PL202048B1

PL202048B1 - Sposób nadawania oporności na wirusa nekrotycznej żółtaczki nerwów buraka (BNYVV) roślinie buraka cukrowego, wektor transformacyjny do nadawania roślinie oporności na BNYVV, jego zastosowanie, komórka roślinna wykazująca oporność na BNYVV, jej zastosowanie, roślina buraka cukrowego wykazująca oporność na BNYVV, oporne na BNYVV potomstwo rośliny buraka cukrowego i wegetatywne struktury do reprodukcji

Info

Publication number: PL202048B1
Application number: PL349573A
Authority: PL
Inventors: Kenneth Richards; Gérard Jonard; Hubert Guilley; Dun Cornelis Maria Petrus Van
Original assignee: Ses Europe Nv Sa
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-26
Publication date: 2009-05-29
Also published as: EE200100390A; EP1169463B1; DE60035972T2; HUP0105157A3; SK286440B6; DE60035972D1; WO2000044915A9; WO2000044915A1; UA79731C2; EA011687B1; EA200501578A1; HUP0105157A2; EP1029923A1; SK10572001A3; EP1169463A1; US6956149B1; EE04856B1; DK1169463T3; EA006701B1; AU3150500A

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobu nadawania oporno sci na wirusa nekrotycznej zó ltaczki nerwów bu- raka (BNYVV) ro slinie buraka cukrowego, który charakteryzuje si e tym, ze w kolejnych etapach: (a) przygotowuje si e fragment DNA z lo zony z co najmniej 15 nukleotydów o sekwencji, która jest co najmniej w 70% homologiczna z odpowiedni a sekwencj a nukleotydow a genomowego RNA 1 wirusa nekrotycznej zó ltaczki nerwów buraka (BNYVV), (b) wprowadza si e ten fragment DNA po laczony funk- cjonalnie z promotorem, który jest aktywny w ro slinach buraka cukrowego, do komórki buraka cukro- wego, z wytworzeniem stransformowanej komórki buraka cukrowego; i (c) regeneruje si e transge- niczn a ro slin e buraka cukrowego z tej stransformowanej komórki buraka cukrowego. Ponadto wynala- zek dotyczy wektora transformacyjnego do nadawania ro slinie oporno sci na BNYVV, jego zastosowa- nia do transformacji komórki ro slinnej, komórki ro slinnej wykazuj acej oporno sc na BNYVV, jej zasto- sowania do regeneracji z niej ro sliny buraka cukrowego, która jest oporna na BNYVV, ro sliny buraka cukrowego wykazuj acej oporno sc na BNYVV, opornego na BNYVV potomstwo ro sliny buraka cukro- wego, zw laszcza nasion, oraz wegetatywnych struktur do reprodukcji. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są sposób nadawania oporności na wirusa nekrotycznej żółtaczki nerwów buraka (BNYVV skrót od „beet necrotic yellow vein virus) roślinie buraka cukrowego, wektor transformacyjny do nadawania roślinie oporności na BNYVV, jego zastosowanie, komórka roślinna wykazująca oporność na BNYVV, jej zastosowanie, roślina buraka cukrowego wykazująca oporność na BNYVV, oporne na BNYVV potomstwo rośliny buraka cukrowego, zwłaszcza nasiona, oraz wegetatywne struktury do reprodukcji.

Wirusy roślinne są poważnym problemem dla wielu z głównych roślin uprawnych. Tak więc BNYVV, który jest przenoszony przez obecny w glebie grzyb z klasy plazmodioforowców (plasmodiophoromycetes), Polymyxa betae, jest przyczyną ekonomicznie ważnej choroby buraka cukrowego (Beta vulgaris), znanej jako rizomania. Choroba ta została po raz pierwszy opisana we Włoszech w latach 50-tych i od tego czasu stał a się poważ nym zagrożeniem dla upraw buraka cukrowego w większości obszarów upraw na świecie.

W warunkach polowych BNYVV jest na ogół ograniczony do podziemnych części rośliny. Zakażone korzenie buraka cukrowego wykazują zwiększoną proliferację i nekrozę bocznych korzeni, zmniejszenie całkowitej masy korzenia głównego i w efekcie obniżenie ilości uzyskiwanego cukru. Po zakażeniu może też nastąpić śmierć rośliny, zwłaszcza jeśli uprawa jest zakażona wcześnie w sezonie. Czasem wirus przechodzi na liść, gdzie może spowodować związane z nerwami inwazyjne uszkodzenia chlorotyczne i nekrotyczne.

BNYVV jest typowym członkiem rodziny wirusów Benyvirus, które są przenoszonymi przez grzyby wirusami o kształcie pałeczki mającymi podzielony genom złożony z dwóch lub większej liczby komponentów jednoniciowego (ss) RNA. Zidentyfikowano cztery różne rodzaje plus-sensownych ssRNA BNYVV, które są określane jako RNA od 1 do 4 w kolejności zmniejszających się rozmiarów (RNA 1: 6,8 kb; RNA 2: 4,7 kb; RNA 3: 1,8 kb; RNA 4: 1,5 kb). Niektóre japońskie izolaty zawierają także piąty komponent RNA (RNA 5: 1,45 kb). Wszystkie RNA zostały sklonowane i zsekwencjonowane. Mapa genetyczna wirusowych RNA została przedstawiona na fig. 1.

Wszystkie pięć RNA są zakończone ogonami 3' poli-A i RNA 1-4 mają na swoich końcach 5' struktury czapeczki. RNA 1 i 2 kodują podstawowe niezależne od gospodarza geny „metabolizmu podstawowego, podczas gdy mniejsze RNA biorą udział specyficznie w procesie naturalnego zakażenia, w tym pośredniczonego przez wektor zakażenia korzeni buraka cukrowego, proliferacji w obrębie systemu korzeniowego i wywoływania objawów rizomanii. Tak więc wykazano, że RNA 1 koduje aktywność wirusowej polimerazy RNA, a RNA 2 koduje białko płaszcza wirusa o masie 21 kD. 3'-proksymalna połowa RNA 2 niesie grupę trzech kolejnych nieco zachodzących na siebie genów wirusowych znanych jako potrójny blok genów („triple gene block TGB3), które są bardzo podobne do skupienia trzech genów u innych wirusów o kształcie pałeczki i biorą udział w ruchu wirusa od komórki do komórki. RNA 3 jest związany z silną proliferacją drobnych korzeni w buraku cukrowym i ułatwia rozprzestrzenianie się wirusa w tkance korzenia, podczas gdy RNA 4 zwiększa skuteczność transmisji wirusa przez grzyby.

Przenoszone przez grzyby wirusy, takie jak BNYVV, mogą być utrzymywane w spoczynkowych sporach w glebie przez lata po zakażeniu pola. Jako że nie istnieją skuteczne chemiczne lub fizyczne sposoby zwalczania wirusa, ani w roślinach ani w ziemi, jedynym rozwiązaniem dla hodowcy buraków cukrowych jest stosowanie odmian opornych genetycznie. Kilka firm dostarczyło szereg tolerancyjnych, nawet częściowo opornych odmian, przez przeniesienie genów tolerancji typu dzikiego do dostępnych w handlu odmian poprzez hodowlę. Jest to jednak proces żmudny i czasochłonny, na ogół otrzymanie użytecznych roślin opornych zajmuje bardzo wiele czasu. Dodatkowo w warunkach wysokiej presji choroby rośliny tolerancyjne lub częściowo oporne będą wykazywały objawy choroby ponieważ oporność jest za niska. Innym problemem związanym z roślinami tolerancyjnymi lub tylko częściowo opornymi jest to, że narastają podpopulacje wirusa, co może spowodować pojawienie się szczepu BNYVV, który może przełamać geny oporności/tolerancji.

Szybka rewolucja w dziedzinach inżynierii roślin doprowadziła do opracowania nowych strategii nadawania oporności genetycznej na wirusy. Oporność na choroby wirusowe przez wprowadzanie części sekwencji genomu wirusa stała się nowym źródłem oporności. Sekwencja wirusa (konstrukt) jest transformowana do rośliny przez połączenie zastosowania odpowiednich technik hodowli komórkowej lub tkankowej i system dostarczania DNA, taki jak dobrze znany system transformacji

PL 202 048 B1

Agrobacterium tumefaciens, lub bezpośrednie przeniesienie DNA pośredniczone przez związki chemiczne, takie jak glikol polietylenowy (PEG).

Znane sposoby wywoływania mechanizmów obrony przed patogenem u roślin opisano na przykład w EP 9687106.0, który dotyczy sposobu wywoływania oporności na wirus obejmującego sekwencję TGB3. W publikacji tej opisano, że było możliwe wywołanie oporności na BNYVV za pomocą sposobu, który składa się z transformacji komórek roślinnych konstruktem DNA odpowiadającym fragmentowi sekwencji kwasu nukleinowego genomowego lub subgenomowego RNA 2 BNYVV. Wadą tego sposobu jest jednak to, że uzyskuje się tylko tolerancję, a nie oporność. U tolerancyjnych roślin gospodarzy mogą nadal być normalne poziomy replikacji wirusów roślinnych, ale roślina wykazuje niewiele widocznych oznak zakażenia wirusem lub ich wcale nie wykazuje, podczas gdy u opornych gospodarzy replikacja jest niska, a nawet jej brak.

W WO 93/25068 oporność na wirusy u roślin jest wywoływana przez transformację roślin częścią replikazy (RNA 1) genomu wirusa roślinnego. Ta publikacja nie dotyczy buraka cukrowego ani BNYVV.

Wiadomo, że buraki cukrowe są gatunkiem opornym na inżynierię genetyczną, co komplikuje udane wywołanie oporności na BNYVV. Jednak ze względu na zakres i wpływ choroby wirusowej BNYVV istnieje duże zainteresowanie aby poprawić źródła oporności genetycznej w roślinach buraka cukrowego.

Celem wynalazku jest zatem dostarczenie sposobów uzyskania roślin buraka cukrowego, które wykazują oporność na BNYVV. Korzystnie wykazują one całkowitą oporność lub odporność, przez połączenie różnych podejść i przez stosowanie sposobów, które nie pozwalają na replikację wirusa.

Zatem wynalazek dotyczy sposobu nadawania oporności na wirusa nekrotycznej żółtaczki nerwów buraka (BNYVV) roślinie buraka cukrowego, który charakteryzuje się tym, że w kolejnych etapach:

(a) przygotowuje się fragment DNA złożony z co najmniej 15 nukleotydów o sekwencji, która jest co najmniej w 70% homologiczna z odpowiednią sekwencją nukleotydową genomowego RNA 1 wirusa nekrotycznej żółtaczki nerwów buraka (BNYVV), (b) wprowadza się ten fragment DNA połączony funkcjonalnie z promotorem, który jest aktywny w roś linach buraka cukrowego, do komórki buraka cukrowego, z wytworzeniem stransformowanej komórki buraka cukrowego; i (c) regeneruje się transgeniczną roślinę buraka cukrowego z tej stransformowanej komórki buraka cukrowego.

Zatem zgodnie ze sposobem według wynalazku otrzymuje się roślinę buraka cukrowego, która wykazuje trwałą oporność i w której wirus nie ulega replikacji. Jest to unikalny aspekt transformanta według wynalazku i nie był dotychczas ujawniony.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się fragment DNA co najmniej w 80%, korzystniej co najmniej w 90%, a najkorzystniej co najmniej w 95% homologiczny z odpowiednią sekwencją nukleotydową genomowego RNA 1 tego wirusa.

Korzystniej w sposobie według wynalazku długość fragmentu DNA wynosi co najmniej 35 zasad.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się fragment mający sekwencję kwasu nukleinowego, która przy powyżej wskazanej homologii odpowiada nukleotydom od 153 do 3258 RNA 1 tego wirusa.

Ponadto korzystnie w sposobie według wynalazku długość tego fragmentu wynosi 100 - 1000 zasad.

Korzystniej w sposobie według wynalazku stosuje się fragment mający sekwencję kwasu nukleinowego, która przy powyżej wskazanej homologii odpowiada nukleotydom od 169 do 539, od 1226 do 1683 lub od 2754 do 3192 RNA 1 tego wirusa.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się też fragment zawierający 6746 nukleotydów.

Korzystnie w sposobie według wynalazku fragment wprowadza się do komórki z użyciem wektora DNA zawierającego ten fragment i połączone z nim funkcjonalnie sekwencje regulujące transkrypcję i translację.

Ponadto wynalazek dotyczy wektora transformacyjnego do nadawania roślinie oporności na BNYVV, który cechuje się tym, że zawiera fragment złożony z co najmniej 15 nukleotydów o sekwencji, która jest co najmniej w 70% homologiczna z odpowiednią sekwencją nukleotydów genomowego RNA 1 wirusa nekrotycznej żółtaczki nerwów (BNYVV), który jest funkcjonalnie połączony z promotorem aktywnym w roślinach buraka cukrowego.

Korzystnie wektor według wynalazku zawiera fragment DNA, który jest co najmniej w 80%, korzystnie co najmniej w 90%, korzystniej co najmniej w 95% homologiczny z odpowiednią sekwencją nukleotydową genomowego RNA 1 tego wirusa.

PL 202 048 B1

Korzystnie w wektorze według wynalazku długość fragmentu DNA wynosi co najmniej 35 zasad.

Korzystnie wektor według wynalazku zawiera fragment mający sekwencję kwasu nukleinowego, która przy powyżej wskazanej homologii odpowiada nukleotydom od 153 do 3258 RNA 1 tego wirusa.

Korzystnie w wektorze według wynalazku długość tego fragmentu wynosi 100 - 1000 zasad.

Korzystniej wektor według wynalazku zawiera fragment mający sekwencję kwasu nukleinowego, która przy powyżej wskazanej homologii odpowiada nukleotydom od 169 do 539, od 1226 do 1683 lub od 2754 do 3192 RNA 1 tego wirusa.

Ponadto korzystnie wektor według wynalazku zawiera fragment zawierający 6746 nukleotydów.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania powyżej zdefiniowanego wektora do transformacji komórki roślinnej.

Ponadto wynalazek dotyczy komórki roślinnej wykazującej oporność na BNYVV, która charakteryzuje się tym, że zawiera w swoim genomie fragment DNA złożony z co najmniej 15 nukleotydów o sekwencji, która jest co najmniej w 70% homologiczna z odpowiednią sekwencją nukleotydową genomowego RNA 1 tego wirusa.

Korzystnie komórka roślinna według wynalazku zawiera fragment DNA, który jest co najmniej w 80%, korzystniej co najmniej w 90%, a najkorzystniej co najmniej w 95% homologiczny z odpowiednią sekwencją nukleotydową genomowego RNA 1 tego wirusa.

Korzystnie w komórce roślinnej według wynalazku długość tego fragmentu DNA wynosi co najmniej 35 zasad.

Korzystnie komórka roślinna według wynalazku zawiera fragment mający sekwencję kwasu nukleinowego, która przy powyżej wskazanej homologii odpowiada nukleotydom od 153 do 3258 RNA 1 tego wirusa.

Ponadto korzystnie w komórce roślinnej według wynalazku długość fragmentu wynosi 100 - 1000 zasad.

Korzystniej komórka roślinna według wynalazku zawiera fragment mający sekwencję kwasu nukleinowego, która przy powyżej wskazanej homologii odpowiada nukleotydom od 169 do 539, od 1226 do 1683 lub od 2754 do 3192 RNA 1 tego wirusa.

Korzystnie też komórka roślinna według wynalazku zawiera fragment zawierający 6746 nukleotydów.

Korzystnie komórka roślinna według wynalazku stanowi część rośliny buraka cukrowego, która jest oporna na BNYVV.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania powyżej zdefiniowanej komórki roślinnej do regeneracji z niej rośliny buraka cukrowego, która jest oporna na BNYVV.

Ponadto wynalazek dotyczy rośliny buraka cukrowego wykazującej oporność na BNYVV, która cechuje się tym, że składa się z powyżej zdefiniowanych komórek roślinnych.

Ponadto wynalazek dotyczy opornego na BNYVV potomstwa powyżej zdefiniowanej rośliny buraka cukrowego, które cechuje się tym, że składa się co najmniej częściowo z powyżej zdefiniowanych komórek roślinnych.

Ponadto wynalazek dotyczy nasion rośliny buraka cukrowego, będących potomstwem powyżej zdefiniowanej rośliny buraka cukrowego, które cechują się tym, że składają się co najmniej częściowo z powyżej zdefiniowanych komórek roś linnych i mogą być zregenerowane w roślinę wykazującą oporność na BNYVV.

Ponadto wynalazek dotyczy wegetatywnych struktur do reprodukcji, takich jak kalusy, pąki, zarodki z powyżej zdefiniowanej rośliny buraka cukrowego lub powyżej zdefiniowanego potomstwa, które cechują się tym, że składają się co najmniej częściowo z powyżej zdefiniowanych komórek roślinnych i mogą być zregenerowane w roślinę wykazującą oporność na BNYVV.

Określenie homologia czyli „stopień podobieństwa stosuje się w celu określenia sekwencji kwasów nukleinowych, które przy składaniu mają podobne (identycznie lub konserwatywnie podstawione) nukleotydy w podobnych pozycjach lub regionach. Na przykład dwie sekwencje nukleotydowe o homologii co najmniej 85% wzglę dem siebie, mają co najmniej 85% homologicznych (identycznych lub konserwatywnie podstawionych nukleotydów) w podobnej pozycji, gdy są optymalnie składane, co pozwala na wystąpienie do trzech przerw, z tym, że przerwy łącznie dotyczą nie więcej niż 15 reszt aminokwasów. Stopień podobieństwa można określić z zastosowaniem sposobów dobrze znanych w dziedzinie (patrz na przykł ad Wilbur, W.J. i Lipman, D.J. „Rapid Similarity Searches of Nucleic Acid and Protein Data Banks Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80, 726-730 (1983) i Myers, E. i Miller, M. „Optimal Alignments in Linear Space. Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1998). Jeden program, który można zastosować do określenia podobieństwa, stanowi metoda jednej pary

PL 202 048 B1

MegAlign Lipmana-Pearsona (z użyciem parametrów domyślnych). Program ten można uzyskać od

DNAstar Inc, 1228, Selfpark Street, Madison, Wisconsin, 53715 USA jako część systemu Lasergene.

Test homologii sekwencji opiera się na procentowej identyczności, którą oblicza się za pomocą Fast

DB w oparciu o następujące parametry: kara za niesparowanie 1,0, kara za przerwę (1,00), kara za wielkość przerwy 0,33 i kara za łączenie 30,0.

Wynalazek obejmuje także DNA, który hybrydyzuje do DNA według wynalazku i który koduje RNA 1. Korzystnie taka hybrydyzacja zachodzi w warunkach niskiej i wysokiej ostrości, lub między takimi warunkami. Ogólnie, warunki niskiej ostrości można zdefiniować jako 3 x SSC w temperaturze od zbliżonej do temperatury pokojowej do około 65°C, a warunki o wysokiej ostrości jako 0,1 x SSC w okoł o 65°C. SSC stanowi nazwę buforu 0,15M NaCl, 0,015M tricytrynian sodu. 3 x SSC jest wię c trzy razy silniejszy niż SSC i tak dalej.

Fragment może być wprowadzany do zdolnej do regeneracji komórki roślinnej za pomocą wektora DNA zawierającego ten fragment i połączone z nim funkcjonalnie sekwencje regulujące transkrypcję i translację, z zastosowaniem standardowych sposobów transformacji roślin, takich jak transformacja komórek w tkankach roślinnych, takich jak liścienie, za pomocą Agrobacterium (Krens i inni, Plant Science 116: 97-106; 1996) lub pośredniczone przez glikol polietylenowy wchłanianie DNA z przez pojedyncze komórki, takie jak protoplasty komórek „strażników (Hall i inni, Nature Biotechnology 14: 1133-1138; 1996). Wektor DNA zawierający fragment jest także objęty zakresem wynalazku.

Stosowanie konstruktów tak skonstruowanych, że sekwencja genu hamuje lub wzmaga ekspresję genu jest dość dobrze zrozumiane. Całkowita sekwencja genu, pod kontrolą promotora, który skutecznie działa w roślinie, na ogół będzie nadeksprymować produkt genu, powodując amplifikację efektu tak otrzymanego białka. Czasem produkt genu jest obniżony: to zjawisko jest określane jako „kosupresja. Obniżenie poziomu tego genu można uzyskać za pomocą kilku technik. Obniżenie to można uzyskać za pomocą konstruktów „dominantowo-negatywnych. Zawierają one specyficzną domenę wiążącą DNA oraz ewentualnie domeny dimeryzacji, lecz są transkrypcyjnie nieczynne. „Siedzą one na promotorach docelowych genów i w ten sposób zapobiegają wiązaniu endogennego białka. Dodatkowo obniżenie produktu genu można też uzyskać przez stosowanie takich mutacji dominantowonegatywnych lub przez odwrócenie orientacji sekwencji genu względem promotora, tak że produkuje on typ produktu genu zwany „antysensownym RNA informacyjnym.

Konstrukt DNA według wynalazku może być konstruktem „antysensownym generującym „antysensowny RNA lub konstruktem „sensownym (kodującym co najmniej część funkcjonalnego białka) generującym „sensowny RNA.

„Antysensowny RNA jest sekwencją RNA, która jest komplementarna do sekwencji zasad w odpowiadającym mRNA: komplementarna w tym sensie, ż e każda zasada (lub większość zasad) w sekwencji antysensownej (czytanej w kierunku 3' do 5') jest zdolna do parowania z odpowiednią zasadą (G z C, A z U) w sekwencji mRNA czytanej w kierunku 5' do 3'. Taki antysensowny RNA może być produkowany w komórce przez transformację za pomocą odpowiedniego konstruktu DNA umieszczonego by wygenerował transkrypt z co najmniej częścią swojej sekwencji komplementarną do co najmniej części nici kodującej odpowiedniego genu (lub sekwencją DNA wykazującą znaczną do niej homologię).

„Sensowny RNA jest sekwencją RNA, która jest zasadniczo homologiczna do co najmniej części odpowiadającej sekwencji mRNA. Taki sensowny RNA może być produkowany w komórce przez transformację za pomocą odpowiedniego konstruktu DNA umieszczonego w normalnej orientacji tak by wygenerował transkrypt z sekwencją identyczną do co najmniej części nici kodującej odpowiedniego genu (lub sekwencją DNA wykazującą znaczną do niej homologię). Odpowiednie konstrukty sensowne mogą być stosowane do hamowania ekspresji genów (jak opisano w WO 91/08299).

Konstrukty DNA według wynalazku mogą zawierać sekwencję zasad o długości co najmniej 10 zasad (korzystnie co najmniej 35 zasad) do transkrypcji w RNA. Nie ma teoretycznej górnej granicy sekwencji zasad - sekwencja może być tak długa jak odpowiedni mRNA produkowany przez komórkę ale dla wygody na ogół odpowiednie okaże się stosowanie sekwencji o długości 100 - 1000 zasad. Przygotowanie takich konstruktów zostało opisane poniżej w sposób bardziej szczegółowy.

Jako źródło sekwencji zasad DNA do transkrypcji można stosować odpowiedni cDNA lub genomowy DNA, RNA lub syntetyczny polinukleotyd. Region inicjacji transkrypcji (lub promotor) funkcjonalny w roślinach może być promotorem konstytutywnym (takim jak promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora) lub promotorem indukowalnym lub regulowanym w rozwoju, w zależności od warunków. Odpowiednie sekwencje DNA do kontroli ekspresji genów wyrażanych w roślinach (w tym genów markerowych) takie jak regiony inicjacji transkrypcji, enhancery, sekwencje liderów, nietranskrybowane

PL 202 048 B1 lidery lub tym podobne, mogą pochodzić od dowolnego genu, który ulega ekspresji w komórkach roślinnych. Można także stosować promotory hybrydowe łączące funkcjonalne części różnych promotorów lub ich syntetycznych odpowiedników. Poza promotorami konstytutywnymi do kontroli ekspresji genów zgodnych z wynalazkiem, które mogą ulegać ekspresji, można stosować promotory indukowalne lub promotory regulowane w inny sposób w swoim wzorze ekspresji, np. rozwojowo lub specyficznie w stosunku do typu komórek. Na przykład może być pożądane modyfikowanie aktywności białek w pewnych stadiach rozwoju komórki. Zastosowanie promotora konstytutywnego może wywierać wpływ na poziomy białek i ich funkcje we wszystkich częściach rośliny, podczas gdy zastosowanie tkankowo-specyficznego promotora pozwala na bardziej wybiórczą kontrolę ekspresji genu i funkcji, na które on wpływa.

Inną możliwość według wynalazku stanowi zastosowanie promotorów indukowalnych. Znane są promotory, które są indukowalne przez patogeny, stres, związki chemiczne i sygnały ze środowiska. Indukcja aktywności genu przez wewnętrzną lub zewnętrzną indukcję jest w zakresie wynalazku. Promotory tego typu pozwalają na indukowalność aktywności genu w sposób kontrolowany, tak więc roślina może rozwijać się normalnie bez niepożądanego wpływu ze strony genu transgenicznego. Promotory, które są promotorami indukowalnymi, obejmują te promotory opisane w DE 4446342 (PRP-1 indukowalny przez grzyby i auksynę), WO 96/28561 (PRP-1 indukowalny przez grzyb), EP 0712273 (indukowalne przez nicienie), EP 0330479 i US 5510474 (indukowalne przez stres), WO 96/12814 (indukowalne przez zimno) i promotor indukowalny przez alkohol Zeneca. Inne promotory indukowalne opisano w EP 0494724, EP 0619844, WO 92/19724. Tak więc produkt genu, czy sensowny czy antysensowny RNA czy peptyd, jest jedynie produkowany w tej tkance w momencie, gdy jest wymagana jego aktywność.

Jak wspomniano powyżej, określenie „promotor indukowalny obejmuje promotory, które mogą być indukowane chemicznie. Zastosowanie sekwencji promotora, która jest kontrolowana przez stosowanie zewnętrznego bodźca chemicznego jest najbardziej szczególnie korzystne. Zewnętrzny bodziec chemiczny jest korzystnie rolniczo akceptowanym związkiem chemicznym, którego stosowanie jest zgodne z praktyką rolniczą i nie szkodzi roślinom ani ssakom. Najbardziej korzystnie region promotora indukowalnego zawiera indukowalny system promotora przełącznikowego, taki jak na przykład dwuskładnikowy system, taki jak system promotora przełącznikowego genu alcA/alcR opisany w WO 93/21334, system ekdyzonu przełącznikowego, opisany w WO 96/37609 lub promotor GST opisany w WO 90/08826 i WO 93/031294. Takie układy promotorów są tu określane jako „promotory przełącznikowe. Chemikalia do przełączenia stosowane w połączeniu z promotorami przełącznikowymi są związkami dopuszczalnymi w rolnictwie, co czyni ten system szczególnie przydatnym w sposobie według wynalazku.

Fachowiec będzie w stanie wybrać wektor DNA do stosowania w tych sposobach. Przykładem odpowiedniego wektora do transformacji pośredniczonej przez Agrobacterium jest pBIN19. Odpowiednie wektory do transformacji pośredniczonej przez PEG obejmują wektor pBluescript lub pIGPD7 (Hall i inni, Nature Biotechnology 14: 1133-1138; 1996). Wprowadzenie fragmentu do tych wektorów można osiągnąć za pomocą standardowych technik biologii molekularnej, jak na przykład tych opisanych w Sambrook i inni, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Stransformowane rośliny otrzymane sposobem według wynalazku wykazują absolutną oporność lub odporność na BNYVV. Poprzednie próby nadania roślinom oporności na BNYVV (Kallerhof i inni, Plant Cell Reports 9: 224-228, 1990 i Mannerlof i inni, Euphytica 90: 293-299, 1996) lub na inne wirusy, takie jak wirus mozaiki tytoniowej (TMV) (Donson i inni, Mol. Plant-Microbe Interact. 6: 635-642; 1993) przez transformację roślin częściami genomu wirusowego były mniej udane. Zaszczepione liście nadal wykazywały objawy zakażenia, co wskazywało iż oporność nie jest absolutna. Zatem zaskakujące jest to, sposób według wynalazku jest zdolny do nadania absolutnej oporności na BNYVV roślinom buraka cukrowego.

W korzystnej postaci wynalazku opisana w opisie oporność można łączyć z innymi typami oporności lub tolerancji na BNYVV.

Wynalazek będzie dalej zilustrowany w następujących przykładach i figurach, lecz nie jest do nich ograniczony.

Fig. 1 przedstawia schematycznie genomową organizację wirusa nekrotycznej żółtaczki nerwów buraka (BNYVV) (w oparciu o Jupin i inni, Seminars in Virology, tom 2.2:112-129; 1991).

Fig. 2 przedstawia mapy fizyczne pVDH239 i pVDH240. LB = lewa granica, RB = prawa granica, P35S = promotor 35S CaMV, NPTII = fosfotransferaza II neomycyny, T35S = sygnał poliadenylacji

PL 202 048 B1

35S CaMV, GUSINT = gen β-glukuronidazy, BNYWpolTRUNC = fragment cDNA1 BNYVV, Tnos = sygnał poliadenylacji pochodzący z genu syntazy nopaliny. Zaznaczono pozycje głównych miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne.

Fig. 3 przedstawia analizę metodą Southern blot, za pomocą której określono liczbę wstawek T-DNA wintegrowanych do genomu pierwotnego transformanta buraka cukrowego T157-01. U góry przedstawiono zarys struktury T-DNA binarnego wektora pVDH239.

Fig. 4 przedstawia schematy poszczególnych wartości ELISA wyciągów z korzeni roślin buraka cukrowego populacji Cadyx (kontrola wrażliwa), Rifle (odmiana tolerancyjna w stosunku do rizomanii), Rhizor (odmiana tolerancyjna w stosunku do rizomanii) i T157-91 (GUS-dodatni rośliny F1) po zaszczepieniu ziemią zakażoną BNYVV. Każdy numer na osi poziomej przedstawia pojedynczą roślinę.

Fig. 5B przedstawia analizę metodą Southern blot, za pomocą której oceniono liczbę wstawek T-DNA wintegrowanych do genomu roślin potomnych F1 T157-01 jak również schemat poszczególnych wartości ELISA wyciągów z korzeni z roślin potomnych F1 T157-01) po zaszczepieniu ziemią zakażoną BNYVV (Fig. 5A). Liczby na górze biotów Southern przedstawiają kody laboratoryjne poszczególnych roślin potomnych F1. Wartości ELISA wskazywane przez „genotyp 1 w dolnym panelu odpowiadają osobnikom wykazującym pojedynczy prążek na blocie Southern (2012, 2019, 2021, 2029, 2030, 2031, 2034, 2035, 2038, 2042, 2044, 2046, 2051, 2052, 2061, 2066, 2068, 2069), a wartości ELISA wykazywane przez „genotyp 2 + 3 w dolnym panelu odpowiadają osobnikom wykazującym dwa lub trzy prążki na blocie Southern (1999, 2000, 2001, 2007, 2008, 2011, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018 ,2020, 2022, 2023, 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2032, 2033, 2036, 2037, 2039, 2040, 2041, 2043, 2045, 2047, 2048, 2049, 2050, 2053, 2054, 2055, 2056, 2057, 2058, 2059, 2060, 2062, 2063, 2064, 2065, 2067, 2070). Wartości ELISA wskazywane przez „segreganty GUS(-) w dolnym panelu odpowiadają indywidualnym roślinom potomnym F1, które są GUS-ujemne (1997, 1998, 2002, 2004, 2005, 2006, 2009, reszty nieprzedstawiono).

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Przygotowanie konstruktu ze skróconą sekwencją replikazy BNYVV

W celu uzyskania klonów cDNA BNYVV do klonowania w wektorze transformacyjnym zastosowano dwie kombinacje starterów (Bouzoubaa i inni, J. Gen. Virol. 68:615-626; 1987).

W przypadku końca 5' jako startery zastosowano

P1: 5'-CGCGGATCCACCATGGCAGATTCGTTC-3' (zawierający miejsca restrykcyjne BamHI i Ncol i nukleotydy identyczne do nukleotydów 153-168) i

P2: 5'-GACGAATTCAAGTCGTCTTTC-3' (miejsce restrykcyjne EcoRI i nukleotydy komplementarne do nukleotydów 288-301).

W przypadku końca 3' jako startery zastosowano

P3: 5'-GACGAATTCGAAAGATGAGTCTA-3' (miejsce EcoRI i nukleotydy identyczne do nukleotydów 2799-2812) i

P4: 5'-CGCAGATCTTTAACTGCTCATCACCAAC-3' (miejsce Bglll i nukleotydy komplementarne do nukleotydów 3244-3258 oraz kodon stop).

Przed sklonowaniem fragmentów do wektora Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA, USA) miejsce Sall/Hincll/Accl zastąpiono miejscem Bglll. Po amplifikacji cDNA BNYVV z użyciem P1 i P2 otrzymano fragment DNA, który strawiono BamHI i EcoRI i wstawiono do zmodyfikowanego wektora pBluescript strawionego BamHl/EcoRI, z otrzymaniem pKSNBPoll. Następnie cDNA1 BNYVV zamplifikowano z użyciem P3 i P4. Otrzymany fragment DNA strawiono EcoRI i Bglll i wstawiono do pKSBNPol1 strawionego EcoRI i Bglll, z otrzymaniem pKSNBPpol2.

Następnie fragment AccI cDNA1 BNYVV identyczny do nukleotydów 250 - 2815 wklonowano w pKSBNPol2 strawiony AccI. Tak otrzymano pKSBNPoltrunc, który zawierał fragment cDNA1 BNYVV („poltrunc) identyczny do nukleotydów 153-3258, oflankowany przez miejsce BamHI na końcu 5' i fragment Bglll na końcu 3'. Fragment poltrunc sklonowano jako fragment BamHI-Bglll w miejscu BamHI pVDH4 tak, że funkcjonalny fragment sensowny poltrunc znajdował się za promotorem 35S CaMV i przed sekwencją terminatora nopaliny. Całkowity konstrukt z promotorem 35S CaMV, fragmentem poltrunc i sekwencją terminatora nopaliny wycięto z plazmidu ClaI i sklonowano w binarnym wektorze transformacyjnym pVDH212, w którym miejsce BamHI zmieniono na miejsce ClaI przez wstawienie linkera molekularnego.

pVDH212 stanowi binarny wektor transformacyjny, pochodzący od pBIN19, który zawiera 35S-NPTII (fosfotransferazę neomycyny pod kontrolą promotora 35S CaMV jako selekcyjny gen markero8

PL 202 048 B1 wy nadający oporność na kanamycynę) jak również 35S-GUSi (gen kodujący β-glukuronidazę (Vancanneyt i inni, Mol. Gen. Genet. 220:245-250:1990). W ten sposób otrzymano dwa różne wektory transformacyjne, zawierające konstrukt poltrunc: jeden wektor, pVDH239, z konstruktem poltrunc o takim samym kierunku transkrypcji jak gen NPTII i GUS oraz drugi wektor, pVDH240, z konstruktem poltrunc o przeciwnym kierunku transkrypcji. Binarne wektory transformacyjne pVDH239 i 240 (Fig. 2) skoniugowano i przeniesiono do Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Phabagen Collection, Utrecht, Holandia), w wyniku czego otrzymano szczepy HAT1239 (dla pVDH239) i HAT1240 (dla pVDH240). HAT1239 i HAT1240 zastosowano do transformacji buraka cukrowego.

P r z y k ł a d 2

Transformacja buraka cukrowego

Metody transformacji pośredniczone przez Agrobacterium z zastosowaniem binarnych wektorów są dobrze znane fachowcowi.

Aby uzyskać stransformowane rośliny buraka cukrowego, rośliny B8M5.9 typu O transformowano zgodnie z Krensem i innymi (Plant Science 116: 97-106; 1996). W wyniku transformacji Agrobacterium HAT1239 otrzymano 8 transformantów: T156-03, T156-06, T156-09, T156-10, T156-13, T156-20, T156-30 i T157-01, a z Agrobacterium HAT1240 otrzymano 12 transformantów: T183-01, T183-02, T183-06, T183-10, T183-16, T183-19, T183-21, T183-23, T183-26, T184-02, T183-03 i T184-04. Kwitnienie transformantów wywołano na drodze wernalizacji i transformanty zastosowano do produkcji nasion poprzez samozapylenie (nasiona samozapylające się lub S1) lub zapylenie krzyżowe na sterylnych roślinach męskich (nasiona hybrydowe lub F1). Zapylanie przeprowadzono w zamkniętych komorach pyłkowych, aby zapobiec zapylaniu buraka cukrowego przez pyłek z innego źródła.

W celu przeprowadzenia próby biologicznej dla określenia oporności na BNYVV jako materiał wyjściowy użyto nasiona F1. Siewki badano początkowo pod kątem aktywności GUS, co wskazuje na obecność T-DNA. Jako ujemną próbkę kontrolną w próbie biologicznej użyto segregantów GUS-ujemnych. W zależności od całkowitej liczby wstawek T-DNA oporność, o ile jest obecna, może doprowadzić do segregacji w obrębie populacji GUS-dodatniej. Tylko potomstwo pochodzące od T157-01 wykazywało oporność na BNYVV.

Następnie pierwotny transformant T157-01 dalej analizowano techniką Southern blot. Genomowy DNA wyizolowano z liści, strawiono oddzielnie EcoRI, BamHI i SacI i użyto do przygotowania blotów Southern, który następnie hybrydyzowano z sondą GUS. Z tego doświadczenia wywnioskowano, że pierwotny transformant zawierał trzy wstawki T-DNA (Fig. 3).

P r z y k ł a d 3

Próba biologiczna

Opracowano próbę biologiczną z użyciem bocznych korzeni, jako test dla pojedynczej rośliny w celu selekcji roślin buraka cukrowego opornych na rizomanię. Roślinki jednotygodniowe przeniesiono do standardowej mieszaniny 10% gleby zakażonej rizomanią i dalej inkubowano przez 4 tygodnie. Warunki zakażenia optymalizowano i standaryzowano na poziomie presji infekcyjnej i wzrostu korzonków (tylko wytwarzanie korzeni włochatych). Zastosowano następujące warunki inkubacji: 18,9-19°C dzień/noc, względna wilgotność: 70%, 10000 luksów białego światła, doniczki w odległości 32,5 cm od lamp.

Ilość wirusa w korzonkach, która była bezpośrednio skorelowana z mechanizmem oporności w roślinie, mierzono metodą ELISA. Wartość odcięcia dla roślin opornych umieszczono przy wartości OD 0,2 (Clark i inni, J. Virol. Meth. 15:213-222; 1987). Cztery tygodnie po przeniesieniu w celu przeprowadzenia ELISA użyto dolnej części korzeni. Kawałek korzenia wysuszono na bibule filtracyjnej i przeniesiono do moździerza. Dodano buforu do ekstrakcji w ilości 10 równ. objęt. masy korzeni (rozcieńczenie 1/10). Sok wyekstrahowano z korzeni poprzez ręczne zgniatanie. Sok przeniesiono do 1,5 ml probówek i odwirowano (300 obr./min., 10 minut), supernatanty utrzymywano na lodzie i poddano analizie. Badano następujące populacje:

Populacja	Liczba roślin	Uwagi
T 157-01 (F1)	73	rośliny GUS(+)
Cadyx F 052	26	kontrola wrażliwa
Rhizor F 202	27	kontrola tolerancyjna
Rifle	28	kontrola tolerancyjna

PL 202 048 B1

W grupie roślin T157-01 GUS(+) można było zaobserwować dwie kategorie (Fig. 4). Jedna kategoria wykazuje odporność na BNYVV (odcięcie ELISA 0,2) ze średnią wartością ELISA 0,006, stanowiącą poziom tła układu doświadczalnego. Druga kategoria wykazuje normalną wrażliwość ze średnią wartością ELISA w zakresie wrażliwej kontroli.

Presja infekcyjna w tej próbie biologicznej była wysoka ze względu na przyrost temperatury w czasie części okresu zakażenia. W efekcie nie było wyraźnych różnic pomiędzy Cadyx i Rizor/Rifle (Fig. 4). Z drugiej strony oporne rośliny wybrane w potomstwie F1 T157-01 można uznać za całkowicie oporne niezależnie od presji infekcyjnej związanej z rizomanią (Fig. 4). Na koniec wprowadzenie konstruktu zawierającego fragment cDNA1 BNYVV doprowadziło do dramatycznie negatywnego wpływu na namnażanie się BNYVV w bocznych korzeniach zakażonych transgenicznych roślin buraka cukrowego, co skutecznie zapewniło całkowitą oporność roślin na rizomanię.

W celu wyjaś nienia segregacji populacji GUS(+) we wraż liwej i opornej kategorii przebadano pojedyncze rośliny w oddzielnym doświadczeniu pod kątem ich oporności na BNYVV i jednocześnie na obecność T-DNA na drodze analizy techniką Southern z użyciem SacI jako enzymu restrykcyjnego i GUS jako sondy. Wyniki, przedstawione na fig. 5A i 5B, wskazują, że w obrębie tej populacji wszystkie rośliny GUS(+), które zawierały pojedynczy prążek na blocie Southern, były wrażliwe (średnia wartość ELISA 0,63), zaś wszystkie rośliny GUS(+), które zawierały dwa lub trzy prążki na blocie Southern, były oporne (średnia wartość ELISA 0,21). Wszystkie segreganty GUS(-) były wrażliwe (średnia wartość ELISA 0,80). Jak widać fenotyp opornościowy wiąże się z obecnością górnego i dolnego prążka tego konkretnego układu prążków, uzyskanego techniką Southern blot, podczas gdy obecność środkowego prążka nie wiąże się z fenotypem opornościowym. Zatem należy dojść do wniosku, że segregację populacji GUS(+) do wrażliwej i opornej kategorii można wyjaśnić poprzez fakt, że jeden z T-DNA, który moż e dać w efekcie fenotyp GUS(+), nie wp ł ywa na oporność na BNYVV.

PL 202 048 B1

	Wykaz sekwencji
<110>	SES Europę N.V./S.A.
<120>	Sposób nadawania oporności na wirusa nekrotycznej żółtaczki nerwów buraka (BNYW) roślinie buraka cukrowego, wektor transformacyjny do nadawania roślinie oporności na BNYW, jego zastosowanie, komórka roślinna wykazująca oporność na BNYW, jej zastosowanie, roślina buraka cukrowego wykazująca oporność na BNYW, oporne na BNYW potomstwo rośliny buraka cukrowego i wegetatywne struktury do reprodukcj i.
<130>	seseurope4seqlist
<140>	PCT/EP00/00609
<141>	2000-01-26
<150>	EP 992002360
<151>	1999-01-27
<160>	4
<170>	Patentln wersja 2.1
<210>	1
<211>	27
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>
<223>	Opis sekwencji sztucznej: starter PI
<400>	1

cgcggatcca ccatggcaga ttcgttc 27

<210>	2
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>
<223>	Opis sekwencji sztucznej: starter P2

PL 202 048 B1 <400> 2 gacgaattca agtcgtcttt c 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P3 <400> 3 gacgaattcg aaagatgagt eta 23 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P4 <400> 4 egeagatett taactgctca tcaccaac 28

Claims

1. Sposób nadawania oporności na wirusa nekrotycznej żółtaczki nerwów buraka (BNYVV) roślinie buraka cukrowego, znamienny tym, że w kolejnych etapach:

(a) przygotowuje się fragment DNA złożony z co najmniej 15 nukleotydów o sekwencji, która jest co najmniej w 70% homologiczna z odpowiednią sekwencją nukleotydową genomowego RNA 1 wirusa nekrotycznej żółtaczki nerwów buraka (BNYVV), (b) wprowadza się ten fragment DNA połączony funkcjonalnie z promotorem, który jest aktywny w roślinach buraka cukrowego, do komórki buraka cukrowego, z wytworzeniem stransformowanej komórki buraka cukrowego; i (c) regeneruje się transgeniczną roślinę buraka cukrowego z tej transformowanej komórki buraka cukrowego.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ten fragment DNA jest co najmniej w 80%, korzystnie co najmniej w 90%, korzystniej co najmniej w 95% homologiczny z odpowiednią sekwencją nukleotydową genomowego RNA 1 tego wirusa.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że długość fragmentu DNA wynosi co najmniej 35 zasad.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że ten fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 1 i 2 odpowiada nukleotydom od 153 do 3258 RNA 1 tego wirusa.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że długość tego fragmentu wynosi 100 - 1000 zasad.

PL 202 048 B1

6. Sposób wedł ug zastrz. 5, znamienny tym, ż e fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 1 i 2 odpowiada nukleotydom od 169 do 539 RNA 1 tego wirusa.

7. Sposób wedł ug zastrz. 5, znamienny tym, ż e ten fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 1 i 2 odpowiada nukleotydom od 1226 do 1683 RNA 1 tego wirusa.

8. Sposób wedł ug zastrz. 5, znamienny tym, ż e ten fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 1 i 2 odpowiada nukleotydom od 2754 do 3192 RNA 1 tego wirusa.

9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że ten fragment zawiera 6746 nukleotydów.

10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8 albo 9, znamienny tym, że ten fragment wprowadza się do komórki z użyciem wektora DNA zawierającego ten fragment i połączone z nim funkcjonalnie sekwencje regulujące transkrypcję i translację.

11. Wektor transformacyjny do nadawania roślinie oporności na BNYVV, znamienny tym, że zawiera fragment złożony z co najmniej 15 nukleotydów o sekwencji, która jest co najmniej w 70% homologiczna z odpowiednią sekwencją nukleotydów genomowego RNA 1 wirusa nekrotycznej żółtaczki nerwów (BNYVV), który jest funkcjonalnie połączony z promotorem aktywnym w roślinach buraka cukrowego.

12. Wektor według zastrz. 11, znamienny tym, że ten fragment DNA jest co najmniej w 80%, korzystnie co najmniej w 90%, korzystniej co najmniej w 95% homologiczny z odpowiednią sekwencją nukleotydową genomowego RNA 1 tego wirusa.

13. Wektor według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że długość tego fragmentu DNA wynosi co najmniej 35 zasad.

14. Wektor według zastrz. 11 albo 12, albo 13, znamienny tym, że ten fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 11 i 12 odpowiada nukleotydom od 153 do 3258 RNA 1 tego wirusa.

15. Wektor według zastrz. 11 albo 12, albo 13, znamienny tym, że długość tego fragmentu wynosi 100 - 1000 zasad.

16. Wektor według zastrz. 15, znamienny tym, że ten fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 11 i 12 odpowiada nukleotydom od 169 do 539 RNA 1 tego wirusa.

17. Wektor według zastrz. 15, znamienny tym, że ten fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 11 i 12 odpowiada nukleotydom od 1226 do 1683 RNA 1 tego wirusa.

18. Wektor według zastrz. 15, znamienny tym, że ten fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 11 i 12 odpowiada nukleotydom od 2754 do 3192 RNA 1 tego wirusa.

19. Wektor według zastrz. 11 albo 12, albo 13, znamienny tym, że ten fragment zawiera 6746 nukleotydów.

20. Zastosowanie wektora zdefiniowanego w zastrz. 11 - 19 do transformacji komórki roślinnej.

21. Komórka roślinna wykazująca oporność na BNYVV, znamienna tym, że zawiera w swoim genomie fragment DNA złożony z co najmniej 15 nukleotydów o sekwencji, która jest co najmniej w 70% homologiczna z odpowiednią sekwencją nukleotydową genomowego RNA 1 tego wirusa.

22. Komórka roślinna według zastrz. 21, znamienna tym, że ten fragment DNA jest co najmniej w 80%, korzystnie co najmniej w 90%, korzystniej co najmniej w 95% homologiczny z odpowiednią sekwencją nukleotydową genomowego RNA 1 tego wirusa .

23. Komórka roślinna według zastrz. 21 albo 22, znamienna tym, że długość tego fragmentu DNA wynosi co najmniej 35 zasad.

24. Komórka roślinna według zastrz. 21 albo 22, albo 23, znamienna tym, że ten fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 21 i 22 odpowiada nukleotydom od 153 do 3258 RNA 1 tego wirusa.

25. Komórka roślinna według zastrz. 21 albo 22, albo 23, znamienna tym, że długość tego fragmentu wynosi 100 - 1000 zasad.

PL 202 048 B1

26. Komórka roślinna według zastrz. 25, znamienna tym, że ten fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 21 i 22 odpowiada nukleotydom od 169 do 539 RNA 1 tego wirusa.

27. Komórka roślinna według zastrz. 25, znamienna tym, że ten fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 21 i 22 odpowiada nukleotydom od 1226 do 1683 RNA 1 tego wirusa.

28. Komórka roślinna według zastrz. 25, znamienna tym, że ten fragment ma sekwencję kwasu nukleinowego, która przy homologii wskazanej w zastrz. 21 i 22 odpowiada nukleotydom od 2754 do 3192 RNA 1 tego wirusa.

29. Komórka roślinna według zastrz. 21 albo 22, albo 23, znamienna tym, że fragment zawiera 6746 nukleotydów.

30. Komórka roślinna według zastrz. 21 albo 22, albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28 albo 29, znamienna tym, że stanowi część rośliny buraka cukrowego, która jest oporna na BNYVV.

31. Zastosowanie komórki roślinnej zdefiniowanej w zastrz. 21 - 29, do regeneracji z niej rośliny buraka cukrowego, która jest oporna na BNYVV.

32. Roślina buraka cukrowego wykazująca oporność na BNYVV, znamienna tym, że składa się z komórek roś linnych zdefiniowanych w zastrz. 21 - 29.

33. Oporne na BNYVV potomstwo rośliny buraka cukrowego zdefiniowanej w zastrz. 32, znamienne tym, że to potomstwo składa się co najmniej częściowo z komórek roślinnych zdefiniowanych w zastrz. 21 - 29.

34. Nasiona rośliny buraka cukrowego będące potomstwem rośliny buraka cukrowego zdefiniowanym w zastrz. 33, znamienne tym, że składają się co najmniej częściowo z komórek roślinnych zdefiniowanych w zastrz. 21 - 29 i mogą być zregenerowane w roślinę wykazującą oporność na BNYVV.

35. Wegetatywne struktury do reprodukcji, takie jak kalusy, pąki, zarodki z rośliny buraka cukrowego zdefiniowanej w zastrz. 32 lub potomstwa zdefiniowanego w zastrz. 33, znamienne tym, że składają się co najmniej częściowo z komórek roślinnych zdefiniowanych w zastrz. 21 - 29 i mogą być zregenerowane w roślinę wykazującą oporność na BNYVV.