ES2335722T3 - Toxinas pesticidas y genes procedentes de cepas de bacillus laterosporus. - Google Patents
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Abstract
Una toxina aislada que es activa contra una plaga del gusano de las raíces del maíz, que comprende una secuencia de aminoácido que tiene más del 90% de identidad con la ID SEC Nº 7 o la ID SEC Nº 9.
Description
Toxinas pesticidas y genes procedentes de cepas
de Bacillus laterosporus.
Los insectos y otras plagas cuestan anualmente a
los agricultores miles de millones de dólares en pérdidas de
cosecha y en el gasto de mantener estas plagas bajo control. Las
pérdidas causadas por las plagas de insectos en entornos de
producción agrícola incluyen el descenso en la producción agrícola,
una reducción en la calidad de la cosecha y un aumento de los
costos de la cosecha.
El gusano de las raíces del maíz (una plaga de
un insecto coleóptero) es una plaga importante de los cultivos.
Todos los años se producen muchos daños en la cosecha de maíz de los
Estados Unidos porque las larvas del gusano de las raíces del maíz
(Diabrotica spp.) se comen las raíces. Se ha calculado que
aproximadamente 3.764.000 hectáreas del maíz de EE. UU. están
infestadas con un complejo de especies de gusanos de las raíces del
maíz. El complejo de especies del gusano de las raíces del maíz
incluye el gusano de las raíces del maíz occidental (Diabrotica
virgifera virgifera), el gusano de las raíces del maíz
septentrional (Diabrotica barberi) y el gusano de las raíces
del maíz meridional (Diabrotica undecimpunctata howardi).
El ciclo vital de cada una de las especies de
Diabrotica es similar. Los huevos del gusano de las raíces
del maíz se depositan en el suelo. Las larvas recién eclosionadas
(el primer estado larvario) permanecen en el suelo y se alimentan
de las raíces ramificadas más pequeñas del maíz. Los estados
larvarios posteriores de los gusanos de las raíces del maíz
occidentales y septentrionales invaden los tejidos internos de la
raíz que transportan el agua y los elementos minerales a las
plantas. En la mayor parte de los casos, las larvas migran para
alimentarse de las nuevas raíces emergentes. La tunelización hacia
el interior de las raíces por parte de las larvas da por resultado
daños que pueden ser observados como cicatrices marrones alargadas
en la superficie de la raíz, tunelización dentro de las raíces o
grados variados de poda. Las plantas con las raíces podadas
normalmente se desprenden después de tormentas acompañadas por
fuertes precipitaciones y vientos intensos. Las larvas del gusano
de las raíces del maíz meridional se alimentan de raíces, de forma
similar a las larvas de las raíces del maíz occidental y
septentrional. Las larvas del gusano de las raíces del maíz
meridional también pueden alimentarse del punto de crecimiento del
tallo mientras permanezca cerca de la línea del suelo, lo que puede
provocar que la planta se marchite y muera.
Tras alimentarse durante aproximadamente 3
semanas, las larvas del gusano de las raíces del maíz abandonan las
raíces y se transforman en crisálidas en el suelo. Los escarabajos
adultos emergen del suelo y pueden alimentarse de polen de maíz y
de muchos otros tipos de polen, al igual que de barbas del maíz. La
alimentación a base de barbas verdes puede reducir el nivel de
polinización, lo que resulta en una deficiente conformación del
grano y en una mala cosecha. El gusano de las raíces del maíz
occidental adulto también se alimenta de las hojas del maíz, lo que
ralentiza el crecimiento de la planta y, en raras ocasiones, mata
plantas de algunas variedades de maíz.
Las larvas de estas especies de
Diabrotica que viven en el suelo se alimentan de la raíz de
la planta de maíz, causando encamado. El encamado acaba reduciendo
la producción de maíz y resulta a menudo en la muerte de la planta.
Al alimentarse de las barbas del maíz, los escarabajos adultos
reducen la polinización y, por lo tanto, perjudican la producción
de maíz de cada planta. Además, los adultos y las larvas del género
Diabrotica atacan las cosechas de cucurbitáceas (pepinos,
melones, calabazas, etc.) y de muchos verduras y de cultivos
extensivos de producción industrial, al igual que los que existen
en huertas domésticas.
Se ha calculado que el coste anual de
insecticidas para controlar el gusano de las raíces del maíz y de
las pérdidas anuales en cosecha causadas por los daños producidos
por el gusano de las raíces del maíz supera un total de mil
millones de dólares cada año en los Estados Unidos (Meycalf, R.L.
[1986] en Methods for the Study of Pest Diabrotica, Drysan, J.L. y
T.A. Miller [Eds.], Springer-Verlag, Nueva York, NY,
pp. vii-xv). Anualmente se aplican insecticidas por
un valor aproximado de 250 millones de dólares en los Estados Unidos
para controlar los gusanos de las raíces del maíz. En los estados
centrales de Estados Unidos, se aplicaron 60 millones y 40 millones
de dólares en Iowa y Nebraska, respectivamente, en 1990. Aun con el
uso de insecticida, los gusanos de las raíces del maíz causan unas
pérdidas en cosechas por valor aproximado de 750 millones de
dólares cada año, lo que hace de ellos la plaga de insectos más
grave del maíz en los estados centrales de Estados Unidos.
El control del gusano de las raíces del maíz ha
sido parcialmente abordado con procedimientos de cultivo como la
rotación de cultivos y la aplicación de niveles elevados de
nitrógeno para estimular el desarrollo de un sistema de raíces
adventicias. Sin embargo, se depende fundamentalmente de los
insecticidas químicos para garantizar el grado de control deseado.
Los insecticidas se extienden en capas sobre el suelo o bien se
incorporan al mismo. Las exigencias económicas de la utilización
del suelo rústico restringen el uso de la rotación de cultivos.
Además, una tendencia emergente a una diapausa (o hibernación) en
los gusanos de las raíces del maíz septentrionales está trastocando
las rotaciones de cultivos en algunas zonas.
El uso de insecticidas para controlar el gusano
de las raíces del maíz tiene también varios inconvenientes. El uso
continuo de insecticidas ha permitido que evolucionen insectos
resistentes. Situaciones como poblaciones sumamente numerosas de
larvas, lluvias fuertes y una indebida calibración de los equipos de
aplicación del insecticida pueden resultar en un control
deficiente. El uso de insecticida suscita a menudo inquietudes
medioambientales como la contaminación del suelo y de los
suministros hídricos, tanto los superficiales como los subterráneos.
El público ha llegado a preocuparse también por la cantidad de
productos químicos residuales que podría hallarse en los alimentos.
El trabajo con insecticidas también puede plantear riesgos para las
personas que los aplican. Por lo tanto, los pesticidas químicos
sintéticos están siendo objeto creciente de escrutinio, y así debe
ser, por sus consecuencias medioambientales potencialmente tóxicas.
Ejemplos de pesticidas químicos sintéticos de uso generalizado
incluyen los organoclorados, por ejemplo DDT, mirex, kepona,
lindano, aldrina, clordrano, aldicarb y dieldrina; los
organofosfatados, por ejemplo clorpirifós, paratión, malatión y
diazinón; y los carbamatos. Nuevas restricciones estrictas al uso
de pesticidas y la eliminación del mercado de algunos pesticidas
efectivos podrían limitar las opciones económicas y efectivas para
controlar las pagas costosas.
Debido a los problemas asociados con el uso de
pesticidas químicos sintéticos orgánicos, existe una clara
necesidad de limitar el uso de estos agentes y una necesidad de
identificar agentes de control alternativos. La sustitución de los
pesticidas químicos sintéticos o la combinación de estos agentes con
pesticidas biológicos podrían reducir los niveles de productos
químicos tóxicos en el entorno.
Un agente pesticida biológico que goza de
popularidad creciente es el microbio, hallado en el suelo,
Bacillus thuringiensis (B.t.). El microbio del suelo
Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria grampositiva
formadora de esporas. La mayoría de las cepas de B.t. no
presentan actividad pesticida. Algunas cepas de B.t. producen
y pueden ser caracterizadas por inclusiones proteínicas cristalinas
parasporales. Estas "endotoxinas 6", que tienen típicamente
actividad pesticida específica, son diferentes de las exotoxinas,
que tienen un abanico de huéspedes no específico. Estas inclusiones
aparecen a menudo microscópicamente como cristales con forma
distintiva. Las proteínas pueden ser sumamente tóxicas para las
plagas y específicas en su actividad tóxica. Ciertos genes de la
toxina del B.t. han sido aislados y secuenciados. La
clonación y la expresión de un gen de la proteína cristalina del
B.t. en Escherichia coli fueron descritas en la
bibliografía publicada hace más de 15 años (Schnepf, H.E., H.R.
Whiteley [1981] Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:2893-2897). Además, con el uso de técnicas de
ingeniería genética, se están desarrollando nuevos enfoques a la
administración de toxinas de B.t. a entornos agrícolas,
incluyendo el uso de plantas modificadas mediante ingeniería
genética con genes de la toxina del B.t. para casos de
resistencia de los insectos y el uso de células microbianas intactas
estabilizadas como vehículos de distribución de la toxina del
B.t. (Gaertner, F.H., L. Kim [1988] TIBTECH
6:S4-S7). Así, los genes aislados de la endotoxina
del B.t. están llegando a ser comercialmente valiosas.
Hasta los últimos quince años, el uso comercial
de los pesticidas a base del B.t. ha estado restringido
fundamentalmente a un estrecho abanico de plagas de lepidópteros
(orugas). Durante muchos años se han usado preparados de las
esporas y los cristales de la subespecie kurstaki del B.
thuringiensis como insecticidas comerciales para las plagas de
lepidópteros. Por ejemplo, la variedad kurstaki
HD-1 del B. thuringiensis produce una
endotoxina d cristalina que es tóxica para las larvas de varios
insectos lepidópteros.
Sin embargo, en años recientes los
investigadores han descubierto pesticidas a base de B.t. con
especificidades para un abanico de plagas mucho más amplio. Por
ejemplo, se han usado comercialmente otras especies del B.t.,
concretamente la israelensis y la morrisoni
(denominada también tenebrionis y B.t.
M-27), para controlar insectos de los órdenes
Díptera y Coleoptera, respectivamente (Gaertner, F.H. [1989]
"Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and
Non-Living Microorganisms", en Controlled
Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins, ed., Taylor y
Francis, Nueva York y Londres, 1990, pp. 245-255).
Véanse también Couch, T.L. (1980) "Mosquito Pathogenicity of
Bacillus thuringiensis var. israelensis", Developments en
Industrial Microbiology 22:61-76; y Beegle, C.C.
(1978) "Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems",
Developments in Industrial Microbiology 20:97-104.
Krieg, A., A.M. Huger, G.A. Langenbruch, W. Schnetter (1983) Z. ang.
Ent. 96:500-508 describen la variedad
tenebrionis del Bacillus thuringiensis, de la que se
ha informado que es activa contra dos escarabajos del orden
Coleoptera. Se trata del escarabajo de la patata de Colorado,
Leptinotarsa decemlineata, y de Agelastica alni.
Recientemente, han sido identificadas nuevas
subespecies del B.t., y han sido aislados los genes
responsables de las proteínas de las endotoxinas d activas (Höfte,
H., H.R. Whiteley [1989] Microbiological Reviews
52(2):242-255). Höfte y Whiteley
clasificaron los genes de la proteína cristalina en cuatro clases
fundamentales. Las clases eran Cryl (específica de los
lepidópteros), CryII (específica para los lepidópteros y los
dípteros), CryIII (específica para los coleópteros) y CryIV
(específica para los dípteros). Se han presentado informes del
descubrimiento de cepas específicamente tóxicas a otras plagas
(Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim [1992] BiolTechnology
10:271-275). Se ha propuesto la clase CryV para
designar una clase de genes de toxinas que son específicas para los
nematodos. Lambert et al. (Lambert, B., L. Buysse, C.
Decock, S. Jansens, C. Piens, B. Saey, J. Seurinck, K. van
Audenhove, J. Van Rie, A. Van Vliet, M. Peferoen [1996] Appl.
Environ. Microbiol 62(1):80-86) y Shevelev
et al. ([1993] FEBS Lett. 336:79-82)
describen la caracterización de toxinas Cry9 activas contra los
lepidópteros. Las solicitudes publicadas de PCT WO 94/05771 y WO
94/24264 también describen aislados de B.t. activos contra
plagas de lepidópteros. Gleave et al. ([1991] JGM
138:55-62) y Smulevitch et al. ([1991] FEBS
Lett. 293:25-26) también describen toxinas de
B.t. Ahora se han identificado varias clases más de genes de
B.t.
La nomenclatura y el esquema de clasificación de
1989 de Höfte y Whiteley para las proteínas cristalinas se basaban
tanto en la secuencia deducida de aminoácidos como en el abanico de
huéspedes de la toxina. Ese sistema estaba adaptado para abarcar 14
tipos diferentes de genes de toxina que se dividieron en cinco
grandes clases. El número de genes de proteínas cristalinas de
Bacillus thuringiensis secuenciadas en la actualidad supera
los 50. Se ha propuesto un esquema de nomenclatura revisada que se
basa únicamente en la identidad de los aminoácidos (Crickmore et
al. [1996] Society for Invertebrate Pathology, 29th Annual
Meeting, IlIrd International Colloquium on Bacillus
thuringiensis, Universidad de Córdoba, Córdoba, España,
1-6 de septiembre de 1996, resumen). Se ha
mantenido el "cry" mnemotécnico para todos los genes de
toxinas, salvo cytA y cytB, que permanecen como clase aparte. Los
números romanos han sido sustituidos con números arábigos en el
rango primario, y se han eliminado los paréntesis del rango
terciario. Se han retenido muchos de los nombres originales, con las
excepciones señaladas, aunque varios han sido reclasificados.
Véanse también "Revisions of the Nomenclature for the Bacillus
thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore,
D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J.
Baum, y D.H. Dean, Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998)
Vol. 62:807-813; y Crickmore, Zeigler, Feitelson,
Schnepf, Van Rie, Lereclus, Baum, y Dean, "Bacillus
thuringiensis toxin nomenclature" (1999)
http://www.biols.susx.ac.uk/Home/NeilCrickmore/Bt/index.html. Ese
sistema usa las aplicaciones informáticas disponibles gratuitamente
CLUSTAL W y PHYLIP. La aplicación NEIGHBOR dentro del paquete
PHYLIP usa un algoritmo de medias aritméticas (UPGMA).
Como consecuencia de la amplia investigación y
de la inversión de recursos, han surgido otras patentes para los
nuevos aislados de B.t. y los nuevos usos de los aislados de
B.t. Para una reseña, véase Feitelson et al.,
supra. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos aislados de
B.t. y de nuevos usos de los aislados de B.t sigue
siendo una técnica empírica imprevisible.
Favret y Yousten ([1985] J. Invert. Path.
45:195-203) sometieron a ensayo la actividad
insecticida de cepas del Bacillus laterosporus, pero
llegaron a la conclusión de que los reducidos niveles de toxicidad
demostrada por esas cepas indican que esas cepas no eran candidatos
potenciales para convertirse en agentes de biocontrol. Montaldi y
Roth (172 J. Bac. 4; April 1990; pp.2168-2171)
llevaron a cabo un examen de microscopía electrónica de cuerpos
parasporales de Bacillus laterosporus sporangia. Bone et
al. (patente estadounidense Nº 5.045.314) informan de que las
esporas de cepas seleccionadas del B. laterosporus inhiben la
eclosión de los huevos y/o el desarrollo larvario de un nematodo
parásito de animales. Aronson et al. (patente estadounidense
Nº 5.055.293) describen un Bacillus laterosporus formador de
esporas designado como P5 (ATCC 53694). El Bacillus
laterosporus NRS-590 es usado en ese documento
como control negativo. Aronson et al. Postulan que el
B.l. P5 puede o bien invadir larvas muy jóvenes del gusano
de las raíces del maíz para dañarlas de forma inmediata o posterior
o bloquear la recepción o respuesta del gusano de las raíces a la
señal de las raíces del maíz que lo dirige a las raíces. Los
documentos WO 94/21795 y WO 96/10083 describen toxinas que son
supuestamente activas contra ciertas plagas. El documento WO
98/18932 describe muchas nuevas clases de toxinas microbianas que
son activas contra diversos tipos de insectos. En ese mismo
documento se dan a conocer también sondas y cebadores diversos.
Orlova et al. (64 Appl. Env. Micro. 7, julio de 1998, pp.
2723-2725) informan que las inclusiones cristalinas
de ciertas cepas de Bacillus laterosporus podrían usarse
potencialmente como candidatas al control de mosquitos.
Los obstáculos al uso agrícola fructífero de las
toxinas de B.t. incluyen el desarrollo de resistencia a las
toxinas de B.t. por parte de los insectos. Además, ciertos
insectos pueden ser inmunes a los efectos del B.t. Estos
incluyen insectos como el gorgojo del algodón y la oruga podadora
negra, al igual que insectos adultos de la mayoría de las especies
que, hasta la fecha, no han demostrado ninguna sensibilidad
significativa evidencia a las endotoxinas d del B.t. Aunque
han cobrado gran interés las estrategias de gestión de la
resistencia en la agrotecnología transgénica del B.t.,
subsiste una gran necesidad de desarrollar genes que puedan ser
expresados con éxito a niveles adecuados en plantas de una manera
que resulte en el control efectivo de diversos insectos.
La presente invención versa acerca de materiales
y procedimientos útiles en el control de plagas no mamíferas y, en
particular, de plagas de plantas. En una realización, la presente
invención proporciona toxinas pesticidas novedosas y genes que
codifican toxinas que son obtenibles a partir de aislados del
Bacillus laterosporus. En una realización preferida, las
plagas diana son plagas del gusano de las raíces del maíz. Las
toxinas de la presente invención incluyen toxinas solubles
termolábiles que pueden ser obtenidas del sobrenadante de cultivos
de las presentes cepas de Bacillus laterosporus. Las toxinas
de la presente invención incluyen también toxinas termolábiles
menores obtenibles a partir de estas cepas.
La presente invención proporciona además
secuencias de nucleótidos que codifican las toxinas de la presente
invención. Las secuencias de nucleótidos de la presente invención
codifican toxinas que son distintas de las toxinas descritas
anteriormente. Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden usarse también en la identificación y
caracterización de genes que codifican las toxinas pesticidas.
En una realización de la presente invención, los
aislados del presente bacilo pueden ser cultivados en condiciones
que resultan en la multiplicación elevada del microbio. Tras tratar
los microbios para que proporcionen ácido nucleico genómico
monocatenario, el ADN es caracterizado usando secuencias de
nucleótidos conforme a la presente invención. Los fragmentos
característicos de los genes que codifican las toxinas se amplifican
por el procedimiento, identificando así la presencia del gen o
genes que codifican las toxinas.
En una realización preferida, la presente
invención versa acerca de plantas y de células vegetales
transformadas para producir al menos una de las toxinas pesticidas
de la presente invención, de tal modo que las células vegetales
transformadas expresen toxinas pesticidas en tejidos consumidos por
las plagas diana. Además, pueden usarse mezclas y/o combinaciones
de toxinas conforme a la presente invención.
La transformación de plantas con los constructos
genéticos dados a conocer en el presente documento puede ser
lograda usando técnicas bien conocidas a las personas versadas en la
técnica y típicamente conllevaría la modificación del gen para
optimizar la expresión de la toxina en las plantas.
\vskip1.000000\baselineskip
La ID SEC Nº 1 es una sonda MIS.
La ID SEC Nº 2 es una sonda WAR.
La ID SEC Nº 3 es un cebador MIS directo.
La ID SEC Nº 4 es un cebador MIS inverso.
La ID SEC Nº 5 es una secuencia de nucleótidos
procedente del gen de la toxina MIS de la cepa MB438 del
B.l.
La ID SEC Nº 6 es la secuencia de nucleótidos
del gen de la toxina MIS de la cepa MB438 del B.l.
La ID SEC Nº 7 es la secuencia de polipéptidos
de la toxina MIS de la cepa MB438 del B.l.
La ID SEC Nº 8 es la secuencia de nucleótidos
del gen de la toxina WAR de la cepa MB438 del B.l.
La ID SEC Nº 9 es la secuencia de polipéptidos
de la toxina WAR de la cepa MB438 del B.l.
La ID SEC Nº 10 es una secuencia de nucleótidos
procedente del gen de la toxina MIS de la cepa MB439 del
B.l.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención versa acerca de materiales
y procedimientos útiles en el control de de plagas no mamíferas y,
en particular, de plagas de plantas. En una realización, la presente
invención proporciona toxinas pesticidas novedosas y genes que
codifican toxinas que son obtenibles a partir de aislados del
Bacillus laterosporus (B.l.). En una realización preferida,
las plagas diana son plagas del gusano de las raíces del maíz. Las
toxinas de la presente invención incluyen toxinas solubles
termolábiles que pueden ser obtenidas del sobrenadante de cultivos
de las presentes cepas de Bacillus laterosporus. Las toxinas
de tipo MIS y WAR obtenibles a partir de estas cepas son descritas
con detalle más abajo. Las toxinas de la presente invención
incluyen también toxinas termolábiles menores obtenibles a partir de
estas
cepas.
cepas.
La presente invención proporciona además
secuencias de nucleótidos que codifican las toxinas de la presente
invención. Las secuencias de nucleótidos de la presente invención
codifican toxinas que son distintas de las toxinas descritas
anteriormente. Otras secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden usarse también en procedimientos diagnósticos y
analíticos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las
sondas, los cebadores y las secuencias parciales pueden usarse para
identificar y caracterizar genes que codifican las toxinas
pesticidas.
En una realización de la presente invención, los
aislados del presente bacilo pueden ser cultivados en condiciones
que resultan en la multiplicación elevada del microbio. Tras tratar
los microbios para que proporcionen ácido nucleico genómico
monocatenario, el ADN es caracterizado usando secuencias de
nucleótidos conforme a la presente invención. Los fragmentos
característicos de los genes que codifican las toxinas se amplifican
por el procedimiento, identificando así la presencia del gen o
genes que codifican las toxinas.
En una realización preferida, la presente
invención versa acerca de células vegetales transformadas para
producir al menos una de las toxinas pesticidas de la presente
invención, de tal modo que las células vegetales transformadas
expresen toxinas pesticidas en tejidos consumidos por las plagas
diana. Además, pueden usarse mezclas y/o combinaciones de toxinas
conforme a la presente invención. En algunas realizaciones
preferidas, se usan conjuntamente una toxina MIS y una toxina
WAR.
La transformación de plantas con los constructos
genéticos dados a conocer en el presente documento puede ser
lograda usando técnicas bien conocidas a las personas versadas en la
técnica y típicamente conllevaría la modificación del gen para
optimizar la expresión de la toxina en las plantas.
\newpage
Los aislados útiles conforme a la presente
invención han sido depositados en la colección permanente de
Colección de Cultivos de Patentes del Servicio de Investigación
Agrícola (NRRL), Centro de Investigación Regional del Norte, North
University Street, Peoria, Illinois 61604, EE. UU. Los números del
repositorio de cultivos son los siguientes:
Esta memoria describe cebadores y sondas de
nucleótidos para aislar, caracterizar e identificar genes del
bacilo que codifican toxinas proteínicas que son activas contra
plagas no mamíferas. Las secuencias de nucleótidos descritas en el
presente documento también pueden ser usadas para identificar nuevos
aislados de bacilo pesticidas. La invención versa además acerca de
genes, aislados y toxinas identificados usando los procedimientos y
los materiales dados a conocer en el presente documento.
En una realización preferida, las toxinas de
tipo MIS de la presente invención tienen un peso molecular de entre
aproximadamente 70 y 100 kDa y lo más preferible es que las toxinas
tengan un tamaño de aproximadamente 80 kDa. Típicamente, estas
toxinas son solubles y pueden ser obtenidas del sobrenadante de los
cultivos de bacilo tal como se describe en el presente documento.
Estas toxinas tienen toxicidad contra plagas no mamíferas. En una
realización preferida, estas toxinas tienen actividad contra el
gusano de las raíces del maíz occidental. Las proteínas MIS son
además útiles gracias a su capacidad para formar poros en las
células. Estas proteínas pueden ser usadas con segundas entidades
que incluyen, por ejemplo, otras proteínas. Cuando se usan con una
segunda entidad, la proteína MIS facilita la entrada del segundo
agente en una célula diana. En una realización preferida, la
proteína MIS interactúa con los receptores NITS de una célula diana
y causa la formación de poros en la célula diana. La segunda
entidad puede ser una toxina u otra molécula cuya entrada en la
célula se desee.
La presente invención versa además acerca de
toxinas de tipo WAR que tienen un tamaño de aproximadamente
30-50 kDa y lo más normal es que tengan un tamaño
de aproximadamente 40 kDa. Típicamente, estas toxinas son solubles
y pueden ser obtenidas del sobrenadante de cultivos del bacilo según
se describe en el presente documento.
Las toxinas de tipo MIS y WAR de la presente
invención pueden ser identificadas con los cebadores descritos en
el presente documento.
Con las enseñanzas proporcionadas en el presente
documento, una persona versada en la técnica podría producir y usar
fácilmente las diversas toxinas y secuencias polinucleótidas
descritas en el presente documento.
Genes y toxinas. Tal como se usan en el
presente documento, las expresiones "toxina de tipo natural" y
"gen de tipo natural" se refieren a los genes y las toxinas
producidas de forma natural por los presentes aislados (MB438 y
MB439). Los genes y las toxinas de la presente invención incluyen no
solo las secuencias de longitud completa y tipo natural, sino
también fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes y
proteínas de fusión que retienen la actividad pesticida
característica de las toxinas ejemplificadas específicamente en el
presente documento. Por ejemplo, la patente estadounidense Nº
5.605.793 describe procedimientos para generar diversidad molecular
adicional usando reensamblaje de ADN tras una fragmentación
aleatoria. Además, pueden hacerse supresiones internas a los genes
y las toxinas específicamente ejemplificados en el presente
documento con la condición de que las toxinas modificadas retengan
una actividad pesticida. Los genes y las toxinas quiméricos,
producidos combinando porciones de más de una toxina o un gen del
bacilo, pueden también utilizarse conforme a las enseñanzas de la
presente invención. Tal como se usan en el presente documento, los
términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren
a las secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o
que codifican toxinas equivalentes dotadas de actividad pesticida.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "toxinas
equivalentes" se refiere a toxinas dotadas de la misma actividad
biológica, o esencialmente la misma, contra las plagas diana que
las toxinas ejemplificadas.
Resulta evidente a una persona versada en esta
técnica que los genes que codifican toxinas activas pueden ser
identificados y obtenidos mediante varios medios. Los genes
específicos ejemplificados en el presente documento pueden ser
obtenidos a partir de aislados depositados en un repositorio de
cultivos, tal como se ha descrito anteriormente. Estos genes, o
porciones o variantes de los mismos, pueden también ser construidos
sintéticamente, por ejemplo mediante el uso de un sintetizador de
genes. Pueden construirse con facilidad variaciones de genes usando
técnicas estándar para hacer mutaciones puntuales. Además, los
fragmentos de estos genes pueden fabricarse usando exonucleasas o
endonucleasas disponibles comercialmente conforme a procedimientos
estándar. Por ejemplo, pueden usarse enzimas como la Bal31 o
mutagénesis dirigida al sitio para cortar sistemáticamente
nucleótidos de los extremos de estos genes. Además, los genes que
codifican fragmentos activos pueden ser obtenidos usando una
variedad de enzimas de restricción. Pueden usarse proteasas para
obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas.
Toxinas equivalentes y/o genes que codifican
estas toxinas equivalentes pueden derivarse de aislados del bacilo
y/o de bibliotecas de ADN usando las enseñanzas proporcionadas en el
presente documento. Hay varios procedimientos para obtener las
toxinas pesticidas de la presente invención. Por ejemplo, pueden
usarse anticuerpos a las toxinas pesticidas reveladas y
reivindicadas en el presente documento para identificar y aislar
toxinas de una mezcla de proteínas. Específicamente, pueden
cultivarse anticuerpos a las porciones de las toxinas que son más
constantes y más diferenciadas de otras toxinas del bacilo. Estos
anticuerpos pueden ser usados para identificar específicamente
toxinas equivalentes con la actividad característica mediante
inmunoprecipitación, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
(ELISA) o transferencia Western. Los anticuerpos a las toxinas
dadas a conocer en el presente documento, o a toxinas equivalentes,
pueden ser preparados fácilmente usando procedimientos estándar de
esta técnica. Los genes que codifican estas toxinas pueden entonces
ser obtenidos a partir del microorganismo.
Los fragmentos y los equivalentes que retengan
la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas están dentro
del ámbito de la presente invención. Además, debido a la redundancia
del código genético, una variedad de secuencias diferentes de ADN
puede codificar las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en el
presente documento. Está perfectamente dentro de la capacidad de
una persona formada en la técnica crear estas secuencias
alternativas de ADN que codifican las mismas toxinas, o
esencialmente las mismas. Estas secuencias variantes de ADN están
dentro del ámbito de la presente invención. Tal como se usa en el
presente documento, la referencia a "esencialmente la misma"
secuencia se refiere a secuencias que tienen sustituciones,
eliminaciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no
afectan materialmente la actividad pesticida. Los fragmentos que
retienen la actividad pesticida están también incluidos en esta
definición.
Un procedimiento adicional para identificar las
toxinas y los genes de la presente invención es mediante el uso de
sondas oligonucleótidas. Estas sondas son secuencias nucleótidas
detectables. Las sondas proporcionan un procedimiento rápido para
identificar genes de la presente invención que codifican toxinas.
Los segmentos nucleótidos que se usan como sondas conforme a la
invención pueden ser sintetizados usando un sintetizador de ADN y
procedimientos estándar.
Ciertas toxinas de la presente invención han
sido específicamente ejemplificadas en el presente documento. Dado
que estas toxinas son meramente ejemplares de las toxinas de la
presente invención, debería ser inmediatamente evidente que la
presente invención comprende toxinas variantes o equivalentes (y
secuencias de nucleótidos que codifican las toxinas equivalentes)
dotadas de la misma actividad pesticida, o similar, que la toxina
ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán una identidad de
aminoácidos mayor del 90%, y puede ser mayor del 95%. Estas
identidades son según se determina usando técnicas estándar de
alineamiento, preferentemente las usadas por Crickmore et
al., tal como se presenta en la sección de Antecedentes de la
presente Memoria. La homología de aminoácidos será mayor en las
regiones críticas de la toxina que explican la actividad biológica
o están implicadas en la determinación de la configuración
tridimensional que, en último término, es responsable de la
actividad biológica. En este sentido, son aceptables y cabe esperar
ciertas sustituciones de aminoácidos si estas sustituciones están
en regiones que no son críticas para la actividad o son
sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afecten la
configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los
aminoácidos pueden agruparse en las siguientes clases: apolares,
polares sin carga, básicos y ácidos. Las sustituciones
conservadoras con las que un aminoácido de una clase es sustituido
con otro aminoácido del mismo tipo caen dentro del ámbito de la
invención con la condición de que la sustitución no altere
materialmente la actividad biológica del compuesto. Enumerados
abajo en la Tabla 1 hay ejemplos de los aminoácidos que pertenecen a
cada clase.
En algunos casos, también pueden hacerse
sustituciones no conservadoras. El factor crítico es que estas
sustituciones no deben menoscabar significativamente la actividad
biológica de la toxina.
Tal como se usa en el presente documento, la
referencia a polinucleótidos "aislados" y/o a toxinas
"purificadas" se refiere a estas moléculas cuando no están
asociadas con las otras moléculas con las que se encontrarían en la
naturaleza. Así, la referencia a "aislado y purificado"
significa la implicación la "mano del hombre", tal como se
describe en el presente documento. Las toxinas y los genes
quiméricos también implican la "mano del hombre".
Huéspedes recombinantes. Los genes que codifican
toxinas de la presente invención pueden ser introducidos en una
amplia variedad de huéspedes microbianos o vegetales. La expresión
del gen de la toxina resulta, directa o indirectamente, en la
producción y el mantenimiento del pesticida. Se prefiere la
transformación de huéspedes vegetales. Las plagas que se alimentan
de la planta recombinante que expresa la toxina entrarán en contacto
con ello con la toxina. Con huéspedes microbianos adecuados, por
ejemplo pseudomonas, los microbios pueden ser aplicados al sitio de
la plaga, donde proliferarán y serán ingeridos. Con cualquiera de
los diversos enfoques, el resultado es el control de la plaga.
Alternativamente, el microbio que alberga el gen de la toxina puede
ser muerto y tratado bajo condiciones que prolonguen la actividad de
la toxina y estabilicen la célula. A continuación, la célula
tratada, que retiene la actividad tóxica, puede ser aplicada al
entorno de la plaga diana. La toxina del bacilo puede ser aplicada
también introduciendo un gen mediante un vector adecuado a un
huésped microbiano y aplicando a continuación el huésped al entorno
en un estado vivo.
Se dispone de una amplia variedad de formas para
introducir un gen de bacilo que codifica una toxina en un huésped
bajo condiciones que permiten el mantenimiento y la expresión
estables del gen. Estos procedimientos son bien conocidos para las
personas versadas en la técnica y están descritos, por ejemplo, en
la patente estadounidense Nº 5.135.867.
Los genes sintéticos que son funcionalmente
equivalentes a las toxinas de la presente invención pueden ser
usados también para transformar huéspedes. Los procedimientos para
la producción de genes sintéticos pueden encontrarse, por ejemplo,
en la patente estadounidense Nº 5.380.831. En realizaciones
preferidas, los genes de la presente invención están optimizados
para su expresión en plantas.
Tratamiento de las células. Tal como se
ha mencionado anteriormente, el bacilo o las células recombinantes
que expresan una toxina del bacilo pueden ser tratados para
prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la célula. La
microcápsula pesticida que se forma comprende la toxina del bacilo
dentro de una estructura celular que ha sido estabilizada y que
protegerá la toxina cuando la microcápsula se aplique al entorno de
la plaga diana. Las células huésped adecuadas pueden incluir ya sea
organismos procariotas o eucariotas. Como huéspedes, un interés
particular los procariotas y los eucariotas inferiores, como los
hongos. La célula estará normalmente intacta y estará
sustancialmente en forma proliferativa cuando esté tratada, no en
forma de espora.
El tratamiento de la célula microbiana, por
ejemplo un microbio que contenga el gen de la toxina del bacilo,
puede realizarse mediante medios químicos o físicos, o mediante una
combinación de medios químicos y/o físicos, con la condición de que
la técnica no afecte adversamente las propiedades de la toxina o
disminuya la capacidad celular de proteger a la toxina. Los
procedimientos para el tratamiento de las células microbianas se dan
a conocer en las patentes estadounidenses N^{os} 4.695.455 y
4.695.462.
Procedimientos y formulaciones para el
control de plagas. El control de plagas usando las toxinas y los
genes de la presente invención puede lograrse mediante una variedad
de procedimientos conocidos a las personas versadas en la técnica.
Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, la aplicación de
aislados del bacilo a las plagas (o a su ubicación), la aplicación
de microbios recombinantes a las plagas (o sus ubicaciones) y la
transformación de plantas con genes que codifican las toxinas
pesticidas de la presente invención. Las transformaciones pueden
ser realizadas por las personas versadas en la técnica usando
técnicas estándar. Los materiales necesarios para estas
transformaciones son dados a conocer en el presente documento o, si
no, son fácilmente asequibles al experto en la técnica.
Pueden aplicarse al suelo los gránulos
formulados de cebo que contienen un atrayente y las toxinas de los
aislados del bacilo, o microbios recombinantes que comprenden los
genes obtenidos de los aislados del bacilo dados a conocer en el
presente documento. El producto formulado puede ser aplicado también
como un revestimiento de semillas o como tratamiento de las raíces
o un tratamiento de la planta entera en fases posteriores del ciclo
de cultivo. Los tratamientos de plantas y suelo con células del
bacilo pueden emplearse como polvos, gránulos o polvo humectables,
mediante mezclas con diversos materiales inertes, como minerales
inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y
similares) o materiales botánicos (zuros, cascarillas de arroz,
cáscaras de nuez molidos y similares). Las formulaciones pueden
incluir adyuvantes esparcidores-engomadores,
agentes estabilizantes, otros aditivos pesticidas o tensioactivos.
Las formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa o no acuosas y
ser empleadas como espumas, geles, suspensiones, concentrados
emulsionables o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes
reológicos, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes o
polímeros.
Como apreciaría una persona versada en la
técnica, la concentración de pesticida variará ampliamente
dependiendo de la naturaleza de la formulación específica,
particularmente en si es un concentrado o si ha de usarse
directamente. El pesticida estará presenta en al menos un 1% en
peso, y puede ser el 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán
aproximadamente un 1-95% en peso del pesticida,
mientras que las formulaciones líquidas serán generalmente de
aproximadamente el 1-60% en peso de los sólidos de
la fase líquida. Las formulaciones que contienen células tendrán
generalmente entre aproximadamente 10^{2} y aproximadamente
10^{4} células/mg. Estas formulaciones serán administradas a
razón de aproximadamente 50 mg (líquidos o secos) hasta 1 kg o más
por hectárea.
Las formulaciones pueden ser aplicadas al
entorno de la plaga, por ejemplo el suelo y el follaje, mediante
rociadura, pulverización, aspersión o similar.
Sondas polinucleótidas. Es bien sabido
que el ADN posee una propiedad fundamental denominada
complementaridad de las bases. En la naturaleza, el ADN existe por
lo general en forma de pares de cadenas antiparalelas, proyectándose
las bases de cada hebra desde esa hebra hacia la hebra opuesta. La
base adenina (A) siempre estará enfrentada a la base timina (T) en
la otra hebra, y la base guanina (G) estará enfrentada a la base
citosina (C). Las bases se mantienen en aposición por su capacidad
de formar enlaces de hidrógeno de esta manera específica. Aunque
cada enlace individual es relativamente débil, el efecto neto de
muchas bases adyacentes con enlaces de hidrógeno, junto con los
efectos del apilamiento de bases, es una unión estable de las dos
cadenas complementarias. Estos enlaces pueden romperse mediante
tratamientos tales como un pH elevado o una alta temperatura, y
estas condiciones resultan en la disociación o la
"desnaturalización" de las dos cadenas. Si el ADN es puesto a
continuación en condiciones que hagan que el enlace de hidrógeno de
las bases sea termodinámicamente favorable, las cadenas de ADN se
aparearán o "hibridarán", y volverán a formar el ADN original
de doble hebra. Si se lleva a cabo en las condiciones apropiadas,
esta hibridación puede ser sumamente específica. Es decir, solamente
las hebreas con un grado elevado de complementaridad de las bases
podrán formar estructuras estables de doble hebra. La relación de
la especificidad de la hibridación con las condiciones de la
reacción es bien conocida. Así, la hibridación puede ser usada para
verificar si dos trozos de ADN son complementarios en las secuencias
de sus bases. Precisamente este mecanismo de hibridación facilita
el uso de las sondas de la presente invención para detectar y
caracterizar fácilmente las secuencias de ADN de interés.
Las sondas pueden ser ARN, ADN o APN (ácido
peptidonucleico). La sonda tendrá normalmente al menos
aproximadamente 10 bases, más habitualmente al menos
aproximadamente 17 bases, y puede tener hasta aproximadamente 100
bases o más. Pueden ser utilizadas fácilmente sondas mayores, y
tales sondas pueden ser, por ejemplo, de varias kilobases de
longitud. La secuencia de la sonda está diseñada para que sea al
menos sustancialmente complementaria de una porción de un gen que
codifica una toxina de interés. No es preciso que la sonda tenga una
complementaridad perfecta de la secuencia que hibrida. Las sondas
pueden ser marcadas utilizando técnicas que son bien conocidas para
las personas versadas en esta técnica.
Un enfoque para el uso de la presente invención
como sondas conlleva la identificación en primer lugar mediante
análisis de transferencia de Southern de un banco de genes del
aislado del bacilo de todos los segmentos homólogos de ADN con las
secuencias nucleótidas reveladas. Así, es posible, sin la ayuda del
análisis biológico, saber de antemano la actividad probable de
muchos aislados nuevos del bacilo, y de los productos de genes
individuales expresados por un aislado de bacilo dado. Tal análisis
de sondas proporciona un procedimiento rápido para identificar
genes de toxinas insecticidas potencialmente valiosos comercialmente
dentro de las múltiples subespecies del bacilo.
Un procedimiento de hibridación útil conforme a
la presente invención incluye típicamente los pasos iniciales de
aislar la muestra de ADN objeto de interés y purificarla
químicamente. Pueden usarse bacterias lisadas o bien el ácido
nucleico fraccionado total de bacterias. Las células pueden tratarse
usando técnicas conocidas para liberar su ADN (y/o ARN). La muestra
de ADN puede ser cortada en trozos con una enzima de restricción
apropiada. Los trozos pueden separarse por tamaño mediante
electroforesis en un gel, normalmente agarosa o acrilamida. Los
trozos de interés pueden ser transferidos a una membrana
inmovilizante.
La técnica particular de hibridación no es
esencial para la presente invención. Según se realicen mejoras en
las técnicas de hibridación, pueden ser aplicadas fácilmente.
La sonda y la muestra pueden entonces ser
combinadas en una solución tampón de hibridación y mantenerse a una
temperatura apropiada hasta que ocurra en apareamiento. A
continuación, la membrana es lavada para librarla de materiales
foráneos, típicamente dejando la muestra y las moléculas enlazadas a
la sonda detectadas y cuantificadas mediante autorradiografía y/o
conteo por escintilación de líquidos. Tal como se conoce en la
técnica, si la molécula sonda y la muestra del ácido nucleico se
hibridan formando un fuerte enlace no covalente entre las dos
moléculas, puede suponerse razonablemente que la sonda y la muestra
son esencialmente idénticas. La marca detectable de la sonda
proporciona un medio para determinar de manera conocida si ha
ocurrido hibridación.
En el uso de los segmentos nucleótidos como
sondas, la sonda particular se marca con cualquier marca adecuada
conocida a las personas expertas en la técnica, incluyendo marcas
radiactivas y no radiactivas. Las marcas radiactivas típicas
incluyen ^{32}P, ^{35}S o similares. Las marcas no radiactivas
incluyen, por ejemplo, ligantes como la biotina o la tiroxina, al
igual que enzimas como las hidrolasas o las peroxidasas, o los
diversos quimioluminiscentes, como la luciferina, o compuestos
fluorescentes como la fluoresceína y sus derivados. Las sondas
pueden hacerse inherentemente fluorescentes tal como se describe en
la Solicitud Internacional Nº WO 93/16094.
Pueden usarse diversos grados de rigurosidad de
hibridación. Cuanto más rigurosas sean las condiciones, mayor será
que complementaridad que se requiere para la formación bicatenaria.
La rigurosidad puede controlarse mediante la temperatura, la
concentración de la sonda, la longitud de la sonda, la fuerza iónica
y similares. Preferentemente, la hibridación se realiza con
condiciones de rigurosidad de moderadas a altas mediante técnicas
bien conocidas en la técnica, tales como las descritas, por ejemplo,
en Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press,
Nueva York, NY, pp. 169-170.
Tal como se usa aquí, condiciones de
"rigurosidad de moderadas a altas" para la hibridación se
refiere a condiciones que logran el mismo grado, o aproximadamente
el mismo, de especificidad de hibridación que las condiciones
empleadas por los presentes solicitantes. En el presente documento
se proporcionan ejemplos de condiciones de rigurosidad de moderadas
a altas. Específicamente, la hibridación de ADN inmovilizado en
membranas de Southern con sondas de genes específicos marcadas con
^{32}P se llevó a cabo con procedimientos estándar (Maniatis
et al.). En general, la hibridación y los lavados
subsiguientes se llevaron a cabo bajo condiciones de rigurosidad de
moderadas a altas que permitían la detección de secuencias de acceso
con homología con los genes de toxinas ejemplificadas. Para las
sondas de genes de ADN de doble hebra, la hibridación se llevó a
cabo durante la noche a 20-25ºC por debajo de la
temperatura de fusión (Tf) del híbrido de ADN en 6X SSPE, 5X de la
solución de Denhardt, 0,1% SDS, 0,1 mg/l de ADN desnaturalizado. La
temperatura de fusión es descrita mediante la siguiente fórmula
(Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas, y F.C.
Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman y K.
Moldave [eds.] Academic Press, Nueva York
100:266-285):
Tf = 81,5ºC
+16,6 Log [Na+]+ 0,41(%G +
C)-0,61(%formamida)-600/longitud de
la doble cadena en pares de
bases
Típicamente, los lavados se efectúan como
sigue:
- (1)
- Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1 X SSPE, 0,1% SDS (lavado de rigurosidad reducida).
- (2)
- Una vez a Tf-20ºC durante 15 minutos en 0,2X SSPE, 0,1% SDS (lavado de rigurosidad moderada).
\vskip1.000000\baselineskip
Para las sondas oligonucleótidas, la hibridación
se llevó a cabo durante la noche a 10-20ºC por
debajo de la temperatura de fusión (Tf) del híbrido en 6X SSPE, 5X
de la solución de Denhardt, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml de ADN
desnaturalizado. La Tf para las sondas oligonucleótidas se determinó
mediante la siguiente fórmula:
Tf (ºC) =
2(número de pares de bases T/A)+4(número de pares de
bases
G/C)
(Suggs, S.V., T. Miyake, E. H.
Kawashime, M. J. Johnson, K. Itakura y R. B. Wallace [1981]
ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified
Genes, D. D. Brown [ed.], Academic Press, Nueva York,
23:683-693).
\vskip1.000000\baselineskip
Típicamente, los lavados se efectuaron como
sigue:
- (1)
- Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1 X SSPE, 0,1% SDS (lavado de rigurosidad reducida).
- (2)
- Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en 1X SSPE, 0,1% SDS (lavado de rigurosidad moderada).
\vskip1.000000\baselineskip
En general, la sal y/o la temperatura pueden
alterarse para cambiar la rigurosidad. Con a fragmentos de ADN
marcados >70 aproximadamente bases en longitud, pueden usarse las
siguientes condiciones:
- Baja: 1 o 2X SSPE, temperatura ambiente
- Baja: 1 o 2X SSPE, 42ºC
- Moderada: 0,2X o 1X SSPE, 65ºC
- Elevada: 0,1X SSPE, 65ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La formación y estabilidad bicatenarias dependen
de una complementaridad sustancial entre las dos cadenas de un
híbrido, y, como se ha hecho notar anteriormente, puede tolerarse
cierto grado de disparidad. Por lo tanto las secuencias sonda de la
presente invención incluyen mutaciones (tanto simples como
múltiples), supresiones, inserciones de las secuencias descritas, y
combinaciones de las mismas, en las que dichas mutaciones,
inserciones y supresiones permiten la formación de híbridos
estables con el polinucleótido diana objeto de interés. Las
mutaciones, las inserciones y las supresiones pueden ser producidas
en una secuencia polinucleótida dada de muchas maneras, y estos
procedimientos son conocidos para una persona con un dominio normal
de la técnica. En el futuro pueden llegar a conocerse otros
procedimientos.
Tecnología RCP. La reacción en cadena de la
polimerasa (RCP) es una síntesis repetitiva enzimática con cebadores
de secuencias de un ácido nucleico. Este procedimiento es bien
conocido y es usado comúnmente por las personas expertas en este
técnica (véanse Mullis, patentes estadounidenses N^{os} 4.683.195,
4.683.202 y 4.800.159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred
Faloona, Wary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman
Arnheim "Enzymatic Amplification of
\beta-Globin Genomic Sequences and Restriction
Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia". Science
230:1350-1354). La RCP se basa en la amplificación
enzimática de un fragmento de ADN de interés que está flanqueado
por dos cebadores oligonucleótidos que se hibridan a cadenas
opuestas de la secuencia diana. Los cebadores están orientados con
los extremos 3' apuntándose mutuamente. Los ciclos reiterados de
desnaturalización térmica de la plantilla, apareamiento de los
cebadores con sus secuencias complementarias y extensión de los
cebadores apareados con una polimerasa de ADN resultan en la
amplificación del segmento definido por los extremos 5' de los
cebadores de la RCP. Dado que el producto de la extensión de cada
cebador puede servir de plantilla para el otro cebador, cada ciclo,
en esencia, dobla la cantidad del fragmento de ADN producido en el
ciclo previo. Esto resulta en la acumulación exponencial del
fragmento diana específico, hasta en varios millones de veces en
cuestión de horas. Usando una polimerasa de ADN termoestable como
la polimerasa Taq, que es aislada de la bacteria termófila Thermus
aquaticus, el procedimiento de amplificación puede ser
completamente automatizado. Otras enzimas que pueden usarse son
conocidas para las personas versadas en la técnica.
Las secuencias de ADN de la presente invención
pueden ser usadas como cebadores de la amplificación por RCP. Al
llevar a cabo la amplificación por RCP, puede tolerarse cierto grado
de disparidad entre el cebador y la plantilla. Por lo tanto, las
mutaciones, las supresiones y las inserciones (especialmente las
adiciones de nucleótidos al extremo 5') de los cebadores
ejemplificados caen dentro del ámbito de la presente invención.
Pueden producirse mutaciones, inserciones y supresiones en un
cebador dado mediante procedimientos conocidos para una persona con
un grado normal de dominio de la técnica.
A continuación figuran ejemplos que ilustran
procedimientos para practicar la invención. No debería interpretarse
que estos ejemplos sean limitantes. Todos los porcentajes son en
peso y todas las proporciones de mezclas de disolventes son en
volumen, a no ser que se haga notar lo contrario.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se cultivaron cepas nativas de Bacillus
laterosporus y recombinantes de B.t. que expresaban
toxinas MIS y WAR de B.l. en un medio líquido de TB (+
glicerol) a 30ºC y 300 RPM durante 25 horas. Las células fueron
aglomeradas mediante centrifugación y los sobrenadantes ("SN")
fueron decantados y guardados. Se añadió EDTA hasta 1 mM y las
muestras se almacenaron a -20ºC. Se usaron muestras nuevas para los
bioensayos el mismo día de su recogida. Las muestras congeladas se
descongelaron a 4ºC y se centrifugaron para aglomerar y eliminar
cualquier sólido y luego fueron presentadas y después usadas para
el bioensayo o el fraccionamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se preparó ADN celular total a partir de
diversas cepas de Bacillus laterosporus cultivadas hasta una
densidad óptica de 0,5-0,8 a 600 nm de luz visible
en caldo Luria Bertani (LB). El ADN fue extraído usando el
kit Qiagen Genomic-tip 500/G o el
Genomic-Tip 20/G y el Genomic DNA Buffer Set
conforme al protocolo para bacterias grampositivas (Qiagen Inc.;
Valencia, California). El ADN genómico total preparado fue digerido
con diversas enzimas de restricción, sometido a electroforesis en
un gel de agarosa al 0,8% e inmovilizado en una membrana de nailon
soportada usando procedimientos estándar (Maniatis, T., E.F.
Fritsch, J. Sambrook [1982] Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York).
Fueron detectados genes de toxinas novedosas usando sondas marcadas
con ^{32}P en hibridaciones Southern estándar o con procedimientos
no radiactivos usando el sistema DIG de marcación y detección de
ácidos nucleicos (Boehringer Mannheim; Indianápolis,
Indiana).
Indiana).
En la ID SEC Nº 1 se muestra la sonda MIS, de
aproximadamente 2,6 pkb. En la ID SEC Nº se muestra la sonda WAR,
de aproximadamente 1,3 pkb. Estas sondas pueden prepararse de
diversas maneras, incluyendo el uso de una "máquina genética",
o puede ser clonadas a partir del aislado PS 177C8 del B.t. y
ser amplificadas mediante RCP con cebadores homólogos a los
extremos 5' y 3' de cada gen respectivo. En el último caso, los
fragmentos de ADN fueron purificados en gel y aproximadamente 25 ng
de cada fragmento de ADN se marcaron aleatoriamente con ^{32}P
para la detección radiactiva. Aproximadamente 300 ng de cada
fragmento de ADN se marcaron aleatoriamente con el kit High
Prime de DIG para la detección no radiactiva. La hibridación del ADN
inmovilizado con sondas marcadas aleatoriamente con ^{32}P se
llevó a cabo en condiciones estándar de formamida: 50% formamida,
5X SSPE, 5X solución de Denhardt, 2% SDS, 0,1 mg/ml a 42ºC durante
la noche. Las membranas se lavaron con rigurosidad reducida en 2X
SSC, 0,1% SDS a 42ºC y fueron expuestas a una película.
Se muestran a continuación, en la Tabla 2, los
resultados del polimorfismo de la longitud de fragmentos de
restricción del ADN celular total procedente de las cepas MB438 y
MB439 del Bacillus laterosporus según se determina mediante
análisis de transferencia de Southern con sondeo o bien de sondas
MIS o WAR, según se indica. Las bandas contienen al menos un
fragmento del operón de tipo MIS o WAR objeto de interés.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se prepararon bibliotecas lambda del ADN
genómico total de las cepas MB439 o MB438 del Bacillus
laterosporus a partir de ADN parcialmente digerido de tamaño
fraccionado en el intervalo de tamaños de 9-20 kb.
Se determinaron los tiempos específicos de digestión usando enzima
NdeII diluida 1:10 (aproximadamente 0,5 unidades) para
optimizar el intervalo deseado de tamaños del ADN digerido. El ADN
fue digerido durante el tiempo apropiado y luego fraccionado sobre
un gel de agarosa al 0,7%. El ADN se visualizó usando tinción de
bromuro de etidio y se separó del gel el ADN dentro del intervalo
de tamaños de 9-20 kb. El fragmento de gel se puso
en tubos de diálisis (corte de 12-14.000 PM) junto
con 2 ml de Tris-HCl 10 mM, tampón EDTA 1mM, pH
8,90 (TE). El ADN fue electroeluido a partir del fragmento de gel en
tampón TAE 0,1X a aproximadamente 30 mA durante una hora. El ADN se
retiró de los tubos en el tampón TE y fue purificado usando una
columna y el protocolo Elutip (Schleicher and Schuell; Keene, Nueva
Hampshire). El ADN purificado fue precipitado en etanol y
resuspendido en 10
ul TE.
ul TE.
El ADN fraccionado purificado fue ligado en
brazos digeridos con BamHI del
Lambda-GEM-11 (Promega Corp.,
Madison, Wisconsin) conforme al protocolo. A continuación, el ADN
ligado fue empaquetado en fago lambda usando extracto de
empaquetamiento Gigapack III Gold (Stratagene Corp., La Jolla,
California) conforme al protocolo. Se infectó la cepa bacteriana
KW251 de E. coli con extractos de empaquetamiento y se
depositó sobre placas de LB en agarosa cubierta de LB. Las
plaquitas se elevaron a filtros de nitrocelulosa y se prepararon
para la hibridación usando procedimientos estándar (Maniatis et
al., supra). Se preparó la sonda marcada con ^{32}P
(véase más arriba) y los filtros fueron hibridados y lavados tal
como se ha descrito anteriormente. Las plaquitas que contenían el
clon deseado se visualizaron exponiendo los filtros a película Kodak
XAR-5. Las plaquitas fueron aisladas de las placas
y resuspendidas en fagos desde el agar al tampón SM. El ADN del fago
fue preparado usando adsorbente de fagos LambdaSorb (Promega,
Madison, Wisconsin). Se llevó a cabo RCP en el ADN del fago para
verificar que contenía el operón diana usando la ID SEC Nº 3 y la ID
SEC Nº 4 como cebadores. Las reacciones de RCP produjeron una banda
de 1 kb en ambas muestras de ADN, reafirmando que esos clones
contienen el gen de tipo mis. Para identificar un fragmento
menor de ADN que contuviera el operón objeto de interés que pudiera
ser entonces subclonado en un vector bacteriano para análisis y
expresión ulteriores, los ADN de los fagos fueron digeridos con
diversas enzimas, fraccionados sobre gel de agarosa al 1% y puestos
en membranas para el análisis de Southern. El análisis de Southern
se llevó a cabo tal como se describe más arriba. Para MB438 fue
identificado un fragmento HincII de un tamaño aproximado de
10 kb. Este fragmento fue purificado en gel y clonado en el sitio
EcoRV del vector pBluescriptII (SK+); el plásmido resultante
se designa como pMYC2608, y la cepa de E. coli recombinante
que contiene este plásmido se designa como MR957.
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Ejemplo
4
Se determinó una secuencia de ADN parcial para
el gen mis de MB438 en un fragmento de ADN amplificado con
RCP. Se efectuó RCP usando cebadores MIS (ID SEC Nº 3 e ID SEC Nº 4)
en ADN genómico celular total de MB438 y MB439. La MB438 produjo un
fragmento de ADN de aproximadamente 1 pkb que fue clonado
subsiguientemente en el vector plásmido de clonación de TA del ADN
con RCP, pCR2.1, tal como describe el suministrador (Invitrogen,
San Diego, California). Se aislaron los plásmidos a partir de clones
recombinantes de la RCP de la MB438 y se sometieron a ensayo para
detectar la presencia de un inserto de aproximadamente 1 pkb
mediante RCP usando los cebadores T3 y T7 del vector plásmido. Los
que contenían el inserto fueron aislados entonces para su uso como
plantillas de secuenciación usando kits de minipreparaciones
de QIAGEN (Santa Clarita, California) según describe el
suministrador. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo
usando el kit de reacciones listo para la secuenciación de
ciclos con terminadores tincionados de PE Applied Biosystems. Las
reacciones de secuenciación se llevaron a cabo en un Secuenciador
Automatizado ABI PRISM 377. Los datos de las secuencias se
recogieron, se editaron y se ensamblaron usando los programas
Collection, Factura y AutoAssembler del ABI PRISM 377 de PE ABI. Se
muestra una secuencia nucleótida parcial del gen de tipo mis
de MB438 como ID SEC Nº 5.
Las secuencias completas para los genes MIS y
WAR de MB438 fueron determinadas ensamblando datos de secuencia de
fragmentos de restricción aleatorios del pMYC2608 y mediante el
acompañamiento del inserto de ADN del pMYC2608 por parte del
cebador. El inserto de ADN del plásmido pMYC2608 fue aislado
mediante escisión del vector usando enzimas de restricción
policonectoras NotI y ApaI, fraccionamiento sobre un
gel de agarosa al 0,7% y purificación a partir del gel de agarosa
usando el kit QiaexII (Qiagen Inc; Valencia, California). El
ADN del inserto purificado en gel fue digerido a continuación con
las enzimas de restricción AluI, MseI y RsaI, y
fraccionado sobre gel de agarosa al 1%. Los fragmentos de ADN entre
0,5 y 1,5 kb se separaron del gel y fueron purificados usando el
kit QiaexII. Los fragmentos recuperados fueron ligados en
pBluescriptII digerido con EcoRV y transformados en células
XL10Gold. El ADN de la minipreparación se preparó a partir de
transformantes escogidos aleatoriamente, fue digerido con
NotI y ApaI para verificar el inserto y usado para la
secuenciación. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo
usando un kit de Secuenciación dRhodamine (ABI Prism/Perkin Elmer
Applied Biosystems). Las secuencias fueron liberadas en gel de
secuenciación conforme al protocolo (ABI Prism) y analizadas usando
los programas Factura y Autoassembler (ABI Prism). La secuencia
nucleótida completa del gen mis de MB438 se muestra como la
ID SEC Nº 6; la secuencia de péptidos MIS de MB438 deducida se
muestra como la ID SEC Nº 7. La secuencia nucleótida completa del
gen war de MB438 se muestra como la ID SEC Nº 8; la secuencia
de péptidos WAR de MB438 deducida se muestra como la ID SEC Nº
9.
Se determinó una secuencia de ADN parcial para
el gen mis de MB439 a partir de fragmentos de ADN
amplificados mediante RCP. Se llevó a cabo RCP usando los cebadores
de ID SEC Nº 3 e ID SEC Nº 4 en ADN genómico celular total
procedente de MB439. Se obtuvo un fragmento de ADN de
aproximadamente 1 pkb que fue clonado subsiguientemente en el
vector plásmido de clonación de TA del ADN con RCP,
pCR-TOPO, tal como describe el suministrador
(Invitrogen, San Diego, California). Se aislaron los plásmidos a
partir de clones recombinantes de la RCP de la MB439 y se
sometieron a ensayo para detectar la presencia de un inserto de
aproximadamente 1 pkb mediante RCP usando los cebadores T3 y T7 del
vector plásmido. Los que contenían el inserto fueron aislados
entonces para su uso como plantillas de secuenciación usando
kits de minipreparaciones de QIAGEN (Santa Clarita,
California) según describe el suministrador. Las reacciones de
secuenciación se llevaron a cabo usando el kit de reacciones
listo para la secuenciación de ciclos con terminadores tincionados
de PE Applied Biosystems. Las reacciones de secuenciación se
llevaron a cabo en un Secuenciador Automatizado ABI PRISM 377. Los
datos de las secuencias se recogieron, se editaron y se ensamblaron
usando los programas Collection, Factura y AutoAssembler del ABI
PRISM 377 de PE ABI. Se muestra la secuencia nucleótida parcial del
gen de tipo mis de MB439 como la ID
SEC Nº 9.
SEC Nº 9.
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Ejemplo
5
La expresión de las toxinas MIS y WAR de MB438
en B.t. se logró subclonando el fragmento de ADN genómico
clonado procedente del pMYC2608 en un vector lanzadera de un número
de copias elevado capaz de replicación tanto en huéspedes E.
coli como B.t. El vector lanzadera, pMYC2614, es una
versión modificada de pHT370 (O. Arantes and D. Lereclus. 1991.
Gene 108:115-119) que contiene la región de sitios
de clonación múltiples de pBluescript II (Stratagene). El inserto
de ADN genómico que contenía los genes war y mis fue
separado del pMYC2608 usando enzimas de restricción NotI y
ApaI, purificado sobre gel y ligado con los sitios
NotI y ApaI del pMYC2614. El plásmido lanzadera
resultante de B.t. fue designado como pMYC2609.
Para someter a ensayo la expresión de los genes
de toxina de MB438 en el B.t., el pMYC2609 fue transformado
en el huésped de B.t. acristalino (Cry-), CryB (A. Aronson,
Purdue University, West Lafayette, Indiana) mediante
electroporación. Esta cepa recombinante fue designada como MR557. La
expresión de la toxina WAR se demostró mediante
inmunoelectrotransferencia con anticuerpos generados a la toxina WAR
del PS 177C8. Se sometieron a ensayo preparados del sobrenadante
del cultivo y gránulos de células de MR557 contra gusanos de las
raíces del maíz occidentales, tal como se describe más abajo en el
Ejemplo 8.
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Ejemplo
6
Muestras del sobrenadante preparadas como se
explicó en el Ejemplo 1 fueron cargadas desde arriba sobre dieta
artificial a una tasa de 215 \mul/1,36 cm^{2}. Estos preparados
fueron infestados a continuación con neonatos del gusano de las
raíces del maíz occidental y se mantuvieron durante 4 días en la
oscuridad a 25ºC. A no ser que se indique lo contrario, las
muestras fueron evaluadas en cuanto a mortalidad en el día 4
posterior a la infestación.
\newpage
La Tabla 3 versa acerca de la progresión
temporal para las cepas MB438 y MB439. Las cepas MB438 y MB439
demuestran la aparición de actividad en torno a las
22-30 h (MB438) y las 24- 39 h (MB439). Todas las
cepas se cultivaron en un medio de TBG. Ninguna de estas muestras
fue tratada térmicamente.
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\newpage
Los resultados de los que se informa en la Tabla
4 demuestran que el calentamiento elimina la mayoría o la totalidad
de la actividad presente en nuevas muestras no calentadas de MB438 y
MB439 cultivadas durante 24 h y 48 h.
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los resultados de los que se informa en la Tabla
5 demuestran que la actividad de las cepas MB438 y MB439 responde a
la dosis. Todas las cepas se cultivaron en un medio de TBG. Ninguna
de estas muestras fue tratada térmicamente. Todas las muestras son
cultivos de 24 horas.
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Ejemplo
7
Para las muestras dializadas, se transfirieron
alícuotas del sobrenadante de los cultivos a tubos de diálisis y
fueron dializadas contra NaPO_{4} 25 mM, EDTA 1 mM, pH 7, con
agitación durante la noche a 4ºC. Esto elimina cualquier componente
fluyente del SN que sea menor que el punto de corte del peso
molecular nominal de la membrana de diálisis. Los tamaños de poro
estaban entre 6-8 kD y 50 kD, y estas muestras
examinan la actividad de los componentes retenidos dentro de la
membrana de diálisis que pueden denominarse de "peso molecular
elevado".
Las fracciones de bajo peso molecular fueron
generadas mediante ultrafiltración ("UF") a través de membranas
de tamaño de poro de 1, 3 o 10 kD mediante presión de gas nitrógeno
a 4ºC. Este procedimiento resulta en soluciones que contienen
componentes sobrenadantes menores que el punto de corte del peso
molecular de la membrana de UF. Estas soluciones son denominadas
"filtrados".
Los resultados de los que se informa en la Tabla
6 demuestran que el componente de menos de 10 kD de las cepas MB438
y MB439 muestra actividad. Todas las muestras se cultivaron en un
medio de TBG. Ninguna de estas muestras fue tratada térmicamente.
Todas las muestras son cultivos de 24 horas.
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Los resultados de los que se informa en la Tabla
7 demuestran que los componentes < 10 kD de las cepas MB438 y
MB439 muestran una actividad que es moderada por el calor intenso, y
que la eliminación de los componentes de bajo peso molecular tras
la diálisis no elimina la actividad. Todas las muestras eran
cultivos de 24 horas realizados en un medio de TBG.
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Los resultados de los que se informa en la Tabla
8 demuestran que las cepas MB438 y MB439 tienen actividad en un
componente de menos de 10 kD que no pasa por una membrana de UF de 1
kD. Todas las muestras eran cultivos de 24 horas realizados en un
medio de TBG.
Ejemplo
8
Se realizaron cultivos de MR957 en 5,0 ml de
medio (Difco TB premix; 4 g/litro de glicerol) en tubos de plástico
de 16 x 150 mm con tapones. Los cultivos fueron agitados en un
tambor rotatorio durante 24 horas a 37ºC. Las células fueron
aglomeradas mediante centrifugación y los sobrenadantes fueron
decantados y guardados. Se añadió EDTA hasta 1 mM y las muestras se
almacenaron a 20ºC. Para la determinación de la densidad celular,
las muestras fueron centrifugadas y se transfirieron 100 \mul de
cada caldo de cultivo a un tubo Falcon (14 mL; 17 x 100 mm). Se
preparó una disolución 1:50 añadiendo 4,9 mL de agua destilada a
cada tubo y sometiéndolos nuevamente a centrifugación. Se
realizaron lecturas de DO usando un espectrofotómetro a 600 nm. Se
cultivaron cepas de B.t. recombinante tal como se describe
en el Ejemplo 1.
Se hicieron bioensayos en el gusano de las
raíces del maíz occidental para las cepas MR957, clon de E.
coli, y MR557, clon del B. thuringiensis (cada una de
las cuales contenía genes mis y war de MB438), usando
esencialmente el mismo diseño experimental descrito en el Ejemplo
6. MR948 y MR539 son cepas de control negativo que contienen
vectores de clonación sin los insertos de genes de toxina. Para el
ensayo de cepas de E. coli, se aplicaron sobrenadantes o
muestras de todo el cultivo a la superficie de la dieta a una dosis
de 215 ul/1,36 cm^{2}, mientras que las muestras de
aglomeraciones celulares fueron concentradas cinco veces y cargadas
sobre la dieta a 50 ul/1,36 cm^{2} (Tabla 9). Para el ensayo de
cepas del B.t., se aplicaron sobrenadantes o muestras de
todo el cultivo a la superficie de la dieta a una dosis de 215
ul/1,36 cm^{2}, mientras que las muestras de aglomeraciones
celulares fueron concentradas cinco veces y cargadas sobre la dieta
a tasas diversas (Tabla 10). Se transfirieron aproximadamente
6-8 larvas a la dieta inmediatamente después de que
la muestra se hubo evaporado. La placa del bioensayo se selló con
revestimiento de Mylar usando una plancha de pegar y se practicaron
agujeritos encima de cada pocillo para permitir el intercambio de
gases. La mortalidad se evaluó cuatro días después de la
infestación.
Los resultados de ambos ensayos demuestran una
mortalidad del gusano de las raíces del maíz más elevada atribuible
a los genes mis y war de la MB438 clonada. La Tabla 9
muestra la actividad cualitativa de las toxinas de la MB438 clonada
en preparados de cultivos de E. coli contra el gusano de las
raíces del maíz occidental.
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\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 10 muestra la actividad dependiente de
la dosis de las toxinas de la MB438 clonada en preparados de
cultivos de B.t. crudo contra el gusano de las raíces del
maíz occidental. En las Tablas 9 y 10 los números en negrita son la
mortalidad porcentual; los números entre paréntesis indican las
larvas muertas divididas por el total de larvas en el ensayo.
Ejemplo
9
Un aspecto de la presente invención es la
transformación de plantas con genes que codifican la toxina
insecticida de la presente invención. Las plantas transformadas son
resistentes al ataque de la plaga diana.
Los genes que codifican las toxinas pesticidas,
tal como se dan a conocer en el presente documento, pueden ser
insertados en células vegetales usando una variedad de técnicas que
son bien conocidas en la especialidad. Esas técnicas incluyen la
transformación con ADN-T usando el Agrobacterium
tumefaciens o el Agrobacterium rhizogenes como agentes
transformadores, la fusión, la inyección, la biolística (bombardeo
con micropartículas) o la electroporación, al igual que otros
procedimientos posibles.
Si se usan agrobacterias para la transformación,
el ADN que debe insertarse tiene que ser clonado en plásmidos
especiales, concretamente o en un vector intermedio o en un vector
binario. Los vectores intermedios pueden ser integrados en el
plásmido Ti o Ri mediante recombinación homóloga, debido a las
secuencias que son homólogas a las secuencias del
ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende la
región vir necesaria para la transferencia del
ADN-T. Los vectores intermedios no pueden
autorreplicarse en las agrobacterias. El vector intermedio puede
ser transferido al Agrobacterium tumefaciens por medio de un
plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden
replicarse tanto en E. coli como en las agrobacterias.
Comprenden un gen marcador de selecciones y un conector o un
policonector que están flanqueados por las regiones limítrofes
derecha e izquierda del ADN-T. Pueden ser
transformados directamente en agrobacterias (Holsters et al.
[1978] Mol. Gen. Genet. 163:181-187). La
agrobacteria usada como célula huésped ha de comprender un plásmido
que contenga la región vir. La región vir es necesaria para la
transferencia del ADN-T a la célula vegetal. Puede
contener ADN-T adicional. La bacteria así
transformada es usada para la transformación de células vegetales.
Los explantes vegetales pueden cultivarse con ventaja con
Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes
para la transferencia del ADN a la célula vegetal. Pueden entonces
regenerarse plantas completas a partir del material vegetal
infectado (por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallo, raíces,
pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un
medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la
selección. Las plantas así obtenidas pueden ser sometidas a ensayo
a continuación para verificar la presencia del ADN insertado.
No se realizan exigencias especiales en cuanto a
los plásmidos en el caso de la inyección y la electroporación. Es
posible usar plásmidos ordinarios, como, por ejemplo, los derivados
pUC. En la transformación biolística pueden emplearse ADN de
plásmido o ADN lineal.
Se dispone de un gran número de vectores de
clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli
y un marcador que permite la sección de las células transformadas
para la preparación de la inserción de genes foráneos en plantas
superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, series
pUC, series M13mp, pACYC184, etc. En consecuencia, la secuencia que
codifica la toxina del bacilo puede ser insertada en el vector en un
sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para
la transformación en E. coli. Las células de E. coli
son cultivadas en un medio nutriente adecuado, y después son
recogidas y lisadas. Se recupera el plásmido. Se llevan a cabo como
procedimientos analíticos análisis de secuencias, análisis de
restricciones, electroforesis y otros procedimientos biológicos de
bioquímica molecular. Después de cada manipulación, la secuencia de
ADN usada puede ser escindida y unida con la siguiente secuencia de
ADN. Cada secuencia plásmida puede ser clonada en los mismos
plásmidos o en otros. Dependiendo del procedimiento de inserción de
los genes deseados en cada planta, pueden ser necesarias otras
secuencias de ADN. Por ejemplo, si se usa plásmido Ti o Ri para la
transformación de la célula vegetal, entonces al menos el borde
derecho, pero a menudo el borde derecho y el izquierdo del
ADN-T del plásmido Ti o Ri, tienen que estar unidos
como región flanqueante de los genes que han de insertarse.
El uso de ADN-T para la
transformación de células vegetales ha sido objeto de intensas
investigaciones y ha sido suficientemente descrito en el documento
EP 120 516; Hoekema (1985) en The Binary Plant Vector System,
Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam,
capítulo 5; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci.
4:1-46; y An et al. (1985) EMBO J.
4:277-287.
Una vez que el ADN se ha integrado en el genoma,
es relativamente estable en él y, por regla general, no vuelve a
salirse. Normalmente contiene un marcador de selección que confiere
a las células vegetales transformadas resistencia a un biocida o a
un antibiótico, como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o
cloranfenicol, entre otros. Por ende, el marcador de empleo
individual debería permitir la selección de células transformadas,
no de células que no contienen el ADN insertado.
Las células transformadas son regeneradas de la
manera usual en plantas morfológicamente normales. Si un evento de
transformación conlleva una célula de la línea germinal, entonces el
ADN insertado y la(s) correspondiente(s)
característica(s) fenotípica(s)
correspondiente(s) será(n) transmitida(s) a las
plantas descendientes. Tales plantas pueden ser cultivadas de la
manera normal, y ser cruzadas con plantas que tengan los mismos
factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios.
Los resultantes ejemplares híbridos tienen las correspondientes
propiedades fenotípicas.
En una realización preferida de la presente
invención, las plantas pueden ser transformadas con genes en los
que el uso de los codones ha sido optimizado para plantas. Véase,
por ejemplo, la patente estadounidense Nº 5.380.831.
<110>
| Nombre(s) de los solicitantes: | MYCOGEN CORPORATION | |
| Dirección: | 5501 Oberlin Drive | |
| Ciudad: | San Diego | |
| Estado/Provincia: | California | |
| País: | EE. UU. | |
| Código postal: | 92121 | |
| Número de teléfono: | (800) 745-7475 | |
| Número de fax: | (619) 453-0142 |
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Toxinas pesticidas y genes
procedentes de cepas del Bacillus laterosporus
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MA-719XC2
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/095.955
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-08-10
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/138.251
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-06-08
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
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<170> Patente en Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 2645
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus laterosporus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 1341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Bacillus laterosporus
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<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Bacillus laterosporus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Bacillus laterosporus
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<400> 4
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1062
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Bacillus laterosporus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 2355
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Bacillus laterosporus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 784
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de péptidos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 1356
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus laterosporus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 451
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de péptidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1041
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Bacillus laterosporus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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Claims (12)
1. Una toxina aislada que es activa contra una
plaga del gusano de las raíces del maíz, que comprende una
secuencia de aminoácido que tiene más del 90% de identidad con la ID
SEC Nº 7 o la ID SEC Nº 9.
2. Una toxina de la reivindicación 1 que
comprende la secuencia de aminoácido de ID SEC Nº 7.
3. Una toxina de la reivindicación 1 que
comprende la secuencia de aminoácido de ID SEC Nº 9.
4. Un polinucleótido aislado que codifica una
toxina de cualquier reivindicación precedente.
5. Un polinucleótido de la reivindicación 4 que
comprende la ID SEC Nº 5, la ID SEC Nº 6, la ID SEC Nº 8 o la ID
SEC Nº 10.
6. Una célula vegetal o microbiana que comprende
un polinucleótido que codifica una toxina de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
7. Una célula vegetal o microbiana que comprende
un polinucleótido de las reivindicaciones 4 o 5.
8. Una célula de la reivindicación 7 que es una
célula bacteriana.
9. Una célula de la reivindicación 7 que es una
célula de maíz.
10. Un procedimiento para el control de una
plaga de coleópteros, que comprende la administración a la plaga de
una toxina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
11. Un procedimiento conforme a la
reivindicación 10 en el que la plaga es un gusano de las raíces del
maíz.
12. Un cultivo de las cepas de Bacillus
laterosporus MB438, NRRL B-30085, o MB439, NRRL
B-30086.
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