MXPA00010890A

MXPA00010890A - Toxinas plaguicidas y secuencias de nucleotidos que codifican para estas toxinas.

Info

Publication number: MXPA00010890A
Application number: MXPA00010890A
Authority: MX
Inventors: H Ernest Schnepf
Original assignee: Mycogen Corp
Priority date: 1998-05-06
Filing date: 1999-05-06
Publication date: 2002-04-24
Also published as: HUP0101991A2; US20020100080A1; TR200003264T2; WO1999057282A3; AU759579B2; CA2327266A1; CN1296482C; CA2327266C; EP1944372A2; KR100763074B1; US6656908B2; AU3888399A; BR9915969A; HUP0101991A3; JP2002513574A; EP1944372B1; EP1075522A2; BR9915969B1; AR016989A1; US6242669B1

Abstract

Se describen y reclaman aislados de Bacillus thuringiensis, toxinas plaguicidas, genes y sondas y cebadores de nucleotidos novedosos para la identificacion de genes que codifican para toxinas activas contra plagas; los cebadores son otiles en tècnicas de PCR para producir fragmentos gènicos que son característicos de genes que codifican para estas toxinas,la presente invencion provee familias completamente nuevas de toxinas que pueden obtenerse de los sobrenadantes de cultivos de Bacillus.

Description

TOXINAS PLAGUICIDAS Y SECUENCIAS DE NUCLEOTIPOS QUE CODIFICAN PARA ESTAS TOXINAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los insectos y otras plagas cuestan a los granjeros miles de millones de dólares anualmente en pérdidas de cultivo y a costa de mantener a estas plagas bajo control. Las pérdidas ocasionadas por plagas de insectos en ambientes de producción agrícola ¡ncluyen disminución en el rendimiento del cultivo, calidad reducida del cultivo y costos de cosecha incrementados. Los métodos de cultivo, tales como la rotación de cultivos y la aplicación de altos niveles de nitrógeno para estimular el crecimiento de un sistema de raíz adventicio, han resuelto parcialmente los problemas ocasionados por las plagas agrícolas. Las demandas económicas en la utilización de suelo agrícola restringen el uso de la rotación de cultivos. Además, las características de algunos insectos para sobrevivir en el invierno interrumpen las rotaciones de cultivos en algunas áreas. De esta manera, se confía principalmente en el uso de insecticidas químicos para garantizar el nivel de control deseado. Los insecticidas son rociados sobre, o incorporados en el suelo. El uso de insecticidas químicos tiene varias desventajas. El uso continuo de insecticidas ha permitido la creación de insectos resistentes. Situaciones tales como poblaciones de larvas extremadamente altas, lluvias intensas y una calibración inadecuada del equipo de aplicación de insecticida pueden dar como resultado un control deficiente. El uso de insecticidas comúnmente genera preocupaciones ambientales tales como la contaminación del suelo y tanto de los suministros de agua en superficie como subterráneos. El público también se ha preocupado acerca de la cantidad de químicos sintéticos residuales que pudieran encontrarse en alimentos. El trabajar con insecticidas también puede presentar riesgos a las personas que los apliquen. Por lo tanto, los plaguicidas químicos sintéticos han sido sometidos a escrutinio cada vez más, y de manera correctiva, para verificar sus potenciales consecuencias ambientales tóxicas. Ejemplos de plaguicidas químicos sintéticos ampliamente usados incluyen los organocloros, por ejemplo, DDT, mirex, kepone, lindano, aldrina, clordano, aldicarb y dieldrina; los organofosfatos, por ejemplo, clorpirifos, paratión, maliatión y diazinona; y los carbamatos. Nuevas restricciones estrictas en el uso de plaguicidas y la eliminación de algunos plaguicidas efectivos del mercado podrían limitar las opciones económicas y efectivas para controlar plagas dañinas y costosas. Debido a los problemas asociados con el uso de plaguicidas químicos sintéticos orgánicos, existe una clara necesidad por limitar el uso de estos agentes y una necesidad por identificar agentes de control alternativos. Los niveles de químicos tóxicos en el ambiente podrían reducirse mediante el reemplazo de plaguicidas químicos sintéticos, o la combinación de estos agentes con plaguicidas biológicos.

Un agente plaguicida biológico que adquiere cada vez más popularidad es el microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t). El microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t) es una bacteria Gram-positiva que forma esporas. La mayoría de las cepas de B. t. no exhiben actividad plaguicida. Algunas cepas de ß. t. producen, y pueden caracterizarse por, inclusiones de proteínas cristalinas paraesporales. Estas inclusiones comúnmente aparecen microscópicamente como cristales de formas distintas. Algunas proteínas de B. t. son altamente tóxicas para plagas, tales como insectos, y son específicas y son efectivas en su actividad tóxica. Ciertas proteínas de B. t. insecticidas están asociadas con las inclusiones. Estas "d-endotoxinas", son diferentes de las exotoxinas, las cuales tienen una gama de hospederos no específica. Otras especies de Bacillus producen también proteínas plaguicidas. Se han aislado y secuenciado ciertos genes de toxina de Bacillus, y ciertos productos a base de ADN recombinante se han producido y aprobado para su uso. Además, con el uso de técnicas de ingeniería genética, se encuentran en desarrollo enfoques nuevos para suministrar estas toxinas a ambientes agrícolas. Estos enfoques incluyen en el uso de plantas genéticamente manipuladas con genes de toxinas para resistencia a insectos y el uso de células microbianas intactas y estabilizadas como vehículos de suministro de toxinas. De esta manera, los genes de toxina de Bacillus aislados están adquiriendo valor comercial. Hasta los últimos quince años, el uso comercial de plaguicidas de B. t. ha estado en gran parte restringido a una gama estrecha de plagas de lepidópteros (orugas). Las preparaciones de las esporas y cristales de B. thuringiensis subesp. kurstaki se han usado durante muchos años como insecticidas comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo, B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 produce una d-endotoxina cristalina que es tóxica para las larvas de un número de insectos lepidópteros. En los últimos años, sin embargo, los investigadores han descubierto plaguicidas de B. t. con especificidades para una gama mucho más amplia de plagas. Por ejemplo, otras especies de S. t, a saber, israelensis y morrísoni (a.k.a. tenebrionis, a.k.a. B. t. M-J, a.k.a. ß. t. san diego) se han usado comercialmente para controlar insectos de los ordenes de dípteros y coleópteros. Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, según se informa, es activo contra dos escarabajos del orden de los coleópteros. Estos son el escarabajo de la papa de Colorado, Leptinotarsa decemlineata y Agelastica alni. Más recientemente, se han identificado nuevas subespecies de B. t. y se han aislado los genes responsables de las proteínas activas de d-endotoxina. Hofte y Whiteley clasificaron genes de proteínas cristalinas de B. t. en cuatro clases principales (Hófte, H., H. R. Whiteley (1989) Microbiological Reviews 52(2): 242-255). Las clases eran Cryl (específica de lepidópteros), Cryll (específica de lepidópteros y dípteros), Cryl 11 (específica de coleópteros) y CrylV (específica de dípteros). Se ha informado el descubrimiento de cepas específicamente tóxicas para otras plagas. Se han propuesto CryV para designar una clase de genes de toxinas que es específica de nematodos.

La nomenclatura y el esquema de clasificación de 1989 de Hófte y Whiteley para proteínas de cristal se basó tanto en la secuencia de aminoácidos deducida como en la gama de hospederos de la toxina. Ese sistema se adaptó para cubrir 14 tipos diferentes de genes de toxinas que se dividieron en cinco clases principales. El número de genes de proteína de cristal de Bacillus thuringiensis secuenciados rebasa actualmente los 50. Se ha propuesto un esquema de nomenclatura revisado que se basa únicamente en la identidad del aminoácido (Crikmore et al.

[1996] Sociedad para la Patología de Invertebrados, 29 Reunión Anual, Tercer Coloquio Internacional de Bacillus thuringiensis, Universidad de Córdoba, Córdoba, España, septiembre 1-6, 1996, resumen). Se ha conservado la nemónica "ery" para todos los genes de toxinas, excepto cytA y cytB, los cuales permanecen como una clase separada. Los números romanos se han cambiado por números arábigos en el rango primario, y se han retirado los paréntesis en el rango terciario. Se han conservado muchos de los nombres originales, con las excepciones indicadas, aunque se ha reclasificado otro número. Muchos otros genes de ß. t. Han sido ahora identificados. Los documentos WO 94/21795, WO 96/10083 y WO 98/4413J, y Estruch, J.J. et al (1996) PNAS 93: 5389-5394, describen toxinas Vip1A(a), Vip1A(b), Vip2A(a), Vip2A(b), Vip3A(a) y Vip3A(b) obtenidas de microbios Bacillus. Se informa que esas toxinas se producen durante el crecimiento celular vegetativo y en consecuencia se denominaron proteínas insecticidas vegetativas (VIP). Se informó la actividad de estas toxinas contra ciertas plagas de lepidópteros y ciertas plagas de coleópteros. El documento WO 98/18932 describe nuevas clases de toxinas plaguicidas. Los obstáculos para el uso agrícola exitoso de toxinas de Bacillus incluyen el desarrollo de resistencia a toxinas de ß. t. por insectos. Además, ciertos insectos pueden ser refractarios a los efectos de las toxinas de Bacillus. Estos últimos incluyen insectos tales como gusano de la cápsula del algodón y gusano negro, así como insectos adultos de la mayoría de las especies que hasta la fecha no han demostrado sensibilidad significativa aparente a d-endotoxinas de B. t. Aunque las estrategias de manejo de resistencia en tecnología de plantas transgénicas de B. t. se han vuelto de gran interés, permanece una gran necesidad por desarrollar genes adicionales que puedan ser expresados en plantas para poder controlar en forma efectiva varios insectos. La presente solicitud provee nuevas clases de toxinas y genes, además de las ya descritas en WO98/18932, y las cuales son distintas de las descritas en WO 94/21795, WO 96/10083, WO/44137 y Estruch eí al..

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con materiales y métodos útiles en el control de plagas no de mamíferos, y en particular, plagas de plantas. En una modalidad, la presente invención provee nuevos aislados de ß. t. que tienen actividad ventajosa contra plagas no de mamíferos. En otra modalidad, la presente invención provee nuevas toxinas útiles para el control de plagas no de mamíferos. En una modalidad preferida, estas plagas son lepidópteros y/o coleópteros. Las toxinas de la presente invención incluyen d-endotoxinas, así como también toxinas solubles que pueden obtenerse del sobrenadante de cultivos de Bacillus. La presente invención además provee secuencias de nucleótidos que codifican para las toxinas de la presente invención. La presente invención además provee secuencias de nucleótidos y métodos útiles en la identificación y caracterización de genes que codifican para las toxinas plaguicidas. En una modalidad, la presente invención se relaciona con secuencias de nucleótidos de carácter único, que son útiles como sondas de hibridación y/o cebadores en técnicas de PCR. Los cebadores producen fragmentos genéticos característicos, que pueden usarse en la identificación, caracterización y/o aislamiento de genes de toxinas específicos. Las secuencias de nucleótidos de la presente invención codifican para toxinas que son distintas de las toxinas que se describieron anteriormente. En una modalidad específica, la presente invención provee nuevas clases de toxinas que tiene actividades plaguicidas ventajosas. Estas clases de toxinas pueden ser codificadas por secuencias de polinucleótidos que se caracterizan por su capacidad de hibridar con ciertas secuencias ejemplificadas, y/o por su capacidad de ser amplificadas por PCR usando ciertos cebadores ejemplificados.

Un aspecto de la presente invención se relaciona con la identificación y caracterización de familias completamente nuevas de toxinas de Bacillus thuringiensis, que tienen propiedades plaguicidas ventajosas. La presente invención incluye nuevas clases de genes y toxinas referidas en la presente como MIS-7 y MIS-8. Se describen también genes y toxinas de las clases novedosas WAR y SUP. Ciertos genes y toxinas MIS-1 y MIS-2 se caracterizan también en la presente. Estas familias de toxinas, y los genes que las codifican, se pueden caracterizar en términos de, por ejemplo, el tamaño de la toxina o gen, el ADN o la secuencia de aminoácidos, la actividad plaguicida, y/o la reactividad de anticuerpos. Con respecto a los genes que codifican para las nuevas familias de toxinas de la presente invención, la presente descripción provee sondas de hibridación y cebadores de PCR de carácter único, que se pueden usar para identificar y caracterizar ADN dentro de cada una de las familias ejemplificadas. En una modalidad de la presente invención, los aislados de Bacillus se pueden cultivar bajo condiciones que producen una alta multiplicación del microbio. Después de tratar el microbio para proveer ácido nucleico genómico de cadena sencilla, el ADN se puede poner en contacto con los cebadores de la invención, y se pueden someter a amplificación de PCR. Los fragmentos característicos de los genes que codifican para las toxinas serán amplificados por el procedimiento, identificando así la presencia del(los) gen(es) que codifica(n) a las toxinas.

Otro aspecto de la presente invención es el uso de las secuencias de nucleótidos descritas, como sondas para detectar genes que codifican para toxinas de Bacillus que son activas contra plagas. Otros aspectos de la presente invención ¡ncluyen los genes y aislados identificados usando los métodos y secuencias de nucleótidos que se describen en la presente. Los genes así identificados codifican para las toxinas activas contra plagas. Asimismo, los aislados tendrán actividad contra estas plagas. En una modalidad preferida, esas plagas son plagas de lepidópteros o coleópteros. En una modalidad preferida, la presente invención se relaciona con células vegetales transformadas con por lo menos una secuencia de polinucleótidos de la presente invención, de manera que las células de las plantas transformadas expresen toxinas plaguicidas en tejidos consumidos por las plagas objetivo. Como se describe en la presenie, las toxinas útiles de conformidad con la presente invención puede ser toxinas quiméricas producidas combinando porciones de múltiples toxinas. Además, las mezclas y/o combinaciones de toxinas se pueden usar de conformidad con la presente invención. La transformación de plantas con las construcciones genéticas que se describen en la presente se puede efectuar usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, y típicamente involucrarían la modificación del gen para optimizar la expresión de la toxina en plantas.

Alternativamente, los aislados de Bacillus de la presente invención, o los microbios recombinantes que expresan las toxinas que se describen en la presente, se pueden usar para controlar plagas. En este aspecto, la invención incluye el tratamiento de células de Bacillus sustancialmente intactas, y/o células recombinantes que contienen a las toxinas expresadas de la invención, tratadas para prolongar la actividad plaguicida cuando las células sustancialmente intactas se aplican al medio ambiente de una plaga objetivo. La célula tratada actúa como un revestimiento protector para la toxina plaguicida. La toxina se vuelve activa con la ingesta por parte de un insecto objetivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO. 1 es una secuencia de nucleótidos que codifica para una toxina de la cepa Javelin 1990. de B. t. SEQ ID NO. 2 es una secuencia de aminoácidos para la toxina Javelin 1990. SEQ ID NO. 3 es un cebador hacia adelante usado de conformidad con la presente invención SEQ ID NO. 4 es un cebador hacia atrás usado de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 5 es una secuencia de nucleótidos de un gen de toxina de la cepa PS66D3 de B. t.

SEQ ID NO. 6 es una secuencia de aminoácidos de la toxina 66D3. SEQ ID NO. 7 es una secuencia de nucleótidos de un gen de toxina MIS de la cepa PS177C8 de ß. t. SEQ ¡D NO. 8 es una secuencia de aminoácidos de la toxina 177C8-MIS. SEQ ID NO. 9 es una secuencia de nucleótidos de un gen de toxina de la cepa PS 17718 de ß. t. SEQ NO. 10 es una secuencia de aminoácidos de la toxina 17718. SEQ ID NO. 11 es una secuencia de nucleótidos que codifica para un gen de toxina 177C8-WAR de la cepa PS177C8 de B. t. SEQ ID NO. 12 es una secuencia de aminoácidos de una toxina 177C8-WAR de la cepa PS177C8 de B. t. SEQ ID NOS. 13-21 son cebadores usados de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 22 es el complemento inverso del cebador de SEQ ID NO. 14 SEQ ID NO. 23 es el complemento inverso del cebador de SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 24 es el complemento inverso del cebador de SEQ ID NO. 17 SEQ ID NO. 25 es el complemento inverso del cebador de SEQ ID NO. 18 SEQ ID NO. 26 es el complemento inverso del cebador de SEQ ID NO. 19 SEQ ID NO. 27 es el complemento inverso del cebador de SEQ ID NO. 20 SEQ ID NO. 28 es el complemento inverso del cebador de SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO. 29 es un cebador hacia adelante MIS-7. SEQ ID NO. 30 es un cebador hacia atrás MIS-7. SEQ ID NO. 31 es un cebador hacia adelante MIS-8. SEQ ID NO. 32 es un cebador hacia atrás MIS-8. SEQ ID NO. 33 es una secuencia de nucleótidos de un gen de toxina MIS-7 designado 157C1-A de la cepa PS157C1 de ß. t. SEQ ID NO. 34 es una secuencia de aminoácidos de una toxina MIS-7 designada 157C1-A de la cepa PS157C1 de ß. t. SEQ ID NO. 35 es una secuencia de nucleótidos de un gen de toxina MIS-7 de la cepa PS201Z de B. t. SEQ ID NO. 36 es una secuencia de nucleótidos de un gen de toxina MIS-8 de la cepa PS31 F2 de B. t. SEQ ID NO. 37 es una secuencia de nucleótidos de un gen de toxina MIS-8 de la cepa PS185Y2 de B. t.

SEQ ID NO. 38 es una secuencia de nucleótidos de un gen de toxina MIS-1 de la cepa PS33F1 de ß. t. SEQ ID NO. 39 es un cebador MIS para usarse de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 40 es un cebador MIS para usarse de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 41 es un cebador WAR para usarse de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 42 es un cebador WAR para usarse de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 43 es una secuencia de nucleótidos parcial para un gen MIS-7 de PS205C. SEQ ID NO. 44 es una secuencia de aminoácidos parcial para una toxina MIS-7 de PS205C. SEQ ID NO. 45 es una secuencia de nucleótidos parcial para un gen WAR de PS205C. SEQ ID NO. 46 es una secuencia de aminoácidos parcial para una toxina WAR de PS205C. SEQ ID NO. 47 es una secuencia de nucleótidos para un gen MIS-8 de PS31 F2. SEQ ID NO. 48 es una secuencia de aminoácidos para una toxina MIS-8 de PS31 F2.

SEQ ID NO. 49 es una secuencia de nucleótidos para un gen WAR de PS31 F2. SEQ ID NO. 50 es una secuencia de aminoácidos para una toxina WAR de PS31 F2. SEQ ID NO. 51 es un cebador SUP para usarse de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 52 es un cebador SUP para usarse de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 53 es una secuencia de nucleótidos para un gen SUP de KB59A4-6. SEQ ID NO. 54 es una secuencia de aminoácidos para una toxina SUP de KB59A4-6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con materiales y métodos para el control de plagas no de mamíferos. En modalidades específicas, la presente invención se relaciona con nuevos aislados de Bacillus thuringiensis y toxinas que poseen actividad contra lepidópteros y/o coleópteros. La presente invención además se relaciona con nuevos genes que codifican para toxinas plaguicidas, y con nuevos métodos para identificar y caracterizar genes de Bacillus que codifican para toxinas con propiedades útiles. La presente invención se relaciona no sólo con las secuencias de polinucleótidos que codifican para estas toxinas, sino también con el uso de estas secuencias de polinucleótidos para producir hospederos recombinantes que expresan las toxinas. Las proteínas de la presente invención son distintas de las toxinas de proteínas que se han aislado previamente de Bacillus thuringiensis. Los aislados de ß. t. útiles de conformidad con la presente invención se han depositado en la colección permanente de la Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604 USA. Los números de depósito de cultivo de las cepas de ß. t. son los siguientes: CUADRO 1 Los cultivos que se han depositado para los propósitos de esta solicitud de patente se depositaron bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo está disponible durante la suspensión de esta solicitud de patente, para una persona determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas con derecho al mismo bajo 37 CFR 1.14 y 35 U.S.C. 122. Los depósitos estarán disponibles como lo requieren las leyes de patentes extranjeras en países en donde se presentan las contrapartes de la solicitud presente o su progenie. Sin embargo, debería entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para la práctica de la presente invención en derogación de los derechos de patente concedidos por acción gubernamental. Además, los presentes depósitos de cultivos serán almacenados y se tornarán disponibles al público de conformidad con las especificaciones del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos, es decir, serán almacenados con todo el cuidado necesario para mantenerlos viables y sin contaminar durante un período de por lo menos cinco años después del pedido más reciente para el suministro de una muestra del depósito, y en cualquier caso, durante un período de por lo menos treinta (30) años después de la fecha de depósito o durante la vida de cumplimiento de cualquier patente que puede ser concedida con descripción del(los) cultivo(s). El depositario reconoce el deber de reemplazar el(los) depósito(s) en caso de que el depositario sea incapaz de suministrar una muestra cuando fuera requerido, debido a la condición del depósito. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público de los presentes depósitos de cultivos serán irrevocablemente eliminadas con la concesión de una patente que los describa. Muchas de las cepas útiles de conformidad con la presente invención se encuentran fácilmente disponibles en virtud de la concesión de patentes que describen estas cepas, o por su depósito en colecciones públicas, o por su inclusión en productos comerciales. Por ejemplo, la cepa de B. t. utilizada en el producto comercial, Javelin, y los aislados de HD, se encuentran todos comercialmente disponibles. Los mutantes de los aislados referidos en la presente se pueden obtener por medio de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un mutante esporógeno se puede obtener a través de mutagénesis con sulfonato de etilmetano (EMS) de un aislado. Los mutantes se pueden obtener usando luz ultravioleta y nitrosoguanidina, por procedimientos bien conocidos en la técnica. En una modalidad, la presente invención se relaciona con materiales y métodos que incluyen cebadores de nucleótidos y sondas para aislamiento, caracterización e identificación de genes de Bacillus que codifican para toxinas de proteínas que son activas contra plagas no de mamíferos. Las secuencias de nucleótidos que se describen en la presente también se pueden usar para identificar nuevos aislados de Bacillus plaguicidas. La invención además se relaciona con los genes, aislados y toxinas identificados usando los métodos y materiales que se describen en la presente.

Las nuevas toxinas y secuencias de polinucleótidos que se proveen en la presente se definen de conformidad con varios parámetros. Una característica de las toxinas que se describen en la presente es la actividad plaguicida. En una modalidad específica, estas toxinas poseen actividad contra plagas de coleópteros y/o lepidópteros. Las toxinas y genes de la presente invención se pueden definir adicionalmente por secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Las secuencias de las moléculas se pueden definir en términos de homología con ciertas secuencias ejemplificadas, así como también en términos de la capacidad de hibridar con, o ser amplificados por, ciertos cebadores y sondas ejemplificadas. Las toxinas provistas en la presente también se pueden identificar en base a su inmunorreactividad con ciertos anticuerpos. Un aspecto importante de la presente invención es la identificación y caracterización de nuevas familias de toxinas de Bacillus, y los genes que codifican para dichas toxinas. Estas familias se han designado como MIS-7 y MIS-8. Se describen también en la presente nuevas familias de toxinas tipo WAR y SUP. Las toxinas dentro de estas familias, así como también los genes que codifican para toxinas dentro de estas familias, se pueden identificar sin dificultad como se describe en la presente, por ejemplo, por tamaño, secuencia de ADN o aminoácidos, y reactividad de anticuerpos. Las características de las secuencias de ADN y aminoácidos incluyen homología con secuencias ejemplificadas, capacidad para hibridar con sondas de ADN y capacidad para ser amplificadas con cebadores específicos.

Se caracterizan también en la presente un gen y toxina (los cuales pueden obtenerse de PS33F1 ) de la familia MIS-1 , y un gen y toxina (los cuales pueden obtenerse de PS66D3) de la familia MIS-2. Una familia novedosa de toxinas identificadas en la presente es la familia MIS-7. Esta familia incluye toxinas que se pueden obtener de los aislados de B. t. PS157C1 , PS205C y PC201Z. La presente invención además provee sondas y cebadores para la identificación de genes y toxinas MIS-7. Otra familia novedosa de toxinas identificadas en la presente es la familia MIS-8. Esta familia incluye toxinas que se pueden obtener de los aislados de ß. t. PS31 F2 y PS185Y2. La presente invención además provee sondas y cebadores para la identificación de genes y toxinas MIS-8. En una modalidad preferida, los genes de la familia MIS codifican para toxinas que tienen un peso molecular de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 kDa, y con más prefencia, las toxinas tienen un tamaño de aproximadamente 80 kDa. Típicamente, estas toxinas son solubles y se pueden obtener del sobrenadante de cultivos de Bacillus como se describe en la presente. Estas toxinas poseen toxicidad contra plagas no de mamíferos. En una modalidad preferida, estas toxinas poseen actividad contra plagas de coleópteros. Las proteínas MIS además son útiles debido a su capacidad para formar poros en las células. Estas proteínas se pueden usar con segundas entidades incluyendo, por ejemplo, otras proteínas. Cuando se usan con una segunda entidad, la proteína MIS facilitará la entrada del segundo agente en una célula objetivo. En una modalidad preferida, la proteína MIS interactúa con receptores MIS en una célula objetivo, y causa la formación de poros en la célula objetivo. La segunda entidad puede ser una toxina u otra molécula cuya entrada a la célula se desea. La presente invención además se relaciona con una familia de toxinas designadas como toxinas tipo WAR. Las toxinas WAR típicamente tienen un tamaño de aproximadamente 30 - 50 kDa, y más típicamente, tienen un tamaño de aproximadamente 40 kDa. Típicamente, estas toxinas son solubles y se pueden obtener del sobrenadante de cultivos de Bacillus como se describe en la presente. Las toxinas WAR se pueden identificar con cebadores descritos en la presente, así como también con anticuerpos. Una familia adicional de toxinas provistas de conformidad con la presente invención son las toxinas designadas como toxinas tipo SUP. Típicamente, estas toxinas son solubles y se pueden obtener del sobrenadante de cultivos de Bacillus como se describe en la presente. En una modalidad preferida, las toxinas SUP son activas contra plagas de lepidópteros. Las toxinas SUP típicamente tienen un tamaño de aproximadamente 70 - 100 kDa y, con preferencia, aproximadamente 80 kDa. La familia SUP se ejemplifica en la presente con toxinas del aislado KB59A4-6. La presente invención provee sondas y cebadores útiles para la identificación de toxinas y genes en la familia SUP. La presente invención además provee genes y toxinas de Bacilllus que incluyen genes y toxinas MJS, WAR y SUP.

Las toxinas en las familias MIS, WAR y SUP son todas solubles y se pueden obtener como se describe en la presente, del sobrenadante de cultivos de Bacillus. Estas toxinas se pueden usar solas o en combinación con otras toxinas para controlar plagas. Por ejemplo, las toxinas de las familias MIS se pueden usar en conjunto con toxinas de tipo WAR para lograr el control de plagas, en particular plagas de coleópteros. Estas toxinas se pueden usar, por ejemplo, con d - endotoxinas que se obtienen de aislados de Bacillus. El cuadro 2 provee un resumen de las nuevas familias de toxinas y genes de la presente invención. Ciertas familias MIS se ejemplifican específicamente en la presente por medio de toxinas que se pueden obtener de aislados de ß. t. particulares, como se muestra en el cuadro 2. Los genes que codifican para toxinas en cada una de estas familias se pueden identificar por medio de una variedad de parámetros altamente específicos, incluyendo la capacidad de hibridar con las sondas particulares expuestas en el cuadro 2. La identidad de las secuencias de más de aproximadamente 80% con las sondas expuestas en el cuadro 2, también se puede usar para identificar los genes de las varias familias. Además se ejemplifican pares de cebadores particulares que se pueden usar para amplificar los genes de la presente invención. Una porción de un gen dentro de las familias indicadas típicamente sería amplificable con por lo menos uno de los pares de cebadores enumerados. En una modalidad preferida, la porción amplificada sería de aproximadamente el tamaño de fragmento indicado. Los cebadores que se muestran en el cuadro 2 consisten de secuencias de polinucleótidos que codifican para péptidos como se muestra en el listado de secuencias adjunto a la presente. Los cebadores y sondas adicionales pueden ser construidos con facilidad por los expertos en la técnica, de manera que las secuencias de polinucleótidos alternas que codifican para las mismas secuencias de aminoácidos se puedan usar para identificar y/o caracterizar genes adicionales que codifican para toxinas plaguicidas. En una modalidad preferida, estas toxinas adicionales, y sus genes, podrían obtenerse de aislados de Bacillus.

CUADRO 2 Familia Aislados Sondas Pares de cebadores Tamaño del (SEQ ID NO.) (SEQ ID NOS.) fragmento (nt) MIS-1 PS33F1 37 13 y 22 69 13 y 23 506 14 y 23 458 MIS-2 PS66D3 5 16 y 24 160 16 y 25 239 16 y 26 400 16 y 27 509 16 y 28 703 17 y 25 102 17 y 26 263 17 y 27 372 17 y 28 566 18 y 26 191 18 y 27 300 18 y 28 494 19 y 27 131 19 y 28 325 20 y 28 213 MIS-7 PS205C, 33, 35 29 y 30 598 PS157C1 (157C1-A), PS201Z MIS-8 PS31 F2, 36, 37 31 y 32 585 PS185Y2 SUP KB59A4-6 1 51 y 52 Además, se pueden usar toxinas quiméricas de conformidad con la presente invención. Se han desarrollado métodos para obtener toxinas quiméricas útiles combinando porciones de proteínas de ß. t.. No es necesario que las porciones que se combinan sean plaguicidas en sí, siempre que la combinación de porciones cree una proteína quimérica que sea plaguicida. Esto se puede hacer usando enzimas de restricción, como se describe, por ejemplo, en la patente europea 0228 838, Ge, A. Z., N. L. Shivarova, D. H. Dean (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 4037-4041 ; Ge, A. Z., D. Rivers, R. Milne, D. H. Dean (1991 ) J. Biol. Chem. 266: 17954-17958; Schnepf, H. E., K. Tomczak, J. P. Ortega, H. R. Whiteley (1990) J. Biol. Chem. 265: 20923-20930; Honee, G., D. Convenís, J. Van Rie, S. Jansens, M. Peferoen, B. Visser (1991) Mol. Microbiol. 5: 2799-2806. Alternativamente, se puede usar recombinación usando mecanismos de recombinación celular para lograr resultados similares. Véase, por ejemplo, Caramori, T., A. M. Albertini, A. Galizzi (1991) Gene 98: 37-44; Widner, W. R., H. R. Whiteley (1990) J. Bacteriol. 172: 2826-2832; Bosch, D., B. Schipper, H. van der Kliej, R. A. de Maagd y W. J. Stickema (1994) Biotechnology 12; 915-918. Se conoce en la técnica un número de otros métodos por los cuales se pueden obtener dichos ADNs quiméricos. La presente invención tiene el propósito de incluir proteínas quimpericas que utilizan las nuevas secuencias identificadas en la presente invención. Con las enseñanzas que se proveen en la presente, el experto en la técnica podría producir sin dificultad y usar las varias toxinas y secuencias de polinucleótidos que se describen en la presente.

Genes y toxinas Los genes y toxinas útiles de conformidad con la presente invención incluyen no sólo las secuencias de longitud completa, sino también fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes y proteínas de fusión que retienen la actividad plaguicida caracterizada de las toxinas específicamente ejemplificadas en la presente. Las toxinas y genes quiméricos, producidos por combinación de porciones de más de un gen o toxina de Bacillusx también se pueden utilizar de conformidad con las enseñanzas de la presente invención. Como se usan en la presente, los términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleótidos que codifican para las mismas toxinas o que codifican para toxinas equivalentes que tienen actividad plaguicida. Como se usa en la presente, el término "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma, o esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas objetivo, que las toxinas ejemplificadas. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,605,793 describe métodos para generar diversidad molecular adicional mediante el uso de reensamble del ADN después de fragmentación aleatoria. Resulta evidente para los expertos en la técnica, que los genes que codifican para toxinas activas se pueden identificar y obtener a través de varios medios. Los genes específicos ejemplificados en la presente se pueden obtener de los aislados depositados en un depósito de cultivo como se describió anteriormente. Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, también se pueden construir en forma sintética, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes. Las variaciones de los genes se pueden construir con facilidad usando técnicas estándar para obtener mutaciones puntuales. Además, los fragmentos de estos genes se pueden obtener usando endonucleasas o exonucleasas comercialmente disponibles, de conformidad con procedimientos estándar. Por ejemplo, enzimas tales como Bal31 ó mutagénesis dirigida a sitio, pueden usarse para cortar nucleótidos sistemáticamente de los extremos de estos genes. Además, los genes que codifican para fragmentos activos se pueden obtener usando una variedad de enzimas de restricción. Las proteasas se pueden usar para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas. Las toxinas equivalentes y/o genes que codifican para estas toxinas equivalentes pueden derivar de aislados de Bacillus y/o genotecas de ADN, usando las enseñanzas que se proveen en la presente. Existe un número de métodos para obtener las toxinas plaguicidas de la presente invención. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos para las toxinas plaguicidas que se describen y se reclaman en la presente, para identificar y aislar toxinas de una mezcla de proteínas. Específicamente, se pueden producir anticuerpos para las pociones de las toxinas que son más constantes y más distintas de otras toxinas de Bacillus. Estos anticuerpos luego se pueden usar para identificar específicamente toxinas equivalentes con la actividad característica por inmunoprecipitación, prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), o Western blotting. Los anticuerpos para las toxinas que se describen en la presente, o para toxinas equivalentes, o fragmentos de estas toxinas, se pueden preparar sin dificultad usando procedimientos estándar en esta técnica. Los genes que codifican para estas toxinas luego se pueden obtener del microorganismo. Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad plaguicida de las toxinas ejemplificadas se encuentran dentro del alcance de la presente invención,. Además, debido a la redundancia del código genético, una variedad de diferentes secuencias de ADN puede codificar a las secuencias de aminoácidos que se describen en la presente. Se encuentra dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, la creación de estas secuencias de ADN alternativas que codifican para las mismas, o esencialmente las mismas, toxinas. Estas secuencias de ADN variantes se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Como se usa en la presente, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen sustituciones de aminoácidos, deleciones, adiciones o inserciones, que no afectan materialmente la actividad plaguicida. Los fragmentos que retienen la actividad plaguicida también se incluyen en esta definición. Otro método para la identificación de toxinas y genes de la presente invención es a través del uso de sondas de oligonucleótidos. Estas sondas son secuencias de nucleótidos detectables. Las sondas proveen un rápido método para identificar genes que codifican para toxinas de la presente invención. Los segmentos de nucleótidos que se usan como sondas de conformidad con la invención pueden ser sintetizados usando un sintetizador de ADN y procedimientos estándar. Ciertas toxinas de la presente invención han sido específicamente ejemplificadas en la presente. Debido a que estas toxinas son puramente ejemplares de las toxinas de la presente invención, debería ser evidente sin dificultad que la presente invención comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleótidos que codifican para las toxinas equivalentes) que tienen la misma o similar actividad plaguicida de la toxina ejemplificada, Las toxinas equivalentes tendrán homología de aminoácidos con una toxina ejemplificada. Esta identidad de aminoácidos típicamente será mayor al 60%, con preferencia mayor al 75%, con más preferencia mayor al 80%, con más preferencia mayor al 90%, y puede ser mayor al 95%. Estas identidades son determinadas usando técnicas estándar de alineación. La homología de aminoácidos será más alta en regiones críticas de la toxina que representan la actividad biológica o están involucradas en la determinación de la configuración tridimensional que en última instancia es responsable de la actividad biológica. En este aspecto, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables, y se pueden esperar si estas sustituciones son en regiones que no son decisivas para la actividad, o son sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos pueden colocarse en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras por las cuales un aminoácido de una clase es reemplazado con otro aminoácido del mismo tipo, se encuentran dentro del alcance de la presente invención, siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. El cuadro 3 provee un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

CUADRO 3 En algunos casos, también se pueden hacer sustituciones no conservadoras. El factor decisivo es que estas sustituciones no deben restringir significantemente la actividad biológica de la toxina. Las d-endotoxinas de la presente invención también se pueden caracterizar en términos de la forma y ubicación de las inclusiones de toxinas que se describieron anteriormente. Como se usa en la presente, la referencia a polinucleótidos "aislados" y/o toxinas "purificadas", se refiere a estas moléculas cuando no están asociadas con las otras moléculas con las cuales se encontrarían en la naturaleza. Así, la referencia a "aislada y purificada" significa la intervención de la "mano del hombre", como se describe en la presente. Los genes y las toxinas quiméricos también involucran la "mano del hombre".

Hospederos recombinantes Los genes que codifican para toxinas de la presente invención pueden ser introducidos en una amplia variedad de hospederos microbianos o de plantas. La expresión del gen de la toxina produce, directa o indirectamente, la producción y el mantenimiento del plaguicida. Con hospederos microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios se pueden aplicar al sitio de la plaga, donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el control de la plaga. Alternativamente, el microbio que alberga al gen de toxina puede ser destruido y tratado bajo condiciones que prolonguen la actividad de la toxina y estabilicen a la célula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, luego puede ser aplicada al medio ambiente de la plaga objetivo. Cuando el gen de toxina de Bacillus es introducido mediante un vector adecuado, en un hospedero microbiano, y dicho hospedero se aplica al medio ambiente en un estado viviente, es esencial que se usen ciertos microbios hospederos. Se seleccionan los hospederos de microorganismos que se sabe ocupan la "fitoesfera" (filoplano, filoesfera, rizoesfera, y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de tal manera que sean capaces de competir exitosamente en el medio ambiente particular (cultivos y otros hábitats de insectos) con los microorganismos de tipo silvestre, proveer mantenimiento y expresión estables del gen que expresa el polipéptido plaguicida, y convenientemente, proveer una mejorada protección del plaguicida contra la degradación ambiental y la inactivación. Se sabe que en un gran número de microorganismos habita el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizoesfera (el suelo que rodea las raíces de la planta) de. una amplia variedad de importantes cultivos. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de particular interés microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, en particular levaduras, por ejemplo, los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son de particular interés las especies bacterianas de la fitoesfera, tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus y Azotobacter vinlandii; y especies de lavaduras de la fitoesfera, tales como Rhodotorula rubra, R glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. Son de particular interés los microorganismos pigmentados. Se encuentra disponible una amplia variedad de formas para introducir un gen de Bacillus que codifica para una toxina en un microorganismo hospedero, bajo condiciones que permitan el mantenimiento y expresión estables del gen. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,135,867, la cual se incorpora en la presente como referencia.

Los genes sintéticos que son funcionalmente equivalentes a las toxinas de la presente invención también se pueden usar para transformar hospederos. Los métodos para la producción de genes sintéticos se pueden hallar, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,380,831.

Tratamiento de células Como se mencionó anteriormente, Bacillus o células recombinantes que expresen una toxina de Bacillus pueden tratarse para prolongar la actividad de toxina y estabilizar la célula. La microcápsula plaguicida que se forma comprende la toxina de Bacillus dentro de una estructura celular que ha sido estabilizada, y protegerá a la toxina cuando la microcápsula sea aplicada al medio ambiente de la plaga objetivo. Las células hospederas adecuadas pueden incluir ya sea procariontes o eucariontes. Como hospederos, serán de particular interés los procariontes y los eucariontes inferiores, tales como hongos. La célula habitualmente será intacta, y estará sustancialmente en la forma proliferativa cuando es tratada, en lugar de estar en la forma de espora. El tratamiento de la célula microbiana, por ejemplo, un microbio que contienen el gen de toxina de Bacillus, puede ser por medios químicos o físicos, o por una combinación de medios químicos y/o físicos, siempre que la técnica no afecte nocivamente las propiedades de la toxina, ni disminuya la capacidad celular de protección a la toxina. Los métodos para el tratamiento de células microbianas se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 4,695,455 y 4,695,462, las cuales se incorporan en la presente como referencia.

Métodos y formulaciones para el control de plagas El control de plagas usando los aislados, toxinas y genes de la presente invención se puede efectuar por medio de una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, por ejemplo, la aplicación de aislados de Bacillus a las plagas (o su ubicación), la aplicación de microbios recombinantes a las plagas (o su ubicación), y la transformación de plantas con genes que codifican para las toxinas plaguicidas de la presente invención. Las transformaciones pueden ser hechas por los expertos en la técnica usando técnicas estándar. Los materiales necesarios para estas transformaciones se describen en la presente, o de otra forma pueden ser obtenidos sin dificultad por los expertos en la técnica. Se pueden aplicar al suelo granulos cebo formulados que contienen un atrayente y las toxinas de los aislados de Bacillus, o microbios recombinantes que comprenden los genes que se pueden obtener de los aislados de Bacillus que se describen en la presente. El producto formulado también se puede aplicar como un revestimiento de semillas o un tratamiento de raíces, o tratamiento de planta total en etapas posteriores del ciclo de cultivo. Los tratamientos de suelo y de planta de células de Bacillus se pueden emplear como polvos para mezclar con agua, granulos o polvos finos, mezclando con varios materiales inertes, tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, y similares). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes diseminantes-adherentes, agentes estabilizantes, otros aditivos plaguicidas, o agente tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa o no acuosa, y se pueden emplear como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables, o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, agente tensioactivos, emulsionantes, dispersantes o polímeros. Como apreciarán los expertos en la técnica, la concentración de plaguicida variará ampliamente de conformidad con la naturaleza de la formulación particular, particularmente si se trata de un concentrado o va a ser usado directamente. El plaguicida estará presente en por lo menos 1 % en peso, y puede ser 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán desde aproximadamente 1-95% en peso del plaguicida, mientras que las formulaciones líquidas en general serán desde aproximadamente 1-60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones que contienen células en general tendrán desde aproximadamente 102 a aproximadamente 104 células/mg. Estas formulaciones se administrarán a aproximadamente 50 mg (líquido o seco) a 1 kg o más por hectárea. Las formulaciones se pueden aplicar al medio ambiente de la plaga, por ejemplo, suelo y follaje, por rociado, espolvoreo, chorro, o similares.

Sondas de polinucleótidos Es bien sabido que el ADN posee una propiedad fundamental denominada complementariedad de bases. En la naturaleza, el ADN existe comúnmente en forma de pares de cadenas antiparalelas, las bases en cada cadena se proyectan desde esa cadena hacia la cadena opuesta. La base adenina (A) en una cadena siempre será opuesta a la base timina (T) en la otra cadena, y la base guanina (G) será opuesta a la base citosina (C). Las bases se mantienen en posición por su capacidad para formar enlaces de hidrógeno en esta forma específica. Si bien cada enlace individual es relativamente débil, el efecto neto de muchas bases enlazadas a hidrógeno adyacentes, junto con efectos de apiñamiento de bases, es una unión estable de las dos cadenas complementarias. Estos enlaces pueden ser interrumpidos por tratamientos tales como alto pH o alta temperatura, y estas condiciones producen la disociación o "desnaturalización" de las dos cadenas. Si el ADN luego se pone en condiciones que hacen que el enlace de hidrógeno de estas bases sea termodinámicamente favorable, las cadenas de ADN se unirán o "hibridarán", y reformarán el ADN de doble cadena original. Si se lleva a cabo bajo condiciones apropiadas, esta hibridación puede ser altamente específica. Es decir, sólo las cadenas con un alto grado de complementariedad de bases serán capaces de formar estructuras estables de doble cadena. La relación de la especificidad de hibridación a las condiciones de reacción es bien conocida. Así, la hibridación se puede usar para evaluar si dos fragmentos de ADN son complementarios en sus secuencias de bases. Es este mecanismo de hibridación el que facilita el uso de sondas de la presente invención para detectar fácilmente y caracterizar secuencias de ADN de interés. Las sondas pueden ser ARN, ADN, o ANP (ácido nucleico peptídico). La sonda normalmente tendrá por lo menos aproximadamente 10 bases, más habitualmente por lo menos aproximadamente 17 bases, y puede tener hasta aproximadamente 100 bases o más. Las sondas más largas se pueden utilizar sin dificultad, y dichas sondas pueden ser, por ejemplo, de varios kilobases de longitud. La secuencia de sonda se diseña para ser por lo menos sustancialmente complementaria a una porción de un gen que codifica para una toxina de interés. No es necesario que la sonda tenga complementariedad perfecta con la secuencia a la cual se hibrida. Las sondas pueden ser marcadas utilizando técnicas que son bien conocidas por los expertos en la técnica. Un procedimiento para el uso de la presente invención como sondas entraña primero identificar por análisis Southern blot de un banco de genes del aislado de Bacillus, todos los segmentos de ADN homólogos a las secuencias de nucleótidos descritas. En consecuencia, es posible, sin ayuda de análisis biológico, conocer por adelantado la actividad probable de muchos nuevos aislados de Bacillus, y de los productos genéticos individuales expresados por un aislado de Bacillus determinado. Dicho análisis de sonda provee un rápido método para identificar genes de toxinas insecticidas de potencial valor comercial, dentro de las múltiples subespecies de B. t.

Un procedimiento de hibridación útil de conformidad con la presente invención típicamente incluye los pasos iniciales de aislar la muestra de ADN de interés y purificarla químicamente. Se pueden usar ya sea bacterias usadas o ácido nucleico fraccionado total aislado de bacterias. Las células se pueden tratar usando técnicas conocidas para liberar su ADN (y/o ARN). La muestra de ADN se puede cortar en fragmentos con una enzima de restricción apropiada. Los fragmentos pueden ser separados por tamaño a través de electroforesis en un gel, habitualmente agarosa o acrilamida. Los fragmentos de interés pueden ser transferidos a una membrana inmovilizante. La técnica de hibridación particular no es esencial paren la presente invención. Como se están haciendo mejoras en las técnicas de hibridación, se pueden aplicar sin dificultad. La sonda y la muestra luego pueden ser combinadas en una solución reguladora de pH de hibridación, y pueden mantenerse a una temperatura apropiada hasta que se produzca la unión. Luego, la membrana se lava para eliminar materiales extraños, dejando la muestra, y las moléculas de sonda enlazadas típicamente se detectan y se cuantifican por autorradiografía y/o conteo por centelleo líquido. Como es bien sabido en la técnica, si la molécula de la sonda y la muestra de ácido nucleico hibridan formando un fuerte enlace no covalente entre las dos moléculas, se puede dar por sentado razonablemente que la sonda y la muestra, son esencialmente idénticas. La marca detectable de la sonda provee un medio para determinar de una forma conocida si se ha producido la hibridación.

En el uso de los segmentos de nucleótidos como sondas, la sonda particular es marcada con cualquier marca adecuada conocida por los expertos en la técnica, incluyendo marcas radiactivas y no radiactivas. Las marcas radiactivas típicas incluyen 32P, 35S, o similares. Las marcas no radiactivas incluyen, por ejemplo, ligandos tales como biotina o tiroxina, así como también enzimas tales como hidrolasas o peroxidasas, o los varios quimioluminiscentes tales como luciferina, o compuestos fluorescentes tales como fluoresceína y sus derivados. Las sondas se pueden hacer inherentemente fluorescentes como se describe en la solicitud internacional No. WO 93/16094. Se pueden emplear varios grados de severidad de hibridación. Cuanto más severas son las condiciones, mayor es la complementariedad que se requiere para la formación del dúplex. La severidad se puede controlar por la temperatura, la concentración de la sonda, la longitud de la sonda, la resistencia iónica, el tiempo, y similares. Con preferencia, la hibridación se conduce bajo condiciones de severidad moderada a alta, por técnicas bien conocidas en la técnica, como se describe, por ejemplo, en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, páginas 169-170. Como se usa en la presente, las condiciones de "severidad moderada a alta" para la hibridación, se refieren a condiciones que logran el mismo, o aproximadamente el mismo grado de especificidad de hibridación que las condiciones empleadas por los presentes solicitantes. Ejemplos de condiciones de severidad moderada a alta se proveen en la presente.

Específicamente, la hibridación de ADN inmovilizado en Southern blots, con sondas específicas de genes, marcadas con 32P, se efectuó por métodos estándar (Maniatis et al). En general, la hibridación y los posteriores lavados se llevaron a cabo bajo condiciones de seveiidad moderada a alta, que permitieron la detección de secuencias objetivo con homología a los genes de toxina ejemplificados. Para las sondas de genes de ADN de doble cadena, la hibridación se llevó a cabo durante la noche a 20-25°C por debajo de la temperatura de fusión (Tf) del ADN híbrido en 6X SSPE, 5X solución de Denhardt, 0.1 % SDS y 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La temperatura de fusión se describe por la siguiente fórmula (Beltz, G. A., K. A. Jacobs, T. H.

Eickbush, P. T. Cherbas y F. C. Kafatos

[1983] Methods of Enzymology, R.

Wu, L. Grossman y K. Moldave (eds.) Academic Press, New York 100: 266- 285). Tf=81.5°C + 16.6 Log [Na+] + 0.41 (% G+C) - 0.61 (% formamida)- 600/longitud de dúplex en pares de bases. Los lavados típicamente se llevan a cabo de la siguiente forma: (1 ) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1 X SSPE, 0.1% SDS (lavado de baja severidad). (2) Una vez a Tf-20°C durante 15 minutos en 0.2 X SSPE, 0.1 % SDS (lavado de severidad moderada). Para las sondas de oligonucleótidos, la hibridación se llevó a cabo durante la noche a 10-20°C por debajo de la temperatura de fusión (Tf), del híbrido en 6X SSPE, 5X solución de Denhardt, 0.1% SDS y 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La Tf para las sondas de oligonucleótidos se determinó por la siguiente fórmula: Tf (°C)=2 (número de pares de bases T/A) + 4 (número de pares de bases G/C) (Suggs, S. V., T. Miyake, E. H. Kawashime, M. J. Johnson, K. Itakura y R. B. Wallace

[1981] INC-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D. D. Brown (ed.) Academic Press, New York, 23:683-693). Los lavados típicamente se llevaron a cabo de la siguiente forma: (1 ) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos 1 X SSPE, 0.1 % SDS (lavado de baja severidad). (2) Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en 1 X SSPE, 0.1 % SDS (lavado de severidad moderada). En general, la sal y/o o la temperatura pueden alterarse para cambiar la severidad. Con un fragmento de ADN marcado > 70 bases de longitud, o alrededor de 70, se pueden usar las siguientes condiciones: Baja: 1 ó 2 X SSPE, temperatura ambiente Baja: 1 ó 2 X SSPE, 42°C Moderada: 0.2 X ó 1X SSPE, 65°C Alta: 0.1 X SSPE, 65°C. La formación de dúplex y la estabilidad dependen de la complementariedad sustancial entre las dos cadenas de un híbrido, y como se observó anteriormente, se puede tolerar un cierto grado de no apareamiento.

Por lo tanto, las secuencias de sondas de la presente invención incluyen mutaciones (tanto simples como múltiples), deleciones, inserciones de las secuencias descritas, y combinaciones de las mismas, en donde dichas mutaciones, inserciones y deleciones permiten la formación de híbridos estables con el polinucleótido objetivo de interés. Las mutaciones, inseciones y deleciones se pueden producir en una secuencia de polinucleótidos determinada de muchas formas, y estos métodos son conocidos para el experto en la técnica. Otros métodos pueden ser conocidos en el futuro. En consecuencia, las variantes mutacionales, insercionales y delecionales de las secuencias de nucleótidos descritas pueden ser preparadas sin dificultad mediante métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Estas variantes se pueden usar de la misma forma que las secuencias de cebadores ejemplificadas, siempre que las variantes posean homología de secuencias sustancial con la secuencia original. Como se usa en la presente, la homología de secuencias sustancial se refiere a homología que es suficiente como para permitir que la sonda variante funcione en la misma capacidad que la sonda original. Con preferencia, esta homología es mayor al 50%; con más preferencia, esta homología es mayor al 75%; y con más preferencia, esta homología es mayor al 90%. El grado de homología necesario para que la variante funcione en su capacidad propuesta, dependerá del uso intencionado de la secuencia. Se encuentra dentro de la capacidad del experto en la técnica, hacer mutaciones mutacionales, insercionales y delecionales que están diseñadas para mejorar la función de la secuencia, o de otra forma, proveer una ventaja metodológica.

Tecnología de PCR La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es una síntesis repetitiva, enzimática y con cebadores, de una secuencia de ácido nucleico. Este procedimiento es bien conocido, y comúnmente utilizado por los expertos en esta técnica (véase Mullis, patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,800,159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Hom, Henry A. Erlich, Norman Arnheim

[1985] "Enzymatic Amplification of ß-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia", Science 230: 1350-1354). La PCR se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN de interés, que es flanqueado por dos cebadores de oligonucleótidos que hibridan con cadenas opuestas de las secuencias objetivo. Los cebadores están orientados con los extremos 3' apuntándose entre sí. Los ciclos repetidos de desnaturalización por calor del molde, la unión de los cebadores a sus secuencias complementarias, y la extensión de los cebadores unidos con una ADN polimerasa, producen la amplificación del segmento definido por los extremos 5' de los cebadores de PCR. Debido a que el producto de extensión de cada cebador puede servir como molde para el otro cebador, cada ciclo esencialmente dobla la cantidad de fragmento de ADN producida en el ciclo previo. Esto produce la acumulación exponencial del fragmento objetivo específico, hasta varios millones de veces en algunas horas. Usando una ADN polimerasa termoestable, tal como la Taqr polimerasa, que es aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus, el procedimiento de amplificación puede ser completamente automatizado. Otras enzimas que se pueden usar son conocidas por los expertos en la técnica. Las secuencias de ADN de la presente invención se puede usar como cebadores para amplificación de PCR. Al efectuar la amplificación de PCR, un cierto grado de no apareamiento puede ser tolerado entre el cebador y el molde. Por lo tanto, las mutaciones, deleciones e inserciones (especialmente las adiciones de los nucleótidos al extremo 5') de los cebadores ejemplificados se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Las mutaciones, inserciones y deleciones se pueden producir en un cebador determinado por métodos conocidos para el experto en la técnica. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan en la presente como referencia. A continuación siguen ejemplos que ilustran procedimientos para la práctica de la invención. Estos ejemplos no deberían interpretarse como un límite. Todos los porcentajes son en peso, y todas las proporciones de mezcla de solventes son en volumen, a menos que se observe de otra forma.

EJEMPLO 1 Cultivo de aislados de Bacillus útiles de conformidad con la invención El hospedero celular que contiene al gen insecticida de Bacillus puede ser desarrollado en cualquier medio nutriente conveniente. Estas células luego pueden ser cosechadas de conformidad con formas convencionales. Alternativamente, las células pueden ser tratadas antes de cosecharlas. Las células de Bacillus de la invención pueden ser cultivadas usando medios y técnicas de fermentación estándar en la técnica. Durante el ciclo de fermentación, las bacterias se pueden cosechar primero separando las células vegetativas de Bacillus, las esporas, cristales y los restos celulares lisados del caldo de fermentación, por medios bien conocidos en la técnica. Cualquier espora de Bacillus o d-endotoxina cristalina formada, pueden ser recuperadas empleando técnicas bien conocidas, y utilizarse como una preparación de B. t. de d-endotoxina convencional. El sobrenadante del procedimiento de fermentación contiene toxinas de la presente invención. Las toxinas son aisladas y purificadas empleando técnicas bien conocidas. Se puede usar un subcultivo de aislados de Bacillus, o mutantes de los mismos, para inocular el siguiente medio, conocido como caldo TB: Triptona 12 g/l Extracto de levadura 24 g/l Glicerol 4 g/l KH2P04 2.1 g/l K2HP04 14.7 g/l pH 7.4 El fosfato de potasio se agregó al caldo sometido a autoclave después del enfriamiento. Los matraces se incubaron a 30°C en un agitador giratorio, a 250 rpm durante 24-36 horas.

El procedimiento anterior se puede graduar sin dificultad para fermentadores grandes, por medio de procedimientos bien conocidos en la técnica. El Bacillus obtenido en la fermentación anterior se puede aislar por procedimientos bien conocidos en la técnica. Un procedimiento frecuentemente utilizado es someter el caldo de fermentación cosechado a técnicas de separación, por ejemplo, centrifugación. En una modalidad específica, las proteínas de Bacillus útiles de conformidad con la presente invención se pueden obtener del sobrenadante. El sobrenadante de cultivo que contiene la(s) proteína(s) activa(s) se puede usar en bioensayos. Alternativamente, un subcultivo de aislados de Bacillus, o mutantes de los mismos, se pueden usar para inocular el siguiente medio de peptona, glucosa y sales: Bacto Peptona 7.5 g/l Glucosa 1.0 g/l KH2P04 3.4 g/l K2HP0 4.35 g/l Solución salina 5.0 ml/l Solución de CaCI2 5.0 ml/l PH 7.2 Solución de sales (100 ml) MgS04 7H20 2.46 g MnS04 • H20 0.04 g ZnS04 ' 7H20 0.28 g FeS04 7H20 0.40 g Solución de CaCI2 (100 ml) CaCI2 ' 7H20 3.66g La solución de sales y la solución de CaCI2 se esterilizan por filtro y se agregan al caldo sometido a autoclave y cocido al momento de la inoculación. Los matraces se incuban a 30°C en un agitador giratorio, a 200 rpm durante 64 horas. El procedimiento anterior se puede graduar sin dificultad para fermentadores grandes, por medio de procedimientos bien conocidos en la técnica. Las esporas y/o cristales, de Bacillus obtenidos en la fermentación anterior, se pueden aislar por procedimientos bien conocidos en la técnica. Un procedimiento frecuentemente utilizado es someter el caldo de fermentación cosechado a técnicas de separación, por ejemplo, centrifugación.

EJEMPLO 2 Aislamiento y preparación de ADN celular para PCR Se puede preparar ADN de células desarrolladas en agar de Spizizen, u otro agar mínimo o enriquecido conocido por los expertos en la técnica, durante aproximadamente 16 horas. El agar de ácido casamino de Spizizen comprende 23.2 g/l de sales mínimas de Spizizen [(NH4)2S04, 120 g; K2HP04, 840 g; KH2P04, 360 g; citrato de sodio, 60 g; MgS04 " 7H20, 12 g. Total: 1392 g]; 1.0 g/l de ácidos casamino libres de vitaminas; 15.0 g/l de agar Difco. Al preparar el agar, la mezcla se sometió a autoclave durante 30 minutos, luego se puede agregar una solución de glucosa a 50% estéril a una concentración final de 0.5% (1/100 vol). Una vez que las células son desarrolladas durante aproximadamente 16 horas, se puede raspar un parche de células de aproximadamente 1 cm2 del agar, en 300 µl de 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)-1 mM EDTA. Se agregó proteinasa K a 50 µg/ml y se incubó a 55°C durante 15 minutos. Se pueden usar otras proteasas adecuadas que carezcan de actividad de nucleasa. Las muestras entonces se colocaron en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos, para ¡nactivar la proteinasa, y desnaturalizar el ADN. Esto también precipita componentes no deseados. Las muestras luego se centrifugan a 14,000 x g en una microcentrífuga Eppendorf a temperatura ambiente durante 5 minutos, para remover los restos celulares. Los sobrenadantes que contenían ADN crudo se transfirieron a tubos frescos y se congelaron a -20°C hasta que se usaron en reacciones de PCR. Alternativamente, se puede preparar ADN celular total a partir de células desarrolladas en placa, usando el equipo QlAamp Tissue, de Qiagen (Santa Clarita, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 3 Cebadores útiles para caracterizar v/o identificar genes de toxinas La siguiente serie de cebadores de PCR se puede usar para identificar y/o caracterizar genes de la presente invención, los cuales codifican para toxinas plaguicidas: GGRTTAMTTGGRTAYTATTT (SEQ ID NO. 3) ATATCKWAYATTKGCATTTA (SEQ ID NO. 4) Los códigos de nucleótidos redundantes usados a lo largo de la presente descripción, están de conformidad con la convención de la lUPAC, e incluyen: R = A o G M = A o C Y = C o T K = G o T W = A o T EJEMPLO 4 Identificación y secuenciación de genes que codifican para nuevas toxinas de proteínas solubles de cepas de Bacillus Se efectuó PCR usando cebadores SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. , en el ADN genómico celular total aislado de un amplio rango de cepas de ß. t. Las muestras que producen una banda de aproximadamente 1 kb se seleccionaron para caracterización por secuenciación de ADN. Los fragmentos de ADN amplificados primero se clonaron en el vector de plásmido clonante de TA, de ADN de PCR, pCR2.1 , como lo describe el proveedor (Invitrogen, San Diego, CA). Los plásmidos se aislaron de clones recombinantes y se evaluaron para determinar la presencia de una inserción de aproximadamente 1 kpb, por PCR, usando los cebadores de vectores de plásmidos, T3 y T7. Las siguientes cepas produjeron la banda esperada de aproximadamente 1000 pb, indicando así la presencia de un gen de toxina MIS: PS66D3, PS177C8, PS177I8, PS33F1 , PS157C1 , (157C1-A), PS201Z, PS31 F2 y PS185Y2. Luego se aislaron los plásmidos para usarse como moldes de secuenciación, usando equipos miniprep QIAGEN (Santa Clarita, CA), como lo describe el proveedor. Las reacciones de secuenciación se efectuaron usando el Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, de PE Applied Biosystems. Las reacciones de secuenciación se efectuaron en un Secuenciador Automatizado ABl PRISM 377. Se recogió la información de secuencia, se editó y se reunió usando la ABl PRISM 377 Collection, Factura, y programa AutoAssembler, de PE ABl. Se determinaron secuencias de ADN para porciones de genes de toxinas novedosos de los siguientes aislados: PS66D3, PS177C8, PS177I8, PS33F1 , PS157C1 (157C1-A), PS201Z, PS31 F2 y PS185Y2. Estas secuencias de nucleótidos se muestran en SEQ ID NOS. 5, 7, 9, 38, 33, 35, 36 y 37, respectivamente. Se dedujeron secuencias de polipéptidos para porciones de las toxinas solubles novedosas codificadas a partir de los siguientes aislados: PS66D3, PS177C8, PS177I8 y PS157C1 (toxina 157C1-A). Estas secuencias de nucleótidos se muestran en SEQ ID NOS. 6, 8, 10 y 34, respectivamente.

EJEMPLO 5 Polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) de toxinas de cepas de Bacillus thuringiensis Se preparó ADN celular total de varias cepas de Bacillus thuringiensis (B. t.) desarrolladas a una densidad óptica de 0.5 - 0.8 a 600 nm de luz visible. Se extrajo ADN usando el equipo Genomic-tip 500/G y el equipo de regulador de pH para ADN genómico Qiagen de conformidad con el protocolo para bacterias Gram positivas (Qiagen Inc.; Valencia, CA). Se usaron hibridaciones Southern estándar usando sondas marcadas con 32P, para identificar y caracterizar nuevos genes de toxinas dentro de las preparaciones de ADN genómico total. Se digirió ADN genómico total preparado, con varias enzimas de restricción, se sometió a electroforesis en un gel de agarosa a 1 %, y se inmovilizó en una membrana de nylon con soporte, usando métodos estándar (Maniatis et al).

Los fragmentos de ADN amplificados por PCR de 1.0 - 1.1 kb de longitud se purificaron por gel para usarse como sondas. Se usaron aproximadamente 25 ng de cada fragmento de ADN como molde para cebar la síntesis de ADN naciente usando fragmento Klenow de ADN polimerasa I (New England Biolabs), cebadores de hexanucleótidos de azar (Boehringer Mannheim) y 32PdCTP. Cada fragmento marcado con 32P sirvió como sonda específica a su blot de ADN genómico correspondiente. Las hibridaciones de ADN inmovilizado con sondas marcadas con 32P al azar se efectuaron en regulador de pH acuoso estándar, que consistía de 5X SSPE, 5X solución de Denhardt, 0.5% SDS, 0.1 mg/ml a 65°C durante la noche. Los blots se lavaron bajo severidad moderada en 0.2 X SSC, 0.1 % SDS a 65°C, y se expusieron a película. Los datos de RFLP que muestran bandas de hibridación específica que contienen todo o parte del nuevo gen de interés, se obtuvieron para cada cepa.

CUADRO 3 En experimentos separados, se usaron sondas alternativas para genes MIS y WAR para detectar genes de toxina novedosos en Southern blots de ADN genómico mediante autorradiografía de 32P o mediante métodos no-radiactivos usando el sistema DIG para detección y marcación de ácidos nucleicos (Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN). Fragmentos de ADN de aproximadamente 2.6 kpb (gen de toxina MIS de PS177C8; SEQ ID NO. 7) y 1.3 kpb (gen de toxina WAR de PS177C8; SEQ ID NO. 11 ) de longitud, fueron amplificados mediante PCR a partir del plásmido pMYC2450 usando cebadores homólogos a los extremos 5' y 3' de cada gen respectivo. pMYC2450 es un plásmido recombinante que contiene los genes MIS y WAR de PS177C8 en un fragmento Clal de aproximadamente 14 kbp en pHTBIuell (un vector de lanzadera de E.coli/B. thuringiensis formado de pBluescript S/K [Stratagene, La Jolla, CA] y el origen de replicación de un plásmido residente de ß. t. [D. Lereclus et al. 1989; FEMS Microbiology Letters 60:211-218]. Estos fragmentos de ADN se usaron como sondas para RFLP de MIS clases A a N, y RFLP de WAR clases A a L. Los datos de RFLP del cuadro 4 para la clase O se obtuvieron usando fragmentos de MIS de aproximadamente 1636 pb amplificados con los cebadores S1-633F (CACTCAAAAAATGAAAAGGGAAA; SEQ IN NO. 39) y S1-2269R (CCGGTTTTATTGATGCTAC; SEQ ID NO. 40). Los datos de RFLP del cuadro 5 para la clase M se obtuvieron usando fragmentos WAR de aproximadamente 495 pb amplificados con los cebadores S2-501 F (AGAACAATTTTTAGATAGGG; SEQ ID NO. 41 ) y S2-995R (TCCCTAAAGCATCAGAAATA; SEQ ID NO. 42). Los fragmentos se purificaron por gel y se marcaron aproximadamente 25 ng de cada fragmento de ADN al azar, con 32P para detección radiactiva, o aproximadamente 300 ng de cada fragmento de ADN fueron marcados al azar con el equipo DIB High Prime para detección no radiactiva. Se efectuó la hibridación de ADN inmovilizado con sondas marcadas con 32P al azar, en condiciones de formamida estándar: 50% formamida, 5X SSPE, 5X solución de Denhardt, 2% SDS, 0.1 mg/ml de ADN de esperma tratado con sonido a 42°C durante la noche. Los blots se lavaron bajo severidad baja en 2X SSC, 0.1 % SDS a 42°C y se expusieron a película. Se obtuvieron para cada cepa los datos de RFLP que muestran bandas de ADN que contenían todo o parte del nuevo gen de interés. Los datos de RFLP usando sondas de MIS, fueron los siguientes: CUADRO 4 Los datos de RFLP usando sondas de WAR como se describió anteriormente, fueron los siguientes: CUADRO 5 EJEMPLO 6 Caracterización v/o identificación de toxinas WAR En otra modalidad de la presente invención, se pueden caracterizar y/o identificar toxinas plaguicidas mediante su nivel de reactividad con anticuerpos para toxinas plaguicidas ejemplificadas en la presente. En una modalidad específica, se pueden producir anticuerpos para toxinas WAR, tales como la toxina obtenible de PS177C8a. Otras toxinas WAR se pueden identificar y/o caracterizar entonces mediante su reactividad con los anticuerpos. En una modalidad preferida, los anticuerpos son anticuerpos policlonales. En este ejemplo, las toxinas con la mayor similitud con la toxina 177C8a-WAR, tendrían la mayor reactividad con los anticuerpos policlonales. Las toxinas WAR con mayor diversidad reaccionan con los anticuerpos policlonales 177C8a, pero a un menor grado. Toxinas que inmunorreaccionan con anticuerpos policlonales producidos para la toxina 177C8a WAR se pueden obtener, por ejemplo, de los aislados designados como PS177C8a, PS177I8, PS66D3, KB68B55-2, PS185Y2, KB53A49-4, KB68B51-2, PS31 F2, PS74H3, PS28M, PS71G6, PS71 G7, PS71 I1 , PS71 N1 , PS201JJ7, KB73, KB68B46-2, KB71A35-4, KB71A116-1 , PS70B2, PS71C2, PS86D1 , HD573B, PS33F1 , PS67B3, PS205C, PS40C1 , PS130A3, PS143A2, PS157C1 , PS201Z, PS71G4, KB42A33-8, KB71A72-1 , KB71A133-11 , KB71A134-2, KB69A125-3, KB69A127-7, KB69A136-2 y KB71A20-4. Los aislados PS31 F2 y KB68B46-2 muestran reactividad de anticuerpo muy débil, sugiriendo diversidad ventajosa.

EJEMPLO 7 Clonación molecular y análisis de secuencias de ADN de genes de proteína insecticida soluble (MIS y WAR) de la cepa PS205C de Bacillus thurinpiensis Se preparó ADN celular a partir de la cepa PS205C de Bacillus thuringiensis desarrollada hasta una densidad óptica de 0.5-0.8 a 600 nm de luz visible en caldo de Luria Bertani (LB). Se extrajo ADN usando el equipo de regulador de pH para ADN genómico y el equipo Genomic-tip 500/G Qiagen de conformidad con el protocolo para bacterias Gram positivas (Qiagen Inc.; Valencia, CA). Se construyó una genoteca del cósmido PS205C en el vector SuperCos (Stratagene) usando inserciones de ADN celular total de PS205C digeridas parcialmente con Nde II. Las células XL1-Blue (Stratagene) fueron transfectadas con cósmidos empacados para obtener clones resistentes a carbenicilina y kanamicina. Se desarrollaron 576 colonias de cósmidos en bloques de 96 cavidades en 1 ml de LB + carbenicilina (100 µg/ml) + kanamicina (50 µg/ml) a 37°C durante 18 horas, y se depositaron réplicas sobre filtros de nylon para selección mediante hibridación. Un amplicón de PCR que contenía aproximadamente 1000 pb del gene MIS de PS205 fue amplificada a partir de ADN genómico de PS205 usando los cebadores SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4 como se describe en el ejemplo 4. El fragmento de ADN fue purificado en gel usando extracción Qiaexll (Qiagen). La sonda fue marcada radiactivamente con 32P-dCTP usando el equipo Prime-lt II (Stratgene), y se usó en solución acuosa para hibridación (6X SSPE, 5X de solución de Denhardt, SDS a 01 %, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado), con los filtros de aislamiento de colonias a 65°C durante 16 horas. Los filtros para aislamiento de colonias fueron lavados brevemente 1X en 2XSSC/SDS a 0.1% a temperatura ambiente, seguido de dos lavados adicionales durante 10 minutos en 0.5XSSC/SDS a 0.1%. Los filtros fueron expuestos entonces a películas de rayos X durante 5.5 horas. Un clon del cósmido que híbrido fuertemente con la sonda fue seleccionado para análisis posterior. Se confirmó que este clon contenía el gen MIS para amplificación mediante PCR con los cebadores SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4. El clon de este cósmido fue designado como pMYC3105; las células recombinantes XL-1 Blue MR de E. coli que contenían a pMYC3105, se designan como MR992. Un subcultivo de MR992 fue depositado en la colección permanente de la Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604 USA el 4 mayo de 1999. Su número de acceso es NRRL B-30124. Un clon de plásmido truncado para PS205C fue depositado también el 4 de mayo de 1999. Su número de acceso es NRRL B-30122.

Para secuenciar los genes MIS y WAR de PS205C, se generaron inserciones de transposones aleatorios en pMYC3105 usando el sistema de cebadura de genomas GPS-1 y protocolos (New England Biolabs). Se seleccionó el vector de transposición que codifica para resistencia a cloranfenicol para selección de cósmidos que contienen las inserciones. Los cósmidos de pMYC3105 que adquirieron transposones, fueron identificados mediante transformación y selección de XL1-Blue MR de E. coli en medios que contenían ampicilina, kanamicina y cloroanfenicol. Se prepararon moldes del cósmido a partir de colonias individuales para su uso como moldes de secuenciación usando la preparación para plásmidos de 96 cavidades Multiscreen (Millipore). Los genes de toxina MIS y WAR codificadas por pMYC3105 fueron secuenciados con cebadores GPS2 usando el sistema de secuenciación automatizada ABI377 y programas asociados. Se encontró que los genes MIS y WAR se localizan cerca uno del otro en un operón de transcripción aparente. Las secuencias de nucleótidos y las secuencias deducidas de polipéptidos, se designan como SEQ ID NOS: 43-46.

EJEMPLO 8 Clonación molecular y análisis de secuencias de ADN de genes de proteína insecticida soluble (MIS y WAR) a partir de la cepa PS31F2 de Bacillus thurinpiensis a. Preparación y clonación de ADN qenómico Se preparó ADN celular total a partir de la cepa PS31 F2 de Bacillus thuringiensis desarrollada a una densidad óptica de 0.5-0.8 a 600nm de luz visible en caldo de Luria Bertani (LB). Se extrajo ADN usando el equipo Genomic-tip 500/G o el equipo de regulador de pH para ADN genómico y el equipo Genomic-tip 20/G Qiagen (Qiagen Inc.; Valencia, CA) de conformidad con el protocolo para bacterias Gram positivas. Se prepararon genotecas lambda que contenían ADN genómico total a partir de la cepa PS31 F2 de Bacillus thuringiensis a partir de ADN parcialmente digerido con NdeW. Los productos de digestión de restricción parcial de NdeW fueron sometidos a electroforesis en un gel de agarosa a 0.7%, y la región del gel que contenía los fragmentos de ADN dentro de la escala de tamaño de 9 a 20kpb, fue separada del gel. El ADN fue electroeluído del fragmento del gel en 0.1 X de regulador de pH TAE a aproximadamente 30 V durante 1 hora, y purificado usando columnas Elutip-d (Schleicher y Schuell; Keene, NH). EL ADN fraccionado y purificado fue ligado en brazos Lambda-GEM-11 digeridos con Bam ?\ (Promega Corp., Madison, Wl). El ADN ligado fue empacado entonces en fagos lambda usando extracto para empacamiento Gigapack lll Gold (Stratagene Corp., La Jolla, CA). La cepa KW251 de E. coli fue infectada con el fago recombinante, y depositada en placas LB en agarosa cubierta con LB. Las placas fueron elevadas en filtros de nitrocelulosa, y preparadas para hibridación usando métodos estándar (Maniatis, et al.). Fragmentos de ADN de aproximadamente 1.1 kb (MIS de PS177C o 700 pb (WAR de PS177C8) de longitud fueron amplificados mediante PCR del plásmido pMYC2450, y usados como sondas. Los fragmentos fueron purificados en gel y aproximadamente 25 ng de cada fragmento de ADN fueron marcados aleatoriamente con 32P-dCTP. La hibridación de ADN inmovilizado con sondas de PS177C8 marcadas aleatoriamente con 32P, se llevó a cabo en condiciones estándar con formamida: formamida a 50%, 5X SSPE, 5X solución de Denhardt, SDS a 2%, 01. mg/ml a 42°C durante la noche. Los blots fueron lavados bajo baja severidad en 2X SSC, SDS a 0.1 % a 42°C, y expuestos a película. Las placas de hibridación fueron aisladas de las placas, y suspendidas en regulador de pH SM. El ADN del fago fue preparado usando adsorbente de fagos LambdaSorb (Promega, Madison, Wl). Se llevó a cabo la PCR usando los oligonucleótidos cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO. 4 usando moldes de ADN del fago para verificar la presencia del gen objetivo. Las reacciones del PCR se produjeron la banda esperada de 1 kb en ambas muestras de ADN, confirmando que los clones del fago contenían el gen de interés. Para subclonación, el ADN del fago fue digerido con varias enzimas, fraccionado en un gel de agarosa a 1 %, y blotted para análisis Southern. El análisis Southern se llevó a cabo como se describió anteriormente. Un fragmento de HindW\ de aproximadamente 8 kb de tamaño fue identificado, y contenía los genes de toxina PS31 F2. Este fragmento fue purificado en gel, y clonado en el sitio HindW\ de pBluescriptlI (SK+); este clon del plásmido es designado como pMYC610. La cepa recombinante XLIOGold de E. coli [pMYC2610] fue designada como MR983. Un subcultivo de MR983 fue depositado en la colección permanente de la Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604 USA el 4 de mayo de 1999. Su número de acceso es NRRL B-30123. b. Secuenciación de ADN El fragmento HindW de pMYC2610 que contenía los genes de toxina PS31 F2, fue aislado mediante digestión por restricción, fraccionado sobre un gel de agarosa a 0.7% y purificado a partir de la matriz de gel usando el equipo Qiaexll (Qiagen Inc.; Valencia, CA). El ADN de la inserción purificada en el gel fue digerido entonces por separado con enzimas de restricción Alu\, Mse\ o Rsal, y fraccionado sobre un gel de agarosa a 1 %. Los fragmentos del ADN entre 0.5 y 1.5 kb fueron separados del gel y purificados usando el equipo Qiaexll. Los fragmentos recuperados fueron ligados en pBluescriptlI digerido con EcoRV y transformados en células XL10 Gold de E. coli. El ADN del plásmido fue preparado a partir de transformantes seleccionados aleatoriamente, digerido con Not\ y Apa\ para verificar el tamaño de la inserción, y usado como moldes para secuenciación con cebadores homólogos a las secuencias del vector del plásmido. Se usó recorrido del cebador para completar la secuencia. Se llevaron a cabo reacciones de secuenciación usando el equipo de secuenciación dRhodamine o BigDye (ABl Prism/Perkin Elmer Applied Biosystems), y se hicieron correr sobre secuenciadores automatizados ABl 373 ó 377. Los datos se analizaron usando programas Factura, Autoassembler (ABl Prism) y Gentics Computer Group (Madison, Wl). Se encontró que los genes MIS y WAR se encuentran próximos entre sí en un operón de transcripción aparente. El gen WAR está en posición 5' hacia el gen MIS, y los dos genes están separados por 4 bases de nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos y las secuencias deducidas de péptidos para los genes MIS y WAR novedosos de PS31F2, se reportan como SEQ ID NOS. 47-50 nuevas. c. Subclonación y transformación de ß. thuringiensis Los genes de toxina PS31 F2 fueron subclonados en el fragmento H/nDIII de 8 kbp de pMYC2610 en el vector de lanzadera de E. coli/B. t, pHT370 (O. Arantes y D. Lereclus. 1991. Gene 108: 115-119), para expresión del promotor nativo de Bacillus. La construcción de plásmido resultante fue designada como pMYC2615. Se preparó ADN plasmídico de pMYC2415 a partir de XLIOGold recombinante de E. coli para transformación en el hospedero acristalífero de B. t. (Cry-), CryB (A. Aronson, Purdue University, West Lafayette, IN), mediante electroporación. La cepa CryB recombinante [pMYC2615] fue designada como MR558.

EJEMPLO 9 Clonación molecular y análisis de secuencias de ADN de un gen de toxina SUP novedoso de la cepa KB59A4-6 de Bacillus thuríngiensis Se preparó ADN celular total a partir de la cepa KB59A4-6 de Bacillus thuringensis desarrollada hasta una densidad óptica de 0.5-0.8 a 600 nm de luz visible en caldo de Luria Bertani (LB). Se extrajo ADN usando el equipo de regulador de pH para ADN genómico y el equipo Genomic-tip 500/G Qiagen de conformidad con el protocolo para bacterias Gram positivas (Qiagen Inc.; Valencia, CA). El ADN fue digerido con HinDU\, y se hizo correr sobre geles de agarosa a 0.7% para análisis Southern blot mediante métodos estándar (Maniatís et al.). Un amplicón de PCR que contenía al gen similar a SUP (SEQ ID NO. 1) del ADN genómico de Javelin-90, se obtuvo usando los oligonucleótidos "3A-atg (GCTCTAGAAGGAGGTAACTTATGAACAAGAATAATACTAAATTAAGC) (SEQ ID NO. 51) y "3A-taa" (GGGGTACCTTACTTAATAGAGACATCG) (SEQ ID NO. 52). Este fragmento de ADN fue purificado en gel y marcado con 32P-dCTP radiactivo usando el equipo de marcación de cebador aleatorio Prime-it II (Stratagene) para usarse como una sonda. La hibridación de filtros para Southern blot se llevó a cabo en una solución de 6X SSPE, 5X de solución de Denhardt, SDS a 0.1 %, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado a 42°C durante la noche en un baño de agua con agitación. Los filtros fueron lavados subsecuentemente en 1X SSPE y SDS a 0.1 %, una vez a 25°C, seguido de dos lavados adicionales a 37°C. Los filtros hibridados fueron expuestos entonces a películas de rayos X a -80°C. Se determinó que un fragmento de HinDW\ de aproximadamente 1 kpb de ADN genómico de KB59A4-6 hibridó con la sonda SUP de Javelin 90. Se construyó una genoteca lambda de ADN genómico de KB59A4-6 de la manera siguiente. El ADN fue digerido parcialmente con Sau3A y fraccionado por tamaño sobre geles de agarosa. La región del gel que contenía fragmentos entre 9.0 y 23 kpb fue cortada, y se aisló el ADN mediante electroelucíón en 0.1X de regulador de pH TAE seguido de purificación sobre columnas Elutip-d (Schleicher y Schuell, Keene, NH). Las inserciones de ADN fraccionadas por tamaño fueron ligadas en Lambda-Gem 111 digeridas con BamHl (Promega), y se empacaron fagos recombinantes usando el extracto de empacamiento Gi^apacklll XL (Stratagene). Los fagos fueron puestos sobre células VCS257 de E. coli para selección mediante hibridación. Las placas fueron transferidas a filtros de nylon, y secadas bajo vacío a 80°C. La hibridación se llevó a cabo entonces con la sonda del gen SUP de Javelin 90 como se describió anteriormente. Se seleccionó una placa que dio una señal positiva usando una pipeta Pasteur para obtener un tapón. El tapón fue sumergido durante la noche a temperatura ambiente en 1 ml de regulador de pH SM + 10ul de CHCI3. Se obtuvieron preparaciones de ADN del fago a gran escala (Maniatis et al.) a partir de lisados líquidos de KW251 de E. coli infectados con este fago. El gen de toxina de KB59A4-6 fue subclonado en el vector de lanzadera de E. coli/B. thuringiensis, pHT370 (O. Arantes y D. Lereclus. 1991. Gene 108: 115-119), sobre un fragmento Sacl/Xbal de aproximadamente 5.5 kpb identificado mediante hibridación Southern. Este subclon del plásmido fue designado como pMYC2473. Las células recombinantes XL10-Gold de E. coli (Stratagene) que contienen esta construcción son designadas como MR993. El gen de toxina insecticida fue secuenciado haciendo correr el cebador usando el plásmido pMYC2473 y amplicones de PCR como moldes de ADN: Se llevaron a cabo reacciones de secuenciación usando el equipo Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction de PE Applied Biosystems, y se hicieron correr sobre un secuenciador automatizado ABl PRISM 377. Los datos de secuencias fueron analizados usando el programa Collection, Factura and AutoAssembler PE ABl PRISM 377. La secuencia de ADN y la secuencia deducida de péptidos de la toxina KB59A4-6 se reportan como SEQ ID NOS. 53 y 54 nuevas, respectivamente. Un subcultivo de MR993 fue depositado en la colección permanente de la Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604 USA, el 4 de mayo de 1999. Su número de acceso es NRRL B-30125.

EJEMPLO 10 Bioensavos para determinar la actividadd contra lepidópteros v coleópteros Se puede confirmar la actividad biológica de las toxinas y aislados de la presente invención, usando procedimientos de bioensayo estándar. Uno de dichos ensayos es el ensayo del gusano de brote- gusano del maíz (Heliothis virescens [Fabrícius] y Helicoverpa zea [Boddie]. Se llevaron a cabo bioensayos con lepidópteros ya sea con aplicación de superficie a dieta de insectos artificial, o incorporación de dieta de las muestras. Todos los insectos lepidópteros se evaluaron desde la etapa neonata hasta la segunda crisálida. Todos los ensayos se llevaron a cabo ya sea con dieta artificial de harina de soya tostada, o dieta artificial de oruga nocturna negra (BioServ, Frenchtown, NJ). La incorporación de la dieta se puede llevar a cabo mezclando las muestras con dieta artificial a un régimen de 6 ml de suspensión más 54 ml de dieta. Después de someter a acción de remolino, esta mezcla se vierte en bandejas de plástico con espacios de 3 ml con compartimentos (Nutrend Container Corporation, Jacksonville, FL). Un manto de agua que no contiene B. t. sirve como control. Se colocan larvas de la primera crisálida (USDA-ARS, Stoneville, MS) sobre la mezcla de dieta. Luego los espacios se sellan con laminación Mylar (ClearLam Packaging, IL), usando un cautín, y se hacen varios agujeros en cada espacio para permitir el intercambio de gases. Las larvas se mantienen a 25°C durante 6 días, en una habitación de mantenimiento 14:10 (luz:oscuridad). Se registran la mortalidad y la atrofia después de seis días. El bioensayo por el método de carga superior utiliza la misma muestra y preparaciones de dieta que las que se listan anteriormente. Las muestras se aplican a la superficie de la dieta del insecto. En una modalidad específica, el área de superficie variaba desde 0.3 a aproximadamente 0.8 cm2, de conformidad con el tamaño de la bandeja, y se usaron placas de cultivo de tejidos de 96 cavidades además del formato que se cita anteriormente. Después de la aplicación, las muestras se dejan secar al aire antes de la infestación por los insectos. Un manto de agua que no contiene ß. t. puede servir como el control. Se aplican los huevos a cada espacio tratado y luego se sellan con laminación Mylar (ClearLam Packaging, IL), usando un cautín, y se hacen agujeros en cada espacio para proveer intercambio de gases. Los bioensayos se mantienen a 25°C durante 7 días en una relación de 14:10 (luz:oscuridad), o a 28°C durante 4 días en una habitación de mantenimiento de 14:10 (luz:oscuridad). Se registran la mortalidad y la atrofia de los insectos al final de cada bioensayo. Otro ensayo útil de conformidad con la presente invención es el ensayo del gusano de la raíz del maíz occidental. Las muestras se pueden poner a prueba contra larvas neonatas del gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera) mediante la carga superior de las muestras en una dieta artificial a base de agar a un régimen de 160 ml/cm2.

La dieta artificial se puede administrar a cavidades de 0.78 cm2 en placas de cultivo de tejidos de 48 cavidades, o similares, y dejar endurecerse. Después de que la dieta se solidifica, las muestras se suministran por pipeta sobre la superficie de la dieta. El exceso de líquido luego se evapora de la superficie antes de transferir aproximadamente tres lavas neonatas por cavidad sobre la superficie de la dieta, por cepillado de pelo de camello. Para evitar el escape de insectos mientras que se permite el intercambio de gases, las cavidades se sellan por calor con película de poliéster perforada de 2 mil, con adhesivo 27HT (Oliver Products Company, Grand Rapids, Michigan). Los bioensayos se mantienen en la oscuridad a 25°C, y se clasifica la mortalidad después de cuatro días. Los expertos en la técnica pueden efectuar bioensayos análogos, para evaluar la actividad contra otras plagas, tales como la oruga nocturna negra (Agrotis ípsilon). Los resultados se muestran en el cuadro 6.

CUADRO 6 Genética y función de los sobrenadantes concentrados de B. t. seleccionados para actividad contra lepidópteros y coleópteros EJEMPLO 11 Resultados de los bioensayos del gusano de la raíz del maíz occidental v caracterización adicional de las toxinas Se evaluaron soluciones de sobrenadante líquido concentrado, obtenidas de conformidad con la presente invención, para determinar la actividad contra el gusano de la raíz del maíz occidental (WCRW). Se encontró que los sobrenadantes de los siguientes aislados causan mortalidad contra WCRW: PS31 F2, PS66D3, PS177I8, KB53A49-4, KB68B46-2, KB68B51-2, KB68B55-2 y PS177C8. Además, se encontró que los sobrenadantes de los siguientes aislados causan mortalidad contra WCRW: PS205A3, PS185V2, PS234E1 , PS71G4, PS248N10, PS191A21 , KB63B19-13, KB63B19-7, KB68B62-7, KB68B63-2, KB69A125-1 , KB69A125-3, KB69A125-5, KB69A127-7, KB69A132-1 , KB69B2-1 , KB70B5-3, KB71A125-15 Y KB71A35-6; se confirmó que esta actividad era lábil al calor. Además, se determinó que los sobrenadantes de los siguientes aislados no reaccionaron (dieron resultados de prueba negativos) con el anticuerpo WAR (véase ejemplo 12), y no reaccionaron con las sondas MIS (SEQ ID NO. 31) y WAR (SEQ ID NO. 51 ): PS205A3, PS185V2, PS234E1 , PS71G4, PS248N10, PS191A21 , KB63B19-13, KB63B19-7, KB68B62-7, KB68B63-2, KB69A125-1 , KB69A132-1 , KB69B2-1 , KB70B5-3, KB71A125-15 y KB71A35-6; los sobrenadantes de los aislados KB69A125-3 y KB69A127-7 dieron resultados de prueba positivos.

EJEMPLO 12 Cultivo de clones 31 F2 v bioensavo de toxinas 31 F2 en el gusano de la raíz del maíz occidental (wCRW) La cepa MR983 de E. coli y la cepa de control negativo MR948 (XL1-Blue de E. coli [pSupercos]; control de vector), fueron cultivadas en matraces con deflector de fondo de 250 ml conteniendo 50 ml de medio de caldo Terrific de DIFCO. Los cultivos fueron incubados en agitador New Brunswick agitando a 250 RPM, 30°C durante aproximadamente 23 horas. Después de 23 horas de incubación, las muestras fueron tomadas asépticamente para examinar los cultivos bajo el microscopio para verificar la presencia de contaminantes. Se suministraron 30 ml de cultivo en un tubo de centrífuga de 50 ml, y se centrifugaron en una centrífuga Sorvall a 15,000 rpm durante 20 minutos. El 1X de sobrenadante fue recogido y sometido a bioensayo contra wCRW. La pella fue resuspendida 5X con regulador de pH TRIS a 10 mM, y fue tratada con sonido antes de someterla a bioensayo contra wCRW. La cepa MR558 de ß. t. y el control negativo MR539 (ery B de B. t. [pHT Blue II]; control de vector), fueron cultivadas de la misma forma excepto por la omisión de glicerol a partir del medio de caldo Terrific. Las pellas de células de ß. t. fueron resuspendidas en agua más que en regulador de pH antes de su tratamiento con sonido.

Se llevaron a cabo pruebas para el clon MR983 de E. coli y el clon MR558 de ß. thuringiensis que contenían los genes de toxina 31 F2, usando el mismo diseño experimental usado en el ejemplol para el gusano de la raíz del maíz occidental, con las siguientes excepciones: muestras de sobrenadante fueron cargadas al máximo en una dieta a una dosis de -160 ul/cm2. Muestras de pellas celulares de B. t. a una concentración de 5X fueron cargadas al máximo en una dieta a una dosis de -150 ul/cm2 para ambos clones, y a -75 y a dosis de -35 ul /cm2 para el clon MR558 de ß. thuringiensis (cantidad de toxina activa desconocida para cada clon). Aproximadamente 6-8 larvas fueron transferidas a la dieta inmediatamente después de que la muestra se había evaporado. La placa de bioensayo fue sellada con laminación Mylar usando un cautín, y se hicieron pequeños agujeros arriba de cada cavidad para permitir el intercambio de gases. Los clones MR983 y MR558 demostraron grados de bioactividad (mayor mortalidad) contra el gusano de la raíz del maíz occidental, comparativamente con los clones MR948 y MR539 negativos a la toxina. El cuadro 7 muestra los resultados que muestran la bioactividad de las toxinas del PS31 F2 clonado ante el gusano de la raíz del maíz occidental.

CUADRO 7 EJEMPLO 13 Plagas obietivo Las toxinas de la presente invención se pueden usar, solas o en combinación con otras toxinas, para controlar una o más plagas no de mamíferos. Estas plagas pueden ser, por ejemplo, las que se citan en el cuadro 8. La actividad se puede confirmar sin dificultad usando los bioensayos que se proveen en la presente, adaptaciones de estos bioensayos, y/u otros bioensayos bien conocidos por los expertos en la técnica.

CUADRO 8 Especies de plagas obietivo EJEMPLO 14 Inserción de genes de toxinas en plantas Un aspecto de la presente invención es la transformación de plantas con genes que codifican para la toxina insecticida de la presente invención. Las plantas transformadas son resistentes al ataque por las plagas objetivo. Los genes que codifican para toxinas plaguicidas, como se describen en la presente, pueden ser insertados en células vegetales usando una variedad de técnicas que son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas, se encuentra disponible para la preparación para la inserción de genes extraños en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. En consecuencia, la secuencia que codifica para la toxina de Bacillus se puede insertar en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, luego se cosechan y se lisan. El plásmido se recupera. El análisis de secuencias, análisis de restricción, electroforesis y otros métodos bioquímicos o de biología molecular en general se llevan a cabo como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede ser cortada y unida a la próxima secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido se puede clonar en el mismo u otros plásmidos. De conformidad con el método de inserción de los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se usa el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula vegetal, entonces por lo menos el borde derecho, pero a menudo el borde derecho y el izquierdo del ADN-T de plásmido Ti o Ri, tiene que ser unido como la región flanqueante de los genes a ser insertados. El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales ha sido intensamente investigado y suficientemente descrito en el documento EP 120 516; Hoekema (1985) en: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Capítulo 5; Fraley et al, Crit. Rev. Plant Sci 4:1-46; y An et al (1985) EMBO J. 4: 277-287. Una vez que el ADN insertado ha sido integrado en el genoma, es relativamente estable allí, y como regla, no se sale nuevamente. Normalmente contiene un marcador de selección que confiere resistencia a un biocida o a un antibiótico tal como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o cloranfenicol, entre otros. El marcador individualmente empleado en consecuencia debería permitir la selección de células transformadas en lugar de células que no contienen el ADN insertado. Se encuentra disponible un gran número de técnicas para insertar ADN en una célula vegetal hospedera. Dichas técnicas incluyen transformación con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporación, así como también otros métodos posibles. Si se usan agrobacterias para la transformación, el ADN a ser insertado tiene que ser clonado en plásmidos especiales, a saber, ya sea en un vector intermediario o en un vector binario. Los vectores intermediarios se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri por recombinación homologa debido a secuencias que son homologas a secuencias en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri además comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermediarios no pueden replicarse por sí solos en agrobacterias. El vector intermediario se puede transferir a Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios se pueden replicar por sí solos tanto en E. coli como en agrobacterias. Comprenden un gran marcador de selección y un enlazador o polienlazador que están enmarcados por las regiones de borde de ADN-T derecha e izquierda. Se pueden transformar directamente en agrobacterias (Holsters et al

[1978] Mol. Gen. Genet. 163:181-187). El Agrobacterium usado como célula hospedera debe comprender un plásmído que lleve una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T a la célula vegetal. Puede haber ADN-T adicional. La bacteria así transformada se usa para la transformación de células vegetales. Los explantes de las plantas se pueden cultivar ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal. Luego se pueden regenerar plantas enteras a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, piezas de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, el cual puede contener antibióticos o biocidas para selección. Las plantas así obtenidas luego pueden ser evaluadas para determinar la presencia del ADN insertado. No se hacen demandas especiales de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible usar plásmidos comunes, tales como, por ejemplo, derivados de pUC. En la transformación biolístíca, se puede emplear ADN de plásmido o ADN lineal. Las células transformadas se regeneran en plantas morfológicamente normales de la forma habitual. Si un evento de transformación involucra una célula de línea germinal, entonces el ADN insertado y Ia(las) característica(s) fenotípica(s) correspond iente(s) serán transmitidos a las plantas de la progenie. Dichas plantas se pueden desarrollar de manera normal y cruzar con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados, u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las correspondientes propiedades fenotípicas. En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas serán transformadas con genes en donde el uso de codones ha sido optimizado para las plantas. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,380,831. Además, ventajosamente, se usarán plantas que codifiquen para una toxina truncada. La toxina truncada típicamente codificará aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de la toxina de longitud completa. Los métodos para crear genes de Bacillus sintéticos para su uso en plantas, son conocidos en la técnica. Debería entenderse que los ejemplos y modalidades que se describen en la presente con solamente para propósitos ilustrativos, y que serán sugeridas para los expertos en la técnica varias modificaciones o cambios en vista de las mismas, y deben incluirse dentro del espíritu y alcance de esta solicitud.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTES: Nombre(s) del solicitante: MYCOGEN CORPORATION Calle: 5501 Oberlin Drive Ciudad: San Diego Estado/provincia: California País: E.U.A. Código postal: 92121 Teléfono: (800) 745-7475 Fax: (619) 453-0142 (") TITULO DE LA INVENCIÓN: TOXINAS PLAGUICIDAS Y SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN PARA ESTAS TOXINAS (¡ii) NUMERO DE SECUENCIAS: 54 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) NOMBRE: Saliwanchik, Lloyd & Saliwanchik (B) CALLE: 2421 N.W. 41 st Street, Suite A-1 (C) CIUDAD: Gainesville (D) ESTADO: Florida (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 32606-6669 (v) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC IBM compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 09/073,898 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-MAYO-1998 (viii) INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Sanders, Jay M. (B) NUMERO DE MATRICULA: 39,355 (C) NUMERO DE REFERENCIA CASO: MA-708C2 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: 352-375-8100 (B) TELEFAX: 352-372-5800 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2375 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (vi) FUENTE ORIGINAL: (C) AISLAMIENTO INDIVIDUAL: Jav90 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.1 : ATGAACAAGA ATAATACTAA ATTAAGCACA AGAGCCTTAC CAAGTTTTAT TGATTATTTT 60 AATGGCATTT ATGGATTTGC CACTGGTATC AAAGACATTA TGAACATGAT TTTTAAAACG 120 GATACAGGTG GTGATCTAAC CCTAGACGAA ATTTTAAAGA ATCAGCAGTT ACTAAATGAT 180 ATTTCTGGTA AATTGGATGG GGTGAATGGA AGCTTAAATG ATCTTATCGC ACAGGGAAAC 240 TTAAATACAG AATTATCTAA GGAAATATTA AAAATTGCAA ATGAACAAAA TCAAGTTTTA 300 AATGATGTTA ATAACAAACT CGATGCGATA AATACGATGC TTCGGGTATA TCTACCTAAA 360 ATTACCTCTA TGTTGAGTGA TGTAATGAAA CAAAATTATG CGCTAAGTCT GCAAATAGAA 420 TACTTAAGTA AACAATTGCA AGAGATTTCT GATAAGTTGG ATATTATTAA TGTAAATGTA 480 CTTATTAACT CTACACTTAC TGAAATTACA CCTGCGTATC AAAGGATTAA ATATGTGAAC 540 GAAAAATTTG AGGAATTAAC TTTTGCTACA GAAACTAGTT CAAAAGTAAA AAAGGATGGC 600 TCTCCTGCAG ATATTCTTGA TGAGTTAACT GAGTTAACTG AACTAGCGAA AAGTGTAACA 660 AAAAATGATG TGGATGGTTT TGAATTTTAC CTTAATACAT TCCACGATGT AATGGTAGGA 720 AATAATTTAT TCGGGCGTTC AGCTTTAAAA ACTGCATCGG AATTAATTAC TAAAGAAAAT 780 GTGAAAACAA GTGGCAGTGA GGTCGGAAAT GTTTATAACT TCTTAATTGT ATTAACAGCT 840 CTGCAAGCAA AAGCTTTTCT TACTTTAACA ACATGCCGAA AATTATTAGG CTTAGCAGAT 900 ATTGATTATA CTTCTATTAT GAATGAACAT TTAAATAAGG AAAAAGAGGA ATTTAGAGTA 960 AACATCCTCC CTACACTTTC TAATACTTTT TCTAATCCTA ATTATGCAAA AGTTAAAGGA 1020 AGTGATGAAG ATGCAAAGAT GATTGTGGAA GCTAAACCAG GACATGCATT GATTGGGTTT 1080 GAAATTAGTA ATGATTCAAT TACAGTATTA AAAGTATATG AGGCTAAGCT AAAACAAAAT 1140 TATCAAGTCG ATAAGGATTC CTTATCGGAA GTTATTTATG GTGATATGGA TAAATTATTG 1200 TGCCCAGATC AATCTGAACA AATCTATTAT ACAAATAACA TAGTATTTCC AAATGAATAT 1260 GTAATTACTA AAATTGATTT CACTAAAAAA ATGAAAACTT TAAGATATGA GGTAACAGCG 1320 AATTTTTATG ATTCTTCTAC AGGAGAAATT GACTTAAATA AGAAAAAAGT AGAATCAAGT 1380 GAAGCGGAGT ATAGAACGTT AAGTGCTAAT GATGATGGGG TGTATATGCC GTTAGGTGTC 1440 ATCAGTGAAA CATTTTTGAC TCCGATTAAT GGGTTTGGCC TCCAAGCTGA TGAAAATTCA 1500 AGATTAATTA CTTTAACATG TAAATCATAT TTAAGAGAAC TACTGCTAGC AACAGACTTA 1560 AGCAATAAAG AAACTAAATT GATYGTCCCG CCAAGTGGTT TTATTAGCAA TATTGTAGAG 1620 AACGGGTCCA TAGAAGAGGA CAATTTAGAG CCGTGGAAAG CAAATAATAA GAATGCGTAT 1680 GTAGATCATA CAGGCGGAGT GAATGGAACT AAAGCTTTAT ATGTTCATAA GGACGGAGGA 1740 ATTTCACAAT TTATTGGAGA TAAGTTAAAA CCGAAAACTG AGTATGTAAT CCAATATACT 1800 GTTAAAGGAA AACCTTCTAT TCATTTAAAA GATGAAAATA CTGGATATAT TCATTATGAA 1860 GATACAAATA ATAATTTAGA AGATTATCAA ACTATTAATA AACGTTTTAC TACAGGAACT 1920 GATTTAAAGG GAGTGTATTT AATTTTAAAA AGTCAAAATG GAGATGAAGC TTGGGGAGAT 1980 AACTTTATTA TTTTGGAAAT TAGTCCTTCT GAAAAGTTAT TAAGTCCAGA ATTAATTAAT 2040 ACAAATAATT GGACGAGTAC GGGATCAACT AATATTAGCG GTAATACACT CACTCTTTAT 2100 CAGGGAGGAC GAGGGATTCT AAAACAAAAC CTTCAATTAG ATAGTTTTTC AACTTATAGA 2160 GTGTATTTTT CTGTGTCCGG AGATGCTAAT GTAAGGATTA GAAATTCTAG GGAAGTGTTA 2220 TTTGAAAAAA GATATATGAG CGGTGCTAAA GATGTTTCTG AAATGTTCAC TACAAAATTT 2280 GAGAAAGATA ACTTTTATAT AGAGCTTTCT CAAGGGAATA ATTTATATGG TGGTCCTATT 2340 GTACATTTTT ACGATGTCTC TATTAAGTAA CCCAA 2375 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 790 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FUENTE ORIGINAL: (C) AISLAMIENTO INDIVIDUAL: Jav90 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.2: Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 lie Asp Tyr Phe Asn Gly He Tyr Gly Phe Ala Thr Gly He Lys Asp 20 25 30 He Met Asn Met He Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu 35 40 45 Asp Glu He Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp He Ser Gly Lys 50 55 60 Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu He Ala Gln Gly Asn 65 70 75 80 Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu He Leu Lys He Ala Asn Glu Gln 85 90 95 Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala He Asn Thr 100 105 110 Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys He Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 115 120 125 Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln He Glu Tyr Leu Ser Lys 130 135 140 Gln Leu Gln Glu He Ser Asp Lys Leu Asp He He Asn Val Asn Val 145 150 155 160 Leu He Asn Ser Thr Leu Thr Glu He Thr Pro Ala Tyr Gln Arg He 165 170 175 Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr 180 185 190 Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp He Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val 210 215 220 Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly 225 230 235 240 Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu He 245 250 255 Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr 260 265 270 Asn Phe Leu He Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr 275 280 285 Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp He Asp Tyr Thr 290 295 300 Ser He Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val 305 310 315 320 Asn He Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala 325 330 335 Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met He Val Glu Ala Lys 340 345 350 Pro Gly His Ala Leu He Gly Phe Glu He Ser Asn Asp Ser He Thr 355 360 365 Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp 370 375 380 Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val He Tyr Gly jp Met Asp Lys Leu Leu 385 390 395 400 Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln He Tyr Tyr Thr Asn Asn He Val Phe 405 410 415 Pro Asn Glu Tyr Val He Thr Lys He Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys 420 425 430 Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly 435 440 445 Glu He Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 450 455 460 Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val 465 470 475 480 He Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro He Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala 485 490 495 Asp Glu Asn Ser Arg Leu He Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg 500 505 510 Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu He 515 520 525 Val Pro Pro Ser Gly Phe He Ser Asn He Val Glu Asn Gly Ser He 530 535 540 Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr 545 550 555 560 Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His 565 570 575 Lys Asp Gly Gly He Ser Gln Phe He Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys 580 585 590 Thr Glu Tyr Val He Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser He His 595 600 605 Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr He His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn 610 615 620 Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr He Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 625 630 635 640 Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu He Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu 645 650 655 Ala Trp Gly Asp Asn Phe He He Leu Glu He Ser Pro Ser Glu Lys 660 665 670 Leu Leu Ser Pro Glu Leu He Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly 675 680 685 Ser Thr Asn He Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg 690 695 700 Gly He Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg 705 710 715 720 Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg He Arg Asn Ser 725 730 735 Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val 740 745 750 Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr He Glu 755 760 765 Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro He Val His Phe Tyr 770 775 780 Asp Val Ser He Lys Pro 785 790 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómíco) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.3: GGRTTAMTTG GRTAYTATTT 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.4: ATATCKWAYA TTKGCATTTA 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1042 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (vi) FUENTE ORIGINAL: (C) AISLAMIENTO INDIVIDUAL: 66D3 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.5: TTAATTGGGT ACTATTTTAA AGGAAAAGAT TTTAATAATC TTACTATATT TGCTCCAACA 60 CGTGAGAATA CTCTTATTTA TGATTTAGAA ACAGCGAATT CTTTATTAGA TAAGCAACAA 120 CAAACCTATC AATCTATTCG TTGGATCGGT TTAATAAAAA GCAAAAAAGC TGGAGATTTT 180 ACCTTTCAAT TATCGGATGA TGAGCATGCT ATTATAGAAA TCGATGGGAA AGTTATTTCG 240 CAAAAAGGCC AAAAGAAACA AGTTGTTCAT TTAGAAAAAG ATAAATTAGT TCCCATCAAA 300 ATTGAATATC AATCTGATAA AGCGTTAAAC CCAGATAGTC AAATGTTTAA AGAATTGAAA 360 TTATTTAAAA TAAATAGTCA AAAACAATCT CAGCAAGTGC AACAAGACGA ATTGAGAAAT 420 CCTGAATTTG GTAAAGAAAA AACTCAAACA TATTTAAAGA AAGCATCGAA AAGCAGCCTG 480 TTTAGCAATA AAAGTAAACG AGATATAGAT GAAGATATAG ATGAGGATAC AGATACAGAT 540 GGAGATGCCA TTCCTGATGT ATGGGAAGAA AATGGGTATA CCATCAAAGG AAGAGTAGCT 600 GTTAAATGGG ACGAAGGATT AGCTGATAAG GGATATAAAA AGTTTGTTTC CAATCCTTTT 660 AGACAGCACA CTGCTGGTGA CCCCTATAGT GACTATGAAA AGGCATCAAA AGATTTGGAT 720 TTATCTAATG CAAAAGAAAC ATTTAATCCA TTGGTGGCTG CTTTTCCAAG TGTCAATGTT 780 AGCTTGGAAA ATGTCACCAT ATCAAAAGAT GAAAATAAAA CTGCTGAAAT TGCGTCTACT 840 TCATCGAATA ATTGGTCCTA TACAAATACA GAGGGGGCAT CTATTGAAGC TGGAATTGGA 900 CCAGAAGGTT TGTTGTCTTT TGGAGTAAGT GCCAATTATC AACATTCTGA AACAGTGGCC 960 AAAGAGTGGG GTACAACTAA GGGAGACGCA ACACAATATA ATACAGCTTC AGCAGGATAT 1020 CTAAATGCCA ATGTACGATA TA 1042 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 347 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (iii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi)FUENTE ORIGINAL: (C) AISLAMIENTO INDIVIDUAL: 66D3 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.6: Leu He Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe Asn Asn Leu Thr He 1 5 10 15 Phe Ala Pro Thr Arg Glu Asn Thr Leu He Tyr Asp Leu Glu Thr Ala 20 25 30 Asn Ser Leu Leu Asp Lys Gln Gln Gln Thr Tyr Gln Ser He Arg Trp 35 40 45 He Gly Leu He Lys Ser Lys Lys Ala Gly Asp Phe Thr Phe Gln Leu 50 55 60 Ser Asp Asp Glu His Ala He He Glu He Asp Gly Lys Val He Ser 65 70 75 80 Gln Lys Gly Gln Lys Lys Gln Val Val His Leu Glu Lys Asp Lys Leu 85 90 95 Val Pro He Lys He Glu Tyr Gln Ser Asp Lys Ala Leu Asn Pro Asp 100 105 110 Ser Gln Met Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys He Asn Ser Gln Lys 115 120 125 Gln Ser Gln Gln Val Gln Gln Asp Glu Leu Arg Asn Pro Glu Phe Gly 130 135 140 Lys Glu Lys Thr Gln Thr Tyr Leu Lys Lys Ala Ser Lys Ser Ser Leu 145 150 155 160 Phe Ser Asn Lys Ser Lys Arg Asp He Asp Glu Asp He Asp Glu Asp 165 170 175 Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ala He Pro Asp Val Trp slu Glu Asn Gly 180 185 190 Tyr Thr He Lys Gly Arg Val Ala Val Lys Trp Asp Glu Gly Leu Ala 195 200 205 Asp Lys Gly Tyr Lys Lys Phe Val Ser Asn Pro Phe Arg Gln His Thr 210 215 220 Ala Gly Asp Pro Tyr Ser Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Lys Asp Leu Asp 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe Pro 245 250 255 Ser Val Asn Val Ser Leu Glu Asn Val Thr He Ser Lys Asp Glu Asn 260 265 270 Lys Thr Ala Glu He Ala Ser Thr Ser Ser Asn Asn Trp Ser Tyr Thr 275 280 285 Asn Thr Glu Gly Ala Ser He Glu Ala Gly He Gly Pro Glu Gly Leu 290 295 300 Leu Ser Phe Gly Val Ser Ala Asn Tyr Gln His Ser Glu Thr Val Ala 305 310 315 320 Lys Glu Trp Gly Thr Thr Lys Gly Asp Ala Thr Gln Tyr Asn Thr Ala 325 330 335 Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr 340 345 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NOJ: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2645 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (vi) FUENTE ORIGINAL: (C) AISLAMIENTO INDIVIDUAL: PS177C8a (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NOJ: ATGAAGAAGA AGTTAGCAAG TGTTGTAACG TGTACGTTAT TAGCTCCTAT GTTTTTGAAT 60 GGAAATGTGA ATGCTGTTTA CGCAGACAGC AAAACAAATC AAATTTCTAC AACACAGAAA 120 AATCAACAGA AAGAGATGGA CCGAAAAGGA TTACTTGGGT ATTATTTCAA AGGAAAAGAT 180 TTTAGTAATC TTACTATGTT TGCACCGACA CGTGATAGTA CTCTTATTTA TGATCAACAA 240 ACAGCAAATA AACTATTAGA TAAAAAACAA CAAGAATATC AGTCTATTCG TTGGATTGGT 300 TTGATTCAGA GTAAAGAAAC GGGAGATTTC ACATTTAACT TATCTGAGGA TGAACAGGCA 360 ATTATAGAAA TCAATGGGAA AATTATTTCT AATAAAGGGA AAGAAAAGCA AGTTGTCCAT 420 TTAGAAAAAG GAAAATTAGT TCCAATCAAA ATAGAGTATC AATCAGATAC AAAATTTAAT 480 ATTGACAGTA AAACATTTAA AGAACTTAAA TTATTTAAAA TAGATAGTCA AAACCAACCC 540 CAGCAAGTCC AGCAAGATGA ACTGAGAAAT CCTGAATTTA ACAAGAAAGA ATCACAGGAA 600 TTCTTAGCGA AACCATCGAA AATAAATCTT TTCACTCAAA AAATGAAAAG GGAAATTGAT 660 GAAGACACGG ATACGGATGG GGACTCTATT CCTGACCTTT GGGAAGAAAA TGGGTATACG 720 ATTCAAAATA GAATCGCTGT AAAGTGGGAC GATTCTYTAG CAAGTAAAGG GTATACGAAA 780 TTTGTTTCAA ATCCGCTAGA AAGTCACACA GTTGGTGATC CTTATACAGA TTATGAAAAG 840 GCAGCAAGAG ACCTAGATTT GTCAAATGCA AAGGAAACGT TTAACCCATT GGTAGCTGCT 900 TTTCCAAGTG TGAATGTTAG TATGGAAAAG GTGATATTAT CACCAAATGA AAATTTATCC 960 AATAGTGTAG AGTCTCATTC ATCCACGAAT TGGTCTTATA CAAATACAGA AGGTGCTTCT 1020 GTTGAAGCGG GGATTGGACC AAAAGGTATT TCGTTCGGAG TTAGCGTAAA CTATCAACAC 1080 TCTGAAACAG TTGCACAAGA ATGGGGAACA TCTACAGGAA ATACTTCGCA ATTCAATACG 1140 GCTTCAGCGG GATATTTAAA TGCAAATGTT CGATATAACA ATGTAGGAAC TGGTGCCATC 1200 TACGATGTAA AACCTACAAC AAGTTTTGTA TTAAATAACG ATACTATCGC AACTATTACG 1260 GCGAAATCTA ATTCTACAGC CTTAAATATA TCTCCTGGAG AAAGTTACCC GAAAAAAGGA 1320 CAAAATGGAA TCGCAATAAC ATCAATGGAT GATTTTAATT CCCATCCGAT TACATTAAAT 1380 AAAAAACAAG TAGATAATCT GCTAAATAAT AAACCTATGA TGTTGGAAAC AAACCAAACA 1440 GATGGTGTTT ATAAGATAAA AGATACACAT GGAAATATAG TAACTGGCGG AGAATGGAAT 1500 GGTGTCATAC AACAAATCAA GGCTAAAACA GCGTCTATTA TTGTGGATGA TGGGGAACGT 1560 GTAGCAGAAA AACGTGTAGC GGCAAAAGAT TATGAAAATC CAGAAGATAA AACACCGTCT 1620 TTAACTTTAA AAGATGCCCT GAAGCTTTCA TATCCAGATG AAATAAAAGA AATAGAGGGA 1680 TTATTATATT ATAAAAACAA ACCGATATAC GAATCGAGCG TTATGACTTA CTTAGATGAA 1740 AATACAGCAA AAGAAGTGAC CAAACAATTA AATGATACCA CTGGGAAATT TAAAGATGTA 1800 AGTCATTTAT ATGATGTAAA ACTGACTCCA AAAATGAATG TTACAATCAA ATTGTCTATA 1860 CTTTATGATA ATGCTGAGTC TAATGATAAC TCAATTGGTA AATGGACAAA CACAAATATT 1920 GTTTCAGGTG GAAATAACGG AAAAAAACAA TATTCTTCTA ATAATCCGGA TGCTAATTTG 1980 ACATTAAATA CAGATGCTCA AGAAAAATTA AATAAAAATC GTACTATTAT ATAAGTTTAT 2040 ATATGAAGTC AGAAAAAAAC ACACAATGTG AGATTACTAT AGATGGGGAG ATTTATCCGA 2100 TCACTACAAA AACAGTGAAT GTGAATAAAG ACAATTACAA AAGATTAGAT ATTATAGCTC 2160 ATAATATAAA AAGTAATCCA ATTTCTTCAA TTCATATTAA AACGAATGAT GAAATAACTT 2220 TATTTTGGGA TGATATTTCT ATAACAGATG TAGCATCAAT AAAACCGGAA AATTTAACAG 2280 ATTCAGAAAT TAAACAGATT TATAGTAGGT ATGGTATTAA GTTAGAAGAT GGAATCCTTA 2340 TTGATAAAAA AGGTGGGATT CATTATGGTG AATTTATTAA TGAAGCTAGT TTTAATATTG 2400 AACCATTGCA AAATTATGTG ACAAAATATA AAGTTACTTA TAGTAGTGAG TTAGGACAAA 2460 ACGTGAGTGA CACACTTGAA AGTGATAAAA TTTACAAGGA TGGGACAATT AAATTTGATT 2520 TTACAAAATA TAGTRAAAAT GAACAAGGAT TATTTTATGA CAGTGGATTA AATTGGGACT 2580 TTAAAATTAA TGCTATTACT TATGATGGTA AAGAGATGAA TG I I I I I CAT AGATATAATA 2640 AATAG 2645 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 881 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (C) AISLAMIENTO INDIVIDUAL: PS177C8a (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.8: Met Lys Lys Lys Leu Ala Ser Val Val Thr Cys Thr Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Met Phe Leu Asn Gly Asn Val Asn Ala Val Tyr Ala Asp Ser Lys Thr 20 25 30 Asn Gln He Ser Thr Thr Gln Lys Asn Gln Gln Lys Glu Met Asp Arg 35 40 45 Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe Ser Asn Leu 50 55 60 Thr Met Phe Ala Pro Thr Arg Asp Ser Thr Leu He Tyr Asp Gln Gln 65 70 75 80 Thr Ala Asn Lys Leu Leu Asp Lys Lys Gln Gln Glu Tyr Gln Ser He 85 90 95 Arg Trp He Gly Leu He Gln Ser Lys Glu Thr Gly Asp Phe Thr Phe 100 105 110 Asn Leu Ser Glu Asp Glu Gln Ala He He Glu He Asn Gly Lys He 115 120 125 He Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gln Val Val His Leu Glu Lys Gly 130 135 140 Lys Leu Val Pro He Lys He Glu Tyr Gln Ser Asp Thr Lys Phe Asn 145 150 155 160 He Asp Ser Lys Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys He Asp Ser 165 170 175 Gln Asn Gln Pro Gln Gln Val Gln Gln Asp Glu Leu Arg Asn Pro Glu 180 185 190 Phe Asn Lys Lys Glu Ser Gln Glu Phe Leu Ala Lys Pro Ser Lys He 195 200 205 Asn Leu Phe Thr Gln Lys Met Lys Arg Glu He Asp Glu Asp Thr Asp 210 215 220 Thr Asp Gly Asp Ser He Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly Tyr Thr 225 230 235 240 He Gln Asn Arg He Ala Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu Ala Ser Lys 245 250 255 Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Leu Glu Ser His Thr Val Gly 260 265 270 Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp Leu Ser 275 280 285 Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe Pro Ser Val 250 295 300 Asn Val Ser Met Glu Lys Val He Leu Ser Pro Asn Glu Asn Leu Ser 305 310 315 320 Asn Ser Val Glu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr Thr Asn Thr 325 330 335 Glu Gly Ala Ser Val Glu Ala Gly He Gly Pro Lys Gly He Ser Phe 340 345 350 Gly Val Ser Val Asn Tyr Gln His Ser Glu Thr Val Ala Gln Glu Trp 355 360 365 Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gln Phe Asn Thr Ala Ser Ala Gly 370 375 380 Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr Gly Ala He 385 390 395 400 Tyr Asp Val Lys Pro Thr Thr Ser Phe Val Leu Asn Asn Asp Thr He 405 410 415 Ala Thr He Thr Ala Lys Ser Asn Ser Thr Ala Leu Asn He Ser Pro 420 425 430 Gly Glu Ser Tyr Pro Lys Lys Gly Gln Asn Gly He Ala He Thr Ser 435 440 445 Met Asp Asp Phe Asn Ser His Pro He Thr Leu Asn Lys Lys Gln Val 450 455 460 Asp Asn Leu Leu Asn Asn Lys Pro Met Met Leu Glu Thr Asn Gln Thr 465 470 475 480 Asp Gly Val Tyr Lys He Lys Asp Thr His Gly Asn He Val Thr Gly 485 490 495 Gly Glu Trp Asn Gly Val He Gln Gln He Lys Ala Lys Thr Ala Ser 500 505 510 He He Val Asp Asp Gly Glu Arg Val Ala Glu Lys Arg Val Ala Ala 515 520 525 Lys Asp Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Lys Thr Pro Ser Leu Thr Leu Lys 530 535 540 Asp Ala Leu Lys Leu Ser Tyr Pro Asp Glu He Lys Glu He Glu Gly 545 550 555 560 Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn Lys Pro He Tyr Glu Ser Ser Val Met Thr 565 570 575 Tyr Leu Asp Glu Asn Thr Ala Lys Glu Val Thr Lys Gln Leu Asn Asp 580 585 590 Thr Thr Gly Lys Phe Lys Asp Val Ser His Leu Tyr Asp Val Lys Leu 595 600 605 Thr Pro Lys Met Asn Val Thr He Lys Leu Ser He Leu Tyr Asp Asn 610 615 620 Ala Glu Ser Asn Asp Asn Ser He Gly Lys Trp Thr Asn Thr Asn He 625 630 635 640 Val Ser Gly Gly Asn Asn Gly Lys Lys Gln Tyr Ser Ser Asn Asn Pro 645 650 655 Asp Ala Asn Leu Thr Leu Asn Thr Asp Ala Gln Glu Lys Leu Asn Lys 660 665 670 Asn Arg Asp Tyr Tyr He Ser Leu Tyr Met Lys Ser Glu Lys Asn Thr 675 680 685 Gln Cys Glu He Thr He Asp Gly Glu He Tyr Pro He Thr Thr Lys 690 695 700 Thr Val Asn Val Asn Lys Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Asp He He Ala 705 710 715 720 His Asn He Lys Ser Asn Pro He Ser Ser He His He Lys Thr Asn 725 730 735 Asp Glu He Thr Leu Phe Trp Asp Asp He Ser He Thr Asp Val Ala 740 745 750 Ser He Lys Pro Glu Asn Leu Thr Asp Ser Glu He Lys Gln He Tyr 755 760 765 Ser Arg Tyr Gly He Lys Leu Glu Asp Gly He Leu He Asp Lys Lys 770 775 780 Gly Gly He His Tyr Gly Glu Phe He Asn Glu Ala Ser Phe Asn He 785 790 795 800 Glu Pro Leu Gln Asn Tyr Val Thr Lys Tyr Lys Val Thr Tyr Ser Ser 805 810 815 Glu Leu Gly Gln Asn Val Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp Lys He Tyr 820 825 830 Lys Asp Gly Thr He Lys Phe Asp Phe Thr Lys Tyr Ser Xaa Asn Glu 835 840 845 Gln Gly Leu Phe Tyr Asp Ser Gly Leu Asn Trp Asp Phe Lys He Asn 850 855 860 Ala He Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn 865 870 875 880 Lys (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1022 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (vi) FUENTE ORIGINAL: (C) AISLAMIENTO INDIVIDUAL: 17718 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.9: TGGATTAATT GGGTATTATT TCAAAGGAAA AGATTTTAAT AATCTTACTA TGTTTGCACC 60 GACACGTGAT AATACCCTTA TGTATGACCA ACAAACAGCG AATGCATTAT TAGATAAAAA 120 ACAACAAGAA TATCAGTCCA TTCGTTGGAT TGGTTTGATT CAGAGTAAAG AAACGGGCGA 180 TTTCACATTT AACTTATCAA AGGATGAACA GGCAATTATA GAAATCGATG GGAAAATCAT 240 TTCTAATAAA GGGAAAGAAA AGCAAGTTGT CCATTTAGAA AAAGAAAAAT TAGTTCCAAT 300 CAAAATAGAG TATCAATCAG ATACGAAATT TAATATTGAT AGTAAAACAT TTAAAGAACT 360 TAAATTATTT AAAATAGATA GTCAAAACCA ATCTCAACAA GTTCAACTGA GAAACCCTGA 420 ATTTAACAAA AAAGAATCAC AGGAATTTTT AGCAAAAGCA TCAAAAACAA ACCTTTTTAA 480 GCAAAAAATG AAAAGAGATA TTGATGAAGA TACGGATACA GATGGAGACT CCATTCCTGA 540 TCTTTGGGAA GAAAATGGGT ACACGATTCA AAATAAAGTT GCTGTCAAAT GGGATGATTC 600 GCTAGCAAGT AAGGGATATA CAAAATTTGT TTCGAATCCA TTAGACAGCC ACACAGTTGG 660 CGATCCCTAT ACTGATTATG AAAAGGCCGC AAGGGATTTA GATTTATCAA ATGCAAAGGA 720 AACGTTCAAC CCATTGGTAG CTGCTTTYCC AAGTGTGAAT GTTAGTATGG AAAAGGTGAT 780 ATTATCACCA AATGAAAATT TATCCAATAG TGTAGAGTCT CATTCATCCA CGAATTGGTC 840 TTATACGAAT ACAGAAGGAG CTTCCATTGA AGCTGGTGGC GGTCCATTAG GCCTTTCTTT 900 TGGAGTGAGT GTTAATTATC AACACTCTGA AACAGTTGCA CAAGAATGGG GAACATCTAC 960 AGGAAATACT TCACAATTCA ATACGGCTTC AGCGGGATAT TTAAATGCCA ATATACGATA 1020 TA 1022 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 340 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (C) AISLAMIENTO INDIVIDUAL: 17718 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.10: Gly Leu He Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe Asn Asn Leu Thr 1 . 5 10 15 Met Phe Ala Pro Thr Arg Asp Asn Thr Leu Met Tyr Asp Gln Gln Thr 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Asp Lys Lys Gln Gln Glu Tyr Gln Ser He Arg 35 40 45 Trp He Gly Leu He Gln Ser Lys Glu Thr Gly Asp Phe Thr Phe Asn 50 55 60 Leu Ser Lys Asp Glu Gln Ala He He Glu He Asp Gly Lys He He 65 70 75 80 Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gln Val Val His Leu Glu Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Val Pro He Lys He Glu Tyr Gln Ser Asp Thr Lys Phe Asn He 100 105 110 Asp Ser Lys Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys He Asp Ser Gln 115 120 125 Asn Gln Ser Gln Oln Val Oln Leu Arg Asn Pro slu Phe Asn Lys Lys 130 135 140 Glu Ser Gln slu Phe Leu Ala Lys Ala Ser Lys Thr Asn Leu Phe Lys 145 150 155 160 sln Lys Met Lys Arg Asp He Asp slu Asp Thr Asp Thr Asp sly Asp 165 170 175 Ser He Pro Asp Leu Trp Olu Olu Asn sly Tyr Thr He Oln Asn Lys 180 185 190 Val Ala Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu Ala Ser Lys sly Tyr Thr Lys 195 200 205 Phe Val Ser Asn Pro Leu Asp Ser His Thr Val sly Asp Pro Tyr Thr 210 215 220 Asp Tyr Olu Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp Leu Ser Asn Ala Lys Olu 225 230 235 240 Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala Ala Xaa Pro Ser Val Asn Val Ser Met 245 250 255 Glu Lys Val He Leu Ser Pro Asn Glu Asn Leu Ser Asn Ser Val Glu 260 265 270 Ser His Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr Thr Asn Thr Glu Gly Ala Ser 275 280 285 He slu Ala sly Gly Gly Pro Leu Gly Leu Ser Phe Gly Val Ser Val 290 295 300 Asn Tyr Gln His Ser slu Thr Val Ala Oln Glu Trp Gly Thr Ser Thr 305 310 315 320 Gly Asn Thr Ser Gln Phe Asn Thr Ala Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala 325 330 335 Asn He Arg Tyr 340 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.11 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1341 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ií) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómíco) (vi) FUENTE ORIGINAL: (C) AISLAMIENTO INDIVIDUAL: PS177C8a (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.11 : ATGTTTATGG TTTCTAAAAA ATTACAAGTA GTTACTAAAA CTGTATTGCT TAGTACAGTT 60 TTCTCTATAT CTTTATTAAA TAATGAAGTG ATAAAAGCTG AACAATTAAA TATAAATTCT 120 CAAAGTAAAT ATACTAACTT GCAAAATCTA AAAATCACTG ACAAGGTAGA GGATTTTAAA 180 GAAGATAAGG AAAAAGCGAA AGAATGGGGG AAAGAAAAAG AAAAAGAGTG GAAACTAACT 240 GCTACTGAAA AAGGAAAAAT GAATAATTTT TTAGATAATA AAAATGATAT AAAGACAAAT 300 TATAAAGAAA TTACTTTTTC TATGGCAGGC TCATTTGAAG ATGAAATAAA AGATTTAAAA 360 GAAATTGATA AGATGTTTGA TAAAACCAAT CTATCAAATT CTATTATCAC CTATAAAAAT 420 GTGGAACCGA CAACAATTGG ATTTAATAAA TCTTTAACAG AAGGTAATAC GATTAATTCT 480 GATGCAATGG CACAGTTTAA AGAACAATTT TTAGATAGGG ATATTAAGTT TGATAGTTAT 540 CTAGATACGC ATTTAACTGC TCAACAAGTT TCCAGTAAAG AAAGAGTTAT TTTGAAGGTT 600 ACGGTTCCGA GTGGGAAAGG TTCTACTACT CCAACAAAAG CAGGTGTCAT TTTAAATAAT 660 AGTGAATACA AAATGCTCAT TGATAATGGG TATATGGTCC ATGTAGATAA GGTATCAAAA 720 GTGGTGAAAA AAGGGGTGGA GTGCTTACAA ATTGAAGGGA CTTTAAAAAA GAGTCTTGAC 780 TTTAAAAATG ATATAAATGC TGAAGCGCAT AGCTGGGGTA TGAAGAATTA TGAAGAGTGG 840 GCTAAAGATT TAACCGATTC GCAAAGGGAA GCTTTAGATG GGTATGCTAG GCAAGATTAT 900 AAAGAAATCA ATAATTATTT AAGAAATCAA GGCGGAAGTG GAAATGAAAA ACTAGATGCT 960 CAAATAAAAA ATATTTCTGA TGCTTTAGGG AAGAAACCAA TACCGGAAAA TATTACTGTG 1020 TATAGATGGT GTGGCATGCC GGAATTTGGT TATCAAATTA GTGATCCGTT ACCTTCTTTA 1080 AAAGATTTTG AAGAACAATT TTTAAATACA ATCAAAGAAG ACAAAGGATA TATGAGTACA 1140 AGCTTATCGA GTGAACGTCT TGCAGCTTTT GGATCTAGAA AAATTATATT ACGATTACAA 1200 GTTCCGAAAG GAAGTACGGG TGCGTATTTA AGTGCCATTG GTGGATTTGC AAGTGAAAAA 1260 GAGATCCTAC TTGATAAAGA TAGTAAATAT CATATTGATA AAGTAACAGA GGTAATTATT 1320 AAGGTGTTAA GCGATATGTA G 1341 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 446 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (C) AISLAMIENTO INDIVIDUAL: PS177C8a (xí) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.12: Met Phe Met Val Ser Lys Lys Leu sln Val Val Thr Lys Thr Val Leu 1 5 10 15 Leu Ser Thr Val Phe Ser He Ser Leu Leu Asn Asn Glu Val He Lys 20 25 30 Ala Glu Gln Leu Asn He Asn Ser Oln Ser Lys Tyr Thr Asn Leu Oln 35 40 45 Asn Leu Lys He Thr Asp Lys Val Glu Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu 50 55 60 Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr 65 70 75 80 Ala Thr Glu Lys Oly Lys Met Asn Asn Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp 85 90 95 He Lys Thr Asn Tyr Lys Glu He Thr Phe Ser Met Ala Gly Ser Phe 100 105 110 slu Asp Glu He Lys Asp Leu Lys Glu He Asp Lys Met Phe Asp Lys 115 120 125 Thr Asn Leu Ser Asn Ser He He Thr Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr 130 135 140 Thr He Oly Phe Asn Lys Ser Leu Thr Glu Gly Asn Thr He Asn Ser 145 150 155 160 Asp Ala Met Ala Gln Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Arg Asp He Lys 165 170 175 Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu Thr Ala Oln Gln Val Ser Ser 180 185 190 Lys Glu Arg Val He Leu Lys Val Thr Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser 195 200 205 Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Val He Leu Asn Asn Ser Glu Tyr Lys 210 215 220 Met Leu He Asp Asn Gly Tyr Met Val His Val Asp Lys Val Ser Lys 225 230 235 240 Val Val Lys Lys Gly Val Glu Cys Leu Gln He Olu Oly Thr Leu Lys 245 250 255 Lys Ser Leu Asp Phe Lys Asn Asp He Asn Ala Glu Ala His Ser Trp 260 265 270 Gly Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala Lys Asp Leu Thr Asp Ser Gln 275 280 285 Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Tyr Lys Glu He Asn 290 295 300 Asn Tyr Leu Arg Asn Oln Gly Gly Ser Gly Asn Glu Lys Leu Asp Ala 305 310 315 320 Gln He Lys Asn He Ser Asp Ala Leu Gly Lys Lys Pro He Pro Glu 325 330 335 Asn He Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gln 340 345 350 He Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys Asp Phe Glu Glu Gln Phe Leu 355 360 365 Asn Thr He Lys slu Asp Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser 370 375 380 Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg Lys He He Leu Arg Leu Gln 385 390 395 400 Val Pro Lys Oly Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Ser Ala He Gly Gly Phe 405 410 415 Ala Ser Glu Lys Glu He Leu Leu Asp Lys Asp Ser Lys Tyr His He 420 425 430 Asp Lys Val Thr Olu Val He He Lys Val Leu Ser Asp Met 435 440 445 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ií) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.13: GCTGATGAAC CATTTAATGC C 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.14: CTCTTTAAAG TAGATACTAA GC 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ií) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.15: GATGAGAACT TATCAAATAG TATC 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.16: CGAATTCTTT ATTAGATAAG CAACAACAAA CCT 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.17: GTTATTTCGC AAAAAGGCCA AAAG 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.18: GAATATCAAT CTGATAAAGC GTTAAACCCA G 31 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.19: GCAGCYTGTT TAGCAATAAA AGT 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ií) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.20: CAAAGGAAGA GTAGCTGTTA 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.21 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.21 : CAATGTTAGC TTGGAAAATG TCACC 25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.22: GCTTAGTATC TACTTTAAAG AG 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.23: GATACTATTT GATAAGTTCT CATC 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.24: CTTTTGGCCT TTTTGCGAAA TAAC 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.25: CTGGGTTTAA CGCTTTATCA GATTGATATT C 31 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.26: ACTTTTATTG CTAAACARGC TGC 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.27: TAACAGCTAC TCTTCCTTTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ií) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.28: GGTGACATTT TCCAAGCTAA CATTG 25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.29: CCAGTCCAAT GAACCTCTTA C 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.30: AGGGAACAAA CCTTCCCAAC C 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.31 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.31 : CARMTAKTAA MTAGGGATAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.32: AGYTTCTATC GAAGCTGGGR ST 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1035 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.33: GGGTTAATTG GGTATTATTT TAAAGGGAAA GATTTTAATA ATCTGACTAT GTTTGCACCA 60 ACCATAAATA ATACGCTTAT TTATGATCGG CAAACAGCAG ATACACTATT AAATAAGCAG 120 CAACAAGAGT TCAATTCTAT TCGATGGATT GGTTTAATAC AAAGTAAAGA AACAGGTGAC 180 TTTACATTCC AATTATCAGA TGATAAAAAT GCCATCATTG AAATAGATGG AAAAGTTGTT 240 TCTCGTAGAG GAGAAGATAA ACAAACTATC CATTTAGAAA AAGGAAAGAT GGTTCCAATC 300 AAAATTGAGT ACCAGTCCAA TGAACCTCTT ACTGTAGATA GTAAAGTATT TAACGATCTT 360 AAACTATTTA AAATAGATGG TCATAATCAA TCGCATCAAA TACAGCAAGA TGATTTGAAA 420 ATCCTGAATT TAATAAAAAG GAAACGAAAG AGCTTTTATC AAAAACAGCA AAAAGAACCT 480 TTTCTCTTCA AAACGGGGTT GAGAAGCGAT GAGGATGATG ATCTAGGATA CAGATGGTGA 540 TAGCATTCCT GGATAATTGG GAAATGAATG GATATACCAT TCAAACGAAA AATGGCAGTC 600 AAATGGGATG ATTCATTTGC AGAAAAAGGA TATACAAAAT TTGTTTCGAA TCCATATGAA 660 GCCCATACAG CAGGAGATCC TTATACCGAT TATGAAAAAG CAGCAAAAGA TATTCCTTTA 720 TCGAACGCAA AAGAAGCCTT TAATCCTCTT GTAGCTGCTT TTCCATCTGT CAATGTAGGA 780 TTAGAAAAAG TAGTAATTTC TAAAAATGAG GATATGAGTC AGGGTGTATC ATCCAGCACT 840 TCGAATAGTG CCTCTAATAC AAATTCAATT GGTGTTACCG TAGATGCTGG TTGGGAAGGT 900 TTGTTCCCTA AATTTGGTAT TTCAACTAAT TATCAAAACA CATGGACCAC TGCACAAGAA 960 TGGGGCTCTT CTAAAGAAGA TTCTACCCAT ATAAATGGAG CACAATCAGC CTTTTTAAAT 1020 GCAAATGTAC GATAT 1035 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.34: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 345 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.34: aly Leu He Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe Asn Asn Leu Thr 1 5 10 15 Met Phe Ala Pro Thr He Asn Asn Thr Leu He Tyr Asp Arg Gln Thr 20 25 30 Ala Asp Thr Leu Leu Asn Lys Gln Gln Oln Olu Phe Asn Ser He Arg 35 40 45 Trp He Oly Leu He Gln Ser Lys Glu Thr Gly Asp Phe Thr Phe Gln 50 55 60 Leu Ser Asp Asp Lys Asn Ala He He Glu He Asp Gly Lys Val Val 65 70 75 80 Ser Arg Arg Gly Glu Asp Lys Gln Thr He His Leu slu Lys sly Lys 85 90 95 Met Val Pro He Lys He slu Tyr Oln Ser Asn slu Pro Leu Thr Val 100 105 110 Asp Ser Lys Val Phe Asn Asp Leu Lys Leu Phe Lys He Asp sly His 115 120 125 Asn Gln Ser His Gln He sln sln Asp Asp Leu Lys He Leu Asn Leu 130 135 140 He Lys Arg Lys Arg Lys Ser Phe Tyr sln Lys Gln Gln Lys Glu Pro 145 150 155 160 Phe Leu Phe Lys Thr Gly Leu Arg Ser Asp Glu Asp Asp Asp Leu Gly 165 170 175 Tyr Arg Trp Xaa Xaa His Ser Trp He He Gly Lys Xaa Met Asp He 180 185 190 Pro Phe Lys Arg Lys Met Ala Val Lys Trp Asp Asp Ser Phe Ala Glu 195 200 205 Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Tyr Glu Ala His Thr Ala 210 215 220 Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Lys Asp He Pro Leu 225 230 235 240 Ser Asn Ala Lys Glu Ala Phe Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe Pro Ser 245 250 255 Val Asn Val Gly Leu Glu Lys Val Val He Ser Lys Asn Glu Asp Met 260 265 270 Ser Gln sly Val Ser Ser Ser Thr Ser Asn Ser Ala Ser Asn Thr Asn 275 280 285 Ser He Gly Val Thr Val Asp Ala Gly Trp Glu Gly Leu Phe Pro Lys 290 295 300 Phe Gly He Ser Thr Asn Tyr Gln Asn Thr Trp Thr Thr Ala Oln Glu 305 310 315 320 Trp Gly Ser Ser Lys Glu Asp Ser Thr His He Asn Gly Ala Gln Ser 325 330 335 Ala Phe Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr 340 345 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.35: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1037 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.35: GGGTTAATTG GGTATTATTT TAAAGGGAAA GATTTTAATA ATCTGACTAT GTTTGCACCA 60 ACCATAAATA ATACGCTTAT TTATGATCGG CAAACAGCAG ATACACTATT AAATAAGCAG 120 CAACAAGAGT TCAATTCTAT TCGATGGATT GGTTTAATAC AAAGTAAAGA AACAGGTGAC 180 TTTACATTCC AATTATCAGA TGATAAAAAT GCCATCATTG AAATAGATGG AAAAGTTGTT 240 TCTCGTAGAG GAGAAGATAA ACAAACTATC CATTTAGAAA AAGGAAAGAT GGTTCCAATC 300 AAAATTGAGT ACCAGTCCAA TGAACCTCTT ACTGTAGATA GTAAAGTATT TAACGATCTT 360 AAACTATTTA AAATAGATGG TCATAATCAA TCGCATCAAA TACAGCAAGA TGATTTGAAA 420 AATCCTGAAT TTAATAAAAA AGAAACGAAA GAGCTTT" rAT CAAAAACAGC AAAAAGRAAC 480 CTTTTCTCTT CAAACGRRGT KGAGAAGCGA TGAGGATGAT RATCYTAGAT ACAGGTGGKG 540 ATAGCATTCC YKGATAATTG GGGAAATGAA WGGRTATACC ATTCAACSGA AAAATGGSAG 600 TCAAATGGGA TGATTCATTT GCGGAAAAAG GATATACAAA ATTTGTTTCG AATCCATATG 660 AAGCCCATAC AGCAGGAGAT CCTTATACCG ATTATGAAAA AGCAGCAAAA GATATTCCTT 720 TATCGAACGC AAAAGAAGCC TTTAATCCTC TTGTAGCTGC TTTTCCATCT GTCAATGTAG 780 GATTAGAAAA AGTAGTAATT TCTAAAAATG AGGATATGAG TCAGGGTGTA TCATCCAGCA 840 CTTCGAATAG TGCCTCTAAT ACAAATTCAA TTGGTGTTAC CGTAGATGCT GGTTGGGAAG 900 GTTTGTTCCC TAAATTTGGT ATTTCAACTA ATTATCAAAA CACATGGACC ACTGCACAAG 960 AATGGGGCTC TTCTAAAGAA GATTCTACCC ATATAAATGG AGCACAATCA GCCTTTTTAA 1020 ATGCAAATGT ACGATAT 1037 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.36: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1048 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.36: TGGGTTAATT GGGTATTATT TTAAAGGGCA AGAGTTTAAT CATCTTACTT TGTTCGCACC 60 AACACGTGAT AATACCCTTA TTTATGATCA ACAAACAGCG AATTCCTTAT TAGATACCAA 120 GCAACAAGAA TATCAATCTA TTCGCTGGAT TGGTTTAATT CAAAGTAAAG AAACGGGTGA 180 TTTCACATTT AACTTATCAG ATGATCAACA TGCAATTATA GAAATCGATG GCAAAATCAT 240 TTCGCATAAA GGACAGAATA AACAAGTTGT TCACTTAGAA AAAGGAAAGT TAGTCCCGAT 300 • AAAAATTGAG TATCAATCAG ATCAACTATT AAATAGGGAT AGTAACATCT TTAAAGAGTT 360 TAAATTATTC AAAGTAGATA GTCAGCAACA CGCTCACCAA GTTCAACTAG ACGAATTAAG 420 AAACCCTGCG TTTAATAAAA AGGAAACACA ACAATCTTAA GAAAAAGCAT CCAAAAACAA 480 TCTTTTTACA CCAGGGACAT TAAAAGGAAG ATACTGATGA TGATGATAAG GATAACAGGA 540 TGGGAGATTC TATTCCTGGA CCTTTTGGGG GAAGAAAATG GGTATACCAA TCCCAAAATA 600 AAATAGCTGG TCCAAGTGGG ATGTTCATTC GCCGCGAAAG GGTATACAAA TTTGTTTCTT 660 AATCCACTTG ATAGTCATAC AGTTGGAGAT CCCTATACGG ATTATGAAAA AGCAGCAAGA 720 GATTTAGACT TGGCCCAATG CAAAAGAAAC GAACCCA TTAGTAGCTG CTTTTCCAAG 780 TGTGAATGTG AATTTGGAAA AAGTCATTTT ATCTAAAGAT GAAAATCTAT CCAATAGTGT 840 AGAGTCACAT TCCTCCACCA ACTGGTCTTA TACGAATACA GAAGGAGCTT CTATCGAAGC 900 TGGGGCTAAA CCAGAGGGTC CTACTTTTGG AGTGAGTGCT ACTTATCAAC ACTCTGAAAC 960 AGTTGCAAAA GAATGGGGAA CATCTACAGG AAATACCTCG CAATTTAATA CAGCTTCAGC 1020 AGGATATTTA AATGCAAATG TACGATAT 1048 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.37: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1175 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.37: ACCTCTAGAT GCANGCTCGA GCGGCCGCCA GTGTGATGGA TATCTGCAGA ATTCGGATTA 60 CTTGGGTATT ATTTTAAAGG GAAAGAGTTT AATCATCTTA CTTTGTTCGC ACCAACACGT 120 GATAATACCC TTATTTATGA TCAACAAACA GCGAATTCCT TATTAGATAC CAAACAACAA 180 GAATATCAAT CTATTCGCTG GATTGGTTTG ATTCAAAGTA AAGAAACAGG TGATTTCACG 240 TTTAACTTAT CTGATGATCA AAATGCAATT ATAGAAATAG ATGGCAAAAT CATTTCGCAT 300 AAAGGACAGA ATAAACAAGT TGTTCACTTA GAAAAAGGAA AGTTAGTCCC GATAAAAATT 360 GAGTATCAAT CAGATCAGAT ATTAACTAGG GATAGTAACA TCTTTAAAGA GTTCAATTAT 420 TCAAAGTAGA TAGTCAAGCA ACACTCTCAC CAAAGTTCAA CTTAGGNCNG AATTAAGNAA 480 CCCTNGGATT TTAANTTNAA AAAAAGGAAC CCNCANCATT CTTTAGGAAA AAGCAGCAAN 540 AACCAAATCC TTTTTTACCA CAGGATATTG AAAAGGAGAT ACGGGNTNGA TGATGGATTG 600 ATACCGGGAT ACCAGTTGGG GNTTCTANTC CCTGACCTTT GGGGAAAGAA AATNGGTATA 660 CCNATCCCAA AANTTAAGCC AGCTGTCCAG GTGGGATGAT TCAATTCGCC CGCGAAAGGG 720 TATACCAAAA TTTGTTTCTT AATCCACTTG AGAGTCATAC AGTTGGAGAT CCCTATACGG 780 ATTATGAAAA AGCAGCAAGA GATTTAGACT TGGCCAATGC AAAAGAAACA TTTAACCCAT 840 TAGTAGCTGC ITCCAAGT GTGAATGTGA ATTTGGAAAA AGTAATATTA TCCCCAGATG 900 AGAATTTATC TAACAGTGTA GAATCTCATT CGTCTACAAA TTGGTCTTAT ACGAATACTG 960 AAGGAGCTTC TATCGAAGCT GGGGGTGGTC CATTAGGTAT TTCATTTGGA GTGAGTGCTA 1020 ATTATCAACA CTCTGAAACA GTTGCAAAAG AATGGGGAAC ATCTACAGGA AATACCTCGC 1080 AATTTAATAC AGCTTCAGCA GGATATTTAA ATGCCAATGG TCGATNTAAG CCGAATNCCA 1140 NCACACTGNC GGCCGTTAGT AGTGGCACCG AGCCC 1175 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.38: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1030 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.38: GGRTTAMTTG GGTATTATTT TAAAGGGAAA GATTTTAATG ATCTTACTGT ATTTGCACCA 60 ACGCGTGGGA ATACTCTTGT ATATGATCAA CAAACAGCAA ATACATTACT AAATCAAAAA 120 CAACAAGACT TTCAGTCTAT TCGTTGGGTT GGTTTAATTC AAAGTAAAGA AGCAGGCGAT 180 TTTACATTTA ACTTATCAGA TGATGAACAT ACGATGATAG AAATCGATGG GAAAGTTATT 240 TCTAATAAAG GGAAAGAAAA ACAAGTTGTC CATTTAGAAA AAGGACAGTT CGTTTCTATC 300 AAAATAGAAT ATCAAGCTGA TGAACCATTT AATGCGGATA GTCAAACCTT TAAAAATTTG 360 AAACTCYTTA AAGTAGATAC TAAGCAACAG TCCCAGCAAA TTCAACTAGA TGAATTAAGA 420 AACCCTGRAA TTTAATAAAA AAGAAACACA AGAATTTCTA ACAAAAGCAA CAAAAACAAA 480 CCTTATTACT CAAAAAGTGA AGAGTACTAG GGATGAAGAC ACGGATACAG ATGGAGATTC 540 TATTCCAGAC ATTTGGGAAG AAAATGGGTA TACCATCCAA AATAAGATTG CCGTCAAATG 600 .

GGATGATTCA TTAGCAAGTA AAGGATATAC GAAATTTGTT TCAAACCCAC TAGATACTCA 660 CACGGTTGGA GATCCTTATA CAGATTATGA AAAAGCAGCA AGGGATTTAG ATTTGTCAAA 720 TGCAAAAGAA ACATTTAACC CATTAGTTGC GGCTTTTCCA AGTGTGAATG TGAGTATGGA 780 AAAAGTGATA TTGTCTCCAG ATGAGAACTT ATCAAATAGT ATCGAGTCTC ATTCATCTAC 840 GAATTGGTCG TATACGAATA CAGAAGGGGC TTCTATTGAA GCTGGTGGGG GAGCATTAGG 900 CCTATCTTTT GGTGTAAGTG CAAACTATCA ACATTCTGAA ACAGTTGGGT ATGAATGGGG 960 AACATCTACG GGAAATACTT CGCAATTTAA TACAGCTTCA GCGGGGTATT TAAATGCCAA 1020 TRTAMGATAT 1030 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.39: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.39: CACTCAAAAA ATGAAAAGGG AAA 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.40: CCGGTTTTAT TGATGCTAC 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.41 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.41 : AGAACAATTT TTAGATAGGG 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.42: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.42: TCCCTAAAGC ATCAGAAATA 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.43: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1170 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómíco) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.43: ATGAAGAAAC AAATAGCAAG CGTTGTAACT TGTACGCTAT TAGCCCCTAT GCTTTTTAAT 60 GGAGATATGA ACGCTGCTTA CGCAGCTAGT CAAACAAAAC AAACACCTGC AGCTCAGGTA 120 AACCAAGAGA AAGAAGTAGA TCGAAAAGGA TTACTTGGCT ATTACTTTAA AGGGAAAGAT 180 TTTAATGATC TTACTGTATT TGCACCAACG CGTGGGAATA CTCTTGTATA TGATCAACAA 240 ACAGCAAATA CATTACTAAA TCAAAAACAA CAAGACTTTC AGTCTATTCG TTGGGTTGGT 300 TTAATTCAAA GTAAAGAAGC AGGCGATTTT ACATTTAACT TATCAGATGA TGAACATACG 360 ATGATAGAAA TCGATGGGAA AGTTATTTCT AATAAAGGGA AAGAAAAACA AGTTGTCCAT 420 TTAGAAAAAG GACAGTTCGT TTCTATAAAA TGATTCAGCT GATGAACCAT TTAATGCGGT 480 AGTAAACCTT TAAAAATTTG AAACTCTTTA AAGTAGATAC TAAGCAACAG TCCCAGCAAA 540 TTCAACTAGA TGAATTAAGA AACCCTGAAT TTAATAAAAA AGAAACACAA GAATTTCTAA 600 CAAAAGCAAC AAAAACAAAC CTTATTACTC AAAAAGTGAA GAGTACTAGG GATGAAGACA 660 CGGATACAGA TGGAGATTCT ATTCCAGACA TTTGGGAAGA AAATGGGTAT ACCATCCAAA 720 ATAAATTGCC GTCAAATGGG ATGATTCATT AGCAAGTAAA GGATATACGA AATTTGTTTC 780 AAACCCACTA GATACTCACA CGGTTGGAGA TCCTTATACA GATTATGAAA AAGCAGCAAG 840 - GGATTTAGAT TTGTCAAATG CAAAAGAAAC ATTTAACCCA TTAGTTGCGG CTTTTCCAAG 900 TGTAATTGAG TATGGAAAAA GGATTTGTTC CAGATGAGAA CTTATCAAAT AGTATCGAGT 960 TCATTCATTC CTACAATTGG TCGATACGAA TACAGAAGGG GCTTCTATTG AAGCTGGTGG 1020 GGGAGCATTA GGCCTATCTT TTGGTGTAAG TGCAAACTAT CAACATTCTG AAACAGTTGG 1080 GTATGAATGG GGAACATCTA CGGGAAATAC TTCGCAA1 AATACAGCTT CAGCGGGGTA 1140 TAAATGCG AATGTTGCTA CAATAACGTG 1 170 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.44: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 348 aminoácidos (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.44: Met Lys Lys Gln He Ala Ser Val Val Thr Cys Thr Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Met Leu Phe Asn Gly Asp Met Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Ser Gln Thr 20 25 30 Lys Gln Thr Pro Ala Ala Oln Val Asn Gln Glu Lys Glu Val Asp Arg 35 40 45 Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe Asn Asp Leu 50 55 60 Thr Val Phe Ala Pro Thr Arg Gly Asn Thr Leu Val Tyr Asp Gln Gln 65 70 75 80 Thr Ala Asn Thr Leu Leu Asn Gln Lys Gln Gln Asp Phe Gln Ser He 85 90 95 Arg Trp Val Oly Leu He Gln Ser Lys Glu Ala Gly Asp Phe Thr Phe 100 105 110 Asn Leu Ser Asp Asp Glu His Thr Met He Glu He Asp Gly Lys Val 115 120 125 He Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gln Val Val His Leu Glu Lys Gly 130 135 140 Gln Phe Val Ser Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Asp slu Pro Phe Asn 145 150 155 160 Ala Xaa Ser Xaa Thr Phe Lys Asn Leu Lys Leu Phe Lys Val Asp Thr 165 170 175 Lys Oln Gln Ser Gln sln He Gln Leu Asp Glu Leu Arg Asn Pro Glu 180 185 190 Phe Asn Lys Lys Glu Thr Gln Glu Phe Leu Thr Lys Ala Thr Lys Thr 195 200 205 Asn Leu He Thr Gln Lys Val Lys Ser Thr Arg Asp Glu Asp Thr Asp 210 215 220 Thr Asp Gly Asp Ser He Pro Asp He Trp Glu Glu Asn Gly Tyr Thr 225 230 235 240 He Gln Asn Xaa He Ala Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu Ala Ser Lys 245 250 255 Oly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Leu Asp Thr His Thr Val Gly 260 265 270 Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp Leu Ser 275 280 285 Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe Pro Ser Val 290 295 300 Asn Xaa Ser Met Glu Lys Xaa He Leu Xaa Pro Asp Glu Asn Leu Ser 305 310 315 320 Asn Ser He Olu Xaa His Ser Phe Leu Xaa He Gly Arg He Arg He 325 330 335 Gln Lys Oly Leu Leu Leu Lys Leu Val Gly Glu His 340 345 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.45: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 3 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xí) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.45: ATG (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.46: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1 aminoácido (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.46: Met (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.47: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2583 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.47: ATGACATATA TGAAAAAAAA GTTAGTTAGT GTTGTAACTT GCACGTTATT GGCTCCGATA 60 TGACTG GAAATGTACA TCCTGTTAAT GCAGACAGTA AAAAAAGTCA GCCTTCTACA 120 GCGCAGGAAA AACAAGAAAA GCCGGTTGAT CGAAAAGGGT TACTCGGCTA TTTTTTTAAA 180 GGGAAAGAGT TTAATCATCT TACTTTGTTC GCACCAACAC GTGATAATAC CCTTATTTAT 240 GATCAACAAA CAGCGAATTC CTTATTAGAT ACCAAACAAC AAGAATATCA ATCTATTCGC 300 TGGATTGGTT TGATTCAAAG TAAAGAAACA GGTGATTTCA CGTTTAACTT ATCTGATGAT 360 CAAAATGCAA TTATAGAAAT > AGATGGCAAA ATCATTTCGC ATAAAGGACA GAATAAACAA 420 GTTGTTCACT TAGAAAAAGG AAAGTTAGTC CCGATAAAAA TTGAGTATCA ATCAGATCAG 480 ATATTAACTA GGGATAGTAA CATCTTTAAA GAGTTTCAAT TATTCAAAGT AGATAGTCAG 540 CAACACTCTC ACCAAGTTCA ACTAGACGAA TTAAGAAACC CTGATTTTAA TAAAAAAGAA 600 ACACAACAAT TCTTAGAAAA AGCAGCAAAA ACAAATCTTT TTACACAGAA TATGAAAAGA 660 GATACGGATG ATGATGATGA TACGGATACA GATGGAGATT CTATTCCTGA CCTTTGGGAA 720 GAAAATGGGT ATACCATCCA AAATAAAGTA GCTGTCAAGT GGGATGATTC ATTCGCCGCG 780 AAAGGGTATA CAAAATTTGT TTCTAATCCA CTTGAGAGTC ATACAGTTGG AGATCCCTAT 840 ACGGATTATG AAAAAGCAGC AAGAGATTTA GACTTGGCCA ATGCAAAAGA AACATTTAAC 900 CCATTAGTAG CTGCTTTTCC AAGTGTGAAT GTGAATTTGG AAAAAGTAAT ATTATCCCCA 960 GATGAGAATT TATCTAACAG TGTAGAATCT CATTCGTCTA CAAATTGGTC TTATACGAAT 1020 ACTGAAGGAG CTTCTATCGA AGCTGGGGGT GGTCCATTAG GTATTTCATT TGGAGTGAGT 1080 GCTAATTATC AACACTCTGA AACAGTTGCA AAAGAATGGG GAACATCTAC AGGAAATACC 1140 TCGCAATTTA ATACAGCTTC AGCAGGATAT TTGAATGCGA ATGTTCGATA CAATAATGTG 1200 GGAACAGGTG CGATTTATGA GGTGAAACCT ACAACAAGTT TTGTATTAGA TAAAGATACT 1260 GTAGCAACAA TTACCGCAAA ATCGAATTCG ACAGCTTTAA GTATATCTCC AGGAGAAAGT 1320 TATCCCAAAA AAGGACAAAA TGGAATTGCA ATTAATACAA TGGATGATTT TAATTCCCAT 1380 CCGATTACAT TAAATAAACA ACAATTAGAT CAACTATTAA ATAATAAACC TCTTATGTTA 1440 GAAACAAATC AGGCAGATGG TGTTTATAAA ATAAAGGATA CAAGCGGTAA TATTGTGACT 1500 GGTGGAGAAT GGAACGGTGT TATCCAACAA ATTCAAGCAA AAACAGCCTC TATTATCGTT 1560 GATACGGGAG AAAGTGTTTC AGAAAAGCGT GTCGCAGCAA AAGATTATGA TAATCCTGAG 1620 GATAAAACAC CTTCTTTATC TTTAAAAGAG GCACTTAAAC TTGGATATCC AGAAGAAATT 1680 AAAGAAAAAG ATGGATTGTT GTACTATAAG GACAAGCCAA TTTACGAATC TAGTGTTATG 1740 ACTTATCTAG ATGAGAATAC AGCCAAGGAA GTGGAAAAAC AATTACAGGA TACAACCGGA 1800 ATATATAAAG ATATCAATCA TTTATATGAT GTGAAATTAA CACCTACAAT GAATTTTACG 1860 ATÍAAATTAG CTTCCTTATA TGATGGAGCT GAAAATAATG ATGTGAAGAA TGGTCCTATA 1920 GGACATTGGT ATTATACCTA TAATACAGGG GGAGGAAATA CTGGAAAACA CCAATATAGG 1980 TCTGCTAATC CCAGTGCAAA TGTAGTTTTA TCTTCTGAAG CGAAAAGTAA GTTAGATAAA 2040 AATACAAATT ACTACCTTAG TATGTATATG AAAGCTGAGT CTGATACAGA GCCTACAATA 2100 GAAGTAAGTG GTGAGAATTC TACGATAACG AGTAAAAAGG TAAAACTAAA CAGTGAGGGC 2160 TATCAAAGAG TAGATATTTT AGTGCCGAAT TCTGAAAGAA ATCCAATAAA TCAAATATAT 2220 GTAAGAGGAA ATAATACAAC AAATGTATAC TGGGATGATG TTTCAATTAC AAATATTTCA 2280 GCTATAAACC CAAAAACTTT AACAGATGAA GAAATTAAAG AAATATATAA AGATTTTAGT 2340 GAGTCTAAAG ACTGGCCTTG GTTCAATGAT GTTACGTTTA AAAATATTAA ACCATTAGAG 2400 AATTATGTAA AACAATATAG AGTTGATTTC TGGAATACTA ATAGTGATAG ATCATTTAAT 2460 AGGATTAAGG ACAGTTACCC AGTTAATGAA GATGGAAGTG TTAAAGTCAA CATGACAGAA 2520 TATAATGAAG GATATCCACT TAGAATTGAA TCCGCCTACC ATTTAAATAT TTCAGATCTA 2580 TAA 2583 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.48: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 860 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.48: Met Thr Tyr Met Lys Lys Lys Leu Val Ser Val Val Thr Cys Thr Leu 1 5 10 15 Leu Ala Pro He Phe Leu Thr Gly Asn Val His Pro Val Asn Ala Asp 20 25 30 Ser Lys Lys Ser Gln Pro Ser Thr Ala Gln Glu Lys Gln Glu Lys Pro 35 40 45 Val Asp Arg Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Phe Lys Gly Lys Glu Phe 50 55 60 Asn His Leu Thr Leu Phe Ala Pro Thr Arg Asp Asn Thr Leu He Tyr 65 70 75 80 Asp Gln Gln Thr Ala Asn Ser Leu Leu Asp Thr Lys Gln Oln Olu Tyr 85 90 95 Gln Ser He Arg Trp He Gly Leu He Gln Ser Lys slu Thr Gly Asp 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Leu Ser Asp Asp Gln Asn Ala He He Glu He Asp 115 120 125 Gly Lys He He Ser His Lys Gly Gln Asn Lys Gln Val Val His Leu 130 135 140 Glu Lys Gly Lys Leu Val Pro He Lys He Glu Tyr Gln Ser Asp Gln 145 150 155 • 160 He Leu Thr Arg Asp Ser Asn He Phe Lys Glu Phe Gln Leu Phe Lys 165 170 175 Val Asp Ser Gln Gln His Ser His Gln Val Gln Leu Asp slu Leu Arg 180 185 190 Asn Pro Asp Phe Asn Lys Lys slu Thr Gln Gln Phe Leu Glu Lys Ala 195 200 205 Ala Lys Thr Asn Leu Phe Thr Gln Asn Met Lys Arg Asp Thr Asp Asp 210 215 220 Asp Asp Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser He Pro Asp Leu Trp Glu 225 230 235 240 Glu Asn Gly Tyr Thr He Gln Asn Lys Val Ala Val Lys Trp Asp Asp 245 250 255 Ser Phe Ala Ala Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Leu Glu 260 265 270 Ser His Thr Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg 275 280 285 Asp Leu Asp Leu Ala Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala 290 295 300 Ala Phe Pro Ser Val Asn Val Asn Leu Glu Lys Val He Leu Ser Pro 305 310 315 320 Asp Glu Asn Leu Ser Asn Ser Val slu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp 325 330 335 Ser Tyr Thr Asn Thr Olu sly Ala Ser He Glu Ala Gly Gly Gly Pro 340 345 350 Leu Gly He Ser Phe Gly Val Ser Ala Asn Tyr Gln His Ser Olu Thr 355 360 365 Val Ala Lys Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gln Phe Asn 370 375 380 Thr Ala Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr Asn Asn Val 385 390 395 400 Gly Thr Gly Ala He Tyr Glu Val Lys Pro Thr Thr Ser Phe Val Leu 405 410 415 Asp Lys Asp Thr Val Ala Thr He Thr Ala Lys Ser Asn Ser Thr Ala 420 425 430 Leu Ser He Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Lys Lys Gly Gln Asn Gly 435 440 445 He Ala He Asn Thr Met Asp Asp Phe Asn Ser His Pro He Thr Leu 450 455 460 Asn Lys Gln Gln Leu Asp Gln Leu Leu Asn Asn Lys Pro Leu Met Leu 465 470 475 480 Glu Thr Asn Gln Ala Asp Gly Val Tyr Lys He Lys Asp Thr Ser Gly 485 490 495 Asn He Val Thr Gly Gly Glu Trp Asn Gly Val He Gln sln He Gln 500 505 510 Ala Lys Thr Ala Ser He He Val Asp Thr Gly Glu Ser Val Ser slu 515 520 525 Lys Arg Val Ala Ala Lys Asp Tyr Asp Asn Pro Glu Asp Lys Thr Pro 530 535 540 Ser Leu Ser Leu Lys Glu Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Pro Glu Glu He 545 550 555 560 Lys Glu Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asp Lys Pro He Tyr Glu 565 570 575 Ser Ser Val Met Thr Tyr Leu Asp Glu Asn Thr Ala Lys Olu Val slu 580 585 590 Lys sln Leu Gln Asp Thr Thr Gly He Tyr Lys Asp He Asn His Leu 595 600 605 Tyr Asp Val Lys Leu Thr Pro Thr Met Asn Phe Thr He Lys Leu Ala 610 615 620 Ser Leu Tyr Asp Gly Ala Glu Asn Asn Asp Val Lys Asn Gly Pro He 625 630 635 640 Gly His Trp Tyr Tyr Thr Tyr Asn Thr Gly Gly Gly Asn Thr Gly Lys 645 650 655 His sln Tyr Arg Ser Ala Asn Pro Ser Ala Asn Val Val Leu Ser Ser 660 665 670 slu Ala Lys Ser Lys Leu Asp Lys Asn Thr Asn Tyr Tyr Leu Ser Met 675 680 685 Tyr Met Lys Ala Glu Ser Asp Thr Glu Pro Thr He Glu Val Ser Gly 690 695 700 Glu Asn Ser Thr He Thr Ser Lys Lys Val Lys Leu Asn Ser Glu Gly 705 710 715 720 Tyr Gln Arg Val Asp He Leu Val Pro Asn Ser Glu Arg Asn Pro He 725 730 735 Asn Gln He Tyr Val Arg Gly Asn Asn Thr Thr Asn Val Tyr Trp Asp 740 745 750 Asp Val Ser He Thr Asn He Ser Ala He Asn Pro Lys Thr Leu Thr 755 760 765 Asp Glu Glu He Lys Glu He Tyr Lys Asp Phe Ser Glu Ser Lys Asp 770 775 780 Trp Pro Trp Phe Asn Asp Val Thr Phe Lys Asn He Lys Pro Leu Glu 785 790 795 800 Asn Tyr Val Lys Gln Tyr Arg Val Asp Phe Trp Asn Thr Asn Ser Asp 805 810 815 Arg Ser Phe Asn Arg He Lys Asp Ser Tyr Pro Val Asn Glu Asp Gly 820 825 830 Ser Val Lys Val Asn Met Thr Glu Tyr Asn Glu sly Tyr Pro Leu Arg 835 840 845 He Glu Ser Ala Tyr His Leu Asn He Ser Asp Leu 850 855 860 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.49: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1356 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.49: ATGGTATCCA AAAAGTTACA ATTAGTCACA AAAACTTTAG TGTTTAGTAC AGTTTTGTCA 60 ATACCGTTAT TAAATAATAG TGAGATAAAA GCGGAACAAT TAAATATGAA TTCTCAAATT 120 AAATATCCTA ACTTCCAAAA TATAAATATC GCTGATAAGC CAGTAGATTT TAAAGAGGAT 180 AAAGAAAAAG CACGAGAATG GGGAAAAGAA AAAGAAAAAG AGTGGAAACT AACTGCTACT 240 GAAAAAGGGA AAATTAATGA TTTTTTAGAT GATAAAGATG GATTAAAAAC AAAATACAAA 300 GAAATTAATT TTTCTAAGAA TTTTGAATAT GAAACAGAGT TAAAACAGCT TGAAAAAATT 360 AATAGCATGC TAGATAAAGC AAATCTAACA AATTCAATTG TCACGTATAA AAACGTTGAG 420 CCTACAACAA TAGGATTCAA TCACTCTTTG ACTGATGGGA ATCAAATTAA TTCCGAAGCT 480 CAACAGAAGT TCAAGGAACA GTTTTTAGGA AATGATATTA AATTTGATAG TTATTTGGAT 540 ATGCACTTAA CTGAACAAAA TGTTTCCGGT AAAGAAAGGG TTATTTTAAA AGTTACAGTA 600 CTTAGTGGGA AAGGTTCTAC TCCAACAAAA GCAGGTGTTG TTTTAAATAA TAAAGAATAC 660 AAAATGTTGA TTGATAATGG ATATATACTA CATGTAGAAA ACATAACGAA AGTTGTAAAA 720 AAAGGACAGG AATGTTTACA AGTTGAAGGA ACGTTAAAAA AGAGCTTGGA CTTTAAAAAT 780 GATAGTGACG GTAAGGGAGA TTCCTGGGGA AAGAAAAATT ACAAGGAATG GTCTGATTCT 840 TTAACAAATG ATCAGAGAAA AGACTTAAAT GATTATGGTG CGCGAGGTTA TACCGAAATA 900 AATAAATATT TACGTGAAGG GGGTACCGGA AATACAGAGT TGGAGGAAAA AATTAAAAAT 960 ATTTCTGACG CACTAGAAAA GAATCCTATC CCTGAAAACA TTACTGTTTA TAGATATTGC 1020 GGAATGGCGG AATTTGGTTA TCCAATTCAA CCCGAGGCTC CCTCCGTACA AGATTTTGAA 1080 GAGAAATTTT TGGATAAAAT TAAGGAAGAA AAAGGATATA TG AGTACG AG CTTATCAAGT 1140 • GATGCGACTT CTTTTGGCGC AAGAAAAATT ATCTTAAGAT TGCAGATACC AAAAGGAAGT 1200 TCAGGAGCAT ATGTAGCTGG TTTAGATGGA TTTAAACCAG CAGAGAAGGA GATTCTTATT 1260 GATAAGGGAA GCAAGTATCA TATTGATAAA GTAACAGAAG TAGTTGTGAA AGGTATTAGA 1320 AAACTCGTAG TAGATGCGAC ATTATTATTA AAATAA 1356 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.50: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 451 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.50: Met Val Ser Lys Lys Leu Gln Leu Val Thr Lys Thr Leu Val Phe Ser 1 5 10 15 Thr Val Leu Ser He Pro Leu Leu Asn Asn Ser slu He Lys Ala slu 20 25 30 Gln Leu Asn Met Asn Ser Gln He Lys Tyr Pro Asn Phe Gln Asn He 35 40 45 Asn He Ala Asp Lys Pro Val Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala 50 55 60 Arg Olu Trp Gly Lys Glu Lys Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr 65 70 75 80 Glu Lys Gly Lys He Asn Asp Phe Leu Asp Asp Lys Asp Oly Leu Lys 85 90 95 Thr Lys Tyr Lys Olu He Asn Phe Ser Lys Asn Phe slu Tyr Glu Thr 100 105 110 Glu Leu Lys Gln Leu slu Lys He Asn Ser Met Leu Asp Lys Ala Asn 115 120 125 Leu Thr Asn Ser He Val Thr Tyr Lys Asn Val slu Pro Thr Thr He 130 135 140 Gly Phe Asn His Ser Leu Thr Asp Gly Asn Gln He Asn Ser Glu Ala 145 150 155 160 Gln Gln Lys Phe Lys Olu Gln Phe Leu Gly Asn Asp He Lys Phe Asp 165 170 175 Ser Tyr Leu Asp Met His Leu Thr Glu sln Asn Val Ser Oly Lys Olu 180 185 190 Arg Val He Leu Lys Val Thr Val Leu Ser Gly Lys Gly Ser Thr Pro 195 200 205 Thr Lys Ala Oly Val Val Leu Asn Asn Lys Glu Tyr Lys Met Leu He 210 215 220 Asp Asn Gly Tyr He Leu His Val Glu Asn He Thr Lys Val Val Lys 225 230 235 240 Lys Oly Gln Glu Cys Leu Gln Val Glu Gly Thr Leu Lys Lys Ser Leu 245 250 255 Asp Phe Lys Asn Asp Ser Asp Gly Lys Gly Asp Ser Trp Gly Lys Lys 260 265 270 Asn Tyr Lys Glu Trp Ser Asp Ser Leu Thr Asn Asp Gln Arg Lys Asp 275 280 285 Leu Asn Asp Tyr Gly Ala Arg Gly Tyr Thr Glu He Asn Lys Tyr Leu 290 295 300 Arg Glu Gly Gly Thr Oly Asn Thr Glu Leu Glu Glu Lys He Lys Asn 305 310 315 320 He Ser Asp Ala Leu Glu Lys Asn Pro He Pro Glu Asn He Thr Val 325 330 335 Tyr Arg Tyr Cys Gly Met Ala Glu Phe Gly Tyr Pro He Gln Pro Glu 340 345 350 Ala Pro Ser Val Gln Asp Phe Glu Glu Lys Phe Leu Asp Lys He Lys 355 360 365 Glu Glu Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Asp Ala Thr Ser 370 375 380 Phe Gly Ala Arg Lys He He Leu Arg Leu Gln He Pro Lys Gly Ser 385 390 395 400 Ser Gly Ala Tyr Val Ala Gly Leu Asp Gly Phe Lys Pro Ala Glu Lys 405 410 415 Glu He Leu He Asp Lys Gly Ser Lys Tyr His He Asp Lys Val Thr 420 425 430 Glu Val Val Val Lys sly He Arg Lys Leu Val Val Asp Ala Thr Leu 435 440 445 Leu Leu Lys 450 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO.51 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 47 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.51 : GCTCTAGAAG GAGGTAACTT ATGAACAAGA ATAATACTAA ATTAAGC 47 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.52: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.52: GGGGTACCTT ACTTAATAGA GACATCG 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.53: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2364 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.53: ATGAATATGA ATAATACTAA ATTAAACGCA AGGGCCCTAC CGAGTTTTAT TGATTATTTT 60 AATGGCATTT ATGGATTTGC CACTGGTATC AAAGACATTA TGAATATGAT TTTTAAAACG 120 GATACAGGTG GTAATCTAAC CTTAGACGAA ATCCTAAAGA ATCAGCAGTT ACTAAATGAG 180 ATTTCTGGTA AATTGGATGG GGTAAATGGG AGCTTAAATG ATCTTATCGC ACAGGGAAAC 240 TTAAATACAG AATTATCTAA GGAAATCTTA AAAATTGCAA ATGAACAGAA TCAAGTCTTA 300 AATGATGTTA ATAACAAACT CGATGCGATA AATACGATGC TTCATATATA TCTACCTAAA 360 ATCACATCTA TGTTAAGTGA TGTAATGAAG CAAAATTATG CGCTAAGTCT GCAAGTAGAA 420 TACTTAAGTA AACAATTGAA AGAAATTTCT GATAAATTAG ATGTTATTAA CGTAAATGTT 480 CTTATTAACT CTACACTTAC TGAAATTACA CCTGCATATC AACGGATTAA ATATGTAAAT 540 GAAAAATTTG AAGAATTAAC TTTTGCTACA GAAACCACTT TAAAAGTAAA AAAGGATAGC 600 TCGCCTGCTG ATATTCTTGA CGAGTTAACT GAATTAACTG AACTAGCGAA AAGTGTTACA 660 AAAAATGACG TGGATGGTTT TGAATTTTAC CTTAATACAT TCCACGATGT AATGGTAGGA 720 AATAATTTAT TCGGGCGTTC AGCTTTAAAA ACTGCTTCAG AATTAATTGC TAAAGAAAAT 780 GTGAAAACAA GTGGCAGTGA AGTAGGAAAT GTTTATAATT TCTTAATTGT ATTAACAGCT 840 CTACAAGCAA AAGCTTTTCT TACTTTAACA ACATGCCGAA AATTATTAGG CTTAGCAGAT 900 ATTGATTATA CATCTATTAT GAATGAACAT TTAAATAAGG AAAAAGAGGA ATTTAGAGTA 960 AACATCCTTC CTACACTTTC TAATACTTTT TCTAATCCTA ATTATGCAAA AGTTAAAGGA 1020 AGTGATGAAG ATGCAAAGAT GATTGTGGAA GCTAAACCAG GACATGCATT GGTTGGGTTT 1080 GAAATTAGTA ATGATTCAAT GACAGTATTA AAAGTATATG AAGCTAAGCT AAAACAAAAT 1140 TACCAAGTTG ATAAGGATTC CTTATCGGAA GTCATTTATA GTGATATGGA TAAATTATTG 1200 TGCCCAGATC AATCTGAACA AATTTATTAT ACAAATAATA TAGTATTTCC AAATGAATAT 1260 GTAATTACTA AAATTGATTT TACTAAGAAA ATGAAAACTT TAAGATATGA GGTAACAGCT 1320 AATTCTTACG ATTCTTCTAC AGGAGAAATT GACTTAAATA AGAAGAAAGT AGAATCAAGT 1380 GAAGCGGAGT ATAGGACGTT AAGTGCTAAT AATGATGGAG TATATATGCC GTTAGGTGTC 1440 ATCAGTGAAA CATTTTTGAC TCCAATTAAT GGATTTGGCC TCCAAGCTGA TGAAAATTCA 1500 AGATTAATTA CTTTAACATG TAAATCATAT TTAAGGGAAC TACTACTAGC GACAGACTTA 1560 AGCAATAAAG AAACTAAATT GATTGTCCCG CCTATTAGTT TTATTAGTAA TATTGTAGAA 1620 AATGGGAACT TAGAGGGAGA AAACTTAGAG CCGTGGATAG CAAATAACAA AAATGCGTAT 1680 GTAGATCATA CAGGTGGTAT AAATGGAACT AAAGTTTTAT ATGTTCATAA GGATGGTGAG 1740 TTTTCACAAT TTGTTGGAGG TAAGTTAAAA TCGAAAACAG AATATGTAAT TCAATATATT 1800 GTAAAGGGAA AAGCTTCTAT TTATTTAAAA GATAAAAAAA ATGAGAATTC CATTTATGAA 1860 GAAATAAATA ATGATTTAGA AGGTTTTCAA ACTGTTACTA AACGTTTTAT TACAGGAACG 1920 GATTCTTCAG GGATTCATTT AATTTTTACC AGTCAAAATG GCGAGGGAGC ATTTGGAGGA 1980 AACTTTATTA TCTCAGAAAT TAGGACATCC GAAGAGTTAT TAAGTCCAGA ATTGATTATG 2040 TCGGATGCTT GGGTTGGATC CCAGGGAACT TGGATCTCAG G AAATTCTCT CACTATTAAT 2100 AGTAATGTAA ATGGAACCTT TCGACAAAAT CTTCCGTTAG AAAGTTATTC AACCTATAGT 2160 ATGAACTTTA CTGTGAATGG ATTTGGCAAG GTGACAGTAA GAAATTCTCG TGAAGTATTA 2220 TTTGAAAAAA GTTATCCGCA GCTTTCACCT AAAGATATTT CTGAAAAATT TACAACTGCA 2280 GCCAATAATA CCGGATTATA TGTAGAGCTT TCTCGCTCAA CGTCGGGTGG TGCAATAAAT 2340 TTCCGAGATT TTTCAATTAA GTAA 2364 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0.54: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 787 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xí) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0.54: Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 He Asp Tyr Phe Asn sly He Tyr Gly Phe Ala Thr Gly He Lys Asp 20 25 30 He Met Asn Met He Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu 35 40 45 Asp Glu He Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu He Ser Gly Lys 50 55 60 Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu He Ala Gln Gly Asn 65 70 75 80 Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu He Leu Lys He Ala Asn Glu Gln 85 90 95 Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala He Asn Thr 100 105 110 Met Leu His He Tyr Leu Pro Lys He Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 115 120 125 Met Lys Oln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu sln Val Olu Tyr Leu Ser Lys 130 135 140 Gln Leu Lys slu He Ser Asp Lys Leu Asp Val He Asn Val Asn Val 145 150 155 160 Leu He Asn Ser Thr Leu Thr Olu He Thr Pro Ala Tyr sln Arg He 165 170 175 Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr 180 185 190 Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp He Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val 210 215 220 Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly 225 230 235 240 Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu He 245 250 255 Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr 260 265 270 Asn Phe Leu He Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr 275 280 285 Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp He Asp Tyr Thr 290 295 300 Ser He Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val 305 310 315 320 Asn He Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala 325 330 335 ID Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met He Val Glu Ala Lys 340 345 350 Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu He Ser Asn Asp Ser Met Thr 355 360 365 Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Oln Val Asp 370 375 380 15 Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val He Tyr Ser Asp Met Asp Lys Leu Leu 385 390 395 400 Cys Pro Asp Gln Ser Olu Gln He Tyr Tyr Thr Asn Asn He Val Phe 405 410 415 Pro Asn Glu Tyr Val He Thr Lys He Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys 420 425 430 20 Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Thr Gly 435 440 445 Glu He Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 450 455 460 Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asn Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val 465 470 475 480 He Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro He Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala 485 490 495 Asp Glu Asn Ser Arg Leu He Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg 500 505 510 Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu He 515 520 525 Val Pro Pro He Ser Phe He Ser Asn He Val Glu Asn Gly Asn Leu 530 535 540 Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp He Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr 545 550 555 560 Val Asp His Thr Gly Gly He Asn Gly Thr Lys Val Leu Tyr Val His 565 570 575 Lys Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Val Gly Gly Lys Leu Lys Ser Lys 580 585 590 Thr Glu Tyr Val He Gln Tyr He Val Lys Gly Lys Ala Ser He Tyr 595 600 605 Leu Lys Asp Lys Lys Asn Glu Asn Ser He Tyr Glu Glu He Asn Asn 610 615 620 Asp Leu Glu Gly Phe Gln Thr Val Thr Lys Arg Phe He Thr Gly Thr 625 630 635 640 Asp Ser Ser Oly He His Leu He Phe Thr Ser Gln Asn Gly Glu Gly 645 650 655 Ala Phe Gly Gly Asn Phe He He Ser Glu He Arg Thr Ser Glu Glu 660 665 670 Leu Leu Ser Pro Glu Leu He Met Ser Asp Ala Trp Val Gly Ser Gln 675 680 685 Gly Thr Trp He Ser Gly Asn Ser Leu Thr He Asn Ser Asn Val Asn 690 695 700 Gly Thr Phe Arg Gln Asn Leu Pro Leu Glu Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser 705 710 715 720 Met Asn Phe Thr Val Asn Gly Phe Gly Lys Val Thr Val Arg Asn Ser 725 730 735 Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Ser Tyr Pro Gln Leu Ser Pro Lys Asp 740 745 750 He Ser Glu Lys Phe Thr Thr Ala Ala Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val 755 760 765 Glu Leu Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly Ala He Asn Phe Arg Asp Phe 770 775 780 Ser He Lys 785

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un polinucleótido aislado que codifica para una proteína plaguicidamente activa, en donde una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31 , SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41 , SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 51 , SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53 y SEQ ID NO. 54 híbrida bajo condiciones estrictas con una secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína o es complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína.

2.- Un polinucleótido aislado que codifica para por lo menos para una porción plaguicidamente activa de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 50 y SEQ ID NO. 54.

3.- Un polinucleótido aislado que codifica por lo menos para una porción plaguicidamente activa de una proteína seleccionada del grupo que consiste en una proteína MIS-1 producida por el aislado PS33F1 de B. t, una proteína MIS-7; una proteína MIS-8 y una proteína SUP producida por KB59A4-6.

4.- Un polinucleótido aislado que codifica para una proteína plaguicidamente activa producida por un aislado seleccionado del grupo que consiste en PS33F1 , PS71G4, PS86D1 , PS185V2, PS191A21 , PS201Z, PS205A3, PS205C, PS234E1 , PS248N10, KB63B19-13, KB63B19-7, KB68B62-7, KB68B63-2, KB69A125-1 , KB69A125-3, KB69A125-5, KB69A127-7, KB69A132-1 , KB69B2-1 , KB70B5-3, KB71A125-15, KB71A35-6, KB71A72-1 , KB71A134-2, PS185Y2 y KB59A4-6.

5.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha proteína es una proteína MIS producida por un aislado seleccionado del grupo que consiste en PS177C8a, PS66D3, PS177I8, PS31 F2, PS185Y2, KB68B46-2, KB68B51-2, KB6855-2, KB53A49-4, PS86D1 , HD573B, PS33F1 , PS205C, PS157C1 , PS201Z, PS71G4, KB71A72-1 , KB71A134-2, KB69A125-3 y KB69A127-7.

6.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha proteína es una proteína WAR producida por un aislado seleccionado del grupo que consiste en PS177C8a, PS66D3, PS177I8, PS31 F2, PS185Y2, KB68B46-2, KB68B51-2, KB6855-2, KB53A49-4, HD573B, PS33F1 , PS205C, PS157C1 , PS201Z, PS71G4, KB71A72-1 , KB71A134-2, KB69A125-3 y KB69A127-7.

7.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha proteína es una proteína WAR producida por un aislado seleccionado del grupo que consiste en KB68B46-2, PS86D1 , HD573B, PS33F1 , PS205C, PS157C1 , PS201Z, PS71G4, KB71A72-1 , KB71A134-2, KB69A125-3, KB69A127-7, PS31 F2 y KB68B46-2.

8.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha proteína es activa contra gusanos de raíz del maíz occidental, y en donde dicha proteína se produce por un aislado seleccionado del grupo que consiste en PS205A3, PS185V2, PS234E1 , PS71G4, PS248N10, PS191A21 , KB63B19-13, KB63B19-7, KB68B62-7, KB68B63-2, KB69A125-1 , KB69A125-3, KB69A125-5, KB69A127-7, KB69A132-1 , KB69B2-1 , KB70B5-3, KB71A125-15 y KB71A35-6.

9.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha proteína es una proteína MIS-7 producida por el aislado PS157C1-A de B. t.

10.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha proteína comprende por lo menos una porción plaguicida de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO.34.

11.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque dicho polinucleótido comprende por lo menos una porción de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 33 que es suficiente para codificar para una proteína plaguicidamente activa.

12.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha proteína es una proteína MIS-7 producida por el aislado PS201Z de B. t.

13.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende por lo menos una porción de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 35 que es suficiente para codificar para una proteína plaguicidamente activa.

14.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 35.

15.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha proteína es una proteína MIS-7 producida por el aislado PS205C de B. t.

16.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha proteína comprende por lo menos una porción plaguicida de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N0.44.

17.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende por lo menos una porción de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 43 que es suficiente para codificar para una proteína plaguicidamente activa.

18.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha proteína es una proteína MIS-8 producida por el aislado PS31F2 de B. t.

19.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha proteína comprende por lo menos una porción plaguicida de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N0.48.

20.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende por lo menos una porción de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 47 que es suficiente para codificar para una proteína plaguicidamente activa.

21.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha proteína es una proteína MIS-8 producida por el aislado PS185Y2 de B. t.

22.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 37.

23.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 38.

24.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho polinucleótido codifica para una proteína que comprende por lo menos una porción plaguicida de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N0.46.

25.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende por lo menos una porción de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 45 que es suficiente para codificar para una proteína plaguicidamente activa.

26.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polinucleótido codifica para una proteína que comprende por lo menos una porción plaguicida de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 50.

27.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende por lo menos una porción de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 49 que es suficiente para codificar para una proteína plaguicidamente activa.

28.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polinucleótido codifica para una proteína que comprende por lo menos una porción plaguicida de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 54.

29.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende por lo menos una porción de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 53 que es suficiente para codificar para una proteína plaguicidamente activa.

30.- Un hospedero recombinante que comprende por lo menos un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.

31.- El hospedero recombinante de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicho hospedero es una célula vegetal.

32.- El hospedero recombinante de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicho hospedero es una planta.

33.- Un hospedero recombinante que comprende por lo menos un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2.

34.- Un hospedero recombinante que comprende por lo menos un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3.

35.- Un hospedero recombinante que comprende por lo menos un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4.

36.- Una proteína plaguicidamente activa codificada por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.

37.- Una proteína plaguicidamente activa codificada por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2.

38.- Una proteína plaguicidamente activa codificada por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3.

39.- Una proteína plaguicidamente activa codificada por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4.

40.- Un método para controlar una plaga que no es de mamíferos poniendo en contacto dicha plaga por lo menos con una proteína plaguicidamente activa codificada por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.

41.- Un método para controlar una plaga que no es de mamíferos poniendo en contacto dicha plaga por lo menos con una proteína plaguicidamente activa codificada por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2.

42.- Un método para controlar una plaga que no es de mamíferos poniendo en contacto dicha plaga por lo menos con una proteína plaguicidamente activa codificada por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3.

43.- Un método para controlar una plaga que no es de mamíferos poniendo en contacto dicha plaga por lo menos con una proteína plaguicidamente activa codificada por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4.

44.- Un método para controlar gusano de la raíz del maíz, en donde dicho método comprende poner en contacto dicho gusano de la raíz del maíz por lo menos con una proteína plaguicidamente activa codificada por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicha proteína se produce por un aislado seleccionado del grupo que consiste en PS205A3, PS185V2, PS234E1 , PS71G4, PS248N10, PS191A21 , KB63B19-13, KB63B19-7, KB68B62-7, KB68B63-2, KB69A125-1 , KB69A125-3, KB69A125-5, KB69A127-7, KB69A132-1 , KB69B2-1 , KB70B5-3, KB71A125-15 y KB71A35-6.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque dicho gusano de la raíz del maíz es gusano de raíz del maíz occidental.

46.- Un método para controlar gusano de raíz del maíz occidental, en donde dicho método comprende poner en contacto dicho gusano de raíz del maíz por lo menos con una proteína plaguicidamente activa codificada por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicha proteína es producida por el aislado PS31 F2 de B. t

47.- Un cultivo biológicamente puro de un aislado de ß. t. que produce una proteína plaguicidamente activa codificada por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho aislado se selecciona del grupo que consiste en PS33F1 , PS71G4, PS86D1 , PS185V2, PS191A21 , PS201Z, PS205A3, PS205C, PS234E1, PS248N10, KB63B19-13, KB63B19-7, KB68B62-7, KB68B63-2, KB69A125-1, KB69A125-3, KB69A125-5, KB69A127-7, KB69A132-1, KB69B2-1, KB70B5-3, KB71A125-15, KB71A35-6, KB71A72-1, KB71A134-2, PS185Y2 y KB59A4-6.

48.- Un polinucleótido de diagnóstico para usarse como una sonda o cebador para hibridar a un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho polinucleótido de diagnóstico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31 , SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41 , SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 51 , SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53 y SEQ ID NO. 54.