ES2289743T3 - Plantas transgenicas expresando construcciones de adn comprendiendo una pluralidad de genes para impartir una resistencia viral. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UNA MOLECULA DE ADN RECOMBINANTE QUIMERICA QUE INCLUYE: VARIAS SECUENCIAS DE ADN, CADA UNA DE ELLAS CON UN PROMOTOR FUNCIONAL EN VEGETALES UNIDO A UNA REGION CODIFICANTE QUE CODIFICA UNA PROTEINA DE REVESTIMIENTO ASOCIADA A VIRUS. LAS SECUENCIAS DE ADN SE UNEN PREFERIBLEMENTE EN TANDEM DE FORMA QUE SE EXPRESAN EN CELULAS VEGETALES SUSCEPTIBLES A VIRUS TRANSFORMADAS CON DICHA MOLECULA DE ADN RECOMBINANTE PARA PROPORCIONAR RESISTENCIA A DICHOS VIRUS. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A METODOS PARA TRANSFORMAR PLANTAS CON LAS ESTRUCTURAS QUIMERICAS Y PARA SELECCIONAR PLANTAS QUE EXPRESEN AL MENOS UNA DE DICHAS SECUENCIAS DE ADN QUE PROPORCIONAN RESISTENCIA A VIRUS.

Description

Plantas transgénicas expresando construcciones de ADN comprendiendo una pluralidad de genes para impartir una resistencia viral.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la ingeniería genética de plantas y a un medio y a un método para conferir una pluralidad de características, incluyendo resistencia a los virus, a una planta usando un vector codificante de una pluralidad de genes, tales como genes de proteína de revestimiento.

Antecedentes de la invención

Muchos cultivos agrícolas importantes son sensibles a la infección por virus vegetales, que pueden dañar seriamente una cosecha, reducir su valor económico para los productores, y aumentar su coste para el consumidor. Se han realizado intentos para controlar o prevenir la infección de un cultivo por un virus vegetal, ya que los patógenos virales siguen siendo un problema importante para la agricultura.

Los científicos han desarrollado recientemente medios para la producción de plantas resistentes a un virus usando técnicas de ingeniería genética. Este enfoque representa una ventaja en la medida en que el material genético que proporciona la protección es incorporado en el genoma de la misma planta y puede ser transmitido a su progenie. Una planta huésped es resistente si tiene la capacidad para suprimir o retrasar la multiplicación de un virus, o el desarrollo de síntomas patógenos. "Resistente es lo opuesto a ``sensible", y puede dividirse en: (1) resistencia alta, (2) moderada, o (3) baja, dependiendo de su eficacia. Esencialmente, una planta resistente muestra poca o ninguna expresión de síntoma, y la multiplicación del virus en ella es reducida o insignificante. Se reconocen diferentes tipos de resistencia huésped a los virus. El huésped puede ser resistente al: (1) establecimiento de infección, (2 multiplicación del virus, o (3) movimiento viral.

Los potivirus son un grupo distinto de virus vegetales que son patógenos para varios cultivos, y que demuestran tener infectividad cruzada entre miembros vegetales de distintas familias. Los potivirus incluyen un virus del mosaico de la sandía 2 (WMV-2); cepas del virus anular de la papaya, mosaico anular de la papaya y de la sandía I (PRy-p y PRVw), dos miembros estrechamente relacionados del grupo potivirus de la planta que fueron clasificados una vez como tipos de virus distintos, pero que son clasificados actualmente como cepas diferentes del mismo virus; virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV); virus de la patata Y; grabado del tabaco y muchos otros. Véase, por ejemplo, la tabla I de la solicitud de patente europea 578,627 publicada.

Estos virus consisten en partículas flexuosas, filamentosas con dimensiones de aproximadamente 780 X 12 nanómetros. Las partículas virales contienen un genoma de ARN monocatenario conteniendo aproximadamente 10,000 nucleótidos de polaridad positiva (+, codificante, o de sentido). La traslación del genoma ARN del potivirus muestra que el ARN codifica una poliproteína individual grande de aproximadamente 330 kD. Esta poliproteína contiene varias proteínas, de las cuales una es una proteasa 49 kD que es específica para la escisión de la poliproteína en al menos otros seis (6) péptidos. Se pueden encontrar estas proteínas en la célula vegetal infectada y formar los componentes necesarios para una replicación viral. Una de las proteínas contenidas en esta poliproteína es una capsida o proteína de revestimiento 35 kD que cubre y protege el ARN viral de la degradación. Otra proteína es la proteína de inclusión nuclear, también definida como replicasa, que actúa en la replicación del ARN viral. Durante una infección potiviral, la proteína replicasa (60 kDa, también definida como proteína de inclusión nuclear B) y la proteína proteasa (50 kDa, también definida como proteína de inclusión nuclear I o de inclusión nuclear A) son transportadas postranslacionalmente a través de la membrana nuclear al interior del núcleo de la célula vegetal durante las etapas posteriores de la infección viral y acumuladas en altos niveles.

Generalmente, el gen de la proteína de revestimiento está situado en el extremo 3' del ARN, justo antes de una extensión de residuos nucleótidos de adenina terminal (200 a 300 bases). La ubicación del gen proteasa 49 kD debe ser conservada en estos virus. En el virus del grabado del tabaco, el sitio de escisión de la proteasa ha sido determinado como el dipéptido Gin-Ser, Gin-Gly o Gin-Ala. La conservación de estos dipéptidos como sitios de escisión en estas poliproteínas virales es evidente en las secuencias de potivirus citadas anteriormente.

La expresión de los genes de proteína de revestimiento del virus del mosaico del tabaco, virus de mosaico de la alfalfa, virus de mosaico del pepino, y virus de la patata X, entre otros, en plantas transgénicas ha producido plantas que son resistentes a la infección por el virus respectivo. Alguna evidencia de protección heteróloga ha sido indicada también. Por ejemplo, Namba et al., Fitopatología 82, 940 (1992) indican que la expresión de genes de proteína de revestimiento del virus de mosaico de la sandía 2 o del virus del mosaico amarillo del calabacín en plantas de tabaco transgénico proporcionaba protección contra otros seis potivirus: virus del mosaico amarillo de la judía, virus de la patata Y, virus del mosaico del guisante, virus de la lupulina, virus moteado de la pimienta y virus del grabado de tabaco. Stark et al., Biotecnología, 1, 1257 (1989) indican que la expresión del virus del mosaico de la semilla de soja potivirus en plantas transgénicas proporcionaba una protección contra dos potivirus no relacionados serológicamente: virus del grabado de tabaco y virus de la patata Y.

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No obstante, la expresión de un gen de proteína de revestimiento preseleccionada no proporcionaba de manera fiable una protección heteróloga a una planta. Por ejemplo, las plantas de calabaza transgénica conteniendo el gen de proteína de revestimiento CMV-C y que han demostrado ser resistentes a una cepa CMV-C, no están protegidas contra diversas cepas altamente virulentas de CMV, incluyendo CMV-V-27 y CARNA-5. Por ello es necesario crear métodos mejorados para impartir una resistencia a las plantas de los potivirus.

Tricoli et al. (J. Cell. Biochem. Supl.; 1994, página 91) describe la producción de plantas transgénicas de calabaza y de melón transformadas con un casete trivalente comprendiendo los genes de proteína de revestimiento CMV, ZYMV y WMV2. Se describe un híbrido de melón, el cual es inoculado con un inóculo mezclado conteniendo los tres
virus.

Tricoli et al. (1993, Fitopatología 83: 1425, resumen Nº. A830) se refiere a variedades de calabaza transgénicas, creadas genéticamente con genes de proteína de revestimiento ZYMV y WMV-2. Las plantas fueron evaluadas en condiciones de campo para determinar su resistencia al virus, y se observaron dos niveles de resistencia.

W094/28147 describe plantas transformadas, especialmente remolacha azucarera, comprendiendo secuencias nucleótidas codificantes de la proteína de revestimiento de un luteovirus y de un closterovirus. Se describe que las plantas muestran una resistencia mejorada cuando se enfrentan a ambos virus.

No obstante, ninguno de los documentos de la técnica anterior describe un método de generación de una planta recombinante que presente esencialmente los mismos niveles de resistencia cuando es inoculada individualmente con varios virus diferentes.

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Resumen de la invención

La presente invención provee la reivindicación 1 (a)-(c) en la que se identifica una planta transformada, la cual exhibe esencialmente el mismo grado de resistencia viral cuando es inoculada con cada uno de los virus solo. [0014] Preferiblemente, cada secuencia de ADN es enlazada también a una secuencia de ADN no transcrita 3' que funciona en las células vegetales para provocar la terminación de la transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados en el extremo 3' de las secuencias de ARNm transcritas. Preferiblemente, el virus es un virus asociado a una planta, como un potivirus.

De esta manera, la molécula de ADN presente puede ser empleada como una "construcción de expresión" recombinante quimérica, o "casete de expresión" para preparar plantas transgénicas que exhiben una resistencia incrementada a la infección por al menos dos virus vegetales, como los potivirus. Los casetes presentes comprenden también preferiblemente al menos un gen marcador o gen indicador seleccionable que está integrado de manera estable en el genoma de las células vegetales transformadas en asociación con los genes virales. El marcador seleccionable y/o genes indicadores facilitan la identificación de células vegetales y plantas transformadas. Preferiblemente, la serie del gen viral está flanqueada por dos o más genes marcadores seleccionables, genes indicadores o una combinación de
estos.

Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar una planta transformada resistente a múltiples virus que contenga proteínas de virus codificantes de secuencias de ADN integrado de manera estable.

Otro objeto de la presente invención también consiste en proporcionar células vegetales transformadas resistentes a virus que contengan una pluralidad de genes virales, es decir, 2-7 o más genes, que son expresados como proteínas virales de la misma cepa de virus, de distintas cepas de virus así como de distintos elementos del grupo de virus, tal como el grupo potivirus.

La invención es ejemplificada principalmente por la inserción de múltiples casetes de expresión de la proteína de revestimiento del virus en un plásmido binario y una caracterización posterior de los plásmidos obtenidos. Se dispusieron combinaciones de los casetes de expresión de la proteína de revestimiento CMV, ZYMV, WMV-2, SQMV, y PRV en el plásmido binario pPRBN. Posteriormente se movilizaron los plásmidos binarios que albergaban múltiples casetes de expresión de la proteína de revestimiento en Agrobacterium para usar en los procedimientos de transformación de plantas. Los plásmidos binarios comprendiendo múltiples casetes de expresión son empleados para transferir dos o más genes sensibles a la transformación de la proteína de revestimiento de virus a plantas, tales como los miembros de la familia Cucurbitaceae, con el marcador asociado y/o genes indicadores seleccionables.

De esta manera, la presente invención proporciona una metodología de ingeniería genética mediante la cual se pueden rastrear y manipular varios rasgos como un único inserto de gen, es decir, como una construcción que actúa como un gen único que segrega como un único locus Mendeliano.

También se descubrió que cuando se insertan genes múltiples en tándem, preferiblemente estos exhiben todos esencialmente los mismos niveles de eficacia, y más preferiblemente esencialmente niveles iguales de eficacia, donde el término "sustancial", referido a la resistencia viral, es definido en referencia a los ensayos descritos en los ejemplos siguientes. Por ejemplo, si se examinan varias líneas transgénicas conteniendo un inserto de proteína de revestimiento intacto ZYMV y WMV-2, se descubre que si una línea es inmune a una infección por ZYMV, es también inmune a una infección por WMV-2. De manera similar, si una línea exhibe un retraso en desarrollar síntomas con ZYMV, también exhibirá un retraso en desarrollar síntomas con WMV2. Finalmente, si una línea es sensible a ZYMV será sensible a WMV-2. Este fenómeno es inesperado. Si no hubiera correlación entre la eficacia de cada gen en estos constructos de múltiples genes, este enfoque como herramienta en un cultivo vegetal sería probable y prohibitivamente difícil de usar. Incluso con constructos de genes individuales, se deben probar varias líneas de planta transgénica para poder encontrar una que muestre el nivel de eficacia apropiado. La probabilidad de resultado de una línea con niveles útiles de expresión puede variar de 10-50% (dependiendo de las especies implicadas).

Si la eficacia de los genes individuales en un plásmido Ti incluyendo genes múltiples fuera independiente, la probabilidad de descubrir una línea transgénica que fuera resistente a los virus se reduciría de manera importante. Por ejemplo, en una especie en la que existe un 10% de probabilidad de identificar una línea con resistencia usando un inserto génico individual, se transforma con un constructo génico triple CZW y cada gen presenta unos niveles independientes de eficacia, la probabilidad de encontrar una línea de resistencia a CMV, ZYMV y WMV-2 sería de 0,1 X 0,1 X 0,1 = 0,001 ó 0,1%. No obstante, puesto que la eficacia de los genes multivalentes no es independiente el uno del otro, la probabilidad de encontrar una línea con resistencia a CMV, ZYMV y WMV-2 es aún del 10% en vez del 0,1%. Obviamente esta ventaja se vuelve más importante a medida que se usen constructos conteniendo cuatro o más genes.

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Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la estructura del vector binario pPRBoriGN.

La Figura 2 representa la estructura del vector binario pPRBN.

La Figura 3 representa la estructura de pPRCPW.

La Figura 4 representa la estructura del plásmido binario pBPG321.

La Figura 5 representa la estructura del plásmido binario pEPG106.

La Figura 6 representa la estructura del plásmido binario pBPG III.

La Figura 7 representa la estructura del plásmido binario pEPG109.

La Figura 8 representa la estructura del plásmido binario pEPG115.

La Figura 9 representa la estructura del plásmido binario pEPG212.

La Figura 10 representa la estructura del plásmido binario pEPG113.

La Figura 11 representa la estructura del plásmido binario pGA482GG.

La Figura 12 representa la estructura del plásmido binario pEPG328.

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Descripción detallada de la invención

La resistencia viral conferida a las plantas de la presente invención es provista por la expresión en la planta de una secuencia de ADN aislado codificante de nucleótidos comprendiendo una pluralidad, es decir, 2-7 proteínas de virus, tales como proteínas de revestimiento.

Unos virus representativos en los que estas secuencias de ADN pueden ser aisladas incluyen, pero sin limitarse a ellos, el virus de la patata X (PVX), potivirus tales como el virus de la patata Y (PVY), cucumovirus (CMV), virus del moteado de la nervura del tabaco, virus del mosaico de la sandía (WMV), virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV); virus del mosaico común de la judía, virus del mosaico amarillo de la judía, virus del mosaico de la semilla de soja, virus del moteado del cacahuete, virus del mosaico de la remolacha, virus del mosaico del trigo estriado, virus del mosaico del maíz enano, virus del mosaico del sorgo, virus del mosaico de la caña de azúcar, virus del mosaico de la hierba Johnson, virus de la viruela de la ciruela, virus del grabado del tabaco, virus del moteado plumoso del boniato, virus del mosaico del ñame, y virus anular de la papaya (PRV), cucumovirus, incluyendo CMA y
comovirus.

Generalmente, un potivirus es un virus con ARN monocatenario que está rodeado por un monómero proteínico de repetición, que se define como proteína de revestimiento (CP). El virus encapsulado tiene una morfología de vara flexuosa. La mayoría de los potivirus son transmitidos de manera no persistente por pulgones. Como se puede observar en la amplia gama de cultivos afectados por potivirus, la gama de huéspedes incluye familias tan diversas de plantas, pero sin limitarse a ellas, como Solanaceae, Chenopodiaceae, Gramineae, Compositae, Leguminosae, Dioscroeaceae, Cucurbitaceae, y Caricaceae.

Tal y como se utiliza aquí, con respecto a una secuencia de ADN o "gen", el término "aislado" está destinado a indicar que la secuencia es o bien extraída de su contexto en el genoma viral por medios químicos y purificada y/o bien es modificada hasta que pueda ser introducida en los vectores presentes en la orientación apropiada, es decir, de sentido o de antisentido. Como se utiliza en este caso, el término "quimérico" define el enlace de dos o más secuencias de ADN que son derivadas de distintas fuentes, cepas o especies, es decir, de bacterias y plantas, o indica que dos o más secuencias de ADN de la misma especie son enlazadas en una forma que no tiene lugar en el genoma nativo. De esta manera, las secuencias de ADN útiles en la presente invención pueden ser naturales, semisintéticas o totalmente sintéticas. La secuencia de ADN puede ser lineal o circular, es decir que puede localizarse sobre un plásmido intacto o linealizado, tal como los plásmidos binarios descritos a continuación. Como se utiliza aquí, el término "heterólogo" se refiere a no idéntico, por ejemplo, diferente en una secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos, a un fenotipo o a un aislado independiente. Como se utiliza en este caso, el término "expresión" significa transcripción o transcripción seguida de una translación de una molécula de ADN particular.

La mayoría de los métodos de ADN recombinante empleados en la práctica de la presente invención son procedimientos estándares, muy conocidos por los expertos en la materia y descritos en detalle en, por ejemplo la publicación de solicitud de patente europea número 223,452, publicada el 29 de noviembre de 1986, que se ha incorporado aquí como referencia. Las enzimas son obtenidas a partir de fuentes comerciales y son usadas de acuerdo con las recomendaciones del vendedor u otras variaciones conocidas en la técnica. Las referencias generales comprendiendo estas técnicas estándares incluyen las siguientes: R. Wu, ed. (1979) Métodos de enzimología, Vol. 68; J.H. Miller (1972) Experiencias en genéticas moleculares; J. Sambrook et al. (1989) Clonación molecular: Manual de laboratorio 2ª Ed.; D.M: Glover, ed. (1985) Clonación de ADN Vol, II; H.G. Polites y K.R. Marotti (1987) "Protocolo paso a paso para una síntesis de ADNc", Biotécnicas 4; 514-520; S.B. Gelvin y R.A. Schilperoort, eds. Introducción, Expresión, y Análisis de productos genéticos en plantas, todos incorporados como referencia.

Para la práctica de la presente invención, un gen viral debe ser aislado del genoma viral e insertado en un vector conteniendo las secuencias reguladoras genéticas necesarias para expresar el gen insertado. Por consiguiente, se debe construir un vector para proporcionar las secuencias reguladoras de tal manera que éstas sean funcionales desde la inserción de un gen deseado. Una vez ensamblado el constructo de vector de expresión/inserto, éste es usado para transformar células vegetales que son posteriormente usadas para regenerar las plantas. Estas plantas transgénicas llevan el gen viral en el constructo de vector de expresión/inserto. El gen es expresado en la planta y se provee así una resistencia superior a la infección viral.

Existen varios tratamientos diferentes para aislar un gen viral. Para ello, un experto en la materia puede utilizar la información sobre la organización genómica de potivirus, cucumovirus o comovirus para localizar y aislar el gen de proteína de revestimiento o los genes de cuerpo de inclusión nuclear. El gen de proteína de revestimiento en los potivirus está situado en el extremo 3' del ARN, justo antes de una extensión de aproximadamente 200-300 residuos de nucleótido de adenina. El gen de cuerpo de inclusión nuclear B (Nlb) está situado justo en el 5' del gen de la proteína de revestimiento, y el gen de cuerpo de inclusión nuclear A (Nla) en el 5' del gen Nlb. Además, la información relacionada con los sitios de escisión proteolítica es utilizada para determinar el terminal N del gen de la proteína de revestimiento de potivirus y terminales N y C de genes de proteína de no revestimiento. Los sitios de reconocimiento de la proteasa son conservados en los potivirus y han sido determinados como el dipéptido Gln-Ser, Gln-Gly o Gln-Ala. Las secuencias nucleótidas que codifican estos dipéptidos pueden ser
determinadas.

Usando métodos bien conocidos en la técnica, se cultiva y cosecha una cantidad de virus. El ARN viral es posteriormente separado y el gen viral es aislado usando varios procedimientos conocidos. Una biblioteca de ADNc es creada usando el ARN viral, mediante métodos conocidos en la técnica. El ARN viral es incubado con cebadores que se hibridizan con el ARN viral y una transcriptasa inversa, y una molécula de ADN complementaria es producida. Un complemento de ADN de la molécula de ADN complementaria es producida y esa secuencia representa un copia de ADN (ADNc) de la molécula de ARN viral original. El complemento de ADN puede ser producido de tal manera que se produzca un ADNc bicatenario único o se pueden utilizar reacciones de cadena de polimerasa para amplificar el ADN codificante del ADNc con el uso de cebadores oligoméricos específicos para el gen viral. Estos cebadores puede incluir, además de secuencias específicas virales, nuevos sitios de restricción usados en fases de clonación posteriores. De esta manera se genera una molécula de ADN bicatenario, la cual contiene la información de la secuencia del ARN viral. Estas moléculas de ADN pueden ser clonadas en vectores plásmidos E.coli después de las adiciones de moléculas enlazadoras de enzimas de restricción por una ligasa de ADN. Los diversos fragmentos son insertados en vectores de clonación, tales como plásmidos caracterizados de manera apropiada, que son usados posteriormente para transformar el E. coli para crear una biblioteca de ADNc.

Puesto que los genes de potivirus se conservan en general, también se puede usar oligonucleótidos basados en un gen análogo de aislado anterior o un fragmento de gen análogo de aislado anterior como una sonda de hibridación para identificar la biblioteca de ADNc para determinar si alguna de las bacterias transformadas contiene fragmentos de ADN con las secuencias virales apropiadas. Los insertos de ADNc en cualquier colonia bacteriana que se hibridizan con estas sondas pueden ser secuenciados. El gen viral está presente en su totalidad en colonias que poseen secuencias que se extienden 5' en secuencias que codifican un sitio de escisión proteolítico de terminal N y 3' en secuencias que codifican un sitio de escisión proteolítico de terminal C para el gen de interés.

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De manera alternativa, los fragmentos de ADNc pueden ser insertados en la orientación de sentido en vectores de expresión. Se pueden utilizar anticuerpos contra una proteína viral para identificar la biblioteca de expresión de ADNc y se puede aislar el gen de las colonias que expresan la proteína.

Las secuencias de nucleótidos codificantes de los genes de la proteína de revestimiento y genes de inclusión nuclear de un número de virus han sido determinadas y los genes han sido insertados en vectores de expresión. Los vectores de expresión contienen las secuencias reguladoras genéticas necesarias para la expresión de un gen insertado. El gen de la proteína de revestimiento está insertado de manera tal que estas secuencias reguladoras sean funcionales y los genes puedan ser expresados cuando son incorporados en un genoma de planta. En la siguiente Tabla I se relacionan referencias de bibliografía seleccionada a métodos de aislamiento, clonación y expresión de genes virales.

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TABLA 1 Genes clonados a partir de virus de ARN

100

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Para expresar el gen viral, las secuencias reguladoras genéticas necesarias deben ser provistas. Puesto que las proteínas codificadas en un genoma de potivirus son producidas por el proceso postranslacional de una poliproteína, un gen viral aislado del ARN viral no contiene las señales de transcripción y de translación necesarias para su expresión una vez que se ha transferido e integrado en un genoma de planta. Este debe ser, por consiguiente, sometido a un proceso de ingeniería para contener un promotor expresable en plantas, un codón iniciador de translación (ATG) y una señal de adición (AATAAA) 3' funcional poli(A) de planta de su codón de terminación de translación. En la presente invención, un gen viral es insertado en un vector conteniendo sitios de clonación para la inserción 3' del codón iniciador y 5' de la señal poli(A). El promotor es 5' del codón iniciador de tal forma que cuando se insertan los genes estructurales en el sitio de clonación se forma una unidad funcional en la que los genes insertados son expresados bajo el control de las varias secuencias genéticas reguladoras.

El segmento de ADN definido como el promotor es responsable de la regulación de la transcripción de ADN en ARNm. Un número de promotores, cuya función en células vegetales es conocida en la técnica, puede ser empleado en la práctica de la presente invención. Estos promotores pueden ser obtenidos a partir de una variedad de fuentes tales como virus de plantas o vegetales, y pueden incluir pero sin limitarse a ellos, promotores aislados del grupo caulimovirus tales como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S), el promotor 35S mejorado del virus del mosaico de la coliflor (enh CaMV35S), el promotor transcrito de longitud total del virus del mosaico de la escrofularia (FMV35S), y el promotor aislado de la proteína de enlace de la clorofila a/b. Otros promotores útiles incluyen promotores que pueden expresar las proteínas de potivirus de manera inducible o de manera específica al tejido en ciertos tipos de célula en los que se produce la infección. Por ejemplo, los promotores inducibles de fenilalanina amonio-liasa, chalcona sintasa, glicoproteina rica en hidroxiprolina, extensina, proteínas relacionadas con patogénesis (por ejemplo PR-1a), y un inhibidor de proteasa inducible por herida de la patata pueden ser útiles.

Los promotores preferidos para usar en los presentes casetes de expresión de gen viral incluyen los promotores constitutivos de CaMV, los genes Ti de la nopalina sintasa (Bevan et al., Nucleic Acids Res. II, 369-385 (1983)) y octopina sintasa (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet., 1, 561-564 (1982)), y la faseolina del gen de la proteína de almacenamiento de la judía. Las señales de adición poli(A) de estos genes son adecuadas también para usar en los presentes casetes. El promotor particular seleccionado puede provocar preferiblemente la expresión suficiente de las secuencias codificantes de ADN a las que está enlazado operativamente para obtener la producción de cantidades de proteínas o de ANRs eficientes para proporcionar la resistencia viral, sin que pueda ser perjudicial para la célula en la que se expresan. Los promotores seleccionados deberían poder funcionar en tejidos incluyendo pero sin limitarse a tejidos epidérmicos, vasculares, y mesófilos. La elección actual del promotor no es critica, siempre que tenga una actividad transcripcional suficiente para efectuar la expresión de las proteínas preseleccionadas o ARN antisentido, y conferir posteriormente la resistencia viral a las plantas.

La secuencia líder no transladada puede derivar de cualquier fuente adecuada y pueden ser modificada específicamente para aumentar la translación del ARNm. La región no transladada 5' puede ser obtenida del promotor seleccionado para expresar el gen, un promotor no relacionado, la secuencia líder nativa del gen o de la región codificante que expresar, ARNs viral, genes adecuados eucarióticos, o una secuencia de gen sintético. La presente invención no se limita a los constructos presentados en los ejemplos siguientes.

La región de terminación o región no transladada 3' empleada es una región que producirá la terminación de la transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados en el extremo 3' de la secuencia de ARNm transcrita. La región de terminación puede ser nativa con la región de promotor, nativa con el gen estructural, o puede derivar de otra fuente, e incluir preferiblemente un terminador y una codificación de secuencia para la poliadenilación. Las regiones adecuadas 3' no transladadas del gen vegetal quimérico incluyen, pero sin limitarse a ellos: (1) las regiones no transladadas transcritas 3', conteniendo la señal de poliadenilación de genes plásmidos de inducción de tumor por Agrobacterium (Ti), como el gen de la nopalina sintasa (NOS), y genes vegetales (2) como los genes de proteína de almacenamiento 7S de la semilla de soja.

Se pueden incorporar genes marcadores seleccionables en los presentes casetes de expresión y ser usados para seleccionar aquellas células o plantas que deben ser transformadas. El gen marcador empleado puede expresar una resistencia a un antibiótico, tal como la canamicina, gentamicina, G418, higromicina, estreptomicina, espectinomicina, tetracilina, cloranfenicol, y similares. Se pueden emplear otros marcadores adicional o alternativamente, como por ejemplo, un gen que codifique la tolerancia a herbicidas, tal como la tolerancia a glifosata, sulfonilurea, fosfinotricina, o bromoxinilo. Un medio adicional de selección puede incluir resistencia al metotrexato, metales pesados, prototrofía provista por complementación para un huésped auxotrófico, y similares. Por ejemplo, véase la Tabla 1 del PCT WO/91/10725 citado arriba. La presente invención prevé también la sustitución de todos los genes asociados a un virus con una serie de genes marcadores seleccionables.

El marcador particular empleado será un marcador que permita la selección de células transformadas en forma opuesta a las células que no se han transformado. Dependiendo del número de las distintas especies huésped, se pueden emplear uno o más marcadores donde serán útiles diferentes condiciones de selección para seleccionar el huésped diferente, y éstas serán conocidas por los expertos en la materia. Se puede usar un marcador identificable o "gen indicador" tal como el gen de \beta-glucuronidasa o gen de luciferasa en lugar de o con un marcador seleccionable. Las células transformadas con este gen pueden ser identificadas mediante la producción de un producto azul tratado con 5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-glucuronida (X-Gluc).

Al desarrollar el presente constructo de expresión, los varios componentes del constructo de expresión como las secuencias de ADN, enlaces, o fragmentos derivados serán insertados normalmente en un vector de clonación conveniente, tal como un plásmido o fago, que pueda realizar una replicación en un huésped bacteriano, tal como el E. coli. Existen numerosos vectores de clonación que han sido descritos en la literatura. Después de cada clonación, el vector de clonación puede ser aislado y sometido a otra manipulación, tal como una restricción, inserción de nuevos fragmentos, ligadura, deleción, resección, inserción, mutagénesis in vitro, adición de fragmentos poliligadores, y similares, para proveer un vector que satisfaga una necesidad particular.

Para la transformación mediada por Agrobacterium, el casete de expresión estará incluido en un vector y flaqueado por fragmentos del plásmido Ti o Ri de Agrobacterium, representando los límites derecho y, opcionalmente izquierdo, del ADN (T-ADN) transferido del plásmido Ti o Ri. Esto facilita la integración de las secuencias de ADN quiméricas presentes en el genoma de la célula vegetal huésped. Este vector contiene también secuencias que facilitan la replicación del plásmido en células de Agrobacterium, así como en células de E. coli.

Todas las manipulaciones de ADN se realizan habitualmente en células de E.coli, y el plásmido final que lleva el casete de expresión de potivirus es introducido en las células de Agrobacterium mediante una transformación, conjugación de ADN directa, y similares. Estas células de Agrobacterium contendrán un segundo plásmido, también derivado del plásmido Ti o Ri. Este segundo plásmido llevará todos los genes virales requeridos para transferir el ADN extraño a las células vegetales.

Los vectores de clonación de transformación vegetal adecuados incluyen aquellos derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, como se ha descrito generalmente en Glassman et al. (Patente U.S. Nº 5.258,300). Además de los vectores descritos, por ejemplo, Herrera-Estrella, Nature, 303, 209 (1983), Biotechnica (solicitud de PCT publicada PCT WO/91/10725), y Patente U.S. Nº 4.940,838, concedida a Schilperoort et al.

Hay disponibles una variedad de técnicas para la introducción del material genético dentro de la célula vegetal huésped o la transformación de ésta. No obstante, la manera particular de introducción del vector vegetal en el huésped no es critica con respecto a la práctica de la presente invención, y cualquier método que proporcione una transformación eficaz puede ser empleado. Además de la transformación usando vectores de transformación vegetal derivados de los plásmidos de inducción de tumor (Ti) o de inducción de raíz (Ri) de Agrobacterium, se pueden usar métodos alternativos para insertar los constructos de ADN de la presente invención en células vegetales. Tales métodos pueden incluir, por ejemplo, el uso de liposomas, la transformación usando un virus o polen, productos químicos que aumenten la absorción directa de ADN (Paszkowski et al., EMBO J., 3, 2717 (1984)), microinyección (Crossway et al., Mol. Gen.Genet., 202, 179 (1985)), electroporación (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 824 (1985)), o microproyectiles de alta velocidad (Klein et al., Nature, 327, 70 (1987)).

La elección de una fuente de tejido vegetal o células vegetales cultivadas para la transformación dependerá de la naturaleza de la planta huésped y del protocolo de transformación. Las fuentes de tejido útiles incluyen tejido calloso, células de cultivo en suspensión, protoplastos, segmentos de hoja, segmentos de tallo, borlas, polen, embriones, hipocótilos, segmentos de tubérculo, regiones meristemáticas, y similares. La fuente de tejido puede regenerarse, en la medida en que va a retener la capacidad para regenerar plantas fértiles enteras, después de la transfor-
mación.

La transformación se realiza en condiciones directas en el tejido vegetal de elección. Las células o tejido vegetales son expuestos al ADN transportando el casete de expresión multigen presente durante un periodo de tiempo eficaz. Este puede variar desde un pulso de electricidad de menos de un segundo para la electroporación, hasta un cocultivo de dos a tres días en presencia de células de Agrobacterium que lleven los plásmidos. Los tampones y medios usados variarán también con la fuente de tejido vegetal y protocolo de transformación. Muchos protocolos de transformación emplean una capa alimentadora de células de cultivo suspendido (por ejemplo, tabaco o maíz negro dulce mexicano) sobre la superficie de placas de medios sólidos, separadas por un disco de papel filtrante estéril de las células o tejidos vegetales que han sido transformados.

Después del tratamiento con ADN, las células o tejido vegetales pueden ser cultivados en varios periodos de tiempo antes de la selección, o pueden ser expuestos inmediatamente a un agente selectivo tal como los que se han descrito anteriormente. Los protocolos conteniendo la exposición a Agrobacterium incluyen también un agente inhibitorio para el crecimiento de las células de Agrobacterium. Los compuestos usados habitualmente son antibióticos como la cefotaxima y carbenicilina. Los medios usados en la selección puede ser formulados para mantener tejidos callosos transformados o células de cultivo en suspensión en un estado indiferenciado, o para permitir la producción de brotes de tejidos callosos, segmentos de hoja o de tallo, discos de tubérculo, y similares.

Las células o tejidos callosos observados durante su crecimiento en presencia de concentraciones normalmente inhibitorias de los agentes selectivos están destinados a ser transformados y pueden ser subcultivados varias veces más en el mismo medio para eliminar secciones no resistentes. Las células o tejidos callosos pueden ser evaluados después para determinar la presencia del casete de gen viral o puede ser sometidos a protocolos conocidos de regeneración vegetal. En aquellos protocolos que implican la producción directa de brotes, estos brotes, que aparecen en los medios selectivos, están destinados a ser transformados y pueden ser cortados y enraizados, ya sea en medios selectivos adecuados para la producción de raíces, o simplemente por inmersión del brote cortado en un compuesto de inducción de raíz y plantando este último directamente en vermiculita.

Para producir plantas transgénicas que exhiban una resistencia multiviral, los genes virales debe estar dispuestos en la célula vegetal e integrados de manera estable en el genoma de la planta. Se supone que las células y tejidos vegetales seleccionados por su resistencia a un agente inhibidor deben haber adquirido el gen marcador seleccionable codificante de esta resistencia durante el tratamiento de transformación. Puesto que el gen marcador se enlaza habitualmente a los genes víricos, se puede considerar que los genes virales han sido adquiridos de manera similar. Se pueden usar después análisis de hibridación por transferencia de Southern usando una sonda específica para los genes virales para confirmar que los genes extraños han sido absorbidos e integrados en el genoma de la célula vegetal. Esta técnica también puede proporcionar alguna indicación sobre el número de copias del gen que se ha incorporado. También se puede evaluar la transcripción acertada del gen extraño en ARNm usando un análisis de hibridación por transferencia de Northern del ARN celular total y/o el ARN celular enriquecido en una región poliadenilada. Las moléculas de ARNm incluidas en el campo de la invención son las que contienen secuencias virales específicas derivadas de los genes virales presentes en el vector transformado que tienen la misma polaridad que la del ARN genómico viral para que éstos puedan realizar un apareamiento de bases con el ARN viral específico de polaridad opuesta a la del ARN genómico viral en las condiciones descritas en el Capítulo 7 de Sambrook et al. (1989). Las moléculas de ARNm también incluidas en el campo de la invención son las que contienen secuencias virales específicas derivadas de los genes virales presentes en el vector transformado que presentan una polaridad opuesta a la del ARN genómico viral para que éstos puedan realizar un apareamiento de bases con el ARN genómico viral en las condiciones descritas en el Capítulo 7 de Sambrook et Al (1989).

La presencia de un gen viral puede ser detectada también por ensayos inmunológicos, como los ensayos sándwich de anticuerpos dobles tal y como ha sido descrito por Namba et al., Gene, 07. 181 (1991), modificado por Clark et al., J. Gen Virol, 34, 475 (1979). Véase también, Namba et al., Fitopatología 82, 940 (1992).

Se puede evaluar la resistencia a un virus a través de estudios de infectividad tal y como ha sido descrito generalmente por Namba et al., ibid., donde las plantas son marcadas de forma sintomática cuando cualquier hoja inoculada expone síntomas de claro de vena, de mosaico o necróticos.

Se entiende que la invención funciona cuando el ARN viral específico de sentido o antisentido es transcrito a partir de los casetes de expresión descritos anteriormente. Esto significa que no existe ningún mecanismo molecular específico atribuido al fenotipo y/o genotipo deseado expuesto por las plantas transgénicas. Por consiguiente, la protección contra un desafío viral puede tener lugar mediante cualquier o cualquier número de mecanismo.

También se entiende que la resistencia al virus puede producirse por la expresión de cualquier gen viral codificado. Por consiguiente, las plantas transgénicas de expresión de un gen de proteína de revestimiento o de un gen de proteína de no revestimiento pueden resistir el ataque de un virus homólogo o heterólogo. Por ejemplo, una planta transgénica incluyendo un gen proteasa PRV Nla resultó ser resistente a un ataque con PRV (véase Tabla 7, Ejemplo III), una planta transgénica incluyendo una cepa WMV-2 FL de gen de proteína de revestimiento fue resistente a un ataque con una cepa heteróloga de virus WMV-2 NY (Tablas 1-8; Ejemplos I-IV), y una planta transgénica incluyendo un gen de proteína de revestimiento CMV-C presentó cierta resistencia a un ataque con ZYMV (para más información véase la solicitud de patente divisional de los cesionarios de los solicitantes de la solicitud Nº 08/367,016 titulada "Plantas transgénicas exhibiendo una protección viral heteróloga" solicitada el 30 de diciembre de 1994, actualmente abandonada).

Una semilla de planta regenerada a partir de un cultivo de tejido es cultivada en el campo y autopolinizada para generar verdaderas plantas reproductoras. La progenie de estas plantas se convierten en verdaderas líneas reproductoras que son evaluadas para determinar la resistencia viral en el campo con una serie de condiciones medioambientales. El valor comercial de las plantas de resistencia viral es mayor cuando muchas combinaciones híbridas distintas resistentes están disponibles para la venta. El agricultor cultiva normalmente más de un tipo de híbrido en base a diferencias tales como la madurez, enfermedad y resistencia a insectos, color u otras características agronómicas. Además, los híbridos adaptados a un área en un país no se adaptan a otra área debido a las diferencias de tales rasgos como la madurez, la enfermedad y la tolerancia frente a insectos o la demanda pública de variedades específicas a determinadas zonas geográficas. Por ello es necesario mejorar la resistencia viral en un gran número de líneas parentales para que muchas combinaciones híbridas puedan ser producidas.

La adición de resistencia viral a líneas agronómicamente selectas se realiza de manera más eficaz cuando se entiende el control genético de una resistencia viral. Esto requiere cruzar plantas resistentes y sensibles y estudiar el patrón hereditario en la generaciones de segregación para averiguar si la característica es expresada de un modo dominante o recesivo, el número de genes implicados y cualquier interacción posible entre genes cuando se requiera más de uno para una expresión. Con respecto a las plantas transgénicas del tipo descrito aquí, los transgenes exhiben un comportamiento Mendeliano dominante, de un único gen. Este análisis genético puede formar parte de los esfuerzos iniciales para convertir líneas agronómicamente selectas pero aún sensibles en líneas resistentes. Se realiza proceso de conversión (retrocruce) para cruzar la línea original resistente con una línea selecta sensible y cruzar la progenie de nuevo con el genitor sensible. La progenie de este cruce se segregará de tal manera que algunas plantas llevarán
el(los) gen(es) de resistencia mientras que otras no. Las plantas que llevan el(los) gen(s) de resistencia serán cruzadas de nuevo con el genitor sensible produciendo una progenie que se segrega de nuevo en resistencia y sensibilidad. Esto se repite hasta que el genitor sensible original se haya convertido en una línea resistente, que además posee todos los otros atributos importantes encontrados originalmente en el genitor sensible. Se realiza un programa de retrocruce separado para cada línea selecta sensible que debe ser convertida en una línea resistente a un
virus.

Después del retrocruce, las nuevas líneas resistentes y las combinaciones apropiadas de líneas que producen buenos híbridos comerciales son evaluados para obtener una resistencia viral, así como una batería de características agronómicas importantes. Se producen líneas e híbridos resistentes que son exactos al tipo de líneas e híbridos originales sensibles. Esto requiere una evaluación en una gama de condiciones medioambientales en las que las líneas o híbridos van a ser cultivados comercialmente. Las líneas parentales de híbridos que actúan de manera satisfactoria son aumentadas y utilizadas para la producción de híbridos usando prácticas de producción estándar.

La invención será descrita también en referencia a los siguientes ejemplos detallados.

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Ejemplo I Variedades de Calabacín con Resistencia a un Virus Múltiple A. Vectores de Plásmido Binario

El ADN que fue transferido a los genomas vegetales estaba contenido en plásmidos binarios (M. Bevan, Nucleic Acids Res., 369 (1983)). El plásmido binario parental era PGA482, construido por G. An, Plant Physiol., 81, 86 (1986). Este vector contiene las secuencias límites del ADN-T de pTiT37, el gen marcador seleccionable Nos-NPT II (que contiene el promotor del gen de nopalina expresable en plantas fusionado con el gen bacteriano NPT II obtenido a partir de Tn5), una región de clonación múltiple, y los extremos cohesivos del fago lambda.

El plásmido pPRBoriGN (figura 1) fue derivado del plásmido PGA482 como sigue: un marcador seleccionable bacteriano, de resistencia a la gentamicina, (R. Allmansberger, et al., Molec. Gen. genet., 198, 514 (1985)) fue insertado adyacente al límite derecho (BR), pero fuera de la región de ADN-T. El gen Nos-NPT II fue cortado y después el sitio de clonación múltiple (MCS) fue regenerado adyacente al BR, justo en la región de ADN-T. A continuación, un casete de gen \beta-glucuronidasa (GUS) expresable en plantas (R.A. Jefferson, et al., EMBO J., 6, 3901 (1987)) fue insertado en la región de ADN-T adyacente para el inicio de la replicación pBR322. Finalmente, un gen NPT II expresable en plantas fue insertado en la región de ADN-T adyacente al límite izquierdo (B_{L}). Este gen NPT II fue producido por inserción de la región codificante NPT II en el casete de expresión del plásmido E. coli pDH51 (R. Kay et al., Nucl. Acids Res., 15, 2778 (1987)). Esto proporcionó una señal de poliadenilación promotora 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV).

El plásmido pPRBN (figura 2) fue derivado de pPRBoriGN como sigue: se borró la región de pPRBoriGN desde el principio de la secuencia de codificación GUS en el B_{L}. En consecuencia, el gen GUS y el casete 35S/NPT II fueron eliminados como una unidad. Esta región fue posteriormente sustituida por un fragmento comprendiendo sólo el casete 35S/NPT II. El resultado obvio de estas etapas fue la eliminación del gen GUS y una región corta de homología pBR322, dejando el gen NPT II expresable en plantas adyacente al B_{L}.

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B. Genes donantes 1. Virus del Mosaico de la Sandía 2

Se construyó un gen WMV2 expresable en plantas usando cebadores oligonucleótidos específicos para generar un fragmento comprendiendo la región codificante de proteína de revestimiento WMV2 de la cepa WMV-2 FL y flanqueando los sitios de enzima de restricción AatII (5') y BgIII (3'). Este fragmento fue ligado a pUC19B_{2} digerido en AatII/BgIII, que es el plásmido pUC19 modificado para contener el sitio de enzima de restricción BgIII en su región de clonación múltiple. El plásmido obtenido, designado pUCWM2P_{25}, fue posteriormente modificado por la adición del promotor CaMV 35S y una señal de poliadenilación obtenida a partir de pUC1813/CP19, (J.L. Slightom, Gene, 100, 251 (1991)) para producir un casete de proteína de revestimiento expresable en plantas. La proteína producida por la expresión de este gen debe ser una fusión entre la proteína de revestimiento WMV2 y la porción terminal NH3 del gen de proteína de revestimiento CMV. Este casete (CPW) fue posteriormente cortado por digestión de BamHI y ligado al sitio BgIII de pPRBoriGN para producir el plásmido binario designado pPRCPW (figura 3).

2. Virus del Mosaico Amarillo del Calabacín

Se describe la clonación y caracterización del gen de proteína de revestimiento ZYMV de cepa ZYMV FL usada aquí en H. Quemada, et al., J. Gen. Virol., 71, 1451 (1990). La estrategia empleada en la construcción de un gen de proteína de revestimiento ZYMV expresable en plantas es descrita por J.L. Slightom, (1991) citado más arriba, y S. Namba et al., Fitopatología, 82, 945 (1992).

3. Virus del Mosaico del Pepino

La clonación, caracterización e ingeniería del gen de proteína de revestimiento CMV usado en nuestros experimentos están descritos en H. Quemada, et al., J. Gen. Virol., 70, 1065 (1989) y en el documento de1991 citado anteriormente.

4. Virus del Mosaico de la Calabaza

El SQMV es un comovirus que es transmitido por una semilla y se expande a través del escarabajo del pepino atigrado o manchado (especie Acalymma y Diabrotica). El insecto adquiere el virus en cinco minutos y el virus es retenido hasta 20 días. El rango de huéspedes se limita a la Cucurbitaceae. Este virus consiste en una partícula isométrica de 30 nm de diámetro que contiene ARN monocatenario dividido en dos partes funcionales llamadas ARN-M y ARN-B (Provvidenti, en Plant Viruses of Horticultural Crops in the Tropics and Subtropics. Taiwan, Rep. de China (1986) páginas 20-36).

El aislamiento, secuencia de ADN, modificación, y expresión de estos genes en células vegetales son descritos por Hu et al., Arch. Virol., 130, 17 (1993). Brevemente, después del aislamiento y de la secuenciación, los genes fueron sometidos a procesos de ingeniería en el casete de expresión vegetal, pUC18cpexpress, según Slightom, Gene, 100, 251 (1991). El uso de esta metodología y casete de expresión produjo clones de proteína de revestimiento de SQMV unidos en la estructura al líder no transladado 5' de virus del mosaico del pepino. Las fusiones son dirigidas por el promotor 35S y utilizan el terminador 35S (figura 4). Los genes modificados fueron aislados posteriormente, después de la digestión de HindIII y en una única etapa, introducidos en el plásmido binario Upjohn pGA482GG (figura 11). Este plásmido es un derivado de pGA482 (An, Methods in Enzymol., 153, 292 (1987)). Los dos casetes de proteína de revestimiento son orientados en la misma dirección que el gen NPTII. Los genes están presentes en forma de copias únicas.

5. Virus de la Mancha Anular de la Papaya

Un gen PRV expresable en plantas fue aislado a través de una reacción en cadena de polimerasa usando cebadores oligonucleótidos específicos. Para más información remitirse a la solicitud de patente divisional de los cesionarios del solicitante N°. 08/366,881 titulada "Gen de proteína de revestimiento del virus de la mancha anular de la papaya" solicitada el 30 de diciembre de 1994; actualmente abandonada. Después del aislamiento y de la secuenciación, el gen fue creado genéticamente en el casete de expresión en plantas pUCl8cpexpress según Slightom, ibid, (1991).

6. Construcciones de Proteína de Revestimiento Múltiples

Se colocaron casetes de expresión de proteína de revestimiento juntos en varias combinaciones para obtener plásmidos binarios capaces de transferir más de un gen expresable en plantas en genomas vegetales.

(a) ZYMY72/WMBN-22

ZYMV72/WMBN22 es derivado del plásmido binario pPRBN, donde se han insertado los casetes de expresión de proteína de revestimiento ZYMV y WMV2. Los casetes de expresión fueron insertados secuencialmente en el único sitio de restricción BgIII de pPRBN. Para realizarlo, un sitio RamHI fue introducido 5' en el promotor 35S, y un sitio BgIII fue introducido 3' en la secuencia de adición poli A de los casetes de expresión WMV-2 y ZYMV. Los sitios BamHI y BgIII fueron introducidos usando cebadores oligonucleótidos apropiados durante una amplificación por PCR de los casetes. Los productos de la PCR fueron digeridos con BamHI y BgIII para producir los extremos apropiados. El casete WMV-2 portador de extremos BamHI/BgIII fue insertado en el único sitio de terminales de BamHI/BgIII para producir ZYMV72/WMBN22 (figura 5). El casete binario es designado ZW.

(b) CMV73/ZYMV72/WMBN22

El casete de expresión de proteína de revestimiento CMV-c fue insertado en el único sitio HindIII de ZYMV72/
WMBN22 produciendo CMV73/ZYMV72/WMBN2 (figura 5). Este casete terciario es designado CZW.

(c) CMV-WLA1/ZYMV72/WMBN22 (C-WLZW)

Los casetes de expresión para la cepa CMV de hoja blanca (WL), ZYMV, y genes de proteína de revestimiento WMV2 fueron insertados en el plásmido binario pPRBN para obtener CMV-WI41/ZYMV72/WMV2 (C-WLZW). Para instalar esta combinación de casetes de proteína de revestimiento de virus en pPRBN, un casete de expresión genética de proteína de revestimiento de cepa de hoja blanca CMV fue insertado en ZYMV72/WMVN22 (véase más arriba para la construcción de ZYMV72/WMBN22). Para construir el casete de expresión cp CMV-WL, Namba et al., Cene. 107, 181 (1991) se insertó la región codificante de proteína de revestimiento de CMV-WL en cpexpress. Un fragmento HindIII conteniendo el casete de expresión CMV-WL fue insertado en el sitio HindIII de ZYMV72/WMBN22 para obtener CMV-WL41/ZYMV72/WMBN22 (figura 7). Este plásmido binario es designado C_{WL}ZW.

(d) WM310/ZYMV47/482G

Un fragmento de HindIII incluyendo el casete de expresión cp 2YMV descrito anteriormente fue instalado en el sitio único HindIII de pGA482G para obtener ZYMV47/482G. Posteriormente, un fragmento de BamHI incluyendo el casete WMV2 descrito anteriormente fue insertado en el único sitio BgIII de ZYMV47/482G para obtener WMV310/482G. Esta construcción fue designada WZ.

(e) PRVcpwm16S/WZ_{WL}41/ZY72/WMBN22

Los casetes de expresión para una cepa FL PRV (para más información véase la solicitud de patente divisional de los cesionarios del solicitante Nº -08/366,881-; titulada "Gen de proteína de revestimiento del virus de la mancha anular de la papaya" solicitada el 30 de diciembre de 1994, actualmente abandonada e incorporada aquí como referencia), la cepa CMV de la hoja blanca, y los genes de proteína de revestimiento ZYMV y WMV-2 fueron insertados en el plásmido binario pPRBN para obtener PRVcpwnI6S/C_{W1}41/ZY72/WNBN22 (figura 9). Esta construcción es designada PCZW.

(f) PNIa22/C_{WL}41/ZY72/WMBN22

Los casetes de expresión para el gen PNIa de cepa PRV-P (para más información véase la solicitud de patente divisional de los cesionarios del solicitante Nº -08/366,490- titulada " Gen de proteasa del virus de la mancha anular de la papaya", solicitada el 30 de diciembre de 1994 -actualmente abandonada-, e incorporada aquí como referencia) y los casetes de gen de proteína de revestimiento de cepa CMV-WL, ZYMV y WMV-2 fueron insertados en el plásmido binario pPRBN para obtener PNIa22/C_{WL}41/ZY72/WMBN22 (figura 10). Este constructo es desingnado PNIa
CZW.

(g) SO21/SO42/WMBN22/ZY72/PRVcpwm16s/C_{WL}41

Se formaron los casetes de expresión para los genes de proteína de revestimiento de cepa WMV-2, ZYMV, PRV-FL y CMV-WL y los dos genes de proteína de revestimiento de SqMV y se insertaron en un plásmido binario pGA482GG (figura 12). Este constructo es designado SWZPC.

C. Transformación de la calabaza

Después de eliminar los revestimientos de las semillas, las semillas fueron esterilizadas superficialmente durante 20-25 minutos en una solución con 20% de hipoclorito sódico (Clorox) conteniendo Tween 20 (200 ul/1000 mis). La desinfectación fue seguida por tres enjuagues de 100 ml en agua destilada estéril. Las semillas fueron germinadas en tubos de cultivo de 150 X 25 mm conteniendo 20 mis de 1/4 de Murashige fuerte y un medio solidificado (MS) de orgánicos mínimos Skoog con 0,8% de Difco Bacto Agar. Después de 5-7 días, los cotiledones fueron eliminados de las semillas, y unas puntas de brote fueron cortadas y transferidas a unos vasos GA7 (Magenta Corp.) conteniendo 75 mis de medio solidificado MS con 1,5% de Difco Bacto Agar. A menos que se declare lo contrario, todos los cultivos fueron incubados en una cámara de crecimiento a 25ºC con un fotoperíodo de 16 horas de luz. La luz fue provista por lámparas fluorescentes de tipo cool (Phillips F40CW) y lámparas de crecimiento para plantas (General Electric PF F40) .

Se recogieron trozos de hoja (0,5 cm) de plantas in vitro y se mojaron en un caldo de cultivo de Agrobacterium tumefaciens (OD 600 0,1-0,2) y se transfirieron a unos discos Petri de 100 X 20 mm conteniendo 40 mis de medio MS donde se añadieron 1,2 mg/litro de ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético (2,4,5-T) y 0,4 mg/litro de benziloaminoácido (BAP) (MS-I) con 200 \muM de AS. Las placas fueron incubadas a 23ºC. Después de dos a tres días, los trozos de hoja fueron transferidos en un medio MS-I conteniendo 500 mg/litro de carbenicilina, 200 mg/litro de cefotaxima y 150 mg/litro de sulfato de canamicina (MS-IA). Después de diez días, las hojas fueron transferidas a un medio fresco MS-IA. Posteriormente, el tejido fue transferido a un medio fresco MIS-IA cada tres semanas. Después de aproximadamente 16-24 semanas un tejido calloso embriogénico resistente a la canamicina fue recogido y transferido a tubos planares conteniendo un medio líquido MS de orgánicos mínimos al que se añadieron 500 mg/litro de carbencilina y 150 mg/litro de sulfato de canamicina y 1,03 mg/l de CACl_{2}\cdot2H_{2}O. Los embriones desarrollados fueron recogidos y transferidos a un medio MS de orgánicos mínimos conteniendo 20 mg de AgNO_{3}. Los embriones de germinación fueron subcultivados en medios frescos hasta obtener brotes enraizados. Unas plántulas fueron transferidas en tierra para obtener una producción de semilla R.

D. Análisis de la Planta

Los transformantes resistentes a la canamicina fueron analizados para la expresión del gen NPT II por ELISA usando un equipo ELISA comercialmente disponible (5-Prime 3-Prime, Boulder, CO). Se dirigieron reacciones de cadena de la polimerasa usando los cebadores apropiados para amplificar el gen NPT II (adyacente al límite derecho) y situar el gen de la proteína de revestimiento más cerca del límite izquierdo. Algunas líneas fueron caracterizadas también usando el análisis de transferencia de Southern. La expresión del gen viral de la proteína de revestimiento en plantas transformadas putativamente fue detectada por ELISA utilizando anticuerpos alcalinos conjugados con fosfatasa según el protocolo de M.F. Clark et al., J. Gen. Virol., 34, 475 (1977). Los antisueros para CMV-C, WMV-2-NY, y ZYMV-FL, fueron provistos por D. Gonsalves (Universidad de Cornell, Geneva, Nueva York).

La presencia o ausencia del ADN-T en el R, y de generaciones posteriores fue determinada mediante pruebas ELISA para el gen marcador NPT II seleccionable. La PCR o el análisis de Southern fueron usados para seguir la herencia en la línea ZW20 cuyas generaciones avanzadas carecen del gen NPT II.

D. Procedimiento de inoculación

Mediante la segregación, la progenie R_{1} o R_{2} junto con las líneas de control apropiadas germinaron en el invernadero. Antes de una inoculación viral, las muestras cotiledóneas fueron recogidas para los ensayos de NPT II por ELISA. Los cotiledones espolvoreados con carborundo fueron inoculados mecánicamente en plántulas de seis días de vida con una dilución de 1x10^{-1} de peso/vol de una cepa C de CMV, una cepa FL de ZYMV, o una cepa NY de WMV-2 (Disponibles por D. Gonsalves, Universidad de Cornell), que fueron propagadas en Cucumis Sativus, Cucurbita pepo y Phaseolus vulgaris respectivamente. Las plantas fueron inoculadas con un virus en el invernadero. Aproximadamente 7-10 días después de la inoculación, las plantas fueron transplantadas en el campo. En algunas pruebas, las plantas de control no inoculadas fueron incluidas para controlar una propagación del virus por pulgones. Los datos de desarrollo sintomático fueron recogidos antes de revisar los resultados de NPT II por ELISA, de esta manera el marcado se realizó sin conocimiento del estado transgénico del segregador individual que se estaba evaluando.

Se determinó en las plantas un rango de gravedad de enfermedad de 0-9 en base a los síntomas de follaje (0 = no sintomático; 3 = síntomas en hoja inoculada y/o síntomas muy leves en crecimiento nuevo, 5 = propagación sistémica moderada 7 = propagación sistémica severa, 9 = propagación sistémica severa y crecimiento reducido). Las frutas fueron también anotadas en función de la gravedad del síntoma (0 = no sintomático; 3 = mancha verde leve de la fruta, 5 = decoloración moderada, 7 = decoloración severa, 9 = decoloración y distorsión de la fruta). Cada línea presentaba después un nivel de enfermedad para la fruta y el follaje que era un promedio de las valoraciones de las plantas individuales.

E. Diseño de las Parcelas de Prueba en Campo

Las pruebas en campo fueron realizadas con permisos expedidos por el servicio de inspección de salud de plantas y animales (APHIS) del departamento de agricultura de Estados Unidos (USDA). Se empleó un diseño en el que cada fila conteniendo una línea transgénica estaba pareada con una fila conteniendo su contrapartida no transgénica como control. Cada fila consistía en 15 plantas, separadas dos pies, con cinco pies entre las filas. Se incorporaron dos a tres réplicas de cada línea transgénica en cada prueba. Las parcelas fueron rodeadas por una zona limítrofe mínima de 30 pies de plantas de calabaza no transgénicas para reducir el flujo de polen transgénico al exterior del sitio de prueba y para controlar la expansión viral en el campo. El material transgénico incorporado en la prueba incluía una progenie R1 y R2 de líneas parentales de zapallo amarillo auto empolinizadas o retrocruzadas Ro. En algunos casos, una línea parental transgénica se cruzaba con la línea parental no transgénica apropiada para producir las versiones transgénicas de los híbridos de calabaza comerciales, Pavor o Dixie.

F. Resultados Constructos ZW

La línea ZW20 se desarrolló a partir de una planta Ro que se transformó con ZYMV72/WMBN22. Las observaciones hechas durante las pruebas 1 y 2 en campo sobre la población R, reveló que todas las plantas conteniendo el inserto NPT II permanecían resistentes a ZYMV y WMV-2 a lo largo de la prueba.

La línea ZW19 se desarrolló también a partir de una planta R_{0} que se transformó con ZYMV72/WMVN22. En contraste con la línea ZW-20, ZW-19 proporcionaba una reducción del desarrollo del síntoma inoculado con ZYMV o bien con WMV-2 (Tabla 1).

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1

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Constructos CW

Plantas de calabaza transgénica incluyendo vectores de expresión con genes CP CMV-C y WMV-2 fueron inoculadas sea con cepas CMV V27, V33, o V34 (para más información, véase la solicitud de patente divisional de los cesionarios del solicitante Nº 08/367.789- titulada "Plantas resistentes a cepas de virus del mosaico del pepino V27, V33, o V34" solicitada el 30 de diciembre de 1994, -actualmente abandonada), que pueden infectar plantas transgénicas que expresen una proteína de revestimiento CMV-C. La mayoría de las plantas transgénicas resistió al ataque con estas cepas heterólogas CMV, al contrario de las líneas transgénicas incluyendo una CP solo CMV-C. En las plantas infectadas restantes se redujeron de manera importante los síntomas relativos a plantas transgénicas con una CP solo de CMV-C.

Constructos CZW

La línea CZW-3 se desarrolló a partir de una Planta R_{0} transformada con CMV73/ZYMV72/WMBN22. Se mantuvo asintomática durante las pruebas en campo con una infección de CMV-C, ZYMV-FL o WMV-2, en caso de que cada inoculación fuera aplicada individualmente o en un cóctel conteniendo los tres agentes virales (Tabla 2).

La línea CZW-40 se desarrolló a partir de una planta Ro transformada con C_{WL}41./ZWMV-72/WMBN22. No consiguió proveer ninguna protección contra la infección durante la inoculación con cualquiera de CMV-C, ZYMV-FL o WMV-2 NY (Tabla 2).

2

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La fruta y el follaje tienen niveles de enfermedad 0. En contraste, el 100% de los segregantes cp desarrollaron síntomas de infección por virus sobre su follaje y su fruta. Los niveles de enfermedad de segregantes CP variaron entre 7,0 y 9,0 (Tabla 3). Esta prueba demostró que por medio de la disposición en combinación de los genes de proteína de revestimiento, se puede conseguir una resistencia contra una infección simultánea por varios virus tanto en las líneas parentales como en las líneas híbridas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

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Para el tercer periodo de prueba una generación de R_{2} de CZW-3 fue producida mediante una autofecundación de un segregante CP positivo R CZW-3. Dos líneas híbridas transgénicas equivalentes a los híbridos comerciales Pavo y Dixie de Asgrow fueron producidos también usando esa línea parental transgénica como una de las parentales. La progenie de la línea parental autofecundada exhibía la proporción de segregación prevista (basada en la prueba por ELISA de NPT II) de 3:1 para el gen insertado, mientras que las dos líneas híbridas presentaban la proporción 1:1 prevista. La progenie parental transgénica e híbrida fue inoculada con una mezcla inócula comprendiendo una dilución de 1/10 en p/v de los tres virus, CMV-C, WMV-2-NY y ZYMV-FL. La Tabla 3 muestra que los segregantes eran completamente resistentes a una infección producida por los tres virus.

Los resultados presentados aquí confirman que los genes de proteína de revestimiento proporcionan una resistencia multiviral cuando son insertados en combinación. Por ejemplo la línea transgénica CZW-3 se mantuvo asintomática en las pruebas con los tres virus (CMV, ZYMV, y WMV-2) en las que fue inoculada con cada virus individualmente, de la misma manera que se mantuvo asintomática cuando se inoculó con los tres virus simultáneamente. La capacidad para obtener líneas con una resistencia a la infección por virus múltiples es esencial para el desarrollo de los cultivos de calabaza útiles comercialmente, ya que en condiciones de campo comerciales es común encontrar una infección producida por más de un virus durante una estación de crecimiento.

En estos ensayos, también se observó que cuando los genes de proteína de revestimiento múltiples son insertados en un único constructo, todos los genes en el constructo proporcionan niveles similares de eficacia. La línea CZW-3 que proporciona un nivel elevado de resistencia a CMV-C, también proporciona un nivel elevado de resistencia a ZYMV-FL y WMV-2-NY. En las líneas transgénicas con constructos tales como ZW-19, que poseen sólo una resistencia moderada (es decir, un desarrollo de la resistencia a un síntoma más leve) al WMV-2, éstas también presentan sólo una resistencia moderada al ZYMV. Además los estudios en invernadero sobre la línea transgénica CZW-40 demostraron que esta línea, que no podía proveer resistencia al CMV-C, tampoco conseguía proveer resistencia al ZYMV-FL y WMV-2-NY. Este nivel coordinado de acción entre genes en un constructo múltiple de genes puede reflejar el efecto de la disposición en el genoma de la planta en el que se insertan los genes. En cualquier caso, este fenómeno proporciona un método para mejorar ampliamente la probabilidad de encontrar líneas transgénicas individuales con altos niveles de resistencia contra agentes virales múltiples.

Ejemplo II Introducción de casetes de gen Multi-CD en el Melón 1. Transformación del melón

La líneas parentales del melón fueron transformadas con los constructos múltiples de genes citados anteriormente usando una modificación del procedimiento de Fang and Grumet Molec. Plant Microbe Interations, 6, 358 (1993). Unas plantas enraizadas transformadas fueron transferidas al invernadero y se produjo R.

Análisis de la planta/Proceso de inoculación

Las plantas transgénicas fueron analizadas e inoculadas como se ha descrito en el Ejemplo I citado anteriormente.

2. Resultados

Constructos ZW. Una línea CA76-ZW-102-29 proporcionaba resistencia a una infección por ambos ZYMV-FL o WMV-2-NY. En contraste, ninguna de las otras líneas lograba proporcionar resistencia contra una infección sea por ZYMV o por WMV-2 (Tabla 4).

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4

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Constructo PCZW. La línea CA95 PXZW-1 proporcionó resistencia a una infección por CMV-C, ZYMV-FL y WMV-2. La línea presenta una resistencia tradicional a PRV, de manera que la eficacia del inserto de PRV no puede ser establecida. En contraste, numerosas líneas transgénicas PCZW no conseguían proporcionar resistencia frente a CMV-C o ZYMV-FL. La inoculación de estas líneas con WMV-2-NY sigue en progreso (Tabla 5).

5

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Constructo SWZPC. Aunque estas líneas no hayan sido evaluadas aún para determinar la resistencia, un análisis de PCR ha verificado que 27/36 (75%) de las líneas de melón producidas con este constructo contenían los seis genes cp más el gen marcador seleccionable NPT II. Se ha demostrado que una transformación mediada por Agrobacterium puede ser utilizada para transferir al menos siete (aunque probablemente muchos más) genes enlazados en un plásmido binario en células vegetales con una recuperación posterior de plantas intactas conteniendo los siete insertos de gen enlazado.

Ejemplo III Introducción de casetes de gen Multi-Cp en el Pepino 1. Transformación del Pepino

Se transformaron los parentales de pepino con los constructos de gen de proteína de revestimiento múltiple citados anteriormente, usando una modificación del proceso de Sannento et al., Plant cell Tissue and Organ Culture, 31, 185 (1992). Las plantas enraizadas fueron transferidas al invernadero y una semilla R fue producida. Las plantas transgénicas fueron analizadas e inoculadas tal y como se ha descrito en el ejemplo I anterior.

2. Resultados

Constructos CZW. La línea GA715 CZW 7, 95, 33, 99, era resistente a ambos ZYMV-FL y WMV-2-NY (estas líneas han sido producidas generalmente para resistir al CMV-C, por lo que la eficacia del inserto de proteína de revestimiento CMV no pudo ser establecida) (Tabla 6).

6

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Constructo PNIa CZW. La línea GA715 PNIa CZW-21 era resistente a CMV-C, ZYMV-FL y PRV-P-HA mientras que la línea GA715 PNIaCZW-15 era sensible a FL ZYMV y PRV-P-HA (Tabla 7).

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(Tabla pasa a página siguiente)

7

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Ejemplo IV Introducción de Casete de Gen Multi CP en la Sandía 1. Transformación de la Sandía

Se transformaron los parentales de sandía con casetes de gen de proteína de revestimiento múltiple, WZ citados anteriormente, usando una modificación del proceso descrito por Choi et al., Plant Cell Reports, 344 (1994).

2. Análisis de las Plantas Proceso de Inoculación

Las plantas transgénicas fueron analizadas e inoculadas tal como se ha descrito en el ejemplo I anteriormente.

3. Resultados

Constructo WZ. Las líneas WA3WZ-20-14 eran resistentes a ZYMV-FL y WMV-2-NY (Tabla 8).

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante están previstas sólo para la comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se haya prestado particular atención a la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

- EP578627[0004][0033]

- WO 9110725 A [0039][0044]

- WO 9428147 A [0011]

- US 5258300 A [0044]

- EP 223452 A [0027]

- US 4940838 A [0044]

- WO 9002185 A [0033]

Otra literatura, que no son patentes, citada en la descripción

\bulletNAMBA et al. Phytopathology, 1992, vol. 82, 940 [0007][0051]

\bulletSTARK et al. Biotechnology, 1989, vol.1, 1257 [0007]

\bulletTRICOLI et al. Cell. Biochem. Suppl., 1994, 91 [0009]

\bulletMethods in Enzymology vol. 68 [0027]

\bullet J.H. MILLER. Experiments in Molecular Genetics, 1972 [0027]

\bullet J. SAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1989 [0027]

\bullet DNA Cloning, 1985, vol. II [0027]

\bullet H.G. POLITES; K.R. MAROTTI. A step-wise protocol for cDNA synthesis, Biotechniques, 1987, vol. 4, 514-520 [0027]

\bullet M.M. FITCH et al. Bio/Technology, 1992, vol 10, 1466 [0033]

\bullet K. LING et al. Bio/Technology, 1991, vol. 9, 752 [0033]

\bullet A. HOEKEMA et al. Bio/Technology, 1989, vol. 7, 273 [0033]

\bullet H. QUEMADA et al .J. Gen. Virol., 1990, vol. 71, 1451 [0033][0063]

\bullet S. NAMBA et al. Phytopathology, 1992, vol. 82, 940 [0033][0033]

\bullet R.S. NELSON et al. Bio/Technology, 1988, vol.6, 403 [0033]

\bullet P. POWELL ABEL et al. Science, 1986, vol. 232, 738 [0033]

\bulletLOESCH-FRIES et al. EMBO J., 1987, vol. 6, 1845 [0033]

\bullet N.E. TURNER et al.EMBO J., 1987, vol. 6, 1181 [0033]

\bullet D.M. STARK et al. Biotechnology, 1989, vol.7, 1257 [0033]

\bullet H.Q. QUEMADA et al. Molec. Plant Pathol., 1991, vol. 81, 794 [0033]

\bulletALLISON et al. Virology, 1985, vol. 147, 309 [0033]

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\bulletDEPICKER et al. J. Mol. Appl. Genet., 1982, vol. 1, 561-564 [0036]

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\bulletPROVVIDENTI. Plant Viruses of Horticultural Crops in the Tropics and Subtropics, 1986, 20-36 [0065]

\bulletHU et al. Arch. Virol., 1993, vol. 130, 17 [0066]

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\bulletAN. Methods in Enzymol., 1987, vol. 153, 292 [0066]

\bullet M.F. CLARK et al. J. Gen. Virol., 1977, vol. 34, 475 [0078]

\bulletSANNENTO et al. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1992, vol. 31, 185 [0097]

\bulletCHOI et al. Plant Cell Reports, 1994, vol. 344 [0100]

Claims (11)

1. Método para impartir resistencia a múltiples virus a una planta que es sensible a los virus, en el que la expresión de las secuencias de ADN codificantes imparte niveles de resistencia esencialmente iguales frente a una infección por cada uno de los virus, comprendiendo:

(a)

la transformación de células de dicha planta sensible con una molécula de ADN recombinante quimérica comprendiendo al menos tres secuencias de ADN enlazadas en tándem, cada una comprendiendo un promotor funcional en células de dicha planta y enlazado operativamente a una secuencia de ADN codificante de una proteína de revestimiento de un virus que puede infectar dicha planta; donde dichos virus son elegidos del grupo que consiste en potivirus, cucumovirus y comovirus;

(b)

la regeneración de dichas células de planta para proporcionar una planta diferenciada;

(c)

la identificación de una planta transformada que expresa las secuencias de ADN codificantes para que la planta sea resistente a la infección de dichos virus, y

(d)

la identificación de una planta transformada que exhibe esencialmente el mismo grado de resistencia viral cuando es inoculada individualmente con cada uno de dichos virus.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la expresión de al menos una de dichas secuencias de ADN codificantes provee resistencia frente a una pluralidad de dichos virus.

3. Método según la reivindicación 1, donde la planta es una dicotiledónea.

4. Método según la reivindicación 1, donde la molécula de ADN es una parte de un plásmido binario Ti y las células de planta son transformadas por una transformación mediada por A. tumefaciens.

5. Método según la reivindicación 1, donde las secuencias de ADN comprenden también un marcador de gen seleccionable o un indicador de gen que permite la identificación de dicha planta transformada.

6. Método según la reivindicación 1, donde dichas secuencias de ADN comprenden también al menos dos de los genes de proteína de revestimiento del virus del mosaico de la sandía II, virus del mosaico del pepino o virus del mosaico amarillo del calabacín.

7. Método según la reivindicación 1, donde la planta sensible es un miembro de la familia Cucurbitaceae.

8. Planta transformada preparada por el método según la reivindicación 1.

9. Célula de planta transformada de la planta transformada preparada por el método según la reivindicación 1.

10. Semilla transformada de la planta transformada preparada por el método según la reivindicación 1.

11. Planta híbrida obtenida a partir de la planta según la reivindicación 8, que es resistente a la infección por dichos virus.