CN109609546A - 一种植物多分体病毒载体的开发和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物多分体病毒载体的开发和应用。本发明提供了成套重组病毒载体，包括表达BN1的重组载体和表达BN2的重组载体；所述表达BN1的重组载体为将BNYVV基因组的RNA1全长CDNA序列替换双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA1；所述表达BN2的重组载体为将BNYVV基因组的RNA2全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA2。本发明采用的多分体病毒表达载体能在植物同一个细胞内同时表达多个蛋白；在植物体内表达量比较高，周期短，并且可以系统侵染。

Description

一种植物多分体病毒载体的开发和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种植物多分体病毒载体的开发和应用。

背景技术

植物病毒载体开发的基本原理是利用反向遗传学，在植物病毒的侵染性克隆上寻找合适的位点插入或替换外源片段，随着重组病毒侵染寄主植物，外源基因得到大量地表达。与外源基因稳定表达的转基因系统相比，病毒载体周期较短，外源蛋白的表达量也较大，并且对于转基因操作困难的植物来说，病毒载体系统显得尤为重要。自1984年科学家首次利用花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)表达载体在植物上异源表达细菌基因以来(Brisson et al.,1984)，基于植物病毒改造开发的载体在重组蛋白的异源表达和植物功能基因组研究方面得到了广泛的应用(Palmer and Gleba,2014)。

目前，用于载体开发的植物病毒主要为单分体和双分体病毒，即含有一条或两条基因组核酸链。如属于烟草花叶病毒属(Tobamoviruses)(Takamatsu et al.,1987；Yusibovet al.,1999)，马铃薯X病毒属(Potexviruses)(Chapman et al.,1992；Baulcombeet al.,1995；Zhang et al.,2013)，马铃薯Y病毒属(Potyvirus)(Majeret al.,2015；Jarugula et al.,2016；Seoet al.,2016)和花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)(Brissonet al.,1984)等单分体病毒；属于线虫传多面体病毒属(Necrovirus)(Zhou et al.,2010)，真菌传杆状病毒属(Furovirus)和豇豆花叶病毒属(Comoviruses)(Sainsbury etal.,2008；Zhang et al.,2010)的双分体病毒。也有少数三分体病毒如大麦病毒属(Hordeivirus)(Yuan et al.,2011；Lee et al.,2012；Cheuk and Houde,2018)和雀麦花叶病毒属(Geminiviruses)(Stanley,1993)的成员也被开发为病毒载体。

BNYVV是正单链RNA病毒，典型的多分体病毒，含有4-5条基因组RNA。RNA1和2编码持家基因，RNA3、4和5编码病毒致病和介体传播相关的蛋白。在一些田间分离物或者病毒通过汁液摩擦继代接种时，RNA2、3、4和5的内部会发生片段的缺失，表明这些区域不是病毒复制所必须的，因此这些缺失区域可以改造为外源片段的插入位点。目前，欧洲的两个BNYVV分离物F-13和Yu2已被分别构建了T7和35S启动子下的全长cDNA侵染性克隆(Delbianco etal.,2013；Laufer et al.,2018a)，其中F-13分离物的RNA3和RNA5被改造开发成病毒表达载体，在昆诺黎和大果甜菜上异源表达GFP和RFP蛋白(Erhardt et al.,2000；Schmidlinet al.,2005；Alice et al.,2013；Delbianco et al.,2013；Laufer et al.,2018b)。BNYVV其他组分RNA还未见载体开发的报道。

甜菜一直是世界上一种重要的糖料、能源和饲用作物，并且近年来菜用甜菜由于其独特的营养成分也逐渐受到大众的青睐。尽管2014年已经测定了普通甜菜的全基因组序列(Dohm et al.,2014)，但因为甜菜转基因比较困难，目前其基因的生物学功能研究还未深入开展。因此，开发适用于甜菜的病毒的表达载体对甜菜基因功能的研究具有非常重要的意义。

在植物基因工程和植物功能基因组学研究中，往往需要2个或者多个蛋白同时在一个细胞中表达，如表达疫苗抗原，抗体和异源多聚蛋白复合体等。而目前已有的植物病毒表达载体插入位点较少，通常只含有1个插入位点，极少数含2个插入位点，很难满足在一个细胞中同时表达两个或以上蛋白的要求。此外，大多数植物病毒载体可容纳的外源片段大小约为500-1000bp，当外源片段过长时载体稳定性较差，插入片段极易自发丢失。因此，稳定的病毒多基因表达载体仍需要进一步研究开发。

尽管法国F-13分离物的RNA3和RNA5已被改造成病毒表达载体(Delbianco etal.,2013)，但该表达载体系统仍存在不足，首先F-13分离物的致病性较强，在寄主植物上能诱发严重的症状，这将干扰人们对植物基因的功能研究；同时BNYVV的RNA2和RNA4还尚未开发成病毒载体。

发明内容

本发明一个目的是提供一种成套重组病毒载体。

本发明提供的成套重组病毒载体，包括表达BN1的重组载体和表达BN2的重组载体；

所述表达BN1的重组载体为将BNYVV基因组的RNA1全长CDNA序列替换双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA1；

所述表达BN2的重组载体为将BNYVV基因组的RNA2全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA2。

或，本发明提供的成套重组病毒载体，包括表达BN1的重组载体、表达BN2的重组载体，和，如下三种至少一种：表达BN3的重组载体、表达BN4的重组载体和表达BN5的重组载体：

所述表达BN1的重组载体为将BNYVV基因组的RNA1全长CDNA序列替换双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA1；

所述表达BN2的重组载体为将BNYVV基因组的RNA2全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA2；

所述表达BN3的重组载体为将BNYVV基因组的RNA3全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA3；

所述表达BN4的重组载体为将BNYVV基因组的RNA4全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA4；

所述表达BN5的重组载体为将BNYVV基因组的RNA5全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA5。

上述成套重组病毒载体中，

所述双元表达载体为植物双元表达载体；

和/或，所述植物双元表达载体具体为pCB301-2x35S-MCS-HDV_RZ-NO(pCB301)、pBI121、pCAMBIA3100或pCASS-RZ。

所述多克隆位点为StuI和SmaI识别位点。

上述重组病毒载体在制备植物表达目的核酸的多分体病毒载体系统中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种植物表达目的核酸的多分体病毒载体系统。

本发明提供的多分体病毒载体系统，包括上述表达BN1的重组载体和表达目的核酸和BN2的重组载体；

所述表达目的核酸和BN2的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将上述表达BN2的重组载体中的RNA2全长CDNA序列第1565-1872位核苷酸替换为目的核酸，且其他核苷酸不变，得到的载体。

或，本发明提供的多分体病毒载体系统，包括上述表达BN1的重组载体、上述表达BN2的重组载体，和，如下三种至少一种：表达目的核酸和BN3的重组载体、表达目的核酸和BN4的重组载体以及表达目的核酸和BN5的重组载体；

所述表达目的核酸和BN3的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将上述表达BN3的重组载体中RNA3全长CDNA序列上的p25蛋白编码基因替换为目的核酸，得到的载体；

所述表达目的核酸和BN4的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将上述表达BN4的重组载体中RNA4全长CDNA序列上的p31蛋白编码基因去除终止密码子，且在去除终止密码子p31蛋白编码基因的3'末端融合和目的核酸，得到的载体；

所述表达目的核酸和BN5的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将上述表达BN4的重组载体中RNA5全长CDNA序列上的p26蛋白编码基因去除终止密码子，且在去除终止密码子p26蛋白编码基因的3'末端融合和目的核酸，得到的载体。

上述系统中，所述目的核酸为目的基因或gRNA；

和/或，所述表达目的核酸和BN3的重组载体、所述表达目的核酸和BN4的重组载体以及所述表达目的核酸和BN5的重组载体中的目的核酸相同或不同。

上述系统中，所述目的核酸为目的基因，

所述表达目的核酸和BN4的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将权利要求1中所述表达BN4的重组载体中RNA4全长CDNA序列上的p31蛋白编码基因去除终止密码子，且在去除终止密码子p31蛋白编码基因的3'末端依次融合去除终止密码子的氨基酸自剪切序列和目的核酸，得到的载体；

所述表达目的核酸和BN5的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将权利要求1中所述表达BN4的重组载体中RNA5全长CDNA序列上的p26蛋白编码基因去除终止密码子，且在去除终止密码子p26蛋白编码基因的3'末端依次融合去除终止密码子的氨基酸自剪切序列和目的核酸，得到的载体。

上述系统中，所述氨基酸自剪切序列为P2A蛋白编码基因。

上述的系统在植物表达目的核酸中的应用也是本发明保护的范围。

上述BNYVV基因组为人源的或鼠源的，具体为BNYVV HU分离物基因组。

本发明的实验证明，本发明采用的多分体病毒表达载体有如下优点：

1)多分体病毒表达载体可以插入较长的外源基因片段,且插入的外源基因片段不易丢失，表达稳定性好；

2)该表达载体能在植物同一个细胞内同时表达多个蛋白；

3)该表达载体在植物体内表达量比较高，周期短，并且可以系统侵染。

附图说明

图1为验证BNYVV侵染性克隆在本生烟和大果甜菜上的侵染性；a：BNYVV全长侵染性克隆构建示意图，BNYVV RNA1，RNA2，RNA3，RNA4，RNA5构建到了pCB301载体上。b和c:RT-PCR检测BNYVV RNA2-5在本生烟(b)和大果甜菜(c)的接种叶和系统叶上的积累情况。Mock和BN12345分别代表接种pCB301空载体和pCB-BN12345的检测结果，本生烟的EF1A基因和大果甜菜的Actin基因分别作为内参。

图2为将BNYVV RNA2和RNA4开发为表达载体；a：基于RNA2和RNA4的表达载体示意图。将RNA2外壳蛋白通读区域(RTD)nt1565到nt1872替换成sGFP序列。GUS序列融合到RNA4p31C末端或融合到p31N端27个氨基酸之后。b：本生烟上农杆菌浸润接种pCB301空载体或pCB-BN1/2-G11天后症状照片(自然光)和GFP表达模式照片(长波紫外)。c：接种11天后，利用BNYVV CP和GFP特异性抗体对本生烟系统发病叶片进行Western检测，考马斯亮蓝染色作为内参。d：利用基于BNYVV RNA4的载体在本生烟上系统表达大分子量蛋白。在本生烟上农杆菌浸润接种BN1/2/4-GUS，接种11天后对整株植物进行GUS染色，可在整株水平检测到GUS表达。pCB301空载体作为阴性对照。。

图3为基于BNYVV载体在本生烟上同时表达4个外源蛋白；a：pCB-BN2-sGFP、pCB-BN3-mCherry、pCB-BN4-p31GUS、pCB-BN5-eCFP载体构建示意图。将RNA3上p25序列替换成mCherry序列。eCFP-HA序列融合到RNA5编码的p26的C末端。b：本生烟rdr6i植株叶片接种pCB-BN1/2G/3mC/4GUS/5eC第五天后的症状(自然光)、GFP表达(长波紫外)、GUS表达(GUS染色)结果图。c：激光共聚焦显微镜观察接种pCB-BN1/2G/3mC/4GUS/5eC 5天后的rdr6i本生烟叶片，对照样品没有观察到荧光信号。

图4为基于BNYVV载体在甜菜上多重表达外源蛋白和进行蛋白共定位观察；a：甜研309叶片接种pCB-BN1/2G/3mC/4GUS/5eC第10天后的症状(自然光)、GFP表达(长波紫外)、GUS表达(GUS染色)结果。野生型BNYVV侵染性克隆pCB-BN12345作为对照。b：激光共聚焦显微镜观察接种pCB-BN1/2G/3mC/4GUS/5eC 8天后的甜研309叶片，对照样品没有观察到荧光信号。c：pCB-BN3-GFP-p14和pCB-BN4-RFP-Fib2载体构建示意图，将RNA3p25序列替换成GFP-p14序列，将RFP-Fib2融合到RNA4p31序列C末端。d：pCB-BN1/2/3GFP-p14/4RFP-Fib2接种甜研309叶片10天后，激光共聚焦显微镜观察GFP-p14和RFP-Fib2的共定位情况。接种了野生型BNYVV侵染性克隆pCB-BN12345的叶片观察不到荧光信号。

图5为基于BNYVV载体利用CRISPR-Cas9系统在本生烟上进行基因编辑；a：基于BNYVV的基因编辑载体示意图。本生烟PDS3基因靶标序列和gRNA序列融合到RNA3编码的p31C末端，获得pCB-BN4gRNA：PDS。b：接种了pCB-BN1/2/4gRNA:NbPDS的Cas9超表达转基因本生烟株系(KQ334)叶片出现白化现象(右图)，接种pCB-BN1/2/4的植株叶片则未出现白化现象(左图)。照片拍摄于接种第5周后。c：pCB-BN1/2/4或pCB-BN1/2/4gRNA:NbPDS接种本生烟KQ334株系5周后，RT-PCR检测BNYVV及gRNA：NbPDS的侵染性。本生烟EF1A作为内参基因。d：基于BNYVV的载体在本生烟上成功对PDS3进行基因编辑。提取接种了pCB-BN1/2/4gRNA:NbPDS的KQ334株系白化叶片部分的DNA并扩增PDS3基因片段，NcoI酶切处理后，接着进行2％琼脂糖凝胶电泳(泳道3)。接种了pCB-BN1/2/4的植株DNA PCR产物作为对照(泳道2)。应用软件ImageJ统计突变率。箭头指示酶切产物片段。E：野生型PDS基因及由BNYVV介导的基因编辑载体引起的PDS突变体的Sanger测序结果。靶标序列以红色字体显示，PAM序列以绿色字体显示，NcoI酶切位点由蓝色下划线标出，序列右侧标注了相应突变类型的缺失碱基数和检测到的该类型突变体个数。(-表示缺失了n个碱基)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中引物序列见表1。

表1

pCB301-2x35S-MCS-HDV_RZ-NOS(pCB301)记载在如下文献中：Yao,M.,Zhang.T.Q.,Tian,Z.C.,Wang,Y.C.and Tao,X.R.(2011)Construction of

agrobacterium-mediated Cucumber mosaic virus infectious cDNA clonesand 2b deletion viral vector.Scientia Agricultura Sinica.44,3060-3068。

pUOF6-1-GUS记载在如下文献中，Wu,W.Q.,Fan,H.Y.,Jiang,N.,Wang,Y.,Zhang,Z.Y.,Zhang,Y.L.,Wang,X.B.,Li,D.W.,Yu,J.L.and Han,C.G.(2014)Infection of Beetnecrotic yellow vein virus with RNA4-encoded P31specifically up-regulatespathogenesis-related protein 10in Nicotiana benthamiana.Virol.J.11,118。

pGD-3G-mCherry记载在如下文献中，Sun,Q.,Li,Y.Y.,Wang,Y.,Zhao,H.H.,Zhao,T.Y.,Zhang,Z.Y.,Li,D.W.,Yu,J.L.,Wang,X.B.,Zhang,Y.L.and Han,C.G.(2018)Brassica yellows virus P0protein impairs the antiviral activity of NbRAF2inNicotiana benthamiana.J.Exp.Bot.69,3127-3139.。

质粒pEG102记载在如下文献中，Earley,K.W.,Haag,J.R.,Pontes,O.,Opper,K.,Juehne,T.,Song,K.and Pikaard,C.S.(2006)Gateway-compatible vectors for plantfunctional genomics and proteomics.The Plant journal:for cell and molecularbiology.45:616-629。

本生烟rdr6i记载在如下文献中，Qu,F.,Ye,X.,Hou,G.,Sato,S.,Clemente,T.E.,&Morris,T.J.(2005).Rdr6has a broad-spectrum but temperature-dependentantiviral defense role in nicotiana benthamiana.Journal of Virology,79(24),15209-17。

pGDG载体记载在如下文献中，Goodin,M.M.,Dietzgen,R.G.,Schichnes,D.,Ruzin,S.,&Jackson,A.O.(2010).Pgd vectors:versatile tools for the expressionof green and red fluorescent protein fusions in agroinfiltrated plantleaves.Plant Journal for Cell&Molecular Biology,31(3),375-383.Jarugula,S.,Charlesworth,S.R.,Qu,F.and Stewart,L.R.(2016)Soil-borne wheat mosaic virusinfectious clone and manipulation for gene-carrying capacity.Arch.Virol.161,2291-2297。

pGDR-Fib2记载在如下文献中，Li,Z.G,Zhang,Y.L.,Jiang,Z.H.,Jin,X.J.,Zhang,K.,Wang,X.B.,Han,C.G.,Yu,J.L.and Li,D.W.(2018)Hijacking of thenucleolar protein fibrillarin by TGB1is required for cell-to-cell movement ofBarley stripe mosaic virus.Mol.Plant Pathol.19,1222-1237。

本生烟株系KQ334记载在如下文献中，Yin,K.Q.,Han,T.,Liu,G.,Chen,T.Y.,Wang,Y.,Yu,A.Y.L.and Liu,Y.L.(2015)A geminivirus-based guide RNA deliverysystem for CRISPR/Cas9mediated plant genome editing.Sci.Rep.5,14926。

农杆菌C58CI记载在如下文献中：Wu,W.Q.,Fan,H.Y.,Jiang,N.,Wang,Y.,Zhang,Z.Y.,Zhang,Y.L.,Wang,X.B.,Li,D.W.,Yu,J.L.and Han,C.G.(2014)Infection of Beetnecrotic yellow vein virus with RNA4-encoded P31specifically up-regulatespathogenesis-related protein 10in Nicotiana benthamiana.Virol.J.11,118。

实施例1、重组病毒表达载体的构建

一、重组病毒表达载体

1、重组载体的构建

以pCB301-2x35S-MCS-HDV_RZ-NOS(pCB301)载体为骨架进行BNYVV Hu分离物cDNA侵染性克隆的构建，得到重组载体pCB-BN1、pCB-BN2、pCB-BN3、pCB-BN4、pCB-BN5(图1a)；具体如下：

重组载体pCB-BN1为将BNYVV基因组的RNA1全长cDNA序列(序列1)替换pCB301载体的StuI和SmaI酶切位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA1；

重组载体pCB-BN2为将BNYVV基因组的RNA2全长cDNA序列(序列2)替换pCB301载体的StuI和SmaI酶切位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA2；

重组载体pCB-BN3为将BNYVV基因组的RNA3全长cDNA序列(序列3)替换pCB301载体的StuI和XbaI酶切位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA3；

重组载体pCB-BN4为将BNYVV基因组的RNA4全长cDNA序列(序列4)替换pCB301载体的StuI和XbaI酶切位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA4；

重组载体pCB-BN5为将BNYVV基因组的RNA5全长cDNA序列(序列5)替换pCB301载体的StuI和XbaI酶切位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA5。

二、转化

1、重组菌的制备

将上述5个重组载体pCB-BN1、pCB-BN2、pCB-BN3、pCB-BN4和pCB-BN5分别转化农杆菌C58CI，得到重组菌C58CI/pCB-BN1、C58CI/pCB-BN2、C58CI/pCB-BN3、C58CI/pCB-BN4和C58CI/pCB-BN5。

将空载体pCB301转化农杆菌(菌株C58CI)，得到重组菌C58CI/pCB301。

2、转BN1/2/3/4/5植物的病毒表达表型

将上述5个重组菌C58CI/pCB-BN1、C58CI/pCB-BN2、C58CI/pCB-BN3、C58CI/pCB-BN4和C58CI/pCB-BN5共同浸润本生烟或大果甜菜叶片，得到pCB-BN1/2/3/4/5侵染本生烟或pCB-BN1/2/3/4/5侵染大果甜菜；

具体如下：将5个重组菌分别在含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的液体LB培养基中于28°摇培过夜，3,000rpm离心6min收集菌体，弃培养基，用重悬液(10mmol/lMgCl2，10mmol/L MES，100μmol/l AS)悬浮，调OD₆₀₀各为0.05，室温静置诱导3h以上。无针头的注射器浸润接种本生烟或大果甜菜叶片下表皮。本生烟注射第三和第四片真叶，大果甜菜注射第一和第二片真叶，需将所注射的叶片整片完全浸润。

将重组菌C58CI/pCB301采用同样的方法接入本生烟或大果甜菜叶片，得到pCB301侵染本生烟或pCB301侵染大果甜菜。

上述转化实验中，重组菌的OD₆₀₀均为0.05，本生烟苗龄为5-6叶期，大果甜菜苗龄为2叶期。

在接种5天后，转pCB-BN1/2/3/4/5本生烟的接种叶上出现坏死斑，而接种7天后，转pCB-BN1/2/3/4/5大果甜菜的接种叶上出现黄斑，转pCB301本生烟或转pCB301大果甜菜的接种叶则没有明显症状。

pCB-BN1/2/3/4/5侵染本生烟或pCB-BN1/2/3/4/5侵染大果甜菜分别在第10天和第14天出现系统发病症状，与此前用BNYVV通过病毒接种的症状一致。

接种叶：注射接菌的叶片；

系统叶：注射接菌后整株植物新发病的叶片。

上述结果表明，pCB-BN1/2/3/4/5侵染本生烟或大果甜菜可表现出BNYVV病毒感染的相同性状，表明表达BNYVV病毒的RNA1-5。

重组载体pCB-BN1、pCB-BN2、pCB-BN3、pCB-BN4和pCB-BN5可作为病毒表达载体。

3、转BN1/2/3/4/5植物的RT-PCR检测

接菌后5天的pCB-BN1/2/3/4/5侵染本生烟、接菌后7天的pCB-BN1/2/3/4/5侵染大果甜菜、pCB301侵染本生烟和pCB301侵染大果甜菜的接种叶；

接菌后12天的pCB-BN1/2/3/4/5侵染本生烟、接菌后21天的pCB-BN1/2/3/4/5侵染大果甜菜、pCB301侵染本生烟和pCB301侵染大果甜菜系统叶；

分别用Trizol提取接种叶和系统叶的RNA，以18TR为引物进行反转录合成cDNA，以cDNA为模板，进行RT-PCR。

RNA1-RNA5的特异性引物如下：RNA2：BNCPF、BNCPR；RNA3：P25F、P25R；RNA4：P31F、P31R；RNA5：P26F、P26R，本生烟的EF1A基因和大果甜菜的Actin基因分别作为内参，引物序列(NbEF1A-F/R,BvActin-F/R)详见引物列表。

本生烟的结果如图1b所示，BNYVV为pCB-BN1/2/3/4/5侵染本生烟；mockpCB301侵染本生烟；表明，pCB-BN1/2/3/4/5侵染本生烟的接种叶和系统叶均可稳定检测到RNA2、3、4，而RNA5仅能在接种叶检测到，系统叶上几乎检测不到RNA5的存在，这说明在本生烟上RNA5的系统侵染效率很低，与之前报道的结果相吻合。

大果甜菜的结果如图1c所示，BNYVV为pCB-BN1/2/3/4/5侵染大果甜菜；mock为pCB301侵染大果甜菜；表明，pCB-BN1/2/3/4/5侵染大果甜菜的接种叶和系统叶，不论在接种叶还是系统叶上均能稳定检测到RNA2、3、4、5，这说明，BNYVV所有RNA组分均参与到该病毒自然侵染甜菜的过程中。

上述结果表明，重组载体pCB-BN1、pCB-BN2、pCB-BN3、pCB-BN4和pCB-BN5在本生烟和甜菜上均有侵染性。

实施例2、重组多分体病毒表达载体系统的构建

一、重组载体pCB-BN1和改造的pCB-BN2作为病毒表达载体系统表达单个目的基因以绿色荧光蛋白编码基因sGFP作为目的基因为例。

1、重组载体的构建

重组载体pCB-BN2-sGFP为将重组载体pCB-BN2中的RNA2全长CDNA序列第1565-1872位核苷酸替换为目的核酸(绿色荧光蛋白的编码基因sGFP；序列6)，且其他核苷酸不变，得到的载体(图2a)。

pCB-BN2-sGFP具体构建方法如下：在pCB-BN2的基础上，经Kpn I(1127nt)和Xba I(3948nt)酶切该质粒，分别回收pCB301载体部分和BN2片段，将后者连入经相同酶切的pUC19-T(购自Takara公司)载体，获得中间克隆pUC-BN2，再以其为模板，用引物对BN2-NcoI-1565R/BN2-XhoI-1872F进行反向PCR扩增得到引入NcoI和XhoI酶切位点、并缺失1565-1872nt(非侵染必须)的pUC-BN2线性化片段。经磷酸化自连后，转化MC1022，获得含有pUC-BN2NX质粒的克隆。再以NcoI/XhoI双酶切该pUC-BN2NX质粒，并连入经相同酶切的sGFP片段(用引物对sGFP-NcoI-F和sGFP-XhoI-R，以pGD-sGFP为模板扩增)，获得pUC-BN2-sGFP克隆。以KpnI和XbaI酶切该质粒，回收大片段并连入最开始回收的pCB301载体片段，获得质粒pCB-BN2-sGFP。

2、转化检测pCB-BN2-sGFP的侵染性及GFP的表达效率

将重组载体pCB-BN1、pCB-BN2-sGFP和pCB301空载体分别转入农杆菌C58CI中，得到重组菌C58CI/pCB-BN1、重组菌C58CI/pCB-BN2-sGFP和重组菌C58CI/pCB301；

将重组菌C58CI/pCB-BN1和重组菌C58CI/pCB-BN2-sGFP共浸润本生烟叶片，得到pCB-BN1/pCB-BN2-sGFP侵染本生烟；

以重组菌C58CI/pCB-BN1和重组菌C58CI/pCB301共浸润本生烟叶片作为空白对照，得到pCB-BN1/pCB301侵染本生烟。

观察结果如图2b所示，在接种后第5天，pCB-BN1/pCB-BN2-sGFP侵染本生烟(pCB-1/2G)的叶片开始出现坏死斑，而转pCB-BN1/pCB301的本生烟(pCB301)的对照组叶片则无明显症状。接种11天后，pCB-BN1/pCB-BN2-sGFP侵染本生烟植株上部叶片与pCB-BN1/pCB301侵染本生烟植株的症状相比并无明显区别。然而，在长波紫外照射下，pCB-BN1/pCB-BN2-sGFP侵染本生烟的系统叶片、叶柄、茎等部位均可以观察到明显的绿色荧光，而pCB-BN1/pCB301侵染本生烟上则观察不到绿色荧光。

用GFP多克隆抗体和BNYVV CP多克隆抗体(各个多克隆抗体为免疫原免疫兔得到的抗体)对pCB-BN1/pCB-BN2-sGFP侵染本生烟(pCB-BN1/2G)和pCB-BN1/pCB301侵染本生烟(pCB301)植株的蛋白进行了蛋白免疫印迹检测。

结果如图2c所示，pCB-BN1/pCB-BN2-sGFP可以在本生烟上复制并完成系统侵染，这说明BNYVV RNA2的RTD区域可以插入外源基因。

表明，pCB-BN1和pCB-BN2X可以作为载体系统表达目的蛋白如绿色荧光蛋白。

二、重组载体pCB-BN1、pCB-BN2和改造后pCB-BN4作为病毒表达载体系统表达单个目的基因

以GUS蛋白编码基因GUS作为目的基因为例。

1、重组载体的构建

重组载体pCB-BN4-p31GUS为将重组载体pCB-BN4中RNA4全长CDNA序列上的p31蛋白编码基因去除终止密码子后，在去除终止密码子p31蛋白编码基因的3'末端依次融合去除终止密码子的P2A蛋白编码基因(序列7)和目的核酸(GUS基因，序列8)，其他核苷酸不变，得到的载体，该载体表达去除终止密码子的p31蛋白编码基因、P2A蛋白编码基因和GUS编码基因(图2a)。

pCB-BN4-p31GUS的具体构建方法如下：用引物对P31-GUS-In-F和P31-GUS-In-R，以pUOF6-1-GUS为模板扩增得到GUS片段，用引物对P31C-fx-1和P31C-fx-2以pCB-BN4为模板进行反向PCR得到BN4线性化载体片段，GUS片段和线性化载体通过同源重组的方法得到pCB-BN4-p31GUS。

2、转化检测pCB-BN4-p31GUS的侵染性及GUS的表达效率

将重组载体pCB-BN1、重组载体pCB-BN2、重组载体pCB-BN4-p31GUS和重组载体pCB301空载体分别转入农杆菌C58CI中，得到重组菌C58CI/pCB-BN1、重组菌C58CI/pCB-BN2、重组菌C58CI/pCB-BN4-p31GUS和重组菌C58CI/pCB301；

将重组菌C58CI/pCB-BN1、重组菌C58CI/pCB-BN2和重组菌C58CI/pCB-BN4-p31GUS共浸润本生烟叶片，得到pCB-BN1/2/4-p31GUS侵染本生烟；

以重组菌C58CI/pCB-BN1、重组菌C58CI/pCB-BN2和重组菌C58CI/pCB301共浸润本生烟叶片作为空白对照，得到pCB-BN1/2/pCB301侵染本生烟。

在接种后11天，采集pCB-BN1/2/4-p31GUS侵染本生烟和pCB-BN1/2/pCB301侵染本生烟，进行GUS染色。

GUS染色结果如图2d所示，与pCB-BN1/2/pCB301侵染本生烟相比，接pCB-BN1/2/4-p31GUS的本生烟的接种叶、系统叶、茎、根部均可观察到GUS的表达。

以上结果表明，BNYVV RNA4上可以插入多达880个氨基酸(p31-GUS融合蛋白)的外源蛋白，并可以在本生烟上稳定地系统侵染。

表明，pCB-BN1、pCB-BN2和改造后的pCB-BN4可以作为载体系统表达目标蛋白如GUS。

三、重组载体pCB-BN1、改造后的pCB-BN2、改造后的pCB-BN3、改造后的pCB-BN4和改造后的pCB-BN5作为病毒表达载体系统表达多个目的基因

以sGFP蛋白编码基因sGFP、mCherry、GUS、eCFP-HA作为目的基因为例。

1、重组载体的构建

重组载体pCB-BN2-sGFP，同前；

重组载体pCB-BN3-mCherryΔp25为将重组载体pCB-BN3中RNA3全长CDNA序列上的p25蛋白编码基因替换为目的核酸(报告基因mCherry，序列9)得到的载体。

pCB-BN3-mCherryΔp25的具体构建方法如下：用引物对R3-mC-In-F and和R3-mC-In-R，以质粒pGD-3G-mCherry为模板扩增得到mCherry片段。用引物对R3Δp25fx-1和R3Δp25fx-2，以pCB-BN3为模板进行反向PCR得到RNA3线性化载体，随后mCherry片段和RNA3线性化载体通过同源重组方法获得pCB-BN3-mCherryΔp25。

重组载体pCB-BN4-p31GUS，同前；

重组载体pCB-BN5-p26eCFP-HA为重组载体pCB-BN5中RNA4全长CDNA序列上的p26蛋白编码基因去除终止密码子后，在去除终止密码子p26蛋白编码基因的3'末端依次融合去除终止密码子的P2A蛋白编码基因和目的核酸(eCFP-HA基因，序列10)，其他核苷酸不变，得到的载体，该载体表达去除终止密码子的p26蛋白编码基因、P2A蛋白编码基因和eCFP-HA基因(图3a)。

pCB-BN5-p26eCFP-HA具体构建方法如下：用引物对P26-eC-HA-In-F和P26-eC-HA-In-R，以质粒pEG102为模板扩增得到eCFP-HA片段。用引物对P26Cfx-1and P26Cfx-2，以pCB-BN5为模板进行反向PCR得到RNA5线性化载体，随后eCFP-HA片段和RNA5线性化载体通过同源重组方法获得pCB-BN5-p26eCFP-HA。

2、转化

将重组载体pCB-BN1，重组载体pCB-BN2-sGFP，重组载体pCB-BN3-mCherryΔp25，重组载体pCB-BN4-p31GUS、重组载体pCB-BN5-p26eCFP-HA、重组载体pCB-BN2，重组载体pCB-BN3，重组载体pCB-BN4、重组载体pCB-BN5分别转入农杆菌C58CI中，得到重组菌C58CI/pCB-BN1、重组菌C58CI/pCB-BN2-sGFP、重组菌C58CI/pCB-BN3-mCherryΔp25、重组菌C58CI/pCB-BN4-p31GUS、重组菌C58CI/pCB-BN5-p26eCFP-HA、重组菌C58CI/pCB-BN2，重组菌C58CI/pCB-BN3，重组菌C58CI/pCB-BN4、重组菌C58CI/pCB-BN5；

将重组菌C58CI/pCB-BN1、重组菌C58CI/pCB-BN2-sGFP、重组菌C58CI/pCB-BN3-mCherryΔp25、重组菌C58CI/pCB-BN4-p31GUS、重组菌C58CI/pCB-BN5-p26eCFP-HA共浸润本生烟rdr6i叶片(各菌液终OD₆₀₀各为0.05，注射叶片为6周苗龄的本生烟rdr6i株系10-12片真叶，注射叶片下表皮，整片叶片完全浸润)，得到pCB31-BN1/2-G/3-mC/4-GUS/5-eC侵染的本生烟rdr6i；

以重组菌C58CI/pCB-BN1、重组菌C58CI/pCB-BN2、重组菌C58CI/pCB-BN3、重组菌C58CI/pCB-BN4、重组菌C58CI/pCB-BN5共浸润本生烟rdr6i叶片作为空白对照，得到pCB-BN12345侵染本生烟。

接种后第5天，接种叶在长波紫外照射下可以观察到呈散点状分布的绿色荧光，对接种叶进行GUS染色，发现GUS也在叶片上呈散点状分布，其分布大致与sGFP荧光重合(图3b)。接种后第5天对接种了pCB-BN1/2-G/3-mC/4-GUS/5-eC的叶片进行了激光共聚焦显微镜观察，可同时在一个细胞里观察到sGFP、mCherry和eCFP三种荧光(图3c)。接种pCB-BN12345的阴性对照并无明显的荧光(图3c)。

四、利用基于BNYVV的载体在甜菜上进行蛋白共定位实验和多重外源蛋白表达

甜菜是世界范围内非常重要的经济作物，在糖料生产，生物质能和动物饲料等方面均有重要地位。此前，在甜菜上进行蛋白表达和蛋白共定位观察的结果鲜有报道。

1、利用基于BNYVV的表达载体在甜菜上进行多重蛋白表达

将上述三构建的重组菌C58CI/pCB-BN1、重组菌C58CI/pCB-BN2-sGFP、重组菌C58CI/pCB-BN3-mCherryΔp25、重组菌C58CI/pCB-BN4-p31GUS、重组菌C58CI/pCB-BN5-p26eCFP-HA(图4a)混合并共浸润甜菜栽培品种甜研309的叶片，得到pCB31-BN1/2-G/3-mC/4-GUS/5-eC侵染甜菜。

接种后第7天，采集出现黄斑的甜菜叶片进行长波紫外拍照和GUS染色。激光共聚焦显微镜观察结果与本生烟上的结果一致。

在同一细胞水平可同时观察到sGFP、mCherry、eCFP荧光信号和GUS表达(图4a和4b，具体方法如下：

GUS染色：取叶片浸泡于GUS染色液，37°16hs以上，避光。随后转入70％的乙醇溶液脱色，直至叶绿素被完全漂洗干净。

GUS染色液配制：

0.1M PBS缓冲液：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.42g，KH₂PO₄ 0.27g，溶于900ml蒸馏水，调pH至7.2，定容为1L。

GUS染色液：0.1M PBS缓冲液，0.5mM K₃[Fe(CN)₆],0.5mM K₄[Fe(CN)₆],10mMNa₂EDTA,0.1％(V/V)TritonX-100,0.25mg/ml X-Gluc。)

激光共聚焦显微镜观察荧光蛋白定位情况：所使用仪器为徕卡SP8激光共聚焦显微镜，相应的荧光蛋白及其对应使用的激发波长分别为：eCFP，430nm；GFP，488nm；RFP或mCherry，546nm。

以接种野生型BNYVV的甜菜叶片为对照，结果观察不到荧光信号和GUS表达(图4a和4b)。

2、利用基于BNYVV的载体在甜菜上进行了蛋白共定位观察

先前报道中，融合了eGFP的BNYVV p14蛋白在昆诺藜BY2细胞中定位于核仁和细胞质(Chiba et al.,2013)，但p14在BNYVV天然寄主甜菜上的定位情况未见报道。利用基于RNA3的载体表达GFP-p14融合蛋白，利用基于RNA4的载体表达RFP-Fibrillarin作为核仁marker(图4c)。

1)重组载体的构建

pCB-BN3-GFP-p14Δp25为将重组载体pCB-BN3中RNA3全长CDNA序列上的p25蛋白编码基因替换为目的核酸(GFP-p14，序列12；GFP为序列12的第1-717位；p14为序列12的第718-1107位)得到的载体(图4c)。

pCB-BN3-GFP-p14Δp25具体按照如下方法制备：为了构建pCB-BN3-GFP-p14Δp25，首先构建了质粒pGDG-p14。将BNYVV p14基因构建到pGDG载体上，得到质粒pGDG-p14。用引物G-P14-In-F和G-P14-In-R以pGDG-p14为模板扩增GFP-p14片段，以pCB-BN3为模板，用引物R3Δp25fx-1和R3Δp25fx-2进行反向PCR得到RNA3线性化载体片段，将GFP-p14片段和RNA3载体片段利用同源重组的方法得到质粒pCB-BN3-GFP-p14Δp25。

pCB-BN4-RFP-Fib2(图4c)为将重组载体pCB-BN4中RNA4全长CDNA序列上的p31蛋白编码基因去除终止密码子后，在去除终止密码子p31蛋白编码基因的3'末端依次融合去除终止密码子的P2A蛋白编码基因(序列7)和目的核酸(RFP-Fibrillin2，序列13；RFP为序列13第1-675位；Fibrillin2为序列13第672-1620位)，其他核苷酸不变，得到的载体，该载体表达去除终止密码子的p31蛋白编码基因、P2A蛋白编码基因和RFP-Fibrillin2编码基因。

pCB-BN4-RFP-Fib2具体按照如下方法制备：

用引物R-Fib-In-F和R-Fib-In-R，以pGDR-Fib2为模板扩增RFP-Fibrillin2片段，以pCB-BN4为模板，用引物P31C-fx-1和P31C-fx-2扩增RNA4载体片段，将RFP-Fibrillin2片段和RNA4载体片段利用同源重组的方法得到质粒pCB-BN4-RFP-Fib2。

2)转化

将重组质粒pCB-BN3-GFP-p14Δp25和pCB-BN4-RFP-Fib2分别转化农杆菌，得到重组菌C58CI/pCB-BN3-GFP-p14Δp25和重组菌C58CI/pCB-BN4-RFP-Fib2。

将重组菌C58CI/pCB-BN1、重组菌C58CI/pCB-BN2、重组菌C58CI/pCB-BN3-GFP-p14Δp25和重组菌C58CI/pCB-BN4-RFP-Fib2混合并共浸润甜菜栽培品种甜研309的叶片，得到pCB-BN1/2/3-G-p14/4-R-Fib2侵染甜菜。

在接种后第10天用激光共聚焦显微镜观察蛋白定位情况。RFP荧光信号位于核仁(图4d)，而GFP荧光信号在核仁和细胞质中均有存在(图4d)，这说明，GFP-p14在甜菜上的定位情况与在昆诺藜BY2细胞上的定位情况一致。

上述结果表明，基于BNYVV的载体可以成功实现在甜菜上同时表达四个外源蛋白，并可在甜菜上用于研究蛋白共定位情况。

五、利用BNYVV载体表达gRNA，应用CRISPR/Cas9系统进行植物基因编辑

CRISPR-Cas系统已成为了研究植物基因功能的重要工具(Lowder et al.,2015)。对该系统而言，高效的靶向RNA(gRNA)表达是该技术成功的关键。由于植物病毒在其寄主上可以高效复制，基于植物病毒的表达载体有很大潜力进行gRNA的表达，进而在植物上实现基因编辑。

利用基于BNYVV的载体在本生烟上表达gRNA。

1、重组载体的构建

重组载体pCB-BN4-gR:PDS为将重组载体pCB-BN4中RNA4全长CDNA序列上的p31蛋白编码基因去除终止密码子后，在去除终止密码子p31蛋白编码基因的3'末端融合和目的核酸(gR:PDS，序列11)，其他核苷酸不变，得到的载体(图5a)，该载体可表达gR:PDS序列。

pCB-BN4-gR:PDS具体按照如下方法制备：用引物对gRPDS-31C-1/2以pCB-BN4为模板，得到亚克隆pCB-BN4-gRNbPDS-1，再用引物对gRPDS-31C-3/4以亚克隆pCB-BN4-gRNbPDS-1为模板进行反向PCR，最终得到pCB-BN4-gR:PDS。

2、转化

将重组载体pCB-BN4-gR:PDS转入农杆菌C58CI中，得到重组菌C58CI/pCB-BN4-gR:PDS。

将重组菌C58CI/pCB-BN1、重组菌C58CI/pCB-BN2和重组菌C58CI/pCB-BN4-gR:PDS共浸润Cas9超表达的转基因本生烟株系KQ334，得到pCB-BN1/2/4-gR:PDS侵染本生烟KQ334。

将重组菌C58CI/pCB-BN1、重组菌C58CI/pCB-BN2和重组菌C58CI/pCB-BN4共浸润Cas9超表达的转基因本生烟株系KQ334，得到pCB-BN124侵染本生烟KQ334，作为阴性对照。

接种4周后，pCB-BN1/2/4-gR:PDS侵染本生烟KQ334部分系统叶开始出现白化现象，在接种后第5周，白化现象最为明显(图5b)。综合3次实验结果，78％(26/30)的pCB-BN1/2/4-gR:PDS侵染本生烟KQ334在第五周有部分系统叶片出现白化现象，而pCB-BN124侵染本生烟KQ334则没有叶片白化现象发生。

为确定叶片白化是由BNYVV介导的基因编辑系统作用的结果，在接种了pCB-BN1/2/4-gR:PDS的植株上用RT-PCR的方法检测了gRNA的表达(图5c)，所用引物为PDSgR-F，PDSgR-R。

随后，采集了白化叶片并提取基因组DNA，作为阴性对照，对pCB-BN124侵染本生烟KQ334植株叶片同样提取了DNA。以200ng基因组DNA为模板扩增PDS基因内一段404bp的序列(引物对NbPDS3-404bp-F/R)，该序列包含了靶标序列(靶标序列C末端有NcoI酶切位点，图5a)，回收PCR产物并用NcoI酶切处理。

结果表明，来自pCB-BN124侵染本生烟KQ334的DNA的PCR扩增产物被完全酶切成了两条更小的条带(图5d，泳道2)。然而，来自pCB-BN124侵染本生烟KQ334的DNA的PCR扩增产物仅有一小部分被酶切开，ImageJ软件分析显示，来自pCB-BN124侵染本生烟KQ334植株DNA的PDS基因PCR扩增产物有85％未被酶切开(图5d，泳道3)。克隆并测序了未被NcoI切开的PDS片段，通过序列比对发现了来自8个克隆的5种PDS缺失突变(图5e)，这表明，共浸润了pCB-BN1/2/4-gR:PDS的本生烟株系KQ334上的PDS基因的确被编辑了。

以上结果表明，基于BNYVV的载体可以表达gRNA，并在本生烟上进行高效的基因编辑。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种植物多分体病毒载体的开发和应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6746

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

aaattcgatt cttcccattc gccatcattg aatcattact cgtgtactgg aacgcggtta 60

ggagtggctc caaagcatct tctttgaaaa tagattgcga agtgagttca cctaagacga 120

cgtcggtgtt ttacgagttt ttacataatc aacatggcag attcgttcgg ttttactcca 180

atggaggttt tgctttttgg tggtgaatcg gttcagttgt taacttcaga catgcctatt 240

gatgtccagt ggggctttgt acactccact cgatgttatg ctctctggaa agacgacttg 300

attcatctca atccgctgtt gaaatattca cagcgaattg caaaacggtg ggaaaggtta 360

gtttcgggct ttgttggccc agtaccgctt gataagttgt tgtctttgtt ggcaaaactt 420

atgaggtatt gtgttaacat gggggtgtct gtacaggaga tatatttgtc tgatgctatt 480

gtttcatcgt cttatatgtt gcatgtgtct aggagtgcag gttgtgtgtc ttttagttgg 540

ttgtatgcca agctgtccat gtttgcttcg tgtggcaagt tctgggtagg gtcttcacat 600

cacacggctg ccaacatgat tgaaggttcc cgtgctgtga atggtccgga tgtggctatt 660

tctgagatgg ttgaagcctt ccatttagag gtgaagtctt cactcgttgt aactgtatct 720

ttgactccta gggagaaaaa gattttggag cgagagctag gttttgtgcc gttgtacaaa 780

cagaaaagta gagctccacg caatcaccca gtgctggctg ctcttcgcga ggttatgagg 840

caggagtact ctgctagttg taatattctt aatacaaagt tgaaaacact ggtagttggt 900

gctgccagtc gtgaagttaa ttgttattcg tctaatccgt ctgtacatta ctattttgct 960

aataaagata gcaaggattt ggtaaggacc actctggagt tgttgcatag cgctttggct 1020

acaaagtacc gcaatatgga aagtggtgag cgagaactca tgaataattt gaagggttgt 1080

ggttatattg tcaaaaggtc ggttgaaaat gctgtctatg aggttgtttc cgataaagat 1140

gttgccgaag tgttaaggta tgcgcaaact gtcgcttcaa cgaagaaaga ggcgaaaagg 1200

aaacccaaca ctggaaagcg aaaaatggtc atgtcggaag caactcgtag aacaatcgaa 1260

ctgcatgagt tgtcgcgtat tgtagccgaa gagaagaaga ttcctaacca tttccacttt 1320

gatgaaagtg attttgcttc tgttggtaat tttactcagt tggtttgtga agatgttggt 1380

tacaattttt ctgtggatgc ttggttgcat ttgttcgagg cgaccggtgc gcagactgcc 1440

gttggttata tggcattgcc taatgaactt ttgtttgaac attatccgat atcagattat 1500

tatgattatt gggagggtgt tgaaaagcat ggttcattgg gtggtattac tgtttcccct 1560

ttgcggaatg gacaggttgt tggtatgccg actggggttt ttcaacctgt tcattttgac 1620

aagacgtctg ctggtttagg tattcctggt tcaaagatgg gtactgctga acgtgttata 1680

tgtcacatgt cagatggact tggaaatggc tacaatcatg ttaaaagtga ttggcagacg 1740

ttgttgaaac atcctatttt gtcttcttca aagtataatt ttgctgttga agtggattta 1800

acgggacgtt atggttgtct tgccaccttt cggttaactc gtgtgactgg agtcaagtat 1860

gttgctagaa ctataaaatt gcgtccagaa gataggtatg ttcgggtgtt ggatttgtta 1920

catattgtgc gtagtattag gttgaaaggg catgccggtt tgaaagaacc atatcagtat 1980

tttcctgtgt ataaacgtga ggtagatacg acggtgtctt actgtttttc tattgctgaa 2040

aaatcgttga cagtacaaaa cattgctaat tttattagac atcatattgg tggtgtttct 2100

ttagttaaca aagaattagt atcggcgtgg cgtctgaatc cacaacttgt tccttcgttc 2160

gcatatgccg tttactttta tgttgttaat ttgagaggtg agttggatgg gatgttgcag 2220

aagttaatga aaaagggtat cacatgggca gataggttga aggctaatgt ttcagcgttt 2280

ttgcgagata tggtagatcc tattagtttt ttgtggacgt ggttatttga gaggagatta 2340

gtcgatcaaa tttttcagga tgggactgat gttttttacc agatggatcg tgcttgtgtt 2400

gatgagaagg cattgcgttt gaacgatcac attaaaatta cacgagactt tttgcccgct 2460

gacactttac ttcctgaagg atggtcttta gacgattggg aaaaagctcc cgatagtttg 2520

aagactcttt cggcagctgc ttcgttgcca gtagagtgcg gggcggtaaa ttgtgttggt 2580

aagtcgttta agagcgtgcg tactctatta ccaccatctg ttgttacttc acctgttgag 2640

cagtttttca aatctggtgg taaatttaga gatgatgccg agtttgcgga attgttgagt 2700

gcgcactatc gctggcagat ggacaattct ttttgtgctt gtcaggtttg tgctgctttg 2760

actggtaaaa cgggttctca agttgttgaa tgcagatgga aagctgagtc tatgtataca 2820

ttttctatgt cacaaactga ggttgatgat tttagaaatg agattaaggc tcaatctatt 2880

gaaaagggaa atcgttttgg tgaaatgtta ataggtgtac atcagaaaat tcctacacaa 2940

gcttttgagg tttcagttcg actcgaatat gttaaaggtg ggcctggtac gggtaaatct 3000

tttcttatac gatcattggc tgaccctatc agggatcttg tggttgctcc gttcataaaa 3060

ttgcgttctg attatcagaa tcaacgagtt ggtgatgagc ttctttcttg ggactttcac 3120

acgcctcaca aagcattgga tgttactggt aagcagatta tttttgttga tgagtttaca 3180

gcctatgatt ggcgtttact agctgtgttg gcttatagaa atcatgccca tactatttac 3240

ttagttggtg atgagcagca gactggtatt caagagggtc gtggagaagg aatatcgata 3300

cttaacaaaa ttgatctgtc taaggtttct acacatgttc caatcatgaa ctttagaaat 3360

cctgtccgtg atgttaaggt attaaattat ctgtttgggt ctcgtatggt tcctatgtct 3420

tccgttgaaa agggatttag tttcggggat attaaagaat tttcgtcttt gtcaaatatc 3480

ccagacacta aaatcattca ttattccgat gagactggtg aacatatgat gcctgattac 3540

gttaggggag tgtcaaaaac tactgtccgt gctaatcagg gtagtaccta cgataatgtt 3600

gttttgcctg ttttaccatc tgatttaaaa ctgattaact cagctgagtt aaatttggta 3660

gctttatctc gtcacaggaa taagttaacc attttattgg acaatgatgg tatgaatatt 3720

ggtgctgttt tgaaaggcat gcttgagggt gtgccggaag aactcgaaag aagggattac 3780

attgttggga tgtaccttgg gttacattta cctattaaga aagagttctt ctttcctgag 3840

tctgagtttg ctaagtcgtt tagattaatg gttgctaagt atgaggcatt tgtaccttac 3900

gatagtgatc tgccaacttt ggtttcacaa ggagatgtcg ttgttttgga catagcacgt 3960

gtggaaaacg atattaatga tgcctttgat tgtgcagatt tctataatct tgtgtctcgt 4020

cctaacaatt gtttagtagt agctatttca gaatgtttag gtgtgacgct agaaaaattg 4080

gacaatctta tgcaagctaa cgctgtgacg cttgataagt atcacgcgtg gttgtctaag 4140

aagtctccat caacttggca agactgtaga atgtttgccg atgctctgaa ggtttccatg 4200

tacgttaagg ttttatctga caaaccttac gatctaactt atgaggttga tggtgctggt 4260

tcctcagtga cattacattt agttggtaag gaaagcgatg ggcattttat tgctgccccg 4320

cttagtccgt cgctgtctac caatgagaga gagtccggag atgatagtaa gaaaccggct 4380

gatgattctg acacctttga tgctgctaat ttgtttgctg ataagggtgt ttcttccgct 4440

gatatagagg ctttttgtgc ctatttagaa aagactttaa tggcaacaat tatggagtat 4500

gatttgagat tgcaatcgtg ggctaatgtg gttgatgata ctgacgattt ttatcaaatt 4560

aatatttctg agtttcgtca gtccacgtgt tttggtaaat tgttgtcagc gcttgaagtt 4620

ttgaaggttg atgtttcgag gaagaggttt atatctgatt ggttgtgtaa aaatcttgag 4680

aatagacaat tccggtggcg ttggtcttct agtgtggctt caactagttc ggccgggtcg 4740

aatgtcgacg atgattttgt caatatggca gggggaaaga ctgatgctaa tgttgatcct 4800

gctgatgttt tgaggcagag ttttatggat tatgcatcgg aatttgttcc tatccttatc 4860

gctgaatcac caatacttat gccgttagtt gagcctgaac cgatattgtc caagtgtatg 4920

gtgcctgagt ttgacgcctt tttattaata aaggaatttg atttggacaa tggtgctgat 4980

gagtatcaat gcgcttatct taatgaatct gttgctaatc gtgttggtga caaatttgtt 5040

tcgggtgttt tagacactga tattatatct ccattaaatc tgaggggaca tcctattgct 5100

gaaaatgtta aatatcatag tatgtgtgtg gccccggctc agatatattt taagcggaat 5160

cagtggcaag aattacaggt tcaacaggct cggtacttat ttcgaaaagt gagaaattct 5220

ccttcatcga cacaagatag tgttgcacgt atggttgctc agctatttgt ttctgattgt 5280

ttggtgccaa acgtagctga tactttttct gcttccaatt tgtggcgaat tatggacaaa 5340

gctatgcatg acatggtcac aaaaaattat caaggacaaa tggaagagga gtttacgcgt 5400

aatgctaaat tatatcgttt tcagttgaag gatattgaaa aacctttgaa ggacccagag 5460

actgatttgg caaaggctgg tcaagggata ttggcatggt ctaaggaggc acatgttaag 5520

tttatggttg cttttagagt tttaaatgat ttgttattga agtcgttaaa ctctaatgtt 5580

gtttacgata acacaatgtc tgagaccgaa tttgttggaa aaataaatgc cgccatgaat 5640

atagtaccgg atagtgctat aaacggggtt atcgatgctg ctgcttgcga ttctgggcaa 5700

ggggttttca cccaattgat agaaagacat atttatgctg ctttgggcat ttctgatttc 5760

tttttggatt ggtatttctc atttcgtgag aaatatgtta tgcagtccag atatgtcaga 5820

gcacatatgt cttatgttaa gactagtgga gaacccggca ctttgcttgg taacaccatt 5880

ttaatgggtg ctatgttaaa tgctatgctt cgtgggaccg gaccattttg tatggccatg 5940

aagggcgatg atggttttaa aaggcaggct aatttgaaaa ttaacgatca aatgttaaag 6000

ttgataaaaa aagaaactgt cttggatttc aaattggatt taaatgttcc tatcactttt 6060

tgtggttatg ctttatctaa tggacatttg tttccaagtg tttcacgtaa attgacgaag 6120

atagcagcac acaggttccg tgagtataag catttttgtg aataccagga atctttgcgt 6180

gattggatta aaaatcttcc caaagaccca gctgtttatg ctgatttttt ggagtgtaat 6240

gctagcttat cttgtcgcaa tgttgatgat gttcaacgtt ggttggatgc tattatctct 6300

gtgtctcgaa ttgggcgtga gcaatttatg atgatgttcc cgatacggga agtttttatg 6360

tcattgccac ccgttgagga tagtttgggt gagttatctt ctacgaaagt ggctgtgtct 6420

attggggaca atgtttctaa tgttgttaga aaggttgctc gtgtcgatat gaaaaagttt 6480

taatgtgtaa tatagtaata taatacgttg tatacttgtg agtagtataa gtttgaaaat 6540

gaataaaggc catgccacag gcctcctatc ttgatgaagg ttgttgtggt tttctcatta 6600

ctgttttatt attgtttgag ttgcttatgt tggttcttga ttatgtggtg cataattatt 6660

gaactaactg tttgttgggt tgtaatgtac tgactgggtg tgaattgtac cagtcgttaa 6720

agggtttact atcagtatat tgatat 6746

<210> 2

<211> 4612

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

aaattctaac tattatctcc attgaataga atttcaccgt ctgttggttc ttattttgtt 60

ctgggggcaa ttttattcag ggccctactt taaatatagg tgcgagtaat aagtagccgc 120

cgtccagaag aagatagtac taacatgtcg agtgaaggta gatatatgac atggaaggat 180

atgtcacata ataagtttat gaccgatcga tgggctcgtg tttcggacgt cgtgagtgtt 240

attaaacaat cgcatgctat ggacttgtcc aaggctgcga atctatctat aattaaaact 300

gctttggcag gattaggatc gggttggtct gacaataatc cttttgtgtc tccgatgacc 360

cgttttccac agacactaac tacgtatggt gcgcttgtgt tatatgttaa tctgtctgac 420

ccagaatttg cgttgataat gactaaggta aatactttaa ctgattcggg gttagcagat 480

aatgcatctg ctaatgtacg tagagatgtg gtgtctggac ataaagctga atcatccggt 540

aaaactgctg gtactaatga gaactctgct tacacgctta ctgtcagtct tgctggttta 600

gctcaagctc ttaggcttga agaattaatg tggacccggg ataagtttga ggaccggttc 660

aagttaccat ggacacctgt tcaaggtaga accagtccac ccggacaata gcaattagct 720

gctgctcggg tgacggcaca cattcgagcg gcgaagcggg cactattata tcctggtgat 780

agtcccgagt gggttggttg gaaacatttc tatcctcctc caccatatga cgtgtatgat 840

gtgccaccgc tggatattat taacgccaaa ttggctgctg atgatattgg cggtcttgtt 900

actcccacac cggcatcctc acatggtctt ccttttgaag tttctgagga agttgagcag 960

gcaaatagaa atagcctatg gctaacagtt ggactactat tagctgcttt ggcaattggt 1020

attggtgtta ctgcttatca taggaagaag ctccaaagta gattacgtga gttaaaatta 1080

ctatggggct ctactggtgg gtctggtggt ggtggtggtt ttggtaccga gctgtacacg 1140

cgtgctacag acaccgttag tttgggaacc actctttcag agcatgttgc tccagctccg 1200

tcaggattgc ggcaccgacc tgccactact gatagtggac ctcacgaagt gctgccgttt 1260

gaggtgtggg tgtttgataa tctagccgta gtgtatgatt cgattgctat gagtgattta 1320

ttttacactg ttagagagtt tgttggggtg tttaacggtg agtttgaagg gcttatagag 1380

ctgttagagt cacctgatga tgatgatggt gtgtatacga atgctcctag agacactgct 1440

attgatgcct acgaatctca agaaaattac gatcgcattg atattgagac tgttttgatt 1500

gagaggcgga taaacttgaa aaagttgctt cttgaagaag cagagctaga acgacgagag 1560

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tctagggtcg aagcaactca tgtagttacc aaagctgaag ctgacgctcg ggcggctgtg 1680

gctatggctg ctcttgcttc taaggaagct aatgactatg atagtaagat ggcttttgac 1740

aggtcctgta aagaacagga attacggttg cgcgaacttg aagtgaatag tatgccgagt 1800

aaaacagaaa ggtatgttca tactggtata caaggtggtg cgcaattggc tggagctatg 1860

gctgttggtg ctatgctgcg acgtggggct ggttcttctt ctcaaactgt ctctagtggt 1920

gctaatattg gttctcgttc gcagagtttg actcgtggtc gtagtgcatc acaacctttg 1980

tcatcggttg gtggttctac tcgtggggtt aataataata atattagtaa tactaatctt 2040

gttagggctg gtaatagtgt tgaagtttct gctggtagat ctactaatag tggtaatagt 2100

aatttttggt ccaaattacg tgttggtgaa ggatggtcca agtacagcgt agaacgggcg 2160

gcgacaaggg cgcaaagggc aatcgtgctt ccagcgcccc cgtccgctcc cgccggatga 2220

ctcaggatga ctggtcacgt acccatcccg acgatatttt ctcagttatt gagaaaacac 2280

tagtagagga tgggtataaa tggaacgggg tgaaacccgg acattgtgat tggggcaaat 2340

tgaaggaatc tggtgctatt gataatttta ggggtacatt agaaggcgag ttaggtaaaa 2400

attgtgattt aacttgtaat gctgctgccg tcaaactcga cacattgcaa aaggtgaaaa 2460

cgtcatcaga ttggactgcc agagttggta ttgttttggg tgctcctggt gttgggaaat 2520

ctacctcgat taaaaacttg ttagacaaat ttggagcaaa acataaaatg gtgttgtgct 2580

taccttttag tcagttgtta gaaggggtat ttgctggtcg gttggacact tttctggttg 2640

atgatttgtt ctgtaggccc gtagaatacg gaaaatataa caccatgctt gtggatgagg 2700

tcactcgtgt gcatatgtgt gagattttgg tgcttgccgg acatttaggt gttaagaacg 2760

tgatatgttt tggtgatccg gcgcaagggt tgaattataa ggccggttct gccgtgaact 2820

ataattttcc aattattgct gaatgttatg ctagtaggcg gttcggtaaa gcgactgccg 2880

atctcatcaa ttccagcaat ggtggtggta aacctgtagt cggtagtaac gaagtaaagg 2940

atagttggac ttttgaagaa ctatgtggga agatattgga tatgtctact gttttggtag 3000

caacccgtga aacccaaaag tttctattag aagataatat tgagtctatt ctttactcgg 3060

acgctcacgg gcaaacatat gacgttgtca ctatcatttt ggaagacgag tttgatgatg 3120

ctgccatttg cgacccgaat gttagggctg tcttgttaac tagagctcgt aagggtggta 3180

tgatcaaaat gggtcctaac attgctgcca ggttcaaaaa cggtgatttt aattcacgtg 3240

gagttagtaa gtcttgtacc ggagatacct tttgcgaaga tagataatgt ctagggaaat 3300

aaccgctcga cccaataaga atgtgcctat tgttgttggt gtttgtgttg tggctttctt 3360

tgtgttgctg gcgttcatgc agcaaaaaca taagacacat tctgggggtg attacggagt 3420

cccaacattt tctaacggtg gtaaatatag agacggtaca aggtcagctg attttaatag 3480

taataatcat cgtgcttacg ggtgcggtgg gtctgggggt agcgttagta gtcgagttgg 3540

gcagcaactt gttgtgttag ctattgtttc tgtgttaata gtgttactat tacaacgatt 3600

aagatcttca ccagaacaca tttgtaatgg tgcttgtgct taaagtagat ttatctaata 3660

ttgtattgta catagttgcc ggttgtgttg ttgttagtat gttgtactca ccgtttttca 3720

gcaacgatgt taaagcgtcc agctatgcgg gagcaatttt taaagggagc ggctgtatca 3780

tggacaggaa ttcgtttgct caatttggga gttgcgatat tccaaagcat gtagccgagt 3840

ccatcactaa ggttgccacc aaagagcacg atgctgacat aatggtaaaa aggggtgaag 3900

tgaccgttcg tgttgtgact ctcaccgaaa ctattttcgt aatattatct agattgtttg 3960

gtttggcggt gtttttgttc atgatatgtt taatgtctat agtttggttt tggtatcata 4020

gataaattgt ggtagaacga gtatggggat ggtagatagt ttgtgcgtgt ttgttggtcg 4080

agtcgtaact gagggatctg aaagtgttga gggtgtggaa aggttttcca ttaagtttag 4140

tgagtggaaa ttgttcacca ccgcggtgtt tgttgaatat cgtcagttag gtgagaaaga 4200

gtgcagtttg aaagatgttg gtaggttaca ttttaatgtg tcatgtgtga aatgctgtca 4260

aaaacttaaa tgcaagaaac aaaataaaaa tcatagtaaa cacgtccaaa atggatattt 4320

acgcaaggtg cgtaattttt ccattttagg tgtttgcggt gattgttgtg agtcttttac 4380

actcgcggac gaaaaacatc atgttattgt cgatcctgaa gtgtaacagg gtttattcaa 4440

gagactatgt ttaatattaa taatcagggc catgccacag gcctcctatt gggttgttcc 4500

gaaggttgtt gtggtttata ttgcttattg ataagtgatt tgattaaggt tgcagtgtac 4560

tgactgggtg tgaattgtac cagtccatgt agggtctgct ttcagtatat tg 4612

<210> 3

<211> 1775

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

aaattcaaaa tttaccatta catattggta tttatttacc ctcagttggt gatatatgtg 60

agaacgctag cctgttgggt ttcctgaccg accaaatcca agcgagctta atccaagtac 120

ctcgtctcaa attgagtgtc aagtgaataa gcatagtgac cccatcgttt cagggtagtt 180

gacggctatt aatagacata ttacaaacgc ttctctttat ttatcaccaa catgggatgt 240

aatgtttatg cgtgagccta cggccgcatt gtaaaattag tggttttgaa tttctattct 300

tcggaatata caaggtttaa aagaccagca tttgggttaa aaatttttaa accttactat 360

ctttaactag taactcgaac tcgatttata ttcagatttt gaatatcaag ttgttgtgtt 420

ttctgatcat cattaagtga ccgtcatggg tgatatatta ggcgcagttt atgatttagg 480

gcacagacct tacctagcac ggcgtacggt ttatgaggat cgtttgagtc ttagcacaca 540

tggtaatatc tgtcgggcta ttaacttgtt aactcacgat aatcgtacta cactggtgta 600

tcacaataat actaaacgca taaggtttcg tggattattg tgtgtttgtc atgggcctta 660

ttgtgggttt cgtgccttat gtagagtaat gttatgttct ctacctcgtt tgtgtgacat 720

ccctatcaat ggatctcgcg actttgttgc agatcctacc agactcgaca gctctgttaa 780

tgagttgctg gtttctaatg gtctcgtcat ccactatgat cgtgttcatc atgttccctt 840

acacactgat ggttttgaag ttgtagattt cacgactgtc tttcgtggtc ctggaaattt 900

tcttttgcct aatgcaacaa atttccctcg gccaaccaca accgatcagg tttacatggt 960

gtgtttggta aacacggtta attgtgtgtt acgttttgag tccgaactta cagtgtgggt 1020

tcactctggt ttgtatacag gtgatgtttt agatgtggat aataatgtta ttcaagcccc 1080

tgacggtgtt gatgataatg attagagtta tcacaatttc aacaacacac ttattggtgt 1140

gttgttctgt tacaccattt gaaagtttaa taattgtctc aattcgattg ttgatctggt 1200

tgggacaatt attttatttt cttttggtgt aatcgtccga agacgttaaa ctacacgtga 1260

tttcacggtg ttcgatgaga agattgttta acggtgttac gttgtgtacc tttaagcctt 1320

cttctcattt taccacatgt gatgattgta gcctgtgggt tgttatgtgg acaattatgg 1380

ttacttattt gtaaatgata aagagtgtgc ggtagccgac tttatgcgag tgggagtagt 1440

tgtgttatta ctactattct ggttcgtata aagatccttg acggcggcat cgtgggttcc 1500

acagccggtt acatggtgtt cccgtccgtt tacgaaggtt taactgtgag ccttgtattt 1560

tacgaataca cagtttttat cttaacaggc tcgttcacaa gcctcctttt acattaagtt 1620

taaaggttta tgtggacaca aaaatatggc ttattggtta tgctaaacct catatcatgt 1680

tataatattc gtttcatatt ataattaagg ttaagatgta ctgactgggt gtgaaatgta 1740

ccagtccttg tagggttctc tgtcagtgta ttgac 1775

<210> 4

<211> 1468

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

aaatcaaatc tcaaatatat atttgtattt ccagttgatt gtctgtaaaa caattccagt 60

tgtttgtctg taaaacaaac atgtatgctt gatcagcttt gtagatcctt gattatcaat 120

tttatttcta tcattgaatt cgaattgttt ctgttgcgat tatctttacg atttgtgtcg 180

tcatttcgta tattggaaga cgggcctgat tccagtattt attggtcagt ttataggtgc 240

agaacgcttt taagtgagac ctaagactgc gtcggaacct tagattcacg agccgcgtga 300

ttaattgggt ttgtcactgg gatccagtct atcagtaagg ggtagttttt tgttgagact 360

tatctgatta gtaacattta tggctgatgg agagatatgt cggtgtcagg ttactgatcc 420

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gtgttatagt ggtgttgatg ttctgtctga tgagttatgt gaagctaata ttgttcatac 780

ttcggtttcg tctgttgcga tgttcgatag gtcgtataaa cctgaagacg tctggatact 840

attacttacg tctagtactt gttatggtta tcatgatgtt gttgttgaaa tagaccaatg 900

tacattacct tctaatatag atgggtgtgt tcattgttct ggcgtttgct atttcaatga 960

taatcattgt ttttgcggtc gtcgtgatag taatccattc aatccgcctt gttttcaatt 1020

tattaaagat tgtaatgagt tgtatggaac aaatgaaact aaacaattca tttgtgacct 1080

tgttggtgat gacaatttgg acagtgttaa cactctaaca aaagaagggt ggcgaaggtt 1140

ttgtgatgtt ctttggaaca ccgcttatgg tgatgttgag tctcgtactt ttgcacgctt 1200

tctgtggttt gtcttttatc acgattagtg gtatttatga tgtgtttagt tattcgagat 1260

acaagaataa taatatgtat aattgtatta ttaacgggct cgttcacaag cctccttgct 1320

atggtaaggt ttatgtgaac acaaaaatat ggcttattgg ttatgctaaa cctcatatcg 1380

tattaaatat atataagtta aggttgagat gtactgactg ggtgtgaaat gtaccagtct 1440

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<210> 5

<211> 1358

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

aaattcaaag tactttcaca ttgtacttat tagtaccgct gtcctaagtg acgtaagtgg 60

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gtactttgtt tttccgctcg cacaagcgtt aaagtactag ttacagtgca aaaataaaat 360

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aagttacgac tataattata attataatta caatttgtga tggatattga tcattgtatg 480

cctgtatttg atatggcata tagcgacgat aatcacctcc cttattacat acagagatcg 540

actcatcatg tggttcggga tgatgattat actggtttta tatgttatcc tttgcaggtt 600

gatcttaatg ataatgttga ggttggtgct gatatttatc acatgaagat taagactaag 660

agatttaatg ttgatattta taacaacgat gttgccacaa agttcccagg ttgggttagg 720

tttattgtgt tttgtacacc tcctgtgtct tcttgggtta atgacgggtg ctctagtctg 780

ttttcacctt ttgtaggtgt gaatagtttt attgatccta aattgttaaa acgtgatggt 840

catgggatta ctgtgttaca tgatggtatt tattgcttgt gctatcaaga acattttacc 900

agaagttttg agtttaactt tcgtggacct ggtaattata ccctaactaa tgatgtttgt 960

tggtcccccg ctactaatgt agattctata tatgtggctt gtgttgctag ttggtgtggt 1020

gatagtgctt tcatgttgca gtccgatagt gtgtcttggg tactcaagag attttggcaa 1080

cgacctgtgt tggaatttgg gcaatgtttg gatgatctac cagatcatga taatgattgt 1140

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<210> 6

<211> 720

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

atggcaagta aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60

ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120

ggaaaactta cccttaaatt tatttgcact actggaaaac tacctgttcc ttggccaaca 180

cttgtcacta ctttctctta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccaga tcatatgaag 240

cggcacgact tcttcaagag cgccatgcct gagggatacg tgcaggagag gaccatctct 300

ttcaaggacg acgggaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaggg agacaccctc 360

gtcaacagga tcgagcttaa gggaatcgat ttcaaggagg acggaaacat cctcggccac 420

aagttggaat acaactacaa ctcccacaac gtatacatca cggcagacaa acaaaagaat 480

ggaatcaaag ctaacttcaa aattagacac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540

gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600

tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660

cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact atacaaataa 720

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<211> 69

<212> DNA

<213>人工序列

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<210> 8

<211> 1812

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

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ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120

gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180

cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240

ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300

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tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 420

cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 480

ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 540

aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 600

tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat 660

caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac 720

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gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag 840

ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac 900

ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg 960

attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg 1020

gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct 1080

ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc 1140

aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa 1200

aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt 1260

gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg 1320

atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt 1380

gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg 1440

gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt 1500

atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 1560

tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc 1620

agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata 1680

ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg 1740

gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 1800

ggcaaacaat ag 1812

<210> 9

<211> 711

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gcgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711

<210> 10

<211> 747

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgacctg gggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacat cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtac 720

ccatacgatg ttccagatta cgcttaa 747

<210> 11

<211> 103

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 11

ttggtagtag cgactccatg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 103

<210> 12

<211> 1107

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

atggcaagta aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60

ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120

ggaaaactta cccttaaatt tatttgcact actggaaaac tacctgttcc ttggccaaca 180

cttgtcacta ctttctctta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccaga tcatatgaag 240

cggcacgact tcttcaagag cgccatgcct gagggatacg tgcaggagag gaccatctct 300

ttcaaggacg acgggaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaggg agacaccctc 360

gtcaacagga tcgagcttaa gggaatcgat ttcaaggagg acggaaacat cctcggccac 420

aagttggaat acaactacaa ctcccacaac gtatacatca cggcagacaa acaaaagaat 480

ggaatcaaag ctaacttcaa aattagacac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540

gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600

tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660

cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact atacaaagtc 720

gacatgggga tggtagatag tttgtgcgtg tttgttggtc gagtcgtaac tgagggatct 780

gaaagtgttg agggtgtgga aaggttttcc attaagttta gtgagtggaa attgttcacc 840

accgcggtgt ttgttgaata tcgtcagtta ggtgagaaag agtgcagttt gaaagatgtt 900

ggtaggttac attttaatgt gtcatgtgtg aaatgctgtc aaaaacttaa atgcaagaaa 960

caaaataaaa atcatagtaa acacgtccaa aatggatatt tacgcaaggt gcgtaatttt 1020

tccattttag gtgtttgcgg tgattgttgt gagtctttta cactcgcgga cgaaaaacat 1080

catgttattg tcgatcctga agtgtaa 1107

<210> 13

<211> 1620

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

atggcctcct ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

cacaacaccg tgaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360

aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480

acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660

caccacctgt tcctgatggt tgcaccaact agaggtcgcg ggggtggtgg attcagaggt 720

ggtaggggag atggaggagg aagaggagga cgaggtggta gaggtggttt tggcggcggt 780

agaggtggcg gaggaagtgc gatgaaacgc ggcggtggaa gaggcggagg aggcagagga 840

ggagggggaa gaggcggagg aagaggagga cgtggaggtg ggttcaaggg tggtaataag 900

gtagttgtgg agccacatag acatggaggt gtgtttattg ctaagggtaa ggaggatgct 960

ctttgtacta agaatttggt gcccggtgaa gctgtctaca atgagaagag aatctctgtt 1020

cagaatgaag acgggacaaa ggttgaatac agagtgtgga atcccttccg ttctaagtta 1080

gcagctgcag ttcttggagg agttgatgat atctggatta aacctggtgc taaggtcctc 1140

taccttggag ctgcgtcagg aaccacagtg tctcatgttt ccgatcttgt tggtcctggt 1200

ggggtggtat atgctgttga attttctcac agaagtggaa gggacttggt gaacatggcc 1260

aagaagcgca ctaatgttat ccccattatt gaggatgcta gacacccagc aaaatacaga 1320

atgcttgtcg gaatggtgga tgtgatattt tctgatgttg ctcagcctga tcaggcaaga 1380

attttagctc tgaatgcatc atacttcttg aaagctggag gtcactttgt tatatcaatc 1440

aaggccaact gcatagattc aacagtgcca gctgaggctg tatttgctca ggaagtgaag 1500

aagctacaag cagagcagtt taaacctatg gagcaggtca cccttgaacc ctttgaaagg 1560

gaccatgcct gtgttgtggg tgcctatcgg gtgccaaaga agcaaaaggc tgctgcctag 1620

Claims (10)

1.一种成套重组病毒载体，包括表达BN1的重组载体和表达BN2的重组载体；

所述表达BN1的重组载体为将BNYVV基因组的RNA1全长CDNA序列替换双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA1；

所述表达BN2的重组载体为将BNYVV基因组的RNA2全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA2。

2.一种成套重组病毒载体，包括表达BN1的重组载体、表达BN2的重组载体，和，如下三种至少一种：表达BN3的重组载体、表达BN4的重组载体和表达BN5的重组载体：

所述表达BN1的重组载体为将BNYVV基因组的RNA1全长CDNA序列替换双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA1；

所述表达BN2的重组载体为将BNYVV基因组的RNA2全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA2；

所述表达BN3的重组载体为将BNYVV基因组的RNA3全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA3；

所述表达BN4的重组载体为将BNYVV基因组的RNA4全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA4；

所述表达BN5的重组载体为将BNYVV基因组的RNA5全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA5。

3.根据权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于：

所述双元表达载体为植物双元表达载体；

和/或，所述植物双元表达载体具体为pCB301-2x35S-MCS-HDV_RZ-NOS；

所述多克隆位点为StuI和SmaI识别位点。

4.权利要求1-3中任一所述重组病毒载体在制备植物表达目的核酸的多分体病毒载体系统中的应用。

5.一种植物表达目的核酸的多分体病毒载体系统，包括权利要求1-3中任一中所述表达BN1的重组载体和表达目的核酸和BN2的重组载体；

所述表达目的核酸和BN2的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将权利要求1中所述表达BN2的重组载体中的RNA2全长CDNA序列第1565-1872位核苷酸替换为目的核酸，且其他核苷酸不变，得到的载体。

6.一种植物表达目的核酸的多分体病毒载体系统，包括权利要求1-3中任一中所述表达BN1的重组载体、权利要求1-3中任一中所述表达BN2的重组载体，和，如下三种至少一种：表达目的核酸和BN3的重组载体、表达目的核酸和BN4的重组载体以及表达目的核酸和BN5的重组载体；

所述表达目的核酸和BN3的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将权利要求1中所述表达BN3的重组载体中RNA3全长CDNA序列上的p25蛋白编码基因替换为目的核酸，得到的载体；

所述表达目的核酸和BN4的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将权利要求1中所述表达BN4的重组载体中RNA4全长CDNA序列上的p31蛋白编码基因去除终止密码子，且在去除终止密码子p31蛋白编码基因的3'末端融合和目的核酸，得到的载体；

所述表达目的核酸和BN5的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将权利要求1中所述表达BN4的重组载体中RNA5全长CDNA序列上的p26蛋白编码基因去除终止密码子，且在去除终止密码子p26蛋白编码基因的3'末端融合和目的核酸，得到的载体。

7.根据权利要求5或6所述的系统，其特征在于：所述目的核酸为目的基因或gRNA；

和/或，所述表达目的核酸和BN3的重组载体、所述表达目的核酸和BN4的重组载体以及所述表达目的核酸和BN5的重组载体中的目的核酸相同或不同。

8.根据权利要求6或7所述的系统，其特征在于：

所述目的核酸为目的基因，

所述表达目的核酸和BN4的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将权利要求1中所述表达BN4的重组载体中RNA4全长CDNA序列上的p31蛋白编码基因去除终止密码子，且在去除终止密码子p31蛋白编码基因的3'末端依次融合去除终止密码子的氨基酸自剪切序列和目的核酸，得到的载体；

所述表达目的核酸和BN5的重组载体按照包括如下步骤的方法制备：将权利要求1中所述表达BN4的重组载体中RNA5全长CDNA序列上的p26蛋白编码基因去除终止密码子，且在去除终止密码子p26蛋白编码基因的3'末端依次融合去除终止密码子的氨基酸自剪切序列和目的核酸，得到的载体。

9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于：所述氨基酸自剪切序列为P2A蛋白编码基因。

10.权利要求5-9中任一所述的系统在植物表达目的核酸中的应用。