CN1171821A - 表达含有多个基因的dna构建体具有抗病毒抗性的转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了嵌合的重组DNA分子,该分子包含多个DNA序列,各DNA序列含有与编码区相连的植物功能性启动子,所述的编码区为病毒相关蛋白质编码,其中所述的DNA序列优选一前一后串接在一起,以便它们在用所述重组DNA分子转化的对病毒敏感的植物细胞中表达,以赋予植物细胞抗所述病毒侵染的抗性。本发明还提供了用嵌合的构建体转化植物的方法,以及选择表达至少一个所述的赋予抗病毒抗性的DNA序列的植株的方法。

Description

表达含有多个基因的DNA构建体 具有抗病毒抗性的转基因植物
                       发明领域
本发明涉及植物遗传工程和运用编码多个基因如外壳蛋白基因、蛋白酶基因或复制酶基因的载体赋予植物多种性状(包括抗病毒)的方式和方法。
                       发明背景
计多重要的农业作物易于被植物病毒侵害，所述病毒可使作物受到严重的损害、使种植者的经济收入下降并使消费者的花费增高。已经做了努力，以控制或预防植物病毒对作物的侵害，但病毒性病原体仍是农业的一个重大的难题。
最近科学家运用遗传工程技术已建立了使植物产生抗病毒抗性的方法。该进步非常有利，因为使植物具有保护作用的遗传物质被掺入到植物本身的基因组内，并能传递给其后代。如果宿主植物具有抑制或阻碍病毒增殖的能力或者是具有防止致病症状发生的能力，那么该植物则是有抗性的。“有抗性的”是“敏感的”反义词，并依据其效果可划分为(1)高抗性、(2)中度抗性或(3)低抗性。重要的是，抗性植物的病症表现减少或根本没有，并且其体内病毒的繁殖减少或可忽略不计。已认识到数种不同的抗病毒的宿主抗性。宿主可以抗(1)侵害的发生，(2)病毒的繁殖或(3)病毒的活动。
马铃薯Y病毒组是一群使多种作物致病的植物病毒，并证明它们在不同科的植物成员之间引起交叉感染。马铃薯Y病毒组包括西瓜花叶病毒-2(WMV-2)、木瓜环斑病毒的木瓜环斑和西瓜花叶I病毒(PRV-p和PRV-w)品系、夏南瓜黄色花叶病毒(ZYMV)、马铃薯病毒Y、烟草蚀刻病毒以及其它许多病毒；其中PRV-p和PRV-w是植物马铃薯Y病毒组群中关系极为密切的两个成员，它们曾一时被划分为不同的病毒类型，但最近将它俩划分为同一病毒的不同的品系。例如，请参见已公开的欧洲专利申请No.578,627中的表I。
这些病毒由直径约为780×12nm的锯齿状丝状的颗粒组成。病毒颗粒含有单链的RNA基因组，该基因组含有大约10,000个阳性(+，编码有义的)核苷酸。马铃薯Y病毒组的RNA基因组的翻译表明该RNA编码一条大约330kD的巨大的多聚蛋白质。该多聚蛋白质包含数个蛋白质，其中之一是49kD的蛋白酶，该蛋白酶特异性地将多聚蛋白质切割成至少6个其它的肽。这些蛋白质可在受侵染的植物细胞中找到，并且是病毒复制的必需成分，包含在该多聚蛋白质之内的一个蛋白质是35kD的衣壳或外壳蛋白，它包被着并保护着病毒RNA，使RNA免遭降解。另一种蛋白质是核内包涵体蛋白，亦被称作复制酶，相信在病毒RNA的复制过程中发挥着作用。在马铃薯Y病毒组侵染的过程中，复制酶(60kD，亦被称为核内包涵体B蛋白)和蛋白酶(50kD，亦被称为核内包涵体I或核内包涵体A蛋白)在转译后被运输，在病毒侵染的后期穿过核膜进入植物的细胞核，并积累达到较高的含量。
外壳蛋白基因通常位于RNA的3′末端，就在一串末端腺苷酸残基(200-300个碱基)之前。在这些病毒中，49kD的蛋白酶基因的位置看来是保守的。在烟草蚀刻病毒中，已确定的蛋白酶的切割位点是二肽Gln-Ser、Gln-Gly或Gln-Ala。从上面所列的马铃薯Y病毒组的序列看，在这些病毒多聚蛋白质中作为切割位点的这些二肽的保守性是显然的。
来自烟草花叶病毒、木瓜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯病毒X以及其它病毒的外壳蛋白基因在转基因植物中的表达使植物对相应病毒的侵染产生了抗性。已有一些异源保护证据的报道。例如，据Namba等Phytopathology(植物病理学)，82，940(1992)报道，来自西瓜花叶病毒-2或夏南瓜黄叶花叶病毒的外壳蛋白基因在转基因烟草植物中的表达使植物获得了抗其它6种马铃薯Y病毒组(菜豆黄色花叶病毒、马铃薯病毒Y、蜿豆花叶病毒、三叶草黄色叶脉病毒、胡椒斑驳病毒和烟草蚀刻病毒)的保护。据Stark等Biotechnologg(生物技术)，1，1257(1989)报道，马铃薯Y病毒组大豆花叶病毒在转基因植物中的表达使植物获得了抗血清学上不相关的两种马铃薯Y病毒组(烟草蚀刻病毒和马铃薯病毒Y)的保护作用。
然而，预先选择的外壳蛋白基因的表达不能可靠地使植物获得异源保护。例如，含有CMV-C外壳蛋白基因并显示对CMV-C已有抗性的转基因南瓜植物并不能抵抗CMV的几个强毒力品系(包括CMV-V-27和CARNA-5)的侵染。因此，需要一种改进的方法，使植物获得抗马铃薯Y病毒组的抗性。
                  本发明概述
本发明提供了包含多个DNA序列的重组嵌合DNA分子，各DNA序列中含有可与编码病毒相关蛋白质如外壳蛋白(CP)、蛋白酶或复制酶的DNA序列相连的启动子，其中所述的DNA序列在被所述的重组DNA分子转化的对病毒敏感的植物细胞中表达，从而赋予植物抵抗各所述病毒侵染的抗性。DNA序列优选以串联方式相连，即一个序列的头接另一个序列的尾。而且，优选在被所述的多个DNA序列转化的植物细胞中存在基本上等量的抗各所述病毒侵染的抗性。
各DNA序列还优选与3′非翻译DNA序列相连，3′非翻译DNA序列在植物细胞中发挥着作用，它引起转录的终止并将多聚腺苷酸加到转录出的mRNA序列的3′末端。所述病毒优选为植物相关病毒如马铃薯Y病毒组。
因此，本发明的DNA分子可用作嵌合的重组“表达构建体”或“表达盒”(expression cassette)以进行转基因植物的制备，该转基因植物抗至少两种植物病毒如马铃薯Y病毒组的抗性增加了。所述的表达盒还优选含有至少一个可选择标记基因或报告基因，标记基因或报告基因与病毒基因一起被稳定地整合到转化植物细胞的基因组中。所述的可选择标记和/或报告基因使被转化的植物细胞和植物易于识别。在病毒基因的侧翼优选排列着两个或多个可选择标记基因、报告基因或其组合。本发明的另一方面在于提供制备抗病毒植物如双子叶植物的方法，包括：
(a)用含有多个DNA序列的嵌合重组DNA分子转化植物细胞，各DNA序列含有在所述植物细胞中发挥作用的启动子，所述启动子与编码病毒相关蛋白质的DNA序列相连，所述的病毒能侵染所述的植物；
(b)使所述的植物细胞再生以获得分化的植株；和
(c)鉴定出表达该DNA序列赋予植物抗所述病毒侵染抗性的转化植株，优选该植株抗各病毒侵染的抗性基本上相等。
本发明的另一目的在于提供赋予对病毒敏感的葫芦科植物抗病毒侵染抗性的方法，该方法包括：
(a)用编码病毒的多个蛋白质的DNA分子转化葫芦植物细胞，所述的病毒能侵染所述的葫芦科植物；
(b)使所述的植物细胞再生以得到分化的植株；
(c)选择表达病毒蛋白质的水平足以使植物对所述病毒的侵染产生抗性的被转化的葫芦科植物。
本发明的再一目的在于提供具有多种病毒抗性的转化植物，所述的被转化植物含有被稳定整合的编码病毒蛋白质的DNA序列。
本发明的又一目的在于提供抗病毒的转化植物细胞，该转化植物细胞含有多个(即2-7个或更多的)病毒基因，该基因表达成同一病毒品系的病毒蛋白质或者表达成来自不同病毒品系的病毒蛋白质，就如同来自病毒群(如马铃薯Y病毒组群)的不同成员一样。
通过将多个病毒外壳蛋白表达盒插入到二分质粒中并随后测定所得的质粒的特征，对本发明进行了初步的说明。CMV、ZYMV、WMV-2、SQMV和PRV外壳蛋白表达盒的组合被置于二分质粒pPRBN中。随后，将含有多个外壳蛋白表达盒的二分质粒移入土壤杆菌(Agrobacterium)，以备在植物转化程序中使用。用含有多个表达盒的二分质粒将两个或多个病毒外壳蛋白转化易感基因与有关的可选择标记和/或报告基因一起转入植物如葫芦科的植物中。
因此，本发明提供了遗传工程的方法，通过该方法多种性状可做为单个的基因插入片段(即，其行为象单个基因作为单个孟德尔位点分离的构建体)被操纵和跟踪。虽然用病毒抗性基因对本发明做了示例性的说明，实际上，任何基因的组合均可被连琐。因此，通过简单地跟踪被连琐的可选择标记或报告基因，人们就可跟踪一串表现性状如疾病抗性、加除草剂抗性增强、加贮藏寿命延长等等性状的基因，所述的可选择标记或报告基因已被插入到转化的载体中。
还发现当多个串联的基因被插入的时候，它们的效力优选基本上一致，更优选它们的效力基本上相等；其中术语“基本上”在指病毒抗性时，参见下文实施例中所描述的定义。例如，如果人们在检查含有完整的ZYMV和WMV-2外壳蛋白插入片段的多个转基因品系时，人们会发现如果一个品系对ZYMV的侵染免疫，它对WMV-2的侵染也会免疫。类似地，如果一个品系表现出发生ZYMV的病症延迟，它表现出发生WMV2的病症也延迟。最后，如果一个品系易被ZYMV侵染，它也易被WMV-2侵染。这一现象是不曾预料到的。如果在这些多基因构建体中各基因的功效之间不存在相关的话，那么作为植物育种工具的这一创举有可能难于运用。即使对于单基因构建体，人们也必须对多个转基因植物品系进行测验，以找到一个表现出适当效力水平的品系。依赖于所用的物种，找到表达水平有用的品系的概率在10-50％的范围内。
如果含有多个基因的Ti质粒上的各个基因的效力是互不相干的话，找到抗各靶病毒的转基因品系的概率将急剧下降。例如，如果一物种采用单基因插入片段，鉴定出抗性品系的概率为10％，用三基因构建体CZW对该物种进行转化并且各基因的效力水平互不相干，那么找到抗CMV、抗ZYMV并抗WMV-2的品系的概率将为0.1×0.1×0.1＝0.001或0.1％。然而，尽管多价基因的效力彼此之间互不相干，找到抗CMV、ZYMV和WMV-2的品系的概率仍然是10％，而是0.1％。当被使用的构建体含有4个或更多的基因时，很显然这一优越性会变得更加显著。
               附图的简要说明
图1显示了二分载体pPRBoriGN的结构。
图2显示了二分载体pPRBN的结构。
图3显示了pPRCPW的结构。
图4显示了二分质粒pEPG321的结构。
图5显示了二分质粒pEPG106的结构。
图6显示了二分质粒pEPG111的结构。
图7显示了二分质粒pEPG109的结构。
图8显示了二分质粒pEPG115的结构。
图9显示了二分质粒pEPG212的结构。
图10显示了二分质粒pEPG113的结构。
图11显示了二分质粒pGA482GG的结构。
图12显示了二分质粒pEPG382的结构。
              本发明的详细描述
通过在植物中表达分离的DNA序列，所述的DNA序列包含编码多个(即，2-7个)病毒蛋白质如外壳蛋白质、蛋白酶和/或复制酶的核苷酸，使本发明的植物被赋予了抗病毒的抗性。
可从中分离出这些DNA序列的有代表性的病毒包括(但不限于)马铃薯病毒X(PVX)、马铃薯Y病毒组如马铃薯病毒Y(PVY)、黄瓜病毒(CMV)、烟草叶脉斑驳病毒、西瓜花叶病毒(WMV)、夏南瓜黄叶花叶病毒(ZYMV)、普通菜豆花叶病毒、菜豆黄叶花叶病毒、大豆花叶病毒、花生斑驳病毒、甜菜花叶病毒、小麦条斑花叶病毒、玉米矮小花叶病毒、高梁花叶病毒、甘庶花叶病毒、石茅高梁花叶病毒、洋李痘病毒、烟草蚀刻病毒、白薯羽状斑驳病毒、薯蓣花叶病毒和木瓜环斑病毒(PRV)、包括CMA和comovirus的黄瓜病毒。
总之，马铃薯Y病毒组是单链的RNA病毒，它被包围在重复蛋白质单体之内，所述单体被称为外壳蛋白(cp)。被包被的病毒具有弯曲的杆状形态。绝大多数的马铃薯Y病毒组被蚜虫以非持续的方式传递。可被马铃薯Y病毒组侵染的作物的范围很广，从中可以看出，宿主的范围包括多科植物，但不限于茄科、藜科、禾木科、菊科、豆科、薯蓣科、葫芦科和蕃木瓜科。
谈及DNA序列或基因，本文所用的术语“分离的”意指用化学方法将序列从病毒的基因组提取出来，并将之纯化和或修饰，其程度为可以使其以适当的方向(即，有义或反义)插入本发明的载体中。本文所用的术语“嵌合的”是指两个或多个DNA序列连琐在一起，该DNA序列来自不同的来源、品系或种(即，来自细菌或植物)，或者指来自同一物种的两个或两个以上的DNA序列的连接方式不曾在天然基因组中出现过。因此，可用于本发明的DNA序列可以是天然存在的、半合成的或者是完全人工合成的DNA。该DNA序列可以是线状的或环状的，即可以位于完整的或线状的质粒如下文所述的二分质粒中。本文所用的术语“异源的”是指不相同，例如在核苷酸和/或氨基酸序列、表型或独立的分离型方面不同。本文所用的术语“表达”是指转录或在特定DNA分子翻译前的转录。
实践本发明所用的多数的重组DNA的方法均是标准方法，为本领域的技术人员所熟知，这些方法被详细描述于(例如)1986年11月29日公开的公开号为No.223,452的欧洲专利申请中，该申请被引入本文做参考。酶是自市售获得并按照Vendor的推荐或本领域已知的其它改进来使用的。包含这些标准技术的文献一般包括下列文献：R.Wu编辑(1979)Methods in Enzymology(酶学方法)，Vol.68；J.H.Miller(1972)Experiments in Molecular Genetics(分子遗传学试验)；J.Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，第二版；D.M.Glover编辑(1985)DNA Cloning Vol.II(DNA克隆第II卷)；H.G.Polites和K.R.Marotti(1987)“A step-wise protocol for cDNAsynthesis，”Biotechniques(生物技术)，4，514-520；S.B.Gelvin和R.A.Schilperoot编辑，Introduction，Expression，and Aralysis of GeneProducts in Plants(植物中的基因产物的介绍、表达和分析)；所有的这些文献均被引入本文做参考。
为实践本发明，必须将病毒基因从病毒基因组中分离出来，并将它插入含有遗传调控序列的载体中，所述的遗传调控序列为被插入基因的表达所必需。当表达载体/插入片段构建体被装配起来时，就用它来转化植物细胞，该植物细胞随后被用来再生成植株。这些转基因植物携带着存在于表达载体/插入片段构建体中的病毒基因。该基因在植物中表达，并因而使植物抗病毒侵染的抗性增强了。
分离病毒基因有几种不同的方法。为此，本领域的普通技术人员可运用有关马铃薯Y病毒组、黄瓜病毒或comoviruses基因组的构成信息，来定位和分离外壳蛋白基因或核内包涵体基因。马铃薯Y病毒组内的外壳蛋白基因位于RNA的3′端，就在一串约200-300个腺苷酸残基的前面。核内包涵体B(NIb)基因就位于该外壳蛋白基因的5′端，而核内包涵体A(NIa)基因则邻着NIb基因的5′端。另外，用蛋白酶解位点的有关信息来确定马铃薯Y病毒组外壳蛋白基因的N末端和非外壳蛋白基因的N末端和C末端。蛋白酶的识别位点在马铃薯Y病毒组中是保守的，并且该位点已被测定为是Gln-Ser、Gln-Gly或Gln-Ala的二肽。编码这些二肽的核苷酸序列可被确定出来。
采用本领域所熟知的方法，培养并收获一定量的病毒。然后采用许多已知的步骤，分离出病毒RNA并将病毒基因分离出来。采用该病毒RNA，用本领域已知的方法制备cDNA文库。将病毒RNA和与该病毒RNA相杂交的引物和反转录酶一起温育，产生出互补的DNA分子。产生该互补DNA分子的互补DNA链；并且该序列是原始病毒RNA分子的DNA拷贝(cDNA)。可以以生成一条双链cDNA的方式来产生所述的DNA互补链，或者采用聚合酶链式反应用对病毒基因特异的寡聚核苷酸引物来扩增编码cDNA的DNA。除了病毒特异性的序列外，这些引物还包括用于随后的克隆步骤的新的限制位点。因此，产生了含有病毒RNA序列信息的双链DNA分子。在通过连接酶加入了限制酶接头分子之后，可把这些DNA分子克隆到大肠杆菌的质粒载体中。将各种各样的片段插入克隆载体如其特征熟知的质粒中，然后用所述的质粒转化大肠杆菌以制备cDNA文库。
因马铃薯Y病毒组基因通常是保守的，可用根据类似基因或类似基因片段的寡聚核苷酸作杂交探针来筛选cDNA文库，以确定任何转化的细菌是否含有带适当病毒序列的DNA片段，所述的类似基因或类似基因片段来自先前的分离物。可对任何细菌菌落中与这些探针杂交的cDNA插入片段进行测序。该病毒基因完整地存在于菌落中，该基因的5′延伸到编码该目的基因N-末端蛋白酶切割位点的序列，而其3′延伸到编码C-末端蛋白酶解切割位点的序列。
另外，可将cDNA片段以有义的方向插入表达载体中。可用抗病毒蛋白质的抗体来筛选cDNA表达文库，并可从表达该蛋白质的菌落中将该基因分离出来。
已经确定了为许多病毒的外壳蛋白基因和核内包涵体基因编码的核苷酸序列，并且所述的基因已被插入表达载体之中。表达载体含有表达被插入基因所必需的遗传调控序列。外壳蛋白基因被插入的方式须使调控序列能发挥作用，并且当被转入植物的基因组中时该基因能够表达。选择了几篇分离、克隆和表达病毒基因的参考文献列于下文的表I。
                             表I
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              N.E.Turner et al.，EMBO J.，6，1181
              (1987)大豆花叶病毒cp    D.M.Stark et al.，Biotechnology(生物技学)，7，1257
              (1989)黄瓜花叶病毒C     H.Q.Ouemada et al.，Molec.Plant Pathol.(分子植物病品系cp            理学)，81，794(1991)黄瓜花叶病毒WL    UpJohn Co.(PCT WO90/02185)品系cp烟草蚀刻病毒cp    Allison et al.，Virology(病毒学)，147，309(1985)烟草蚀刻病毒核    J.C.Carrington et al.，J.Virol.，61，2540内包涵体蛋白      (1987)胡椒斑驳病毒cp    W.G.Dougherty et al.，Virology(病毒学)，146，282
              (1985)马铃薯病毒Y cp    D.D.Shukla et al.，Virology(病毒学)，152，118
              (1986)马铃薯病毒Y核     European Patent Application(欧洲专利申请)578，627内包涵体蛋白马铃薯病毒X cp    C.Lawson et al.，Biotechnology(生物技术)，8，127
              (1990)烟草条斑病毒      C.M.Van Dun et al.Virology(病毒学)，164，383(TSV)cp           (1988)
  为使病毒基因得到表达，必须采用必需的遗传调控序列。因马铃薯Y病毒组基因组编码的蛋白质是多聚蛋白经翻译后加工产生的，从病毒RNA分离出的病毒基因，并不含有转录和翻译信号，所述的转录和翻译信号是病毒基因一旦被转入并整合到植物基因组中后其表达所必需的。因此，必须通过遗传工程使它含有植物可表达启动子、翻译起始密码子(ATG)和植物功能性的其翻译终止密码子3′端的Poly(A)添加信号(AATAAA)。在本发明中，病毒基因被插入载体，该载体含有插入起始密码子的3′端和Poly(A)信号的5′端的克隆位点。起始密码子的5′端是启动子，这样当结构基因被插在克隆位点上时，就形成了有功能的单位，在该单位中被插入的基因在各种各样的遗传调控序列的控制下表达。
被称作启动子的DNA片段负责DNA转录成mRNA的调控。许多在植物细胞中发挥作用的启动子在本领域是已知的，并可被用于本发明的实践。这些启动子可从各种来源如植物或植物病毒中得到，所述的启动子包括(但不限于)自caulimovirus群分离出的启动子如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、花椰菜花叶病毒35S强启动子(enhCaMV35S)、玄参花叶病毒全长转录启动子(FMV35S)、和自叶绿素a/b结合蛋白中分离出的启动子。其它有用的启动子包括能以可诱导的方式或组织特异性的方式，在已知发生了感染的某些类型的细胞中使马铃薯Y病毒组蛋白质表达的启动子。例如，来自苯丙氨酸氨裂合酶、苯基苯乙烯酮合成酶、富含羟基脯氨酸的糖蛋白、伸展蛋白、与发病有关的蛋白质(如PR-1a)和来源于马铃薯的受伤诱导性蛋白酶抑制剂的可诱导启动子都是可以使用的。
用于本发明病毒基因表达盒的优选启动子包括来自CaMV、Ti基因胭脂碱合成酶基因(Bevan等，Nucleic Acids Res.II(核酸研究第II卷)，369-385(1983))和章鱼肉碱合成酶基因(Depicker等，J.Mol.Appl.Genet.(应用分子遗传学杂志)，1，561-564(1982))以及菜豆贮藏蛋白基因菜豆蛋白基因。来源于这些基因的Poly(A)添加信号也适合用于本发明的表达盒。所选的特定的启动子优选能使与它相连的DNA编码序列充分表达，从而产生大量的蛋白质或RNA以提供有效的抗病毒的抗性，但其量不能多至对表达蛋白质或RNA的细胞造成伤害的程序。所选的启动子应能在包括(但不限于)表皮组织、维管组织和叶肉组织中发挥作用。实际上，启动子的选择要求并不十分严格，只要它具有足够的转录活性，能完成预先选定的蛋白质或反义RNA的表达并随后赋予植物以抗病毒的抗性。
非翻译引导序列可来自任何合适的来源，并可对之进行特异性的修饰以便它能促进mRNA的翻译。5′非翻译区可从所选用来表达基因的启动子、从无关的启动子、要被表达基因的天然的引导序列或编码区、病毒RNA、合适的真核基因或合成的基因序列中获得。本发明不限于下面实施例中出现的构建体。
所用的终止区或3′非翻译区是会引起转录终止并使多聚腺苷酸(Poly(A))添加到转录出的mRNA序列的3′端的序列。终止区可能与启动子区域或者结构基因一起天然存在，或者来自另外的来源，而且终止区优选包括终止子和为多聚腺苷酸化编码的序列。嵌合植物基因的适当的3′非翻译区包括(但不限于)：(1)3′被转录的非翻译区，该区包含诱导土壤杆菌根癌形成的Ti质粒基因如胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号；和(2)象大豆7S贮藏蛋白质基因样的植物基因。
可将选择标记基因掺入本发明的表达盒中，并用来选择那些已被转化了的细胞和植物。所用的标记基因可以表达为抗抗生素的抗性，所述的抗生素如卡那霉素、庆大霉素、G418、潮霉素、链霉素、壮观霉素、四环素、氯霉素等等。也可结合使用或者单独使用其它的标记如(例如)编码除草剂耐受的基因，如对甘草膦、磺酰尿、phosphinothricin或溴苯腈耐受的基因。另外的选择方式包括氨甲蝶呤抗性、重金属抗性、使营养缺陷型宿主变为原养型的互补等等。例如，请参见上文引述的表1中的PCT WO/91/10725。本发明还拟想用一串可选择的标记基因来置换所有的病毒相关基因。
所用的特定的标记将是能使被转化细胞选择出来的标记，因转化细胞的标记与那些未被转化的细胞的标记相反。根据不同宿主种类的数量，可以采用一个或多个标记，其中用不同的选择条件来对不同的宿主做出选择，所述的各种选择条件为本领域的技术人员所已知。可用可筛选的标记或报告基因如β-葡糖苷酸酶基因或荧光素酶基因替换可选择的标记，或者与可选择的标记一起使用。用这一基因转化的细胞，可凭用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)处理有蓝色的产物生成这一现象来鉴定。
在形成本发明表达构建体的过程中，将表达构建体的各组分如DNA序列、接头或其片段常规地插入常规克隆载体如质粒或噬菌体中，所述的载体能在细菌宿主如大肠杆菌中复制。有大量的克隆载体存在，它们已被述于文献之中。为了使载体满足特定的需要，每次克隆后，可将克隆载体分离出来并进行进一步的操作如限制酶切、插入新的片段、连接、缺失、切除、插入、体外诱变、加入多聚接头片段等等。
对于土壤杆菌介导的转化，表达盒将被包括在载体之内，其侧翼为土壤杆菌Ti或Ri质粒的片段，代表着土壤杆菌Ti或Ri质粒转移DNA(T-DNA)的右边界和/或左边界。这样容易使本发明的嵌合的DNA序列整合到宿主植物细胞的基因组中。该载体还含有使质粒在土壤杆菌细胞以及在大肠杆菌细胞中易于复制的序列。
所有的DNA操作通常在大肠杆菌细胞中进行，通过直接的DNA转化、接合等手段将带有马铃薯Y病毒组表达盒的最终质粒转入土壤杆菌细胞。这些土壤杆菌细胞含有也自Ti或Ri质粒衍生的第二个质粒。该第二质粒带有把外源DNA转入植物细胞所需的所有的病毒基因。
合适的植物转化克隆载体包括自根癌土壤杆菌的Ti质粒衍生的那些载体，这些载体一般被公开于Glassman等的美国专利No.5,258,300中。除了公开的那些载体之外，还能在(例如)Herrera-Estrella，Nature(自然)，303，209(1983)、Biotechnica(公开的PCT申请PCTWO/91/10725)、和授予给Schilperoort等的美国专利No.4,940,838中找到。
可以利用各种技术来将遗传物质引入植物细胞宿主中或进行植物细胞宿主的转化。然而，把植物载体引入宿主的具体方式对于实现本发明来讲不是关键性的，可以采用能进行有效转化的任何方法。除了采用自土壤杆菌的根癌诱导(Ti)质粒或毛根诱导(Ri)质粒衍生的植物转化载体进行转化之外，可采用另外的方法来将本发明的DNA构建体引入植物细胞。所述的方法可能包括，例如，采用脂质体、采用病毒或花粉进行转化、使用能增加DNA直接吸收的化学物质(Paszkowski等，EMBOJ.(EMBO杂志)，3，2717(1984))、显微注射(Crossway等，Mol.Gen.Genet.(基因分子遗传学)，202，179(1985))、电穿孔(Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院进展)，82，824(1985))或者高速微弹轰击法(Klein等，Nature(自然)，327，70(1987))。
用于转化的植物组织的来源或培养的植物细胞的选择依赖于宿主植物和转化方案的性质。有用的组织来源包括愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶子碎片、茎碎片、雄花序、花粉、胚、胚轴、块茎碎片、分生组织区域等等。所述的组织来源是可再生的，因为它保留了在转化后再生成完整的能育植株的能力。
在适于所选的植物组织的条件下进行转化。使植物细胞或组织与带有本发明多基因表达盒的DNA接触有效的一段时间。其范围为从进行电穿孔的少于1秒的电脉冲至在含质粒的土壤杆菌细胞存在下的2-3天的共培养。所用的缓冲液和介质也随着植物组织来源和转化方案的不同而变化。许多转化方案在固体培养基平板上采用悬浮培养细胞的饲养层(例如，来自tobacco或Black Mexican Sweet Corn.)，使之通过无菌的滤纸片与要被转化的植物细胞或组织分开。
用DNA处理后，可在选择前将植物细胞或组织培养不同的时间，或者使细胞或组织立即与选择试剂如上文所述的那些选择试剂接触。涉及与土壤杆菌接触的方案还将包括抑制土壤杆菌细胞生长的试剂。通常所用的化合物是抗生素如cefotaxime和羧苄青霉素。可将在选择时使用的培养基配制成使被转化的愈伤组织或悬浮培养细胞维持在不分化的状态，或者使愈伤组织、叶或茎的碎片、块茎片等等长出根。
在常规抑制浓度的选择试剂存在下生长的细胞或愈伤组织被认为是已被转化了的，并可在同样的培养基上继续继代培养几代以除去不具抗性的部分。然后对细胞或愈伤组织进行病毒基因(表达)盒是否存在的测定，或者使细胞或愈伤组织进行已知的植物再生程序。在涉及直接长苗的方案中，在选择性培养基上长出的那些苗被认为是已被转化了的，并可将其切下，使之在适于长根的选择培养基上生根，或者通过将切下的苗简单地浸入诱导生根的化合物中并直接将它种植于蛭石中使之生根。
为了产生具有多种病毒抗性的转基因植物，必须使病毒基因被植物细胞吸收并稳定地整合到植物的基因组内。所选出的对抑制剂有抗性的植物细胞和组织被认为在转化处理过程中已经获得了为该抗性编码的可选择标记基因。因标记基因通常与病毒基因相连，可以假设病基基因亦同样地被获得了。然后，可以采用对病毒基因特异的探针进行Southern印迹杂交分析，以此来证实外源基因已被植物细胞吸收被整合到了植物细胞的基因组中。该技术还会给出已被掺入的基因的拷贝数。可采用分析总细胞RNA和/或细胞RNA的Northern印迹杂交分析，对外源基因成功地转录成mRNA的转录进行同样的测定，所述的细胞RNA被富集在多聚腺苷酸化区域。包含在本发明范围内的mRNA分子是含有自病毒基因衍生的病毒特异性序列的那些mRNA，所述的病毒基因存在于被转化的载体中，其极性与病毒基因组RNA的极性相同，这样在Sambrook等(1989)的第7章所述的条件下，它们能与其极性跟病毒基因组的极性相反的病毒特异性RNA进行碱基配对。还包含在本发明范围之内的mRNA分子是含有自病毒基因衍生的病毒特异性序列的那些mRNA，所述的病毒基因存在于被转化的载体中，其极性与病毒基因组RNA的极性相反，这样在Sambrook等(1989)的第7章所述的条件下它们能与病毒基因组RNA进行碱基配对。
亦可通过免疫学试验来探测病毒基因的存在，免疫学试验如Namba等所述(Gene(基因)，107，181(1991))、被Clark等改进(J.Gen.Virol.(病毒遗传学杂志)，34，475(1979))的双抗体夹心测定法。还请参见Namba等，Phytopathology(植物病理学)，82，940(1992)。
可通过被Namba等在ibid中公开的侵染力研究试验对抗病毒的抗性进行测定，其中当任何被接种的叶子显示叶脉清晰、花叶或坏死症状的时候，按照症状划定植物的级别。
应理解的是当有义或反义病毒特异性RNA是从上文所述的表达盒转录的时候，本发明是可行的。也就是说，导致转基因植物表现出的目的表型和/或基因型的原因，并不存在着特定的分子机制。因此，抗病毒侵害的保护可通过一种或几种机制来实现。
还应理解的是抗病毒的抗性可通过任何病毒编码基因的表达来实现。因此，表达外壳蛋白基因或非外壳蛋白基因的转基因植物可对同源病毒或异源病毒的侵染产生抗性。例如，发现带有PRV NIa蛋白酶基因的转基因植物对PRV(参见表7，实施例III)的攻击产生抗性，带有WMV-2 FL品系的外壳蛋白基因的转基因植物对异源品系的病毒WMV-2 NY(表1-8，实施例I-IV)的攻击产生抗性，带有CMV-C外壳蛋白基因的转基因植物对ZYMV的攻击有一定程度的抗性(有关ZYMV的更进一步的信息，请参见本申请人作为受让人的序号为一、题目为“Transgenic Plants Exhibiting Heterologous Viral Proteotion”、申请日为1994年12月30日的待审专利申请，该申请被引作本文的参考文献)。
将组织培养再生植株结的种子种植在土壤中，并使其白花传粉来产生纯种植物。来自这些植物的后代变成了不分离品系，该品系在一定范围的环境条件下被用来评估在田间对病毒的抗性。如果具有抗性的许多不同的杂种组合可以销售的话，抗病毒植物的商业价值是极为巨大的。一般根据成熟期、疾病和虫害抗性、颜色或其它农学性状上的差异，种植者一般种植不只一种杂种。另外，因为在给定的地理位置，在成熟期、疾病和虫害耐受性、或公众对特定品种的要求等性状方面存在差异，适应了国家一部分地区的杂种并不适应国家的另一部分地区。为此，将抗病毒的抗性培育到大量的亲代品系中，以便可以产生许多杂种组合。
当抗病毒抗性的遗传控制被理解了的时候，将抗病毒的抗性添加到农学上极佳的品系中可被极为有效地完成。这需要使抗性植物和敏感植物杂交，并研究分离代的遗传类型，以确定该性状是作为显性的还是作为阴性的性状进行表达、所涉及的基因数量，以及如果表达需要不只一个基因，确定在基因间可能存在的任何相互作用。关于本文所公开的那些类型的转基因植物，转移的基因表现为显性的单基因孟德尔遗传行为。该遗传分析可以是起初将农学上优良但敏感的品系变成抗性品系的努力的一部分。通过使原始的抗性品系与敏感的优良品系杂交并使后代与敏感的亲本杂交，进行转变过程(回交)。来自该杂交的后代产生分离，结果一些植物携带了抗性基因，而一些则没有带。使带有抗性基因的植物与敏感亲本再次杂交，产生的后代再次发生抗性和敏感的分离。重复进行这一过程直至原始的敏感性亲本已被转变成抗性品系，该品系还具备最初在敏感亲本中发现的其它所有的重要性状。每个要被转变成抗病毒品系的敏感的优良品系都实行了独立的回交程序。
回交后，对新的抗性品系和产生有商业价值的杂种品系的适当组合进行抗病毒抗性和一组农学性状的评估。产生不分离的抗性品系和杂种，做为原始敏感品系和杂种的代表。需要在一定范围的环境条件下对此进行评估，在所述条件下对所述品系和杂种进行商业种植。使令人满意的杂种亲本品系增多，并采用标准的杂种生产方法进行杂种生产。
将参照下列详细的实施例对本发明做进一步的说明。
        实施例I具有多病毒抗性的南瓜品种A.二分质粒载体
被转移到植物基因组中的DNA被包含在二分质粒中(M.Bevan，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，11，369(1983))。亲代二分质粒为PGA482，由G.An构建(G.An Plant Physicl.(植物生理学)，81，86(1986))。该载体含有来自pTiT37的T-DNA边界序列、可选择标记基因Nos-NPTII、多克隆区和噬菌体λ的粘性末端，所述的Nos-NPTII含有植物可表达的胭脂碱基因的启动子，该启动子与得自Tn5的细菌NPTII基因融合。
从质粒PGA482衍生质粒pPRBoriGN(图1)的步骤如下：将细菌选择标记、庆大霉素抗性(R.Allmansberger等，Molec.Gen.Genet.(基因的分子遗传学)，198，514(1985))插到右边界(BR)附近，但在T-DNA区域的外侧。然后切除Nos-NPTII基因，并在BR附近在T-DNA区域内再生出多克隆位点(MCS)。接着，将植物可表达的β-葡糖苷酸酶(GUS)基因盒(R.A.Jefferson等，EMBO J.，6，3901(1987))插入在pBR322复制起点附近的T-DNA区域内。最后，将植物可表达的NPTII基因插入在左边界(BL)附近的T-DNA区域内。该NPTII基因是经过将NPTII编码区插入大肠杆菌质粒pDH51的表达盒中产生的(R.Kay等，Nucl.Acids.Res.(核酸研究)，15，2778(1987))。这样提供了花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子多聚腺苷酸化信号。
按下述步骤，从pPRBoriGN衍生质粒pPRBN(图2)：将pPRBoriGN上的自GUS编码序列的开始部分至BL的区域缺失。因此，GUS基因和35S/NPTII表达盒作为一个单元被除去了。然后，该区域被仅由35S/NPTII表达盒组成的片段取代。这些步骤的结果是除去了GUS基因和pBR322同源序列的一小段，留下植物可表达的在BL附近的NPTII基因。B.供体基因
1.西瓜花叶病毒2
采用特异的寡聚核苷酸引物产生由来自WMV-2 FL品系的WMV2外壳蛋白编码区和侧翼AatII(5′)及BglII(3′)限制酶位点组成的片段，以此来构建植物可表达的WMV2基因。将该片段与AatII/BglII消化的pUC19B2连接，pUC19B2是在其多克隆区域含有BglII限制酶位点的被修饰的pUC19质粒。为了产生植物可表达的外壳蛋白表达盒，对所得的质粒(被定名为pUCWM2P25)进行进一步的修饰，即增加CaMV35S启动子和来自pUC1813/CP19的多聚腺苷酸化信号(J.LSlightom，Gene(基因)，100，251(1991))。由该基因表达所产生的蛋白质应是WMV2外壳蛋白和CMV外壳蛋白的氨基末端部分融合的融合蛋白质。然后用BamHI消化，切出该表达盒(CPW)，并将之连接到pPRBoriGN的BglII位点上，以产生被定名为pPRCPW的二分质粒(图3)。
2.夏南瓜黄叶花叶病毒
本文所用的ZYMV FL品系的ZYMV外壳蛋白基因的克隆和特征被描述于H.Quemada等，J.Gen.Virol.(病毒遗传学杂志)，71，1451(1990)。用来构建植物可表达ZYMV外壳蛋白基因的策略被描述于上文引述过的J.L Slightom(1991)和S.Namba等，Phytopathology(植物病理学)，82，945(1992)中。
3.黄瓜花叶病毒
在我们的试验中使用的CMV外壳蛋白基因的克隆、特征分析及遗传工程被描述于H.Quemada等的J.Gen.Virol.(病毒遗传学杂志)，70，1065(1989)和上文引述过的1991的论文中。
4.南瓜花叶病毒
SQMV是由种子传递并由条斑或圆点黄瓜甲虫(Acalymma种和Diabrotica种)传播的comovirus。在5分钟之内昆虫就会染上病毒，而且病毒会被保留直至第20天。宿主的范围限于葫芦科植物。该病毒由直径为30nm的全对称颗粒构成，颗粒内包含着单链的RNA，该RNA被分成称作M-RNA和B-RNA的两个有功能的区段(Provvidenti，PlantViruses of Horticulture Crops in Tropics and Subtropics(热带和亚热带园艺学植物的植物病毒)，中国台湾(1986)，第20-36页)。
这些基因的分离、DNA序列、修饰和在植物细胞中的表达被Hu等描述于Arch.Virol.，130，17(1993)。简言之，分离和测序后，按Slightom，Gene(基因)，100，251(1991)的方法，通过遗传工程把基因插入到植物表达盒pUC18cpexpress中。该方法学和表达盒的采用产生了SQMV外壳蛋白克隆，该克隆与黄瓜花叶病毒的5′非翻译引导序列相连。该融合体由35S启动子驱动并采用了35S终止子(图4)。HindIII消化后，将该被修饰的基因分离出来，并在单一的步骤中将它引入Upjohn二分质粒pGA482GG(图11)中。该质粒是PGA482(An，Methods in Enzymol.(酶学方法)，153，292(1987))的衍生物。两个外壳蛋白表达盒被定向于与NPTII基因的方向相同的方向上。这些基因以单拷贝基因而存在。
5.木瓜环斑病毒
采用特异的寡聚核苷酸引物，通过聚合酶链式反应分离植物可表达的PRV基因。关于进一步的信息请参阅本申请人做为受让人的序号为＿、题目为“Papaya Ringspot Virus Coat Protein Gene”、申请日为1994年12月30日的待审专利申请，该申请被引入本文作参考。按照Slightom，ibid(1991)的方法，在分离和测序后，通过遗传工程将该基因插入植物表达盒pUC18cpexprers中。
6.多个外壳蛋白的构建体
为了获得能将多于一个的植物可表达基因转入植物基因组的二分质粒，单个外壳蛋白的表达盒分别以各种各样的组合被连到了一起。
(a)ZYMV72/WMBN-22
ZYMV72/WMBN22来源于二分质粒pPRBN，在该质粒中已被插入了表达ZYMV和WMV2外壳蛋白的表达盒。该表达盒被按顺序地插入到pPRBN的独特的BglII限制位点中。为实现这一插入，在WMV-2和ZYMV表达盒的35S启动子的5′端引入BamHI位点、在poly(A)添加序列的3′端引入BglII位点。通过在PCR扩增表达盒的过程中采用适当的寡聚核苷酸引物，来引入BamHI和BglII位点。用BamHI和BglII消化PCR产物，以得到适当的末端。将带有BamHI/BglII末端的WMV-2表达盒插入上述独特的BamHI/BglII终端位点中，以产生ZYMV72/WMBN22(图5)。将该二元表达盒定名为ZW。
(b)CMV73/ZYMV72/WMBN22
将CMV-c外壳蛋白表达盒插入ZYMV72/WMBN22的独特的HindIII位点中，得到了CMV73/ZYMV72/WMBN22(图5)。该三元表达盒被定名为CZW。
(c)CMV-WL41/ZYMV72/WMBN22(C-WLZW)
将CMV-白色叶片品系的表达盒、ZYMV和WMV2外壳蛋白基因插入二分质粒pPRBN中，以获得CMV-WL41/ZYMV72/WMV2(C-WLZW)。为了把病毒外壳蛋白表达盒的这一组合置于pPRBN之内，将CMV-白叶品系的外壳蛋白基因的表达盒插入了ZYMV72/WMVN22(参见上文ZYMV72/WMBN22的构建)。为了构建CMV-WL cp表达盒，Namba等(Namba等，Gene(基因)，107，181(1991)将该CMV-WL的外壳蛋白编码区插入了cpexpress。含有CMV-WL表达盒的HindIII片段被插入ZYMV72/WMBN22的HindIII位点中，以得到CMV-WL41/ZYMV72/WMBN22(图7)。该二分质粒被定名为CwLZW。
(d)WM310/ZYMV47/482G
将带有ZYMV cp表达盒(如上文所述)的HindIII片段插入到pGA482G的独特的HindIII位点中，以得到ZYMV47/482G。接着，将上文所述的带有WMV2表达盒的BamHI片段插入ZYMV47/482G的独特的BglII位点中，以得到WMV310/482G。该构建体被定名为WZ。
(e)PRVcpwm16S/WLWL41/ZY72/WMBN22
将PRV-FL品系、CMV-白叶品系、ZYMV和WMV-2外壳蛋白基因的表达盒插入二分质粒pPRBN中，以得到PRVcpwm16S/CWL41/ZY72/WNBN22(图9)。关于PRV-FL品系表达盒的进一步的信息，请参阅本申请人为受让人、序号为＿、题目为“PapayaRingspot Virus Coat Protein Gene”、申请日为1994年12日30日的待审专利申请，该申请被引入本文作参考。PRVcpwm16S/CWL41/ZY72/WNBN22这一构建体被定名为PCZW。
(f)PNIa22/CWL41/ZY72/WMBN22
将PRV-P品系PNIa基因的表达盒和CMV-WL品系ZYMV及WMV-2的外壳蛋白基因的表达盒插入二分质粒pPRBN中，以得到PNIa22/CWL41/ZY72/WMBN22(图10)。该构建体被定名为PNIa CZW。关于PRV-P品系PNIa基因表达盒的进一步的信息，请参阅本申请人为受让人、序号为＿、题目为“Papaya Ringspot Virus Protease Gene”、申请日为1994年12月30日的待审专利申请，该申请被引入本文作参考。
(g)SQ21/SQ42/WMBN22/ZY72/PRVcpwm16s/CWL41
为WMV-2、ZYMV、PRV-FL和CMV-WL品系的外壳蛋白基因和来自SqMV的两个外壳蛋白基因制备了表达盒，所述的表达盒被插入二分质粒pGA482GG(图12)中。该构建体被定名为SWZPC。C.南瓜的转化
将种子去皮后，使种子在含有吐温20(200μl/1000ml)的20％的次氯酸钠溶液中表面消毒20-25分钟。然后用蒸留水漂洗3次，每次100ml。使种子在150×25mm的培养管中萌发，该培养管中装有20ml1/4强度的Murashige和以0.8％Difco Bacto琼脂固化的Skoog基本有机物(MS)培养基。5-7天后，将幼苗中的子叶去除，切下苗尖，并转入装有75ml MS培养基(以1.5％的Difco Bacto琼脂固化)的GA7培养箱(Magenta Corp.)中。除非另有说明，所有的培养物均在培养室中进行培养，温度25℃，光照期为16小时。光线由冷荧光灯(Phillips F40CW)和植物生长灯(General Electric F40-PF)提供。
在体外采集植物的叶子碎片，并将其浸泡在根癌土壤杆菌的肉汤培养物(OD 600，0.1-0.2)中，并将之转入100×20mm的培养皿中，该培养皿中装有40ml补加了1.2mg/升的2，4，5-三氯苯氧乙酸(2，4，5-T)和0.4mg/升的苄氨基酸(BAP)和200μM AS的MS培养基(MS-I)。将平板温育在23℃。2-3天后，将叶子碎片转到含羧苄青霉素(500mg/升)、cefotaxime(200mg/升)和硫酸卡那霉素(150mg/升)的MS-I培养基(MS-IA)上。10天后，将叶片转入新鲜的MS-IA培养中。此后，每隔3周将组织转入新鲜的MIS-IA培养基中。大约过16-24周后，得到了抗卡那霉素的胚胎愈伤组织，并将该愈伤组织转入旋转培养试管中，该试管中装有补加了羧苄青霉素(500mg/升)、硫酸卡那霉素(150mg/升)和CaCl2·2H2O(1.03mg/升)的液体MS基本有机物培养基。收获正在发育的胚胎，并将之转入含20mg AgNO3的MS基本有机物培养基中。使萌发的胚胎在新鲜培养基中继代培养，直至长出根的幼苗形成。将胚幼苗转入土壤中，进行R1种子的生产。D.植物分析
采用可自市售购得的ELISA试剂盒(5-Prime 3-Prime，Boulder，CO)，通过ELISA分析卡那霉素抗性转化体对NPTII基因的表达。采用适当的引物，进行聚合酶链式反应，以便扩增NPTII基因(在右边界附近)和离左边界最近的外壳蛋白基因。用Southern印迹分析对某些品系的特征做进一步的分析。按照M.F.Clark等，J.Gen.Virol.(病毒遗传学杂志)，34，475(1977)的程序，用与碱性磷酸酶接合的抗体通过ELISA来探测病毒外壳蛋白基因在推测为被转化了的植物中的表达。抗CMV-C、WMV-2-NY和ZYMV-FL的抗血清由D.Gonsalves(ComellUniversity，Geneva，New York)提供。
T-DNA在R1及其后代中存在与否由测定可选择NPTII标记基因的ELISA试验来确定。用PCR或Southern分析来跟踪在品系ZW20中的遗传(ZW20的高级世代缺乏NPTII基因)。D.接种步骤
使分离的R1或R2后代和适当的对照品系一起在温室中萌发。在接种病毒之前，采集子叶以进行NPTII ELISA测定。将分别在CucumisSativus、Cucurbita Pepo和Phaseolus Vulgaris中繁殖的CMV C品系、ZYMV FL品系和WMV-2 NY品系，以1×10-1(重量/体积)的稀释度和撒有金刚砂的子叶机械接种在6日龄的秧苗上。在温室中对植物进行接种。接种后约7-10天，将植物移植到田间。为了监测蚜虫对病毒的某些传播，一些试验中包括了未接种的对照植物。在检查NPTII ELISA的结果之前，收集症状发育的数据，因此记分是在不知道要被评估的各分离子的转基因状态下进行的。
根据叶片上的症状，给植物评0-9的疾病严重程度的分数(0＝无症状，3＝在被接种的叶子上有症状和/或在新长出的叶子上有极轻微的症状，5＝中度的全身播散，7＝严重的全身播散，9＝严重的全身播散和发育障碍)。按照症状的严重程度也对果实给予评分(0＝无症状，3＝果实略带绿斑，5＝中度变色，7＝严重变色，9＝果实变色并变形)。然后评出各植物的果实和叶片的疾病分数，以平均数给出各品系的疾病级别。E.田间试验区的设计
在美国农业部(USDA)的动物和植物健康检疫局(APHIS)颁步的许可下进行了田间试验。采用的设计为由转基因品系组成的各行与含有作为其对照的非转基因对应体的行配对。各行由15株植物(两株间隔2英尺)组成，行间间隔5英尺。每个试验中，每个转基因品系设2-3个重复。试验区由最少30英尺的非转基因南瓜植株隔离带包围，以便减少飞出试验点的转基因花粉，并监测病毒在田间的传播。用在该试验中的转基因材料包括来自自花授粉或回交的R0黄色曲颈(crookneck)自交系的R1和R2后代。在某些情况下，将转基因自交系与非转基因自交系杂交，以便产生商用南瓜杂种Pavor或Dixie的转基因型。F.结果
AW构建体
品系ZW20来自被ZYMV72/WMBN22转化的R0植株。在田间试验1和2期间对R1植株的观察结果揭示，含有NPTII插入片段的植株在整个试验期间均保持了对ZYMV和WMV-2的抗性。
品系ZW19也来自被ZYMV72/WMVN22转化的R0植株。与ZW-20相比，ZW-19当用ZYMV或WMV-2接种时，表现出症状发育减弱(表2)。
表1在我们1991和1992年进行的试验中，以1/10(重量/体积)的稀释度接种ZYMV-FL品系或WMV-2品系40-47天后，转基因黄色曲颈南瓜(YC)南瓜品系表现出的症状(#有症状的植物(％))
 品系  NPTII       1991WMV-2试验         1992WMV-2试验         1992ZYMV试验
ZW-19     +-   ----   ----   14/1416/16   (100)(100)   11/11*19/19   (100)(100)
ZW-20     +-   0/145/18   (0)(28)   0/510/25   (0)(40)   ----   ----
轻微
CW构建体
用CMV V27、V33或V34品系对带有表达载体的转基因南瓜植株接种，所述的表达载体含有CMV-C和WMV-2 CP基因，所述的CMVV27、V33或V34品系能够侵染表达CMV-C外壳蛋白的转基因植物。有关CMV V27、V33或V34品系的进一步的信息，请参阅本申请人为受让人、序号为＿、题目为“Plants Resistant to V27、V33或V34 Strainsof Cucumber Mosaic Virus”、申请日为1994年12月30的待审专利申请，该申请被引入本文作参考。绝大部分的转基因植物对这些异源CMV品系的攻击有抗性，不像仅带有CMV-C CP的转基因品系。相对于仅带有CMV-C CP的转基因植物而言，剩下的被侵染的植物的症状大大地减轻了。
CZW构建体
CZW-3品系从用CMV73/ZYMV72/WMBN22转化的R0植株发育而来。该品系在田间试验中对于CMV-C、ZYMV-FL或WMV-2的侵染一直没有症状，无论是分别接种还是以含有全部三种病毒试剂的混合形式接种(表2)。
CZW-40品系从用CWL41/ZWMV-72/WMBN22转化的R0植株发育而来。当用CMV-C、ZYMV-FL或WMV-2 NY侵染时，它不具有抗侵染的任何保护(表2)。
表2以1/10(重量/体积)的稀释度接种CMV-C、ZYMV-FL或WMV-2-NY后，南瓜植株表现出的症状
  品系   NPTII   攻击     有症状的比例％   疾病的级别叶片  果实
  CZW-3     +-   CMV-C   1/13     0.76/6      100   0.4    0.08.5    --
  CZW-40*     +-   CMV-C   4/4      10011/11    100   5.0    --9.0    --
  CZW-3     +-   ZYMV-FL   0/14      04/4      100   0.0    0.08.0    7.0
  CZW-40     +-   ZYMV-FL   9/9      1005/5      100   9.0    --7.0    --
  CZW-3     +-   WMV-2-NY   0/40      015/15    100   0.0    0.07.0    7.0
  CZW-40     +-   WMV-2-NY   11/11    1003/3      100   7.0    --7.0    --
  *温室筛选
叶片和果实的疾病级别为0。相反，100％的cp-分离子在其叶片和果实上表现出病毒感染严重的症状。CP-分离子的疾病级别在7.0-9.0的范围内。该试验说明，通过把外壳蛋白基因组合起来，人们就能在自交系和杂交系中得到同时抗不同病毒感染的抗性。
表3以1/10(w/v)的稀释度同时接种CMV-C、ZYMV-FL和WMV-2-NY的混合物55天后，南瓜植株表现出的症状
    品系    CP      有症状的比例％        疾病的级别叶片  果实
Dixie CZW-3     +-     0/2730/30      0100     0.08.4     0.07.0
Pavo CZW-3     +-     0/2733/33      0100     0.07.0     0.0--
YS20CZW-3     +-     0/4015/15      0100     0.07.0     0.07.0
  Dixie     +-     --14/14     --100     --8.7     --7.0
  Pavo     +-     --24/24     --100     --8.9     --7.0
在第3试验季节，通过CP阳性R1 CZW-3分离子的自交产生出CZW-3的R2代。该转基因自交系做亲本的一方，还产生出了两个转基因杂交系，相当于Asgrow的商用杂种Pavo和Dixie。对于插入的基因，自交系的后代表现出预期3∶1的分离比率(基于NPTII ELISA)，而两个杂交系均表现出预期的1∶1的比率。该转基因的自交和杂交后代以1/10(w/v)的稀释度，用含有所有三种病毒CMV-C、WMV-2-NY和ZYMV-FL的接种混合物接种。表3显示分离子对所有3种病毒的感染有完全的抗性。
这里的结果证实，当外壳蛋白基因是以组合的方式被插入时，它们赋予植物以抗多种病毒的抗性。例如，转基因品系CZW-3在所有的3个病毒试验(CMV、ZYMV和WMV-2)中均无症状，在所述的试验中既用各病毒对它们进行单一的接种也用所有的三种病毒同时进行接种，均一直无症状表现。因为在商用田的条件下，在生长季节经常发现不只一种病毒的感染，所以获得具有抗多种病毒感染抗性品系的能力对于开发出有商用价值的南瓜栽培品种是至关重要的。
在这些试验中，还观察到当多个外壳蛋白基因被插入同一构建体时，在该构建体中所有基因表现出的效力水平大致相等。抗CMV-C抗性水平高的CZW-3品系抗ZYMV-FL和WMV-2-NY的抗性水平也高。与此形成对照的是，转基因品系如ZW-19对于WMV-2仅显示出中度的抗性(有较微弱的抗性症状表现)，该品系对ZYMV也仅显示出中度的抗性。而且，对转基因品系CZW-40的温室筛选证明，不能抗CMV-C的该品系也不能抗ZYMV-FL和WMV-2-NY。这种在多基因构建体上的基因间相互协调的作用水平可能是对基因插入到植物基因组内位置效应的反映。无论如何，这种现象提供了一种方法，该方法极大地增加了找到高水平地抗多种病毒的各转基因品系的概率。
            实施例II将多-CP基因表达盒引入棱瓜
1.棱瓜的转化
采用Fang和Grumet的方法(Fang和Grumet，Molec.Plant MicrobeInteraction(植物微生物相互作用的分子生物学)，6，358(1993))，用上文所列的多基因构建体转化棱瓜自交系。将生出根来的转化植株移入温室并使之产生R1。
                植物分析/接种步骤
如上文的实施例I所述，对转基因植物进行分析和接种。
2.结果
ZW构建体。品系CA76-ZW-102-29对ZYMV-FL或WMV-2-NY的侵染都具有抗性。相反，其它所有的品系都不能抗ZYMV或WMV-2的侵染(表4)。
表4以1/10(重量/体积)的稀释度接种ZYMV-FL或WMV-2-NY后，棱瓜植株表现出的症状
    品系  NPTII   攻击  有症状的比例％  疾病的级别
 CA-ZW-102-29     +- ZYMV-FL     0/30    0     0.0
    +- WMV-2-NY     0/9     02/2    100     0.05.0
 CA-ZW-115-38     +- ZYMV-FL     0/30    0     0.0
    +- WMV-2-NY     9/17    06/8     75     0.04.0
PCZW构建体。品系CA95 PXZW-1对CMV-C、ZYMV-FL和WMV-2的侵染有抗性。该品系具有常规的抗PRV的抗性，这样PRV插入片段的效力就能被确定了。相反，多数的PCZW转基因品系不具有抗CMV-C或ZYMV-FL的抗性。用WMV-2-NY对这些品系的接种仍在进行当中(表5)。
表5以1/10(重量/体积)的稀释度接种ZYMV-FL、WMV-2-NY或CMV-C后，棱瓜植株表现出的症状
        品系   NPTII   攻击     有症状的比例％ 疾病的级别
CA95-PCZW-93351-1     +-   CMV-C   1/123/3   (08)(100)     0.66.3
    +-   WMV-2-NY   1/92/2   (11)(100)     0.55.0
    +-   ZYMV-FL   6/86/6   (75)(100)     4.29.0
CZ95-PCZW-93356-1     +-   CMV-C   9/94/4   (100)(100)     7.07.0
    +-   ZYMV   10/105/5   (100)(100)     7.07.0
CA95-PCZW-93356-6     +-   CMV-C   9/91/1   (100)(100)     7.09.0
    +-   ZYMV   10/101/1   (100)(100)     7.07.0
SWZPC构建体。虽然还没有对这些品系进行抗性的评估，PCR分析已经证实由该构建体产生的棱瓜品系的27/36(75％)含有全部的6个CP基因，外加NPTII可选择标记基因。这一点说明土壤杆菌介导的转化可被用来将二分质粒中的至少7个(还可能更多的)连琐基因转入植物细胞中，随后得到含有所有7个连琐基因插入片段的完整植株。
            实施例III将多个CP基因表达盒引入黄瓜
1.黄瓜的转化
采用改进的Sarmento等的方法(Sarmento等，Plant Cell Tissue andOrgan Culture(植物细胞组织和器官培养)，31，185(1992))，用上文所列的多个外壳蛋白基因构建体转化黄瓜自交系。将已生根的植物转入温室，并生产R1种子。如上文的实施例I所述，对转基因植物进行分析和接种。
2.结果
CZW构建体。品系GA715 CZW7、95、33、99对ZYMV-FL和WMV-2-NY都有抗性(这些品系传统上是被繁育出来抗CMV-C的，因此CMV外壳蛋白插入片段的效力不能被确定)(表6)
表6以1/10(重量/体积)的稀释度接种ZYMV-FL、ZYMV-CA或WMV-2-NY后，黄瓜植株表现出的症状
    品系   NPTII     攻击    有症状的比例％   疾病的级别
 GA715 CZW-7     +-   ZYMV-FL     0/87/7      0100     0.06.4
    +-   WMV-2-NY     0/58/9      089     0.04.4
 CA715-CZW-33     +-   ZYMV-FL     0/69/9      0100     0.06.9
    +-   WMV-2-NY     0/68/8      0100     0.04.3
 GA715-CZW-95     +-   ZYMV-FL     0/112/2      0100     0.05.0
    +-   WMV-2-NY     0/102/2      0100     0.05.0
 GA715-CZW-99     +-   ZYMV-F     0/86/6      0100     0.06.7
    +-   WMV-2-NY     0/75/5      0100     0.03.0
PNIa CZW构建体。品系GA715 PNIa CZW-21抗CMV-C、ZYMV-FL和PRV-P-HA，而品系GA715 PNIa CZW-15对ZYMV-FL和WMV-2-NY却是敏感的(表7)
表7以1/10(重量/体积)的稀释度接种ZYMV-FL、WMV-2-NY或PRV-P-HA后，黄瓜植株表现出的症状
        品系   NPTII   攻击   有症状的比例％ 疾病的级别
 GA715 PNIaCZW-21     +-  ZYMV-FL     0/7     02/2    100     0.07.0
    +-  CMV-Carna-5     0/4     04/11    44     0.02.2
    +-  WMV-2-NY     NT      NTNT      NT     NTNT
    +-  PRV-P-HA     0/3      06/6     100     0.03.0
 GA715 PNIa CZW-15     +-  ZYMV-FL     2/2     10012/12   100     3.05.0
    +-  WMV-2-NY     4/4     10010/10   100     3.03.0
    +-  PRV-P-HA     NT      NTNT      NT     NTMT
    +-  CMV-CCarna-5     NT      NTNT      NT     NTNT
           实施例iV将多CP基因表达盒引入西瓜
1.西瓜的转化
采用改进了的Choi等(Plant Cell Repons(植物细胞报道)，344(1994))描述的方法，用上文所列的多个外壳蛋白基因表达盒WZ转化西瓜自交系。
2.植物分析/接种步骤
按照上文实施例I的描述，对转基因植物进行分析和接种。
3.结果
WZ构建体。品系WA3WZ-20-14对ZYMV-FL和WMV-2-NY有抗性(表8)。
表8以1/10(重量/体积)的稀释度接种ZYMV-FL或WMV-2-NY后，转基因西瓜品系表现出的症状
    品系   NPTII   攻击    有症状的比例％ 疾病级别
WA3WZ-20-14     +- ZYMV-FL     0/14      011/11    100     0.09.0
    +- WMV-2-NY     0/13      01/10     100     0.09.0
所有的出版物、专利和专利文献均被引入本文做参考，就好象各篇是被单独引入的一样。参照具体的和优选的实施方案和技术，已对本发明做了描述。然而，应理解的是，在落入本发明的精神和范围内的前提下，可进行许多变化和修改。

Claims (20)

1.嵌合的重组DNA分子，包含：
多个DNA序列，各序列含有与编码病毒蛋白质的DNA序列相连的启动子，其特征在于所述的多个DNA序列在被所述的重组DNA分子转化的对病毒敏感的植物细胞中表达，以赋予所述的细胞抗所述的各病毒侵染的抗性。
2.权利要求1的嵌合的DNA分子，其特征在于所述的DNA序列一前一后地串连在一起。
3.权利要求1的嵌合的DNA分子，其特征在于所述DNA序列的表达带来基本上等量的抗侵染抗性。
4.权利要求1的嵌合的DNA分子，其特征在于所述多个DNA序列中的至少一个序列的表达带来抗多种病毒的抗性。
5.权利要求1的DNA分子，其特征在于所述的DNA序列还包含可选择的标记基因、报告基因或其组合，所述的标记基因、报告基因或其组合能使被所述的DNA分子转化的植物细胞鉴定出来。
6.权利要求5的DNA分子，其特征在于所述的多个DNA序列的侧翼为两个可选择的标记基因、两个报告基因或其组合。
7.权利要求1的DNA分子，其特征在于所述的病毒蛋白质包括西瓜花叶病毒II、黄瓜花叶病毒或夏南瓜黄叶花叶病毒外壳蛋白中的至少两种。
8.权利要求1的DNA分子，其特征在于所述的植物细胞来自葫芦科植物。
9.赋予对病毒敏感的植物抗多种病毒抗性的方法，该方法包括：
(a)用含有多个DNA序列的嵌合重组DNA分子对所述的敏感植物的细胞进行转化，各DNA序列包含在所述植物的细胞中有功能的启动子，而且该启动子与编码病毒蛋白质的DNA序列相连，所述的病毒能侵染所述的植物；
(b)使所述的植物细胞再生以得到分化的植株；和
(c)鉴定出被转化的植物，该转化的植株表达所述的DNA编码序列以赋予该植物抗所述病毒侵染的抗性。
10.权利要求9的方法，其特征在于DNA编码序列的表达带来基本上等量的抗各病毒侵染的抗性。
11.权利要求9的方法，其特征在于所述DNA编码序列中的至少一个序列的表达带来抗多个所述病毒的抗性。
12.权利要求9的方法，其特征在于所述的植物是双子叶植物。
13.权利要求9的方法，其特征在于所述的DNA分子是二分Ti质粒的一部分，并且所述的植物细胞是被根癌土壤杆菌介导的转化转化了的细胞。
14.权利要求9的方法，其特征在于所述的DNA序列还包含能将所述的被转化植物鉴定出来的可选择标记基因或报告基因。
15.权利要求9的方法，其特征在于所述的DNA序列还包含西瓜花叶病毒II、黄瓜花叶病毒或夏南瓜黄叶花叶病毒的外壳蛋白基因中的至少两个。
16.权利要求9的方法，其特征在于所述的敏感植物是葫芦科的植物。
17.以权利要求9的方法制备的被转化植物。
18.以权利要求9的方法制备的被转化的植物细胞。
19.权利要求17的被转化植物的被转化的种子。
20.由权利要求17的被转化植物制备的杂种植物，该植物抗所述病毒的侵染。
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