CN104145020B - 工程化的杀有害生物蛋白质 - Google Patents

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Abstract

披露了针对广泛的有害生物具有高活性的工程化的杀有害生物多肽以及制备此类多肽的方法。编码该杀有害生物多肽的核苷酸序列可以用于转化各种原核和真核生物体，这些生物体可以用于生产这些杀有害生物多肽。这些重组生物体和/或由这些重组生物体产生的多肽可以用于在各种环境中控制有害生物。

Description

工程化的杀有害生物蛋白质
发明领域
本发明涉及对靶生物体具有改变的杀有害生物活性的工程化的多肽、编码这些多肽的多核苷酸，以及制备和使用这些多肽和相应的多核苷酸控制有害生物的方法。
背景
植物有害生物是全世界重要农作物损失中的一个主要因素。由于非哺乳动物有害生物(包含昆虫)的侵染，仅在美国每年就损失大约80亿美元。除了农作物中的损失之外，昆虫有害生物对于菜农和果农，对于观赏性花卉的生产商，以及对于家庭花匠也是一种负担。
昆虫有害生物主要是通过密集使用化学杀有害生物剂来控制，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫成长、预防昆虫摄食或繁殖、或者导致死亡是有效的。由此可以达到良好的昆虫控制，但这些化学品有时也会影响有益的昆虫，并且也许不能达到侵染的位置。由化学杀有害生物剂的广泛使用产生的另一个问题是出现了抗药性昆虫品种。通过各种抗性管理实践已部分地缓和了这种状况，但对于可替代的有害生物控制剂存在着越来越多的需要。
生物性有害生物控制剂，例如表达杀有害生物多肽像δ(δ)-内毒素(也称为Cry蛋白质)的苏云金芽孢杆菌菌株，也已经应用至作物而具有令人满意的结果，因此提供对化学杀有害生物剂的替代或补充。已经分离了这些Cry蛋白中的一些的编码基因并且它们在异源宿主中的表达已经显示出提供了另一种用于控制经济上重要的昆虫有害生物的手段。具体地，Cry蛋白在转基因植物中的表达已经提供了对抗某些昆虫有害生物的有效保护，并且表达此类蛋白质的转基因植物已经被商业化，这允许农民减少或排除对化学昆虫控制剂的应用。
另外，非内毒素基因和它们编码的蛋白质也已经被鉴定出。美国专利5,877,012、6,107,279、6,137,033、和6,291,156连同伊施特鲁赫(Estruch)等人(1996，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)93:5389-5394)和于(Yu)等人(1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:532-536)(都通过引用结合在此)描述了被称为Vip3的一个新类型的杀昆虫蛋白。Vip3编码序列编码大概88kDa的蛋白质，该蛋白质是由苏云金芽孢杆菌在它生长的营养期产生和分泌的(营养期杀昆虫蛋白或Vip)。该Vip3A蛋白对广谱的鳞翅类有害生物具有杀昆虫活性，这些鳞翅类有害生物包括但不限于黑切根虫(BCW，小地老虎)、秋季行军虫(fall armyworm)(FAW，草地贪夜蛾)、烟夜蛾(TBW，烟芽夜蛾)、以及棉铃虫(CEW，谷实夜蛾)，但对欧洲玉米钻蛀虫(ECB，欧洲玉米螟)不具有活性。最近，已发现表达该Vip3A蛋白的植物对由半翅类昆虫有害生物引起的摄食损害具有抗性(美国专利号6,429,360)。因此，该Vip3A蛋白显示具有独特的杀昆虫活性谱。WO 03/075655、WO 02/078437、WO98/18932、WO 98/33991、WO 98/00546、以及WO 99/57282已经鉴定了该Vip3类蛋白的其他成员。
关于表达杀昆虫蛋白的转基因作物部署产生的一个忧虑是昆虫有害生物是否将会变得抗杀昆虫蛋白。种子产业、大学研究员以及美国环境保护局已经一起合作来制定管理计划以帮助缓和昆虫抗性的发生。这些计划主要是基于高剂量以及避护所策略。例如对于玉米中的欧洲玉米钻蛀虫的一个高剂量策略是使用表达足够高水平的杀昆虫蛋白的玉米杂交体来杀死甚至有部分抗性的欧洲玉米钻蛀虫。基础的假设是杀死有部分抗性的ECB并且大力防止它们交配延迟了抗性的发展。一个高剂量策略的成功部分取决于杀昆虫蛋白对欧洲玉米钻蛀虫的比活性以及在这种转基因玉米植物中可以表达多少这种蛋白。例如，杀昆虫蛋白对有害生物的比活性越高，为实现高剂量策略需要在转基因植物中表达的杀昆虫蛋白就越少。因此，例如由于该Cry蛋白(Cry1Ab)对于欧洲玉米钻蛀虫幼虫很具毒性(即，高比活性)，在转基因植物中可实现的Cry1Ab的表达水平很容易将这样的玉米杂交体置于高剂量范畴中。
因此，仍需要发现新型并有效的为农民提供经济利益并且是环境上可接受的有害生物控制剂。具体需要的是靶向更广谱的经济上重要的昆虫有害生物并且针对对现存的昆虫控制剂有抗性或会变得有抗性的昆虫有害生物具有高比活性的控制剂。此外，其应用使环境负担最小化的药剂是令人希望的。
因此，本发明通过提供包括Vip多肽的组合物连同用于制备和使用这些多肽的方法解决了本领域中先前的缺点，这些Vip多肽针对靶生物体(例如昆虫)具有改变的杀有害生物(例如杀昆虫)活性和/或对具体的细胞和/或生物体具有改变水平/程度的毒性。
概述
在一方面中，本发明提供一种工程化的杀有害生物多肽，该工程化的杀有害生物多肽包括与SEQ ID NO:1(Vip3D)具有至少95％一致性的氨基酸序列并且进一步在对应于表1中识别的一个位置、或其任意组合的位置上包括至少一个氨基酸突变，其中与一种野生型多肽的ECB活性相比，该突变改进了针对至少欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫，ECB)的杀有害生物活性，该工程化的杀有害生物多肽衍生自该野生型多肽。在本发明的一些方面中，提供了包括本发明的工程化的多肽的一种组合物。在其他方面中，提供了包括编码本发明的工程化的杀有害生物多肽的核苷酸序列的一种核酸分子。
在另一个方面中，本发明还提供了包括本发明的核酸分子的一种转基因非人类宿主细胞。
本发明的另一个方面提供一种产生针对至少欧洲玉米钻蛀虫具有杀有害生物活性的多肽的方法，该方法包括在一个转基因非人类宿主细胞中表达本发明的核酸分子，从而产生针对至少欧洲玉米钻蛀虫具有杀有害生物活性的一种多肽。
另外提供的是一种产生抗有害生物转基因植物的方法，该方法包括：向植物体内引入包括本发明的一个核苷酸序列的一种重组核酸分子，其中该核苷酸序列编码在该植物中表达的一种杀有害生物多肽，从而赋予该植物对至少欧洲玉米钻蛀虫的抗性，并产生一种抗有害生物转基因植物。在一些实施例中，该有害生物是一种昆虫有害生物。
在本发明的另外的实施例中，提供了一种控制昆虫的方法，该方法包括向这些昆虫递送有效量的本发明的工程化的杀有害生物多肽。在本发明的一些方面中，这些昆虫是鳞翅类昆虫。在本发明的其他方面中，这些鳞翅类昆虫是欧洲玉米钻蛀虫和秋季行军虫。在本发明的一些方面中，本发明的工程化的多肽是经口递送给这些昆虫。
本发明的一个另外的方面提供一种产生针对靶细胞和/或生物体具有改进的杀有害生物活性的杀有害生物多肽的方法，该方法包括：a)将多肽的氨基酸序列进行比对，其中多肽中的至少一个对该靶细胞和/或生物体展现至少中等杀有害生物活性；b)鉴定使得在(a)的比对的氨基酸序列中的至少两个之间不同的至少一个氨基酸残基；c)针对在步骤(b)中鉴定的至少一个氨基酸残基取代一个氨基酸残基，以产生一种修饰的多肽；d)确定在步骤(c)中产生的修饰的多肽针对该靶细胞和/或生物体的杀有害生物活性的水平；并且e)选择(d)的针对该靶细胞和/或生物体具有改进的杀有害生物活性的一个修饰的多肽，从而产生针对该靶细胞和/或生物体具有改进的杀有害生物活性的一种多肽。在本发明的一些方面中，该杀有害生物活性是杀昆虫活性,并且该靶细胞或生物体是一种昆虫细胞或昆虫。在本发明的其他方面中，鉴定使得在比对的氨基酸序列中的至少两个之间不同的至少一个氨基酸残基包括在比对的氨基酸序列中鉴定一个必需的氨基酸位置、一个增效剂氨基酸位置、一个隐藏增效剂氨基酸位置、或其任意组合。
通过阅读以下说明书并且参照形成其一部分的附图、或出于披露目的给出的本发明的实施例的任何实例，其他的以及进一步的目的、特征以及优点将会清楚并且更易于理解。
附图简要说明
图1显示对用本发明的多核苷酸转化植物有用的12225载体。
在序列表中的序列的简要说明
SEQ ID NO:1是Vip3D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是对SEQ ID NO:1(Vip3D)进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3是Vip3D多肽的K455A突变型的氨基酸序列(Vip3E)。
SEQ ID NO:4是对SEQ ID NO:3进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5是Vip3D多肽的V338A突变型的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是对SEQ ID NO:5进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7是V768A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是对SEQ ID NO:7进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9是I544A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是对SEQ ID NO:9进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11是E760A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是对SEQ ID NO:11进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是S712A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是对SEQ ID NO:13进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15是Vip3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是Vip3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是Vip3C的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是R465A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是对SEQ ID NO:18进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20是S532A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是对SEQ ID NO:20进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22是G580A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是对SEQ ID NO:22进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24是L766A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是对SEQ ID NO:24进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26是D471A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是对SEQ ID NO:26进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:28是Q495A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是对SEQ ID NO:28进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:30是R501A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是对SEQ ID NO:30进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:32是S543A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33是对SEQ ID NO:32进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:34是P591A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35是对SEQ ID NO:34进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:36是P605A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是对SEQ ID NO:36进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:38是H608A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39是对SEQ ID NO:38进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:40是Y616A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41是对SEQ ID NO:40进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:42是I617A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43是对SEQ ID NO:42进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:44是H618A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45是对SEQ ID NO:44进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:46是R635A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47是对SEQ ID NO:46进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:48是K643A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49是对SEQ ID NO:48进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:50是W658A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51是对SEQ ID NO:50进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:52是P681A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53是对SEQ ID NO:52进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:54是I753A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:55是对SEQ ID NO:54进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:56是S774A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:57是对SEQ ID NO:56进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:58是G775A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:59是对SEQ ID NO:58进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:60是H779A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:61是对SEQ ID NO:60进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:62是L514A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:63是对SEQ ID NO:62进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:64是E546A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:65是对SEQ ID NO:64进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:66是T614A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:67是对SEQ ID NO:66进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:68是T724A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:69是对SEQ ID NO:68进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:70是T743A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:71是对SEQ ID NO:70进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:72是S744A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:73是对SEQ ID NO:72进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:74是T756A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:75是对SEQ ID NO:74进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:76是S761A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:77是对SEQ ID NO:76进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:78是T764A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:79是对SEQ ID NO:78进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:80是G778A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:81是对SEQ ID NO:80进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:82是V785A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:83是对SEQ ID NO:82进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:84是M362A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:85是对SEQ ID NO:84进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:86是L494A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:87是对SEQ ID NO:86进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:88是I503A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:89是对SEQ ID NO:88进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:90是T600A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:91是对SEQ ID NO:90进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:92是N625A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:93是对SEQ ID NO:92进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:94是Y629A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:95是对SEQ ID NO:94进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:96是K650A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:97是对SEQ ID NO:96进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:98是N682A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:99是对SEQ ID NO:98进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:100是S683A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:101是对SEQ ID NO:100进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:102是L701A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:103是对SEQ ID NO:102进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:104是M747A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:105是对SEQ ID NO:104进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:106是R773A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:107是对SEQ ID NO:106进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:108是V372A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:109是对SEQ ID NO:108进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:110是G689突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:111是对SEQ ID NO:110进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:112是F400A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:113是对SEQ ID NO:112进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:114是包括在高度保守的N-端分泌信号中的Vip3-特异性氨基酸序列。
SEQ ID NO:115是I544A/S712A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:116是对SEQ ID NO:115进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:117是K455A/V338A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:118是对SEQ ID NO:117进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:119是H618A/T750A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:120是对SEQ ID NO:119进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:121是L701A/I721A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:122是对SEQ ID NO:121进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:123是S722A/S781A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:124是对SEQ ID NO:123进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:125是S761A/S744A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:126是对SEQ ID NO:125进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:127是S781A/S744A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:128是对SEQ ID NO:127进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:129是S781A/T750A突变型Vip3D多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:130是对SEQ ID NO:129进行编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO:131-252是用于进行丙氨酸取代的X1cgcX2引物。
SEQ ID NO:253-340是用于改变突变的vip3密码子的第一和/或第二位置以进行丙氨酸取代的引物。
SEQ ID NO:341-452是用于制备旋转突变型(spin mutant)的引物。
SEQ ID NO:453是在本发明中有用的定点诱变载体中编码的氨基酸表位。
SEQ ID NO:454是编码Vip3E(K455A突变型)的玉米优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:455是Cry2Aa多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:456是Cry2Ab多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:457是Cry2Ac多肽的氨基酸序列。
详细说明
本发明涉及修饰Vip多肽、修饰Vip多肽以增加杀有害生物活性(例如针对所选择的有害生物(例如昆虫有害生物)的杀有害生物活性)的方法，并涉及制备和使用这些多肽以控制此类有害生物。具体而言，提供了用作杀有害生物剂的修饰的Vip3多肽。
本说明不意在是一个本发明实施的所有不同方式、或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以结合入其他实施例中，并且关于一个具体实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略在此陈述的任何特征或特征的组合。另外，鉴于本披露内容，对在此建议的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域内的普通技术人员是清楚的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐明本发明的一些具体实施例，并不旨在完全列举出其所有排列、组合以及变型。
除非另外定义，否则所有在此使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在本发明的在此说明中使用的术语是仅出于描述具体实施例的目的，且并不旨在限制本发明。
在本说明书中提到的所有公开文件和专利申请对于本发明所涉及的领域的技术人员的技术水平是指示性的。此外，公开、专利申请、专利、以及其他在此提到的参考文献通过引用以其全部内容结合在此。
如在本发明的实施例的说明和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”旨在还包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。
如在此使用的，“和/或”是指并且涵盖相关列出项目中的一个或多个的任何和所有可能的组合。
如在此使用的术语“约”当是指一个可测量的值如化合物的量、剂量、时间、温度等时意在涵盖20％、10％、5％、1％、0.5％、或甚至0.1％的指定量的变化。
术语“包含(comprises和/或comprising)”当用于本说明书中时指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、和/或组分的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、和/或其组的存在或添加。
如在此使用的，连接词“基本上由...组成”(以及语法变体)意指，权利要求书的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由...组成”不旨在被解读为等同于“包含”。
本发明的Vip3多肽的“活性”是指该Vip3多肽起生物活性控制剂的作用。因此，例如当充当杀昆虫剂时，本发明的Vip3多肽充当经口活性昆虫控制剂，具有一种毒性作用，和/或能够干扰或阻止昆虫摄食，这可能引起或者可能不引起该昆虫的死亡。当本发明的Vip3多肽被递送给该昆虫时，这种结果典型地是该昆虫的死亡，或者该昆虫停止在使该Vip3多肽对该昆虫有效的来源上摄食。
如在此处使用的针对该Vip多肽和编码该Vip多肽的多核苷酸的术语“修饰(modify、modifying和/或modification)”(及其语法变体)是指改变野生型或参照Vip氨基酸和多核苷酸，以使得相对于野生型或参照Vip氨基酸和多核苷酸的毒性，产生自该改变的氨基酸和多核苷酸的多肽的毒性被改变。对氨基酸序列的特异性修饰由针对待被修饰的氨基酸所指定的单一字母、该修饰的位置以及针对替代氨基酸的单一字母代码来标记。例如“V338A”意指在位置338处的缬氨酸被替代为丙氨酸。Vip多肽的“毒性变化”包括但不限于当它涉及任何具体靶生物体和/或被靶定的一个或多个生物体中的变化时毒性上的增加和/或降低。
如在此使用的，“可操作地连接”当指示可操作地连接至第二核酸序列的第一核酸序列时意指在该第一核酸序列与该第二核酸序列处于功能性关系中时的情况。例如，如果一个启动子影响一个编码序列的转录或表达，那么该启动子可操作地连接到该编码序列。可操作地连接的核酸序列可以是连续的，或它们可以例如对于转录增强子来说彼此为远端。
“嵌合基因”是一种重组核酸分子，其中一个启动子或调节多核苷酸可操作地连接至对一个mRNA进行编码或者表达为一种多肽的一个多核苷酸，以使得该调节多核苷酸能够调节该关联的对一个mRNA进行编码或表达为一种多肽的多核苷酸的转录或表达。如在自然中发现的，该嵌合基因的调节多核苷酸一般不是可操作地连接至该关联的对一个mRNA进行编码或者表达为一种多肽的多核苷酸。
“编码序列”是转录成核糖核酸(RNA)(例如前-RNA、mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)的一个多核苷酸。在一些实施例中，该RNA然后在一个生物体或一个细胞中被翻译以产生一种蛋白质。
“控制”一种生物体(例如昆虫有害生物)意指通过毒性作用抑制生物体(例如昆虫有害生物)存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力或者限制作物中与该生物体活动有关的损害或损失。“控制”一种生物体可以是或可以不是意指杀死该生物体，尽管它优选地意指杀死该生物体。
在本发明的背景下，“对应于(Corresponding to或corresponds to)”意指在将变体Vip3多肽的氨基酸序列(野生型或工程化的)与一个参照Vip3氨基酸序列进行比对时，该变体Vip3多肽的氨基酸与该参照Vip3氨基酸序列的某些已列举的氨基酸位置对齐，但不必然是在相对于具体的变体Vip3氨基酸序列的这些确切数字位置处，该变体中的氨基酸“对应于”参照氨基酸序列中的位置。例如而不限于，当将一个Vip3A氨基酸序列(SEQ ID NO:15)与一个参照Vip3D氨基酸序列(SEQ ID NO:1)进行比对时，在SEQ ID NO:15的氨基酸位置753处的丝氨酸(S)与位置754处的谷氨酸(E)和在SEQ ID NO:1的氨基酸位置754处的丝氨酸(S)与位置755处的甘氨酸(G)对齐。因此，根据本发明，Vip3A(SEQ ID NO:15)的S753和E754分别“对应于”Vip3D(SEQ ID NO:1)的S754和G755。在一个另外的非限制实例中，当将一个Cry2Ac氨基酸序列(SEQ ID NO:457)与一个参照Cry2Aa氨基酸序列(SEQ ID NO:455)进行比对时，在SEQ ID NO:457的氨基酸位置517处的精氨酸与在SEQ ID NO:455的氨基酸位置527处的谷氨酰胺对齐。因此，根据本发明，Cry2Ac(SEQ ID NO:457)的R517对应于Cry2Aa(SEQ ID NO:455)的Q527。
如在此处使用的“杀有害生物的”、“杀昆虫的”、“杀线虫的”等等是指一种Vip多肽(例如Vip3多肽)控制一个有害生物生物体的能力或可控制如此处定义的一个有害生物生物体的一种Vip多肽(例如Vip3多肽)的量。因此，一种杀有害生物Vip多肽(例如Vip3多肽)可杀死一个有害生物生物体(例如昆虫有害生物)或抑制其存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力。
出于本发明的一些实施例的目的，昆虫有害生物包括而不限于选自以下各目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、隐翅目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等等。在本发明的一些方面中，这些昆虫有害生物来自鳞翅目。这类鳞翅类昆虫包括而不限于欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫)、小菜蛾(菱形斑纹蛾)、草地贪夜蛾(秋季行军虫)、小地老虎(黑切根虫)、谷实夜蛾(棉铃虫)、烟芽夜蛾(烟夜蛾)、甜菜夜蛾(甜菜行军虫)、巨座玉米螟(西南玉米钻蛀虫)、小蔗螟(甘蔗钻蛀虫)、粉纹夜蛾(甘蓝尺蠖)、西非蛀茎夜蛾(Sesamia nonagroides)(地中海玉米钻蛀虫)、红铃麦蛾(红铃虫)、向日葵细卷叶蛾(Cochylis hospes)(带状向日葵斑蛾(banded sunflower moth))、茶色铃夜蛾(原生夜蛾)、棉铃虫(棉花螟蛉)、和/或其任意组合。
在本发明的其他方面中，线虫有害生物的非限制性实例包括小环线虫属、茎线虫属、球异皮线虫属、螺旋线虫属、异皮线虫属、长针线虫属、根结线虫属、拟毛刺线虫属、短体线虫属、穿孔线虫属(Radolpholus)、盘旋线虫属(Rotelynchus)、肾形线虫属、小垫刃线虫属、剑线虫属和/或其任意组合。在具体实施例中，线虫有害生物包括而不限于根结线虫属(例如南方根结线虫和爪哇根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫)、异皮线虫属(例如大豆异皮线虫、胡萝卜异皮线虫、甜菜异皮线虫、燕麦异皮线虫和三叶草异皮线虫)、球异皮线虫属(例如，马铃薯金线虫)、穿孔线虫属(例如，相似穿孔线虫)、肾形线虫属、短体线虫属(例如落选短体线虫和穿刺短体线虫)、滑刃线虫属、螺旋线虫属、纽带线虫属、类毛刺线虫属、长针线虫属、真珠线虫属、亚蛇形线虫属、刺线虫属、小环线虫属、轮线虫属、茎线虫属、鳞球茎茎线虫、锥线虫属、半轮线虫属、鞘线虫属、潜根线虫属、根结线虫属、大节片线虫属、梅林纽斯属(Meliniusspp.)、斑皮线虫属、五沟线虫属、盾状线虫属、剑线虫属、矮化线虫属、和/或其任意组合。
“有效的有害生物控制量”、“有效的昆虫控制量”或“有效的线虫控制量”是指通过一种毒性作用分别抑制有害生物、昆虫和/或线虫存活、生长、摄食和/或繁殖的能力，或限制作物中与有害生物、昆虫和/或线虫有关的损害或损失的一种多肽的浓度或量。“有效的有害生物控制量”、“有效的昆虫控制量”或“有效的线虫控制量”可意指或可不意指分别杀死有害生物、昆虫和/或线虫，尽管它优选意为杀死该有害生物、昆虫和/或线虫。
如在此使用的术语“基因”是指能够被用于生产mRNA或反义RNA的核酸分子。基因可以或不可以能够用于产生功能蛋白质。基因可以包括编码区和非编码区(例如、内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列和5'和3'非翻译区)二者。基因可以是“分离的”，这意指一种核酸，其基本上或本质上不含正常情况下发现的在其天然状态下与这种核酸结合的组分。此类组分包括其他细胞物质、来自重组生产的培养基和/或在化学合成该核酸时所用的各种化学品。
“感兴趣的多核苷酸”是指当被转移至一种植物时，在该植物上赋予一种所希望的特征(例如抗生素抗性、病毒抗性、虫抗性、疾病抗性、或对其他有害生物的抗性、除草剂耐受性、改进的营养价值、改进的工业过程的性能或者改变的繁殖能力)的任何多核苷酸。“感兴趣的多核苷酸”还可以是被转移至植物用于在该植物中产生商业上有价值的酶或代谢物的一种多核苷酸。
“异源多核苷酸”是一个不与它被引入其中的宿主细胞天然地关联的多核苷酸，包括天然存在的多核苷酸的非天然存在的多个拷贝。
“野生型”核酸、核苷酸序列、多核苷酸、多肽或氨基酸序列指的是天然存在的(“天然的(native)”)或内源核酸、核苷酸序列、多核苷酸、多肽或氨基酸序列。因此，例如，“野生型mRNA”是天然存在于或内源于有机体的mRNA。“同源多核苷酸”是与它被引入其中的宿主细胞天然相关联的多核苷酸。
“同源重组”是在同源核酸分子之间的核酸片段的相互交换。
如在此处使用的“杂交体毒素”是由人手工制备的一种杀有害生物(例如杀昆虫的)毒素，该毒素包括与来自一种不同毒素的氨基酸区域或片段连接的一种毒素的氨基酸区域或片段。
当一个核酸序列编码了一种多肽，该多肽与由一种参比核酸序列所编码的多肽具有相同的氨基酸序列时，这种核苷酸序列与这种参比核酸序列“同类编码”。
“改进的Vip3多肽”是一种突变型Vip3多肽，当与它的野生型亲本Vip3多肽相比时，该多肽显示以下特征中的一个或多个：1)针对靶昆虫的效力增加(更高的比活性)或杀伤率增加(在可比的蛋白水平下更快的杀死)；2)靶有害生物谱增加或减小；3)靶有害生物的抗性发展的敏感性降低；4)在转基因宿主或宿主细胞中的表达水平增加；5)对昆虫蛋白酶降解的抗性增加(在靶昆虫肠道中的稳定性增加)；6)在环境中的稳定性增加；以及7)对有益昆虫、非靶有害生物、以及植物的毒性降低。
在本发明的背景中，“改进杀有害生物(例如杀昆虫的、杀线虫的)活性”或“改进的杀有害生物(例如杀昆虫的、杀线虫的)活性”或其任意语法变体意指本发明的突变得到本发明的具有以下特征中的一个或多个的工程化的多肽：1)针对靶有害生物(例如昆虫和/或线虫)的效力增加(即更高的比活性)或杀伤率增加(在可比的蛋白水平下更快的杀死)，2)靶有害生物谱增加或减小，3)靶有害生物的抗性发展的敏感性降低，4)在转基因宿主或宿主细胞中的表达水平增加，5)对昆虫蛋白酶降解的抗性增加(在靶昆虫肠道中的稳定性增加)，6)在环境中的稳定性增加，以及7)对有益昆虫、非靶有害生物、以及植物的毒性降低。
“分离的”核酸分子或“分离的”多肽是通过人手工从其天然环境中分开而存在的一种核酸分子或多肽并因此不是自然的产物。分离的核酸分子或分离的多肽可以按纯化形式存在或可以存在于非天然环境例如像重组宿主细胞中。因此，例如，相对于多核苷酸而言，术语分离的意指将该多核苷酸从它天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出。如果将一种多核苷酸从它天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出并且然后将其插入它并不天然存在于其中的遗传背景、染色体、和/或细胞中，则该多核苷酸也是被分离的。本发明的工程化的多肽、编码该工程化的多肽的核苷酸序列、以及重组核酸分子可被认为是如上定义的“分离的”，包括当被包含在转基因植物或转基因植物细胞中时。
“核酸分子”、“核酸序列”、“多核苷酸”或“核苷酸序列”是可以从任何来源分离的单链或双链DNA或RNA的线性片段。
“调节元件”是指涉及控制多核苷酸的表达的序列。因此，例如调节元件可包括一个可操作地连接至感兴趣的多核苷酸和终止信号上的启动子。调节元件还典型地涵盖了适当翻译该多核苷酸所需要的序列。
“改组的”核酸是由改组程序例如此处提出的任何改组程序产生的一种核酸。改组的核酸是通过将两个或更多个核酸(或字符串(character string))以例如人工的以及可任选地递归的方式进行重新组合(有形地或无形地)产生的。通常，一个或多个筛选步骤用于在改组过程中鉴定感兴趣的多核苷酸；该筛选步骤可在任何重新组合步骤之前或之后执行。在一些(但不是全部)改组实施例中，希望的是在选择增加待筛选的库的多样性之前执行多个回合的重新组合。可任选地将重新组合和选择的整个过程递归地重复。依赖于背景，改组可以指重新组合和选择的整个过程，或可替代地可仅仅指整个过程的重新组合部分。
如在此使用的，“比活性”是指具有杀昆虫效果所需要的蛋白质的量。因此，当一种第一蛋白质具有比一种第二蛋白质更高的比活性时，为具有对相同百分比的暴露昆虫的杀昆虫效果所耗费的该第一蛋白质的量比第二蛋白质的量更少。比活性的一个量度是杀死50％的暴露昆虫所耗费的多肽的致死浓度(即LC50)。具有比一种第二多肽更低LC50的一种第一多肽具有比该第二多肽更高的比活性。
具有同源性的不同核酸或多肽在此称作“同源物”。术语同源物包括来自相同种类和其他种类的同源序列以及来自相同种类和其他种类的直向同源序列。“同源性”是指就位置一致性(即，序列相似性或一致性)百分比而言，两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间的相似性水平。同源性也是指不同核酸或蛋白质之间相似功能特性的概念。
如在此使用的“序列一致性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的整个比对窗口内不变的程度。“一致性”可以通过已知方法容易地计算出，这些方法包括但不限于以下文献中描述的那些：计算分子生物学(ComputationalMolecular Biology)(莱斯克A.M.(Lesk,A.M.)编辑)牛津大学出版社(Oxford UniversityPress)，纽约(1988)；生物计算：信息学与基因组计划(Biocomputing:Informatics andGenome Projects)(史密斯D.W.(Smith,D.W.)编辑)学术出版社(Academic Press)，纽约(1993)；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)，部分I(格里芬A.M.(Griffin,A.M.)和格里芬H.G.(Griffin,H.G.)编辑)胡马纳出版社(Humana Press)，新泽西州(1994)；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)(冯·海因切G.(von Heinje,G.)编辑)学术出版社(1987)；以及序列分析初级读本(Sequence Analysis Primer)(哥博斯科夫M.(Gribskov,M.)和德弗罗J.(Devereux,J.)编辑)斯托克顿出版社(Stockton Press)，纽约(1991)。
如在此使用的，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指在两个序列最佳比对(在比较窗口范围内具有总计小于参比序列20％的适当核苷酸插入、缺失或空位)时，与检验(“对象”)多核苷酸(或其互补链)相比，参比(“查询”)多核苷酸(或其互补链)的直链核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。在一些实施例中，“一致性百分比”可以是指氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。
如在此使用的，在两个核酸或蛋白质序列的背景下，短语“基本上一致的”是指两个或更多个序列或子序列，这些序列或子序列当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％的核苷酸或氨基酸残基一致性，正如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量。在本发明的一些实施例中，在至少约50个残基至约150个残基长度的序列区域上存在基本上的一致性。因此，在本发明的一些实施例中，在至少约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、或更多个残基长度的序列区域上存在基本上的一致性。在一些具体实施例中，这些序列在至少约150个残基上是基本上一致的。在另一个实施例中，这些序列在编码区的整个长度上是基本上一致的。此外，基本上一致的核苷酸或蛋白质序列基本上执行相同的功能。
对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的一个参比序列。当使用一种序列比较算法时，将测试和参比的序列输入到电脑中(若有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，这种序列比较算法基于所指定的程序参数来计算这个或这些测试序列相对于该参比序列的序列一致性百分比。
用于比对一个比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员所熟知的并且可以由以下工具实施：如史密斯和沃特曼(Waterman)的局部同源性算法、尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)的同源性比对算法、皮尔森(Pearson)和利普曼(Lipman)的相似性搜索方法，并且任选地由这些算法的计算机化实现方式来实施，如作为
Figure BDA0000554259860000161
Wisconsin
Figure BDA0000554259860000162
(材料科学软件公司(Accelrys Inc.)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州)的部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。测试序列和参比序列的已比对区段的“一致性分数”是由两个已比对序列所共有的相同组分的数目除以参比序列区段(即，完整的参比序列或参比序列的更小限定部分)中组分的总数目。序列一致性百分比被表示为一致性分数乘以100。一个或多个核苷酸序列的比较可以是相对于全长核苷酸序列或其一部分，或相对于较长的核苷酸序列。出于本发明的目的，也可以使用针对翻译的核苷酸序列的2.0版BLASTX和针对核苷酸序列的2.0版BLASTN测定“一致性百分比”。
用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)公开地获得。这种算法涉及首先通过识别查询序列中具有具有长度W的字码而鉴定得分高的序列对(HSP)，这些具有长度W的字码当与数据库序列中具有相同长度的一个字码(word)进行比对时匹配或满足某个阳性值的阈值分值T。T称为邻近字码得分阈值(阿尔丘尔(Altschul)等人，1990)。这些初始的邻近命中字码充当种子用于起始搜索以发现包含它们的较长的HSP。然后，将这些命中字码在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以得到增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用一种得分矩阵来计算该累积得分。当累积的比对得分从它所达到的最大值降低了数量X，由于一个或多个负得分的残基比对使的积累使累积的得分降至0或0以下时，这些词的命中记录在每个方向的延伸停止，或者到达了各自序列的末端。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了该比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62得分矩阵作为默认值(参见海尼科夫(Henikoff)与海尼科夫，美国科学院院刊89:10915(1989))。
除计算序列一致性百分比之外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性统计分析(参见，例如，卡林(Karlin)&阿尔丘尔(Altschul)，美国科学院院刊90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小概率总和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生一个匹配的概率的一个指示。例如，如果在一个测试核苷酸序列与一个参比核苷酸序列的比较中的最小概率总和是小于约0.1至小于约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参比序列相似的。因此，在本发明的一些实施例中，在测试核苷酸序列与参比核苷酸序列的比较中的最小概率总和是小于约0.001。
两个核酸序列基本上一致的另一指示是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”是指一种分子在严格条件下仅可与一种具体的多核苷酸结合、双链化或杂交，这是在该多核苷酸存在于DNA的或RNA的一种复合混合物(例如，总细胞的)中时进行的。“基本上结合”是指在一个探针核酸与一个靶核酸之间的互补杂交，并且涵盖少量错配，这些错配可以通过降低该杂交介质的严格度来被容纳，以实现该靶核酸序列的所希望的检测。
在核酸杂交实验(如DNA和RNA杂交)的背景下“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。具有较长的序列的多核苷酸特定地在较高的温度下杂交。对核酸杂交的广泛指导见于蒂森(Tijssen)的生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交(Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)第2章第I部分“杂交原理和核酸探针测定策略综述(Overview of principles of hybridization and thestrategy ofnucleic acid probe assays)”，爱思唯尔(Elsevier)，纽约(1993)。总体上，高严格杂交和洗涤条件在一种限定的离子强度和pH下被选定为比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将会与它的靶子序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。
Tm是50％的靶序列与一种完全匹配的探针进行杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。极严格条件被选定为等于具体探针的Tm。对于互补核酸(它们在Southern或Northern印迹中在滤器上具有超过100个互补的残基)的杂交的严谨杂交条件的一个实例是在42℃下、具有1mg肝素的50％甲酰胺、将杂交进行过夜。高严格洗涤条件的一个实例是0.15MNaCl，在72℃下持续约15分钟。严格洗涤条件的一个实例是在65℃下以0.2x SSC洗涤15分钟(参见萨姆布鲁克，以下针对SSC缓冲液的说明)。经常，高严格性洗涤之前会先进行低严格性洗涤，以去除背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双链体的中等严格性洗涤的一个实例是在45℃下以1x SSC进行15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链体的低严格性洗涤的一个实例是在40℃下以4-6x SSC进行15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在pH7.0至8.3下约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐类)，并且温度典型地是至少约30℃。还可以通过加入去稳定剂(如甲酰胺)来实现严格条件。一般而言，在特定的杂交测定中相比于不相关的探针观察到的高出2倍(或更高)的信噪比表明检测到一个特定杂交。
以下是可以用于克隆同源多核苷酸的杂交/洗涤条件的设置的例子，这些同源多核苷酸是与本发明的参比多核苷酸基本上一致的。在一个实施例中，一个参比多核苷酸在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA中与该“测试”多核苷酸杂交，并且在50℃下在2XSSC、0.1％SDS中洗涤。在另一个实施例中，该参比多核苷酸在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中与该“测试”多核苷酸杂交，并且在50℃下在1X SSC、0.1％SDS中洗涤；或者在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中杂交，并且在50℃下在0.5X SSC、0.1％SDS中洗涤。在仍另外的实施例中，该参比多核苷酸在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中与该“测试”多核苷酸杂交，并且在50℃下在0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤；或者在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，并且在65℃下在0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤。
两个多核苷酸或两个多肽基本上是一致的一个另外的指示是指由该第一核酸编码的蛋白与由该第二核酸编码的蛋白进行免疫性交联反应或与其特异性结合。因此，一种多核苷酸典型地是与一种第二多核苷酸基本上一致的，例如其中这两种多核苷酸仅区别于保守取代。
如在此使用的，“合成的”是指包括在天然多核苷酸或核苷酸序列中不存在的结构性特征的一种多核苷酸或核苷酸序列。例如与双子叶植物和/或单子叶植物基因的G+C含量和正常密码子分布非常密切地相似的一个人工序列就称为是合成的。
在本发明的背景中的“Vip3多肽”意指一种营养期杀昆虫蛋白(VIP)，它是包括而不限于以下各项的Vip3类的一员：Vip3Aa1、Vip3Aa2、Vip3Aa3、Vip3Aa19、Vip3Aa20、Vip3Af1、Vip3Af2、Vip3Ag1、以及它们的同系物。鉴定一种蛋白质在Vip3类蛋白质中的一些结构性特点包括1)大约80-88kDa的大小，通过昆虫或胰蛋白酶以蛋白水解方式被处理至约62-66kDa毒性核心(李(Lee)等人2003，应用与环境微生物学69:4648-4657)；以及2)一个高度保守的N-端分泌信号，该信号在苏云金芽孢杆菌的分泌过程中被非天然地处理并包括氨基酸序列IYGFATGIKDI(SEQ ID NO:114)。包括先前提到的那些的Vip3类的成员的非限制实例以及它们各自的Genbank登录号、美国专利或专利公开号是Vip3Aa1(AAC37036)、Vip3Aa2(AAC37037)、Vip3Aa3(美国专利6137033)、Vip3Aa4(AAR81079)、Vip3Aa5(AAR81080)、Vip3Aa6(AAR81081)、Vip3Aa7(AAK95326)、Vip3Aa8(AAK97481)、Vip3Aa9(CAA76665)、Vip3Aa10(AAN60738)、Vip3Aa11(AAR36859)、Vip3Aa12(AAM22456)、Vip3Aa13(AAL69542)、Vip3Aa14(AAQ12340)、Vip3Aa15(AAP51131)、Vip3Aa16(AAW65132)、Vip3Aa17(美国专利6603063)、Vip3Aa18(AAX49395)、Vip3Aa19(DQ241674)、Vip3Aa19(DQ539887)、Vip3Aa20(DQ539888)、Vip3Aa21(ABD84410)、Vip3Aa22(AAY41427)、Vip3Aa23(AAY41428)、Vip3Aa24(BI 880913)、Vip3Aa25(EF608501)、Vip3Aa26(EU294496)、Vip3Aa27(EU332167)、Vip3Aa28(FJ494817)、Vip3Aa29(FJ626674)、Vip3Aa30(FJ626675)、Vip3Aa31(FJ626676)、Vip3Aa32(FJ626677)、Vip3Aa33(GU073128)、Vip3Aa34(GU073129)、Vip3Aa35(GU733921)、Vip3Aa36(GU951510)、Vip3Aa37(HM132041)、Vip3Aa38(HM117632)、Vip3Aa39(HM117631)、Vip3Aa40(HM132042)、Vip3Aa41(HM132043)、Vip3Aa42(HQ587048)、Vip3Aa43(HQ594534)、Vip3Aa44(HQ650163)、Vip3Ab1(AAR40284)、Vip3Ab2(AAY88247)、Vip3Ac1(美国专利申请公开20040128716)、Vip3Ad1(美国专利申请公开20040128716)、Vip3Ad2(CAI43276)、Vip3Ae1(CAI43277)、Vip3Af1(美国专利7,378,493)、Vip3Af2(ADN08753)、Vip3Af3(HM117634)、Vip3Ag1(ADN08758)、Vip3Ag2(FJ556803)、Vip3Ag3(HM117633)、Vip3Ag4(HQ414237)、Vip3Ag5(HQ542193)、Vip3Ah1(DQ832323)、Vip3Ba1(AAV70653)、Vip3Ba2(HM117635)、Vip3Bb1(美国专利7,378,493)、Vip3Bb2(ABO30520)以及Vip3Bb3(ADI48120)。
此处使用“同系物”意指所指示的多肽与Vip3类的多肽的其他成员具有一种定义的关系。这种定义的关系包括但不限于：(1)与Vip3类多肽的另一个成员在序列水平上是至少大约70％至至少大约90％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)相同的、同时也保留杀有害生物活性的多肽，(2)与免疫地识别Vip3类多肽的另一个成员的抗体发生交叉反应的多肽，(3)与Vip3类多肽的另一个成员的受体发生交叉反应并保留诱导细胞程序死亡的能力的多肽，以及(4)多肽与Vip3类多肽的另一个成员的有毒核心区域在序列水平上是至少大约70％至至少大约90％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)相同的，同时也保留杀有害生物活性的多肽。Vip3同系物已经在WO 98/18932、WO 98/33991、WO 98/00546、和WO 99/57282中披露。
因此，在本发明的一些实施例中，该多肽与Vip3类多肽的另一个成员和/或与Vip3类多肽的另一个成员的有毒核心区域在序列水平上是至少70％相同的，同时也保留杀有害生物活性。在本发明的其他实施例中，这些多肽与Vip3类多肽的另一个成员和/或与Vip3类多肽的另一个成员的有毒核心区域在序列水平上是至少80％相同的，同时也保留杀有害生物活性。在仍其他实施例中，这些多肽与Vip3类多肽的另一个成员和/或与Vip3类多肽的另一个成员的有毒核心区域在序列水平上是至少90％相同的，同时也保留杀有害生物活性。
核苷酸通过其碱基由以下标准缩写进行指示：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。同样氨基酸是由以下标准缩写来表示：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、以及缬氨酸(Val；V)。
本发明基于以下发现，在Vip3多肽中鉴定的具体位置处取代氨基酸残基可改变该Vip3多肽在以下方面的杀有害生物(例如，杀昆虫)活性：对细胞和/或生物体(已知Vip3多肽针对其有活性)的毒性水平方面，和/或在受该多肽影响的具体种群方面(例如，其中可修饰该多肽活性的种特异性)。因此，本发明提供修饰的Vip3多肽以及产生和使用这些修饰的多肽的方法。
因此，在本发明的一个实施例中，提供了针对至少欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫，ECB)具有杀有害生物活性(例如杀昆虫活性)的工程化的多肽，其中该多肽包括与氨基酸序列SEQ ID NO:1(Vip3D)具有至少95％(例如95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)一致性的氨基酸序列，并且进一步在对应于以下列出的表1中识别的一个位置、或其任意组合的位置上包括至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等等)氨基酸突变，其中与一种野生型多肽的ECB的活性相比，该突变改进了针对至少欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫，ECB)的杀有害生物活性，该工程化的多肽衍生自该野生型多肽(例如SEQ ID NO:1(Vip3D))。在本发明的一个另外的实施例中，提供了针对至少欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫，ECB)具有杀有害生物活性(例如杀昆虫活性)的工程化的多肽，其中该多肽包括与氨基酸序列SEQ ID NO:1(Vip3D)具有至少95％(例如95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)一致性的氨基酸序列，并且进一步在以下列出的表1中识别的一个位置、或其任意组合包括至少一个氨基酸突变，其中与一种野生型多肽的ECB的活性相比，该突变改进了针对至少欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫，ECB)的杀有害生物活性，该工程化的多肽衍生自该野生型多肽(例如SEQ ID NO:1(Vip3D))。
根据本发明的另一个实施例，本发明包括一种修饰的Vip3多肽，该Vip3多肽包括对应于在表1中披露的一个或多个位置或在此处包括一个突变，其中该修饰的Vip3多肽与未修饰的Vip3多肽相比针对靶昆虫有害生物具有更高的比活性。
表1.权利要求1的工程化的多肽中的氨基酸突变的位置。
这些氨基酸残基的编号基于SEQ ID NO:1(Vip3D)的氨基酸序列。
Figure BDA0000554259860000231
因此，在一些实施例中，提供了一种工程化的多肽，该工程化的多肽包括与SEQ IDNO:1(Vip3D)的氨基酸序列具有至少95％(例如95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)一致性的氨基酸序列，并且进一步在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的以下氨基酸位置的一个位置处包括至少一个氨基酸突变：S200、A257、K284、V358、D660、K661、L665、P669、A670、N682、I685、T687、A690、F698、G702、S710、A725、S726、F729、N730、R743、N745、S751、H752、G755、K758、G776、V785、M362、F581、T633、T663、D672、G689、I699、N700、N704、T706、F707、R708、S712、Y716、S720、T732、V733、S749、I753、N762、N763、T764、G765、L766、V768、R772、G778、I780、N784、K668、P681、S683、T686、P688、S691、K696、L701、T703、N714、I721、S722、T724、P728、S744、L746、M747、S748、T750、T756、E760、S761、R773、S774、G775、H779、S781、E783、N312、V338、D342、M347、H355、V372、E374、N380、V391、I392、F400、V415、D426、K432、T433、V438、E449、K455、R465、N470、D471、V480、L494、Q495、A496、R501、I503、T504、L514、S532、S543、I544、E546、D547、G580、P591、T600、P605、H608、N613、T614、Y616、I617、H618、N625、Y62P、R635、T637、L642、K643、L649、K650、W658、或其任意组合，其中与野生型多肽的ECB的活性相比，该突变改进了针对至少欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫，ECB)的杀有害生物(即杀昆虫的)活性，该工程化的多肽衍生自该野生型多肽(例如SEQ ID NO:1)。在其他实施例中，该至少一个氨基酸突变是在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中位置S200、A257、K284、V358、D660、K661、L665、P669、A670、N682、I685、T687、A690、F698、G702、S710、A725、S726、F729、N730、R743、N745、S751、H752、G755、K758、G776、V785、M362、F581、T633、T663、D672、G689、I699、N700、N704、T706、F707、R708、S712、Y716、S720、T732、V733、S749、I753、N762、N763、T764、G765、L766、V768、R772、G778、I780、N784、K668、P681、S683、T686、P688、S691、K696、L701、T703、N714、I721、S722、T724、P728、S744、L746、M747、S748、T750、T756、E760、S761、R773、S774、G775、H779、S781、E783、N312、V338、D342、M347、H355、V372、E374、N380、V391、I392、F400、V415、D426、K432、T433、V438、E449、K455、R465、N470、D471、V480、L494、Q495、A496、R501、I503、T504、L514、S532、S543、I544、E546、D547、G580、P591、T600、P605、H608、N613、T614、Y616、I617、H618、N625、Y62P、R635、T637、L642、K643、L649、K650、W658、或其任意组合处，其中与该野生型多肽(SEQ ID NO:1)的ECB的活性相比，该突变改进了针对至少欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫，ECB)的杀有害生物(即杀昆虫)活性。
在其他实施例中，本发明提供了一种工程化的多肽，该工程化的多肽包括与SEQID NO:1(Vip3D)的氨基酸序列具有至少95％(例如95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)一致性的氨基酸序列，并且进一步在对应于SEQ ID NO:1中的以下各项中的一个氨基酸位置或在该处的一个位置包括至少一个氨基酸突变：V338、K455、R465、S532、I544、G580、S712、E760、L766、V768和/或其任意组合处，其中与野生型多肽的ECB的活性相比，该突变改进了针对至少欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫，ECB)的杀有害生物活性，该工程化的多肽衍生自该野生型多肽(例如SEQ IDNO:1)。
在仍另外的实施例中，提供了一种工程化的多肽，该工程化的多肽包括与SEQ IDNO:1(Vip3D)的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列，并且进一步包括至少一个氨基酸突变，该突变是对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的以下突变或即是以下突变中的一个：V338A、V338N、V338T、V338P、V338G、V338W、V338Y、V338S、V338L、V338K、V338I、V338M、V338E、V338C、V338Q、V338F、V338D、K455A、K455N、K455T、K455G、K455I、K455E、R465A、R465N、V465T、V465P、V465G、V465W、V465Y、V465S、V465L、V465K、V465I、V465M、V465E、V465C、V465Q、V465F、V465D、D471A、D471N、D471T、D471I、D471Q、D471V、S532A、S532N、S532Y、S532K、S532M、S532C、S532D、I544A、I544N、H608A、H608L、Y629A、Y629W、Y629S、Y629K、Y629E、Y629Q、Y629F、R635A、R635S、K643A、K643S、L649A、L649W、L649S、L649R、S683A、S683N、S683Y、S683K、S683M、S683C、S683D、M747A、M747W、M747Y、M747S、M747K、M747E、M747C、M747Q、L766A、L766T、L766P、L766G、L766W、L766S、L766K、L766I、L766M、L766E、L766C、L766F、L766R、G580A、G580N、G580T、G580P、G580W、G580Y、G580S、G580K、G580M、G580C、G580H、G580L、G580E、K650A、K650N、或其任意组合，其中与野生型多肽的ECB的活性相比，该突变改进了针对至少欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫，ECB)的杀有害生物(即杀昆虫的)活性，该工程化的多肽衍生自该野生型多肽(例如SEQ ID NO:1)。
在另外的实施例中，提供了一种工程化的多肽，该工程化的多肽包括与SEQ IDNO:1(Vip3D)的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列，并且进一步包括氨基酸突变，这些氨基酸突变对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的以下氨基酸突变：在I544A和在S712A处的一个突变、在K455A和在V338A处的一个突变、在H618A和在T750A处的一个突变、在L701A和在I721A处的一个突变、在S722A和在S781A处的一个突变、在S761A和在S744A处的一个突变、在S781A和在S744A处的一个突变、以及在S781A和在T750A处的一个突变，其中与野生型多肽的ECB的活性相比，该突变改进了针对至少欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫，ECB)的杀有害生物(即杀昆虫)活性，该工程化的多肽衍生自该野生型多肽(例如SEQ IDNO:1)。
在其他实施例中，提供了一种工程化的多肽，该工程化的多肽包括与SEQ ID NO:1(Vip3D)的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列，并且进一步包括至少两个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等等)氨基酸突变，这些氨基酸突变是SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的以下氨基酸突变：I544A和S712A、K455A和V338A、H618A和T750A、L701A和I721A、S722A和S781A、S761A和S744A、S781A和S744A,或S781A和T750A，其中与野生型多肽的ECB的活性相比，该突变改进了针对至少欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫，ECB)的杀有害生物(即杀昆虫)活性，该工程化的多肽衍生自该野生型多肽(例如SEQ ID NO:1)。
当然，本领域的普通技术人员将认识到，这些氨基酸修饰无须在这些多肽本身中进行(尽管此类多肽的化学合成是本领域的普通技术人员熟知的)，而还可以通过引起编码这样一种多肽的多核苷酸的突变来进行。用于引起这种多核苷酸突变的手段在此处详细描述，并且使用此类方法构建的示例性多肽也在此处之后的实例中详细描述。
在另外的实施例中，本发明提供了一个重组核酸分子，该核酸分子包含对本发明的一种多肽进行编码的一个核苷酸序列。在一些实施例中，对本发明的一种多肽进行编码的核苷酸序列包括但不限于SEQ ID NO:4的核苷酸序列、SEQ ID NO:6的核苷酸序列、SEQID NO:8的核苷酸序列、SEQ ID NO:10的核苷酸序列、SEQ ID NO:12的核苷酸序列、SEQ IDNO:14的核苷酸序列、SEQ ID NO:19的核苷酸序列、SEQ ID NO:21的核苷酸序列、SEQ IDNO:23的核苷酸序列、SEQ ID NO:25的核苷酸序列、SEQ ID NO:27的核苷酸序列、SEQ IDNO:29的核苷酸序列、SEQ ID NO:31的核苷酸序列、SEQ ID NO:33的核苷酸序列、SEQ IDNO:35的核苷酸序列、SEQ ID NO:37的核苷酸序列、SEQ ID NO:39的核苷酸序列、SEQ IDNO:41的核苷酸序列、SEQ ID NO:43的核苷酸序列、SEQ ID NO:45的核苷酸序列、SEQ IDNO:47的核苷酸序列、SEQ ID NO:49的核苷酸序列、SEQ ID NO:51的核苷酸序列、SEQ IDNO:53的核苷酸序列、SEQ ID NO:55的核苷酸序列、SEQ ID NO:57的核苷酸序列、SEQ IDNO:59的核苷酸序列、SEQ ID NO:61的核苷酸序列、SEQ ID NO:63的核苷酸序列、SEQ IDNO:65的核苷酸序列、SEQ ID NO:67的核苷酸序列、SEQ ID NO:69的核苷酸序列、SEQ IDNO:71的核苷酸序列、SEQ ID NO:73的核苷酸序列、SEQ ID NO:75的核苷酸序列、SEQ IDNO:77的核苷酸序列、SEQ ID NO:79的核苷酸序列、SEQ ID NO:81的核苷酸序列、SEQ IDNO:83的核苷酸序列、SEQ ID NO:85的核苷酸序列、SEQ ID NO:87的核苷酸序列、SEQ ID NO:89的核苷酸序列、SEQ ID NO:91的核苷酸序列、SEQ ID NO:93的核苷酸序列、SEQ ID NO:95的核苷酸序列、SEQ ID NO:97的核苷酸序列、SEQ ID NO:99的核苷酸序列、SEQ ID NO:101的核苷酸序列、SEQ ID NO:103的核苷酸序列、SEQ ID NO:105的核苷酸序列、SEQ ID NO:107的核苷酸序列、SEQ ID NO:109的核苷酸序列、SEQ ID NO:111的核苷酸序列、SEQ ID NO:113的核苷酸序列、SEQ ID NO:116的核苷酸序列、SEQ ID NO:118的核苷酸序列、SEQ IDNO:120的核苷酸序列、SEQ ID NO:122的核苷酸序列、SEQ ID NO:124的核苷酸序列、SEQ IDNO:126的核苷酸序列、SEQ ID NO:128的核苷酸序列、SEQ ID NO:130的核苷酸序列、或其任意组合。
在仍另外的实施例中，本发明提供了一个重组核酸分子，该核酸分子包含对本发明的一种工程化的多肽进行编码的一个核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了一个重组核酸分子，该重组核酸分子包含对以下各项进行编码的一个核苷酸序列：SEQ ID NO:3的氨基酸序列、SEQ ID NO:5的氨基酸序列、SEQ ID NO:7的氨基酸序列、SEQ ID NO:9的氨基酸序列、SEQ ID NO:11的氨基酸序列、SEQID NO:13的氨基酸序列、SEQ ID NO:18的氨基酸序列、SEQ ID NO:20的氨基酸序列、SEQ IDNO:22的氨基酸序列、SEQ ID NO:24的氨基酸序列、SEQ ID NO:26的氨基酸序列、SEQ IDNO:28的氨基酸序列、SEQ ID NO:30的氨基酸序列、SEQ ID NO:32的氨基酸序列、SEQ IDNO:34的氨基酸序列、SEQ ID NO:36的氨基酸序列、SEQ ID NO:38的氨基酸序列、SEQ IDNO:40的氨基酸序列、SEQ ID NO:42的氨基酸序列、SEQ ID NO:44的氨基酸序列、SEQ IDNO:46的氨基酸序列、SEQ ID NO:48的氨基酸序列、SEQ ID NO:50的氨基酸序列、SEQ IDNO:52的氨基酸序列、SEQ ID NO:54的氨基酸序列、SEQ ID NO:56的氨基酸序列、SEQ IDNO:58的氨基酸序列、SEQ ID NO:60的氨基酸序列、SEQ ID NO:62的氨基酸序列、SEQ IDNO:64的氨基酸序列、SEQ ID NO:66的氨基酸序列、SEQ ID NO:68的氨基酸序列、SEQ IDNO:70的氨基酸序列、SEQ ID NO:72的氨基酸序列、SEQ ID NO:74的氨基酸序列、SEQ IDNO:76的氨基酸序列、SEQ ID NO:78的氨基酸序列、SEQ ID NO:80的氨基酸序列、SEQ IDNO:82的氨基酸序列、SEQ ID NO:84的氨基酸序列、SEQ ID NO:86的氨基酸序列、SEQ IDNO:88的氨基酸序列、SEQ ID NO:90的氨基酸序列、SEQ ID NO:92的氨基酸序列、SEQ IDNO:94的氨基酸序列、SEQ ID NO:96的氨基酸序列、SEQ ID NO:98的氨基酸序列、SEQ IDNO:100的氨基酸序列、SEQ ID NO:102的氨基酸序列、SEQ ID NO:104的氨基酸序列、SEQ IDNO:106的氨基酸序列、SEQ ID NO:108的氨基酸序列、SEQ ID NO:110的氨基酸序列、SEQ IDNO:112的氨基酸序列、SEQ ID NO:115的氨基酸序列、SEQ ID NO:117的氨基酸序列、SEQ IDNO:119的氨基酸序列、SEQ ID NO:121的氨基酸序列、SEQ ID NO:123的氨基酸序列、SEQ IDNO:125的氨基酸序列、SEQ ID NO:127的氨基酸序列、SEQ ID NO:129的氨基酸序列、或其任意组合。
在其他实施例中，本发明的重组核酸分子包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列、SEQ IDNO:6的核苷酸序列、SEQ ID NO:8的核苷酸序列、SEQ ID NO:10的核苷酸序列、SEQ ID NO:12的核苷酸序列、SEQ ID NO:14的核苷酸序列、SEQ ID NO:19的核苷酸序列、SEQ ID NO:21的核苷酸序列、SEQ ID NO:23的核苷酸序列、SEQ ID NO:25的核苷酸序列、SEQ ID NO:27的核苷酸序列、SEQ ID NO:29的核苷酸序列、SEQ ID NO:31的核苷酸序列、SEQ ID NO:33的核苷酸序列、SEQ ID NO:35的核苷酸序列、SEQ ID NO:37的核苷酸序列、SEQ ID NO:39的核苷酸序列、SEQ ID NO:41的核苷酸序列、SEQ ID NO:43的核苷酸序列、SEQ ID NO:45的核苷酸序列、SEQ ID NO:47的核苷酸序列、SEQ ID NO:49的核苷酸序列、SEQ ID NO:51的核苷酸序列、SEQ ID NO:53的核苷酸序列、SEQ ID NO:55的核苷酸序列、SEQ ID NO:57的核苷酸序列、SEQ ID NO:59的核苷酸序列、SEQ ID NO:61的核苷酸序列、SEQ ID NO:63的核苷酸序列、SEQ ID NO:65的核苷酸序列、SEQ ID NO:67的核苷酸序列、SEQ ID NO:69的核苷酸序列、SEQ ID NO:71的核苷酸序列、SEQ ID NO:73的核苷酸序列、SEQ ID NO:75的核苷酸序列、SEQ ID NO:77的核苷酸序列、SEQ ID NO:79的核苷酸序列、SEQ ID NO:81的核苷酸序列、SEQ ID NO:83的核苷酸序列、SEQ ID NO:85的核苷酸序列、SEQ ID NO:87的核苷酸序列、SEQ ID NO:89的核苷酸序列、SEQ ID NO:91的核苷酸序列、SEQ ID NO:93的核苷酸序列、SEQ ID NO:95的核苷酸序列、SEQ ID NO:97的核苷酸序列、SEQ ID NO:99的核苷酸序列、SEQ ID NO:101的核苷酸序列、SEQ ID NO:103的核苷酸序列、SEQ ID NO:105的核苷酸序列、SEQ ID NO:107的核苷酸序列、SEQ ID NO:109的核苷酸序列、SEQ ID NO:111的核苷酸序列、SEQ ID NO:113的核苷酸序列、SEQ ID NO:116的核苷酸序列、SEQ ID NO:118的核苷酸序列、SEQ ID NO:120的核苷酸序列、SEQ ID NO:122的核苷酸序列、SEQ ID NO:124的核苷酸序列、SEQ ID NO:126的核苷酸序列、SEQ ID NO:128的核苷酸序列、SEQ ID NO:130的核苷酸序列、或其任意组合。
在一些实施例中，本发明的核酸分子的表达得到可被用于控制鳞翅类昆虫的多肽，这些鳞翅类昆虫包括但不限于欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫)、小菜蛾(菱形斑纹蛾)、草地贪夜蛾(秋季行军虫)、小地老虎(黑切根虫)、西部灰地老虎(灰白西部切根虫)、豆切根虫(西部豆切根虫)、谷实夜蛾(棉铃虫)、烟芽夜蛾(烟夜蛾)、甜菜夜蛾(甜菜行军虫)、茶色铃夜蛾(原生夜蛾)、棉铃虫(棉花螟蛉)、烟草天蛾(烟天蛾)、粉纹夜蛾(甘蓝尺蠖)、红铃麦蛾(红铃虫)、巨座玉米螟(西南玉米钻蛀虫)、小蔗螟(甘蔗钻蛀虫)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)(小玉米茎蛀虫)、大豆夜蛾(Psuedoplusia includens、soybean looper)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)(藜豆毛虫(velvetbeancaterpillar))、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)(绿色苜蓿虫)、以及向日葵细卷叶蛾(带状向日葵斑蛾)。
在其他实施例中，本发明的核酸分子的表达得到可被用于控制线虫有害生物的多肽，这些线虫有害生物包括但不限于根结线虫属(例如南方根结线虫和爪哇根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫)、异皮线虫属(例如大豆异皮线虫、胡萝卜异皮线虫、甜菜异皮线虫、燕麦异皮线虫和三叶草异皮线虫)、球异皮线虫属(例如，马铃薯金线虫)、穿孔线虫属(例如，相似穿孔线虫)、肾形线虫属、短体线虫属(例如落选短体线虫和穿刺短体线虫)、滑刃线虫属、螺旋线虫属、纽带线虫属、类毛刺线虫属、长针线虫属、真珠线虫属、亚蛇形线虫属、刺线虫属、小环线虫属、轮线虫属、茎线虫属、鳞球茎茎线虫、锥线虫属、半轮线虫属、鞘线虫属、潜根线虫属、根结线虫属、大节片线虫属、梅林纽斯属(Melinius spp.)、斑皮线虫属、五沟线虫属、盾状线虫属、剑线虫属、矮化线虫属、和/或其任意组合。
在其他实施例中，该核酸分子进一步包括可操作地连接至本发明的核苷酸序列的一个异源性启动子序列。因此，作为举例，本发明的这些工程化的Vip3核苷酸序列可操作地稠合至多个用于在宿主细胞(例如，植物细胞)中表达的启动子。这些启动子可以包括例如组成型、诱导型、时间调节型、发育调节型、化学调节型、组织优选型、以及组织特异型启动子以制备重组DNA分子，即嵌合基因。
“启动子”是一个编码区的不被翻译的DNA序列上游，它包含RNA聚合酶结合位点并且起始DNA的转录。“启动子区”也可以包括充当基因表达的调节子的多个其他元件。在具体方面，适用于本发明的“启动子”是能够在植物细胞中启动核苷酸序列的转录的启动子。
启动子的选择将依赖于表达的时间和空间需要而变化，并且还依赖于有待转化的宿主细胞而变化。因此，例如，本发明的核苷酸序列的表达可以处于任何植物和/或植物部分中(例如，处于叶子中、处于茎杆或茎中、处于穗中、处于花序中(例如，穗状花序、圆锥花序、穗轴等)、处于根、和/或幼苗等中)。然而在许多情况下，寻求针对多于一种类型昆虫有害生物的保护，并且因此在多个组织中的表达是令人希望的。尽管已经显示来自双子叶植物的很多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然，但理想的是选择双子叶植物启动子用于在双子叶植物中的表达，并且选择单子叶植物启动子用于在单子叶植物中的表达。然而，对所选择的启动子的起源并没有限制，足够的是它们在推动多核苷酸在所希望的细胞中的表达中是可操作的。
适用于本发明的启动子包括组成性地驱动多核苷酸的表达的那些启动子、在诱导时驱动表达的那些启动子、以及以组织或发育特异性方式驱动表达的那些启动子。这些不同类型的启动子在本领域是已知的。
组成型启动子的实例包括但不限于夜香树病毒启动子(cmp)(美国专利号7,166,770)、稻肌动蛋白1启动子(王(Wang)等人，(1992)分子细胞生物学报(Mol.Cell.Biol.)12:3399-3406；以及美国专利号5,641,876)、CaMV 35S启动子(奥德尔(Odell)等人，(1985)自然(Nature)313:810-812)、CaMV 19S启动子(劳顿(Lawton)等人，(1987)植物分子生物学报(Plant Mol.Biol.)9:315-324)、nos启动子(埃伯特(Ebert)等人，(1987)美国科学院院刊84:5745-5749)、Adh启动子(瓦尔克等人，(1987)美国科学院院刊84:6624-6629)、蔗糖合酶启动子(杨(Yang)和拉塞尔(Russell)(1990)美国科学院院刊87:4144-4148)、以及泛素启动子。源于泛素的组成型启动子积累在很多细胞类型中。已经从若干植物种类中克隆泛素启动子以用于转基因植物，例如向日葵(比内(Binet)等人，1991，植物科学(PlantScience)79:87-94)、玉米(克里斯滕森(Christensen)等人，1989，植物分子生物学报12:619-632)、以及拟南芥(诺里斯(Norris)等人，1993，植物分子生物学报21:895-906)。玉米泛素启动子(UbiP)已经在转基因单子叶植物系统中得以发展，并且它的序列以及构建用于单子叶植物转化的载体披露于专利公开EP 0 342 926中。泛素启动子适用于本发明的多核苷酸在转基因植物(尤其是单子叶植物)中的表达。此外，由麦克尔罗伊(McElroy)等人(分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)231:150-160(1991))描述的启动子表达盒可容易被修饰以用于本发明的多核苷酸的表达并且特别适用于在单子叶植物宿主中使用。
在一些实施例中，可以使用组织特异性启动子。组织特异性表达模式包括但不限于绿色组织特异性的、根特异性的、茎特异性的、以及花特异性的。适用于在绿色组织中表达的启动子包括调节涉及光合作用的基因的许多启动子，并且这些中的许多已经从单子叶植物和双子叶植物两者中得以克隆。在一个实施例中，适用于本发明的一种启动子是来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC启动子(哈得斯佩斯(Hudspeth)和格鲁拉(Grula)，植物分子生物学报12:579-589(1989))。组织特异性启动子的非限制性实例包括与编码种子贮藏蛋白(如β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白、油菜籽蛋白以及菜豆素)、玉米蛋白或油体蛋白(如油质蛋白)、或脂肪酸生物合成中涉及的蛋白质(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶、以及脂肪酸去饱和酶(fad 2-1))的基因关联以及与胚发育过程中表达的其他核酸(如Bce4，参见，例如克里德(Kridl)等人(1991)种子科学研究(Seed Sci.Res.)1:209-219；连同欧洲专利号255378)关联的那些启动子。用于在植物(特别是玉米)中表达对本发明的新颖的杀有害生物多肽进行编码的多核苷酸的组织特异性的或组织优先的启动子是那些直接在根、髓、叶或花粉中表达的启动子。此类启动子披露于WO 93/07278中，通过引用以其全文结合在此。适用于本发明的其他组织特异性启动子包括披露于美国专利6,040,504中的棉花二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)启动子；披露于美国专利5,604,121中的稻蔗糖合酶启动子；由德弗瑞蒙德(de Framond)(FEBS290:103-106(1991)；授予汽巴-嘉基(Ciba-Geigy)的EP 0 452 269)描述的根特异性启动子；描述于美国专利5,625,136(授予汽巴-嘉基)并驱动玉米trpA基因表达的茎特异性启动子；以及披露于WO 01/73087中的夜香树黄叶卷曲病毒启动子，所有文献通过引用结合
组织特异性启动子的额外实例包括但不限于：根特异性启动子RCc3(郑(Jeong)等人植物生理学(Plant Physiol)153:185-197(2010))和RB7(美国专利号5459252)；凝集素启动子(林斯特龙(Lindstrom)等人(1990)Der.Genet.11:160-167；以及沃德金(Vodkin)(1983)临床生物学研究进展(Prog.Clin.Biol.Res.)138:87-98)；玉米醇脱氢酶1启动子(丹尼斯(Dennis)等人(1984)核酸研究(Nucleic Acids Res.)12:3983-4000)；S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)(范德米金斯布鲁格(Vander Mi jnsbrugge)等人(1996)植物与细胞生理学(Plant and Cell Physiology)，37(8):1108-1115)；玉米集光复合体启动子(班赛尔(Bansal)等人(1992)美国科学院院刊89:3654-3658)；玉米热激蛋白启动子(奥德尔(O’De11)等人(1985)欧洲分子生物学学会杂志5:451-458；以及罗切斯特(Rochester)等人(1986)欧洲分子生物学学会杂志5:451-458)；豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子(植物遗传工程(Genetic Engineering of Plants)(霍兰德尔(Hollaender)编，Plenum出版社(PlenumPress)1983)中的卡什莫尔(Cashmore)，“编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基的核基因(Nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase)”，第29-39页；以及波尔森(Poulsen)等人(1986)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet)205:193-200)；Ti质粒甘露氨酸合成酶启动子(兰格里奇(Langridge)等人(1989)美国科学院院刊86:3219-3223)；Ti质粒胭脂氨酸合成酶启动子(兰格里奇等人(1989)同上)；矮牵牛查尔酮异构酶启动子(范杜能(van Tunen)等人(1988)欧洲分子生物学学会杂志7:1257-1263)；豆富甘氨酸蛋白1启动子(凯勒(Keller)等人(1989)基因与发育(Genes Dev.)3:1639-1646)；截短的CaMV 35S启动子(奥德尔等人(1985)自然313:810-812)；马铃薯贮藏蛋白启动子(温茨勒(Wenzler)等人(1989)植物分子生物学(PlantMol.Biol.)13:347-354)；根细胞启动子(山本(Yamamoto)等人(1990)核酸研究18:7449)；玉米素启动子(克里茨(Kriz)等人(1987)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)207:90-98；兰格里奇(Langridge)等人(1983)细胞(Cell)34:1015-1022；雷纳(Reina)等人(1990)核酸研究18:6425；雷纳等人(1990)核酸研究18:7449；以及万德尔特(Wandelt)等人(1989)核酸研究17:2354)；球蛋白-1启动子(贝朗葛(Belanger)等人(1991)遗传学(Genetics)129:863-872)；α-微管蛋白cab启动子(沙利文(Sullivan)等人(1989)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)215:431-440)；PEPCase启动子(哈得斯佩斯(Hudspeth)和久拉(Grula)(1989)植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)12:579-589)；R基因复合体-相关联启动子(钱德勒(Chandler)等人(1989)植物细胞(Plant Cell)1:1175-1183)；以及查尔酮合成酶启动子(弗兰肯(Franken)等人(1991)欧洲分子生物学学会杂志10:2605-2612)。特别适用于种子特异性表达的是豌豆的豌豆球蛋白启动子(扎科(Czako)等人(1992)分子遗传学与普通遗传学235:33-40；以及披露于美国专利号5,625,136中的种子特异性启动子)。
对于在成熟叶中表达的其他有用启动子是在衰老开始时开启的那些，如来自拟南芥属(Arabidopsis)的SAG启动子(甘(Gan)等人，(1995)科学(Science)270:1986-1988)。
此外，可以使用在质体中发挥功能的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因95'UTR以及其他的披露于美国专利号7,579,516中的启动子。适用于本发明的其他启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和库尼茨(Kunitz)胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。
在本发明的一些实施例中，可以使用诱导型启动子。本发明的多核苷酸的表达经由化学调节过的启动子进行的调节使得例如Vip3多肽仅当用诱导化学品处理作物时能被合成。诱导型启动子的例子包括但不限于四环素阻抑物系统启动子、Lac阻抑物系统启动子、铜诱导型系统启动子、水杨酸酯诱导型系统启动子(例如，PR1a系统)、糖皮质激素诱导型启动子(Aoyama等人，(1997)Plant J.11:605-612)和蜕皮素诱导型系统启动子。其他诱导型启动子包括ABA-和膨胀-诱导型启动子、生长素-结合蛋白基因启动子(施沃布(Schwob)等人，(1993)植物杂志4:423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基-转移酶启动子(罗尔斯顿(Ralston)等人，(1988)遗传学报119:185-197)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(科德罗(Cordero)等人，(1994)植物杂志6:141-150)、以及甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶启动子(科勒(Kohler)等人(1995)植物分子生物学报29:1293-1298；马丁内斯(Martinez)等人(1989)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)208:551-565；以及奎格利(Quigley)等人(1989)分子进化杂志(J.Mol.Evol.)29:412-421)。还包括苯磺酰胺诱导型(美国专利号5,364,780)和醇诱导型(国际专利申请公开号WO 97/06269和WO 97/06268)系统和谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样地，可以使用描述于加茨(1996)生物技术新见(Current Opinion Biotechnol.)7:168-172和加茨(1997)植物生理学与植物分子生物学年度综述(Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.)48:89-108中的诱导型启动子中的任一种。适用于指导对本发明的新颖的杀有害生物多肽进行编码的基因在植物中的表达的其他化学诱导型启动子披露于美国专利5,614,395中，该专利通过引用以其全文结合在此。基因表达的化学诱导还详述于公开申请EP 0 332 104(授予汽巴-嘉基)和美国专利5,614,395中。在一些实施例中，一种用于化学诱导的启动子可以是烟草PR-1a启动子。
本发明的其他方面提供了可操作地连接至一个启动子的本发明的多核苷酸，该启动子是创伤诱导型或由病原体/有害生物攻击进行的诱导型。已经说明了数量众多的在创伤部位和/或在攻击部位表达的启动子。理想的是，这种启动子在攻击部位应该仅有局部活性，并且按照这种方式这些杀有害生物多肽仅在需要合成这些杀有害生物多肽的细胞中积聚以杀死入侵的有害生物。这类启动子包括但不限于由斯坦福(Stanford)等人，分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)215:200-208(1989)；徐(Xu)等人，植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)22:573-588(1993)；洛格曼(Logemann)等人，植物细胞(Plant Cell)1:151-158(1989)；罗尔迈尔和莱勒(Rohrmeier&Lehle)，植物分子生物学(PlantMolec.Biol.)22:783-792(1993)；费雷克(Firek)等人，植物分子生物学(PlantMolec.Biol.)22:129-142(1993)；以及华纳(Warner)等人，植物杂志(Plant J.)3:191-201(1993)所说明的那些。
在另外的实施例中，本发明的核酸分子可以被包含在重组载体中。用于在植物和其他有机体的转化中使用的载体在本领域是熟知的。
在仍另外的实施例中，本发明提供包括本发明的核酸分子的转基因的非人类宿主细胞。该非人类宿主细胞可包括但不限于植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、或昆虫细胞。因此，在一些实施例中，本发明提供包括本发明的核酸分子的细菌细胞。在一个另外的实施例中，本发明提供包括本发明的核酸分子的酵母细胞。在仍另外的实施例中，本发明提供包括本发明的核酸分子的植物细胞。
因此，例如，为生物性昆虫控制剂，本发明的这些杀有害生物多肽可通过多核苷酸的表达来产生，这些多核苷酸在异源宿主细胞中编码本发明的多肽，这些异源宿主细胞能够表达这些多肽。因此，例如在一个实施例中，提供了包括本发明的一种或多种多核苷酸的苏云金芽孢杆菌细胞。
在一些实施例中，将本发明的至少一种多核苷酸插入一个表达盒中，该表达盒包含用于表达该多核苷酸的必要元件。一个表达盒可包括但不限于启动子和终止信号。多核苷酸在表达盒中的表达可以是组成型的，或它可以是诱导型的，取决于启动子的选择，如以上讨论的。在一些实施例中，可使用响应各种类型的刺激以启动转录的诱导型启动子。在一些实施例中，其中可表达杀有害生物多肽的细胞是来自一种微生物例如细菌或真菌的细胞。在另一个实施例中，一种病毒(如杆状病毒)在其基因组中包含本发明的一种多核苷酸，并且在感染了真核细胞之后表达大量相应的杀有害生物多肽，这些真核细胞适宜于病毒复制以及该多核苷酸的表达。因此产生的杀有害生物多肽可用作杀有害生物剂、杀昆虫剂和/或杀线虫剂。可替代地，被工程化以包含本发明的一种或多种多核苷酸的杆状病毒可用于体内感染昆虫并通过该杀有害生物多肽的表达或通过病毒感染与该杀有害生物多肽的表达的组合而将这些昆虫杀死。
在另一个实施例中，本发明的多核苷酸可被引入到一种非致病性自我复制病毒中。
如前所述，细菌细胞也可以是用于表达本发明的多核苷酸的宿主。在一个实施例中，可使用能够在植物组织内(所谓的内生植物)生活并复制的非致病性共生细菌，或能够定殖在叶际或根际(例如附生植物)的非致病性共生细菌。这样的细菌包括但不限于以下属的细菌：土壤杆菌属、产碱菌属、固氮螺菌属、定氮菌属、芽孢杆菌属、棒形杆菌属、肠杆菌属、欧文菌属、黄杆菌属、克雷白菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、沙雷菌属、链霉菌属、以及黄单胞菌属。共生真菌(例如木霉属以及胶枝霉属)也可以是用于表达本发明的一种或多种多核苷酸的宿主。
用于转化各种生物体/宿主细胞的技术是本领域内已知的。例如，表达载体pKK223-3以及pKK223-2可以用来在大肠杆菌中(在转录或翻译融合中)在tac或trc启动子之后表达异源基因。为了表达编码多个ORF的操纵子，一个程序是在转录融合中将该操纵子插入一种载体(如pKK223-3)中，允许对该异源基因的同源核糖体结合位点进行利用。在革兰氏阳性种类(如芽孢杆菌属)中的过表达技术在本领域中也是已知的，并且可在本发明的背景中使用(库阿克斯(Quax)等人，在：工业微生物：基础和应用分子遗传学(IndustrialMicroorganisms:Basic and Applied MolecularGenetics)，巴尔茨(Baltz)等人编辑，美国微生物学会(American Society for Microbiology)，华盛顿(1993)中)。用于过表达的替代性系统依赖于(例如)酵母载体，并包括毕赤酵母属、酵母属、以及克鲁维酵母属的使用(史瑞克里什娜(Sreekrishna)，在：工业微生物：基础和应用分子遗传学(IndustrialMicroorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics)，巴尔茨(Baltz)、赫格曼(Hegeman)以及斯卡图德(Skatrud)编辑，美国微生物学会(American Society forMicrobiology)，华盛顿(1993)；德坎(Dequin)&巴雷(Barre)，生物技术(Biotechnology)L2:173-177(1994)；万继武(van den Berg)等人，生物技术8:135-139(1990)中)。
在其他实施例中，本发明的杀有害生物多肽中的一种或多种可在一种高级生物体(例如植物)中表达。因此，在本发明的一些方面中，提供了包括这类细胞的一种转基因植物，该细胞进一步包括本发明的多核苷酸和/或核酸分子。产生转基因植物细胞和转基因植物的方法在本领域中是熟知的，如以下讨论的。
在一些实施例中，表达有效量的杀有害生物多肽的转基因植物可保护这些植物本身免于昆虫有害生物。因此，当该昆虫开始以本发明的转基因植物为食时，它摄取了这些已表达的多肽。摄取该杀有害生物多肽可以妨碍该昆虫进一步咬食植物组织或甚至可以伤害或杀死该昆虫。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸可稳定地整合到植物细胞的基因组中，因此稳定地转化该植物细胞。在一些实施例中，其中一种植物细胞、植物部分、或组织培养被稳定地转化，一种稳定转化的植物可以从中再生。在本发明的其他实施例中，一种植物可以被瞬时转化。
“转化”是用于将一个或多个异源多核苷酸引入到宿主细胞或生物体中的一种方法。
在核酸的语境下，“瞬时转化”意指一种核酸被引入细胞并且它不整合到该细胞的基因组中。
如在此使用的，“稳定转化(stable transformation)”或“稳定转化的(stablytransformed)”意指被引入到细胞中并且整合到该细胞的基因组中的一种核酸。这样，所整合的核酸能够被其子代遗传，更具体地，被多个连续世代的子代遗传。如在此使用的，该基因组还包括质粒基因组，并且因此包括该核酸进入例如叶绿体基因组的整合。如在此使用的，稳定转化还可以指一种例如作为微型染色体在染色体外保持的转基因。
在将一种核酸引入至细胞中的背景下，“稳定引入”或“稳定引入的”意指引入的核酸稳定结合(整合)到细胞的基因组中，并且细胞因此被所述核酸稳定转化。
在感兴趣的一种多核苷酸的背景下，“引入”意指按这样一种方式将该多核苷酸呈现给该植物，该方式使得该多核苷酸获准进入宿主细胞(例如植物细胞、细菌细胞、真菌细胞等)的内部。在有待引入多于一种多核苷酸的情况下，这些多核苷酸可以作为一种单一的多核苷酸或核酸构建体的部分、或者作为分开的多核苷酸或核酸构建体而组装，并且可以位于相同或不同的转化载体上。另外，这些多核苷酸可以在一个单一转化事件中、在分开的转化事件中、或例如作为一个育种方案的一部分被引入细胞中。
“转化的”、“转基因的”或“重组的”是指一种宿主有机体，例如其中引入了一种异源核酸分子的一种细菌或一种植物。该核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者该核酸分子还可以作为一种染色体外分子存在。这样一种染色体外分子可以自主复制。转化的细胞、组织或者植物应当理解为不仅包含一个转化过程的终产物，而且包含其转基因子代。一个“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指不含异源核酸分子的一种野生型生物体(例如细菌或植物)。
本发明的一种多核苷酸可以在转基因植物中表达，由此导致相应的杀有害生物多肽在这些转基因植物中的生物合成。通过这种方式，可产生对有害生物(例如昆虫)具有增强的抗性的转基因植物。对于它们在转基因植物中的表达，本发明的多核苷酸可能需要修饰和优化以在植物中表达。尽管在许多情况下，来自微生物生物体的基因能够在植物中高水平表达而无需修饰，在转基因植物中的低表达可能起因于微生物多核苷酸的序列，这些序列具有在植物中并不优选的密码子。在本领域中已知的是所有生物体都具有特定的密码子利用偏好，而且在本发明中所说明的这些核苷酸序列的密码子可以被改变以符合植物偏好，同时维持着由其编码的这些氨基酸。此外，在植物中高表达可以由以下编码序列实现，这些编码序列具有至少大约35％GC、超过大约45％GC含量、超过大约50％GC含量、或超过大约60％GC含量。具有低GC含量的微生物多核苷酸在植物中也许表达欠佳，这是由于存在着可能使信息不稳定的ATTTA基序，以及可导致不恰当的多聚腺苷酸化的AATAAA基序。此外，尽管感兴趣的多核苷酸可以在单子叶植物和双子叶植物种类中充分表达，还可以对多核苷酸进行修饰以便解决单子叶植物或双子叶植物特定的密码子偏好以及GC含量偏好，因为这些偏好已经被证明是不同的(默里(Murray)等人，核酸研究17:477-498(1989))。此外，可针对不正常剪接位点的存在对这些核苷酸序列进行筛选，这些位点可能导致信息平截(message truncation)。所有需要在核苷酸序列内进行的变化，例如以上所述的那些，可使用在例如公开的专利申请EP 0 385 962、EP 0 359 472l、以及WO 93/07278中描述的方法，使用定点突变、PCR、和/或合成基因构建体的熟知的技术进行。
因此，在本发明的一个实施例中，可根据美国专利5,625,136(通过引用结合在此)中所披露的程序设计和优化vip3E核苷酸序列(例如SEQ ID NO:4)以在植物中表达(SEQ IDNO:454)。在这个程序中，使用了玉米偏爱的密码子，即最频繁地编码玉米中的氨基酸的单一密码子。针对一种特定的氨基酸的玉米偏爱的密码子可源自(例如)来自玉米的已知基因序列。针对来自玉米植物的28个基因的玉米密码子使用发现于例如默里(Murray)等人(核酸研究17:477-498(1989))中，其披露内容通过引用结合在此。按照这种方式，为了在任何植物中进行表达可以对这些核苷酸序列进行优化。认识到的是该核苷酸序列的所有或任何部分可以是优化的或合成的。即，还可以使用合成的或部分优化的序列。
为了有效的翻译起始，可以修饰与起始甲硫氨酸相邻的序列。例如，它们可以通过包含已知在植物中有效的序列而被修饰。Joshi(乔希)已经提出了针对植物的一种合适的共有序列(核酸研究15:6643-6653(1987))，并且克隆泰克(Clonetech)提出了另一个共有翻译起始子(1993/1994目录，210页)。这些共有序列适宜与本发明的核苷酸序列一起使用。将这些序列添加至包含核苷酸序列的构建体中，达到ATG并且包括ATG(同时保持不修饰第二个氨基酸)，或者可替代地达到ATG后的GTC并且包括ATG后的GTC(具有修饰该转基因的第二个氨基酸的可能性)。
除了选择一种适合的启动子之外，用于杀有害生物多肽在植物中表达的构建体可能还需要一种适当的、附接在异源核苷酸序列下游的转录终止子。一些此类的终止子是可获得的并且在本领域中是已知的(例如来自CaMV的tml，来自rbcS的E9)。任何一种已知在植物中发挥功能的可供使用的终止子均可以在本发明的背景下使用。
可以将数量众多的其他序列结合到本发明的表达盒和/或核酸分子中。这些序列包括已经显示出增强表达的序列，如内含子序列(例如，来自Adhl和bronzel)以及病毒的前导序列(例如，来自TMV、MCMV、以及AMV)。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸的表达可在植物中靶向不同的细胞定位。在一些实施例中，在胞质溶胶中的定位可能是令人希望的，而在其他实施例中，在某个亚细胞器中的定位可能是希望的。使用本领域内熟知的技术进行由转基因编码的酶类的亚细胞定位。典型地，对编码来自一种已知靶向细胞器的基因产物的靶肽的DNA进行处理并将其融合在该多核苷酸序列的上游。针对叶绿体的许多这样的靶序列是已知的并且已经证明了它们在异源构建体中的功能。还将本发明的多核苷酸的表达靶向宿主细胞的内质网或液泡。用于将核苷酸序列靶向具体细胞器的技术是本领域中熟知的。
用于转化植物的程序是熟知的并且在本领域内是常规的并且在文献中普遍描述。用于植物转化的方法的非限制性实例包括通过以下各项的转化：细菌介导的核酸递送(例如，经由土壤杆菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸须晶介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米粒子介导的转化、超声处理、渗入、PEG介导的核酸吸收、以及使得核酸引入到植物细胞中的任何其他电学的、化学的、物理的(机械的)和/或生物的机制，包括其任意组合。对于本领域已知的不同植物转化方法的一般指导包括今井(Miki)等人(在格里克B.R.(Glick,B.R.)和汤普逊J.E.(Thompson,J.E.)编辑的植物分子生物学与生物技术方法(Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology)中的“用于将外来DNA引入植物中的程序(Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants)”(CRC出版公司(CRC Press,Inc.)，波卡拉顿(Boca Raton)，1993)，第67-88页)和拉科沃奇-特罗扬诺夫斯卡(Rakowoczy-Trojanowska)(细胞与分子生物学快报(Cell.Mol.Biol.Lett.)7:849-858(2002))。
对于土壤杆菌介导的转化，二元载体或携带至少一个T-DNA边界序列的载体是适合的，而对于直接基因转移(例如粒子轰击等)，任何载体都是适合的，并且可以使用仅包含感兴趣的构建体的线性DNA。在直接基因转移的情况下，可以用一个单一的DNA种类进行转化或使用共转化(肖赫尔(Schocher)等人，生物技术4:1093-1096(1986))。对于直接基因转移以及土壤杆菌介导的转化这二者，转化通常(但不是必需的)用一种选择性标记(可以是一种阳性选择(磷酸甘露糖异构酶))进行，这种选择性标记可以提供针对一种抗生素(卡那霉素、潮霉素、或甲氨蝶呤)或一种除草剂(草甘膦或巴斯塔(Basta))的抗性。然而，选择性标记的选择对于本发明并不是至关重要的。
土壤杆菌介导的转化是一种用于转化植物、尤其是双子叶植物的普遍使用的方法，因为它的高转化效率以及因为它对于许多不同种类的广泛实用性。土壤杆菌介导的转化典型地涉及将携带感兴趣的外来DNA的二元载体转移到适当的土壤杆菌菌株，这可能取决于由宿主土壤杆菌菌株或者在共同存在的Ti质粒上或染色体地携带的vir基因的互补序列(乌肯斯(Uknes)等人，(1993)植物细胞5:159-169)。将该重组二元载体转移至土壤杆菌可以利用携带该重组二元载体的大肠杆菌、一种辅助大肠杆菌的菌株(该辅助菌株携带一种质粒，该质粒能够将该重组二元载体移动到靶土壤杆菌菌株中)通过一种三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将该重组二元载体转移到土壤杆菌中(霍根
Figure BDA0000554259860000401
&威尔米策(Willmitzer)(1988)核酸研究16:9877)。
通过重组土壤杆菌转化植物通常涉及该土壤杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域中熟知的方法。将转化的组织在携带位于这些二元质粒T-DNA边界之间的抗生素标记或除草剂抗性标记的选择性培养基上进行再生。
如前所述，另一种用于转化植物、植物部分以及植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性或生物学活性的粒子。参见，例如，美国专利号4,945,050；5,036,006以及5,100,792。通常，这种方法涉及在有效于穿透该细胞的外表面并提供在其内部中的合并的条件下在植物细胞处推进惰性或生物活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有感兴趣的核酸的载体包被这些粒子而将该载体引入该细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被该载体围绕使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物学活性的粒子(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自包含一种或多种被试图引入的核酸)推进入到植物组织中。
在另一个实施例中，本发明的一种多核苷酸可被直接转化到质体基因组中。质体转化的一种主要优点在于质体通常能够表达细菌基因而无需实质性的修饰，而且质体能够在一种单一启动子的控制下表达多个开放阅读框。在美国专利号5,451,513、5,545,817、以及5,545,818、在PCT申请号WO95/16783、并且在麦克布赖德(McBride)等人(1994)美国国家科学院院刊91,7301-7305中广泛说明了质体转化技术。基本的叶绿体转化技术涉及将位于一种选择性标记侧翼的克隆的质体DNA区连同所感兴趣的基因一起引入到一种适合的靶组织中，这是(例如)通过生物射弹(biolistics)或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)来进行的。这些1至1.5kb的侧翼区(被命名为靶向序列)促进了与质体基因组的同源重组，并且因而允许置换或修饰该原质体(plastome)的特定区域。最初，可将叶绿体16SrRNA和rps 12基因(赋予了针对壮观霉素和/或链霉素的抗性)的点突变用作选择性标记用于转化(斯瓦布(Svab,Z.)、海杜凯维奇(Hajdukiewicz,P.)、以及马利加(Maliga,P.)(1990)美国国家科学院院刊87,8526-8530)；斯托布(Staub,J.M.)、以及马利加(Maliga,P.)(1992)植物细胞4,39-45)。在这些标记之间克隆位点的存在允许建立一种质体靶向载体用于外源基因的引入(斯托布(Staub,J.M.)、以及马利加(Maliga,P.)(1993)欧洲分子生物学组织期刊(EMBO J.)12,601-606)。转化频率的大量增加可通过用一种显性的选择性标记(对壮观霉素去毒酶氨基糖甙3'-腺苷转移酶进行编码的细菌aadA基因)替换隐性的rRNA或r蛋白质抗生素抗性基因而获得(斯瓦布(Svab,Z.)、以及马利加(Maliga,P.)(1993)美国国家科学院院刊90,913-917)。之前，这种标记已经被成功地用于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)这种绿藻的质体基因组的高频率转化(戈尔德施密特-克莱蒙特(Goldschmidt-Clermont,M.)(1991)核酸研究19:4083-4089)。用于质体转化的其他选择性标记是本领域所已知的，并且被包括在本发明的范围之内。典型地，转化之后需要大致15-20个细胞分裂循环以便达到一种同质状态。质体表达(其中多种基因通过同源重组被插入到在每个植物细胞中存在的所有数千个环状质体基因组的拷贝中)利用了超过核表达的基因的庞大的拷贝数目的优点，以便允许能够很容易超过总的可溶性植物蛋白的10％的表达水平。在一个实施例中，可将本发明的一种多核苷酸插入至一种质体靶向的载体中并且转化至一种所希望的植物宿主的质体基因组中。因此，可获得与含有本发明的一种核苷酸序列的质粒基因组同质的植物，这些植物能够对该多核苷酸进行高表达。
选择转化的转基因植物、植物细胞和/或植物组织培养物的方法在本领域中是常规的，并且可以用于在此提供的本发明的方法中。
另外，如在本领域中熟知的，可以使用多种已知技术中的任一种来从经转化的植物细胞、植物组织培养和/或培养的原生质体中再生完整的转基因植物。从植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体的植物再生描述于例如埃文斯(Evans)等人(植物细胞培养手册(Handbook of Plant Cell Cultures)，第1卷，麦克米兰出版公司(MacMilanPublishing Co.)纽约(New York)(1983))；以及瓦希尔I.R.(Vasil I.R.)(编)(植物的细胞培养与体细胞遗传学(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)，学术出版社(Acad.Press)，奥兰多(Orlando)，第I卷(1984)和第II卷(1986))。
此外，工程化到以上所述的本发明的转基因种子和植物、植物部分和/或植物细胞中的遗传特性可以通过有性生殖或营养生长来传递，并且因此可以在子代植物中维持并传代。通常，维持和传代利用了被开发以适合特定目的(如收获、播种或耕作)的已知农业方法。
因此，可以用本领域熟知的任何数目的方法将一种多核苷酸引入到该植物、植物部分和/或植物细胞中，如上所述的。因此，不依赖于用于将一种或多种多核苷酸引入到植物中的具体方法，而可以使用允许该一种或多种多核苷酸获准进入该植物的至少一个细胞内部的任何方法。在有待引入一种以上多核苷酸的情况中，这些对应的多核苷酸可以作为一种单一核酸分子的部分、或者作为分开的核酸分子而进行组装，并且可以位于相同的或不同的核酸分子上。因此，可以在单一的转化事件中、在分开的转化事件中、或者例如作为育种方案的一部分在植物中，将这些多核苷酸引入到感兴趣的细胞中。
在本发明的一些实施例中，如果引入的核酸分子被结合到非染色体自主复制子中或被整合到该植物的一条或多条染色体中，则该引入的核酸分子可以稳定地维持在该植物细胞中。可替代地，引入的核酸分子可以存在于染色体外非复制型载体上并且可以瞬时地表达或瞬时地具有活性。不论是存在于染色体外非复制型载体中还是存在于整合到一个染色体中的载体中，该核酸分子可以存在于一个植物表达盒中。植物表达盒可以含有在植物细胞中驱动基因表达的调节序列，其中这些调节序列可操作地连接，从而每个序列可以实现其功能，例如，通过多腺苷酸化信号终止转录。示例性多腺苷酸化信号可以是起源于根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)t-DNA的那些，例如已知为Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合成酶(吉耶朗(Gielen)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)3:835(1984))或其功能等效物的基因，但是植物中的所有其他具有功能活性的终止子也是合适的。本发明的一个植物表达盒还可以包含其他可操作地连接的序列，像增强每RNA比率多肽的翻译增强子，例如含有来自烟草花叶病毒的5’-非翻译前导序列的超速驱动序列(overdrive-sequence)，(加利(Gallie)等人，核酸研究15:8693-8711(1987))。
因此，本发明的一些实施例针对被设计来表达本发明的多核苷酸和核酸分子的表达盒。如在此所使用，“表达盒”是指一种核酸分子，该核酸分子具有操作性地连接到感兴趣的核苷酸序列上的至少一个控制序列。以这种方式，例如，在表达盒中提供与待表达的核苷酸序列处于可操作连接的植物启动子以便用于表达在植物、植物部分和/或植物细胞中。
包含感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种是异源的。表达盒还可以是一种天然存在但已经是以适用于异源表达的重组形式获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒相对于该宿主而言是异源的，即该表达盒的特定核酸序列不是天然存在于该宿主细胞中的，并且必须已经通过一个转化事件引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先(ancestor)中。
除可操作地连接至本发明的核苷酸序列的启动子之外，本发明的表达盒还可以包括其他调节序列。如在此使用的，“调节序列”意指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列包括但不限于增强子、内含子、翻译前导序列、终止信号、以及多腺苷酸化信号序列。
已知源自病毒的多个非翻译前导序列用来增强基因表达。确切地说，已经显示来自烟草花叶病毒(TMV，“ω-序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)以及苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达方面有效(加利(Gallie)等人(1987)核酸研究15:8693-8711；以及斯库策斯基(Skuzeski)等人(1990)植物分子生物学15:65-79)。本领域已知的其他前导序列包括但不限于：小核糖核酸病毒前导子，如脑心肌炎(EMCV)5'非编码区前导子(埃尔罗伊-斯坦因(Elroy-Stein)等人(1989)美国科学院院刊86:6126-6130)；马铃薯y病毒组前导子，如烟草蚀纹病毒(TEV)前导子(艾利森(Allison)等人(1986)病毒学(Virology)154:9-20)；玉米矮花叶病毒(MDMV)前导子(艾莉森等人(1986)，同上)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导子(马策亚克(Macejak)和萨摩(Samow)(1991)自然353:90-94)；来自AMV的外壳蛋白mRNA的非翻译前导子(AMV RNA 4；乔布林(Jobling)和格尔克(Gehrke)(1987)自然325:622-625)；烟草花叶病TMV前导子(加利等人(1989)RNA分子生物学(Molecular Biology ofRNA)237-256)；以及MCMV前导子(隆梅尔(Lommel)等人(1991)病毒学81:382-385)。还参见，黛拉-乔帕(Della-Cioppa)等人(1987)植物生理学报84:965-968。
表达盒还可以任选地包括在植物中具有功能性的一个转录和/或翻译终止区(即，终止区)。多种转录终止子是可供用于在表达盒中使用的并且负责在超出感兴趣的异源核苷酸序列时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。该终止区对于该转录起始区可以是原生的，对于该操作性地连接的感兴趣的核苷酸序列可以原生的，对于该植物宿主可以是原生的，或者可以源自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的核苷酸序列、该植物宿主、或其任何组合而言是外源的或异源的)。适当的转录终止子包括但不限于CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子和豌豆rbcs E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物二者中使用。此外，可以使用编码序列的天然转录终止子。
该表达盒还可以包括一种用于选择性标记的核苷酸序列，该核苷酸序列可以用于对一种转化的植物、植物部分和/或植物细胞进行选择。如在此所使用，“选择性标记(selectable marker)”是指一种核苷酸序列，当该核苷酸序列表达时赋予一种不同的表型给表达该标记的植物、植物部分和/或植物细胞，并且因此允许此类转化的植物、植物部分和/或植物细胞与不具有该标记的那些区别开来。这样的核苷酸序列可以编码一种可选择的或可筛选的标记，这取决于该标记是否给予一种可以通过化学方法而被选择的性状，如通过使用一种选择性试剂(例如，一种抗生素、除草剂、或类似物)，或者取决于该标记是否仅是一种人们可以通过观察或测试而鉴别的性状，如通过筛选(例如，R基因座性状)。当然，合适的选择性标记的许多实例在本领域中是已知的并且可以用于在此描述的这些表达盒中。
选择性标记的实例包括但不限于：一种编码neo或nptll的核苷酸序列，它赋予对卡那霉素、G418、以及类似物的抗性(拍特里库斯(Potrykus)等人(1985)，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)199:183-188)；一种编码bar的核苷酸序列，它赋予对草丁膦的抗性；一种编码改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶的核苷酸序列，它赋予对草甘膦的抗性(欣奇(Hinchee)等人(1988)，生物技术(Biotech.)6:915-922)；一种编码腈水解酶(如来自臭鼻克雷白氏杆菌(Klebsiella ozaenae)的bxn)的核苷酸序列，它赋予对溴草腈的抗性(斯托克尔(Stalker)等人(1988)，科学242:419-423)；一种编码改变的乙酰乳酸合成酶(ALS)的核苷酸序列，它赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS-抑制化学品的抗性(欧洲专利申请号154204)；一种编码甲氨蝶呤-抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)的核苷酸序列(泰莱特(Thillet)等人(1988)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263:12500-12508)；一种编码茅草枯脱卤素酶的核苷酸序列，它赋予对茅草枯的抗性；一种编码甘露糖-6-磷酸异构酶(也称为磷酸甘露糖异构酶(PMI))的核苷酸序列，它赋予代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)；一种编码改变的邻氨基苯甲酸盐合酶的核苷酸序列，它赋予对5-甲基色氨酸的抗性；和/或一种编码hph的核苷酸序列，它赋予对潮霉素的抗性。本领域技术人员能够选择用于本发明表达盒中的合适选择性标记。
另外的选择性标记包括但不限于：一种编码β-葡萄糖醛酸酶的核苷酸序列或编码对于多种显色底物已知的一种酶的uidA(GUS)；一种编码在植物组织中对花色苷色素(红色)进行调节的产物的R基因座核苷酸序列(Dellaporta(德拉普塔)等人，染色体结构与功能：新概念的影响(Chromosome Structure and Function:Impact of New Concepts)中的263-282“通过Ac转座子标签技术对玉米R-nj等位基因的分子克隆”(“Molecular cloningof the maize R-nj allele by transposon-tagging with Ac”)，第18届斯特德莱遗传学专题讨论会(18th Stadler Genetics Symposium)(古斯塔夫森(Gustafson)和阿佩尔斯(Appels)编，Plenum出版社(Plenum Press)(1988))；一种编码β-内酰胺酶的核苷酸序列，对于β-内酰胺酶而言多种显色底物是已知的(例如，PADAC，一种显色头孢菌素)(苏利夫(Sutcliffe)(1978)美国科学院院刊75:3737-3741)；一种编码xylE的核苷酸序列，xylE编码一种儿茶酚双加氧酶(茹科夫斯基(Zukowsky)等人(1983)美国科学院院刊80:1101-1105)；一种编码酪氨酸酶的核苷酸序列，酪氨酸酶能够氧化酪氨酸成为DOPA以及多巴醌，其进而缩合形成黑色素(卡茨(Katz)等人(1983)普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)129:2703-2714)；一种编码β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，对于β-半乳糖苷酶而言存在显色底物；一种编码荧光素酶(lux)的核苷酸序列，荧光素酶允许生物发光检测(奥(Ow)等人(1986)科学234:856-859)；一种编码水母发光蛋白的核苷酸序列，水母发光蛋白可以在钙敏感的生物发光检测中采用(普鲁切(Prasher)等人(1985)生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)126:1259-1268)；或一种编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列(涅茨(Niedz)等人(1995)植物细胞报道(Plant Cell Reports)14:403-406)。本领域技术人员能够选择用于本发明表达盒中的合适选择性标记。
在一些实施例中，本发明的表达盒还可以包括对其他所希望的性状进行编码的核苷酸序列。此类核苷酸序列可以与核苷酸序列的任何组合叠加，以产生出具有所希望的表型的植物、植物部分或植物细胞。叠加的组合可以通过任何方法来产生，包括但不限于，通过任何常规的方法学的杂交育种植物或通过遗传转化。如果是通过遗传转化这些植物来进行叠加的，所感兴趣的核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如，包括一种或多种所希望的性状的转基因植物可以用作通过后续转化而引入另外的性状的靶标。额外的核苷酸序列可以在一个共转化方案中与由表达盒的任何组合提供的、本发明的核苷酸序列、核酸分子、核酸构建体、和/或组合物同时引入。例如，如果将引入两个核苷酸序列，则它们可以合并在分开的盒(反式)中或可以合并在相同的盒(顺式)上。多核苷酸的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子来驱动。进一步认识到的是，多核苷酸可以在一个所希望的基因组位置处使用位点特异性重组系统进行叠加。参见，例如，国际专利申请公开号WO 99/25821；WO 99/25854；WO 99/25840；WO 99/25855；以及WO 99/25853。
表达盒还可以包括用于一个或多个多肽的一个编码序列，这一个或多个多肽用于主要受益者是种子公司、栽培者或谷物加工者的农艺性状。感兴趣的多肽可以是由感兴趣的核苷酸序列编码的任何多肽。适合用于在植物中生产的感兴趣的多肽的非限制性实例包括产生农艺学重要性状的那些多肽，这些性状如除草剂抗性(有时也称为“除草剂耐受性”)、病毒抗性、细菌病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、和/或真菌抗性。参见，例如，美国专利号5,569,823；5,304,730；5,495,071；6,329,504；以及6,337,431。该多肽还可以是提高植物活力或产量(包括允许植物在不同的温度、土壤条件以及日光和沉淀水平下生长的性状)的多肽、或是允许对展现感兴趣性状的植物进行鉴定的多肽(例如，选择性标记、种皮颜色、等等)。不同的感兴趣的多肽，以及用于将这些多肽引入植物的方法描述于例如，美国专利号4,761,373、4,769,061、4,810,648、4,940,835、4,975,374、5,013,659、5,162,602、5,276,268、5,304,730、5,495,071、5,554,798、5,561,236、5,569,823、5,767,366、5,879,903、5,928,937、6,084,155、6,329,504以及6,337,431；以及美国专利公开号2001/0016956。还参见，万维网上的lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/。
赋予对抑制生长点或分生组织的除草剂(如咪唑啉酮或磺酰脲)的抗性/耐受性的多核苷酸也可以适用于本发明的一些实施例中。对于突变型ALS和AHAS酶在这一分类码中的示例性多核苷酸如描述在例如在美国专利号5,767,366和5,928,937中。美国专利号4,761,373和5,013,659针对抵抗不同的咪唑啉酮或磺酰胺除草剂的植物。美国专利号4,975,374涉及含有一种核酸的植物细胞和植物，该核酸编码一种突变型谷氨酰胺合成酶(GS)，该突变型谷氨酰胺合成酶抵抗已知抑制GS的除草剂(例如草胺膦和甲硫氨酸亚砜亚胺)的抑制作用。美国专利号5,162,602披露了对环己二酮和芳氧苯氧丙酸除草剂的抑制作用有抗性的植物。该抗性由改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)赋予。
赋予对草甘膦抗性的、由核苷酸序列编码的多肽也适用于本发明。参见，例如美国专利号4,940,835和美国专利号4,769,061。美国专利号5,554,798披露了抗草甘膦的转基因玉米植物，所述抗性由改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶基因赋予。
编码对磷酰基化合物(如草铵膦或草胺膦、以及吡啶氧丙酸或苯氧丙酸以及环己酮)的抗性的多核苷酸也是适合的。参见欧洲专利申请号0 242 246。参见，例如美国专利号5,879,903、5,276,268和5,561,236。
其他合适的多核苷酸包括对抑制光合作用的除草剂(如三嗪和苯基氰(腈水解酶))的抗性进行编码的那些。参见美国专利号4,810,648。编码用于除草剂抗性的另外的合适多核苷酸包括编码对2,2-二氯丙酸、烯禾啶、吡氟氯禾灵、咪唑啉酮除草剂、硫酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、均三嗪除草剂以及溴草腈的抗性的那些。同样适合的是赋予对原卟啉原氧化酶的抗性或者提供增强的对植物疾病的抗性、增强的对不利环境条件(非生物胁迫)的耐受性(这些条件包括但不限于干旱、极冷、极热、或极端的土壤盐度或极端的酸度或碱度)、以及在植物构型或发育中的改变(包括发育时间方面的变化)的多核苷酸。参见，例如，美国专利公开号2001/0016956和美国专利号6,084,155。
其他合适的多核苷酸包括对杀有害生物(例如杀昆虫)多肽进行编码的那些。这些多肽可以按足以控制例如昆虫有害生物的量(即昆虫控制量)进行生产。应当理解的是，在植物中对控制昆虫或其他有害生物必需的杀有害生物多肽的生产量可以变化，这取决于栽培品种、有害生物的类型、环境因素等。用于另外的昆虫或有害生物抗性的多核苷酸包括例如对芽孢杆菌生物体中鉴定的毒素进行编码的那些。已经克隆了编码来自几种亚种的苏云金芽孢杆菌(Baccillus thuringiensis)(Bt)毒素的多核苷酸，并且已经发现重组克隆毒杀鳞翅类、双翅类和鞘翅类昆虫幼虫(例如，不同的δ-内毒素基因，如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1Ea、Cry1Fa、Cry3A、Cry9A、Cry9C和Cry9B；以及编码植物性杀昆虫蛋白的基因，如Vip1、Vip2和Vip3)。Bt毒素的完整清单可以在万维网在苏塞克斯大学(University of Sussex)维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名法数据库中找到(还参见，例如克里克摩尔(Crickmore)等人(1998)微生物分子生物学综述(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:807-813)。
适合在植物中生产的多肽进一步包括改进或通过其他方式有助于收获的植物和/或植物部分转化成为一种商业上有用的产品(包括(例如)增加的或改变的碳水化合物含量和/或分布、改进的发酵特性、增加的油含量、增加的蛋白含量、改进的消化率、以及增加的营养成分含量(例如，增加的植物甾醇含量、增加的生育酚含量、增加的甾烷醇含量和/或增加的维生素含量))的那些。感兴趣的多肽还包括，例如在一种收获的作物中导致或促成不需要的成分例如植酸、或降解糖的酶类的含量降低的那些。“导致”或“促成”是指这种感兴趣的多肽可以直接或间接地促成一种感兴趣的性状的存在(例如，通过一种异源纤维素酶的使用来增加纤维素降解)。
在一个实施例中，多肽促成改进的食品或饲料的可消化度。木聚糖酶是半纤维素分解酶，这些酶改进了植物细胞壁的分解，这导致动物更好地利用这些植物营养素。这导致了改进的生长率和饲料转化。同样，可以减小包含木聚糖的饲料的粘度。在植物细胞内异源产生木聚糖酶也可以促进木质纤维素转化成工业加工中的可发酵糖。
来自真菌和细菌微生物的多种木聚糖酶已经得到鉴别和特征化(参见，例如美国专利号5,437,992；库格林(Coughlin)等人(1993)“里氏木霉纤维素酶和其他水解酶的第二三醋酸纤维研讨会论文集(Proceedings of the Second TRICEL Symposium onTrichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases)”，埃斯波(Espoo)；索米宁(Souminen)和雷尼凯恩(Reinikainen)编(1993)生物技术和工业发酵研究基金会(Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research)8:125-135；美国专利公开号2005/0208178；以及PCT公开号WO 03/16654)。具体地说，在里氏木霉(T.reesei)中已经鉴别出三种特异性木聚糖酶(XYL-I、XYL-II、和XYL-III)(滕卡宁(Tenkanen)等人，(1992)微生物酶技术(Enzyme Microb.Technol.)14:566；特洛宁(Torronen)等人，(1992)生物/技术(Bio/Technology)10:1461；以及徐(Xu)等人，(1998)应用微生物生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)49:718)。
在另一个实施例中，对于本发明有用的多肽可以是多糖降解酶。生产这种酶的本发明的植物对于产生例如用于生物加工的发酵原料会是有用的。在一些实施例中、可用于发酵过程的酶包括α淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、颗粒淀粉水解酶以及其他葡糖淀粉酶。
多糖降解酶包括：淀粉降解酶如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、葡糖醛酸糖苷酶(E.C.3.2.1.131)；外切-1,4-α-D葡聚糖酶如淀粉葡糖苷酶和葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)、β-淀粉酶(EC3.2.1.2)、α-葡糖苷酶(EC3.2.1.20)和其他外切淀粉酶；淀粉去分支酶，如a)异戊基(EC3.2.1.68)、支链淀粉酶(EC3.2.1.41)等；b)纤维素酶如外切-1,4-3-纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)、外切-1,3-β-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)；c)L-阿拉伯糖酶(arabinase)、如内切-1,5-α-L-阿拉伯糖酶(EC3.2.1.99)、α-阿拉伯糖苷酶(EC3.2.1.55)等；d)半乳聚糖酶如内切-1,4-β-D-半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、内切-1,3-β-D-半乳聚糖酶(EC3.2.1.90)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)等；e)甘露聚糖酶，如内切-1,4-β-D-甘露聚糖(EC3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、α-甘露糖苷酶(EC3.2.1.24)等；f)木聚糖酶，如内切-1,4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-D-木糖苷酶(EC3.2.1.37)、1,3-β-D-木聚糖酶等；和g)其他酶如α-L-岩藻糖苷酶(EC3.2.1.51)、α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)、果聚糖酶(EC3.2.1.65)、菊粉酶(EC3.2.1.7)等。
可以与本发明一起使用的另外的酶包括蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括但不限于从曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、毛霉属(Mucor)和根霉属(Rhizopus)，如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)和米黑毛霉(M.miehei)获得的那些。在一些实施例中，本发明的多肽可以是纤维二糖水解酶(CBH)(EC3.2.1.91)。在一个实施例中，纤维二糖水解酶可以是CBH1或CBH2。
其他酶类(与本发明一起使用)包括但不局限于：半纤维素酶类，例如甘露聚糖酶类以及阿拉伯呋喃糖酶类(EC 3.2.1.55)；木素酶类；脂肪酶类(例如，E.C.3.1.1.3)、葡萄糖氧化酶类、果胶酶类、木聚糖酶类、转葡萄糖苷酶类、α1,6葡糖苷酶(例如，E.C.3.2.1.20)；酯酶如阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)以及乙酰基木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)；以及角质酶(cutinases)(例如，E.C.3.1.1.74)。
如在此使用，“植物”意为任何植物并且因此包括，例如被子植物(包括单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、苔藓植物、厥类和/或拟蕨类。在本发明的一些实施例中，该植物是一种种子植物。另外，本发明的一种“植物”是处于任何发育阶段的任何植物。
如在此使用的，术语“植物部分”或“植物材料”包括但不限于，胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、根、花或花部分、枝、果实、果仁、穗、穗轴、果壳、茎秆、根、根尖、花药、花粉、卵细胞、受精卵、插条、植物细胞(包括在植物和/或植物的部分中完整的植物细胞)、植物原生质体、植物组织、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团(plant clumps)、或任何其他部分或植物的产物。另外，如此处使用的，“植物细胞”是指植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。因此，在一些实施例中，本发明的植物细胞可以处于一种分离的单细胞形式中，或者可以是一种培养的细胞，或者可以是较高级的组织单位(例如像，一种植物组织或一种植物器官)的一部分。
“原生质体”是一种分离的植物细胞，没有细胞壁或仅具有部分细胞壁。
“植物细胞培养物”意指植物单元(例如像，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
如在此使用的，“植物器官”是植物的一个独特而明显结构化和分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
如在此使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括在培养物或在植物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于：全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
植物的非限制性实例可以包括蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。
在一些具体实施例中，本发明的植物可以是高粱、小麦、向日葵、番茄、油菜作物、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜以及玉米。在其他实施例中，该植物是玉米。
一旦一种令人希望的多核苷酸已经被转化到一种特定的植物种类中，使用传统的育种技术可以将其在该种类中繁殖或将其转移到相同种类的其它品种中，特别包括商业品种。
本发明的另外的方面包括从本发明的这些转基因植物和/或其部分中产生的收获产物以及从所述收获产物中产生的加工产物。收获产物可以是全株植物或任何植物部分，如在此描述的。因此，在一些实施例中，收获的产物的非限制性实例包括种子、果实、花或其部分(例如，花药、柱头等)、叶、茎等。在其他实施例中，加工产物包括但不限于由收获的本发明的种子产生的细粉、粗粉、油、淀粉、谷物等，其中所述种子包含发明的一种核酸分子/多核苷酸/核苷酸序列。
在其他实施例中，本发明提供了来自本发明的转基因种子和/或转基因植物的提取物，其中该提取物包含本发明的一种核酸分子、一种多核苷酸、一种核苷酸序列或一种多肽。来自植物或植物部分的提取物可以根据本领域中熟知的程序制备(参见，戴拉托瑞(dela Torre)等人，食品农业和环境杂志(Food,Agric.Environ.)2(1):84-89(2004)；古伊德(Guidet)，核酸研究22(9):1772-1773(1994)；李普顿(Lipton)等人，食品和农业免疫学(Food Agric.Immun.)12:153-164(2000)。
本发明的一个仍另外的方面是包括在一种农业上可接受的载体中的本发明的工程化的多肽的一种组合物。
如在此使用的，“农业上可接受的载体”可以包括与该活性组分结合以有助于它施用于植物或其部分的天然或合成、有机或无机材料。农业上可接受的载体包括但不限于可用于农业配制品中的惰性组分、分散剂、表面活性剂、佐剂、增粘剂、粘着剂、粘合剂、或其组合。另一种农业上可接受的载体可以是一种转基因植物或植物部分。
这类组合物可以按使该杀有害生物多肽与该有害生物接触的任何方式施用。因此，可以将该组合物施用于植物或植物部分(包括种子、叶、花、茎、块茎、根等)的表面。
在另外的实施例中，提供了一种产生针对至少欧洲玉米钻蛀虫具有杀有害生物(例如杀昆虫)活性的多肽的方法，该方法包括：在一个转基因非人类宿主细胞中表达本发明的多核苷酸和/或核酸分子，从而生产针对至少欧洲玉米钻蛀虫具有杀有害生物(例如杀昆虫)活性的多肽。在一些实施例中，该转基因非人类宿主细胞是一种植物细胞。在其他实施例中，该转基因非人类宿主细胞是一种细菌细胞。在仍其他实施例中，该转基因非人类宿主细胞是一种酵母细胞。
在一些实施例中，本发明的多肽针对至少一种另外的昆虫(除欧洲玉米钻蛀虫之外)具有杀有害生物活性，其中所述另外的昆虫包括但不限于小菜蛾(菱形斑纹蛾)、草地贪夜蛾(秋季行军虫)、小地老虎(黑切根虫)、西部灰地老虎(灰白西部切根虫)、豆切根虫(西部豆切根虫)、谷实夜蛾(棉铃虫)、烟芽夜蛾(烟夜蛾)、甜菜夜蛾(甜菜行军虫)、茶色铃夜蛾(原生夜蛾)、棉铃虫(棉花螟蛉)、烟草天蛾(烟天蛾)、粉纹夜蛾(甘蓝尺蠖)、红铃麦蛾(红铃虫)、巨座玉米螟(西南玉米钻蛀虫)、小蔗螟(甘蔗钻蛀虫)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)(小玉米茎蛀虫)、大豆夜蛾(Psuedoplusia includens、soybean looper)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)(藜豆毛虫(velvetbean caterpillar))、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)(绿色苜蓿虫)、以及向日葵细卷叶蛾(带状向日葵斑蛾)、及其任意组合。
在一个另外的方面，本发明提供一种产生抗有害生物(例如抗昆虫)转基因植物的方法，包括：向植物体内引入包括编码本发明的多肽的核苷酸序列的一种重组核酸分子，其中该核苷酸序列在该植物中表达，从而赋予该植物对至少欧洲玉米钻蛀虫的抗性，并产生一种抗有害生物(例如抗昆虫)转基因植物。在一些实施例中，该重组核酸分子被可操作地连接至一个异源性启动子序列。在一些实施例中，与缺乏所述重组核酸分子的对照植物相比，抗有害生物转基因植物对至少欧洲玉米钻蛀虫具有抗性。
在本发明的一些方面中，与不包括引入的本发明的一种或多种核酸分子或一种或多种核苷酸序列的对照植物对有害生物的抗性相比，包括本发明的核苷酸序列或核酸分子的转基因植物对相同的有害生物具有抗性。在本发明的其他方面中，与不包括引入的本发明的一种或多种核酸分子或一种或多种核苷酸序列的对照植物对有害生物的抗性相比，包括本发明的核苷酸序列或核酸分子的转基因植物对相同的有害生物(例如昆虫有害生物和/或线虫有害生物)具有抗性。
在一些实施例中，对至少欧洲玉米钻蛀虫具有抗性的本发明的转基因植物进一步对至少一种另外的昆虫具有抗性，其中所述另外的昆虫包括但不限于欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫)、小菜蛾(菱形斑纹蛾)、草地贪夜蛾(秋季行军虫)、小地老虎(黑切根虫)、西部灰地老虎(灰白西部切根虫)、豆切根虫(西部豆切根虫)、谷实夜蛾(棉铃虫)、烟芽夜蛾(烟夜蛾)、甜菜夜蛾(甜菜行军虫)、茶色铃夜蛾(原生夜蛾)、棉铃虫(棉花螟蛉)、烟草天蛾(烟天蛾)、粉纹夜蛾(甘蓝尺蠖)、红铃麦蛾(红铃虫)、巨座玉米螟(西南玉米钻蛀虫)、小蔗螟(甘蔗钻蛀虫)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)(小玉米茎蛀虫)、大豆夜蛾(Psuedoplusia includens、soybean looper)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)(藜豆毛虫(velvetbean caterpillar))、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)(绿色苜蓿虫)、以及向日葵细卷叶蛾(带状向日葵斑蛾)、或其任意组合。
在另外的实施例中，提供了一种控制至少欧洲玉米钻蛀虫昆虫的方法，该方法包括向这些昆虫递送有效量的本发明的工程化的多肽。
“递送”一种Vip多肽是指该多肽与一种昆虫或昆虫有害生物相接触，得到对该昆虫的毒性作用以及控制。为了是有效的，该Vip多肽首先被该昆虫经口摄取。然而，该Vip多肽可以按许多认可的方式递送给该昆虫。将一种多肽经口递送给一种昆虫的方式包括但不限于提供该多肽于：(1)一种转基因植物中，其中该昆虫食用(摄取)该转基因植物的一个或多个部分，从而摄取在该转基因植物中表达的该多肽；(2)可施用于例如昆虫生长介质或合并到其中的一种或多种配制的蛋白质组合物中；(3)可施用于一个植物部分的表面(例如，喷雾到该表面)、然后随着该昆虫食用一个或多个经喷雾的植物部分而被该昆虫摄取的一种或多种蛋白质组合物中；(4)一种诱饵基质；(5)经由注射进入该昆虫体内；或(6)领域认可的任何其他毒素递送系统。因此，经口递送给昆虫的的任何方法可用于递送本发明的杀有害生物多肽。在一些具体实施例中，本发明的多肽是经口递送给昆虫的，其中该昆虫摄取转基因植物的一个或多个部分。
在其他实施例中，本发明的工程化的多肽是经口递送给昆虫的，其中该昆虫摄取经包括本发明的多肽的一种组合物喷雾的植物的一个或多个部分。可以使用本领域技术人员已知的用于将化合物、组合物、配制品等施用于植物表面的任何方法将本发明的组合物递送到植物表面。递送至或接触一种植物或其部分的一些非限制性实例包括喷洒、撒粉、喷雾、分散、下雾、雾化、撒播、浸泡、土壤注入、土壤掺入、浸透(例如，根、土壤处理)、浸渍、灌注、涂覆、叶或茎渗透、侧施或种子处理等、及其组合。用于使一种或多种化合物、一种或多种组合物或一种或多种配制品接触一种植物或其部分的这些和其他程序对于本领域普通技术人员是熟知的。
在本发明的一些实施例中，提供一种产生针对靶细胞和/或生物体具有改进的杀有害生物活性的杀有害生物多肽的方法，该方法包括：a)将彼此具有至少80％一致性的多肽的多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或更多个)氨基酸序列进行比对，其中这些多肽中的至少一个对该靶细胞和/或生物体展现至少中等毒性并且这些多肽的至少另一种对该靶细胞和/或生物体未展现毒性或展现低毒性；b)鉴定在(a)的比对的氨基酸序列中的至少两个之间不同的至少一个氨基酸残基；c)针对在步骤(b)中鉴定的至少一个氨基酸残基取代一个氨基酸残基，以产生一种修饰多肽的修饰氨基酸序列；d)确定在步骤(c)中产生的修饰的多肽针对该靶细胞和/或生物体的杀有害生物活性的水平；并且e)选择(d)的针对该靶细胞和/或生物体具有改进的杀有害生物活性(与未用相同的一个或多个氨基酸取代修饰的多肽相比)的一个修饰的多肽，从而产生针对该靶细胞和/或生物体具有改进的杀有害生物活性的一种多肽。
在本发明的另外的实施例中，提供一种产生针对靶细胞和/或生物体(例如昆虫细胞或昆虫)具有改进的杀有害生物活性的Vip多肽的方法，该方法包括：a)将彼此具有至少80％一致性的Vip多肽的多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或更多)氨基酸序列进行比对，其中该Vip多肽中的至少一个对该靶细胞和/或生物体展现至少中等毒性并且该Vip多肽的至少另一种对该靶细胞和/或生物体未展现毒性或展现低毒性；b)鉴定在(a)的比对的Vip氨基酸序列中的至少两个之间不同的至少一个氨基酸残基；c)针对在步骤(b)中鉴定的至少一个氨基酸残基取代一个氨基酸残基，以产生一种修饰Vip多肽的修饰的Vip3氨基酸序列；d)确定在步骤(c)中产生的修饰的Vip多肽针对该靶细胞和/或生物体的杀有害生物活性的水平；并且e)选择(d)的针对该靶细胞和/或生物体具有改进的杀有害生物活性(与未用相同的一个或多个氨基酸取代修饰的Vip多肽相比)的一个修饰的Vip多肽，从而产生针对该靶细胞和/或生物体具有改进的杀有害生物活性的一种Vip多肽。在一些实施例中，该Vip多肽是一种Vip3多肽。如以上指出的，一种Vip3多肽可被鉴定为是具有大约80-88kDa大小的、具有在芽孢杆菌属的分泌中未被处理(即裂解)的高保守N端分泌信号的芽孢杆菌属多肽，并且该多肽包括IYGFATGIKDI(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中，鉴定在(a)的比对的氨基酸序列(例如Vip氨基酸序列)中的至少两个之间不同的至少一个氨基酸残基包括在在步骤(a)的比对的氨基酸序列中(例如在比对的Vip或Vip3氨基酸序列中)鉴定一个必需的氨基酸位置、一个增效剂氨基酸位置、一个隐藏增效剂氨基酸位置、或其任意组合。
在另外的方面，该比对的氨基酸序列(例如Vip或Vip3氨基酸序列)彼此可具有至少大约80％一致性(例如至少大约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％和/或其中的任意范围、和/或其任意组合)。在一些实施例中，该比对的氨基酸序列中的至少一个对该靶生物体不具有毒性或具有非常低的毒性。
如在此处使用的“中等毒性”、“中等杀有害生物活性”或“中等杀昆虫活性”是指在标准测试多肽浓度(例如3μg/cm3)下对易感(例如杀死或生长降低大约50％)的靶生物体(例如昆虫)的毒性水平。如在此处使用的“无活性或非常低活性”意指该多肽对靶生物体(例如昆虫)不具有负面影响或该多肽在标准多肽浓度下产生少于50％生长抑制。
如在此使用的，“隐藏增效剂”或“隐藏增效剂位置”是指一种杀有害生物(例如杀昆虫)多肽的氨基酸序列内的一组残基。这些是以下这样的氨基酸位置，其中具有至少中等杀有害生物(例如杀昆虫)活性的一种或多种多肽具有不同的残基，并且其中无杀有害生物活性或具有非常低杀有害生物(例如杀昆虫)活性的一种或多种多肽与具有至少中等杀有害生物活性的一种或多种多肽相同的位置处具有相同的残基。作为举例而非限制，Vip3C的N312是一个隐藏增效剂位置。Vip3B在位置312具有一个天冬氨酸，而Vip3A在该位置具有一个天冬酰胺(D)。在公式术语中，C＝A≠B。作为举例而非限制，Vip3C的K661也是一个隐藏增效剂位置。代替赖氨酸，Vip3B和Vip3A在此位置具有一个天冬酰胺。在公式术语中，B＝A≠C。
“必需的”或“必需的位置”是指一种杀有害生物(例如杀昆虫)多肽的氨基酸序列内的一组残基。这些是以下这样的氨基酸位置，其中具有至少中等杀有害生物(例如杀昆虫)活性的一种或多种多肽具有相同的残基，并且其中无杀有害生物活性或具有非常低杀有害生物(例如杀昆虫)活性的一种或多种多肽在相同的位置处具有不同的残基。作为举例而非限制，Vip3C的A257是一个必需的位置。Vip3B也在位置257具有一个丙氨酸，而Vip3A在该位置具有一个苏氨酸。在公式术语中，B＝C≠A。
如在此使用的，“增效剂”或“增效剂位置”是指一种杀有害生物(例如杀昆虫)多肽的氨基酸序列内的一组残基。这些是以下这样的氨基酸位置，其中具有至少中等杀有害生物(例如杀昆虫)活性的一种或多种多肽在相同的位置彼此之间相比时以及与针对测试生物体无杀有害生物活性或具有非常低杀有害生物(例如杀昆虫)活性的一种或多种多肽相比时不具有相同的残基。作为举例而非限制，Vip3C的E760是一个增效剂位置。Vip3A在位置760具有一个赖氨酸，而Vip3B在此位置具有一个丙氨酸。在公式术语中，B≠C≠A。
靶向和控制一种或多种生物体而不影响非靶生物体的能力可能是希望的。因此，在一些实施例中，本发明进一步提供降低Vip多肽对具体的靶细胞或生物体的杀有害生物活性的方法。因此，本发明的一些方面提供一种产生针对靶细胞和/或生物体具有降低的杀有害生物活性的Vip多肽的方法，该方法包括：a)将Vip多肽的多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或更多个)氨基酸序列进行比对，其中这些Vip多肽中的至少一个对该靶细胞和/或生物体展现至少中等毒性；b)鉴定在(a)的比对的Vip氨基酸序列中的至少两个之间不同的至少一个氨基酸残基；c)针对在步骤(b)中鉴定的至少一个氨基酸残基取代一个氨基酸残基，以产生修饰Vip多肽的修饰氨基酸序列；d)确定在步骤(c)中产生的修饰的Vip多肽针对该靶细胞和/或生物体的杀有害生物活性的水平；并且e)选择(d)的针对该靶细胞和/或生物体具有降低的杀有害生物活性(与未用相同氨基酸取代修饰的Vip多肽相比)的一个修饰的Vip多肽，从而产生针对该靶细胞和/或生物体具有降低的杀有害生物活性的一种Vip多肽。
在本发明的一些实施例中，该Vip多肽是一种Vip3多肽。在另外的实施例中，该Vip3多肽在对应于选自表1中的一个位置、或其任意组合的位置上包括至少一个氨基酸突变。在其他实施例中，该Vip3多肽在对应于V338、K455、R465、S532、I544、G580、S712、E760、L766、V768中的一个位置、或其任意组合的位置上包括至少一个氨基酸突变。在另外的实施例中，具有改进的杀昆虫活性的Vip多肽具有以下各项：SEQ ID NO:3的氨基酸序列、SEQ IDNO:5的氨基酸序列、SEQ ID NO:7的氨基酸序列、SEQ ID NO:9的氨基酸序列、SEQ ID NO:11的氨基酸序列、SEQ ID NO:13的氨基酸序列、SEQ ID NO:18的氨基酸序列、SEQ ID NO:20的氨基酸序列、SEQ ID NO:22的氨基酸序列、SEQ ID NO:24的氨基酸序列、SEQ ID NO:26的氨基酸序列、SEQ ID NO:28的氨基酸序列、SEQ ID NO:30的氨基酸序列、SEQ ID NO:32的氨基酸序列、SEQ ID NO:34的氨基酸序列、SEQ ID NO:36的氨基酸序列、SEQ ID NO:38的氨基酸序列、SEQ ID NO:40的氨基酸序列、SEQ ID NO:42的氨基酸序列、SEQ ID NO:44的氨基酸序列、SEQ ID NO:46的氨基酸序列、SEQ ID NO:48的氨基酸序列、SEQ ID NO:50的氨基酸序列、SEQ ID NO:52的氨基酸序列、SEQ ID NO:54的氨基酸序列、SEQ ID NO:56的氨基酸序列、SEQ ID NO:58的氨基酸序列、SEQ ID NO:60的氨基酸序列、SEQ ID NO:62的氨基酸序列、SEQ ID NO:64的氨基酸序列、SEQ ID NO:66的氨基酸序列、SEQ ID NO:68的氨基酸序列、SEQ ID NO:70的氨基酸序列、SEQ ID NO:72的氨基酸序列、SEQ ID NO:74的氨基酸序列、SEQ ID NO:76的氨基酸序列、SEQ ID NO:78的氨基酸序列、SEQ ID NO:80的氨基酸序列、SEQ ID NO:82的氨基酸序列、SEQ ID NO:84的氨基酸序列、SEQ ID NO:86的氨基酸序列、SEQ ID NO:88的氨基酸序列、SEQ ID NO:90的氨基酸序列、SEQ ID NO:92的氨基酸序列、SEQ ID NO:94的氨基酸序列、SEQ ID NO:96的氨基酸序列、SEQ ID NO:98的氨基酸序列、SEQ ID NO:100的氨基酸序列、SEQ ID NO:102的氨基酸序列、SEQ ID NO:104的氨基酸序列、SEQ ID NO:106的氨基酸序列、SEQ ID NO:108的氨基酸序列、SEQ ID NO:110的氨基酸序列、SEQ ID NO:112的氨基酸序列、或其任意组合。
如本领域的普通技术人员将理解的，本发明的方法还可以用于降低其他多肽对具体靶细胞或生物体的杀有害生物活性。
如在此处使用的靶细胞或生物体可以是任何生物体或细胞。在一些实施例中，该靶细胞和/或生物体是昆虫或线虫、或昆虫或线虫的细胞。
如在此使用的，靶昆虫(或昆虫细胞)包括但不限于来自以下各目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、隐翅目(Siphonaptera)、或毛翅目(Trichoptera)。在一些实施例中，该靶细胞和/或生物体是来自鳞翅目的靶昆虫细胞或昆虫。在其他实施例中，该昆虫是欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫)、小菜蛾(菱形斑纹蛾)、草地贪夜蛾(秋季行军虫)、小地老虎(黑切根虫)、西部灰地老虎(灰白西部切根虫)、豆切根虫(西部豆切根虫)、谷实夜蛾(棉铃虫)、烟芽夜蛾(烟夜蛾)、甜菜夜蛾(甜菜行军虫)、茶色铃夜蛾(原生夜蛾)、棉铃虫(棉花螟蛉)、烟草天蛾(烟天蛾)、粉纹夜蛾(甘蓝尺蠖)、红铃麦蛾(红铃虫)、巨座玉米螟(西南玉米钻蛀虫)、小蔗螟(甘蔗钻蛀虫)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)(小玉米茎蛀虫)、大豆夜蛾(Psuedoplusiaincludens、soybean looper)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)(藜豆毛虫(velvetbeancaterpillar))、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)(绿色苜蓿虫)、以及向日葵细卷叶蛾(带状向日葵斑蛾)、或其任意组合。在一些具体实施例中，该鳞翅类昆虫是欧洲玉米螟(欧洲玉米钻蛀虫)。
如在此使用的，靶线虫(或线虫细胞)包括但不限于小环线虫属、茎线虫属、球异皮线虫属、螺旋线虫属、异皮线虫属、长针线虫属、根结线虫属、拟毛刺线虫属、短体线虫属、穿孔线虫属(Radolpholus)、盘旋线虫属(Rotelynchus)、肾形线虫属、小垫刃线虫属、剑线虫属和/或其任意组合。在具体实施例中，靶线虫包括而不限于根结线虫属(例如南方根结线虫和爪哇根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫)、异皮线虫属(例如大豆异皮线虫、胡萝卜异皮线虫、甜菜异皮线虫、燕麦异皮线虫和三叶草异皮线虫)、球异皮线虫属(例如，马铃薯金线虫)、穿孔线虫属(例如，相似穿孔线虫)、肾形线虫属、短体线虫属(例如落选短体线虫和穿刺短体线虫)、滑刃线虫属、螺旋线虫属、纽带线虫属、类毛刺线虫属、长针线虫属、真珠线虫属、亚蛇形线虫属、刺线虫属、小环线虫属、轮线虫属、茎线虫属、鳞球茎茎线虫、锥线虫属、半轮线虫属、鞘线虫属、潜根线虫属、根结线虫属、大节片线虫属、梅林纽斯属(Meliniusspp.)、斑皮线虫属、五沟线虫属、盾状线虫属、剑线虫属、矮化线虫属、和/或其任意组合。
因此，如本领域的普通技术人员将认识到的，除了改进Vip3多肽的杀有害生物活性，此处所述的方法可用于改进杀有害生物多肽，一般包括但不限于Vip1多肽、Vip2多肽和/或Cry蛋白。具体地，本发明的方法可用于在任何多肽中鉴定靶氨基酸位置以用于突变分析，在所述多肽中1)一个或多个家族成员对靶有害生物具有至少中等毒性；以及2)相同家族的一个或多个成员针对相同的靶有害生物无活性至具有非常低的活性。例如，可应用这类方法来增加杀昆虫活性谱或增加针对某些靶有害生物的比活性。
昆虫控制成分的组合
本发明的工程化的杀有害生物多肽可以与苏云金芽孢杆菌(Bt)Cry蛋白或其他杀有害生物成分组合使用以增加有害生物的靶范围或以预防或缓和有害生物抗性的发展。可用于与本发明的工程化的杀有害生物多肽组合的Bt Cry蛋白的完整清单可以在万维网在苏塞克斯大学(University of Sussex)维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名法数据库中找到(也参见，例如克里克摩尔(Crickmore)等人(1998)微生物分子生物学综述62:807-813)。其他的杀昆虫成分包括蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸型两者)、凝集素、　-淀粉酶、过氧化物酶以及胆固醇氧化酶。其他Vip编码序列，如在美国专利号5,849,870中披露并在此处通过引用结合的例如vip1A(a)和vip2A(a)，以及其他Vip3蛋白也适用于本发明。
可以将一种植物遗传工程化以包含并表达所有的在作为分子堆积(molecularstack)中必需的基因来实现一种以上的杀昆虫成分在同一个转基因植物中的共表达。可替代地，可以将一种植物(亲本1)遗传工程化，用于本发明的编码工程化的杀有害生物多肽的多核苷酸的表达。可以将一种第二植物(亲本2)遗传工程化，用于一种补充性昆虫控制成分的表达。通过将亲本1与亲本2杂交以创建一个生殖堆积，可获得表达被引入至亲本1和亲本2中的所有基因的子代植物。
还可以将本发明的转基因植物或转基因种子用化学杀有害生物剂处理。这样的化学处理可以包括杀昆虫剂、杀真菌剂或杀线虫剂。本发明的转基因植物或种子还可以用一种杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣进行处理，如在美国专利号5,849,320以及5,876,739中所说明，通过引用结合在此。其中本发明的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣与转基因植物或种子针对同一种靶昆虫是具有活性的，该组合(i)在用于增强本发明的工程化的一种杀有害生物多肽针对靶有害生物的活性的方法中以及(ii)在用于通过提供针对该靶有害生物的一种第二作用机制而防止对本发明的工程化的杀有害生物多肽产生抗性的一种方法中是有用的。因此，本发明提供了一种增强活性的方法，这种活性对抗或防止在一种靶有害生物(例如，昆虫有害生物)中产生抗性，该方法包括将一种杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣施用至包含本发明的一种或多种工程化的杀有害生物多肽的一种转基因植物或种子上。这类杀昆虫剂的实例包括而不限于一种合成拟除虫菊酯，例如七氟菊酯、λ三氯氟氰菊酯、联苯菊酯、苄氯菊酯和氟氯氰菊酯；一种拟除虫菊酯，例如除虫菊酯、τ氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯、反式-氟氯氰菊酯、噻嗯菊酯、生物苄呋菊酯、胺菊酯、苯醚菊酯、烯炔菊酯、苯醚氰菊酯、炔丙菊酯、炔咪菊酯、烯丙菊酯以及生物烯丙菊酯；噁二嗪衍生物；一种氯烟碱，例如吡虫啉、啶虫脒、以及烯啶虫胺；一种硝基胍；一种吡咯，例如溴虫腈；一种吡唑，例如吡螨胺；一种二酰肼，例如虫酰肼、甲氧虫酰肼、以及氯虫酰肼；一种三唑，例如唑蚜威；一种生物/发酵产物，例如阿维菌素以及多杀菌素；一种苯基吡唑，例如氟虫腈；一种有机磷酸盐，例如高灭磷、苯线磷、二嗪磷、氯蜱硫磷、氯蜱硫磷-甲基以及马拉硫磷；以及一种氨基甲酸酯，例如甲萘威、涕灭威、呋喃丹、硫双威以及草氨酰。以上列出的类型的杀有害生物剂的另外的信息可以在杀有害生物剂手册(The Pesticide Manual)，第11版，C.D.S.汤姆林(Tomlin)编，英国作物保护委员会，法纳姆(Farnham)，萨里(Surry)，UK(1997)中找到。甚至在杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣针对不同的昆虫有害生物是有活性的时候，该杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣对于扩展昆虫有害生物控制的范围是有用的。
本发明进一步囊括一种保护本发明的转基因植物对抗一种或多种有害生物的摄食损害的方法，该方法包括针对该转基因植物提供一种种子，其中该种子包括本发明的一种核酸分子，并且用有效量的一种杀有害生物剂处理该种子，与该多肽结合，这对于保护从该种子生长的植物对抗至少一种或多种有害生物的摄食损害是有效的。
在本发明的另一个实施例中，提供了增强对本发明的转基因植物的保护的方法，该方法包括针对该转基因植物提供一种种子，其中该种子包括本发明的一种核酸分子，并且用有效量的一种杀有害生物剂处理该种子，与本发明的一种多肽结合，这与由单独的该杀有害生物剂或该多肽所预期的相比，对于保护从该种子生长的植物对抗至少一种或多种有害生物的摄食损害在较大的程度上是有效的。
毒性测定
可使用一种全昆虫测定用于确定毒性。在这些测定中，Vip3多肽被置于昆虫饮食例如人工饮食或植物组织上，并被靶昆虫消耗。可在进一步的生物测定中对这些引起靶昆虫生长抑制或死亡的克隆进行测试以确定效力。在一些实施例中，具有改进的效力的编码多肽的Vip3基因可被鉴定为具有降低的EC50(将昆虫生长降低50％所需的多肽的浓度)和/或LC50(引起50％死亡率所需的多肽的浓度)的编码多肽的那些。
还可使用体外测定用于对修饰的Vip3多肽的毒性进行筛选。这类测定典型地涉及使用培养的对Vip3多肽易感的昆虫细胞和/或表达Vip3多肽的受体的细胞(天然地或由异源性基因的表达得到的)。可以使用其他体外测定，例如检测细胞形态变化、用于检测细胞死亡的染料和标记、或检测细胞的ATP酶的释放。使用培养的昆虫细胞针对Vip3多肽毒性的适合的体外测定的一个实例是利用Sf9(草地贪夜蛾)细胞。Sf9细胞对Vip3多肽高度敏感。当将Vip3多肽与Sf9细胞混合时，细胞膜对小分子变得高度可渗透。当将一种染料例如台盼蓝添加到该细胞悬浮液中时，被Vip3多肽杀死的那些细胞被染为蓝色。因此，该Vip3多肽的细胞毒性可通过图象分析确定。
其他的体外测定涉及使用Vip3多肽的受体。一种这样的受体披露于美国专利6,291,156中，通过引用结合在此。可将Vip3多肽受体固定在一个接受表面上，例如而不限于96孔板或硝酸纤维素滤膜，并且暴露于包括本发明的核苷酸序列的克隆。因此，可基于对该Vip3受体的结合亲和力来鉴定对功能性Vip3多肽进行编码的本发明的核苷酸序列。另外，可使用本领域中已知的方法(参见例如克莱姆(Clem)和米勒(Miller)，1194，分子与细胞生物学14:5212-522)，将编码该Vip3受体的基因转化到非Vip3易感细胞系(例如施耐德(Schneider)2(S2)果蝇细胞系)中。然后可将转化的S2细胞暴露于包括本发明的核苷酸序列的克隆。因此，可基于对细胞死亡的诱导来鉴定对功能性多肽进行编码的本发明的核苷酸序列。
现在将参考以下实例描述本发明。应了解，这些实例并不旨在将权利要求书的范围限于本发明，而是旨在成为某些实施例的示例。技术人员想到的所例举的方法中的任何变型旨在落在本发明的范围内。
实例
实例1.用于增加Vip3针对欧洲玉米钻蛀虫(ECB；欧洲玉米螟)的比活性的残基选择标准
Vip3A(SEQ ID NO:15)对广谱的鳞翅类昆虫(包括黑切根虫(BCW)、棉铃虫(CEW)、烟夜蛾(TBW)以及秋季行军虫(FAW))具有活性，但对欧洲玉米钻蛀虫(ECB)不具有活性。
Vip3B(SEQ ID NO:16)和Vip3D(SEQ ID NO:1)还对FAW具有活性并且进一步对ECB具有活性。然而，与例如Cry1Ab相比，Vip3B和Vip3D对ECB具有更低的比活性，这使得这些蛋白质不太具有吸引性，这归因于当它们被部署用于经由转基因植物中的表达进行的昆虫控制时针对ECB的“高剂量”策略。因此，将Vip3D工程化的以增加它对至少ECB的比活性。
选择Vip3D中的氨基酸用于诱变，基于对Vip3A、Vip3B和Vip3D的氨基酸序列的比对(参见表2)、单个多肽的生物活性以及以下假设：1)Vip3D的ECB活性是通过在Vip3B和Vip3D中保守而在Vip3A中不同的一些氨基酸(即Vip3D＝Vip3B≠Vip3A)控制。这些氨基酸称作“必需的”并且在表2中披露的序列比对中加粗体；2)Vip3B和Vip3D的ECB活性的变化是通过Vip3B和Vip3D之间不匹配的氨基酸调节的。在这三种多肽中在这些位置的氨基酸是不同的(即Vip3D≠Vip3B≠Vip3A)。这些氨基酸称作“增效剂”并且在表2的序列比对中在该氨基酸位置的上方用“*”标记；并且3)Vip3A具有一些与Vip3B或Vip3D中的氨基酸相同的氨基酸，这些氨基酸可涉及到Vip3B或Vip3D针对ECB的活性中(即Vip3B＝Vip3A≠Vip3D并且Vip3D＝Vip3A≠Vip3B)。这些残基称作“隐藏增效剂”并且在表2中披露的序列比对中加下划线。此外，基于关于Vip3A的核心毒性区域本领域中已知的，Vip3D的核心毒性区域被认为包括SEQ ID NO:1的氨基酸G200(在表2中用箭头标示)至氨基酸K787。
表2.Vip3氨基酸序列的比对。
Figure BDA0000554259860000641
Figure BDA0000554259860000651
使用这些标准，33个“必需的”、28个“增效剂”以及74个“隐藏增效剂”被鉴定为用于突变分析的最好的候选。表3中示出了所选择的氨基酸。
表3.用于修饰的残基(数据与表1中所示的相同，上文)
Figure BDA0000554259860000661
实例2.残基取代
使用定点诱变试剂盒(斯曲杰(Stratagene)，拉乔拉(La Jolla)，CA)构建突变型vip3D编码序列(衍生自SEQ ID NO:1的野生型亲本vip3D编码序列)。使用本领域中已知的技能但不总是遵循生产厂商对这类设计建议的参数来设计诱变引物以便提供特定点突变。用于该诱变反应的模板是在一个载体中的野生型vip3D编码序列(SEQ IDNO:1)，该载体提供一个6X组氨酸(6-His)标签连同一个短表位序列GMASMATGGQQMGRDLYDDDDKDPTL(SEQ ID NO:453)，以用于在表达的突变型多肽的N端用抗体探测。简言之，该诱变方法包括使包含该vip3D编码序列的载体变性并用包含所希望的突变的诱变引物使该变性的质粒退火。使用
Figure BDA0000554259860000663
DNA聚合酶(斯曲杰，拉乔拉，CA)的非链置换作用，使这些诱变引物延伸并合并，得到带切口的环状链。将该甲基化的未突变的亲本DNA模板用限制性内切酶Dpn I进行消化，并将该环状的带切口的dsDNA转化到XL1-蓝色或可比的超感受态细胞中。
最初，在鉴定为隐藏的、必需的和增效的位置处进行丙氨酸取代。引物长度典型地是从大约27个至大约46个核苷酸，并且正向引物典型地是以以下通式设计的：X1gcgX2，其中cgc是编码丙氨酸的密码子，并且其中X1是待产生突变的天然vip3D密码子的核苷酸5'的连续延伸，并且X2是待产生突变的天然vip3D密码子的核苷酸3'的连续延伸。X1典型地包括从13个至26个核苷酸并且X2典型地包括从11个至19个核苷酸。反向引物是正向引物的反向互补序列。例如为了在SEQ ID NO:15的位置K668进行丙氨酸取代，使用正向引物5'-TACAATTTTAGAAATTgcgCCTGCGGAGGATTT-3'(SEQ ID NO:131)和反向引物(5'-AAATCCTCCGCAGGcgcAATTTCTAAAATTGTA-3'(SEQ ID NO:132))。表4中示出了(但不是全部)以此方式设计的针对待产生突变的位置中的一些的其他引物实例。技术人员将认识到，表4意在提供用于本发明的一些引物的非限制实例并且可使用其他引物序列。
表4.用于进行丙氨酸取代的X1cgcX2引物的实例。
Figure BDA0000554259860000681
因此，如本领域的普通技术人员将认识到的，使用式X1nnnX2(n＝任何核苷酸；X1＝待产生突变的密码子的大约13至26个核苷酸5'的连续延伸；X2＝待产生突变的密码子的大约11至19个核苷酸3'的连续延伸)，可制备引物用于取代Vip3多肽中的其他氨基酸密码子或感兴趣的任何多肽中的任何氨基酸密码子，如在此处所述的。
设计其他引物以改变在待产生突变的天然vip3D密码子的第一或第二位置处或第一和第二位置两处的碱基。例如为了在SEQ ID NO:1的位置V785进行丙氨酸取代，可以使用正向引物5'-CATATATCATTTGAAAACGcTTCTATTAAATAAAAG-3'(SEQ ID NO:253)和反向引物5'-CTTTTATTTAATAGAAgCGTTTTCAAATGATATATG-3'(SEQ ID NO:254)，其中该正向引物中的小写“c”和该反向引物中的小写“g”指定了编码V785的密码子中的突变碱基对。表5中示出了(但不是全部)以此方式设计的针对待产生突变的位置中的一些的其他引物实例。技术人员将认识到，可以按此方式设计并使用用于Vip多肽(或感兴趣的任何其他多肽)的不同引物序列(式X1n1-2X2；n＝待产生突变的密码子的第一和/或第二核苷酸；X1＝待产生突变的一个或多个核苷酸的大约13至26个核苷酸5'的连续延伸；X2＝待产生突变的一个或多个核苷酸的大约11至19个核苷酸3'的连续延伸)，并且表5意为提供用于本发明的一些引物的非限制实例。
表5.用于改变突变的vip3密码子的第一和/或第二位置的引物的实例。
Figure BDA0000554259860000701
也可以制备双重丙氨酸突变型并且根据此处披露的方法进行测试。制备的这类双重丙氨酸突变型的一些实施例包括I544A+S712A、K455A+V338A、H618A+T750A、L701A+I721A、S722A+S781A、S761A+S744A、S781A+S744A以及S781A+T750A。双重突变型是通过以下方式制备：在PCR反应中用如上所述设计的引物使一个第一位置产生突变，被确认是正确的，并且然后在随后的PCR反应中，使用来自该第一突变型的DNA作为模板，使用如上所述设计的引物使一个第二位置产生突变。
实例3：Vip3D丙氨酸突变型蛋白的生物测定
将在实例2中所述的单和双重丙氨酸取代的Vip3D突变型多肽针对欧洲玉米钻蛀虫(ECB)和秋季行军虫(FAW)使用领域认可的人工饮食生物测定方法进行测试。简言之，使各表达该突变型Vip3D多肽中的一种的大肠杆菌克隆生长过夜。对该过夜培养物进行超声处理并确定包涵体中的多肽的量。然后将来自每种突变型克隆的一个当量的多肽溶液施用到小型培养皿中的人工昆虫饮食的表面(Bioserv有限公司，法国镇(Frenchtown)，新泽西州(NJ))。在该饮食表面干燥之后，向每个板中添加ECB或FAW幼虫。将这些板密封并保持在就温度、光照以及相对湿度而言的环境实验室条件下。将由ECB或FAW幼虫组成的阳性对照组暴露至一种野生型Vip3D多肽。将由ECB或FAW幼虫组成的阴性对照组暴露给没有测试物质的昆虫饮食(仅饮食)和用减去载体的大肠杆菌蛋白溶液(即无Vip3D多肽)处理的昆虫饮食。在大约120小时之后，评估死亡率并相对于该野生型Vip3D多肽进行评分。保留任何显示活性增加或降低的多肽。废弃进行了取代而不具有效果(即活性与野生型Vip3D是可比的)的那些突变型或没有表达多肽的那些。
对Vip3D的丙氨酸突变型的生物测定的结果部分显示于表6中，显示与野生型Vip3D多肽相比，在氨基酸位置V338、K455、D471、Q495、R501、S543、I544、G580、P591、P605、H608、Y616、I617、H618、R635、K643、W658、P681、S712、I753、E760、V768A、S774、G775、以及H779处的丙氨酸突变对ECB具有显著更高的比活性，这些突变型衍生自该野生型Vip3D多肽。发现当与该野生型Vip3D多肽相比时，在位置E374、V415、T433、V438、E449、V480、L649、D672、N700、Y716、S722、N763、I780以及S781处的丙氨酸突变型对ECB不具有显著不同的毒性。发现当与该野生型Vip3D多肽相比时，具有在氨基酸位置L514、E546、T614、T724、T743、S744、T756、S761 T764、G778和V785处的丙氨酸突变的Vip3D多肽对ECB具有更低的毒性。此外，在位置M362、V372、F400 R465、L494、I503、S532、T600、N625、Y629、K650、N682、S683、G689、L701、M747、L766和R773处的氨基酸的丙氨酸取代完全敲除了ECB活性。因此，这些结果清楚地显示，Vip3蛋白中的某些氨基酸在该蛋白针对至少欧洲玉米钻蛀虫的活性这点发挥作用。这些丙氨酸突变中的大部分对FAW活性没有影响。然而，在氨基酸V372和G689处的丙氨酸取代敲除了或显著降低了Vip3D针对FAW的活性。这些相同的突变完全敲除了ECB活性。这表明，大体上这些氨基酸可以在Vip3毒性中发挥重要作用。
表6.丙氨酸突变型Vip3D多肽的生物测定的结果。
Figure BDA0000554259860000721
Figure BDA0000554259860000731
表7示出了双重突变型生物测定的结果。所有双重突变型保持了它们针对FAW的活性。双重突变型K455A+V338A、I544A+S712A和H618A+T750A针对ECB和FAW与它们的单突变型对应物一样具有活性。然而，双重突变型S722A+S781A、S761A+S744A、S781A+S744A和S781A+T750A与它们的单突变型对应物相比针对ECB具有更少活性。另外，合并突变L701A+I721A敲除了ECB活性，尽管它们的单突变型对应物比该野生型Vip3D蛋白具有更大的ECB活性。
表7.双重突变型生物测定的结果。
Figure BDA0000554259860000732
实例4.残基旋转
现在将以上鉴定为在ECB活性中发挥关键作用的氨基酸替换为已知的20种氨基酸中的任一种(此处称为“残基旋转”)，以在关键位置鉴定最好表现的氨基酸，即得到对ECB具有更高的比活性和/或具有改进的杀有害生物活性谱的一种Vip3D多肽。若干氨基酸特征可用于区分在该旋转残基突变中使用的氨基酸的优先次序。例如可通过对靶生物体肠道受体结合的可能的影响的重要性将氨基酸以疏水性>电荷>尺寸排名。
在某些氨基酸位置产生残基旋转突变型的程序与如在实例2中所述的用于构建这些丙氨酸突变型的程序是基本相同的，除了使用了不同的引物对。在这些残基旋转突变型中使用的引物长度典型地是从大约27至大约40个核苷酸。将正向引物设计为改变在待产生突变的天然vip3D密码子的一个第一、第二和/或第三位置或其任意组合处的一个碱基，并典型地具有以下通式：X1NX2，其中N是来自该突变的密码子的一至三个突变的碱基，并且其中X1是待产生突变的一个或多个天然vip3D碱基的核苷酸5'的连续延伸，并且X2是待产生突变的一个或多个天然vip3D碱基的核苷酸3'的连续延伸。反向引物是正向引物的反向互补序列。例如而不限于，为了将SEQ ID NO:1的位置338处的缬氨酸(V)改变为苏氨酸(T)，可以使用正向引物5'-CCTAATTATGCAAAAacTAAAGGAAGTGATGAAG-3'(SEQ ID NO:339)和反向引物5'-CTTCATCACTTCCTTTAGTTTTTGCATAATTAGG-3'(SEQ ID NO:340)，其中该正向引物中的小写“ac”指定了编码V338的密码子中的突变的碱基。表8中示出了以此方式针对待通过残基旋转产生突变的位置中的一些而设计的另外引物的实例。技术人员将认识到，可以按此方式设计并使用与表8中显示的那些不同的引物序列，并且表8仅提供适用于本发明的一些引物的非限制实例。使用这些事例，技术人员可使感兴趣的蛋白中的任何位置产生突变。
表8.用于残基旋转突变的引物。
Figure BDA0000554259860000751
实例5.残基旋转突变型的生物测定
将在实例4中所述的残基旋转Vip3D突变型针对欧洲玉米钻蛀虫(ECB)如以上所述进行测试。许多突变型是在两个分开的生物测定中测试的并且它们中的许多是在三个分开的生物测定中测定的。将生物活性与相同位置处的丙氨酸突变型进行比较。这些生物测定中的一些的结果示于表9中。将旋转残基与来自实例3的丙氨酸突变型结果(阴影细胞(shaded cell))进行比较。
表9.旋转残基突变型针对欧洲玉米钻蛀虫的生物活性。
Figure BDA0000554259860000761
实例6.Vip3突变型的提升测试
可使用某些非限制标准对以上实例中所述的突变型多肽进行选择以用于进一步的测试和评价。提升的突变型具有：(1)改进的ECB活性；(2)对FAW活性无负面影响；(3)在大肠杆菌中表达的能力；以及(4)无观察到的不稳定性。
基于这些标准，将包括V338A、K455A、K455G、R465L、S532D、S532Y、I5444A、G580A、S712A、E760A、L766W和V768A的12个单Vip3D突变型多肽在至少三个另外的生物测定中针对ECB以饮食的300ng/cm2的多肽浓度进行测试，基本上如上所述。结果示于表10中。
表10.Vip3突变型针对欧洲玉米钻蛀虫的生物活性。
Figure BDA0000554259860000771
将始终产生>90％ECB死亡率的六个突变型进行提升以用于确定该工程化的多肽的LC50(杀死50％的暴露昆虫所需的致死浓度)。
实例7.对选择的工程化多肽的LC50的确定
根据生产厂商的指示，将编码每种突变型多肽的核酸分子克隆到pTrcHis
Figure BDA0000554259860000772
载体(英杰公司(Invitrogen Corp.)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州(CA))中。该pTrcHis
Figure BDA0000554259860000773
载体具有一个HisG表位和一个6x His标签N-端至该突变型编码序列，以用于检测和纯化该重组多肽。将一个pTrcHis-Vip3D突变型载体基本上使用生产厂商指示转化到大肠杆菌中。使每个大肠杆菌克隆在37℃下生长，使用IPTG诱导，收获细胞并按照生产厂商指示制备溶解产物。基本上根据生产厂商指示，使用ProBondTM纯化系统(英杰公司)纯化突变型多肽，该系统被设计为用于纯化在细菌中表达的带6x His-标签的重组多肽。将纯化的突变型多肽进行定量并用于确定LC50。
基本上如上所述在ECB生物测定中对每种突变型多肽以多浓度进行测试。使用概率单位分析计算每种突变型多肽的LC50。表11显示六种突变型多肽与野生型Vip3D、连同Vip3C(SEQ ID NO:17)和Vip3A(SEQ ID NO:15)(两者都是与Vip3D密切相关的Vip3多肽类的成员)相比的LC50值。
表11.突变型多肽针对ECB和FAW的比活性。
Figure BDA0000554259860000781
结果显示与野生型Vip3D相比，所选择的突变型Vip3D多肽中的五种针对欧洲玉米钻蛀虫(ECB)具有低2-3倍的LC50，该野生型Vip3D显著增加了在ECB管理中它们是高剂量的可能性。一种突变型—V338A针对ECB具有与该野生型Vip3D多肽大致相同的LC50。有趣地是，与该野生型相比，这些突变型中的大部分针对秋季行军虫(FAW)具有更高的LC50。一种突变型—K455A针对FAW具有更低的LC50。因此，该K455A突变改进了该亲本野生型Vip3D多肽针对ECB和FAW两者的比活性。
实例8.Vip3E的表征
进一步分析Vip3D-K455A突变型。使用来自鳞翅类昆虫消化道的提取物，这个具体的位置—K455被确定为Vip3A和Vip3D中的“热点”，这通过鳞翅类肠道酶对该多肽的降解来识别。通过去除该“热点”(即通过进行K→A突变)，由丝氨酸蛋白酶进行的Vip3多肽的降解可受阻滞，从而将该Vip3多肽稳定在在该昆虫消化道中并允许它有更多的时间发挥作用(例如杀死该昆虫或否则的话控制该昆虫)。该Vip3D-K455A突变型命名为Vip3E。
对Vip3E的进一步测定显示在3μg/cm2，该多肽：(1)针对欧洲玉米钻蛀虫、秋季行军虫、黑切根虫(小地老虎)、棉铃虫(谷实夜蛾)、甜菜行军虫(甜菜夜蛾)和菱形斑纹蛾(小菜蛾)具有高活性(100％死亡率)；(2)针对红铃虫(红铃麦蛾)、和烟夜蛾(烟芽夜蛾)具有中等活性(>50％死亡率和显著生长抑制)，引起一些死亡、摄食和/或生长抑制；并且(3)针对帝王蝶(大红斑蝶)(一种环境有益鳞翅类昆虫)、或鞘翅类有害生物(西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)和科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯甲虫))不具有活性。
实例9.Vip3E在植物中的表达
将编码Vip3E多肽的一种合成玉米优化的多核苷酸(SEQ ID NO:454)转化到玉米植物中。对于这个实例，制备包括一个玉米泛素启动子(Ubi1)的一个第一表达盒，该启动子可操作地连接到Vip3E编码序列上，该编码序列可操作地连接到一个Nos终止子上，并且制备包括一个Ubi1启动子的一个第二表达盒，该启动子可操作地连接到磷酸甘露糖异构酶(PMI)编码序列上，该编码序列可操作地连接到一个Nos终止子上。PMI的表达允许在甘露糖上阳性选择转基因植物。将两种表达盒都克隆到一个适合的载体中用于土壤杆菌介导的玉米转化。将所得到的载体指定为pSYN12225(图1)。
未成熟的玉米胚的转化基本上如在内格罗托(Negrotto)等人，2000，植物细胞报告(Plant Cell Rep)19:798-803中描述来执行。简言之，使包含pSYN12225的土壤杆菌菌株LBA4404(pSB1)生长在YEP(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l琼脂，pH6.8)固体培养基上，在28℃生长2至4天。将约0.8 X 109个土壤杆菌细胞悬浮于补充有100μM As的LS-inf培养基中。在此培养基中预诱导细菌大概30-60分钟。
将来自玉米近交的JHAX707的未成熟胚从8至12天大的穗中切除到液体LS-inf+100μM As中。用新鲜的感染培养基漂洗这些胚。然后添加土壤杆菌溶液，并将这些胚涡旋30秒并允许其与细菌一起沉降5分钟。然后将这些胚盾片向上地转移到LSA培养基中，并且在暗处培养两到三天。随后，将每培养皿大概20个至25个之间的胚转移至添加有头孢噻肟(250mg/l)以及硝酸银(1.6mg/l)的LSDc培养基中，并且在黑暗中大概28℃下培养10天。
将产生胚性愈伤组织的未成熟的胚转移到LSD1M0.5S培养基中。在此培养基上选择培养物大约6周，其中在约3周时进行继代培养步骤。将存活着的愈伤组织(calli)转移到补充有甘露糖的Reg1培养基中。在亮处培养(16小时亮/8小时暗方案)之后，然后将绿色组织转移到不具有生长调节剂的Reg2培养基中，并且孵育约1-2周。将这些小植株转移到含有Reg3培养基的马真塔(Magenta)GA-7盒(马真塔公司(Magenta Corp)，伊利诺斯州芝加哥(Chicago Ill.))中，并且使它们在亮处生长。大约2至3周之后，将植物通过PCR针对PMI基因和vip3E基因的存在进行测试。将来自PCR测定的阳性植物转移至温室中并测试其针对昆虫有害生物的抗性。
实例10.转基因玉米植物的分析
当植物从马真塔(Magenta)GA-7盒移植至土壤中时，对其进行采样。采样包括切下两小片叶子(大约2-4cm长)并且将其各自置于一个小培养皿中。在来自相同植物的叶上确定Vip3E蛋白浓度。阴性对照是来自同一个实验的对vip3E基因呈PCR阴性的转基因植物，或者来自生长于相似条件下的非转基因植物(与测试植物具有相似尺寸)。
通过将10个一龄幼虫置于每个叶片上，将来自每个植物的叶子样品用欧洲玉米钻蛀虫(欧洲玉米螟)或秋季行军虫(草地贪夜蛾)进行接种。然后将培养皿紧密密封。
在接种后大约3至4天收集生物测定数据。计算出幼虫的死亡百分比以及叶子的可见损伤等级。采食损害被评定为高、中、低、或无，并且分别给予数值3、2、1或0的数值。
在表12中示出的结果表明，包含vip3E多肽并且表达该vip3E多肽的转基因玉米植物对于至少欧洲玉米钻蛀虫(ECB)和秋季行军虫(FAW)是具有杀昆虫性的。一些Vip3E-表达事件针对黑切根虫(小地老虎)和棉铃虫(谷实夜蛾)也是具有活性的。在这些事件中的Vip3E蛋白浓度从大约450至1000μg/mg可溶性蛋白变化。
表12.表达Vip3E的转基因玉米的功效。
Figure BDA0000554259860000811
实例11.改进的工程化的多肽可增加杀伤速度
本发明的工程化的多肽具有多种功能、用途和活性。例如与野生型多肽相比，本发明的工程化的多肽针对靶有害生物生物体可加速杀伤速率。在这个实例中，将工程化的多肽和野生型Vip3D针对棉铃虫(CEW；谷实夜蛾)在大概相同的多肽浓度下进行测试，并在120小时之后对CEW死亡率进行评分。
结果示于表13中。一些工程化的多肽比野生型Vip3D产生更快的杀伤速率。例如突变型S761A、T750A、S683A和T686A在120小时之后引起58％-64％死亡率，与野生型Vip3D引起的33％死亡率形成对比。
表13.杀伤速度的生物测定结果。
突变型 死亡率百分比(120小时)
P681A 27
S683A 58
T686A 58
S691A 0
L701A 0
I721A 8
S722A 0
S744A 46
M747A 42
T750A 64
T756A 50
S761A 58
Vip3D 33
阴性对照 0
实例12.应用于制备其他重组多肽的方法
以上所述的方法可用于在任何多肽中鉴定靶氨基酸位置用于突变分析，在该多肽中1)一个或多个家族成员对靶有害生物具有中等活性至高活性；以及2)相同家族的一个或多个成员针对相同的靶有害生物具有低活性至无活性。例如，可将这类方法应用于苏云金芽孢杆菌Cry蛋白以改进它们对某一种或多种靶有害生物的杀昆虫活性。例如而不限于，可将这些方法应用于Cry2A类的Bt Cry蛋白。
Cry2Aa(SEQ ID NO:455)和Cry2Ab(SEQ ID NO:456)对某些实夜蛾亚科种类都具有中等活性。然而，Cry2Ac(SEQ ID NO:457)(该Cry2A家族的一种紧密相关的成员)对这些有害生物中的许多、特别是铃夜蛾属种类具有非常低的比活性。
Cry2A蛋白对实夜蛾亚科种类的相对毒性(LC50(ng/cm2)报道于里奥(Liao)等人2002，无脊椎动物病理学杂志(J Invert.Pathol.)，80:55-63中，如下：(1)棉铃虫：Cry2Aa＝149，Cry2Ab＝421并且Cry2Ac＝1678；(2)茶色铃夜蛾：Cry2Aa＝52，Cry2Ab＝412并且Cry2Ac＝6205；(3)谷实夜蛾：Cry2Aa＝114-4043，Cry2Ab＝61并且Cry2Ac＝未确定；以及(4)烟夜蛾(Helicoverpa virescens)：Cry2Aa＝15.1，Cry2Ab＝20.6并且Cry2Ac＝120。
为了改进Cry2Ab针对至少某些铃夜蛾属种类的活性，可以将三种氨基酸序列全部进行比对，如在表10中示出的。基于以上所述的标准，为了鉴定如上所述的待产生突变的关键氨基酸，可将这些氨基酸位置归类为“必需的”(加粗体在表14中)、“增效剂”(*在表14中)、或“隐藏增效剂”(加下划线在表14中)。这种分类显示在表15中。氨基酸残基在表15中的编号是基于Cry2Ab(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列。
表14.Cry 2氨基酸序列的比对。
Figure BDA0000554259860000831
Figure BDA0000554259860000841
表15.对于工程化Cry2Ab鉴定的待产生突变的氨基酸位置。
Figure BDA0000554259860000851
应当理解的是在此描述的实例以及实施例仅是为了说明性的目的，并且根据它们的不同修改或变更将提示给本领域的普通技术人员并且将会包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围之内。
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Claims (32)

1.一种工程化的来自苏云金芽孢杆菌的Vip3杀有害生物多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的位置K455的位置处具有氨基酸突变，其中相比于该工程化的多肽所衍生自的野生型多肽的ECB活性而言，该突变改进了该工程化的多肽针对至少欧洲玉米螟(ECB)的杀有害生物活性，并且其中该氨基酸突变对应于从由以下各项组成的组中选择的突变：K455A、K455G、K455I和K455E。
2.根据权利要求1所述的工程化的Vip3杀有害生物多肽，其中该氨基酸突变在位置K455处，其中相比于SEQ ID NO:1的野生型多肽的ECB活性而言，该突变改进了该工程化的多肽针对至少欧洲玉米螟(ECB)的杀有害生物活性，并且其中该氨基酸突变选自由以下各项组成的组：K455A、K455G、K455I和K455E。
3.如权利要求1所述的工程化的Vip3杀有害生物多肽，其进一步在对应于SEQ ID NO:1的位置V338的位置处包含氨基酸突变，其中相比于该工程化的多肽所衍生自的野生型多肽的ECB活性而言，该突变改进了该工程化的多肽针对至少欧洲玉米螟(ECB)的杀有害生物活性，并且其中该氨基酸突变对应于K455A和V338A的突变。
4.如权利要求3所述的工程化的Vip3杀有害生物多肽，其中该氨基酸突变是K455A和V338A的突变。
5.如权利要求2所述的工程化的Vip3杀有害生物多肽，其中该多肽由从由以下各项组成的组中选择的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸序列、SEQ ID NO:5的氨基酸序列和SEQ ID NO:117的氨基酸序列。
6.一种重组核酸分子，其由编码如权利要求1至5中任一项所述的多肽的核苷酸序列组成。
7.如权利要求6所述的重组核酸分子，其中该核苷酸序列选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:4的核苷酸序列、SEQ ID NO:6的核苷酸序列和SEQ ID NO:118的核苷酸序列。
8.如权利要求6或权利要求7所述的重组核酸分子，其中该核苷酸序列与启动子可操作地关联。
9.一种重组载体，其包含如权利要求8所述的核酸分子。
10.一种组合物，其在农业上可接受的载体中包含如权利要求1至5中任一项所述的工程化的多肽。
11.一种产生具有针对至少欧洲玉米钻蛀虫的杀有害生物活性的多肽的方法，包括：
在转基因非人类宿主细胞中表达如权利要求6至8中任一项所述的重组核酸分子，从而生产具有针对至少欧洲玉米钻蛀虫的杀有害生物活性的多肽。
12.如权利要求11所述的方法，其中该多肽具有针对至少一种另外的昆虫的杀有害生物活性，其中所述昆虫选自由以下各项组成的组：小菜蛾、草地贪夜蛾、小地老虎、谷实夜蛾、烟芽夜蛾、甜菜夜蛾、茶色铃夜蛾、棉铃虫、烟草天蛾、粉纹夜蛾、红铃麦蛾、向日葵细卷叶蛾及其任意组合。
13.一种产生抗有害生物的转基因植物的方法，该方法包括：向植物中引入如权利要求6至8中任一项所述的重组核酸分子，其中该核苷酸序列在该植物中表达，从而赋予该植物对至少欧洲玉米钻蛀虫的抗性，并产生抗有害生物的转基因植物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中该转基因植物对从由以下各项组成的组中选择的至少一种另外的有害生物具有抗性：小菜蛾、草地贪夜蛾、小地老虎、谷实夜蛾、烟芽夜蛾、甜菜夜蛾、茶色铃夜蛾、棉铃虫、烟草天蛾、粉纹夜蛾、红铃麦蛾、向日葵细卷叶蛾及其任意组合。
15.一种控制至少欧洲玉米钻蛀虫昆虫的方法，该方法包括向这些昆虫递送有效量的如权利要求1至5中任一项所述的多肽。
16.如权利要求15所述的方法，其中该多肽是经口递送的。
17.一种产生具有经改进的针对靶细胞和/或生物体的杀有害生物活性的Vip3多肽的方法，该方法包括：
(a)将Vip3多肽的彼此之间具有至少80％一致性的多个氨基酸序列进行比对，其中这些Vip3多肽中的至少一个对该靶细胞和/或生物体展现出至少中等的毒性，并且至少一个对该靶细胞和/或生物体未展现出毒性或展现出低毒性；
(b)鉴定出至少一个在(a)的经比对的Vip3多肽序列中的至少两个之间不同的氨基酸残基；
(c)将氨基酸残基取代为在步骤(b)中鉴定出的至少一个氨基酸残基，以产生经修饰的Vip3多肽，其中所述氨基酸残基之一对应于K455；
(d)确定在步骤(c)中产生的经修饰的Vip3多肽针对该靶细胞和/或生物体的杀有害生物活性的水平；并且
(e)选择(d)的具有经改进的针对该靶细胞和/或生物体的杀有害生物活性的经修饰的Vip3多肽，从而产生具有经改进的针对该靶细胞和/或生物体的杀有害生物活性的Vip3多肽。
18.如权利要求17所述的方法，其中该靶细胞和/或生物体是昆虫、线虫或其任意组合。
19.如权利要求18所述的方法，其中该靶细胞和/或生物体是靶昆虫，该靶昆虫是鳞翅类昆虫。
20.如权利要求19所述的方法，其中该鳞翅类昆虫选自由以下各项组成的组：欧洲玉米螟、小菜蛾、草地贪夜蛾、小地老虎、谷实夜蛾、烟芽夜蛾、甜菜夜蛾、茶色铃夜蛾、棉铃虫、烟草天蛾、粉纹夜蛾、红铃麦蛾、向日葵细卷叶蛾及其任意组合。
21.如权利要求20所述的方法，其中该鳞翅类昆虫是欧洲玉米螟。
22.如权利要求21所述的方法，其中该氨基酸突变在对应于SEQ ID NO:1的K455的位置处。
23.如权利要求21所述的方法，其中该具有改进的杀有害生物活性的Vip3多肽由从由以下各项组成的组中选择的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸序列、SEQ ID NO:5的氨基酸序列和SEQ ID NO:117的氨基酸序列。
24.一种产生具有经改进的针对靶细胞和/或生物体的活性的Vip3多肽的方法，该方法包括：
(a)将Vip3多肽的彼此之间具有至少80％一致性的多个氨基酸序列进行比对，其中这些Vip3多肽中的至少一个对该靶细胞和/或生物体展现出至少中等的毒性，并且至少一个Vip3多肽对该靶细胞和/或生物体未展现出毒性或展现出低毒性；
(b)在(a)的经比对的Vip3氨基酸序列中鉴定出必需氨基酸位置、增效剂氨基酸位置、隐藏增效剂氨基酸位置或其任意组合；
(c)在步骤(b)中鉴定出的至少一个氨基酸位置中对氨基酸残基进行取代，以产生经修饰的Vip3多肽，其中所述氨基酸位置之一对应于位置K455；
(d)确定在步骤(c)中产生的经修饰的Vip3多肽针对该靶细胞和/或生物体的杀有害生物活性的水平；并且
(e)选择(d)的具有经改进的针对该靶细胞和/或生物体的杀有害生物活性的经修饰的Vip3多肽序列，从而产生具有经改进的针对该靶细胞和/或生物体的杀有害生物活性的Vip3，
其中，
(i)所述必需氨基酸位置被定义为这样的氨基酸位置，其中具有至少中等的杀有害生物活性的一种或多种多肽具有相同的残基，并且其中无杀有害生物活性或具有非常低的杀有害生物活性的一种或多种多肽在相同的位置处具有不同的残基；
(ii)所述增效剂氨基酸位置被定义为这样的氨基酸位置，其中具有至少中等的杀有害生物活性的一种或多种多肽在彼此之间相比时以及在与无杀有害生物活性或具有非常低的杀有害生物活性的一种或多种多肽相比时在相同的位置处不具有相同的残基；
(iii)所述隐藏增效剂氨基酸位置被定义为这样的氨基酸位置，其中具有至少中等的杀有害生物活性的一种或多种多肽具有不同的残基，并且其中无杀有害生物活性或具有非常低的杀有害生物活性的一种或多种多肽与所述具有至少中等的杀有害生物活性的一种或多种多肽之一在相同的位置处具有相同的残基。
25.如权利要求24所述的方法，其中该靶细胞和/或生物体是昆虫、线虫或其任意组合。
26.如权利要求25所述的方法，其中该靶细胞和/或生物体是靶昆虫，该靶昆虫是鳞翅类昆虫。
27.如权利要求26所述的方法，其中该鳞翅类昆虫选自由以下各项组成的组：欧洲玉米螟、小菜蛾、草地贪夜蛾、小地老虎、谷实夜蛾、烟芽夜蛾、甜菜夜蛾、茶色铃夜蛾、棉铃虫、烟草天蛾、粉纹夜蛾、红铃麦蛾、向日葵细卷叶蛾及其任意组合。
28.如权利要求27所述的方法，其中该鳞翅类昆虫是欧洲玉米螟。
29.如权利要求28所述的方法，其中该氨基酸突变在对应于SEQ ID NO:1的K455的位置处。
30.如权利要求28所述的方法，其中该具有改进的杀有害生物活性的Vip3多肽由从由以下各项组成的组中选择的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸序列、SEQ ID NO:5的氨基酸序列和SEQ ID NO:117的氨基酸序列。
31.如权利要求17或24所述的方法，其中取代是使用具有由下式定义的核苷酸序列的引物进行的定点诱变，该式选自由以下各式组成的组：(1)X1nnnX2，其中n是任意核苷酸，X1是待产生突变的密码子的5'端的13至26个核苷酸的连续延伸，并且X2是待产生突变的密码子的3'端的11至19个核苷酸的连续延伸；和/或(2)X1n1-2X2，其中n是待产生突变的密码子的第一和/或第二核苷酸，X1是待产生突变的一个或多个核苷酸的5'端的13至26个核苷酸的连续延伸，并且X2是待产生突变的一个或多个核苷酸的3'端的11至19个核苷酸的连续延伸。
32.一种组合物，其在农业上可接受的载体中包含一种或多种通过如权利要求11所述的方法产生的杀有害生物多肽。
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