CN111148432B - 工程化的杀有害生物蛋白和控制植物有害生物的方法 - Google Patents

工程化的杀有害生物蛋白和控制植物有害生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织以及种子杀有害生物活性(例如杀昆虫活性)的核酸、多肽、转基因植物、组合物以及方法。编码所述杀昆虫蛋白的核酸可以用于转化原核和真核生物，包括植物，以表达所述杀昆虫蛋白。重组生物和包含所述重组生物或杀昆虫蛋白的组合物可用于控制有害生物(例如昆虫)。

Description

工程化的杀有害生物蛋白和控制植物有害生物的方法
技术领域
本发明涉及工程化的杀有害生物蛋白和编码它们的核酸分子，连同用于控制植物有害生物的组合物和方法。
背景技术
昆虫有害生物是引起作物损失的一个主要原因。仅在美国，由于各个属的昆虫的侵染每年就损失数十亿美元。除了大田作物的损失之外，昆虫有害生物对于菜农和果农、对于观赏性花卉的生产商而言也是一种负担，并且对于园丁和房屋所有者而言是一种令人讨厌的东西。
玉米根虫的多个物种被认为是最具破坏性的玉米有害生物。在美国，三个重要的物种是玉米根萤叶甲指名亚种指名亚种(Diabrotica virgifera virgifera，又称西方玉米根虫(western corn rootworm，WCRW))、长角巴氏根萤叶甲(D.longicornis barberi，又称北方玉米根虫(northern corn rootworm，NCRW))和黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi，又称南方玉米根虫(southern corn rootworm，SCRW))。在美国玉米带中，只有西方和北方玉米根虫被认为是主要的玉米有害生物。另外地，美国南部的一种重要的玉米根虫有害生物是墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲(Diabroticavirgifera zeae))(MCRW)。玉米根虫的幼虫通过几乎专一摄食玉米根而造成最为实质性的植物损害。已显示这种损伤增加了植物倒伏、减少了谷物产量以及营养物质的产量连同改变了谷物的营养物含量。幼虫摄食还通过为导致根腐病和茎腐病的细菌和真菌感染打开了进入根部的途径，而对玉米造成了间接的影响。成年玉米根虫在晚夏时活跃在玉米地中，在此它们摄食穗、穗丝以及花粉，由此干扰了正常的授粉。
玉米根虫主要是通过密集施用化学杀有害生物剂而得到控制的，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、预防昆虫摄食或繁殖、或者导致死亡而具有活性。由此可以达到良好的玉米根虫控制，但这些化学品有时也能影响其他有益的生物。由化学杀有害生物剂的广泛使用产生的另一个问题是出现了抗性昆虫品种。又另一个问题是由于下述事实：玉米根虫幼虫在地下摄食因此使得施用杀昆虫剂的救护处理变得困难。因此，大多数杀昆虫剂的施用是在种植时预防性地进行的。这种实践导致了巨大的环境负担。通过各种农田管理实践已部分地改善了这种状况，但对替代性有害生物控制的机制存在着不断增加的需求。
生物性有害生物控制剂，如表达杀有害生物毒素像δ-内毒素(也被称为结晶毒素或Cry蛋白)的苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株已经被施用至作物植物中，产生了针对昆虫有害生物的令人满意的结果。这些δ-内毒素是在结晶基质内所容纳的蛋白质，已知它们当被某些昆虫摄取时拥有杀昆虫活性。来自苏云金芽孢杆菌的若干天然Cry蛋白或工程化的Cry蛋白已经在转基因作物植物中表达并且在商业上被开发以控制某些鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物。例如，从2003年开始，通过表达Cry3Bb1(例如在玉米事件MON88017中)、Cry34Ab1/Cry35Ab1(例如在玉米事件DAS-59122中)或经修饰的Cry3A(mCry3A；例如在玉米事件MIR604中)或Cry3Ab(eCry3.1Ab；例如在玉米事件MIR604中)蛋白来控制玉米根虫的转基因玉米杂种已经在美国可商购。
尽管已经显示使用表达Cry蛋白的转基因植物非常有效，但现在针对某些转基因植物中表达的Cry蛋白具有抗性的昆虫有害生物是已知的。因此，仍需要鉴定新型并有效的有害生物控制剂，这些有害生物控制剂为农民提供经济利益并且是环境可接受的。特别需要的是对根萤叶甲属(Diabrotica)物种(一种主要的玉米有害生物)有毒的蛋白质，与现存的昆虫控制产品相比这些蛋白质作为缓和抗性发展的方法具有不同的作用方式。此外，通过这些使环境负担最小化的产品(如通过转基因植物)递送昆虫控制剂是令人希望的。
发明内容
本发明提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织以及种子的杀有害生物活性(例如杀昆虫活性)的核酸、多肽、组合物以及方法。特别地，本发明提供了新颖的工程化的杀有害生物蛋白(例如，工程化的杀昆虫蛋白)，与亲本分子(即不包含根据本发明的经修饰的Axmi205蛋白)相比，其任选具有改变或增强的杀有害生物(例如杀昆虫)活性和/或哺乳动物消化蛋白酶的加工(即切割)。
在实施例中，本发明的工程化的蛋白对经济上重要的昆虫有害生物(特别是侵染植物的昆虫有害生物)是有毒的(例如，通过抑制昆虫有害生物存活、生长和/或繁殖的能力)。例如，在实施例中，本发明的杀昆虫蛋白可用于控制一种或多种经济上重要的鞘翅目有害生物，包括但不限于豆叶甲(Bean Leaf Beetle)(菜豆莹叶甲(Cerotomatrifurcata))，科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado Potato Beetle)(马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata))，棉铃象鼻虫(Boll Weevil)(墨西哥棉铃象(Anthonomusgrandis)和/或玉米根虫有害生物(例如根萤叶甲属物种(Diabrotica spp.))，例如西方玉米根虫(WCRW；玉米根萤叶甲指名亚种)，北方玉米根虫(NCRW；巴氏根萤叶甲(D.barberi))，南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲食根亚种)，墨西哥玉米根虫(MCRW；墨西哥玉米根萤叶甲)等。在实施例中，杀昆虫蛋白对WCRW有害生物具有活性，所述WCRW有害生物对以下有抗性：mCry3A蛋白(例如，在玉米事件MIR604中)、eCry3.1Ab蛋白(例如，在玉米事件5307中)、Cry3Bb1蛋白(例如，在玉米事件MON88017中)、Cry34/35Ab1二元蛋白(例如，在玉米事件DAS-59122中)和/或RNAi性状(例如DvSnf7 dsRNA(例如，在玉米事件MON87411中))。
因此，一方面，本发明提供经修饰的Axmi205毒素，其中所述经修饰的Axmi205毒素对植物有害生物(例如，昆虫有害生物(例如鞘翅目有害生物))具有杀昆虫活性，并且包含并入SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的多肽的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的修饰(例如，缺失、取代和/或插入)，并且其中修饰导致与除了不包含所述修饰外相同的Axmi205毒素相比，哺乳动物消化蛋白酶对经修饰的Axmi205毒素的消化增强。
在其他方面，经修饰的Axmi205毒素对鞘翅目昆虫有害生物，例如玉米根虫(例如，根萤叶甲属物种(Diabrotica species))、豆叶甲(菜豆莹叶甲)、科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯叶甲)和/或棉铃象鼻虫(墨西哥棉铃象)。
另一方面，本发明提供经修饰的Axmi205毒素，其包含以下、基本由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1的多肽，所述SEQ ID NO:1的多肽已经被一个或多个氨基酸的修饰(例如，缺失、取代和/或插入)所修饰，导致被哺乳动物消化蛋白酶(例如，胃蛋白酶)的消化增强。
在其他方面，哺乳动物消化蛋白酶(例如，胃蛋白酶)对经修饰的Axmi205毒素的消化增强(更快和/或更完全)，使得当在相同条件(例如，酶浓度、蛋白质浓度、pH、温度和/或时间)下测试时，与不包含修饰(例如，缺失、取代和/或插入)的Axmi205毒素相比，剩余的4kDa以上片段的数量更少。例如，如实例5中所述，使用胃蛋白酶的消化可以在以下条件进行：约37℃和约pH 1.2，任选地具有约10单位(U)胃蛋白酶/微克蛋白质的酶浓度。在实施例中，在用哺乳动物消化蛋白酶(例如胃蛋白酶)消化10分钟后，高于4kDa的经修饰的Axmi205毒素的片段不存在(例如，不可检测)。
另一方面，修饰(一个或多个氨基酸的缺失、取代和/或插入)位于SEQ ID NO:1的多肽的从氨基酸402到氨基酸497的部分中，或在另一Axmi205毒素的相应部分。
在一些方面，本发明提供了经修饰的Axmi205毒素，其包括：
a)具有脂肪族疏水侧链的一个或多个氨基酸被缺失、取代和/或插入；
b)具有芳香族疏水侧链的一个或多个氨基酸被缺失、取代和/或插入；
c)具有极性中性侧链的一个或多个氨基酸被缺失、取代和/或插入；
d)具有酸性侧链的一个或多个氨基酸被缺失、取代和/或插入；
e)具有碱性侧链的一个或多个氨基酸被缺失、取代和/或插入；或
f)(a)至(e)的任意组合。
在其他示例性方面，并入修饰的Axmi205毒素中的修饰产生新的蛋白酶(例如，胃蛋白酶)切割位点。任选地，根据这个方面，具有脂肪族疏水侧链和/或芳香族疏水侧链的一个或多个氨基酸被取代和/或插入。
在另一方面，并入修饰的Axmi205毒素中的修饰通过被另一个氨基酸取代而消除了Axmi205毒素中的一个或多个半胱氨酸残基。
根据另外的方面，本发明提供了经修饰的Axmi205毒素，其包含：
a)SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸K402处或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸残基处的氨基酸取代；
b)SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸K402和Y404处或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸和酪氨酸残基处的氨基酸取代；
c)SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸C482处或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基处的氨基酸取代；
d)SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸C507处或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基处的氨基酸取代；
e)SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸M422和M423处或另一Axmi205毒素中的相应甲硫氨酸残基处的氨基酸取代；
f)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A475和G476之间或另一Axmi205毒素中的相应的丙氨酸和甘氨酸残基之间的氨基酸插入；
g)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸G496和D497之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的氨基酸插入；
h)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Q471和P472之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的氨基酸插入；
i)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A479和S480之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的氨基酸插入；
j)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Y489和N490之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的氨基酸插入；
k)在由SEQ ID NO:1的氨基酸位置469和483界定的区域内的单个氨基酸插入；或
l)在由SEQ ID NO:1的氨基酸位置483和501界定的区域内的单个氨基酸插入。
在另一方面，本发明提供了经修饰的Axmi205毒素，其包含：
a)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸K402或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的取代；
b)以下的氨基酸取代：(i)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸K402或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸；以及(ii)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Y404或另一Axmi205毒素中的相应酪氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸；
c)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸C482或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的取代；
d)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸C507或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的取代；
e)以下的氨基酸取代：(i)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸M422或另一Axmi205毒素中的相应甲硫氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸；以及(ii)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸M423或另一Axmi205毒素中的相应甲硫氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸；
f)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A475和G476之间或另一Axmi205毒素中的相应丙氨酸和甘氨酸残基之间具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的插入；
g)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸G496和D497之间或另一Axmi205毒素中的相应甘氨酸和天冬氨酸残基之间具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的插入；
h)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Q471和P472之间或另一Axmi205毒素中的相应丙氨酸和甘氨酸残基之间具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的插入；
i)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A479和S480之间或另一Axmi205毒素中的相应丙氨酸和甘氨酸残基之间具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的插入；或
j)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Y489和N490之间或另一Axmi205毒素中的相应丙氨酸和甘氨酸残基之间具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的插入。
在其他说明性方面，本发明提供了经修饰的Axmi205毒素，其包含：
a)SEQ ID NO:1的多肽中的K402F、K402N或K402D或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸的氨基酸取代；
b)SEQ ID NO:1的多肽中的(i)K402L和Y404F或(ii)K402D和Y404L或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸和酪氨酸残基的氨基酸取代；
c)SEQ ID NO:1的多肽中的C482S、C482D或C482F或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基的氨基酸取代；
d)SEQ ID NO:1的多肽中的C507S、C507L、C507A、C507F、C507D或C507R或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基的氨基酸取代；
e)(i)M422S和M423L、(ii)M422T和M423F、(iii)M422S和M423E、(iv)M422D和M423E、(v)M422K和M423R或(vi)M422K和M423F或另一Axmi205毒素中的相应甲硫氨酸残基的氨基酸取代；
f)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A475和G476之间或另一Axmi205毒素中的相应的丙氨酸和甘氨酸残基之间的亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸的插入；
g)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸G496和D497之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸的插入；
h)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Q471和P472之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸的插入；
i)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A479和S480之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸的插入；或
j)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Y489和N490之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸的插入。
更进一步，在代表性的方面，本发明提供了经修饰的Axmi205毒素，其包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ IDNO:123、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:127。
在其他方面，本发明提供了多核苷酸，其包含编码本发明的经修饰的Axmi205毒素的核苷酸序列，任选地密码子优化用于在植物中表达。还提供了包含本发明的多核苷酸的表达盒和载体。
根据一些方面，本发明提供了包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：
a)SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:126的核苷酸序列；
b)与(a)的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列；
c)在严格杂交条件下退火至(a)或(b)的核苷酸序列的核苷酸序列；或
d)由于遗传密码的简并性而不同于(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的核苷酸序列。
任选地，根据这个方面，多核苷酸包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQID NO:70、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:126的核苷酸序列。
作为另外的方面，本发明提供了转基因细胞(例如转基因植物细胞，如双子叶植物细胞或单子叶植物细胞，或转基因细菌细胞)、转基因植物部分、转基因植物培养物、以及转基因植物种子，其包含本发明的核苷酸序列、表达盒、载体和/或杀昆虫蛋白。
作为仍另外的方面，本发明涵盖转基因植物，所述转基因植物包含本发明的植物细胞、植物部分、核苷酸序列、表达盒、载体和/或杀昆虫蛋白。
作为另外的方面，涉及产生本发明的转基因植物的种子和由本发明的转基因植物产生的种子。
还提供了衍生自本发明的转基因植物的收获产物，其中所述收获产物任选地包含本发明的核苷酸序列、表达盒、载体和/或杀昆虫蛋白。进一步提供了衍生自本发明的收获产物的加工产物，其中所述收获产物任选地包含本发明的核苷酸序列、表达盒、载体和/或杀昆虫蛋白。在实施例中，所述收获产物或加工产物包含本发明的杀昆虫蛋白，并且对昆虫有害生物(例如鞘翅目昆虫有害生物，例如WCRW)具有增加的抗性。
作为仍另外的方面，本发明提供了杀昆虫组合物，所述杀昆虫组合物包含本发明的杀昆虫蛋白和农业上可接受的运载体。
仍另外，本发明作为另外的方面，提供了产生对昆虫有害生物(例如鞘翅目昆虫有害生物，例如WCRW)具有增加的抗性的转基因植物的方法。在实施例中，所述方法包括向植物中引入本发明的多核苷酸、表达盒或载体，其中所述杀昆虫蛋白在植物中表达，从而产生对昆虫有害生物具有增加的抗性的转基因植物。任选地，所述引入步骤包括：(i)用多核苷酸、表达盒或载体转化植物细胞并再生转基因植物；或者(ii)使包含多核苷酸、表达盒或载体的第一植物与第二植物杂交。在实施例中，所述方法进一步包括产生来自转基因植物的种子。在实施例中，所述方法进一步包括从转基因植物中获得子代植物，其中所述子代植物包含多核苷酸、表达盒或载体，表达杀昆虫蛋白，并且对昆虫有害生物具有增加的抗性。
作为又另一个方面，本发明提供了产生对昆虫有害生物(例如鞘翅目昆虫有害生物，例如WCRW)具有增加的抗性的转基因植物的方法，所述方法包括：(a)种植包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体的种子；和(b)使来自种子的转基因植物生长，其中所述转基因植物包含多核苷酸、表达盒或载体并产生杀昆虫蛋白，并且对昆虫有害生物具有增加的抗性。在实施例中，所述方法进一步包括：(c)收获来自(b)的转基因植物的种子，其中所述收获种子包含多核苷酸、表达盒、载体和/或杀昆虫蛋白。任选地，所述种子对昆虫有害生物(例如鞘翅目昆虫有害生物，例如WCRW)具有增加的抗性。
仍另外，作为另一个方面，本发明提供了产生种子的方法。在实施例中，所述方法包括：(a)提供包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体的转基因植物；和(b)收获来自(a)的转基因植物的种子，其中所述收获种子包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体和/或杀昆虫蛋白。任选地，所述种子对昆虫有害生物(例如鞘翅目昆虫有害生物，例如WCRW)具有增加的抗性。
本发明进一步考虑到产生杂交植物种子的方法。在代表性实施例中，方法包括：(a)使第一近交植物(其是包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体的转基因植物)与不同近交植物(其可以包含或不包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体)杂交；和(b)允许形成杂交种子。在实施例中，所述杂交种子包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体和/或杀昆虫蛋白。任选地，所述种子对昆虫有害生物(例如鞘翅目昆虫有害生物，例如WCRW)具有增加的抗性。
作为另一个方面，本发明提供了控制昆虫有害生物(例如鞘翅目昆虫有害生物，例如玉米根虫)的方法，所述方法包括向昆虫有害生物或其环境递送组合物，所述组合物包含有效量的本发明的杀昆虫蛋白或杀昆虫组合物。在实施例中，所述方法是控制鞘翅目昆虫有害生物(例如，玉米根虫，例如WCRW)的方法，所述有害生物对以下有抗性：mCry3A蛋白(例如，在玉蜀黍事件MIR604中)、eCry3.1Ab蛋白(例如，在玉蜀黍事件5307中)、Cry3Bb1蛋白(例如，在玉米事件MON88017中)、Cry34/35Ab1二元蛋白(例如，在玉米事件DAS-59122中)和/或RNAi性状(例如DvSnf7 dsRNA(例如，在玉米事件MON87411中))。
本发明还涉及使用本发明的多核苷酸的方法，例如在DNA构建体或表达盒或载体中用于在生物(包括植物和微生物，如细菌)中进行转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以是已经被设计用于在生物(如植物或细菌)中表达的天然的或合成的序列。本发明进一步涉及制造本发明的杀昆虫蛋白的方法以及使用这些多核苷酸序列和杀昆虫蛋白的方法，例如，在微生物中控制昆虫或者在转基因植物中赋予保护免受昆虫损害。
本发明的另一个方面包括杀昆虫组合物和配制品，所述组合物和配制品包含本发明的杀昆虫蛋白，以及使用这些组合物或配制品来控制昆虫群体的方法，例如通过将这些组合物或配制品应用至昆虫侵染的区域，或者应用至预防性处理易感昆虫的区域或植物以赋予针对昆虫有害生物的保护。任选地，除本发明的杀昆虫蛋白之外，本发明的组合物或配制品可以包含其他杀有害生物剂(如化学杀有害生物剂、其他杀有害生物蛋白或dsRNA)，例如，以加强或增强组合物或配制品的昆虫控制能力和/或用于昆虫抗性管理。
本发明的这些组合物和方法可用于控制攻击植物、特别是作物植物的昆虫有害生物。本发明的这些组合物对于检测商用产品或转基因生物中的杀昆虫蛋白或编码其的核酸的存在也是有用的。
本发明还提供了本发明的杀昆虫蛋白、核酸、转基因植物、植物部分、种子和杀昆虫组合物的用途，例如，用于控制昆虫有害生物(例如鞘翅目有害生物，例如WCRW)。
在实施例中，本发明提供了使用本发明的多核苷酸、表达盒、载体或宿主细胞以产生用于控制昆虫有害生物(例如鞘翅目昆虫有害生物，例如WCRW)的杀昆虫组合物的方法。
在实施例中，本发明提供了使用本发明的多核苷酸、表达盒或载体以产生转基因种子的方法，其中所述转基因种子生长成对昆虫有害生物具有增加的抗性的转基因植物。
作为另一个方面，本发明还考虑了本发明的转基因植物用于产生转基因种子(其任选地是杂交种子)的用途。
在实施例中，本发明提供方法，所述方法使用本发明的杀昆虫蛋白、多核苷酸、表达盒、载体、转基因植物或杀昆虫组合物来防止靶鞘翅目昆虫有害生物群体中针对以下的抗性的发展：mCry3A蛋白(例如，在玉蜀黍事件MIR604中)、eCry3.1Ab蛋白(例如，在玉蜀黍事件5307中)、Cry3Bb1蛋白(例如，在玉米事件MON88017中)、Cry34/35Ab1二元蛋白(例如，在玉米事件DAS-59122中)和/或RNAi性状(例如DvSnf7 dsRNA(例如，在玉米事件MON87411中))。
参考以下详细说明书和权利要求书，本发明的这些和其他特征、方面、以及优点将变得更好理解。
附图说明
图1–Axmi205序列显示带有下划线的第2个结构域，预测的胃蛋白酶切割位点以灰影显示，C末端结构域中的半胱氨酸残基以粗体显示。
图2–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#5(K402F)、#21(C482S)、#23(C507S)、#28(M4222S&M423L)和#34(475-Phe-476)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图3–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#36D(496-Asp-497)、#37L(471-Leu-472)、#38L(479-Leu-480)和#39L(489-Leu-490)在时间T0和T5的SGF测定结果。
图4–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#13(C406S)、#16(C482S)、#18(C445S)、#21(C482S)和#23(C439S)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图5–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#1(K328Y)、#9(R416L)、#14(C406L)、#19(R454F)和#25(F378L)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图6–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#26(S495L)、#28(M4222S&M423L)、#31(396-Leu-397)、#32(330-Leu-331)和#35(367-Leu-368)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图7–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#3(K328F)、#4(Y404F)、#5(K402F)、#6(K402N)和#22(C482L)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图8–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#2(K328L)、#8(Y404F&K402L)、#33(456-Leu-457)、#34(475-Leu-476)和#36(496-Leu-497)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图9–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#11(R391L)、#12(R391I)和#20(R464L)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图10–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#2(K402L)、#15(P411L)、#17(C439L)、#27(G496L)和#29(V467S和S468L)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图11–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#5D(K402D)、#21F(C482F)、#23F(C507F)和#28TF(M422T&M423F)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图12–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#28KR(M422K&M423R)、#34D(475-Asp-476)、#34F(475-Phe-476)和#34R(475-Arg-476)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图13–在野生型Axmi205和eAxmi205突变体#23D(C507D)、#23L(C507L)、#23R(C507R)、#28DE(M422D&M423E)和#36D(496-Asp-497)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图14–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#21D(C482D)、#28SE(M4222S&M423E)、#36R(496-Arg-497)、#37F(471-Phe-472)和#37L(471-Leu-472)在时间T0和T10的SGF测定结果。
图15–野生型Axmi205和eAxmi205突变体#28KF(M4222K&M423F)、#36F(496-Phe-497)、#38F(479-Phe-480)、#38L(479-Leu-480)、#39F(489-Phe-490)、#39L(489-Leu-490)在时间T0和T10的SGF测定结果。
序列简述
SEQ ID NO:1是天然Axmi205蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是天然Axmi205蛋白的cDNA序列。
SEQ ID NO:3是eAxmi205#1突变蛋白(K328Y)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是编码SEQ ID NO:3的eAxmi205#1突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5是eAxmi205#2突变蛋白(K328L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是编码SEQ ID NO:5的eAxmi205#2突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7是eAxmi205#3突变蛋白(K328F)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是编码SEQ ID NO:7的eAxmi205#3突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9是eAxmi205#4突变蛋白(Y404F)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是编码SEQ ID NO:9的eAxmi205#4突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11是eAxmi205#5突变蛋白(K402F)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是编码SEQ ID NO:11的eAxmi205#5突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是eAxmi205#6突变蛋白(K402N)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是编码SEQ ID NO:13的eAxmi205#6突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15是eAxmi205#7突变蛋白(K402L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是编码SEQ ID NO:15的eAxmi205#7突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17是eAxmi205#8突变蛋白(Y404F+K402L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是编码SEQ ID NO:17的eAxmi205#8突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19是eAxmi205#9突变蛋白(R416L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是编码SEQ ID NO:19的eAxmi205#9突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21是eAxmi205#10突变蛋白(P386L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是编码SEQ ID NO:21的eAxmi205#10突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23是eAxmi205#11突变蛋白(R391L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是编码SEQ ID NO:23的eAxmi205#11突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25是eAxmi205#12突变蛋白(R391I)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26是编码SEQ ID NO:25的eAxmi205#12突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27是eAxmi205#13突变蛋白(C406S)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是编码SEQ ID NO:27的eAxmi205#13突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:29是eAxmi205#14突变蛋白(C406L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30是编码SEQ ID NO:29的eAxmi205#14突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:31是eAxmi205#15突变蛋白(P411L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32是编码SEQ ID NO:31的eAxmi205#15突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:33是eAxmi205#16突变蛋白(C439S)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34是编码SEQ ID NO:33的eAxmi205#16突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:35是eAxmi205#17突变蛋白(C439L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是编码SEQ ID NO:35的eAxmi205#17突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:37是eAxmi205#18突变蛋白(C445S)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38是编码SEQ ID NO:37的eAxmi205#18突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:39是eAxmi205#19突变蛋白(R454F)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40是编码SEQ ID NO:39的eAxmi205#19突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:41是eAxmi205#20突变蛋白(R464L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42是编码SEQ ID NO:41的eAxmi205#20突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:43是eAxmi205#21突变蛋白(C482S)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44是编码SEQ ID NO:43的eAxmi205#21突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:45是eAxmi205#22突变蛋白(C482L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46是编码SEQ ID NO:45的eAxmi205#22突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:47是eAxmi205#23突变蛋白(C507S)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48是编码SEQ ID NO:47的eAxmi205#23突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:49是eAxmi205#24突变蛋白(C406S+C439S+C445S+C482S+C507S)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50是编码SEQ ID NO:49的eAxmi205#24突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:51是eAxmi205#25突变蛋白(F378L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:52是编码SEQ ID NO:51的eAxmi205#25突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:53是eAxmi205#26突变蛋白(S495L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:54是编码SEQ ID NO:53的eAxmi205#26突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:55是eAxmi205#27突变蛋白(G496L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:56是编码SEQ ID NO:55的eAxmi205#27突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:57是eAxmi205#28突变蛋白(M422S+M423L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:58是编码SEQ ID NO:57的eAxmi205#28突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:59是eAxmi205#29突变蛋白(V467S+S468L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:60是编码SEQ ID NO:59的eAxmi205#29突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:61是eAxmi205#30突变蛋白(V467S+S468L+W470G)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:62是编码SEQ ID NO:61的eAxmi205#30突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:63是eAxmi205#31突变蛋白(396-Leu-397)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:64是编码SEQ ID NO:63的eAxmi205#31突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:65是eAxmi205#32突变蛋白(330-Leu-331)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:66是编码SEQ ID NO:65的eAxmi205#32突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:67是eAxmi205#33突变蛋白(456-Leu-457)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:68是编码SEQ ID NO:67的eAxmi205#33突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:69是eAxmi205#34突变蛋白(475-Leu-476)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:70是编码SEQ ID NO:69的eAxmi205#34突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:71是eAxmi205#35突变蛋白(367-Leu-368)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:72是编码SEQ ID NO:71的eAxmi205#35突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:73是eAxmi205#36突变蛋白(496-Leu-497)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:74是编码SEQ ID NO:73的eAxmi205#36突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:75是编码SEQ ID NO:47的eAxmi205#23突变蛋白的玉蜀黍优化核苷酸序列。
SEQ ID NO:76是编码SEQ ID NO:57的eAxmi205#28突变蛋白的玉蜀黍优化核苷酸序列。
SEQ ID NO:77是编码SEQ ID NO:69的eAxmi205#34突变蛋白的玉蜀黍优化核苷酸序列。
SEQ ID NO:78是编码SEQ ID NO:79的eAxmi205#5D突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:79是eAxmi205#5D突变蛋白(K402D)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:80是编码SEQ ID NO:81的eAxmi205#21F突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:81是eAxmi205#21F突变蛋白(C482F)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:82是编码SEQ ID NO:83的eAxmi205#21D突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:83是eAxmi205#21D突变蛋白(C482D)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:84是编码SEQ ID NO:85的eAxmi205#23L突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:85是eAxmi205#23L突变蛋白(C507L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:86是编码SEQ ID NO:87的eAxmi205#23A突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:87是eAxmi205#23A突变蛋白(C507A)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:88是编码SEQ ID NO:89的eAxmi205#23F突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:89是eAxmi205#23F突变蛋白(C507F)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:90是编码SEQ ID NO:91的eAxmi205#23D突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:91是eAxmi205#23D突变蛋白(C507D)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:92是编码SEQ ID NO:93的eAxmi205#23R突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:93是eAxmi205#23R突变蛋白(C507R)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:94是编码SEQ ID NO:95的eAxmi205#28TF突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:95是eAxmi205#28TF突变蛋白(M422T+M423F)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:96是编码SEQ ID NO:97的eAxmi205#28DE突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:97是eAxmi205#28DE突变蛋白(M422D+M423E)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:98是编码SEQ ID NO:99的eAxmi205#28KR突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:99是eAxmi205#28KR突变蛋白(M422K+M423R)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:100是编码SEQ ID NO:101的eAxmi205#28SE突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:101是eAxmi205#28SE突变蛋白(M422S+M423E)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:102是编码SEQ ID NO:103的eAxmi205#28KF突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:103是eAxmi205#28KF突变蛋白(M422K+M423F)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:104是编码SEQ ID NO:105的eAxmi205#34F突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:105是eAxmi205#34F突变蛋白(475-Phe-476)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:106是编码SEQ ID NO:107的eAxmi205#34D突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:107是eAxmi205#34D突变蛋白(475-Asp-476)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:108是编码SEQ ID NO:109的eAxmi205#34R突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:109是eAxmi205#34R突变蛋白(475-Arg-476)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:110是编码SEQ ID NO:111的eAxmi205#36D突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:111是eAxmi205#36D突变蛋白(496-Asp-497)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:112是编码SEQ ID NO:113的eAxmi205#36F突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:113是eAxmi205#36F突变蛋白(496-Phe-497)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:114是编码SEQ ID NO:115的eAxmi205#36R突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:115是eAxmi205#36R突变蛋白(496-Arg-497)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:116是编码SEQ ID NO:117的eAxmi205#37F突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:117是eAxmi205#37F突变蛋白(471-Phe-472)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:118是编码SEQ ID NO:119的eAxmi205#37L突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:119是eAxmi205#37L突变蛋白(471-Leu-472)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:120是编码SEQ ID NO:121的eAxmi205#38F突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:121是eAxmi205#38F突变蛋白(479-Phe-480)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:122是编码SEQ ID NO:123的eAxmi205#38L突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:123是eAxmi205#38L突变蛋白(479-Leu-480)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:124是编码SEQ ID NO:125的eAxmi205#39F突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:125是eAxmi205#39F突变蛋白(489-Phe-490)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:126是编码SEQ ID NO:127的eAxmi205#39L突变蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:127是eAxmi205#39L突变蛋白(489-Leu-490)的氨基酸序列。
具体实施方式
本说明不旨在是可以实施本发明的所有不同方式，或可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中，并且关于一个特定实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略在此陈述的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本披露内容，在此建议的不同实施例的众多变化以及附加对于本领域技术人员是显而易见的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些特定实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文的发明的说明中使用的术语是仅出于描述特定实施例的目的，且并不旨在限制本发明。
本文引用的所有的公开、专利申请、专利以及其他参考文件对于引用中提及的有关句子和/或段落的传授内容通过引用以其全文并入本文。
在此提供的核苷酸序列以5’至3’方向从左至右表示，并且使用代表核苷酸碱基的标准代码表示，如37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中所述，例如：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。
氨基酸同样是使用WIPO标准ST.25来指示，例如：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；1)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、以及缬氨酸(Val；V)。
除非上下文另外指示，明确地预期的是本文所述的本发明的不同特征能以任何组合使用。此外，本发明还考虑到在本发明的一些实施例中，本文陈述的任何特征或特征的组合可以被排除或省略。举例说明，如果本说明书陈述组合物包含组分A、B和C，明确地预期A、B或C的任何一种或其组合可单一地或以任何组合被省略和放弃。
定义.
如在本发明的说明书和所附的权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述(the)”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指示。
如在此使用的，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(“或”)解释时组合的缺少。
如在此使用的，术语“约”当是指一个可测量的值如剂量或时间段等时意在涵盖±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％、或甚至±0.1％的指定量的变化。如在此使用的，短语如“在约X和Y之间”意指“在约X和约Y之间”，并且短语如“从约X至Y”意指“从约X至约Y”。
除非上下文另有说明，如本文所使用的，例如“在约X和Y之间”、“在约X和约Y之间”、“从X至Y”和“从约X至约Y”(以及类似短语)的短语应被解释为包括X和Y。
本发明的杀昆虫蛋白的“活性”意指杀昆虫蛋白作为口服活性的昆虫控制剂发挥作用，具有毒性作用，例如通过抑制昆虫有害生物存活、生长和/或繁殖(例如导致发病率和/或死亡率)的能力，和/或能够干扰和/或阻止昆虫摄食，这可能引起或者可能不引起昆虫的死亡。因此，当本发明的杀昆虫蛋白被递送至昆虫时，这种结果典型地是所述昆虫的发病和/或死亡，和/或所述昆虫减少或停止摄食使所述杀昆虫蛋白可供昆虫利用的来源。
“编码序列”是转录成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)的核酸序列。在实施例中，所述RNA随后被翻译以产生蛋白质。
如在此使用的，“密码子优化的”核苷酸序列意指重组的、转基因的、或合成的多核苷酸的核苷酸序列，其中这些密码子被选择以反映宿主细胞或生物可以具有的特定的密码子偏好性。这典型地是以这样一种方式来完成，所述方式是为了保持由密码子优化的核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列。在某些实施例中，针对所述构建体有待在其中进行表达的细胞(例如，动物、植物、真菌或细菌细胞)对核苷酸序列进行密码子优化。例如，有待在植物细胞中表达的构建体可以使其全部或部分序列进行密码子优化用于在植物中表达。参见例如，美国专利号6,121,014。在实施例中，本发明的多核苷酸被密码子优化用于在植物细胞(例如，双子叶植物细胞或单子叶植物细胞)或细菌细胞中表达。
“控制”昆虫有害生物意指通过毒性作用抑制昆虫有害生物存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力，和/或限制由昆虫有害生物引起的昆虫相关的损害或作物植物损失，和/或保护在昆虫有害生物存在的条件下生长时由有害生物引起的作物的产量潜力。“控制”昆虫有害生物可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管在本发明的实施例中，“控制”昆虫意指杀死昆虫。
术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”当用于本说明书中时指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、或组分的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、和/或其组的存在或添加。
如在此使用的，过渡短语“基本上由...组成”(以及语法变体)意指，权利要求书的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由...组成”并不旨在被解释为等同于“包含(comprising)”。
在本发明的上下文中，“对应于(corresponding to)”或“对应于(correspondsto)”意指当经修饰的或同系物蛋白的氨基酸序列与彼此比对时，“对应于”在所述经修饰的或同系物蛋白中某些枚举的位置的氨基酸是与参考蛋白中的这些位置比对的那些，但在相对于本发明的特定参考氨基酸序列而言的相同精确的数字位置中是不必要的。例如，如果SEQ ID NO:1(天然Axmi205)是参考序列并与SEQ ID NO:73(Axmi205-36突变体)比对，那么SEQ ID NO:73的氨基酸残基498至537的序列(紧随在突变体Axmi205-36中的亮氨酸插入之后)“对应于”SEQ ID NO:1(天然Axmi205)的氨基酸残基497至536。
如在此使用的，术语“Cry蛋白”意指苏云金芽孢杆菌晶体δ-内毒素类型的杀昆虫蛋白。术语“Cry蛋白”可以指原毒素形式或其任何杀昆虫活性片段或毒素，所述毒素包括部分加工的和成熟的毒素形式(例如，没有N末端肽基片段和/或C末端原毒素尾部)。
如在此使用的，“递送(deliver)”或“递送(delivering)”(以及语法变体)组合物或杀昆虫蛋白意指所述组合物或杀昆虫蛋白与昆虫接触，这促进所述组合物或杀昆虫蛋白的经口摄取，产生对昆虫的毒性作用和控制。可以按照许多公认的方式，包括但不限于转基因植物表达、一种或多种配制的蛋白质组合物、一种或多种可喷雾的蛋白质组合物、诱饵基质、或任何其他本领域公认的蛋白质递送系统来递送所述组合物或杀昆虫蛋白。
术语“结构域”是指沿着进化相关蛋白的序列的比对在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然其他位置上的氨基酸可在同系物之间有所不同，但是在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性和/或功能中很可能是重要的氨基酸。通过其在蛋白质同系物家族的经比对序列中的高度保守性进行鉴别，其可用作鉴别物(identifier)，用来确定所讨论的任何多肽是否属于先前鉴别的多肽组。
“控昆虫有效量”意指杀昆虫蛋白的浓度，其通过毒性作用抑制昆虫存活、生长、摄食和/或繁殖的能力，和/或限制昆虫相关的损害或作物植物损失。“控昆虫有效量”可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管在实施例中，它指示杀死昆虫。
如在此使用的“表达盒”意指能够在适当的宿主细胞中指导至少一种目的多核苷酸(如编码本发明的杀昆虫蛋白的多核苷酸)的表达的核酸分子，所述核酸分子包含可操作地连接至目的多核苷酸(其可操作地连接至终止信号)的启动子。“表达盒”还典型地包含另外的多核苷酸以促进目的多核苷酸的正确翻译。所述表达盒还可以包含与目的多核苷酸的表达无关的但是由于用于从表达载体去除表达盒的方便限制位点而存在的其他多核苷酸。在实施例中，表达盒中的至少一种组分相对于至少一种其他组分(例如，与目的多核苷酸可操作相关联的异源启动子)可以是异源的(即外来的)。该表达盒还可以是天然存在的但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的表达盒。然而，典型地，所述表达盒相对于宿主是异源的，即所述表达盒(或甚至目的多核苷酸)不是天然存在于宿主细胞中的，并且已经通过转化方法或育种方法引入到所述宿主细胞或其祖先细胞中。该表达盒中的一个或多个目的多核苷酸的表达通常是在启动子的控制下。在多细胞生物(如植物)的情况下，启动子还可能对于特定组织、或器官、或者发育阶段是特异性的或优先的(如在此更详细描述的)。当被转化进植物中时，表达盒或其片段也可被称为“插入的多核苷酸”或者“插入多核苷酸”。
“基因”在此定义为包含一个或多个多核苷酸的遗传单位，该遗传单位占据染色体或质粒上特定位置并且含有用于生物中的特定特征或性状的遗传指令。
如本文所用，“肠蛋白酶”或“消化蛋白酶”是指天然发现于动物(例如，昆虫或哺乳动物，例如人)的消化道中的蛋白酶。在实施例中，“肠蛋白酶”或“消化蛋白酶”来自哺乳动物(例如，人)。所述蛋白酶通常参与被摄取的蛋白质的消化。肠蛋白质酶的实例包括胰蛋白酶，其典型地切割赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基的C末端侧上的肽；以及胰凝乳蛋白酶，其典型地切割苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)的C末端侧上的肽。胃蛋白酶通常在两个疏水残基之间切割。
如此处使用的，术语"异源的"意指外来的、外源的、非天然的和/或非天然发生的。在实施例中，“异源的”多核苷酸或多肽是不与将所述多核苷酸或多肽引入其中的宿主细胞天然相关联的多核苷酸或多肽，包括天然存在的核苷酸序列或多肽的非天然存在的多拷贝。在实施例中，核苷酸序列对于与其可操作相关联的另一序列是异源的，例如，启动子可以对于可操作相关联的编码序列是异源的(即外来的)。
如此处使用的“同源的”意指天然的。例如，同源的核苷酸序列或氨基酸序列是与将它引入其中的宿主细胞天然相关联的核苷酸序列或氨基酸序列，同源的启动子序列是与编码序列天然相关联的启动子序列等。
如本文所用，术语“增加(increase、increasing、increased)”、“增强(enhance、enhanced、enhancing和enhancement)”(及其语法变体)以及类似术语描述指定参数的升高和/或改进。因此，在实施例中，术语“增加”(increase、increasing、increased)，“增强”(enhance、enhanced、enhancing和enhancement)(以及其语法变体)和类似术语可以指示如与合适的对照相比，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的升高。
如本文所用的涉及消化蛋白酶对本发明的经修饰的Axmi205蛋白的消化(例如切割)的术语“增加”(increase、increasing、increased)，“增强”(enhance、enhanced、enhancing和enhancement)(以及其语法变体)和类似术语指经修饰的Axmi205毒素的消化速度和/或消化程度的升高或改善。当在相同条件下进行测试时，消化的增加可以参考使用合适的对照所观察到的消化水平(例如，SEQ ID NO:1的Axmi205蛋白和/或除了缺少本发明的修饰外与本发明经修饰的Axmi205蛋白相同的Axmi205毒素)。例如，如实例5中所述，使用胃蛋白酶的消化可以在以下条件进行：约37℃和约pH 1.2，任选地具有约10单位(U)胃蛋白酶/微克蛋白质的酶浓度。因此，术语“增加”(increase、increasing、increased)，“增强”(enhance、enhanced、enhancing和enhancement)(以及其语法变体)指示与合适的对照相比，经修饰的Axmi205毒素的蛋白酶消化升高和/或更快至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、200％、300％、400％、500％或更多，和/或更完全(例如，任选地例如在消化约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟后的特定时间点，更少数量的未消化或部分消化的片段保留)。在实施例中，任选地，在本文界定的条件(例如，约37℃和约pH 1.2，任选地，酶浓度为10单位(U)/μg蛋白质)下，在使用消化蛋白酶(例如，胃蛋白酶)消化约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之后，无本发明的经修饰的Axmi205毒素的可检测片段(例如，免疫反应性片段)保持在约4kDa以上。可以使用任何合适的方法(例如SDS-PAGE)完成检测经修饰的Axmi205毒素的未消化或部分消化片段的方法，并可以使用合适的抗体(例如，直接针对SEQ ID NO:1的Axmi205毒素)检测免疫反应性片段，例如，如工作实例中所述。
如在此使用的，涉及植物有害生物的控制水平的术语“增加(increase、increasing、increased)”、“增强(enhance、enhanced、enhancing和enhancement)”(及其语法变体)和类似术语描述了在控制植物有害生物方面的升高，例如通过使植物与本发明的多肽接触(如例如，通过转基因表达或通过局部应用方法)。这种控制的增加可以参考在本发明多肽不存在的情况下植物有害生物的控制水平(例如，不是转基因表达多肽或不是用多肽局部处理的植物)。因此，在实施例中，术语“增加(increase、increasing、increased)”、“增强(enhance、enhanced、enhancing和enhancement)”(及其语法变体)和类似术语可以指示如与适合的对照(例如，不与本发明多肽接触的植物、植物部分、植物细胞)相比，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的升高。
如在此使用的“杀昆虫”被定义为有毒的生物活性，其能够控制昆虫有害生物，任选地但优选地通过杀死它们来控制。
当核酸序列编码了多肽(该多肽与由参考核酸序列所编码的多肽具有相同的氨基酸序列)时，该核酸序列与参考核酸序列“同类编码”。
在代表性实施例中，本发明的这些核酸分子、多核苷酸或蛋白质是“分离的”。“分离的”核酸分子、多核苷酸或蛋白质等是不再存在于其天然环境中的核酸分子、多核苷酸或蛋白质等。本发明的分离的核酸分子、多核苷酸或蛋白质可以按照纯化的形式存在，或者可以存在于重组宿主中，例如转基因细菌或转基因植物中。在实施例中，分离的核酸分子、核苷酸序列或多肽以纯化形式存在，即与天然存在的生物或病毒的至少一些其他组分(例如，细胞或病毒结构组分或通常发现与所述多核苷酸相关联的其他多肽或核酸)至少部分地分开。在其他实施例中，“分离的”核酸分子、核苷酸序列或多肽可以存在于非天然环境中，如例如重组宿主细胞。因此，例如，相对于核苷酸序列而言，术语“分离的”可以意指将所述核苷酸序列从它天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出。如果将多核苷酸从它天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出并且然后将其插入它并不天然存在于其中的遗传背景、染色体和/或细胞(例如，不同的宿主细胞、不同的调节序列、和/或与自然中发现的不同的基因组位置)中，则所述多核苷酸也是被分离的。因此，这些重组核酸分子、核苷酸序列以及它们所编码的多肽是“分离的”，因为它们通过人工方式从其天然环境中分开而存在并因此不是自然产物，然而，在一些实施例中，它们可以被引入到重组宿主细胞中并存在于所述重组宿主细胞中。在代表性实施例中，分离的核酸分子、分离的核苷酸序列和/或分离的多肽是至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更纯的。
术语“基序”或“共有序列”或“特征(signature)”是指进化相关蛋白的序列中的短保守区。基序常常是结构域的高度保守部分，但是也可只包括结构域的一部分，或位于保守结构域外部(如果基序的所有氨基酸位于所限定结构域的外部)。
“天然”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然存在的或内源性的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因此，例如，“野生型mRNA”是天然存在于生物体中的或对生物体来说是内源性的mRNA。
术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”、“寡核苷酸”以及“多核苷酸”在此可以互换地使用，除非上下文另外指示，并且是指核苷酸的杂聚物。这些术语包括但不限于DNA和RNA分子，包括cDNA、基因组DNA、合成的(例如，化学合成的)DNA和RNA、质粒DNA、mRNA、反义RNA和RNA/DNA杂交体，其中的任一项都可以是线状的或分支的、单链的或双链的、或其组合。当合成地产生dsRNA时，较少见的碱基，如肌苷，5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤和其他也可以用于反义、dsRNA和核酶配对作用。例如，已经显示含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合RNA并且是基因表达的强力反义抑制剂。也可以作出其他修饰，如修饰磷酸二酯主链或RNA的核糖基团中的2'-羟基。在实施例中，“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”、“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指DNA。
如在此使用的“可操作地连接”或“可操作地相关联”意指所指定的元件是彼此功能上相关的，并且还通常是物理相关的。因此，如此处使用的术语“可操作地连接的”或“可操作地关联的”是指在功能上关联的一个单一核酸分子上的核苷酸序列。因此，可操作地连接至第二核苷酸序列的第一核苷酸序列是指当所述第一核苷酸序列被放入与所述第二核苷酸序列的功能关系中时的情况。例如，如果启动子影响核苷酸序列的转录或表达，则所述启动子与所述核苷酸序列可操作地关联。本领域普通技术人员将理解，控制序列(例如启动子)不需要和与其可操作地相关联的核苷酸序列邻接，只要所述控制序列能发挥指导其表达的功能。因此，例如，介入未翻译的、已转录的序列可以存在于启动子与核苷酸序列之间，并且所述启动子仍可以被认为“可操作地连接至”所述核苷酸序列上或与所述核苷酸序列“可操作地相关联”。
如在此使用的“植物”是指处于任何发育阶段的任何植物。
在实践本发明中可采用任何植物(或将植物分组为例如一个属或更高的目分类)，包括被子植物或裸子植物、单子叶植物或双子叶植物。
示例性植物包括但不限于玉米(玉蜀黍(Zea mays))、卡罗拉(canola)(欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.))、苜蓿(紫花苜蓿(Medicagosaliva))、水稻(栽培稻(Oryza sativa)，包括但不限于籼稻和/或粳稻)、油菜(欧洲油菜)、黑麦(rye，Secale cereale)、高粱(两色蜀黍(Sorghum bicolor)、Sorghum vulgare)、向日葵(sunflower，Helianthus annus)、小麦(普通小麦(Triticum aestivum))、大豆(soybean，Glycine max)、烟草(普通烟草(Nicotiana tabacum))、马铃薯(洋芋(Solanumtuberosum))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(番薯(Ipomoea batatas))、木薯(树薯(Manihot esculenta))、咖啡(咖啡属亚种(Cofea spp.))、椰子(可可椰子(Cocos nucifera))、菠萝(凤梨(Ananas comosus))、柑桔树(柑橘属物种(Citrus spp.))、可可(cocoa，Theobroma cacao)、茶(茶树(Camelliasinensis))、香蕉(芭蕉属物种(Musa spp.))、鳄梨(avocado，Persea americana)、无花果(fig，Ficus casica)、番石榴(guava，Psidium guajava)、芒果(杧果(Mangiferaindica))、橄榄(油橄榄(Olea europaea))、番木瓜(木瓜(Carica papaya))、腰果(cashew，Anacardium occidentale)、澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)、扁桃(巴旦杏(Prunus amygdalus))、糖用甜菜(甜菜(Beta vulgaris))、苹果(apple，Malus pumila)、黑莓(悬钩子属(Rubus))、草莓(草莓属(Fragaria))、胡桃(普通胡桃(Juglans regia))、葡萄(酿酒葡萄(Vitis vinifera))、杏(apricot，Prunus armeniaca)、樱桃(李属(Prunus))、桃(碧桃(Prunus persica))、李(欧洲李(Prunus domestica))、梨(西洋梨(Pyruscommunis))、西瓜(watermelon，Citrullus vulgaris)、浮萍(浮萍属(Lemna spp.))、燕麦(oats，Avena sativa)、大麦(barley，Hordium vulgare)、蔬菜、观赏植物、针叶树和草坪草(例如观赏性、娱乐或饲料用)、以及生物质禾草(例如柳枝稷和芒草)。
蔬菜包括但不限于茄属物种(例如西红柿、番茄(Lycopersicon esculentum))、莴苣(例如莴苣(Lactuea sativa))、胡萝卜(Caucus carota)、花椰菜(甘蓝(Brassicaoleracea))、芹菜(旱芹(Apium graveolens))、茄子(eggplant，Solanum melongena)、芦笋(石刁柏(Asparagus officinalis))、秋葵(黄秋葵(Abelmoschus esculentus))、四季豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、青豆(Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrusspp.))，南瓜属(Cucurbita)的成员如古巴瓜(C.hubbard)、冬南瓜(南瓜(C.moschata))、密生西葫芦(zucchini)(西葫芦(C.pepo))、曲颈南瓜(C.crookneck)、C.argyrosperma、C.argyrosperma ssp sororia、C.digitata、C.ecuadorensis、旱地油瓜(C.foetidissima)、C.lundelliana、以及C.martinezii，以及黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(cucumber，Cucumis sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)、以及甜瓜(香瓜(C.melo))。
观赏植物包括但不限于杜鹃花(杜鹃属(Rhododendron spp.))、绣球花(hydrangea，Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(玫瑰属(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属(Tulipa spp.))、水仙花(水仙属(Narcissus spp.))、矮牵牛(petunias，Petunia hybrida)、康乃馨(carnation，Dianthus caryophyllus)、猩猩木(一品红(Euphorbia pulcherima))、以及菊花。
可以用于实践本发明的针叶树包括例如，松树如火炬松(loblolly pine，Pinustaeda)、湿地松(slash pine，Pinus elliotii)、杰克松(西黄松(Pinus ponderosa))、黑松(小干松(Pinus contorta))以及蒙特利松树(辐射松(Pinus radiata))；花旗松(Douglas-fir，Pseudotsuga menziesii)；美国西部铁杉(加拿大铁杉(Tsuga canadensis))；美国西加云杉(白云杉(Picea glauca))；红杉(北美红杉(Sequoia sempervirens))；冷杉如银杉(温哥华冷杉(Abies amabilis))和香脂冷杉(加拿大胶杉(Abies balsamea))；以及雪松，如美国西部侧柏(北美香柏(Thuja plicata))以及阿拉斯加黄杉(Alaska yellow-cedar)(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。
草坪草包括但不限于结缕草、剪股颖、羊茅草、早熟禾、奥古斯丁草、百慕达草、bufallograsses、黑麦草、以及鸭茅。
还包括的是主要充当实验室模式的植物，例如拟南芥。
“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单个细胞或培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(如例如，植物组织、植物器官、或全株植物)的一部分。在实施例中，植物细胞是不繁殖的和/或不能再生整个植物。
“植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
如在此使用的，术语“植物部分”包括但不限于，胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药、和/或植物细胞(包括在植物和/或植物的部分中完整的植物细胞)、植物原生质体、植物组织、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团(plantclumps)等。
如在此使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于：全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
“目的多核苷酸”是指任何多核苷酸，当其转移至生物(例如，植物)中时赋予所述生物所希望的特征，如昆虫抗性、疾病抗性、除草剂耐受性、抗生素抗性、改善的营养价值、工业过程中改善的性能、商业上有价值的酶或代谢物的生产、或者改变的繁殖能力等。
本发明多肽的“部分”或“片段”将理解为意指相对于本发明多肽的参考氨基酸序列而言长度减少的氨基酸序列。根据本发明，在适宜的情况下，这种部分或片段可以包括于它作为组分的较大多肽内(例如，标记的或融合蛋白)。在实施例中，所述“部分”或“片段”基本上保留了杀昆虫活性(例如，全长蛋白活性的至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或甚至100％，或者具有比全长蛋白更高的杀昆虫活性)。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文可以互换地使用。
如在此使用的术语“启动子”是指多核苷酸，典型地在编码多核苷酸的上游(5')，其通过提供对RNA聚合酶和其他转录机制的识别来控制所述编码多核苷酸的表达。
如在此使用的“原生质体”是指分离的植物细胞，没有细胞壁或仅具有部分细胞壁。
如在此使用的，术语“重组”是指核酸分子(例如，DNA或RNA)或蛋白质或生物的如下形式，所述形式通常不会在自然界中发现并且正因为如此通过人类干预来产生。如在此使用的，“重组核酸分子”(和类似术语)是包含多核苷酸组合的核酸分子，这些多核苷酸不会天然地一起存在并且是人类干预的结果，例如，由至少两种彼此异源的多核苷酸的组合构成的核酸分子，或人工合成的并且包含偏离通常存在于自然界中的多核苷酸的多核苷酸的核酸分子，或包含人工掺入宿主细胞的基因组DNA中的转基因和所述宿主细胞基因组的相关侧翼DNA的核酸分子。重组核酸分子的实例是由将转基因插入至植物的基因组DNA中产生的DNA分子，其可以最终导致所述生物中的重组RNA/或蛋白质分子的表达。在实施例中，“重组”蛋白是通常不存在于自然界中或存在于非天然存在的环境中的蛋白质，并且由重组核酸分子表达。如在此使用的，“重组植物”是通常不会在自然界中存在的植物，是人类干预的结果，并且含有重组多核苷酸(例如，掺入其基因组中的转基因或异源核酸分子)。由于此类基因组改变，该重组植物明显不同于相关的野生型植物。
本文所使用的术语“减少(reduce、reduced、reducing、reduction)”、“减小(diminish)”、和“抑制(suppress)”(及其语法变体)和类似术语是指相关参数的减少。在实施例中，术语“减少(reduce、reduced、reducing、reduction)”、“减小(diminish)”、和“抑制(suppress)”(及其语法变体)和类似术语意味着与合适的对照相比减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。
如在此使用的，涉及控制植物有害生物的术语“减少(reduce、reduced、reducing、reduction)”、“减小(diminish)”、和“抑制(suppress)”(及其语法变体)和类似术语是指植物有害生物的存活、生长和/或繁殖的减少，例如通过使植物与本发明的多肽接触(如例如，通过转基因表达或通过局部应用方法)。这种存活、生长和/或繁殖的减少可以参考在本发明多肽不存在的情况下观察到的水平(例如，不是转基因表达多肽或不是用多肽局部处理的植物)。因此，在实施例中，术语“减少(reduce、reduced、reducing、reduction)”、“减小(diminish)”、和“抑制(suppress)”(及其语法变体)和类似术语意指如与不与本发明多肽接触的植物(例如，不是转基因表达多肽或不是用多肽局部处理的植物)相比降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在代表性实施例中，所述减少导致无或基本上无(即不显著量，例如少于约10％、少于约5％或甚至少于约1％)可检测的植物有害生物的存活、生长和/或繁殖。
“调节元件”是指参与控制多核苷酸的表达的核苷酸序列。调节元件的实例包括促进多核苷酸正确翻译的启动子、终止信号和核苷酸序列。
如本文所使用的，“选择性标记(selectable marker)”意指如下核苷酸序列，当该核苷酸序列表达时向表达该标记的植物、植物部分和/或植物细胞赋予不同的表型，并且因此允许此类转化的植物、植物部分和/或植物细胞与不具有该标记的那些区别开来。这样的核苷酸序列可以编码选择性或筛选性标记，这取决于该标记是否赋予可以通过化学手段而被选择的性状，如通过使用选择剂(例如，抗生素、除草剂等)，或者取决于该标记是否仅是人们可以通过观察或测试而鉴别的性状，如通过筛选(例如，R基因座性状)。
如在此使用的，“特异活性”是指具有杀昆虫效果所需的蛋白质的量。因此，当第一蛋白质具有比第二蛋白质更高的特异活性时，意指所述第一蛋白质比第二蛋白质采取更少的量而具有对相同百分比的昆虫的杀昆虫效果。
在两个核酸或两个氨基酸序列的上下文中，短语“基本上相同的”是指当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少约50％核苷酸或氨基酸残基同一性(如使用序列比较算法或通过目测检查所测量的)的两个或更多个序列或子序列。在某些实施例中，基本上相同的序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施例中，相对于蛋白质序列或编码其的核苷酸序列，在序列至少约50个氨基酸残基、100个氨基酸残基、150个氨基酸残基、200个氨基酸残基、250个氨基酸残基、300个氨基酸残基、350个氨基酸残基、400个氨基酸残基、450个氨基酸残基、500个氨基酸残基、525个氨基酸残基、526个氨基酸残基、527个氨基酸残基、528个氨基酸残基、529个氨基酸残基、530个氨基酸残基、531个氨基酸残基、532个氨基酸残基、533个氨基酸残基、534个氨基酸残基、535个氨基酸残基、536个氨基酸残基的区域中存在基本同一性。在另外的实施例中，当这些序列在编码区的整个长度上是相同的时，这些序列是基本上相同的。
“同一性”或“百分比同一性”是指在两种核酸或氨基酸序列之间的同一性的程度。对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中(如有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，该序列比较算法基于所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中(如有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，该序列比较算法基于所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可以按照以下方式进行，例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法的搜索，通过这些算法的计算机化实施(威斯康星州遗传学分析软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group),科学街575号(575ScienceDr.),麦迪逊,威斯康星州)，或通过目测检查(总体上参见，)。
适合于确定序列一致性百分比以及序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于以下文献中：Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990)。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开地获得(在the world wide web atncbi.nlm.nih.gov/)。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字码而鉴定得分高的序列对(HSP)，这些得分高的序列对当与数据库序列中具有相同长度的字码(word)进行比对时匹配或满足一些正值阈值的得分T。T被称为邻近字码得分阈(Altschul等人.,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990))。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现含有它们的较长的HSP。然后，将这些字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当累积的比对得分从它的最大达到值降低了数量X；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积得分趋于零或零以下；或者到达任一序列的末端时，停止这些字码命中在每个方向上的延伸。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如Karlin和Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小概率总和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，若在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中最小概率总和小于约0.1、更优选地小于约0.01、并且最优选地小于约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参考序列相似的。
用于进行序列比对的另一种被广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson,et al.Nuc.Acids Res.,22:4673-4680,1994[Thompson等人，核酸研究，22:4673-4680，1994])。将匹配的碱基或氨基酸的数目除以碱基或氨基酸的总数目并乘以100，以获得百分比同一性。例如，如果两个580个碱基对序列具有145个匹配的碱基，则它们会是25％相同的。如果两个进行比较的序列具有不同的长度，则将匹配的数目除以这两个长度中较短的一个。例如，如果在200个氨基酸的蛋白质与400个氨基酸的蛋白质之间存在100个匹配的氨基酸，则相对于较短的序列而言这两个蛋白质是50％相同的。如果所述较短的序列在长度上小于150个碱基或50个氨基酸，则将匹配的数目除以150(对于核酸碱基而言)或50(对于氨基酸而言)并乘以100，以获得百分比同一性。
当两个核苷酸序列在严格条件下彼此杂交时，这两个核苷酸序列也可以被认为是基本上相同的。在代表性实施例中，被认为基本上相同的两个核苷酸序列在高严格条件下彼此杂交。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指核酸与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于非靶序列)的条件，并且任选地可以基本上排除与非靶序列的结合。严格条件是序列依赖性的并且在不同的情形下将会改变。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格度，可以鉴定可以与参考核苷酸序列高达100％互补的靶序列。可替代地，可以使用中等或甚至低严格条件来允许序列中的一些不匹配，从而检测到较低程度的序列相似性。例如，本领域技术人员将理解，为了起到引物或探针的作用，核酸序列仅需要与靶序列充分互补以基本上与其结合，从而在采用的条件下形成稳定的双链结构。因此，可以在高、中等或甚至低严格条件下使用引物或探针。类似地，低或中等严格条件可以有利于检测同源物、直向同源物和/或旁系同源序列，所述同源物、直向同源物和/或旁系同源序列具有与在高严格条件下鉴定的较低的序列同一性程度。
如在此使用的，术语“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”(和类似术语)是指多核苷酸在容许性盐条件和温度条件下通过碱基配对发生天然结合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两单链分子之间的互补性可以是部分的(partial)，其中这些核苷酸中仅一些结合，或者当这些单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对于分子之间杂交的效率和强度具有显著影响。如在此使用的，术语“基本上互补的”(和类似术语)意指两个核酸序列是至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多互补的。可替代地，术语“基本上互补的”(和类似术语)可以意指两个核酸序列在高严格条件(如在此描述的)下可以杂交在一起。
如在此使用的，“特异性”或“选择性”杂交(和类似术语)是指分子在严格条件下与特定的核酸靶序列结合、双链化或杂交，这是在所述序列存在于复合混合物(例如，总细胞的DNA或RNA)中时进行的，以致于基本上排除非靶核酸，或甚至与非靶序列没有可检测的结合、双链化或杂交。特异性或选择性杂交序列典型地是至少约40％互补的并且任选地是基本上互补的或甚至完全互补的(即，100％相同的)。
对于DNA-DNA杂交体，可从Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.[分析生物化学],138:267-84(1984)的方程粗略估计Tm：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟苷以及胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm是50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度及pH下)。对于每1％错配，Tm降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以便杂交至所希望的程度的同一性的序列。例如，如果寻找具有>90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。一般来说，将严格条件选择为比特定序列及其补体在限定的离子强度及pH下的热熔点(Tm)低约5℃。然而，高严格条件可利用在热熔点(Tm)或者低于热熔点(Tm)1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可利用低于热熔点(Tm)6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可利用低于热熔点(Tm)11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的杂交和/或洗涤。如果所希望的不匹配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则任选地可以增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。有关核酸杂交的详尽指南见于以下文献：Tijssen，生物化学与分子生物学实验室技术－与核酸探针杂交(Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes)，第I部分，第2章，“杂交原理概述和核酸探针测定策略(Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid probe assays)”Elsevier,New York(1993)；现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)，第2章，Ausubel等人编著，Greene Publishing与Wiley-Interscience，纽约(1995)；以及Green和Sambrook,In:Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆，实验手册],第4版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(2012)。
典型地，严格条件是这些：其中盐浓度小于约1.5M Na离子、典型地在约pH 7.0至pH 8.3下大约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度为至少约30℃而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃。通过添加不稳定剂如甲酰胺或Denhardt's(在500ml水中的5g聚蔗糖(Ficoll)、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)也可以达到严格条件。示例性的低严格条件包括用30％至35％的甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液中在37℃下杂交，并且在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M枸橼酸钠)中在50℃至55℃下洗涤。示例性的中等严格条件包括在40％至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交，并且在0.5X至1X SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交，并且在0.1X SSC在60℃至65℃下洗涤。高严格条件的另外的非限制性实例包括在4X SSC、5XDenhardt's、0.1mg/ml煮沸鲑鱼精子DNA下杂交，并在25mM磷酸Na在65℃下洗涤，并在0.1XSSC、0.1％SDS在65℃下洗涤。另一个高严格杂交条件的阐述包括在7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃下杂交，在2X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，可替代地在1X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，可替代地在0.5X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，或可替代地在0.1XSSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，或甚至在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤。本领域技术人员将会理解特异性典型地是杂交后的洗涤的作用，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。
如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质是基本上相同的，则它们仍然是基本上相同的(例如，由于遗传密码的简并性)。
两个核酸序列或蛋白质基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的蛋白质与由第二核酸编码的蛋白质进行免疫性交联反应。因此，蛋白质典型地是与第二蛋白质基本上相同的，例如其中这两种蛋白质仅在保守性取代上不同。
如在此使用的，如果经修饰的多肽或片段(等)“基本上保留”杀昆虫活性，意思是所述经修饰的多肽或片段保留参考蛋白针对一种或多种靶昆虫的至少约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或甚至100％的杀昆虫活性，或者具有甚至更高的杀昆虫活性。
“合成的”是指如下核苷酸序列，所述核苷酸序列包含在天然序列中不存在的碱基或者一个或多个结构特征。例如，编码本发明的蛋白的人工序列(其更类似于双子叶植物或单子叶植物基因的G+C含量和正常密码子分布)被表述为合成的。
如在此使用的，对昆虫有害生物是“有毒的”蛋白是一种口服活性的昆虫控制剂，所述昆虫控制剂可杀死昆虫有害生物，导致昆虫有害生物生长和/或繁殖的减少和/或能够破坏或阻止昆虫摄食，其可能引起或者可能不引起昆虫的死亡。当本发明的蛋白质被递送至昆虫或昆虫与所述蛋白质进行接触时，结果典型地是所述昆虫的死亡、所述昆虫的生长和/或繁殖减慢、和/或所述昆虫减少或停止以使有毒的蛋白质可供昆虫利用的来源为食。
术语“毒素片段”和“毒素部分”在此可以互换地使用，是指本发明的较长(例如，全长)杀昆虫蛋白的片段或部分，其中所述“毒素片段”或“毒素部分”保留杀昆虫活性。在实施例中，本发明的杀昆虫蛋白的“毒素片段”或“毒素部分”在N末端和/或C末端被截短。在实施例中，“毒素片段”或“毒素部分”在N末端被截短，并且任选地包含至少约405、410、425、450、475、500、510、520、525、530、531、532、533、534、535、536、537或538个本文具体描述的杀昆虫蛋白的连续氨基酸或与其基本相同的氨基酸序列。因此，在实施例中，杀昆虫蛋白的“毒素片段”或“毒素部分”在N末端被截短，例如，一个氨基酸或多于一个氨基酸的N末端截短，例如多达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个氨基酸的N末端截短，例如，SEQ ID NO:1的Axmi205毒素的N末端截短结合根据本发明的一个或多个修饰。在实施例中，杀昆虫蛋白的“毒素片段”或“毒素部分”在C末端被截短，例如，一个氨基酸或多于一个氨基酸的C末端截短，例如多达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个氨基酸的C末端截短。在实施例中，“毒素片段”或“毒素部分”包含在SEQ ID NO:1的天然Axmi205蛋白的N末端区域(在SEQ ID NO:1的约氨基酸101至300所定义的区域内，参见GenBank登录号AML23188.1)或其他Axmi205毒素的相应区域中发现的MAC/PF(膜攻击复合物/穿孔素蛋白超家族)结构域，和/或Axmi205毒素的C末端半部分(例如，在SEQ ID NO:1的约氨基酸300至526内或其他Axmi205毒素的相应区域)中的β-Prism结构域。
“转化”是用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物的方法。在特定的实施例中，“转化”意指DNA分子稳定地整合到目的生物(例如，植物细胞)的基因组中。
在此使用的术语“转化的”和“转基因的”是指引入了异源核酸分子的宿主生物，如细菌或植物。核酸分子可以稳定地整合进入宿主基因组，或者，核酸分子也可以作为染色体外分于存在。这种染色体外分子能够自主复制。“转化的”或“转基因的”细胞、组织或植物应当理解为不仅涵盖转化过程的终产物，而且涵盖包含所述异源核酸分子的其子代。“非转化的”或“非转基因的”宿主是指不含所述异源核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。
术语“载体”是指用于将一种核酸(或多种核酸)转移、递送或引入到细胞中的组合物。载体包含核酸分子，所述核酸分子包含有待被转移、递送或引入的一个或多个核苷酸序列。
杀有害生物蛋白。
本发明提供包含经修饰的Axmi205毒素的新颖杀有害生物(例如，杀昆虫)蛋白，所述经修饰的Axmi205毒素与不包含所述修饰的Axmi205毒素(例如，SEQ ID NO:1的Axmi205蛋白和/或除了缺少本发明的修饰外与本发明的经修饰的Axmi205蛋白相同的Axmi205毒素)相比，具有增强的被消化蛋白酶(例如，胃蛋白酶)的消化(例如，切割)。在本发明范围内的修饰包括但不限于缺失、取代和/或插入。
SEQ ID NO:1的天然Axmi205毒素先前已描述于US 8,575,425 B2和Sampson等人(Discovery of a novel insecticidal protein from Chromobacterium piscinae withactivity against Western Corn Rootworm,Diabrotica virgifera virgifera[来自Chromobacterium piscinae的具有抗西部玉米根虫玉米根萤叶甲指名亚种活性的新型杀虫蛋白的发现],J.Invertebrate Pathology[无脊椎动物病理学杂志]142:34-43(2016))。另参见GenBank登录号AML23188.1。US 8,575,425 B2还描述了许多保留针对WCRW的活性的Axmi205点突变和截短(参见，US 8,575,425 B2的实例7和8)。这样的突变体包括本申请的SEQ ID NO:1的Axmi205蛋白序列(US 8,575,425B2的SEQ ID NO:2)中以下突变：S307A、D315A、V317A、S349A、G351A、K353A、V355A、D395A、G399A、W407A、G419A、P355A、P435A、S443A、K465A、V467A、F483A、P487A、S495A、D497A、E499A、K509A和I513A。还披露了Axmi205蛋白，其从本申请的SEQ ID NO:1的Axmi205的C末端具有10或20个氨基酸的C末端截短(US8,575,425 B2的SEQ ID NO:2)。
如本文所用，要根据本发明修饰的“Axmi205毒素”(例如，以增强被消化蛋白酶(例如胃蛋白酶)的消化)包含SEQ ID NO:1氨基酸序列或与SEQ ID NO:1基本相同的序列、基本上由其组成、或由其组成。通常，要根据本发明修饰的Axmi205毒素具有哺乳动物消化蛋白酶(例如胃蛋白酶)的不期望的消化谱，例如，任选地在大约37℃和大约pH 1.2、并且作为另一选择使用10U/微克蛋白质的蛋白酶浓度的条件下，在使用消化蛋白酶消化约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多分钟后，约4kDa以上的未消化或部分消化的Axmi205毒素片段仍然存在。因此，本文披露的修饰可以并入Axmi205毒素中，以增强/改善被消化蛋白酶(例如蛋白酶)的消化。
SEQ ID NO:1的Axmi205毒素是从Chromobacterium piscinae分离的。在实施例中，如本文所用，要根据本发明修饰的“Axmi205毒素”来自色杆菌(Chromobacterium)属，任选地为C.piscinae(直接从生物体中分离，或部分或完全合成以复制天然存在的色杆菌(任选地为C.piscinae)蛋白)。美国专利公开US2014/0223599(Athenix公司)描述了Axmi279(该专利公开的SEQ ID NO:2)，其也从C.piscina分离而来，与Axmi205具有97.9％的氨基酸同一性，并且在控制WCRW方面具有活性。US2014/0223599还描述了两个Axmi279变体，从中截短了C末端氨基酸和N末端18或20个氨基酸(分别为US2014/0223599的SEQ ID NO:3和SEQID NO:4)。US2014/0223599中描述的Axmi279蛋白及其变体也被本发明的Axmi205毒素所涵盖。
WO2013/016617(Athenix公司)也描述了本申请SEQ ID NO:1的Axmi205蛋白的许多变体：具有针对WCRW的活性的S468L、V467L、V467T、R464N、Q517R和E86T。此外，US 2014/0274885 A1(先锋良种公司)也描述了许多具有针对WCRW的杀昆虫活性的Axmi205变体。
因此，在实施例中，如本文所用，要根据本发明修饰的“Axmi205毒素”包含变体Axmi205蛋白、基本上由其组成或由其组成，所述Axmi205蛋白例如，描述于US 8,575,425B2(Athenix公司)、WO2013/016617(Athenix公司)中或US 2014/0274885 A1(先锋良种公司(Pioneer Hi-Bred))中的Axmi205毒素。
因此，如本文所用的术语“Axmi205毒素”涵盖披露于US8,575,425B2,WO2013/016617和/或US 2014/0274885A1中的SEQ ID NO:1以及Axmi205变体，和/或披露于US2014/0223599中的Axmi279及其变体。
在实施例中，与SEQ ID NO:1的Axmi205毒素或基本相同的蛋白相比，经修饰的Axmi205毒素包含一个或多个氨基酸的缺失(包括截短)、取代和/或插入，其中与不包含缺失、取代和/或插入的Axmi205毒素(例如，SEQ ID NO:1和/或除了缺少本发明的修饰外与本发明的经修饰的Axmi205蛋白相同的Axmi205毒素)相比，所述缺失、取代和/或插入导致胃蛋白酶和/或其他哺乳动物消化蛋白酶(例如，人消化蛋白酶)对经修饰的Axmi205毒素的消化增强。
在实施例中，本发明的经修饰的Axmi205毒素基本上保留了亲本分子(例如，SEQID NO:1)对一种或多种靶有害生物(例如，鞘翅目有害生物例如WCRW)的杀昆虫活性。
在实施例中，本发明的杀昆虫蛋白可以提供针对一种或多种靶标昆虫有害生物的新的作用方式。例如，本发明的杀昆虫蛋白可对通常对另一种昆虫控制剂(例如，杀昆虫蛋白或杀昆虫dsRNA)的杀昆虫活性具有抗性的昆虫有害生物或群体具有杀昆虫活性。为了说明，本发明的杀昆虫蛋白可以对玉米根虫(例如，WCRW)有害生物或群体具有杀昆虫活性，所述玉米根虫(例如，WCRW)有害生物或群体对以下有抗性：mCry3A蛋白(例如，在玉米事件MIR604中)、eCry3.1Ab蛋白(例如，在玉米事件5307中)、Cry3Bb1蛋白(例如，在玉米事件MON88017中)、Cry34/35Ab1二元蛋白(例如，在玉米事件DAS-59122中)和/或RNAi性状(例如DvSnf7 dsRNA(例如，在玉米事件MON87411中))。
在实施例中，当在相同条件(例如酶浓度、蛋白质浓度、pH、温度和/或时间)下测试时，与合适的对照(例如，SEQ ID NO:1和/或不含本发明的修饰的亲本分子)相比，本发明的经修饰的Axmi205蛋白具有增强的被哺乳动物消化蛋白酶(例如，胃蛋白酶)的消化。评估胃蛋白酶和其他消化蛋白酶的蛋白质消化的方法是本领域众所周知的，例如，实例3和5中所述的模拟胃液(SGF)测定。例如，使用胃蛋白酶的消化可以在以下条件进行：约37℃和约pH1.2，任选地具有约10单位(U)胃蛋白酶/微克蛋白质的酶浓度。
在代表性实施例中，任选地在前述段落中所述的条件下，在使用消化蛋白酶(例如，胃蛋白酶)消化约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之后，无本发明的经修饰的Axmi205毒素的可检测片段(例如，免疫反应性片段)保持在约4kDa以上。检测经修饰的Axmi205蛋白的未消化或部分消化片段的方法是本领域已知的(例如，SDS-PAGE)，并可以使用合适的抗体(例如，直接针对SEQ ID NO:1的Axmi205毒素)检测免疫反应性片段，例如，如工作实例中所述。
在实施例中，经修饰的Axmi205毒素包含发现于SEQ ID NO:1的天然Axmi205蛋白的N末端区域(在SEQ ID NO:1的氨基酸101至300所定义的区域内，参见GenBank:AML23188.1)中的MAC/PF(膜攻击复合物/穿孔素蛋白超家族)结构域和/或Axmi205毒素的C末端半部分(例如，在SEQ ID NO:1的约氨基酸300至526内或其他Axmi205毒素的相应区域)中的β-Prism结构域。
可以在亲本Axmi205毒素的任何一个或多个部分中进行本发明的一个或多个修饰，其导致被哺乳动物消化蛋白酶(例如，胃蛋白酶)的消化增强，任选地基本上保留亲本Axmi205毒素的杀昆虫活性。在实施例中，通过SEQ ID NO:1的Axmi205毒素的从约氨基酸400或402至约氨基酸497、500或536的部分、或另一Axmi205毒素的相应部分中的一个或多个氨基酸的缺失、取代和/或插入对Axmi205毒素进行修饰。在实施例中，一个或多个氨基酸的缺失、取代和/或插入位于SEQ ID NO:1的Axmi205毒素的从约氨基酸402至约氨基酸497的部分、或另一Axmi205毒素的相应部分中。
在代表性的实施例中，修饰可包括任何天然存在和/或非天然存在的氨基酸中的一个或多个的取代和/或插入。在实施例中，修饰包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸中的一个或多个的插入和/或取代。在实施例中，插入和/或取代不是丙氨酸。
在实施例中，通过以下的取代和/或插入来修饰Axmi205毒素：(a)具有脂肪族疏水侧链的一个或多个氨基酸(例如丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和/或缬氨酸；在实施例中，氨基酸不是丙氨酸)；(b)具有芳香族疏水侧链的一个或多个氨基酸(例如，苯丙氨酸、色氨酸和/或酪氨酸)；(c)具有极性中性侧链的一个或多个氨基酸(例如，天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和/或苏氨酸)；(d)具有酸性侧链的一个或多个氨基酸(例如，天冬氨酸和/或谷氨酸)；具有碱性侧链的一个或多个氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸和/或赖氨酸)；(e)一个或多个甘氨酸残基；(f)一个或多个脯氨酸残基；或(g)(a)至(f)的任何组合。
在代表性实施例中，一个或多个氨基酸的缺失、取代和/或插入为哺乳动物蛋白酶创造出不存在于亲本Axmi205毒素中的新切割位点，例如，并入SEQ ID NO:1的Axmi205毒素的非天然存在的胃蛋白酶切割位点。为了说明，如本领域中已知的，胃蛋白酶优先在两个疏水性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和/或酪氨酸)之间切割。因此，在实施例中，修饰包含与现有的疏水氨基酸相邻的疏水氨基酸(具有脂肪族和/或芳香族侧链)的插入或取代，以产生新的胃蛋白酶切割位点。在实施例中，修饰包括两个氨基酸的插入或取代以产生两个相邻的疏水氨基酸。在实施例中，一个氨基酸被取代并且一个氨基酸被插入以产生两个相邻的疏水氨基酸。在代表性的实施例中，具有脂肪族疏水侧链和/或芳香族疏水侧链的一个或多个氨基酸被取代和/或插入。在其他代表性的实施例中，一个或多个(例如，2、3、4或5)氨基酸的缺失使两个疏水氨基酸进入相邻位置，从而产生蛋白酶切割位点。
不受本发明的任何理论的束缚，在实施例中，对Axmi205毒素的修饰打开了蛋白质的二级和/或三级结构，从而提供更好地接近消化蛋白酶。在实施例中，对Axmi205毒素的修饰包含一个或多个半胱氨酸残基(例如，1、2、3、4、或5个半胱氨酸残基)的缺失，或其被另一氨基酸残基取代，以任选地减少潜在的二硫键形成(例如，通过减少蛋白质中半胱氨酸残基的总数)。
在实施例中，经修饰的Axmi205毒素包含：(a)SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸K402处或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸残基处的氨基酸取代；(b)SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸K402和Y404处或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸和酪氨酸残基处的氨基酸取代；(c)SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸C482处或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基处的氨基酸取代；(d)SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸C507处或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基处的氨基酸取代；(e)SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸M422和M423处或另一Axmi205毒素中的相应甲硫氨酸残基处的氨基酸取代；(f)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A475和G476之间或另一Axmi205毒素中的相应的丙氨酸和甘氨酸残基之间的氨基酸插入；(g)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸G496和D497之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的氨基酸插入；(h)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Q471和P472之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的氨基酸插入；(i)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A479和S480之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的氨基酸插入；(j)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Y489和N490之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的氨基酸插入；或(k)以上(a)至(j)的任意组合。
在实施例中，经修饰的Axmi205毒素包含：在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸K402或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的取代；
a)以下的氨基酸取代：(i)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸K402或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有碱性侧链的氨基酸、甘氨酸或脯氨酸；以及(ii)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Y404或另一Axmi205毒素中的相应酪氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有碱性侧链的氨基酸、甘氨酸或脯氨酸；
b)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸C482或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸、甘氨酸或脯氨酸的取代；
c)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸C507或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸、甘氨酸或脯氨酸的取代；
d)以下的氨基酸取代：(i)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸M422或另一Axmi205毒素中的相应甲硫氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有碱性侧链的氨基酸、甘氨酸或脯氨酸；以及(ii)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸M423或另一Axmi205毒素中的相应甲硫氨酸残基处具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有碱性侧链的氨基酸、甘氨酸或脯氨酸；
e)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A475和G476之间或另一Axmi205毒素中的相应丙氨酸和甘氨酸残基之间具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有碱性侧链的氨基酸、甘氨酸或脯氨酸的插入；
f)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸G496和D497之间或另一Axmi205毒素中的相应甘氨酸和天冬氨酸残基之间具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有碱性侧链的氨基酸、甘氨酸或脯氨酸的插入；
g)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Q471和P472之间或另一Axmi205毒素中的相应丙氨酸和甘氨酸残基之间具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的插入；
h)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A479和S480之间或另一Axmi205毒素中的相应丙氨酸和甘氨酸残基之间具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的插入；
i)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Y489和N490之间或另一Axmi205毒素中的相应丙氨酸和甘氨酸残基之间具有脂肪族疏水侧链的氨基酸、具有芳香族疏水侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、或具有碱性侧链的氨基酸的插入；或
j)(a)至(i)的任意组合。
具有脂肪族疏水侧链、芳香族疏水侧链、极性中性侧链、酸性侧链或碱性侧链的氨基酸如本文其他地方所述。
在示例性实施例中，经修饰的Axmi205毒素包含：
a)SEQ ID NO:1的多肽中K402F、K402N或K402D或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸的氨基酸取代；
b)SEQ ID NO:1的多肽中的(i)K402L和Y404F或(ii)K402D和Y404L或另一Axmi205毒素中的相应赖氨酸和酪氨酸残基的氨基酸取代；
c)SEQ ID NO:1的多肽中的C482S、C482D或C482F或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基的氨基酸取代；
d)SEQ ID NO:1的多肽中的C507S、C507L、C507A、C507F、C507D或C507R或另一Axmi205毒素中的相应半胱氨酸残基的氨基酸取代；
e)(i)M422S和M423L、(ii)M422T和M423F、(iii)M422K和M423F、(iv)M422D和M423E、(v)M422K和M423R或(vi)M422S and M423E或另一Axmi205毒素中的相应甲硫氨酸残基的氨基酸取代；
f)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A475和G476之间或另一Axmi205毒素中的相应的丙氨酸和甘氨酸残基之间的亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸的插入；
g)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸G496和D497之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸的插入；
h)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Q471和P472之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸的插入；
i)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸A479和S480之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸的插入；
j)在SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸Y489和N490之间或另一Axmi205毒素中的相应的甘氨酸和天冬氨酸残基之间的亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸的插入；或
k)(a)至(j)的任意组合。
在具体实施例中，本发明的杀昆虫蛋白包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：(a)SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:73中任一项的氨基酸序列，或其毒素片段；或者(b)与(a)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
本领域技术人员将理解的是，本发明的杀昆虫蛋白可以进一步包含其他功能结构域和/或肽标签，例如N末端和/或C末端上的肽标签。为了说明，用可以被可商购的抗体(例如，FLAG基序)识别的肽标签或用促进纯化(例如，通过添加聚-His标签)和/或检测的肽标签表达所述杀昆虫蛋白可能是有用的。可替代地，可以将表位引入所述蛋白中以促进抗体的产生，这些抗体特异性识别经修饰的蛋白以将经修饰的蛋白与未经修饰的嵌合体和/或一个亲本蛋白或多个亲本蛋白区分开来。例如，一个或多个氨基酸可以被取代到抗原环中以产生新的表位。在其他实施例中，所述蛋白可以被修饰以增强其稳定性，例如，通过将麦芽糖结合蛋白(MBP)或谷胱甘肽-S-转移酶融合到多肽。作为另一种选择，杀昆虫蛋白可以是包含报道分子的融合蛋白。此外，可以将亚细胞靶向肽并入蛋白质中，例如靶向内质网的KDEL序列标签。
如上所讨论，本发明涵盖多肽(这些多肽具有与在此明确披露的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，及其毒素片段)。应当理解的是，在此明确披露的杀昆虫蛋白将典型地允许在氨基酸序列中的修饰并基本上保留生物活性(例如，杀昆虫活性)。此类修饰包括一个或多个氨基酸的插入、缺失(包括任一末端处的截短)和取代，包括多达约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155个、或更多个氨基酸的取代、缺失和/或插入。
在实施例中，本发明的多肽包含如WO2013/016617(Athenix公司)和/或US 2014/0274885 A1(先锋良种公司)中披露的修饰。
为了鉴定与在此明确披露的杀昆虫蛋白基本上相同的多肽，氨基酸取代可以基于本领域中已知的任何特性，包括氨基酸侧链取代基的相对相似性或差异，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。
例如，在鉴定编码除在此明确披露的那些之外的杀昆虫多肽的氨基酸序列时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质以交互性生物功能中的重要性在本领域中通常是被理解的(参见Kyte和Doolittle,(1982),J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]157:105；通过引用以其全文结合在此)。接受的是所述氨基酸的相对亲水特征有助于所得蛋白的次级结构，所述次级结构进而定义蛋白与其他分子(例如酶、基质、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
每种氨基酸已基于其疏水性和电荷特征被指定了亲水指数(Kyte和Doolittle,Id.)，这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸盐(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
因此，当修饰在此明确披露的多肽时，可以考虑氨基酸(或氨基酸序列)的亲水指数。
在本领域中也理解氨基酸的取代可基于亲水性进行。美国专利号4,554,101说明蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性支配的)与所述蛋白质的生物特性相关。
如在美国专利号4,554,101中详述的，已将以下亲水性值指定给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+-.3.0)；天冬氨酸盐(+3.0.+-.1)；谷氨酸盐(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+I)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
因此，当鉴定除在此明确披露的那些之外的另外的杀昆虫多肽时，可以考虑氨基酸(或氨基酸序列)的亲水性。
本发明的杀昆虫蛋白，包括在此明确披露的多肽的修饰和毒素片段，可以通过任何本领域已知的适合的方法来制备，通常通过修饰编码核酸序列来制备。操作和修饰核酸以实现所希望的修饰的方法是本领域熟知的。此外，也可以使用基因编辑技术产生本发明的杀昆虫蛋白或对其进行进一步修饰。
作为另一种途径，可以在如下宿主细胞中表达待修饰的多肽，所述宿主细胞在DNA复制过程中展现高比率的碱基错误结合，如XL-1Red(斯特塔杰公司(Stratagene)，拉荷亚(La Jolla)，加利福尼亚州)。在此类菌株中繁殖之后，可以分离出DNA(例如通过制备质粒DNA，或通过PCR扩增并且将所得的PCR片段克隆到载体中)，在非诱变菌株中培养这些蛋白突变体，并且鉴定具有杀昆虫活性的经突变的基因，例如通过进行对杀昆虫活性进行测试的测定。在示例性方法中，在摄食测定中混合并使用了所述蛋白质。参见例如Marrone等人,(1985),J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]78:290-293。此类测定可以包括使植物与一种或多种有害生物接触，并且确定该植物存活或引起这些有害生物死亡的能力。导致毒性提高的突变的实例见于Schnepf等人,(1998),Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物分子生物学综述]62:775-806中。
在实施例中，分离出本发明的杀昆虫蛋白(包括基本上类似的多肽和毒素片段)。在实施例中，本发明的杀昆虫蛋白(包括基本上类似的多肽和毒素片段)是重组蛋白。
可以通过本领域已知的任何方法(包括基因组编辑技术)来产生本发明的杀昆虫蛋白的变体。例如，在编码本发明所涵盖的杀昆虫蛋白的异源多核苷酸序列被引入到植物中后，所述引入的多核苷酸被稳定地整合到现在转基因植物的基因组中。因此，根据本发明，编码的杀昆虫蛋白可以使用各种基因组编辑技术(如锌指核酸酶(ZNF)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR))通过靶向DNA编辑进行进一步原位修饰(美国专利号8,697,359；Ran等人)。CRISPR系统可用于在靶序列处引入特定的核苷酸修饰。工程化的CRISPR-Cas9系统，最初在细菌中发现，其中几种不同的CRISPR级联起着先天免疫系统和天然防御机制的作用，可被编程以靶向特定的遗传密码延伸并在精确位置处进行切割。在过去几年中，这些功能已被利用并用作基因组编辑工具，使得研究人员能够永久性地修饰植物细胞中的基因。
本发明的杀昆虫蛋白具有针对一种或多种昆虫有害生物的活性。在实施例中，本发明的杀昆虫蛋白对鞘翅目、鳞翅目、双翅目、半翅目、直翅目和/或缨翅目昆虫有害生物具有活性。在实施例中，杀昆虫蛋白对鞘翅目有害生物具有活性。
鞘翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何鞘翅目昆虫，包括原鞘亚目、粘食亚目、肉食亚目和多食亚目、及其任何组合中的那些。
在这个实施例的一个方面中，本发明的杀昆虫蛋白针对根萤叶甲属物种具有活性。根萤叶甲属是鞘翅目的一种甲虫属，通常被称为“玉米根虫”或“黄瓜甲虫”。示例性根萤叶甲属物种包括但不限于：巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi)(北方玉米根虫)、玉米根萤叶甲指名亚种(西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、黄瓜条根萤叶甲(D.balteata)(带状黄瓜甲虫(banded cucumber beetle))、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata undecimpunctata)(西方斑点黄瓜甲虫(western spotted cucumberbeetle))、斯格尼根萤叶甲(D.significata)(3斑叶甲(3-spotted leaf beetle))、南美叶甲(D.speciosa)(菊花甲虫(chrysanthemum beetle))、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、班尼根萤叶甲(D.beniensis)、克里斯塔根萤叶甲(D.cristata)、科威根萤叶甲(D.curvipustulata)、双斑根萤叶甲(D.dissimilis)、华丽根萤叶甲(D.elegantula)、伊墨根萤叶甲(D.emorsitans)、禾本科根萤叶甲(D.graminea)、伊斯帕尼根萤叶甲(D.hispanolae)、莱米妮根萤叶甲(D.lemniscata)、赭腿根萤叶甲(D.linsleyi)、米勒根萤叶甲(D.milleri)、钱币形根萤叶甲(D.nummularis)、扇叶根萤叶甲(D.occlusa)、普拉根萤叶甲(D.porracea)、蜗牛根萤叶甲(D.scutellata)、胫骨根萤叶甲(D.tibialis)、三线根萤叶甲(D.trifasciata)以及微绿根萤叶甲(D.viridula)；及其任何组合。
根据本发明的鞘翅目昆虫有害生物的其他非限制性实例包括瘦跗叶甲属物种(Leptinotarsa spp.)，如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)；叶甲虫属物种(Chrysomelaspp.)，如黑杨叶甲(C.scripta)(黑杨叶甲虫(cottonwood leaf beetle))；咪小蠹属物种(Hypothenemus spp.)，如咖啡果小蠹(H.hampei)(咖啡豆钻孔虫(coffee berry borer))；米象属物种(Sitophilus spp.)，如玉米象(S.zeamais)(玉蜀黍象(maize weevil))；毛跳甲属物种(Epitrix spp.)，如烟草跳甲(E.hirtipennis)(烟草跳
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(tobacco fleabeetle))和黄瓜跳甲(E.cucumeris)(马铃薯跳甲(potato flea beetle))：条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)，如十字花科跳甲(P.cruciferae)(十字花科植物跳甲(cruciferflea beetle))和西方黑跳甲(P.pusilla)(西方黑色跳甲(western black fleabeetle))；花象属物种(Anthonomus spp)，例如墨西哥棉铃象(棉铃象鼻虫)和胡椒花象(胡椒茎象甲)；金针虫属物种(Hemicrepidus spp.)，如金针虫(H.memnonius)(铁线虫(wireworms))；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)，如普通梳爪叩头甲(M.communis)(铁线虫(wireworms))；荚象甲属物种(Ceutorhychus spp.)，如甘蓝荚象甲(C.assimilis)(甘蓝心皮象鼻虫(cabbage seedpod weevil))；条跳甲属物种，如十字花科跳甲(P.cruciferae)(十字花科跳甲植物(crucifer flea beetle))；Aeolus属物种(Aeolusspp.)，如A.mellillus(铁线虫)；Aeolus属物种，如A.mancus(小麦铁线虫(wheatwireworm))；砂铁线属物种(Horistonotus spp.)，如砂铁线虫(H.uhlerii)(沙子铁线虫(sand wireworm))；尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)，如玉米谷象(S.maidis)(玉蜀黍谷象(maize billbug))、梯牧草谷象(S.zeae)(梯牧草谷象虫(timothy billbug))、牧草长喙象(S.parvulus)(早熟禾谷象(bluegrass billbug))和南方玉米长喙象(S.callosus)(南方玉米谷象(southern corn billbug))；鳃角金龟属物种(Phyllophaga spp.)(蛴螬(white grub))；凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)，如玉米铜色跳甲(C.pulicaria)(玉米跳甲(corn flea beetle))；弧丽金龟属物种(Popillia spp.)，如日本弧丽金龟(P.japonica)(日本金龟子(Japanese beetle))；食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)，如墨西哥豆瓢虫(E.varivestis)(墨西哥豆甲虫(Mexican bean beetle))；萤叶甲属物种(Cerotoma spp.)，如菜豆莹叶甲(C.trifurcate)(豆叶甲(Bean leaf beetle))；豆芫菁属物种(Epicauta spp.)，如边缘豆芫菁(E.pestifera)和芫菁(E.lemniscata)(斑蝥(listerbeetles))；以及前述的任何组合。
在实施例中，所述杀昆虫蛋白针对鳞翅目有害生物的一个或多个以下非限制性实例具有活性：玉米螟属物种，如欧洲玉米螟(欧洲玉米蛀虫)和/或亚洲玉米螟(亚洲玉米蛀虫)；菜蛾属物种，如小菜蛾(P.xylostella，diamondback moth)；灰翅夜蛾属物种(Spodoptera spp.)，如草地贪夜蛾(秋黏虫)、海灰翅夜蛾(S.littoralis)(埃及棉树叶虫(Egyptian cotton leafworm))、黄条粘虫(S.ornithogalli，yellowstriped armyworm)、西部黄条粘虫(S.praefica，western yellowstriped armyworm)、南部粘虫(S.eridania，southern armyworm)和/或甜菜夜蛾(S.exigua，beet armyworm)；地老虎属物种，如小地老虎(A.ipsilon)(黑色地老虎)、普通地老虎(A.segetum，common cutworm)、泥背地老虎(A.gladiaria)(泥背地蚕(claybacked cutworm))和/或西部灰地老虎(A.orthogonia，pale western cutworm)；切根虫属物种(Striacosta spp.)，如豆白缘切根虫(S.albicosta，western bean cutworm)；铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)，如玉米穗虫(H.zea)(玉米穗蛾(corn earworm))、茶色铃夜蛾(H.punctigera，native budworm))和/或棉铃虫(H.armigera，cotton bollworm)；实夜蛾属物种(Heliothis spp.)，如烟芽夜蛾(H.virescens)(烟青虫(tobacco budworm))；蔗螟属物种(Diatraea spp.)，如西南玉米螟(D.grandiosella，southwestern corn borer)和/或小蔗螟(D.saccharalis，sugarcaneborer)；粉纹夜蛾属物种(Trichoplusia spp.)，如粉纹夜蛾(T.ni，cabbage looper)；蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)，如地中海玉米螟(S.nonagroides，Mediterranean cornborer)和/或非洲大螟(S.calamistis)(粉螟虫(pink stem borer))；红铃虫属物种(Pectinophora spp.)，如棉红铃虫(P.gossypiella，pink bollworm)；纹卷蛾属物种(Cochylis spp.)，如向日葵细卷叶蛾(C.hospes，banded sunflower moth)；天蛾属物种(Manduca spp.)，如烟草天蛾(M.sexta，tobacco hornworm)和/或番茄天蛾(M.quinquemaculata，tomato hornworm)；玉米苗斑螟属物种(Elasmopalpus spp.)，如南美玉米苗斑螟(E.Lignosellus)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer))；尺夜蛾属物种(Pseudoplusia spp.)，如大豆尺蠖(P.includens)(大豆夜蛾(soybean looper))；干煞夜蛾属物种(Anticarsia spp.)，如黎豆夜蛾(A.gemmatalis，velvetbean caterpillar)；绿夜蛾属物种(Plathypena spp)，如苜蓿绿夜蛾(P.scabra，green cloverworm)；马醉木属物种(Pieris spp.)，如大菜粉蝶(P.brassicae)(纹白蝶(cabbage butterfly))；夜蛾属物种(Papaipema spp.)，如蛀茎夜蛾(P.nebris)(钻心虫(stalk borer))；黏虫属物种(Pseudaletia spp.)，如一星黏虫(P.unipuncta)(普通黏虫(common armyworm))；疆夜蛾属物种(Peridroma spp.)，如杂色地老虎(P.saucia)(豆杂色夜蛾(variegatedcutworm))；茄茎麦蛾属物种(Keiferia spp.)，如番茄蠹蛾(K.lycopersicella)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；菜粉蝶属物种(Artogeia spp.)，如菜粉蝶(A.rapae)(菜青虫(imported cabbageworm))；茄麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)，如马铃薯麦蛾(P.operculella，potato tuberworm)；锞蚊夜蛾属物种(Chrysodeixis spp.)，如大豆尺蠖(C.includes)(大豆夜蛾(soybean looper))；脏切叶蛾属物种(Feltia spp.)，如脏切夜蛾(F.ducens)(番茄褐夜蛾(dingy cutworm))；禾草螟属物种(Chilo spp.)，如二化螟(C.suppressalis)(高粱条螟(striped stem borer))；稻纵卷叶螟属物种(Cnaphalocrocis spp.)，如稻纵卷叶螟(C.medinalis，rice leaffolder)，或前述的任何组合。
半翅目中的昆虫包括草盲蝽属物种(Lygus spp)臭虫(包括绿蝽属物种(Nezaraspp.)、茶翅蝽属物种(Halyomorpha spp)、Brochymena spp.和美洲蝽属物种(Euschistusspp.))，蚜虫(包括蚜虫属物种(Aphis spp.)和长管蚜属物种(Nasonovia spp.)，以及其他刺吸式昆虫和吸啜式昆虫。
双翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何双翅目昆虫，包括但不限于斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)，如三叶斑潜蝇(L.trifolii)(潜叶虫(leafminer))和美洲斑潜蝇(L.sativae)(蔬菜潜叶虫(vegetable leafminer))；Scrobipalpula属物种，如番茄潜叶虫(S.absoluta，tomato leafminer)；地种蝇属物种(Delia spp.)，如玉米蝇蛆(D.platura)(玉米种蝇(seedcorn maggot))、甘蓝种蝇蛆(D.brassicae)(甘蓝种蝇(cabbage maggot))和甘蓝根花蝇(D.radicum，cabbage root fly)；锈蝇属物种(Psiliaspp.)，如胡萝卜锈蝇(P.rosae，carrot rust fly)；根斑蝇属物种(Tetanops spp.)，如甜菜根蛆(T.myopaeformis)(甜菜根斑蝇(sugarbeet root maggot))；以及前述的任何组合。
直翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何直翅目昆虫，包括但不限于黑蝗属物种(Melanoplus spp.)，如异黑蝗(M.differentialis)(长额负蝗(Differential grasshopper))、赤胫黑蝗(M.femurrubrum，Redlegged grasshopper))、双带黑蝗(M.bivittatus，Twostriped grasshopper))；及其任何组合。
缨翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何缨翅目昆虫，包括但不限于花蓟马属物种(Frankliniella spp.)，如西花蓟马(F.occidentalis)(西方花蓟马(western flower thrips))和烟褐花蓟马(F.fusca)(烟草蓟马(tobacco thrips))；和蓟马属物种(Thrips spp.)，如烟蓟马(T.tabaci)(葱蓟马(onion thrips))、瓜蓟马(T.palmi，melon thrips)；以及前述的任何组合。
在实施例中，本发明的杀有害生物蛋白对线虫有活性。如本文使用的术语“线虫”涵盖目前已知的或之后鉴定的任何被分类为动物界线虫门的生物，包括但不限于有腺纲(包括例如：嘴刺目、等咽目、单齿目、矛线目、毛首目、索虫目、姆斯帕目、薄咽目、色矛目、带线虫目、链环目和单宫目)和/或胞管肾纲(包括例如：小杆目、圆线虫目、蛔虫目、旋尾目、驼形目、双胃目、垫刃目和滑刃目)中的线虫。
线虫包括但不限于寄生线虫，如根结线虫、胞囊线虫和/或腐线虫。根据本发明的线虫的示例性属包括但不限于：根结线虫属(根结线虫)、异皮线虫属(胞囊线虫)、球异皮线虫属(Globodera)(胞囊线虫)、穿孔线虫属(穿孔线虫)、肾状线虫属(肾形肾状线虫)、短体线虫属(腐线虫)、滑刃线虫属(叶面线虫)、螺旋线虫属(螺旋线虫)、纽带线虫属(矛线虫)、拟毛刺属(短粗根线虫)、长针线虫属、珍珠线虫属(假根结线虫)、亚粒线虫属(Subanguina)、刺线虫属(刺线虫)、小环线虫属(小环线虫)、环线虫属(环线虫)、茎线虫属(茎线虫)、锥线虫属(锥线虫)、半轮线虫属(半轮线虫)、鞘线虫属(鞘线虫)、潜根线虫属(潜根线虫)、根结线虫属(Hypsoperine)、大茎线虫属(大茎线虫)、Melinius属、刻点胞囊属(Punctodera)、五沟线虫属(Quinisulcius)、盾线虫属(盾线虫)、剑线虫属(匕首线虫)、矮化线虫属(矮化线虫)、穿刺线虫属(穿刺线虫)、伞滑刃属(蛔虫)、及其任何组合。
根据本发明的示例性植物寄生线虫包括但不限于：细小刺线虫(Belonolaimusgracilis)、长尾刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus，pine wood nematode)、龙胆轮线虫属(Criconemoides ornata)、马玲薯腐烂线虫(Ditylenchus destructor，potato rot nematode)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchusdipsaci，stem and bulb nematode)、马铃薯胞囊线虫(Globodera pallida，potato cystnematode)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)(金黄线虫(golden nematode))、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，soybean cyst nematode)、甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii，sugar beet cyst nematode)；玉米胞囊线虫(Heterodera zeae，corn cystnematode)、禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae，cereal cyst nematode)、胡萝卜异皮线虫(Heterodera carotae)、Heterodera trifolii(三叶异皮线虫)、哥伦布纽带线虫(Hoplolaimus columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、Hoplolaimusmagnistylus、短环长针线虫(Longidorus breviannulatus)、花生根结线虫(Meloidogynearenaria)、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、北方根节线虫(Meloidogynehapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)、异盘中环线虫(Mesocriconema xenoplax)、异常珍珠线虫(Nacobbusaberrans)、Naccobus dorsalis、Paratrichodorus christiei、微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、刻痕短体线虫(Pratylenchus crenatus)、Pratylenchus hexincisus、落选短体线虫(Pratylenchusneglectus)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、Pratylenchus projectus、斯克里布纳短体线虫(Pratylenchus scribneri)、Pratylenchus tenuicaudatus、Pratylenchusthornei、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)、Punctodera chaccoensis、Quinisulciusacutus、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、肾形轮线虫(Rotylenchulus reniformis)、顺逆矮化线虫(Tylenchorhynchus dubius)、柑桔半穿刺线虫(Tylenchulussemipenetrans)、美洲剑线虫(Siphinema americanum)、X.Mediterraneum、以及前述的任何组合。
本发明还涵盖特异性结合本发明的杀昆虫蛋白的抗体。所述抗体可任选地是单克隆抗体或多克隆抗血清。在实施例中，抗体对经修饰的Axmi205蛋白具有选择性，并且不结合未经修饰的Axmi205毒素，例如SEQ ID NO:1的天然Axmi205蛋白，并且可以用于区分经修饰的蛋白与未经修饰的Axmi205蛋白。此类抗体可以使用生产多克隆抗血清的标准免疫学技术生产，并且如果需要的话，无限增殖免疫宿主的抗体产生细胞用于单克隆抗体生产源。用于生产针对任何目的物质的抗体的技术是熟知的，例如如在以下文献中所描述的：Harlow和Lane(1988,Antibodies a laboratory manual.[抗体：实验室手册],第726页,冷泉港实验室)以及如在Goding(Monoclonal Antibodies:Principles&practice[单克隆抗体：原理与实践]1986,学术出版社公司(Academic Press,Inc.),奥兰多,佛罗里达州)。本发明还涵盖杀昆虫蛋白，所述杀昆虫蛋白与抗体、特别是单克隆抗体交叉反应，产生了针对本发明的杀昆虫蛋白的一种或多种。
根据本发明的抗体可用于例如在免疫测定中确定例如生物样品中本发明的杀昆虫蛋白或抗原相关多肽的量或存在。此类测定在质量控制生产含有本发明的杀昆虫蛋白中的一种或多种或抗原相关多肽的组合物中也是有用的。此外，这些抗体可以用来评估本发明的杀昆虫蛋白中的一种或多种或抗原相关多肽的重组生产的功效，以及用于筛选表达文库以确定编码本发明的蛋白中的一种或多种或抗原相关多肽的核苷酸序列的存在。抗体进一步可作为亲和配体用于纯化或分离本发明的蛋白质中的任何一种或多种或抗原相关多肽。在实施例中，抗体不识别(即，不特异性结合)不包含本发明的修饰的天然Axmi205和/或亲本Axmi205毒素，并且可以用于区分和/或分离本发明的杀昆虫蛋白与天然Axmi205。
核酸、表达盒和载体。
作为另外的方面，本发明提供了编码本发明多肽(包括如在此描述的经修饰的多肽和毒素片段)的核酸。
根据一些实施例，本发明提供了包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：(a)核苷酸序列，其编码以下氨基酸序列：SEQID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:57、SEQID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127或其毒素片段；(b)编码与(a)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)在严格杂交条件下退火至(a)或(b)的核苷酸序列的核苷酸序列；或者(d)由于遗传密码的简并性而不同于(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的核苷酸序列。
在实施例中，所述核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：(a)SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ IDNO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:126的核苷酸序列或其编码毒素的片段；(b)与(a)的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列；(c)在严格杂交条件下退火至(a)或(b)的核苷酸序列的核苷酸序列；或者(d)由于遗传密码的简并性而不同于(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的核苷酸序列。任选地，核苷酸序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQID NO:124或SEQ ID NO:126的核苷酸序列。
在实施例中，所述核苷酸序列是部分或完全合成的序列，例如，其具有用于在宿主生物(例如，在细菌宿主或植物宿主中(例如，转基因单子叶植物宿主或转基因双子叶植物宿主))中表达而进行了优化的密码子。用于在玉蜀黍植物中表达而被密码子优化的核苷酸序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77。
在代表性实施例中，修饰和/或优化了本发明的核苷酸序列用于在转基因植物中表达。例如，尽管在许多情况下，来自微生物的基因能够在植物中高水平表达而无需修饰，但在转基因植物中的低表达可能是由于微生物核苷酸序列的缘故，这些序列具有在植物中并不优选的密码子。在本领域中已知，活生物具有特定的密码子使用偏好，而且在本发明中所描述的这些核苷酸序列的密码子可以被改变以符合植物偏好，同时维持由其编码的氨基酸。此外，在本领域中已知，在植物(例如玉米植物)中高表达可以是由如下编码序列实现的，所述编码序列具有至少约35％、或至少约45％、或至少约50％、或至少约60％的GC含量。具有低GC含量的微生物核苷酸序列在植物中也许表达欠佳。尽管某些核苷酸序列均可以在单子叶植物和双子叶植物物种两者中充分表达，但是可以对序列进行修饰以便迎合单子叶植物或双子叶植物特定的密码子偏好以及GC含量偏好，因为这些偏好已经被证明是不同的(Murray等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究]17:477-498(1989))。此外，在实施例中，修饰所述核苷酸序列以去除可能导致消息平截(message truncation)的不正常剪接位点。使用描述于例如美国专利号5,625,136、5,500,365和6,013,523中的方法，使用熟知的定点诱变、PCR以及合成基因构建技术，可以对这些核苷酸序列做出此类修饰。
在一些实施例中，本发明提供了根据披露于美国专利号5,625,136中的程序制备的合成编码序列或多核苷酸。在这个程序中，使用了玉蜀黍优选的密码子，即最频繁地编码玉蜀黍中的氨基酸的单一密码子。针对特定的氨基酸的玉蜀黍偏好的密码子可衍生自例如来自玉蜀黍的已知基因序列。例如，针对来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子使用发现于以下文献中：Murray等人,Nucleic Acids Research[核酸研究]17:477-498(1989)。应当认识到，密码子进行优化用于在一种植物物种中的表达也将作用于其他植物物种，但密码子进行优化用于表达的植物物种可能不在相同水平。以这种方式，这些核苷酸序列可以进行优化用于在任何植物中表达。应当认识到，核苷酸序列的全部或任何部分可以是优化的或合成的。也就是说，多核苷酸可以包含作为部分天然序列和部分密码子优化序列的核苷酸序列。
在代表性实施例中，本发明的多核苷酸是分离的多核苷酸。在实施例中，本发明的多核苷酸是重组多核苷酸。
在实施例中，本发明进一步提供了核酸分子，所述核酸分子包含与启动子(例如异源启动子)可操作地相关联的多核苷酸。例如，启动子可以包括组成性的、诱导性的、时间调节的、发育调节的、化学调节的、组织优选的和/或组织特异性的启动子。在特定方面，适用于本发明的启动子是能够在植物细胞中(例如在单子叶植物(例如玉蜀黍或水稻)或双子叶植物(例如大豆、棉花)的细胞中)启动核苷酸序列的转录的启动子。
在实施例中，异源启动子是植物可表达型启动子(例如，单子叶植物可表达型或双子叶植物可表达型启动子)。例如但不限于，该植物可表达型启动子可以选自以下启动子：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS 6、玉蜀黍H3组蛋白、噬菌体T3基因9 5'UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、水稻肌动蛋白、水稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白(potato patatin)、凝集素、CaMV 35S以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。
尽管已经显示来自双子叶植物的很多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然，但在实施例中，选择双子叶植物启动子用于在双子叶植物中表达，并且选择单子叶植物启动子用于在单子叶植物中表达。不过，对于所选的启动子的起源没有限制；只要它们可有效驱动核苦酸序列在所希望细胞中表达就足够了。
启动子的选择可以依赖于表达的时间和空间需要而变化，并且还依赖于有待转化的宿主细胞而变化。因此，例如，本发明的核苷酸序列的表达可以处于任何植物和/或植物部分中(例如，处于叶子中、处于茎杆或茎中、处于穗中、处于花序中(例如，穗状花序、圆锥花序、穗轴等)、处于根、种子和/或幼苗等中)。例如，在希望在特异性组织或器官中表达的情况下，可以使用组织特异性或组织优选的启动子(例如，根特异性或优选的启动子)。相比之下，在希望响应刺激而表达的情况下，可以使用可由刺激或化学物诱导的启动子。在希望在植物的所有细胞中以相对恒定水平连续表达的情况下，可以选择组成型启动子。
适用于本发明的启动子包括但不限于组成性地驱动核苷酸序列的表达的那些启动子、在诱导时驱动表达的那些启动子、以及以组织或发育特异性方式驱动表达的那些启动子。这些不同类型的启动子在本领域是已知的。
适合的组成型启动子包括例如CaMV 35S启动子(Odell等人,Nature[自然]313:810-812,1985)；拟南芥At6669启动子(参见PCT公开号W0 04081173A2)；玉蜀黍Ubi 1(Christensen等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689,1992)；水稻肌动蛋白(McElroy等人,Plant Cell[植物细胞]2:163-171,1990)；pEMU(Last等人,Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81:581-588,1991)；CaMV19S(Nilsson等人,Physiol.Plant[植物生理学]100:456-462,1997)；GOS2(de Pater等人,Plant J[植物杂志]11月；2(6):837-44,1992)；泛素(Christensen等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689,1992)；水稻亲环蛋白(Bucholz等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]25(5):837-43,1994)；玉蜀黍H3组蛋白(Lepetit等人,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]231:276-285,1992)；肌动蛋白2(An等人,Plant J.[植物杂志]10(1)；107-121,1996)、组成型根尖CT2启动子(SEQ ID NO:1535；还参见PCT申请号IL/2005/000627))以及Synthetic Super MAS(Ni等人,The Plant Journal[植物杂志]7:661-76,1995)。其他组成型启动子包括美国专利号5,659,026、5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、以及5,608,142中的那些。
对于在植物(任选地是玉蜀黍)中表达本发明的多肽是有用的组织特异性的或组织优选的启动子包括那些直接在根、髓、叶或花粉中表达的启动子。适合的组织特异性启动子包括但不限于叶特异性启动子(如例如由Yamamoto等人,Plant J.[植物杂志]12:255-265,1997；Kwon等人,Plant Physiol.[植物生理学]105:357-67,1994；Yamamoto等人,Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]35:773-778,1994；Gotor等人,Plant J.[植物杂志]3:509-18,1993；Orozco等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]23:1129-1138,1993；以及Matsuoka等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:9586-9590,1993所描述)，种子优选启动子(例如来自种子特异性基因；Simon等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]5.191,1985；Scofield等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]262:12202,1987；Baszczynski等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]14:633,1990)、巴西坚果白蛋白(Pearson等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:235-245,1992)、豆球蛋白(Ellis等人，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]10:203-214,1988)、谷蛋白(Takaiwa等人,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]208:15-22,1986；Takaiwa等人,FEBS Letts.[欧洲生化学会联合会快报]221:43-47,1987)、玉米蛋白(Matzke等人,Plant Mol Biol[植物分子生物学],143).323-32 1990)、napA(Stalberg等人,Planta[植物]199:515-519,1996)、小麦SPA(Albanietal,Plant Cell[植物细胞]，9:171-184,1997)、向日葵油体蛋白(oleosin)(Cummins等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]19:873-876,1992)]，胚乳特异性启动子(例如，小麦LMW和HMW、麦谷蛋白-1(Mol Gen Genet[分子遗传学与普通遗传学]216:81-90,1989；NAR 17:461-2)、小麦a、b和g麦醇溶蛋白(EMB03:1409-15,1984)、大麦ltrl启动子、大麦B1、C、D大麦醇溶蛋白(Theor Appl Gen[理论与应用遗传学]98:1253-62,1999；Plant J[植物杂志]4:343-55,1993；Mol Gen Genet[分子遗传学与普通遗传学]250:750-60,1996)、大麦DOF(Mena等人,The Plant Journal[植物杂志]116(1):53-62,1998)、Biz2(EP 99106056.7)、合成启动子(Vicente-Carbajosa等人,Plant J.[植物杂志]13:629-640,1998)、水稻谷醇溶蛋白NRP33、水稻-球蛋白Glb-1(Wu等人,Plant CellPhysiology[植物细胞生理学]39(8)885-889,1998)、水稻α-球蛋白REB/OHP-1(Nakase等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]33:513-S22,1997)、水稻ADP-葡萄糖PP(Trans Res6:157-68,1997)、玉蜀黍ESR基因家族(Plant J[植物杂志]12:235-46,1997)、高粱γ-高粱醇溶蛋白(Plant Mol.Biol[植物分子生物学]32:1029-35,1996))，胚特异性启动子(例如，水稻OSH1(Sato等人,Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]93:8117-8122)、KNOX(Postma-Haarsma等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]39:257-71,1999)、水稻油体蛋白(Wu等人,J.Biochem.[生物化学杂志]，123:386,1998)]，花特异性启动子(例如，AtPRP4，查尔酮合酶(chalene synthase；chsA)(Van der Meer等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15,95-109,1990)，LAT52(Twell等人,Mol.Gen Genet.[分子遗传学与普通遗传学]217:240-245；1989)，apetala-3，以及植物繁殖组织特异性的启动子(例如，OsMADS启动子(美国专利公开2007/0006344))。
适用于在绿色组织中优选表达的启动子的实例包括调节参与光合作用的基因的许多启动子，并且这些中的许多已经从单子叶植物和双子叶植物两者中得以克隆。一种此类启动子是来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉蜀黍PEPC启动子(Hudspeth和Grula,PlantMolec.Biol.[植物分子生物学]12:579-589(1989))。另一种用于根特异性表达的启动子是由de Framond(FEBS 290:103-106(1991)或美国专利号5,466,785)描述的启动子。另一种在本发明中有用的启动子是描述于美国专利号5,625,136中的茎特异性启动子，它天然地驱动玉蜀黍trpA基因的表达。
此外，可以使用在质体中发挥作用的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因9 5'UTR以及其他的披露于美国专利号7,579,516中的启动子。适用于本发明的其他启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。
在本发明的一些实施例中，可以使用诱导型启动子。因此，例如，可以使用化学调节的启动子以通过应用外源化学调节物来调节植物中的基因表达。本发明的核苷酸序列的表达经由化学调节过的启动子进行的调节使得本发明的多肽仅当用诱导的化学物处理作物植物时能被合成。取决于目的，在应用化学物诱导基因表达时启动子可以是化学诱导型启动子，或者在应用化学物阻抑基因表达时启动子可以是化学阻抑型启动子。用于基因表达的化学诱导的此类技术的实例详述于公开申请EP 0 332 104和美国专利号5,614,395中。
化学诱导型启动子在本领域是已知的，并且包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其由用作发芽前除草剂的疏水亲电子化合物激活)、以及烟草PR-1a启动子(其由水杨酸激活)(例如，PR1a系统)、类固醇反应性启动子(参见例如，Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]USA 88,10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.[植物杂志]14,247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型启动子和四环素-阻抑型启动子(参见例如，Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学]227,229-237和美国专利号5,814,618和5,789,156)、Lac阻遏物系统启动子、铜诱导型系统启动子、水杨酸诱导型系统启动子(例如，PR1a系统)、糖皮质激素诱导型启动子(Aoyama等人(1997)Plant J.[植物杂志]11:605-612)以及蜕皮激素诱导型系统启动子。
诱导型启动子的其他非限制性实例包括ABA诱导型和细胞膨胀诱导型启动子、植物生长素结合蛋白基因启动子(Schwob等人(1993)Plant J.[植物杂志]4:423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶启动子(Ralston等人(1988)Genetics[遗传学]119:185-197)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero等人(1994)Plant J.[植物杂志]6:141-150)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Kohler等人(1995)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29:1293-1298；Martinez等人(1989)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]208:551-565；和Quigley等人(1989)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]29:412-421)。还包括苯磺酰胺诱导型(美国专利号5,364,780)和乙醇诱导型(国际专利申请公开号WO 97/06269和WO 97/06268)系统和谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样地，可以使用描述于以下文献中的诱导型启动子中的任一种：Gatz(1996)Current Opinion Biotechnol.[生物技术新见]7:168-172和Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.[植物生理学与植物分子生物学年度综述]48:89-108。适用于指导本发明的核苷酸序列在植物中的表达的其他化学诱导型启动子披露于美国专利5,614,395中。基因表达的化学诱导还详述于EP 0 332 104(授予汽巴-嘉基公司(Ciba-Geigy))和美国专利5,614,395中。
另一类在本发明中有用的启动子是创伤诱导型启动子。已经描述了数量众多的在创伤部位并且还在植物病原菌感染的部位表达的启动子。理想的是，这样的启动子在昆虫入侵的部位应该仅有局部活性，并且以此方式这些杀昆虫蛋白仅在需要合成这些杀昆虫蛋白的细胞中积聚以杀死入侵的昆虫有害生物。这类启动子的实例包括由以下文献所描述的那些：Stanford等人,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]215:200-208(1989)；Xu等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:573-588(1993)；Logemann等人,PlantCell[植物细胞]1:151-158(1989)；Rohrmeier和Lehle,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:783-792(1993)；Firek等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:129-142(1993)以及Warner等人,Plant J.[植物杂志]3:191-201(1993)。
在实施例中，本发明的核酸可以包含表达盒，基本上由其组成，或由其组成，或者可以包含在表达盒内。
包含目的多核苷酸的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少另外一种是异源的。表达盒还可以是天然存在但已经是以适用于异源表达的重组形式获得的表达盒。典型地，所述表达盒相对于宿主而言是异源的，即所述表达盒的特定核酸序列不是天然存在于宿主细胞中的，并且必须已经通过转化事件引入到宿主细胞或宿主细胞的祖先中。
除与本发明的核苷酸序列可操作地相关联的启动子之外，本发明的表达盒还可以包括其他调节元件。调节元件包括但不限于增强子、内含子、翻译前导序列、终止信号、以及多腺苷酸化信号序列。适合的转录终止子信号的实例是可获得的并且在本领域中是已知的(例如来自CaMV的tml，来自rbcS的E9)。任何已知在植物中发挥作用的可供使用的终止子均可以在本发明的上下文中使用。
可以将许多其他序列掺入本发明所描述的表达盒中。这些序列包括已经显示出增强表达的序列，如内含子序列(例如，来自Adhl和bronzel)以及病毒的前导序列(例如，来自TMV、MCMV、和AMV)。
为了更加有效的翻译起始，可修饰与起始甲硫氨酸相邻的序列。例如，它们可以通过包含已知在植物中有效的序列而被修饰。Joshi已经提出了针对植物的适当的共有序列(NAR 15:6643-6653(1987))，并且Clonetech提出了另一种共有翻译起始子(1993/1994目录，第210页)。这些共有序列适于与本发明的核苷酸序列一起使用。将这些序列掺入至包含核苷酸序列的构建体中，达到ATG并且包括ATG(同时保持不修饰第二氨基酸)，或者可替代地达到ATG后的GTC并且包括ATG后的GTC(具有修饰该转基因的第二氨基酸的可能性)。
在实施例中，希望的是将本发明的多肽的表达靶向至植物细胞中的特定细胞定位。在一些情况下，在胞质溶胶中的定位可能是令人希望的，而在其他情况下，在某个亚细胞器中的定位可能是优选的。用于靶向例如植物中的基因产物的任何机构都可以用于实践本发明，并且已知此类机构存在于植物中并且已经相当详细地表征了控制这些机构的功能的序列。已经表征了导致将基因产物靶向其他细胞区室的序列。例如，氨基末端序列可以负责将目的蛋白质靶向细胞区室，如植物细胞的液泡、线粒体、过氧化物酶体、蛋白体、内质网、叶绿体、淀粉颗粒、淀粉体、质外体或细胞壁(例如Unger等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]13:411-418(1989)；Rogers等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82:6512-651；美国专利号7,102,057；WO 2005/096704)。任选地，信号序列可以是来自waxy的N末端信号序列、来自γ-玉米蛋白的N末端信号序列、淀粉结合结构域、C末端淀粉结合结构域、将成熟蛋白引入叶绿体的叶绿体靶向序列(Comai等人(1988)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]263:15104-15109；van den Broeck等人(1985)Nature[自然]313:358-363；美国专利号5,639,949)或来自糊粉细胞的分泌信号序列(Koehler和Ho,Plant Cell[植物细胞]2:769-783(1990))。另外，与羧基末端序列结合的氨基末端序列负责基因产物的液泡靶向，并且可以随本发明一起使用(Shinshi等人,(1990)PlantMolec.Biol.[植物分子生物学]14:357-368)。在一个实施例中，所选择的信号序列包括已知的切割位点，并且构建的融合体考虑了在一个或多个切割位点之后的需要切割的任何氨基酸。在一些情况下，这个要求可以通过在切割位点与转基因ATG之间添加小数目的氨基酸，或可替代地置换转基因序列内的一些氨基酸来满足。这些构建技术在本领域是熟知的并且同样适用于任何细胞区室。
应认识到，用于细胞靶向的上述机制不仅可以与其同源启动子结合使用，还可以与异源启动子结合使用，从而在启动子的转录调节下实现特定的细胞靶向目标，该启动子具有不同于自其衍生靶向信号的启动子的表达谱。
本发明的表达盒还可以包括用于选择性标记的核苷酸序列，所述选择性标记可以用于选择转化的植物、植物部分和/或植物细胞。适合的选择性标记的许多例子是本领域已知的并且可以用于在此描述的表达盒中。
选择性标记的实例包括但不局限于，编码neo或nptII的核苷酸序列，其赋予对卡那霉素、G418等的抗性(Potrykus等人,(1985)Mol.Gen.Genet[分子与普通遗传学]199:183-188)；编码bar的核苷酸序列，其赋予对草丁膦的抗性；编码改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)的核苷酸序列，其赋予对草甘膦的抗性(Hinchee等人,(1988),Biotech.[生物技术]6:915-922)；编码腈水解酶(如来自臭鼻克雷白氏杆菌的bxn)的核苷酸序列，其赋予对溴草腈的抗性(Stalker等人,(1988),Science[科学]242:419-423)；编码改变的乙酰乳酸合酶(ALS)的核苷酸序列，其赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS-抑制化学物的抗性(欧洲专利申请号154204)；编码甲氨蝶呤-抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)的核苷酸序列(Thillet等人,(1988),J.Biol.Chem.[生物化学杂志]263:12500-12508)；编码茅草枯脱卤素酶的核苷酸序列，其赋予对茅草枯的抗性；编码甘露糖-6-磷酸异构酶(也称为磷酸甘露糖异构酶(PMI))的核苷酸序列，其赋予代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378与5,994,629)；编码改变的邻氨基苯甲酸盐合酶的核苷酸序列，其赋予对5-甲基色氨酸的抗性；或编码hph的核苷酸序列，其赋予对潮霉素的抗性。本领域技术人员能够选择用于在本发明的表达盒中使用的适合的选择性标记。
另外的选择性标记包括但不限于：编码β-葡萄糖醛酸酶的核苷酸序列或编码对于多种显色底物已知的酶的uidA(GUS)；编码在植物组织中对花色苷色素(红色)进行调节的产物的R基因座核苷酸序列(Dellaporta等人,“Molecular cloning of the maize R-njallele by transposon-tagging with Ac”263-282In:Chromosome Structure andFunction:Impact of New Concepts[《染色体结构与功能：新概念的影响》中的263-282“通过Ac转座子标签技术对玉蜀黍R-nj等位基因的分子克隆”],18th Stadler GeneticsSymposium(第18届斯特德莱遗传学专题讨论会)(Gustafson和Appels编辑,Plenum Press(Plenum出版社)(1988))；编码β-内酰胺酶的核苷酸序列，对于β-内酰胺酶而言多种显色底物是已知的(例如，PADAC，一种显色头孢菌素)(Sutcliffe(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3737-3741)；编码xylE的核苷酸序列，xylE对儿茶酚双加氧酶进行编码(Zukowsky等人,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:1101-1105)；编码酪氨酸酶的核苷酸序列，酪氨酸酶能够氧化酪氨酸成为DOPA以及多巴醌，其进而缩合形成黑色素(Katz等人,(1983)J.Gen.Microbiol.[普通微生物学杂志]129:2703-2714)；编码β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，对于β-半乳糖苷酶而言存在显色底物；编码荧光素酶(lux)的核苷酸序列，荧光素酶允许生物发光检测(Ow等人,(1986)Science[科学]234:856-859)；编码水母发光蛋白的核苷酸序列，水母发光蛋白可以在钙敏感的生物发光检测中采用(Prasher等人,(1985)Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理学研究通讯]126:1259-1268)；或编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列(Niedz等人,(1995)Plant CellReports[植物细胞报道]14:403-406)。本领域技术人员能够选择用于在本发明的表达盒中使用的适合的选择性标记。
在一些实施例中，本发明的表达盒还可以包括编码除本发明的杀昆虫蛋白之外的其他所希望的性状的多核苷酸。此类其他多核苷酸的实例包括编码多肽或dsRNA以获得其他所希望的目的性状的那些。此类包含“叠加”性状的表达盒可以用来例如产生具有所希望的具有叠加性状(即，分子叠加)的表型的植物、植物部分或植物细胞。植物中的此类叠加的组合还可以通过其他方法来产生，包括但不限于通过任何常规的方法学来杂交育种植物(即，育种叠加)。如果是通过遗传转化这些植物来进行叠加的，目的核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如，包含一种或多种所希望的性状的转基因植物可以用作通过后续转化而引入另外的性状的靶标。另外的核苷酸序列可以在共转化方案中与由表达盒的任何组合提供的本发明的核苷酸序列、核酸分子、核酸构建体、或组合物同时引入。例如，如果将引入两个核苷酸序列，则它们可以合并在分开的盒(反式)中或合并在相同的盒(顺式)上。多核苷酸的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。进一步认识到多核苷酸可以使用位点特异性重组系统在所希望的基因组位置处叠加。参见，例如，国际专利申请公开号WO 99/25821；WO 99/25854；WO 99/25840；WO 99/25855和WO 99/25853。
在代表性实施例中，所述表达盒还可以包括用于农艺性状(例如，主要受益者是种子公司、栽培者或谷物加工者的农艺性状)的一种或多种目的多肽或双链RNA分子(dsRNA)的另外的编码序列。目的多肽可以是由目的核苷酸序列编码的任何多肽。适合用于在植物中生产的目的多肽的非限制性实例包括产生农艺学重要性状的那些多肽，这些性状如除草剂抗性(有时也称为“除草剂耐受性”)、病毒抗性、细菌病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、或真菌抗性。参见，例如美国专利号5,569,823；5,304,730；5,495,071；6,329,504；和6,337,431。在实施例中，目的多肽可以是提高植物活力或产量(包括允许植物在不同的温度、土壤条件以及日光和沉淀水平下生长的性状)的多肽、或是允许对展现目的性状(例如，选择性标记、种皮颜色等)的植物进行鉴定的多肽。不同的目的多肽，连同用于将这些多肽引入植物中的方法描述于例如美国专利号4,761,373、4,769,061、4,810,648、4,940,835、4,975,374、5,013,659、5,162,602、5,276,268、5,304,730、5,495,071、5,554,798、5,561,236、5,569,823、5,767,366、5,879,903、5,928,937、6,084,155、6,329,504和6,337,431，连同美国专利公开号2001/0016956中。还参见互联网上lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/。
赋予对抑制生长点或分生组织的除草剂(如咪唑啉酮或磺酰脲)的抗性/耐受性的多核苷酸也可以适用于本发明的一些实施例中。对于突变型ALS和AHAS酶在这一分类号中的示例性多核苷酸如描述于例如，美国专利号5,767,366和5,928,937中。美国专利号4,761,373和5,013,659针对抵抗不同的咪唑啉酮或磺酰脲除草剂的植物。美国专利号4,975,374涉及含有如下核酸的植物细胞和植物，所述核酸编码突变型谷氨酰胺合成酶(GS)，所述突变型谷氨酰胺合成酶抵抗已知抑制GS的除草剂(例如，草丁膦和甲硫氨酸磺基肟(methionine sulfoximine))的抑制作用。美国专利号5,162,602披露了抵抗环己二酮和芳氧苯氧丙酸除草剂的抑制作用的植物。该抗性由改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)赋予。
赋予对草甘膦抗性的、由核苷酸序列编码的多肽也适用于本发明。参见例如，美国专利号4,940,835和美国专利号4,769,061。美国专利号5,554,798披露了抗草甘膦的转基因玉蜀黍植物，该抗性由改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶基因赋予。
编码对磷酰基化合物(如草铵膦或草丁膦、以及吡啶氧丙酸或苯氧丙酸以及环己酮)的抗性的多核苷酸也是适合的。参见欧洲专利申请号0 242 246。还参见美国专利号5,879,903、5,276,268和5,561,236。
其他适合的多核苷酸包括编码对抑制光合作用的除草剂(如三嗪和苯基氰(腈水解酶))的抗性的那些。参见美国专利号4,810,648。编码用于除草剂抗性的另外的适合的多核苷酸包括编码对2,2-二氯丙酸、烯禾啶、吡氟氯禾灵、咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、均三嗪除草剂以及溴草腈的抗性的那些。同样适合的是赋予对原卟啉原氧化酶的抗性或者提供增强的对植物疾病的抗性、增强的对不利环境条件(非生物胁迫)的耐受性(这些条件包括但不限于干旱、极冷、极热、或极端的土壤盐度或极端的酸度或碱度)、以及在植物构造或发育中的改变(包括发育时间方面的变化)的多核苷酸。参见例如，美国专利公开号2001/0016956和美国专利号6,084,155。
另外的适合的多核苷酸包括对杀有害生物(例如杀昆虫)多肽进行编码的那些。这些多肽可以按足以控制例如昆虫有害生物的量(即，昆虫控制量)进行生产。在实施例中，所述多肽是鳞翅目活性的、鞘翅目活性的、半翅目活性的和/或双翅目活性的多肽，或其任何组合。应当认识到在植物中对控制昆虫或其他有害生物的杀有害生物多肽的生产量可以变化，这取决于栽培品种、有害生物的类型、环境因素等。有用于另外的昆虫或其他有害生物抗性的多核苷酸包括例如编码芽孢杆菌属(Bacillus)生物中鉴定到的毒素的那些。已经克隆了包含编码来自几个亚种的苏云金芽孢杆菌(Bt)Cry蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，并且已经发现这些重组克隆对鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫幼虫是有毒的。此类Bt杀昆虫蛋白的实例包括如下Cry蛋白，如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1Ea、Cry1Fa、Cry3A、Cry9A、Cry9B、Cry9C、二元毒素Cry34/35、以及经修饰的Cry蛋白(包括Cry3Bb1、mCry3A、eCry3.1Ab)等，连同营养期杀昆虫蛋白如Vip1、Vip2、Vip3等，以及前述Bt杀昆虫蛋白的任何组合。Bt来源的蛋白质的完整清单可以在万维网在苏塞克斯大学(University of Sussex)维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名法数据库中找到(还参见，Crickmore et al.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813[Crickmore等人(1998)微生物分子生物学综述，62：807-813])。
在实施例中，另外的多肽是衍生自非Bt来源的杀昆虫多肽，包括但不限于：α淀粉酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、几丁质酶、凝集素、工程化抗体或抗体片段、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属物种(如嗜线虫致病杆菌(X.nematophila)或伯氏致病杆菌(X.bovienii))杀昆虫蛋白、发光杆菌属物种(如发光杆菌(P.luminescens)或P.asymobiotica)杀昆虫蛋白、短芽胞杆菌属物种(如侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporous))杀昆虫蛋白、赖氨酸芽胞杆菌属物种(Lysinibacillus spp.)(如球形赖氨酸芽孢杆菌(L.Sphearicus))杀昆虫蛋白、色杆菌属物种(如C.subtsugae或C.piscinae)杀昆虫蛋白、耶尔森菌属物种(如耶尔森噬虫霉(Y.entomophaga))杀昆虫蛋白、类芽孢杆菌属物种(如丙型类芽孢杆菌属(P.propylaea))杀昆虫蛋白、梭菌属物种(如双酶梭菌(C.bifermentans))杀昆虫蛋白、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)(如荧光假单胞菌(P.fluorescens)杀昆虫蛋白和木质素。
还包括基于RNA干扰(RNAi)的杀昆虫性状。与本发明一起使用的双链RNA(dsRNA)分子包括但不限于抑制靶标有害生物(例如昆虫)基因的那些。在实施例中，所述dsRNA靶向鳞翅目、鞘翅目、半翅目或双翅目昆虫有害生物中的基因，或前述的任何组合。如在此使用的词语“基因抑制”当一起考虑时旨在是指用于减少作为基因转录为mRNA和该mRNA的后续翻译的结果而产生的蛋白质的水平的任何熟知的方法。基因抑制还旨在意指减少从基因或编码序列表达蛋白质，包括转录后基因抑制和转录抑制。
转录后基因抑制由从靶向抑制的基因或编码序列转录的mRNA的全部或其一部分与用于抑制的相应双链RNA之间的同源性介导，并且是指在细胞中可供被核糖体结合使用的可获得的mRNA的量的实质且可测量的减少。经转录的RNA可以处于正义方向而发挥作用，称为共抑制，处于反义方向而发挥作用，称为反义抑制，或在两个方向上产生dsRNA而发挥作用，称为RNA干扰(RNAi)。转录抑制由细胞中存在作为基因抑制剂的与启动子DNA序列或其补体展示出实质序列同一性而发挥作用的dsRNA介导，称为启动子反式抑制。针对与性状相关联的天然植物基因，基因抑制可以是有效的，例如，以提供具有减少水平的由所述天然基因编码的蛋白质或具有增强或减少水平的受影响代谢物的植物。针对植物有害生物中的靶基因，基因抑制也可以是有效的，这些有害生物可以摄取或接触含有基因抑制剂的植物材料，这些基因抑制剂专门设计用于阻抑或抑制一种或多种同源或互补序列在该有害生物的细胞中的表达。靶向抑制的此类基因可以编码必需蛋白质，其预测功能选自下组，该组由以下组成：肌肉形成、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、消化酶合成、细胞膜电势的维持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、外激素(pheromone)合成、外激素感测、触角形成、翼形成、腿形成、发育和分化、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸以及凋亡。
在实施例中，dsRNA包括但不限于靶向液泡ATP合酶、β-微管蛋白、26S蛋白酶体亚基p28蛋白、EF1α48D、肌钙蛋白I、四次穿膜蛋白、γ-衣被蛋白、β-衣被蛋白和/或保幼激素环氧化物水解酶的dsRNA。在实施例中，多核苷酸编码DvSnf7 dsRNA(例如，在玉米事件MON87411中)。
在一些实施例中，本发明的杀昆虫蛋白和另外的昆虫控制剂针对相同的靶昆虫。
适合在植物中生产的多肽进一步包括改善或通过其他方式促进收获的植物或植物部分转化成为商业上有用的产品(包括例如增加的或改变的碳水化合物含量或分布、改善的发酵特性、增加的油含量、增加的蛋白质含量、改善的消化率、以及增加的营养成分含量(例如，增加的植物甾醇含量、增加的生育酚含量、增加的甾烷醇含量或增加的维生素含量))的那些。目的多肽还包括，例如在收获的作物中导致或促成不需要的成分(例如植酸、或降解糖的酶类)的含量降低的那些。“导致(resulting in)”或“促成(contributing to)”是指这种目的多肽可以直接或间接地促成目的性状的存在(例如，通过异源纤维素酶的使用来增加纤维素降解)。
在一些实施例中，多肽促成了食品或饲料的改进的可消化度。木聚糖酶是半纤维素分解酶，这些酶改进了植物细胞壁的分解，这导致动物更好地利用这些植物营养素。这导致了改进的生长率和饲料转化。同样，可以减小含有木聚糖的饲料的粘度。在植物细胞内异源产生木聚糖酶也可以促进木质纤维素转化成工业加工中的可发酵糖。
来自真菌和细菌微生物的众多木聚糖酶已经得到鉴别和表征(参见例如，美国专利号5,437,992；Coughlin等人,(1993),“Proceedings of the Second TRICEL Symposiumon Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases”[“里氏木霉纤维素酶和其他水解酶的第二TRICEL研讨会论文集”]，埃斯波(Espoo)；Souminen和Reinikainen编著,(1993)生物技术和工业发酵研究基金会(Foundation for Biotechnical and IndustrialFermentation Research)8:125-135；美国专利公开号2005/0208178；以及PCT公开号WO03/16654)。特别地，在里氏木霉(T.reesei)中已经鉴别出三种特异性木聚糖酶(XYL-I、XYL-II、和XYL-III)(Tenkanen等人,(1992),Enzyme Microb.Technol.[酶与微生物技术]14:566；Torronen等人,(1992),Bio/Technology[生物/技术]10:1461；以及Xu等人,(1998),Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物与生物技术]49:718)。
在其他实施例中，对于本发明有用的多肽可以是多糖降解酶。产生这样一种酶的本发明的植物对于产生例如用于生物加工的发酵原料会是有用的。在一些实施例中、可用于发酵过程的酶包括α淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、颗粒淀粉水解酶以及其他葡糖淀粉酶。
多糖降解酶包括：淀粉降解酶类，例如，α-淀粉酶类(EC 3.2.1.1)、葡萄糖醛酸酶类(E.C.3.2.1.131)；外-1,4-α-D葡聚糖酶类，例如淀粉糖化酶类以及葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)、β-淀粉酶类(EC 3.2.1.2)、α-糖苷酶类(EC 3.2.1.20)、以及其他外-淀粉酶类；淀粉脱支酶类，例如a)异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、以及类似物；b)纤维素酶类，例如外-1,4-3-纤维素二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、外-1,3-β-D-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)、β-糖苷酶(EC 3.2.1.21)；c)L-阿拉伯糖酶类(arabinases)，例如内-1,5-α-L-阿拉伯糖酶(EC 3.2.1.99)、α-阿拉伯糖苷酶类(EC 3.2.1.55)以及类似物；d)半乳聚糖酶类(galactanases)，例如内-1,4-β-D-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、内-1,3-β-D-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)以及类似物；e)甘露聚糖酶类(mannanases)，例如内-1,4-β-D-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)以及类似物；f)木聚糖酶类，例如内-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、1,3-β-D-木聚糖酶、以及类似物；以及g)其他酶类，例如α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)、果聚糖酶(EC 3.2.1.65)、菊粉酶(EC 3.2.1.7)、以及类似物。在一个实施例中，所述α-淀粉酶是描述于美国专利号8,093,453中的合成α-淀粉酶Amy797E。
可以与本发明一起使用的另外的酶包括蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括但不限于从曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、毛霉属(Mucor)和根霉属(Rhizopus)，如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)和米黑毛霉(M.miehei)获得的那些。在一些实施例中，本发明的多肽可以是纤维二糖水解酶(CBH)(EC3.2.1.91)。在一个实施例中，该纤维二糖水解酶可以是CBH1或CBH2。
与本发明一起使用的其他酶包括但不限于半纤维素酶，如甘露聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)；木质素酶；脂肪酶(例如，E.C.3.1.1.3)、葡糖氧化酶、果胶酶、木聚糖酶、转葡糖苷酶、α1,6葡糖苷酶(例如，E.C.3.2.1.20)；酯酶，如阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)和乙酰基木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)；以及角质酶(例如，E.C.3.1.1.74)。
在实施例中，本发明的核酸可进一步包含载体，基本上由其组成或由其组成。
在实施例中，本发明的多核苷酸和表达盒包含在载体中。用于在植物和其他生物的转化中使用的载体在本领域是熟知的。一般类别的载体的非限制性实例包括质粒、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、福斯质粒、噬菌体、人工染色体或病毒载体。在实施例中，所述载体是植物载体，例如用于植物转化。在实施例中，所述载体是细菌载体，例如用于细菌转化。适用于植物、细菌和其他生物的载体是本领域已知的。
转基因植物、植物部分、植物细胞、种子。
本发明还涵盖了如下转基因非人类宿主细胞，所述转基因非人类宿主细胞包含本发明的多核苷酸、核酸分子、表达盒、载体或多肽。转基因非人类宿主细胞可以包括但不限于植物细胞(包括单子叶植物细胞和/或双子叶植物细胞)、酵母细胞、细菌细胞或昆虫细胞。因此，在一些实施例中，本发明提供了选自以下属的细菌细胞：芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、梭菌属(Clostridium)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、发光杆菌属(Photorhabdus)、巴斯德氏芽菌属(Pasteuria)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、农杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)或产碱杆菌属(Alcaligenes)。因此，例如，作为生物昆虫控制剂，本发明的杀昆虫蛋白可以通过在细菌细胞中表达编码本发明的杀昆虫蛋白的多核苷酸而产生。例如，在一些实施例中，提供了包含编码本发明的杀昆虫蛋白的多核苷酸的苏云金芽孢杆菌细胞。
在实施例中，所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。在另外的实施例中，所述双子叶植物细胞是大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、芸苔属作物细胞、棉花细胞、糖用甜菜细胞或烟草细胞。在另外的实施例中，所述单子叶植物细胞是大麦细胞、玉蜀黍细胞、燕麦细胞、水稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞或小麦细胞。在实施例中，本发明提供了多个双子叶植物细胞或单子叶植物细胞，这些细胞包含表达本发明的杀昆虫蛋白的多核苷酸。在实施例中，将所述多个细胞并列以形成质外体并且使其在自然光照中生长。在实施方案中，转基因植物细胞是不繁殖的和/或不能再生整个植物。
在本发明的实施例中，在高等生物(例如，植物)中表达本发明的杀昆虫蛋白。在这种情况下，表达有效量的杀昆虫蛋白的转基因植物保护自身免受植物有害生物如昆虫有害生物的伤害。当昆虫开始摄食这样一种转基因植物时，它摄取了所表达的杀昆虫蛋白。这可以妨碍昆虫进一步咬食植物组织或者甚至可以伤害或杀死昆虫。在实施例中，本发明的多核苷酸被插入表达盒中，然后所述表达盒被稳定地整合到植物的基因组中。在其他实施例中，该多核苷酸被包括在非致病性自我复制病毒中。
在本发明的一些实施例中，包含本发明的核酸分子或多肽的转基因植物细胞是植物部分、植物器官或植物培养物(各自如在此描述的)的细胞，包括但不限于根、叶、种子、花、果实、花粉细胞、器官或植物培养物等，或愈伤组织细胞或培养物。
根据本发明的转基因植物或植物细胞可以是单子叶植物或双子叶植物或植物细胞，并且包括但不限于玉米(玉蜀黍)、大豆、水稻、小麦、大麦、黑麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、糖用甜菜、棉花、甘蔗、油菜、苜蓿、烟草、花生、蔬菜(包括甘薯、豆类、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、西兰花、芜菁、胡萝卜、茄子、黄瓜、萝卜、菠菜、马铃薯、番茄、芦笋、洋葱、大蒜、瓜类、胡椒、芹菜、南瓜、西葫芦、绿皮西葫芦等)、水果(包括苹果、梨、榅桲、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉等)和特种植物或植物细胞(如拟南芥)，或者木本植物或植物细胞(如针叶树和/或落叶树)。在实施例中，本发明的植物或植物细胞是作物植物或植物细胞，如玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、糖用甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜植物或植物细胞等。
本发明进一步提供了本发明的转基因植物的一部分。任选地，所述植物部分包含本发明的杀昆虫蛋白和/或编码其的核酸。
本发明进一步提供了本发明的转基因植物的种子或产生本发明的转基因植物的种子。任选地，所述种子包含本发明的杀昆虫蛋白和/或编码其的核酸。
本发明的另外的实施例包括从本发明的转基因植物、植物部分或种子产生的收获产物，连同从所述收获产物产生的加工产物。收获产物可以是如在此描述的全株或任何植物部分。因此，在一些实施例中，收获产物的非限制性实例包括种子、果实、花或其部分(例如，花药、柱头等)、叶、茎等。在其他实施例中，加工产物包括但不限于由收获的本发明的种子或其他植物部分产生的细粉、粗粉、油、淀粉、谷物等。任选地，所述收获产物或加工产物包含本发明的杀昆虫蛋白和/或编码其的核酸。
在其他实施例中，本发明提供了来自本发明的转基因植物、植物部分的提取物，任选地其中所述提取物包含本发明的杀昆虫蛋白和/或编码其的核酸。可以根据本领域熟知的程序制备来自植物或植物部分的提取物(参见，de la Torre等人,Food,Agric.Environ.[食品农业与环境]2(1):84-89(2004)；Guidet,Nucleic Acids Res.[核酸研究]22(9):1772-1773(1994)；Lipton等人,Food Agric.Immun.[食品农业通讯]12:153-164(2000))。
本发明的杀昆虫蛋白可以作为昆虫控制剂在植物部分、植物细胞、植物器官、种子、收获产物、加工产物或提取物等中起作用。换言之，所述杀昆虫蛋白可以继续执行它在转基因植物中具有的杀昆虫功能。所述核酸可以起到表达所述杀昆虫蛋白的作用。作为编码本发明的杀昆虫蛋白的替代方案，所述核酸可用于鉴定本发明的转基因植物部分、植物细胞、植物器官、种子、收获产物、加工产物或提取物。
在实施例中，本发明的转基因植物、植物部分、植物细胞、植物器官或种子对于本发明的多核苷酸或表达盒是半合子的。在实施例中，本发明的转基因植物、植物部分、植物细胞、植物器官或种子对于本发明的多核苷酸或表达盒是纯合的。
在实施例中，如与不包含编码本发明杀昆虫蛋白的核酸的适合的对照相比，转基因植物、植物部分、植物细胞、植物器官、种子、收获产物、加工产物或提取物对一种或多种昆虫有害生物(例如鞘翅目有害生物，例如玉米根虫，例如WCRW)具有增加的抗性。
植物转化。
用于转化植物的程序在本领域中是熟知且常规的并且普遍描述于文献中。用于植物转化的方法的非限制性实例包括通过以下的转化：细菌介导的核酸递送(例如，经由农杆菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸须晶介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米粒子介导的转化、超声处理、渗入、PEG介导的核酸吸收、连同使得核酸引入到植物细胞中的任何其他电学的、化学的、物理的(机械的)或生物的机制，包括其任何组合。对于本领域已知的不同植物转化方法的一般指导包括以下文献：Miki等人(“Procedures for Introducing Foreign DNAinto Plants”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology[植物分子生物学与生物技术方法中的“用于将外来DNA引入植物中的程序”],Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑,CRC出版公司(CRC Press,Inc.),波卡拉顿(Boca Raton),1993,第67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.[细胞与分子生物学快报]7:849-858(2002))。
对于农杆菌介导的转化，二元载体或携带至少一个T-DNA边界序列的载体通常是适合的，而对于直接基因转移(例如，微粒轰击等)，任何载体都是适合的，并且可以使用仅含有目的构建体的线性DNA。在直接基因转移的情况下，可以使用以单个DNA物种的转化或共转化(Schocher等人,Biotechnology[生物技术]4:1093-1096(1986))。对于直接基因转移以及农杆菌介导的转移二者，转化通常(但不是必需的)用如下选择性标记进行，所述选择性标记可以是正向选择(例如，磷甘露糖异构酶)，提供对抗生素(例如，卡那霉素、潮霉素或甲氨蝶呤)或除草剂(例如，草甘膦或草丁膦)的抗性。然而，选择性标记的选择对于本发明并不是至关重要的。
农杆菌介导的转化是用于转化植物的常用方法，因为它的高转化效率以及因为它与许多不同物种的广泛实用性。农杆菌介导的转化典型地涉及将携带目的外来DNA的二元载体转移至适当的农杆菌菌株，这可能取决于由宿主农杆菌菌株或者在共同存在的Ti质粒上或染色体地携带的vir基因的互补体(Uknes等人,(1993),Plant Cell[植物细胞]5:159-169)。将该重组二元载体转移至农杆菌可以使用携带该重组二元载体的大肠杆菌、辅助大肠杆菌菌株(该辅助菌株携带能够将该重组二元载体移动到靶标农杆菌菌株中的质粒)通过三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将所述重组二元载体转移至农杆菌中(
Figure BDA0002432322630000891
和Willmitzer,(1988)Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:9877)。
可以使用农杆菌转化双子叶植物以及单子叶植物。用于农杆菌介导的水稻转化方法包括熟知的水稻转化方法，如任何以下文献中描述的那些：欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta[植物]199:612-617,1996)；Chan等人(Plant Mol Biol[植物分子生物学]22(3):491-506,1993)，Hiei等人(Plant J[植物杂志]6(2):271-282,1994)，将这些披露通过引用结合在此，其引用程度如同完全阐明一样。在玉米转化的情况下，优选方法是如Ishida等人(Nat.Biotechnol[自然生物技术]14(6):745-50,1996)或Frame等人(Plant Physiol[植物生理学]129(1):13-22,2002)中所描述的，将这些披露通过引用结合在此，其引用程度如同完全阐明一样。所述方法例如在B.Jenes等人,Techniques for GeneTransfer[基因转移技术]，在：Transgenic Plants[转基因植物],第1卷,Engineering andUtilization[工程化以及利用]中，S.D.Kung和R.Wu编著,学术出版社(1993)128-143以及在Potrykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.[植物生理学年评和植物分子生物学]42(1991)205-225)中进一步描述。有待表达的核酸或构建体优选地克隆至适合于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体例如pBin19中(Bevan等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究]12(1984)8711)。然后，能够以已知的方式使用由这种载体转化的农杆菌来转化植物，如用作模型的植物像拟南芥或作物植物如烟草植物，方法是例如通过将捣碎的叶或切碎的叶浸没于农杆菌溶液中，并且然后将其在适合的培养基中培养。例如，借助于根癌农杆菌来转化植物由Hagen和Willmitzer描述于Nucl.Acid Res.[核酸研究](1988)16,9877中或尤其自以下文献已知：F.F.White,Vectors for Gene Transfer inHigher Plants；in Transgenic Plants[用于高等植物中的基因转移的载体],第1卷,Engineering and Utilization[工程化以及利用],编辑S.D.Kung和R.Wu,学术出版社(Academic Press),1993,第15-38页。
通过重组农杆菌进行的植物转化通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域熟知的方法。在携带位于这些二元质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上对转化的组织进行再生。
如先前所讨论的，另一种用于转化植物、植物部分和植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性或生物活性的粒子。参见例如，美国专利号4,945,050；5,036,006和5,100,792。通常，这种方法涉及在有效于穿透该细胞的外表面并提供掺入在其内部中的条件下在植物细胞处推进惰性或生物活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有目的核酸的载体包被这些粒子而将该载体引入该细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被该载体围绕以使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物活性的粒子(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自含有一种或多种被试图引入的核酸)推进到植物组织中。
在其他实施例中，本发明的多核苷酸可以被直接转化进质体基因组中。质体转化的主要优点在于质体通常能够表达细菌基因而无需实质性的修饰，而且质体能够在单个启动子的控制下表达多个开放阅读框。在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申请号WO 95/16783中，以及在McBride等人,(1994),Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91,7301-7305中广泛描述了质体转化技术。基本的叶绿体转化技术涉及将位于选择性标记侧翼的经克隆的质体DNA区连同目的基因一起引入适合的靶组织中，这是例如使用生物射弹(biolistic)或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)来进行的。这些1至1.5kb的侧翼区(被命名为靶向序列)促进了与质体基因组的同源重组，并且因而允许置换或修饰原质体(plastome)的特定区域。最初，可以将叶绿体16S rRNA和rps12基因(赋予针对大观霉素或链霉素的抗性)的点突变用作供转化用的选择性标记(Svab,Z.、Hajdukiewicz,P.和Maliga,P.,(1990),Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87,8526-8530)；Staub,J.M.和Maliga,P.,(1992),Plant Cell[植物细胞]4,39-45)。在这些标记之间克隆位点的存在允许建立质体靶向载体用于外来基因的引入(Staub,J.M.和Maliga,P.(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]12,601-606)。转化频率的实质性增加可以是通过用显性选择性标记(细菌aadA基因，其编码了大观霉素-解毒酶氨基糖苷-3'-腺苷酰转移酶)来置换这些隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因(Svab,Z.和Maliga,P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90,913-917)。之前，这种标记已经被成功地用于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)这种绿藻的质体基因组的高频率转化(戈尔德施密特-克莱蒙特(Goldschmidt-Clermont,M.)(1991)《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)19:4083-4089)。有用于质体转化的其他选择性标记在本领域是已知的，并且被包括在本发明的范围之内。典型地，转化之后需要大约15-20个细胞分裂循环以便达到同质状态。质体表达(其中基因通过同源重组被插入到在每个植物细胞中存在的所有数千个环状质体基因组的拷贝中)利用了超过核表达的基因的庞大的拷贝数目的优点，以便允许能够很容易超过总的可溶性植物蛋白的10％的表达水平。在一个实施例中，可以将本发明的多核苷酸插入质体靶向载体中并转化进所希望的植物宿主的质体基因组中。因此，可以获得与含有本发明的核苷酸序列的质体基因组同型的植物，这些植物能够高表达该多核苷酸。
选择转化的转基因植物、植物细胞或植物组织培养物的方法在本领域中是常规的，并且可以用于在此提供的本发明的方法中。例如，本发明的重组载体还可以包括包含用于选择性标记的核苷酸序列的表达盒，该选择性标记可以用于选择转化的植物、植物部分或植物细胞。
此外，如本领域中所熟知的，完整的转基因植物可以使用多种已知技术中的任何技术从转化的植物细胞、植物组织培养物或培养的原生质体再生而来。在以下文献中描述了从植物细胞、植物组织培养物或培养的原生质体进行的植物再生：例如，Evans等人(Handbook of Plant Cell Cultures[植物细胞培养物手册],第1卷,麦克米兰出版公司(MacMilan Publishing Co.),纽约(1983))；以及Vasil I.R.(编辑)(Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants[植物的细胞培养和体细胞遗传学],学术出版社,奥兰多,第I卷(1984)和第II卷(1986))。
另外，工程化进以上所述的本发明的转基因种子和植物、植物部分或植物细胞中的遗传特性可以通过有性生殖或营养生长来传递，并且因此可以在子代植物中维持并传代。通常，维持和传代利用了被开发以适合特定目的(如收获、播种或耕作)的已知农业方法。
因此，可以按本领域熟知的任何数目的方法(如上所述的)将多核苷酸引入该植物、植物部分或植物细胞中。因此，没有依赖用于将一种或多种多核苷酸引入植物中的特定方法，相反可以使用允许将该一种或多种多核苷酸稳定地整合到该植物的基因组中的任何方法。在有待引入一种以上多核苷酸的情况下，这些对应的多核苷酸可以作为单一核酸分子的一部分、或者作为分开的核酸分子而进行组装，并且可以位于相同的或不同的核酸分子上。因此，可以在单个转化事件中、在分开的转化事件中、或者例如作为育种方案的一部分在植物中，将这些多核苷酸引入目的细胞中。
一旦所希望的多核苷酸已经被转化进特定的植物物种中，便可以使用传统的育种技术将其在该物种中繁殖或将其转移到相同物种的其他品种中，特别是包括商业品种。此外，可以使用基因组编辑技术原位修饰Axmi205转基因以并入本发明的修饰。
杀有害生物组合物。
在实施例中，本发明提供了杀昆虫组合物，所述杀昆虫组合物包含农业上可接受的运载体中的本发明的杀昆虫蛋白。如在此使用的“农业上可接受的运载体”可以包括与活性蛋白组合以促进它应用至植物或其部分或者在植物或其部分中应用的天然或合成的有机或无机材料。农业上可接受的运载体的实例包括但不限于粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体以及溶液。农业上可接受的运载体进一步包括但不限于可用于农业配制品中的惰性组分、分散剂、表面活性剂、佐剂、增粘剂、粘着剂、粘合剂或其组合。此类组合物可以按使杀有害生物蛋白或其他有害生物控制剂与这些有害生物接触的任何方式施用。因此，可以将这些组合物施用于植物或植物部分的表面，包括种子、叶、花、茎、块茎、根等。在其他实施例中，在植物体内产生本发明的杀昆虫蛋白的植物是被表达的杀昆虫蛋白的农业上可接受的运载体。在实施例中，本发明的组合物和农业上可接受的运载体不包括转基因植物。
在另外的实施例中，所述杀昆虫组合物包含细菌细胞或本发明的转基因细菌细胞，其中所述细菌细胞或转基因细菌细胞产生本发明的杀昆虫蛋白。这样一种杀昆虫组合物可以通过脱水、冷冻干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩苏云金芽孢杆菌(Bt)的培养物(包括转基因Bt培养物)而制备。在实施例中，本发明的组合物可包含按重量计至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少99％的本发明的多肽。在另外的实施例中，所述组合物包含按重量计从约1％至约99％的本发明的杀昆虫蛋白。
本发明的杀昆虫蛋白可以与其他有害生物控制剂(例如，昆虫控制剂)组合使用，以增加靶有害生物(例如昆虫)谱和/或用于预防或管理昆虫抗性。此外，本发明的杀昆虫蛋白与杀昆虫剂(其具有不同的作用方式和/或靶向昆虫肠中不同的受体)相组合进行使用对于预防和/或管理昆虫抗性而言具有特定的功用。在实施例中，本发明的杀昆虫蛋白与靶向相同昆虫有害生物的另一种昆虫控制剂组合使用。
因此，在一些实施例中，本发明提供了控制一种或多种植物有害生物(例如昆虫有害生物，如鳞翅目昆虫有害生物、鞘翅目昆虫有害生物、半翅目昆虫有害生物和/或双翅目昆虫有害生物)的组合物，其中所述组合物包含第一有害生物控制剂(其是本发明的杀昆虫蛋白)和不同于所述第一有害生物控制剂的至少第二有害生物控制剂(例如，昆虫控制剂)。在其他实施例中，组合物是用于局部施用至植物的配制品。在仍其他实施例中，组合物是转基因植物。在另外的实施例中，组合物是局部施用至转基因植物的配制品的组合。在一些实施例中，当所述转基因植物包含所述第二有害生物控制剂时，所述配制品包含所述第一有害生物控制剂(其是本发明的杀昆虫蛋白)。在其他实施例中，当所述转基因植物包含所述第一有害生物控制剂(其是本发明的杀昆虫蛋白)时，所述配制品包含所述第二有害生物控制剂。
在一些实施例中，所述第二有害生物控制剂可以是以下中的一种或多种：化学杀有害生物剂(如杀昆虫剂)、Bt杀昆虫蛋白、和/或非Bt杀有害生物剂，包括但不限于致病杆菌属杀昆虫蛋白、发光杆菌属杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)杀昆虫蛋白、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)杀昆虫蛋白、蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸类型两者)、凝集素、α-淀粉酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶或双链RNA(dsRNA)分子。
在其他实施例中，所述第二有害生物控制剂是一种或多种化学杀有害生物剂，其任选地是种子包衣。化学杀有害生物剂的非限制性实例包括拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、新烟碱、神经元钠通道阻断剂、杀昆虫大环内酯、γ-氨基丁酸(GABA)拮抗剂、杀昆虫脲以及保幼激素模拟物。在其他实施例中，所述化学杀有害生物剂是以下中的一种或多种：阿巴美丁、乙酰甲胺磷、啶虫脒、磺胺螨酯(amidoflumet)(S-1955)、除虫菌素(avermectin)、印楝素、甲基谷硫磷、联苯菊酯、联苯肼酯(binfenazate)、噻嗪酮、克百威、溴虫腈、定虫隆、毒死蜱、甲基毒死蜱、环虫酰肼、噻虫胺、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、三氯氟氰菊酯、λ-三氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、溴氰菊酯、杀螨隆、二嗪磷、除虫脲、乐果、苯虫醚、甲氨基阿维菌素、硫丹、高氰戊菊酯、乙虫腈、苯硫威(fenothicarb)、苯氧威、甲氰菊酯、唑螨酯、氰戊菊酯、氟虫腈、氟啶虫酰胺、氟氰戊菊酯、τ-氟胺氰菊酯、嘧虫胺(UR-50701)、氟虫脲、地虫硫磷、氯虫酰肼、氟铃脲、吡虫啉、茚虫威、异柳磷、虱螨脲、马拉硫磷、聚乙醛、甲胺磷、杀扑磷、灭多威、烯虫酯、甲氧氯、久效磷、甲氧虫酰肼、噻虫醛(nithiazin)、双苯氟脲、多氟脲(XDE-007)、杀线威、对硫磷、甲基对硫磷、氯菊酯、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜威、丙溴磷、吡蚜酮、啶虫丙醚、蚊蝇醚、鱼藤酮、多杀菌素、螺甲螨酯(spiromesifin)(BSN 2060)、硫丙磷、虫酰肼、伏虫隆、七氟菊酯、特丁硫磷、杀虫畏、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威、杀虫双(thiosultap-sodium)、四溴菊酯、敌百虫和杀铃脲、涕灭威、杀线威、苯线磷、双甲脒、灭螨猛、乙酯杀螨醇、三环锡、三氯杀螨醇、除螨灵、依杀螨、喹螨醚、苯丁锡、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、克螨特、哒螨灵以及吡螨胺。在仍其他实施例中，所述化学杀有害生物剂选自以下中的一种或多种：氯氰菊酯、三氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯和β-氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、氰戊菊酯、四溴菊酯、苯硫威、灭多威、杀线威、硫双威、噻虫胺、吡虫啉、噻虫啉、茚虫威、多杀菌素、阿巴美丁、除虫菌素(avermectin)、甲氨基阿维菌素、硫丹、乙虫腈、氟虫腈、氟虫脲、杀铃脲、苯虫醚、蚊蝇醚、吡蚜酮以及双甲脒。
在另外的实施例中，所述第二有害生物控制剂可以是任何数目的Bt杀昆虫蛋白中的一种或多种，包括但不限于Cry蛋白、营养期杀昆虫蛋白(VIP)以及任何前述杀昆虫蛋白的杀昆虫嵌合体。在其他实施例中，所述第二有害生物控制剂是选自以下的Cry蛋白：Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ad、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ai、Cry1Aj、Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Bc、Cry1Bd、Cry1Be、Cry1Bf、Cry1Bg、Cry1Bh、Cry1Bi、Cry1Ca、Cry1Cb、Cry1Da、Cry1Db、Cry1Dc、Cry1Dd、Cry1Ea、Cry1Eb、Cry1Fa、Cry1Fb、Cry1Ga、Cry1Gb、Cry1Gc、Cry1Ha、Cry1Hb、Cry1Hc、Cry1Ia、Cry1Ib、Cry1Ic、Cry1Id、Cry1Ie、Cry1If、Cry1Ig、Cry1Ja、Cry1Jb、Cry1Jc、Cry1Jd、Cry1Ka、Cry1La、Cry1Ma、Cry1Na、Cry1Nb、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry2Ac、Cry2Ad、Cry2Ae、Cry2Af、Cry2Ag、Cry2Ah、Cry2Ai、Cry2Aj、Cry2Ak,Cry2Al、Cry2Ba、Cry3Aa、Cry3Ba、Cry3Bb、Cry3Ca、Cry4Aa、Cry4Ba、Cry4Ca、Cry4Cb、Cry4Cc、Cry5Aa、Cry5Ab、Cry5Ac、Cry5Ad、Cry5Ba、Cry5Ca、Cry5Da、Cry5Ea、Cry6Aa、Cry6Ba、Cry7Aa、Cry7Ab、Cry7Ac、Cry7Ba、Cry7Bb、Cry7Ca、Cry7Cb、Cry7Da、Cry7Ea、Cry7Fa、Cry7Fb、Cry7Ga、Cry7Gb、Cry7Gc、Cry7Gd、Cry7Ha、Cry7Ia、Cry7Ja、Cry7Ka、Cry7Kb、Cry7La、Cry8Aa、Cry8Ab、Cry8Ac、Cry8Ad、Cry8Ba、Cry8Bb、Cry8Bc、Cry8Ca、Cry8Da、Cry8Db、Cry8Ea、Cry8Fa、Cry8Ga、Cry8Ha、Cry8Ia、Cry8Ib、Cry8Ja、Cry8Ka、Cry8Kb、Cry8La、Cry8Ma、Cry8Na、Cry8Pa、Cry8Qa、Cry8Ra、Cry8Sa、Cry8Ta、Cry9Aa、Cry9Ba、Cry9Bb、Cry9Ca、Cry9Da、Cry9Db、Cry9Dc、Cry9Ea、Cry9Eb、Cry9Ec、Cry9Ed、Cry9Ee、Cry9Fa、Cry9Ga、Cry10Aa、Cry11Aa、Cry11Ba、Cry11Bb、Cry12Aa,Cry13Aa、Cry14Aa、Cry14Ab、Cry15Aa、Cry16Aa、Cry17Aa、Cry18Aa、Cry18Ba、Cry18Ca、Cry19Aa、Cry19Ba、Cry19Ca、Cry20Aa、Cry20Ba、Cry21Aa、Cry21Ba、Cry21Ca、Cry21Da、Cry21Ea、Cry21Fa、Cry21Ga、Cry21Ha、Cry22Aa、Cry22Ab、Cry22Ba、Cry22Bb、Cry23Aa、Cry24Aa、Cry24Ba、Cry24Ca、Cry25Aa、Cry26Aa、Cry27Aa、Cry28Aa、Cry29Aa、Cry29Ba、Cry30Aa、Cry30Ba、Cry30Ca、Cry30Da、Cry30Db、Cry30Ea、Cry30Fa、Cry30Ga,Cry31Aa、Cry31Ab、Cry31Ac、Cry31Ad、Cry32Aa、Cry32Ab、Cry32Ba、Cry32Ca、Cry32Cb、Cry32Da、Cry32Ea、Cry32Eb、Cry32Fa、Cry32Ga、Cry32Ha、Cry32Hb、Cry32Ia、Cry32Ja、Cry32Ka、Cry32La、Cry32Ma、Cry32Mb、Cry32Na、Cry32Oa、Cry32Pa、Cry32Qa、Cry32Ra、Cry32Sa、Cry32Ta、Cry32Ua、Cry33Aa、Cry34Aa、Cry34Ab、Cry34Ac、Cry34Ba、Cry35Aa、Cry35Ab、Cry35Ac、Cry35Ba、Cry36Aa、Cry37Aa、Cry38Aa、Cry39Aa、Cry40Aa、Cry40Ba、Cry40Ca、Cry40Da、Cry41Aa、Cry41Ab、Cry41Ba、Cry42Aa、Cry43Aa、Cry43Ba、Cry43Ca、Cry43Cb、Cry43Cc、Cry44Aa、Cry45Aa、Cry46Aa、Cry46Ab、Cry47Aa、Cry48Aa、Cry48Ab、Cry49Aa、Cry49Ab、Cry50Aa、Cry50Ba、Cry51Aa、Cry52Aa、Cry52Ba、Cry53Aa、Cry53Ab、Cry54Aa、Cry54Ab、Cry54Ba、Cry55Aa、Cry56Aa、Cry57Aa、Cry57Ab、Cry58Aa、Cry59Aa、Cry59Ba、Cry60Aa、Cry60Ba、Cry61Aa、Cry62Aa、Cry63Aa、Cry64Aa、Cry65Aa、Cry66Aa、Cry67Aa、Cry68Aa、Cry69Aa、Cry69Ab、Cry70Aa、Cry70Ba、Cry70Bb、Cry71Aa、Cry72Aa、Cry73Aa，或前述的任何组合。在实施例中，Cry蛋白是mCry3A蛋白(例如在玉米事件MIR604中)、eCry3.1Ab蛋白(例如在玉米事件5307中)，Cry3Bb1蛋白(例如在玉米事件MON88017中)和/或Cry34/35Ab1二元蛋白(例如在玉米事件DAS-59122中)。
在另外的实施例中，所述第二有害生物控制剂是选自以下的一种或多种Vip3营养期杀昆虫蛋白：Vip3Aa1、Vip3Aa2、Vip3Aa3、Vip3Aa4、Vip3Aa5、Vip3Aa6、Vip3Aa7、Vip3Aa8、Vip3Aa9、Vip3Aa10、Vip3Aa11、Vip3Aa12、Vip3Aa13、Vip3Aa14、Vip3Aa15、Vip3Aa16、Vip3Aa17、Vip3Aa18、Vip3Aa19、Vip3Aa20、Vip3Aa21、Vip3Aa22、Vip3Aa2、Vip3Aa24、Vip3Aa25、Vip3Aa26、Vip3Aa27、Vip3Aa28、Vip3Aa29、Vip3Aa30、Vip3Aa31、Vip3Aa32、Vip3Aa33、Vip3Aa34、Vip3Aa35、Vip3Aa36、Vip3Aa37、Vip3Aa38、Vip3Aa39、Vip3Aa40、Vip3Aa41、Vip3Aa42、Vip3Aa43、Vip3Aa44、Vip3Ab1、Vip3Ab2、Vip3Ac1、Vip3Ad1、Vip3Ad2、Vip3Ae1、Vip3Af1、Vip3Af2、Vip3Af3、Vip3Ag1、Vip3Ag2、Vip3Ag3 HM117633、Vip3Ag4、Vip3Ag5、Vip3Ah1、Vip3Ba1、Vip3Ba2、Vip3Bb1、Vip3Bb2、Vip3Bb3，或前述的任何组合。在实施例中，所述Vip3蛋白是Vip3Aa(美国专利号6,137,033)，例如，如由玉米事件MIR162(美国专利号8,232,456；美国专利号8,455,720；和美国专利号8,618,272)所代表的。
在实施例中，所述第二有害生物控制剂可以衍生自除苏云金芽孢杆菌外的来源。例如，所述第二有害生物控制剂可以是α淀粉酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、几丁质酶、凝集素、工程化抗体或抗体片段、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属物种(如嗜线虫致病杆菌(X.nematophila)或伯氏致病杆菌(X.bovienii))杀昆虫蛋白、发光杆菌属物种(如发光杆菌(P.luminescens)或P.asymobiotica)杀昆虫蛋白、短芽胞杆菌属物种(如侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporous))杀昆虫蛋白、赖氨酸芽胞杆菌属物种(Lysinibacillus spp.)(如球形赖氨酸芽孢杆菌(L.Sphearicus))杀昆虫蛋白、色杆菌属物种(如C.subtsugae或C.piscinae)杀昆虫蛋白、耶尔森菌属物种(如耶尔森噬虫霉(Y.entomophaga))杀昆虫蛋白、类芽孢杆菌属物种(如丙型类芽孢杆菌属(P.propylaea))杀昆虫蛋白、梭菌属物种(如双酶梭菌(C.bifermentans))杀昆虫蛋白、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)(如荧光假单胞菌(P.fluorescens)杀昆虫蛋白和木质素。在其他实施例中，所述第二试剂可以是至少一种衍生自杀昆虫毒素复合物(Tc)(所述复合物来自发光杆菌属、异短杆菌属(Xenorhabus)、沙雷氏菌属或耶尔森菌属)的杀昆虫蛋白。在其他实施例中，所述杀昆虫蛋白可以是衍生自杀昆虫细菌(如发光杆菌属物种)的ADP-核糖基转移酶。在其他实施例中，所述杀昆虫蛋白可以是非Bt VIP蛋白(如来自蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的VIP1和/或VIP2)。在仍其他实施例中，所述杀昆虫蛋白可以是衍生自杀昆虫细菌(如来自侧孢短芽孢杆菌的ISP1A和ISP2A或来自球形芽孢杆菌的BinA和BinB)的二元毒素。在仍其他实施例中，所述杀昆虫蛋白可以被工程化或可以是前述杀昆虫蛋白中的任一个的杂交体或嵌合体。
在一些实施例中，所述第二杀有害生物剂可以是非蛋白质的(例如干扰RNA分子，如dsRNA)，其可以被转基因表达或作为组合物的一部分应用(例如，使用局部方法)。干扰RNA分子典型地包含针对靶基因的至少一种RNA片段、间隔序列、和与第一RNA片段互补的第二RNA片段，从而可以形成双链RNA结构。当生物识别双链RNA(dsRNA)分子并水解它们时，RNA干扰(RNAi)发生。所得的水解产物是约19-24个核苷酸长度的小RNA片段，这些小RNA片段被称为小干扰RNA(siRNA)。然后这些siRNA扩散或被携带至整个生物，包括越过细胞膜，在那里它们与mRNA(或其他的RNA)杂交并且导致RNA的水解。干扰RNA由RNA干扰沉默复合体(RISC)识别，RNA的效应链(或“引导链”)位于所述复合体中。此引导链充当双链体序列的识别和破坏模板。每次siRNA与其互补RNA靶标杂交，此过程都被重复，有效防止那些mRNA被翻译，并且因此“沉默”mRNA自其中转录的特异性基因的表达。本领域已知干扰RNA可用于昆虫控制(参见例如，公开物WO 2013/192256，其通过引用并入本文)。设计用于昆虫控制的干扰RNA产生非天然存在的双链RNA，其利用昆虫中的天然RNAi途径来触发靶基因的下调，这可能导致停止摄食和/或生长并可能导致昆虫有害生物死亡。干扰RNA分子可赋予针对与本发明的蛋白质相同的靶标有害生物的昆虫抗性，或可靶向不同的有害生物。靶标昆虫植物有害生物可以通过咀嚼、吸吮或刺穿来摄食。本领域已知干扰RNA可用于昆虫控制。在实施例中，可用于昆虫控制的dsRNA描述于2016年8月5日提交的美国临时申请号62/371,259、62/371,261或62/371,262中。在实施例中，可用于昆虫控制的dsRNA描述于美国专利号7,812,219；9,238,822；9,340,797；8,946,510或美国专利公开US2014/0275208中。在实施例中，可用于昆虫控制的dsRNA描述于美国专利申请系列号12/868,994；14/207,313或14/207318中。在实施例中，dsRNA靶向编码液泡ATP合酶、β-微管蛋白、26S蛋白酶体亚基p28蛋白、EF1α48D、肌钙蛋白I、四次穿膜蛋白、γ-衣被蛋白、β-衣被蛋白和/或保幼激素环氧化物水解酶的基因。在实施例中，dsRNA是DvSnf7 dsRNA(例如，在玉米事件MON87411中)。
在实施例中，干扰RNA赋予针对非昆虫植物有害生物(如线虫有害生物或病毒有害生物)的抗性。
在仍另外的实施例中，在转基因植物中共表达所述第一昆虫控制剂(其是本发明的杀昆虫蛋白)和所述第二有害生物控制剂。可以通过将植物遗传工程化以含有并表达编码昆虫控制剂的核酸序列来实现一种以上杀有害生物成分在相同转基因植物中的共表达。例如，一种以上杀有害生物剂在相同转基因植物中的共表达可以通过制备单一的重组载体(其在分子叠加(molecular stack)中包含一种以上杀有害生物剂的编码序列)并对植物进行遗传工程化以在所述转基因植物中含有并表达所有的杀有害生物剂而实现。此类分子叠加还可以通过使用微型染色体进行制备，如在例如美国专利7,235,716中所述的。可替代地，可以将植物(亲本1)遗传工程化，用于本发明的杀昆虫蛋白的表达。可以将第二植物(亲本2)遗传工程化，用于第二有害生物控制剂的表达。通过将亲本1与亲本2杂交，获得了表达来自亲本1和亲本2二者的昆虫控制剂的子代植物(即育种叠加)。
在其他实施例中，本发明提供了对植物有害生物侵染有抗性的叠加性转基因植物，所述植物包含编码用于在靶标有害生物中抑制必需基因的dsRNA的核酸(例如DNA)序列和编码针对所述靶标有害生物展示出杀昆虫活性的本发明的杀昆虫蛋白的核酸例如(DNA)序列。已经报道，dsRNA对抗某些鳞翅目有害生物是无效的(Rajagopol等人,2002,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:468-494)，这可能是由于中肠中的高pH使得dsRNA不稳定。因此，在一些靶标有害生物是鳞翅目有害生物的实施例中，本发明的杀昆虫蛋白可以起作用以瞬时降低中肠pH，这用于稳定共摄取的dsRNA，从而使得所述dsRNA有效沉默靶基因。
包含和/或表达本发明的杀昆虫蛋白的转基因植物或种子还可以用杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣进行处理，如美国专利号5,849,320和5,876,739中所述的。在实施例中，在本发明的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣以及转基因植物或种子针对相同靶标昆虫例如鞘翅目有害生物(例如玉米根虫，例如WCRW)具有活性的情况下，所述组合(i)在用于进一步增强本发明的组合物针对所述靶标昆虫的活性的方法中和/或(ii)在用于通过提供针对所述靶标昆虫的又另一种作用机制而预防对本发明的组合物产生抗性的方法中是有用的。因此，在实施例中，本发明提供了增强鞘翅目昆虫群体的控制的方法，所述方法包括提供本发明的转基因植物或种子并且向所述植物或种子施用本发明的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣。
即使在杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣针对不同昆虫具有活性的情况下，所述杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣对于扩展昆虫控制的范围是有用的，例如通过将针对鳞翅目昆虫具有活性的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣添加到本发明的转基因种子(在一些实施例中针对鞘翅目昆虫具有活性)中，所产生的包被的转基因种子控制鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物两者。
制备和使用杀昆虫蛋白、核酸和转基因植物的方法。
本发明还涵盖产生抗昆虫(例如，抗鞘翅目昆虫)的转基因植物的方法。在代表性实施例中，方法包括：向植物中引入包含编码本发明的杀昆虫蛋白的核苷酸序列(包括与在此明确披露的多肽基本上相同的毒素片段和修饰形式)的本发明的多核苷酸、表达盒或载体，其中所述核苷酸序列被表达于所述植物中以产生本发明的杀昆虫蛋白，从而赋予所述植物对昆虫有害生物的抗性，并且产生抗昆虫的转基因植物(例如，如与适合的对照植物相比，如不包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体和/或不表达本发明多肽的植物)。
在实施例中，向所述植物中引入本发明的多核苷酸、表达盒或载体的方法包含首先用多核苷酸、表达盒或载体转化植物细胞并由此再生转基因植物，其中所述转基因植物包含多核苷酸、表达盒或载体，并表达本发明的杀昆虫蛋白。
可替代地或另外地，所述引入步骤可以包含使包含多核苷酸、表达盒或载体的第一植物与第二植物(例如，与第一植物不同的植物，例如不包含多核苷酸、表达盒或载体的植物)杂交，并且任选地，产生包含多核苷酸、表达盒或载体并表达本发明的杀昆虫蛋白的子代植物，从而导致对至少一种昆虫有害生物的增加的抗性。因此，本发明的转基因植物涵盖是转化事件的直接结果的植物及其(任一代)子代，所述植物及其子代包含多核苷酸、表达盒或载体并任选地表达杀昆虫蛋白，导致对至少一种昆虫有害生物的增加的抗性。
作为另一选择，基因组编辑技术可用于原位修饰编码天然Axmi205蛋白(SEQ IDNO:1)或变体Axmi205(例如，描述于Athenix公司的WO2013/016617和先锋良种公司的US2014/0274885 A1中的Axmi205变体)的转基因，以并入本发明的突变。为了说明，在包含编码天然Axmi205蛋白或其变体的异源多核苷酸序列的植物中，可以使用各种基因组编辑技术(例如锌指核酸酶(ZNF)、转录激活子样效应核酸酶(TALENS)、大范围核酸酶和成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR))(美国专利号8,697,359；Ran等人)，通过靶向的DNA编辑来进一步原位修饰天然或变体Axmi205的编码序列。CRISPR系统可用于在靶序列处引入特定的核苷酸修饰。工程化的CRISPR-Cas9系统，最初在细菌中发现，其中几种不同的CRISPR级联起着先天免疫系统和天然防御机制的作用，可被编程以靶向特定的遗传密码延伸并在精确位置处进行切割。在过去几年中，这些功能已被利用并用作基因组编辑工具，使得研究人员能够永久性地修饰植物细胞中的基因。
因此，本发明涵盖用于产生编码本发明的经修饰的Axmi205蛋白的多核苷酸的方法，其中所述方法包括使用基因编辑技术(例如CRISPR)以并入根据本发明的一个或多个突变来修饰植物基因组，所述植物基因组包含编码天然Axmi205蛋白(例如，SEQ ID NO:1)或Axmi205变体的多核苷酸。在实施例中，所述方法涉及经由单指导RNA的20nt指导序列将Cas9靶向至特定的基因组基因座(在这种情况下是编码天然Axmi205蛋白的多核苷酸或编码Axmi205变体的多核苷酸)。在线CRISPRO设计工具可以鉴定适合的靶位点(万维网上的tools.genome-engineering.org；Ran等人Genome engineering using the CRISPR-Cas9system[使用CRISPR-Cas9系统的基因组工程]Nature Protocols I[自然实验手册I]；2281-2308(2013))。用于根据本发明的诱变/基因组编辑方法的靶植物是其中已引入编码天然Axmi205蛋白或Axmi205突变蛋白的多核苷酸的任何单子叶植物或双子叶植物(各自如本文进一步描述)。
任选地，产生对昆虫有害生物(例如鞘翅目昆虫有害生物，例如WCRW)具有增加的抗性的转基因植物的方法进一步包括获得一个或多个世代的后代植物，其中所述后代植物包含多核苷酸、核酸分子或载体，并且对鞘翅目昆虫有害生物具有增强的抗性。
本发明进一步提供了鉴定本发明的转基因植物的方法，所述方法包括检测植物(或由其衍生的植物细胞、植物部分等)中的本发明的多核苷酸、表达盒、载体或杀昆虫蛋白的存在，从而基于本发明的多核苷酸、表达盒、载体或杀昆虫蛋白的存在将所述植物鉴定为本发明的转基因植物。
本发明进一步提供了产生对至少一种昆虫有害生物(例如，至少一种鞘翅目有害生物)具有增加的抗性的转基因植物的方法，所述方法包括：种植包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体的种子，并且使来自所述种子的转基因植物生长，其中所述转基因植物包含多核苷酸、表达盒或载体并产生杀昆虫蛋白。
在实施例中，通过本发明的方法产生的转基因植物包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体。在实施例中，通过本发明的方法产生的转基因植物包含本发明的杀昆虫蛋白，并且任选地对至少一种昆虫有害生物具有增加的抗性。
产生在此描述的转基因植物的方法任选地包括从所述转基因植物中收获种子的另外的步骤，其中所述种子包含多核苷酸、表达盒或载体并产生杀昆虫蛋白。任选地，所述种子产生另外的转基因植物，所述转基因植物包含多核苷酸、表达盒或载体并产生杀昆虫蛋白，从而对至少一种昆虫有害生物具有增加的抗性。
本发明进一步提供了通过本发明的方法生产的转基因植物的植物部分、植物细胞、植物器官、植物培养物、种子、植物提取物、收获产物和加工产物。
作为另外的方面，本发明还提供了产生种子的方法，所述方法包括：提供包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体的转基因植物，并且收获来自所述转基因植物的种子，其中所述种子包含多核苷酸、表达盒、载体并产生杀昆虫蛋白。任选地，所述种子产生另外的转基因植物，所述转基因植物包含多核苷酸、表达盒或载体并产生杀昆虫蛋白，从而对至少一种昆虫有害生物具有增加的抗性。在代表性实施例中，提供所述转基因植物的步骤包括种植产生所述转基因植物的种子。
本发明进一步提供了产生杂交植物种子的方法，所述方法包括:使第一近交植物(其是包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体并任选地表达本发明的杀昆虫蛋白的转基因植物)与不同近交植物(例如，不包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体的近交植物)杂交，并且允许形成杂交种子。任选地，所述方法进一步包括收获杂交种子。在实施例中，所述杂交种子包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体，并且在实施例中可进一步包含本发明的杀昆虫蛋白并任选地对昆虫有害生物具有增加的抗性。在实施例中，所述杂交种子产生转基因植物，所述转基因植物包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体，表达本发明的杀昆虫蛋白，以及对至少一种昆虫有害生物具有增加的抗性。
在一些实施例中，本发明的转基因植物控制至少一种鞘翅目昆虫有害生物(如在此描述的)。在实施例中，转基因植物控制玉米根虫昆虫有害生物或群体(例如，WCRW昆虫有害生物或群体)，所述玉米根虫昆虫有害生物或群体对以下有抗性：mCry3A蛋白(例如，在玉米事件MIR604中)、eCry3.1Ab蛋白(例如，在玉米事件5307中)、Cry3Bb1蛋白(例如，在玉米事件MON88017中)、Cry34/35Ab1二元蛋白(例如，在玉米事件DAS-59122中)和/或RNAi性状(例如DvSnf7 dsRNA(例如，在玉米事件MON87411中)。
在其他实施例中，控制至少一种昆虫有害生物(例如，至少一种鞘翅目昆虫有害生物，例如玉米根虫，例如，WCRW)的方法包括提供本发明的杀昆虫蛋白。在实施例中，所述方法包括向昆虫有害生物或其环境递送(例如，经口递送)有效量的本发明的杀昆虫蛋白。通常，为了有效，所述多肽被昆虫经口摄取。然而，所述杀昆虫蛋白可以按许多公认的方式被递送至昆虫。用于将蛋白质经口递送至昆虫的方式包括但不限于将该蛋白质提供于(1)转基因植物中，其中该昆虫取食(摄取)该转基因植物的一个或多个部分，由此摄取在该转基因植物中表达的多肽；(2)一种或多种配制的蛋白质组合物中，它们可以被施用至或掺入例如昆虫生长介质中；(3)一种或多种蛋白质组合物中，它们可以被施用至表面，例如喷雾在植物部分的表面，然后当该昆虫取食喷雾的一个或多个植物部分时组合物被该昆虫摄取；(4)饵基；或(5)任何其他本领域公认的蛋白质递送系统。因此，可以使用经口递送至昆虫的任何方法来递送本发明的毒性蛋白。在一些特定实施例中，将本发明的杀昆虫蛋白经口递送至昆虫，其中所述昆虫摄取本发明的转基因植物的一个或多个部分。
在其他实施例中，将本发明的杀昆虫蛋白经口递送至昆虫，其中所述昆虫摄取用包含本发明的杀昆虫蛋白的组合物喷雾的植物的一个或多个部分。可以使用本领域技术人员已知的用于将化合物、组合物、配制品等应用于植物表面的任何方法将本发明的组合物递送至植物表面。递送至或接触植物或其部分的一些非限制性实例包括喷雾、撒粉、喷洒、分散、下雾、雾化、撒播、浸泡、土壤注入、土壤掺入、浸透(例如，根、土壤处理)、浸渍、灌注、涂覆、叶或茎渗透、侧施或种子处理等及其组合。用于使植物或其部分与一种或多种化合物、一种或多种组合物或一种或多种配制品接触的这些和其他程序是本领域技术人员熟知的。
在另外的实施例中，本发明提供控制鞘翅目昆虫有害生物的方法，所述鞘翅目昆虫有害生物对以下有抗性：mCry3A蛋白(例如，在玉米事件MIR604中)、eCry3.1Ab蛋白(例如，在玉米事件5307中)、Cry3Bb1蛋白(例如，在玉米事件MON88017中)、Cry34/35Ab1二元蛋白(例如，在玉米事件DAS-59122中)和/或RNAi性状(例如DvSnf7 dsRNA(例如，在玉米事件MON87411中)，所述方法包括将有效量的本发明的杀昆虫蛋白或组合物递送至鞘翅目昆虫或其环境。在代表性的实施例中，抗性昆虫有害生物是抗性玉米根虫(例如，WCRW)昆虫有害生物或群体。
在其他实施例中，本发明提供方法，所述方法减少或防止靶鞘翅目昆虫有害生物群体中对表达于转基因植物中的以下项的抗性的发展：mCry3A蛋白(例如，在玉米事件MIR604中)、eCry3.1Ab蛋白(例如，在玉米事件5307中)、Cry3Bb1蛋白(例如，在玉米事件MON88017中)、Cry34/35Ab1二元蛋白(例如，在玉米事件DAS-59122中)和/或RNAi性状(例如DvSnf7 dsRNA(例如，在玉米事件MON87411中)，所述方法包含将转基因植物递送至靶鞘翅目昆虫群体，所述转基因植物包含多核苷酸(所述多核苷酸包含编码mCry3A蛋白的核苷酸序列、编码eCry3.1Ab蛋白的核苷酸序列、编码Cry3Bb1蛋白的核苷酸序列、编码Cry34/35Ab1二元蛋白的一个或多个核苷酸序列和/或编码RNAi性状的核苷酸序列)；和表达本发明的杀昆虫蛋白的本发明的多核苷酸、表达盒或载体。在一些实施例中，靶鞘翅目昆虫有害生物是玉米根虫(例如WCRW)。根据前述实施例，所述转基因植物可包含两种或更多种杀昆虫性状的育种叠加，两种或更多种杀昆虫性状的分子堆叠，或两者的组合。
在一些实施例中，本发明涵盖为农民提供控制昆虫有害生物(例如，鞘翅目有害生物，例如玉米根虫，例如WCRW)的手段的方法，所述方法包括向农民供应或出售植物材料如种子，所述植物材料包含能够表达本发明的杀昆虫蛋白的多核苷酸、表达盒、载体。在实施例中，所述植物材料包含本发明的杀昆虫蛋白，并且任选地对至少一种昆虫有害生物具有增加的抗性。在实施例中，所述植物材料是种子，并且从所述种子生长的植物包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体，表达本发明的杀昆虫蛋白，以及对至少一种昆虫有害生物具有增加的抗性。
除了提供组合物之外，本发明还提供了产生对鞘翅目有害生物有毒的杀昆虫蛋白的方法。这样一种方法包括在转基因非人类宿主细胞产生对鞘翅目有害生物有毒的杀昆虫蛋白的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体(其表达本发明的杀昆虫蛋白)。在一些实施例中，所述转基因非人类宿主细胞是植物细胞。在一些其他实施例中，所述植物细胞是玉蜀黍细胞。在其他实施例中，所述植物细胞或玉蜀黍细胞在其下生长的条件包括自然光照。在其他实施例中，所述转基因非人类宿主细胞是细菌细胞。在仍其他实施例中，所述转基因非人类宿主细胞是酵母细胞。
在实施例中，本发明的方法提供了对至少一种鞘翅目、鳞翅目、双翅目、半翅目、直翅目和/或缨翅目昆虫有害生物(每种均在本文中更详细地描述)的控制。在实施例中，杀昆虫蛋白对鞘翅目有害生物具有活性，所述鞘翅目有害生物包括但不限于：根萤叶甲属物种(Diabrotica spp.)(例如，巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)；玉米根萤叶甲指名亚种(西方玉米根虫)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)；黄瓜条根萤叶甲(D.balteata)(带状黄瓜甲虫(banded cucumber beetle))；黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctataundecimpunctata)(西方斑点黄瓜甲虫(western spotted cucumber beetle))；斯格尼根萤叶甲(D.significata)(3斑叶甲(3-spotted leaf beetle))；南美叶甲(D.speciosa)(菊花甲虫(chrysanthemum beetle))；墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)；班尼根萤叶甲(D.beniensis)；克里斯塔根萤叶甲(D.cristata)；科威根萤叶甲(D.curvipustulata)；双斑根萤叶甲(D.dissimilis)；华丽根萤叶甲(D.elegantula)；伊墨根萤叶甲(D.emorsitans)；禾本科根萤叶甲(D.graminea)；伊斯帕尼根萤叶甲(D.hispanolae)；莱米妮根萤叶甲(D.lemniscata)；赭腿根萤叶甲(D.linsleyi)；米勒根萤叶甲(D.milleri)；钱币形根萤叶甲(D.nummularis)；扇叶根萤叶甲(D.occlusa)；普拉根萤叶甲(D.porracea)；蜗牛根萤叶甲(D.scutellata)；胫骨根萤叶甲(D.tibialis)；三线根萤叶甲(D.trifasciata)以及微绿根萤叶甲(D.Viridula)；)；及其任何组合)，瘦跗叶甲属物种(例如，马铃薯叶甲；科罗拉多马铃薯甲虫)；叶甲属物种(例如，黑杨叶甲；黑杨叶甲虫)；咪小蠹属物种(例如，咖啡果小蠹；咖啡豆钻孔虫)；米象属物种(例如，玉米象；玉蜀黍象)；毛跳甲属物种(例如烟草跳甲[烟草跳
Figure BDA0002432322630001081
]和黄瓜跳甲[马铃薯跳甲]；条跳甲属物种(例如十字花科条跳甲[十字花科植物跳甲]和西方黑跳甲[西方黑色跳甲]；花象属物种(例如墨西哥棉铃象[棉铃象鼻虫]和胡椒花象[胡椒茎象甲]；针虫属物种(例如，金针虫；铁线虫)；梳爪叩头虫属物种(例如，普通梳爪叩头甲；铁线虫)；荚象甲属物种(例如甘蓝荚象甲；甘蓝心皮象鼻虫)；条跳甲属物种(例如十字花科条跳甲；十字花科植物跳甲)；Aeolus属物种(例如，A.mellillus；铁线虫)；Aeolus属物种(例如，A.mancus；小麦铁线虫)；砂铁线属物种(例如砂铁线虫；沙子铁线虫)；尖隐喙象属物种(例如玉米谷象[玉蜀黍谷象]、梯牧草谷象[梯牧草谷象虫]、牧草长喙象[早熟禾谷象]和南方玉米长喙象[南方玉米谷象])；鳃角金龟属物种(例如，蛴螬)；凹胫跳甲属物种(例如，玉米铜色跳甲；玉米跳甲)；弧丽金龟属物种(例如，日本弧丽金龟；日本金龟子)；食植瓢虫属物种(例如，墨西哥豆瓢虫；墨西哥豆甲虫)；萤叶甲属物种(例如，菜豆莹叶甲；豆叶甲)；豆芫菁属物种(例如，边缘豆芫菁和芫菁；斑蝥)；以及前述的任何组合。
在实施例中，本发明的方法提供了对玉米根虫(例如WCRW)昆虫有害生物或群体的控制，所述玉米根虫(例如WCRW)昆虫有害生物或群体对以下有抗性：mCry3A蛋白(例如，在玉米事件MIR604中)、eCry3.1Ab蛋白(例如，在玉米事件5307中)、Cry3Bb1蛋白(例如，在玉米事件MON88017中)、Cry34/35Ab1二元蛋白(例如，在玉米事件DAS-59122中)和/或RNAi性状(例如DvSnf7 dsRNA(例如，在玉蜀黍事件MON87411中)。
本发明还提供了本发明的杀昆虫蛋白、核酸、转基因植物、植物部分、种子和杀昆虫组合物的用途，例如，用于控制昆虫有害生物(如鞘翅目有害生物)(如在此描述的)。
在实施例中，本发明提供了使用本发明的多核苷酸、表达盒、载体或宿主细胞以产生用于控制昆虫有害生物(例如鞘翅目昆虫有害生物)的杀昆虫组合物的方法。
在实施例中，本发明提供了使用本发明的多核苷酸、表达盒或载体以产生转基因种子的方法，其中所述转基因种子生长成对昆虫有害生物具有增加的抗性的转基因植物。
作为另一个方面，本发明还考虑了本发明的转基因植物用于产生转基因种子(其任选地是杂交种子)的用途。
在实施例中，本发明提供方法，所述方法使用本发明的杀昆虫蛋白、多核苷酸、表达盒、载体、转基因植物或杀昆虫组合物来防止靶鞘翅目昆虫有害生物群体中针对以下的抗性的发展：mCry3A蛋白(例如，在玉米事件MIR604中)、eCry3.1Ab蛋白(例如，在玉米事件5307中)、Cry3Bb1蛋白(例如，在玉米事件MON88017中)、Cry34/35Ab1二元蛋白(例如，在玉米事件DAS-59122中)和/或RNAi性状(例如DvSnf7 dsRNA(例如，玉蜀黍事件MON87411))。
现在将参考以下实例描述本发明。本领域技术人员应理解的是，这些实例并非将权利要求书的范围限于本发明，反而旨在成为某些实施例的示例。本发明的其他实施例可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行实践，其范围是由本披露和所附权利要求书限定的。
实例1
突变体选择
Axmi205是杀昆虫蛋白，其分离自Chromobacterium piscinae，并且先前描述于US8,575,425 B2和Sampson等人(Discovery of a novel insecticidal protein fromChromobacterium piscinae,with activity against Western Corn Rootworm,Diabrotica virgifera virgifera[来自Chromobacterium piscinae的具有抗西部玉米根虫玉米根萤叶甲指名亚种活性的新型杀虫蛋白的发现],J.Invertebrate Pathology[无脊椎动物病理学杂志]142:34-43(2016))。另请参见GenBank登录号AML23188.1。天然Axmi205的氨基酸和cDNA序列分别以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2提供。
先前的实验已确定，Axmi205的天然氨基酸序列(SEQ ID NO:1)在标准的模拟胃液(SGF)测定中显示出延迟的消化，在30分钟的时间段内仍存在未消化的23kDa条带，致使从监管的角度来看这种毒素不那么理想。SGF测定用于估算哺乳动物肠道中蛋白质的消化率，是评估任何新的杀昆虫蛋白质用于监管部门批准的标准组成。
质谱分析鉴定出23kDa条带由蛋白的整个第二结构域组成，其大约对应于天然Axmi205蛋白(SEQ ID NO:1)的残基303-526。使用已发表的在pH<1.3处的胃蛋白酶切割指南(Keil,B.Specificity of proteolysis[蛋白水解的特异性].施普林格出版社-柏林-海德堡-纽约,第335页.(1992))，预测了天然Axmi205蛋白中可能的胃蛋白酶切割的位点。鉴定出没有预期的胃蛋白酶切割位点的天然Axmi205蛋白的区段，并选择这些区域内的残基用于突变分析，以增加蛋白的蛋白水解切割(例如，被胃蛋白酶切割)，同时保持杀昆虫活性。例如，在一些突变体中，一个或多个疏水氨基酸被取代或插入到天然Axmi205蛋白序列中。在其他情况下，替换半胱氨酸残基以减少形成二硫键的可能性，这可能会打开三级蛋白质结构以促进酶的进入。参见图1。
实例2
天然Axmi205和工程化的Axmi205变体的产生
使用表达载体pEBDuet28A作为所有工程化的Axmi205(eAxmi205)突变体生产的起始分子，所述表达载体pEBDuet28A含有天然Axmi205 cDNA序列(SEQ ID NO:2)以及烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶可去除的N末端10xHis标签。合成了包含Axmi205突变的DNA片段，随后将其克隆到Axmi205源载体的EcoRI-SalI位点。
表达eAxmi205变体的载体被转化进入大肠杆菌BL21*(DE3)(INVITROGENTM)用于产生蛋白质。简而言之，100mL Terrific液体培养基培养物在37℃下生长直至对数中期(OD600＝0.6-1.0)，此后使用0.1mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导蛋白质表达，并随后转移至18℃过夜。通过离心收集细胞，并使用机械裂解法裂解。澄清细菌裂解液，然后通过His GRAVITRAPTM(GE医疗健康基团(GE Healthcare))镍柱，以分离目的蛋白。通过洗涤除去未结合的蛋白质，然后使用咪唑洗脱eAxmi205变体。合并含蛋白质的级分，并在4℃下针对1xPBS透析过夜。测定蛋白质浓度，并且将蛋白质等分并在液氮中速冻以在-80℃下长期储存。
实例3
模拟胃液T10方案
作为初步筛选，测试了纯化的eAxmi205突变体在暴露于模拟胃液(SGF)10分钟(T10)后的消化率。简而言之，将测试蛋白归一化至通用浓度(通常约1mg/mL)，以允许以胃蛋白酶与测试蛋白的适当比例(大约1111U胃蛋白酶/mL，在于G-Con溶液{2mg/mL NaCl，pH1.2}中)产生单一SGF原液。在37℃下，通过将30μL的测试蛋白质添加到270μL的SGF中来启动消化反应。在10分钟(T10)时，将100μL的测试蛋白-SGF反应混合物去除，然后通过将测试混合物等分试样添加到100μL的预热(95℃)终止溶液中终止反应，该终止液由65％的Tricine上样缓冲液(Bio-Rad 2x Tricine上样缓冲液，含10％β-巯基乙醇)和35％的500mMNaHCO3 pH 11.0组成。通过将10μL的测试蛋白质添加到100μL的预热(95℃)终止液和95uLSGF中，得出时间零(T0)数据点。将所有样品在95℃下加热5分钟，并然后储存在冰上直至SDS-PAGE分析。
对于SDS-PAGE，在标准蛋白质凝胶电泳之前，将每个反应30μL加载到10％-20％Tris-tricine肽凝胶(伯乐公司(Bio-Rad))上。电泳20分钟后，立即用40％的甲醇:10％乙酸混合物固定Tris-tricine凝胶。然后将凝胶在室温下用GELCODETM蓝色蛋白质染色剂(赛默飞世尔科学公司(ThermoFisher Scientific))染色1小时。1小时后，用蒸馏水将凝胶脱色过夜。
在SDS-PAGE上，天然Axmi205在T10处保留约23kDa的条带。鉴定出突变体，其中在T10处未观察到大于大约3-4kDa的未消化片段，这表明与天然Axmi205蛋白相比，这些eAxmi205突变体可能表现出被胃蛋白酶更完全的消化，并进行选择用于进一步评估杀昆虫生物活性和更完整的SGF消化谱。
实例4
eAxmi205对西方玉米根虫的生物活性
然后对在初步SGF测试(实例2)中在10分钟时显示出丧失约23kDa条带的eAxmi205突变体在人工饮食生物测定中抵抗西方玉米根虫(WCRW；玉米根萤叶甲指名亚种)幼虫的生物活性进行评估。
将每个突变体的纯化蛋白样品归一化至0.4mg/mL(最终200μg/mL)，并在1.5mL离心管中与等体积的加热的人工昆虫饮食(生物服务公司(Bioserv,Inc.)，新泽西州弗朗西敦(Frenchtown NJ))混合，然后应用至小皮氏培养皿。饮食样品混合物冷却并固化后，将12只WCRW新孵化的幼虫添加到每个培养皿中，然后将培养皿密封。将皮氏培养皿在温度、光照和相对湿度方面保持在环境条件下。蛋白存储缓冲液(即，PBS)用作阴性对照，而天然Axmi205用作阳性对照。在第3天或第4天评估以及第6天再次评估死亡率。
对WCRW具有生物活性的eAxmi205突变体进行了更完整的SGF消化评估。
实例5
SGF时程测定
对既通过初始SGF T10测试(实例2)又保留了对WCRW的生物活性(实例3)的突变体进行SGF消化的全时程。
总而言之，将固体胃蛋白酶(约3mg，约3640U/mg固体)溶解在1mL G-Con溶液(2mg/mL NaCl，pH 1.2)中，制成胃蛋白酶的浓缩原液。将胃蛋白酶原液在G-Con溶液中稀释至合适的浓度，以制成10U胃蛋白酶/μg蛋白(由最初的测试蛋白原液浓度确定)，以生产用于测定的最终SGF溶液。通过在37℃下将70μL的测试蛋白原液添加到630μL的SGF溶液中，开始消化反应(T0)。通过在1、2、5、10、30和60分钟(即T1、T2、T5、T10、T30和T60)时去除100μL反应混合物并与预热至95℃的100μL终止液(65％Tricine上样缓冲液与(含5％β-巯基乙醇)、35％500mM NaHCO3 pH 11.0)混合来终止反应。对照包括T0对照(10μL测试蛋白+100μL终止溶液+90μL SGF)、SGF对照(在T0和T60处的90μL SGF+10μL缓冲液+100μL终止溶液)、和测试蛋白对照(在T0和T60处的90μL G-Con溶液+10μL测试蛋白+100μL终止溶液)。将反应混合物等分试样加入终止溶液后，将所有样品在95℃加热5分钟，然后保存在冰上直至进行SDS-PAGE分析。
对于SDS-PAGE，在标准蛋白质凝胶电泳之前，将每个反应30μL加载到10％-20％Tris-tricine肽凝胶(伯乐公司(Bio-Rad))上。电泳20分钟后，立即用40％甲醇:10％乙酸的混合物固定Tris-tricine凝胶。然后将凝胶在室温下用GELCODETM蓝色蛋白质染色剂(赛默飞世尔科学公司(ThermoFisher Scientific))染色1小时。1小时后，用蒸馏水将凝胶脱色过夜。
还使用多克隆兔抗Axmi205抗体进行了标准蛋白质分析，以鉴定免疫反应条带。
实例6
eAxmi205突变体的合成、表达和纯化
表1列出了合成和纯化的三十六种eAxmi205突变体。编号为1至30的突变体是取代突变体，编号为31至36的突变体是插入突变体。下表和讨论中指出的eAxmi205突变的氨基酸位置均参考SEQ ID NO:1的天然Axmi205蛋白序列。
表1.eAxmi205突变
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Figure BDA0002432322630001161
如实例2所述表达和纯化每种eAxmi205蛋白，尽管一些蛋白表达水平较低。在这些实验中，无法纯化足够量的eAxmi205突变体#10和#24进行进一步分析；其他三十四种eAxmi205突变蛋白已成功纯化，并在初步SGF消化分析中进行了进一步评估。
实例7
eAxmi205突变体的SGF消化的初步评估
天然eAxmi205蛋白在标准SGF测定中显示不完全消化，在约23kDa处有一条持久条带。按照实例3中所述的方案，对在实例6中表达和纯化的34种eAxmi205突变蛋白进行SGF消化能力的单个10分钟时间点(T10)评估。在10分钟时在23kDa或更低处未显示条带的突变体被认为已“通过”该初步T10评估(数据未显示)，并进行了生物活性评估。
以下eAxmi205突变体被认为“通过”了T10 SGF消化评估：#5、#6、#21、#23、#28、#32、#33、#34、#35和#36。
若干种eAxmi205变体(#8、#29和#30)被评为“未通过/通过”，因为尽管它们显示出比天然Axmi205好得多的消化，但在10分钟时似乎出现了模糊条带。因为这是初步筛选，所以保留了这些Axmi205变体以供进一步评估。
其他eAxmi205突变体“未通过”初步T10 SGF消化，因为在10分钟时在23kDa或更低处存在一个或多个条带，并且未作进一步评估。
实例8
eAxmi205突变蛋白对西方玉米根虫的控制
根据实例4中所述的方案，在人工饮食生物测定中评估了在10分钟时具有可接受的SGF消化的来自实例7的eAxmi205变体(#5、#6、#8、#21、#23、#28、#29、#30、#32、#33、#34、#35和#36)在控制WCRW中的活性。
在人工饮食生物测定中，在第3天或第4天和第6天评估死亡率。天然Axmi205(“Axmi205 wt”)用作阳性对照，而单独的缓冲液用作阴性对照。数据显示在下表2至4中：
Figure BDA0002432322630001181
Figure BDA0002432322630001191
实例9
eAxmi205突变体的SGF消化的时程研究
对eAxmi205突变体#5、#6、#21、#23、#28、#34和#36针对SGF消化进行更详细的时程评估。如实例5所述，在0、1、2、5、10、30和60分钟(即，T0、T1、T2、T5、T10、T30和T60)之后，使用抗天然Axmi205的多克隆兔抗体通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析评估每个突变体的SGF消化。结果总结如下。
eAxmi205#5:
在SDS-PAGE上，在SGF中孵育一分钟后，在零时间(T0)对应于全长Axmi205-5的条带不再可见。1分钟后，出现56kDa、23kDa、4kDa和3kDa片段。在5分钟时看到非常模糊的53kDa条带，并到10分钟时消失。在T30样品中看不到23kDa片段。在SGF中孵育60分钟后，仍然可以看到3kDa和4kDa片段。
蛋白质印迹分析证实了SDS-PAGE的结果。1分钟时不再可见全长Axmi205-5。在T10样品中不再可见56kDa条带，在T30样品中不再可见23kDa片段。没有检测到其他免疫反应性片段。
eAxmi205#6:
在SGF中孵育1分钟后，在零时间(T0)对应于全长Axmi205-6的条带不再可见。在T1时间点，出现56kDa、23kDa、4kDa和3kDa片段。在T5处看到非常模糊的53kDa条带，并到T10时消失。在T10处观察到非常模糊的23kDa条带，并在T30样品中消失。在SGF中孵育60分钟后，仍然可以看到3kDa和4kDa片段。
蛋白质印迹分析证实了SDS-PAGE的结果。1分钟时不再可见全长Axmi205-6。在T10样品中不再可见56kDa条带，在T30样品中可见非常模糊的23kDa片段。没有检测到其他免疫反应性片段。
eAxmi205#21:
在SDS-PAGE上，在SGF中孵育一分钟后，在零时间(T0)对应于全长Axmi205-21的条带不再可见。孵育1分钟后，出现56kDa、23kDa、4kDa和3kDa片段。分别地，在SGF中孵育5分钟和10分钟后，不再可见56kDa和23kDa片段。4kDa和3kDa片段强度随时间推移降低，但是在SGF中孵育60分钟后仍然可见。
蛋白质印迹分析证实了SDS-PAGE的结果。在SGF中孵育一分钟后，全长Axmi205-21不再可见。在SGF中孵育5分钟后，可以看到与56kDa和23kDa片段相对应的非常模糊的条带，其在10分钟后消失。没有检测到其他免疫反应性片段。
eAxmi205#23:
在SDS-PAGE上，在SGF中孵育一分钟后，在零时间(T0)对应于全长Axmi205-23的条带不再可见。孵育1分钟后，出现56kDa、23kDa、4kDa和3kDa片段。在SGF中孵育5分钟后，不再可见56kDa和23kDa片段。4kDa和3kDa片段强度随时间推移降低，但是它们在SGF中孵育60分钟后仍然可见。
蛋白质印迹分析证实了SDS-PAGE的结果。在SGF中孵育一分钟后，全长Axmi205-23不再可见。分别地，在SGF中孵育5分钟和2分钟后，不可见56kDa和23kDa片段。没有检测到其他免疫反应性片段。
eAxmi205#28:
在SDS-PAGE上，在SGF中孵育一分钟后，在零时间(T0)对应于全长Axmi205-28的条带不再可见。在1分钟时，出现56kDa、23kDa、4kDa和3kDa片段。在5分钟时未观察到53kDa和23kDa片段带。在SGF中孵育60分钟后，仍然可以看到3kDa和4kDa片段。
蛋白质印迹分析证实了SDS-PAGE的结果。一分钟时不再可见全长Axmi205-28。在5分钟后不再可见56kDa片段。在2分钟时仍可以看到非常模糊的23kDa条带，但在5分钟时未观察到。没有检测到其他免疫反应性片段。
eAxmi205#34:
在SDS-PAGE上，在SGF中孵育一分钟后，在零时间(T0)对应于全长Axmi205-34的条带不再可见。一分钟时，4kDa和3kDa片段出现，并且在SGF中孵育60分钟后仍然可见。在凝胶上未观察到其他明显的考马斯染色条带。
蛋白质印迹分析证实了SDS-PAGE的结果。SGF消化一分钟后不再可见全长Axmi205-34。没有检测到其他免疫反应性片段。
eAxmi205#36:
在SDS-PAGE上，在SGF中孵育一分钟后(T1)，在零时间(T0)对应于全长Axmi205-36(约59kDa)的条带不再可见。一分钟时，出现了较小的片段(约56kDa)，但在T2时不再观察到。4kDa和3kDa片段在T1出现，并且在SGF中孵育60分钟后仍然可见。在凝胶上未观察到其他明显的考马斯染色条带。
蛋白质印迹分析证实了SDS-PAGE的结果。SGF消化一分钟后不再可见全长Axmi205-34。没有检测到其他免疫反应性片段。
实例10
实例6至9的结果总结
下表5提供了以上实例6至9讨论的结果的总结。图2-10显示了SGF测定结果。
表5.
Figure BDA0002432322630001221
Figure BDA0002432322630001231
实例11
WCRW控制活性的剂量应答
基本上使用实例4中描述的方案，针对天然Axmi205(“Axmi205WT”)和eAxmi205突变体#23、#28和#34，在人工饮食生物测定中进行了控制WCRW的剂量应答研究。在第1天、第4天以及第6天评定死亡率。
每个处理以15个昆虫的两次重复进行。结果在表6中示出：
Figure BDA0002432322630001251
Figure BDA0002432322630001261
出人意料的是，测试的所有3种eAxmi205突变体在控制WCRW方面都与天然Axmi205活性基本相同，同时具有更理想的SGF消化谱。
实例12
其他eAxmi205变体
基于以上表5中提供的信息，本领域技术人员容易产生具有改善的SGF消化谱的其他eAxmi205突变体。突变体可以添加新的胃蛋白酶切割位点，减少二硫键的形成和/或以其他方式修饰和“打开”蛋白质的三级结构以增加酶的进入。
例如，eAxmi205突变体#21具有C482S突变(相对于SEQ ID NO:1的天然Axmi205的参考氨基酸序列)。可替代地，天然存在的或合成的任何其他氨基酸在位置482处被取代。例如，在位置482处的氨基酸取代是具有脂肪族疏水侧链的氨基酸(例如，A、I、L或V)、具有芳香族疏水侧链的氨基酸(例如，F、W或Y)、具有极性中性侧链的氨基酸(例如，N、Q、M或T)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D或E)、具有碱性侧链的氨基酸(例如，R、H或K)、G、或P的取代。在实施例中，取代在位置482处的取代的直接之前和/或直接之后(即，在残基481和482之间和/或在残基482和483之间)导致新的胃蛋白酶切割位点。产生了其他突变体eAxmi205突变体#21F和#21D(C482F，C482D)，并且这些突变的数据包括在表7中。
作为另一个非限制性实例，eAxmi205突变体#23具有C507S突变(相对于SEQ IDNO:1的天然Axmi205的参考氨基酸序列)。可替代地，天然存在的或合成的任何其他氨基酸在位置507处被取代。例如，在位置507处的氨基酸取代是具有脂肪族疏水侧链的氨基酸(例如，A、I、L或V)、具有芳香族疏水侧链的氨基酸(例如，F、W或Y)、具有极性中性侧链的氨基酸(例如，N、Q、M或T)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D或E)、具有碱性侧链的氨基酸(例如，R、H或K)、G、或P的取代。在实施例中，取代在位置507处的取代的直接之前和/或直接之后(即，在残基506和507之间和/或在残基507和508之间)导致新的胃蛋白酶切割位点。产生了其他突变体eAxmi205突变体#23L、#23A、#23F、#23D和#23R(C507L、C507A、C507F、C507D、C507R)，并且这些突变的数据包括在表7中。
作为进一步说明，eAxmi205突变体#28具有两个取代突变：M422S和M423L(相对于SEQ ID NO:1的天然Axmi205的参考氨基酸序列)。可替代地，产生仅具有所述取代之一(即M422S或M423L)的eAxmi205变体。作为另一替代方案，天然存在的或合成的任何其他氨基酸在位置422和/或位置423处被取代。例如，在位置422和/或位置423处的氨基酸取代是具有脂肪族疏水侧链的氨基酸(例如，A、I、L或V)、具有芳香族疏水侧链的氨基酸(例如，F、W或Y)、具有极性中性侧链的氨基酸(例如，N、C、Q、S或T)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D或E)、具有碱性侧链的氨基酸(例如，R、H或K)、G、或P的取代。在实施例中，一个或多个取代直接在残基422之前、在残基422和423之间和/或直接在残基423之后(即，在残基421和422之间、在残基422和423之间和/或在残基423和424之间)导致新的胃蛋白酶切割位点。在实施例中，取代不是位置422和/或位置423处的半胱氨酸(C)。产生了其他突变体eAxmi205突变体#28TF、#28DE、#28KR、#28SE和#28KF(M422T+M423F、M422D+M423E、M422K+M423R、M422S+M423E、M422K+M423F)，并且这些突变的数据包括在表7中。
eAxmi205突变体#34在氨基酸475和476之间(相对于SEQ ID NO:1的天然Axmi205的参考氨基酸序列)具有亮氨酸(L)插入。可替代地，将天然存在的或合成的任何其他氨基酸插入在位置475和476处的氨基酸残基之间。例如，在位置475和476之间的氨基酸插入是具有脂肪族疏水侧链的氨基酸(例如，A、I或V)、具有芳香族疏水侧链的氨基酸(例如，F、W或Y)、具有极性中性侧链的氨基酸(例如，N、C、Q、M、Q、S或T)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D或E)、具有碱性侧链的氨基酸(例如，R、H或K)、G、或P的插入。在实施例中，插入在插入的直接之前和/或直接之后(即，在残基475与插入的氨基酸之间和/或在插入的氨基酸与残基476之间)产生新的胃蛋白酶切割位点。在实施例中，插入的氨基酸不是半胱氨酸(C)。产生了其他突变体eAxmi205突变体#34F、#34D和#34R(475-Phe-476、475-Asp-476、475-Arg-476)，并且这些突变的数据包括在表7中。
eAxmi205突变体#36在氨基酸496和497之间(相对于SEQ ID NO:1的天然Axmi205的参考氨基酸序列)具有亮氨酸(L)插入。可替代地，将天然存在的或合成的任何其他氨基酸插入在位置496和497处的氨基酸残基之间。例如，在位置496和497之间的氨基酸插入是具有脂肪族疏水侧链的氨基酸(例如，A、I或V)、具有芳香族疏水侧链的氨基酸(例如，F、W或Y)、具有极性中性侧链的氨基酸(例如，N、C、Q、M、Q、S或T)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D或E)、具有碱性侧链的氨基酸(例如，R、H或K)、G、或P的插入。在实施例中，插入在插入的直接之前和/或直接之后(即，在残基496与插入的氨基酸之间和/或在插入的氨基酸与残基497之间)产生新的胃蛋白酶切割位点。在实施例中，插入的氨基酸不是半胱氨酸(C)。产生了其他突变体eAxmi205突变体#36F和#36R(496-Phe-497、496-Arg-497)，并且这些突变的数据包括在表7中。
eAxmi205突变体#5和#6分别具有K402F和K402N突变(相对于SEQ ID NO:1的天然Axmi205的参考氨基酸序列)。可替代地，天然存在的或合成的任何其他氨基酸在位置402处被取代。例如，在位置402处的氨基酸取代是具有脂肪族疏水侧链的氨基酸(例如，A、I或V)、具有芳香族疏水侧链的氨基酸(例如，W或Y)、具有极性中性侧链的氨基酸(例如，C、Q、M、Q、S或T)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D或E)、具有碱性侧链的氨基酸(例如，R或H)、G、或P的取代。在实施例中，取代在位置402处的取代的直接之前或直接之后(即，在残基401和402之间或在残基402和403之间)导致新的胃蛋白酶切割位点。产生了另一个突变体eAxmi205突变体#5D(K402D)，并且该突变的数据包括在表7中。
eAxmi205突变体#8具有两个取代突变：K402L和Y404F(相对于SEQ ID NO:1的天然Axmi205的参考氨基酸序列)。可替代地，天然存在的或合成的任何其他氨基酸在位置402和/或404处被取代。例如，在位置402和/或位置404处的氨基酸取代是具有脂肪族疏水侧链的氨基酸(例如，A、I、L或V)、具有芳香族疏水侧链的氨基酸(例如，F、W或Y)、具有极性中性侧链的氨基酸(例如，N、C、M、Q、S或T)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D或E)、具有碱性侧链的氨基酸(例如，R、H或K)、G、或P的取代。在实施例中，一个或多个取代在残基402的直接之前和/或残基404的直接之后(即在残基401和402之间和/或在残基404和405之间)导致新的胃蛋白酶切割位点。在实施例中，取代不是位置402和/或位置404处的半胱氨酸(C)。
作为另外的替代方案，表5或此实例中描述的突变的任何组合均被组合以产生其他eAxmi205变体，例如位置402和404处的突变的组合。
其他eAxmi205变体可以如实例3和/或5中所述评估SGF消化，并且如实例4中所述通过人工饮食生物测定和/或通过在植物中表达来评估杀昆虫活性(如下所述)。
作为另外的替代方案，可以在没有胃蛋白酶切割位点的蛋白质的长区域中进行其他的或可替代的插入。基于突变体#34和#36及其变体的SGF结果，在SEQ ID NO:1的位置469和483之间以及SEQ ID NO:1的位置483和501之间的氨基酸区段中产生了其他突变体。产生了其他突变体，eAxmi205突变体#37F和#37L(471-Phe-472，471-Leu-472)、#38F和#38L(479-Phe-480，479-Leu-480)、以及#39F和#39L(489-Phe-490，489-Leu-490)，并且这些突变的数据包括在表7中。
表7显示了在该实例中如上所列的eAxmi205突变体#5、#21、#23、#28、#34、#36、#37、#38、#39及其变体的数据。如实例3和/或5所述评估这些突变体的SGF消化。从数据可以清楚地看出，在所有情况下，这些位置处的其他突变体均改善了经修饰的Axmi205毒素的消化。这些经修饰的Axmi205毒素显示出被哺乳动物蛋白酶增强的消化率，因此在相同条件下测试时与不包含经修饰的Axmi205毒素相比，剩余的4kDa以上片段的数量更少。60分钟后，四个未通过T10测试的突变体仍应增强消化率。图11-15显示了SGF测定结果。
Figure BDA0002432322630001311
Figure BDA0002432322630001321
可以将上述任何一种突变体彼此组合，以进一步改善消化率。这些结果的关键发现是某些氨基酸区段，即SEQ ID NO:1的位置469和483之间以及SEQ ID NO:1的位置483和501之间的氨基酸区段显得对胃蛋白酶裂解具有强烈影响。在这两个区段的不同位置插入氨基酸导致消化率显著增加，表明它们是胃蛋白酶切割的关键。
实例13
eAxmi205变体在单子叶植物中的表达和活性
产生了适用于农杆菌介导的转化的二元载体构建体。所述二元载体包含玉蜀黍优化的eAxmi205编码序列，所述序列在5’末端可操作地连接至适合于驱动在玉蜀黍植物中表达的启动子，并在3’末端可操作地连接至终止子序列。合适的玉蜀黍密码子优化的序列的实例包括SEQ ID NO:75(eAxmi205#23)，SEQ ID NO:76(eAxmi205#28)和SEQ ID NO:77(eAxmi205#34)。
使用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术将所述二元载体转化到根癌农杆菌中。为了制备用于转化的农杆菌，将细胞在28℃和220rpm下在液体YPC培养基中培养过夜。基本上如在Negrotto等人,2000(Plant Cell Reports[植物细胞通讯]19:798-803)中所说明进行未成熟玉蜀黍胚的农杆菌转化；然而，可以使用本领域中已知的各种方案。
转化、选择和再生后，使用
Figure BDA0002432322630001322
分析针对eAxmi204编码序列的存在对玉蜀黍植株进行测定。还测试了植物中是否存在载体骨架。将对载体骨架阴性并且包含来自二元载体构建体的转基因的一个拷贝的植物转移到温室中，并测试其对WCRW损害的抗性。
实例14
eAxmi205变体在双子叶植物中的表达和活性
大豆的转化(以产生转基因大豆植物)完成如下：使用品种Williams 82的成熟种子靶，通过根癌农杆菌介导的转化，使用基本描述于Hwang等人(WO 08/112044)和Que等人(WO 08/112267)的外植体材料和培养基配方；但是，还可以使用其他各种方案。
转化、选择和再生后，使用
Figure BDA0002432322630001331
分析针对eAxmi204编码序列的存在对大豆植株进行测定。还测试了植物中是否存在载体骨架。将对载体骨架阴性并且包含来自二元载体构建体的转基因的一个拷贝的植物转移至温室，并测试其对豆叶甲(菜豆莹叶甲)的损害的抗性。
实例15
针对抗性玉米根虫的活性
所披露的Axmi205变体可用于控制已经对另一鞘翅目昆虫控制剂(例如，蛋白毒素，化学、微生物和/或RNAi控制剂)产生抗性的鞘翅目昆虫有害生物。Axmi205变体也可以与一种或多种其他鞘翅目昆虫控制剂组合，以延迟或防止鞘翅目昆虫群体中抗性的发展。
在饮食生物测定或植物测定中测试了Axmi205变体(例如#5、#6、#21、#21、#23、#28、#34和/或#36)对玉米根虫(例如WCRW)群体的活性，所述玉米根虫(例如WCRW)群体对以下有抗性：鞘翅目昆虫控制剂，例如mCry3A(例如玉蜀黍事件MIR604；先正达公司(Syngenta))、eCry3.1Ab(例如玉蜀黍事件5307；先正达公司)、Cry3Bb1(例如玉蜀黍事件MON88017；孟山都公司(Monsanto))、Cry34/35Ab1(例如玉蜀黍事件DAS-59122，陶氏益农公司(Dow AgroSciences))或RNAi性状，例如DvSnf7 dsRNA(例如，玉蜀黍事件MON87411；孟山都公司)。
在一个实验中，基本上如上文实例4中所述，在人工饮食生物测定中针对WCRW群体评估了Axmi205突变体#34(SEQ ID NO:69)，所述WCRW群体具有对毒素eCry3.1Ab的抗性。2次重复的结果显示在下表8中。实例12中所述的其他突变体的结果示于表9。
Figure BDA0002432322630001351
Figure BDA0002432322630001361
实例16
eAxmi205与杀昆虫干扰RNA组合
如实例2所述表达和纯化如本文所述的eAxmi205变体。制备针对WCRW中必需靶基因的dsRNA。在非限制性实例中，dsRNA可靶向编码液泡ATP合酶、β-微管蛋白、26S蛋白体亚基p28蛋白、EF1α48D、肌钙蛋白I、跨膜四蛋白、γ-外被体、β-外被体和/或保幼激素环氧化物水解酶的基因(美国临时申请号62/371,259、62/371,261、和62/371,262；美国专利号7,812,219；各自通过引用并入本文)。在基本上如实例4所述进行的膳食掺入测定中测试dsRNA和纯化的蛋白质针对WCRW的功效。
实例17
植物细胞中的原位基因组编辑以
产生编码eAxmi205变体的经修饰的核酸序列
以下实例说明了使用原位植物细胞基因组的基因组编辑，以将本文所述的突变(包括但不限于表5和实例12中所述的突变)并入天然Axmi205蛋白(SEQ ID NO:1)的编码序列或并入已经修饰的Axmi205蛋白的编码序列。
定向基因组修饰(也称为基因组编辑)可用于在特定DNA序列中引入突变。这些基因组编辑技术，其包括锌指核酸酶(ZNF)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)，已成功施用至包括作物植物在内的50多种不同生物。参见例如，Belhaj,K.等人,Plant Methods[植物方法]9,39(2013)；Jiang,W.等人,Nucleic Acids Res[核酸研究]41,e188(2013))。用于基因组编辑的CRISPR/Cas系统基于Cas9核酸酶和指定靶标多核苷酸序列的工程化的单引导RNA(sgRNA)的瞬时表达。
Cas9是大型单体DNA核酸酶，其在两个20个核苷酸(nt)的非编码RNA:CRIPSR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的复合体(在功能上可作为单一合成RNA嵌合体获得)的帮助下，被引导至DNA靶序列。Cas9蛋白含有两个与RuvC和HNH核酸酶同源的核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域切割互补DNA链，而RuvC样结构域切割非互补链，因此，在靶DNA中引入钝切(blunt cut)。
当Cas9和sgRNA在活的玉蜀黍细胞中瞬时表达时，在转基因玉蜀黍细胞中产生特异性靶DNA中的双链断裂(DSB)。通过非同源末端连接和同源定向DNA修复途径引入断裂位点处的突变。
通过使用表达Cas9核酸酶和sgRNA靶标(针对转基因玉蜀黍中的axmi205或经修饰的axmi205序列进行了玉米密码子优化)的重组质粒，将特定突变(例如上文表5和实例12中所述的eAxmi205突)引入天然Axmi205(SEQ ID NO:1)或经修饰的Axmi205的编码序列。该方法的实施是通过根癌农杆菌的农杆菌浸润方法，该根癌农杆菌携带含有指定的目的靶序列的二元质粒。sgRNA与靶标axmi205或经修饰的axmi205编码序列结合后，Cas9核酸酶对编码序列进行特异性切割，并在DNA修复过程中引入所需的一个或多个突变。因此，现在突变的axmi205编码序列将编码eAxmi205变体蛋白，例如表5中描述的变体，例如，其中位置507的突变用丝氨酸(S)代替半胱氨酸(C)，或其中位置422的突变用丝氨酸(S)代替甲硫氨酸(M)组合以在位置423的突变用亮氨酸(L)代替甲硫氨酸(M)，或其中在位置475和476的氨基酸之间和/或在位置496和497的氨基酸之间插入亮氨酸(L)。
通过PCR和测序筛选包含基因组编辑的eAxmi205编码序列的植物细胞。诱导在axmi205或经修饰的axmi205编码序列中具有基因组编辑的突变的愈伤组织，以再生植物进行表型评估，评估表达的eAxmi205蛋白对以下的杀昆虫活性：WCRW，北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲)、南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲食根亚种)和/或墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲)。
以上所述情形是用作说明本发明的，并且不应当解释为本发明的限制。本发明是由以下权利要求书限定的，这些权利要求的等效物被包括在其中。
序列表
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Met Ala Ser Ala Ala Asn Ala Gly Gln Leu Gly Asn Leu Pro Gly Val
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Thr Ser Met Gly Met Gly Tyr Asp Val Asn Gly Leu Tyr Ala Ser Pro
20 25 30
Glu Ser Leu Leu Gly Gln Pro Leu Phe Asp Phe Gly Gly Glu Leu Asp
35 40 45
Ser Ile Glu Ile Glu Gly Arg Ser Tyr Thr Phe Pro Arg Ser Met His
50 55 60
Val His Thr Tyr Phe His Ser Asp Phe Lys Gln Asp Val Ser Lys Glu
65 70 75 80
Ile Glu Glu Tyr Arg Glu Lys Met Ser Gln His Val Gly Val Ser Gly
85 90 95
Arg Tyr Lys Leu Phe Ser Ala Ser Leu Ser Val Asp Phe Thr Thr Thr
100 105 110
Asp Gln Gln Leu Thr Glu Ile Thr Tyr Ser Ser Thr Arg Glu Ala His
115 120 125
Val Leu Trp Tyr Ile Ser Leu Pro Gly Ala Ala Thr Leu Arg Ser Met
130 135 140
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ctggctgtgt tcaatcccag cacctccaat ggctacaaga tggttggcca gttcggtcag 1080
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<210> 47
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eAxmi205 #23 突变体
<400> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eAxmi205 #23 突变体
<400> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eAxmi205 #24 突变体
<400> 50
atggcatccg cagcaaatgc aggtcagctt ggcaacctcc ccggcgttac ttctatgggc 60
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<223> eAxmi205 #25 突变体
<400> 51
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<220>
<223> eAxmi205 #26 突变体
<400> 53
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> eAxmi205 #34 突变体
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> eAxmi205 #36 突变体
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<223> 玉蜀黍优化的 eAxmi205 #23 突变体
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<212> DNA
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<220>
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<400> 76
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<223> 玉蜀黍优化的 eAxmi205 #34 突变体
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Ser Ile Glu Ile Glu Gly Arg Ser Tyr Thr Phe Pro Arg Ser Met His
50 55 60
Val His Thr Tyr Phe His Ser Asp Phe Lys Gln Asp Val Ser Lys Glu
65 70 75 80
Ile Glu Glu Tyr Arg Glu Lys Met Ser Gln His Val Gly Val Ser Gly
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Arg Tyr Lys Leu Phe Ser Ala Ser Leu Ser Val Asp Phe Thr Thr Thr
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Asp Gln Gln Leu Thr Glu Ile Thr Tyr Ser Ser Thr Arg Glu Ala His
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Val Leu Trp Tyr Ile Ser Leu Pro Gly Ala Ala Thr Leu Arg Ser Met
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Leu Arg Arg Asp Phe Arg Asp Asp Leu Asn Asn Pro Asn Met Pro Ala
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Met Glu Leu Phe Lys Arg Tyr Gly Pro Tyr Tyr Ile Ser Glu Ala Ala
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Ser Lys Asp Tyr Ala Cys Trp Arg Ala Ile Pro Pro Gln Gly Tyr Arg
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<400> 122
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atcgaagagt atcgggagaa aatgagccag cacgtgggcg tgtccggccg ctacaagttg 300
ttcagcgctt cgctgagcgt ggatttcacc accacggacc agcaactgac cgagattacc 360
tacagctcca cccgcgaagc ccatgtgctg tggtacatca gcctgcctgg cgcggccacg 420
ctgcgttcga tgctgcgccg cgatttccgc gacgacctga acaaccccaa tatgccggcc 480
atggagctgt tcaagcgcta tggtccctac tacatatcgg aagcggcggt gggcggccgg 540
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atggaaaagc aggtcaacag cttccgcagc aactccacca tccgtctcac cgccaccggc 720
ggcaagccgg gcatgaccga tcgcatactg cacggtccgg attcgcagca ggcgttctcg 780
caatgggcgg aatcgctgct cgactatgcg acgctgatgg acttttccac cgaaagcctg 840
caaccgatct gggcgctggc cgacaagccc gagcgccgcg tcgagcttga ggacgccttc 900
cccgaattca tgaagcagtc gcagcagtcc atccccaagg tggacaaggt gctgctgatg 960
gacgcgcggc cgcctatggt gaaggctggg gaggatagcg gctccggcgc gtcggaggat 1020
ctggctgtgt tcaatcccag cacctccaat ggctacaaga tggttggcca gttcggtcag 1080
cgcaaccatg ccagcgtggc ggatggccat gcgccgattt tcaaggatct gttcgatctg 1140
ggcgtgctga aggcgccggt gggttggcag cgggtgtggg acgacgccgg ctccggcaag 1200
tccaaggact acgcgtgctg gcgcgcgatt ccgccgcagg gctaccgcgc gctgggcgat 1260
gtgatgatgc tggccaccag cggctataac ccgccgaatc tgccggacta tgtttgcgtg 1320
catcaaagcc tgtgcgcgga tgtgcagacg ctgcaaaacc gggtgtggtg ggacaagggc 1380
accggcgcgc gcaaggatgt cagcctgtgg caaccgggcg cggccggcgc ggtggcgctg 1440
tcctcttgct tcgccggcgt gcctaattac aacaacccgc ccaattccgg cgacatcgag 1500
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aagtccatgc tcagccagca ccaaggcatg gaagcgatga tgtccaagct gtga 1614
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eAxmi205 #38L 蛋白质
<400> 123
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165 170 175
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> eAxmi205 #39F
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<213> 人工序列
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<223> eAxmi205 #39F 蛋白质
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<220>
<223> eAxmi205 #39L
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<400> 127
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530 535

Claims (27)

1.一种经修饰的Axmi205毒素，其中所述经修饰的Axmi205毒素由SEQ ID NO:69组成。
2.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如权利要求1所述的经修饰的Axmi205毒素的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸针对在植物中表达进行了密码子优化。
4.如权利要求2或3所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:70或SEQ IDNO:77组成的核苷酸序列。
5.一种核酸分子，所述核酸分子包含与异源启动子可操作地相关联的如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的核酸分子，其中所述异源启动子是植物可表达型启动子。
7.一种载体，所述载体包含如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸或者如权利要求5或6所述的核酸分子。
8.一种转基因细胞，所述转基因细胞包含如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸、或者如权利要求5或6所述的核酸分子、或者如权利要求7所述的载体。
9.如权利要求8所述的转基因细胞，其中所述细胞是转基因细菌细胞或转基因植物细胞。
10.如权利要求9所述的转基因植物细胞，其中所述植物细胞是：
i.单子叶植物细胞；或
ii.双子叶植物细胞。
11.如权利要求10所述的转基因植物细胞，其中所述单子叶植物细胞是大麦细胞、玉蜀黍细胞、燕麦细胞、水稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞或小麦细胞。
12.如权利要求10所述的转基因植物细胞，其中所述双子叶植物细胞是大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、芸苔属作物细胞、棉花细胞、糖用甜菜细胞或烟草细胞。
13.如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸或者如权利要求5或6所述的核酸分子或者如权利要求7所述的载体用于产生转基因植物的用途。
14.如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸或者如权利要求5或6所述的核酸分子或者如权利要求7所述的载体用于产生转基因种子的用途。
15.一种衍生自包含如权利要求1所述的经修饰的Axmi205毒素的转基因植物的收获产物，其中所述收获产物包含所述经修饰的Axmi205毒素，并且其中所述收获产物不是植物或种子。
16.一种衍生自收获产物的加工产物，所述收获产物衍生自包含如权利要求1所述的经修饰的Axmi205毒素的转基因植物，其中所述加工产物是面粉、粗粉、油、淀粉、或衍生自前述任一项的产物。
17.一种杀昆虫组合物，所述杀昆虫组合物包含如权利要求1所述的经修饰的Axmi205毒素，以及农业上可接受的运载体。
18.如权利要求17所述的杀昆虫组合物，其中所述农业上可接受的运载体是粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体或溶液。
19.一种产生对鞘翅目昆虫有害生物具有增加的抗性的转基因植物的方法，所述方法包括向植物中引入如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸、如权利要求5或6所述的核酸分子或者如权利要求7所述的载体，其中所述经修饰的Axmi205毒素在所述植物中表达，从而产生对鞘翅目昆虫有害生物具有增加的抗性的转基因植物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述引入步骤包括：
i.用所述多核苷酸、核酸分子或载体转化植物细胞并再生转基因植物；
ii.使包含所述多核苷酸、核酸分子或载体的第一植物与第二植物杂交；或
iii.对转基因植物中编码Axmi205毒素的序列进行基因组编辑。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述转基因植物获得一个或多个世代的后代植物，其中所述后代植物包含所述多核苷酸、所述核酸分子或所述载体并且对鞘翅目昆虫有害生物具有增加的抗性。
22.一种产生种子的方法，所述方法包括：
a)提供转基因植物，所述转基因植物包含如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸、如权利要求5或6所述的核酸分子或者如权利要求7所述的载体；并且
b)收获来自(a)的转基因植物的种子，其中所收获的种子包含所述经修饰的Axmi205毒素。
23.一种控制鞘翅目昆虫有害生物的方法，所述方法包括向所述昆虫有害生物或其环境递送组合物，所述组合物包含有效量的如权利要求1所述的经修饰的Axmi205毒素。
24.如权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述植物是：
i.单子叶植物；或
ii.双子叶植物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述单子叶植物是大麦植物、玉蜀黍植物、燕麦植物、水稻植物、高粱植物、甘蔗植物或小麦植物。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述双子叶植物是大豆植物、向日葵植物、番茄植物、芸苔属作物植物、棉花植物、糖用甜菜植物或烟草植物。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍植物。
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