CN1116238A - 用基因工程培育抗黄瓜花叶病毒病蕃茄的方法 - Google Patents

Abstract

利用基因工程技术将黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白的基因转入优质蕃茄细胞后获得转基因植株并在分子水平上证实外源基因已整合到染色体上并得到表达经人工接种鉴定结果表明对CMV具有抗性，这种新的蕃茄株系既保持了原有的优良园艺性状又对CMV有稳定的抗性，适合我国种植和与抗TMV的品种杂交获得双抗杂交品种，这样植株的获得为我国蕃茄和其它蔬菜作物抗病毒育种开辟了一条新途径。

Description

用基因工程培育抗黄瓜花叶病毒病蕃茄的方法

所属技术领域：

本项目所属是分子生物学领域中的植物基因工程学科。

黄瓜花叶病毒病(CMV)是一种蚜传病毒，在蕃茄上危害十分严重，我国已建立对蕃茄抗CMV病毒的选育“八五”蕃茄育种攻关项目，但由于在诸多蕃茄品种中至今没有找到抗源，因此，通过常规育种手段很难解决这一问题，利用黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV—CP)基因，进行蕃茄抗病毒育种。

现有技术(与本发明最接近的现有技术)

本项目采用的技术是植物基因工程育种技术，是一个新兴的高科技学科；以往的经典生物学技术和经典的农作物育种技术无法在同一水平上与之比较、培育抗病毒植物的基因工程方法目前有几种本项目采用的是已为国际承认的有效的方法，即利用病毒的外壳旦白的基因转入植物以防止病毒传染的方法。

植物的病毒危害是农业生产上损失最大的病害之一，到目前为止还没有很有效的方法来防治，通常采用的是用农药来杀死、控制传染病毒的昆虫，保护植物免受病毒侵染。这种方法的缺点是不但化学药品的价格较高，而且往往造成严重的环境污染。另一种方法是组织脱毒法，用于无性繁殖的一些植物。取这类植物的茎尖、芽点等病毒尚未入侵到的组织，通过组培的方法，育出大量的无毒苗，用于田间生产。目前在马铃薯、草莓等生产上已经应用。这个方法的缺点是，组培脱毒育苗不但成本高，工作量大，而且由于病毒的田间再侵染，能维持无毒的有效期不长，两三年后产量又会严重下降。还有一种防病毒的方法叫交叉保护(crossp rotection)法，当把一种病毒的弱株接种到植物上，同种的强病毒再侵染这些植物时，表现出植株受到保护的现象，此时强病毒的侵染能力和致病能力都大大降低。我国从70年代开始，主要将此法用于防治蕃茄上的病毒病，80年代在抗木瓜环斑病毒上也曾使用此法。这个经典的、利用病毒的交叉保护特点建立的方法也存在着一些问题。首先，需要找到一株弱病毒，找到一株适用的这样的病毒，往往需要几年时间；其次，虽然选用的是弱病毒，但仍能在一定程度上降低此种作物的产量；再者，弱病毒株只能与和它相类似的病毒有交叉免疫作用，而对相距较大的病毒种类没有什么作用，有时甚至还能和这些不相关的病毒相互影响，加重病害，使作物遭到更大的损失。加之工作量大，成本高，此法比较难以广泛使用。下面介绍如何利用植物基因工程解决病毒防治，现有5种方法。

第一种方法是向植物转入病毒的外壳蛋白基因。1986年，在美国通过植物基因工程成功地获得抗病毒的转基因植株。他们首次将烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因转移到了烟草和番茄的细胞里去，并培育成株。在这种番茄和烟草的叶片里都测到了烟草花叶病毒的外壳蛋白，并且发现当用烟草花叶病毒侵染这些植物时，这些植株能在一定程度上有抵抗作用。TMV外壳蛋白基因在细胞中的存在，能抑制TMV在寄主细胞中的复制，并能阻止或降低TMV在植株体内的传递。1986年的实验结果是在温室里得到的，后经美国浓业部批准，这种转基因番茄已在美国的几个不同的地区，进行了大田实验。结果表明，它们在大田里的表现和在温室里的表现一致。大田实验的数据说明：有TMV外壳蛋白的番茄，在接种TMV后，只有5％左右的植株得病，而对照植株的发病率是99％。在产量上与无病株相比，含TMV外壳蛋白的番茄几乎不减产，而对照组的产量损失达26—35％。从此提供了一条通过植物基因工程来抗病毒的十分诱人的途径。继抗烟草花叶病毒的外壳蛋白基因工程成功之后，现在已经完成的还有黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、苜蓿花叶病毒(AIMV)和最近即将报导的大豆花叶病毒(SMV)等的外壳蛋白基因工作。应该说，使用转病毒的外壳蛋白基因方法培育出来的抗病毒植物比较安全。因为外壳蛋白本身并没有毒性，我们平日吃的番茄和马铃薯里就有这些病毒，只是到目前为止我们还没有足够的证据证明这个方法能够解决所有种类的病毒为害。也许这种办法有一定的限度，但是直到目前为止我们还未曾发现它有什么副作用。另一个问题是，如果某种病毒的外壳蛋白能够装配虫传的它种病毒的RNA的话，也许会发生危险。但是，直到目前为止并没有提出任何有这种危险存在的迹象和实际根据。

第二种方法是通过病毒的卫星RNA的植物基因工程来防治病毒。不少种类的病毒有卫星RNA。黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA是用于植物基因工程方面最早获得成功的一个例子抗黄瓜花叶病毒的工程植株(转基因植物)。但是人们普遍地认为，因为病毒的卫星RNA存在着不能彻底地抑制它的互补病毒的复制，本身具有很高的突变率，以及与它种病毒互补后会加强被补病毒的为害等几个问题，如果在生产上使用会有一定的潜在危险。因此，目前这方面的研究存在着一些困难，需要设计一些新的实验。如对卫星RNA的cDNA搞些点突变，作些改造，也许能在农业生产上使用。

第三种方法是利用病毒的反义RNA。这个方法最早用在动物病毒上，具体的作法是将病毒的基因组反向地结合在启动子后，这样就能在转基因的细胞里编码出反义基因。当外源的病毒RNA侵染进入植物细胞之后，和这些细胞里编码出来的反义RNA形成互补，构成双链的RNA，使得病毒无法复制，减轻了病毒的为害。利用植物基因工程的技术，已经成功地将植物的一些病毒基因组反过来接在植物的启动子后面，转到植物细胞里去，出现了能抵抗这些病毒侵染的结果。但是，这个方法也还有一些缺点，主要问题是需要比较大量的反义RNA才能彻底抵抗外源病毒的入侵。它的产量起码还要提高50倍，而目前的植物启动子都还达不到这个水平。所以，这个方法可以抵抗不太严重的病毒侵染；当入侵病毒的数量大时，它所起的作用就很小了。

第四个方法是利用植物自己编码的抗病基因。有些植物在受病毒侵染时，表现出一定的抵抗能力，最明显的例子是有的番茄品种能抗烟草花叶病毒。育种家们有许多带抗原的材料。我们可以通过克隆这类抗原基因，得到抗某种病毒的转基因植物。这方面的工作的困难在于分离到能被利用的基因。但是如果这种方法成功，这种转基因植物的危险性应该最小。

第五，利用病毒上的其他基因。前面说到过的是利用病毒中的一个外壳蛋白基因。在病毒基因组中除了外壳蛋白基因外，还有其他一些基因，其中有转移基因、复制酶基因等等，我们有可能用改造基因组的办法得到抗病毒的基因。这个办法目前尚处于探索阶段。

在上述5种方法中，比较成功的还是前三种，在国外都已达到得到转基因植物的阶段，有的甚至已经进入大田实验。我国已经开展这方面的工作，并且已得到了不少成果。针对一些国内广泛流行严重为害的作物病毒，我们实验室开展了它们的外壳蛋白基因分离和转化的工作。现已成功地分离并合成了编码烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和另外几种常见的作物病毒的外壳蛋白基因，并对这些基因作了序列等方面的分析；同时还得到了其中一些病毒外壳蛋白基因对我国现生产用的烟草、番茄优良品种的基因转化植物。全世界每年由植物病毒危害造成的作物减产，至少以10％计。我们这么大的农业国家，其损失难以计数。植物基因工程这一方面的工作对农业增产会有立竿见影的好处，我国需要大力开展这方面的工作。

发明的目的：

在我国对蕃茄生产危害的主要病毒病害是TMV和CMV，TMV的危害已由我国的科技人员用常规杂交育种的方法解决，现有栽培品种基本上都能抗TMV，因此CMV成了蕃茄的头号病毒病害，病情来势猛，且逐年上升，对秋蕃茄、露地春蕃茄都产生危害，轻病年份损失产量的20％左右且品质差，商品率低，重病年份基本绝收。CMV病毒病被视为蕃茄的癌症。

本项目就是针对以上的问题通过基因工程技术，达到科学研究和培育出一个抗CMV的蕃茄品种的目的。

发明的内容及方案：

CMV病毒的构成及特性；黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的cDNA克隆和全序列测定及其比较；菌株及其培养；蕃茄组培系统的优化；蕃茄转化系统的建立；本实验利用CMV—cp基因转化蕃茄植株的结果；转基因蕃茄的DNA分子杂交(Southern blot)；植物蛋白质的提取及Dotblot和Western blot检测；转基因蕃茄植株对CMV病毒抗性鉴定；转基因蕃茄8805田间品质比较试验。

实施例：

一、CMV病毒的构成及特性：

CMV为多分体病毒，通常在CMV病毒粒子中含有四条单链RNA，按其分子量递减的顺序依次是RNA1-4，其分子量分别为1.35×10⁶，1.16×10⁶，0.85×10⁶和0.35×10⁶道尔顿，在株Q株系中RNA1-4的大小依次为3.4Kb，3.0Kb，2.2Kb，1.0Kb。CMV中至少存在三种病毒粒子，两种分别含RNA1和RNA2，另一种含RNA3和RNA4，在同一株系中两种病毒粒子的沉降系数和电泳移动率等物理性质没有明显区别，在四种RNA中，RNA1-3为基因组RNA，为侵染植物所必需，RNA4则是RNA3的衍生物，作为合成外壳蛋白的mRNA。除RNA4之外，RNA3中也有含有编码外壳蛋的基因，事实上，RNA4的序列与RNA3的3′端1.0Kb的序列是完全一致的，RNA3还编码一个3A蛋白，体外翻译实验表，RNA1和RNA2各自编码一个大的蛋白，序列分析结果也显示出这两个RNA各含一个大的编码区，核酸杂交实验指出，CMV RNA1—4的3′端有约300个核苷酸的同源性很高的序列。

CMV有许多独立的株系，不同株系的宿主范围及引起病理现象都有所不同。根据血清学反应和核酸杂交结果，CMV的绝大部分株系被分为两个亚组，第一亚组含较少的CMV株系，如CMV—C、CMV—D、CMV—FnY、CMV—Ma等，第二亚组包括CMV—Q、CMV—R、CMV—S等。CDNA—RNA杂交结果表明，属于同一亚组内的株系间核酸同源性较高，而分属不同亚组的株系间核酸同源性较低。不过，分别属于两个亚组的RNA成分可以混合在一起组建成多种有功能的“杂种病毒”，或称假重组子，因此可以认为两个亚组间存在遗传上相容的RNA。近年来两个亚组成员的基因组RNA的cDNA序列分析已有许多报道，不难发现同一亚组的核酸序列同源率高达90％以上，亚组间核酸序列同源率为70％左右。

二、黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的cDNA克隆和全序列测定及比较

1.病毒的来源及RNA提取

从山东大田的发病烟叶中，提取CMV病毒，用聚乙二醇6000沉淀植物组织抽提液，经差速离心，超速离心和蔗糖密度梯度离心(10—40％)后得到提纯的病毒，将病毒液用蛋白酶K消化，苯酚氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀，得到病毒RNA。

2.cDNA的合成与克隆

人工合成一段含24个核苷酸的DNA序列作为引物：5′—TGGTCTCCTTATGGAGAACCTGTG—3′，该引物由北京大学生命中心ABI DNA合成仪合成，可以与CMV RNA1—4的3′端互补，cDNA的合成是以CMV的总RNA为模板。

双链cDNA用T₄DNA聚合酶进行末端补平，将质粒Bluescript用EcoRV切开作为载体，用T₄DNA连接酶连接后，转化到大肠杆菌DHS细胞中，转化菌经筛选后，挑出其中白色菌落进行分析。在合成cDNA的第一链和第二链时都加入了α—³²P-dATP，经碱性凝胶电泳后，得到放射自显影的X光片，最长的cDNA自段可达3Kb，而CMV RNA基因组在1.0—3.4Kb范围内，所以合成的cDNA中有希望获得外壳蛋白基因的完整序列。

3.筛选和鉴定重组质粒

根据文献报道，CMV外壳蛋白基因中有一个ECoRI酶切位点，其它RNA序列中没有，故用ECoRI酶切的方法筛选重组的质粒，cDNA经连接转化后得到900多个白色菌落，经小量提取质粒，EcoRI酶切分析后得到21个阳性克隆，插入片段在0.5—2.0Kb之间，对其中的一个质粒PHC210的插入片段进行了部分DNA序列分析，发现与发表的CMV—D株系的外壳蛋白基序列相吻合。

4.pHC210质粒插入片段的完整序列分析及与其它株系间外壳蛋白基因同源性的比较

经酶切测定，pHC210质粒的插入片段约有1Kb，为了测定其完整序列，先分析了这段DNA的物理图谱并进而做了不同酶切片段的亚克隆。这段DNA的限制性内切酶点是：SaII(0.1Kb)，EcoRI(0.35Kb)，HindIII(0.36Kb)，XhoI(0.63Kb)，SaII(0.66Kb)。其中EcoRI(0.35Kb)和SaII(0.66Kb是CMV—D的相应序列中所没有的，其它位点和CMV—D一致。DNA序列分析的结果证实了这一点。

通过对pHC210质粒插入片段的四种亚克隆的DNA序列分析，得到了该质粒完整插入片段的序列，经与CMV—D的外壳蛋白基因比较，发现该质粒中含有完整的CMV外壳蛋白基因。该片段全长1008bp，5′端非编码区53bp，3′端具有完整的301bp的非编码区，外壳蛋白基因编码区654bp。这段1008bp的序列与CMV—D的相应序列相比，同源率为92.6％，其中基因编码的同源率为93.9％。与CMV—Q的相应序列相比，同源序列占73.1％，基因编码区的同源序列占77.1％。由这段序列推知该基因编码的蛋白含218个氨其酸残基，分子量为24060。与CMV—D外壳蛋白所含氨基酸残基数相等，分子量也很接近(后者分子量为24100)。序列同源率为96.3％CMV—Q外壳蛋白含有较多的氨基酸残基(236个)，相比之下，二者的同源氨基酸序列占71.5％。

根据血清学反应和核酸序列同源性的比较可以将CMV的绝大部分株系分为两个亚组。CMV—Q、CMV—R、CMV—S等属于一个亚组，CMV—D、CMV—C、CMV—Ma等属于另一个亚组。上述cDNA序列同源性比较表明，流行于我国的这种CMV株系应属于CMV—D所在的亚组。

三、菌株及其培养：

上面已经提到CMV外壳蛋白基因已被克隆在Bs(Bluescript)质粒中，然后将之转移到Ti质粒的中间载体PC024上得到整合中间载体PHCM39。最后通过三亲杂交，被整合到根瘤农杆菌GV—311SE中Ti质粒上T—DNA区段。三亲是指：(1)中间载体，PHCM39，spe+含CMV-cp，(2)土壤农杆菌，GV—311SE，(3)助手质粒PRK2013，最后利用菌落原位杂交验证目的基因是否转入Ti质粒中。

CMV—cp基因所用的启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，它能使外源基因在茎叶等种植物组织中表达，中间载体PHCM39带有NptII基因，使转化体愈伤组织或分化芽能够在含有卡那霉素的培养基上生长。

菌种GV311SE培养在附加卡那霉素Kanamicin 50mg/l，壮观霉素Spectinomycin 50mg/l，氯霉素chloromycercin 30mg/l的LB液体培养基中，26-28℃下100rpm的摇床中过夜培养，菌液培养好后，在冰冻离心机上离心(5000rpm 5分钟)，取沉淀，用1/2MS液体培养基溶解沉淀，在可内光λ＝600时测定0.D值(0.D值在0.15—0.25范围内较合适)。这时的菌液即可用于转化。

四、蕃茄组培系统的优化：

1.外源激素种类及浓度与蕃茄外殖体再生的关系

基本培养基采用MS培养基的大量元素及微量元素成份，B5培养基的维生素成份，蔗糖用量为3％，琼脂用量为8％，另加不同浓度的各种激素和微量元素，PH调至5.8，在121℃下高压灭菌15分钟，本实验所使用的培养基成分如下：

MS培养基(mg/L)微量元素成分：

NH₄NO₃ 1650     MnSO₄4H₂O 22.3

KNO₃ 1900        ZnSO₄7H₂O 8.6

CaCl₂H₂O 440    H₃BO₄ 6.2

MgSO₄7H₂O370    KI 0.83

KH₂PO₄ 170      Na₂MoO₄2H₂O 0.25

Na₂EDTA 37.3      CoCl₂6H₂O 0.025

FeSO₄7H₂O 27.8   CuSO₄5H₂O 0.025

B₅维生素成份：mg/L 肌醇100，VB₆1.0；烟酸1.0，VB₁10；

蕃茄再生诱导培养基的激素成分见表1

表1蕃茄再生诱导培养基的激素成分

激素激素浓度mg/L培养基号	激素种类
		IAA    NAA   2，4-D  BA    ZT    GA 胱氨酸
	M1             0.2                        2.0M2             0.2                  2.0M3             0.2                  1.0M4             0.5                  2.0M5             1.0                  2.5M6                    2.0           1.0M7                          2.0M8                                        0.5      15M9                                        2.0M10                                       2.0   2.0

IAA：吲哚乙酸；    ZT：玉米素；    BA：6-苄基氨嘌呤

NAA：α-荃乙酸；    2，4-D：—二氯苯氧乙酸；GA：赤霉素

切取7—10天苗龄的蕃茄的子叶和下胚轴，用解剖刀切成0.5cm左右的小块或小段，在M₁—M₉培养基上培养3—4周，每个10cm培养皿放置20块外植体，重复一次，其实验结果如表2所示：

表2 各种培养基诱导蕃茄外植体再生的结果(苏8805)

重复	分    培化    养数    基	M1    M2    M3    M4     M5  M6     M7     M8*       *
			重一20块/皿	(芽)块/皿(芽)个/块	16     14     15     14      10    15      17      72.0    2.1    2.3    3.3     1.4   2.0     3.0     1.2
重复二20块/皿	(芽)块/皿(芽)个/块	17     18     13     13      8     14      10      63.1    1.7    1.9    3.0     1.1   1.9     1.5     1.7
			平均	(芽)块/皿**(芽)个/块	16.5   16     14     13.5    9     14.5    13.5    6.582.5％ 30％   70％   67.5％  45％  72.5％  67.5％  32.5％2.6    1.9    2.1    3.2     1.3   2.0     2.1     1.5

*M₆，M₇的分化数指的是愈伤组织的分化数，

**指的是分化百分数，

从上表可以看出：M1、M2分化最好，生芽最多，M3、M4较多，M6、—8产生愈伤组织。所以选用M1、M2为主、辅之M3、M4作为诱导转化植物外殖体以获得转化幼苗。

2.看护培养对转化外殖体的影响

为了建立较理想的转化系统，进一步探索了细胞看护培养对转化外殖体(苏8805)再生的影响见表3。

          表3 胡萝卜悬浮细胞看护培养结果比较

	日期 外殖体数 再生芽数(率) 愈伤组织数(率) 分化芽和愈伤组织总数
		看护培养	3/14   160      2(1.3％)          03/16   300      11(3.7％)     4(1.3％)         26(3.4％)3/20   300      9(3.0％)          0
非看护培养	3/14   160      2(1.3％)          03/16   300      2(0.7％)          0            5(0.8％)3/20   200      1(0.5％)          0

从上表可以看出看护培养的效果是明显的，看护培养得芽率为3.1％，相比非看护培养的得芽率仅为0.7％。从芽和愈伤组织总分化率看，看护培养的分化率(3.4％)是非看护培养的分化率(0.8％)的4倍。可能是悬浮细胞分泌物有利于外殖体的再生。

五、蕃茄转化系统的建立

按Hotsch等人的叶圆盘转化法进行。取培养7—10的蕃茄无菌苗的子叶及胚轴，用解剖刀切成0.5cm左右的小块或小段，浸入前述过夜培养的GV3LLSE菌液3—5分钟，取出用滤纸吸干多余的菌液，将外殖体放在有一层无菌滤纸的MS＋KT1.0mg/L的固体培养基上，于28℃黑暗条件下，共培养48小时后，转入筛选培养基M₁、M₂、M₃、M₄(50mg/L羧苄青霉素＋100mg/L卡那霉素)上。每两周换一次培养基，3—4周后便有芽长出，待芽长到3—5cm时，将芽切下移入生根培养基MSO中诱导生根，2周左右便可见幼根长出。

六、本试验利用CMV—cp基因转化蕃茄植株的结果

试验共选用4个蕃茄品种，转化26000个外殖体，共产芽437个，其中在卡那霉素培养基上能正常生长的不足300个，将152个长得较好的芽转移至生根培养基上，有82个长出了根。根生长良好而叶片呈嵌合状态的有9株，叶片生长正常而根系生长不好的有12株，叶片和根生长均正常的只有42株，将其中35株生长发育良好的植株定植于花盆中见表4。

      表4GV3LLSE转化蕃茄外殖体结果品种    外殖体块数    产芽数(％)    产愈伤组织数(％)苏8805     23000       350(1.5％)       110(0.5％)苏8807     2000        70(3.5％)        25(1.3％)丽春      500         12(6.0％)        9(1.8％)强力米寿   500         5(1.0％)         5(1.0％)

七、转基因蕃茄的DNA分子杂交(Southern blot)

1.植物总DNA的提取步骤

(1)在60℃的水浴中，预热CTAB缓冲液(2％(W/V)CTAB、1.4MNaCl、0.2％V/V疏基乙醇、20nM EDTA、100nM Tris·HCl(PH80))(CTAB：bexodecyltrimethy ammonium bromide，即十六烷三甲基澳化铵)。

(2)剪取约0.1g叶片在液氮中磨碎，把磨碎的叶粉倒入盛有500ul预热过的CTAB缓冲液的ependorf管中，慢慢混匀。

(3)在60℃的水浴中保温30分钟，时而轻轻摇动。

(4)加等体积的24∶1(氯仿∶异戊醇)，轻轻摇匀，4500rpn离心10分钟。

(5)取上层水溶液，加等体积的24∶1溶液，摇匀，45000rpn离心10分钟。

(6)取上层水溶液，加2/3体积的预冷异丙醇沉淀DNA，—20℃放置半小时以上及至过夜，可看到絮状沉淀。

(7)12000rpm离心10分钟，加清洗缓冲液(76％乙醇，10mM醋酸钠)洗涤后，10000rpm离心5分钟，弃去洗液。

(8)真空干燥沉淀物，将沉淀溶于20μl TE缓冲液中(10mMTris，HCL，1mMEDTA PH7.4)。

(9)加RNA酶，使其终浓度为10μg/u(加0.5μlRNase(10mg/ml)＋17.9μl H2O37℃保温30分钟至2小时以除去RNA。

(10)加入200μl饱和苯酚，轻轻混匀，离心10分钟(4500rpn)。

(11)吸取上清液，加入等体积的1∶1(苯酚∶氯仿)，混匀后，4500rpm离心10分钟。

(12)吸取上清液，加上清液1/10体积的3M NaAc(PH5.2)，再加两倍体积的无水乙醇，-70℃沉淀DNA 0.5—2小时，10000rpn离心20分钟。

(13)弃掉溶液，沉淀用70％酒精洗涤后，离心10分钟(10000rpn)，弃酒精，真空抽干，溶于20μl TE中，取4μl的DNA溶液电泳检查。

2.DNA酶切及转移

(1)每个样品及对照(非转化叶片的DNA作负对照，PHCM39质粒DNA中的一段CMV—cp片段作正对照)。各取10μg DNA，用限制性内切酶EcoRI进行消化(8μl植物DNA＋2μl EcoRI酶＋3μl)EcoRI buffer＋17μl H2O 4μl质粒DNA＋2μl EcoRI酶＋3μl EcoRI buffer＋21μl(H2O)，37℃保温过夜后，加6μl酚蓝65—68℃水浴8-12分钟。

(2)用TBE(89mMTris，HCL，89mM硼酸，2mM EDTA)，缓冲液配100ml0.8％琼脂糖凝胶，加2μ的EB(澳化乙锭)、凝结后点样。

(3)35—40V恒压条件下，电泳8—12小时。

(4)停止电泳，在UV下拍照，凝胶留做Southern印迹。

(5)去掉凝胶中不必要的部分，在1.5M NaCl和0.5M NaOH变性液中变性1小时。

(6)倾去变性液，加入中和液(1MTris HCL＜PH为8.0和1.5M NaCl)。中和1小时。

(7)按照《Moleculat cloning》介绍的方法进行Southern转移，转移液为20×SSC(3MNaCL，0.3M柠檬钠，用HCL调PH至7.0，加水至1升)。转移12—24小时。

(8)将转移好的硝酸纤维膜取下，在室温下，用6×SSC泡洗5分钟，将膜取出夹在两张滤纸之间，室温干燥后，在80℃真空中烘烤2小时。

3.探针的制备

杂交所用的探针是中间载体PHCM39的EcoRI酶切的764bp的片段。

(1)DNA片段的制备

用煮沸法提取中间载体PHCM39质粒DNA，用EcoRI酶切(DNA10μl＋EcoRI buffer 2μl＋EcoRIIμl＋H₂O7μl)保温2小时电泳，在紫外光下切下所需要的DNA片段，回收该片段，将回收的DNA片段溶于10μl的TE中。

(2)同位素标记(Nick translation)

取—ependotf管，加入：dATP3.3μl；dGTP3.3μl；dTTp3.3μl；10×NTbuffer 5μl；DNA 5μl；α-³²P-dCTP3μl；DNase I 5μl；H₂O 22μl；混匀后置于15℃水浴中反应1小时之后，加入5μl终止反应滚(0.25MEDTA)，再中5μl NaC，15μl＋tRNA120μl，无水乙醇，-70℃沉淀半小时以上。10000rpm离心20分钟，弃掉溶液，加70％乙醇洗一次，10000rpm离心10分钟，弃去乙醇，用10μl TE溶解。

(3)探针的变性

将得到的探针在100℃水浴中煮10分钟，使DNA变性成为单链探针。置于铅管内，-70℃保存备用。

4、Soutbern杂交

(1)试剂准备：

a、配制10％ SDS溶液；

b、杂交液成分：6×SSC；0.01M EDTA；α-³²P标记的探针；5×Denhardt溶液；0.5％SDS；100mg/ml变性的鱼精DNA；按所需配好后过滤灭菌，然后放到-20℃冰箱中存备用。

c、Denhardt溶液(50×)：聚蔗糖5g；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5g；牛血清蛋白(BSA)5g；用H₂O调至500ml。

(2)预杂交

将转移好的NC膜装入杂交袋内，加入5—10ml的杂交液，尽可能挤出袋中的气泡，封好袋口，将袋浸在68℃的水浴中保温2—4小时，预杂交的目的是减少非特异性杂交。

(3)杂交

从水浴中取出杂交袋，剪开一个小口，把准备好的探针加入袋内，尽可能挤出袋中的气泡，在68℃的水浴摇床杂交12—24小时。

(4)洗膜压片

从水浴中取出杂交袋，剪开，将膜洗液I(2×SSC，0.5％SDS)中，洗脱5分钟，然后转至洗液II(2×SSC，0.1％SDS)洗5分钟，最后转至洗液III(0.1×SSC，0.5％SDS)，68℃条件下洗膜20分钟至到1小时。在室温下将NC膜放在一张滤纸上，晾干后，用保鲜膜包住NC膜，压X光片，置于-70℃冰箱内放射自显影，压片时间根据放射性强度而定。

5、Southern blot结果

DNA分子杂交是dsDNA变性和带有互补序列的同源单链间配对过程，Southernblot可以验证外源基因是否已经整合到植物的染色体上，CMV外壳蛋白的基因全长10008bp，为了方便起见，选用EcoRI酶切外壳蛋白基因中的一段764bp片段作为探针，所检测过的9株中苏“8807”1株、“丽春”1株、余者为“苏8805”品种所转化产生的再生株，转基因工程植株均有杂交带，证明CMV—cp基因已经整合到这些工程植株中。

八、植物蛋白质的提取及Dot blot和Western blot检测

(一)试剂准备

研磨缓冲液：0.28M Tris.HCl pH＝7.6；20％甘油；4％一疏基乙醇；0.02％澳酚蓝；

制胶母液：丙烯胺∶双丙胺(29∶1)制备成30％水溶液2×分离胶缓冲液；0.75M Tris.HCl pH＝8.8；0.2％SDS；10×电极缓冲液；0.25M甘氨酸；％SDS2×浓缩胶缓冲液；0.25M Tris.HCl pH＝6.8；0.2％SDS；

脱胶缓冲液：20％甲醇；10％醋酸；70％水；

转移缓冲液：11.6％甘氨酸；2.4gTtis；0.4gSDS；200ml甲醇；

用水定溶1升pH＝8.3；TNT缓冲液10mM Tris.HCL；150mMNaCL；0.05％ Tween20；

第一抗体：抗CMV抗血清。第二抗体：连接生物素的鼠第一抗体的IgG。

(二)蛋白质的提取

(1)在水浴条件下，取1g蕃茄叶片加研磨缓冲液1ml，研磨成浆状；(2)在沸水中煮10分钟后于10000rpm条件下离心10分钟；(3)取上清液于4℃保存备用。

(三)western blot

(1)电泳

首先配制15％分离胶，待凝固后配制3％的浓缩胶，SDS终浓度为0.1％，凝胶点样后，加1×电极缓冲，恒压150伏电泳3-4小时，走电泳直到澳酚蓝刚走出凝胶边缘。

(2)转移电泳

电泳完成后，将凝胶在转移缓冲液中漂洗20分钟，按照H.Towbin等人的方法，将蛋白质从聚丙烯胶转移到硝酸纤维素(NC)滤膜上(150mA电泳12小时)。取下滤膜，夹在滤纸中放置保存备用。

(3)封闭(blocting)

经转移后的NC膜先用TNT缓冲液冲洗两次后，用含1％BSA的TNT缓冲液封闭30分钟。

(4)第一抗体反应，硝酸纤维素膜经封闭后，用TNT缓冲液冲洗两次，每次5-10分钟，用抗CMV的单克隆抗体按1∶10稀释(TNT)，30℃温浴1小时。

(5)第二抗体反应，结合了第一抗体的NC膜用TNT缓冲液冲洗三次，每次5-10分钟，然后用anti-mouse(抗鼠的)抗体37℃温浴1小时。

(6)显色

NC膜用TNT缓冲液冲洗三次(每次5-10分钟)后，投入含有BCIP/NBT的显色液中，至条带显现清楚为止(3-5)分钟。而后将膜漂于蒸馏水中，取出将凉干，拍照。

(四)Dot blot

取一张NC膜，相隔一定距离点上0.5ml的样品，自然凉干，杂交过程同western blot。

(五)、转基因蕃茄植株中CMV-cp基因表达检测

许多实验证明工程植株对病毒的抗性需要病毒外壳蛋白的参与，而且抗性的强弱与蛋白质的表达量有直接相关，用Western blot的方法可以测定蕃茄工程植株中能否表达CMV外壳蛋白，第一抗体(CMV抗血清)和硝酸纤维膜结合，第二抗体是与碱性磷酸酶偶联的抗鼠IgG，碱性磷酸酶可以使底物产生颜色反应，取样分析的7株(“苏8807”1株、“丽春”1株、“苏8805”5株)转化植株都能全成同一分子量并能与CMV抗血清起特异免疫性反应，而未转化的蕃茄叶片总蛋白则未能与CMV抗血清起特异免疫反应，因而没有出现此种蛋白的杂交带。

这一结果证明了CMV-cp基因已在蕃茄工程植株中得到表达。

九、转基因蕃茄8805对CMV的抗性鉴定及遗传表现

在对转基因蕃茄8805植株进行分子杂交(Southern blot cross)和蛋白质检测(Western blot.Dot blot)以后，虽然证明CMV-cp基因已进入蕃茄细胞染色体中，并能正常表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白。但关键还是看转基因蕃茄对CMV病毒是否具有真实抗性，因此，对转基因蕃茄8805进行人工接种CMV病毒鉴定非常必要。

根据黄瓜花叶病毒在蕃茄上危害引起的病状不同，我们将其分成四个株系(不同于分子生物学的分类标准)即：花叶株系、条斑株系、坏死株系和厥叶株系。其中以花叶株系病症表现最轻，厥叶株系最为严重，本实验所用CMV毒源，系经充分纯化的厥叶株系。

播种床土经高温灭菌消毒，接种在蕃茄两叶一心期进行。接种CMV病毒时，先将带CMV病毒烟叶加磷酸缓冲液研碎，然后用金刚砂进行叶面磨擦接种，接种后用装有蒸馏水的洗瓶冲洗蕃茄叶面，间隔一星期再接种一次，从第一此接种后一个月开始统计发病情况。

(一)转基因蕃茄8805R，接种CMV病毒的结果

选择一株经分子检测证明转化CMV-cp基因且植株生长旺盛，果实较大的8805蕃茄植株(R₀)进行自交留种，将R₁种子播种，按照上述方法进行接毒试验。

             表5 8805R₁代接种CMV病毒结果

品种	病级	总数	发病率(％)	病指
					0    1    3    5    7    9
	8805R18805(CK1)早粉2号(CK2)					50        42   16   1012   18   20   35   712   25   48   40	11892125	57.9100.0100.0	25.957.276.2

从表5可见8805R₁在接种一个月后，发病率57.9％，病情指数25.9，第一对照8805(未转基因)发病率为100％，病情指数为57.2。第二对照“甲粉二号”发病率为100％，病情指数为76.2，这一结果表明：转基因蕃茄对CMV病毒的抗性明显高于对照品种。此外，由于黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因产生抗性基理主要是交叉保护。

接种10天后，8805R₁发病率4.3％，8805(未转基因)为13.5％，甲粉二号为18.4％，接种20天以后，8805R₁发病率15.6％，8805为53.5％，甲粉二号为73.8％，接种一个月后结果同表5。以上结果表明，转基因蕃茄8805R₁不仅发病率低于对照，而且发病速率低于对照，说明CMV外壳蛋白基因能够推迟CMV病毒病症表现。

(二)转基因蕃茄8805R2代接种筛选结果

R1代选择10株抗病性最好的单株留种，R2代分株系进行苗期人工接种鉴定，方法同上，结果见表6。

从表6可见，R2代的10个株系，接种CMV病毒后，其发病率、病情指数绝大部分低于R1代，其中4号单系表现抗性最好，发病率为7.69％，病情指数为4.0。将其单独留种得R3单系，在R2单系接种试验中，仍有少数单系发病率，病情指数偏高，这是由所选择的R1单株在抗性方面仍为杂合体状态，故R2代出现抗分离现象。

(三)转基因蕃茄8805R3单系接种CMV病毒鉴定结果

从8805R2的4号单系中挑选出抗病性单株留种得R3单系，对其进行苗期人工接种鉴定，结果见表6。

8805R3发病率为14.95％，发病最高级数为3级，病情指数为4.98，与R2代4号株系相当，说明抗性已基本稳定，两个对照品种的发病率，病情指数仍相当高，证明所用毒源的致病力相当有效。

                     表6 8805R₁代R₃接种CMV病毒结果

R2单系	病级	总数	发病率(％)	病指
					0    1    3    5    7    9
	12345678910CK1CK2					13        1014             14l0             213             111             711        11   8         305         39              715             59         26    21   14        1715   20   18   5	232812141863.381620115858	43.55016.67.6938.92737.543.82518.2100100	14.527.718.54.021.61124.31465660.5
R3CK1CK2		101       164    22   32   20        2418   28   16   30	12310292	14.9594.4100	4.9547.2869.56

(四)(黄粉×8805R3)F1及(早粉二号×8805R3)F1接种TMV，

CMV病毒鉴定结果

黄粉是一种抗TMV病毒较理想的蕃茄亲本材料，早粉二号是上文提到的第二对照，果实品质优良，但抗病性不理想。

分别利用黄粉、早粉二号与8805R3杂交，配制组合进行接种病毒试验，结果见表7。

1、接种TMV病毒0株系

TMV病毒0株系仍是我国蕃茄生产上TMV病毒的流行株系，因此，选用这一株系进行接种鉴定，结果表明：由于黄粉品种具有显性的抗TMV病毒Tm₂ ^nv基因(8805R3具有抗TMV病毒的Tm1基因)，因此，(黄粉×8805R3)F1接种TMV病毒0株系后均未发病。(早粉二号×8805R3)F1发病率和病情指数分别为12.5％和6.86。

2、接种CMV病毒厥叶株系

将上述两种组合，分别接种CMV病毒，进行抗性鉴定(黄粉×8805R3)F1发病率和病情指数分别为10.86％和4.38，(早粉二号×8805R3)F1发病指数分别为23.76％和16.54，对照8805的发病率和病情指数分别为89.6％和45.3，见表7。

                  表7 8805R₃的配组合抗病性鉴定

品系	TMV		CMV
					发病率	病指	发病率	病指
	(黄粉×8805R3)F1(早粉2号×8805R3)F18805	012.514.5	06.867.32	10.8623.7689.6					4.3816.5445.3

从上述两个接毒实验可见，8805R3对TMV病毒有一定抗性，对CMV病毒也存在真实抗性，因此从抗病性角度出发，8805R3具有双抗能力，可以选育成定型品种推广应用。

十、转基因蕃茄8805R4田间比较试验

进行转基因蕃茄品种比较试验，参试的品种有8805R4、8805、(黄粉×8805R₃)F₁，田间试验采用完全随机区组排列，重复3次，每小区40株。

1、产量表现

总产量以(黄粉×8805R₃)F₁最高，127.7斤/40株，8805R₄次之，对照8805最低，109.7斤/40株，见表8。

                    表8 8805R₄田间品比产量结果

                                          单位：公斤

品系	I	II	III	平均
					8805R48805(黄粉×8805R3)F1	124115133	118108126	122106124	121.33109.7127.7

2、抗病性

调查田间发病情况，CMV病毒尚未发现，隔10天后调查，8805CMV病毒的发病率为10.12％，病情指数为5.36，8805R₄的发病率为4.96％，病情指数1.7，(黄粉×8805R₃)F₁的发病率为4.2％，病情指数为1.42。

从田间比较试验不难看出，8805R₄无论产量还是抗病性均优于对照8805，产量提高10.6％，CMV病毒的发病低于对照50％。

从产量和抗病性两方面综合考虑，将抗CMV病毒转基因蕃茄8805与抗TMV的黄苗亲本材料配制组合推广应用，其利用价值更大，推广前景更好。

十一、表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因蕃茄及其对CMV的抗性

利用根癌农杆菌Ti质粒转化系统，采用叶盘法将CMV-cp基因转入蕃茄细胞中，获得42株转基因植株，经Southernblot、Westernblot和Dot blot检测，证明CMV-cp基因已进入蕃茄核染色体中，并能正常表达，通过对转基因植株R₁和R₂代苗期进行人工接种CMV病毒鉴定，发现CMV-cp基因产物对CMV有一定抗性，其抗性遗传符合孟德尔一对基因控制性状的遗传规律并能稳定遗传。通过对8805R₁优良单系进行CMV病毒实验，结果表明8805R₃对CMV的抗性已基本稳定，可以将这一材料直接选育推广应用，也可作亲本材料配制组合。

材料与方法：

(一)、菌株及其培养

转化蕃茄所用的带有CMV-cp基因的衍生Ti质粒是由本实室构建CMV-cp基因首先被克隆在BS(Bluescript)质粒上，然后将之转移至Ti质粒的中间载体PCo24上，得到整合的载体pHCM39，最后经三亲杂交，被整合到根癌农杆菌GV—311SE Ti质粒的T—DNA区段，CMV—cp基因所用的启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，载体PHCM39带有NptII基因，使转化体愈伤组织或分化芽能够在含有卡那霉素的培养基上生长。

菌株GV—311SE培养在附加卡那霉素Kanamicin 50mg/L壮观霉素Spectinomycin 50mg/L，氯霉素Chloromycetin 30mg/L的LB液体培养基中，23℃下，100rpm的摇床中过夜培养，即可用于转化。

(二)、蕃茄材料

从30多份品种中选择苏8805、苏8807、丽春和强力米寿4个品种，其中苏8805、苏8807园艺性状优良，故转化工作以这两个品种为主。

(三)、培养基

1号培养基：MS＋2mg/L Zeatin＋0.2mg/L IAA

2号培养基：1号培养基＋50mg/L羧苄青霉素＋100mg/L卡那霉素。

3号培养基：MSO为生根培养基

(四)、CMV—cp基因转化蕃茄的具体方法

按Horsch等人的叶盘法进行，取培养7—10天的番茄菌苗的子叶及下胚轴，用解剖刀切成0.5cm左右大小段或方块，取出一部分材料分别置于1号和2号培养基上作为正负对照，另一部分材料浸入上述过夜培养GV—311SE菌液中浸5分钟，然后用滤纸吸干多余的菌液，置于看护培养基上暗培养两天(看护培养基：胡萝卜或烟草细胞悬浮液5—10ml加于1号培养基上均匀分布，上盖一层无苗滤纸即可)，然后转入2号培养基，每两周换一次培养基，3—4周后便有芽长出，待长到3—5cm时，将芽切下转入3号培养基中诱导生根。

结果：

(一)、蕃茄转基因再生株的获得

试验共选用4个蕃茄品种，转化26000块外殖体，共产芽437个，其中在卡那霉素培养基上能正常生长的287个，将152个长得较好的芽转移至生根培养基上，有32个长出了根，根生长良好，而叶片呈嵌合状态的有9株，叶片生长正常而根系生长不好的有12株，叶片和根生长均正常的只有42株，将其中35株生长发育良好的植株定植于花盆中(见表9)。表9    GV311SE转化番茄外殖体结果

品种	外殖体块数 产芽数(％) 产愈伤组织块数(％)
		苏8805苏8807丽春强力米寿	23000      350(1.5％)    110(0.5％)2000       70(3.5％)     25(1.3％)500        12(6.0％)     9(1.8％)500        5(1.0％)      5(1.0％)

(二)、DNA分子杂交(Southern blot)

DNA分子杂交是dsDNA的变性和带有互补序列的同源单链间配对过程。Southern blot可以验证外源基因是否已经整合到植物的染色体上，CMV外壳蛋白的基因全长为1008bp，为方便起见，选用EcoRI酶切外壳蛋白基因中的一段764bp片段作为探针，所检测过的9株中“苏8807”1株、“丽春”1株、余者为“苏8805”品种所转化产生的再生株，转基因工程植株均有杂交带，证明CMV-cp基因已经整全到这些工程植株中。

(三)、转基因蕃茄植株中CMV-cp基因表达检测

许多实验证明工程植株对病毒的抗性需要病毒外壳蛋白的参与，而且抗性的强弱与蛋白质的表达量有直接相关，用Western blot的方法可以测定蕃茄工程植株中能否表达CMV外壳蛋白，第一抗体(CMV抗血清)和硝酸纤维膜结合，第二抗体是与碱性磷酸酶偶联的抗鼠IgG，碱性磷酸酶可以使底物产生颜色反应，取样分析的7株(苏8807 1株、丽春1株、苏8805 5株)转化植株都能全成同一分子量并能与CMV抗血清血特异免疫性反应，而未转育基因的蕃茄叶片总蛋白则未能与CMV抗血清起特异免疫反应，因而没有出现此种蛋白的杂交带。

Dot blot检测结果证明了CMV—cp基因已在蕃茄工程植株中得到表达。

(四)、转基因蕃茄植株对CMV病毒抗性鉴定

利用温室苗期人工接种CMV病毒，进行转基因植株的抗性鉴定。

1.R₁代抗性鉴定：选择1株“苏8805”转基因株(Ro)自交得R1，对R1代苗期二叶一心时进行接毒鉴定，毒源系南京地区最强的蕨叶株系，“苏8805”作为第一对照，感病品种“早粉二号”作为第二对照，以“苏8805”R₁发病率、病情指数明显低于对照品种，由于CMV—cp基因产生抗性基理是交叉保护，因此，发病达3级即心叶及中上部叶花叶可能亦应归到抗病范围内，这样“苏8805”R₁抗病与感病株的比例已接近3∶1，符合孟德尔对遗传基因控制性状的遗传规律。

2.“苏8805”R₂代抗性筛选

从R₁代选取10株抗病单株留种，R₂代分单系进行苗期接种，方法同上，结果见表10。

从表10可见，R₂的10个株系接种CMV病毒后，发病率、发病级数及病指均低于R₁代，而且苗期抗病的植株到开花结果以后均未发病，证明CMV-cp基因的抗性能够稳定遗传，同时，我们也发现R₂代有的株系抗CMV的能力不够理想，这并下表示CMV-cp基因对CMV没有抗性，而是由于R1中还存在CMV-cp基因杂合体类型。

3.转基因蕃茄8805R₃单系接种CMV病毒鉴定结果

从8805R₂的4号单系中挑出抗病性强的单株留种得R₃单系，对其进行人工接种CMV病毒鉴定，结果见表10。

8805R_1-3代之后发病率14.95％，发病最高级数为3级，病情指数为4.98，与R_1-4相当，说明其抗CMV病毒能力已基本稳定，两个对照品种的发病率、病情指数仍相当高，证明所用毒源的致病力相当有效。

                    表10 8805_1-10代接种CMV病毒结果

品种	病级	总数  发病率(％)   病指
			0    1    3    5    7    9
	8305R13005(CK1)早粉2号(CK2)8305R1-18805R1-28805R1-38805R1-48805R1-58805R1-68805R1-78805R1-88805R1-98805R1-108805R(CK1)早粉2号(CK2)8805R1-4-18805(CK1)早粉2号(CK2)			50        42   16   1012   18   20   35   712   25   48   4013        1314             1410             213             111             711        11   85         39         7              1615             59         26    21   14        1715   20   18   5101       164    22   32   20        2418   28   16   30	116    57.9       25.992     100.0      57.2125    100.0      76.223     43.5       14.528     50.0       27.712     16.6       18.514     7.69       4.018     33.9       21.630     63.3       278      37.5       1143.8   24.320     25.0       1411     18.2       658     100.0      5658     100.0      60.5123    14.95      4.98102    100.0      47.2892     100.0      69.56

优点及效果

(一)、转基因蕃茄植株对CMV病毒抗性鉴定

利用温室苗期人工接种CMV病毒，进行转基因植株的抗性鉴定。

1.R₁代抗性鉴定：选择1株“苏8805”转基因株(Ro)自交得R₁，对R1代苗期二叶一心时进行接毒鉴定，毒源系南京地区最强的蕨叶株系，“苏8805”作为第一对照，感病品种“早粉二号”作为第二对照，以“苏8805”R₁发病率、病情指数明显低于对照品种，由于CMV—cp基因产生抗性基理是交叉保护，因此，发病达3级即心叶及中上部叶花叶可能亦应归到抗病范围内，这样“苏8805”R₁抗病与感病株的比例已接近3∶1，符合孟德尔对遗传基因控制性状的遗传规律。

2.“苏8805”R₂代抗性筛选

从R₁代选取10株抗病单株留种，R₂代分单系进行苗期接种，方法同上。

从表10可见，R₂的10个株系接种CMV病毒后，发病率、发病级数及病指均低于R₁代，而且苗期抗病的植株到开花结果以后均未发病，证明CMV-cp基因的抗性能够稳定遗传，同时，我们也发现R₂代有的株系抗CMV的能力不够理想，这并下表示CMV-cp基因对CMV没有抗性，而是由于R1中还存在CMV-cp基因杂合体类型。

3.转基因蕃茄8805R₃单系接种CMV病毒鉴定结果

从8805R₂的4号单系中挑出抗病性强的单株留种得R₃单系，对其进行人工接种CMV病毒鉴定。

8805R_1-3发病率14.95％，发病最高级数为3级，病情指数为4.98，与R_1-4相当，说明其抗CMV病毒能力已基本稳定，两个对照品种的发病率、病情指数仍相当高，证明所用霉源的致病力相当有效。

Claims (3)

1、一种获得抗黄瓜花叶病毒CMV转基因蕃茄的方法，其特征是所述方法是包括：分离筛选、鉴定、克隆CMV-cp基因；将该基因转入蕃茄细胞后经组织培养，诱导愈伤组织，诱导再生植株，

(1)分离、筛选、鉴定克隆CMV-cp外壳旦白基因：

从山东大田的发病烟叶中，提取CMV病毒，用聚乙二醇6000沉淀植物组织抽提液，经差速离心，超速离心和蔗糖密度梯度离心(10—40％)后得到提纯的病毒，将病毒液用蛋白酶K消化，苯酚氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀，得到病毒RNA；

cDNA的合成与克隆：

人工合成一段含24个核苷酸的DNA序列作为引物：5′一TGGTCTCCTTATGGAGAACCTGTG—3′该引物由北京大学生命中心ABI DNA合成仪合成，可以与CMV RNA1—4的3′端互补，cDNA的合成是以CMV的总RNA为模板；

双链cDNA用T₄DNA聚合酶进行末端补平，将质粒Bluescript用EcoRV切开作为载体，用T₄DNA连接酶连接后，转化到大肠杆菌DHS细胞中，转化菌经筛选后，挑出其中白色菌落进行分析；

筛选和鉴定重组质粒，CMV外壳蛋白基因中有一个ECoR I酶切位点，其它RNA序列中没有，故用ECoR I酶切的方法筛选重组的质粒；

DNA序列分析：将全长的cDNA克隆用多种限制性内切酶切开，并亚克隆在Bluescript载体上，以双脱氧核苷酸链终止法，直接用双链DNA测定其cDNA序列；即先将超螺旋的质粒DNA在0.2mol/L NaOH中变性5min，再以0.4倍体积的5mol/L NH₄Ac中和，乙醇沉淀，变性的质粒和序列引物一起退火，然后按Chen和Seeburg的方法测定DNA序列；

cDNA的合成：在合成cDNA的第一链和第二链时，都加入了α-³²P-dATP，经碱性胶电泳后，得到放射自显影的X光片，最长的cDNA片段可达3kb；而CMV RNA基因组在1.0—3.4kb范围内，所以从合成的cDNA中获得外壳蛋白基因的完整序列；

重组质粒的筛选和鉴定：cDNA经连接转化后得到900多个白色菌落，经小量提取质粒，EcoRI酶切分析后得到21个阳性克隆，插入片段在0.5—2.0Kb之间，对其中的一个质粒PHC210的插入片段进行了部分DNA序列分析，发现与发表的CMV—D株系的外壳蛋白基序列相吻合；

pHC210质粒插入片段的完整序列分析及与其它株系间外壳蛋白基因同源性的比较：

经酶切测定，pHC210质粒的插入片段约有1Kb，为了测定其完整序列，先分析了这段DNA的物理图谱并进而做了不同酶切片段的亚克隆；这段DNA的限制性内切酶点是：SaII(0.1Kb)，EcoRI(0.35Kb)，HindIII(0.36Kb)，XhoI(0.63Kb)，SaII(0.66Kb)；其中EcoRI(0.35Kb)和SaII(0.66Kb是CMV—D的相应序列中所没有的，其它位点和CMV—D一致；DNA序列分析的结果证实了这一点；

通过对pHC210质粒插入片段的四种亚克隆的DNA序列分析，得到了该质粒完整插入片段的序列，经与CMV—D的外壳蛋白基因比较，发现该质粒中含有完整的CMV外壳蛋白基因；该片段全长1008bp，5′端非编码区53bp，3′端具有完整的301bp的非编码区，外壳蛋白基因编码区654bp；这段1008bp的序列与CMV—D的相应序列相比，同源率为92.6％，其中基因编码的同源率为93.9％；与CMV—Q的相应序列相比，同源序列占73.1％，基因编码区的同源序列占77.1％；由这段序列推知该基因编码的蛋白含218个氨其酸残基，分子量为24060；与CMV—D外壳蛋白所含氨基酸残基数相等，分子量也很接近(后者分子量为24100)；序列同源率为96.3％CMV—Q外壳蛋白含有较多的氨基酸残基(236个)，相比之下，二者的同源氨基酸序列占71.5％；

根据血清学反应和核酸序列同源性的比较可以将CMV的绝大部分株系分为两个亚组；CMV—Q、CMV—R、CMV—S等属于一个亚组，CMV—D、CMV—C、CMV—Ma等属于另一个亚组；上述cDN A序列同源性比较表明，流行于我国的这种CMV株系应属于CMV—D所在的亚组；

(2)将CMV—cp基因转入蕃茄细胞后经组织培养，诱导愈伤组织，诱导再生植株：根瘤脓杆菌菌种GV311SE培养在附加卡那霉素Kanamicin 50mg/l，壮观霉素Spectinomycin 50mg/l，氯霉素chloromycercin 30mg/l的LB液体培养基中，26-28℃下100rpm的摇床中过夜培养，菌液培养好后，在冰冻离心机上离心(5000rpm 5分钟)，取沉淀，用1/2MS液体培养基溶解沉淀，在可内光λ＝600时测定0.D值(0.D值在0.15—0.25范围内较合适)；这时的菌液即可用于转化；利用外源激素适当搭配掌握合适的浓度获得组培系统优化条件如下：

基本培养基采用MS培养基的大量元素及微量元素成份，其中B5培养基的维生素成份，蔗糖用量为3％，琼脂用量为8％，另加不同浓度的各种激素和微量元素，PH调至5.8，在121℃下高压灭菌15分钟；

本实验所用的培养基成分如下：

MS培养基(mg/L)微量元素成分：

NH₄NO₃ 1650     MnSO₄4H₂O 22.3

KNO₃ 1900        ZnSO₄7H₂O 8.6

CaCl₂H₂O 440    H₃BO₄ 6.2

MgSO₄7H₂O 370   KI 0.83

KH₂PO₄ 170      Na₂MoO₄2H₂O 0.25

Na₂EDTA 37.3     CoCl₂6H₂O 0.025

FeSO₄7H₂O 27.8  CuSO₄5H₂O 0.025

B₅培养基维生素成份：mg/L 肌醇100，VB₆1.0；

烟酸1.0，VB₁10；

本实验再生诱导培养基的激素成份如下：

蕃茄再生诱导培养基的激素成分      激素激素浓度mg/L培养基号                激素种类 IAA    NAA   2，4-D  BA  ZT   GA  胱氨酸       M1M2M3M4M5M6M7M8M9M10 0.2                      2.00.2                  2.00.2                  1.00.5                  2.01.0                  2.52.02.00.5        152.02.0  2.0

其中：IAA：吲哚乙酸，ZT：玉米素，BA：6-苄基氨嘌呤，

      NAA：α-萘乙酸，2，4-D：2，4—二氯苯氧乙酸，GA：赤霉素

切取7—10天苗龄的蕃茄的子叶和下胚轴，用解剖刀切成0.5cm，左右的小块或小段，在M1—M9培养基上培养3—4周，每个10cm培养皿放置20块外植体，重复一次，其实验结果如下所示：

各种培养基诱导蕃茄外植体再生的结果(品种苏8805)     重复 分    培化    养数    基 M₁    M₂  M₃  M₄    M₅   M₆    M₇    M₈*      *    重一20块/皿    (芽)块/皿(芽)个/块 16     14   15   14     10    15     17     72.0    2.1  2.3  3.3    1.4   2.0    3.0    1.2   重复二20块/皿    (芽)块/皿(芽)个/块 17     18   13   13     8     14     10     63.1    1.7  1.9  3.0    1.1   1.9    1.5    1.7 平均    (芽)块/皿**(芽)个/块 16.5   16   14   13.5   9     14.5   13.5   6.582.5％ 80％ 70％ 67.5％ 45％  72.5％ 67.5％ 32.5％2.6    1.9  2.1  3.2    1.3   2.0    2.1    1.5

*M₆，M₇的分化数指的是愈伤组织的分化数，

**指的是分化百分数，

从以上结果看出：M1、M2培养基分化最好，生芽最多；M3、M4培养基较多；M6、M8培养基产生愈伤组织；所以选用M1、M2培养基为主、辅之M3、M4培养基作为诱导转化植物外殖体以获得转化幼苗。

2、根据权利要求1(1)中所述的分离、筛选、鉴定克隆CMV-cp基因，其特征在于用本方法所获得的CMV-cp基因可用于多种植物转基因，例如：瓜类、茄科、豆科，大豆、茄子、花生、哈密瓜、南瓜等，以获得抗CMV病毒的效果。

3、根据权利要求1(2)中所述的将CMV-cp基因转入蕃茄细胞后经组织培养，诱导愈伤组织，诱导再生组织，其特征在于所使用的方法及培养基也适当用于各种蕃茄品种的转化。