ES2383997T3 - Nuevas toxinas plaguicidas y secuencias de nucleótidos que codifican estas toxinas - Google Patents

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Abstract

Una proteina que es activa frente a una plaga de lepidopteranos, que tiene una identidad de como minimo 95% con la secuencia de aminoacidos de la SEC lD NO. 3

Description

Nuevas toxinas plaguicidas y secuencias de nucle6tidos que codifican estas toxinas.
Antecedentes de la invenci6n
Los insectos y otras plagas cuestan a los agricultores miles de millones de d6lares anualmente en perdidas de cosechas y gastos para mantener bajo control estas plagas. Las perdidas causadas por las plagas de insectos en los medios de producci6n agricola incluyen la disminuci6n del rendimiento de la cosecha, la disminuci6n de la calidad de la cosecha y el aumento de los costes de recogida de la cosecha.
Procedimientos de cultivo tales como la rotaci6n de cultivos y la aplicaci6n de niveles de nitr6geno altos para estimular el crecimiento de un sistema de raiz adventicia se han enfrentado parcialmente a los problemas causados por las plagas agricolas. Los demandas econ6micas sobre la utilizaci6n del campo de cultivo restringen el uso de la rotaci6n de cultivos. Ademas, las caracteristicas de algunos insectos de mantenerse vivos durante el invierno rompen en algunas zonas las rotaciones de la cosecha. Asi, los insecticidas quimicos son a los sumo capaces de garantizar el nivel deseado de control. Los insecticidas son aplicados sobre el suelo o incorporados al suelo.
El uso de insecticidas quimicos tiene varios inconvenientes. El uso continuo de insecticidas ha permitido la generaci6n de insectos resistentes. Situaciones tales como poblaciones extremadamente grandes de larvas, lluvias fuertes y un calibrado inapropiado del equipo para aplicar el insecticida pueden dar por resultado un mal control. Con frecuencia, el uso de insecticidas genera preocupaciones tales como contaminaci6n del suelo y de suministro del agua tanto superficial como subterranea. El publico tambien se ha preocupado por la cantidad de productos sinteticos residuales que se pueden encontrar en los alimentos. El trabajo con insecticidas tambien puede suponer riesgos para las personas que los aplican. Por tanto, se estan examinando crecientemente los plaguicidas quimicos sinteticos en cuanto a sus potenciales consecuencias t6xicas ambientales. Entre los ejemplos de plaguicidas quimicos sinteticos extensamente usados figuran los compuestos organocloro, por ejemplo, DDT, mirex, kepone, lindano, aldrina, clordano, aldicarb y dieldrina; los organofosfatos, por ejemplo, clorpirifos, parati6n, malati6n y diazin6n; y carbamatos. Nuevas restricciones exigentes sobre el uso de plaguicidas y la eliminaci6n del mercado de algunos plaguicidas eficaces podrian limitar opciones econ6micas y eficaces para controlar daros y plagas costosas.
A causa de los problemas asociados con el uso de plaguicidas organicos quimicos sinteticos, existe una clara necesidad de limitar el uso de estos agentes y una necesidad de identificar agentes de control alternativos. La sustituci6n de plaguicidas quimicos sinteticos, o una combinaci6n de estos agentes con plaguicidas biol6gicos, podria reducir los niveles de productos quimicos t6xicos en el ambiente.
Un agente plaguicida biol6gico que goza de una popularidad creciente es el microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.). El microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria Gram positiva que forma esporas. La mayoria de las cepas de B.t. no exhiben actividad plaguicida. Algunas cepas de B.t. producen inclusiones de proteina paraesporales cristalinas y se pueden caracterizar por ellas. A menudo, estas inclusiones aparecen microsc6picamente como cristales conformados distintivamente. Algunas proteinas de B.t. son muy t6xicas para plagas tales como insectos y son especificas en cuanto a su actividad t6xica. Ciertas proteinas de B.t. insecticidas estan asociadas con las inclusiones. Estas β-endotoxinas son diferentes de las exotoxinas, que tienen una gama huesped no especifica. Otras especies de Bacillus tambien producen proteinas plaguicidas.
Se han aislado y secuenciado ciertos genes de toxina de Bacillus y se han producido y aprobado para uso productos basados en ADN recombinante. Ademas, con el uso de tecnicas de ingenieria genetica se estan desarrollando nuevos enfoques para suministrar estas toxinas a ambientes agricolas. Entre ellas figuran el uso de plantas generadas por ingenieria genetica con genes de toxina para resistencia a insectos y el uso de celulas microbianas intactas como vehiculos para suministro de toxinas. Asi, los genes de toxina aislados de Bacillus estan llegando a ser comercialmente valiosos.
Hasta los ultimos quince aros, el uso de plaguicidas de B.t. ha estado restringido en gran medida a la selecci6n de dianas de una gama estrecha de plagas de leptidopteranos (oruga). Durante muchos aros se han usado como insecticidas comerciales para plagas de lepidopteranos preparaciones de las esporas y cristales de B. thuringiensis, subesp. kurstaki. Por ejemplo, B. thuringiensis, var. kurstaki HD-1 produce una β endotoxina que es t6xica para las larvas de varios insectos de lepidopteranos.
En los ultimos aros, sin embargo, los investigadores han descubierto plaguicidas de B.t. con especifidad para una gama mucho mas amplia de plagas. Por ejemplo, se han usado otras especies de B.t., a saber, israelensis y morrisoni (a.k.a. tenebrionis, a.k.a. B.t., M-7, a.k.a. B.t. san diego) para controlar insectos de los 6rdenes Diptera y Coleoptera, respectivamnente. Se ha dado cuenta de que B. thuringiensis, var. tenebrionis es activo frente a
escarabajos del orden Coleoptera (escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata y Agelastica alni).
Mas recientemente se han identificad nuevas especies de B.t. y se han aislado genes responsables de las proteinas de δ-endotoxina. Hofte y Whiteley clasificaron los genes de proteina cristalina de B.t. en cuatro clases principales (Hofte, H., H.R. Whiteley [1989], Microbiological Reviews, 52(2).242-255). Las clases son (Cryl (especifica para lepid6pteros), Cryll (especifica para lepid6pteros y dipteros), Crylll (especifica para cole6pteros) y CrylV (especifica para dipteros). Se ha dado cuenta del descubrimiento de cepas especificamente t6xicas para otras plagas. Por ejemplo, se ha propuesto que CryV y CryVl designen una clase de genes de toxina que son especificos para nematodos.
La nomenclatura de 1989 y el esquema de clasificaci6n de Hofte y Whiteley para proteinas cristalinas estaban basados en la secuencia de aminoacidos deducida y la gama huesped de la toxina. Ese sistema se adapt6 para cubrir 14 tipos diferentes de genes de toxina que se dividieron en cinco clases importantes. El numero de genes de proteina cristalina de Bacillus thurigiensis secuenciados es actualmente de mas de 50. Se ha propuesto un esquema de nomenclatura revisado basado unicamente en la identidad de aminoacidos (Crickmores y otros, [1996], Society for lnvertebrate Pathology, 29th Annual Meeting, lllrd lnternational Colloquium on Bacillus thurigiensis, Universidad de C6rdoba, C6rdoba, Espara, 1-6 de septiembre de 1996, resumen). El termino nemotecnico "cry" se ha conservado para todos los genes de toxina excepto para cytA y cytB que permanecen como clase separada. En la primera fila se han intercambiado los numeros romanos por numeros arabigos y se han eliminado los parentesis en la tercera fila. Se han conservado muchos de los nombres originales con las excepciones indicadas, aunque se han reclasificado algunos.
Se han identificado ahora muchos otros genes de B.t. Los documentos WO 94/21795, WO 96/10083, WO 98/44137, y Estruch., J.J. y otros (1996) PNAS 93:5389-5393 describen las toxinas Vip1A(a), Vip1A(b), Vip2A(a), Vip2A(b), Vip3A(a) y Vip3A(b) obtenidas de microbios Bacillus. Se ha indicado que estas toxinas se producen durante el crecimiento celular vegetativo y por ello se denominaron proteinas insecticidas vegetativas (VlP). Se ha dado cuenta de la actividad de estas toxinas frente a ciertas plagas de lepidopteranos y coleopteranos. El documento WO 98/18932 da a conocer nuevas clases de toxinas plaguicidas.
Entre los obstaculos para el uso exitoso de toxinas de Bacillus figuran el desarrollo de resistencia a las toxinas de
B.t. por los insectos. Ademas, ciertos insectos pueden ser refractarios a los efectos de las toxinas de Bacillus. Entre ellos figuran insectos tales como picudo del algodonero (Anthonomus grandis) y larva Agrotis, asi como insectos de la mayoria de especies que hasta el momento han demostrado no tener una sensibilidad significativa a las δendotoxinas de B.t. Si bien actualmente tienen gran interes las tecnicas de control de la resistencia en la tecnologia de plantas transgenicas, sigue habiendo una gran necesidad del desarrollo de genes adicionales que se puedan expresar en plantas con el fin de controlar eficazmente diversos insectos.
El documento WO 98/00546 describe cebadores y sondas para cepas de Bacillus thurigiensis.
El documento WO 98/18932 describe toxinas SUP-1 de dos cepas de Bacillus thurigiensis, PS49C y PS 158C2 que son activas frente a Heliothis virescens y Helicoverpa zea.
Sumario de la invenci6n
Un primer aspecto de la presente invenci6n es una proteina que es activa frente a la plaga de lepldopteranos, que tiene una identidad de al menos 95% con la secuencia de aminoacidos de la SEC. lD NO.3. Preferiblemente, la proteina comprende la secuencia de aminoacidos de la SEC. lD NO.3
Un segundo aspecto de la presente invenci6n es un polinucle6tido que codifica una proteina de la invenci6n. Por ejemplo, el polinucle6tido comprende la SEC. lD NO. 2. Las secuencias se dan mas adelante.
Otros aspectos de la invenci6n son celulas microbianas, y tambien plantas, que comprenden un polinucle6tido de la invenci6n, y plantas que comprenden el polinucle6tido. Otro aspecto de la invenci6n es un procedimiento para controlar una plaga de lepidopterano, que comprende poner en contacto la plaga con una proteina de la invenci6n.
La transformaci6n de plantas con las construcciones geneticas descritas aqui se puede realizar usando metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica y tipicamente implican modificaci6n del gen para optimizar la expresi6n de la toxina en plantas.
Para controlar las plagas se pueden usar los microbios recombinantes que expresan las toxinas descritas aqui. A este respecto, la invenci6n incluye el tratamiento de celulas de Bacillus sustancialmente intactas y/o celulas recombinantes que contienen la toxinas expresadas de la invenci6n, tratadas para prolongar la actividad plaguicidas cuando las celulas intactas se aplican al medio ambiente da la plaga diana. La celula tratada actua como un revestimiento protector para la toxina plaguicida. La toxina se hace activa despues de que la digiere el insecto diana.
Descripci6n detallada de la invenci6n
Las toxinas de acuerdo con la invenci6n se denominan toxinas de tipo SUP. Tipicamente, estas toxinas son solubles y se pueden obtener a partir del material sobrenadante de cultivos de Bacillus como se describe aqui. Las toxinas SUP tipicamente tienen un tamaro de aproximadamente 70-100 kDa y, preferiblemente, de aproximadamente 80 kDa. La familia SUP se ejemplifica aqui por toxinas del aislado KB59A4-6. Este aislado se ha depositado en la colecci6n permanente de la Agricultural Research Service Patente Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, USA. El numero de dep6sito de esta cepa de B.t. es NRRL B-30173.
Una persona experta en esta tecnica sabe que los genes que codifican toxinas activas se pueden codificar y obtener por diversos medios.
Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, se pueden tambien construir sinteticamente, por ejemplo, usando un sintetizador de genes. Las variaciones de genes se pueden construir facilmente usando tecnicas estandar para hacer mutaciones puntuales. Tambien se pueden hacer fragmentos de estos genes usando exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles de acuerdo con procedimientos estandar. Por ejemplo, se pueden usar enzimas tales como Ba/31 o mutagenesis dirigida al sitio para cortar sistematicamente nucle6tidos de los extremos de estos genes. Tambien se pueden obtener genes que codifican fragmentos activos usando una variedad de enzimas de restricci6n. Se pueden usar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas.
Toxinas equivalentes y/o genes que codifican estas toxinas equivalentes se pueden derivar de aislados de Bacillus y/o bibliotecas de ADN usando las enseranzas proporcionadas aqui. Hay diversos procedimientos para obtener las toxinas plaguicidas de la presente invenci6n. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos de las toxinas plaguicidas descritas y reivindicadas aqui para identificar y aislar toxinas de una mezcla de proteinas. Especificamente, se pueden incorporar anticuerpos a las porciones de toxinas que son las mas constantes y diferenciadas de otras toxinas de Bacillus. Estos anticuerpos se pueden usar para identificar especificamente toxinas equivalentes con la actividad caracteristica por inmunoprecipitaci6n, ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELlSA) o transferencia western. Los anticuerpos para las toxinas descritas aqui o toxinas equivalentes, o fragmentos de estas toxinas se pueden preparar facilmente usando procedimientos estandar en esta tecnica. Los genes que codifican estas toxinas se pueden obtener luego del microorganismo.
Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad plaguicida de las toxinas ejemplificadas estan dentro del alcance de la invenci6n. Tambien, a causa de la redundancia del c6digo genetico, una variedad de diferentes secuencias del ADN pueden codificar las secuencias de aminoacidos descritas aqui. Tambien, corresponde a la habilidad de una persona experimentada en la tecnica crear estas secuencias alternativas de ADN que codifican las mismas o esencialmente las mismas toxinas. Estas secuencias variantes de ADN estan dentro del alcance de la presente invenci6n. Tal como se usa aqui, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen, sustituciones, supresiones, adiciones o inserciones de aminoacidos que no afectan materialmente a la actividad plaguicida. Tambien estan incluidos en esta definici6n los fragmentos que retienen la actividad plaguicida.
Otro procedimiento para identificar las toxinas y genes de la presente invenci6n es el uso de sondas de oligonucle6tidos. Estas sondas son secuencias de nucle6tidos detectables. Las sondas proporcionan un procedimiento rapido para identificar genes que identifican toxinas de la presente invenci6n. Los segmentos de nucle6tidos que se usan como sondas de acuerdo con la invenci6n se pueden sintetizar usando un sintetizador de ADN y procedimientos estandar.
Se han dado especificamente aqui ejemplos de ciertas toxinas de la presente invenci6n. Puesto que estas toxinas son meramente ejemplos de la presente invenci6n, debe entenderse facilmente que la presente invenci6n comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias de nucle6tidos que codifican toxinas equivalentes) que tienen la misma o similar actividad plaguicida de la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendran una homologia de aminoacidos con una toxina ejemplificada de al menos 95%. Estas identidades se determinan usando tecnicas de alineamiento estandar. La homologia de aminoacidos sera maxima en regiones criticas de la toxina que origina la actividad biol6gica o estan implicadas en la determinaci6n de la configuraci6n tridimensional que es finalmente responsable de la actividad biol6gica. A este respecto, ciertas sustituciones de aminoacidos son aceptables y se puede considerar si estas sustituciones estan en regiones que no afectan a la actividad o son sustituciones conservadoras de aminoacidos que no afectan a la configuraci6n tridimensional de la molecula. Por ejemplo, los aminoacidos se pueden ordenar en las clases siguientes: no polares, polares no cargadas, basicas y acidas. Las sustituciones conservadoras en las que un aminoacido de una clase es reemplazado con otro aminoacido del mismo tipo estan comprendidas en el alcance de la presente invenci6n siempre que la sustituci6n no altere materialmente la actividad biol6gica del compuesto. La Tabla l proporciona un listado de ejemplos de aminoacidos que pertenecen a cada clase.
Tabla I
Clase de aminoacido
Ejemplos de aminoacidos
No polar Polar no cargado Acido Basico
Ala, Val, Leu, lle, Pro, Met, Phe, Trp Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Asp, Glu Lys, Arg, His
En algunos casos tambien se pueden hacer sustituciones no conservadoras. El factor critico es que estas sustituciones no deben aminorar significativamente la actividad biol6gica de la toxina.
Las δ-toxinas de la presente invenci6n se pueden caracterizar tambien en terminos de la forma y localizaci6n de las inclusiones de toxina, descritas antes.
Tal como se usa aqui, la referencia a polinucle6tidos "aislados" y/o "purificados" se refiere a estas moleculas que no estan asociadas con las otras moleculas con las que se encontrarian asociadas en la naturaleza. Asi, la referencia a "aisladas y purificadas" significa la intervenci6n de la "mano del hombre" como se describe aqui. Las toxinas y genes quimericos implican tambien "la mano del hombre".
Huespedes recombinantes. Los genes que codifican toxinas de la presente invenci6n se pueden introducir en una variedad de huespedes microbianos o plantas. La expresi6n del gen de toxina da por resultado, directa o indirectamente, la producci6n y mantenimiento del plaguicida. Con huespedes microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios se pueden aplicar al sitio de la plaga donde proliferaran y seran digeridos. El resultado es un control de la plaga. Alternativamente, el microbio que aloja el gen de toxina se puede matar y tratar en condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la celula. La celula tratada, que retiene la actividad t6xica, se puede aplicar luego al ambiente de la plaga diana.
Cuando la toxina de Bacillus se introduce mediante un vector adecuado en el huesped microbiano y el mencionado huesped se aplica al ambiente en estado vivo, es esencial usar ciertos microbios huespedes. Se seleccionan huespedes de microorganismos que se sabe que ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de una o varios cosechas de interes. Estos microorganismos se seleccionan de manera que sean capaces de competir con exito en el ambiente particular (cosechas y otros habitats de insectos) con los microorganismos de tipo salvaje, proporcionen el mantenimiento y expresi6n del gen que expresa el plaguicida de polipeptido y, deseablemente, proporcionen una protecci6n mejorada del plaguicida frente a la degradaci6n e inactivaci6n ambiental.
Se conoce un gran numero de microorganismos para inhibir el filoplano (la superficie de las hojas de la planta) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raices de la planta) de una variedad de cultivos importantes. Entre estos microorganismos figuran bacterias, algas y hongos. Son de interes particular microorganismos tales com bacterias, por ejemplo, los generos Pseudomonas, Errinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, en particular levaduras, por ejemplo los generos Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Tienen un interes particular especies bacterianas de fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus y Azobacter vinlandiii; y especies de levaduras de fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R, aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurantii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. Son de un interes particular los microorganismos pigmentados.
Hay disponibles varias vias para introducir un gen de Bacillus que codifica una toxina en un microorganismo en condiciones que permiten una expresi6n y un mantenimiento estable del gen. Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la tecnica y se describen en, por ejemplo, la patente U.S. nO. 5.135.867, que se incorpra aqui por referencia.
Para transformar huespedes se pueden usar genes sinteticos que son funcionalmente equivalentes a las toxinas de
la presente invenci6n. Se pueden encontrar procedimientos para la producci6n de genes sinteticos en, por ejemplo, la patente U.S. nO. 5.380.831.
Tratamiento de celulas. Como se ha mencionado antes, celulas de Bacillus o recombinantes que expresan una toxina de Bacillus se pueden tratar para prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la celula. La microcapsula de plaguicida que se forma comprende la toxina de Bacillus dentro de una estructura celular que se ha estabilizado y que protegera la toxina cuando se aplica la microcapsula al ambiente de la plaga diana. Las celulas huesped adecuadas pueden incluir procariotes o eucariotes. Como huespedes seran de un interes particular los procariotes y los eucariotes inferiores, tales como hongos. Usualmente la celula estara intacta y sustancialmente en la forma proliferativa cuando se trata, mas que en forma de espora.
El tratamiento de la celula microbiana, por ejemplo, un microbio que contiene el gen de Bacillus, se puede hacer por medios quimicos o fisicos, o por una combinaci6n de medios quimicos y/o fisicos, con la condici6n de que la tecnica no afecte perjudicialmente a las propiedades de la toxina ni disminuya la capacidad celular de proteger la toxina. Se consideran procedimientos para tratar celulas microbianas en las patentes U.S. nO. 4.695.455 y nO. 4.695.462, que se incorporan aqui por referencia.
Procedimientos y formulaciones para control de plagas. El control de plagas usando los aislados, las toxinas y los genes de la presente invenci6n se puede realizar por varios procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica. Entre estos procedimientos figuran, por ejemplo, la aplicaci6n de aislados de Bacillus a las plagas (o su localizaci6n), la aplicaci6n de microbios recombinantes a las plagas (o su localizaci6n) y la transformaci6n de plantas con genes que codifican las toxinas plaguicidas de la presente invenci6n. Las transformaciones las pueden hacer los expertos en la tecnica usando metodos estandar. Se describen aqui los materiales necesarios para estas transformaciones, que, por otra parte, son facilmente adquiribles por un tecnico experto.
Se pueden aplicar al suelo granulos de cebo formulados que contienen una sustancia atractiva y las toxinas de los aislados de Bacillus, o microbios recombinantes que comprenden los genes obtenibles de los aislados de Bacillus. El producto formulado tambien se puede aplicar como revestimiento de siembra, o tratamiento de raices, o tratamiento total de la planta en etapas posteriores del ciclo de cosecha. En los tratamientos de la planta y el suelo con celulas de Bacillus se pueden emplear estas como polvos, granulos o polvos que se pueden mojar, mezclando diversos materiales inertes tales como minerales inorganicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares), o materiales botanicos (mazorcas de maiz, corteza de arroz, cascaras de nuez y similares). Las formulaciones pueden contener coadyuvantes adhesivos-de esparcimiento, agentes estabilizadores, otros aditivos plaguicidas o tensioactivos. Las formulaciones liquidas pueden ser de base acuosa o no acuosa y emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsivos o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reol6gicos, tensioactivos, emulsivos, dispersivos o polimeros.
Como lo apreciaria una persona experta en la tecnica, la concentraci6n de plaguicida variara dependiendo ampliamente de la naturaleza de la formulaci6n particular, en particular de si se trata de un concentrado o se ha de usar directamente. El plaguicida estara presente en al menos 1% en peso y puede estar presente en 100% en peso. Las formulaciones secas tendran 1-95% en peso del plaguicida mientras que las formulaciones liquidas generalmente tendran aproximadamente 1-60% en peso de los s6lidos en la fase liquida. Las formulaciones que contienen celulas generalmente tendran de aproximadamente 102 a aproximadamente 104 celulas/mg. Estas formulaciones se administraran a raz6n de 50 mg (liquido o seco) en 1 kg o mas por hectarea.
Las formulaciones se pueden aplicar al ambiente de la plaga, por ejemplo el suelo y el follaje, por pulverizaci6n, atomizaci6n, esparcimiento o similar.
Sondas de polinucle6tidos. Es bien sabido que el ADN tiene una propiedad fundamental denominada complementariedad de bases. En la naturaleza, el ADN ordinariamente existe en forma de pares de cadenas antiparalelas, proyectandose las bases en cada cadena desde la cadena hasta la cadena opuesta. La base adenina
(A) en una cadena estara siempre opuesta a la base tiamina (T) de la otra cadena y la base guanina (G) estara opuesta a la base citosina (C). Las bases se mantienen en aposici6n por su capacidad de uni6n por hidr6geno de esta manera especifica. Aunque cada enlace individual es relativamente debil, el efecto neto de muchas bases adyacentes unidas por hidr6geno, junto con los efectos del rimero de bases, es una uni6n estable de las dos cadenas complementarias. Estas uniones se pueden romper por tratamientos tales como pH alto o temperatura alta, y estas condiciones dan por resultado la disociaci6n o desnaturalizaci6n de las dos cadenas. Si luego se pone el ADN en condiciones en las que la uni6n por hidr6geno de las bases es termodinamicamente favorable, las cadenas de ADN se condensaran o "hibridaran" y reformaran el ADN original de doble cadena. Si se realiza en condiciones apropiadas, esta hibridaci6n puede ser muy especifica. Esto es, s6lo cadenas con un alto grado de complementariedad de las bases seran capaces de formar estructuras estables de doble cadena. La relaci6n de la especifidad de hibridaci6n a condiciones de reacci6n es bien conocida. Asi, la hibridaci6n se puede usar para ensayar si las dos piezas de ADN son complementarias en sus secuencias de base. Es este mecanismo de hibridaci6n lo que facilita el uso de sondas de la presente invenci6n para detectar y caracterizar facilmente las 6 10
secuencias de ADN.
Las sondas pueden ser ARN, ADN o APN (acido peptidonucleico). Normalmente la sonda tendra al menos aproximadamente 10 bases, mas usualmente al menos aproximadamente 17 bases y puede tener hasta aproximadamente 100 bases o mas. Se pueden utilizar facilmente sondas mayores y tales sondas pueden tener una longitud de, por ejemplo, varias kilobases. La secuencia de la sonda se disera que sea al menos sustancialmente complementaria para una porci6n de un gen que codifica una toxina de interes. No es necesario que la sonda tenga una complementariedad perfecta con la secuencia a la que se hibrida. Las sondas se pueden marcar utilizando tecnicas que son bien conocidas por los expertos en esta tecnica.
Un enfoque para el uso de la presente invenci6n como sondas implica identificar primeramente por analisis de transferencia southern de un banco de genes del aislado de Bacillus todos los segmentos de ADN hom6logos con las secuencias de nucle6tidos consideradas. Asi es posible conocer previamente, sin ayuda de un analisis biol6gico, la actividad probable de muchos aislados nuevos de Bacillus y de productos genicos individuales expresados por un aislado de Bacillus dado. Este analisis de una sonda proporciona un procedimiento rapido para identificar genes de toxina plaguicida potencialmente valiosa comercialmente dentro de las subespecies muy diversas de B.t.
Un procedimiento de hibridaci6n util de acuerdo con la presente invenci6n incluye tipicamente las etapas de aislar la muestra de ADN de interes y purificarla quimicamente. Se puede usar bacteria lisada o acido nucleico total fraccionado aislado de bacteria. Las celulas se pueden tratar usando tecnicas conocidas para liberar su ADN (y/o ARN). La muestra de ADN se puede cortar en piezas con una enzima de restricci6n apropiada. Las piezas se pueden separar por tamaros mediante electroforesis en un gel usando agarosa o acrilamida. Las piezas de interes se pueden transferir a una membrana inmovilizadora.
Para la presente invenci6n no es esencial la tecnica particular de hibridaci6n. Como las mejoras se hacen por tecnicas de hibridaci6n, se pueden aplicar facilmente.
La sonda y la muestra se pueden combinar luego en una soluci6n tamp6n de hibridaci6n y mantener a una temperatura apropiada hasta que se produce la hibridaci6n. Luego se lava la membrana liberandola de materiales extraros, dejando la muestra y las moleculas de sonda unidas tipicamente detectadas y cuantificadas por autorradiografia y/o recuento por centelleo en liquido. Como es bien sabido en la tecnica, si la molecula de la sonda y la muestra de acido nucleico se hibridan por formaci6n de un enlace fuerte no covalente entre las dos moleculas, se puede suponer razonablemente que la sonda y la muestra son esencialmente identicas. La marca detectable de la sonda proporciona un medio para determinar de manera conocida si se ha producido la hibridaci6n.
Al usar como sondas segmentos de nucle6tidos, la sonda particular se marca con un marcador adecuado conocido por los expertos en la tecnica, incluidos marcadores radiactivos y no radiactivos. Entre los marcadores radiactivos figuran 32P, 35S o similares. Entre los marcadores no radiactivos figuran, por ejemplo, ligandos tales como biotina o tiroxina, asi como enzimas tales como hidrolasas o peroxidasas, o diferentes agentes quimioluminiscentes tales como luciferina, o compuestos fluorescentes tales como fluoresceina y sus derivados. Las sondas se pueden hacer inherentemente fluorescentes como se describe en la solicitud de patente internacional nO. WO 93/16094.
Se pueden emplear diversos grados de estrictez de hibridaci6n. Cuanto mas severas son las condiciones, mayor es la complementariedad requerida para formaci6n de duplex. La severidad se puede controlar por la temperatura, la concentraci6n de la sonda, la longitud de la sonda, la fuerza i6nica, el tiempo y factores similares. Preferiblemente, la hibridaci6n se realiza en condiciones de estrictez moderada a alta por metodos bien conocidos en la tecnica, descritos, por ejemplo, por Keller, G.H., M.M. Manak (1987), DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, pags. 169-170.
Tal como se usa aqui, la expresi6n condiciones de "estrictez moderada a alta" para la hibridaci6n se refiere a condiciones que alcanzan el mismo o sustancialmente el mismo grado de especifidad de hibridaci6n que las condiciones empleadas por los solicitantes corrientes. Se proporcionan aqui ejemplos de condiciones de estrictez moderada y alta. Especificamente, la hibridaci6n de ADN inmovilizado en manchas Southern con sondas especificas a genes marcados con 32P se realiz6 por procedimientos estandar (Maniatis y otros). En general, la hibridaci6n y los posteriores lavados se realizaron en condiciones de estrictez de moderadas a altas que permitieron la detecci6n de secuencias diana de moderadas a altas con homologia con los genes de toxina ejemplificados. Para sondas de gen de DNA de cadena doble, la hibridaci6n se realiz6 durante la noche a 20-25OC por debajo de la temperatura de fusi6n (Tm) del hibrido de ADN en SSPE 6 X, soluci6n de Denhardt 5 X, 0,1% de SDS, 0,1 mg/ml de ADN desnaturalizado. Las temperaturas de fusi6n se describen por la f6rmula siguiente (Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbushh, P.T. Cherbas y F.C. Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu., L. Grossman y K. Moldave [eds], Academic Press, New York 100:266-285).
Tm = 81,5OC+16,6 log[Na+]+0,41(% de G+C)-0,61(% de formamida)-600/longitud de duplex en pares de base. 7
Los lavados se realizan tipicamente como sigue:
(1)
Dos veces a temperatura ambiente durante 15 min en SSPE 1 X, 0,1% de SDS (lavado de baja estrictez).
(2)
Una vez a Tm-20OC durante 15 min en SSPE 0,2 X, 0,1% de SDS (lavado de estrictez moderada).
Para sondas de oligonucle6tidos, la hibridaci6n se realiz6 durante la noche a 10-20OC por debajo de la temperatura de fusi6n (Tm) del hibrido en SSPE 6 X, soluci6n de Denhardt 5 X, 0,1% de SDS, 0,1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La Tm de sondas de oligonucle6tido se determin6 por la f6rmula siguiente:
Tm(OC) = 2(numero de pares de base T/A)+4(numero de pares de base G/C) (Suggs, S.V., T. Miyake, E.H. Kawashime, M.J. Johnson, K. ltakura y R.B. Wallace [1981], /CN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes,
D.D. Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693).
Tipicamente los lavados se hicieron como sigue:
(1)
Dos veces a temperatura ambiente durante 15 min en SSPE 1 X, 0,1% de SDS (lavado de baja estrictez).
(2)
Una vez a la temperatura de hibridaci6n durante 15 min en SSPE 1 X, 0,1% de SDS (lavado de estrictez moderada).
En general se puede alterar la sal y/o la temperatura para cambiar la estrictez. Con un fragmento de ADN marcado de una longitud >70 o aproximado de bases se pueden usar las condiciones siguientes:
Baja: SSPE 1 o 2 X, temperatura ambiente
Baja: SSPE 1 o 2 X, 42OC
Moderada: SSPE 0,2 o 1 X, 65OC
Alta: SSPE 0,1 X, 65OC
La formaci6n de duplex y la estabilidad dependen de la complementariedad sustancial de las dos cadenas de un hibrido y, como se ha indicado antes, se puede tolerar un cierto grado de desajuste. Por tanto, las secuencias de la sonda de la presente invenci6n incluyen mutaciones (individuales y multiples), supresiones, inserciones de las secuencias descritas y combinaciones de las mismas, permitiendo las mencionadas mutaciones, inserciones y supresiones la formaci6n de hibridos estables con el polinucle6tido diana. Las mutaciones, inserciones y supresiones se pueden producir en una secuencia de polinucle6tido dada de muchas maneras y estos procedimientos son conocidos por un experto de cualificaci6n normal. En el futuro se podran conocer otros procedimientos.
Por tanto, se pueden preparar facilmente variantes mutacionales, insercionales y supresoras de las secuencias de nucle6tidos indicadas por procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Estas variantes se pueden usar de la misma manera que las secuencias de cebador ejemplificadas siempre que las variantes tengan una homologia sustancial de secuencias con la secuencia original. Tal como se usa aqui, homologia sustancial de secuencias se refiere a homologia que es suficiente para que la sonda variante actue con la misma capacidad que la sonda original. Preferiblemente, esta homologia es mayor que 50%; mas preferiblemente esta homologia es mayor que 75% y, muy preferiblemente, esta homologia es mayor que 90%. El grado de homologia necesario para que funcione la variante con su capacidad pretendida dependera del uso previsto de la secuencia. Corresponde a la capacidad de una persona experta en esta tecnica hacer variaciones mutacionales, insercionales y supresoras diseradas para mejorar la funci6n de la secuencia o que proporcionen una ventaja metodol6gica.
Tecnologia de RCP. La Reacci6n en Cadena de Polimerasa (RCP) es una sintesis repetitiva, enzimatica, de cebado de una secuencia de acido nucleico. El procedimiento es bien conocido y muy usado por los expertos en esta tecnica (vease Mullis, patentes U.S. nO. 4.683.195, nO. 4.683.202 y nO. 4.800.159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim [1985], Enzymatic Amplification of β-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analisis for Diaganosis of Sickle Cell Anemia,
Science 230:1350-1354). La RCP esta basada en la amplificaci6n enzimatica de un fragmento de ADN de interes que esta flanqueado por dos cebadores que hibridan a cadenas opuestas de la secuencia diana. Los cebadores estan orientados con los extremos 3' mutuamente enfrentados. Ciclos de desnaturalizaci6n repetidos de la plantilla, hibridaci6n de los cebadores a sus secuencias complementarias y extensi6n de los cebadores hibridados con una polimerasa de ADN dan por resultado la amplificaci6n del segmento definido por los extremos 5' de los cebadores de RCP. Puesto que el producto de extensi6n de cada cebador puede actuar como plantilla para el otro cebador, cada ciclo esencialmente duplica la cantidad de fragmento de ADN producida en el ciclo anterior. Esto da por resultado la acumulaci6n exponencial del fragmento diana especifico, hasta varios millones de veces en unas pocas horas. Usando una polimerasa de ADN termoestable tal como la polimerasa Taq, que se aisla de la bacteria term6fila Thermus aquaticus, se puede automatizar completamente el proceso de amplificaci6n. Los expertos en la
tecnica conocen otras enzimas que se pueden usar.
Las secuencias de ADN de la presente invenci6n se pueden usar como cebadores para amplificaci6n por RCP. Al realizar la amplificaci6n por RCP, se puede tolerar un cierto grado de desajuste entre cebador y plantilla. Por tanto, las mutaciones, supresiones e inserciones (especialmente adiciones de nucle6tidos al extremo 5') de los cebadores ejemplificados estan dentro del alcance de la presente invenci6n. Las mutaciones, supresiones e inserciones se pueden producir en un cebador dado por procedimientos conocidos por un experto en la tecnica de cualificaci6n normal.
Seguidamente se presentan ejemplos que ilustran procedimientos para la practica de la invenci6n. Estos ejemplos no deben considerarse como limitativos. Todos los porcentajes son en peso y las proporciones en mezclas de disolventes son en volumen a no ser que se indique lo contrario.
Ejemplo 1 - Cultivo de aislados de Bacillus utiles de acuerdo con la invenci6n
El huesped celular que contiene el gen insecticida de Bacillus puede hacerse crecer en cualquier medio nutriente conveniente. Estas celulas se pueden cosechar luego de acuerdo con metodos convencionales. Alternativamente, las celulas se pueden tratar antes de cosechar.
Las celulas de Bacillus de la invenci6n se pueden cultivar usando medios estandar en la tecnica y tecnicas de fermentaci6n. Durante el ciclo de fermentaci6n, las bacterias se pueden cosechar separando primeramente las celulas vegetativas, las esporas, los cristales y restos celulares lisados de Bacillus del caldo de fermentaci6n por procedimientos bien conocidos en la tecnica. Cualesquier esporas o δ-endotoxinas de Bacillus formadas se pueden recuperar empleando tecnicas bien conocidas y usadas como la preparaci6n de una δ-endotoxina convencional de
B.t. El material sobrenadante del proceso de fermentaci6n contiene toxinas de la presente invenci6n. Las toxinas se aislan y purifican empleando tecnicas bien conocidas.
Para inocular el siguiente medio, conocido como caldo TB, se puede usar un subcultivo de aislados de Bacillus o mutantes de los mismos:
Triptona: 12 g/l
Extracto de levadura 24 g/l
Glicerol 4 g/l
KH2PO4 2,1 g/l
K2HPO4 14,7 g/l
pH 7,4
El fosfato potasico se aradi6 al caldo tratado en autoclave despues de enfriar. Los matraces se incubaron a 30OC en una mesa de sacudidas rotatoria a 30OC y a 250 rpm durante 24-36 h.
El procedimiento anterior se puede diserar facilmente a mayor escala siguiendo procedimientos conocidos en la tecnica para fermentadores grandes.
El Bacillus obtenido en la fermentaci6n anterior se puede aislar por procedimientos bien conocidos en la tecnica. Un procedimiento frecuentemente usado es someter el caldo de fermentaci6n cosechado a tecnicas de separaci6n, por ejemplo centrifugaci6n. En una realizaci6n especifica, las proteinas de Bacillus utiles de acuerdo con la presente invenci6n se pueden obtener del material sobrenadante. El material sobrenadante del cultivo que contiene la(s) proteina(s) activa(s) se puede usar en bioensayos.
Alternativamente, un subcultivo de aislado de Bacillus, o sus mutantes, se puede usar para inocular un medio de peptona, glucosa y sales:
Bactopeptona 7,5 g/l
Glucosa 1,0 g/l
KH2PO4 3,4 g/l
K2HPO4 4,35 g/l
Soluci6n de sal 5,0 ml/l
Soluci6n de CaCl2 7,2 ml/l
pH 7,2
Soluci6n de sales (100 ml)
MgSO4•7H2O
2,46 g
MnSO4•H2O
0,04 g
ZnSO4•7H2O
0,28 g
FeSO4•7H2O
0,40 g
Soluci6n de CaCl2 (100 ml)
3,66 g
La soluci6n de sales y la soluci6n de CaCl2 se esterilizan por filtraci6n y se araden al caldo tratado en autoclave y cocido en el momento de la inoculaci6n. Los matraces se incuban a 30OC en una mesa de sacudidas rotatoria a 200 rpm durante 64 h.
El procedimiento anterior se puede diserar facilmente a mayor escala por procedimientos bien conocidos en la tecnica para fermentadores grandes.
Las esporas y/o cristales de Bacillus obtenidos en la fermentaci6n se pueden aislar por procedimientos bien conocidos en la tecnica. Un procedimiento frecuentemente usado es someter el caldo de fermentaci6n cosechado a tecnicas de separaci6n, por ejemplo centrifugaci6n.
Ejemplo 2 - Aislamiento y preparaci6n de ADN celular para RCP
Se puede preparar ADN de celulas crecidas en agar de Spizzen u otro agar minimo o enriquecido conocido por los expertos en la tecnica, durante aproximadamente 16 h. El agar de casaminoacido de Spizzen comprende 23,2 g/l de sales minimas de Spizzens [(NH4)2SO4, 120 g; K2HPO4, 840 g; KH2PO4, 360 g; citrato s6dico, 60 g; MgSO4•7H2O, 12 g. Total: 1392 g]; 1,0 g/l de casaminoacidos exentos de vitamina; 15,0 g/l de agar Difco. Al preparar el agar, la mezcla se mantuvo en autoclave durante 30 min, luego se puede aradir una soluci6n esteril de glucosa al 50% a una concentraci6n final de 0,5% (1/100 vol). Una vez que las celulas crecieron durante aproximadamente 16 h, se extrajo del agar un parche de aproximadamente 1 cm2 de celulas que se pas6 a Tris-HCl 10 mM (pH 8,0)-EDTA 1 mM. Se aradi6 proteinasa K a 50 μg/ml y se incub6 a 55OC durante 15 min. Se pueden usar otras proteasas adecuadas que carecen de actividad de nucleasa. Las muestras se pusieron luego en un baro de agua hirviendo durante 15 min para inactivar la proteinasa y desnaturalizar el ADN. Esto tambien precipita los componentes innecesarios. Luego se centrifugan las muestras a 14.000 x g en una microcentrifugadora Eppendorf a temperatura ambiente durante 5 min para eliminar residuos celulares. Los materiales sobrenadantes que contenian ADN en bruto se pasaron a tubos frescos y se congelaron a -20OC hasta que se usaron en reacciones de RCP.
Alternativamente se puede preparar ADN celular total a partir de celulas crecidas en placa usando el kit QlAamp Tissue Kit de Qiagen (Santa Clarita, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 3 - Clonaci6n molecular y anmlisis de secuencia de ADN de un nuevo gen de toxina SUP de la cepa KB59A4-6 de Bacillus thuringiensis
Se prepar6 ADN celular total de la cepa KB59A4-6 de Bacillus thuringiensis crecida a una densidad 6ptica de 0,50,8 a 600 nm de luz visible en caldo Luria Bertani (LB). Se extrajo ADN usando el kit Qiagen Genomic-tip 500 G/ki y el set Genomic DNA Buffer de acuerdo con el protocolo para bacterias Gram positivas (Qiagen lnc.; Valencia CA). Se digiri6 ADN con HinDlll y se trat6 en geles de agarosa al 0,7% para analisis de transferencia Southern por procedimientos estandar (Maniatis y otros). Usando los oligos "3A-atg (GCTCTAGAAGGAGGTAACTTATGAA CAAGAATAATACTAAATTAAGC) y "3A-taa" (GGGGTACCTTACTTAATAGAGACATGG) se obtuvo un amplic6n de RCP que contenia genes de tipo SUP (SEC lD NO.1) de ADN gen6mico de Javelin-90. Este fragmento de ADN se purific6 en gel y se marc6 con 32P-dCTP radiactivo usan el kit Prime-lt ll Random Primer Labeling kit (Stratagene) para uso como sonda. La hibridaci6n de los filtros de transferencia Southern se realiz6 en una soluci6n 6X de SSPE, 5X de soluci6n de Denhardt, 0,1% de SDS, 0,1 mg/ml de ADN desnaturalizado a 42OC durante la noche en un baro de agua de sacudidas. Los filtros se lavaron posteriormente en SSPE 1 X y 0,1% de SDS a 25O una vez y adicionalmente dos veces a 37OC. Los filtros hibridados se expusieron luego a pelicula de rayos X a -80OC. Se identific6 que un fragmento HinDlll de aproximadamente 1 kbp de ADN KB59A4-6 gen6mico hibrid6 a la sonda Javelin 90 SUP.
Se construy6 como sigue una biblioteca lambda de ADN KB59A4-6 gen6mico. Se digiri6 parcialmente ADN con
Sau3A y se fraccion6 en tamaros sobre geles de agarosa. Se cort6 la regi6n del gel que contenia fragmentos entre 9,0 y 23 kbp y se aisl6 el ADN por electroeluci6n en tap6n 0,1X TAE y seguidamente se purific6 sobre columnas Elutip-d (Schleicher y Schuell, Keene, NH). Se ligaron los insertos de ADN fraccionados en tamaros en Lambda-Gem11 digerido con BamHl (Promega) y se empaquetaron los fagos recombinantes usando Gigapacklll XL Packing Extract (Stratagene). Se cultivaron los fagos sobre celulas VCS257 de E. coli para exploraci6n por hibridaci6n. Las placas se transfirieron a filtros de nailon y se secaron en vacio a 80OC. La hibridaci6n se realiz6 luego con sonda de gen Javalib 90 Sup como se ha descrito antes. Se seleccion6 usando una pipeta Pasteur una placa que dio seral positiva, obteniendose un tap6n. El tap6n se macer6 durante la noche en 1 ml de tamp6n SM + 10uL de CHCl3. De los lisados liquidos de KW251 de E. Coli infectados con este fago se obtuvieron preparaciones de ADN de fago a gran escala (Maniatis y otros).
El gen de toxina de KB59A4-6 se subclon6 en el vector transportador de E. coli B. thurigiensis, pHT370 (O. Arantes y D. Lereclus, 1991, Gene 108: 115-119) en un fragmento Sacl/Xbal de aproximadamente 5,5 kbp identificado por hibridaci6n Southern. Este subcl6n de plasmido se design6 pMYC2473. Las celulas XL10-Gold de E. coli recombinantes (Stratagene) que contienen esta construcci6n se designan MR993. El gen de toxina insecticida se secuenci6 por desplazamiento de cebador usando el plasmido pMYC2473 y amplicones de RCP como plantillas de ADN. Las reacciones de secuenciaci6n se realizaron usando el kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction de PE Applied Biosystems y en un secuenciador automatico ABl PRlSM 377. Los datos de secuencia se analizaron usando software PE ABl PRlSM 377 de recogida, factura y autoensamblaje. La secuencia de ADN y la secuencia de peptido deducida de la toxina de KB59A4-6 se expresan como nuevas secuencias SEC lD NOS. 53 y 54, respectivamente.
Se deposit6 un subcultivo de MR993 en la colecci6n permanente de la Patent Culture Collection (NRRL), Regional Center Research, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604 USA el 4 de mayo de 1999. El numero de acceso es NRRL B-30125.
Ejemplo 4 -Biensayos de la actividad frente a lepidopteranos y coleopteranos
Las actividad biol6gica de las toxinas y aislados de la presente invenci6n se puede confirmar usando procedimientos estandar de bioensayos. Un ensayo de esta clase es el ensayo de larva de capullos-gusano el6tero (Heliothis virescens [Fabricius] y Helicoverpa zea [Boddie]). Los bioensayos de Lepidoptera se hicieron con aplicaci6n superficial a dieta de insectos artificial o incorporaci6n de dieta de muestras. Todos los insectos lepidopteranos se ensayaron desde la etapa neonatal a la segunda muda. Todos los ensayos se realizaron en dieta artificial de harina de soja tostada o dieta artificial de larva Agrotis negra (BioServ, Frenchtown, NJ),
La incorporaci6n de dieta se puede realizar mezclando las muestras con dieta artificial en una proporci6n de 6 ml de suspensi6n mas 54 ml de dieta. Despues de agitar con vortex, esta mezcla se vierte en bandejas de plastico con pocillos en compartimientos de 3 ml (Nutrend Container Corporation, Jacksonville, Fl). Como control sirvi6 un blanco de agua que no contenia B.t. Se ponen sobre la mezcla de dieta larvas de primera muda (USDA-ARS, Stonweville, MS). Se sellan los pocillos con hoja Mylar (ClearLam Packaging, lL) usando un calentador y se hicieron varios agujeros finos en cada pocillo para intercambio de gas. Las larvas se tuvieron a 25OC durante 6 dias en una sala de mantenimiento 14:10 (luz:oscuridad). Despues de 6 dias se registran la mortalidad y la atrofia,
El bioensayo por el procedimiento de carga en la parte superior utiliza la misma muestra y las mismas preparaciones de dieta anteriores. Las muestras se aplican a la superficie de la dieta de insecto. En una realizaci6n especifica, el area superficial es de 0,3 a aproximadamente 0,8 cm2 dependiendo del tamaro de la bandeja y se usaron placas de cultivo de 96 pocillos ademas del formato indicado antes. Despues de la aplicaci6n, las muestras se dejaron secar al aire antes de infestarlas con insecto. Como control puede servir un blanco de agua que no contiene B.t. A cada pocillo tratado se aplican huevos y se sellaron con hoja Mylar (ClearLam Packaging, lL) usando un calentador y se hacen agujeros finos en cada pocillo para que haya intercambio de gas. Los bioensayos se mantienen a 25OC durante 7 dias en una sala de mantenimiento 14:10 (luz:oscuridad). Al final de cada bioensayo se registran la mortalidad y la atrofia,
Otro ensayo util de acuerdo con la presente invenci6n es el ensayo del gusano de raiz de maiz occidental. Las muestras se pueden someter a bioensayo frente a larvas de gusano de raiz de maiz occidental (Diabrotica virgifera virgifera) mediante carga de la muestra en la parte superior sobre una dieta artificial sobre base de agar en cuantia de 160 ml/cm2. La dieta artificial se puede dispensar en pocillos de 0,78 cm2 en placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos o similares y se deja que endurezca. Despues de que solidifique la dieta, se dispensan las muestras con pipeta sobre la superficie de la dieta. Luego se evapora de la superficie el exceso de liquido antes de transferir con cepillo de pelo de camello aproximadamente tres larvas neonatas por pocillo sobre la superficie de la dieta. Para impedir que se escape el insecto durante el intercambio de gas, los pocillos se sellan por calor con una pelicula de poliester de 0,05 mm con adhesivo 27HT (Oliver Productos Company, Grand Rapids, Michigan). Los bioensayos se hacen en la oscuridad a 25OC y se puntua la mortalidad despues de cuatro dias.
Los expertos en la tecnica pueden hacer analogos bioensayos para estimar la actividad frente a otras plagas tales como larva Agrotis negra (Agrotis ipsilon).
Las toxinas de la invenci6n tener utilidad respecto a las plagas de lepidopteranos dadas en la Tabla 2.
La actividad se puede confirmar facilmente usando los bioensayos indicados aqui, adaptaciones de etos ensayos y/u otros bioensayos bien conocidos por los expertos en la tecnica.
Tabla 2
Especies diana de plagas
Nombre comun
Nombre latino
Taladro del maiz europeo Taladro del maiz europeo resistente a toxinas de la clase CrylA Larva Agrotis Cogollero del maiz Barredor grande del maiz Gusano el6tero Oruga de capullo de tabaco Oruga del capullo de tabaco resistente a toxinas de la clase CrylA Mariposa del girasol Mariposa del girasol bandeada Cuncunilla verde Espilosoma Gardama berta Palomilla dorso de diamante Palomila dorso de diamante
Ostrinia nubilatis Ostrinia nubilatis Agrotis ipsilon Spodoptera frugiperda Diatraea grandiosella Helicoverpa zea Heliothis viriscens Heliothis viriscens Homeosoma ellectellum Cochylis hospes Rachiplusia nu Spilosoma virginica Mamestra configurata Plutella xylostels Plutella xylostells
Ejemplo 5 -Inserci6n de genes de toxina en plantas
Un aspecto de la presente invenci6n es la transformaci6n de plantas con genes que codifican la toxina insecticida de la presente invenci6n. Las plantas transformadas son resistentes al ataque por la plaga diana.
Los genes que codifican toxinas plaguicidas de acuerdo con la indicado aqui se pueden insertar en celulas de
15 plantas usando una variedad de metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, para la preparaci6n de la inserci6n de genes foraneos en plantas superiores hay disponibles un gran numero de vectores de clonaci6n que comprenden un sistema de replicaci6n en E. coli y un marcador que permite la selecci6n de las celulas transformadas. Entre los vectores figuran, por ejemplo, pBR322, la serie pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. Consecuentemente, la secuencia que codifica la toxina de Bacillus se puede insertar en el vector en un sitio de
20 restricci6n adecuado. El plasmido resultante se usa para transformaci6n en E. coli. Las celulas de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, luego se cosechan y lisan. Se recupera el plasmido. Generalmente, el analisis de secuencias, el analisis de restricci6n, la electroforesis y otros metodos biol6gicos bioquimicosmoleculares se realizan como metodos de analisis. Despues de cada manipulaci6n, la secuencia de ADN usada se puede escindir y unir a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plasmido se puede clonar en los
25 mismos o diferentes plasmidos. Dependiendo del procedimiento de inserci6n de los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se usa el plasmido Ti o Ri para la transformaci6n de la celula de la planta, se ha de unir al menos el borde derecho, a menudo el borde derecho y el izquierdo de ADN-T del plasmido Ti o Ri como regi6n de flanqueo de los genes a insertar.
Se ha investigado intensivamente el uso de ADN-T para la transformaci6n de celulas de plantas y se ha descrito
suficientemente en la PE 120 516; por Hoekema (1985) en The Binary Plant �ector System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, capit. 5; Fraley y otros, Crit. Rev. Plant Sci, 4:1-46; y An y otros, (1985) EMBO J. 4:277-287.
Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma, es relativamente estable en el y, como regla, no vuelve a salir. Normalmente contiene un marcador de selecci6n que confiere a las celulas de la planta transformada resistencia a un biocida o un antibi6tico, tal como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o cloranfenicol, entre otros. Consecuentemente, el marcador individualmente empleado debe permitir la selecci6n de celulas transformadas preferentemente a celulas que no contienen el ADN insertado.
Para insertar ADN en un huesped planta hay disponibles un gran numero de tecnicas, Entre esas tecnicas figuran transformaci6n de ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformaci6n, fusi6n, inyecci6n, biolistica (bombardeo de microparticulas) o electroporaci6n, asi como otros posibles metodos. Si para la transformaci6n se usan agrobacterias, el ADN a insertar se ha de clonar en plasmidos especiales, a saber, en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar en el plasmido Ti o Ri por recombinaci6n hom6loga debido a las secuencias que son hom6logas a secuencias en el ADN-T. El plasmido Ri o Ti tambien comprende la regi6n vir necesaria para transferir el ADN-T. Los vectores intermedios no pueden replicarse en si en agrobacterias. El vector intermedio puede transferirse a Agrobacterium tumefaciens mediante un plasmido cooperador (conjugaci6n). Los vectores binarios pueden replicarse en si en E. coli y en agrobacterias. Comprenden un gen marcador de selecci6n y un acoplador o poliacoplador que estan enmarcados por las regiones derecha e izquierda de ADN-T. Pueden transferirse directamente a agrobacterias (Holsters y otros, [1978] Mol. Gen. Genet. 163:181-187). La agrobacteria usada como celula huesped ha de comprender tambien un plasmido que presenta una regi6n vir. La regi6n vir es necesaria para la transferencia de ADN-T a la celula de la planta. Puede estar contenido ADN-T adicional. La bacteria asi transformada se puede usar para la transformaci6n de celulas de plantas. Los explantes de plantas pueden cultivarse ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para transferir el ADN a la celula de la planta. Se pueden recuperar luego plantas enteras del material de planta infectado (por ejemplo trozos de hojas, segmentos del tallo, raices, pero tambien protoplastos o celulas cultivadas en suspensi6n) en un medio adecuado, que puede contener antibi6ticos o biocidas para selecci6n. Las plantas asi obtenidas se pueden luego ensayar en cuanto a la presencia de ADN insertado. No se demanda nada especial de los plasmidos en el caso de inyecci6n y electroporaci6n. Es posible usar plasmidos corrientes tales como, por ejemplo, derivados de pUC. En la transformaci6n biolistica se puede emplear ADN de plasmido o ADN lineal.
Las celulas transformadas se regeneran a plantas morfol6gicamente normales de la manera usual. Si la transformaci6n implica una celula de linea de germen, el ADN insertado y el (los) correspondiente(s) rasgo(s) fenotipicos(s) sera(n) transmitido(s) a las plantas de la progenie. Tales plantas se pueden crecer de manera normal y se pueden cruzar con plantas que tienen los mismos factores hereditarios u otros factores hereditarios. Los individuos hibridos resultantes tienen las correspondientes propiedades fenotipicas.
En una realizaci6n preferente de la presente invenci6n, las plantas se trasformaran con genes en los que se ha optimizado el uso de cod6n para plantas. Vease, por ejemplo, patente U.S. nO. 5.380.831. Tambien, ventajosamente se usaran plantas que codifican una toxina truncada. Tipicamente, la toxina truncada codificara de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de la toxina de longitud entera. Los procedimientos para crear genes sinteticos de Bacillus para uso en plantas son conocidos en la tecnica.
LlSTA DE SECUENClAS

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una proteina que es activa frente a una plaga de lepidopteranos, que tiene una identidad de como minimo 95% con la secuencia de aminoacidos de la SEC lD NO. 3
    5 2. Una proteina de acuerdo con la reivindicaci6n 1, que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEC lD NO.
  2. 3.
  3. 3.
    Un polinucle6tido que codifica una proteina de la reivindicaci6n 1 o la reivindicaci6n 2.
  4. 4.
    Un polinucle6tido de la reivindicaci6n 3, que comprende la secuencia de nucle6tidos de la SEC. lD NO. 2.
  5. 5.
    Una celula microbiana o de planta que comprende un polinucle6tido de la reivindicaci6n 3 o la reivindicaci6n 4.
    10 6. Una celulas de acuerdo con la reivindicaci6n 5, que es una celula bacteriana.
  6. 7.
    Una planta que comprende un polinucle6tido de la reivindicaci6n 3 o la reivindicaci6n 4.
  7. 8.
    Un procedimiento para controlar una plaga de lepidopteranos, que comprende poner en contacto la plaga con una proteina de la reivindicaci6n 1 o la reivindicaci6n 2.
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