CN116745425A - 杀虫基因及使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了具有杀虫活性的组合物及其使用方法。组合物包括具有杀虫活性的分离的和重组的多肽、编码所述杀虫多肽的重组和合成核酸分子、包含所述核酸分子的DNA构建体、包含所述核酸分子的载体、包含所述载体的宿主细胞和针对所述杀虫多肽的抗体。编码本文提供的所述多肽的核苷酸序列可用于DNA构建体或表达盒中，以用于在目标生物体中转化和表达。本文所提供的组合物和方法可用于产生具有增强的害虫抗性或耐受性的生物。还提供了包含编码本发明的杀虫蛋白的核苷酸序列的转基因植物和种子。提供了用于产生本文公开的多肽的方法，以及用于使用那些多肽来控制害虫的方法。还包括用于检测样品中本发明多肽的方法和试剂盒。

Description

杀虫基因及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年11月24日提交的美国临时申请第63/117,797号和2021年1月21日提交的美国临时申请第63/140,058号的优先权，每一份申请均通过引用整体并入本文。

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以ASCII格式代替纸质副本提供，并通过引用并入本说明书。该ASCII副本名为A101100_1660WO_0543_4_SL，大小为93132字节，创建于2021年11月18日，通过EFS-Web以电子方式提交。

发明领域

本发明涉及用于防治害虫、特别是植物害虫的方法和组合物。

背景

害虫、植物疾病和杂草可以是对作物的严重威胁。估计由于害虫和疾病造成的损失占全世界农业生产的37％，其中13％由昆虫、细菌和其他生物造成。

毒素是毒力决定因子，其在微生物致病性和/或宿主免疫反应的逃避中起重要作用。来自革兰阳性细菌芽孢杆菌属(Bacillus)，特别是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的毒素已被用作杀虫蛋白。目前的策略使用表达这些毒素的基因来产生转基因作物。表达杀虫蛋白毒素的转基因作物用于对抗昆虫造成的作物损害。

尽管使用芽孢杆菌毒素已经成功地控制了昆虫，但在世界上其中此类毒素已被广泛使用的许多地方，一些目标害虫中已经发展出对Bt毒素的抗性。解决该问题的一种方法是将Bt作物与常规非Bt作物(避难所)以交替行播种。避免或减缓昆虫抗性发展的一种可选方法是在转基因植物中堆积具有不同抗昆虫作用模式的杀虫基因。目前使用表达杀虫蛋白毒素的转基因作物的策略越来越强调在源自苏云金芽孢杆菌的那些毒素之余发现新型毒素。可证明这些毒素可用作来源于苏云金芽孢杆菌的那些毒素的替代物，部署在抗昆虫和抗害虫的转基因植物中。因此，需要新的毒素蛋白。

概述

提供了具有杀虫活性的组合物及其使用方法。组合物包括多肽序列，包括具有杀虫活性的分离的和重组的多肽序列，编码所述杀虫多肽的核酸分子(包括分离的、重组的和合成的核酸分子)，包含所述核酸分子的DNA构建体，包含所述核酸分子的载体、包含所述DNA构建体或载体的宿主细胞和针对所述杀虫多肽的抗体。编码本文提供的多肽的核苷酸序列可用于DNA构建体或表达盒中，以用于在目标生物体(包括微生物和植物)中转化和表达。

本文提供的组合物和方法可用于产生具有增强的害虫抗性或耐受性的生物体。这些生物体和包含所述生物体的组合物是农业目的所需的。还提供了包含编码本发明的杀虫蛋白的核苷酸序列的转基因植物和种子。此类植物对昆虫和其他害虫具有抗性。

提供了用于产生本文公开的各种多肽，以及使用那些多肽来控制或杀死害虫的方法。还包括用于检测样品中本发明多肽的方法和试剂盒。

发明详述

现在将在下文中更全面地描述本发明，其中描述了本发明的一些但并非全部实施方案。实际上，这些发明可以以许多不同的形式体现，并且不应该被解释为限于本文中所示的实施方案；相反，提供这些实施方案是为了使本公开满足适用的法律要求。相同的数字指代始终相同的要素。

受益于前述描述和相关附图中呈现的教导，本发明所属领域的技术人员将想到本文所阐述的本发明的许多修改和其他实施方案。因此，应该理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，并且改动和其他实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了特定术语，但它们仅以其一般性和描述性意义使用，而不是用于限制的目的。

I.多核苷酸和多肽

提供了用于赋予生物体以杀虫活性的组合物和方法。经修饰的生物体表现出杀虫抗性或耐受性。提供了保留杀虫活性的重组杀虫蛋白或多肽及其片段和变体，包括SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40中所示的那些多肽。所述杀虫蛋白具有抗害虫(包括昆虫、真菌、线虫等)的生物活性(例如杀虫)。提供了编码所述杀虫多肽的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和/或39中所示的核苷酸序列。编码所述杀虫多肽，包括例如SEQ IDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40，或者其活性片段或变体的核苷酸序列可用于产生转基因生物，例如植物和微生物。所述杀虫蛋白对包括昆虫、真菌、线虫等的害虫具有生物活性(例如杀虫)。在特定实施方案中，当与本领域中的其他多肽相比时，所述杀虫多肽及其活性变体和片段具有改进的杀虫活性。编码所述杀虫多肽，包括例如SEQ ID NOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40，或者其活性片段或变体的多核苷酸可用于产生转基因生物，例如植物和微生物。转化的生物的特征在于包含至少一个稳定地整合的DNA构建体的基因组，所述DNA构建体包含本文公开的杀虫蛋白的编码序列。在一些实施方案中，所述编码序列与驱动所编码的杀虫多肽表达的启动子可操作地连接。因此，提供了转化的微生物、植物细胞、植物组织、植物、种子和植物部分。各种多肽、其活性变体和片段以及编码它们的多核苷酸的概述列于下表1中。如表1所示，提供了各种形式的多肽。提供了全长杀虫多肽，以及原始全长序列的修饰形式(即，变体)。

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i.杀虫蛋白的种类

本文提供的杀虫蛋白和编码它们的核苷酸序列可用于影响害虫的方法。也就是说，本发明的组合物和方法可用于农业中控制或杀死害虫，包括许多农作物的害虫。本文提供的杀虫蛋白质是来自细菌的毒素蛋白，并且表现出抗某些害虫的活性。杀虫蛋白来自几类毒素，包括Cry、Cyt、BIN和Mtx毒素。关于本文提供的各种SEQ ID NOs的特定蛋白质分类，参见例如表1。另外，在整个本公开内容中参考Pfam数据库条目。Pfam数据库是蛋白质家族的数据库，每个蛋白质家族由多个序列比对和概况隐藏马尔可夫模型(profile hiddenMarkov model)表示。Finn等(2014)Nucl.Acid Res.Database Issue42:D222-D230。

苏云金芽孢杆菌(Bt)是革兰氏阳性细菌，其在其生长的孢子形成期期间产生以晶体包涵体存在的杀虫蛋白。苏云金芽孢杆菌(Bt)的蛋白质性质的包涵体被称为晶体蛋白质或δ-内毒素(或Cry蛋白质)，其对昆虫纲和其他无脊椎动物的成员有毒。类似地，Cyt蛋白是来自Bt的伴孢包涵体(parasporal inclusion)蛋白，其表现出溶血(溶细胞)活性或与已知的Cyt蛋白具有明显的序列相似性。这些毒素对其靶生物体具有高度特异性，但对人、脊椎动物和植物无害。

Cry毒素的结构揭示了五个保守的氨基酸模块，主要集中在结构域的中心或结构域之间的连接处。Cry毒素由三个结构域组成，每个结构域具有特定功能。结构域I是七个α-螺旋的束，其中中心螺旋完全被六个外螺旋围绕。该结构域涉及膜中的通道形成。结构域II表现为三个反向平行β-折叠的三角柱，其类似于免疫球蛋白的抗原结合区。结构域III包含呈β夹心形式的反平行β-链。毒素蛋白的N-末端部分负责其毒性和特异性，并含有五个保守区域。C-末端部分通常是高度保守的并且可能负责晶体形成。参见例如美国专利号8,878,007。

苏云金芽孢杆菌菌株显示出针对不同昆虫目(鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、虱目或食毛目和蜱螨目)和其他无脊椎动物(线虫动物门、扁形动物门和Sarocomastebrate)的广泛特异性。基于对各种昆虫和无脊椎动物组的毒性，已经将Cry蛋白分类成几个组。通常，Cry I表现出对鳞翅目昆虫的毒性，Cry II表现出对鳞翅目昆虫和双翅目昆虫的毒性，CryIII表现出对鞘翅目昆虫的毒性，Cry IV表现出对双翅目昆虫的毒性以及Cry V和Cry VI表现出对线虫的毒性。可以鉴定新的Cry蛋白并基于氨基酸同一性而将其分配至一个Cry组内。参见例如Bravo,A.(1997)J.of Bacteriol.179:2793-2801；Bravo等(2013)Microb.Biotechnol.6:17-26，通过引用并入本文。

超过750种不同的cry基因序列已被分类为73个组(Cry1-Cry73)，该基因家族的新成员继续被发现(Crickmore等(2014)www.btnomenclature.info/)。cry基因家族由可具有不同作用模式的几个在系统发生上不相关的蛋白家族：三结构域Cry毒素家族、杀蚊Cry毒素家族、二元样毒素家族和Cyt家族毒素组成(Bravo等，2005)。一些Bt菌株产生另外的杀虫毒素，VIP毒素。也参见Cohen等.(2011)J.Mol.Biol.413:4-814；Crickmore等(2014)苏云金芽孢杆菌毒素命名,可见于互联网址lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/；Crickmore等(1988)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813；Gill等(1992)Ann.Rev.Entomol.37:807-636；Goldbert等(1997)Appl.Environ.Microbiol.63:2716-2712；Knowles等(1992)Proc.R.Soc.Ser.B.248:1-7；Koni等(1994)Microbiology 140:1869-1880；Lailak等(2013)Biochem.Biophys.Res.Commun.435:216-221；Lopez-Diaz等(2013)Environ.Microbiol.15:3030-3039；Perez等(2007)Cell.Microbiol.9:2931-2937；Promdonkoy等(2003)Biochem.J.374:255-259；Rigden(2009)FEBS Lett.583:1555-1560；Schnepf等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:775-806；Soberon等(2013)Peptides 41:87-93；Thiery等(1998)J.Am.Mosq.Control Assoc.14:472-476；Thomas等(1983)FEBSLett.154:362-368；Wirth等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10536-10540；Wirth等(2005)Appl.Environ.Microbiol.71:185-189；和Zhang等(2006)Biosci.Biotechnol.Biochem.70:2199-2204；其每一篇通过引用整体并入本文。

Cyt表示来自苏云金芽孢杆菌的具有溶细胞活性的伴胞晶体包涵体蛋白，或与已知Cyt蛋白具有序列相似性的蛋白质。(Crickmore等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)。该基因用cyt表示。这些蛋白质在结构和活性上与Cry蛋白质不同(Gill等(1992)Annu.Rev.Entomol.37:615-636)。Cyt毒素最早在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中被发现(Goldberg等(1977)Mosq.News.37:355-358)。在当前命名法中存在3个Cyt毒素家族，包括11种全型毒素(Crickmore等.(2014)苏云金芽孢杆菌毒素nomenclature found on theworld wide web at lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。大多数具有cyt基因的苏云金芽孢杆菌分离株显示出针对双翅目昆虫(特别是蚊子和黑蝇)的活性，但也有已在靶向鳞翅目昆虫或鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌菌株中描述过的cyt基因(Guerchicoff等(1997)Appl.Environ.Microbiol.63:2716-2721)。

通过X射线晶体学解析的Cyt2A的结构显示单个结构域，其中α-螺旋的两个外层环绕在混合的β-折叠周围。Cyt毒素的其他可用晶体结构支持保守的α-β结构模型，其中两个α-螺旋发夹位于含有7至8个β-链的β-折叠核心的侧翼。(Cohen等(2011)J.Mol.Biol.413:804-814)。诱变研究发现β-折叠残基对毒性至关重要，而螺旋结构域中的突变不影响毒性(Adang等；Diversity of Bacillus thuringiensis Crystal Toxins and Mechanism ofAction.T.S.Dhadialla和S.S.Gill编，Advances in Insect Physiology，第47卷，Oxford:Academic Press,2014，第39-87页)。Cyt毒素的代表性结构域是δ-内毒素，Bac_thur_toxin(Pfam PF01338)。

对于Cyt毒素的作用模式存在多种推测的模型，并且其仍然是活跃研究的领域。已显示一些Cyt蛋白(Cyt1A)的结晶需要辅助蛋白存在。Cyt1A和Cyt2A原毒素通过消化性蛋白酶在N-和C-末端的相同位点加工成稳定的毒素核心。然后，Cyt毒素与非饱和的膜脂质诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂相互作用。对于Cyt毒素，孔形成和去垢剂样膜破坏已被提出作为非排他性机制；并且通常认为两者均可能发生，这取决于毒素浓度，其中较低浓度有利于寡聚孔，较高浓度导致膜破裂。(Butko(2003)Appl.Environ.Microbiol.69:2415-2422)。在孔形成模型中，Cyt毒素与细胞膜结合，诱导膜囊泡中阳离子选择性通道形成，导致细胞的胶体-渗透性裂解。(Knowles等(1989)FEBS Lett.244:259-262；Knowles等(1992)Proc.R.Soc.Ser.B.248:1-7以及Promdonkoy等(2003)Biochem.J.374:255-259)。在去垢剂模型中，脂质双层表面上存在毒素的非特异性聚集，导致膜分解和细胞死亡。(Butko(2003)同上；Manceva等(2005)Biochem.44:589-597)。

多项研究已显示Cyt毒素与其他苏云金芽孢杆菌毒素，特别是Cry、Bin和Mtx毒素之间的协同活性。甚至已经证明这种协同作用可以克服昆虫对其他毒素的抗性。(Wirth1997,Wirth 2005,Thiery1998,Zhang 2006)。已提出Cry毒素的Cyt协同作用涉及Cyt1A与溶液中或膜平面上Cry毒素的结构域II的结合，以促进Cry毒素前孔寡聚体的形成。该寡聚体的形成与Cyt寡聚化、结合或插入无关。(Lailak 2013,Perez 2007,Lopez-Diaz 2013)

在营养生长期间，一些苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)菌株产生许多与Cry蛋白无关的杀虫蛋白(Estruch等(1996)Proc Natl Acad Sci USA93:5389–5394；Warren等(1994)WO 94/21795)。这些营养性杀虫蛋白或Vip不形成伴胞晶体蛋白，并且显然是从细胞中分泌出来的。Vip目前被排除在Cry蛋白命名法之外，因为它们不是晶体形成蛋白。一些苏云金芽孢杆菌Cry蛋白也在营养生长期间以及在静止和孢子形成阶段期间产生(最显著的是Cry3Aa)的，从这意义上说术语VIP是一种误称。据报道，Vip基因在苏云金芽孢杆菌基因组中的位置位于也编码cry基因的大质粒上(Mesrati等(2005)FEMSMicrobiol.Lett.244(2):353-8)。Bt毒素命名的网站可在万维网上于lifesci.sussex.ac.uk处找到，路径为“/home/Neil_Crickmore/Bt/”，和“btnomenclature.info/”。另见Schnepf等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(3):775-806。此类参考文献通过引用并入本文。

Vip基因可以分成四类。一些Vip基因形成二元双组分蛋白复合物；“A”组分通常是“活性”部分，“B”组分通常是“结合”部分。(Pfam pfam.xfam.org/family/PF03495)。Vip1和Vip4蛋白通常含有二元毒素B蛋白结构域。Vip2蛋白通常含有二元毒素A蛋白结构域。

Vip1和Vip2蛋白是对鞘翅目昆虫表现出毒性的二元毒素的两种组分。Vip1Aa1和Vip2Aa1对玉米根虫特别是玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)和长角叶甲(长角叶甲)具有非常大的活性(Han等(1999)Nat.Struct.Biol.6:932–936；Warren GW(1997)“Vegetative insecticidal proteins:novel proteins for control of corn pests”In:Carozzi NB,Koziel M(编辑)Advances in insect control,the role of transgenicplants；Taylor&Francis Ltd,London，第109–21页)。膜结合的95kDa Vip1多聚体为52kDa的vip2 ADP-核糖基酶(ribosylase)提供进入靶西部玉米根虫细胞的细胞质的途径(Warren(1997)同上)。NAD依赖性ADP-核糖基转移酶Vip2可能在Arg177处修饰单体肌动蛋白以阻断聚合，从而导致肌动蛋白细胞骨架的丧失和由于体内肌动蛋白丝内的快速亚基交换而导致的最终细胞死亡(Carlier M.F.(1990)Adv.Biophys.26:51–73)。

与Cry毒素一样，活化的Vip3A毒素是能够在膜中形成稳定离子通道的孔形成蛋白(Lee等(2003)Appl.Environ.Microbiol.69:4648–4657)。Vip3蛋白对几种主要的鳞翅目害虫具有活性(Rang等(2005)Appl.Environ.Microbiol.71(10):6276-6281；Bhalla等(2005)FEMS Microbiol.Lett.243:467–472；Estruch等(1998)WO 9844137；Estruch等(1996)ProcNatl Acad Sci USA93:5389–5394；Selvapandiyan等(2001)Appl.Environ Microbiol.67:5855–5858；Yu等(1997)Appl.Environ Microbiol.63:532–536)。Vip3A对小地老虎(Agrotis ipsilon)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)和玉米穗蛾(Helicoverpa zea)具有活性(Warren等(1996)WO 96/10083；Estruch等(1996)Proc Natl Acad Sci USA93:5389–5394)。与Cry毒素一样，Vip3A蛋白必须在被蛋白酶激活后，才能在中肠上皮细胞表面上识别出与Cry毒素所识别的那些特定膜蛋白不同的特定膜蛋白。

MTX毒素蛋白家族的特征在于保守结构域ETX_MTX2(pfam03318)的存在。该家族的成员与来自球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)的杀蚊剂毒素Mtx2和Mtx3以及与来自产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的ε毒素ETX共有序列同源性(Cole等(2004)Nat.Struct.Mol.Biol.11:797-8；Thanabalu等(1996)Gene170:85-9)。MTX样蛋白质在结构上不同于三结构域Cry毒素，因为它们具有细长且主要基于β-折叠的结构。然而，类似于三结构域毒素，认为MTX样蛋白在靶细胞的膜中形成孔(Adang等(2014)同上)。而与三结构域Cry蛋白不同，MTX样蛋白的长度要小得多，在267个氨基酸(Cry23)至340个氨基酸(Cry15A)的范围内变化。

与三结构域Cry家族相比，MTX样毒素蛋白质家族是一个相对较小的类别(Crickmore等(2014)同上；Adang等(2014)同上)。MTX样毒素家族的成员包括Cry15、Cry23、Cry33、Cry38、Cry45、Cry46、Cry51、Cry60A、Cry60B和Cry64。该家族具有一系列杀虫活性，包括对鳞翅目昆虫和鞘翅目昆虫害虫的活性。该家族的一些成员可以与其他蛋白质形成二元伴侣关系，这可能是也可能不是杀虫活性所必需的。

Mtx样蛋白的分类已被修订为在来自ETX/MTX2家族的β-孔形成杀虫蛋白的Mpp(Mtx2样杀虫蛋白)类内。参见Crickmore,et al.,2020,J.Invert.Path.,Jul 9:107438,doi:10.1016/j.jip.2020.107438,PMID:32652083。

Cry15是在苏云金芽孢杆菌血清型thompsoni HD542中鉴定的一种34kDA蛋白；其与约40kDa的无关蛋白一起天然存在于晶体中。编码Cry15及其伴侣蛋白的基因一起排列在操纵子中。已显示单独的Cry15对鳞翅目昆虫害虫包括烟草天蛾、苹果蠹蛾(Cydiapomonella)和菜粉蝶(Pieris rapae)具有活性，其中已显示该40kDA蛋白质的存在仅增强Cry15对苹果蠹蛾的活性(Brown K.和Whiteley H.(1992)J.Bacteriol.174:549-557；Naimov等(2008)Appl.Environ.Microbiol.74:7145–7151)。需要进一步的研究来阐明Cry15的伴侣蛋白的功能。类似地，Cry23为一种29kDA蛋白，已显示其与其伴侣蛋白Cry37一起对鞘翅目害虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和日本丽金龟(Popillia japonica)具有活性(Donovan等(2000)美国专利号6,063,756)。

MTX样家族的新成员继续被鉴定出来。最近在苏云金芽孢杆菌血清型tolworthi菌株Na205-3的基因组中鉴定了ETX_MTX毒素基因。发现该菌株对鳞翅目害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera)有毒，并且其还含有Cry1、Cry11、Vip1、Vip2和Vip3的同源物(Palma等(2014)Genome Announc.2(2):e00187-14.2014年3月13日在doi:10.1128/genomeA.00187-14；PMCID:PMC3953196在线发表)。因为MTX样蛋白质相对于三结构域Cry蛋白具有独特的结构域结构，所以它们被认为具有独特的作用模式，从而使它们成为昆虫控制和抵抗昆虫抗性的有价值的工具。

细菌细胞产生大量具有针对宿主和非宿主生物体的不同特异性的毒素。已在许多细菌家族中鉴定出二元毒素大家族，包括具有抗昆虫害虫的活性的毒素。(Poopathi和Abidha(2010)J.Physiol.Path.1(3):22-38)。球形芽孢杆菌(Ls)，以前称为球形芽孢杆菌(Ahmed等(2007)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.57:1117-1125)作为昆虫生物控制菌株而众所周知。Ls产生几种杀虫蛋白，包括高效的二元复合物BinA/BinB。该二元复合物在Ls细胞中形成伴胞晶体，并且对双翅目昆虫，特别是蚊子具有强烈且特异的活性。在一些地区，已经报道了对现有的Ls杀蚊剂菌株的昆虫抗性。具有不同靶特异性或克服昆虫抗性的能力的新的二元毒素的发现具有重要意义。

Ls二元杀虫蛋白复合物含有两种主要多肽，即42kDa多肽和51kDa多肽，分别命名为BinA和BinB(Ahmed等(2007)同上)。这两种多肽协同作用以赋予针对其靶标的毒性。作用模式涉及蛋白质与幼虫中肠中的受体的结合。在一些情况下，通过在幼虫肠中的蛋白酶消化来修饰蛋白质以产生活化形式。BinB组分据认为参与结合，而BinA组分赋予毒性(Nielsen-LeRoux等(2001)Appl.Environ.Microbiol.67(11):5049–5054)。当分开克隆和表达时，BinA组分对蚊子幼虫有毒，而BinB组分则对幼虫无毒。然而，所述蛋白的共施用显著增强了毒性(Nielsen-LeRoux等(2001)同上)。

已从细菌来源描述了少量Bin蛋白同源物。Priest等(1997)Appl.Environ.Microbiol.63(4):1195-1198描述了鉴定新Ls菌株的杂交努力，尽管他们鉴定的大多数基因编码的蛋白质与已知的BinA/BinB蛋白相同。BinA蛋白含有被称为毒素10超家族结构域的确定的保守结构域。该毒素结构域最初由其在BinA和BinB中的存在来定义。这两种蛋白质均具有该结构域，尽管BinA与BinB之间的序列相似性局限于该区域(<40％)。Cry49Aa蛋白质(其也具有杀虫活性)也具有该结构域(如下所述的)。

Ls的Cry48Aa/Cry49Aa二元毒素具有杀死五带淡色库蚊(Culexquinquefasciatus)幼虫的能力。这些蛋白质属于与苏云金芽孢杆菌(Bt)的Cry蛋白复合物(一种众所周知的杀虫蛋白家族)具有一定相似性的蛋白质结构种类。还已知Bt的Cry34/Cry35二元毒素杀死昆虫，包括西部玉米根虫(一种重要的玉米害虫)。已经鉴定了其几种变体的Cry34是小的(14kDa)多肽，而Cry35(也由几种变体编码)为44kDa多肽。这些蛋白质与BinA/BinB蛋白质组具有一定的序列同源性，并且被认为是进化相关的(Ellis等(2002)Appl.Environ.Microbiol.68(3):1137-1145)。

Cry34的分类已被修改为属于杨树菇溶血素(aegerolysin)杀虫蛋白的Gpp类内，例如Gpp34Aa。参见Crickmore,et al.,2020,J.Invert.Path.,Jul 9:107438,doi:10.1016/j.jip.2020.107438,PMID:32652083。

磷脂酰肌醇磷脂酶C蛋白(PI-PLC；还有磷脂酰肌醇磷脂酶C)是更广泛的磷脂酶C蛋白组的成员。这些蛋白中的许多蛋白在信号转导中作为正常细胞生理学的一部分起着重要作用。几种重要的细菌毒素也含有与这些蛋白相似的结构域(Titball,R.W.(1993)Microbiological Reviews.57(2):347-366)。重要的是，这些蛋白在Bt Cry蛋白使昆虫细胞中毒期间参与信号放大(Valaitis,A.P.(2008)Insect Biochemistry and MolecularBiology.38:611-618)。

PI-PLC毒素类别存在于芽孢杆菌分离株中，通常与其他所述的毒素类别(诸如二元毒素)的同源物共同出现。这类序列与磷脂酰肌醇磷酸二酯酶(也称为磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C-PI-PLC)具有同源性。Heinz等(Heinz等，(1995)The EMBO Journal.14(16):3855-3863)解析了蜡状芽孢杆菌PI-PLC的晶体结构及其活性部位。等使用定点诱变、动力学和晶体结构分析研究了蜡状芽孢杆菌PI-PLC活性部位氨基酸残基在催化和底物结合中的作用(/>等，(1997)Biochemistry.36(42):12802-13)。

这些PI-PLC毒素蛋白含有PLC样磷酸二酯酶、TIMβ/α-桶结构域(IPR017946)和/或磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性、X结构域(IPR000909)(也称为PI-PLC X-盒结构域)。我们还看到了具有这些结构域的蛋白质与其他典型的芽孢杆菌蛋白质毒素结构域的组合。该列表包括最常见的凝集素结构域(IPR000772)(一种可以一个或多个拷贝存在并且被认为结合细胞膜的糖结合结构域)以及杀虫晶体毒素(IPR008872)(也称为毒素10或P42)，其为二元毒素的定义结构域。

先前，在美国专利号8,318,900B2(SEQ ID NOs 30(DNA)和79(氨基酸))中，在美国专利公开号20110263488A1(SEQ ID NOs 8(DNA)和9(氨基酸))中以及在美国专利号8,461,421B2(SEQ ID NOs 3(DNA)和63(氨基酸))中定义了该PI-PLC类别的毒素。

本文提供了来自这些类别的毒素的杀虫蛋白。按其结构、与已知毒素的同源性和/或其杀虫特异性对杀虫蛋白质进行分类。

ii.杀虫蛋白的变体和片段以及编码其的多核苷酸

本发明的杀虫蛋白或多肽包括SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40所示的杀虫蛋白或多肽以及其片段和片段。“杀虫毒素”或“杀虫蛋白”或“杀虫多肽”旨在指具有抗一种或多种害虫(包括昆虫、真菌、线虫等)的活性，使得所述害虫被杀死或控制的毒素或蛋白质或多肽。

术语“分离的”或“纯化的”包括这样的多肽或蛋白质或其生物活性部分、多核苷酸或核酸分子或者其他实体或物质，其大体上或基本上不含通常与其天然存在的环境中发现的多肽或多核苷酸相伴或相互作用的组分。分离的多肽或多核苷酸可以与它们最初相关的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的其它组分分离。因此，分离的或纯化的多肽或蛋白质在通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。基本上不含细胞物质的蛋白质包括含有少于约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计)污染性蛋白质的蛋白质制剂。当重组产生本发明的蛋白质或其生物活性部分时，最佳地培养基代表少于约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计)的化学前体或非目标蛋白质的化学物质。

术语“片段”是指本发明的多肽序列的一部分。“片段”或“生物活性部分”包括含有足够数量的连续氨基酸残基以保持生物活性，即具有杀虫活性的多肽。杀虫蛋白的片段包括由于使用替代的下游起始位点，或者由于产生具有杀虫活性的较短蛋白质的加工而比全长序列短的片段。加工可在表达蛋白质的生物体中发生，或者在蛋白质摄入后于害虫中发生。所述蛋白质的片段的实例可见于表1中。杀虫蛋白的生物活性部分可以是SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40中任一序列的长度为例如10、20、25、30、50、40、50、60、70、75、80、90、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190、200、210、220、225、230、240、250、260或更多个毗邻氨基酸的多肽。此类生物活性部分可通过重组技术来制备，并评估其杀虫活性。如此处所用，片段包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40的至少8个连续氨基酸。

细菌基因，包括编码本文公开的杀虫蛋白的细菌基因，通常在开放阅读框的起点附近具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始将导致功能性蛋白质的产生。这些起始密码子可包括ATG密码子。但是，细菌诸如芽孢杆菌属的种还将密码子GTG识别为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白质在第一个氨基酸处含有甲硫氨酸。在极少数情况下，细菌系统中的翻译可以在TTG密码子处起始，但在这种情况下，TTG编码甲硫氨酸。此外，通常不先验地确定这些密码子中的哪一种在细菌中被天然使用。因此，应理解，使用替代甲硫氨酸密码子之一也可导致产生杀虫蛋白。这些杀虫蛋白包括在本发明中，并可用于本文公开的方法中。应当理解，当在植物中表达时，有必要将替代的起始密码子改变为ATG以进行适当的翻译。

在各种实施方案中，本文提供的杀虫蛋白包括由全长核苷酸序列推导的氨基酸序列和由于使用替代的下游起始位点而短于全长序列的氨基酸序列。因此，本发明的核苷酸序列和/或载体、宿主细胞和包含本发明的核苷酸序列的植物(以及制备和使用本发明核苷酸序列的方法)可包含编码替代起始位点的核苷酸序列。

认识到可以对本文提供的杀虫多肽进行修饰，产生变体蛋白。可通过应用定点诱变技术引入由人设计的变化。或者，还可鉴定与本文中公开的序列在结构上和/或功能上相关的天然的、尚未知的或尚未鉴定的多核苷酸和/或多肽，其落入本发明的范围内。可以在不改变杀虫蛋白功能的非保守区域中进行保守氨基酸取代。或者，可以进行改善毒素活性的修饰。通过结构域III交换修饰Cry毒素在一些情况下导致具有改善的针对某些昆虫物种的毒性的杂合毒素。因此，结构域III交换可以是改善Cry毒素的毒性或产生新型杂合毒素的有效策略，所述杂合毒素对于显示对亲本Cry毒素没有易感性的害虫具有毒性。结构域II环序列的定点诱变可导致具有增加的杀虫活性的新毒素。结构域II环区域是初始Cry毒素的关键结合区域，其是具有改善的杀虫特性的Cry毒素的诱变和选择的合适靶标。可以修饰Cry毒素的结构域I以引入蛋白酶切割位点来改善抗某些害虫的活性。在大量cry基因中改组三个不同结构域的策略和高通量输出生物测定筛选方法可提供具有改善的或新型的毒性的新型Cry毒素。

如所指出的，本文公开的多肽的片段和变体将保留杀虫活性。杀虫活性包括组合物实现减少靶害虫的发生或活性(包括例如导致至少一种害虫的死亡，或害虫生长、摄食或正常生理发育的显著减少)的可观察效果的能力。数量、害虫生长、摄食或正常发育的这种减少可包括任何统计学上显著的减少，包括例如约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、95％或更多的减少。针对本文提供的各种害虫的一种或多种的杀虫活性，包括例如针对鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、Mallophaga、同翅目、半翅目、直翅目、线虫、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等或本文所述的任何其他害虫的杀虫活性。应认识到，杀虫活性可以相对于天然蛋白质的活性是不同的或改善的，或者可以保持不变，只要保留杀虫活性即可。用于测量杀虫活性的方法在本文其他地方提供。另见Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252:199-206；Marrone等(1985)J.of EconomicEntomology78:290-293；以及美国专利号5,743,477，所有这些文献都通过引用整体并入本文。

“变体”旨在指具有与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40中任一个的氨基酸序列具有至少约70％、约75％、约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列并保留杀虫活性的多肽。要指出的是，表1提供了SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40中每一个的变体多肽(和编码其的多核苷酸)的非限制性实例。本发明的杀虫多肽的生物活性变体的差异可以是少至约1-15个氨基酸残基，少至约1-10个，例如约6-10个，少至5个，少至4个，少至3个，少至2个，或少至1个氨基酸残基。在具体的实施方案中，所述多肽可以包含N末端或C末端截短，其可从所述多肽的N或C末端包含至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个氨基酸或更多个氨基酸的缺失。

表2提供了基于PFAM数据在SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40中发现的蛋白质结构域。表2中提供了结构域描述和给定SEQID NO内的位置。在具体的实施方案中，包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40中任一个的活性变体与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40中的任一个可具有至少70％、75％、76％、77％、78、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且还包含表2中列出的至少一个保守结构域。例如，在一个实施方案中，活性变体将与SEQ ID NO：4具有至少70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且还包含41-408位的天然氨基酸。

表2.SEQ ID NOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中每一个序列内的PFAM结构域的概述

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还提供了编码本文公开的杀虫多肽的核酸分子，包括重组或合成核酸分子，包括SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和/或39中所述的那些。特别令人感兴趣的是被设计用于在目标植物或微生物中表达的核酸序列。也就是说，可以优化核酸序列以增加目标宿主植物或宿主微生物中的表达。可对本发明的杀虫蛋白进行反向翻译以产生包含为在特定宿主(例如作物植物)中表达而优化的密码子的核酸。在另一个实施方案中，可优化编码本文提供的多肽的多核苷酸以增加在转化植物中的表达。也就是说，可使用植物偏爱的密码子合成多核苷酸以改善表达。关于宿主偏爱的密码子用法的论述，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11。用于合成植物偏爱的基因的方法在本领域中是可得的。参见例如美国专利号5,380,831和5,436,391，和Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498，通过引用并入本文。转化植物(例如双子叶植物或单子叶植物)表达这种编码序列将导致杀虫多肽的产生并赋予植物对害虫的增强的抗性。编码本发明的杀虫蛋白的重组和合成核酸分子不包括编码该蛋白的天然存在的细菌序列。

“重组多核苷酸”或“重组核酸”或“重组核酸分子”包含在自然界中不存在直接连接的两个或更多个化学连接的核酸区段的组合。“直接连接的”旨在指两个核酸区段直接相邻并通过化学键相互连接。在具体的实施方案中，重组多核苷酸包含目标多核苷酸或其变体或片段，使得另外的化学连接的核酸区段位于目标多核苷酸的5'、3'或内部。或者，重组多核苷酸的化学连接的核酸区段可通过缺失序列来形成。另外的化学连接的核酸区段或被缺失以连接所述连接的核酸区段的序列可具有任意长度，包括例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多个核苷酸。制备此类重组多核苷酸的各种方法包括化学合成或通过基因工程技术操纵分离的多核苷酸区段。在具体的实施方案中，重组多核苷酸可包含重组DNA序列或重组RNA序列。“重组多核苷酸或核酸的片段”包含两种或更多种化学连接的氨基酸区段的组合中的至少一种，所述氨基酸区段在自然界中不存在直接连接。“重组多肽”或“重组蛋白质”是由重组多核苷酸编码的多肽或蛋白质。

多核苷酸(RNA或DNA)的片段可编码保留活性的蛋白质片段。在具体的实施方案中，重组多核苷酸或重组多核苷酸构建体的片段包含两个或更多个化学连接或可操作地连接的核酸区段的至少一个连接，所述连接的核酸区段在自然界中不存在直接连接。编码保留杀虫活性的多肽的生物活性部分的多核苷酸的片段将编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40所示的全长多肽中存在的至少25个、30个、40个、50个、60个、70个、75个、80个、90个、100个、110个、120个、125个、130个、140个、150个、160个、170个、175个、180个连续氨基酸，或达到全长多肽中存在的氨基酸总数。在一些实施方案中，多核苷酸的片段包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和/或39中的至少25、30、40、50、60、70、75、80、90、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190、200、210、220、225、230、240、250、260、270、275、280、290、300、310、320、325、330、340、350、360、370、375、380、390、400个连续核苷酸，或多达SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和/或39中列出的全长核苷酸序列中存在的核苷酸总数。在具体的实施方案中，此类多肽片段是活性片段，并且在其他实施方案中，多肽片段包含重组多肽片段。如本文所用，重组多肽的片段包含两个或更多个化学连接的氨基酸区段的组合中的至少一种，所述连接的氨基酸区段在自然界中未发现直接连接。

“变体”旨在表示基本相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸内的一个或多个内部位点处一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或天然多核苷酸中一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文中所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。

还可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽与参考多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列同一性来评估本发明的特定多核苷酸(包括SEQ ID NOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和/或39中所示的那些多核苷酸，即参考多核苷酸)的变体。因此，例如，公开了编码与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40的多肽具有给定百分比序列同一性的多肽的分离的多核苷酸。可使用本文其他地方描述的序列比对程序和参数计算任何两个多肽之间的百分比序列同一性。当通过比较由它们编码的两种多肽共有的百分比序列同一性来评估本发明的任何给定的多核苷酸对时，两个编码的多肽之间的百分比序列同一性为与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在其他实施方案中，本文提供的多核苷酸的变体与天然序列有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸的差别。

变体多核苷酸和蛋白质还包括从诱变和重组过程(诸如DNA改组)产生的序列和蛋白质。通过这种方法，操作本文公开的一种或多种不同的杀虫蛋白(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40)以产生具有所需特性的新的杀虫蛋白。以这种方式，重组多核苷酸文库由一群相关序列多核苷酸产生，所述序列多核苷酸包含具有基本序列同一性的序列区，并且可在体外或体内同源重组。例如，通过使用该方法，可在本文提供的杀虫序列与其他已知的杀虫基因之间改组编码目标结构域的序列基序，以获得编码具有改善的目标性质(例如在酶的情况下增加的Km)的蛋白质的新基因。这种DNA改组的策略在本领域中是已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370:389-391；Crameri et al.(1997)NatureBiotech.15:436-438；Moore等(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhang等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4504-4509；Crameri等(1998)Nature 391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。“改组的”核酸是通过改组程序诸如本文所示的任何改组程序产生的核酸。通过例如以人工和任选地递归方式重组(物理或虚拟)两个或更多个核酸(或字符串)产生改组核酸。通常，在改组过程中使用一个或多个筛选步骤来鉴定目标核酸；该筛选步骤可以在任何重组步骤之前或之后进行。在一些(但非全部)改组实施方案中，希望在选择之前进行多轮重组以增加待筛选的库的多样性。任选地，递归地重复重组和选择的整个过程。取决于上下文，改组可以指重组和选择的整个过程，或者可替代地，可以简单地指代整个过程的重组部分。

在一个实施方案中，提供了获得编码包含杀虫活性的改进的多肽的多核苷酸的方法，其中所述改进的多肽具有优于SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40中任一个的至少一个改善的性质。此类方法可包括(a)重组多个亲本多核苷酸以产生编码重组杀虫多肽的重组多核苷酸的文库；(b)筛选文库以鉴定优于亲本多核苷酸的编码改良的重组杀虫多肽的重组多核苷酸，所述改良的重组杀虫多肽具有改善的性质；(c)回收编码(b)中鉴定的改进的重组杀虫多肽的重组多核苷酸；和(d)使用步骤(c)中回收的重组多核苷酸作为重复步骤(a)中的多个亲本多核苷酸之一重复步骤(a)、(b)和(c)。

iii.序列比较

如本文所用，术语“同一性”或“百分比同一性”当用于所比对氨基酸序列或所比对核苷酸序列的特定对时，是指通过计数比对中相同匹配的数目并将该相同匹配的数目除以比对序列的长度而获得的百分比氨基酸序列同一性或百分比核苷酸序列同一性。如本文中所用，当针对所比对氨基酸序列或所比对核苷酸序列的特点对使用时，术语“相似性”或“百分比相似性”是指从比对中的每个氨基酸对或每个核苷酸对的评分矩阵获得的得分的总和除以比对序列的长度。

除非另有说明，否则将通过Needleman-Wunsch全局比对和评分算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453)计算同一性和相似性，如使用默认缺口罚分和评分矩阵(对于蛋白质，使用EBLOSUM62，对于DNA使用EDNAFULL)，通过作为EMBOSS软件包的一部分分发的“针”程序(Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.,EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite,2000,Trends in Genetics 16,(6)第276-277页，6.3.1版，可在embnet.org/resource/emboss andemboss.sourceforge.net从EMBnet以及其他来源获得)执行的。也可以使用等效程序。“等效程序”旨在指任何序列比较程序，所述序列比较程序对于考虑的任何两个序列，当与通过来自EMBOSS 6.3.1版的针产生的相应比对相比时，产生具有相同核苷酸残基匹配和相同百分比序列同一性的比对。

另外的数学算法在本领域中是已知的，并且可用于比较两个序列。参见例如Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中改进的。这种算法被并入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序中。可使用BLASTN程序(针对核苷酸序列搜索的核苷酸查询)进行BLAST核苷酸搜索以获得与本发明的杀虫样核酸分子同源的核苷酸序列，或者使用BLASTX程序(针对蛋白质序列搜索的翻译的核苷酸查询)以获得与本发明的杀虫核酸分子同源的蛋白质序列。可使用BLASTP程序(针对蛋白质序列搜索的蛋白质查询)进行BLAST蛋白质搜索以获得与本发明的杀虫蛋白质分子同源的氨基酸序列，或者使用TBLASTN程序(针对翻译的核苷酸序列搜索的蛋白质查询)以获得与本发明的杀虫蛋白分子同源的核苷酸序列。为了获得带缺口的比对以用于比较目的，可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389中所述使用Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。或者，PSI-Blast可用于执行检测分子之间的远程关系的迭代搜索。参见Altschul等(1997)同上。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各个程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。也可通过目测手动进行比对。

当使用确定的氨基酸取代矩阵(例如BLOSUM62)、缺口存在罚分和缺口延伸罚分(以达到该对序列所可能的最高分数)对它们进行比对以进行相似性评分时，两个序列是“最佳比对的”。氨基酸取代矩阵及其在定量两个序列之间的相似性中的用途在本领域中是公知的，并且描述于例如Dayhoff等(1978)"A model of evolutionary change inproteins"，在"Atlas of Protein Sequence and Structure"一书中，第5卷，Suppl.3(M.O.Dayhoff编)，第345-352页，Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.和Henikoff等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919。BLOSUM62矩阵通常用作序列比对方案中的默认评分替换矩阵。对于在比对序列之一中引入单个氨基酸缺口，施加缺口存在罚分，并且对于插入已经打开的缺口中的每个另外的空氨基酸位置，施加缺口延伸罚分。比对由比对开始和结束时的每个序列的氨基酸位置限定，并且任选地通过在一个或两个序列中插入缺口或多个缺口来限定，以便达到最高可能分数。尽管可以手动完成最佳比对和评分，但有利地通过使用计算机实施的比对算法，例如Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中描述的带缺口的BLAST 2.0来实现该方法，所述方法可在国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)向公众开放。包括多重比对的最佳比对可使用例如PSI-BLAST制备，PSI-BLAST可通过www.ncbi.nlm.nih.gov获得，在Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中有描述。

对于最佳地与参考序列比对的氨基酸序列，氨基酸残基“对应于”参照序列中与该残基在比对中配对的位置。“位置”由数字表示，该数字基于参考序列中的每个氨基酸相对于N-末端的位置按顺序标识所述每个氨基酸。例如，在SEQ ID NO:2中，位置1是M，位置2是H，位置3是S等。当测试序列与SEQ ID NO:2最佳比对时，测试序列中与位置3处的S对齐的残基被称为“对应于SEQ ID NO:2的位置3”。由于在确定最佳比对时必须考虑的缺失、插入、截短、融合等，通常通过简单地从N末端计数确定的测试序列中的氨基酸残基编号不一定与参考序列中其相应位置的编号相同。例如，在其中比对的测试序列中存在缺失的情况下，将没有氨基酸对应于参考序列中缺失位点处的位置。当在比对的参考序列中存在插入时，该插入将不对应于参考序列中的任何氨基酸位置。在截短或融合的情况下，参考序列或比对序列中可存在不对应于相应序列中的任何氨基酸的氨基酸段。

iv.抗体

还包括了针对本发明的多肽或其变体或片段的抗体。产生抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.；以及美国专利号4,196,265)。这些抗体可用于检测和分离毒素多肽的试剂盒中。因此，本公开提供了包含特异性结合本文所述多肽的抗体的试剂盒，所述多肽包括例如具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40的序列的多肽。

II.害虫

本文提供的组合物和方法可用于对抗多种害虫。“害虫”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨虫、原生动物病原体、动物寄生肝吸虫等。特别感兴趣的害虫是昆虫害虫，特别是对农业植物造成显著损害的害虫。昆虫害虫包括选自鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目或线虫的害虫。在非限定性实施方案中，昆虫害虫包括西部玉米根虫、玉米根叶甲；草地粘虫、草地贪夜蛾；科罗拉多马铃薯甲虫、马铃薯叶甲；玉米穗虫、玉米穗蛾(在北美相同物种攻击棉花，并因此而被称为棉铃虫)；欧洲玉米钻心虫、欧洲玉米螟；黑色切根虫、小地老虎；小菜蛾、菜蛾；梨豆夜蛾、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)；西南玉米钻心虫、小庶杆草螟；棉铃虫、棉铃虫(在除USA外的世界其他地方发现的)；南方绿色臭椿、南绿椿象；绿臭虫(Greenstinkbug)、Chinavia halaris；棕色大理石纹蝽(Brown marmorated stinkbug)、茶翅蝽(Halyomorpha halys)；和褐臭蝽(brown stink bug),褐美洲蝽(Euschistus servus)、英雄美洲蝽(Euschistus heros)(新热带臭蝽或大豆臭蝽)；盖氏壁蝽(Piezodorusguildinii)(巴氏蝽(red-banded stink bug))；帝麦蝽(Dichelops melacanthus)(无通用名)和/或Dichelops furcatus(无通用名)；蚜虫，诸如大豆蚜。在其他实施方案中，害虫包括线虫，包括但不限于北方根结线虫(meloidogyne hapla)(北方根结线虫)；象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)(花生根结线虫)；和爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)。

如本文中所用，术语"昆虫害虫"是指昆虫和其它类似害虫，诸如例如真螨目的那些昆虫和害虫，包括但不限于螨和蜱。本发明的昆虫害虫包括但不限于鳞翅目的昆虫，例如，小錯螟、西部黑头长翅卷蛾、黑头长翅卷蛾、小黄卷叶蛾、小地老虎、棉叶波紋夜蛾、波林尺蛾(Alsophila pometaria)、脐禮螟蛾(Amyelois transitella)、地中海粉螟(Anagastakuehniella)、桃条麦蛾(Anarsia lineatella)、栎黄条大香蛾(Anisota senatoria)、柞蚕(Antheraea pernyi)、梨豆夜蛾、黄卷蛾属的某一个种，带卷蛾属的某一个种，粗皮夜蛾(Athetis mindara)、桑蚕、棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella)、干果斑螟(Cadracautella)、色卷蛾属的某一个种、Cochylls hospes、苜蓿粉蝶(Colias eurytheme)、米缀蛾(Corcyra cephalonica)、Cydia latiferreanus、苹果蠹蛾、核桃配片舟蛾(Datanaintegerrima)、西伯利亚松毛虫(Dendrolimus sibiricus)、Desmiafeneralis、甜瓜絹野螟(Diaphania hyalinata)、黄瓜絹野螟(Diaphania nitidalis)、小庶杆草螟、小庶杆草螟(Diatraea saccharalis)、白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria)、Eoreuma loftini、烟草粉螟(Esphestia elutella)、Erannis tilaria、盐泽灯蛾(Estigmene acrea)、Euliasalubricola、Eupocoellia ambiguella、女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella)、黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea)、暗缘地老虎(Euxoa messoria)、蜡螟(Galleriamellonella)、梨小食心虫(Grapholita molesta)、黑拟铃蛾(Harrisina americana)、Helicoverpa subflexa、玉米穗蛾、烟芽夜蛾、草原毛虫(Hemileuca oliviae)、向日葵斑螟(Homoeosoma electellum)、美国白蛾(Hyphantia cunea)、番爺莲麦蛾(Keiferialycopersicella)、铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria)、Lambdina fiscellarialugubrosa、雪毒蛾(Leucoma salicis)、葡萄小卷蛾(Lobesia botrana)、黄绿条螟(Loxostege sticticalis)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、Macalla thyrisalis、幕毛虫属的一个种、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、披肩粘虫(Mamestra configurata)、番煎天蛾(Manduca quinquemaculata)、:烟草天蛾(Manduca sexta)、豆荚野螟(Marucatestulalis)、Melanchra picta、冬尺蛾(Operophtera brumata)、古毒蛾属的某一个种、欧洲玉米螟、春尺蠖(Paleacrita vernata)、凤蝶(Papilio cresphontes)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、加州橡树蛾(Phryganidia californica)、斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella)、Pieris napi、菜粉蝶、苜蓿绿夜蛾(Plathypenascabra)、Platynota flouendana、荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)、Platyptiliacarduidactyla、印度谷螟(Plodia interpunctella)、菜蛾、Pontia protodice、一星粘虫(Pseudaletia unipuncta)、大豆尺夜蛾(Pseudoplasia includens)、杂食尺蠖(Sabulodesaegrotata)、红山背舟蛾(Schizura concinna)、麦蛾(Sitotroga cerealella)、苹白小卷蛾(Spilonota ocellana)、斜纹夜蛾属的某一个种、松异舟蛾(Thaurnstopoeapityocampa)、幕谷蛾(Tineola bisselliella)、粉纹夜蛾(Trichoplusia hi)、温室螟蛾(Udea rubigalis)、Xylomyges curiails和苹果巢蛾(Yponomeuta padella)。

昆虫害虫还包括选自双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目、鞘翅目的昆虫。主要作物的本发明的昆虫害虫包括但不限于：玉米：玉米螟(Ostrinia nubilalis)、欧洲玉米钻心虫；小地老虎、黑色切根虫；玉米穗蛾，玉米穗虫；草地贪夜蛾，秋季粘虫；小庶杆草螟，西南玉米螟；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎钻心虫(lesser cornstalk borer)；小庶杆草螟，蔗螟；西部玉米根虫例如，玉米根叶甲；北方玉米根虫，例如，Diabrotica longicornisbarberi；南方玉米根虫，例如Diabrotica undecimpunctata howardi；梳爪叩头虫属的某些种，金针虫；圆头犀金龟(Cyclocephala borealis)，北方蒙面金龟(白蛴螬)；南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)、南部蒙面金龟(白蛴螬)；Popetia japonica、日本甲虫；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria)、玉米跳蚤甲虫；玉米象甲(Sphenophorus maidis)、玉米谷象(maize billbug)；玉米蚜、玉米叶蚜虫；玉米根姆虫(Anuraphis maidiradicis)、玉米根蚜虫；Euschistus heros(新热带棕色臭虫或大豆臭虫)；Piezodorus guildinii(红带臭虫)；Dichelops melacanthus(没有常用名)；Dichelops furcatus(没有常用名)；麦长蝽(Blissus leucopterus)、麦长蝽(chinch bug)；红足黑蝗，红腿蚱蜢；迁飞黑蝗(Melanoplus sanguinipes)、迁徙蚱蜢；灰地种蝇(Hylemya platura)，种子蝇；美洲黍潜绳(Agromyza parvicornis)，玉米斑点潜叶蛾(corn blotch leafminer)；玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscurus)、美洲锥形蓟马(grass thrips)；窃叶蚁(Solenopsismilesta)、窃蚁(thief ant)；二斑叶螨(Tetranychus urticae)、二点叶螨(two-spottedspider mite)；高粱：玉米螟(Chilo partellus)、高粱螟(sorghum borer)；草地贪夜蛾、秋夜蛾；玉米穗蛾、玉米穗虫；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)、小玉米茎钻心虫(leser cornstalk borer)；粒肤地老虎(Feltia Subterranea)、斑点夜蛾(granulatecutworm)；具毛鲍角金龟(Phyllophaga crinita)、白蛴螬；伪金针虫属、宽胸叩头虫属和埃俄罗斯属的某些种，金针虫；黑角负泥虫(Oulema melanopus)、谷物叶甲虫；玉米跳甲、玉米跳蚤甲虫；玉米象甲(Sphenophorus maidis)、玉米谷象；玉米蚜；玉米叶蚜虫；美甘鹿伪毛姆(Sipha flava)、甘蔗黃蚜；长蝽，例如，麦长蝽；高粱瘿蚊、高粱蠓(sorghum midge)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)、胭脂红蜘蛛螨(carmine spider mite)；二斑叶螨、二点叶螨；小麦：线虫粘虫(Pseudaletia unipunctata)、粘虫；草地贪夜蛾、秋夜蛾；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)、小玉米茎钻心虫；Agrotis orthogonia、西部灰地老虎；南美玉米苗斑螟、小玉米茎钻心虫；黑角负泥虫、谷物叶甲虫；三叶草叶象(Hyperapunctata)、车轴草叶象虫；南方玉米根虫，例如黄瓜十一星叶甲(Diabroticaundecimpunctata)；俄罗斯小麦蚜；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)、麦二叉蚜(greenbug)；麦长管蚜(Macrosiphum avenae)、英国谷物蚜；红足黑蝗、红腿蚱蜢；异黑蝗、长额负蝗(differential grasshopper)；迁飞黑蝗、迁徙蚱蜢；小麦瘿蚊、黑森瘿蚊(Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana)、麦蠓；美洲麦秆蝇(Meromyzaamericana)、小麦茎蛆(wheat stem maggot)；麦地种绳(Delia coarctata)、小麦球蝇(wheat bulb fly)；马铃薯蓟马(Frankliniella fusca)、烟草蓟马；麦茎蜂(Cephuscinctus)、小麦茎蝇(wheat stem sawfly)；郁金香瘤瘦螨(Aceria tulipae)、小麦卷曲螨；向日葵：Cylindrocupturus adspersus、向日葵茎象甲；Smicronyx fulus、红色向日葵种子象鼻虫；Smicronyx sordidus、灰色向日葵种子象鼻虫；向日葵芽蛾(Suleimahelianthana)、向日葵芽蛾；向日葵斑螟(Homoeosoma electellum)、向日葵蛾；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis)、向日葵甲虫；胡萝卜利犀金龟(Bothyrus gibbosus)、胡萝卜甲虫；向日葵杆瘦蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)，向日葵种子；棉花：烟芽夜蛾，烟芽夜蛾；玉米穗蛾、棉铃虫；甜菜夜蛾、甜菜粘虫(beet armyworm)；棉红铃虫、粉红棉铃虫；棉铃象鼻虫，例如，棉铃象(Anthonomus grandis)；棉蚜(Aphis gossypii)、棉蚜；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)、棉蚤；茼麻粉風(Trialeurodes abutilonea)、纹翅粉虱(bandedwinged whitefly)；牧草盲棒(Lygus lineolaris)、失去光泽的植物虫(tarnishedplant bug)；红足黑蝗、红腿蚱蜢；异黑蝗、长额负蝗；棉蓟马、洋葱蓟马；烟草蓟马(Franklinkiella fusca)、烟草蓟马(tobacco thrips)；朱砂叶螨、棉红蜘蛛螨；二斑叶螨、二点叶螨；稻：小庶杆草螟、甘蔗螟；草地夜蛾、秋夜蛾；玉米穗蛾、玉米穗虫；葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea)、葡萄肖叶甲；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)、水稻象鼻虫(rice water weevil)；米象(Sitophilus oryzae，rice weevil)；黑尾叶蝉(Nephotettixnigropictus)、稻叶蝉(rice leafhopper)；长蝽，例如，美洲毛谷杆长蝽(Blissusleucopterus)；喜绿虫春(Acrosternum hilare,green stink bug)；大豆：大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、大豆尺蠖(soybean looper)；梨豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis,velvetbean caterpillar)；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra,greencloverworm)；玉米螟、欧洲玉米钻心虫；小地老虎、黑地蚕；甜菜夜蛾、甜菜粘虫；烟芽夜蛾、菸夜蛾(tobacco budworm)；玉米穗蛾、棉铃虫；墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)、墨西哥豆甲虫；桃蚜(Myzus persicae)，绿桃蚜；香豆微叶虫单(Empoasca fabae)、马铃薯微叶蝉(potato leafhopper)；拟绿棒(Acrosternum hilare)、绿蝽；红足黑蝗、红腿蚂蚱；异黑蝗、长额负蝗；灰地种蝇、种蝇；豆蓟马(Sericothrips variabilis)、大豆蓟马、棉蓟马、葱蓟马；土耳其斯坦叶螨、草莓蜘蛛螨；二斑叶螨、二点叶螨；大麦：玉米螟、欧洲玉米钻心虫、小地老虎、黑色切根虫；麦二叉蚜、麦二叉蚜；麦长蝽(chinch bug)，例如美洲毛谷杆长蝽；拟绿蝽、绿蝽、褐臭蝽(Euschistus servus)、褐臭椿(brown stink bug)；玉米种蝇、玉米种蛆；小麦瘿蚊、黑森瘿蚊；麦岩螨(Petrobia latens)、棕色小麦螨；油籽油菜(Oil SeedRape)：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)、甘蓝蚜(cabbage aphid)；蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae)、十字花科跳甲(crucifer flea beetle)；黄条叶蚤(Phyllotreta striolata)、黄条跳甲(striped flea beetle)；大豆淡足跳甲(Phyllotreta nemorum)、条纹芜菁跳甲(striped turnip flea beetle)；油菜花露尾甲(Meligethes aeneus)、菜籽甲虫(rapeseed beetle)；以及露尾甲Meligethes rufimanus、Meligethes nigrescens、Meligethes canadianus和Meligethes viridescens；马铃薯：马铃薯叶甲、科罗拉多马铃薯甲虫。

本文提供的方法和组合物可以有效地抗半翅目诸如豆荚盲蝽(Lygus hesperus)、美洲牧草盲棒(Lygus lineolaris)、牧草盲蝽(Lygus pratensis)、LygusrugulipennisPopp、Lygus pabulinus、马铃薯盲蝽(Calocoris norvegicus)、Orthopscompestris、苹盲蝽(Plesiocoris rugicollis)、Cyrtopeltis modestus、黑斑烟盲蝽(Cyrtopeltis notatus)、白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus)、Diaphnocorischlorinonis、Labopidicola allii、棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)、苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris rapidus)、四线盲蝽(Poecilocapsus lineatus)、麦长蝽、小长蝽(Nysiusericae)、Nysius raphanus、褐美洲蝽、南绿椿象、扁盾蝽属、緣蝽科、紅蝽科、谷蛾科、负蝽科、猎蝽科和臭虫科。目标害虫包括咖啡豆象(Araecerus fasciculatus)、咖啡豆象(coffee bean weevil)；菜豆象(Acanthoscelides obtectus)、豆象(bean weevil)；Bruchus rufmanus、蚕豆象(broadbean weevil)；豌豆象(Bruchus pisorum)、豌豆象虫(pea weevil)；巴西豆象(Zabrotes subfasciatus)、墨西哥豆瓢虫(Mexican beanweevil)；带斑黄瓜叶甲(Diabrotica balteata)、带状黄瓜甲虫(banded cucumberbeetle)；菜豆萤叶甲(Cerotoma trifurcata)、豆叶甲虫(bean leaf beetle)；玉米根叶甲、墨西哥玉米根虫(Mexican corn rootworm)；黄瓜跳甲(Epitrix cucumeris)、马铃薯跳甲；甘薯叶甲(Chaetocnema confinis)、甘薯跳甲(sweet potato flea beetle)；紫苜蓿叶象、:苜蓿叶象虫；苹果花象(Anthonomus quadrigibbus)、苹果象虫；豆茎象(Sternechuspaludatus)、豆茎象(bean stalk weevil)；Hypera brunnipennis、埃及苜蓿象鼻虫；谷象(Sitophilus granaries)、谷象(granary weevil)；葡萄象(Craponius inaequalis)、葡萄象甲(grape curculio)；玉米象(Sitophilus zeamais)、玉米象鼻虫；梅球颈象(Conotrachelus nenuphar)、梅象(plum curculio)；Euscepes postfaciatus、西印度甘薯象(West Indian sweet potato weevil)；栗色绒金龟(Maladera castanea)、亚洲花园甲虫(Asiatic garden beetle)；欧洲切根腮金龟(Rhizotrogus majalis)、欧洲金龟子(European chafer)；蔷薇鲍角金龟(Macrodactylus subspinosus)、玫瑰金龟子；杂拟谷盗(Triboliumconfusum)、杂拟谷盗；黄粉虫(Tenebrio molitor)、黑粉虫(dark mealworm)；赤拟谷盗、赤拟谷盗(red flour beetle)；黄粉虫、黄粉虫(yellow mealworm)。

在一些实施方案中，本公开的杀虫蛋白对昆虫害虫具有杀虫活性，所述害虫对苏云金芽孢杆菌的一种或多种菌株或由苏云金杆菌的一种或更多种菌株产生的一种或多种毒素蛋白具有抗性。如本文所用，与昆虫害虫有关的术语“抗性”是指在存在毒素的情况下不会死亡，或者与不存在毒素时害虫的生长相比，在存在毒素时不会表现出生长减少的昆虫害虫。在某些实施方案中，本公开的杀虫蛋白具有针对昆虫害虫的杀虫活性，所述昆虫害虫对Cry34/Cry35、Cry3Bb、Cry2Ab2和Vip3A中的任何一种具有抗性。在特定的实施方案中，本公开的杀虫蛋白对针对Cry34/Cry35和Cry3Bb中的一种或多种具有抗性的鞘翅目害虫(包括但不限于西方玉米根虫)具有杀虫活性。在一些实施方案中，本公开的杀虫蛋白对鳞翅目害虫(包括但不限于秋粘虫)具有杀虫活性，所述害虫对Cry2Ab2和Vip3A中的一种或多种具有抗性。

线虫包括寄生线虫，如根结线虫，囊肿和病变线虫，包括异皮线虫属的某些种、根结线虫属的某些种和球孢囊线虫属的某些种；特别是囊线虫的成员，包括但不限于大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode))；甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)(甜菜胞囊线虫)；禾谷胞嚢线虫(Heterodera avenae)(谷类囊肿线虫)；以及马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globoderapailida)(马铃薯囊肿线虫)。病变线虫包括短体线虫的某些种。

可在早期发育阶段(例如如幼虫或其它未成熟形式)测试本发明的组合物对昆虫害虫的杀虫活性。可将昆虫在约20℃至约30℃和约30％至约70％相对湿度的完全黑暗中饲养。可如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83(6):2480-2485所述进行生物测定。也参见本文的实验部分。

III.表达盒

可在表达盒中提供编码本文提供的杀虫蛋白的多核苷酸以用于在目标生物中表达。所述表达盒将包括可操作地连接于编码本文提供的杀虫多肽的多核苷酸的5'和3'调控序列，其允许所述多核苷酸表达。所述表达盒可另外含有至少一种另外的基因或遗传元件，以共转化到生物体中。在包括其他基因或元件的情况下，可操作地连接组分。或者，可在多个表达盒上提供另外的基因或元件。此类表达盒具有多个限制性位点和/或重组位点，用于插入多核苷酸以使其处于调节区的转录调节之下。表达盒可另外含有选择标记基因。

表达盒将以5'-3'的转录方向包含转录和翻译起始区(即启动子)、本发明的杀虫多核苷酸，以及在目标生物体即植物或细菌中具有功能的转录和翻译终止区(即终止区)。本发明的启动子能够在宿主细胞中指导或驱动编码序列的表达。调节区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)对宿主细胞或彼此可以是内源的或异源的。如本文所用，关于序列的“异源的”是源自外来物种的序列，或者，如果来自相同物种，则通过有意的人为干预从组合物和/或基因组基因座中的其天然形式实质性修饰而来。如本文中所用，嵌合基因包含与转录起始区可操作地连接的编码序列，所述转录起始区与编码序列是异源的。

方便的终止区可从根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒获得，诸如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另见Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon等(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等(1990)PlantCell2:1261-1272；Munroe等(1990)Gene 91:151-158；Ballas等(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891-7903；以及Joshi等(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。

另外的调控信号包括但不限于转录起始起始位点、操纵子、激活子、增强子、其他调控元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。参见例如美国专利号5,039,523和4,853,331；EPO 0480762A2；Sambrook等(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Maniatis等编(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)，在下文中为"Sambrook 11"；Davis等编(1980)Advanced Bacterial Genetics(Cold SpringHarbor Laboratory Press),Cold Spring Harbor,N.Y.，以及本文中引用的参考文献。

在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以便以适当的方向，以及在适当的情况下在适当的阅读框中提供DNA序列。为此，可使用衔接子或接头连接DNA片段，或者可采用其他操作来提供方便的限制性位点，除去多余的DNA，除去限制性位点等。为此目的，可采用体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换例如转换和颠换。

可将许多启动子用于实施本发明。可以基于期望的结果选择启动子。可将核酸与组成型、诱导型、组织偏爱型或其他启动子组合，以用于在目标生物体中表达。参见例如WO99/43838和美国专利号8,575,425、7,790,846、8,147,856、8,586832、7,772,369、7,534,939、6,072,050、5,659,026、5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611(通过引用并入本文)中所示的启动子。

对于在植物中的表达，组成型启动子还包括CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白启动子(McElroy等(1990)Plant Cell 2:163-171)；遍在蛋白启动子(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU启动子(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS启动子(Velten等(1984)EMBO J.3:2723-2730)。诱导型启动子包括驱动发病机制-相关蛋白(PR蛋白)的表达的那些启动子，所述启动子在被病原体感染后被诱导。参见例如Redolfi等(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254；Uknes等(1992)Plant Cell4:645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4:111-116；和WO 99/43819，通过引用并入本文。还可使用在病原体感染部位或其附近局部表达的启动子(Marineau等(1987)PlantMol.Biol.9:335-342；Matton等(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331；Somsisch等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2427-2430；Somsisch等(1988)Mol.Gen.Genet.2:93-98；以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:14972-14977；Chen等(1996)Plant J.10:955-966；Zhang等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2507-2511；Warner等(1993)Plant J.3:191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1:961-968；Cordero等(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189-200；美国专利号5,750,386(线虫诱导型)；以及本文引用的参考文献)。

伤口诱导型启动子可用于本发明的构建体。此类伤口诱导型启动子包括pin II启动子(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28:425-449；Duan等(1996)Nature Biotechnology14:494-498)；wun1和wun2(U.S.Patent No.5,428,148)；win1和win2(Stanford等(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208)；系统素(McGurl等(1992)Science225:1570-1573)；WIP1(Rohmeier等(1993)Plant Mol.Biol.22:783-792；Eckelkamp等(1993)FEBS Letters 323:73-76)；MPI基因(Corderok等(1994)Plant J.6(2):141-150)等，通过引用整体并入本文。

用于本发明的组织偏爱型启动子包括以下文献中所示的那些组织偏爱型启动子：Yamamoto等(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343；Russell等(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp等(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini等(1996)PlantPhysiol.112(2):513-524；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco等(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590和Guevara-Garcia等(1993)Plant J.4(3):495-505.

叶偏爱型启动子包括以下文献中所示的启动子：Yamamoto等(1997)Plant J.12(2):255-265；Kwon等(1994)Plant Physiol.105:357-67；Yamamoto等(1994)Plant CellPhysiol.35(5):773-778；Gotor等(1993)Plant J.3:509-18；Orozco等(1993)PlantMol.Biol.23(6):1129-1138和Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590。

根偏爱型启动子是已知的，包括以下文献中描述的那些启动子：Hire等(1992)Plant Mol.Biol.20(2):207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell3(10):1051-1061(根特异性控制元件)；Sanger等(1990)Plant Mol.Biol.14(3):433-443(根癌土壤杆菌的甘露碱合酶(MAS)基因)；和Miao等(1991)Plant Cell 3(1):11-22(胞质谷氨酰胺合成酶(GS))；Bogusz等(1990)Plant Cell2(7):633-641；Leach和Aoyagi(1991)Plant Science(Limerick)79(1):69-76(rolC和rolD)；Teeri等(1989)EMBO J.8(2):343-350；Kuster等(1995)Plant Mol.Biol.29(4):759-772(VfENOD-GRP3基因启动子)；和Capana等(1994)Plant Mol.Biol.25(4):681-691(rolB启动子)。另见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。

“种子偏爱型”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(在种子萌发期间有活性的那些启动子)。参见Thompson等(1989)BioEssays 10:108。种子偏爱型启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO 00/11177和美国专利号6,225,529)。γ-玉米醇溶蛋白是胚乳特异性启动子。球蛋白1(Glb-1)是一种代表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于豆β-菜豆素、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、蜡质、shrunken 1、shrunken 2、球蛋白1等的启动子。参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏爱型启动子。

为了在细菌宿主中表达，在细菌中有功能的启动子是本领域熟知的。此类启动子包括任何已知的晶体蛋白基因启动子，包括本发明的任何杀虫蛋白的启动子，和对苏云金芽孢杆菌sigma因子特异的启动子。或者，可对诱变或重组晶体蛋白编码基因启动子进行重组工程化并将其用于促进本文公开的新型基因区段的表达。

表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择标记基因。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，诸如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物诸如草铵膦铵、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D)抗性的基因。其他选择标记是已知的，并且可以使用任何标记。参见例如2014年12月19日提交的美国临时申请62/094,697和2015年7月7日提交的美国临时申请62/189,505，两者均通过引用整体并入本文，其公开了可用作选择标记的草铵膦抗性序列。参见例如2015年12月18日提交的PCT/US2015/066648，其通过引用整体并入本文，其公开了可用作选择标记的草铵膦抗性序列。

IV.方法、宿主细胞和植物细胞

如所指出的，包含编码杀虫蛋白或其活性变体或片段的核苷酸序列的DNA构建体可用于转化目标植物或其他目标生物。转化方法包括将核苷酸构建体引入植物中。“引入”旨在以使得构建体进入植物细胞或宿主细胞内部的方式将核苷酸构建体引入植物或其他宿主细胞。本发明的方法不需要用于将核苷酸构建体引入植物或宿主细胞的特定方法，只需要核苷酸构建体可进入植物或宿主生物的至少一个细胞的内部。将核苷酸构建体引入植物和其他宿主细胞的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

所述方法产生转化的生物，诸如植物，包括完整植物以及植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或“转化植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已掺入或整合编码至少一种本发明杀虫多肽的多核苷酸的植物。应承认，也可将其他外源或内源核酸序列或DNA片段掺入植物细胞中。土壤杆菌和基因枪介导的转化仍然是两种主要使用的方法。然而，转化可通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微喷射、基因枪或微粒轰击、电穿孔、二氧化硅/碳纤维、超声介导、PEG介导、磷酸钙共沉淀、聚阳离子DMSO技术、DEAE葡聚糖程序、土壤杆菌和病毒介导的(花椰菜花叶病毒、双粒病毒、RNA植物病毒)、脂质体介导的技术等来进行。

转化方案以及用于将多肽或多核苷酸序列引入植物的方案可以根据被靶向转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而变化。转化方法是本领域已知的，包括美国专利号8,575,425、7,692,068、8,802,934、7,541,517(其每一个通过引用并入本文)中所示的那些转化方法。也参见Rakoczy-Trojanowska,M.(2002)Cell Mol BiolLett.7:849-858；Jones等(2005)Plant Methods 1:5；Rivera等(2012)Physics of LifeReviews 9:308-345；Bartlett等(2008)Plant Methods 4:1-12；Bates,G.W.(1999)Methods in Molecular Biology111:359-366；Binns和Thomashow(1988)Annual Reviewsin Microbiology 42:575-606；Christou,P.(1992)The Plant Journal2:275-281；Christou,P.(1995)Euphytica 85:13-27；Tzfira等(2004)TRENDS in Genetics 20:375-383；Yao等(2006)Journal of Experimental Botany 57:3737-3746；Zupan和Zambryski(1995)Plant Physiology 107:1041-1047；Jones等(2005)Plant Methods1:5；

转化可导致核酸稳定或瞬时掺入细胞中。“稳定转化”旨在意指引入宿主细胞的核苷酸构建体整合到宿主细胞的基因组中并且能够被其后代遗传。“瞬时转化”旨在意指多核苷酸被引入宿主细胞并且不整合到宿主细胞的基因组中。

转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如Svab等(1990)Proc.Nail.Acad.Sci.USA 87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。该方法依赖于含有选择标记的DNA的粒子枪递送以及DNA通过同源重组靶向至质体基因组。另外，可通过核编码的且质体定向的RNA聚合酶的组织偏爱型表达反式活化质体携带的沉默转基因来实现质体转化。已在McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7301-7305报导了此类系统。

可以按照常规方法将已转化的细胞生长成植物中。参见例如McCormick等(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后可使这些植物生长，并用相同的转化品系或不同品系授粉，并鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得杂交体。可以生长两代或更多代以确保所需表型特征的表达得以稳定维持和遗传，然后收获种子以确保实现所需表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，其具有稳定地掺入其基因组中的本发明的核苷酸构建体，例如本发明的表达盒。

在具体的实施方案中，本文提供的序列可被靶向到宿主细胞或植物细胞的基因组内的特定位点。此类方法包括但不限于针对目标植物基因组序列设计的大范围核酸酶(D'Halluin等2013Plant Biotechnol J)；CRISPR-Cas9、TALEN和用于精确编辑基因组的其他技术(Feng，等Cell Research 23:1229-1232,2013,Podevin等Trends Biotechnology，在线公开，2013,Wei等，J Gen Genomics,2013,Zhang等(2013)WO 2013/026740)；Cre-lox位点特异性重组(Dale等(1995)Plant J 7:649-659；Lyznik等(2007)Transgenic Plant J1:1-9；FLP-FRT重组(Li等(2009)Plant Physiol 151:1087-1095)；Bxb1-介导的整合(Yau等Plant J(2011)701:147-166)；锌指介导的整合(Wright et al.(2005)Plant J 44:693-705)；Cai等(2009)Plant Mol Biol69:699-709)；和同源重组(Lieberman-Lazarovich和Levy(2011)Methods Mol Biol 701:51-65)；Puchta(2002)Plant Mol Biol48:173-182)。

本文提供的序列可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目标植物的实例包括但不限于玉米(玉蜀黍)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜、芸苔属的种、苜蓿、黑麦、小米、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括但不限于番茄、莴苣、青豆、利马豆、豌豆和黄瓜属(Curcumis)的成员诸如黄瓜、哈密瓜和麝香瓜。观赏植物包括但不限于杜鹃花、绣球花、芙蓉、玫瑰、郁金香、水仙花、矮牵牛花、康乃馨、一品红和菊花。优选地、本发明的植物是农作物(例如玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜等)。

如本文中所用，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、植物可从其再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛和植物中完整的植物细胞或植物的部分如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、果仁、穗、玉米棒、果壳、茎、根、根尖、花药等。谷物旨在意指由商业种植者生产的用于除种植或繁殖物种之外的目的的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含引入的多核苷酸。还提供了保留本文公开的序列的经加工的植物产品或副产品，包括例如豆粕。

在另一个实施方案中，编码杀虫蛋白的基因可用于转化生物体，从而创建昆虫病原性生物。此类生物包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。可以选择已知占据一种或多种目标作物的“植物圈”(叶面、叶圈、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中与野生型微生物成功竞争，提供表达杀虫蛋白的基因的稳定维持和表达，并且理想地提供使杀虫剂免受环境降解和失活的改进的保护作用。

此类微生物包括古细菌、细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，诸如细菌，例如芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、甲基葡萄球菌属(Methylius)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属(Alcaligenes)。真菌包括酵母，例如酵母属、隐球菌属、克鲁维酵母属、掷孢酵母属、红酵母属和短梗霉属。特别令人感兴趣的是此类植物圈细菌物种，如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、农杆菌属(Agrobacteria)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandir)，和植物圈酵母物种，诸如胶红酵母菌(Rhodotorula rubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海洋红酵母(R.marina)、澄黄红酵母菌(R.aurantiaca)、白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗茜糖酵母(Saccharomyces rosei)、善地糖酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粉红掷孢酵母(Sporobolomycesrosues)、香味掷抱酵母(S.odorus)、维罗纳克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。

革兰氏阴性和革兰氏阳性的示例性原核生物包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)和变形杆菌属(Proteus)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiceae)诸如根瘤菌属(Rhizobium)；螺菌科(Spirillaceae)诸如发光杆菌属(photobacterium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺旋菌属(Spirillum)；乳酸细菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，如假单胞菌和醋杆菌；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。真菌包括藻菌纲(Phycomycetes)和子囊菌纲(Ascomycetes)，例如酵母，例如酵母属和裂殖酵母属；和担子菌纲酵母，例如红酵母属、短梗霉属、掷孢酵母属等。

可以通过电转化、PEG诱导的转化、热休克、转导、接合等引入编码杀虫蛋白的基因。具体地，可将编码杀虫蛋白的基因克隆到穿梭载体中，例如pHT3101(Lerecius等(1989)FEMS Microbiol.Letts.60:211-218)。可以例如通过电穿孔将包含特定杀虫蛋白基因的编码序列的穿梭载体pHT3101转化到根定殖的芽孢杆菌中(Lerecius等(1989)FEMSMicrobiol.Letts.60:211-218)。

可以设计表达系统，使得通过将合适的信号肽与杀虫蛋白的氨基末端融合，从而将杀虫蛋白分泌到革兰氏阴性细菌的细胞质外。被大肠杆菌识别的信号肽包括OmpA蛋白(Ghrayeb等(1984)EMBO J,3:2437-2442)。

可在细菌宿主中对杀虫蛋白及其活性变体进行发酵，加工所得细菌，并且以与苏云金芽孢杆菌菌株被用作杀虫喷雾剂相同的方式将其用作微生物喷雾。在从芽孢杆菌分泌的杀虫蛋白的情况下，使用本领域已知的方法除去或突变分泌信号。此类突变和/或缺失防止杀虫蛋白在发酵过程中分泌到生长培养基中。杀虫蛋白保留在细胞内，然后处理细胞以产生包封的杀虫蛋白。

或者，通过将异源基因引入细胞宿主中或通过在其天然细胞中表达杀虫蛋白来产生所述杀虫蛋白。异源基因或天然基因的表达直接或间接地导致杀虫剂的细胞内产生和维持。然后在当将细胞施用于目标害虫的环境时会延长细胞中产生的毒素活性的条件下处理这些细胞。所得产物保留了毒素的毒性。然后可按照常规技术配制这些杀虫蛋白，以应用于容纳目标害虫的环境，例如土壤、水和植物的叶子。参见，例如美国专利号6,468,523和美国公开号20050138685，以及其中引用的参考文献。在本发明中，转化的微生物或天然微生物(其包括完整生物、细胞、孢子、杀虫蛋白、杀虫成分、有害生物的成分、突变体、活细胞或死细胞和细胞组分，包括活细胞和死细胞和细胞组分的混合物，包括破碎的细胞和细胞组分)或分离的杀虫蛋白可以制成配方，并且可以用可接受的载体配制成杀虫或农业组合物，其为例如液体、悬浮液、溶液、乳液、粉剂、粉末、丸剂、颗粒、可分散的颗粒、可湿性粉剂、无水可流动组合物、可分散可流动组合物、可湿性颗粒组合物、喷雾干燥细胞组合物、可乳化的浓缩物、气溶胶、浸渍颗粒、佐剂、可涂覆的糊剂、喷雾、胶体、水溶液、基于油的溶液，以及例如聚合物物质中的包封物。

农业组合物可包含本文公开的多肽、其重组源多肽或变体或片段，或者表达杀虫多肽的异源微生物或包含杀虫蛋白的天然微生物。可将本文公开的农业组合物施用于植物或栽培区域的环境，或施用于植物、植物部分、植物细胞或种子。

上述公开的此类组合物可进一步包括加入表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、喂食刺激剂、引诱剂、包封剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外线防护剂、缓冲剂、流动剂或肥料、微量营养素供体或影响植物生长的其他制剂来获得。可将一种或多种农用化学品，包括但不限于除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收获助剂和肥料与配制领域内常用的载体、表面活性剂或佐剂或其它组分组合，以促进产品的处理和针对特定目标害虫的应用。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并且对应于配制技术中通常使用的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。本发明的活性成分通常以组合物的形式施用，并且可以施用于待处理的作物区域、植物或种子。例如，可将本发明的组合物施用于准备在谷物仓或筒仓等中储存的谷物或在储存期间应用于谷物。本发明的组合物可以与其他化合物同时或相继施用。施用本发明的活性成分或含有至少一种由本发明的细菌菌株产生的杀虫蛋白的本发明农业化学组合物的方法包括但不限于叶面施用、种子包衣、和土壤施用。施用次数和施用率取决于相应害虫的侵染强度。

合适的表面活性剂包括但不限于阴离子化合物诸如，例如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单酯或二酯或这些酯的盐；脂肪醇硫酸盐诸如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐诸如烷基-苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐，例如丁基-萘磺酸盐；磺化萘-甲醛缩合物的盐；磺化苯酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐诸如酰胺磺酸盐，例如油酸的磺化缩合产物和N-甲基牛磺酸；或二烷基磺基琥珀酸盐，例如琥珀酸二辛酯的磺酸钠。非离子试剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪-烷基-或烯基-取代的酚与环氧乙烷的缩合产物、多元醇醚的脂肪酯，例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯，此类酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、环氧乙烷和环氧丙烷、乙炔二醇诸如2,4,7,9-四乙基-5-癸基-4,7-二醇或乙氧基化乙炔二醇的嵌段共聚物。阳离子表面活性剂的实例包括，例如，脂族单-、二-或多胺诸如乙酸盐、环烷酸盐或油酸盐；或含氧胺诸如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过羧酸与二胺或多胺缩合制备的酰胺-连接的胺；或季铵盐。

惰性材料的实例包括但不限于无机矿物质诸如高岭土、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或植物材料诸如软木、粉状玉米棒、花生壳、稻壳和核桃壳。

本发明的组合物可呈用于直接施用的合适形式或作为主要组合物的浓缩物，所述浓缩物在施用前需要用适量的水或其它稀释剂稀释。杀虫浓度将根据具体制剂的性质而变化，具体而言，无论其是浓缩物还是要被直接使用。该组合物含有1％至98％的固体或液体惰性载体和0％至50％或0.1％至50％的表面活性剂。这些组合物将以商品的标记比率(例如当以干燥形式施用时约0.01lb-5.0lb/英亩，当以液体形式施用时约0.01pts.-10pts/英亩)施用。

在另外的实施方案中，可在配制之前处理本文提供的组合物以及转化的微生物和杀虫蛋白，以在施用于目标害虫的环境时延长杀虫活性，只要预处理对杀虫活性无害即可。只要处理不会有害地影响组合物的性质，这种处理可以通过化学和/或物理手段进行。化学试剂的实例包括但不限于卤化剂；醛类诸如甲醛和戊二醛；抗感染剂，诸如苯扎氯铵；醇类，诸如异丙醇和乙醇；和组织学固定剂，如Bouin's固定剂和Helly's固定剂(参见例如，Humason(1967)Animal Tissue Techniques(W.H.Freeman and Co.)。

关于植物害虫的“控制”或“控制”是指抑制或减少植物害虫的生长、取食、繁殖力、繁殖和/或增殖或者杀死(例如导致发病率或死亡率，或繁殖力降低)中的一种或多种。因此，用本文提供的杀虫多肽或蛋白质、包含杀虫多肽或蛋白的组合物处理的植物和/或表达杀虫多肽或蛋白的植物可以显示害虫侵扰减少，或由害虫引起的损害减少统计学上显著的量。在特定的实施方案中，“控制”和“保护”植物免受害虫侵害是指抑制或减少害虫的生长、发芽、繁殖和/或增殖中的一种或多种；和/或杀死、移除、破坏或以其他方式减少有害生物的发生和/或活动。因此，用本文提供的杀虫蛋白处理的植物和/或表达本文提供的杀虫蛋白的植物在存在植物害虫的情况下可以显示出统计学上显著量的疾病或损害的严重程度降低或发展减少。

本文提供了控制昆虫害虫对植物的损害的方法，包括在植物或其细胞中表达编码本文提供的杀虫多肽的核酸分子。还提供了控制植物害虫和/或由植物害虫引起的损害的方法，所述方法包括将有效量的至少一种本文提供的杀虫多肽或其活性变体和/或衍生自其的组合物施用于具有植物病虫害和/或损害的植物，其中所述杀虫多肽和/或衍生自其的组合物控制引起所述植物疾病或损害的植物害虫。在特定的实施方案中，所述植物损害是由昆虫害虫引起的。

在一个方面，通过将本文提供的杀虫蛋白施用于给定的区域，可以在该区域中杀死或减少害虫的数量。或者，可将杀虫蛋白预防性施用于环境区域以防止易感害虫侵染。优选地，害虫摄入杀虫有效量的多肽或将其与杀虫有效量的多肽接触。“杀虫有效量”旨在指能够使至少一种害虫死亡，或显著减少害虫生长、摄食或正常生理发育的杀虫剂的量。该量将根据诸如以下因素而变化，例如，待控制的特定目标害虫、特定环境、位置、植物、作物或待处理的农业场所、环境条件以及杀虫有效的多肽组合物的施用的方法、速率、浓度、稳定性和量。制剂或组合物还可以在气候条件、环境考虑因素和/或施用频率和/或害虫侵染的严重性方面变化。

活性成分通常以组合物的形式施用，并且可被施用于待处理的作物区域、植物或种子。因此，提供了用于向植物、植物细胞、种子、植物部分或栽培区域提供有效量的农业组合物的方法，所述农业组合物包含多肽、重组多肽或其活性变体或片段。“有效量”旨在指蛋白质或组合物的量具有杀虫活性，其足以杀死或控制害虫或导致害虫生长、摄食或正常生理发育的显著减少。数量、害虫生长、摄食或正常发育的这种减少可包括任何统计学上显著的减少，包括例如约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、95％或更高的减少。

例如，可将组合物施用于准备在谷物仓或筒仓等中储存的谷物或在谷物仓或筒仓等储存期间施用于谷物。组合物可以与其他化合物同时或相继施用。施用包含至少一种本文公开的多肽、重组多肽或其变体或片段的活性成分或农业化学组合物的方法包括但不限于叶面施用、种子包衣和土壤施用。

提供了增加植物产量的方法。所述方法包括提供表达编码本文公开的杀虫多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞，并使所述植物或其种子在被所述多肽对其具有杀虫活性的害虫侵染(或易受其侵染)的田地中生长。在一些实施方案中，所述多肽具有针对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫害虫的杀虫活性，并且所述田地被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫害虫侵染。如本文所定义，植物的“产量”是指植物产生的生物质的质量和/或数量。“生物质”旨在指任何测量的植物产品。生物量产量的增加是所测量的植物产品的产量的任何提高。增加植物产量具有几个商业应用。例如，增加植物叶子生物量可以增加用于人或动物消费的叶类蔬菜的产量。另外，增加叶生物量可用于增加植物来源的药物或工业产品的产量。产量的增加可包括相较于不表达杀虫序列的植物有任何统计上显著的增加，包括但不限于产量的至少1％的增加、至少3％的增加、至少5％的增加、至少10％的增加、至少20％的增加、至少30％的增加、至少50％的增加、至少70％的增加、至少100％或更高的增加。在具体方法中，由于表达本文公开的杀虫蛋白的植物的害虫抗性改善，因此植物产量增加。杀虫蛋白的表达导致害虫侵染或摄食的能力降低。

进一步提供了一种用于保护植物免受昆虫害虫侵害的方法，包括在植物或其细胞中表达编码杀虫多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：(a)编码包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40中任一所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；或(b)编码包含与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和/或40中所示序列的氨基酸序列具有至少表1中所列百分比序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

植物也可以用一种或多种化学组合物处理，包括一种或几种除草剂、杀虫剂或杀真菌剂。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸，包括SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和/或39中所示的那些多核苷酸，可以与感兴趣的多核苷酸序列的任何组合堆叠，以产生具有所需性状的植物。如本文所用，性状是指衍生自特定序列或序列组的表型。例如，本发明的多核苷酸可以与编码具有杀害虫和/或杀昆虫活性的多肽的任何其他多核苷酸堆叠，例如其他苏云金芽孢杆菌毒性蛋白(描述于美国专利5366892；5747450；5737514；5723756；5593881；和Geiser等人(1986)Gene 48:109)、凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol Biol.24:825)、戊聚糖(pentin)(描述于美国专利5981722)等。所产生的组合还可以包括本文提供的任何一种多核苷酸的多个拷贝。本发明的多核苷酸也可以与任何其他基因或基因组合堆叠，以产生具有多种所需性状组合的植物，包括但不限于动物饲料所需性状，例如高油基因(例如美国专利No.6232529)；平衡氨基酸(例如激素硫蛋白(美国专利5990389、5885801、5885802和5703409)；大麦高赖氨酸(Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem 165:99-106；和WO 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261:6279；Kirihara等人(1988)基因71:359；和Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.12:123)；增加的消化性(例如改良的储存蛋白(美国申请序列号10/053410，2001年11月7日提交)；和硫氧还蛋白(2001年12月3日提交的美国申请序列号10/005429)；其公开内容通过引用结合于此。

本发明的多核苷酸还可以与疾病或除草剂抗性所需的性状(例如伏马菌素解毒基因(美国专利号5792931)；无毒和抗病基因(Jones等人(1994)Science 266:789；Martin等人(1993)Science 262:1432；Mindrinos等人(1994)Cell 78:1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂，如膦丝菌素或basta(如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；以及加工或加工产品如高油所需的特性(例如美国专利6232529)；改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利5952544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(例如美国专利号5.602321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等(1988)J.Bacteriol.170:5837-5847)促进多羟基烷酸酯(PHA)的表达)；其公开内容通过引用并入本文。还可以将本发明的多核苷酸与提供农艺性状如雄性不育(例如参见美国专利5,583,210)、茎强度、开花时间或转化技术性状如细胞周期调节或基因靶向的多核苷酸组合(例如WO 99/661619、WO 00/17364和WO99/25821)；其公开内容通过引用结合于此。

这些堆叠的组合可以通过任何方法产生，包括但不限于通过任何传统或TopCross方法或遗传转化杂交植物。如果通过遗传转化植物来堆叠序列，则感兴趣的多核苷酸序列可以在任何时间以任何顺序组合。例如，包含一个或多个所需性状的转基因植物可以用作通过后续转化引入进一步性状的靶标。所述性状可以在与由转化盒的任何组合提供的感兴趣多核苷酸的共转化方案中同时引入。例如，如果将引入两个序列，则这两个序列可以包含在分开的转化盒(反式)中或包含在同一转化盒(顺式)上。序列的表达可以由同一启动子或由不同的启动子驱动。在某些情况下，可能希望引入将抑制感兴趣的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合相组合，以在植物中产生所需的性状组合。进一步认识到，可以使用位点特异性重组系统将多核苷酸序列堆叠在期望的基因组位置。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO1999/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些都通过引用并入本文。

非限制性实施方案包括：

1.一种具有杀虫活性的多肽，包括

(a)选自SEQ ID NOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中所列序列的氨基酸序列；或

(b)与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中所列序列的氨基酸序列具有至少表1中所列百分比序列同一性的氨基酸序列。

2.实施方案1的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所述的氨基酸序列。

3.实施方案1或2的多肽，其中所述多肽是分离的多肽。

4.实施方案1或2的多肽，其中所述多肽是重组多肽。

5.一种组合物，其包含实施方案1-4中任一项的多肽。

6.实施方案2的多肽，其进一步包含异源氨基酸序列。

7.一种核酸分子，其编码实施方案1的多肽。

8.实施方案7的核酸分子，其中所述核酸分子是分离的核酸分子。

9.实施方案7的核酸分子，其中所述核酸分子是重组核酸分子。

10.实施方案7-9中任一项的重组核酸，其中所述核酸分子是已设计用于在植物中表达的合成序列。

11.实施方案10的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接到能够指导在植物细胞中的表达的启动子。

12.实施方案7的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接到能够指导细菌中表达的启动子。

13.一种宿主细胞，其包含实施方案12的核酸分子。

14.实施方案13的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌宿主细胞。

15.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含与重组核酸分子可操作地连接的驱动在植物细胞中的表达的异源启动子或异源启动子，所述重组核酸分子包含：

(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中任一项的氨基酸序列；或

(b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中所列序列的氨基酸序列具有至少表1中所列百分比序列同一性的氨基酸序列。

16.实施方案15的DNA构建体，其中所述核苷酸序列是已设计用于在植物中表达的合成DNA序列。

17.一种载体，其包含实施方案15的DNA构建体。

18.一种宿主细胞，其包含实施方案15-17中任一项的DNA构建体。

19.实施方案18的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。

20.一种转基因植物，所述转基因植物包含实施方案19的宿主细胞。

21.一种组合物，其包含实施方案14的宿主细胞。

22.实施方案21的组合物，其中所述组合物选自由粉末、粉尘、丸剂、颗粒、可湿性颗粒、可分散可流动性颗粒/粉末、可润湿性粉末、喷雾、乳液、胶体、水溶液、油基溶液或液体组成的组。

23.实施方案21的组合物，其中所述组合物包含约1重量％至约99重量％的所述多肽。

24.一种控制害虫种群的方法，包括使所述种群与杀虫有效量的实施方案21的组合物接触。

25.一种杀死害虫种群的方法，包括使所述种群与杀虫有效量的实施方案21的组合物接触。

26.一种生产具有杀虫活性的多肽的方法，包括在表达编码所述多肽的核酸分子的条件下培养实施方案13的宿主细胞。

27.一种植物，其具有稳定地整合到其基因组中的DNA构建体，所述DNA构建体包含编码具有杀虫活性的蛋白质的核酸分子，其中所述核酸分子包含：

(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中任一项的氨基酸序列；或

(b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中所列序列的氨基酸序列具有至少表1中所列百分比序列同一性的氨基酸序列。

28.实施方案27的植物的转基因种子。

29.一种保护植物免受昆虫害虫侵害的方法，包括在植物或其细胞中表达编码杀虫多肽的核酸分子，其中所述核酸分子包括：

(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中任一项的氨基酸序列；或

(b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中所列序列的氨基酸序列具有至少表1中所列百分比序列同一性的氨基酸序列。

30.实施方案29的方法，其中所述植物产生对鳞翅目害虫、半翅目害虫或鞘翅目害虫具有杀虫活性的杀虫多肽。

31.根据实施方案30所述的方法，其中所述鳞翅目害虫或所述鞘翅目害虫对苏云金芽孢杆菌的一种或多种菌株或由苏云金杆菌的一种或多种菌株产生的一种或多种毒素蛋白具有抗性。

32.实施方案31的方法，其中所述鳞翅目害虫或所述鞘翅目害虫对Cry34/Cry35、Cry3Bb、Cry2Ab2和Vip3A中的任何一种具有抗性。

33.一种提高植物产量的方法，所述方法包括在田地中生长植物或其种子，所述植物或其种子具有稳定地整合到其基因组中的DNA构建体，所述DNA构建体包含与编码杀虫多肽的核酸分子可操作地连接的、驱动在植物中的表达的启动子，其中所述核酸分子包括：

(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中任一项的氨基酸序列；或

(b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中所列序列的氨基酸序列具有至少表1中所列百分比序列同一性的氨基酸序列。

34.一种获得编码包含杀虫活性的改良多肽的多核苷酸的方法，其中所述改良多肽相对于SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中的任何一个具有至少一种改良的性质，所述方法包括：

(a)重组包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39的多个亲本多核苷酸或者其活性变体或片段，以产生编码重组杀虫多肽的重组多核苷酸文库；

(b)筛选所述文库以鉴定编码改良的重组杀虫多肽的重组多核苷酸，所述改良的重组杀虫多肽具有比亲本多核苷酸改良的增强性质；

(c)回收编码(b)中鉴定的改进的重组杀虫多肽的重组多核苷酸；和

(d)使用在步骤(c)中回收的重组多核苷酸作为重复步骤(a)中的多个亲本多核苷酸之一重复步骤(a)、(b)和(c)。

以下实施例是以示例性方式提供的，并非为了限制。

实验

实施例1.通过测序和DNA分析发现新型基因

将微生物培养物在标准实验室培养基中的液体培养基中进行生长。在DNA制备之前使培养物生长至饱和(16至24小时)。通过去垢剂裂解从细菌细胞中提取DNA，然后将其结合至二氧化硅基质并用乙醇缓冲液洗涤。用温和的碱性缓冲水溶液从二氧化硅基质上洗脱纯化的DNA。

通过分光光度法测试用于测序的DNA的纯度和浓度。使用Nextera XT文库制备试剂盒，按照制造商的方案制备测序文库。根据Illumina HiSeq 2000系统用户指南协议在HiSeq 2000上生成序列数据。

使用CLC Bio Assembly Cell软件包将测序读数组装成草图基因组。组装后，通过几种方法进行基因调用，并询问所得的基因序列以鉴定杀虫基因的新型同源物。通过BLAST，通过结构域组成和通过相对于杀虫基因的靶标组的成对比对来鉴定新型基因。此类序列的概述示于表1中。

通过PCR从细菌DNA扩增同源性搜索中鉴定的基因，并将其克隆到含有框内融合的纯化标签的细菌表达载体中。将克隆的基因在大肠杆菌中表达，并通过柱层析纯化。SEQ IDNO:1、5和27各自成功地进行了瞬时表达。在昆虫饮食生物测定研究中评估纯化的蛋白质以鉴定活性蛋白质。

实施例2.大肠杆菌中的异源表达

将表4中所示的每一个开放阅读框克隆到含有麦芽糖结合蛋白的大肠杆菌表达载体(pMBP)中。将表达载体转化到BL21*RIPL中。将补充有羧苄青霉素的LB培养物用单菌落接种，并使用0.5％的过夜培养物在37℃生长过夜，接种新鲜培养物并在37℃下生长至对数期。使用250mM IPTG在16℃下诱导培养物18小时。将细胞沉淀并重悬于补充有蛋白酶抑制剂的10mM Tris pH7.4和150mM NaCl中。通过SDS-PAGE评估蛋白质表达。

实施例3.针对鞘翅目和鳞翅目的杀虫活性

方法

蛋白质表达：如实施例2中所述，在大肠杆菌中表达表4中所示的每个序列。接种400mL LB并使其生长至OD600为0.6。将培养物用0.25mM IPTG在16℃诱导过夜。将细胞离心并将细胞沉淀重悬于5mL缓冲液中。将重悬浮液在冰上超声处理2分钟。

生物测定：天鹅绒豆毛虫(Velvetbean Caterpillar，VBC)、秋粘虫(FAW)、玉米穗虫(corn ear worm,CEW)、欧洲玉米螟(ECB)、西南玉米螟(SWCB)、soybean looper(SBL)和小菜蛾(diamond backed moth,DBM或Px)卵购自商业养虫室(Benzon Research Inc.,Carlisle,PA)。将VBC、FAW、CEW、ECB和BCW卵温育至在测定设置的12小时内发生羽化的点。将ECB、SWCB和DBM作为新生幼虫引入测定。在含有多物种鳞翅目饮食(Southland ProductsInc.,Lake Village,Ariz.)的24孔盘中进行测定。将超声裂解物的样品施用于饮食表面(饮食覆盖层)并使其蒸发并浸入到饮食中。对于CEW、FAW、BCW、ECB和SWCB，将125μl超声裂解物加入到饮食表面并干燥。对于DBM，将超声裂解物的1:2稀释液50μl加入到饮食表面。用带有针孔的板密封膜密封生物测定板。将板在26℃，65％相对湿度(RH)下以16:8白天:黑夜周期在Percival中温育5天。评估测定法的死亡率、生长抑制和进食抑制的水平。

对于西部玉米根虫生物测定、北方玉米根虫(northern corn rootworm,NCRW)生物测定和南方玉米根虫(southern corn rootworm,SCRW)生物测定，蛋白质构建体/裂解物在昆虫生物测定中通过在24孔板(Cellstar，24孔，Greiner Bio One)的孔中在饮食的顶部表面上分配60μl体积并使其干燥来评估。每个孔含有500μl饮食(Marrone等，1985)。使用细尖漆刷在每个孔中引入15至20只新生幼虫，并用膜(Viewseal，Greiner Bio One)覆盖板。将生物测定储存在环境温度下并在第4天或第5天评估死亡率和/或生长/摄食抑制。

对于科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)，从马铃薯叶中切下8号软木塞大小的叶盘，将其浸入蛋白质构建体/裂解液中直至完全湿润并置于滤盘顶部(Millipore，玻璃纤维过滤器，13mm)。向每个滤盘中加入60μl dH₂O，并置于24孔板(Cellstar，24孔，Greiner Bio One)的每个孔中。使叶盘干燥，并使用细尖漆刷在每个孔中引入五至七个第一龄幼虫。用膜(Viewseal，Greiner Bio One)覆盖该板，并在膜的每个孔中刺穿小孔。用4次重复评估构建体，并在第3天评估死亡率和叶片损伤。

表3提供了对不同序列的鞘翅目和鳞翅目的杀虫活性的总结。表代码：“-”表示未看到活性；“+”表示杀虫活性；“NT”表示未测试；“S”表示迟缓；“SS”表示轻微迟缓；“LF”表示低饲喂；“M”表示死亡率。

表3对鞘翅目和鳞翅目昆虫的杀虫活性综述

LC50分析

产生了包含SEQ ID NO:2、6或28的6xHis构建体。将构建体转化到大肠杆菌BL21*(DE3)中用于蛋白质生产。使用HIS标记蛋白质的标准技术纯化蛋白质，并通过SDS-PAGE分析级分的纯度。然后在如上所述的基于饮食的测定中在易感昆虫上测试纯化的蛋白质作为表面处理。结果如表4所示。

表4杀虫活性的LC50分析

APG#	靶生物体(昆虫)	LC50(μg/cm2)	95％置信区间(μg/cm2)
				APG06396.0	WCR	7.8μg/cm2	7.4-8.3
APG03548.1	WCR	2.8μg/cm2	1.8-4.1
				APG03083.1	CEW	10.1μg/cm2	0.2-22.1

实施例4.针对半翅目的杀虫活性

蛋白质表达：如实施例2中所述，将表4中所示的每一个序列在大肠杆菌中表达。接种400mL的LB并使其生长至OD600为0.6。用0.25mM IPTG在16℃诱导培养物过夜。将细胞离心，然后将细胞沉淀重悬于5mL缓冲液中。将重悬浮液在冰上超声处理2分钟。

第二龄期南方绿椿象(southern green stink bug，SGSB)获自商业养虫室(Benzon Research Inc.,Carlisle,PA)。在生物测定中使用50％v/v的超声处理裂解物样品对20％蔗糖的比率。拉伸的石蜡膜用作进料膜以将SGSB暴露于饮食/样品混合物。将板以25℃:21℃、16:8白天:夜晚周期下于65％RH下温育5天。

对每个样品的死亡率进行评分。

实施例5.大豆的转化

包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39或其活性变体或片段中的每一个与在植物中具有活性的启动子可操作地连接的DNA构建体克隆到转化载体中，并如2015年12月19日提交的美国临时申请号62/094,782(通过引用整体并入本文)中所述引入土壤杆菌中。

接种前4天，将数个环的土壤杆菌划线到补充有适当的抗生素**(壮观霉素、氯霉素和卡那霉素)的YEP*培养基的新鲜平板上。将细菌在黑暗中于28℃生长两天。两天后，在125ml Erlenmeyer烧瓶中将数个环的细菌转移到3ml的含有抗生素的YEP液体培养基中。将烧瓶置于旋转振荡器上，在250RPM在28℃下过夜。在接种前一天，将2-3ml过夜培养物转移到500ml Erlenmeyer烧瓶中的含有抗生素的125ml YEP中。将烧瓶置于旋转振荡器上，在250RPM，28℃下过夜。

在接种之前，在OD 600下检查细菌培养物的OD。OD为0.8-1.0表明培养物处于对数期。将培养物在Oakridge管中以4000RPM离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于一定体积的大豆感染培养基(SI)中，以达到所需的OD。将培养物定期混合直至需要接种。

在接种前两或三天，使用氯气对大豆种子进行表面灭菌。在通风橱中，将带有种子的培养皿放入钟罐中，取下盖子。在钟罐内的250ml Erlenmeyer烧瓶中，将1.75ml的12NHCl缓慢加入100ml漂白剂中。将盖子立即放在钟罐的顶部。使种子消毒14-16小时(过夜)。将顶部从钟罐上取下并更换培养皿的盖子。然后将表面灭菌的培养皿在层流中打开约30分钟以驱散任何剩余的氯气。

用无菌DI水或大豆感染培养基(SI)使种子吸胀1-2天。在100x25mm培养皿中用液体覆盖20至30粒种子，并在黑暗中于24℃温育。吸胀后，丢弃未发芽的种子。

采用美国专利7,473,822(通过引用并入本文)的方法，使用SI培养基浸湿的无菌滤纸在无菌纸板上处理子叶外植体。

通常，每次处理接种16-20个子叶。弃去用于保持外植体的SI培养基，并用25ml土壤杆菌培养物(OD 620＝0.8-20)代替。在将所有外植体浸没后，接种进行30分钟，同时定期旋转培养皿。30分钟后，除去土壤杆菌培养物。

通过将一片无菌纸覆盖在大豆共培养培养基(SCC)上来制备共培养板。在没有印迹的情况下，将接种的子叶在滤纸上正面朝下培养。可在每个平板上培养约20个外植体。将平板用石蜡膜密封并在24℃和约120μmol m-2s-1(在Percival培养箱中)下培养4-5天。

共培养后，将子叶在含有200mg/l头孢噻肟和特美洒汀(timentin)的25ml大豆洗涤培养基中洗涤3次。将子叶印迹在无菌滤纸上，然后转移到大豆芽诱导培养基(SSI)中。将外植体的节末端稍微压入培养基中，使远端以约45度保持在表面上方。在每个平板上培养不超过10个外植体。将平板用Micropore胶带包裹并在Percival中于24℃和约120μmolesm-2s-1下培养。

14天后将外植体转移到新鲜的SSI培养基中。来自茎尖和子叶节的新芽被丢弃。在相同条件下继续芽诱导14天。

在芽诱导4周后，将子叶与节末端分离，并在芽诱导区域(芽垫)下方进行平行切割。将平行切割的区域置于大豆芽伸长培养基(SSE)上，并将外植体在Percival中于24℃和约120umoles m-2s-1下培养。只要芽继续伸长，每2周重复该步骤一次，直至长达8周。

当芽长达2-3cm时，将它们转移到Plantcon容器中的大豆生根培养基(SR)中，并在相同条件下温育2周或直至根达到约3-4cm的长度。此后，将植物转移到土壤中。

注意，对于大豆转化提到的所有培养基均见于Paz等(2010)Agrobacterium-mediated transformation of soybean and recovery of transgenic soybean plants；Plant Transformation Facility of Iowa State University(其通过引用整体并入本文)。(参见agron-www.agron.iastate.edu/ptf/protocol/Soybean.pdf.)

实施例6.玉米的转化

最好在授粉后8-12天收集玉米穗。从穗中分离胚，并且将那些0.8-1.5mm大小的胚优选用于转化。将胚以盾片侧朝上平铺在适当的温育培养基上，诸如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1mL/L(1000倍原液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/LL-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(1mg/mL原液)2,4-D)。然而，除DN62A5S外的培养基和盐是合适的并且是本领域已知的。将胚在黑暗中于25℃温育过夜。然而，本身没有必要将胚温育过夜。

将得到的外植体转移到网格方块(每板30-40个)，转移到渗透培养基上持续约30-45分钟，然后转移到照射板上(参见例如PCT公开号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。使用基本上如PCT公开号WO/0138514中所述的条件，使用气溶胶束加速器将设计用于在植物细胞中表达本发明的GRG蛋白的DNA构建体加速到植物组织中。照射后，将胚在渗透培养基上温育约30分钟，并在黑暗中于25℃置于温育培养基上过夜。为了避免过度损坏照射后的外植体，将它们在转移至回收培养基之前温育至少24小时。然后将胚在黑暗中于25℃下在恢复期培养基上展开约5天，然后转移到选择培养基中。根据所用的特定选择的性质和特征，将外植体在选择培养基中培养长达八周。在选择期后，将得到的愈伤组织转移到胚成熟培养基中，直至观察到成熟体细胞胚的形成。然后将所得的成熟体细胞胚置于弱光下，并通过本领域已知的方法启动再生过程。使得到的芽在生根培养基上生根，并将所得植物转移到育苗盆中并作为转基因植物繁殖。

实施例7.针对线虫的杀虫活性。

大豆孢囊线虫体外测定。

将大豆胞囊线虫分配到96孔测定板中，每孔总体积为100μl和100个J2。将SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中任一所示的目标蛋白质分配到孔中并在室温下保持以待评估。最后，分析含有SCN J2的96孔板的运动性。数据报告为与对照相比的％抑制。命中定义为大于或等于70％的抑制。

大豆孢囊线虫植物上试验(on-plantassay)

如本文其他地方所述，产生表达SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中的一种或多种的大豆植物。用每株植物5000个SCN卵接种3周龄的大豆切块。这种感染持续70天，然后收获用于计数在植物上发育的SCN孢囊。数据报告为与对照相比的％抑制。命中定义为大于或等于90％的抑制。

黄麻根瘤线虫(根结线虫)体外试验

将根结线虫分配到96孔测定板中，每孔总体积为100μl和100个J2。将包含SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中的任一个的目标蛋白质分配到孔中并在室温下保持以待评估。最后，对含有RKN J2的96孔板分析运动性。数据报告为与对照相比的％抑制。命中定义为大于或等于70％的抑制。

黄麻根瘤线虫(根结线虫)植物上试验

如本文中其他地方所述，产生表达SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中的一个或多个的大豆植物。用每株植物5000个RKN卵接种3周龄的大豆。这种感染持续70天，然后收获用于计数在植物上已发育的RKN卵。数据报告为与对照相比的％抑制。命中定义为大于或等于90％的抑制。

实施例8.用于杀虫活性的其他测定

可以多种方式测试SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40所示的各种多肽充当害虫的杀虫剂的活性。一种这样的方法是进行摄食测定。在这样的摄食测定中，将害虫暴露于含有待测化合物的样品或对照样品中。通常，这通过将待测材料或这种材料的合适稀释物放置在害虫将摄取的材料(例如人工饮食)上来进行。待测材料可以由液体、固体或浆料组成。可将待测材料置于表面上，然后使其干燥。或者，可将待测材料与熔融的人工饮食混合，然后分配到测定室中。测定室可以是例如杯子、盘子或微量滴定板的孔。

用于吸吮害虫(例如蚜虫)的测定可包括通过隔板将测试材料与昆虫分离，所述隔板理想地是可被吸吮昆虫的吸嘴部分刺穿以允许摄取测试材料的部分。通常将测试材料与进食刺激剂(诸如蔗糖)混合以促进测试化合物的摄取。

其他类型的测定可以包括将测试材料显微注射到害虫的口或肠内，以及开发转基因植物，然后测试害虫以转基因植物为食的能力。植物测试可包括分离通常食用的植物部分，例如，将小笼子附着在叶子上，或者将整个植物隔离在含有昆虫的笼子中。

用于测定害虫的其他方法和途径是本领域已知的，并且可见于例如Robertson和Preisler编辑(1992)Pesticide bioassays with arthropods,CRC,Boca Raton,Fla.中。或者，测定通常描述于期刊Arthropod Management Tests和Journal of EconomicEntomology中或通过与美国昆虫学会(ESA)的成员讨论来描述。可在如本文实施例3和实施例4所示的测定中表达并采用SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中的任一个。

实施例9.对Bt毒素抗性昆虫的杀虫活性

为了确定杀虫蛋白是否具有来自田间进化抗性昆虫的新作用模式，在田间进化的抗性害虫上测试裂解物。

WCRW-对Cry34/35-R、Cry3Bb-R和易感WCR(SUS)新生幼虫进行饮食覆盖生物测定，以评估APG06396.0和APG03548.1在5天时的蛋白质毒性。表达蛋白质的全细胞大肠杆菌样品、无活性蛋白质(阴性对照)和活性蛋白质Cry34/34(阳性对照)通过在不同体积的LB培养基中使细胞沉淀和重悬来制备。剂量相当于初始细菌培养物的细胞浓度的0.25、0.5、1、2和3倍。LB培养基也作为阴性对照包括在内。制备WCR-MO2，一种基于半固体琼脂的人工饮食(Huynh等人，2019，Sci.Rep.9:16009)，并将其分配到96孔组织培养板的每个孔中。将样品应用于饮食中，并在生物安全柜中风干。将从表面灭菌的WCR卵孵化的单个新生幼虫(Ludwick等人，2018，Sci.Rep.8:5379)放入每个孔中。每个样本在3个重复中针对24只新生幼虫进行测试。粘合膜密封每个孔，并制作针孔以允许气流流动。生物测定板储存在约25℃的黑暗环境室中。

在第5天，对测定进行评估。确定死亡率，并将存活的幼虫收集在乙醇小瓶中。将幼虫放入干燥炉中，然后用Sartorius微型天平称重以估计干重。

鳞翅目昆虫-对Cry2Ab2-R CEW、Vip3A-R FAW以及CEW和FAW的易感种群进行饮食覆盖生物测定，以评估APG03083.1蛋白质在7天时的毒性。通过沉淀和在不同体积的20mM碳酸钠缓冲液中重悬细胞来制备表达该蛋白和无活性蛋白的全细胞大肠杆菌样品。测试的剂量相当于原始细菌培养物的细胞浓度的1倍和3倍。包括20mM碳酸钠作为阴性缓冲液对照。诊断剂量的纯化蛋白Cry2Ab2(10μg/cm^2)和Vip3A(6μg/cm^2)作为阳性对照。制备半固体鳞翅目昆虫饮食，并将其分配到128孔昆虫生物测定托盘的孔中。然后将100μl的每个样品应用于饮食中，并在生物安全柜中风干。在每个孔中放置一只不到12小时大的新生幼虫。用每个小室都有一个透明的穿孔窗口用于气体/水分交换的粘合膜密封每个小室。生物测定托盘保存在约27℃的环境室中。

在7天时，针对幼虫死亡率对测定法进行评估，并测定幼虫的发育期。

测定结果如表5所示。

表5抗Bt毒素抗性昆虫的杀虫活性

APG#	Seq ID No.	靶(昆虫)	浓度	活性
					APG06396.0	2	易感的WCRW	3x	+
APG06396.0	2	Cry3Bb抗性的WCRW	3x	+
					APG06396.0	2	Cry34/35抗性的WCRW	3x	+
APG03548.1	28	易感的WCRW	3x	+
					APG03548.1	28	Cry3Bb抗性的WCRW	3x	+
APG03548.1	28	Cry34/35抗性的WCRW	3x	+
					APG03083.1	6	易感的FAW	3x	+
APG03083.1	6	Vip3A抗性的FAW	3x	+
					APG03083.1	6	Cry1Fa抗性的FAW	3x	+
APG03083.1	6	易感的CEW	3x	+
					APG03083.1	6	Cry2Ab抗性的CEW	3x	+

说明书中提及的所有出版物和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每篇单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。

尽管出于清楚理解的目的通过举例说明和实施例详细地描述了前述发明，但显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。

序列表

<110> AgBiome, Inc.

<120> 杀虫基因及使用方法

<130> A101100 1660WO (0543.4)

<150> 63/117,797

<151> 2020-11-24

<150> 63/140,058

<151> 2021-01-21

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> 解鸟氨酸柔武氏菌(Raoultella ornithinolytica)

<400> 1

atgcattctg aagatattaa agaaaaaaca cttacctggt ttaactacat taccagtccg 60

gtaaataatg aagatgtatt tatgcgaagc tcacaggata tacttgttat gaatcctgcg 120

atagcagctg caacgcaaga gtatatcgat ggaaatactc acgatagtca gctattcaac 180

acaccatcat cagcgcctca aacgatgttt gatggcctgc aaaccattgt aaacctttgc 240

cgtgtgcaat caggttataa tgcacttgat cctaatggaa ccggaagtaa ggcgtatttt 300

acgaaattta ctcagaacat agcaaatgtt ccgtgcctga cgttgttgag tgcggaaaca 360

aaaaatatta aacaacaaag ccataatgca gatgagctca tcaactcatt tgtcgatgct 420

tttgatgggc ttacacaaag cgaccagtct aagattaagt catccgtaac ctcgttagta 480

aaagcagccc tgagctatgc aaatgaagat cagaaatcat caaatttcac gcaaaatatt 540

ttgcaaaccg gtgatgatca ggtgatattc acgttgtatg ccagtacatt tgaaatttct 600

tcgaccaaaa gcaaaggtgt tatatctttt aaatccgaat actcattgca gcaggcgtta 660

tatagccttt cccgcgcaag ctgggaacgg gtgaaagatc tgtttgctga acaagaaaaa 720

actactatgg atcagtggtt aaatgatatg aaaacgccac agaaaagtgg cagtacagta 780

aaagcattat gtttagaa 798

<210> 2

<211> 266

<212> PRT

<213> 解鸟氨酸柔武氏菌

<400> 2

Met His Ser Glu Asp Ile Lys Glu Lys Thr Leu Thr Trp Phe Asn Tyr

1 5 10 15

Ile Thr Ser Pro Val Asn Asn Glu Asp Val Phe Met Arg Ser Ser Gln

20 25 30

Asp Ile Leu Val Met Asn Pro Ala Ile Ala Ala Ala Thr Gln Glu Tyr

35 40 45

Ile Asp Gly Asn Thr His Asp Ser Gln Leu Phe Asn Thr Pro Ser Ser

50 55 60

Ala Pro Gln Thr Met Phe Asp Gly Leu Gln Thr Ile Val Asn Leu Cys

65 70 75 80

Arg Val Gln Ser Gly Tyr Asn Ala Leu Asp Pro Asn Gly Thr Gly Ser

85 90 95

Lys Ala Tyr Phe Thr Lys Phe Thr Gln Asn Ile Ala Asn Val Pro Cys

100 105 110

Leu Thr Leu Leu Ser Ala Glu Thr Lys Asn Ile Lys Gln Gln Ser His

115 120 125

Asn Ala Asp Glu Leu Ile Asn Ser Phe Val Asp Ala Phe Asp Gly Leu

130 135 140

Thr Gln Ser Asp Gln Ser Lys Ile Lys Ser Ser Val Thr Ser Leu Val

145 150 155 160

Lys Ala Ala Leu Ser Tyr Ala Asn Glu Asp Gln Lys Ser Ser Asn Phe

165 170 175

Thr Gln Asn Ile Leu Gln Thr Gly Asp Asp Gln Val Ile Phe Thr Leu

180 185 190

Tyr Ala Ser Thr Phe Glu Ile Ser Ser Thr Lys Ser Lys Gly Val Ile

195 200 205

Ser Phe Lys Ser Glu Tyr Ser Leu Gln Gln Ala Leu Tyr Ser Leu Ser

210 215 220

Arg Ala Ser Trp Glu Arg Val Lys Asp Leu Phe Ala Glu Gln Glu Lys

225 230 235 240

Thr Thr Met Asp Gln Trp Leu Asn Asp Met Lys Thr Pro Gln Lys Ser

245 250 255

Gly Ser Thr Val Lys Ala Leu Cys Leu Glu

260 265

<210> 3

<211> 1311

<212> DNA

<213> 金黄杆菌属的种(Chryseobacterium sp.)

<400> 3

atgaaattga taaaagccac gcttcccgct tcaatattgc tcattgcttg ccagcagcag 60

gcatgggcgg cagataccgt gccacaattc agcgacgtgg tgtatacgga gatgtccccg 120

gataatgagt ccaccattca gaaaattgtg acgtcggacg catttttcaa accatgggcg 180

ttactggcgc attatctcgg ttatggctgg gtaggcggca ataccaacgg caataccgcc 240

gtgggcaagg agtttgaata ccggcgcatc gacaccatgc tggataatct gtcgatgccc 300

gacaataaat accgctacat gatgaatgcc aagtacgatc cgaaggggcc gggcgggtat 360

tgggcggaca agcgtttccg catggccttt tccaacatcc agtggatgat ggaaccggac 420

gacatgaaac tgggctcgcc ggagctgtat aacaagaaac cgctgaaagt ggtgacggtg 480

gtgctggaaa atcacagcga ccagtccgac accggcgtgg ccaacctgaa atacgattcc 540

acggtcagtt ggtccaaagc cgacaagatc agcgtcagcg gcaaggtgac gatgaccaac 600

aagtggacgg gcggtctgcc gctgatcggc ggggcggaaa cctcggtagc ggtagagatc 660

gcttccgggg cggactggac caccaccaac ggcaccagca gcaccacttc gcaaacggcg 720

gagtaccggg cggtgttgcc gcccaagagc aaacgcctga tcacgctgac gctgttcgag 780

cagaaagcca atattcccta tacctccaag atgttcctga cttacgaggc ggagctgtac 840

aacttcctgc gctacagcga caacgcgctg aacggccatc cgtccaaccg tccgttttat 900

ctgagcaagt tcggcggcaa ggacggcctg aacggcgcgc aggatctgct gtcgcaatac 960

ctgaatccgg cgacgtcgaa atgggattgg ccgtgggcgg tgaaccagta ctcgcgaagc 1020

accatcgagt actacatcgg ctcgatttcc aaacgcaagt tcaagcagca gttcaccggg 1080

gtcttcagcg cggtggactc cacggcctac accatcacgg ccggtccggt ggaaccgctg 1140

agcgcgcagg cgcagaccgc ccgctcggcc agcctgggcg cggcggcctc cggcggaatc 1200

cagtatcgcg tggtgagcgg ggacctgaag gatgtgccgg gccgcttgaa gaacctgcgc 1260

ttcacagtgg gcaagccgca ggctgcgcca tccgccgcat cgccgatccg g 1311

<210> 4

<211> 437

<212> PRT

<213> 金黄杆菌属的种

<400> 4

Met Lys Leu Ile Lys Ala Thr Leu Pro Ala Ser Ile Leu Leu Ile Ala

1 5 10 15

Cys Gln Gln Gln Ala Trp Ala Ala Asp Thr Val Pro Gln Phe Ser Asp

20 25 30

Val Val Tyr Thr Glu Met Ser Pro Asp Asn Glu Ser Thr Ile Gln Lys

35 40 45

Ile Val Thr Ser Asp Ala Phe Phe Lys Pro Trp Ala Leu Leu Ala His

50 55 60

Tyr Leu Gly Tyr Gly Trp Val Gly Gly Asn Thr Asn Gly Asn Thr Ala

65 70 75 80

Val Gly Lys Glu Phe Glu Tyr Arg Arg Ile Asp Thr Met Leu Asp Asn

85 90 95

Leu Ser Met Pro Asp Asn Lys Tyr Arg Tyr Met Met Asn Ala Lys Tyr

100 105 110

Asp Pro Lys Gly Pro Gly Gly Tyr Trp Ala Asp Lys Arg Phe Arg Met

115 120 125

Ala Phe Ser Asn Ile Gln Trp Met Met Glu Pro Asp Asp Met Lys Leu

130 135 140

Gly Ser Pro Glu Leu Tyr Asn Lys Lys Pro Leu Lys Val Val Thr Val

145 150 155 160

Val Leu Glu Asn His Ser Asp Gln Ser Asp Thr Gly Val Ala Asn Leu

165 170 175

Lys Tyr Asp Ser Thr Val Ser Trp Ser Lys Ala Asp Lys Ile Ser Val

180 185 190

Ser Gly Lys Val Thr Met Thr Asn Lys Trp Thr Gly Gly Leu Pro Leu

195 200 205

Ile Gly Gly Ala Glu Thr Ser Val Ala Val Glu Ile Ala Ser Gly Ala

210 215 220

Asp Trp Thr Thr Thr Asn Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ser Gln Thr Ala

225 230 235 240

Glu Tyr Arg Ala Val Leu Pro Pro Lys Ser Lys Arg Leu Ile Thr Leu

245 250 255

Thr Leu Phe Glu Gln Lys Ala Asn Ile Pro Tyr Thr Ser Lys Met Phe

260 265 270

Leu Thr Tyr Glu Ala Glu Leu Tyr Asn Phe Leu Arg Tyr Ser Asp Asn

275 280 285

Ala Leu Asn Gly His Pro Ser Asn Arg Pro Phe Tyr Leu Ser Lys Phe

290 295 300

Gly Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Ala Gln Asp Leu Leu Ser Gln Tyr

305 310 315 320

Leu Asn Pro Ala Thr Ser Lys Trp Asp Trp Pro Trp Ala Val Asn Gln

325 330 335

Tyr Ser Arg Ser Thr Ile Glu Tyr Tyr Ile Gly Ser Ile Ser Lys Arg

340 345 350

Lys Phe Lys Gln Gln Phe Thr Gly Val Phe Ser Ala Val Asp Ser Thr

355 360 365

Ala Tyr Thr Ile Thr Ala Gly Pro Val Glu Pro Leu Ser Ala Gln Ala

370 375 380

Gln Thr Ala Arg Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ile

385 390 395 400

Gln Tyr Arg Val Val Ser Gly Asp Leu Lys Asp Val Pro Gly Arg Leu

405 410 415

Lys Asn Leu Arg Phe Thr Val Gly Lys Pro Gln Ala Ala Pro Ser Ala

420 425 430

Ala Ser Pro Ile Arg

435

<210> 5

<211> 1245

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 5

atggcagata ccgtgccaca attcagcgac gtggtgtata cggagatgtc cccggataat 60

gagtccacca ttcagaaaat tgtgacgtcg gacgcatttt tcaaaccatg ggcgttactg 120

gcgcattatc tcggttatgg ctgggtaggc ggcaatacca acggcaatac cgccgtgggc 180

aaggagtttg aataccggcg catcgacacc atgctggata atctgtcgat gcccgacaat 240

aaataccgct acatgatgaa tgccaagtac gatccgaagg ggccgggcgg gtattgggcg 300

gacaagcgtt tccgcatggc cttttccaac atccagtgga tgatggaacc ggacgacatg 360

aaactgggct cgccggagct gtataacaag aaaccgctga aagtggtgac ggtggtgctg 420

gaaaatcaca gcgaccagtc cgacaccggc gtggccaacc tgaaatacga ttccacggtc 480

agttggtcca aagccgacaa gatcagcgtc agcggcaagg tgacgatgac caacaagtgg 540

acgggcggtc tgccgctgat cggcggggcg gaaacctcgg tagcggtaga gatcgcttcc 600

ggggcggact ggaccaccac caacggcacc agcagcacca cttcgcaaac ggcggagtac 660

cgggcggtgt tgccgcccaa gagcaaacgc ctgatcacgc tgacgctgtt cgagcagaaa 720

gccaatattc cctatacctc caagatgttc ctgacttacg aggcggagct gtacaacttc 780

ctgcgctaca gcgacaacgc gctgaacggc catccgtcca accgtccgtt ttatctgagc 840

aagttcggcg gcaaggacgg cctgaacggc gcgcaggatc tgctgtcgca atacctgaat 900

ccggcgacgt cgaaatggga ttggccgtgg gcggtgaacc agtactcgcg aagcaccatc 960

gagtactaca tcggctcgat ttccaaacgc aagttcaagc agcagttcac cggggtcttc 1020

agcgcggtgg actccacggc ctacaccatc acggccggtc cggtggaacc gctgagcgcg 1080

caggcgcaga ccgcccgctc ggccagcctg ggcgcggcgg cctccggcgg aatccagtat 1140

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<211> 415

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 6

Met Ala Asp Thr Val Pro Gln Phe Ser Asp Val Val Tyr Thr Glu Met

1 5 10 15

Ser Pro Asp Asn Glu Ser Thr Ile Gln Lys Ile Val Thr Ser Asp Ala

20 25 30

Phe Phe Lys Pro Trp Ala Leu Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Gly Trp

35 40 45

Val Gly Gly Asn Thr Asn Gly Asn Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Glu

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65 70 75 80

Lys Tyr Arg Tyr Met Met Asn Ala Lys Tyr Asp Pro Lys Gly Pro Gly

85 90 95

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Trp Met Met Glu Pro Asp Asp Met Lys Leu Gly Ser Pro Glu Leu Tyr

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Asn Lys Lys Pro Leu Lys Val Val Thr Val Val Leu Glu Asn His Ser

130 135 140

Asp Gln Ser Asp Thr Gly Val Ala Asn Leu Lys Tyr Asp Ser Thr Val

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Ser Trp Ser Lys Ala Asp Lys Ile Ser Val Ser Gly Lys Val Thr Met

165 170 175

Thr Asn Lys Trp Thr Gly Gly Leu Pro Leu Ile Gly Gly Ala Glu Thr

180 185 190

Ser Val Ala Val Glu Ile Ala Ser Gly Ala Asp Trp Thr Thr Thr Asn

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260 265 270

Ser Asn Arg Pro Phe Tyr Leu Ser Lys Phe Gly Gly Lys Asp Gly Leu

275 280 285

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290 295 300

Lys Trp Asp Trp Pro Trp Ala Val Asn Gln Tyr Ser Arg Ser Thr Ile

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Ser Leu Gly Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ile Gln Tyr Arg Val Val Ser

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Gly Asp Leu Lys Asp Val Pro Gly Arg Leu Lys Asn Leu Arg Phe Thr

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<212> DNA

<213> 金黄杆菌属的种

<400> 7

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tcgtgttcaa gggatgaagt gagtgctatt aatgatgatt cagaaaaggt aaattattct 120

gaagtaaaga aagtacagct gacggaagct gaaatgctgc agaaaggctg gaaaattgta 180

gaccagttta aattatcaga tcaaaataat ctgggtgtaa aaagttcgac caatgaagag 240

cgtgaaatcc ctttcaagcc taaccatttg aaagatatag gatatgatat cagtttttcc 300

ggtgaaaaaa cgaggttaaa aaatgttttt gcctacgccg gccaggttcc ggatggaatt 360

atatttaatc ctgatctttc tgtagatgga gatacccgga atacagcccc caatccaaat 420

gtttctattg ttttagggac accacaggta acaataaaaa ctgacggagt agatttaccg 480

gataatgctt atactacgga agctattaat aacggagatc gtgaaagtga aattacggtg 540

tcttattctt acaaaaaagg atattcaact tcgtggaaac gtacggtctc agggtcattt 600

gaggtagcag catcagtatc cgttgatatt ccgttggttg caaaagcttc agcaagtact 660

aaagttgttg taggtggaga tacaacggaa ggtacagaaa attctgagga aattacagaa 720

accagtacct ataagactat tgttccggca cactccaaaa agacaatttc tatcctgacg 780

aaattaaaag gatcttctgt agaatacttt gtgcctatga agttgaacgg aagattgcag 840

gccaactttc cttctccggc caatggccat tattattggg cttttcctat cgaaaacttc 900

cctgattttc tttctactat acacggagaa tccggtactg tgaagtcggt cagcaatgta 960

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<211> 332

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<213> 金黄杆菌属的种

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Met Ile Lys Met Ile Lys Lys Ile Asn Ser Phe Trp Phe Leu Leu Leu

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Met Leu Ser Val Ser Cys Ser Arg Asp Glu Val Ser Ala Ile Asn Asp

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35 40 45

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Leu Ser Asp Gln Asn Asn Leu Gly Val Lys Ser Ser Thr Asn Glu Glu

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Leu Gly Thr Pro Gln Val Thr Ile Lys Thr Asp Gly Val Asp Leu Pro

145 150 155 160

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165 170 175

Glu Ile Thr Val Ser Tyr Ser Tyr Lys Lys Gly Tyr Ser Thr Ser Trp

180 185 190

Lys Arg Thr Val Ser Gly Ser Phe Glu Val Ala Ala Ser Val Ser Val

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Ser Ile Leu Thr Lys Leu Lys Gly Ser Ser Val Glu Tyr Phe Val Pro

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Met Lys Leu Asn Gly Arg Leu Gln Ala Asn Phe Pro Ser Pro Ala Asn

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Gly His Tyr Tyr Trp Ala Phe Pro Ile Glu Asn Phe Pro Asp Phe Leu

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Ser Thr Ile His Gly Glu Ser Gly Thr Val Lys Ser Val Ser Asn Val

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Ser Val Thr Val Leu Glu Ser Pro Ala Gln Ala Ile

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<213> 金黄杆菌属的种

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<213> 金黄杆菌属的种

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atgaataaaa aaatcaattc tgttttgatt cttttattag cattttcagt atcatgttca 60

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agtgcacatt taacacaggc agagatgctt cagaaaggct ggaaagttgt agatgagttt 180

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agaacgagat tgaaaaatgt ttttgcctac gctggtcagg ttccggatgg aattatattt 360

aatcctgatc tttctgtaga cggagatgtc cggaatacgg ctcctaatcc taatgtttcc 420

attgttttag gaacacctga ggtaaacata aaaacagacg gagtagattt accggataat 480

tcctatacca cggaggccat taataatgga gatagagaaa gtgaaattac agtaacctat 540

tcctataaaa agggatattc tacttcctgg aagcgcactg tctcaggctc atttgaagtg 600

gcagcatccg tatctgttga tattccgtta gtggcaaaag cttctgccag cacaaaagtt 660

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agctataaga ctatcgtgcc ggctcactct aaaaaaagta tttctattct gacgaaatta 780

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tttctttcca atatacacgg agagtcgggg attgtaaaat ctgtaagcaa tgtaagtgtt 960

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<210> 22

<211> 330

<212> PRT

<213> 金黄杆菌属的种

<400> 22

Met Asn Lys Lys Ile Asn Ser Val Leu Ile Leu Leu Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Val Ser Cys Ser Arg Asp Glu Val Ser Ser Met Asn Asp Asp Pro Glu

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Lys Ile Asn Tyr Ala Asp Thr Lys Ser Ala His Leu Thr Gln Ala Glu

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Met Leu Gln Lys Gly Trp Lys Val Val Asp Glu Phe Lys Leu Pro Gly

50 55 60

Asn Asn Asn Leu Gly Ile Asn Tyr Thr Ser Thr His Glu Glu Arg Glu

65 70 75 80

Ile Pro Phe Lys Pro Asn His Leu Lys Asp Met Gly Tyr Asp Val Ser

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Ser Tyr Thr Thr Glu Ala Ile Asn Asn Gly Asp Arg Glu Ser Glu Ile

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Thr Val Thr Tyr Ser Tyr Lys Lys Gly Tyr Ser Thr Ser Trp Lys Arg

180 185 190

Thr Val Ser Gly Ser Phe Glu Val Ala Ala Ser Val Ser Val Asp Ile

195 200 205

Pro Leu Val Ala Lys Ala Ser Ala Ser Thr Lys Val Val Val Gly Gly

210 215 220

Asp Thr Thr Glu Gly Thr Glu Thr Ser Glu Glu Ile Thr Glu Thr Ser

225 230 235 240

Ser Tyr Lys Thr Ile Val Pro Ala His Ser Lys Lys Ser Ile Ser Ile

245 250 255

Leu Thr Lys Leu Lys Gly Ser Ser Val Glu Tyr Phe Val Pro Met Lys

260 265 270

Leu Thr Gly Arg Leu Gln Ala Asn Phe Pro Ser Pro Val Asp Gly His

275 280 285

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290 295 300

Ile His Gly Glu Ser Gly Ile Val Lys Ser Val Ser Asn Val Ser Val

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<210> 23

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 23

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aataatctgg ggataaacta tacttctacc catgaagagc gtgaaattcc tttcaaacct 180

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aatgtttttg cctacgctgg tcaggttccg gatggaatta tatttaatcc tgatctttct 300

gtagacggag atgtccggaa tacggctcct aatcctaatg tttccattgt tttaggaaca 360

cctgaggtaa acataaaaac agacggagta gatttaccgg ataattccta taccacggag 420

gccattaata atggagatag agaaagtgaa attacagtaa cctattccta taaaaaggga 480

tattctactt cctggaagcg cactgtctca ggctcatttg aagtggcagc atccgtatct 540

gttgatattc cgttagtggc aaaagcttct gccagcacaa aagttgttgt aggaggagat 600

acaacggaag gcacagaaac ctctgaagaa attaccgaga ccagcagcta taagactatc 660

gtgccggctc actctaaaaa aagtatttct attctgacga aattaaaagg gtcttctgtt 720

gaatactttg tacctatgaa attgaccgga agattacagg ctaactttcc ttctccggta 780

gatgggcatt attattgggc ttttcctatt gaaaacttcc ctgattttct ttccaatata 840

cacggagagt cggggattgt aaaatctgta agcaatgtaa gtgttactgt tatggaatca 900

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<210> 24

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

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Met Met Asn Asp Asp Pro Glu Lys Ile Asn Tyr Ala Asp Thr Lys Ser

1 5 10 15

Ala His Leu Thr Gln Ala Glu Met Leu Gln Lys Gly Trp Lys Val Val

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Asp Glu Phe Lys Leu Pro Gly Asn Asn Asn Leu Gly Ile Asn Tyr Thr

35 40 45

Ser Thr His Glu Glu Arg Glu Ile Pro Phe Lys Pro Asn His Leu Lys

50 55 60

Asp Met Gly Tyr Asp Val Ser Phe Ser Gly Glu Arg Thr Arg Leu Lys

65 70 75 80

Asn Val Phe Ala Tyr Ala Gly Gln Val Pro Asp Gly Ile Ile Phe Asn

85 90 95

Pro Asp Leu Ser Val Asp Gly Asp Val Arg Asn Thr Ala Pro Asn Pro

100 105 110

Asn Val Ser Ile Val Leu Gly Thr Pro Glu Val Asn Ile Lys Thr Asp

115 120 125

Gly Val Asp Leu Pro Asp Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Ala Ile Asn Asn

130 135 140

Gly Asp Arg Glu Ser Glu Ile Thr Val Thr Tyr Ser Tyr Lys Lys Gly

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Tyr Ser Thr Ser Trp Lys Arg Thr Val Ser Gly Ser Phe Glu Val Ala

165 170 175

Ala Ser Val Ser Val Asp Ile Pro Leu Val Ala Lys Ala Ser Ala Ser

180 185 190

Thr Lys Val Val Val Gly Gly Asp Thr Thr Glu Gly Thr Glu Thr Ser

195 200 205

Glu Glu Ile Thr Glu Thr Ser Ser Tyr Lys Thr Ile Val Pro Ala His

210 215 220

Ser Lys Lys Ser Ile Ser Ile Leu Thr Lys Leu Lys Gly Ser Ser Val

225 230 235 240

Glu Tyr Phe Val Pro Met Lys Leu Thr Gly Arg Leu Gln Ala Asn Phe

245 250 255

Pro Ser Pro Val Asp Gly His Tyr Tyr Trp Ala Phe Pro Ile Glu Asn

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275 280 285

Ser Val Ser Asn Val Ser Val Thr Val Met Glu Ser Pro Ala Gln Lys

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Ile

305

<210> 25

<211> 1215

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属的种(Bacillus sp.)

<400> 25

gtgaagaaaa tgtatacaaa tcataaaatg aagtgttgga agaaaaaatt agctaaagtt 60

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tctaatagta acttagttca tatcggtgat gatttaaatc aaagaatcta tgatgctgtg 240

aaaaataagc ctgatttatt tgtatataga caccttaaag atggaactgg tagagatgaa 300

cgaattagtg atatggatca aagtctacaa aatggttaca ttgttgtaat gaatagctta 360

gcatacggaa aagttacgat taacaatgga tatacgattg attggaatca aaaagaatat 420

gtcggtggag atatcaaggt aacgggtaaa caagatacag tagatggatt gcatagtttt 480

acattaggaa cttttcataa tgaagaggat attgaacaaa ctgctactac acaaaaagaa 540

acttatcaaa cgacagatag ttttacctat tcaaatagtg agggtgttaa gttaggttta 600

acagaatcta taaaagcaac tgcgggcgta ccttttgttg tagaaggcga agagacaaca 660

acactttcaa gtgaattctc atataatcat acctcttcaa atacctcgac gaattcacac 720

acaattgaat ttccatcgca gactattaaa gtcaaaccgc atggaactac aatttatacg 780

ggtgaggtaa aacaaatgaa tttttctgga gattactctg ggacagcgaa attatcaaca 840

aatgatattt catttgctat aacggattcg ggaagtcatt ggggagatgt tatcgctgcg 900

ccgggtgaag agggtcattt tttatataat atattcaaat actccggtca cataattcct 960

tcagatattc gtttagatga tgaaaataga acggttgttg ttgataattc atctatttat 1020

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<210> 26

<211> 405

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属的种

<400> 26

Val Lys Lys Met Tyr Thr Asn His Lys Met Lys Cys Trp Lys Lys Lys

1 5 10 15

Leu Ala Lys Val Ala Pro Ile Cys Val Leu Ser Thr Gly Phe Leu Val

20 25 30

Gly Val Ala Asn Pro Ala Phe Ala Ala Ser Lys Thr Leu Lys Thr Val

35 40 45

His Thr Gln Ala Lys Gln Ser Asn Leu Leu Thr Thr Ser Asn Ser Asn

50 55 60

Leu Val His Ile Gly Asp Asp Leu Asn Gln Arg Ile Tyr Asp Ala Val

65 70 75 80

Lys Asn Lys Pro Asp Leu Phe Val Tyr Arg His Leu Lys Asp Gly Thr

85 90 95

Gly Arg Asp Glu Arg Ile Ser Asp Met Asp Gln Ser Leu Gln Asn Gly

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Tyr Ile Val Val Met Asn Ser Leu Ala Tyr Gly Lys Val Thr Ile Asn

115 120 125

Asn Gly Tyr Thr Ile Asp Trp Asn Gln Lys Glu Tyr Val Gly Gly Asp

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Ile Lys Val Thr Gly Lys Gln Asp Thr Val Asp Gly Leu His Ser Phe

145 150 155 160

Thr Leu Gly Thr Phe His Asn Glu Glu Asp Ile Glu Gln Thr Ala Thr

165 170 175

Thr Gln Lys Glu Thr Tyr Gln Thr Thr Asp Ser Phe Thr Tyr Ser Asn

180 185 190

Ser Glu Gly Val Lys Leu Gly Leu Thr Glu Ser Ile Lys Ala Thr Ala

195 200 205

Gly Val Pro Phe Val Val Glu Gly Glu Glu Thr Thr Thr Leu Ser Ser

210 215 220

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Asp Ser Gly Ser His Trp Gly Asp Val Ile Ala Ala Pro Gly Glu Glu

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Gly His Phe Leu Tyr Asn Ile Phe Lys Tyr Ser Gly His Ile Ile Pro

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Ser Asp Ile Arg Leu Asp Asp Glu Asn Arg Thr Val Val Val Asp Asn

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<210> 27

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 27

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acgtctaata gtaacttagt tcatatcggt gatgatttaa atcaaagaat ctatgatgct 120

gtgaaaaata agcctgattt atttgtatat agacacctta aagatggaac tggtagagat 180

gaacgaatta gtgatatgga tcaaagtcta caaaatggtt acattgttgt aatgaatagc 240

ttagcatacg gaaaagttac gattaacaat ggatatacga ttgattggaa tcaaaaagaa 300

tatgtcggtg gagatatcaa ggtaacgggt aaacaagata cagtagatgg attgcatagt 360

tttacattag gaacttttca taatgaagag gatattgaac aaactgctac tacacaaaaa 420

gaaacttatc aaacgacaga tagttttacc tattcaaata gtgagggtgt taagttaggt 480

ttaacagaat ctataaaagc aactgcgggc gtaccttttg ttgtagaagg cgaagagaca 540

acaacacttt caagtgaatt ctcatataat catacctctt caaatacctc gacgaattca 600

cacacaattg aatttccatc gcagactatt aaagtcaaac cgcatggaac tacaatttat 660

acgggtgagg taaaacaaat gaatttttct ggagattact ctgggacagc gaaattatca 720

acaaatgata tttcatttgc tataacggat tcgggaagtc attggggaga tgttatcgct 780

gcgccgggtg aagagggtca ttttttatat aatatattca aatactccgg tcacataatt 840

ccttcagata ttcgtttaga tgatgaaaat agaacggttg ttgttgataa ttcatctatt 900

tattttacag gaaaactagg gtttaacatg gaggcaacat ggaaattcat ccctgatgat 960

cctaaaaaac caagtgttac aataccaaat gatgtatatt taaaagaaca agcttctggg 1020

aatattagca agtacattga ccaattaata caaactaaaa tgggttctag tgcaaagaaa 1080

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<210> 28

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Leu Ala Tyr Gly Lys Val Thr Ile Asn Asn Gly Tyr Thr Ile Asp Trp

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Lys Gln Met Asn Phe Ser Gly Asp Tyr Ser Gly Thr Ala Lys Leu Ser

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Thr Asn Asp Ile Ser Phe Ala Ile Thr Asp Ser Gly Ser His Trp Gly

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Asp Val Ile Ala Ala Pro Gly Glu Glu Gly His Phe Leu Tyr Asn Ile

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Lys Leu Gly Phe Asn Met Glu Ala Thr Trp Lys Phe Ile Pro Asp Asp

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Gln Ala Ser Gly Asn Ile Ser Lys Tyr Ile Asp Gln Leu Ile Gln Thr

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Lys Met Gly Ser Ser Ala Lys Lys Gly Tyr Ser Pro Lys Lys

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<210> 29

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 29

atgtatacaa atcataaaat gaagtgttgg aagaaaaaat tagctaaagt tgcaccaatt 60

tgtgtgttaa gtacaggatt tttagtgggc gtagctaatc ctgcttttgc tgctagtaag 120

actctcaaaa ctgttcacac tcaagcgaaa cagtctaatt tattgactac gtctaatagt 180

aacttagttc atatcggtga tgatttaaat caaagaatct atgatgctgt gaaaaataag 240

cctgatttat ttgtatatag acaccttaaa gatggaactg gtagagatga acgaattagt 300

gatatggatc aaagtctaca aaatggttac attgttgtaa tgaatagctt agcatacgga 360

aaagttacga ttaacaatgg atatacgatt gattggaatc aaaaagaata tgtcggtgga 420

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acttttcata atgaagagga tattgaacaa actgctacta cacaaaaaga aacttatcaa 540

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agtgaattct catataatca tacctcttca aatacctcga cgaattcaca cacaattgaa 720

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aaacaaatga atttttctgg agattactct gggacagcga aattatcaac aaatgatatt 840

tcatttgcta taacggattc gggaagtcat tggggagatg ttatcgctgc gccgggtgaa 900

gagggtcatt ttttatataa tatattcaaa tactccggtc acataattcc ttcagatatt 960

cgtttagatg atgaaaatag aacggttgtt gttgataatt catctattta ttttacagga 1020

aaactagggt ttaacatgga ggcaacatgg aaattcatcc ctgatgatcc taaaaaacca 1080

agtgttacaa taccaaatga tgtatattta aaagaacaag cttctgggaa tattagcaag 1140

tacattgacc aattaataca aactaaaatg ggttctagtg caaagaaagg atacagtccc 1200

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

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Met Tyr Thr Asn His Lys Met Lys Cys Trp Lys Lys Lys Leu Ala Lys

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Val Ala Pro Ile Cys Val Leu Ser Thr Gly Phe Leu Val Gly Val Ala

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Glu Thr Tyr Gln Thr Thr Asp Ser Phe Thr Tyr Ser Asn Ser Glu Gly

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Ala Lys Leu Ser Thr Asn Asp Ile Ser Phe Ala Ile Thr Asp Ser Gly

275 280 285

Ser His Trp Gly Asp Val Ile Ala Ala Pro Gly Glu Glu Gly His Phe

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Tyr Leu Lys Glu Gln Ala Ser Gly Asn Ile Ser Lys Tyr Ile Asp Gln

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Leu Ile Gln Thr Lys Met Gly Ser Ser Ala Lys Lys Gly Tyr Ser Pro

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Lys Lys

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<211> 1206

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属的种

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gtgagaaaaa tgaatgaaaa taataaaatg aagtgctgga agaaaaaagt agctaaaatt 60

gtaccgattt ctgtgttaag tacaggattt ttagtggggg gaggaaatcc agcttttgca 120

gctagtaagg aatcaaagat gccccccaaa accgttcacg ctcaagcgaa acaatctaat 180

ttatcgacta agtctaatag taacttatat cttatcggag attatttaaa tcaaagaatc 240

tatgatgctg taaaaaatag accagattta tttgtttaca aacacattgg agatcaatct 300

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caaagagaat atgttggtgg agatatcaag gtaacaggta aacaagataa agtagatgga 480

ttgcatagtt tcacattagg aacttttcat aatacagggg atattgaaca aactgctact 540

acgcaaaaag aaacttatca aacgacagat agttttacct attcaaatag tgagggtgtt 600

aagttaggat taacagaatc tataaaagca actgcgggcg taccttttgt tatagaaggc 660

gaagagacaa caacaatttc aagtgaattt tcatataatc atacctcttc aaatacctcg 720

acgaattcac acacaattga atttccatca caaactatta aagtcaaacc ccatggaact 780

acaatttaca ctggagaggt aaaacaaatg aatttttccg gagattactc tggtacagct 840

aaattaacaa caaaggatgt ttcttttgct gcagtagata cttacgggca tattggagat 900

gttattgcag caccgggaga ggaagaacat tttttatata atatttttaa atattcaggc 960

caatcaatcc cttcggatat tcgtttagat gatgaaaata gaatggttgt tgttgataat 1020

tcatccattc attttacagg gaaattaggt tttaacatgg aagccacatg gaaattcatc 1080

cctgatgatc ctaaaaaacc aagtgttaca ataccaaatg atgtatattt aaaagaacag 1140

gcttctggga acattagcaa gtacattgac ggattaatac aaactaaaat gaaatctatg 1200

catcaa 1206

<210> 32

<211> 402

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属的种

<400> 32

Val Arg Lys Met Asn Glu Asn Asn Lys Met Lys Cys Trp Lys Lys Lys

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195 200 205

Lys Ala Thr Ala Gly Val Pro Phe Val Ile Glu Gly Glu Glu Thr Thr

210 215 220

Thr Ile Ser Ser Glu Phe Ser Tyr Asn His Thr Ser Ser Asn Thr Ser

225 230 235 240

Thr Asn Ser His Thr Ile Glu Phe Pro Ser Gln Thr Ile Lys Val Lys

245 250 255

Pro His Gly Thr Thr Ile Tyr Thr Gly Glu Val Lys Gln Met Asn Phe

260 265 270

Ser Gly Asp Tyr Ser Gly Thr Ala Lys Leu Thr Thr Lys Asp Val Ser

275 280 285

Phe Ala Ala Val Asp Thr Tyr Gly His Ile Gly Asp Val Ile Ala Ala

290 295 300

Pro Gly Glu Glu Glu His Phe Leu Tyr Asn Ile Phe Lys Tyr Ser Gly

305 310 315 320

Gln Ser Ile Pro Ser Asp Ile Arg Leu Asp Asp Glu Asn Arg Met Val

325 330 335

Val Val Asp Asn Ser Ser Ile His Phe Thr Gly Lys Leu Gly Phe Asn

340 345 350

Met Glu Ala Thr Trp Lys Phe Ile Pro Asp Asp Pro Lys Lys Pro Ser

355 360 365

Val Thr Ile Pro Asn Asp Val Tyr Leu Lys Glu Gln Ala Ser Gly Asn

370 375 380

Ile Ser Lys Tyr Ile Asp Gly Leu Ile Gln Thr Lys Met Lys Ser Met

385 390 395 400

His Gln

<210> 33

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 33

atgaatgaaa ataataaaat gaagtgctgg aagaaaaaag tagctaaaat tgtaccgatt 60

tctgtgttaa gtacaggatt tttagtgggg ggaggaaatc cagcttttgc agctagtaag 120

gaatcaaaga tgccccccaa aaccgttcac gctcaagcga aacaatctaa tttatcgact 180

aagtctaata gtaacttata tcttatcgga gattatttaa atcaaagaat ctatgatgct 240

gtaaaaaata gaccagattt atttgtttac aaacacattg gagatcaatc tggtagaact 300

gaacggatta gtgacatgga tcaaagtcta caaaatggtt atatcgaagt aatgaatgcc 360

ttaaaatacc caggagttac gattaacaat ggaaataata tagattggaa tcaaagagaa 420

tatgttggtg gagatatcaa ggtaacaggt aaacaagata aagtagatgg attgcatagt 480

ttcacattag gaacttttca taatacaggg gatattgaac aaactgctac tacgcaaaaa 540

gaaacttatc aaacgacaga tagttttacc tattcaaata gtgagggtgt taagttagga 600

ttaacagaat ctataaaagc aactgcgggc gtaccttttg ttatagaagg cgaagagaca 660

acaacaattt caagtgaatt ttcatataat catacctctt caaatacctc gacgaattca 720

cacacaattg aatttccatc acaaactatt aaagtcaaac cccatggaac tacaatttac 780

actggagagg taaaacaaat gaatttttcc ggagattact ctggtacagc taaattaaca 840

acaaaggatg tttcttttgc tgcagtagat acttacgggc atattggaga tgttattgca 900

gcaccgggag aggaagaaca ttttttatat aatattttta aatattcagg ccaatcaatc 960

ccttcggata ttcgtttaga tgatgaaaat agaatggttg ttgttgataa ttcatccatt 1020

cattttacag ggaaattagg ttttaacatg gaagccacat ggaaattcat ccctgatgat 1080

cctaaaaaac caagtgttac aataccaaat gatgtatatt taaaagaaca ggcttctggg 1140

aacattagca agtacattga cggattaata caaactaaaa tgaaatctat gcatcaa 1197

<210> 34

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工多肽

<400> 34

Met Asn Glu Asn Asn Lys Met Lys Cys Trp Lys Lys Lys Val Ala Lys

1 5 10 15

Ile Val Pro Ile Ser Val Leu Ser Thr Gly Phe Leu Val Gly Gly Gly

20 25 30

Asn Pro Ala Phe Ala Ala Ser Lys Glu Ser Lys Met Pro Pro Lys Thr

35 40 45

Val His Ala Gln Ala Lys Gln Ser Asn Leu Ser Thr Lys Ser Asn Ser

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ile Gly Asp Tyr Leu Asn Gln Arg Ile Tyr Asp Ala

65 70 75 80

Val Lys Asn Arg Pro Asp Leu Phe Val Tyr Lys His Ile Gly Asp Gln

85 90 95

Ser Gly Arg Thr Glu Arg Ile Ser Asp Met Asp Gln Ser Leu Gln Asn

100 105 110

Gly Tyr Ile Glu Val Met Asn Ala Leu Lys Tyr Pro Gly Val Thr Ile

115 120 125

Asn Asn Gly Asn Asn Ile Asp Trp Asn Gln Arg Glu Tyr Val Gly Gly

130 135 140

Asp Ile Lys Val Thr Gly Lys Gln Asp Lys Val Asp Gly Leu His Ser

145 150 155 160

Phe Thr Leu Gly Thr Phe His Asn Thr Gly Asp Ile Glu Gln Thr Ala

165 170 175

Thr Thr Gln Lys Glu Thr Tyr Gln Thr Thr Asp Ser Phe Thr Tyr Ser

180 185 190

Asn Ser Glu Gly Val Lys Leu Gly Leu Thr Glu Ser Ile Lys Ala Thr

195 200 205

Ala Gly Val Pro Phe Val Ile Glu Gly Glu Glu Thr Thr Thr Ile Ser

210 215 220

Ser Glu Phe Ser Tyr Asn His Thr Ser Ser Asn Thr Ser Thr Asn Ser

225 230 235 240

His Thr Ile Glu Phe Pro Ser Gln Thr Ile Lys Val Lys Pro His Gly

245 250 255

Thr Thr Ile Tyr Thr Gly Glu Val Lys Gln Met Asn Phe Ser Gly Asp

260 265 270

Tyr Ser Gly Thr Ala Lys Leu Thr Thr Lys Asp Val Ser Phe Ala Ala

275 280 285

Val Asp Thr Tyr Gly His Ile Gly Asp Val Ile Ala Ala Pro Gly Glu

290 295 300

Glu Glu His Phe Leu Tyr Asn Ile Phe Lys Tyr Ser Gly Gln Ser Ile

305 310 315 320

Pro Ser Asp Ile Arg Leu Asp Asp Glu Asn Arg Met Val Val Val Asp

325 330 335

Asn Ser Ser Ile His Phe Thr Gly Lys Leu Gly Phe Asn Met Glu Ala

340 345 350

Thr Trp Lys Phe Ile Pro Asp Asp Pro Lys Lys Pro Ser Val Thr Ile

355 360 365

Pro Asn Asp Val Tyr Leu Lys Glu Gln Ala Ser Gly Asn Ile Ser Lys

370 375 380

Tyr Ile Asp Gly Leu Ile Gln Thr Lys Met Lys Ser Met His Gln

385 390 395

<210> 35

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 35

atggctagta aggaatcaaa gatgcccccc aaaaccgttc acgctcaagc gaaacaatct 60

aatttatcga ctaagtctaa tagtaactta tatcttatcg gagattattt aaatcaaaga 120

atctatgatg ctgtaaaaaa tagaccagat ttatttgttt acaaacacat tggagatcaa 180

tctggtagaa ctgaacggat tagtgacatg gatcaaagtc tacaaaatgg ttatatcgaa 240

gtaatgaatg ccttaaaata cccaggagtt acgattaaca atggaaataa tatagattgg 300

aatcaaagag aatatgttgg tggagatatc aaggtaacag gtaaacaaga taaagtagat 360

ggattgcata gtttcacatt aggaactttt cataatacag gggatattga acaaactgct 420

actacgcaaa aagaaactta tcaaacgaca gatagtttta cctattcaaa tagtgagggt 480

gttaagttag gattaacaga atctataaaa gcaactgcgg gcgtaccttt tgttatagaa 540

ggcgaagaga caacaacaat ttcaagtgaa ttttcatata atcatacctc ttcaaatacc 600

tcgacgaatt cacacacaat tgaatttcca tcacaaacta ttaaagtcaa accccatgga 660

actacaattt acactggaga ggtaaaacaa atgaattttt ccggagatta ctctggtaca 720

gctaaattaa caacaaagga tgtttctttt gctgcagtag atacttacgg gcatattgga 780

gatgttattg cagcaccggg agaggaagaa cattttttat ataatatttt taaatattca 840

ggccaatcaa tcccttcgga tattcgttta gatgatgaaa atagaatggt tgttgttgat 900

aattcatcca ttcattttac agggaaatta ggttttaaca tggaagccac atggaaattc 960

atccctgatg atcctaaaaa accaagtgtt acaataccaa atgatgtata tttaaaagaa 1020

caggcttctg ggaacattag caagtacatt gacggattaa tacaaactaa aatgaaatct 1080

atgcatcaa 1089

<210> 36

<211> 363

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 36

Met Ala Ser Lys Glu Ser Lys Met Pro Pro Lys Thr Val His Ala Gln

1 5 10 15

Ala Lys Gln Ser Asn Leu Ser Thr Lys Ser Asn Ser Asn Leu Tyr Leu

20 25 30

Ile Gly Asp Tyr Leu Asn Gln Arg Ile Tyr Asp Ala Val Lys Asn Arg

35 40 45

Pro Asp Leu Phe Val Tyr Lys His Ile Gly Asp Gln Ser Gly Arg Thr

50 55 60

Glu Arg Ile Ser Asp Met Asp Gln Ser Leu Gln Asn Gly Tyr Ile Glu

65 70 75 80

Val Met Asn Ala Leu Lys Tyr Pro Gly Val Thr Ile Asn Asn Gly Asn

85 90 95

Asn Ile Asp Trp Asn Gln Arg Glu Tyr Val Gly Gly Asp Ile Lys Val

100 105 110

Thr Gly Lys Gln Asp Lys Val Asp Gly Leu His Ser Phe Thr Leu Gly

115 120 125

Thr Phe His Asn Thr Gly Asp Ile Glu Gln Thr Ala Thr Thr Gln Lys

130 135 140

Glu Thr Tyr Gln Thr Thr Asp Ser Phe Thr Tyr Ser Asn Ser Glu Gly

145 150 155 160

Val Lys Leu Gly Leu Thr Glu Ser Ile Lys Ala Thr Ala Gly Val Pro

165 170 175

Phe Val Ile Glu Gly Glu Glu Thr Thr Thr Ile Ser Ser Glu Phe Ser

180 185 190

Tyr Asn His Thr Ser Ser Asn Thr Ser Thr Asn Ser His Thr Ile Glu

195 200 205

Phe Pro Ser Gln Thr Ile Lys Val Lys Pro His Gly Thr Thr Ile Tyr

210 215 220

Thr Gly Glu Val Lys Gln Met Asn Phe Ser Gly Asp Tyr Ser Gly Thr

225 230 235 240

Ala Lys Leu Thr Thr Lys Asp Val Ser Phe Ala Ala Val Asp Thr Tyr

245 250 255

Gly His Ile Gly Asp Val Ile Ala Ala Pro Gly Glu Glu Glu His Phe

260 265 270

Leu Tyr Asn Ile Phe Lys Tyr Ser Gly Gln Ser Ile Pro Ser Asp Ile

275 280 285

Arg Leu Asp Asp Glu Asn Arg Met Val Val Val Asp Asn Ser Ser Ile

290 295 300

His Phe Thr Gly Lys Leu Gly Phe Asn Met Glu Ala Thr Trp Lys Phe

305 310 315 320

Ile Pro Asp Asp Pro Lys Lys Pro Ser Val Thr Ile Pro Asn Asp Val

325 330 335

Tyr Leu Lys Glu Gln Ala Ser Gly Asn Ile Ser Lys Tyr Ile Asp Gly

340 345 350

Leu Ile Gln Thr Lys Met Lys Ser Met His Gln

355 360

<210> 37

<211> 1182

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属的种

<400> 37

atgaagtgct ggaagaaaaa aatagctcaa gttgcaccaa tttgtgtatt aagtacagga 60

tttttagtgg gggtaggaaa tcccgctttt gcagctagta aggaatcaaa gatgagtccc 120

caaaccgttt atgctcaagc gacacaatct gatttatcga ctacgtctaa tagtaactta 180

tctcatatcg gggatgattt aaatcaaaga atccatgacg ctgtggaaaa taggcctgat 240

ttatttatat atagatatct tagggatgat aggggtagaa cgaacgtacg gatgagtgat 300

atgcctcaaa gtgacaacag tggttataac tttgtaatga atagcttaca atacggaaaa 360

gttacgatta acaatggata taatatcgat tggaatcaaa gagaatatgt cggtggagat 420

atcaaggtaa cgggtaaaca agacagcata ggtgggttgc atagttttac actaggaact 480

tttcataaca ctgaagatat tgaacaaaca gctactacgc aaaaagaaac ttatcaaaca 540

acagatagtt ttacctattc aaatagtgag ggtgtcaaat taggattgac agaatctata 600

aaagcaactg ctggtgtacc ttttgttata gcaggcgacg agacaaccac actctcaagt 660

gagttttcat ataatcatac ctcttcaaat acatcgacga actcacatac aattgaattt 720

ccatcacaga ctattaaagt caaaccgcat ggaactacaa tttacatggg tgaggtaaaa 780

caaatgaatt tttctggaga ttactctggg acagcgaaat tatcaacaaa ggatgtttct 840

ttttcaataa cggattcggg aggccattgg ggagatgtta tcgctgcgcc gggtgaagat 900

gagtattttt tatataatat attcaaatac tccggtcatc caattccttc agatattcgt 960

ttagatgatg aaaataaaac ggttgttgtt gttaattcat ccattcattt tacagggaaa 1020

ctaggtttta acatggaggc cacatggaga ttcatccctg atgatcctaa aaaaccaatt 1080

gttacaatac caaatgatgt atatttaaaa gaacaagctt ctgggaatat tagcaagtac 1140

attgaccaat taatacaaac taaaatgaaa tctatgcatc aa 1182

<210> 38

<211> 394

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属的种

<400> 38

Met Lys Cys Trp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Val Ala Pro Ile Cys Val

1 5 10 15

Leu Ser Thr Gly Phe Leu Val Gly Val Gly Asn Pro Ala Phe Ala Ala

20 25 30

Ser Lys Glu Ser Lys Met Ser Pro Gln Thr Val Tyr Ala Gln Ala Thr

35 40 45

Gln Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Asn Leu Ser His Ile Gly

50 55 60

Asp Asp Leu Asn Gln Arg Ile His Asp Ala Val Glu Asn Arg Pro Asp

65 70 75 80

Leu Phe Ile Tyr Arg Tyr Leu Arg Asp Asp Arg Gly Arg Thr Asn Val

85 90 95

Arg Met Ser Asp Met Pro Gln Ser Asp Asn Ser Gly Tyr Asn Phe Val

100 105 110

Met Asn Ser Leu Gln Tyr Gly Lys Val Thr Ile Asn Asn Gly Tyr Asn

115 120 125

Ile Asp Trp Asn Gln Arg Glu Tyr Val Gly Gly Asp Ile Lys Val Thr

130 135 140

Gly Lys Gln Asp Ser Ile Gly Gly Leu His Ser Phe Thr Leu Gly Thr

145 150 155 160

Phe His Asn Thr Glu Asp Ile Glu Gln Thr Ala Thr Thr Gln Lys Glu

165 170 175

Thr Tyr Gln Thr Thr Asp Ser Phe Thr Tyr Ser Asn Ser Glu Gly Val

180 185 190

Lys Leu Gly Leu Thr Glu Ser Ile Lys Ala Thr Ala Gly Val Pro Phe

195 200 205

Val Ile Ala Gly Asp Glu Thr Thr Thr Leu Ser Ser Glu Phe Ser Tyr

210 215 220

Asn His Thr Ser Ser Asn Thr Ser Thr Asn Ser His Thr Ile Glu Phe

225 230 235 240

Pro Ser Gln Thr Ile Lys Val Lys Pro His Gly Thr Thr Ile Tyr Met

245 250 255

Gly Glu Val Lys Gln Met Asn Phe Ser Gly Asp Tyr Ser Gly Thr Ala

260 265 270

Lys Leu Ser Thr Lys Asp Val Ser Phe Ser Ile Thr Asp Ser Gly Gly

275 280 285

His Trp Gly Asp Val Ile Ala Ala Pro Gly Glu Asp Glu Tyr Phe Leu

290 295 300

Tyr Asn Ile Phe Lys Tyr Ser Gly His Pro Ile Pro Ser Asp Ile Arg

305 310 315 320

Leu Asp Asp Glu Asn Lys Thr Val Val Val Val Asn Ser Ser Ile His

325 330 335

Phe Thr Gly Lys Leu Gly Phe Asn Met Glu Ala Thr Trp Arg Phe Ile

340 345 350

Pro Asp Asp Pro Lys Lys Pro Ile Val Thr Ile Pro Asn Asp Val Tyr

355 360 365

Leu Lys Glu Gln Ala Ser Gly Asn Ile Ser Lys Tyr Ile Asp Gln Leu

370 375 380

Ile Gln Thr Lys Met Lys Ser Met His Gln

385 390

<210> 39

<211> 1092

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 39

atggctagta aggaatcaaa gatgagtccc caaaccgttt atgctcaagc gacacaatct 60

gatttatcga ctacgtctaa tagtaactta tctcatatcg gggatgattt aaatcaaaga 120

atccatgacg ctgtggaaaa taggcctgat ttatttatat atagatatct tagggatgat 180

aggggtagaa cgaacgtacg gatgagtgat atgcctcaaa gtgacaacag tggttataac 240

tttgtaatga atagcttaca atacggaaaa gttacgatta acaatggata taatatcgat 300

tggaatcaaa gagaatatgt cggtggagat atcaaggtaa cgggtaaaca agacagcata 360

ggtgggttgc atagttttac actaggaact tttcataaca ctgaagatat tgaacaaaca 420

gctactacgc aaaaagaaac ttatcaaaca acagatagtt ttacctattc aaatagtgag 480

ggtgtcaaat taggattgac agaatctata aaagcaactg ctggtgtacc ttttgttata 540

gcaggcgacg agacaaccac actctcaagt gagttttcat ataatcatac ctcttcaaat 600

acatcgacga actcacatac aattgaattt ccatcacaga ctattaaagt caaaccgcat 660

ggaactacaa tttacatggg tgaggtaaaa caaatgaatt tttctggaga ttactctggg 720

acagcgaaat tatcaacaaa ggatgtttct ttttcaataa cggattcggg aggccattgg 780

ggagatgtta tcgctgcgcc gggtgaagat gagtattttt tatataatat attcaaatac 840

tccggtcatc caattccttc agatattcgt ttagatgatg aaaataaaac ggttgttgtt 900

gttaattcat ccattcattt tacagggaaa ctaggtttta acatggaggc cacatggaga 960

ttcatccctg atgatcctaa aaaaccaatt gttacaatac caaatgatgt atatttaaaa 1020

gaacaagctt ctgggaatat tagcaagtac attgaccaat taatacaaac taaaatgaaa 1080

tctatgcatc aa 1092

<210> 40

<211> 364

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 40

Met Ala Ser Lys Glu Ser Lys Met Ser Pro Gln Thr Val Tyr Ala Gln

1 5 10 15

Ala Thr Gln Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Asn Leu Ser His

20 25 30

Ile Gly Asp Asp Leu Asn Gln Arg Ile His Asp Ala Val Glu Asn Arg

35 40 45

Pro Asp Leu Phe Ile Tyr Arg Tyr Leu Arg Asp Asp Arg Gly Arg Thr

50 55 60

Asn Val Arg Met Ser Asp Met Pro Gln Ser Asp Asn Ser Gly Tyr Asn

65 70 75 80

Phe Val Met Asn Ser Leu Gln Tyr Gly Lys Val Thr Ile Asn Asn Gly

85 90 95

Tyr Asn Ile Asp Trp Asn Gln Arg Glu Tyr Val Gly Gly Asp Ile Lys

100 105 110

Val Thr Gly Lys Gln Asp Ser Ile Gly Gly Leu His Ser Phe Thr Leu

115 120 125

Gly Thr Phe His Asn Thr Glu Asp Ile Glu Gln Thr Ala Thr Thr Gln

130 135 140

Lys Glu Thr Tyr Gln Thr Thr Asp Ser Phe Thr Tyr Ser Asn Ser Glu

145 150 155 160

Gly Val Lys Leu Gly Leu Thr Glu Ser Ile Lys Ala Thr Ala Gly Val

165 170 175

Pro Phe Val Ile Ala Gly Asp Glu Thr Thr Thr Leu Ser Ser Glu Phe

180 185 190

Ser Tyr Asn His Thr Ser Ser Asn Thr Ser Thr Asn Ser His Thr Ile

195 200 205

Glu Phe Pro Ser Gln Thr Ile Lys Val Lys Pro His Gly Thr Thr Ile

210 215 220

Tyr Met Gly Glu Val Lys Gln Met Asn Phe Ser Gly Asp Tyr Ser Gly

225 230 235 240

Thr Ala Lys Leu Ser Thr Lys Asp Val Ser Phe Ser Ile Thr Asp Ser

245 250 255

Gly Gly His Trp Gly Asp Val Ile Ala Ala Pro Gly Glu Asp Glu Tyr

260 265 270

Phe Leu Tyr Asn Ile Phe Lys Tyr Ser Gly His Pro Ile Pro Ser Asp

275 280 285

Ile Arg Leu Asp Asp Glu Asn Lys Thr Val Val Val Val Asn Ser Ser

290 295 300

Ile His Phe Thr Gly Lys Leu Gly Phe Asn Met Glu Ala Thr Trp Arg

305 310 315 320

Phe Ile Pro Asp Asp Pro Lys Lys Pro Ile Val Thr Ile Pro Asn Asp

325 330 335

Val Tyr Leu Lys Glu Gln Ala Ser Gly Asn Ile Ser Lys Tyr Ile Asp

340 345 350

Gln Leu Ile Gln Thr Lys Met Lys Ser Met His Gln

355 360

Claims (36)

1.一种多肽，其中包含：

(a)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；

(b)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；或

(c)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是分离的多肽。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其进一步包含异源氨基酸序列。

4.一种编码多肽的核酸分子，所述多肽包含：

(a)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；

(b)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；或

(c)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述核酸分子是分离的核酸分子。

6.根据权利要求4或5所述的核酸分子，其中所述核酸分子不是编码所述多肽的天然存在的序列。

7.根据权利要求4-6中任一项的核酸，其中所述核酸分子是设计用于在植物中表达的合成序列。

8.一种宿主细胞，其中包含编码多肽的核酸分子，所述多肽包含：

(a)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；

(b)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；或

(c)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌宿主细胞或植物细胞。

10.一种DNA构建体，其包含与编码多肽的核苷酸序列可操作地连接的异源启动子，所述多肽包括：

(a)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；

(b)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；或

(c)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列。

11.根据权利要求10所述的DNA构建体，其中所述启动子驱动植物细胞中的表达。

12.根据权利要求10或11所述的DNA构建体，其中所述核苷酸序列是设计用于在植物中表达的合成DNA序列。

13.根据权利要求10所述的DNA构建体，其中所述启动子驱动细菌细胞中的表达。

14.一种载体，其包含权利要求10-13中任一项的DNA构建体。

15.宿主细胞，其包含权利要求10-13中任一项的DNA构建体或权利要求14的载体。

16.一种包含多肽的制剂，其中所述多肽包含：

(a)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；

(b)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；或

(c)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列。

17.根据权利要求16所述的制剂，其中所述组合物选自粉末、粉尘、丸剂、可湿性颗粒、可湿性粉末、喷雾、乳液、胶体和溶液。

18.一种控制害虫群体的方法，包括使所述害虫群体与杀虫有效量的权利要求16或17所述的制剂接触。

19.一种生产具有杀虫活性的多肽的方法，包括在表达编码所述多肽的核酸分子的条件下培养权利要求8、9或15中任一项所述的宿主细胞。

20.一种植物，其具有稳定地掺入到其基因组中的DNA构建体，所述DNA构建体包含编码具有杀虫活性的蛋白质的核酸分子，其中所述核酸分子包含：

(a)编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述多肽具有杀虫活性；

(b)编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；或

(c)编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列。

21.根据权利要求20所述的植物的转基因种子，其中所述种子已将所述DNA构建体稳定地掺入到其基因组中。

22.根据权利要求20所述的植物，其中所述杀虫活性控制鳞翅目害虫、半翅目害虫或鞘翅目害虫。

23.根据权利要求20所述的植物，其中所述植物是单子叶植物。

24.根据权利要求20所述的植物，其中所述植物是双子叶植物。

25.根据权利要求23所述的植物，其中所述植物为玉米、高粱、小麦、水稻、甘蔗、大麦、燕麦、黑麦、小米、椰子、菠萝或香蕉。

26.根据权利要求24所述的植物，其中所述植物为向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、大豆、甜菜、烟草、油菜、红薯、苜蓿、红花、花生、木薯、咖啡、可可、黄瓜、生菜、橄榄、豌豆或茶。

27.一种保护植物免受昆虫害虫的方法，包括在植物或其细胞中表达编码杀虫多肽的核酸分子，其中所述核酸分子包括：

(a)编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；

(b)编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；或

(c)编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列。

28.根据权利要求27所述的方法，其中保护所述植物包括控制昆虫害虫对所述植物的损害。

29.一种提高植物产量的方法，其中包括在田地中生长在其基因座中稳定地掺入了DNA构建体的植物或其种子，所述DNA构建体包含驱动与之可操作地连接的编码杀虫多肽的核酸分子在植物中的表达的启动子，其中所述核酸分子包含：

(a)编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；

(b)编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性；或

(c)编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中所示的氨基酸序列。

30.根据权利要求27-29中任一项的方法，其中所述植物产生对鳞翅目害虫、半翅目害虫或鞘翅目害虫具有杀虫活性的杀虫多肽。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述鳞翅目害虫或所述鞘翅目害虫对苏云金芽孢杆菌的一种或多种菌株或者由苏云金芽孢杆菌的一种或多种菌株产生的一种或多种毒素蛋白具有抗性。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述鳞翅目害虫或所述鞘翅目害虫对Cry34/Cry35、Cry3Bb、Cry2Ab2和Vip3A中的任何一种具有抗性。

33.根据权利要求27-32中任一项所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。

34.根据权利要求27-32中任一项所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述植物是玉米、高粱、小麦、水稻、甘蔗、大麦、燕麦、黑麦、小米、椰子、菠萝或香蕉。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述植物为向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、大豆、甜菜、烟草、油菜、红薯、苜蓿、红花、花生、木薯、咖啡、可可、黄瓜、生菜、橄榄、豌豆或茶。