【発明の詳細な説明】
バチルス・チューリンギエンシス毒素
発明の背景
土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（B.t.
）は、パラ胞子結晶性蛋白質封入体により伝統的に特徴づけられている、グラム
陽性の胞子形成性細菌である。これらの封入体はしばしば、顕微鏡下で独特な形
態の結晶として観察される。この蛋白質は害虫に対して非常に毒性であり、毒素
活性が特異的でありうる。あるB.t.毒素遺伝子が単離、配列決定され、組換えDN
Aに基づくB.t.産物が製造され、使用が認可されている。さらに、遺伝子操作技
術を用いて、B.t.毒素を農業環境へ送達する新規なアプローチが開発途中であり
、それには、昆虫に耐性のある内毒素遺伝子を用いて遺伝的に改変した植物の使
用、およびB.t.毒素送達の担体として安定化された完全な細菌細胞の使用が含ま
れる（Gaertner，F.H.，L.Kim［1988］TIBTECH 6:S4-S7;Beegle,C.C.，T.Yamamo
to.，「バチルス・チューリンギエンシスの歴史、ベルリンの研究および開発（H
istory of Bacillus thuringiensis Berliner research and development）」，
Can.Ent．124:587-616）。したがって、単離されたB.t.内毒素遺伝子が商業的に
価値のあるものとなりつつある。
１５年前まで、B.t.農薬の商業的使用は、鱗翅目害虫（幼虫）という非常に狭
い範囲に限られていた。B.チューリンギエンシス亜種クルスタキ（kurstaki）の
胞子および結晶の調製物が、鱗翅目害虫の商業的殺虫剤として長い間用いられて
いた。例えば、B.チューリンギエンシス変種クルスタキHD-1は、多くの鱗翅目昆
虫の幼虫に対して毒性である結晶性δ-内毒素を産生する。
研究により、現在はるかに広範囲の害虫に対する特異性を有するB.t.農薬が開
発された。例えば、B.t.の他の種、すなわちイスラエレンシス（israelensis）
およびモリソニ（morrisoni）（テネブリオニス(tenebrionis)、B.t.M-7、B.t.
サンディエゴ(san diego)としても知られる）が、それぞれ双翅目および鞘翅目
の昆虫を制御するために商業的に用いられている（Gaertner,F.H．[1989]「鎖虫
性蛋白質の細胞送達系：生微生物および死微生物（Cellular Delivery Systems
for Inssecticidal Proteins:Living and Non-Living Microorganisms）」穀物
保護剤
の制御送達（Controlled Delivery of Crop Protection Agents）より、R.M.Wil
kins編、Taylor and Francis，New York and London，1990 pp.245-255）。また
カウチ（Couch T.L.）(1980)「バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレン
シス変種の蚊病原性（Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var
．israelensis）」（Developments in Industrial Microbiology 22:61-76）お
よびビーグル（Beegle,C.C.）(1978)「農業経済系における虫性細菌の使用（Use
of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems）」（Developments in Industr
ial Microbiology 20:97-104）も参照されたい。クリーク（Krieg,A.）、ヒュー
ガー（A.M.Huger）、ランゲンブルフ（G.A.Langenbruch）、シュネッター（W.Sc
hnetter）(1983)は、バチルス・チューリンギエンシス・テネブリオニス変種に
ついて報告しており（Z.ang.Ent．96:500-508）、該B.t.種は報告によれば鞘翅
目の二つの甲虫に対して有効である。これらは、コロラドポテト甲虫、レプチノ
タルサ・デセムリネアータ（Leptinotarsa decemlineata）およびアゲラスチカ
・アルニ（Agelastica alni）である。
ごく最近、B.t.の新規亜種が同定され、活性なδ-内毒素蛋白質の遺伝子が単
離された（Hofte,H.,H.R.Whiteley［1989］Microbiological Revies 52(2):242-
255）。ヒュフテ（Hofte）およびホワイトリー（Whiteley）は、B.t.結晶蛋白質
を四つの主要クラスに分類した。そのクラスとは、CryI（鱗翅目特異的）、CryI
I（鱗翅目および双翅目特異的）、CryIII（鞘翅目特異的）、およびCryIV（双翅
目特異的）である。その他の害虫に特異的に毒性である菌株の発見が報告されて
いる（Feitelson,J.S.，J.Payne，L.Kim［1992］Nio/Technology 10:271-275）
。線虫特異的な毒素遺伝子のクラスを称するため、CryVが提唱されている。ラン
バートら（Lambert,B.，L.Buysse，C.Decock，S.Jansens，C.Piens，B.Saey，J.
Seurinck，K.van Audenhove，J.van Rie，A.Van Vliet，M.Peferoen［1996］App
l．Environ．Microbiol 62(1):80-86）は、鱗翅目昆虫に対して有効なCry９毒素
の特徴について記述している。公開されたPCT出願WO94/05771およびWO94/24264
もまた鱗翅目害虫に対して有効なB.t.単離株について記述している。グリーブら
（Gleaveら[1991]JGM 138:55-62）、シェブレフら（Shevelevら［1993］FEBS Le
tt．336:79-82）およびスマルビッチら（Smulevitchら［1991］FEBS Lett．293
:25-26）もまた、B.t.毒素について記述している。B.t.遺伝子の他の多数のクラ
スが今では同定されている。
大腸菌におけるB.t.結晶性蛋白質遺伝子のクローニング及び発現が出版文献に
記述されている（Schnepf H.E.，H.R.Whiteley［1981］Proc．Natl.Acad.Sci.US
A 78:2893-2897）。米国特許第4,448,885号および米国特許第4,467,036号は両者
とも大腸菌におけるB.t.結晶性蛋白質の発現について開示している。米国特許第
4,990,332号、第5,039,523号、第5,126,133号、第5,164,180号、および第5,169,
629号は、鱗翅目害虫に対する活性を有するB.t.毒素を開示するものである。PCT
出願WO96/05314に、PS86W1、PS86V1、および鱗翅目害虫に対して有効な他のB.t.
単離株が開示されている。WO94/24264およびWO94/05771として発行されたPCT特
許出願に、鱗翅目害虫に対して有効な、B.t.単離株および毒素が記載されている
。ノクテュイデ科（Noctuidae）に属するものに対して有効なB.t.蛋白質がラン
バートら（前記）によって報告されている。米国特許第4,797,276号および第4,8
53,331号には、様々な環境において鞘翅目害虫を制御するのに用いられるB.チュ
ーリンギエンシス・テネブリオニス菌株が開示されている。米国特許第4,918,00
6号には双翅目に対して有効なB.t.毒素が開示されている。米国特許第5,151,363
号および米国特許第4,948,734号には、線虫に対して有効なB.t.のある単離株が
開示されている。線虫に対する有効性を開示しているその他の米国特許としては
下記のものが含まれる：第5,093,120号、第5,236,843号、第5,262,399号、第5,2
70,448号、第5,281,530号、第5,322,932号、第5,350,577号、第5,426,049号、お
よび第5,439,881号。
HD263クルスタキのcry2Aa遺伝子は264JBC4740にドノバン（Donovan）らによっ
て開示されている（1989）。HD1クルスタキの別のcry2Aaおよびcry2Ab遺伝子は1
71 J.Bac．965-974（1989）にウィドナー（Widner）およびウィテリー（Whitele
y）によって開示されている。HD1クルスタキの別のcry2Ab遺伝子は4Mol．Micro
2087-2094（1990）にダンクコジック（Dankocsik）らによって開示されている。
B.t.S-1（shanghai）のcry2Ac遺伝子は81 FEMS 31-36（1991）にウー(Wu)らによ
って開示されている。
PS192M4として公知の単離株は、シラミに対して有効な株として米国特許第5,2
73,746号に開示されている。
PS86I2は、鱗翅目に対して有効であるとして米国特許第5,686,069号に開示さ
れている。PS91C2は、CryIF（b）型の鱗翅目に有効な毒素、すなわちその明細書
に開示されている配列を産生すると、その明細書に開示されている。
HD525の鱗翅目に有効な毒素の配列情報およびHD573の鱗翅目に有効な毒素の配
列は国際公開公報第98/00546号に開示されている。それらの毒素はCry2型の毒素
ではない。
広範な研究および資源の投資の結果、新規B.t.単離株およびB.t.単離株の新規
用途についてのその他の特許が発行されている。フェイテルソンら（Feitelson
ら、前記）のレビューを参照のこと。しかし、新規B.t.単離株および既知のB.t.
単離株の新規用途の発見は、依然として経験的なものであり、予測不可能な分野
である。米国特許第5,506,099号には、未知のB.t.単離株を同定するための方法
が記載されている。米国特許第5,204,237号には、B.t.毒素遺伝子を単離するた
めの特異的かつ普遍的なプローブが記載されている。しかし、これらの特許は本
発明のプローブおよびプライマーを記載してはいない。
発明の簡単な概要
本発明は、哺乳動物でない有害生物、特に、植物にとっての有害生物を防除す
るのに有用な材料および方法に関する。具体的な態様において、本発明は、鱗翅
目害虫を制御するのに有用な新規な毒素を提供する。本発明の好ましい態様は、
鱗翅目に有効な本発明の新規な毒素をコードするヌクレオチド配列をさらに提供
する。
本発明は、殺虫性毒素をコードする新規な遺伝子を同定および特徴分析する際
に有用なヌクレオチド配列および方法をさらに提供する。一態様において、本発
明は、PCR技法においてプライマーとして有用なユニークなヌクレオチド配列に
関する。プライマーは、新規な毒素遺伝子を同定および単離する際に使用するこ
とができる特徴的な遺伝子断片を産生する。本発明のさらに別の局面は、開示さ
れているヌクレオチド配列をプローブとして使用して、鱗翅目に有効であるB.t.
毒素をコードする遺伝子を検出することである。
本発明のさらに別の局面は、本明細書に具体的に開示されている新規な遺伝子
および毒素に加えて、本明細書に開示されている方法およびヌクレオチド配列を
使用して同定した他の新規な遺伝子および毒素を含む。このようにして同定した
遺伝子は鱗翅目に有効な毒素をコードする。同様に、これらの毒素を産生するこ
とができる単離株はこれらの害虫に対する活性を有する。このように、本発明は
、本発明に係るプライマーとプローブとを用いて見出される殺虫活性を有する新
規なバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringinensis）単離株をさ
らに提供する。
本発明の一態様において、B.t.単離株は、微生物の増殖性が結果として大きく
なるような条件下で培養することができる。１本鎖ゲノム核酸が得られるように
微生物を処理した後、DNAを本発明のプライマーと接触させ、PCR増幅させること
ができる。毒素をコードする遺伝子の特徴的な断片がこの手順によって増幅され
、それによって毒素をコードする遺伝子の存在が同定される。
好ましい態様において、本発明は、標的害虫によって食害される組織内に形質
転換植物細胞が殺虫性毒素を発現するように、本発明の少なくとも1つのポリヌ
クレオチド配列で形質転換された植物細胞に関する。植物のこのような形質転換
は、当業者に周知の技法を使用して実施することができ、典型的に植物内での毒
素の発現を最高にするように遺伝子を改変することを含んでもよい。また、本発
明の毒素は多数の毒素の一部を組み合わせることによって産生されたキメラ毒素
であってもよい。
植物の形質転換の代替法として、本発明のB.t.単離株および毒素、または本明
細書に記載されている毒素を発現する組換え微生物を使用して害虫を制御するこ
とができる。これに関しては、本発明は、実質的に無傷の細胞を標的害虫の環境
に適用するとき、殺虫活性が延長されるように処理した、実質的に無傷のB.t.細
胞および／または発現された本発明の毒素を含有する組換え細胞の処理を含む。
処理後の細胞は殺虫性毒素の保護被覆として作用する。毒素は標的昆虫に摂取さ
れると活性になる。
発明の簡単な説明
配列番号：１は本発明に係る有用なフォワードプライマーである。
配列番号：２は本発明に係る有用なリバースプライマーである。
配列番号：３は192M4毒素をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：４は192M4毒素の推定アミノ酸配列である。
配列番号：５はHD573毒素をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：６はHD573毒素の推定アミノ酸配列である。
配列番号：７はHD525毒素をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：８はHD525毒素の推定アミノ酸配列である。
配列番号：９は8612毒素をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：１０は8612毒素の推定アミノ酸配列である。
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳類以外の害虫を制御するための材料と方法とに関する。具体的
な態様において、本発明は、鱗翅目に対して有効な新規なバチルス・チューリン
ギエンシス（Bacillus thuringinensis）毒素と毒素をコードする遺伝子とに関
する。本発明は、これらの毒素をコードするポリヌクレオチド配列だけでなく、
これらのポリヌクレオチド配列を使用して、毒素を発現する組換え宿主を作成す
ることに関する。本発明は、殺虫性毒素、特に鱗翅目に有効な毒素をコードする
バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringinensis）（B.t.）遺伝子
のプライマーおよびプローブとして有用な新規なヌクレオチド配列にさらに関す
る。本発明はさらに、有用な特性を有するB.t.単離株、毒素および遺伝子を同定
し、特徴づける新規な方法に関する。
ここで提供されている新規の毒素とポリヌクレオチド配列は、いくつかのパラ
メータによって定義することができる。本明細書において説明されている毒素の
重要な特徴は、殺虫活性である。特異的な態様において、これらの毒素は、鱗翅
目害虫に対して活性をもつ。本発明に係る毒素と遺伝子は、さらに、アミノ酸配
列と塩基配列によって定義することができる。分子の配列は、特定の具体的な配
列に対する相同性または同一性、および、特定の具体的なプローブ、およびプラ
イマーとハイブリダイズすることのできる能力、または、それらによって増幅す
ることのできる能力によって定義することができる。本明細書において提供され
ている毒素は、また、一定の抗体との免疫反応性によって同定することもできる
。
B.t.結晶蛋白質の部位を組み合わせて、有用なキメラ毒素を製造する方法が開
発されている。部位を組み合わせることによって、殺虫性であるキメラ蛋白質が
製造されるかぎり、組み合わされる部位自体が殺虫性である必要はない。これは
、例えば、欧州特許第0 228 838号、Ge，A.Z.，N.L．Shivaroba，D.H．Dean(198
9)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:4037-4041、Ge，A.Z.，D．Rivers，R．Milne
，D.H．Dean（1991）J．Biol．Chem.266:17954-17958、Schnepf，H.E.，K．Tomc
zak，J.P．Ortega，H.R．Whiteley（1990）J．Biol．Chem.265:20923-20930、Ho
nee，G.，D．Convents，J．Van Rie，S．Jansens，M．Peferoen，B．Visser（19
91）Mol.Microbiol．5:2799-2806において述べられているように、制限酵素を用
いて行うことができる。または、細胞の組換えメカニズムを用いた組換えを、同
じような結果を達成するために用いることができる。例えば、Caramori，T.，A.
M．Albertini，A．Galizzi（1991）Gene 98:37-44、Widner，W.R.，H.R．Whitel
ey（1990）J.Bacteriol．172：2826-2832、Bosch，D.，B．Schipper，H van der
Kliej，R.A．de Maagd，W.J．Stickema（1994）Biotechnology 12:915-918。こ
のようなキメラDNAを作出することができる、その他多くの方法が、当技術分野
において知られている。本発明は、本出願において確認された新規の配列を利用
するキメラ蛋白質を含むものである。
本明細書で提供されている指示によって、当業者は、本明細書で説明されてい
る、さまざまな毒素とポリヌクレオチド配列を容易に作成し、使用することがで
きると考えられる。
本発明に記載されている有用なB.t.菌株は、米国イリノイ州61604、ペオリア
、ノースユニバーシティーストリート1815、北部研究センター、農業研究用特許
培養菌株コレクション（NRRL）の永久保存株として寄託されている。培養菌株の
寄託番号は、以下の通りである。
本特許出願の目的のために寄託されている培養菌株は、本出願が未決の間は、
37CFR1.14およびU.S.C.122の下に権限を与えられた、特許庁長官の指定する機関
による、培養菌株の利用を保証するという条件の下で寄託されている。本寄託菌
株は、本出願、または、その係続出願に相当する出願が提出された外国における
特許法によって必要とされるときにも利用することができる。ただし、寄託菌株
が利用できるということは、行政行為によって付与される特許権を減損させて、
本発明を実施する許可を与えるものではないことは明らかである。
さらに、本寄託培養菌株は、微生物の寄託に関するブタペスト条約の条項、す
なわち、その試料の寄託が最後に要請された時から5年以上の期間、また、いず
れの場合にも、寄託日から30年以上、または、培養菌株の開示を述べている特許
の有効期間中は、細心の注意をもって菌株の生存と汚染されない状態を保つよう
にして保存させるべきだという条項に従って保存され、一般に利用可能とされる
べきである。寄託者は、寄託状態のせいで、要請があったときに、受託期間が試
料を供給できなくなったときには、寄託物を取り替えるべき義務を認めるもので
ある。本培養菌寄託株を第三者が利用することに対するすべての制限は、それら
を開示している特許が認められたときには、以後取り消されることなく排除され
る。
単離株HD525およびHD573は、イリノイ州ペオリアにあるUSDA-ARS NRRL培養コ
レクションから入手可能である。
次の表は、本発明に記載されている有用な菌株の特徴を示したものである。
遺伝子および毒素 本発明に記載されている有用な遺伝子と毒素には、全長の
配列だけでなく、これらの配列の変異配列、突然変異配列の断片、および、本明
細書において特異的に例示された毒素に特徴的な農薬活性をもつ融合蛋白質を含
む。一つ以上のB.t.毒素または遺伝子に由来する部位を組み合わせて産生された
キメラ遺伝子と毒素も、本発明が教示するとことに従って利用することができる
。本明細書で用いられる遺伝子の「変種」または「変異」という用語は、同一の
毒素をコードするヌクレオチド配列、または殺虫活性を有する同等の毒素をコー
ドするヌクレオチド配列を表す。本明細書で用いられる「同等の毒素」という用
語は、標的の害虫に対して、例示された毒素と同一または本質的に同一の生物学
的活性を有する毒素を意味する。
活性のある毒素をコードする遺伝子は、いくつかの方法によって同定され入手
できることは、当業者には明白であると思われる。本明細書に例示されている特
定の遺伝子は、前述したように培養物寄託機関に寄託された単離株から得られる
。これらの遺伝子またはそれらの一部またはそれらの変種は、例えば遺伝子シン
セサイザーを使用して人工的に構築してもよい。遺伝子の変異は、点突然変異を
作出するための標準的な技術を用いて、容易に構築することができる。また、標
準的な処理手順によって、市販のエキソヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアー
ゼを用いて、これらの遺伝子の断片を作成することもできる。例えば、Bal31な
どの酵素、または部位特異的突然変異を用いて、これらの遺伝子の末端からシス
テマティックにヌクレオチドを切り出すこともできる。プロテアーゼを用いて、
直接これらの毒素の活性断片を得ることもできる。
同等な毒素および／またはこの同等な毒素をコードする遺伝子を、本明細書に
提示する教示によりB.t.単離株および／またはDNAライブラリーから探し出すこ
ともできる。本発明の殺虫毒素を得る方法は多数ある。例えば、本明細書で開示
され請求される殺虫毒素の抗体は、蛋白質の混合物から他の毒素を同定し分離す
るために使用できる。特に、抗体は、毒素の最も不変である部分及び他のB.t.毒
素とは最も異なる部分に対して作製してもよい。
例示された毒素の殺虫活性を保持している断片またはそれの等価物は、本発明
の範囲に含まれる。また、遺伝子コードの重複性により、さまざまに異なるDNA
配列が、本明細書において開示されているアミノ酸配列をコードすることができ
る。同一の、または本質的に同一の毒素をコードする、これらの代替DNA配列を
作出することは、充分に、当技術分野において熟練した当業者の技術の範囲内に
ある。これらの変異DNA配列は、本発明の範囲内にある。本明細書で用いられる
とき、「本質的に同一な」配列とは、農薬活性に実質的な影響を及ぼさない、ア
ミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入を起こした配列を意味する。農薬活性を
保持している断片も、この定義に含まれる。
本発明に係る特定の毒素が、特に、本明細書で例示されている。これらの毒素
は、本発明に係る典型的な毒素にすぎないため、本発明が、例示されている新規
な毒素と同一または同様の殺虫活性を有する、新規な遺伝子および毒素の変異体
または等価物にも関することは容易に認識される。これらの等価な遺伝子および
毒素は、典型的には本明細書で例示されている配列と60％以上の同一性を有し、
好ましくは75％以上の同一性を有し、より好ましくは80％以上の同一性を有し、
最も好ましくは90％以上の同一性を有し、95％以上の同一性である場合もある。
このアミノ酸の相同性は、毒素の重要な領域で、生物学的活性を説明する領域で
最も高く、究極的に、生物学的活性の原因となる三次構造の決定に関係する。こ
れに関しては、一つのクラスのアミノ酸が、同じタイプの別のアミノ酸に置換さ
れる保存的な置換は、化合物の生物学的活性を実質的に変更させない限り、本発
明の範囲内にある。表４は、各クラスに属するアミノ酸の例を表にしたものであ
る。
場合によっては、非保存的な置換も作ることができる。重要な要因は、この置
換が毒素の生物活性を有意に減少させてはならないことである。
本発明の毒素は、前述されているような、毒素封入体の形状及び場所といった
点からも特徴づけられる。新規な結晶蛋白質は本明細書に具体的に例示されてい
るが、本発明に従い使用するための単離株は、毒素の分泌を促進する条件下で増
殖させることができる。したがって、これらの培養物の上清を使用して、本発明
に係る毒素を得ることができる。このように、本発明は結晶蛋白質に限定されず
、有用な可溶性蛋白質も企図している。
本明細書で用いられる「単離された」ポリヌクレオチド、および/または「精
製された」毒素とは、これらの分子が、自然状態では一緒に存在する他の分子と
結合していない場合を指す。したがって、「精製された」毒素には、例えば、植
物で発現される、本発明の毒素が含まれうる。「単離精製された」とは、本明細
書で説明されているように、「人の手」が関与することを意味する。キメラ毒素
とキメラ遺伝子にも、「人の手」が関与する。
オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより、本発明の毒素および遺伝
子、さらには新規な遺伝子および毒素を同定するための方法が提供される。プロ
ーブにより、毒素をコードする遺伝子を同定するための迅速な方法が提供される
。本発明に係るプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、例えばDN
A合成装置および標準的な手順を使用して合成することができる。
組換え宿主 本発明の毒素コード遺伝子は、多様な微生物または植物の宿主へ
導入することができる。毒素遺伝子が発現すると、直接的または間接的に、殺虫
剤が生産され、そして保持される結果となる。適当な微生物宿主、例えばシュー
ドモナスを用いて、生きた微生物を害虫の環境に適用することができる。そこで
それらが増殖し摂取される。その結果、この害虫が抑制されることになる。また
は、毒素遺伝子を持つ微生物を屠殺し、毒素活性を延長し細胞を安定化するよう
な条件下で処理してもよい。毒素活性を保持している処理後の細胞を、標的害虫
の環境に適用することもできる。
様々な方法が、毒素をコードするB.t.遺伝子を、遺伝子の安定保持と安定発現
を考慮した条件で、微生物宿主に導入するために用いられる。このような方法は
当業者には既知であり、例えば、米国特許第5,135,867号に記載されている。こ
れは本明細書に参照として組み込まれる。
または、本発明の毒素を発現する植物を用いて、標的害虫と毒素とを接触させ
ることができる。合成遺伝子を作出するための方法は、例えば、米国特許第5,38
0,831号に記述されている。
細胞の処理 上述のように、B.t.またはB.t.毒素を発現する組換え細胞は、毒
素活性を延長し、細胞を安定化するために処理することができる。形成された殺
虫マイクロカプセルは、安定化された細胞構造内にB.t.毒素を含み、マイクロカ
プセルが標的害虫の環境に適用されたときに毒素を保護すると考えられる。微生
物細胞の処理方法は、米国特許第4,695,455号および第4,695,462号に開示されて
おり、これらは本明細書に参照として組み入れられる。
細胞の増殖 DNA構築体が選択に対する優位性を提供する場合、実質的に全て
の細胞、または全ての細胞がB.t.遺伝子を保持するような選択培地を準備すれば
、B.t.殺虫遺伝子を含む細胞宿主はいかなる簡便な栄養培地でも増殖させること
ができる。それから、細胞は通常の方法に従って収穫する。または、細胞は収穫
前に処理することもできる。
本発明のB.t.細胞は、標準人工培地および発酵技術を使用して培養できる。培
養サイクルの完了後、当技術分野において既知の手段により発酵培養液からB.t.
の胞子および結晶を最初に分離することにより細菌が回収される。周知の技法を
使用していかなるB.t.胞子および結晶体をも回収することができ、従来のδ-内
毒素B.t.製剤として使用することができる。例えば、取り扱いおよび特定の標的
害虫への適用を容易にするために界面活性剤、分散剤、不活性担体および他の成
分
を添加することによって、胞子および結晶体を水和剤、濃縮液剤、顆粒または他
の製剤として処方することができる。これらの製剤および適用手順は全て当技術
分野において周知である。または、発酵過程の上清を使用して、本発明に係る毒
素を得ることができる。次いで、可溶性の分泌毒素を単離し、周知の技法を使用
して精製する。
有害生物を制御するための方法および処方 本発明の菌株、毒素、および遺伝
子を用いた、クロヨトウムシを含む鱗翅目の制御は、当業者に既知のさまざまな
方法によって行うことができる。これらの方法には、例えば、有害生物（または
、それらがいる場所）へのB.t.菌株の施用、有害生物（または、それらがいる場
所）への組換え微生物の施用、および、本発明の農薬性毒素をコードする遺伝子
による、植物の形質転換が含まれる。組換え微生物は、例えば、B.t.、大腸菌、
またはシュードモナス菌（Pseudomonas）であろう。形質転換は、当業者が、標
準的な技術を用いて行うことができる。これらの形質転換に必要とされる材料は
、本明細書に開示されており、さもなければ、当業者が容易に入手できる。
誘引物質、ならびにB.t.単離株、または本明細書に開示されたB.t.単離株から
得られる遺伝子を含む組換え微生物の毒素を含む製剤化された顆粒状餌は、土壌
に適用することができる。製剤は、種子のコーティングとして、または穀物サイ
クルの後期段階における根の処理または植物全体の処理として適用することがで
きる。B.t.細胞を植物と土壌によって処理したものは、無機的鉱物（フィロケイ
酸塩、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）のような、さまざまな不活性物質、また
は、植物素材（粉末トウモロコシ穂軸、籾殻、クルミの殻など）と混合すること
によって、液体、湿潤性の散剤、顆粒剤、または粉末剤として用いることができ
る。
当業者には理解されるように、殺虫剤濃度は、特定の製剤の性質、特に濃縮物
であるかまたは直接使用されるかにより大きく変化する。殺虫剤は、少なくとも
１重量％含まれていてもよいし、100重量％でもよい。乾燥製剤は殺虫剤を約１
〜９５重量％を含み、液体剤型は通常液相中の固体重量として約１〜６０％を含
むであろう。製剤は一般的には、１mg当たり約102〜104個の細胞を含むであろう
。細胞を含むこれらの製剤は、１ヘクタール当たり約50mg（液状または乾燥状）
か
ら１kgまたはそれ以上で投与される。
製剤は、害虫の環境、例えば土壌および葉に、噴霧、散布、スプリンクラーな
どにより適用することができる。
変異株 本発明により得られる新規の単離株の変異体は、当技術分野において
既知の方法で作製できる。例えば、胞子形成しない変異株は、単離株のエチルメ
タンスルホネート（EMS）変異誘導法により得られる。変異体は、紫外光および
ニトロソグアニジンを使用して当技術分野において既知の方法により作製できる
。
ポリヌクレオチドプローブ ハイブリダイゼーションを用いて、2片のDNAが、
塩基配列において相補的か否かを調べることができる。目的のDNA配列を容易に
検出して、その特徴を調べるために、本発明のプローブの使用を容易にするのが
、このハイブリダイゼーションのメカニズムである。プローブは、RNAであって
もDNAであってもよい。このプローブは、通常は少なくとも約10塩基であり、よ
り一般的には少なくとも約18塩基であり、約50塩基か、それ以上になることもあ
るが、プローブが合成によって作成されるときには、大抵は、約200塩基以上に
なることはない。しかし、これよりも長いプローブを利用することもでき、この
ようなプローブは、例えば、数キロベースの長さである。
本発明のプローブとして使用するための方法の一つでは、B.t.菌株の遺伝子バ
ンクをサザンブロット解析して、開示されている塩基配列と相同性があるDNAセ
グメントを全部同定することが、まず必要である。このように、生物学的解析の
助けを借りなくても、多くの新規のB.t.菌株の予想される活性や、所定のB.t.菌
株で発現される個々の内毒素遺伝子産物の活性を予め知ることができる。このよ
うなプローブ解析は、B.t.のさまざまな亜種の中の農薬性内毒素遺伝子で、商業
的に価値のある可能性のあるものを同定するための迅速な方法を提供する。
特定のハイブリダイゼーション技術は、本発明にとって本質的ではない。ハイ
ブリダイゼーション技術における改良があれば、すぐにそれらを応用することが
できる。
プローブとして用いられる、本発明のヌクレオチドセグメントは、DNA合成機
を使用することによって、標準的な処理手順を用いて合成することができる。ヌ
クレオチドセグメントをプローブとして用いるときには、放射性標識、および非
放
射性標識を含む、当業者に既知の適当な標識によって特定のプローブを標識する
。
さまざまな程度のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを用いることが
できる。条件が厳しくなるほど、二本鎖を形成するために必要な相補性の程度は
高くなる。ストリンジェンシーは、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオ
ン強度、時間などによって調節することができる。好ましくは、例えば、ケラー
（Keller），G.H.，M.M．マナク（Manak）(1987)DNAプローブ（DNA Probes）、
ストックトンプレス社、ニューヨーク州ニューヨーク（StocktonPress，New Yor
k，NY.）169〜170ページにおいて説明されているように、ハイブリダイゼーショ
ンは、当技術分野において周知の技術によって、ストリンジェントな条件下で行
われる。本明細書で用いられる、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジ
ェントな」条件とは、本出願人らが用いた条件と全く同じか、ほぼ同じ程度のハ
イブリダイゼーション特異性に達する条件を意味する。特異的には、32P標識さ
れた遺伝子特異的なプローブによる、固定されたDNAのサザンブロット上でのハ
イブリダイゼーションが、標準的な方法によって行われた（Maniatisら）。一般
的に、ハイブリダイゼーションと、その後の洗浄は、例示された毒素遺伝子に相
同性のある標的配列を検出することを可能にするストリンジェンシー条件の下で
行われた。二本鎖DNA遺伝子のプローブについては、6×SSPE、5×デンハルト溶
液、0.1% SDS、0.1mg/mlの変性DNAの中で、DNAハイブリッドの融解温度（Tm）よ
りも20〜25℃低い温度で一晩ハイブリダイゼーションを行った。融解温度は、下
記の化学式によって表されている（ベルツ（Beltz，G.A.）、ジェイコブズ（K.A
．Jacobs）、アイクブッシュ（T.H．Eickbush）、ケルバス（P.T．Cherbas）、
カファトス（F.C．Kafatos）[1983]酵素学の方法（Methods of Enzymology）、
ウー（R．Wu）グロスマン（L．Grossman）とモルダブ（K．Moldave）、アカデミ
ックプレス社（Academic Press）、ニューヨーク 100：266〜285）。
Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(%G+C)-0.61(%ホルムアミド)-600/二本鎖の塩
基対長
一般的に、洗浄は、以下のようにして行われる：
(1) 1×SSPE、0.1% SDS中、室温で15分間を2回（ストリンジェンシーの低い洗
浄）
(2) 0.2×SSPE、0.1% SDS中、Tm-20℃で15分間を1回（中度のストリンジェンシ
ー洗浄）
オリゴヌクレオチドプローブについては、6×SSPE、5×デンハルト溶液、0.1%
SDS、0.1mg/mlの変性DNAの中で、DNAハイブリッドの融解温度（Tm）よりも10〜
20℃低い温度で一晩ハイブリダイゼーションを行った。オリゴヌクレオチドプロ
ーブに関するTmは、下記の化学式によって決定された：
Tm(℃)＝2(T/A塩基対の数)＋4(G/C塩基対の数)
（Suggs，S.V.，T．Miyake，E.H．Kawashime，M.J．Johnson，K．Itakura，およ
びR.B．Wallace［1981］ICN-UCLASymp．Dev．Biol．Using Purified Genes（精
製した遺伝子の使用），D.D．Brown[編]、アカデミックプレス社（Academic Pre
ss）、ニューヨーク 23:683〜693）。
一般的に、洗浄は、以下のようにして行った：
(1) 1×SSPE、0.1% SDS中、室温で15分間を2回（ストリンジェンシーの低い洗
浄）
(2) 1×SSPE、0.1% SDS中、ハイブリダイゼーション温度で15分間を1回（中度
のストリンジェンシー洗浄）。
PCR 技術 本発明のDNA配列をPCR増幅用プライマーとして用いることができる
。PCR増幅を行うとき、プライマーと鋳型との間の、ある程度のミスマッチは許
容される。したがって、例示されたプライマーの突然変異、欠失、または挿入（
特に、5'末端へのヌクレオチドの付加）は、本発明の範囲内に含まれる。通常の
技術をもつ当業者に既知の方法によって、所与のプライマーの中に、突然変異、
挿入、または欠失を作出することができる。
下記は、本発明を実践するための方法を例示する実施例である。これらの実施
例は、本発明を限定するものとして解釈されるべきはない。特記しない限り、百
分率は全て重量に基づき、溶媒混合液の割合は全て容積に基づく。実施例１−本明細書に記載のB.t.単離株の一般的培養法
B.t.単離株またはその変異株の継代培養液を、下記のペプトン、グルコース、
塩培地に接種するために使用することができる。
バクトペプトン（Bacto Peptone） 7.5g/l
グルコース 1.0g/l
KH2PO4 3.4g/l
K2HPO4 4.35g/l
塩類溶液 5.0ml/l
CaCl2溶液 5.0ml/l
pH7.2
塩類溶液（100ml）
MaSO4・7H2O 2.46g
MnSO2・H2O 0.04g
ZnSO4・7H2O 0.28g
FeSO4・7H2O 0.40g
CaCl2溶液（100ml）
CaCl2・2H2O 3.66g
塩類溶液および塩化カルシウム溶液を濾過減菌し、オートクレーブして加熱し
たブロスに、接種時に添加した。フラスコを30℃で回転式振盪機で200rpmで64時
間インキュベートした。
上記の手順は、当技術分野において既知の方法により大量発酵器へと容易にス
ケールアップすることができる。
上述の発酵により得られるB.t.毒素は、当技術分野において周知の方法により
単離できる。通常使用される方法は、収穫した発酵培地を遠心分離などの分離法
に供するものである。実施例2−鱗翅目に有効な新規バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thur inginensis）毒素をコードする遺伝子の同定
B.t.菌株中の新規な毒素遺伝子を同定し分類するために、DNAに基づいたポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）を使用した。毒素遺伝子を同定するために有用な2つの
PCRプライマー（フォワード1およびリバース1）を作製した。これらのプライマ
ーは、アンビギュイティー・コードによって規定された縮退コドンをヌクレオチ
ド位置に有し、5'末端には制限部位が組込まれており、増幅された新規なDNA断
片の分
子クローニングを可能にしている。これらのオリゴヌクレオチドの配列は以下の
通りである：
フォワード1：
リバース1：
アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製型番381A DNA合成装
置を使用してプライマーを合成した。次いで、以下のように、標準的なPCRプロ
トコール（Perkin-Elmer）により、これらのプライマーを用いてゲノムB.t.DNA
鋳型から毒素遺伝子を増幅した。PCRのDNA鋳型は寒天培地で18時間増殖させたB.
t.細胞から調製した。50μg/mlのプロテイナーゼKを含有するTE緩衝液中に白金
耳量の細胞を懸濁し、55℃において15分間インキュベーションした。次いで、細
胞懸濁液を15分間沸騰させた。細胞の破片が微小管中でペレット化し、DNAを含
有する上清をきれいな試験管に移した。この粗ゲノムDNA鋳型の10μlを、50mM K
Cl、10mM Tris-Cl（pH8.3）、1.5mM MgCl2、200μMの各dNTP、0.1〜1μMの各プ
ライマーおよび2.5単位のTaq DNAポリメラーゼを含む100μlのPCR反応混合液に
使用した。実施例3−バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringinensis）毒素遺 伝子の制限断片長多型（RFLP）
プライマー対1（フォワード1およびリバース1）を使用したPCR増幅は、cry2サ
ブファミリーに関連するB.t.毒素遺伝子から、鎖長が約1900塩基対のDNA断片を
生じることが予測される。PCR産物の消化によって産生したDNA制限酵素断片のサ
イズを、例えばBgIII、HincII、ScaIまたはHinFIと比較することによって、増幅
した遺伝子配列を互いにおよび公知の遺伝子から識別した（表5）。簡単には、P
CR反応物の約0.25〜1μgのDNAを所定の制限酵素で消化し、アガロースまたはポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動した。次いで、ゲルを臭化エチジウムで染色し
、DNA制限酵素断片を260〜280nmのUV光線を照射することによって可視化した。
制限
酵素断片のサイズは、既知のサイズの標準的なDNA断片と比較した電気泳動の移
動度によって測定した。いくつかの菌株において、断片の数から複数の増幅毒素
遺伝子が存在することが示された。 ユニークな制限断片長多型を有する菌株の遺伝子をpBlueacript SK（ストラタ
ジーン（Stratagene）社、カリフォルニア州サンジエゴ）にクローニングし、大
腸菌NM522に形質転換し、さらに研究を実施した。これらの新規毒素をコードす
るプラスミドを有する組換え大腸菌株の継代培養物を、1996年10月17日にイリノ
イ州61604、ペオリア、ノースユニバーシティストリート1815、地域研究センタ
ー（
Regional Research Center）、特許培養物コレクション（NRRL）の永久コレクシ
ョンに寄託した。実施例4−新規毒素遺伝子のDNA配列解析
自動配列決定のためのDNA鋳型をベクタープライマーを使用したPCRによって増
幅した。アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社（カリフォルニ
ア州フォスターシティ）製の自動配列決定方法を使用してこれらのDNA鋳型の配
列を決定した。新規な毒素遺伝子配列（配列番号：3、5、7および9）およびそれ
ぞれの推定ポリペプチド配列（配列番号：4、6、8および10）を以下の表6に掲載
する。
実施例5−新規なB.t.毒素のシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas flu orescens）中での異種発現
上記に掲載した毒素遺伝子を標準的なDNAクローニング方法によってプラスミ
ドベクターに組み入れ、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluore
scens）に形質転換した。種々の鱗翅目害虫に対する発現および定量的生物検定
を実施するための毒素を産生するために組換え細菌株を振盪フラスコ中で増殖さ
せた。実施例6−ヘリオシス・ヴィレセンス（Heliothis virescens）（Fabricius）お よびヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）（Boddie）に対する新規B.t.毒素 の活性
粉末飼料を蒸留水と個別に混合し、激しく攪拌することによって、本発明に係
る組換えクローンを含有する粉末の懸濁液を調製した。懸濁液に加熱したダイズ
粉末人工飼料を、6mLの懸濁液プラス54mLの飼料の割合で混合し、100μg毒素/最
終飼料1mLの濃度を得た。ボルテックスに供した後、この混合物を3mlのウェ
ルに区切られたプラスチック製のトレー（Nutrend Container Corpration）フロ
リダ州ジャクソンビル）に注いだ。組換え毒素を含有しない水のブランクを対照
として使用した。一齢幼虫（USDA-ARS、ミシシッピ州、ストーンビル）を1匹ず
つ飼料混合物中に入れた。次いで、ウェルを粘付アイロンを使用して「MYLAR」
シート（ClearLam Packaging、イリノイ州）で密封し、各ウェルに数個の針穴を
開け、ガス交換させた。幼虫は25℃の14:10（明：暗）飼育室で飼育した。6日後
の死亡率を記録した。
実施例7−ヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nubilalis）（Huebner）に対する 新規なB.t.毒素の活性
粉末試料に蒸留水を混合することによって、0.5mlまたは1mlの容量の試験懸濁
液を調製した。試験懸濁液をスナップキャップ付きの12×75mmのポリプロピレン
管（例えば、Elkay Laboratory Products）に滅菌充填した。飼料を分注する前
に、34〜35℃までの温度で予備加温した熱いブロック（例えば、Fisher Scienti
fic Hot Block）に約15分間（または15分以内の間）管を置いた。12×75mm管に
飼料を添加する直前に2、3秒間試験懸濁液をボルテックスに供した。0.5mlまた
は1mlの容量に1または2mlの飼料をそれぞれ添加した。飼料を測定し、先端にゴ
ムのピストン棒が付いた3mlまたは5mlのシリンジによって、管に注入した。試
験懸濁液と飼料を入れた管を5〜10秒間または混じり合うのが目に見えるまでボ
ルテックスに供した。次いで、毒素/飼料懸濁液を、事前に標識を付けた96ウェ
ルの解析トレーに分注した。
1.25ml容量のピペット・チップを有する反復ピペッターにより1つのウェルあ
たり約100μlとなるよう4セットで、飼料を96ウェルの解析トレーに分注した。
幼虫を1ウェルあたり1匹ずつ飼育し、アイロン（Oliver Products、ミシガン
州）で加熱処理することによってロウ状接着剤による被覆で密封した。生物検定
物を26〜28℃に維持し、7日後にデータを収集した。
実施例８-植物への毒素遺伝子の挿入
本発明の一つの局面は、本発明に係る殺虫性毒素をコードする遺伝子で、植物
を形質転換することである。形質転換された植物は、標的有害生物による攻撃に
対して抵抗性をもつ。
本明細書において開示されているように、当技術分野において周知なさまざま
な技術を用いて、植物細胞の中に、農薬性毒素をコードする遺伝子を挿入するこ
とができる。例えば、大腸菌の中での複製システム、および形質転換された細胞
の選抜を行うことができるマーカーを含む、多数のクローニングベクターを、高
等植物の中に外来遺伝子を挿入するために利用することができる。このベクター
には、例えば、pBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC184などがある。し
たがって、適当な制限酵素部位に、B.t.毒素をコードする配列を挿入することが
できる。この結果できたプラスミドを、大腸菌の中に形質転換するのに用いるこ
とができる。適当な栄養培地の中で大腸菌を培養してから、集菌し、溶菌する。
プラスミドが回収される。配列解析、制限酵素解析、電気泳動、および、その他
の生化学-分子生物学的方法が、解析方法として、一般的に行われる。各操作の
後
、用いたDNA配列を切断して、隣のDNA配列と結合させることができる。各プラス
ミドの配列は、同一の、または別のプラスミドの中にクローニングすることがで
きる。所期の遺伝子を植物の中に挿入する方法によっては、この他のDNA配列が
必要とされよう。例えば、TiまたはRiプラスミドを、植物細胞の形質転換に用い
るときには、少なくとも、TiまたはRiプラスミドT-DNAの右側の境界配列が、多
くの場合には左右の境界配列が、挿入される遺伝子の隣接領域として結合されて
いなければならない。
T-DNAを植物細胞の形質転換に用いることは、欧州特許第120 516号；Hoekema
（1985）バイナリ植物ベクターシステム、Offset-durkkerij Kanters B.V.，Alb
lasserdam，第５章；Fraleyら、Crit．Rev．Plant Sci．4:1〜46;および油ら、
（1985）EMBO J．4:277〜287において盛んに研究され、充分に説明されてきた。
挿入されたDNAは、一旦ゲノムの中に組み込まれれば、比較的安定してそこに
存在するようになり、原則としては、再び飛び出してはこない。これは、通常、
形質転換された植物に、とりわけ、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイ
グロマイシン、またはクロラムフェニコールなどの殺生物剤、または抗生物質に
対する抵抗性を付与する選抜用マーカーをもっている。したがって、個別に用い
られるマーカーは、挿入DNAを含んでいない細胞を選抜するのではなく、形質転
換された細胞を選抜させるものでなければならない。
植物宿主細胞の中にDNAを挿入するために利用できる技術は数多くある。これ
らの技術には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefa
ciens）、またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes
）を形質転換因子として用いた、T-DNAによる形質転換、融合、インジェクショ
ン、バイオリスティクス（マイクロパーティクルガン）、またはエレクトロポレ
ーション、およびその他の可能な方法が含まれる。形質転換にアグロバクテリウ
ムを用いるときには、特別のプラスミド、すなわち、中間ベクター、またはバイ
ナリーベクターのいずれかに、挿入すべきDNAをクローニングしなければならな
い。中間ベクターは、T-DNAの中の配列に相同的な配列による相同的組換えによ
って、TiまたはRiプラスミドを組み込むことができる。また、TiまたはRiプラス
ミドは、T-DNAの移行に必要なvir領域を含んでいる。中間ベクターは、アグロバ
クテリウム
の中で複製することはできない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドという手
段（接合）によって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium
tumefaciens）の中に移行することができる。バイナリーベクターは、大脳菌の
中でも、アグロバクテリウムの中でも複製することができる。それらは、選抜用
マーカーと、両端がT-DNAの左右の境界配列になっているリンカー、ないしはポ
リリンカーを含んでいる。これらは、直接、アグロバクテリウムの中に形質転換
させることができる（ホルスターズ（Holsters）ら、［1978］Mol．Gen．Genet
．163:181〜187）。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウムは、vir領域
をもつプラスミドを含んでいなければならない。T-DNAが植物細胞の中に移行す
るためには、このvir領域が必要である。さらに余計なT-DNAが含まれていてもよ
い。このようにして形質転換された細菌を、植物細胞の形質転換に用いる。DNA
を植物細胞の中に導入するために、植物の外植片を、都合よく、アグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、またはアグロバクテ
リウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）と一緒に培養することができ
る。そして、感染した植物材料（例えば、葉片、茎の分節、分裂組織、根、また
、プロトプラスト、または懸濁培養細胞）から、選抜のための抗生物質、または
殺生物剤を含む適当な培地の中で、全植物体を再生させることができる。そして
、このようにして得られた植物体に、挿入されたDNAが存在することを調べるこ
とができる。インジェクションとエレクトロポレーションの場合には、プラスミ
ドに対して、特別に要求されるものはない。例えば、pUCから派生したプラスミ
ドのような通常のプラスミドを用いることも可能である。バイオリスティクス形
質転換において、プラスミドDNAまたは直鎖状DNAが用いられる。
形質転換された細胞は、普通のようにして、形態学的に正常な植物へと再生さ
れる。形質転換事象に胚細胞系が含まれる場合には、挿入されたDNAおよび対応
する表現形質は後代植物へと伝播される。このような植物を、普通の正常に成長
させ、同一の形質転換された遺伝的因子、または、その他の遺伝的因子をもつ植
物と交配させることができる。この結果できた雑種個体は、それに対応する表現
形質をもっている。
本発明の好ましい態様において、植物体は、コドン使用が植物用に最適化され
ている遺伝子によって形質転換されている。例えば、米国特許第5,380,831号を
参照のこと。また、都合の良いことに、欠失した毒素をコードする植物が用いら
れる。欠失した毒素は、一般的に、毒素の全長の約50％から約80％をコードして
いる。植物で用いるために合成B.t.遺伝子を作出するための方法は、当技術分野
において既知である。
本明細書に引用されている全ての米国特許は、参照として本明細書に組み入れ
られる。
本明細書において説明されている実施例および態様は、例示目的のためにすぎ
ず、この見地から、当業者にはさまざまな修正や変更が示唆され、それらは本出
願の意図するところと範囲に含まれ、添付の請求の範囲に含まれる。