WO2015122546A1 - ダイズ第３番染色体に座上する耐塩性を制御する遺伝子ｑＮａＣｌ３とその利用法 - Google Patents

ダイズ第３番染色体に座上する耐塩性を制御する遺伝子ｑＮａＣｌ３とその利用法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015122546A1
WO2015122546A1 PCT/JP2015/054896 JP2015054896W WO2015122546A1 WO 2015122546 A1 WO2015122546 A1 WO 2015122546A1 JP 2015054896 W JP2015054896 W JP 2015054896W WO 2015122546 A1 WO2015122546 A1 WO 2015122546A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
plant
salt
qnacl3
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/054896
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
東河 許
ドゥ ドゥク トゥエン
ホァタウ チェン
真理子 庄野
山田　哲也
雅志 佐藤
Original Assignee
独立行政法人国際農林水産業研究センター
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人国際農林水産業研究センター filed Critical 独立行政法人国際農林水産業研究センター
Priority to CN201580009062.1A priority Critical patent/CN106029883A/zh
Publication of WO2015122546A1 publication Critical patent/WO2015122546A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Definitions

  • the present invention relates to a gene that controls salt tolerance in soybean and a method for using the same.
  • Soybean is one of the world's most important leguminous crops, and its use is wide-ranging as a major protein and oil source.
  • soybean productivity is lower than that of gramineous crops such as rice and corn, and is unstable due to the effects of various environmental stresses.
  • Salt damage affects the germination and growth of soybean and nodulation, and yield reduction has been reported.
  • about one third of the world's irrigated arable land is affected by soil salinization.
  • salt accumulation areas are expanding due to water shortage and poor irrigation.
  • salt damage caused by inflow of seawater has been reported due to the Great East Japan Earthquake that occurred on March 11, 2011.
  • the present invention provides a soybean salt tolerance gene qNaCl3 and a protein encoded by the gene. Furthermore, another object of the present invention is to provide gene utilization technology such as production of salt-tolerant plants. By solving these problems, not only the elucidation of the expression mechanism of soybean salt tolerance is promoted, but also it can greatly contribute to the establishment of new salt tolerance varieties using isolated genes.
  • the present inventors have found that the qNaCl3 gene derived from soybean is a causative gene of soybean salt tolerance, and the salt tolerance of soybean is improved by excessively expressing the qNaCl3 gene in a salt-sensitive soybean variety. The present inventors have found that development of salt-tolerant varieties higher than existing salt-tolerant soybean varieties can be expected.
  • a salt-tolerant DNA marker can be developed based on the DNA information of the isolated qNaCl3 gene and used as a DNA marker for breeding salt-tolerant soybeans. Furthermore, by using this gene and its similar genes, transformants with improved salt tolerance can be produced not only for soybeans but also for other legume crops and cereal crops, making it possible to develop varieties leading to increased yield. That is, the present invention is as follows.
  • a gene comprising any of the following DNAs (a) to (f): (A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3; (B) encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and has Na + / H + antiporter activity DNA to do; (C) DNA consisting of a base sequence having 90% or more sequence identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and encoding a protein having Na + / H + antiporter activity; (D) DNA comprising a degenerate isomer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3; (E) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; and (f) one or several amino acids are substituted, deleted and / or deleted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the gene according to [1] which is a qNaCl3 gene encoding a protein having Na + / H + antiporter activity that controls salt tolerance of plants.
  • [4] A transformed plant with improved salt stress tolerance, transformed with the plant transformation vector according to [3].
  • a method for improving the salt stress tolerance of a plant by introducing the gene of [1] or [2] into the plant.
  • SSR25.8 is detected using a primer pair consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a primer pair consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6, and SSR55.5 is a primer and sequence consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7
  • any of the following SSR marker primer pairs for detecting the qNaCl3 gene (I) a primer pair of a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6; and (ii) a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7 and a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 Primer pair.
  • a method for breeding a plant having salt tolerance wherein a plant not having an insertion fragment of about 3.8 kb consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 downstream of exon 3 of the qNaCl3 gene is made salt resistant.
  • [15] A primer pair for detecting an insertion of about 3.8 kb downstream of exon 3 of the qNaCl3 gene.
  • the primer pair of [15] comprising a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 and a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • FIG. 1 is a diagram showing a physical map (FIG. 1A) showing the position of QTL (quantitative trait locus) on chromosome 3 by high-precision QTL analysis of soybean salt tolerance. “*” Indicates a physical position (Mb) on soybean chromosome 3.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of salt tolerance candidate gene qNaCl3 expression analysis in the salt tolerant line NILs18-T and the sensitive line NILs18-S using the RT-PCR method.
  • FIG. 3A is a view showing the base sequence (SEQ ID NO: 1) of the full-length cDNA of qNaCl3 gene synthesized from the salt-tolerant strain NILs18-T by the RACE method.
  • FIG. 1 is a diagram showing a physical map (FIG. 1A) showing the position of QTL (quantitative trait locus) on chromosome 3 by high-precision QTL analysis of soybean salt tolerance. “*” Indicates a physical position (M
  • FIG. 3B shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the protein encoded by the qNaCl3 gene.
  • FIG. 4A-1 is a diagram showing the genomic base sequence (SEQ ID NO: 3) of the salt tolerance gene qNaCl3 in the salt tolerance line NILs18-T (following FIG. 4A-2).
  • FIG. 4A-2 is a diagram showing the genomic base sequence (SEQ ID NO: 3) of the salt tolerance gene qNaCl3 in the salt tolerance strain NILs18-T (continuation of FIG. 4A-1).
  • FIG. 4B-1 is a diagram showing the genomic base sequence (SEQ ID NO: 4) of the salt tolerance gene qNaCl3 in the sensitive strain NILs18-S (continuation of FIG.
  • FIG. 4B-2 is a diagram showing the genomic base sequence (SEQ ID NO: 4) of the salt tolerance gene qNaCl3 in the susceptible strain NILs18-S (continuation of FIG. 4B-1).
  • FIG. 4B-3 is a diagram showing the genomic base sequence (SEQ ID NO: 4) of the salt tolerance gene qNaCl3 in the sensitive strain NILs18-S (continuation of FIG. 4B-2).
  • FIG. 5 is a diagram showing the structures of the qNaCl3 gene of soybean salt-tolerant line NILs18-T (FIG. 5A) and susceptible line NILs18-S (FIG. 5B).
  • FIG. 5 is a diagram showing the structures of the qNaCl3 gene of soybean salt-tolerant line NILs18-T (FIG. 5A) and susceptible line NILs18-S (FIG. 5B).
  • FIG. 6 is a diagram showing the relationship between the real-time quantitative PCR expression level of the soybean salt tolerance gene qNaCl3 and the salt tolerance in 126 soybean cultivars / lines (including wild soybeans) derived from countries around the world.
  • the salt tolerance evaluation was performed with a hydroponic culture solution containing 100 mM NaCl.
  • the salt tolerance index is classified into 5 grades from 1 (weak salt tolerance) to 5 (strong salt tolerance).
  • FIG. 7 is a diagram showing the growth in a NaCl-containing medium of a transformant (qNaCl3 1-5 strain) obtained by introducing the qNaCl3 gene into Na / H + antiporter-deficient yeast mutant (B31).
  • Nha1 indicates the yeast Na + / H + antiporter gene.
  • FIG. 8 shows a target gene after salt stress treatment (100 mM NaCl, 24 h) in a qNaCl3 gene-introduced transgenic soybean line (54-1-1, 34-2-7, 20-1-4, 16-1-8). It is a figure which shows the result of expression analysis.
  • FIG. 8A shows the results of expression analysis by RT-PCR
  • FIG. 8B shows the results of expression level analysis by real-time PCR in terms of relative expression levels.
  • FIG. 9 shows the degree of yellowing of the leaf blades after 14 days of treatment with 100 mM NaCl in a transgenic soybean line (54-1-1, 34-2-7, 20-1-4, 16-1-8) into which the salt tolerance gene qNaCl3 has been introduced. It is a figure which shows the SPAD value of the leaf which showed.
  • FIG. 10 is a diagram showing the growth status of the T2 generation 35S: qNaCl3 transformed soybean line 20-1-4 showing high salt tolerance. The right side of FIG.
  • FIG. 10 shows the growth of a 35S: qNaCl3-transformed soybean line individual into which the target gene has been introduced, and the left side of FIG. 10 shows the growth of an individual (null) that does not have the target gene.
  • FIG. 11 is a diagram showing the growth status (2009) of salt-tolerant lines (NILs25-T) and sensitive lines (NILs25-S) in a salt-damaged field in a near-isogenic line of the salt-tolerant gene qNaCl3 grown by DNA marker selection.
  • the right soybean in FIG. 11 is a salt tolerant line (NILs25-T), and the left soybean is a sensitive line (NILs25-S).
  • FIG. 11 is a diagram showing the growth status (2009) of salt-tolerant lines (NILs25-T) and sensitive lines (NILs25-S) in a salt-damaged field in a near-isogenic line of the salt-tolerant gene qNaCl3 grown by DNA marker selection.
  • the present invention is a gene qNaCl3 that controls salt stress tolerance located on the third chromosome of soybean (Glycine max).
  • the qNaCl3 gene product functions as a Na + / H + antiporter.
  • Na + / H + antiporter is a transporter that carries out opposite transport of Na + and H + through a biological membrane, and is involved in the regulation of intracellular Na + level, pH, cell volume, etc. It is involved in the excretion of Na + that has flowed into cells during stress and the sequestration into vacuoles.
  • Salt stress refers to exposure of plants to salt
  • salt stress tolerance refers to the ability to grow even when exposed to salt, also referred to as salt tolerance.
  • Plants that are not resistant to salt stress and are salt-sensitive exhibit salt damage symptoms such as yellowing of leaves and death due to exposure to salt.
  • the qNaCl3 gene can be identified and isolated by map-based cloning from an approximately 58.8 kb genomic region sandwiched between BARCSOYSSR — 03 — 1338 and BARCSOYSSR — 03 — 1341 of the third chromosome of salt-tolerant soybean cultivars.
  • the qNaCl3 gene has 5 exons in salt-resistant soybean lines, but in soybean lines that have lost salt tolerance and become salt-sensitive, insertion of an approximately 3.8 kb fragment into the downstream portion of exon 3 The function of the gene is lost, and the qNaCl3 gene is mutated to consist of three exons.
  • the qNaCl3 gene is not always induced when exposed to salt, but is always maintained. The greater the expression of the qNaCl3 gene, the greater the salt stress tolerance.
  • the cDNA base sequence of the qNaCl3 gene is shown in SEQ ID NO: 1 and FIG.
  • SEQ ID NO: 2 and FIG. 3B show the amino acid sequence of the protein encoded by the qNaCl3 gene.
  • SEQ ID NO: 3 and FIGS. 4A-1 and 4A-2 show the genomic base sequences of the qNaCl3 gene.
  • the sequence of FIG. 4A-2 follows the sequence of FIG. 4A-1.
  • the DNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 has the activity possessed by each DNA or the activity possessed by the protein encoded by each DNA, that is, salt stress tolerance or Na + / H + antiporter activity. As long as it is, you may have a variation
  • a DNA encoding a protein is also included in the DNA of the present invention.
  • stringent conditions are, for example, conditions of about “1XSSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”, and more severe conditions are “0.5XSSC, 0.1% SDS, 42 ° C.” The condition is about “0.2XSSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”.
  • isolation of DNA having high homology with the probe sequence can be expected as the hybridization conditions become more severe.
  • the combination of the above SSC, SDS and temperature conditions is an example, and the necessary stringency can be realized by appropriately combining the DNA concentration, DNA length, hybridization reaction time, and the like. is there.
  • DNA including a sequence (degenerate sequence) based on the degeneracy of the genetic code in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 is also included.
  • a mutation introduction kit for example, Mutant-
  • a mutation introduction kit using, for example, site-directed mutagenesis is performed by a known method such as the Kunkel method or Gapped duplex method or a method analogous thereto. K (manufactured by TAKARA), Mutant-G (manufactured by TAKARA) or the like, or using LA PCR in vitro Mutagenesis series kits manufactured by TAKARA.
  • homologous genes having high sequence identity and similar functions in other types of plants can be searched.
  • the present invention also encompasses genes of other plant species that are homologous genes of the soybean qNaCl3 gene.
  • a homologous gene of another species having a high nucleotide sequence identity with the soybean qNaCl3 gene is included in the qNaCl3 gene comprising a nucleotide sequence having a mutation in the above base.
  • the cDNA of the qNaCl3 gene of the present invention is also included.
  • it is a protein encoded by the above gene and includes a protein having Na + / H + antiporter activity. 2.
  • a transformed plant having salt stress tolerance can be produced.
  • an indirect introduction method such as an Agrobacterium infection method, a direct introduction such as an electroporation method, a particle gun method, a polyethylene glycol method, a liposome method, a microinjection method, etc. Law.
  • Appropriate introduction methods can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • a transformed plant into which the qNaCl3 gene of the present invention has been introduced can be produced as follows. First, a recombinant vector for transformation is prepared and then transformed with Agrobacterium. A recombinant vector for transformation can be obtained by cleaving DNA containing the qNaCl3 gene of the present invention with an appropriate restriction enzyme, ligating an appropriate linker as necessary, and inserting it into a cloning vector for plant cells. it can.
  • binary vector plasmids such as pBE2113Not, pBI2113Not, pBI2113, pBI101, pBI121, pGA482, pGAH, pBIG, and intermediate vector plasmids such as pLGV23Neo, pNCAT, and pMON200 can be used.
  • the qNaCl3 gene is inserted between the boundary sequences (LB, RB) of the binary vector, and this recombinant vector is amplified in E. coli.
  • the amplified recombinant vector is introduced into Agrobacterium tumefaciens EHA105, C58, LBA4404, EHA101, C58C1Rif R, etc. by electroporation, etc., and Agrobacterium into which the qNaCl3 gene has been introduced is transformed into the plant.
  • Agrobacterium used for transformation containing the qNaCl3 gene of the present invention can be prepared by a three-party joining method (Nucleic Acids Research, 12: 8711 (1984)). That is, E. coli having a plasmid containing the qNaCl3 gene of the present invention or E.
  • coli having a helper plasmid (eg, pRK2013) and Agrobacterium are mixed and cultured on a medium containing rifampicillin and kanamycin.
  • a zygote Agrobacterium can be obtained.
  • promoters examples include cauliflower mosaic virus (CaMV) -derived 35S promoter, maize ubiquitin promoter, nopaline synthase (NOS) gene promoter, octopine (OCT) synthase gene promoter, and the like.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • NOS nopaline synthase
  • OCT octopine synthase gene promoter
  • a virus-derived translation enhancer or a plant-derived translation enhancer can be used as a virus-derived translation enhancer or a plant-derived translation enhancer.
  • translation enhancers derived from viruses include sequences such as tobacco mosaic virus, alfalfa mosaic virus RNA4, bromomosaic virus RNA3, potato virus X, and tobacco etch virus.
  • plant-derived translation enhancers examples include soybean-derived ⁇ -1,3 glucanase (Glu) -derived sequences, tobacco ferredoxin-binding subunit (PsaDb) -derived sequences, and the like.
  • Glu soybean-derived ⁇ -1,3 glucanase
  • PsaDb tobacco ferredoxin-binding subunit
  • the terminator for example, a terminator derived from cauliflower mosaic virus or a nopaline synthase gene can be used.
  • promoters, enhancers, and terminators are not limited to those described above, and any of those that are known to function in plants can be used. These promoter, enhancer, and terminator are linked so that the qNaCl3 gene of the present invention to be expressed can function.
  • Selectable markers include kanamycin resistance gene (NPTII), hygromycin phosphotransferase (http) gene that confers resistance to the antibiotic hygromycin, and phosphinothricin acetyltransferase that confer resistance to bialaphos. bar) gene and the like.
  • NPTII kanamycin resistance gene
  • http hygromycin phosphotransferase
  • http phosphinothricin acetyltransferase that confer resistance to bialaphos. bar
  • the gene of the present invention and the selectable marker gene may be incorporated together in a single vector, or two types of recombinant DNAs incorporated in separate vectors may be used.
  • the host plant into which the qNaCl3 gene of the present invention is introduced is a plant cultured cell, the whole plant of a cultivated plant, a plant organ (eg, leaf, petal, stem, root, rhizome, seed, etc.), or a plant tissue (eg, epidermis, phloem) , Soft tissue, xylem, vascular bundle, etc.).
  • the plant species is not limited, and examples include salt-sensitive soybeans that do not have salt stress tolerance, legume plants other than soybeans, and cereal plants. Examples of legume plants other than soybean include, but are not limited to, azuki bean, kidney bean, chickpea, peanut, pea, and broad bean.
  • Cereal plants include, but are not limited to, rice, corn, wheat, barley, rye, oats, pearl barley, oats, buckwheat, millet, millet, millet and the like. Moreover, both dicotyledonous plants and monocotyledonous plants can be used.
  • salt-sensitive soybeans become resistant to salt stress and can develop varieties with higher salt tolerance than existing salt-tolerant soybean varieties.
  • a transformant having improved salt stress tolerance can be obtained by introducing the qNaCl3 gene of soybean or other plant qNaCl3 gene, which is a homologous gene of soybean qNaCl3 gene, into a legume plant or cereal plant other than soybean. Can do.
  • the gene of the present invention is obtained by introducing a vector into a collected plant section by an Agrobacterium infection method, a particle gun method, a polyethylene glycol method or the like.
  • the host can be transformed.
  • a transformed plant can be produced by introduction into a protoplast by electroporation.
  • the transformant When the qNaCl3 gene is introduced into a plant cell, the transformant can be regenerated from the obtained transformed cell by a known tissue culture method.
  • a plant body can be regenerated from plant cells according to the literature such as “Plant Cell Culture Manual” edited by Yasuyuki Yamada, Kodansha Scientific, 1984.
  • DNA is extracted from these cells and tissues according to a conventional method, and a known PCR method or Southern analysis is performed. It can be carried out by detecting the qNaCl3 gene introduced by using.
  • the transformed plant body of the present invention is based on the T1 generation, such as “T1 generation”, which is the current generation that has been transformed and re-differentiated, as well as progenies obtained from self-propagation and other seeds of the plant, It includes generations and individuals that can be obtained by any means of cultivation and breeding.
  • T1 generation is the current generation that has been transformed and re-differentiated, as well as progenies obtained from self-propagation and other seeds of the plant, It includes generations and individuals that can be obtained by any means of cultivation and breeding.
  • T1 generation is the current generation that has been transformed and re-differentiated, as well as progenies obtained from self-propagation and other seeds of the plant, It includes generations and individuals that can be obtained by any means of cultivation and breeding. 3.
  • Evaluation of tolerance to salt stress of transformed plant The tolerance of the transformed plant introduced with the qNaCl3 gene of the present invention to salt stress is, for example, transformed into a container containing a culture medium containing hydroponic culture solution
  • a hydroponic culture solution containing 100 to 200 mM, preferably 100 to 150 mM NaCl after salt treatment at 20 to 35 ° C. for 1 hour to 30 days, preferably 10 to 20 days, more preferably 14 days. It can be evaluated by examining the survival rate and growth status.
  • the salt tolerance index (STR) and the chlorophyll content (SPAD value) may be examined.
  • the salt tolerance index is determined by visually observing the plant and can be classified into grades 5 (1-5).
  • the chlorophyll content (SPAD value) can be measured with a SPAD value measuring instrument.
  • the chlorophyll content is a value indicating the degree of yellowing of the leaves.
  • Plants into which the qNaCl3 gene of the present invention has been introduced have improved salt stress tolerance. That is, for example, when a plant into which the qNaCl3 gene of the present invention has been introduced and a salt-sensitive line having no salt stress tolerance are cultured in a hydroponic culture solution containing 100 to 150 mM NaCl at 20 to 35 ° C.
  • Plants introduced with the qNaCl3 gene of the present invention have a higher survival rate, improved salt tolerance index, and can maintain leaf chlorophyll content compared to salt-sensitive lines. Furthermore, a plant introduced with the qNaCl3 gene of the present invention has better grain formation than a salt-sensitive line, and the yield per unit area of the field is improved. 4).
  • Marker for use in salt-tolerant plant selection and selection The present invention also includes a marker for salt-tolerant plant selection and a method for selecting or breeding salt-tolerant plants using the marker.
  • markers are used for at least a salt tolerance test performed on a plant selected from a plant group including soybean, a novel gene having a function similar to the Na + / H + antiporter gene (qNaCl3 gene) involved in salt tolerance, soybean It can be used for selection of DNA markers for breeding.
  • a plant having the qNaCl3 gene of the present invention and having salt tolerance can be bred by crossing a plant having the qNaCl3 gene with another plant and selecting a hybrid having the qNaCl3 gene.
  • an arbitrary plant line X and a plant line Y having a qNaCl3 gene are crossed to obtain a hybrid, the obtained hybrid and the plant line X are backcrossed, and a hybrid having a qNaCl3 gene is obtained.
  • the method of selecting and performing backcrossing further is mentioned.
  • the backcrossing and selection are preferably repeated several times, preferably 2 to 10 times.
  • a near-isogenic line having the qNaCl3 gene can be obtained.
  • a plant line having the qNaCl3 gene can be selected using a marker.
  • the marker for selection or breeding of a salt-tolerant plant is a DNA marker comprising a DNA sequence serving as a marker for the location of the qNaCl3 gene of the present invention, and is present in the qNaCl3 gene, adjacent to the qNaCl3 gene, or A DNA marker present in the vicinity may be used.
  • a microsatellite marker can be used as such a DNA marker, and examples of the microsatellite marker include an SSR (simple repetitive sequence) marker.
  • SSR simple repetitive sequence
  • DNA markers located in the vicinity of the qNaCl3 gene include Satt339, Satt237, Satt255, Sat_091 and Sat_304 (known soybean markers, Song et al. (2004) Theor. Appl. Genet. , 109: 122-128). These markers can be detected using, for example, a primer pair specific to the marker.
  • the qNaCl3 gene is present in a genomic region of about 58.8 kb sandwiched between BARCSOYSSR — 03 — 1338 and BARCSOYSSR — 03 — 1341 (FIG. 1).
  • BARCSOYSSR — 03 — 1338 and BARCSOYSSR — 03 — 1341 can also be used as selection markers for salt tolerance genes. Also, newly developed SSR markers SSR25.8 and SSR55.5 can be used, and the following SSR marker primer sets (primer pairs) may be used.
  • Primer set of microsatellite (simple repetitive sequence, SSR) marker (SSR25.8) developed at 5.2 kb upstream of qNaCl3 gene: 5′-TTAAGCACCAGCAAATAGTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 5) and 5′- CGACCAACTATTCCCATATAC-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
  • Primer set of microsatellite (simple repetitive sequence, SSR) marker (SSR55.5) developed at 13 kb downstream of qNaCl3 gene: 5′-TTGGATATAGTAGTGTTCTTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 7) and 5′-AAGAAAAGTGATGTGTACTGA- 3 '(SEQ ID NO: 8).
  • the soybean line has salt tolerance can be tested using the presence or absence of the insert fragment as an indicator, and the salt tolerance having the qNaCl3 gene using the absence of the insert fragment as an indicator It is possible to select and breed soybeans.
  • the presence or absence of the inserted fragment can be detected by using an oligonucleotide that is a partial fragment of the inserted fragment or a complementary sequence thereof, or an oligonucleotide composed of a sequence that can hybridize to these sequences under stringent conditions.
  • the stringent conditions are as described above.
  • the oligonucleotide is a probe or primer and can be designed based on the sequence information of the insertion sequence of about 3.8 kb of SEQ ID NO: 9.
  • a primer is designed based on the base sequences on both sides of the insert fragment, and the presence or absence of the 3.8 kb insert fragment can be detected based on the length of the PCR product.
  • the probe is based on a nucleotide sequence (preferably a DNA fragment) consisting of a base sequence of an insert fragment of qNaCl3 gene, a base sequence complementary to the base sequence, or a sequence that can hybridize to these sequences under stringent conditions.
  • the number of bases is 5 to 50, preferably 10 to 30, and more preferably 10 to 25.
  • the presence or absence of the inserted fragment can be detected by allowing hybridization with a nucleic acid sample obtained from a plant as a subject using the probe.
  • the primer is a primer capable of assaying the presence of an insert fragment of the qNaCl3 gene, for example, a sequence capable of amplifying a region having a sequence containing a part of the qNaCl3 gene.
  • a primer is a primer pair of a forward primer and a reverse primer.
  • the primer consists of a nucleotide sequence (preferably a DNA fragment) consisting of a base sequence of an insert fragment of qNaCl3 gene, a base sequence complementary to the base sequence, or a sequence that can hybridize to these sequences under stringent conditions.
  • the number of bases is 5 to 50, preferably 10 to 30, and more preferably 15 to 25.
  • the presence or absence of the inserted fragment can be detected by PCR using a primer.
  • the present invention includes probes and primers (preferably at least a pair of primer sets) used for detecting an insert fragment of the qNaCl3 gene. It also includes a DNA chip on which a probe is immobilized. Furthermore, a kit for detecting an inserted fragment of qNaCl3 gene including a probe, a DNA chip, a primer and the like is also included.
  • the present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • FIG. 1 shows a high-accuracy quantitative locus (QTL) analysis of soybean salt tolerance. It is a physical map which shows the position of QTL on the 3rd chromosome. Soybean salt-tolerant QTL is present in the 58.8 kb QTL region of FIG. 1, and candidate genes involved in soybean salt tolerance were selected from this 58.8 kb region by map-based cloning.
  • QTL quantitative locus
  • SSR markers Satt255 and Sat_091 in the region Zajo salt tolerance QTL on chromosome 3 are selfed the F 8 generation individuals showed hetero, and SSR marker Satt255 from 1,053 individuals segregating population Chromosome recombination individuals between Sat_091 were selected. As a result, 14 recombinant individuals generated between Satt255 and Sat_091 were obtained. These recombinant individuals were selfed once more to obtain 14 recombinant fixed lines.
  • the putative genes Glyma03g32890 and Glyma03g32900 are found to have regions having a structure similar to the sodium / hydrogen exchanger family, and are considered to be causative genes of salt-tolerant QTL. Subsequently, gene expression was analyzed, and as a result, Glyma03g32900 showed a clear difference between soybean salt-tolerant lines and susceptible lines, and this gene was selected as a candidate gene for soybean salt-tolerance and named qNaCl3.
  • the soybean salt-tolerant line NILs18-T and the sensitive line NILs18-S are grown by DNA selection (Hamwieh et al. (2011) Euphytica, 179: 451-459).
  • RT-PCR reverse Transcription-PCR was performed using PrimeScript TM RT-PCR Kit (TAKARA BIO INC). The primers used were 5'-CCACCAACATGTCACGACTC-3 '(SEQ ID NO: 12) and 5'-ACCCCACGATTGACTAGCAC-3' (SEQ ID NO: 13).
  • the actin gene which is a housekeeping gene was used as a control, and the primers used were 5′-GAGCTCATGAATTGCCTGATGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 14) and 5′-CGTTCATGAATTCCAGTAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 15).
  • PCR Program PTC-100 TM programmable Thermal Controller MJ-Research Inc was subjected to 25 cycles of reaction at 95 ° C / 30 seconds, 56 ° C / 30 seconds, 72 ° C / 30 seconds, and then 72 ° C / 7 minutes extension reaction. I went there. After completion of the reaction, the amplified fragment was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results are shown in FIG. The upper panel of FIG.
  • the qNaCl3 gene shows the expression of the qNaCl3 gene, and the lower panel shows the expression of the actin gene, which is a housekeeping gene.
  • the qNaCl3 gene showed a higher expression tendency in the salt-resistant line than in the sensitive line.
  • the expression level of the qNaCl3 gene in the resistant strain does not show a clear difference between the 100 mM NaCl salt treatment and the control (100 mM NaCl).
  • the resistant strain qNaCl3 gene is not a salt stress inducible gene and is always highly expressed. It was suggested to maintain.
  • the qNaCl3 gene was isolated and identified from the NILs18-T strain, which is a salt-tolerant strain, by the RACE (rapid amplification of cDNA ends) method, and the nucleotide sequence of the cDNA and the amino acid sequence of the protein encoded by the qNaCl3 gene were determined.
  • 3 ′ Full RACE was performed using 3′-Full RACE Core Set (TAKARA BIO INC), and 5 ′ Full RACE-PCR was performed using 5′-Full RACE Core Set (TAKARA BIO INC).
  • the cDNA sequences are shown in FIGS. 3A and 3B and SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • FIG. 4A and FIG. 4B show the respective base sequences (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4).
  • 4A-1, FIG. 4A-2, and FIGS. 4B-1 to 4B-3 are each a continuous sequence
  • FIG. 4A-2 is a continuation of the sequence of FIG. 4A-1.
  • 4B-3 is a continuation of the sequence of FIG. 4B-2, and the sequence of FIG.
  • FIG. 4B-2 is a continuation of the sequence of FIG. 4B-1.
  • FIG. 5 shows the structural diagram of the qNaCl3 gene in the salt-tolerant strain NILs18-T and the susceptible strain.
  • the qNaCl3 gene in the salt tolerant line NILs18-T has 5 exons
  • the sensitive line NILs18-S has 3 exons.
  • the cause was revealed that in the sensitive strain NILs18-S, a polyadenylation phenomenon occurred due to the insertion of about 3.8 kb in the downstream portion of exon 3, and the function of the gene was lost.
  • soybean salt tolerance gene qNaCl3 gene in 126 soybean varieties / lines 126 soybean varieties / lines including wild varieties from all over the world were obtained.
  • 126 soybean varieties and lines are US USD National Plant Germplasm System (http://www.ars-grin.gov/npgs/), Japan Agricultural Bioresource Genebank (http: //www.gene.affrc.go.). jp / index_j.php) and the National BioResource Project (http://www.legumebase.brc.miyazaki-u.ac.jp/). These 126 varieties and lines of soybean were subjected to salt tolerance evaluation and qNaCl3 expression level measurement.
  • the salt treatment was performed with 100 mM NaCl from the first true leaf development stage (V1 stage) of soybean.
  • Total RNA extraction uses soybean that has been salt-treated with 100 mM NaCl for 1 day, extracted from soybean root using Trizol (Invitrogen), and performed real-time quantitative PCR of soybean resistance gene qNaCl3 gene. The amount was measured.
  • FIG. 6 shows the relationship between the expression level measured by real-time quantitative PCR of qNaCl3 in 126 varieties / lines and the salt tolerance index (STR).
  • qNaCl3 real-time quantitative PCR expression level is expressed as a ratio of qNaCl3 gene expression level to actin gene expression level. As shown in FIG. 6, it was revealed that the greater the expression level of qNaCl3 in soybean, the higher the salt tolerance index, and the expression level of qNaCl3 gene affects the salt tolerance of soybean.
  • the qNaCl3 gene was introduced into a yeast mutant (B31) lacking the Na + / H + antiporter gene to produce a transformant (qNaCl3 1-5 strain).
  • the transformant was cultured in a medium having a pH of 3.5 containing 0 to 1,000 mM NaCl and 10 mM KCl. Further, the transformant was cultured in a medium having a pH of 3.5 to 6.5 containing 500 mM NaCl and 10 mM KCl.
  • yeast mutant transformed with a vector not containing qNaCl3 was used.
  • FIG. 7A shows the difference in growth due to NaCl concentration
  • FIG. 7B shows the difference in growth due to pH.
  • qNaCl3 1 to 5 indicate the results of each of the 5 lines of transformants.
  • Vector shows the result of the control transformed with the vector
  • Nha1 shows the result of the transformant transformed with the Nha1 gene, which is the Na + / H + antiporter gene of yeast.
  • FIG. 7 the result of each culture is shown by the growth state on the petri dish.
  • the portion that appears white indicates a collection of grown yeast colonies, and the larger the white portion, the better the growth.
  • the qNaCl3 gene transformant was able to grow even when the NaCl concentration of the medium was 750 mM. The growth was clearly different from the control (Vector) when the pH of the medium was low, but the difference disappeared when approaching neutrality. This result indicates that the qNaCl3 gene functions as a Na + / H + antiporter.
  • the transformant was transferred to http: // genetic. eng. yamaguchi-u. ac. jp / KoboHome / Kobokobo.
  • the moisture was conditioned (increases the water absorption content) in a sealed container in which the seed was moisturized for about one week.
  • the seeds were soaked overnight to absorb water.
  • the seed coat was removed and cut with a scalpel to prepare explants.
  • a scalpel was used to make a small wound to promote Agrobacterium infection.
  • a salt tolerance gene qNaCl3 was linked to a 35S promoter (cauliflower mosaic virus 35S promoter), and an expression plasmid vector containing a bar (grefosinate resistance) gene as a selection marker was constructed.
  • This vector was introduced into Agrobacterium EHA105 strain. Explants were infected with Agrobacterium EHA105 strain harboring a binary vector that was allowed to constitutively overexpress the qNaCl3 gene. After co-culture for 5 days, Agrobacterium was washed and cultured twice in a shoot induction medium containing 6 mg / L of glufosinate for 2 weeks. Thereafter, the cells were cultured in a shoot elongation medium containing glufosinate at the same concentration for 2 weeks ⁇ 4 times, and shoots that were sufficiently elongated during that time were transplanted to the rooting medium. After rooting, the seeds were harvested after transplanted to culture soil and cultivated for about 3 months.
  • qNaCl3 gene-introduced transformed soybean lines 54-1-1, 34-2-7, 20-1-4, 16-1-8 were treated with salt stress (100 mM NaCl, 24 h), Total RNA was extracted from the root, qNaCl3 gene expression analysis was performed by RT-PCR, and qNaCl3 gene expression level was analyzed by real-time PCR.
  • FIG. 8 “Kariyutaka” is a wild-type variety
  • GFP is a 35S: GFP gene-transformed soybean line of Kariyutaka
  • NILs18-T and “NILs18-S” are resistant lines of a soybean salt-tolerant quasi-isogenic line. And sensitive lines.
  • FIG. 8A shows the results of expression analysis by RT-PCR
  • FIG. 8B shows the results of expression level analysis by real-time PCR in terms of relative expression levels.
  • expression of the qNaCl3 gene was observed in the qNaCl3 gene-introduced soybean line and the resistant NILs18-T line.
  • FIG. 8B shows that as a result of real-time PCR analysis, the average expression level of the transformed 20-1-4 line was 4.72 times that of the resistant line NILs18-T. This result means that by using this vector constructed to overexpress the gene of interest, the gene of interest can be expressed intentionally more strongly than using genetic resources that exist as natural mutations as they are. To do.
  • FIG. 9 shows the degree of yellowing of the leaf blades after 14 days of treatment with 100 mM NaCl in the transgenic soybean line (54-1-1, 34-2-7, 20-1-4, 16-1-8) into which the salt tolerance gene qNaCl3 was introduced. The SPAD value of the indicated leaf is shown.
  • ** indicates that there is a significant difference from the wild-type cultivar Kariyutaka (P ⁇ 0.01, t-test).
  • FIG. 10 shows the growth state after 14 days. The right side of FIG. 10 shows the growth of a q35S: qNaCl3 transformed soybean line individual into which the target gene has been introduced, and the left side of FIG. 10 shows the growth of an individual (null) that does not have the target gene. As shown in FIG. 10, good growth was observed in the q35S: qNaCl3 transformed soybean line plant introduced with the target gene.
  • salt tolerance gene qNaCl3 in a salt damage field in the near-isogenic line Soybean salt tolerance gene quasi-isogenic lines (Nearisogenic lines, NILs) that have been cultivated by the present inventors so far are obtained by hydroponics of a culture solution containing NaCl. Salt tolerance evaluation at the seedling stage was performed to confirm the resistance gene effect (Hamwieh et al. (2011) Euphytica, 179: 451-459). However, for these lines, the salt tolerance during other growth periods (flowering and ripening periods) is not clear, and the effect on yield under actual salt stress field conditions is not clear.
  • soybean salt-tolerant near-isogenic lines (NILs18, NILs25, NILs72) were cultivated in a salt stress field for two years from 2009 to 2010, and the effects of salt-tolerant genes were investigated.
  • Soybean salt tolerant near-isogenic lines 3 sets of each salt tolerant line and 6 susceptibility statistics (NIL18-S, NIL18-T, NIL25-S, NIL25-T, NIL72-S, NIL72-T) and salt sensitive controls The variety (Tachiyutaka) was evaluated.
  • the field test area design was performed in 3 iterations of the random block method. The cultivation density was 0.2 m between the strains and 0.8 m between the straws. In 2009, it was sown on June 1.
  • salt stress was performed on July 7 by salt water irrigation.
  • concentration of irrigated brine was about 1/4 of the seawater concentration (120 mM NaCl).
  • seeding was performed on June 4, and salt treatment was performed on July 27.
  • traits such as above-ground dry matter and grain weight were examined for each line 10.
  • salt water treatment all salt-sensitive lines showed severe salt damage symptoms such as leaf yellowing and death.
  • the above-ground dry matter weight and grain weight of the strains (NIL18-T, NIL25-T, NIL72-T) having the salt-tolerant allele in the three sets of salt-tolerant near-isogenic lines evaluated were all salt-tolerant The values were higher than those of strains without genes (NIL18-S, NIL25-S, NIL72-S).
  • the grain weight of the salt-tolerant strain averaged 4.2 times the grain weight of the sensitive strain for two years, and the effect of the salt-tolerant gene could be confirmed in the salt damage field.
  • FIG. 11 shows the growth status of a tolerance line (NILs25-T) and a sensitive line (NIL25-S) in a salt-damaged field in a near-isogenic line of the salt tolerance gene qNaCl3 nurtured by DNA marker selection.
  • FIG. 12 shows salt-tolerant lines (NILs18-T, NILs25-T, NILs72-T) and sensitive lines (NILs18-S, NILs25-S, NILs72-S) in a salt-damaged field in a salt-tolerant near-isogenic line nurtured by DNA marker selection. ) Shows the result of comparison of the seed weight. The results show the results of two tests conducted in different years (FIGS. 12A and 12B, respectively). The vertical bars indicate standard deviation (3 repeats), and ** is significantly different from sensitive strains (P ⁇ 0.01). Tachiyutaka and C01 are control varieties.
  • SSR marker primer sets were prepared.
  • Primer sets 5'-CTCGCAAGTGTTCTCACGAA-3 '(SEQ ID NO: 10) and 5'-TTAGCTCCACCAACCCTTTG-3' (SEQ ID NO: 11) are examples of markers for identifying the presence or absence of the qNaCl3 gene.
  • a strong salt-tolerant soybean line can be created.
  • the soybean-derived qNaCl3 gene of the present invention controls plant salt stress tolerance (salt tolerance).
  • salt stress tolerance salt tolerance
  • soybean varieties with improved salt stress tolerance can be obtained, and soybeans can be obtained in high yield even in environments with high salt concentrations.
  • the plant which improved salt stress tolerance can be obtained by introduce
  • a DNA marker relating to salt stress tolerance can be developed based on the DNA information of the qNaCl3 gene, and soybeans with improved salt stress tolerance can be bred by selective breeding of DNA mikers.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　ダイズ耐塩性遺伝子qNaCl3、該遺伝子のcDNAおよび該遺伝子がコードするタンパク質の提供。　植物の塩ストレス耐性を制御するNa＋/H＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードするqNaCl3遺伝子。

Description

ダイズ第３番染色体に座上する耐塩性を制御する遺伝子ｑＮａＣｌ３とその利用法
　本発明は、ダイズにおいて耐塩性を制御する遺伝子およびその利用方法に関する。
　ダイズは世界の重要なマメ科作物の一つであり、主要なタンパク質および油脂原料として、その利用は多岐にわたる。しかし、ダイズの生産性は、イネやトウモロコシなどイネ科作物に比べると低く、さまざまな環境ストレスの影響により不安定である。塩害は、ダイズの発芽と成長および根粒生成に影響し、収量減少が報告されている。現在、世界の灌漑耕地の約１／３の面積が土壌塩性化の影響を受けている。また、地球温暖化に伴い、水不足および不良灌漑により塩類集積地が拡大しつつある。日本においても、２０１１年３月１１日発生した東日本大震災の影響によって海水の流入に起因する塩害が報告されている。対策として、耐塩性ダイズ品種の育成は有力な手段であり、栽培種内の遺伝的変異を利用したダイズ耐塩性の改良が試みられている。現在、ダイズ耐塩性に関する複数の量的遺伝子座（ＱＴＬ）が報告され、ダイズ育種に利用できるこれらのＱＴＬに関連するＤＮＡマーカーが特定されつつある（非特許文献１~４を参照）。しかし、いまだ耐塩性ＱＴＬの原因遺伝子の同定や機能解析は十分に進んでおらず、効率的に育種に利用できる状況にはない。
Ｌｅｅ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（２００４）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０９：１６１０−１６１９． Ｈａｍｗｉｅｈ，Ａ．ａｎｄ　Ｘｕ，Ｄ．Ｈ．（２００８）Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．５８：３５５−３５９． Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｔ．ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ａｇｒ．Ｒｅｓ．５９：１０８６−１０９１ Ｈａｍｗｉｅｈ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．（２０１１）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１７９：４５１−４５９
　本発明は、ダイズ耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３、および該遺伝子がコードするタンパク質を提供する。更に、本発明は、耐塩性植物の作出等の、遺伝子の利用技術を提供することも課題とする。これらの課題が解決されることにより、ダイズ耐塩性の発現機構の解明が促進されるばかりでなく、単離した遺伝子を利用した新しい耐塩性品種育成の確立等に大きく寄与することができる。
　本発明者らは、ダイズに由来するｑＮａＣｌ３遺伝子がダイズの耐塩性の原因遺伝子であることを見出し、ｑＮａＣｌ３遺伝子を塩感受型のダイズ品種で過剰に強く発現させることにより、ダイズの耐塩性が向上し、既存の耐塩性ダイズ品種よりも高い耐塩品種の開発が期待できることを見出した。また、単離したｑＮａＣｌ３遺伝子のＤＮＡ情報に基づいて耐塩性のＤＮＡマーカーを開発し、耐塩性ダイズの育種のＤＮＡマーカーとして利用することもできる。さらに、この遺伝子およびその類似遺伝子を利用することにより、ダイズのみならず他のマメ類作物や穀類作物において、耐塩性を向上した形質転換体を作出し、増収につながる品種開発が可能となる。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］　以下の（ａ）~（ｆ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子；
　（ａ）　配列番号１または３に表される塩基配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）　配列番号１または３に表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
　（ｃ）　配列番号１または３に表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
　（ｄ）　配列番号１または３に表される塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ；
　（ｅ）　配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ；および
　（ｆ）　配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［２］　植物の塩ストレス耐性を制御するＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードするｑＮａＣｌ３遺伝子である、［１］の遺伝子。
［３］　［１］または［２］の遺伝子を含有する植物形質転換用ベクター。
［４］　［３］の植物形質転換用ベクターで形質転換された塩ストレス耐性が向上した形質転換植物。
［５］　双子葉植物である、［４］の形質転換植物。
［６］　ダイズである、［４］の形質転換植物。
［７］　［１］または［２］の遺伝子を植物に導入することにより、該植物の塩ストレス耐性を向上させる方法。
［８］　植物が双子葉植物である、［７］の植物の塩ストレス耐性を向上させる方法。
［９］　植物がダイズである、［７］の植物の塩ストレス耐性を向上させる方法。
［１０］　耐塩性を有する植物を育種する方法であって、ｑＮａＣｌ３遺伝子内またはその近傍に位置するＤＮＡマーカーの存在を指標に、耐塩性を有する植物を選抜することを含む方法。
［１１］　ＤＮＡマーカーとして、ＳＳＲマーカーであるＳＳＲ２５．８および／またはＳＳＲ５５．５を用いる［１０］の方法。
［１２］　ＳＳＲ２５．８を配列番号５の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６の塩基配列からなるプライマーのプライマー対を用いて検出し、ＳＳＲ５５．５を配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８の塩基配列からなるプライマーのプライマー対を用いて検出する、［１１］の方法。
［１３］　ｑＮａＣｌ３遺伝子を検出するための以下のいずれかのＳＳＲマーカープライマー対：
（ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６の塩基配列からなるプライマーのプライマー対；および
（ｉｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８の塩基配列からなるプライマーのプライマー対。
［１４］　耐塩性を有する植物を育種する方法であって、ｑＮａＣｌ３遺伝子のエキソン３の下流の配列番号９に表される塩基配列からなる約３．８ｋｂの挿入断片を有しない植物を耐塩性を有する植物として選抜し育種する方法。
［１５］　ｑＮａＣｌ３遺伝子のエキソン３の下流の約３．８ｋｂの挿入断片を検出するためのプライマー対。
［１６］　配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマーからなる、［１５］のプライマー対。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１４−０２７９７９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１は、ダイズ耐塩性の高精度ＱＴＬ解析により、第３番染色体上にＱＴＬ（量的形質遺伝子座）の位置を示す物理地図（図１Ａ）を示す図である。「＊」は、ダイズ第３番染色体上の物理位置（Ｍｂ）を示す。
　図２は、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて耐塩性系統ＮＩＬｓ１８−Ｔと感受性系統ＮＩＬｓ１８−Ｓにおける耐塩性候補遺伝子ｑＮａＣｌ３発現解析の結果を示す図である。
　図３Ａは、ＲＡＣＥ法により耐塩性系統ＮＩＬｓ１８−Ｔから合成したｑＮａＣｌ３遺伝子の完全長ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１）を示す図である。
　図３Ｂは、ｑＮａＣｌ３遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
　図４Ａ−１は、耐塩性系統ＮＩＬｓ１８−Ｔにおける耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３のゲノム塩基配列（配列番号３）を示す図である（図４Ａ−２に続く）。
　図４Ａ−２は、耐塩性系統ＮＩＬｓ１８−Ｔにおける耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３のゲノム塩基配列（配列番号３）を示す図である（図４Ａ−１の続き）。
　図４Ｂ−１は、感受性系統ＮＩＬｓ１８−Ｓにおける耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３のゲノム塩基配列（配列番号４）を示す図である（図４Ｂ−２に続く）。
　図４Ｂ−２は、感受性系統ＮＩＬｓ１８−Ｓにおける耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３のゲノム塩基配列（配列番号４）を示す図である（図４Ｂ−１の続き）。
　図４Ｂ−３は、感受性系統ＮＩＬｓ１８−Ｓにおける耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３のゲノム塩基配列（配列番号４）を示す図である（図４Ｂ−２の続き）。
　図５は、ダイズ耐塩性系統ＮＩＬｓ１８−Ｔ（図５Ａ）および感受性系統ＮＩＬｓ１８−Ｓ（図５Ｂ）のｑＮａＣｌ３遺伝子の構造を示す図である。
　図６は、世界各国に由来する１２６ダイズ品種・系統（野生ダイズを含む）におけるダイズ耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３のリアルタイム定量ＰＣＲ発現量と耐塩性の関係を示す図である。耐塩性評価は、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む水耕培養液で行った。耐塩指数は、１（耐塩性弱い）~５（耐塩性強い）の５級に分類してある。
　図７は、Ｎａ／Ｈ＋アンチポーター欠損のイーストミュータント（Ｂ３１）にｑＮａＣｌ３遺伝子を導入した形質転換体（ｑＮａＣｌ３　１−５　ｓｔｒａｉｎ）のＮａＣｌ含有培地における生育を示す図である。図中、Ｎｈａ１はイーストのＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子を示す。
　図８は、ｑＮａＣｌ３遺伝子導入形質転換ダイズ系統（５４−１−１，３４−２−７，２０−１−４，１６−１−８）における塩ストレス処理（１００ｍＭ　ＮａＣｌ，２４ｈ）後の標的遺伝子の発現解析の結果を示す図である。図８ＡはＲＴ−ＰＣＲによる発現解析の結果を示し、図８ＢはリアルタイムＰＣＲにより発現量の解析の結果を相対的発現レベルで示す。「Ｋａｒｉｙｕｔａｋａ」は野生型品種を、「ＧＦＰ」はＫａｒｉｙｕｔａｋａの３５Ｓ：ＧＦＰ遺伝子形質転換ダイズ系統を、「ＮＩＬｓ１８−Ｔ」と「ＮＩＬｓ１８−Ｓ」はダイズ耐塩性準同質系統の耐塩性系統と感受性系統を示す。
　図９は、耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３導入形質転換ダイズ系統（５４−１−１，３４−２−７，２０−１−４，１６−１−８）における１００ｍＭ　ＮａＣｌ処理１４日後葉身の黄色化程度を示した葉のＳＰＡＤ値を示す図である。「＊＊」は、野生型品種Ｋａｒｉｙｕｔａｋａと有意差があること（Ｐ＜０．０１，ｔ−ｔｅｓｔ）を示す。「Ｋａｒｉｙｕｔａｋａ」は野生型を、「ＧＦＰ」はＫａｒｉｙｕｔａｋａの３５Ｓ：ＧＦＰ遺伝子形質転換ダイズ系統を、「ＮＩＬｓ１８−Ｔ」と「ＮＩＬｓ１８−Ｓ」はダイズ耐塩性準同質系統の耐塩性系統と感受性系統を示す。
　図１０は、高い耐塩性を示したＴ２世代の３５Ｓ：ｑＮａＣｌ３形質転換ダイズ系統２０−１−４の生育状況を示す図である。図１０の右は、標的遺伝子を導入された３５Ｓ：ｑＮａＣｌ３形質転換ダイズ系統個体の生育を示し、図１０の左は、標的遺伝子を持っていない個体（ヌル）の生育を示す。
　図１１は、ＤＮＡマーカー選抜より育成した耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３の準同質系統における塩害圃場で耐塩性系統（ＮＩＬｓ２５−Ｔ）と感受性系統（ＮＩＬｓ２５−Ｓ）の生育状況（２００９）を示す図である。図１１の右のダイズは耐塩性系統（ＮＩＬｓ２５−Ｔ）であり、左のダイズは感受性系統（ＮＩＬｓ２５−Ｓ）である。
　図１２は、ＤＮＡマーカー選抜より育成した耐塩性準同質系統における塩害圃場で耐塩性系統（ＮＩＬｓ１８−Ｔ、ＮＩＬｓ２５−Ｔ、ＮＩＬｓ７２−Ｔ）と感受性系統（ＮＩＬｓ１８−Ｓ、ＮＩＬｓ２５−Ｓ、ＮＩＬｓ７２−Ｓ）の地上部総乾物重の比較を示す図である。縦棒は標準偏差（３反復）を示す。また、「Ｔａｃｈｉｙｕｔａｋａ」と「Ｃ０１」は、対照品種である。「＊＊」は感受性系統と有意差があること（Ｐ＜０．０１）を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．　本発明の遺伝子
　本発明は、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）の第３染色体に座上する塩ストレス耐性を制御する遺伝子ｑＮａＣｌ３である。ｑＮａＣｌ３遺伝子産物はＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターとして機能する。Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターは、生体膜を介してＮａ＋とＨ＋の対向輸送を行う輸送体であり、細胞内のＮａ＋レベル、ｐＨ、細胞容量などの調節に関与し、植物においては、塩ストレス時に細胞内に流入したＮａ＋の細胞外への排出や液胞への隔離に関与する。
　塩ストレスとは、植物が塩に曝されることをいい、塩ストレス耐性とは、塩に曝された状態でも生育する能力をいい、耐塩性ともいう。塩ストレス耐性がなく、塩感受性の植物は、塩に曝されることにより、葉が黄化したり、枯死する等の塩害症状を示す。
　ｑＮａＣｌ３遺伝子は、耐塩性ダイズ品種の第３染色体のＢＡＲＣＳＯＹＳＳＲ＿０３＿１３３８とＢＡＲＣＳＯＹＳＳＲ＿０３＿１３４１に挟み込まれる約５８．８ｋｂのゲノム領域からマップベースクローニング（ｍａｐ−ｂａｓｅｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ）により同定し、単離することができる。
　ｑＮａＣｌ３遺伝子は、耐塩性を有するダイズ系統では、５つのエキソンを有するが、耐塩性を失い塩感受性となったダイズ系統では、エキソン３の下流の部分への約３．８ｋｂの断片の挿入により、遺伝子の機能が失われ、ｑＮａＣｌ３遺伝子は、３つのエキソンからなるように変異する。
　ｑＮａＣｌ３遺伝子は、塩に曝されたときに発現が誘導されるのではく、常に発現が維持されている。ｑＮａＣｌ３遺伝子の発現が大きいほど、塩ストレス耐性が大きくなる。
　ｑＮａＣｌ３遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を配列番号１および図３Ａに示し、ｑＮａＣｌ３遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２および図３Ｂに示す。
　さらに、配列番号３ならびに図４Ａ−１および図４Ａ−２にｑＮａＣｌ３遺伝子のゲノム塩基配列を示す。図４Ａ−２の配列は図４Ａ−１の配列に続いている。
　本発明において上記配列番号１または３の塩基配列で表されるＤＮＡは、それぞれのＤＮＡが有する活性またはそれぞれのＤＮＡがコードするタンパク質が有する活性、すなわち塩ストレス耐性またはＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有している限り、塩基配列に変異を有していてもよい。例えば、配列番号１または３で表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、配列番号１または３で表される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の配列同一性を有しているＤＮＡ、または前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１または複数もしくは数個（１~１０個、好ましくは１~５個、さらに好ましくは１個もしくは２個）のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記のＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、ＤＮＡの濃度、ＤＮＡの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間などを適宜組み合わせることにより、必要なストリンジェンシーを実現することが可能である。さらに、配列番号１または３に表される塩基配列において遺伝暗号の縮重に基づく配列（縮重配列）を含むＤＮＡも包含する。
　本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法などの公知の手法またはこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）など）を用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。
　本発明のダイズのｑＮａＣｌ３遺伝子の配列情報に基づいて、他の種類の植物において配列同一性が高く同様の機能を有するホモログ遺伝子を探索することができる。本発明はダイズのｑＮａＣｌ３遺伝子のホモログ遺伝子である他の植物種の遺伝子も包含する。例えば、ダイズのｑＮａＣｌ３遺伝子と塩基配列の同一性が高い他種のホモログ遺伝子は、上記の塩基に変異を有する塩基配列からなるｑＮａＣｌ３遺伝子に含まれる。
　本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子のｃＤＮＡも包含する。
　また、上記遺伝子がコードするタンパク質であり、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質も包含する。
２．　本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を導入した形質転換植物の作出
　遺伝子工学的手法を用いて本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子ＤＮＡを植物宿主に導入することにより、塩ストレス耐性を有する形質転換植物を作出することができる。本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子の植物宿主への導入方法としては、アグロバクテリウム感染法等の間接導入法や、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、リポソーム法、マイクロインジェクション法などの直接導入法などが挙げられる。適切な導入方法は当業者ならば、適宜選択することができる。
　例えば、アグロバクテリウム感染法を用いる場合、以下のようにして本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を導入した形質転換植物を作出ことができる。
　最初に、形質転換用組換えベクターを作製し、次いでアグロバクテリウムにより形質転換を行う。
　形質転換用組換えベクターは、本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、植物細胞用のクローニングベクターに挿入することにより得ることができる。クローニング用ベクターとしては、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ等のバイナリーベクター系のプラスミドやｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間ベクター系のプラスミドを用いることができる。
　バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ，ＲＢ）間に、ｑＮａＣｌ３遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・チュメファシエンスＥＨＡ１０５、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ等にエレクトロポレーション法等により導入し、ｑＮａＣｌ３遺伝子を導入したアグロバクテリウムを植物の形質転換に用いればよい。その他、三者接合法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１（１９８４））によって本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を含む形質転換に用いるアグロバクテリウムを調製することができる。すなわち、本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌やヘルパープラスミド（例えばｐＲＫ２０１３）を保有する大腸菌とアグロバクテリウムを混合培養し、リファンピシリンおよびカナマイシンを含む培地上で培養することにより形質転換用の接合体アグロバクテリウムを得ることができる。
　植物体内で外来遺伝子である本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を発現させるためには、ｑＮａＣｌ３遺伝子の前後に植物用のプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等を連結することが望ましい。本発明において利用可能なプロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子プロモーター、オクトピン（ＯＣＴ）合成酵素遺伝子プロモーター等が挙げられる。エンハンサーとしては、ウイルス起源の翻訳エンハンサーや植物起源の翻訳エンハンサーを用いることができる。ウイルス起源の翻訳エンハンサーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４、ブロモモザイクウイルスＲＮＡ３、ポテトウイルスＸ、タバコエッチウイルス等の配列が挙げられる。また、植物起源の翻訳エンハンサーとして、ダイズのβ−１，３グルカナーゼ（Ｇｌｕ）由来の配列、タバコのフェレドキシン結合性サブユニット（ＰｓａＤｂ）由来の配列等が挙げられる。ターミネーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を用いることができる。但し、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターは上記のものに限定されず、植物体内で機能することが知られているものであればいずれも使用することができる。これらのプロモーター、エンハンサー、ターミネーターは、発現させようとする本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子が機能し得るように連結する。
　さらに、効率的に目的の形質転換植物を選択するために、選択マーカー遺伝子を用いることが好ましい。選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子およびビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等が挙げられる。本発明の遺伝子および選択マーカー遺伝子は、単一のベクターに一緒に組み込んでも良いし、それぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いてもよい。
　本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を導入する宿主植物は、植物培養細胞、栽培植物の植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、または植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）のいずれであってもよい。
　植物種は限定されず、塩ストレス耐性を有しない塩感受性のダイズ、ダイズ以外のマメ類植物や穀類植物が挙げられる。ダイズ以外のマメ類植物としては、限定されないが、アズキ、インゲンマメ、ヒヨコマメ、ラッカセイ、エンドウマメ、ソラマメ等が挙げられる。穀類植物としては、限定されないが、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ、カラスムギ、ソバ、ヒエ、アワ、キビ等が挙げられる。また、双子葉植物、単子葉植物のいずれも用いることができる。塩感受性のダイズにｑＮａＣｌ３遺伝子を導入し過剰発現させることにより、塩感受性のダイズは塩ストレスに耐性となり、既存の耐塩性ダイズ品種よりも高い耐塩性の品種を開発することができる。また、ダイズのｑＮａＣｌ３遺伝子またはダイズのｑＮａＣｌ３遺伝子のホモログ遺伝子である他種植物のｑＮａＣｌ３遺伝子をダイズ以外のマメ類植物や穀類植物に導入することにより、塩ストレス耐性が向上した形質転換体を得ることができる。
　植物培養細胞、植物体、植物器官または植物組織を宿主とする場合、本発明の遺伝子は、採取した植物切片にベクターをアグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法またはポリエチレングリコール法などで導入し、植物宿主を形質転換することができる。あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法で導入して形質転換植物を作出することもできる。
　植物細胞にｑＮａＣｌ３遺伝子を導入する場合、得られた形質転換細胞から公知の組織培養法により形質転換体を再生することができる。例えば、「植物細胞培養マニュアル」山田康之編著、講談社サイエンティフィク、１９８４等の文献に従って植物細胞から植物体を再生することができる。
　本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を導入した形質転換植物およびその次世代にｑＮａＣｌ３遺伝子が組み込まれていることの確認は、これらの細胞および組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ法またはサザン分析を用いて導入したｑＮａＣｌ３遺伝子を検出することにより行うことができる。
　本発明の形質転換植物体は、形質転換を行い再分化した当代である「Ｔ１世代」の他、その植物の自殖や他殖の種子から得られた後代等、Ｔ１世代を元にした、あらゆる栽培や育種の手段により得られ得る世代や個体をも包含する。
３．　形質転換植物の塩ストレスに対する耐性の評価
　本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を導入した形質転換植物の塩ストレスに対する耐性は、例えば、水耕培養液やバーミキュライト、パーライトなどを含む培養土を入れた容器に形質転換植物を植え、塩ストレスを負荷して生育させたときの生存や生育状況を調べることによって評価することができる。例えば、１００~２００ｍＭ、好ましくは１００~１５０ｍＭのＮａＣｌを含む水耕培養液で、２０~３５℃で１時間~３０日、好ましくは１０~２０日、さらに好ましくは１４日おき、塩処理した後に生存率や生育状況を調べることにより評価することができる。この際、耐塩指数（ＳＴＲ）や葉緑素含量（ＳＰＡＤ値）を調べてもよい。耐塩指数は、目視で植物体を観察することにより行い、５級（１~５）に分類することができる。また、葉緑素含量（ＳＰＡＤ値）はＳＰＡＤ値計測器で測定することができる。葉緑素含量は葉の黄色化程度を示す値である。また、ダイズ等のマメ類植物や穀類植物などの子実を形成する植物の場合、植物を生育し子実を形成させ、子実のでき具合により評価することができる。
　本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を導入した植物は塩ストレス耐性が向上する。
　すなわち、例えば、本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を導入した植物と塩ストレス耐性を有しない塩感受性系統を１００~１５０ｍＭのＮａＣｌを含む水耕培養液で、２０~３５℃で、２~３週間培養した場合、本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を導入した植物は塩感受性系統に対して、生存率が高くなり、耐塩指数が向上し、葉の葉緑素含量が維持できる。さらに、本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を導入した植物は塩感受性系統に対して、子実の形成が良くなり、圃場の単位面積当たりの収穫量が向上する。
４．　耐塩性植物選抜および選抜に用いるためのマーカー
　本発明は耐塩性植物選抜のためのマーカー、および該マーカーを用いた耐塩性植物の選抜または育種方法も包含する。
　これらのマーカーを、少なくともダイズを包含する植物群から選ばれる植物について行う耐塩性の検定、耐塩性に関与するＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子（ｑＮａＣｌ３遺伝子）と類似する機能を有する新規遺伝子の探索、ダイズ育種上のＤＮＡマーカーの選抜等に用いることができる。
　本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子を有し耐塩性を有している植物は、ｑＮａＣｌ３遺伝子を有する植物と他の植物を交雑し、ｑＮａＣｌ３遺伝子を有する雑種を選抜することにより育種することができる。具体的な選抜育種方法として、例えば、任意の植物系統ＸとｑＮａＣｌ３遺伝子を有する植物系統Ｙを交雑させ雑種を得て、得られた雑種と植物系統Ｘを戻し交雑し、ｑＮａＣｌ３遺伝子を有する雑種を選抜し、さらに戻し交雑を行う方法が挙げられる。戻し交雑および選抜を数回、好ましくは２~１０回繰り返す行うことが好ましい。このような方法により、ｑＮａＣｌ３遺伝子を有する準同質遺伝子系統を得ることができる。この際、ｑＮａＣｌ３遺伝子を有する植物系統はマーカーを利用して選抜することができる。
　耐塩性植物の選抜または育種のためのマーカーは、本発明のｑＮａＣｌ３遺伝子の存在位置の目印となるＤＮＡ配列からなるＤＮＡマーカーであり、ｑＮａＣｌ３遺伝子内に存在するか、ｑＮａＣｌ３遺伝子に隣接するか、あるいは近傍に存在するＤＮＡマーカーを用いればよい。例えば、そのようなＤＮＡマーカーとしてマイクロサテライトマーカーを用いることができ、マイクロサテライトマーカーとしてＳＳＲ（単純反復配列）マーカー等が挙げられる。これらのマーカーの存在を指標に選抜した植物個体は、ｑＮａＣｌ３遺伝子を有しており、耐塩性という形質を有している。ｑＮａＣｌ３遺伝子の近傍に位置するＤＮＡマーカーとして、例えば、ダイズ第３染色体上のＳＳＲマーカーであるＳａｔｔ３３９、Ｓａｔｔ２３７、Ｓａｔｔ２５５、Ｓａｔ＿０９１およびＳａｔ＿３０４（公知ダイズマーカー、Ｓｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（２００４）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：１２２−１２８を参照）等が挙げられる。これらのマーカーは例えば、マーカーに特異的なプライマー対を用いて検出することができる。
　また、ｑＮａＣｌ３遺伝子は、ＢＡＲＣＳＯＹＳＳＲ＿０３＿１３３８とＢＡＲＣＳＯＹＳＳＲ＿０３＿１３４１に挟み込まれる約５８．８ｋｂのゲノム領域に存在する（図１）。従って、ＢＡＲＣＳＯＹＳＳＲ＿０３＿１３３８とＢＡＲＣＳＯＹＳＳＲ＿０３＿１３４１は耐塩性遺伝子の選抜マーカーとしても利用できる。
　また、新たに開発したＳＳＲマーカーＳＳＲ２５．８およびＳＳＲ５５．５を利用することもでき、以下のＳＳＲマーカープライマーセット（プライマー対）を用いればよい。
（１）ｑＮａＣｌ３遺伝子の上流５．２ｋｂのところに開発したマイクロサテライト（単純反復配列、ＳＳＲ）マーカー（ＳＳＲ２５．８）のプライマーセット：５’−ＴＴＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＡＴＡＧＴＴＣ−３’　（配列番号５）及び５’−ＣＧＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＣＡＴＡＴＡＣ−３’　（配列番号６）
（２）ｑＮａＣｌ３遺伝子の下流１３ｋｂのところに開発したマイクロサテライト（単純反復配列、ＳＳＲ）マーカー（ＳＳＲ５５．５）のプライマーセット：５’−ＴＴＧＧＡＴＡＧＴＡＡＴＧＴＴＧＴＣＴＴＣＧ−３’（配列番号７）と５’−ＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＧＡＣＴＴＧＡ−３’　（配列番号８）。
　上記プライマーセットを用いてダイズの塩耐抗と感受性より抽出したＤＮＡに対してＰＣＲを行うことにより増幅され、明瞭な多型が認められた。この２つまたは１つのＳＳＲマーカーを検出することにより、マーカー耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３遺伝子の有無を識別することができる。
　ＤＮＡマーカー選抜による耐塩性ダイズ系統の育種は、例えば、Ｈａｍｗｉｅｈ　ｅｔ　ａｌ．（２０１１）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１７９：４５１−４５９の記載に従って行うことができる。
　さらに、塩感受性系統では、ｑＮａＣｌ３遺伝子はエキソン３の下流に約３．８ｋｂの挿入断片があり、遺伝子の機能が失われている（図５）。約３．８ｋｂの挿入断片の塩基配列を配列番号９に示す。従って、該挿入断片の有無を指標に、ダイズ系統が耐塩性を有しているかを検定することができ、該挿入断片を有していないことを指標にしてｑＮａＣｌ３遺伝子を有している耐塩性ダイズを選抜育種することが可能である。挿入断片の有無は、挿入断片の一部断片であるオリゴヌクレオチドまたはその相補的配列、或いはストリンジェント条件下でそれらの配列にハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて検出することができる。ここで、ストリンジェントな条件は上記のとおりである。
　該オリゴヌクレオチドは、プローブまたはプライマーであり、配列番号９の約３．８ｋｂの挿入配列の配列情報に基づいて設計することができる。具体的には、上記挿入断片の両側の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ産物の長さにより、３．８ｋｂの挿入断片の有無を検出することができる。
　プローブは、ｑＮａＣｌ３遺伝子の挿入断片の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列、あるいはストリンジェントな条件下でそれらの配列にハイブリダイズし得る配列からなるヌクレオチド断片（好ましくは、ＤＮＡ断片）からなり、塩基の数は５~５０、好ましくは１０~３０、さらに好ましくは１０~２５である。該プローブを用いて被験体である植物から得た核酸試料とハイブリダイゼーションを行わせることにより挿入断片の有無を検出することができる。
　プライマーは、ｑＮａＣｌ３遺伝子の挿入断片の存在を検定することのできるプライマーであり、たとえば、ｑＮａＣｌ３遺伝子の一部を含む配列を有する領域を増幅することのできる配列である。プライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーのプライマー対である。プライマーは、ｑＮａＣｌ３遺伝子の挿入断片の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列或いはストリンジェントな条件下でそれらの配列にハイブリダイズし得る配列からなるヌクレオチド断片（好ましくは、ＤＮＡ断片）からなり、塩基の数は５~５０、好ましくは１０~３０、さらに好ましくは１５~２５である。プライマーを用いてＰＣＲにより挿入断片の有無を検出することができる。
　このようなプライマーとして、例えば、５’−ＣＴＣＧＣＡＡＧＴＧＴＴＣＴＣＡＣＧＡＡ−３’　（配列番号１０）と５’−ＴＴＡＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＴＴＴＧ−３’　（配列番号１１）のプライマーセットが挙げられる。
　本発明は、ｑＮａＣｌ３遺伝子の挿入断片を検出するために用いるプローブ及びプライマー（好ましくは、少なくとも一対のプライマーセット）を包含する。また、プローブを固定化したＤＮＡチップをも包含する。さらに、プローブ、ＤＮＡチップ、プライマー等を含むｑＮａＣｌ３遺伝子の挿入断片を検出するためのキットも包含する。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　マップベースクローニング（ｍａｐ−ｂａｓｅｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ）によるダイズの第３番染色体に座上する塩ストレス耐性を制御する遺伝子ｑＮａＣｌ３の同定
　図１は、ダイズ耐塩性の高精度量的遺伝子座（ＱＴＬ）解析により、第３番染色体上にＱＴＬの位置を示す物理地図である。ダイズ耐塩性のＱＴＬは図１の５８．８ｋｂのＱＴＬ領域に存在し、この５８．８ｋｂの領域からダイズの耐塩性に関与する候補遺伝子をマップベースクローニングにより選定した。
　これまでダイズ品種ＦＴ−Ａｂａｙａｒａ（耐塩性）とＣ０１（感受性）を交配して得られたＦ７分離集団（ｎ＝９７）に対して量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）解析が行われ、耐塩性ＱＴＬがダイズ第３染色体にＳＳＲマーカーＳａｔｔ２５５とＳａｔ＿０９１の近傍に座上することを明らかにした（Ｈａｍｗｉｅｈ　ｅｔ　ａｌ．（２０１１）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１７９：４５１−４５９）。次いで、大規模分離集団を用いて、マップベースクローニングにより耐塩性ＱＴＬ領域の詳細な連鎖解析を行った。具体的には、第３染色体に耐塩性ＱＴＬを座上する領域にＳＳＲマーカーＳａｔｔ２５５とＳａｔ＿０９１がヘテロを示したＦ８世代の個体を自殖し、１，０５３個体の分離集団からＳＳＲマーカーＳａｔｔ２５５とＳａｔ＿０９１間の染色体組換え個体を選抜した。その結果、Ｓａｔｔ２５５とＳａｔ＿０９１の間に生じた１４個体の組換え個体を得た。これらの組換え個体をもう一回自殖して１４組換え固定系統を獲得した。次いで、Ｓａｔｔ２５５とＳａｔ＿０９１間の新たな１５個のＳＳＲマーカーを利用して得た１４組換え固定系統を整列化し、各系統の耐塩性の評価結果により耐塩性ＱＴＬはＢＡＲＣＳＯＹＳＳＲ＿０３＿１３３８とＢＡＲＣＳＯＹＳＳＲ＿０３＿１３４１に挟み込まれる約５８．８ｋｂのゲノム領域に存在することが明らかとなった（図１）。この候補ゲノム領域の塩基配列に対して遺伝子予測ならびに類似性検索を行ったところ、この領域に７つの推測遺伝子が存在することが分かった（Ｎａｔｕｒｅ（２０１０）４６３：１７８−１８３）。特に推測遺伝子Ｇｌｙｍａ０３ｇ３２８９０とＧｌｙｍａ０３ｇ３２９００は、Ｓｏｄｉｕｍ／ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅｒ　ｆａｍｉｌｙに類似した構造を持つ領域が見出され、耐塩性ＱＴＬの原因遺伝子と考えられる。続いて、遺伝子発現の解析を行い、その結果、Ｇｌｙｍａ０３ｇ３２９００はダイズ耐塩性系統と感受性系統間に明確な差を示し、この遺伝子はダイズ耐塩性の候補遺伝子として選定し、ｑＮａＣｌ３と命名した。
　ｑＮａＣｌ３遺伝子の解析
　ダイズ耐塩性系統ＮＩＬｓ１８−Ｔおよび感受性系統ＮＩＬｓ１８−Ｓについて、トータルＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより、耐塩性候補遺伝子ｑＮａＣｌ３遺伝子の発現解析を行った。
　ダイズ耐塩性系統ＮＩＬｓ１８−Ｔおよび感受性系統ＮＩＬｓ１８−Ｓは我々がＤＮＡマーカー選抜により育成したものである（Ｈａｍｗｉｅｈ　ｅｔ　ａｌ．（２０１１）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１７９：４５１−４５９）。ＮＩＬｓ１８−ＴとＮＩＬｓ１８−Ｓは、昼温２５±２℃、夜温２０±２℃、日長１４時間に水耕法（１／２濃度Ｈｏａｇｌａｎｄ　ａｎｄ　Ａｒｎｏｎ栄養液、ｐＨ＝６．０−６．５）で栽培した。塩処理は、ダイズの第一本葉展開期（Ｖ１期）から１００ｍＭ　ＮａＣｌで塩処理を行った。トータルＲＮＡ抽出は、１００ｍＭ　ＮａＣｌで１日間と３日間塩処理を行ったダイズ、およびと対照（０ｍＭ　ＮａＣｌ）のダイズを利用し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてダイズの根の部分から抽出した。
　ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ　ＢＩＯ　ＩＮＣ）を用いて行った。用いたｐｒｉｍｅｒは、５’−ＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧＴＣＡＣＧＡＣＴＣ−３’　（配列番号１２）と５’−ＡＣＣＣＣＡＣＧＡＴＴＧＡＣＴＡＧＣＡＣ−３’　（配列番号１３）であった。ハウスキーピング遺伝子であるアクチン遺伝子はコントロールとし、用いたｐｒｉｍｅｒは、５’−ＧＡＧＣＴＡＴＧＡＡＴＴＧＣＣＴＧＡＴＧＧ−３’　（配列番号１４）と５’−ＣＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＡＧＣ−３’　（配列番号１５）であった。ＰＣＲ　Ｐｒｏｇｒａｍ（ＰＴＣ−１００ＴＭ　ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ　ＭＪ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ）は、９５℃／３０秒、５６℃／３０秒、７２℃／３０秒で２５サイクル反応させた後、７２℃／７分間の伸長反応で行った。反応終了後、１．５％アガロースゲル電気泳動によって増幅断片を確認した。
　図２に結果を示す。図２の上のパネルは、ｑＮａＣｌ３遺伝子の発現を示し、下のパネルはハウスキーピング遺伝子であるアクチン遺伝子の発現を示す。図２に示すように、塩に対する耐性系統において、感受性系統に比較してｑＮａＣｌ３遺伝子は高い発現傾向を示した。また、耐性系統におけるｑＮａＣｌ３遺伝子の発現量は、１００ｍＭ　ＮａＣｌ塩処理と対照（１００ｍＭ　ＮａＣｌ）間に明確な差が認めらない、耐性系統のｑＮａＣｌ３遺伝子は塩ストレスの誘導性遺伝子ではなく、常に高い発現を維持することが示唆された。
　耐塩性系統であるＮＩＬｓ１８−Ｔ系統からＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）法によりｑＮａＣｌ３遺伝子を単離同定し、ｃＤＮＡの塩基配列およびｑＮａＣｌ３遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を決定した。３’　Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥは３’−Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ　ＢＩＯ　ＩＮＣ）を用い、５’　Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ−ＰＣＲは５’−Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ　ＢＩＯ　ＩＮＣ）を用いて行った。ｃＤＮＡ配列を図３Ａおよび図３Ｂならびに配列番号１および２に示す。塩基配列は２６７０ｂｐの長さであり（配列番号１）、アミノ酸配列は８１１アミノ酸の長さであった（配列番号２）。
　また、塩耐抗性系統ＮＩＬｓ１８−Ｔおよび感受性系統におけるｑＮａＣｌ３遺伝子領域のゲノム塩基配列を決定した。図４Ａ及び図４Ｂに示しているのは、それぞれの塩基配列である（配列番号３と配列番号４）。なお、図４Ａ−１と図４Ａ−２および図４Ｂ−１~図４Ｂ−３の配列は、それぞれ一続きの連続した配列であり、図４Ａ−２の配列は図４Ａ−１の配列の続きであり、図４Ｂ−３の配列は図４Ｂ−２の、図４Ｂ−２の配列は図４Ｂ−１の配列の続きである。
　上述の塩基配列情報に基づいて、ｑＮａＣｌ３遺伝子の構造を解析した。図５に耐塩性系統ＮＩＬｓ１８−Ｔおよび感受性系統におけるｑＮａＣｌ３遺伝子の構造図を示す。図５に示すように、耐塩性系統ＮＩＬｓ１８−ＴにおけるｑＮａＣｌ３遺伝子は５つのエキソンを有するに対し、感受性系統ＮＩＬｓ１８−Ｓには３つのエキソンを保有している。その原因は、感受性系統ＮＩＬｓ１８−Ｓにはエキソン３の下流の部分の約３．８ｋｂの挿入によってＰｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ現象が起き、遺伝子の機能が失うことが明らかになった。
　１２６ダイズ品種・系統におけるダイズ耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３遺伝子の発現解析
　世界各国に由来する、野生品種を含む１２６のダイズ品種・系統を入手した。１２６のダイズ品種・系統はアメリカＵＳＤＡ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｓ−ｇｒｉｎ．ｇｏｖ／ｎｐｇｓ／）、日本の農業生物資源ジーンバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ＿ｊ．ｐｈｐ）、およびナショナルバイオリソースプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｅｇｕｍｅｂａｓｅ．ｂｒｃ．ｍｉｙａｚａｋｉ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／）から入手した。
　これらの１２６品種・系統のダイズについて耐塩性評価およびｑＮａＣｌ３の発現量測定を行った。
　供試した１２６のダイズ品種・系統は、昼温２５±２℃、夜温２０±２℃、日長１４時間に水耕法（１／２濃度Ｈｏａｇｌａｎｄ　ａｎｄ　Ａｒｎｏｎ栄養液、ｐＨ＝６．０−６．５）で栽培した。塩処理は、ダイズの第一本葉展開期（Ｖ１期）から１００ｍＭ　ＮａＣｌで塩処理を行った。トータルＲＮＡ抽出は、１００ｍＭ　ＮａＣｌで１日間塩処理を行ったダイズを利用し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてダイズの根の部分から抽出し、ダイズ耐性遺伝子ｑＮａＣｌ３遺伝子のリアルタイム定量ＰＣＲを行い、発現量を測定した。塩処理約３週間後、各系統の耐塩指数と葉緑素含量（ＳＰＡＤ値）を調査した。耐塩指数（ＳＴＲ）目視で５級（１−５）に分類した。耐塩指数１は最も耐塩性弱いであり、耐塩指数５は最も耐塩性強いである。葉緑素含量はＳＰＡＤ値として表す計測器ＳＰＡＤ−５０２（Ｋｏｎｉｃａ　Ｍｉｎｏｌｔａ社）で測定した。
　耐塩性評価の結果、供試した１２６ダイズ品種・系統の耐塩性は大きな変異を示した。図６に、１２６品種・系統におけるｑＮａＣｌ３のリアルタイム定量ＰＣＲで測定した発現量と、耐塩指数（ＳＴＲ）の関係を示した。ｑＮａＣｌ３のリアルタイム定量ＰＣＲ発現量はｑＮａＣｌ３遺伝子とアクチン遺伝子の発現量の比で表してある。
　図６に示すように、ダイズのｑＮａＣｌ３の発現量が大きいほど、耐塩指数が高く、ｑＮａＣｌ３遺伝子の発現量がダイズの耐塩性を左右することが明らかになった。
　ｑＮａＣｌ３遺伝子を導入したイースト形質転換体の作出および評価
　Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子を欠損しているイーストミュータント（Ｂ３１）にｑＮａＣｌ３遺伝子を導入し、形質転換体（ｑＮａＣｌ３　１−５　ｓｔｒａｉｎ）を作出した。
　該形質転換体を、０~１，０００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＫＣｌを含むｐＨ３．５の培地で培養した。また、該形質転換体を５００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＫＣｌを含むｐＨ３．５~６．５の培地で培養した。また、コントロールとしてｑＮａＣｌ３を含まないベクターを用いて形質転換したイーストミュータントを用いた。さらに、イーストのＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子であるＮｈａ１遺伝子で形質転換した形質転換体についても培養を行った。
　図７に結果を示す。図７Ａは、ＮａＣｌ濃度による生育の違いを示し、図７ＢはｐＨによる生育の違いを示す。ｑＮａＣｌ３の１~５は５系統の形質転換体のそれぞれの結果を示す。Ｖｅｃｔｏｒは、ベクターで形質転換したコントロールの結果を示し、Ｎｈａ１は、イーストのＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子であるＮｈａ１遺伝子で形質転換した形質転換体の結果を示す。図７には、各培養の結果をシャーレ上の生育状況により示してある。図中、白く見える部分が生育したイーストのコロニーの集まりを示し、白い部分が大きいほど良好に生育したことを示す。
　図７に示すように、ｑＮａＣｌ３遺伝子形質転換体は、培地のＮａＣｌ濃度が７５０ｍＭでも生育が可能となった。生育は培地のｐＨが低い時はコントロール（Ｖｅｃｔｏｒ）との差が明らかであったが、中性に近づくと差が認められなくなった。この結果は、ｑＮａＣｌ３遺伝子はＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターとして機能することを示す。
　実施例４において、形質転換体は、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｔｉｃ．ｅｎｇ．ｙａｍａｇｕｃｈｉ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ＫｏｂｏＨｏｍｅ／ＫｏｂｏＫｏｂｏ．ｈｔｍｌおよびＫｉｔａｇａｗａ，Ｔ．，Ｈｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ａｎｄ　Ａｋａｄａ，Ｒ．：Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７５（３），１３９３（２００７）．に記載の方法に順じて行った。
　具体的には、以下の工程で行った。
１．　Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ　Ｂｕｆｆｅｒを作る。
６０％　ＰＥＧ　６６７μＬ
４Ｍ　ＬｉＡｃ　５０μＬ
１Ｍ　ＤＴＴ　１００μＬ
Ｄ．Ｗ．　１８３μＬ
２．　１．５ｍＬマイクロチューブに５０μＬずつＯｎｅ−Ｓｔｅｐ　Ｂｕｆｆｅｒを分注。
３．　ＹＰＤプレート培地にｏ／ｎで培養したイーストＢ３１系統を２０μＬ程度掻き取りマイクロチューブのｂｕｆｆｅｒに加えてよく混ぜた後遠心で上清を取り除き、５０μＬ　Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ　Ｂｕｆｆｅｒ，５μＬ　ｃａｒｒｉｅｒ　ＲＮＡ，５μＬ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ（ｐＹＥＳ２，ｑＮａＣｌ３−ｐＹＥＳ２，Ｎｈａ１−ｐＹＥＳ２等）をそれぞれ加えてよく混ぜる。
４．　４２℃で１．５ｈｒ培養。
５．　１００μＬのＤ．Ｗ．を加えて混ぜ、ＳＤプレート培地（−ＵＲＡの選択培地）にｐｌａｔｉｎｇ。
６．　３０℃、２−３日培養で形質転換コロニーが出現。
　また、形質転換体の培養は以下の方法で行った。
　ＳＤ（−ＵＲＡ）液体培地でｏ／ｎ培養した形質転換イーストを希釈してＯＤ　６００が１．０になるように希釈し、２．５μＬずつそれぞれの塩濃度、或いはｐＨ条件のＳＤ（−ＵＲＡ）プレート培地に滴下し、３０℃で培養し、１週間後に写真撮影を行った。
　ｑＮａＣｌ３遺伝子導入形質転換ダイズの塩ストレス処理
１．ｑＮａＣｌ３遺伝子発現への影響
　ｑＮａＣｌ３遺伝子導入形質転換ダイズＴ２世代４系統（５４−１−１，３４−２−７，２０−１−４，１６−１−８）を作出した。
　ｑＮａＣｌ３遺伝子導入形質転換ダイズＴ２世代系統は、以下の方法により作出した。
　国内ダイズ品種「カリユタカ」を形質転換体材料として用いた。本品種はダイズ品種の中でも特に培養品種に優れる（Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２４：５３３−５３６）ことから、供試材料に用いた。また、形質転換の方法については既存（Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２７：２１７−２２０）の方法を用いて行った。まず、種子を１週間程度保湿した密閉容器の中で調湿（吸水含量を上昇させる）した。この種子を一晩浸漬し、吸水させた。その後、種皮を取り除き、メスで裁断し、外植片を準備した。特に、不定芽が誘導できる胚軸の基部においてはメスを用いて小さな傷をつけアグロバクテリウムの感染を促した。遺伝子発現ベクターとして耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３を３５Ｓプロモーター（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）に連結し、さらに選抜マーカーとしてｂａｒ（グレフォシネート耐性）遺伝子を含む発現プラスミドベクターを構築した。このベクターをアグロバクテリウムＥＨＡ１０５株に導入した。ｑＮａＣｌ３遺伝子を恒常的に過剰発現させられるようにしたバイナリーベクターを保有するアグロバクテリウムＥＨＡ１０５株を外植片に感染させた。５日間の共存培養後、アグロバクテリウムを洗浄し、グルフォシネートを６ｍｇ／Ｌ含むシュート誘導培地で２週間ｘ２回培養した。その後、同濃度のグルフォシネートを含むシュート伸長培地に２週間ｘ４回培養し、その間に十分に伸長したシュートを発根培地へ移植した。発根後、培養土に移植し、約３カ月養成したのちに種子を収穫した。これらの種子を播種し、１，０００倍に希釈した除草剤「バスタ」を幼植物体の葉に塗布し、導入遺伝子を保有する個体を選抜した。選抜された個体およびその後代を様々な分析対象の材料として用いた。
　得られたｑＮａＣｌ３遺伝子導入形質転換ダイズ系統（５４−１−１，３４−２−７，２０−１−４，１６−１−８）を塩ストレス処理（１００ｍＭ　ＮａＣｌ，２４ｈ）し、その後ダイズの根よりトータルＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによりｑＮａＣｌ３遺伝子の発現解析を行い、さらにリアルタイムＰＣＲによりｑＮａＣｌ３遺伝子の発現量を解析した。この際、野生型品種であるＫａｒｉｙｕｔａｋａ、Ｋａｒｉｙｕｔａｋａの３５Ｓ：ＧＦＰ遺伝子で形質転換したダイズ系統、ならびにダイズ耐塩性準同質系統の耐性系統であるＮＩＬｓ１８−Ｔおよび感受性系統であるＮＩＬｓ１８−Ｓについてもコントロールとして解析を行った。
　図８に結果を示す。図８中、「Ｋａｒｉｙｕｔａｋａ」は野生型品種を、「ＧＦＰ」はＫａｒｉｙｕｔａｋａの３５Ｓ：ＧＦＰ遺伝子形質転換ダイズ系統を、「ＮＩＬｓ１８−Ｔ」と「ＮＩＬｓ１８−Ｓ」はダイズ耐塩性準同質系統の耐性系統と感受性系統を示す。図８ＡはＲＴ−ＰＣＲによる発現解析の結果を示し、図８ＢはリアルタイムＰＣＲにより発現量の解析の結果を相対的発現レベルで示す。図８Ａに示すように、ｑＮａＣｌ３遺伝子導入形質転換ダイズ系統および耐性系統であるＮＩＬｓ１８−Ｔ系統において、ｑＮａＣｌ３遺伝子の発現が認められた。また、図８Ｂに示すように、リアルタイムＰＣＲの解析の結果、形質転換２０−１−４系統の平均発現量は、耐性系統ＮＩＬｓ１８−Ｔの４．７２倍であった。
　この結果は、目的遺伝子を過剰に発現させるよう構築されている本ベクターを用いることにより、自然変異として存在する遺伝資源をそのまま利用するよりも目的遺伝子を意図的により強く発現させることができることを意味する。加えて、遺伝子の発現をより強くすることで、塩ストレスへの耐性をより強くすることが期待できる。
２．形質転換ダイズ系統の耐塩性への影響
　形質転換ダイズ系統について、実施例３と同様の方法で、耐塩性を評価し、さらにＳＰＡＤを測定した。
　図９に、耐塩遺伝子ｑＮａＣｌ３導入形質転換ダイズ系統（５４−１−１，３４−２−７，２０−１−４，１６−１−８）における１００ｍＭ　ＮａＣｌ処理１４日後葉身の黄色化程度を示した葉のＳＰＡＤ値を示す。図中、＊＊は、野生型品種Ｋａｒｉｙｕｔａｋａと有意差があることを示す（Ｐ＜０．０１，ｔ−ｔｅｓｔ）。また、「Ｋａｒｉｙｕｔａｋａ」は野生型品種を、「ＧＦＰ」はＫａｒｉｙｕｔａｋａの３５Ｓ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）：ＧＦＰ遺伝子形質転換ダイズ系統を、「ＮＩＬｓ１８−Ｔ」と「ＮＩＬｓ１８−Ｓ」はダイズ耐塩性準同質系統の耐性系統と感受性系統を示す。
　図１０に１４日後の生育状態を示す。図１０の右は、標的遺伝子を導入されたｑ３５Ｓ：ｑＮａＣｌ３形質転換ダイズ系統個体の生育を示し、図１０の左は、標的遺伝子を持っていない個体（ヌル）の生育を示す。図１０に示すように、標的遺伝子を導入されたｑ３５Ｓ：ｑＮａＣｌ３形質転換ダイズ系統個体で良好な生育が認められた。
　耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３の準同質系統における塩害圃場での栽培
　これまで本発明者らが育成したダイズ耐塩性遺伝子準同質遺伝子系統（Ｎｅａｒｉｓｏｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ，ＮＩＬｓ）については、ＮａＣｌを含む培養液の水耕法で苗期の耐塩性評価を行い、耐性遺伝子効果を確認した（Ｈａｍｗｉｅｈ　ｅｔ　ａｌ．（２０１１）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１７９：４５１−４５９）。しかしながら、これら系統については他の生育期間（開花期、登熟期）における耐塩性は明らかでなく、また実際の塩ストレス圃場条件下での収量への影響についても明らかになっていない。本研究では、塩ストレス圃場において２００９−１０年の２年間でダイズの耐塩性準同質遺伝子系統３セット（ＮＩＬｓ１８，ＮＩＬｓ２５，ＮＩＬｓ７２）を栽培し、耐塩性遺伝子の効果を調査した。
　ダイズ耐塩性準同質遺伝子系統３セットのそれぞれの耐塩性系統と感受性系統計６系統（ＮＩＬ１８−Ｓ，ＮＩＬ１８−Ｔ，ＮＩＬ２５−Ｓ，ＮＩＬ２５−Ｔ，ＮＩＬ７２−Ｓ，ＮＩＬ７２−Ｔ）および塩感受性対照品種（Ｔａｃｈｉｙｕｔａｋａ）を評価した。圃場試験区設計は、乱塊法３反復で行った。栽培密度は株間０．２ｍ、畦間０．８ｍであった。２００９年は６月１日に播種した。塩処理は、７月７日に塩水灌水により塩ストレスを行った。潅漑塩水の濃度は、海水濃度の約１／４（１２０ｍＭ　ＮａＣｌ）であった。２０１０年は６月４日に播種し、塩処理は７月２７日に行った。収穫後、各系統１０につき地上部乾物および粒重などの形質を調査した。
　塩水処理により、すべての塩感受性系統は葉の黄化および枯死などのひどい塩害症状を示した。評価した３セットの耐塩性準同質遺伝子系統において耐塩性の対立遺伝子を有する系統（ＮＩＬ１８−Ｔ、ＮＩＬ２５−Ｔ、ＮＩＬ７２−Ｔ）の地上部乾物重と子実重は、いずれも耐塩性の対立遺伝子を持ってない系統（ＮＩＬ１８−Ｓ、ＮＩＬ２５−Ｓ、ＮＩＬ７２−Ｓ）よりも高い値を示した。耐塩性系統の子実重は２年間平均して感受性系統の子実重の４．２倍であり、耐塩性遺伝子の効果を塩害圃場において確認できた。
　図１１に、ＤＮＡマーカー選抜より育成した耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３の準同質系統を、塩害圃場で耐性系統（ＮＩＬｓ２５−Ｔ）と感受性系統（ＮＩＬ２５−Ｓ）の生育状況を示す。
　図１２に、ＤＮＡマーカー選抜より育成した耐塩性準同質系統における塩害圃場で耐塩性系統（ＮＩＬｓ１８−Ｔ、ＮＩＬｓ２５−Ｔ、ＮＩＬｓ７２−Ｔ）と感受系統（ＮＩＬｓ１８−Ｓ、ＮＩＬｓ２５−Ｓ、ＮＩＬｓ７２−Ｓ）の子実重の比較の結果を示す。結果は異なる年に行った２回の試験の結果を示す（それぞれ、図１２Ａおよび図１２Ｂ）。縦棒は標準偏差（３反復）を示し、＊＊は、感受性系統と有意差があること（Ｐ＜０．０１）。ＴａｃｈｉｙｕｔａｋａとＣ０１は、対照品種である。
　マーカーを利用した耐塩性ダイズ系統の作出
１．ＳＳＲマーカーの利用
　ｑＮａＣｌ３遺伝子を検出するため、以下のＳＳＲマーカーのプライマーセットを作製した。
（１）ｑＮａＣｌ３遺伝子の上流５．２ｋｂのところに開発したマイクロサテライト（単純反復配列、ＳＳＲ）マーカー（ＳＳＲ２５．８）のプライマーセット：５’−ＴＴＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＡＴＡＧＴＴＣ−３’　（配列番号５）及び５’−ＣＧＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＣＡＴＡＴＡＣ−３’　（配列番号６）
（２）ｑＮａＣｌ３遺伝子の下流１３ｋｂのところに開発したマイクロサテライト（単純反復配列、ＳＳＲ）マーカー（ＳＳＲ５５．５）のプライマーセット：５’−ＴＴＧＧＡＴＡＧＴＡＡＴＧＴＴＧＴＣＴＴＣＧ−３’　（配列番号７）と５’−ＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＧＡＣＴＴＧＡ−３’　（配列番号８）。
　この２つのＳＳＲマーカーを用いてダイズの塩耐抗と感受性より抽出したＤＮＡに対してＰＣＲを行うことにより増幅され、明瞭な多型が認められた。上記プライマーセットを用いてこれらの２つのＳＳＲマーカーの１つまたは２つを検出することにより、マーカー耐塩性遺伝子ｑＮａＣｌ３遺伝子の有無を識別することができた。
２．約３．８ｋｂの挿入断片を検出するマーカーの利用
　本発明で獲得した耐塩性および感受性系統のｑＮａＣｌ３遺伝子の塩基配列より、塩感受性系統では、ｑＮａＣｌ３遺伝子はエキソン３の下流に約３．８ｋｂの挿入断片があり、遺伝子の機能が失われている（図５）。この変異の有無を検出するため、プライマーセット５’−ＣＴＣＧＣＡＡＧＴＧＴＴＣＴＣＡＣＧＡＡ−３’　（配列番号１０）と５’−ＴＴＡＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＴＴＴＧ−３’　（配列番号１１）を設計し、３．８ｋｂの挿入断片の有無の検出を行った。このプライマーを用いて、３セットの耐塩性準同質系統および親品種ＦＴ−Ａｂａｙａｒａ（耐塩性品種）とＣ０１（感受性品種）において検証したところ、すべての耐塩性系統はこの約３．８ｋｂの挿入断片を有していなかった。これに対して、すべての感受性系統はこの挿入断片を有していることが示された。よって、今回単離したｑＮａＣｌ３遺伝子の塩基配列情報を利用してダイズ耐塩性の選抜マーカーの作成ができた。プライマーセット５’−ＣＴＣＧＣＡＡＧＴＧＴＴＣＴＣＡＣＧＡＡ−３’　（配列番号１０）と５’−ＴＴＡＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＴＴＴＧ−３’　（配列番号１１）は、ｑＮａＣｌ３遺伝子の有無を識別するためのマーカーの一例であり、マーカーを利用することにより強い耐塩性ダイズ系統を作出することができる。
　本発明のダイズ由来ｑＮａＣｌ３遺伝子は、植物の塩ストレス耐性（耐塩性）を制御している。ｑＮａＣｌ３遺伝子を塩ストレス耐性を有しないダイズ品種に導入することにより塩ストレス耐性が向上したダイズ品種を得ることができ、塩濃度の高い環境でも高収量でダイズを得ることができる。また、ｑＮａＣｌ３遺伝子をダイズ以外の植物に導入することにより塩ストレス耐性が向上した植物を得ることができる。さらに、ｑＮａＣｌ３遺伝子のＤＮＡ情報に基づいて塩ストレス耐性に関するＤＮＡマーカーを開発し、ＤＮＡマイカー選抜育種により塩ストレス耐性が向上したダイズを育種することができる。
配列番号５~８、１０~１５　プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (16)

  1. 　以下の（ａ）~（ｆ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子；
    　（ａ）　配列番号１または３に表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    　（ｂ）　配列番号１または３に表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
    　（ｃ）　配列番号１または３に表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
    　（ｄ）　配列番号１または３に表される塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ；
    　（ｅ）　配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ；および
    　（ｆ）　配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  2. 　植物の塩ストレス耐性を制御するＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードするｑＮａＣｌ３遺伝子である、請求項１記載の遺伝子。
  3. 　請求項１または２に記載の遺伝子を含有する植物形質転換用ベクター。
  4. 　請求項３に記載の植物形質転換用ベクターで形質転換された塩ストレス耐性が向上した形質転換植物。
  5. 　双子葉植物である、請求項４記載の形質転換植物。
  6. 　ダイズである、請求項４記載の形質転換植物。
  7. 　請求項１または２に記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物の塩ストレス耐性を向上させる方法。
  8. 　植物が双子葉植物である、請求項７記載の植物の塩ストレス耐性を向上させる方法。
  9. 　植物がダイズである、請求項７記載の植物の塩ストレス耐性を向上させる方法。
  10. 　耐塩性を有する植物を育種する方法であって、ｑＮａＣｌ３遺伝子内またはその近傍に位置するＤＮＡマーカーの存在を指標に、耐塩性を有する植物を選抜することを含む方法。
  11. 　ＤＮＡマーカーとして、ＳＳＲマーカーであるＳＳＲ２５．８および／またはＳＳＲ５５．５を用いる請求項１０記載の方法。
  12. 　ＳＳＲ２５．８を配列番号５の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６の塩基配列からなるプライマーのプライマー対を用いて検出し、ＳＳＲ５５．５を配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８の塩基配列からなるプライマーのプライマー対を用いて検出する、請求項１１記載の方法。
  13. 　ｑＮａＣｌ３遺伝子を検出するための以下のいずれかのＳＳＲマーカープライマー対：
    （ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６の塩基配列からなるプライマーのプライマー対；および
    （ｉｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８の塩基配列からなるプライマーのプライマー対。
  14. 　耐塩性を有する植物を育種する方法であって、ｑＮａＣｌ３遺伝子のエキソン３の下流の配列番号９に表される塩基配列からなる約３．８ｋｂの挿入断片を有しない植物を耐塩性を有する植物として選抜し育種する方法。
  15. 　ｑＮａＣｌ３遺伝子のエキソン３の下流の約３．８ｋｂの挿入断片を検出するためのプライマー対。
  16. 　配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマーからなる、請求項１５記載のプライマー対。
PCT/JP2015/054896 2014-02-17 2015-02-16 ダイズ第３番染色体に座上する耐塩性を制御する遺伝子ｑＮａＣｌ３とその利用法 WO2015122546A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201580009062.1A CN106029883A (zh) 2014-02-17 2015-02-16 位于大豆第3号染色体上的耐盐性调控基因qNaCl3及其使用方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014027979A JP5652799B1 (ja) 2014-02-17 2014-02-17 ダイズ第３番染色体に座上する耐塩性を制御する遺伝子ｑＮａＣｌ３とその利用法
JP2014-027979 2014-02-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015122546A1 true WO2015122546A1 (ja) 2015-08-20

Family

ID=52339829

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/054896 WO2015122546A1 (ja) 2014-02-17 2015-02-16 ダイズ第３番染色体に座上する耐塩性を制御する遺伝子ｑＮａＣｌ３とその利用法

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP5652799B1 (ja)
CN (1) CN106029883A (ja)
WO (1) WO2015122546A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106086066A (zh) * 2016-08-23 2016-11-09 东北林业大学 一种组蛋白去乙酰化酶基因转化杨树提高其耐盐性的方法及该基因的应用
CN106282140A (zh) * 2016-08-17 2017-01-04 北京市农林科学院 马蔺耐盐相关液泡膜H+‑PPsae基因及其编码蛋白与应用
CN115927393A (zh) * 2023-01-19 2023-04-07 青岛农业大学 GsHSP基因及其在提高大豆耐盐性和提高豆苗菜中异黄酮的含量的应用
CN116397041A (zh) * 2022-11-23 2023-07-07 山西农业大学 一种与谷子盐碱敏感度紧密连锁InDel标记SiDmr6及其引物和应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201809744YA (en) * 2016-06-17 2019-01-30 Sekisui Chemical Co Ltd Method for improving salt tolerance of plant
CN107058496B (zh) * 2017-01-20 2020-10-09 云南农业大学 一种适于大豆磷效率筛选的ssr引物序列及其使用方法
CN109022607A (zh) * 2018-08-02 2018-12-18 中国农业科学院作物科学研究所 一种多抗基因聚合大豆的育种方法以及多抗基因聚合大豆的应用
CN111763758B (zh) * 2020-07-17 2021-04-23 中国农业科学院作物科学研究所 一种提高植物耐盐性的基因及其相关应用
CN111763250B (zh) * 2020-07-17 2021-04-02 中国农业科学院作物科学研究所 基因在提高植物耐盐中的应用
CN116333077B (zh) * 2023-05-22 2023-08-15 中国农业科学院作物科学研究所 玉米ZmLAC9基因在植物适应盐胁迫中的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101659699B (zh) * 2008-08-25 2011-12-07 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物耐逆性相关蛋白GmSIK2及其编码基因与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Uniprot [o] 13 June 2012 (2012-06-13), Database accession no. I1JPC9 *
SCHMUTZ J. ET AL.: "Genome sequence of the palaeopolyploid soybean", NATURE, vol. 463, no. 7278, 2010, pages 178 - 83, XP055084806, ISSN: 0028-0836 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282140A (zh) * 2016-08-17 2017-01-04 北京市农林科学院 马蔺耐盐相关液泡膜H+‑PPsae基因及其编码蛋白与应用
CN106086066A (zh) * 2016-08-23 2016-11-09 东北林业大学 一种组蛋白去乙酰化酶基因转化杨树提高其耐盐性的方法及该基因的应用
CN116397041A (zh) * 2022-11-23 2023-07-07 山西农业大学 一种与谷子盐碱敏感度紧密连锁InDel标记SiDmr6及其引物和应用
CN116397041B (zh) * 2022-11-23 2023-09-15 山西农业大学 一种与谷子盐碱敏感度紧密连锁InDel标记SiDmr6及其引物和应用
CN115927393A (zh) * 2023-01-19 2023-04-07 青岛农业大学 GsHSP基因及其在提高大豆耐盐性和提高豆苗菜中异黄酮的含量的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015149954A (ja) 2015-08-24
CN106029883A (zh) 2016-10-12
JP5652799B1 (ja) 2015-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5652799B1 (ja) ダイズ第３番染色体に座上する耐塩性を制御する遺伝子ｑＮａＣｌ３とその利用法
ES2550364T3 (es) Plantas que tienen incrementada la tolerancia al estrés térmico
US10913954B2 (en) Abiotic stress tolerant plants and methods
US10662435B2 (en) Plants having altered agronomic characteristics under abiotic stress conditions and related constructs and methods involving genes encoding NAC3/ONAC067 polypeptides
CN104004767A (zh) Wrky转录因子多肽基因应用的载体和方法
CN108368515A (zh) 耐旱玉米
US20190037795A1 (en) Soybean resistant to cyst nematodes
AU2015289691A1 (en) Methods of increasing crop yield under abiotic stress
US10626410B2 (en) Plants having altered agronomic characteristics under nitrogen limiting conditions and related constructs and methods involving low nitrogen tolerance genes
CN106164273B (zh) 耐旱性植物以及涉及编码dn-dtp1多肽的基因的相关组合物和方法
US20140068811A1 (en) Drought tolerant plants and related constructs and methods involving genes encoding zinc-finger (c3hc4-type ring finger) family polypeptides
CA2942826A1 (en) Identification and use of tomato genes controlling salt/drought tolerance and fruit sweetness
US20150307895A1 (en) Plants having altered agronomic characteristics under nitrogen limiting conditions and related constructs and methods involving genes encoding snf2 domain-containing polypeptides
MX2014007711A (es) Metodos para mejorar rendimiento de cultivos.
CN103503777A (zh) 谷氨酸受体多肽基因应用的载体和方法
CN114032245B (zh) 基因VLNHX3D在调节植物细胞Na+和/或K+浓度中的应用
US10676753B2 (en) Constructs and method of use for rice gluatamate receptor-like genes
CA3178261A1 (en) Enhancement of productivity in c3 plants
US20150275225A1 (en) Plants having altered agronomic characteristics under nitrogen limiting conditions and related constructs and methods involving genes encoding lnt5 polypeptides and homologs thereof
US20160040181A1 (en) Agronomic characteristics under nitrogen limiting conditions for plants expressing ph11 or nucpu29 polypeptides
US20160032304A1 (en) Slm1, a suppressor of lesion mimic phenotypes
EP3935181A2 (en) Overcoming self-incompatibility in diploid plants for breeding and production of hybrids through modulation of ht

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15749532

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15749532

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1