CN1319138A - 来源于侧孢芽孢杆菌菌株的杀虫毒素与基因 - Google Patents

Abstract

公开了可从此处公开的侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)分离株中获得的新型毒素和基因,并申请专利。在优选的实施方案中,此基因及毒素用于防治西方玉米根虫。

Description

来源于侧孢芽孢杆菌菌株的杀虫毒素与基因

发明背景

昆虫和其它害虫使农民每年在作物损失与防治这些害虫的花费中损失数十亿美元。农业生产环境中由虫害引起的损失包括作物产量的降低、作物质量的降低和收获成本的提高。

玉米根虫(一种鞘翅目害虫)是一种严重的植物害虫。由于玉米根虫(星叶甲属(Diabrotica)的种)幼虫摄食根，美国玉米作物每年遭受重大损失。据估计，每年约有930万英亩美国玉米遭受玉米根虫综合物种的侵害。玉米根虫综合物种包括西方玉米根虫(玉米根叶甲(Diabrotica virgifera virgifera))、北方玉米根虫(Diabrotica barberi)和南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabroticaundecimpunctata howardi))。

星叶甲属的每个种的生活周期类似。玉米根虫的卵沉积于土壤中。新孵化的幼虫(初龄虫)滞留于土壤中，以较小的分支玉米根为食。西方及北方玉米根虫的晚龄虫侵入向植物运送水和矿物元素的内根组织。在大多数情况中，幼虫迁移，以最新生长的根为食。幼虫向根中钻孔引起可表现为根表面的棕色细长疤痕、根内蛀孔或不同程度切断的损害。根被切断的植物通常在伴随大雨和强风的风暴后被拔出。南方玉米根虫的幼虫以与西方及北方玉米根虫幼虫类似的方式摄食根。南方玉米根虫幼虫也可摄食仍接近土壤线的茎的生长点，这可使植物枯死。

摄食约3周后，玉米根虫幼虫离开根，并在土壤中化蛹。甲虫成虫从土壤中出现，并可摄食玉米花粉及其它许多类型的花粉及玉米穗丝。摄食绿色穗丝能降低传粉水平，导致谷粒结粒不良和产量降低。西方玉米根虫成虫也摄食玉米叶，这能减缓植物的生长，在较少见的情况中能杀死某些玉米品种的植物。

这些星叶甲属的种的土壤幼虫以玉米植物的根为食，引起倒伏。倒伏最终降低玉米产量，并且通常导致植物死亡。通过摄食玉米穗丝，甲虫成虫可减少传粉，因此不利地影响每株植物的玉米产量。另外，星叶甲属的成虫和幼虫侵害用于商业生产的葫芦作物(黄瓜、甜瓜、南瓜等)和许多蔬菜作物及大田作物，以及家庭花园中生长的植物。

据估计，在美国每年用来防治玉米根虫的杀虫剂的年度花费和玉米根虫损害引起的作物损失总计超过10亿美元(Meycalf,R.L.[1986]《星叶甲属害虫研究方法》,Drysan,J.L．和T.A.Miller[编],Springer-Verlag，纽约，NY,ⅶ-ⅹⅴ页)。在美国每年用价值约2.5亿美元的杀虫剂防治玉米根虫。在中西部地区，1990年在爱荷华州和内布拉斯加州分别施用了价值6千万美元和4千万美元的杀虫剂。尽管使用杀虫剂，根虫每年仍导致约7.5亿美元的作物损失，使之成为中西部地区最严重的玉米害虫。

利用栽培方法，如轮作和应用高水平氮刺激不定根系统的生长，已部分地进行了玉米根虫的防治。但是，保证希望水平的防治最主要地是依靠化学杀虫剂。杀虫剂或者结合于或者掺入土壤中。对农田利用的经济要求限制了轮作的应用。另外，在某些地区出现的北方玉米根虫的两年滞育(或越冬)性状影响了轮作。

杀虫剂防治玉米根虫的用途也有几个缺点。杀虫剂的连续使用使得产生抗性昆虫。如极大量的幼虫群、大雨和杀虫剂施用装置的不准确刻度等情况均能导致较差的防治。杀虫剂的应用常引发对环境的关注，如土壤和地表及地下供水的污染。公众也担心可在食物中发现的残余化学药品的量。工作中接触杀虫剂也可造成对施用它们的人员的危害。因此，合成化学杀虫剂现正就其潜在的毒性环境后果受到越来越严格的审查，而正应如此。广泛使用的合成化学杀虫剂的实例包括有机氯杀虫剂类，如DDT、灭蚁灵、十氯酮、林丹、艾氏剂、氯丹、涕灭威和狄氏剂；有机磷酸酯类，如毒死蜱、对硫磷、马拉硫磷和二嗪磷；和氨基甲酸酯类。对使用杀虫剂的新的严格限制和市场上某些有效杀虫剂的撤除都能限制对防治害虫的经济、有效的选择。

由于与使用有机合成化学杀虫剂有关的问题，确实需要限制这些药剂的使用，并需要确定备择的防治药剂。合成化学杀虫剂的替换或这些药剂与生物杀虫剂的结合能降低环境中有毒化学药品的水平。

越来越普及的一种生物杀虫剂是土壤微生物苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(B.t.)。土壤微生物苏云金芽孢杆菌(B.t.)是一种革兰阳性的产芽孢细菌。大多数苏云金芽孢杆菌菌株不表现杀虫活性。某些苏云金芽孢杆菌菌株产生且其特征为伴胞晶体蛋白质内含物。这些一般具有特异杀虫活性的“δ-内毒素”不同于具有非特异性宿主范围的外毒素。这些内含物通常在显微镜下显示为特征性形状的晶体。这些蛋白质可能对害虫非常有毒，并且其毒性特异。已经分离并测序了某些苏云金芽孢杆菌毒素基因。苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达早在15年前就已在公开文献中描述(Schnepf,H.E.,H.R.Whiteley[1981]美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78:2893-2897)。另外，利用遗传工程技术，正研究向农业环境中施放苏云金芽孢杆菌毒素的新方法，包括使用以苏云金芽孢杆菌毒素基因遗传改造的植物用于昆虫抗性，和使用稳定的完整微生物细胞作为苏云金芽孢杆菌毒素输送载体(Gaertner,F.H.,L.Kim[1988]TIBTECH 6:S4-S7)。因此，分离的苏云金芽孢杆菌内毒素基因是有商业价值的。

到最近15年，苏云金芽孢杆菌杀虫剂的商业应用主要限于鳞翅目(毛虫)害虫的较小范围。苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克(kurstaki)亚种的芽孢和晶体制剂作为鳞翅目害虫的商品杀虫剂已使用多年。例如，苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克HD-1变种产生一种对多种鳞翅目昆虫的幼虫有毒的晶体δ-内毒素。

然而最近几年，研究人员发现了对更多的害虫有特异性的苏云金芽孢杆菌杀虫剂。例如，苏云金芽孢杆菌的其它种即以色列(israelensis)和莫氏(morrisoni)(a.k.a.tenebrionis,a.k.a.B.t.M-7)已分别商业用于防治双翅目和鞘翅目的昆虫(Gaertner,F.H.[1989]“杀虫蛋白质的细胞输送系统：活与死微生物”，《作物保护剂的受控施放》，R.M.Wilkins编，Taylor和Francis，纽约和伦敦，1990,245-255页)。参见Couch,T.L.(1980)“苏云金芽孢杆菌以色列变种的蚊子致病性”，工业微生物发展(Developments in Industrial Microbiology)22:61-67；Beegle,C.C.(1978)“昆虫体寄生菌在农业生态系统中的应用”工业微生物发展20:97-104。Krieg,A.,A.M.Huger,G.A.Langenbruch,W.Schnetter(1983)Z.ang.Ent.96:500-508描述了据报道对鞘翅目的两种甲虫有活性的苏云金芽孢杆菌粉虫(tenebrionis)变种。它们是科罗拉多马铃薯甲虫--马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata)和杨树莹叶甲(Agelastica alni)。

最近，已鉴定了新的苏云金芽孢杆菌亚种，并分离了活性δ-内毒素蛋白的基因(Hofte,H.,H.R.Whiteley[1989]微生物学综述(Microbiological Reviews)52(2):242-255)。Hofte和Whiteley将苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因分类为4个主要类别。这些类别是CryⅠ(鳞翅目特异的)、CryⅡ(鳞翅目和双翅目特异的)、CryⅢ(鞘翅目特异的)和CryⅣ(双翅目特异的)。已经报道发现了对其它害虫特别有毒的菌株(Feitelson J.S.,J.Payne,L.Kim[1992]生物技术(Bio/Technology)10:271-275)。已建议用CryⅤ代表一类线虫特异的毒素基因。Lambert等人(Lambert B.,L.Buysse,C.Decock,S.Jansens,C.Piens,B.Saey,J.Seurinek,K.van Audenhove,J.van Rie,A.van Vliet,M,Peferoen[1996]应用与环境微生物(Appl.Environ.Microbiol.)62(1):80-86)和Shevelev等人([1993]FEBS Lett.336:79-82)描述了对鳞翅目有活性的Cry9毒素的表征。公开的PCT申请WO94/05771和WO94/24264也描述了对鳞翅目害虫有活性的苏云金芽孢杆菌分离株。Gleave等人([1991]JGM138:55-62)和Smulevitch等人([1991]FEBS Lett.293:25-26)也描述了苏云金芽孢杆菌毒素。现在也已鉴定了大量其它种类的苏云金芽孢杆菌基因。

Hofte和Whiteley对晶体蛋白的1989命名与分类方案是基于毒素的推断氨基酸序列和宿主范围。该系统适于覆盖14个不同种类的毒素基因，它们被分为5个主要类别。被测序的苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因的数量目前超过50个。也提出了一种只基于氨基酸同一性的修订的命名方案(Crickmore等人[1996]无脊椎动物病理学协会(Societyfor Invertebrate Pathology)，第29届年会，第3次国际苏云金芽孢杆菌讨论会，科多巴大学，科多巴，西班牙，1996年9月1-6日，摘要)。对除cytA和cytB之外的所有毒素基因保留了命名“cry”，即这是一种单独的类别。在第一级中用罗马数字替换阿拉伯数字，并去掉第三级中的括号。虽然有许多被重新分类，但除提及的之外仍保留了许多原来的名称。参见“苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白命名法的修订”，N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf,J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baurn和D.H.Dean，微生物学与分子生物学综述(Microbiology and Molecular Biology reviews)(1998)62卷：807-813；Crickmore,Zeigler,Feitelson,Schnepf,Van Rie,Lereclus,Baum和Dean，“苏云金芽孢杆菌毒素命名法”(1999)http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html。该系统使用可自由获得的软件应用程序CLUSTAL W和PHYLIP。PHYLIP程序包中的NEIGHBOR应用程序使用一种算术平均(UPGMA)算法。

由于对资源的广泛研究和投资，已授权了关于新苏云金芽孢杆菌分离株与苏云金芽孢杆菌分离株的新用途的其它专利。参见Feitelson等人，同上，综述。然而，新苏云金芽孢杆菌分离株的发现和已知苏云金芽孢杆菌分离株的新用途仍是一种根据经验的、不可预测的技术。

Favret和Yousten([1985]无脊椎动物病理学杂志(J.Invert.Path.)45:195-203)检测了侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)菌株的杀虫活性，但结论是，这些菌株所显示的低水平毒性表明这些菌株不是生物防治剂的潜在候选者。Montaldi和Roth(172细菌学杂志(J.Bac.)4；1990年4月；2168-2171页)对侧孢芽孢杆菌孢子囊的类芽孢体进行了电子显微镜检查。Bone等人(美国专利号5,045,314)报道所选侧孢芽孢杆菌菌株的芽孢抑制动物寄生线虫卵的孵化和/或幼虫的发育。Aronson等人(美国专利号5,055,293)描述了一种被称为P5的产芽孢的侧孢芽孢杆菌(ATCC53694)。在此用侧孢芽孢杆菌NRS-590作为阴性对照。Aronson等人假定侧孢芽孢杆菌P5能侵袭极幼的玉米根虫幼虫，造成立即或稍后的损害，或者能阻断玉米根虫对将其向根引导的信号的接收或应答。WO94/21795或WO96/10083描述了据说对某些害虫有活性的毒素。WO98/18932描述了对多种昆虫有活性的许多新的微生物毒素类型。在此也公开了多种探针和引物。Orlova等人(64应用与环境微生物学1998年7月7日，2723-2725页)报道，某些侧孢芽孢杆菌菌株的晶体内含物可潜在地用作防治蚊子的候选物。

苏云金芽孢杆菌毒素的成功农业应用的障碍包括昆虫对苏云金芽孢杆菌毒素抗性的发生。另外，某些昆虫难以用苏云金芽孢杆菌的作用防治。后者包括如棉铃象鼻虫和小地老虎的昆虫，及迄今已证明对苏云金芽孢杆菌δ-内毒素无明显敏感性的大多数种的成虫。尽管苏云金芽孢杆菌转基因植物技术中采用的抗性操作策略是十分有意义的，但仍极其需要发现能在植物中以适当水平成功表达，从而有效防治多种昆虫的基因。

                        发明概述

本发明涉及在非哺乳动物害虫，尤其是植物害虫的防治中有用的材料与方法。在一个实施方案中，本发明提供可从侧孢芽孢杆菌分离株中获得的新型杀虫毒素和毒素编码基因。在一个优选的实施方案中，靶害虫是玉米根虫。本发明的毒素包括能从所述侧孢芽孢杆菌菌株培养上清液中获得的热不稳定的可溶性毒素。本发明的毒素也包括可从这些菌株中获得的较小的热不稳定毒素。

本发明还提供编码本发明的毒素的核苷酸序列。本发明的核苷酸序列编码不同于以前所述毒素的毒素。本发明的核苷酸序列也能用于编码杀虫毒素的基因的鉴定与表征。

在本发明的一个实施方案中，能在引起微生物大量增殖的条件下培养所述芽孢杆菌分离株。处理微生物得到单链基因组核酸后，用根据本发明的核苷酸序列表征该DNA。用该方法扩增毒素编码基因的特征片段，从而确定毒素编码基因的存在。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及植物和植物细胞，其被转化后产生至少一种本发明的杀虫毒素，使得被转化的植物细胞在靶害虫所摄食的组织中表达杀虫毒素。另外，根据本发明也能使用毒素的混合物和/或组合。

用此处公开的遗传构建体对植物的转化能通过本领域技术人员所周知的技术实现，一般包括基因的修饰以优化毒素在植物中的表达。

                   序列简述

SEQ ID NO.1是一种MIS探针。

SEQ ID NO.2是一种WAR探针。

SEQ ID NO.3是一种MIS正向引物。

SEQ ID NO.4是一种MIS反向引物。

SEQ ID NO.5是来源于侧孢芽孢杆菌MB438菌株的MIS毒素基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO.6是来源于侧孢芽孢杆菌MB438菌株的MIS毒素基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO.7是来源于侧孢芽孢杆菌MB438菌株的MIS毒素的多肽序列。

SEQ ID NO.8是来源于侧孢芽孢杆菌MB438菌株的WAR毒素基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO.9是来源于侧孢芽孢杆菌MB438菌株的WAR毒素的多肽序列。

SEQ ID NO.10是来源于侧孢芽孢杆菌MB439菌株的MIS毒素的核苷酸序列。

                   发明详述

本发明涉及在非哺乳动物害虫，尤其是植物害虫的防治中有用的材料与方法。在一个实施方案中，本发明提供可从侧孢芽孢杆菌分离株中获得的新型杀虫毒素和毒素编码基因。在一个优选的实施方案中，靶害虫是玉米根虫。本发明的毒素包括能从所述侧孢芽孢杆菌菌株培养上清液中获得的热不稳定的可溶性毒素。下面详述了可从这些菌株中获得的MIS型和WAR型毒素。本发明的毒素也包括可从这些菌株中获得的较小的热不稳定毒素。

本发明还提供编码本发明的毒素的核苷酸序列。本发明的核苷酸序列编码不同于以前所述毒素的毒素。本发明的其它核苷酸序列也能在本领域中众所周知的诊断与分析方法中使用。例如，能用探针、引物和部分序列鉴定与表征编码杀虫毒素的基因。

在本发明的一个实施方案中，能在引起微生物大量增殖的条件下培养所述芽孢杆菌分离株。处理微生物得到单链基因组核酸后，用根据本发明的核苷酸序列表征该DNA。用该方法扩增毒素编码基因的特征片段，从而确定毒素编码基因的存在。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及植物细胞，其被转化后产生至少一种本发明的杀虫毒素，使得被转化的植物细胞在靶害虫所摄食的组织中表达杀虫毒素。另外，根据本发明也能使用毒素的混合物和/或组合。在某些优选的实施方案中，MIS毒素与WAR毒素一起使用。

用此处公开的遗传构建体对植物的转化能通过本领域技术人员所周知的技术实现，一般包括基因的修饰以优化毒素在植物中的表达。

根据本发明有用的分离株将保藏于农业研究机构保藏中心(NRRL)的永久保藏所，北方研究中心，1815North University Street，Peoria,Illinois61604，美国。培养物保藏号如下：

培养物	保藏号	保藏日期
			侧孢芽孢杆菌MB438	NRRL B-30085	1998年12月21日
侧孢芽孢杆菌MB439	NRRL B-30086	1998年12月21日
			大肠杆菌MR957(MB438克隆)	NRRL B-30048	1998年8月14日
苏云金芽孢杆菌PS177C8	NRRL B-21867	1997年10月24日

因本专利申请而保藏的培养物保藏于以下条件下，即，可确保依37CFR1.14和35U.S.C.122授权的专利商标局官员指定的人员在本专利申请未决期间能获得这些培养物。当提交本申请书的相应文本或其后续文本的国家的专利法需要时，这些保藏物应是可获得的。然而，应当理解，保藏物的可获得性不构成在政府机关承认的专利权失效后实施本发明的许可。

另外，所述培养保藏物应按照布达佩斯微生物保藏条约的规定贮存，且可为公众所获得，即，它们应贮存于使其在最近请求提供保藏样品后至少5年内，及在任何情况下，在保藏日期后至少30年内，或可公开培养物的任何专利的有效期内存活且不受污染所必需的条件下。保藏者应承认在保藏所因保藏条件而在请求时不能提供样品时替换保藏物的义务。对培养保藏物公开获得性的所有限制在公开它们的专利获准后不能撤回。

此处所指的分离株的突变体能通过本领域中众所周知的方法制备。例如，通过分离株的甲基磺酸乙酯(EMS)诱变能获得不产芽孢突变体。能通过本领域众所周知的方法用紫外线和亚硝基胍制备突变体。

在一个实施方案中，本发明涉及材料与方法，包括用于分离、表征和鉴定编码对非哺乳动物害虫有活性的蛋白质毒素的芽孢杆菌基因的核苷酸引物和探针。此处所述的核苷酸序列也能用来鉴定新的杀虫性芽孢杆菌分离株。本发明还涉及用此处公开的方法与材料鉴定的基因、分离株和毒素。

此处提供的新的毒素和多核苷酸序列根据几个参数来定义。此处所述的毒素的一个特征是杀虫活性。在一个具体实施方案中，这些毒素具有针对西方玉米根虫的活性。本发明的毒素和基因能按照氨基酸和核苷酸序列进一步定义。根据与例举的某些序列的同源性，以及根据与例举的某些探针和引物杂交的能力，或被其扩增的能力，能定义这些分子的序列。

在一个优选的实施方案中，本发明的MIS型毒素分子量为约70～约100kDa，最优选地这些毒素大小为约80kDa。一般而言，这些毒素是可溶的，并能如此处所述从芽孢杆菌培养上清液中获得。这些毒素对非哺乳动物害虫有毒性。在一个优选的实施方案中，这些毒素对西方玉米根虫有活性。MIS蛋白由于其在细胞中成孔的能力是尤其有用的。这些蛋白质能与第二种物质包括如其它蛋白质一起使用。当与第二种物质一起使用时，MIS蛋白可利于第二种物质向靶细胞中的进入。在一个优选的实施方案中，MIS蛋白与MIS受体在靶细胞中相互作用，导致靶细胞中孔的形成。这第二种物质可以是毒素或希望其进入细胞中的另一种分子。

本发明还涉及大小约为30-50kDa，最典型地大小约40kDa的WAR型毒素。一般而言，这些毒素是可溶的，并能如此处所述从芽孢杆菌培养上清液中获得。

能用此处所述的引物鉴定本发明的MIS型和WAR型毒素。

另一种特殊类型的毒素被确定为由本发明的芽孢杆菌菌株产生。这些毒素比本发明的MIS型和WAR型毒素更小。这些毒素，象MIS型WAR型毒素，是热不稳定的。但是，这些毒素的大致大小为约10kDa～约1kDa。这些毒素也是可溶的，并能如此处所述从芽孢杆菌培养上清液中获得。

根据此处所述，本领域技术人员应能容易地产生并应用此处所述的多种毒素和多核苷酸序列。

基因与毒素。如在此使用，术语“野生型毒素”和“野生型基因”是指所述分离株(MB438和MB439)自然产生的基因和毒素。本发明的基因和毒素不仅包括全长的野生型序列，而且包括这些序列的片段、变体、突变体和融合蛋白，它们保留了此处特别例举的毒素的特有杀虫活性。例如，美国专利号5,605,793描述了在随机断裂后利用DNA重装配产生其它分子多样性的方法。而且，能对此处特别例举的基因和毒素进行内部缺失，只要修饰毒素保留有杀虫活性。根据本发明的教导也可使用由超过一种芽孢杆菌毒素或基因的组合部分产生的嵌合基因和毒素。如在此使用，术语基因的“变体”或“变异”是指编码相同毒素或编码具有杀虫活性的相当毒素的核苷酸序列。如在此使用，术语“相当毒素”是指对靶害虫有与例举的毒素相同或基本相同的生物活性的毒素。

本领域技术人员应当明白，可通过几种方法鉴定并获得编码活性毒素的基因。此处例举的特异基因可从如上所述保藏于培养物保藏中心的分离株中获得。这些基因，或其部分或变体，也可用合成方法构建，例如，利用基因合成仪构建。利用产生点突变的标准技术可容易地构建基因的变异。也能按照标准方法用可商品获得的外切核酸酶或内切核酸酶制备这些基因的片段。例如，能用如Bal31的酶或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。编码活性片段的基因也可用多种限制酶获得。可用蛋白酶直接获得这些毒素的活性片段。

根据此处所述能由芽孢杆菌分离株和/或DNA文库产生相当毒素和/或编码这些相当毒素的基因。有大量方法可获得本发明的杀虫毒素。例如，此处公开并要求保护的杀虫毒素的抗体能用来从蛋白质混合物中鉴别并分离毒素。特别可制备针对最恒定且最不同于其它芽孢杆菌毒素的毒素部分的抗体。然后能用这些抗体通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)或Western印迹特异性鉴定具有特定活性的相当毒素。针对此处公开的毒素或相当毒素或这些毒素的片段的抗体能用本领域的标准方法容易地制备。然后能从微生物中获得编码这些毒素的基因。

保留了所例举毒素的杀虫活性的片段和相当物属于本发明的范围。由于遗传密码的丰余性，多种不同的DNA序列也能编码此处公开的氨基酸序列。本领域技术人员能较好地制备这些编码相同或基本相同毒素的DNA序列。这些变体DNA序列属于本发明的范围。如在此使用，“基本相同的”序列是指含有不显著影响杀虫活性的氨基酸置换、缺失、添加或插入的序列。该定义中也包括保留杀虫活性的片段。

鉴定本发明的毒素和基因的另一种方法是利用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。探针提供一种鉴定本发明的毒素编码基因的快速方法。用作本发明的探针的核苷酸片段能用DNA合成仪和标准方法合成。

在此已具体例举了本发明的某些毒素。由于这些毒素只是本发明的毒素的典型，所以应当明白，本发明包括具有与例举的毒素相同或相似杀虫活性的变体或相当毒素(和编码相当毒素的核苷酸序列)。相当毒素应与例举的毒素有氨基酸同源性。该氨基酸同一性一般大于60％，优选地大于75％，更优选地大于80％，更优选地大于90％，并能大于95％。这些同一性用标准对比技术测定，优选地如本说明书背景部分所述用Crickmore等人所用的技术测定。在决定生物活性或与决定最终影响生物活性的三维构型有关的毒素重要区域中，氨基酸同源性最高。就此而言，某些氨基酸置换是可接受的且可能是希望的，只要这些置换位于对于活性而言不重要的区域中，或是不影响分子三维构型的保守氨基酸置换。例如，氨基酸可属于下列类别：非极性、不带电荷极性、碱性和酸性。一种氨基酸被替换为相同类型的另一种氨基酸的保守置换属于本发明的范围，只要该置换基本上不显著改变化合物的生物活性。下面表1中列出的是分属每一类别的氨基酸的实例。

表1
	氨基酸类别                         氨基酸实例
非极性         Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp不带电荷极性       Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln酸性                        Asp、Glu碱性                      Lys、Arg、His

在某些情况中，也能进行非保守置换。关键因素在于这些置换必须不能明显降低毒素的生物活性。

如在此使用，“分离的”多核苷酸和/或“纯化的”毒素是指不与天然发现时所结合的其它分子相结合的这些分子。因此，“分离和纯化的”表示与如此处所述的“人工”有关。嵌合毒素和基因也与“人工”有关。

重组宿主。本发明的毒素编码基因能被引入多种微生物或植物宿主中。毒素基因的表达直接或间接地导致杀虫剂的产生和维持。优选植物宿主的转化。摄食表达毒素的重组植物的害虫由此接触毒素。通过合适的微生物宿主，如假单胞菌(Pseudomonas)，微生物能加到害虫所处位置，在此增殖并被摄食。利用任何不同方法，结果都将是害虫的防治。另外，在可延长毒素活性和稳定细胞的条件下，带有毒素基因的微生物能被杀死及处理。然后可将保留毒素活性的被处理细胞施用于靶害虫环境。通过经适当载体向微生物宿主中引入一种基因，然后将该宿主以存活状态应用于环境，也能应用芽孢杆菌毒素。

有多种方法可用于在能够稳定保持并表达基因的条件下向宿主中引入编码毒素的芽孢杆菌基因。这些方法为本领域技术人员所周知，如在美国专利号5,135,867中有述，其在此引用作为参考。

也能用功能上与本发明的毒素相当的合成基因转化宿主。例如，在美国专利号5,380,831中能找到产生合成基因的方法。在优选的实施方案中，为在植物中表达而优化本发明的基因。

细胞的处理。如上所述，能处理表达芽孢杆菌毒素的芽孢杆菌或重组细胞，以延长毒素活性并稳定细胞。形成的杀虫剂微囊体在一种细胞结构内包含芽孢杆菌毒素，当应用于靶害虫环境时它可稳定并保护毒素。合适的宿主细胞可包括原核生物或真核生物。作为宿主，特别有意义的是原核生物和低等真核生物，如真菌。当处理时，细胞通常是完整的，且基本上为增殖形式，而不是芽孢形式。

微生物细胞如含芽孢杆菌毒素基因的微生物细胞能通过化学或物理方法处理，或通过化学和/或物理方法的组合处理，只要该技术不能不利地影响毒素的性质，也不降低细胞保护毒素的能力。在美国专利号4,695,455和4,695,462中公开了微生物细胞的处理方法，在此引用作为参考。

防治害虫的方法与制剂。利用本发明的毒素和基因对害虫的防治能通过本领域技术人员周知的方法来实现。这些方法包括，例如，对害虫(或其位置)施用芽孢杆菌分离株，对害虫(或其位置)施用重组微生物，用编码本发明的杀虫毒素的基因转化植物。本领域技术人员能用标准技术进行转化。这些转化所必需的材料在此公开，或易于为技术人员所获得。

配制的含有引诱剂和芽孢杆菌分离株毒素的饵料颗粒，或含有可从此处公开的芽孢杆菌分离株中获得的基因的重组微生物，能施用于土壤。配制的产品也能用于种子包被或根处理或在种植周期后期时整个植物的处理。芽孢杆菌细胞的植物和土壤处理可通过与不同惰性材料如无机矿物质(页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物性材料(粉状玉米穗轴、稻壳、核桃壳等)混合，用作可湿性粉末、颗粒或粉剂。该制剂可包含粘展剂、稳定剂、其它杀虫添加剂或表面活性剂。液体制剂可以是水性的或非水性的，并可用作泡沫、凝胶、悬液、浓缩乳剂等。成份可包括流变剂、表面活性剂、乳剂、分散剂或聚合物。

本领域技术人员应当理解，杀虫浓度将随特定制剂的性质尤其因它是一种浓缩物还是直接使用而大大不同。杀虫剂至少为1％重量，并可达100％重量。干制剂为约1-95％杀虫剂重量，而液体制剂在液相时通常为约1-60％固体重量。含有细胞的制剂通常为约10²～约10⁴细胞/mg。这些制剂可以以每公顷约50mg(液体或干)～1kg或更多的量施用。

能通过喷雾、撒粉、喷洒等将这些制剂施用于害虫环境，如土壤和树叶。

多核苷酸探针。众所周知，DNA具有称为碱基互补的基本性质。实际上，DNA通常以反平行链对的形式存在，每条链上的碱基从该链向相对的链伸出。一条链上的碱基腺嘌呤(A)总是对应于另一条链上的碱基胸腺嘧啶(T)，而碱基鸟嘌呤对应于碱基胞嘧啶(C)。碱基由于其以这种特殊方式氢键键合的能力而保持并列。尽管每一单个键相对较弱，但许多相邻氢键键合碱基的净效应与碱基堆积效应一起可稳定连接两条互补链。这些键能被如高pH或高温的处理所打破，这些条件导致两条链的解离或“变性”。如果之后将DNA置于使碱基热力学上趋于氢键键合的条件下，则DNA链将退火，或“杂交”，并重新形成原来的双链DNA。如果在适当条件下进行，该杂交可能是高度特异的。即，只有高度碱基互补的链才能形成稳定的双链结构。杂交特异性与反应条件的关系众所周知。因此，可用杂交检测两种DNA碱基序列是否互补。该杂交机理利于用本发明的探针方便地检测和表征目的DNA序列。

探针可以是RNA、DNA或PNA(肽核酸)。探针通常有至少约10个碱基，更通常至少约17个碱基，并可有高达约100个碱基或更多。能方便地使用更长的探针，例如这些探针长度可为几千个碱基。探针序列设计为至少基本上互补于编码目的毒素的基因的一部分。探针不需要与杂交序列完全互补。探针可用本领域技术人员所周知的技术标记。

本发明使用探针的一种方法需要首先通过对芽孢杆菌分离株基因库的Southern印迹分析，鉴定与公开的核苷酸序列同源的所有DNA片段。因此，不借助于生物学分析，也能预先了解多种新芽孢杆菌分离株和特定芽孢杆菌分离株表达的个别基因产物的可能活性。这种探针分析提供了一种快速方法，用于在多种芽孢杆菌亚种中鉴定具有潜在商业价值的杀虫毒素基因。

根据本发明有用的一种杂交方法一般包括最初的分离目的DNA样品并化学纯化的步骤。能使用裂解的细菌或从细菌中分离的总分级分离核酸。能用已知技术处理细胞以释放其DNA(和/或RNA)。用合适的限制酶能将DNA样品切为片段。通过凝胶电泳通常为琼脂糖或丙烯酰胺电泳能按大小分离这些片段。并将目的片段转移到固定的膜上。

特定的杂交技术不是本发明的关键。由于杂交技术的改进，能容易地使用这些方法。

然后能在杂交缓冲溶液中使探针与样品结合，并在适当温度下保持直到发生退火。之后，洗涤该膜使之不含外源物质，一般通过放射自显影和/或液体闪烁计数检测，并定量样品和结合的探针分子。本领域中众所周知，如果探针分子和核酸样品通过在两种分子间形成强烈的非共价键而杂交，则可以合理地假定探针和样品基本上相同。探针的可检测标记提供了一种以已知方法确定是否发生杂交的方法。

在使用核苷酸片段作为探针时，用本领域技术人员周知的任何适当标记物，包括放射性和非放射性标记物，标记特定探针。典型的放射性标记包括³²P、³⁵S等。非放射性标记包括，例如，配体如生物素或甲状腺素，以及酶如水解酶或过氧化物酶，或不同的化学发光剂如萤光素，或荧光化合物如荧光素及其衍生物。如国际申请号WO93/16094所述可使探针固有荧光。

能使用不同程度的杂交严格性。条件越严格，双链体形成所需的互补性越强。通过温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间等能控制严格性。优选地，如Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)《DNA探针》,Stockton出版社，纽约，NY,169-170页所述，用本领域众所周知的技术在中等到高度严格条件下进行杂交。该信息在此引用作为参考。

如在此使用，杂交的“中等到高度严格”条件是指达到与本申请人所用条件相同或大致相同程度的杂交特异性的条件。此处提供了中等到高度严格条件的实例。特别用标准方法(Maniatis等人)进行Southern印迹中固定DNA与³²P标记基因特异性探针的杂交。通常在中等到高度严格条件下进行杂交和随后的洗涤，该条件使得可检测与例举的毒素基因有同源性的靶序列。对于双链DNA基因探针，在比DNA杂合体的解链温度(Tm)低20-25℃的温度下，在6×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中杂交过夜。解链温度以下列通式表述(Beltz,G.A.,K.A.Jacobs,T.H.Eickbush,P.T.Cherbas和F.C.Kafatos[1983]《酶学方法》,R.Wu,L.Grossman和K.Moldave[编]，学院出版社，纽约100:266-285)。

Tm=81.5℃+16.6Log[Na⁺]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/碱基对中双链体的长度。

洗涤一般如下进行：

(1)用1×SSPE、0.1％SDS室温洗两次15分钟(低严格性洗涤)。

(2)用0.2×SSPE、0.1％SDS在Tm-20℃下洗一次15分钟(中等严格性洗涤)。

对于寡核苷酸探针，在比杂合体的解链温度(Tm)低10-20℃的温度下，在6×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中杂交过夜。寡核苷酸探针的Tm由下列通式确定：

Tm(℃)=12(T/A碱基对数)+4(G/C碱基对数)(Suggs,S.V.,T.Miyake,E.H.Kawashime,M.J.Johnson,K.Itakura和R.B.Wallace[1981]ICN-UCLA symp.dev.Biol.Using Purified Genes,D.D.Brown[编]，学院出版社，纽约，23:683-693)。

洗涤一般如下进行：

(1)用1×SSPE、0.1％SDS室温洗两次15分钟(低严格性洗涤)。

(2)用1×SSPE、0.1％SDS在杂交温度下洗一次15分钟(中等严格性洗涤)。

通常，能改变盐和/或温度从而改变严格性。标记的DNA片段长度＞70个左右碱基时，能用下列条件：

低：1或2×SSPE，室温

低：1或2×SSPE,42℃

中：0.2×或1×SSPE,65℃

高：0.1×SSPE,65℃。

双链体形成和稳定性取决于杂合体两条链之间的基本互补性，并且如上所述，能允许某种程度的错配。因此，本发明的探针序列包括希望序列的突变(单和多)、缺失、插入，及其组合，其中该突变、插入和缺失使得能与目的多核苷酸形成稳定的杂合体。能用多种方法在特定多核苷酸序列中产生突变、插入和缺失，这些方法为技术人员所公知。其它方法在将来也可成为公知的。

因此，利用本领域技术人员周知的方法能容易地制备公开的核苷酸序列的突变、插入和缺失变体。这些变体能以与例举的引物序列相同的方法使用，只要这些变体与原始序列有基本的序列同源性。如在此使用，基本序列同源性是指足以使变异探针以与原始探针相同的能力起作用的同源性。优选地，这种同源性大于50％，更优选地，该同源性大于75％，最优选地，该同源性大于90％。变体以预期能力起作用所需的同源性或同一性的程度取决于序列的预期用途。本领域技术人员能进行突变、插入和缺失突变，用来提高序列的功能，或另外提供方法优点。

PCR技术。聚合酶链反应(PCR)是一种重复、酶促、引发的核酸序列合成。该方法众所周知，并且为本领域技术人员所常用(见Mullis，美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159；Saiki,Randall K.,Stephen Scharf,Fred Faloona,Kary B.,Mullis,Glenn T. Horn,HenryA.Erlich,Norman Arnheim[1985]“β-珠蛋白基因组序列的酶促扩增和限制位点分析，用于诊断镰状细胞贫血”，科学230:1350-1354)。PCR基于侧翼为两条可与靶序列相对链杂交的寡核苷酸引物的目的DNA片段的酶促扩增。引物用彼此指向的3’末端定向。模板热变性、引物与其互补序列的退火和用DNA聚合酶使退火引物延伸的重复循环，导致PCR引物5’端所限定的片段的扩增。由于每条引物的延伸产物能用作另一条引物的模板，所以每一循环基本上使前一循环产生的DNA片段的量加倍。这导致特异靶片段的指数积累，在几个小时后可达几百万倍。利用热稳定DNA聚合酶如从嗜热菌栖热水生菌(Thermusaquaticus)中获得的Taq聚合酶，扩增过程能完全自动化。可使用的其它酶为本领域技术人员所周知。

本发明的DNA序列能用作PCR扩增的引物。在进行PCR扩增时，可允许引物与模板之间的某种程度的错配。因此，所例举的引物的突变、缺失和插入(特别是核苷酸向5’端的添加)属于本发明的范围。利用技术人员周知的方法能在特定引物中产生突变、插入和缺失。

此处引用的所有参考文献均在此引入作为参考。

下面是说明实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应看作是限制。除非另外指明，否则所有百分数都是重量百分数，所有溶剂混合比例均为体积比。

实施例1-根据本发明有用的侧孢芽孢杆菌分离株的培养

天然侧孢芽孢杆菌菌株和表达侧孢芽孢杆菌MIS和WAR毒素的苏云金芽孢杆菌重组体在30℃和300转/分下在TB(+甘油)液体培养基中培养25小时。离心沉淀细胞，倾析出上清液(“SN”)并保存。加入EDTA至1mM，样品贮存于-20℃。在收获的同一天用新鲜样品进行生物测定。于4℃融解冷冻样品，离心沉淀并去除任何固体，然后用于生物测定或分级分离。实施例2-基因组DNA的制备和Southern印迹分析

从在Luria Bertani(LB)培养液中生长至600nm可见光下的光密度为0.5-0.8的不同侧孢芽孢杆菌菌株中制备总细胞DNA。根据针对革兰氏阳性菌的方法(Qiagen Inc.；Valencia,CA)用QiagenGenomic-tip 500/G试剂盒或Genomic-tip 20/G和基因组DNA缓冲液组提取DNA。制备的总基因组DNA用不同限制酶消化，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，用标准方法固定于支持尼龙膜上(Maniatis,T.,E.F.Fritsch,J.Sambrook[1982]《分子克隆：实验室指南》，冷泉港实验室，冷泉港，NY)。用³²p标记探针经标准Southern杂交或通过利用DIG核酸标记和检测系统的非放射性方法检测新型毒素基因(BoehringerMannheim；Indianapolis,IN)。

SEQ ID NO.1显示约2.6kbp的MIS探针。SEQ ID NO.2显示约1.3kbp的WAR探针。这些探针能用多种方法包括利用“基因机”制备，或者能从苏云金芽孢杆菌分离株PS177CB克隆，并用与各自基因的5’和3’端同源的引物PCR扩增。在后一情况中，凝胶纯化DNA片段，用³²p随机标记约25ng的每种DNA片段进行放射性检测。用DIGHigh Prime试剂盒随机标记约300ng的每种DNA片段进行非放射性检测。固定DNA与随机³²p标记的探针的杂交在标准的甲酰胺条件下进行：50％甲酰胺、5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、2％SDS、0.1mg/ml,42℃过夜。在低严格性下用2×SSC、0.1％SDS 42℃洗涤印迹，并对胶片曝光。

以下表2所示的是侧孢芽孢杆菌菌株MB438和MB439的总细胞DNA的限制片段长度多态性(RFLP)结果，其如述通过以MIS或WAR探针探查的Southern印迹分析测定。这些条带至少含有目的MIS样或WAR样操纵子的一个片段。

                                             表2

RFLP类别	菌株名称	MIS探针杂交带	WAR探针杂交带
				A	MB438	HindⅢ:8414；7871XbaⅠ:12972；8138	HindⅢ:7781；7364；2269XbaⅠ:12972；7871
B	MB439	HindⅢ:7871XbaⅠ:12972	HindⅢ:7364；2269XbaⅠ:12972

实施例3-毒素基因克隆

由大小为9-20kb的部分消化、大小分离的DNA制备侧孢芽孢杆菌菌株MB439或MB438的总基因组DNA的λ文库。确定使用1:10稀释的NdeⅡ酶(约0.5单位)的特异消化时间，以优化希望大小的消化DNA。DNA消化适当时间，然后经0.7％琼脂糖凝胶分级分离。用溴化乙锭染色显示DNA，从凝胶上切下大小为9-20kb的DNA。将凝胶片段与2ml 10mM Tris-HCl、1mM EDTA缓冲液pH8.0(TE)一起置入透析管中(12-14000MW界值)。在大约30mA下用0.1×TAE缓冲液从该凝胶片段上电洗脱DNA1小时。从管中移出溶于TE缓冲液的DNA，并用Elutip柱及方案(Schleicher和Schuell；Keene,NH)纯化。乙醇沉淀纯化的DNA，重悬浮于10μl TE中。

按照方案将纯化、分级分离的DNA与λ-GEM-11BamHI消化的臂(Promega Corp.,Madison,WI)连接。然后按照方案用GigapackⅢGold包装提取物(Stratagene Corp.,La Jolla,CA)将连接的DNA包装于λ噬菌体中。用包装提取物感染大肠杆菌菌株KW251，并平板接种于LB平板的LB顶层琼脂中。噬斑转移到硝酸纤维素膜上，并准备用标准方法杂交(Maniatis等人，同上)。制备³²P标记的探针(见上)，如上所述杂交并洗涤滤膜。通过将滤膜暴露于Kodak XAR-5胶片显示含有希望克隆的噬斑。从平板上分离噬斑，将噬菌体从琼脂中重悬浮于转移到SM缓冲液中。用LambdaSorb噬菌体吸收剂(Promega,Madison,WI)制备噬菌体的DNA。用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4作为引物对噬菌体DNA进行PCR，以证实其含有靶操纵子。两个DNA样品的PCR反应都产生一条1kb的带，再次证实这些克隆含有mis型基因。为了鉴定之后能被亚克隆到细菌载体中进一步分析并表达的含有目的操纵子的较小片段，用不同酶消化噬菌体DNA，经1％琼脂糖凝胶分级分离，并进行Southern印迹分析。Southern分析如上所述进行。对MB438鉴定大小约为10kb的HincⅡ片段。凝胶纯化该片段，并克隆到pBluescriptⅡ(SK+)的EcoRⅤ位点；产生的质粒被命名为pMYC2608，含有该质粒的重组大肠杆菌菌株被命名为MR957。实施例4-MB438 MIS和WAR基因的测序

对PCR扩增的DNA片段测定MB438mis基因的部分DNA序列。用MIS引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)对MB438和MB439的总细胞基因组DNA进行PCR。MB438产生一条大约1kbp的DNA片段，随后如厂商(Invitrogen,San Diego,CA)所述将其克隆到PCRDNATA克隆质粒载体pCR2.1中。从MB438PCR的重组克隆中分离质粒，用质粒载体引物T3和T7经PCR检测约1kbp插入片段的存在与否。如厂商所述用QIAGEN(Santa Clarita,CA)miniprep试剂盒分离含有该插入片段的质粒，用作测序模板。用PE Applied Biosystems的染料终止循环测序快速反应试剂盒进行测序反应。在ABI PRISM377自动测序仪上进行测序反应。用PE ABI的ABI PRISM377收集、制作、自动组接软件收集、编辑、组接序列数据。MB438mis型基因的部分核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

通过组接pMYC2608的随机限制片段的序列数据并通过引物步移pMYC2608中的DNA插入片段确定MB438MIS和WAR基因的完整序列。通过用多接头限制酶NotⅠ和ApaⅠ从载体上酶切分离质粒pMYC2608的插入DNA，经0.7％琼脂糖凝胶分级分离，并用QiaexⅡ试剂盒(Qiagen Inc.；Valencia,CA)从琼脂糖凝胶中纯化。然后用限制酶AluⅠ、MseⅠ和RsaⅠ消化凝胶纯化的插入DNA，经1％琼脂糖凝胶分级分离。从凝胶上切下0.5-1.5kb的DNA片段，用QiaexⅡ试剂盒纯化。回收的片段与EcoRⅤ消化的pBluescriptⅡ连接，并转化XL10Gold细胞。从随机选择的转化子中制备miniprep DNA，用NotⅠ和ApaⅠ消化以证实插入片段并用于测序。用dRhodamine测序试剂盒(ABI Prism/Perkein Elmer Applied Biosystems)进行测序反应。按照手册(ABI Prism)在测序凝胶上电泳序列，用制作与自动组接程序(ABI Prism)分析。MB438mis基因的完整核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；推断的MB438MIS肽序列如SEQ ID NO.7所示。MB438war基因的完整核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；推断的MB438WAR肽序列如SEQ ID NO.9所示。

由PCR扩增的DNA片段测定MB439mis基因的部分DNA序列。使用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4对MB439的总细胞基因组DNA进行PCR。获得约1kbp的DNA片段，随后如厂商(Invitrogen,San Diego,CA)所述将其克隆到PCR DNA TA克隆质粒载体pCR-TOPO中。从MB439PCR的重组克隆中分离质粒，用质粒载体引物T3和T7经PCR确定约1kbp的插入片段的存在与否。然后如厂商所述用QIAGEN(Santa Clarita,CA)miniprep试剂盒分离含有该插入片段的质粒用作测序模板。应用PE Applied Biosystems的染料终止循环测序快速反应试剂盒进行测序反应。在ABI PRISM377自动测序仪上进行测序反应。用PE ABI的ABI PRISM377收集、制作、自动组接软件收集、编辑、组接序列数据。MB439mis型基因的部分核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。实施例5-亚克隆MB438MIS和WAR毒素以在苏云金芽孢杆菌中表达

通过将克隆的pMYC2608的基因组DNA片段亚克隆到能在大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌宿主中复制的高拷贝数穿梭载体中，实现MB438MIS和WAR毒素在苏云金芽孢杆菌中的表达。穿梭载体pMYC2614是pHT370(O.Arantes和D.Lereclus,1991，基因108:115-119)的一种修饰形式，其含有pBluescriptⅡ(Stratagene)的多克隆位点区。用NotⅠ和ApaⅠ限制酶从pMYC2608上切下含有war和mis基因的基因组DNA插入片段，凝胶纯化，连接于pMYC2614的NotⅠ和ApaⅠ位点。产生的苏云金芽孢杆菌穿梭质粒被命名为pMYC2609。

为了检测苏云金芽孢杆菌中MB438毒素基因的表达，经电穿孔用pMYC2609转化不结晶的(Cry-)苏云金芽孢杆菌宿主CryB(A.Aronson,Purdue University,West Lafayette,IN)。将该重组菌株命名为MR557。通过用针对PS177C8 WAR毒素的抗体免疫印迹，证明WAR毒素的表达。如以下实施例8所述对西方玉米根虫测定MR557的培养上清液和细胞沉淀制品。实施例6-MB438和MB439的西方玉米根虫生物测定

以215μl/1.36cm²的速度将如实施例1所述制备的上清液样品施加于人造食物中。然后用新生的西方玉米根虫感染这些制品，并在暗处于25℃下保持4天。除非另外指明，否则在感染后第4天测定样品的死亡率。

表3涉及MB438和MB439的时程。MB438和MB439显示在22-30小时(MB438)和24-39小时(MB439)左右出现活性。所有菌株都在TBG培养基上生长。未加热处理这些样品中的任一个。

                                             表3

菌株	小时	％死亡率	#死亡	总数
					MB438	24	6％	2	36
MB438	26	6％	2	35
					MB438	30	100％	39	39
MB438	32	100％	41	41
					MB438	48	72％	26	36
MB438	16	21％	6	29
					MB438	18	18％	7	38
MB438	22	92％	35	38
					MB438	24	93％	27	29
MB438	39	100％	28	28
					MB439	20	19％	10	54
MB439	24	76％	26	34
					MB439	28	93％	26	28
MB439	44	100％	28	28
					MB439	16	11％	3	28
MB439	18	8％	3	36
					MB439	22	3％	1	36
MB439	24	14％	4	28
					MB439	39	100％	30	30

表4报告的结果表明，加热消除了24小时和48小时培养的MB438和MB439的新鲜、未加热样品所表现的大部分或全部活性。

                                       表4

菌株	加热？	小时	培养基	％死亡率	#死亡	总数
							MB438	否	24	TBG	88％	36	41
MB438	是	24	TBG	22％	11	49
							MB438	否	24	TBG	91％	29	32
MB438	是	24	TBG	6％	2	35
							MB438	否	24	N/A	78％	25	32
MB438	是	24	N/A	23％	6	26
							MB439	否	24	TBG	71％	30	42
MB439	是	24	TBG	16％	7	45
							MB439	否	24	TBG	93％	40	43
MB439	是	24	TBG	17％	4	24
							MB439	否	24	TBG	100％	50	50
MB439	是	24	TBG	19％	8	43
							MB439	否	48	TBG	98％	47	48
MB439	是	48	TBG	20％	7	35
							MB439	否	24	TBG	83％	45	54
MB439	是	24	TBG	4％	2	52
							MB439	否	48	TBG	85％	41	48
MB439	是	48	TBG	12％	6	51
							MB439	否	24	TBG	91％	43	47
MB439	是	24	TBG	11％	5	47
							MB439	否	48	TBG	97％	30	31
MB439	是	48	TBG	16％	7	44

表5报告的结果表明，MB438和MB439的活性是剂量反应性的。所有菌株都在TBG培养基上生长。未加热处理这些样品中的任一个。所有样品均为24小时培养物。

                                         表5

菌株	稀释度	％死亡率	#死亡	总数
					MB438	-20℃贮存的上清液	96％	27	28
MB438	0.25×	93％	25	27
					MB438	0.125×	83％	24	29
MB438	0.0625×	67％	24	35
					MB438	0.03125×	45％	13	29
MB439	-20℃贮存的上清液	97％	34	35
					MB439	0.25×稀释的全部上清液	83％	24	29
MB439	0.125×稀释的全部上清液	77％	24	31
					MB439	0.0625×稀释的全部上清液	69％	24	35
MB439	0.03125×稀释的全部上清液	55％	21	38

实施例7-分级分离的样品的西方玉米根虫生物测定

对于透析的样品，将培养上清液等份转移至纤维素透析管中，并在4℃搅拌过夜下对25mM NaPO4、1mM EDTA,pH7透析。这可除去小于透析膜标称分子量界值的上清液的任何自由流动成分。孔大小为6-8kD和50kD，对这些样品检查保留于透析膜内的成分的活性，其可称为高分子量”。

在4℃下以氮气压通过1、3或10kD孔大小的膜进行超滤(“UF”)，产生低分子量级分。该方法产生含有小于超滤膜标称分子量界值的上清液成分的溶液。这些溶液被称为透过物”。

表6报告的结果表明，MB438和MB439的低于10kD的成分显示活性。所有样品都在TBG培养基上生长。未加热处理任一种样品。所有样品均为24小时培养物。

                                       表6

菌株	处理	％死亡率	#死亡	总数
					MB438	MB438 4℃贮存的上清液	92％	24	26
MB438	MB438超滤膜，10kD分子量界值	41％	15	37
					MB439	MB439 4℃贮存的上清液	64％	30	47
MB439	超滤透过物，10kD分子量界值	52％	17	33

表7报告的结果表明，MB438和MB439的＜10kD成分显示可被高热降低的活性，而透析后低分子量成分的去除不能降低活性。所有样品均为在TBG培养基上生长的24小时培养物。

                                               表7

菌株	加热？	处理	％死亡率	#死亡	总数
						MB438	否	4℃贮存的上清液	97％	30	31
MB438	否	10kD超滤透过物	51％	20	39
						MB438	是	10kD超滤透过物，高压灭菌	16％	6	38
MB438	否	透析过夜的上清液，6-8kD	94％	45	48
						MB438	否	透析过夜的上清液，50kD	84％	37	44
MB439	否	-20℃贮存的上清液	98％	40	41
						MB439	否	10kD超滤透过物	28％	11	40
MB439	是	10kD超滤透过物，高压灭菌	16％	5	31
						MB439	否	透析过夜的上清液，6-8kD	76％	35	46
MB439	否	透析过夜的上清液，50kD	55％	22	40

表8报告的结果表明，MB438和MB439在不能通过1kD超滤膜的低于10kD的成分中具有活性。所有样品均为在TBG培养基上生长的24小时培养物。

                                            表8

菌株	加热？	处理	％死亡率	#死亡	总数
						MB438	否	-20℃贮存的上清液	100％	32	32
MB438	是	-20℃贮存的上清液，高压灭菌	57％	20	35
						MB438	否	10kD分子量界值超滤透过物	78％	25	32
MB438	是	10kD分子量界值超滤透过物，高压灭菌	50％	14	28
						MB438	否	3kD分子量界值超滤透过物	59％	20	34
MB438	是	3kD mwco超滤透过物，高压灭菌	45％	14	31
						MB438	否	1kD分子量界值超滤透过物	31％	23	75
MB438	是	1kD分子量界值超滤透过物，高压灭菌	12％	5	43
						MB439	否	-20℃贮存的上清液	93％	27	29
MB439	是	-20℃贮存的上清液，高压灭菌	34％	12	35
						MB439	否	10kD分子量界值超滤透过物	62％	21	34
MB439	是	10kD分子量界值超滤透过物，高压灭菌	44％	18	41
						MB439	否	3kD分子量界值超滤透过物	20％	6	30
MB439	是	3kD分子量界值超滤透过物，高压灭菌	33％	10	30
						MB439	否	1kD分子量界值超滤透过物	20％	16	82
MB439	是	1kD分子量界值超滤透过物，高压灭菌	15％	6	41

实施例8-MR957和MR557的生物活性

MR957培养物在16×150mm带盖塑料管中的5.0ml培养基(DifcoTB预混合物；4g/升甘油)中生长。培养物于37℃下在滚筒上摇动24小时。离心沉淀细胞，倾析出上清液并保存。加入EDTA至1mM，样品贮存于20℃。为进行细胞密度的测定，振荡样品，并将100μl每种培养液转移到Falcon管(14mL；17×100mm)中。向每一管中加入4.9mL蒸馏水进行1∶50稀释，并再次振荡。用分光光度计在600nm下进行OD读取。如实施例1所述培养重组苏云金芽孢杆菌菌株。

用基本同实施例6所述的实验设计对大肠杆菌克隆MR957和苏云金芽孢杆菌克隆MR557(每种均含有MB438mis和war基因)进行西方玉米根虫生物测定。MR948和MR539是含有无毒素基因插入片段的克隆载体的阴性对照菌株。为测定大肠杆菌菌株，以215μl/1.36cm²的剂量将上清液或整个培养样品加于食物表面，而细胞沉淀样品浓缩5倍，并以50ul/1.36cm²的剂量加于食物表面(表9)。为测定苏云金芽孢杆菌菌株，以215μl/1.36cm²的剂量将上清液样品加于食物表面，而细胞沉淀样品浓缩5倍，并以不同的速度加于食物上(表10)。待样品蒸发后立即向食物上转移约6-8个幼虫。使用钉板熨斗用聚酯薄膜密封生物测定平板，并在每个孔上打一针眼以利于气体交换。包埋4天后测定死亡率。

这两个实验的结果证明了可归因于克隆的MB438mis和war基因的较高CRW死亡率。表9显示了大肠杆菌培养物粗制品中克隆的MB438毒素对西方玉米根虫的定性活性。

                                       表9

克隆	毒素	整个培养物	上清液	5×沉淀
					MR948	MB438 MIS和WAR	18(146/824)	15(135/814)	13(110/832)
MR957	无	56(468/827)	54(437/830)	77(618/812)

表10显示苏云金芽孢杆菌培养物粗制品中克隆的MB438毒素对西方玉米根虫的剂量依赖的活性。在表9和表10中，下划线的数字是百分死亡率；括号中的数字是指试验中死亡的幼虫除以总幼虫数。

                                           表10

克隆	毒素	上清液	沉淀5×	沉淀5×	沉淀5×
								215μl/1.36cm2	200μl/1.36cm2	～200μl/1.36cm2	50μl/1.36cm2
MR557	MB438 MIS和WAR	94(45/48)	92(35/38)	47(20/43)	34(19/56)
						MR539	无	33(15/45)	35(17/49)	21(11/53)	7(4/59)

实施例9-毒素基因向植物中的插入

本发明的一个方面是用编码本发明的杀虫毒素的基因对植物的转化。被转化的植物可耐受靶害虫的侵害。

能用本领域中众所周知的多种技术将如此处公开的编码杀虫毒素的基因插入植物细胞中。这些技术包括用根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化体用T-DNA转化、融合、注射、biolistic(微粒轰击)或电穿孔及其它可能的方法。

如果用农杆菌转化，则必须将欲插入的DNA克隆到特定质粒中，即中间载体或二元载体中。通过与T-DNA序列同源的序列的同源重组，能将中间载体整合到Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒也含有T-DNA转移所需的vir区。中间载体本身不能在农杆菌中复制。利用辅助质粒(接合)能将中间载体转移到根瘤农杆菌中。二元载体本身能在大肠杆菌和农杆菌中复制。它们含有处于左右T-DNA边界区之间的一种选择性标记基因和一种接头或多接头。它们可被直接转化到农杆菌中(Holsters等人[1978]分子与普通遗传学163:181-187)。用作宿主细胞的农杆菌应含有一种携带vir区的质粒。vir区是向植物细胞中转移T-DNA所必需的。也可含有其它T-DNA。这样转化的农杆菌用于植物细胞的转化。为了向植物细胞中转移DNA，能方便地将植物外植体与根瘤农杆菌或毛根农杆菌一起培养。然后在可含有用于筛选的抗生素或杀生物剂的适当培养基中，由被感染的植物材料(例如叶切片、茎切片、根，以及原生质体，或悬浮培养细胞)再生为完整的植物。然后可检测这样得到的植物是否存在插入的DNA。

在注射和电穿孔中对质粒没有特殊要求。能使用普通质粒，如pUC衍生物。在biolistie转化中，能使用质粒DNA或线性DNA。

含有大肠杆菌复制系统和允许筛选转化细胞的标记的多种克隆载体可用于准备向高等植物中插入外源基因。这些载体包括，例如，pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，能将编码芽孢杆菌毒素的序列插入载体的适当限制酶切位点处。用产生的质粒转化大肠杆菌。大肠杆菌细胞在适当的营养培养基中培养，然后收获并裂解。回收该质粒。通常采用序列分析、限制酶切分析、电泳和其它生物化学-分子生物学方法作为分析方法。每一操作后，能酶切使用的DNA序列，并与下一个DNA序列连接。每种质粒序列都能被克隆到同一或其它质粒中。根据向植物细胞中插入希望的基因的方法，其它DNA序列可能是必需的。例如，如果用Ti或Ri质粒转化植物细胞，则Ti或Ri质粒T-DNA的至少右边界，但通常是左右边界必须作为欲插入基因的侧翼区连接。

T-DNA在植物细胞转化中的应用已进行了大量研究，描述于EP120 516；Hoekema(1985),《二元植物载体系统》OffsetdrukkerijKanters B.V.,Alblasserdam，第5章；Fraley等人，植物科学评述(Crit.Rev.Plant Sci.)4:1-46；和An等人(1985)EMBO J.4:277-287。

插入的DNA整合到基因组中后，相对稳定于此，并且通常不再移出。其通常含有一种选择性标记，该选择性标记赋予被转化的植物细胞对杀生物剂或抗生素尤其如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或膦丝菌素的抗性。因此单个使用的标记应使得能筛选出除不含插入DNA的细胞之外的转化细胞。

转化细胞以常规方式再生为形态学正常的植物。如果转化事件涉及种系细胞，则插入的DNA和相应的表型性状将遗传给子代植物。这些植物能以正常的方式生长，并与具有相同转化遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。产生的杂种个体具有相应的表型特性。

在本发明的一个优选实施方案中，能用已为植物优化了密码子选择的基因转化植物。参见，例如，美国专利号5,380,831。

应当理解，此处所述的实施例和实施方案只是用于说明目的，可为本领域技术人员建议根据它们的多种修改或改变，其包括于本说明书和以下权利要求书的精神和范围之内。

                     序列表<110>申请人姓名：MYCOGEN公司

街道地址：5501Oberlin Drive

城市：San Diego

州/省：加利福尼亚

国家：美国

邮政编码：92121

电话：(800)745-7475

传真：(619)453-0142<120>来自侧孢芽孢杆菌的杀虫毒素和基因<130>MA-719XC2<140><141><150>60/095,955<151>1998-08-10<150>60/138,251<151>1999-06-08<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2645<212>DNA<212>侧孢芽孢杆菌<400>1atgaagaaga agttagcaag tgttgtaacg tgtacgttat tagctcctat gtttttgaat 60ggaaatgtga atgctgttta cgcagacagc aaaacaaatc aaatttctac aacacagaaa 120aatcaacaga aagagatgga ccgaaaagga ttacttgggt attatttcaa aggaaaagat 180tttagtaatc ttactatgtt tgcaccgaca cgtgatagta ctcttattta tgatcaacaa 240acagcaaata aactattaga taaaaaacaa caagaatatc agtctattcg ttggattggt 300ttgattcaga gtaaagaaac gggagatttc acatttaact tatctgagga tgaacaggca 360attatagaaa tcaatgggaa aattatttct aataaaggga aagaaaagca agttgtccat 420ttagaaaaag gaaaattagt tccaatcaaa atagagtatc aatcagatac aaaatttaat 480attgacagta aaacatttaa agaacttaaa ttatttaaaa tagatagtca aaaccaaccc 540cagcaagtcc agcaagatga actgagaaat cctgaattta acaagaaaga atcacaggaa 600ttcttagcga aaccatcgaa aataaatctt ttcactcaaa aaatgaaaag ggaaattgat 660gaagacacgg atacggatgg ggactctatt cctgaccttt gggaagaaaa tgggtatacg 720attcaaaata gaatcgctgt aaagtgggac gattctytag caagtaaagg gtatacgaaa 780tttgtttcaa atccgctaga aagtcacaca gttggtgatc cttatacaga ttatgaaaag 840gcagcaagag acctagattt gtcaaatgca aaggaaacgt ttaacccatt ggtagctgct 900tttccaagtg tgaatgttag tatggaaaag gtgatattat caccaaatga aaatttatcc 960aatagtgtag agtctcattc atccacgaat tggtcttata caaatacaga aggtgcttct 1020gttgaagcgg ggattggacc aaaaggtatt tcgttcggag ttagcgtaaa ctatcaacac 1080tctgaaacag ttgcacaaga atggggaaca tctacaggaa atacttcgca attcaatacg 1140gcttcagcgg gatatttaaa tgcaaatgtt cgatataaca atgtaggaac tggtgccatc 1200tacgatgtaa aacctacaac aagttttgta ttaaataacg atactatcgc aactattacg 1260gcgaaatcta attctacagc cttaaatata tctcctggag aaagttaccc gaaaaaagga 1320caaaatggaa tcgcaataac atcaatggat gattttaatt cccatccgat tacattaaat 1380aaaaaacaag tagataatct gctaaataat aaacctatga tgttggaaac aaaccaaaca 1440gatggtgttt ataagataaa agatacacat ggaaatatag taactggcgg agaatggaat 1500ggtgtcatac aacaaatcaa ggctaaaaca gcgtctatta ttgtggatga tggggaacgt 1560gtagcagaaa aacgtgtagc ggcaaaagat tatgaaaatc cagaagataa aacaccgtct 1620ttaactttaa aagatgccct gaagctttca tatccagatg aaataaaaga aatagaggga 1680ttattatatt ataaaaacaa accgatatac gaatcgagcg ttatgactta cttagatgaa 1740aatacagcaa aagaagtgac caaacaatta aatgatacca ctgggaaatt taaagatgta 1800agtcatttat atgatgtaaa actgactcca aaaatgaatg ttacaatcaa attgtctata 1860ctttatgata atgctgagtc taatgataac tcaattggta aatggacaaa cacaaatatt 1920gtttcaggtg gaaataacgg aaaaaaacaa tattcttcta ataatccgga tgctaatttg 1980acattaaata cagatgctca agaaaaatta aataaaaatc gtactattat ataagtttat 2040atatgaagtc agaaaaaaac acacaatgtg agattactat agatggggag atttatccga 2100tcactacaaa aacagtgaat gtgaataaag acaattacaa aagattagat attatagctc 2160ataatataaa aagtaatcca atttcttcaa ttcatattaa aacgaatgat gaaataactt 2220tattttggga tgatatttct ataacagatg tagcatcaat aaaaccggaa aatttaacag 2280attcagaaat taaacagatt tatagtaggt atggtattaa gttagaagat ggaatcctta 2340ttgataaaaa aggtgggatt cattatggtg aatttattaa tgaagctagt tttaatattg 2400aaccattgca aaattatgtg acaaaatata aagttactta tagtagtgag ttaggacaaa 2460acgtgagtga tacacttgaa agtgataaaa tttacaagga tgggacaatt aaatttgatt 2520ttacaaaata tagtraaaat gaacaaggat tattttatga cagtggatta aattgggact 2580ttaaaattaa tgctattact tatgatggta aagagatgaa tgtttttcat agatataata 2640aatag                                                             2645<210>2<211>1341<212>DNA<213>侧孢芽孢杆菌<400>2atgtttatgg tttctaaaaa attacaagta gttactaaaa ctgtattgct tagtacagtt 60ttctctatat ctttattaaa taatgaagtg ataaaagctg aacaattaaa tataaattct 120caaagtaaat atactaactt gcaaaatcta aaaatcactg acaaggtaga ggattttaaa 180gaagataagg aaaaagcgaa agaatggggg aaagaaaaag aaaaagagtg gaaactaact 240gctactgaaa aaggaaaaat gaataatttt ttagataata aaaatgatat aaagacaaat 300tataaagaaa ttactttttc tatggcaggc tcatttgaag atgaaataaa agatttaaaa 360gaaattgata agatgtttga taaaaccaat ctatcaaatt ctattatcac ctataaaaat 420gtggaaccga caacaattgg atttaataaa tctttaacag aaggtaatac gattaattct 480gatgcaatgg cacagtttaa agaacaattt ttagataggg atattaagtt tgatagttat 540ctagatacgc atttaactgc tcaacaagtt tccagtaaag aaagagttat tttgaaggtt 600acggttccga gtgggaaagg ttctactact ccaacaaaag caggtgtcat tttaaataat 660agtgaataca aaatgctcat tgataatggg tatatggtcc atgtagataa ggtatcaaaa 720gtggtgaaaa aaggggtgga gtgcttacaa attgaaggga ctttaaaaaa gagtcttgac 780tttaaaaatg atataaatgc tgaagcgcat agctggggta tgaagaatta tgaagagtgg 840gctaaagatt taaccgattc gcaaagggaa gctttagatg ggtatgctag gcaagattat 900aaagaaatca ataattattt aagaaatcaa ggcggaagtg gaaatgaaaa actagatgct 960caaataaaaa atatttctga tgctttaggg aagaaaccaa taccggaaaa tattactgtg 1020tatagatggt gtggcatgcc ggaatttggt tatcaaatta gtgatccgtt accttcttta 1080aaagattttg aagaacaatt tttaaataca atcaaagaag acaaaggata tatgagtaca 1140agcttatcga gtgaacgtct tgcagctttt ggatctagaa aaattatatt acgattacaa 1200gttccgaaag gaagtacggg tgcgtattta agtgccattg gtggatttgc aagtgaaaaa 1260gagatcctac ttgataaaga tagtaaatat catattgata aagtaacaga ggtaattatt 1320aaggtgttaa gcgatatgta g                                           1341<210>3<211>20<212>DNA<213>侧孢芽孢杆菌<400>3ggrttam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         20                  25                  30Asn Gln Thr Asn Gln Leu Ser Thr Ala Gln Glu Asn Gln Glu Lys Glu

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    115                 120                 125Thr Lys Thr Ile Ser His Lys Gly Gln Asn Lys Gln Val Val His Leu

130                 135                 140Glu Lys Gly Lys Leu Val Pro Ile Lys Ile Glu Tyr Gln Pro Asp Gln145                 150                 155                 160Ile Val Asn Arg Asp Ser Lys Ile Phe Lys Glu Phe Lys Leu Phe Lys

            165                 170                 175Val Asp Ser Lys Gln Gln Ser His Gln Val Gln Leu Asp Glu Leu Arg

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        340                 345                  350Ser Tyr Gly Val Ser Ala Asn Tyr Gln His Ser Glu Thr Val Ala Lys

    355                  360                 365Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gln Phe Asn Thr Ala Ser

370                 375                 380Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr Gly385                 390                 395                 400Ala Ile Tyr Glu Val Lys Pro Thr Thr Gly Phe Val Leu Asp Asn Asp

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    435                 440                 445Asn Thr Met Asp Asp Phe Asn Ser His Pro Ile Thr Leu Asn Lys Gln

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         20                  25                  30Gln Leu Asn Met Asn Ser Gln Ile Lys Tyr Pro Asn Phe Gln Asn Ile

     35                  40                  45Asn Ile Ala Asp Lys Pro Val Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala

 50                  55                  60Arg Glu Trp Gly Lys Glu Lys Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Val Thr65                  70                  75                  80Glu Lys Gly Lys Ile Asn Asp Phe Leu Asp Asp Lys Asp Gly Leu Lys

             85                  90                  95Thr Lys Tyr Lys Glu Ile Asn Phe Ser Lys Asn Phe Glu Tyr Glu Thr

        100                 105                 110GluLeu Lys Glu Leu Glu Lys Ile Asn Thr Met Leu Asp Lys Ala Asn

   115                 120                 125Leu Thr Asn Ser Ile Val Thr Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr Thr Ile

130                 135                 140Gly Phe Asn Gln Ser Leu Ile Glu Gly Asn Gln Ile Asn Ala Glu Ala145                 150                 155                 160Gln Gln Lys Phe Lys Glu Gln Phe Leu Gly Gln Asp Ile Lys Phe Asp

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    195                 200                 205Thr Lys Ala Gly Val Val Leu Asn Asn Asn Glu Tyr Lys Met Leu Ile

210                 215                 220Asp Asn Gly Tyr Val Leu His Val Glu Asn Ile Thr Lys Val Val Lys225                 230                 235                 240Lys Gly Gln Glu Cys Leu Gln Val Glu Gly Thr Leu Lys Lys Ser Leu

            245                 250                 255Asp Phe Lys Asn Asp Ser Asp Gly Lys Gly AspSer Trp Gly Lys Lys

        260                 265                270Asn Tyr Lys Glu Trp Ser Asp Thr Leu Thr Thr Asp Gln Arg Lys Asp

    275                 280                 285

Leu Asn Asp Tyr Gly Val Arg Gly Tyr Thr Glu Ile Asn Lys Tyr Leu

290                 295                 300Arg Glu Gly Asp Thr Gly Asn Thr Glu Leu Glu Glu Lys Ile Lys Asn305                 310                 315                 320Ile Ser Asp Ala Leu Glu Lys Asn Pro Ile Pro Glu Asn Ile Thr Val

            325                 330                 335Tyr Arg Tyr Cys Gly Met Ala Glu Phe Gly Tyr Pro Ile Lys Pro Glu

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    355                 360                 365Glu Glu Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Asp Ala Thr Ser

370                 375                 380Phe Gly Ala Arg Lys Ile Ile Leu Arg Leu Gln Val Pro Lys Gly Ser385                 390                 395                 400Ser Gly Ala Tyr Val Ala Gly Leu Asp Gly Phe Lys Pro Ala Glu Lys

            405                 410                 415Glu Ile Leu Ile Asp Lys Gly Ser Lys Tyr Arg Ile Asp Lys Val Thr

        420                 425                 430Glu Val Val Val Lys Gly Thr Arg Lys Leu Val Val Asp Ala Thr Leu

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Claims (59)

1．编码一种毒素的分离的多核苷酸，其中该野生型毒素由选自MB438和MB439的侧孢芽孢杆菌菌株产生。

2．权利要求1的多核苷酸，其中所述毒素是热不稳定的。

3．权利要求1的多核苷酸，其中所述毒素能从所述侧孢芽孢杆菌菌株的培养上清液中获得。

4．权利要求1的多核苷酸，其中所述毒素的分子量为约1kDa～约10kDa。

5．权利要求1的多核苷酸，其中所述毒素与第二种蛋白质一起对玉米根虫有毒，其中第二种蛋白质由选自MB438和MB439的侧孢芽孢杆菌菌株产生。

6．权利要求1的多核苷酸，其中所述毒素是一种MIS毒素。

7．权利要求1的多核苷酸，其中所述毒素是一种WAR毒素。

8．权利要求1的多核苷酸，其中所述菌株是MB438。

9．权利要求1的多核苷酸，其中所述菌株是MB439。

10．权利要求1的多核苷酸，其编码一种选自SEQ ID NO:7、SEQID NO:9、SEQ ID NO:7的杀虫部分和SEQ ID NO:9的杀虫部分的氨基酸序列。

11．权利要求1的多核苷酸，其中所述毒素包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其活性部分。

12．权利要求1的多核苷酸，其中所述毒素包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

13．权利要求1的多核苷酸，其中所述毒素包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其活性部分。

14．权利要求1的多核苷酸，其中所述毒素包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

15．权利要求1的多核苷酸，其中用SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的引物经聚合酶链反应扩增该多核苷酸的一部分。

16．权利要求1的多核苷酸，其中编码所述毒素的核苷酸序列，或该核苷酸序列的互补序列，在严格条件下可与第二种核苷酸序列杂交，此第二种核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、足以编码一种杀虫活性蛋白质的SEQ ID NO:6的一部分和足以编码一种杀虫活性蛋白质的SEQ ID NO:8的一部分。

17．权利要求16的多核苷酸，其中所述第二种核苷酸序列是SEQID NO:1。

18．权利要求16的多核苷酸，其中所述第二种核苷酸序列是SEQID NO:2。

19．权利要求16的多核苷酸，其中所述第二种核苷酸序列是SEQID NO:5。

20．权利要求16的多核苷酸，其中所述第二种核苷酸序列是SEQID NO:6。

21．权利要求16的多核苷酸，其中所述第二种核苷酸序列是SEQID NO:8。

22．权利要求16的多核苷酸，其中所述第二种核苷酸序列是SEQID NO:10。

23．权利要求16的多核苷酸，其中所述第二种核苷酸序列包含足以编码一种杀虫活性蛋白质的SEQ ID NO:6的一部分。

24．权利要求16的多核苷酸，其中所述第二种核苷酸序列包含足以编码一种杀虫活性蛋白质的SEQ ID NO:8的一部分。

25．权利要求16的多核苷酸，其中该多核苷酸包含一种序列，该序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、足以编码一种杀虫活性蛋白质的SEQ ID NO:6的一部分和足以编码一种杀虫活性蛋白质的SEQ ID NO:8的一部分。

26．权利要求16的多核苷酸，其中该多核苷酸序列包含SEQ IDNO:5的序列。

27．权利要求16的多核苷酸，其中该多核苷酸序列包含SEQ IDNO:6的序列。

28．权利要求16的多核苷酸，其中该多核苷酸序列包含SEQ IDNO:8的序列。

29．权利要求16的多核苷酸，其中该多核苷酸序列包含SEQ IDNO:10的序列。

30．权利要求16的多核苷酸，其中该多核苷酸序列包含足以编码一种杀虫活性蛋白质的SEQ ID NO:6的一部分。

31．权利要求16的多核苷酸，其中该多核苷酸序列包含足以编码一种杀虫活性蛋白质的SEQ ID NO:8的一部分。

32．一种分离的毒素，其中该野生型毒素由选自MB438和MB439的侧孢芽孢杆菌菌株产生。

33．权利要求32的毒素，其中该毒素是热不稳定的。

34．权利要求32的毒素，其中该毒素能从所述侧孢芽孢杆菌菌株的培养上清液中获得。

35．权利要求32的毒素，其中该毒素的分子量为约1kDa～约10kDa。

36．权利要求32的毒素，它与第二种蛋白质一起对玉米根虫有毒，其中该第二种蛋白质由选自MB438和MB439的侧孢芽孢杆菌菌株产生。

37．权利要求32的毒素，其中该毒素是一种MIS毒素。

38．权利要求32的毒素，其中该毒素是一种WAR毒素。

39．权利要求32的毒素，其中所述菌株是MB438。

40．权利要求32的毒素，其中所述菌株是MB439。

41．权利要求32的毒素，其中该毒素包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其活性部分。

42．权利要求32的毒素，其中该毒素包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

43．权利要求32的毒素，其中该毒素包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

44．权利要求32的毒素，其中该毒素包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

45．权利要求32的毒素，其中该毒素包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其活性部分。

46．权利要求32的毒素，其中该毒素包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

47．一种重组宿主，其包含编码一种毒素的多核苷酸，其中该野生型毒素由选自MB438和MB439的侧孢芽孢杆菌菌株产生。

48．权利要求47的宿主，其中该宿主是一种细菌细胞。

49．权利要求47的宿主，其中该宿主是一种植物细胞。

50．权利要求47的宿主，其中该宿主是一种植物。

51．权利要求47的宿主，其中该宿主是一种玉米细胞。

52．权利要求47的宿主，其中该宿主是一种玉米植物。

53．一种防治非哺乳动物害虫的方法，其中该方法包括使该害虫接触一种分离的毒素，其中该野生型毒素由选自MB438和MB439的侧孢芽孢杆菌菌株产生。

54．权利要求53的方法，其中所述害虫是一种鞘翅目昆虫。

55．权利要求53的方法，其中所述害虫是一种玉米根虫。

56．权利要求53的方法，其中该方法还包括使所述害虫接触由选自MB438和MB439的侧孢芽孢杆菌菌株产生的第二种蛋白质。

57．选自MB438和MB439的侧孢芽孢杆菌菌株的生物纯培养物。

58．权利要求36的培养物，其中所述菌株是MB438。

59．权利要求36的培养物，其中所述菌株是MB439。