conforme determinados por análi-) se Southern blot sondada com sondas de MIS ou de WAR, conforme indicado. As bandas contêm pelo menos um fragmento do opéron semelhante a MIS ou WAR de interesse.

Tabela 2 _____________________________________ Classe Nome da Bandas de hibridização Bandas de hibridização da de RFLP cepa da sonda de MIS__________sonda de WAR_______________ A MB438 Hindlll: 8,414; 7,871 Hindlll: 7,781, 7.364, 2,269 _____________________Xbal: 12,972; 8,138 Xbal: 12,792, 7,871_______________ B MB439 Hindlll: 7,871 Hindlll: 7,364,2,269 _____________________Xbal: 12,972_____________|xbal: 12,792________________ Exemplo 3 - Clonagem de gene de toxina > Bibliotecas lambda de DNA genômico total das cepas MB438 ou MB439 de Bacillus laterosporus foram preparadas a partir de DNA parcialmente digerido, de tamanho fracionado, na faixa de tamanho de 9 - 20 kb. Os tempos específicos de digestão usando enzima Ndell diluída 1:10 (aproximadamente 0,5 unidade) foram determinados para otimizar a faixa deseja-i da de tamanho do DNA digerido. O DNA foi digerido pelo tempo apropriado e em seguida fracionado em agarose gel 0,7%. O DNA foi visualizado usando-se uma coloração de brometo de etídio e o DNA na faixa de tamanho de 9 - 20 kb foi excisado do gel. O fragmento de gel foi colocado em um tubo de diálise (corte de PM 12 - 14.000) junto com 2 ml de Tris-HC110 mM, tampão EDTA 1 mM, pH 8,0 (TE). O DNA foi eletroeluído do fragmento de gel em tampão 0,1 X TAE a aproximadamente 30 mA por uma hora. O DNA foi removido do tubo no tampão TE e purificado usando-se coluna e protocolo Elutip (Schleicher & Schuell; Keene, NH). O DNA purificado foi precipitado em etanol e ressuspendido em 10 ul de TE. DNA purificado fracionado foi ligado em braços digeridos com > BamHI Lambda-GEM-11 (Promega Corp., Madison, Wl) de acordo com o protocolo. O DNA ligado foi então acondicionado em fago lambda usando o extrato de acondicionamento Gigapack III Gold (Stratagene Corp., La Jolla, CA) de acordo com o protocolo. A cepa bacteriana KW251 de E. coli foi infectado com extratos de acondicionamento e plaqueadas em pratos LB em i agarose de topo LB. Placas foram erguidas sobre filtros de nitrocelulose e preparadas para hibridização usando-se métodos tradicionais (Maniatis et al., supra). Sonda marcada com 32P (veja acima) foi preparada e filtros hibri-dizados e lavados como descrito acima. Placas contendo o clone desejado foram visualizadas por exposição dos filtros a uma película Kodak XAR-5. i As placas foram isoladas dos pratos e o fago ressuspendido do ágar e introduzido em tampão SM. DNA do fago foi preparado usando-se o adsor-vente de fago LambdaSorb (Promega, Madison, Wl). PCR foi realizada no DNA de fago para verificar que ele continha o opéron alvo usando-se a SEQ ID N° 3 e a SEQ ID N° 4 como primers. As reações de PCR produziram uma banda de 1 kb em ambas as amostras de DNA, reafirmando que esses clones contêm o gene do tipo mis. Para identificar um fragmento menor de DNA contendo o opéron de interesse que poderia ser então subclonado em um vetor bacteriano para ulterior análise e expressão, os DNAs de fago foram digeridos com várias enzimas, fracionadas em agarose gel 1% e manchados para análise Southern. A análise Southern foi realizada como descrito acima. Um fragmento Hincll de aproximadamente 10 kb de tamanho foi identificado para MB438. Este fragmento foi purificado em gel e clonado no sítio EcoRV de pBluescriptll(SK+); o plasmídio resultante é designado pMYC2608, e a cepa recombinante de £. coli contendo este plasmídio é designada MR957.

Exemplo 4 - Seqüenciamento de genes MIS e WAR de MB438 Uma seqüência de DNA parcial para o gene mis de MB438 foi determinada em um fragmento de DNA ampliado por PCR. PCR usando primers MIS (SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4) foi realizada em DNA genômico celular total de MB438 e MB439. MB438 deu um fragmento de DNA de aproximadamente 1 kbp que foi subsequentemente clonado no vetor de > plasmídio de clonagem de TA de DNA de PCR, pCR2.1, como descrito pelo fornecedor (Invitrogen, San Diego, CA). Plasmídios foram isolados de clones recombinantes da PCR de MB438 e testados quanto à presença de uma inserção de aproximadamente 1 kbp por PCR usando os primers de vetor de plasmídio T3 e T7. Aqueles que continham a inserção foram então isolados ) para uso como gabaritos de seqüenciamento usando kits de 'miniprepara-ção’ QIAGEN (Santa Clarita, CA) conforme descrito pelo fornecedor. As reações de seqüenciamento foram realizadas usando o kit Oye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction’ da PE Applied Biosystems. As reações de seqüenciamento foram conduzidas em um seqüenciador automatizado > ABI PRISM 377. Os dados de seqüência foram recolhidos, editados e agrupados usando o software ABI PRISM 377 Collection, Factura, e AutoAssem-bler da PE ABI. Uma seqüência de nucleotídeo parcial do gene do tipo mis de MB438 está mostrada como SEQ ID N° 5.

Seqüências completas para os genes do tipo MIS e WAR de i MB438 foram determinados por agrupamento dos dados de seqüência provenientes de fragmentos de restrição aleatórios de pMYC2608 e por introduzindo por primer ("primer walking") a inserção de DNA no pMYC2608. A inserção de DNA do plasmídio pMYC2608 foi isolada por excisão do vetor usando as enzimas de restrição de poliligante Notl e Apal, fracionamento em agarose gel 0,7% e purificado do agarose gel usando o kit Qiaexll (Qia-gen Inc., Valencia, CA). A inserção de DNA purificada em gel foi então digerida com as enzimas de restrição Alui, Msel e Rsal, e fracionada em agarose gel 1%. Fragmentos de DNA entre 0,5 e 1,5 kb foram excisados do gel e purificados usando o kit Qiaexll. Os fragmentos recuperados foram ligados em pBluescriptll digerido com EcoRV, e transformados em células XLIOGold. DNA ‘minipreparação’ foi preparado a partir de transformantes aleatoriamente escolhidos, digeridos com Notl e Apal para verificar a inser- ção e usados para seqüenciamento. As reações de seqüenciamento foram realizadas usando-se o kit de seqüenciamento dRhodamine (ABI Prism/Perkin Elmer Applied Biosystems). As sequências foram colocadas em gel de seqüenciamento de acordo com o protocolo (ABI Prism) e anali-5 sadas usando-se os programas Factura e Autoassembler (ABI Prism). A se-qüência de nucleotídeo completa do gene do tipo mis de MB438 está mostrada como SEQ ID N° 6; a seqüência de peptídio MIS deduzida de MB438 está mostrada como SEQ ID N° 7. A seqüência de nucleotídeo completa do gene do tipo warde MB438 está mostrada como SEQ ID N° 8; a seqüência D de peptídio WAR deduzida de MB438 está mostrada como SEQ ID N° 9.

Uma seqüência de DNA parcial para o gene do tipo mis de MB439 foi determinada de fragmentos de DNA ampliados por PCR. PCR usando primers de SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4 foi realizada em DNA genô-mico celular total de MB439. Foi obtido um fragmento de DNA de aproxima-5 damente 1 kbp que foi subseqüentemente clonado no vetor de plasmídio de clonagem de TA de DNA de PCR, pCR-TOPO, conforme descrito pelo fornecedor (Invitrogen, San Diego, CA). Plasmídios foram isolados de clones recombinantes da PCR de MB439 e testados quanto à presença de uma inserção de aproximadamente 1 kbp por PCR usando os primers de vetor de D plasmídio T3 e T7. Aqueles que continham a inserção foram então isolados para uso como gabaritos de seqüenciamento usando kits ‘minipreparação’ QIAGEN (Santa Clarita, CA) conforme descrito pelo fornecedor. As reações de seqüenciamento foram realizadas usando o kit ‘Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction’ da PE Applied Biosystems. As reações de se-5 qüenciamento foram conduzidas em um seqüenciador automatizado ABI PRISM 377. Os dados de seqüência foram recolhidos, editados e agrupados usando o software ABI PRISM 377 Collection, Factura, e AutoAssembler da PE ABI. A seqüência de nucleotídeo parcial do gene do tipo mis de MB439 está mostrada como SEQ ID N° 10. D Exemplo 5 - Subclonagem de toxinas do tipo MIS e WAR de MB438 para expressão em Bacillus thuringiensis Expressão das toxinas do tipo MIS e WAR de MB438 em B.t. foi obtida por subclonagem do fragmento de DNA genômico clonado de pMYC2608 em um vetor de transporte de grande número de cópias capaz de replicar em ambos os hospedeiros E. coli e B.t. O vetor de transporte pMYC2614 é uma versão modificado de pHT370 (O. Arantes e D. Lereclus. 5 1991. Gene 108:115-119), contendo a região de sítio de clonagem múltipla do pBluescript II (Stratagene). A inserção de DNA genômico contendo os genes do tipo mis e warfoi excisada de pMYC2608 usando-se as enzimas de restrição Notl e Apal, purificada em gel e ligada aos sítios Notl e Apal de pMYC2614. O plasmídio de transporte de B.t. resultante foi designado D PMYC2609.

Para testar a expressão dos genes de toxina de MB438 em B.t., o pMYC2609 foi transformado no hospedeiro acristalieroso (Cry-) de B.t, CryB (A. Aronson, Purdue University, West Lafayette, IN), por eletropora-ção. Esta cepa recombinante foi designada MR557. A expressão da toxina 5 do tipo WAR foi demonstrada por imunoensaio de manchas com anticorpos gerados para a toxina do tipo WAR PS177C8. Preparações de sobrena-dantes de culturas e péletes de células de MR557 foram analisadas contra a lagarta da raiz de milho do oeste da maneira descrita no exemplo 8 abaixo. Exemplo 6 - Bioensaios de MB438 e MB439 em lagarta da raiz de milho do ) oeste Amostras de sobrenadante preparadas como discutido no exemplo 1 foram introduzidas por cima em dieta artificial a uma taxa de 215 μΙ/1,36 cm2. Essas preparações foram então infestadas com lagartas da raiz de milho do oeste recém-nascidas e foram mantidas no escuro a 25°C por 4 > dias. A menos que de outra forma indicado, as amostras foram avaliadas quanto à mortalidade no dia 4 pós-infestação. A Tabela 3 refere-se aos períodos de tempo para MB438 e MB439. MB438 e MB439 demonstram surgimento de atividade em torno de 22 - 30 h (MB438) e 24 - 39 h (MB439). Todas as cepas foram cultivadas em i meio TBG. Nenhuma dessas amostras foi tratada com calor.

Tabela 3 Os resultados apresentados na Tabela 4 mostram que o calor elimina quase toda ou toda a atividade presente em amostras frescas não aquecidas de MB438 e MB439 cultivadas por 24 h e 48 h.

Tabela 4 Tabela 4 fcnntinuacãnt Os resultados apresentados na Tabela 5 mostram que a atividade de MB438 e MB439 é responsiva à dose. Todas as cepas foram cultivadas em meio TBG. Nenhuma das amostras foi tratada com calor. Todas as amostras são culturas de 24 horas.

Tabela 5 Tabela 5 (continuacãol Exemplo 7 - Bioensaios de amostras fracionadas em lagarta da raiz de milho do oeste Para amostras dialisadas, alíquotas de sobrenadante de cultura foram transferidas para tubos de diálise celulósica e foram dialisadas contra NaP04 25 mM, EDTA 1 mM, pH 7, com agitação por uma noite a 4°C. Isto elimina qualquer componente de escoamento livre do SN que seja menor que o corte de peso molecular nominal da membrana de diálise. Os tamanhos dos poros eram 6 - 8 kD e 50 kD e estas amostras foram examinadas quanto à atividade dos componentes retidos na membrana de diálise que podem ser chamados "de alto peso molecular".

Frações de baixo peso molecular foram geradas por ultrafiltra-ção ("UF") através de membranas de tamanho de poro igual a 1, 3 ou 10 kD por pressão de gás nitrogênio a 4°C. Este método resulta em soluções contendo componentes de sobrenadante menores que o corte de peso molecular nominal da membrana de UF. Estas soluções são chamadas de "permeados".

Os resultados apresentados na Tabela mostram que o componente com menos de 10 kD de MB438 e MB439 apresenta atividade. Todas as amostras foram cultivadas em meio TBG. Nenhuma das amostras foi tratada com calor. Todas as amostras são culturas de 24 horas.

Tabela 6 Os resultados apresentados na Tabela 7 mostram que os componentes < 10 kD de MB438 e MB439 apresentam atividade moderada sob calor elevado, e que a eliminação dos componentes de alto peso molecular mediante diálise não elimina a atividade. Todas as amostras foram culturas de 24 horas cultivadas em meio TBG.

Tabela 7_______________________________ Os resultados apresentados na Tabela 8 mostram que MB438 e MB439 têm atividade em um componente de menos de 10 kD que não passa através de uma membrana de UF de 1 kD. Todas as amostras são culturas de 24 horas cultivadas em meio TBG. _______________________________Tabela 8_________________________ Tabela 8 fcontinuacãol Exemplo 8 - Bioatividade de MR957 e MR557 Culturas de MR957 foram cultivadas em 5,0 ml de meio (pré-mistura TB Difco; 4 g/litro de glicerol) em tubos plásticos de 16 x 150 mm com tampas. As culturas foram agitadas em um tambor giratório por 24 horas a 37°C. As células foram peletizadas por centrifugação e os sobrena-dantes decantados e reservados. EDTA foi adicionado a 1 mM e as amostras armazenadas a 20°C. Para determinação da densidade celular, as amostras foram turbilhonadas e 100 μΙ de cada caldo de cultura foram transferidos para um tubo Falcon (14 ml; 17 x 100 mm). Uma diluição 1:50 foi preparada por adição de 4,9 ml de água destilada a cada tubo e novo turbilhonamento. Leituras de DO foram feitas usando-se um espectrofotô-metro a 600 nm. Cepas recombinantes de B.t. foram cultivadas como descrito no exemplo 1.

Bioensaios da lagarta da raiz de milho do oeste para o clone MR957 de E. coli e o clone MR557 de B. thuringiensis (cada um contendo os genes do tipo mis e war de MB438) foram feitas usando-se essencialmente o mesmo modelo experimental descrito no exemplo 6. MR948 e MR539 são depas de controle negativo contendo vetores de clonagem sem inserções de gene de toxina. Para testar cepas de E. coli, amostras de sobrenadante ou de cultura total foram aplicadas à superfície de dieta a uma dose de 215 ul/1,36 cm2, enquanto amostras de pélete celular foram concentradas 5 vezes e introduzidas na dieta a 50 ul/1,36 cm2 (Tabela 9). Para testas cepas de B.t, amostras de sobrenadante foram aplicadas à superfície de dieta a uma dose de 215 ul/1,36 cm2, enquanto amostras de pélete celular foram concentradas 5 vezes e introduzidas na dieta a várias taxas (Tabela 10). Aproximadamente 6-8 larvas foram transferidas para a dieta imediatamente depois de a amostra ter evaporado. O prato de bioensaio foi vedado com folha de milar usando um ferro de atar ("tacking iron") e furos foram feitos acima de cada compartimento para permitir troca de gás. A mortalidade foi avaliada quatro dias depois do revestimento.

Os resultados dos dois testes demonstram maior mortalidade das lagartas da raiz de milho atribuível aos genes do tipo mis e war de MB438 clonado. A Tabela 9 mostra a atividade qualitativa de toxinas de MB438 clonado em preparações brutas de cultura de E. coli contra a lagarta da raiz de milho.

Tabela 9 A Tabela 10 mostra a atividade dependente da dose de toxinas de MB438 clonado em preparações brutas de cultura de B.t. contra a lagarta da raiz de milho. Nas Tabelas 9 e 10, os números em negrito representam a mortalidade percentual; os números entre parênteses indicam o número de larvas mortas dividido pelo total de larvas no teste.

Tabela 10 Exemplo 9 - Inserção de genes de toxina em plantas Um aspecto da presente invenção é a transformação de plantas com genes codificando a toxina inseticida da presente invenção. As plantas transformadas são resistentes ao ataque da praga alvo.

Genes codificando toxinas pesticidas, descritos nesta invenção, podem ser inseridos em células vegetais usando uma variedade de técnicas que são bastante conhecidas na técnica. Essas técnicas incluem transformação com T-DNA usando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agente de transformação, fusão, injeção, biolística (bombardeamento de micropartículas) ou eletroporação, assim como outros métodos possíveis.

Se Agrobactérias forem usadas para a transformação, o DNA a ser inserido terá que ser clonado em plasmídios especiais, a saber, em um vetor intermediário ou em um vetor binário. Os vetores intermediários podem ser integrados no plasmídio Ti ou Ri por recombinação homóloga devido a sequências que são homólogas a sequências no T-DNA. O plasmídio Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T-DNA. Vetores intermediários não podem se replicar em Agrobactérias. O vetor intermediário pode ser transferido para Agrobacterium tumefaciens por meio de um plasmídio auxiliar (conjugação). Vetores binários podem se replicar tanto em £ coli como em Agrobactérias. Eles compreendem um gene de marcador de seleção e um ligante ou poliligante que são cercados pelas regiões de borda direita e esquerda do T-DNA. Eles podem ser transformados diretamente em Agrobactérias (Holters et al. [1978] Mol. Gen. Genet. 163:181-187). A Agrobaoterium usada como célula hospedeira deve compreender um plasmídio contendo uma região vir. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA para a célula vegetal. T-DNA adicional pode estar contido. A bactéria assim transformada é usada para a transformações de células vegetais. Explantes de plantas podem ser vantajosamente cultivados com Agrobaoterium tumefaciens ou Agrobaoterium rhizogenes para a transferência do DNA para a célula da planta. Plantas inteiras podem ser regeneradas a partir do material vegetal infectado (por exemplo, pedaços de folha, segmentos de caule, raízes, mas também protoplastos ou células cultivadas em suspensão) em um meio adequado, que pode conter antibióticos ou biocidas para seleção. As plantas assim obtidas podem ser então testadas quanto à presença do DNA inserido. Não existe nenhuma exigência especial em relação aos plasmí-dios no caso de injeção e eletroporação. É possível usar plasmídios comuns tais como, por exemplo, derivados de pUC. Na transformação biolística, DNA plasmídio ou DNA linear pode ser empregado.

Inúmeros vetores de clonagem compreendendo um sistema de replicação em E. coli e um marcador que permite seleção das células transformadas estão disponíveis para preparação para a inserção de genes estranhos em plantas superiores. Os vetores compreendem, por exemplo, pBR322, a série pUC, a série M13mp, pACYC184 etc. Por conseguinte, a seqüência codificando a toxina de Bacillus pode ser inserida no vetor em um sítio de restrição adequado. O plasmídio resultante é usado para transformação em E. coli. As células de E. coli são cultivadas em um meio nutriente adequado, em seguida colhidas e lisadas. O plasmídio é recuperado. Análise de sequência, análise de restrição, eletroforese e outros métodos bio-químicos-biológicos moleculares são geralmente empregados como métodos de análise. Depois de cada manipulação, a seqüência de DNA usada pode ser clivada e unida à seqüência de DNA seguinte. Cada seqüência de plasmídio pode ser clonada nos mesmos plasmídios ou em outros. Dependendo do método de inserção dos genes desejados na planta, outras se-qüências de DNA podem ser necessárias. Se, por exemplo, plasmídio Ti ou Ri for usado para a transformação da célula da planta, então pelo menos a borda direita, mas geralmente a borda direita e a esquerda do T-DNA do plasmídio Ti ou Ri, tem que ser unida como a região flanqueadora dos genes a serem inseridos. O uso de T-DNA para a transformação de células vegetais foi extensamente pesquisado e suficientemente descrito no documento EP 120 516; Hoekema (1985) In: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, capítulo 5; Fraley et al., Crít. Rev, Plant Sei. 4:1-46; e An et al. (1985) EMBO J. 4:277-287.

Depois de o DNA inserido ter sido integrado no genoma, ele é relativamente estável no mesmo e, via de regra, não volta a sair. Ele normalmente contém um marcador de seleção que confere às células vegetais transformadas resistência a um biocida ou um antibiótico, tal como canami-cina, G 418, bleomicina, higromicina ou cloranfenicol, inter alia. O marcador individualmente empregado deve por conseguinte permitir a seleção de células transformadas ao invés de outras células que não contêm o DNA inserido.

As células transformadas são regeneradas em plantas morfofo-gicamente novas da maneira usual. Se uma transformação envolver ainda uma célula da linhagem de germe, então o DNA inserido e a(s) característica^) fenotípica(s) correspondente(s) serão transmitidas para as plantas descendentes. Estas plantas podem ser cultivadas de maneira usual e cruzadas com plantas que tenham os mesmos fatores hereditários transformados ou outros fatores hereditários. Os indivíduos híbridos resultantes têm as propriedades fenotípicas correspondentes.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, plantas podem ser transformadas com genes onde o uso de códon fora otimizado para plantas. Veja, por exemplo, a Patente US N° 5.380.831.

Deve ficar entendido que os exemplos e modalidades descritos neste relatório são dados a título ilustrativo apenas e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas a versados na técnica e estão incluídas no espírito e escopo deste pedido e reivindicações anexas.

Claims (3)

1. Método para controle de uma praga lagarta da raiz de milho, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a referida praga em contato com uma quantidade pesticidamente eficaz de uma toxina que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9, em que a toxina é ativa contra a referida praga.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida toxina compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida toxina compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9.