JP2005500849A - 修飾Cry3A毒素及び該毒素をコードする核酸配列 - Google Patents
修飾Cry3A毒素及び該毒素をコードする核酸配列 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005500849A JP2005500849A JP2003523658A JP2003523658A JP2005500849A JP 2005500849 A JP2005500849 A JP 2005500849A JP 2003523658 A JP2003523658 A JP 2003523658A JP 2003523658 A JP2003523658 A JP 2003523658A JP 2005500849 A JP2005500849 A JP 2005500849A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- recognition site
- acid numbers
- modified cry3a
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000003053 toxin Substances 0.000 title claims abstract description 313
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 313
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 148
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title abstract description 69
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims abstract description 322
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 186
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 186
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 180
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 157
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 123
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 103
- 241000489947 Diabrotica virgifera virgifera Species 0.000 claims abstract description 78
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 62
- 108090000617 Cathepsin G Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000004173 Cathepsin G Human genes 0.000 claims abstract description 61
- LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[1-[[1-[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 59
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- 241000489972 Diabrotica barberi Species 0.000 claims abstract description 23
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 13
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 63
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 258
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 155
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 155
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 147
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 92
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 92
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 58
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 53
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 19
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 18
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 13
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 13
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 235000021405 artificial diet Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 abstract description 63
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 abstract description 62
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 abstract description 35
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 abstract description 35
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 abstract description 24
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 12
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 12
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 10
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 140
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 139
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 67
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 27
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 27
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 26
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 25
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 24
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 22
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 17
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 17
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 17
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 12
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 8
- 241000489976 Diabrotica undecimpunctata howardi Species 0.000 description 8
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 7
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 7
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 5
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 4
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 4
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 description 4
- 102000048193 Mannose-6-phosphate isomerases Human genes 0.000 description 4
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 4
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 3
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 3
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- 101150102464 Cry1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 3
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 3
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 3
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 2
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 2
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 2
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 2
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 2
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 2
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 2
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 2
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 2
- 241001608567 Phaedon cochleariae Species 0.000 description 2
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 2
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 2
- 101000955367 Pseudomonas putida Transcriptional regulatory protein XylR Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 229960000988 nystatin Drugs 0.000 description 2
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 1
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 241000589941 Azospirillum Species 0.000 description 1
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101150078024 CRY2 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 102000003908 Cathepsin D Human genes 0.000 description 1
- 108090000258 Cathepsin D Proteins 0.000 description 1
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 1
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 235000007542 Cichorium intybus Nutrition 0.000 description 1
- 244000298479 Cichorium intybus Species 0.000 description 1
- 241000186650 Clavibacter Species 0.000 description 1
- 241000870659 Crassula perfoliata var. minor Species 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 241000219130 Cucurbita pepo subsp. pepo Species 0.000 description 1
- 235000003954 Cucurbita pepo var melopepo Nutrition 0.000 description 1
- 235000017788 Cydonia oblonga Nutrition 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 241000489975 Diabrotica Species 0.000 description 1
- 108010010256 Dietary Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000015781 Dietary Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102100023882 Endoribonuclease ZC3H12A Human genes 0.000 description 1
- 101710112715 Endoribonuclease ZC3H12A Proteins 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000896533 Gliocladium Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000588275 Heteractis magnifica Delta-stichotoxin-Rpa1b Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101150054907 Mrps12 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000931108 Mus musculus DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101000783409 Naja anchietae Long neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010058667 Oral toxicity Diseases 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 1
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009827 Prunus armeniaca Nutrition 0.000 description 1
- 244000018633 Prunus armeniaca Species 0.000 description 1
- 235000006029 Prunus persica var nucipersica Nutrition 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 244000017714 Prunus persica var. nucipersica Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 101100120298 Rattus norvegicus Flot1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100412401 Rattus norvegicus Reg3a gene Proteins 0.000 description 1
- 101100412403 Rattus norvegicus Reg3b gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 235000017848 Rubus fruticosus Nutrition 0.000 description 1
- 240000007651 Rubus glaucus Species 0.000 description 1
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100199945 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) rps1201 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 244000078534 Vaccinium myrtillus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150067314 aadA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021029 blackberry Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N chlorotetracycline Natural products C1=CC(Cl)=C2C(O)(C)C3CC4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004475 chlortetracycline Drugs 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N chlortetracycline Chemical compound C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 201000006591 congenital myasthenic syndrome 16 Diseases 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000021245 dietary protein Nutrition 0.000 description 1
- 108091007735 digestive proteases Proteins 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000077 insect repellent Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021049 nutrient content Nutrition 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 231100000418 oral toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- NONJJLVGHLVQQM-JHXYUMNGSA-N phenethicillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C(C)OC1=CC=CC=C1 NONJJLVGHLVQQM-JHXYUMNGSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008654 plant damage Effects 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 101150082349 pmi gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- -1 rRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008653 root damage Effects 0.000 description 1
- 101150015537 rps12 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150019416 trpA gene Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
植物害虫を駆除するための組成物及び方法が開示される。具体的には、コーン・ルートワームに対する毒性が高められた修飾Cry3A毒素をコードする新規の核酸配列が提供される。標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識部位、例えばカテプシンGを、Cry3A毒素の少なくとも1つの位置に挿入することによって、特にウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する毒性が有意に高められた修飾Cry3A毒素が構成される。さらに、修飾Cry3A毒素を形成する方法、及び、例えば昆虫駆除のために微生物中で、又は昆虫による損害に対する保護のためにトランスジェニック植物中で、修飾Cry3A核酸配列を使用する方法、及び、修飾Cry3A毒素及び修飾Cry3A毒素を含む組成物及び配合物を使用する方法であって、例えば、修飾Cry3A毒素又は組成物又は配合物を、昆虫が蔓延する領域に使用する方法、或いは、昆虫に対して鋭敏な領域又は植物を予防的に処理することにより害虫に対して保護するために、修飾Cry3A毒素、並びに修飾Cry3A毒素を含む組成物及び配合物を使用する方法が開示される。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質工学、植物分子生物学及び害虫駆除の分野に関する。より具体的には、本発明は新規の修飾Cry3A毒素、及び、発現により修飾Cry3A毒素をもたらす核酸配列に関し、また、修飾Cry3A毒素及び対応する核酸配列の形成方法、及び、昆虫を駆除するために修飾Cry3A毒素及び対応する核酸配列を使用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
コーン・ルートワーム(corn rootworm)種は、最も破壊的なトウモロコシ害虫であると考えられている。米国内で、3つの重要な種は、Diabrotica virgifera virgifera(ウェスタン・コーン・ルートワーム)、D. longicornis barberi(ノーザン・コーン・ルートワーム)及びD. undecimpunctata howardi(サザン・コーン・ルートワーム)である。米国トウモロコシ地帯において一次害虫と考えられるのは、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームだけである。コーン・ルートワームの幼虫はほとんど専らトウモロコシの根を食べることにより、最も大きな植物損害を引き起こす。このような損傷は、植物の倒伏量を増大させ、穀物収穫高及び植物収穫高を低減し、また、穀物の栄養含有率を変化させる。幼虫による摂食はまた、根腐れ病及び茎腐れ病を招く細菌及び真菌感染のために根を通して道を開くことによって、トウモロコシに間接的な影響を与える。成熟したコーン・ルートワームは晩夏にトウモロコシ畑で活動し、穂、毛及び花粉を食べ、正常な受粉を妨げる。
【0003】
コーン・ルートワームは主に化学農薬の集中的な使用により駆除される。化学農薬は、昆虫の成長の阻害、昆虫の摂食又は繁殖の予防を通して活性であるか、又は昆虫を死に至らしめる。従ってコーン・ルートワームを良好に駆除することはできるが、しかしこれらの化学物質は他の有益な有機体に影響を与えることもある。化学農薬を広く使用することに起因する別の問題は、耐性の昆虫品種の出現である。さらに別の問題は、コーン・ルートワームの幼虫が地中で摂食し、従って殺虫剤の救援処理を適用することが難しくなるという事実による。従って殆どの殺虫剤は、植え付け時に予防的に使用される。このような方法は結果として環境の大きな負荷となる。このような負荷は種々の農場管理方法によって部分的に緩和されてはいるが、しかし代わりとなる害虫駆除メカニズムがますます必要になっている。
【0004】
生物学的な害虫駆除剤、例えばδ-エンドトキシンのような殺虫性毒素を発現させるBacillus thuringiensis(Bt)菌株も作物に使用されており、主に鱗翅目の害虫に対して申し分のない結果をもたらしている。δ-エンドトキシンは、或る特定の昆虫による摂取時に殺虫活性を有することが知られている、結晶マトリックス内に保持されたタンパク質である。種々のδ-エンドトキシンは、活性スペクトル及び配列相同性に応じて分類されている。1990年以前には、主要なクラスは、これらの活性スペクトルによって、鱗翅目(蛾及び蝶)に対して活性のCry1タンパク質、鱗翅目及び双翅目(蝿及び蚊)の両方に対して活性のCry2タンパク質、鞘翅目(甲虫)に対して活性のCry3タンパク質、及び双翅目に対して活性のCry4タンパク質と定義された(Hofte及びWhitely, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255)。最近は、昆虫の標的特異性ではなくアミノ酸配列相同性に基づいて、Cryタンパク質を系統的に分類する新しい命名法が開発された(Crickmore他、1998、Microbiol. Molec. Biol. Rev.62:807-813)。
【0005】
Btに由来する個々のδ-エンドトキシンの殺虫活性スペクトルは極めて狭く、所与のδ-エンドトキシンは所定の系列内の数種に対してしか活性ではない。例えば、Cry3Aタンパク質は、コロラドハムシ(Lapinotarsa decemlineata)に対して極めて毒性であるが、しかしDiabrotica属における関連甲虫に対する毒性はきわめて低いか又は全くない(Johnson他、1993、J. Econ. Entomol. 86:330-333)。Slaney他(1992, Insect Biochem. Molec. Biol. 22:9-18)によれば、Cry3Aタンパク質のサザン・コーン・ルートワームに対する毒性は、コロラドハムシに対する毒性の2000分の1以下である。Cry3Aのウェスタン・コーン・ルートワームに対する毒性はほとんど又は全くないことも知られている。
【0006】
δ-エンドトキシンの特異性は、活性毒素タンパク質を生成するのに関与する種々のステップ、及び、昆虫の中腸内の上皮細胞とのその後の相互作用の効率の結果である。殺虫活性を発揮するために、殆どの既知のδ-エンドトキシンは先ず昆虫によって摂取され、そして活性毒素を形成するためにタンパク質分解により活性化されなければならない。殺虫性結晶タンパク質の活性化は、多段プロセスである。摂取後、結晶は昆虫消化管内でまず可溶化されなければならない。可溶化されると、δ-エンドトキシンは特異的なタンパク質分解によって活性化される。昆虫消化管内のプロテアーゼは、δ-エンドトキシンがどこでプロセッシングされるかを決定することにより、特異性の役割を果たすことができる。δ-エンドトキシンは可溶化されプロセッシングされると、昆虫の中腸上皮の表面上の特異的な受容体に結合し、続いて刷子縁膜の脂質二重層内に組込まれる。次いでイオンチャネルが形成され、中腸の正常な機能を乱し、最終的には昆虫を死に至らしめる。
【0007】
鱗翅目において、消化管プロテアーゼはδ-エンドトキシンをプロセッシングして、130-140kDaのプロトキシンをほぼ60-70kDaの毒性タンパク質にする。プロトキシンから毒素へのプロセッシングは、N末端アミノ酸及びC末端アミノ酸の双方を除去することにより進められることが報告されている。この場合正確なプロセッシング位置は、関与する特異的な昆虫消化管液に依存する(Ogiwara他、1992、J.Invert. Pathol. 60:121-126)。δ-エンドトキシンのタンパク質分解活性化は、その特異性を決定する上で有意な役割を演じることができる。例えばIC1と呼ばれる、Bt var. aizawaに由来するδ-エンドトキシンは、他の既知のCry1 Abタンパク質との配列相同性に基づいて、Cry1Abタンパク質として分類されている。Cry1 Abタンパク質は典型的には鱗翅目の昆虫に対して活性である。しかし、IC1タンパク質は、これがどのようにプロセッシングされるか如何では鱗翅目及び双翅目の昆虫の双方に対して活性を有する(Haider他、1986、Euro. J. Biochem. 156:531-540)。双翅目の消化管においては、53kDaの活性IC1毒素が得られるのに対して、鱗翅目の消化管においては、55kDaの活性1C1毒素が得られる。1C1は、4つのアミノ酸によってだけしか、正基準標本HD-1 Cry1Abタンパク質とは異ならないので、受容体結合部位の全体的な変化が活性の差異の原因になるとは考えられない。2つの異なる昆虫消化管におけるタンパク質分解の差異は、活性化された分子が異なる状態に折り畳まれ、ひいては異なる受容体と結合可能な異なる領域を暴露することを可能にすると考えられる。従って特異性は、異なる昆虫の消化管プロテアーゼと共に存在すると考えられる。
【0008】
鞘翅目昆虫は、中性寄りの酸性である消化管を有しており、鞘翅目特異的δ-エンドトキシンは、活性化された鱗翅目特異的毒素のサイズと類似している。従って、鞘翅目特異的δ-エンドトキシンのプロセッシングは、かつては毒性には不要と考えられていた。しかし、最近のデータが示唆するところによれば、鞘翅目活性δ-エンドトキシンは可溶化されタンパク質分解されて、より小さな毒性ポリペプチドにされる。B. thuringiensis var. tenebrionisによって生成される73kDaのCry3Aδ-エンドトキシンタンパク質は、N-末端において細菌中で容易にプロセッシングされ、結晶形成中又は結晶形成後に49-57残基を失い、これにより一般には単離された67kDa形を生成する(Carroll他、1989, Biochem. J. 261:99-105)。またMcPherson他、1988(Biotechnology 6:61-66)によって実証されたように、天然型Cry3A遺伝子は、2つの機能性翻訳開始コドンを同じリーディング・フレーム内に含有し、その一方は、演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2参照)のMet-1で始まる73kDaタンパク質をコードし、他方は、Met-48で始まる67kDaタンパク質をコードする。この場合、両タンパク質は天然発生型全長Cry3Aタンパク質と考えることができる。可溶性の67kDA Cry3Aタンパク質をトリプシン又は昆虫消化管抽出物で処理すると、演繹アミノ酸配列のAsn-159をN末端に有する55kDaの開裂生成物が得られる。このポリペプチドは、天然型67kDA Cry3A毒素と同じ毒性を、鋭敏な鞘翅目昆虫に対して有することが見出された(Carroll他、同書)。従って、天然型Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のArg-158とAsn-159との間には天然型トリプシン認識部位が存在する。Cry3Aはキモトリプシンによって開裂することもでき、その結果49、11及び6kDaの3つのポリペプチドが生じる。49kDa成分及び6kDa成分のN末端分析は、最初のアミノ酸残基がそれぞれSer-162及びTyr-588であることを示した(Carroll他、1997、J. Invert. Biol. 70:41-49)。従って、天然型キモトリプシン認識部位は、演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のHis-161とSer-162との間、及びTyr-587とTyr-588との間でCry3A中に存在する。49kDaキモトリプシン生成物は、天然型67kDAタンパク質又は55kDaトリプシン生成物よりも中性pHでより高い可溶性を有すると考えられ、Cry3Aに対して鋭敏な昆虫、コロラドハムシ及びマスタード・ビートル(Phaedon cochleariae)に対する完全な殺虫活性を維持する。昆虫消化管プロテアーゼは典型的には、昆虫が食餌性タンパク質から必須アミノ酸を得るのを助ける機能を果たす。最も良く理解される昆虫消化プロテアーゼは、特に鱗翅目種において最も一般的と考えられるセリン・プロテアーゼである(Englemann及びGeraerts, 1980, J. Insect Physiol. 261:703-710)。鞘翅目の幼虫及び成虫の大部分、例えばコロラドハムシは、弱酸性の中腸を有しており、システイン・プロテアーゼが主要な蛋白質分解作用を提供する(Wolfson及びMudock, 1990, J.Chem.Ecol.16:1089-1102)。より正確には、Thie及びHouseman(1990, Insect Biochem. 20:313-318)が、コロラドハムシにおいてシステイン・プロテアーゼ、カテプシンB及びH、並びにアスパルチル・プロテアーゼ、カテプシンDを同定して特徴付けした。Gillikin他(1992, Arch. Insect Biochem. Physiol. 19:285-298)はウェスタン・コーン・ルートワーム幼虫の消化管内のタンパク質分解作用を特徴付けし、そして15個の、主としてシステイン・プロテアーゼを見出した。本発明において開示されるまで、セリン・プロテアーゼ、カテプシンGがウェスタン・コーン・ルートワーム中に存在することを示す報告はなかった。昆虫消化管プロテアーゼの多様性及び種々異なる活性レベルは、特にBt毒素に対する昆虫の感受性に影響を与えると云える。
【0009】
線虫に対して活性の菌株(欧州特許出願公開第0517367号明細書)を含む、改善された又は新規の生体活性を有する新たな及び新規のBt菌株及びδ-エンドトキシンが数多く過去5年間にわたって発表されている。しかしこれらの菌株及び毒性のうち、鞘翅目の昆虫に対して活性を有するものは相対的に少ない。さらに、現在既知の鞘翅目活性δ-エンドトキシン、例えばCry3A、Cry3B、Cry3C、Cry7A、Cry8A、Cry8B及びCry8Cには、例えば微生物又はトランスジェニック植物を通して送達された場合に、適切な畑管理を可能にするのに十分な、コーン・ルートワームに対する経口毒性を有するものはない。従って、コーン・ルートワームに対して活性の新規毒性を生成するための他のアプローチを究明する必要がある。
【0010】
δ-エンドトキシンがどのように機能するかに関する知識が増えるのに伴って、新しい活性を有するようにδ-エンドトキシンを遺伝子工学的に改変しようという試みが多くなっている。1991年にCry3Aの三次元構造が解明されたことにより(Li他、1991, Nature 353:815-821)、δ-エンドトキシンの改変は一層可能になった。タンパク質は3つの構造ドメインを有している。すなわち、残基1-290から成るN末端ドメインIは、7つのα螺旋から形成され、残基291-500から成るドメインIIは、3つのβシートを含有し、残基501-644から成るC末端ドメインIIIはβサンドイッチである。このような構造に基づき、δ-エンドトキシンの構造と機能との関係に関して、仮説が成り立っている。ドメインIは主に昆虫消化管膜内の孔形成に寄与し(Gazit及びShai, 1993, Appl. Environ. Microbiol. 57:2816-2820)、ドメインIIは主に消化管受容体との相互作用に寄与し(Ge他、1991、J. Biol. Chem. 32:3429-3436)、及びドメインIIIは、おそらくタンパク質安定性(Li他、1991、前掲書)と関連し、またイオンチャネル活性に対して調節上の影響を与える(Chen他、1993, PNAS 90:9041-9045)と、一般には考えられている。
【0011】
特異的活性を改善しようという目的、或いは、殺虫活性スペクトルを広げようという目的で、鱗翅目活性δ-エンドトキシンが遺伝子工学的に作成されている。例えば、Cry1Aaに由来するコイコガ(Bombyx mori)特異性ドメインをCry1Acに移し、こうして、結果として生じたキメラタンパク質に新しい殺虫活性を付与した(Ge他、1989、PNAS 86:4037-4041)。また、1998年にBosch他(米国特許第5,736,131号)は、Cry1EのドメインIIIをCry1CのドメインIIIと置換し、こうしてより広い鱗翅目活性スペクトルを有するCry1E-Cry1Cハイブリッド毒素を生成することにより、新しい鱗翅目活性毒素を作成した。
【0012】
鞘翅目活性δ-エンドトキシンを遺伝子工学的に作成しようという幾つかの試みが報告されている。Van Rie他,1997(米国特許第5,659,123号明細書)は、溶媒接触可能性において重要であると考えられるドメインII内のアミノ酸をアミノ酸アラニンとランダムに置換することにより、Cry3Aを作成した。受容体結合ドメインIIに限定されたこれらのランダム置換のうちのいくつかは、報告によれば、ウェスタン・コーン・ルートワーム毒性の増大に関与する。しかし、その他の報告では、Cry3AのドメインIIにおける幾つかのアラニン置換が、受容体結合の分裂又は構造的な不安定性を招くことが示されている(Wu及びDean, 1996, J. Mol. Biol. 255:628-640)。English他が1999年に(国際公開第99/31248号パンフレット)報告したCry3Bb中のアミノ酸置換は、サザン・コーン・ルートワーム及びウェスタン・コーン・ルートワームに対する毒性を増大させる。しかし、報告された35種のCry3Bb突然変異体のうち、主としてドメインII及びドメインII-ドメインI界面における3つの突然変異体しか、ウェスタン・コーン・ルートワームに対して活性ではなかった。さらに、同じアッセイにおけるウェスタン・コーン・ルートワームに対する野生型Cry3Bbの毒性の差異は、突然変異型Cry3Bb毒素と野生型Cry3Bb毒素との間の差異のうちのいずれよりも大きい。従ってCry3Bb突然変異体の毒性の改善形は、主としてサザン・コーン・ルートワームに限定されると考えられる。
【0013】
農業従事者に経済的な利益を提供し、環境的に許容可能である新しく効果的な害虫駆除剤を構成することが依然として必要である。具体的に必要なのは、既存の昆虫駆除剤に対して耐性の、又は耐性と成り得る米国内の主要な害虫であるウェスタン・コーン・ルートワームを駆除する修飾Cry3A毒素である。さらに、使用しても環境に負荷を最小限にしか加えない、トランスジェニック植物を介して使用されるような作用物質が望ましい。
【発明の開示】
【0014】
これらの必要性から、本発明の目的は、コーン・ルートワームに対する毒性が高められた修飾Cry3A毒素をコードする新規の核酸配列を提供することである。本発明により、標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識部位を、Cry3A毒素の1つ以上の位置に挿入することにより、具体的にはサザン・コーン・ルートワーム及びウェスタン・コーン・ルートワームに対して有意に毒性が高められた修飾Cry3A毒素が構成される。本発明はさらに、核酸配列の発現から生じる新規の修飾Cry3A毒素、及び、修飾Cry3A毒素を含有する組成物及び配合物に関し、これらの修飾Cry3A毒素は、害虫の生存、成長及び繁殖の能力を阻害するか、或いは、作物に対する昆虫関連の損害又は損失を制限することができる。本発明はさらに、修飾Cry3A毒性の形成方法、及び、昆虫駆除のために微生物中で、又は昆虫による損害からの保護のためにトランスジェニック植物中で、修飾Cry3A核酸配列を使用する方法、そして、修飾Cry3A毒素、並びに修飾Cry3A毒素を含む組成物及び配合物を使用する方法であって、例えば修飾Cry3A毒素又は組成物及び配合物を、昆虫が蔓延する領域に使用する方法、或いは、昆虫に対して鋭敏な領域又は植物を予防的に処理することにより害虫に対して保護するために、修飾Cry3A毒素、並びに修飾Cry3A毒素を含む組成物及び配合物を使用する方法に関する。
【0015】
本明細書中に記載された新規の修飾Cry3A毒素は、昆虫に対して高活性である。例えば、本発明の修飾Cry3A毒素は、重要な害虫、例えばウェスタン・コーン・ルートワーム(Diabrotica virgifera virgifera)、ノーザン・コーン・ルートワーム(D. longicornis barberi)を経済的に駆除するために使用することができる。修飾Cry3A毒素は、単独で、又は他の昆虫駆除戦略との組み合わせで使用することにより、環境に対して最小限にしか影響を及ぼさずに、最大の害虫駆除効率を与えることができる。
【0016】
1つの観点によれば、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、該修飾Cry3A毒素が、Cry3A毒素中に天然には発生しない少なくとも1つの付加的なプロテアーゼ認識部位を含む。標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識されるこの付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位とほぼ同じ位置に挿入される。修飾Cry3A毒素が標的昆虫にもたらす死亡率は、Cry3A毒素が同じ標的昆虫にもたらす死亡率よりも高い。好ましくは、Cry3A毒素が標的昆虫に最大約30%の死亡率しかもたらさないのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【0017】
この観点の1実施態様の場合、標的昆虫の消化管プロテアーゼは、セリン・プロテアーゼ、システイン・プロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼから成る群から選択される。この実施態様による好ましいセリン・プロテアーゼは、カテプシンG、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ及びエラスターゼ、最も好ましくはカテプシンGを含む。
【0018】
この観点の別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素のドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置、該認識部位に隣接する位置、又は該認識部位内の位置で、ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。
【0019】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間に挿入される。
【0020】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入される。
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入される。
【0021】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に挿入される。
【0022】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。
【0023】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。
【0024】
1実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、修飾されていないCry3A毒素のドメインI及びドメインIIIに挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置又は該認識部位に隣接する位置で、ドメインIに挿入され、天然発生型プロテアーゼ認識部位内の位置、該認識部位と置き換わる位置、又は該認識部位に隣接する位置で、ドメインIIIに挿入される。
【0025】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。
【0026】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。
【0027】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。
【0028】
好ましい実施態様の場合、本発明の単離された核酸分子は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1818、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1791を含む。
【0029】
別の好ましい実施態様の場合、本発明の単離された核酸分子は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む修飾Cry3A毒素をコードする。
本発明の1実施態様によれば、単離された核酸分子は、鞘翅目昆虫に対して活性の修飾Cry3A毒素をコードする。好ましくは、修飾Cry3A毒素は、ウェスタン・コーン・ルートワームに対する活性を有する。
【0030】
本発明は、本発明の核酸分子に作用連関された異種プロモーター配列を含むキメラ遺伝子を提供する。本発明はまた、このようなキメラ遺伝子を含む組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、このようなキメラ遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト宿主細胞を提供する。本発明のこの観点によるトランスジェニック宿主細胞は細菌細胞又は植物細胞、好ましくは植物細胞であってよい。本発明はさらに、このような植物細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。本発明のこのような観点によるトランスジェニック植物は、サトウモロコシ、小麦、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、アブラナ属植物、綿、稲、大豆、甜菜、サトウキビ、タバコ、大麦、脂肪種子ナタネ、又はトウモロコシ、好ましくはトウモロコシであってよい。本発明はまた、サトウモロコシ、小麦、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、アブラナ属植物、綿、稲、大豆、甜菜、サトウキビ、タバコ、大麦、脂肪種子ナタネ、及びトウモロコシから成るトランスジェニック植物の群から選択された種子を提供する。特に好ましい実施態様の場合、種子はトランスジェニック・トウモロコシ植物に由来する。
【0031】
別の観点において、本発明は、本発明の核酸分子の発現により生成された毒素を提供する。好ましい実施態様において、毒素は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1818、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1791を含む核酸分子の発現によって生成される。
【0032】
別の実施態様の場合、本発明の毒素は、鞘翅目昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワームに対して活性である。
【0033】
1実施態様の場合、本発明の毒素は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む。
【0034】
本発明はまた、本発明による効果的な昆虫駆除量の毒素を含む組成物を提供する。
別の観点において、本発明は、昆虫に対して活性の毒素を生成する方法であって、(a)本発明の核酸分子に作用連関された異種プロモーター配列をそれ自体が含むキメラ遺伝子を含む宿主細胞を獲得し;そして(b)トランスジェニック宿主細胞内に核酸分子を発現させることにより、昆虫に対して活性の1種以上の毒素を生じさせる、ことを含む方法を提供する。
【0035】
さらに別の観点において、本発明は、昆虫に対して抵抗性のトランスジェニック植物を生成する方法であって、トランスジェニック植物中に本発明の核酸分子を導入することを含み、この核酸分子が昆虫駆除に有効な量でトランスジェニック植物において発現可能である、方法を提供する。好ましい実施態様の場合、これらの昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワームである。
【0036】
さらに別の観点において、本発明は昆虫駆除の方法であって、本発明の有効量の毒素を昆虫に送達することを含む方法を提供する。1実施態様によれば、昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワームである。好ましくは、毒素は昆虫に経口送達される。好ましい1実施態様の場合、毒素は、本発明の毒素を発現させる核酸配列を含むトランスジェニック植物を通して経口送達される。
【0037】
本発明によりさらに提供されるのは、修飾Cry3A毒素の形成方法であって:(a) Cry3A毒素をコードするCry3A遺伝子を獲得し;(b) 標的昆虫の消化管プロテアーゼを同定し;(c) 前記消化管プロテアーゼのための認識部位をコードするヌクレオチド配列を獲得し;(d) ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に、Cry3A毒素遺伝子内の天然発生型プロテアーゼ認識部位をコードするヌクレオチド配列と置き換わる位置、該ヌクレオチド配列内の位置、又は該ヌクレオチド配列に隣接する位置で前記(c)のヌクレオチド配列を挿入し、こうして修飾Cry3A毒素遺伝子を作成し;(e) 前記修飾Cry3A遺伝子を発現カセット中に挿入し;(f) 前記修飾Cry3A遺伝子を非ヒト宿主細胞中に発現させることにより、修飾Cry3A毒素を生成する宿主細胞を生じさせ;そして(g) 標的昆虫に対して修飾Cry3A毒素をバイオアッセイし、これにより、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされる標的昆虫の死亡率よりも高い死亡率を標的昆虫にもたらすことを含む、方法である。好ましい実施態様の場合、Cry3A毒素が標的昆虫に最大約30%の死亡率をもたらすのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【0038】
本発明はさらに昆虫駆除の方法であって、トランスジェニック植物が、第2の殺虫成分をコードする第2の核酸配列又は核酸配列群を含む方法を提供する。特に好ましい第2の核酸配列は、δ-エンドトキシンをコードする核酸配列、米国特許第5,849,870号明細書及び同第5,877,012号明細書(これらを参考のため本明細書中に引用する)に開示された栄養殺虫性タンパク質(Vegetative Insecticidal Protein) 毒素をコードする核酸配列、又は非タンパク質殺虫成分を生成するための経路をコードする核酸配列である。
【0039】
本発明のさらに別の観点は、開裂によって所望のサイズの二本鎖ランダム・フラグメント個体群にされた核酸分子に、本発明に基づいて突然変異を誘発する方法であって:(a) 二本鎖ランダム・フラグメントの個体群に、1又は2種以上の一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドを添加し、これのオリゴヌクレオチドはそれぞれ二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対して同一性領域及び異種性領域を含み;(b) 結果として生じた二本鎖ランダム・フラグメントとオリゴヌクレオチドとの混合物を変性して一本鎖フラグメントにし;(c) 結果として生じた単鎖フラグメント個体群を、同一性領域で単鎖フラグメントをアニーリングすることになる条件下で、ポリメラーゼと一緒にインキュベートすることにより、アニールされたフラグメント対を形成し、同一性領域は、対の一方の員が他方の員の複製をプライムするのに十分であり、これにより、突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成し;(d) 2回以上の更なるサイクルにわたって第2ステップ及び第3ステップを反復し、更なるサイクルの第2ステップにおいて結果として得られた混合物が、前のサイクルの第3ステップから得られた突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを含み、そして、前記更なるサイクルは、更なる突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成する、方法を提供することである。
【0040】
本発明の他の観点及び利点は、本発明の以下の説明、及び本発明を限定しない実施例を検討することにより、当業者に明らかになる。
SEQ ID NO:1は、天然型Cry3Aコーディング領域である。
SEQ ID NO:2は、天然型Cry3A遺伝子によってコードされたCry3A毒素のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:3は、天然型Cry3Aコーティング領域のヌクレオチド144で始まる、トウモロコシに対して最適化されたCry3Aコーティング領域である。
SEQ ID NO:4は、トウモロコシに対して最適化されたCry3A遺伝子によってコードされたCry3A毒素のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:5は、pCIB6850のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:6は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A054コーディング配列である。
SEQ ID NO:7は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:8は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A055コーディング配列である。
SEQ ID NO:9は、SEQ ID NO:8のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:10は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A085コーディング配列である。
【0041】
SEQ ID NO:11は、SEQ ID NO:10のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:12は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A082コーディング配列である。
SEQ ID NO:13は、SEQ ID NO:12のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:14は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A058コーディング配列である。
SEQ ID NO:15は、SEQ ID NO:14のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:16は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A057コーディング配列である。
SEQ ID NO:17は、SEQ ID NO:16のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:18は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A056コーディング配列である。
SEQ ID NO:19は、SEQ ID NO:18のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:20は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A083コーディング配列である。
【0042】
SEQ ID NO:21は、SEQ ID NO:20のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:22-34は、本発明において有用なPCRプライマーである。
SEQ ID NO:35は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:36は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:37は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:38は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
【0043】
本明細書中に使用される特定の用語を明確にするために下記のように定義して示す:
本発明の修飾Cry3A毒素の「活性」は、修飾Cry3A毒素が経口活性の昆虫駆除剤として機能するか、毒性効果を有するか、又は昆虫の摂食を妨害又は抑制することができることを意味し、このことは昆虫の死を招いても招かなくてもよい。本発明の修飾Cry3A毒素が昆虫に送達されると、結果として昆虫は死に至らしめられるのが典型的であり、或いは、昆虫は、修飾Cry3A毒素を昆虫に利用可能にする源を食べなくなる。
【0044】
「隣接する」という用語に関しては、本発明によれば、付加的なプロテアーゼ認識部位が天然発生型プロテアーゼ認識部位の4つの残基以内、好ましくは3つの残基以内、より好ましくは2つの残基以内、及び最も好ましくは1つの残基以内にある場合、この付加的なプロテアーゼ認識部位は天然発生型プロテアーゼ認識部位に「隣接」しているという。例えば、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)の演繹アミノ酸配列のPro-154とArg-158との間に挿入された付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)の演繹アミノ酸配列のArg-158とAsn-159との間に位置する天然発生型トリプシン認識部位に「隣接」している。
【0045】
本明細書において使用される「ほぼ同じ位置」という言い方は、天然発生型プロテアーゼ認識部位に関連して、付加的なプロテアーゼ認識部位が挿入されるCry3A毒素中の場所を記述するのに使用され、この場所が天然発生型プロテアーゼ認識部位から多くても残基4つ分だけ隔たっていることを意味する。この場所は、天然発生型プロテアーゼ認識部位から残基3又は2つ分だけ隔たっていてもよい。この場所は、天然発生型プロテアーゼ認識部位から残基1つ分だけ隔たっていてもよい。「ほぼ同じ位置」という言い方はまた、付加的なプロテアーゼ認識部位が天然発生型プロテアーゼ認識部位内に挿入されることを意味することもできる。
【0046】
「関連/作用連関」という用語は、物理的又は機能的に関係する2つの核酸配列を意味する。例えば、プロモーター又は調節DNA配列と、RNA又はタンパク質をコードするDNA配列とが作用連関しているならば、或いは、調節DNA配列がコーディングDNA配列又は構造DNA配列の発現レベルに影響を与えるように位置しているならば、プロモーター又は調節DNA配列は、RNA又はタンパク質をコードするDNA配列と「関連」していると云われる。
【0047】
「キメラ遺伝子」又は「キメラ構造」は組換え核酸配列であって、この配列において、プロモーター又は調節核酸配列が、mRNAをコードするか又はタンパク質として発現される核酸配列と作用連関又は関連し、これにより、調節核酸配列が関連核酸コーディング配列の転写又は発現を調節することができる。キメラ遺伝子の調節核酸配列は、天然に見出されるような関連核酸配列に通常は作用連関されていない。
【0048】
「コーディング配列」は、RNA、例えばmRNA、rRNA、tRNA、snRNA、センスRNA又はアンチセンスRNAに転写される核酸配列である。好ましくはRNAは次いで生物内で翻訳され、これによりタンパク質が生成される。
【0049】
昆虫を「駆除」することは、害虫の生存、成長、摂食及び/又は繁殖の能力を毒性効果を通して阻害するか、或いは、作物の昆虫に関係する損害又は損失を制限することを意味する。昆虫を「駆除」することは、昆虫を殺すことを意味する場合と意味しない場合とがあるが、好ましくは、昆虫を殺すことを意味する。
【0050】
本発明との関連において、「対応する」は、変異体Cry3Aδ-エンドトキシンのアミノ酸配列が互いに整列させられる場合、本発明において列挙した所定の位置に「対応する」アミノ酸が、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)におけるこれらの位置と整合するアミノ酸であることを意味するが、しかし、これらのアミノ酸は、本発明の特定のCry3Aアミノ酸に関してこれらの正確な数値的な位置に必ずしもあるわけではない。例えば、本発明のトウモロコシ最適化Cry3A遺伝子(SEQ ID NO:3)は、Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)をコードし、このCry3A毒素(SEQ ID NO:4)は、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)のMet-48で始まり、このCry3A毒素(SEQ ID NO:2)は天然型Cry3A遺伝子(SEQ ID NO:1)によってコードされる。従って本発明によれば、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107-115(その間の全ての番号を含む)は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154-163及びその間の全ての番号に対応し、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536-541(その間の全ての番号を含む)は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号583-588及びその間の全ての番号に対応する。
【0051】
本明細書中に使用される「Cry3A毒素」は、73kDaのBacillus thuringiensis var. tenebrionis(Kreig他、1983、Z. Angew. Entomol. 96:500-508)(Bt)鞘翅目活性タンパク質(Sekar他、1987、Proc. Nalt. Acad. Sci. 84:7036-7040)、例えばSEQ ID NO:2、並びに、Cry3A毒素、例えばSEQ ID NO:4から誘導可能で、Cry3A毒素とほぼ同じ毒性を維持する、先端切除された任意の低分子量変異体を意味する。低分子量変異形は、Cry3A毒素の天然発生型プロテアーゼ認識部位のプロテアーゼ開裂によって、又は、73kDaのCry3A毒素をコードする翻訳開始コドンと同じフレーム内の第2の翻訳開始コドンによって得ることができる。Cry3A毒素及びその低分子量変異形のアミノ酸配列は、Btにおいて天然発生する毒素に見出すことができる。Cry3A毒素は、SEQ ID NO:1におけるような天然型Bt遺伝子、又は、SEQ ID NO:3におけるような合成コーディング配列によってコードすることができる。「Cry3A毒素」は、Cry3A毒素中に天然発生するプロテアーゼ認識部位以上の付加的なプロテアーゼ認識部位を有することはない。Cry3A毒素は異種系において分離、精製、又は発現することができる。
【0052】
本明細書に使用された「Cry3A遺伝子」は、SEQ ID NO:1又はSEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を意味する。Cry3A遺伝子(Sekar他、1987、Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7036-7040)は、Bacillus thuringiensis var. tenebrionis(Kreig他、1983、Z. Angew. Entomol. 96:500-508)に見出されるような天然発生型、又は合成型であってよく、Cry3A毒素をコードする。本発明のCry3A遺伝子は、SEQ ID NO:1におけるような天然型Cry3A遺伝子、又はSEQ ID NO:3におけるようなトウモロコシ最適化Cry3A遺伝子と呼ぶことができる。
【0053】
毒素を「送達する」ことは、毒素が昆虫と接触し、その結果毒性効果をもたらし、昆虫を駆除することを意味する。毒素は、認識された多くの方法、例えば昆虫による経口摂取、又はトランスジェニック植物の発現、調製されたタンパク質組成物、噴霧可能なタンパク質組成物、ベイト・マトリックス、又は当業者に認識されているその他の毒素送達システムを介して昆虫と接触させることにより、送達することができる。
【0054】
「効果的な昆虫駆除量」は、害虫の生存、成長、摂食及び/又は繁殖の能力を毒性効果を通して阻害するか、或いは、作物の昆虫に関係する損害又は損失を制限する毒素の濃度を意味する。「効果的な昆虫駆除量」は、昆虫を殺すことを意味する場合と意味しない場合とがあるが、好ましくは、昆虫を殺すことを意味する。
【0055】
本明細書中に使用される「発現カセット」という用語は、適切な宿主細胞中に特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる核酸配列を意味する。発現カセットは、当該ヌクレオチド配列に作用連関されたプロモーターを含み、当該ヌクレオチド配列は終止シグナルに作用連関されている。発現カセットはまた典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要な配列を含む。当該ヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであってよく、すなわちこれは、その成分の少なくとも1つがその他の成分のうちの少なくとも1つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然発生型ではあるが、しかし異種発現に有用な組換え形として獲得されているカセットであってもよい。しかし典型的には、発現カセットは宿主に対して異種であり、すなわち、発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞中に天然発生することはなく、宿主細胞又は宿主細胞の原種中に、形質転換事象によって導入されていなければならない。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成性プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下で行われてよい。このプロモーターは、宿主細胞が或る特定の外部刺激に暴露されたときにのみ転写を開始する。多細胞生物、例えば植物の場合、プロモーターは特定の組織又は器官、或いは発育段階に対して特異的であってもよい。
【0056】
「遺伝子」は、ゲノム内に位置する定義済領域であって、上述のコーディング核酸配列以外に、コーディング部分の発現の制御、つまり転写及び翻訳に寄与する他の一次調節核酸配列を含む領域である。遺伝子はその他の5'及び3'未翻訳配列及び終止配列を含んでもよい。存在し得る更なる要素は例えばイントロンである。
【0057】
「当該遺伝子」とは、植物に導入されたときに、その植物に所望の特性、例えば抗生物質抵抗性、ウィルス抵抗性、昆虫抵抗性、疾患抵抗性又は他の害虫に対する抵抗性、除草剤耐性、改善された栄養価、産業プロセスにおける生産能力向上、又は改変された繁殖能力を付与する任意の遺伝子を意味する。「当該遺伝子」とは、植物中で商業的に高価値の酵素又は代謝産物を生成するために、植物に導入された遺伝子であってもよい。
【0058】
「消化管プロテアーゼ」は、昆虫の消化管内に天然に見出されるプロテアーゼである。このプロテアーゼは通常、摂取されたタンパク質の消化に関与する。
「異種」核酸配列は、これが導入される宿主細胞と天然では関連しない核酸配列であり、天然発生型核酸配列の非天然発生型多コピーを含む。
「相同」核酸配列は、これが導入される宿主細胞と天然で関連する核酸配列である。
「相同組換え」は、相同核酸分子間の核酸フラグメントの相互交換である。
「殺虫」は、昆虫を好ましくは殺すことによって駆除することができる毒性生体活性として定義される。
核酸配列が、基準核酸配列によってコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合、その核酸配列は、基準核酸配列と「等コード性」である。
【0059】
「単離された」核酸分子又は単離された毒素は、人手によってその天然環境から離されて存在する核酸分子又は毒素であり、従って天然の生成物ではない。単離された核酸分子又は毒素は、精製された形で存在してよく、或いは、非天然環境、例えば組換え宿主細胞中に存在してもよい。
本発明の「修飾Cry3A毒素」は、付加的なプロテアーゼ認識部位を少なくとも1つ有するCry3A誘導型毒素を意味し、この付加的なプロテアーゼ認識部位は、標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識され、Cry3A毒素中で天然には発生しない。修飾Cry3A毒素は天然発生せず、Bacillus thuringiensis中に見出される天然発生型毒素とは同一ではないアミノ酸配列を人手によって含む。修飾Cry3A毒素は、Cry3A毒素が標的昆虫にもたらす死亡率よりも高い死亡率を、同じ標的昆虫にもたらす。
【0060】
本発明による「修飾Cry3A遺伝子」は、未修飾Cry3A遺伝子中には天然発生しない少なくとも1つの付加的なプロテアーゼ認識部位のコーディング配列を含むCry3A誘導型遺伝子を意味する。修飾Cry3A遺伝子は、天然型Cry3A遺伝子又は合成型Cry3A遺伝子から誘導することができる。
「天然発生型プロテアーゼ認識部位」は、昆虫以外のものに由来するプロテアーゼ、又は、Cry3A毒素に対して鋭敏な昆虫種に由来するプロテアーゼ又は消化管抽出物によって開裂されるCry3A毒素内の位置である。例えば、Cry3A毒素に対して鋭敏な昆虫の消化管抽出物中に見出されるトリプシン及びプロテアーゼによって認識される天然発生型プロテアーゼ認識部位は、演繹Cry3A毒素アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のArg-158とAsn-159との間に存在する。キモトリプシンによって認識される天然発生型プロテアーゼ認識部位は、演繹Cry3A毒素アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のHis-161とSer-162との間並びにTys-587とTyr-588との間に存在する。
「核酸分子」又は「核酸配列」は、任意の源から分離することができる一本鎖又は二本鎖DNA又はRNAの線状セグメントである。本発明との関連において、核酸分子はDNAセグメントであることが好ましい。
【0061】
「植物」は、任意の発育段階にある任意の植物、具体的には種子植物である。
「植物細胞」は、植物の構造的且つ生理学的な単位であり、プロトプラストと細胞壁とを含む。植物細胞は、単離された単一細胞又は培養された細胞の形で、又は、より高度に組織された単位、例えば植物組織、植物器官、又は植物全体の一部であってよい。
「植物細胞培養」とは、植物単位、例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織内の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合体及び種々の発育段階の胚の培養を意味する。
「植物材料」とは、葉、茎、根、花又は花部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、切断部、細胞又は組織培養、又は植物のその他の任意の部分又は生成物を意味する。
本明細書中に使用される「植物組織」とは、構造的及び機能的な単位に組織化された植物細胞の群を意味する。in planta又は培養における任意の植物組織が含まれる。この用語の一例としては、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養及び、構造的単位及び/又は機能的単位に組織化された植物細胞の任意の群が含まれる。上述の又はこの定義によってそれ以外に包含される任意の特定のタイプの植物細胞との関連においてこの用語を使用するとしても、又はこのような植物細胞の存在なしにこの用語を使用するとしても、他のタイプの植物組織を排除するものではない。
【0062】
「プロモーター」はRNAポリメラーゼ結合部位を含有し、DNAの転写を開始するコーティング領域の上流の未翻訳DNA配列である。プロモーター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして作用するその他の要素を含んでもよい。
「プロトプラスト」は、細胞壁を有さないか又は細胞壁の一部しか有さない、単離された植物細胞である。
「調節要素」とは、ヌクレオチド配列の発現の制御に関与する配列を意味する。調節要素は、当該ヌクレオチド配列に作用連関されるプロモーターと終止シグナルとを含む。調節要素は典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要な配列をも包含する。
天然発生型プロテアーゼ認識部位を「置き換える」ことに関して、本発明によれば、付加的なプロテアーゼ認識部位は、付加的なプロテアーゼ認識部位の挿入が天然発生型プロテアーゼ認識部位を排除する場合に、天然発生型プロテアーゼ認識部位を「置き換える」と云う。例えば、Arg-158残基とAsn-159残基とを排除する、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のPro-154とPro-160との間に挿入された付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のArg-158とAsn-159との間に配置された天然発生型トリプシン認識部位と置き換わる。
【0063】
「セリン・プロテアーゼ」は、セリンによる標的ペプチド結合の求核攻撃に基づいたメカニズムを用いて、共有ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素から成る同一群を表す。セリン・プロテアーゼは、配列に対して特異的である。すなわち、それぞれのセリン・プロテアーゼは、酵素認識が発生するタンパク質内の特異的サブ配列を認識する。
「標的昆虫」は、Cry3A毒素に対する感受性を殆ど又は全く有していない害虫種であり、本発明の技術を用いて駆除するための候補として同定される。このような駆除は、幾つかの手段を介して達成することができるが、しかし、最も好ましくは、トランスジェニック植物中に本発明の核酸分子を発現させることによって達成することができる。
【0064】
「標的昆虫消化管プロテアーゼ」は、標的昆虫の消化管内に見出されるプロテアーゼであって、その認識部位をCry3A毒素中に挿入して、本発明の修飾Cry3A毒素を形成することができるプロテアーゼである。
「形質転換」は、宿主細胞又は生物中に異種核酸を導入するプロセスである。具体的には、「形質転換」は、当該生物のゲノム中にDNA分子を安定的に組込むことを意味する。
「形質転換された/トランスジェニック/組換え」は、異種核酸分子が導入された宿主生物、例えば細菌又は植物を意味する。核酸分子は宿主のゲノム中に安定的に組込むことができ、或いは、核酸分子は染色体外分子として存在していてもよい。このような染色体外分子は自己複製性である。形質転換された細胞、組織又は植物が、形質転換プロセスの最終生成物だけでなく、そのトランスジェニック子孫をも包含することは明らかである。「非形質転換」、「非トランスジェニック」又は「非組換え」ホストは野生型生物、例えば細菌又は植物であって、異種核酸分子を含有しないものを意味する。
天然発生型プロテアーゼ認識部位「内」に関しては、本発明によれば、付加的なプロテアーゼ認識部位が天然型プロテアーゼ認識部位の前に来るアミノ酸残基と、天然型プロテアーゼ認識部位の後に来るアミノ酸残基との間にある場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は天然発生型プロテアーゼ認識部位「内」にあると云う。例えば、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のTyr-587とTyr-588との間に挿入された付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のTyr-587とTyr-588との間に配置された天然発生型キモトリプシン認識部位「内」にある。天然発生型プロテアーゼ認識部位内の付加的なプロテアーゼ認識部位の挿入は、プロテアーゼによる天然発生型プロテアーゼ認識部位の認識を変化させても変化させなくてもよい。
【0065】
ヌクレオチドは、下記の標準省略形によってこれらの塩基で示される:アデニン(A)、シトシン(C)、チミン(T)及びグアニン(G)。アミノ酸は同様に下記の標準省略形によって示される:アラニン(Ala;A)、アルギニン(Arg;R)、アスパラギン(Asn;N)、アスパラギン酸(Asp;D)、システイン(Cys;C)、グルタミン(Gln;Q)、グルタミン酸(Glu;E)、グリシン(Gly;G)、ヒスチジン(His;H)、イソロイシン(Ile;l)、ロイシン(Leu;L)、リシン(Lys;K)、メチオニン(Met;M)、フェニルアラニン(Phe;F)、プロリン(Pro;P)、セリン(Ser;S)、トレオニン(Thr;T)、トリプトファン(Trp;W)、チロシン(Tyr;Y)及びバリン(Val;V)。
【0066】
本発明は、発現により修飾Cry3A毒素をもたらす修飾Cry3A核酸配列に関し、また、害虫を駆除するための修飾Cry3A毒素の形成及び使用に関する。修飾Cry3A核酸配列を発現させることにより、修飾Cry3A毒素がもたらされ、この修飾Cry3A毒素は、鞘翅目昆虫、例えばウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームを駆除するのに使用することができる。本発明の修飾Cry3A毒素は、Cry3A毒素中で天然発生しない少なくとも1つの付加的なプロテアーゼ認識部位を含む。標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識されるこの付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位とほぼ同じ位置に挿入される。修飾Cry3A毒素が標的昆虫にもたらす死亡率は、Cry3A毒素が同じ標的昆虫にもたらす死亡率よりも高い。好ましくは、Cry3A毒素が標的昆虫に最大30%の死亡率をもたらすのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【0067】
好ましい1実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、標的昆虫の消化管プロテアーゼ、カテプシンGによって認識される。カテプシンG活性は、実施例2において説明するように、標的昆虫ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管内に存在することが見極められる。好ましくは、カテプシンG活性の存在を見極めるのに使用される基質アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)が、本発明に従ってCry3A毒素中に挿入される。その他のカテプシンG認識部位、例えばAAPM(SEQ ID NO:36)、AVPF(SEQ ID NO:37)、PFLF(SEQ ID NO:38)、又はTanaka他、1985の方法(Biochemistry 24:2040-2047)によって見極められるようなその他のカテプシンG認識部位を、本発明に従って使用することもできる。上記文献の内容を参考のため本明細書中に引用する。標的昆虫の消化管中で同定されるその他のプロテアーゼのプロテアーゼ認識部位、例えば、その他のセリン・プロテアーゼ、システイン・プロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識部位を使用することができる。この実施態様によって包含される好ましいセリン・プロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ及びエラスターゼを含む。
【0068】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素のドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置、該認識部位に隣接する位置、又は該認識部位内の位置で、ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、未修飾Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置、該認識部位に隣接する位置、又は該認識部位内の位置で、ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入されるカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A毒素をコードする核酸分子である。
【0069】
修飾Cry3A毒素をコードする修飾Cry3A核酸分子を形成する方法の具体的な教示例は、実施例3に見出すことができる。当業者には明らかなように、本発明に従ってCry3A毒素中に付加的なプロテアーゼ認識部位を挿入するために、当業者に知られているその他の方法を用いることもできる。
【0070】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間に挿入される。好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A054 (SEQ ID NO:6)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A054毒素(SEQ ID NO:7)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位は、天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接する。SEQ ID NO:6の核酸分子は異種宿主中に発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:6に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0071】
別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む、修飾Cry3A055毒素(SEQ ID NO:9)をコードするCry3A055(SEQ ID NO:8)と呼ばれる核酸分子、及び、修飾Cry3A085毒素(SEQ ID NO:11)をコードするCry3A085(SEQ ID NO:10)と呼ばれる核酸分子である。SEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:10の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:10に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0072】
好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に挿入される。
【0073】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A082 (SEQ ID NO:12)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A082毒素(SEQ ID NO:13)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位は、天然発生型キモトリプシン認識部位と置き換わる。SEQ ID NO:12の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことはSEQ ID NO:12に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0074】
別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A058 (SEQ ID NO:14)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A058毒素(SEQ ID NO:15)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位は、天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。SEQ ID NO:14の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことはSEQ ID NO:14に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0075】
さらに別の好ましい実施態様の場合、本発明は修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A057 (SEQ ID NO:16)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A057毒素(SEQ ID NO:17)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位はドメインIにおいて、天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接し、またドメインIIIにおいて、天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。SEQ ID NO:16の核酸分子は異種宿主中に発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:16に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0076】
さらに別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A056 (SEQ ID NO:18)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A056毒素(SEQ ID NO:19)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位はドメインIにおいて、天然発生型トリプシン認識部位及び天然発生型キモトリプシン部位に隣接し、またドメインIIIにおいて、天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。SEQ ID NO:18の核酸分子は異種宿主中に発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:18に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0077】
さらに別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A058 (SEQ ID NO:20)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A083毒素(SEQ ID NO:21)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位はドメインIにおいて、天然発生型トリプシン認識部位及び天然発生型キモトリプシン部位に隣接し、またドメインIIIにおいて、天然発生型キモトリプシン認識部位と置き換わる。SEQ ID NO:20の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:20に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0078】
好ましい実施態様の場合、本発明の単離された核酸分子は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む。
【0079】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む修飾Cry3A毒素をコードする、単離された核酸分子を包含する。
本発明はまた、本発明の核酸配列を含む組換えベクターを包含する。このようなベクターにおいて、核酸配列は好ましくは、ヌクレオチド配列を発現させることができる宿主細胞中にヌクレオチド配列を発現させるための調節要素を含む発現カセット内に含まれる。このような調節要素は普通、プロモーター及び終止シグナルを含み、また好ましくは、本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドの効率的な翻訳を可能にする要素をも含む。核酸配列を含むベクターは普通、特定の宿主細胞中で、好ましくは染色体外分子として複製することができ、従って、宿主細胞内で本発明の核酸配列を増幅するのに使用される。1実施態様の場合、このようなベクターのための宿主細胞は、微生物、例えば細菌、具体的にはBacillus thuringiensis又はE.coliである。別の実施態様の場合、このような組換えベクターのための宿主細胞は、内生植物又は着生植物である。このようなベクターの好ましい宿主細胞は、真核細胞、例えば植物細胞である。植物細胞、例えばトウモロコシ細胞が最も好ましい宿主細胞である。別の好ましい実施態様の場合、このようなベクターはウィルス・ベクターであり、特定の宿主細胞、例えば昆虫細胞又は植物細胞中のヌクレオチド配列の複製のために使用される。宿主細胞中に本発明のヌクレオチド配列を形質転換するために、組換えベクターも使用される。これにより、ヌクレオチド配列は、このような宿主細胞のDNA中に安定的に組込まれる。1実施態様の場合、このような宿主細胞は原核細胞である。好ましい実施態様の場合、このような宿主細胞は真核細胞、例えば植物細胞である。最も好ましい実施態様の場合、宿主細胞は植物細胞、例えばトウモロコシ細胞である。
【0080】
別の観点において、本発明は、本発明の核酸分子を発現させることにより生成された修飾Cry3A毒素を包含する。
【0081】
好ましい実施態様の場合、本発明の修飾Cry3A毒素は、本発明のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを含む。別の好ましい実施態様の場合、修飾Cry3A毒素は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む核酸分子を発現させることによって生成される。
【0082】
好ましい実施態様の場合、本発明の修飾Cry3A毒素は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む。
【0083】
本発明の修飾Cry3A毒素は、バイオアッセイで害虫に対して試験した場合に、昆虫駆除活性を有する。別の好ましい実施態様の場合、本発明の修飾Cry3A毒素は、鞘翅目昆虫に対して、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対して活性である。本発明の修飾Cry3A毒素の昆虫駆除特性は、さらに実施例4及び6において示す。
【0084】
本発明はまた、本発明による効果的な昆虫駆除量の修飾Cry3A毒素を含む組成物を包含する。
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、昆虫に対して活性の修飾Cry3A毒素を生成する方法であって、(a)本発明の核酸分子に作用連関された異種プロモーター配列をそれ自体が含むキメラ遺伝子を含む宿主細胞を獲得し;そして(b)トランスジェニック宿主細胞内に核酸分子を発現させることにより、昆虫に対して活性の1種以上の修飾Cry3A毒素を生じさせる、ことを含む方法を包含する。
【0085】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、昆虫に対して抵抗性のトランスジェニック植物を生成する方法であって、トランスジェニック植物中に本発明の核酸分子を導入することを含み、この核酸分子が昆虫駆除に有効な量でトランスジェニック植物において発現可能である、方法を包含する。好ましい実施態様の場合、これらの昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームである。
【0086】
さらに別の好ましい実施態様の場合、本発明は昆虫駆除の方法であって、本発明の有効量の修飾Cry3A毒素を昆虫に送達することを含む方法を包含する。1実施態様によれば、昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームである。好ましくは、修飾Cry3A毒素は昆虫に経口送達される。好ましい1実施態様の場合、毒素は、本発明の修飾Cry3A毒素を発現させる核酸配列を含むトランスジェニック植物を通して経口送達される。
【0087】
本発明はまた、修飾Cry3A毒素の形成方法であって:(a) Cry3A毒素をコードするCry3A毒素遺伝子を獲得し;(b) 標的昆虫の消化管プロテアーゼを同定し;(c) 前記消化管プロテアーゼのための認識部位をコードするヌクレオチド配列を獲得し;(d) ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に、Cry3A毒素遺伝子内の天然発生型プロテアーゼ認識部位をコードするヌクレオチド配列と置き換わる位置、該ヌクレオチド配列内の位置、又は該ヌクレオチド配列に隣接する位置で前記(c)のヌクレオチド配列を挿入し、こうして修飾Cry3A毒素遺伝子を作成し;(e) 前記修飾Cry3A毒素遺伝子を発現カセット中に挿入し;(f) 前記修飾Cry3A毒素遺伝子を非ヒト宿主細胞中に発現させることにより、修飾Cry3A毒素を生成する宿主細胞を生じさせ;そして(g) 標的昆虫に対して修飾Cry3A毒素をバイオアッセイし、これにより、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされる標的昆虫の死亡率よりも高い死亡率を標的昆虫にもたらすことを含む、方法を包含する。好ましい実施態様の場合、Cry3A毒素が標的昆虫に最大30%の死亡率をもたらすのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【0088】
本発明はさらに、昆虫駆除の方法であって、トランスジェニック植物がさらに、第2の殺虫成分をコードする第2の核酸配列又は核酸配列群を含む方法を包含する。特に好ましい第2の核酸配列は、δ-エンドトキシンをコードする核酸配列、米国特許第5,849,870号明細書及び同第5,877,012号明細書(これらを参考のため本明細書中に引用する)に開示された栄養殺虫剤タンパク質毒素をコードする核酸配列、又は非タンパク質成分を生成するための経路をコードする核酸配列である。
【0089】
別の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列はさらに、in vitroでの組換え又はDNAシャッフリングとして知られている技術で、ランダムな突然変異を組込むことにより修飾することができる。この技術はStemmer他、Nature 370:389-391(1994)及び米国特許第5,605,793号明細書に記載されている。これらの文献を参考のため本明細書中に引用する。本発明の元のヌクレオチド配列に基づいて、ヌクレオチド配列の数百万の突然変異体コピーが生成され、改善された特性、例えば増大した殺虫活性、向上した安定性、又は標的昆虫の異なる特異性又は範囲を有する変異形が回収される。この方法は、本発明のヌクレオチド配列を含む鋳型二本鎖ポリヌクレオチドから、突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを包含し、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドは開裂によって所望のサイズの二本鎖ランダム・フラグメントにされている。そしてこの方法は、結果として生じた二本鎖ランダム・フラグメント個体群に、1又は2種以上の一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドを添加し、前記オリゴヌクレオチドは二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対して同一性領域及び異種性領域を含み;結果として生じた二本鎖ランダム・フラグメントとオリゴヌクレオチドとの混合物を変性して一本鎖フラグメントにし;結果として生じた単鎖フラグメント個体群を、同一性領域で前記単鎖フラグメントをアニーリングすることになる条件下で、ポリメラーゼと一緒にインキュベートすることにより、アニールされたフラグメント対を形成し、同一性領域は、対の一方の員が他方の員の複製をプライムするのに十分であり、これにより、突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成し;2回以上の更なるサイクルにわたって第2ステップ及び第3ステップを反復し、更なるサイクルの第2ステップにおける混合物が、前のサイクルの第3ステップから得られた突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを含み、そして、前記更なるサイクルは、更なる突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成する、ステップを含む。好ましい実施態様の場合、二本鎖ランダム・フラグメント個体群における二本鎖ランダム・フラグメントの単一種の濃度は、総DNAの1重量%未満である。別の好ましい実施態様の場合、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドは、約100種以上のポリヌクレオチドを含む。別の好ましい実施態様の場合、二本鎖ランダム・フラグメントのサイズは、約5bp-5kbである。別の好ましい実施態様の場合、この方法の第4ステップは、10サイクル以上にわたって第2ステップ及び第3ステップを反復することを含む。
【0090】
異種微生物宿主におけるヌクレオチド配列の発現
生物学的な昆虫駆除剤として、殺虫性修飾Cry3A毒素は、ヌクレオチド配列を発現させることができる異種宿主中にヌクレオチド配列を発現させることにより生成される。第1の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列の修飾形を含むB. thuringiensis細胞が形成される。このような修飾形は、既存の調節要素を突然変異させるか又は抹消し、こうしてヌクレオチド配列の発現を変化させるか、又はヌクレオチド配列の発現を制御する新しい調節要素を組込むことを包含する。別の実施態様の場合、ヌクレオチド配列のうちの1又は2つ以上の付加的なコピーが、染色体中に挿入することにより、又は、これらのヌクレオチド配列を含有する染色体外複製分子を導入することにより、Bacillus thuringiensis細胞に添加される。
【0091】
別の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、プロモーター及び終止シグナルを含む適切な発現カセット内に挿入される。ヌクレオチド配列の発現は構成的であるか、或いは、転写を開始するための種々のタイプの刺激に応答する誘導性プロモーターが使用される。好ましい実施態様の場合、毒素が発現される細胞は微生物、例えばウィルス、細菌又は菌類である。好ましい実施態様の場合、ウィルス、例えばバキュロウィルスは、そのゲノム中に本発明のヌクレオチド配列を含有し、ウィルス複製及びヌクレオチド配列の発現に適した真核細胞の感染後に、対応する多量の殺虫性毒素を発現させる。こうして生成された殺虫性毒素は、殺虫剤として使用される。或いは、ヌクレオチド配列を含むように遺伝子工学的に作り出されたバキュロウィルスを使用することにより、in vivoで昆虫を感染させ、そして、殺虫性毒素を発現させるか、又はウィルス感染と殺虫性毒素の発現とを組み合わせることにより、これらの昆虫を殺す。
【0092】
細菌細胞は、本発明のヌクレオチド配列を発現させるための宿主でもある。好ましい実施態様の場合、植物細胞内で生存し複製することができる非病原性共生細菌、いわゆる内生植物、又は、葉圏又は根圏をコロニー化することができる非病原性共生細菌、いわゆる着生植物が使用される。このような細菌は、Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces及びXanthomonasの属から成る細菌を含む。共生菌類、例えばTrichoderma及びGliocladiumも、同じ目的で本発明のヌクレオチド配列を発現させるのに考えられ得る宿主である。
【0093】
これらの遺伝子操作の技術は、利用可能な種々異なる宿主に対して特異的であり、当業者に知られている。例えば、発現ベクターpKK223-3及びpKK223-2を使用することにより、tac及びtrcプロモーターの後ろで、転写融合又は翻訳融合の際にE.coli中に異種遺伝子を発現させることができる。複数のORFをコードするオペロンを発現させるために、最も簡単な手順は、転写融合の際にpKK223-3のようなベクター内にオペロンを挿入し、異種遺伝子の同系リボソーム結合部位の使用を可能にすることである。グラム陽性種、例えばBacillusにおける過剰発現技術も当業者に知られており、本発明の関連において使用することができる(Quax他、「Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics」 Baltz他編、American Society for Microbiology, Washington (1993))。過剰発現の代替系は、例えば酵母ベクターに依存し、Pichia, Saccharomyces 及びKluyveromycesの使用を含む(Sreekrishna 「Industrial Microorganisms: basic and applied molecular genetics」 Baltz, Hegeman及びSkatrud編、American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173-177(1994); van den Berg他、Biotechnology 8:135-139(1990))。
【0094】
植物の形質転換
特に好ましい実施態様の場合、本発明の殺虫性修飾Cry3A毒素の少なくとも1種が、より高等な生物、例えば植物において発現される。この場合、有効量の修飾Cry3A毒素を発現させるトランスジェニック植物は、害虫から自らを守る。昆虫がこのようなトランスジェニック植物を食べはじめると、その昆虫は、発現された修飾Cry3A毒素をも摂取することになる。このことは、昆虫がこれ以上植物組織に食い付くことを阻止することになり、或いは、昆虫に危害を加えるか又は殺しさえすることができる。本発明のヌクレオチド配列は発現カセット内に挿入され、この発現カセットは次いで好ましくは前記植物のゲノム中に安定的に組込まれる。別の好ましい実施態様の場合、ヌクレオチド配列は、非病原性自己複製ウィルス中に含まれる。本発明に従って形質転換される植物は、単子葉植物又は双子葉植物であってよく、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、サツマイモ、豆、エンドウ豆、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、蕪、大根、ほうれん草、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、胡椒、セロリ、スカッシュ、カボチャ、麻、ズッキーニ、リンゴ、西洋ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、桃、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、大豆、トマト、サトウモロコシ、サトウキビ、甜菜、ヒマワリ、菜種、クローバー、タバコ、ニンジン、綿、アルファルファ、稲、ジャガイモ、茄子、キュウリ、アラビドプシス、及び樹木植物、例えば針葉樹及び落葉樹を含む。所望のヌクレオチド配列が特定の植物種内に形質転換されると、このヌクレオチド配列は伝統的な繁殖技術を用いて、その種内で増殖するか、又は、具体的には実用品種を含む同一種の他の亜種に移動することができる。本発明のヌクレオチド配列は好ましくはトランスジェニック植物中で発現され、こうしてトランスジェニック植物中で、対応する修飾Cry3A毒素を生合成させる。このようにして、昆虫に対して抵抗性が増強されたトランスジェニック植物が生成される。トランスジェニック植物中の発現のために、本発明のヌクレオチド配列は、他の修飾及び最適化を必要とすることがある。多くの場合、微生物に由来する遺伝子は植物中に修飾なしに高レベルで発現させることができるものの、植物において好ましくないコドンを有する微生物ヌクレオチド配列からは、トランスジェニック植物における発現率が低くなることがある。全ての生物がコドン使用頻度に対して特異的な優先傾向を有していることが当業者に知られており、本発明において記載されたヌクレオチド配列のコドンを変更することにより、植物の優先傾向と一致させる一方、これによりコードされたアミノ酸を維持することができる。さらに、GC含有率が約35%以上、好ましくは45%超、より好ましくは約50%超、最も好ましくは約60%超のコーディング配列から、植物中の高発現率が最良に達成される。GC含有率が低い微生物ヌクレオチド配列は、メッセージを不安定化させるATTTAモチーフ、及び、不適切なポリアデニル化を引き起こすAATAAAモチーフの存在に起因して植物中の発現率を悪くするおそれがある。好ましい遺伝子配列は、単子葉植物種及び双子葉植物種の両方において十分に発現させることができるものの、単子葉植物及び双子葉植物の特異的なコドン優先傾向及びGC含有率優先傾向に寄与するように配列を修飾することができる。それというのも、これらの優先傾向は互いに異なることが判っているからである(Murray他、Nucl. Acids Res. 17:477-498(1989))。加えてヌクレオチド配列は、メッセージを切断するおそれのある非正統的なスプライス部位の存在に関してスクリーニングされる。上述のような、ヌクレオチド配列内で行われる必要のある全ての変更は、特定部位の突然変異誘発、PCR、及び、欧州特許出願公開第0385962号明細書(Monsanto)、同第0359472号明細書(Lubrizol)及び国際公開第93/07278号パンフレット(Ciba-Geigy)に記載された方法による合成遺伝子構成の良く知られた技術を用いて実施される。
【0095】
本発明の1実施態様の場合、Cry3A遺伝子は、米国特許第5,625,136号明細書に開示された手順に従って形成される。上記明細書を参考のため本明細書中に引用する。この手順において、トウモロコシ優先コドン、すなわちトウモロコシ中のそのアミノ酸を最も頻繁にコードする単一コドンが使用される。特定のアミノ酸に対応するトウモロコシ優先コドンは、例えばトウモロコシに由来する既知の遺伝子配列から誘導されてよい。トウモロコシ植物に由来する28個の遺伝子に対応するトウモロコシ・コドン使用頻度が、Murray他、Nucleic Acids Research 17:477-498(1989)に見出される。この文献の開示内容を参考のため本明細書中に引用する。トウモロコシ最適化コドンで形成された合成配列はSEQ ID NO:3に示される。
このようにして、ヌクレオチド配列は任意の植物における発現のために最適化することができる。すなわち、合成最適化配列又は部分最適化配列を使用することもできる。
効率的な翻訳開始のために、開始メチオニンに隣接する配列は修飾を必要する場合がある。例えばこれらの配列は、植物において効果的であることが知られている配列を含むことにより修飾することができる。Joshiは、植物のための適切なコンセンサスを示唆しており(NAR 15:6643-6653(1987))、そしてClonetechは、更なるコンセンサス翻訳イニシエーター(1993/1994カタログ、第210頁)を示唆する。これらのコンセンサスは、本発明のヌクレオチド配列と共に使用するのに適している。これらの配列は、ATGまでの(ATGを含む)ヌクレオチド配列(第2アミノ酸は未修飾のままにする)、或いは、ATGに続くGTCまでの(GTCを含む) ヌクレオチド配列(導入遺伝子の第2アミノ酸を修飾することが可能である)を含む構造中に組込まれる。
【0096】
トランスジェニック植物におけるヌクレオチド配列の発現は、植物中で機能するプロモーターによって推進される。プロモーターは、発現に必要な時間的及び空間的な要件に応じて、また標的種に応じて選択される。従って、葉、軸及び茎、穂、花部(例えば下穂、円錐花序、穂軸)、根、及び/又は苗中に、本発明のヌクレオチド配列が発現されることが好ましい。しかし多くの場合、2つ以上のタイプの害虫に対する保護が求められ、ひいては複数の組織における発現が望ましい。双子葉植物に由来する多くのプロモーターが単子葉植物において作用可能であり、その逆も云えることが判っているが、理想的には、双子葉植物における発現のためには双子葉植物プロモーターが選択され、単子葉植物における発現のためには単子葉植物プロモーターが選択される。しかし、選択されるプロモーターの起源に対する制限はなく、これらが所望の細胞におけるヌクレオチド配列の発現を推進する上で作用可能であれば十分である。
【0097】
構成的に発現される好ましいプロモーターは、アクチン又はユビキチンをコードする遺伝子に由来するプロモーターと、CaMV 35S及び19Sプロモーターを含む。本発明のヌクレオチド配列は、化学的に調節されるプロモーターによって調節されながら発現させることもできる。このことは、作物が誘導性化学物質で処理されるときにだけ、殺虫性修飾Cry3A毒素が合成されることを可能にする。遺伝子発現の化学的誘導のための好ましい技術に関しては、欧州特許出願公開第0332104号明細書(Ciba-Geigy)及び米国特許第5,614,395号明細書に詳細に記載されている。化学的誘導のための好ましいプロモーターは、タバコPR-1aプロモーターである。
【0098】
プロモーターの好ましいカテゴリーは、傷誘導性のプロモーターである。傷部位で、また植物病原体感染部位でも発現される多くプロモーターが記述されている。理想的には、このようなプロモーターは感染部位で局所的にのみ活性であることが望ましく、このようになっていれば、殺虫性修飾Cry3A毒素は、侵入する害虫を殺すために殺虫性修飾Cry3A毒素を合成するのを必要とする細胞にだけ蓄積する。このような種類の好ましいプロモーターは、Stanford他、Mol.Gen. Genet. 215:200-208(1989), Xu他、Plant Molec. Biol. 22:573-588(1993), Logemann他、Plant Cell 1:151-158(1989), Rormeier及びLehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792(1993), Firek他、Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993)及びWarner他、Plant J.3:191-201(1993)によって記載されたプロモータを含む。植物、具体的にはトウモロコシにおいて修飾Cry3A毒素遺伝子を発現させるのに有用な組織特異的又は組織優先的なプロモーターは、根、髄、葉又は花粉、特に根において発現を導くプロモーターである。このようなプロモーターは、例えば米国特許第5,625,136号明細書に開示されたPEPC又はtrpA、又は、米国特許第5,466,785号明細書に開示されたMTLから単離されたプロモーターである。上記両米国特許明細書全体を参考のため本明細書中に引用する。
【0099】
別の好ましい実施態様は、傷誘導式又は病原体感染誘導式に、ヌクレオチド配列を発現させるトランスジェニック植物である。
プロモーターに加えて、本発明の修飾Cry3A毒素遺伝子を使用したキメラ遺伝子構造において、種々の転写ターミネーターを使用することもできる。転写ターミネーターは、導入遺伝子を超えた転写の終結、及びその正確なポリアデニル化に寄与する。適切な転写ターミネーター及び植物において機能することが知られているターミネーターは、CaMV 35Sターミネーター、tmlターミネーター、ノパリン・シンターゼ・ターミネーター、pea rbcS E9ターミネーター及び当業者に知られたその他のターミネーターを含む。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方において使用することができる。植物中で機能することが知られている任意の利用可能なターミネーターを、本発明の関連において使用することができる。
【0100】
本発明において記載された発現カセット内に、その他の多くの配列を組込むことができる。これらの配列は、発現を増強することが判っている配列、例えばイントロン配列(例えばAdhl及びbronzel由来)及びウィルス・リーダー配列(例えばTMV, MCMV及びAMV由来)を含む。
【0101】
植物中の種々異なる細胞部位を標的として本発明のヌクレオチド配列を発現させることが好ましい。幾つかの場合には、細胞質ゾルにおける局在化が望ましいのに対して、他の場合には、何らかの亜細胞小器官における局在化が望ましい。導入遺伝子によってコードされた酵素の亜細胞局在化が、当業者に良く知られた技術によって行われる。典型的には、小器官を標的とした既知の遺伝子生成物に由来する標的ペプチドをコードするDNAが操作され、ヌクレオチド配列の上流で融合される。多くのこのような標的配列が葉緑体に関して知られており、異種構造においてこれらの配列が機能することが判っている。本発明のヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞の小胞体又は液胞を標的とする。これを達成するための技術は当業者に良く知られている。
【0102】
植物の形質転換に適したベクターは、本明細書の別の箇所に記載されている。アグロバクテリウム媒介性形質転換の場合、二元ベクター、又は少なくとも1つのT-DNAボーダー配列を担持する二元ベクターが好適であり、これに対して、直接的な遺伝子導入の場合には、いかなるベクターも好適であり、当該構造だけを含有する線状DNAが好ましい。直接的な遺伝子導入の場合、単一DNA種による形質転換又は同時形質転換を用いることができる(Schocher他、Biotechnology 4:1093-1096(1986))。直接的な遺伝子導入の場合にも、アグロバクテリウム媒介性導入の場合にも、形質転換は普通(必ずというわけではない)、選択マーカーを用いて行われる。この選択マーカーは抗生物質(カナマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキサート)又は除草剤(バスタ)に対する耐性を提供することができる。本発明の修飾Cry3A毒素遺伝子を含む植物形質転換ベクターは、米国特許第5,767,378号明細書及び同第5,994,629号明細書(これらを参考のため本明細書中に引用する)に開示されているような、トランスジェニック植物をポジティブに選択することを可能にする遺伝子(例えばホスホマンノース・イソメラーゼ;PMI)を含んでもよい。しかし選択マーカーの選択肢は、本発明にとってさほど重要ではない。
【0103】
別の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列は、プラスチド・ゲノム中に直接的に形質転換される。プラスチド形質転換の主な利点は、プラスチドが一般に、コドンが実質的に最適化されていない細菌遺伝子を発現させることができること、及び、プラスチドが単一プロモーターの制御下で複数のオープン・リーディング・フレームを発現させることができること、である。プラスチド形質転換技術は、米国特許第5,451,513号明細書、同第5,545,817号明細書及び同第5,545,818号明細書、国際公開第95/16783号パンフレット、及びMcBride他(1994)Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305に広範囲にわたって記載されている。葉緑体形質転換のための基本技術は、バイオリスティクス又はプロトプラスト形質転換(例えば塩化カルシウム又はPEGを媒介とする形質転換)を用いて、選択マーカーを側面に有するクローニングされたプラスチドDNAの領域を、当該遺伝子と一緒に好適な標的組織中に導入することを伴う。ターゲティング配列と呼ばれる1-1.5kbの側面領域は、プラスチド・ゲノムとの相同組換えを容易にし、ひいては、プラストムの特定領域の置換又は修飾を可能にする。先ず、スペクチノマイシン及び/又はストレプトマイシンに対する耐性を付与する葉緑体16S rRNA及びrps12の遺伝子中の点突然変異体が、形質転換のための選択マーカーとして利用される(Svab,Z., Hajdukiewicz, P.及びMaliga, P.(1990)Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J.M.及びMaliga, P.(1992)Plant Cell 4, 39-45)。その結果、標的となる葉に対する衝撃100回当たりほぼ1回の頻度で、安定的な同種形成性の形質転換体が得られる。これらのマーカーの間にクローニング部位が存在することにより、外来遺伝子を導入するためのプラスチド標的ベクターの形成が可能になった(Staub, J.M及びMaliga, P.(1993)EMBO J.12,601-606)。劣性rRNA又はr-タンパク質抗生物質耐性遺伝子を、主要な選択マーカー、スペクチノマイシン解毒酵素、アミノグリコシド-3'-アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌aadA遺伝子と置換することにより、形質転換頻度が実質的に増大する(Svab,Z及びMaliga, P.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917)。既に、このマーカーは、緑藻Chlamydomonas reinhardtiiのプラスチド・ゲノムの高頻度形質転換に使用することに成功している(Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089)。プラスチド形質転換に有用な他の選択マーカーが当業者に知られており、これらは本発明の範囲に含まれる。典型的には、同種形成性の状態に達するには、形質転換に続いてほぼ15-20回の細胞分裂サイクルが必要となる。それぞれの植物細胞内に存在する環状プラスチドゲノムの数千個のコピーの全てに、相同組換えにより遺伝子が挿入されるプラスチド発現は、コピー数が莫大であるという、核発現遺伝子を凌ぐ利点を利用することにより、可溶性植物タンパク質全体の10%を容易に上回ることができる発現レベルを可能にする。好ましい実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列は、プラスチド標的ベクター中に挿入され、所望の植物宿主のプラスチド・ゲノム中に形質転換される。本発明のヌクレオチド配列を含有するプラスチド・ゲノムに対して同種形成性の植物が得られ、これらの植物は、このヌクレオチド配列を優先的に高発現させることができる。
【0104】
昆虫駆除成分の組み合わせ
本発明の修飾Cry3A毒素をBtδ-エンドトキシン又はその他の殺虫性成分と組み合わせて使用することにより、害虫の標的範囲を広くすることができる。さらに、Btδ-エンドトキシン又は明確な性質を有するその他の殺虫性成分と組み合わせて、本発明の修飾Cry3A毒素を使用することは、昆虫における抵抗性の予防及び/又は管理に特に有用である。
他の殺虫性成分は例えば、レクチン、α-アミラーゼ、ペルオキシダーゼ及びコレステロール・オキシダーゼを含む。栄養殺虫性タンパク質遺伝子、例えば米国特許第5,889,174号明細書に開示されたVip1A(a)及びvip2A(a)も本発明において有用である。上記明細書を参考のため本明細書中に引用する。
必要な遺伝子全てを含有し発現させるように植物を遺伝子工学的に作り出すことにより、同じトランスジェニック植物中に2つ以上の殺虫性成分を同時発現させることができる。或いは、本発明の遺伝子を発現させるために、植物「親1」を遺伝子工学的に作成することができる。補足的な昆虫駆除成分を発現させるために、第2の植物「親2」を遺伝子工学的に作成することができる。親1と親2とを交配することにより、親1と親2とに導入された遺伝子全てを発現させる子孫植物が得られる。本発明のトランスジェニック種子は、米国特許第5,849,320号明細書及び同第5,876,739号明細書に記載されているような殺虫性種子コーティングで処理することもできる。上記明細書を参考のため本明細書中に引用する。殺虫性種子コーティングと本発明のトランスジェニック種子との双方が同じ標的昆虫に対して活性である場合、その組み合わせは、(i)標的昆虫に対する本発明の修飾Cry3A毒素の活性を増強する方法、及び(ii)標的昆虫に対する第2の作用メカニズムを提供することにより、本発明の修飾Cry3A毒素に対する抵抗性の発生を予防する方法、において有用である。従って本発明は、標的昆虫、例えばコーン・ルートワームに対する活性を増強するか、又は該標的昆虫における抵抗性の発生を予防する方法であって、本発明の1又は2種以上の修飾Cry3A毒素を含むトランスジェニック種子に殺虫性種子コーティングを塗布することを含む、方法を提供する。
【0105】
殺虫性種子コーティングが異なる昆虫に対して活性である場合にも、例えば、鞘翅目昆虫に対して活性を有する本発明のトランスジェニック種子に、鱗翅目昆虫に対して活性を有する殺虫性種子コーティングを添加することにより、殺虫性種子コーティングは昆虫駆除範囲を広げるのに有用である。生成されたコーティング済トランスジェニック種子は、鱗翅目及び鞘翅目双方の害虫を駆除する。
【0106】
実施例
下記に詳述する実施例を参照することにより、本発明をさらに説明する。これらの実施例は例示を目的としてのみ提供され、特に断りのない限り、本発明を限定するものではない。これらの実施例において使用した標準的な組換えDNA及び分子クローニング技術は当業者に良く知られており、J. Sambrook他著、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第3版、Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001);T.J.Silhavy, M.L. Berman及びL.W.Enquist著、Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY: (1984)及びAusubel, F.M.他著、Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter他著、Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press(1992)及びSchultz他著、Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers(1998)によって記述されている。
【0107】
実施例1:トウモロコシ最適化Cry3A遺伝子の構成
トウモロコシに対して最適化されたCry3A遺伝子を、米国特許第5,625,136号明細書に開示された手順に従って形成する。この手順において、トウモロコシ優先コドン、すなわちトウモロコシ中のそのアミノ酸を最も頻繁にコードする単一コドンを使用する。特定のアミノ酸に対応するトウモロコシ優先コドンは、例えばトウモロコシに由来する既知の遺伝子配列から誘導する。トウモロコシ植物に由来する28個の遺伝子に対応するトウモロコシ・コドン使用頻度が、Murray他、Nucleic Acids Research 17:477-498(1989)に見出される。トウモロコシ最適化コドンで形成された合成配列をSEQ ID NO:3に示す。
【0108】
実施例2: ウェスタン・コーン・ルートワーム消化管におけるカテプシンG酵素活性の同定
ウェスタン・コーン・ルートワーム消化管におけるカテプシンG様(セリン・プロテアーゼ)及びカテプシンB様(システイン・プロテアーゼ)酵素活性を、比色分析基質を使用して測定する。それぞれ1mlの反応物は、第3齢のウェスタン・コーン・ルートワームの5つの均質化中腸と、反応緩衝液(10mM Tris, 5mM NaCl, 0.01 M DTT, pH7.5)中に溶解された基質1mgとを含有する。試験されるカテプシンG基質は、Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO:35)-pNAであり、カテプシンB基質はArg-Arg-pNAである。反応物を1時間にわたって28℃でインキュベートする。プロテアーゼが適切な基質を認識する効率を示す、黄色形成強度を処理物と対照とで比較する。色が検出されない場合、又は僅かなバックグラウンド色が検出される場合には、反応物には負(-)のスコアを与える。バックグラウンドを25%、50%、75%又は100%上回る反応物には、それぞれ+, ++, +++又は++++のスコアを与える。酵素アッセイの結果を下記表に示す。
【0109】
【表1】
セリン・プロテアーゼ、カテプシンGの活性がウェスタン・コーン・ルートワーム消化管中で同定されたのはこれが初めてである。ウェスタン・コーン・ルートワーム消化管は明らかに、カテプシンB(システイン・プロテアーゼ)活性よりも強いカテプシンG(セリン・プロテアーゼ)活性を有している。本発明の修飾Cry3A毒素を形成するためのカテプシンGプロテアーゼ認識部位として、AAPF配列(SEQ ID NO:35)を選択する。
【0110】
実施例3:修飾Cry3A遺伝子の構築
ドメインI又はドメインIII、或いはドメインI及びドメインIIIの両方においてカテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を含む修飾Cry3A遺伝子を、オーバーラップPCRを用いて形成する。プラスミドpCIB6850(SEQ ID NO:5)に含まれる、トウモロコシ最適化Cry3A遺伝子(SEQ ID NO:2)を、開始鋳型として使用する。修飾Cry3A毒素をコードする8つの修飾Cry3A遺伝子構造、すなわち、ドメインI内にカテプシンG認識部位コーティング配列を含むCry3A054, Cry3A055, Cry3A085; ドメインIII内にカテプシンG認識部位コーティング配列を含むCry3A058, Cry3A082; ドメインI及びドメインIII内にカテプシンG認識部位コーティング配列を含むCry3A056, Cry3A057, Cry3A083を形成する。これら8つの修飾Cry3A遺伝子及びこれらがコードする修飾Cry3A毒素を以下に説明する:
【0111】
pCMS054に含まれるCry3A054
Cry3A054(SEQ ID NO:6)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する:
1. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3' (SEQ ID NO:23)
2. TAIL5mod-5'-GCTGCACCGTTCCCCCACAGCCAGGGCCG-3' (SEQ ID NO:24)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
3. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
【0112】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を次いで等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A054遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS054と呼ばれ、Cry3A054遺伝子(SEQ ID NO:6)を含む。
【0113】
pCMS054に含まれる修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A054毒素(SEQ ID NO:7)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と113との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接している。
【0114】
pCMS055に含まれるCry3A055
Cry3A055(SEQ ID NO:8)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する:
1. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3' (SEQ ID NO:23)
2. AAPFtail4-5'-GCTGCACCGTTCCGCAACCCCCACAGCCA-3' (SEQ ID NO:26)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
3. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
【0115】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を次いで等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS055と呼ばれ、Cry3A055遺伝子(SEQ ID NO:8)を含む。
pCMS055に含まれる修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A055毒素(SEQ ID NO:9)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然型トリプシン・キモトリプシン認識部位に隣接している。
【0116】
pCMS058に含まれるCry3A058
Cry3A058(SEQ ID NO:14)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する:
1. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
AAPF-Y2-5'-GAACGGTGCAGCGTATTGGTTGAAGGGGGC-3' (SEQ ID NO:28)
2. AAPF-Y1-5'-GCTGCACCGTTCTACTTCGACAAGACCATC-3' (SEQ ID NO:29)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
3. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
【0117】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を次いで等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A058遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS058と呼ばれ、Cry3A058遺伝子(SEQ ID NO:14)を含む。
【0118】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A058毒素(SEQ ID NO:15)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸540と541との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然型キモトリプシン認識部位内にある。
【0119】
Cry3A082を含むpCMS082
Cry3A082(SEQ ID NO:12)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。QuikChange Site Directed Mutagenesis PCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する:
BBmod1-5'-CGGGGCCCCCGCTGCACCGTTCTACTTCGACA-3' (SEQ ID NO:31)
BBmod2-5'-TGTCGAAGTAGAACGGTGCAGCGGGGGCCCCG-3' (SEQ ID NO:32)
【0120】
プライマー対が固有のPCR生成物を発生させる。この生成物をクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A082遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS082と呼ばれ、Cry3A082遺伝子(SEQ ID NO:12)を含む。
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A082毒素(SEQ ID NO:13)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸539と542との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然型キモトリプシン認識部位と置き換わる。
【0121】
pCMS056に含まれるCry3A056
Cry3A056(SEQ ID NO:18)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。6つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾Cry3A中に、2つのカテプシンG認識部位を挿入する:
1. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3' (SEQ ID NO:23)
2. AAPFtail4-5'-GCTGCACCGTTCCGCAACCCCCACAGCCA-3' (SEQ ID NO:26)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
3. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
4. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
AAPF-Y2-5'-GAACGGTGCAGCGTATTGGTTGAAGGGGGC-3' (SEQ ID NO:28)
5. AAPF-Y1-5'-GCTGCACCGTTCTACTTCGACAAGACCATC-3' (SEQ ID NO:29)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
6. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
【0122】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850プラスミドに戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS055と呼ばれる。プライマー対4及びプライマー対5が別の固有のフラグメント・セットを発生させる。これらのフラグメントをプライマー対6で別のPCRによって接合する。このフラグメントを、pCMS055内に含まれる修飾Cry3A055遺伝子のドメインIII中にクローニングする。その結果生じたプラスミドはpCMS056と呼ばれ、Cry3A056遺伝子(SEQ ID NO:18)を含む。
【0123】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A056毒素(SEQ ID NO:19)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111との間に挿入されており、ドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸540と541との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、ドメインIにおいては天然発生型トリプシン・キモトリプシン認識部位に隣接し、ドメインIIIにおいては天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。
【0124】
pCMS057に含まれるCry3A057
Cry3A057(SEQ ID NO:16)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。6つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾Cry3A中に、2つのカテプシンG認識部位を挿入する:
1. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3' (SEQ ID NO:23)
2. TAIL5mod-5'-GCTGCACCGTTCCCCCACAGCCAGGGCCG-3' (SEQ ID NO:24)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
3. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
4. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
AAPF-Y2-5'-GAACGGTGCAGCGTATTGGTTGAAGGGGGC-3' (SEQ ID NO:28)
5. AAPF-Y1-5'-GCTGCACCGTTCTACTTCGACAAGACCATC-3' (SEQ ID NO:29)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
6. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
【0125】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850プラスミドに戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS054と呼ばれる。プライマー対4及びプライマー対5が別の固有のフラグメント・セットを発生させる。これらのフラグメントをプライマー対6で別のPCRによって接合する。このフラグメントを、pCMS054内に含まれる修飾Cry3A054遺伝子のドメインIII中にクローニングする。その結果生じたプラスミドはpCMS057と呼ばれ、Cry3A057遺伝子(SEQ ID NO:16)を含む。
【0126】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A057毒素(SEQ ID NO:17)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と113との間に挿入されており、ドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸540と541との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、ドメインIにおいては天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、且つ天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接し、ドメインIIIにおいては天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。
【0127】
pCMS083に含まれるCry3A083
Cry3A083(SEQ ID NO:20)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対と1つのQuikChange Site Directed Mutagenesis PCRプライマー対とを使用して、未修飾Cry3A中に、2つのカテプシンG認識部位を挿入する:
1. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3' (SEQ ID NO:23)
2. AAPFtail4-5'-GCTGCACCGTTCCGCAACCCCCACAGCCA-3' (SEQ ID NO:26)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
3. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
BBmod1-5'-CGGGGCCCCCGCTGCACCGTTCTACTTCGACA-3' (SEQ ID NO:31)
BBmod2-5'-TGTCGAAGTAGAACGGTGCAGCGGGGGCCCCG-3' (SEQ ID NO:32)
【0128】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850プラスミドに戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS055と呼ばれる。プライマー対4が別の固有のフラグメントを発生させる。このフラグメントを、pCMS055内に含まれる修飾Cry3AのドメインIII中にクローニングする。その結果生じたプラスミドはpCMS083と呼ばれ、Cry3A083遺伝子(SEQ ID NO:20)を含む。
【0129】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A083毒素(SEQ ID NO:21)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111との間に挿入されており、ドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸539と542との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、ドメインIにおいては天然発生型トリプシン・キモトリプシン認識部位に隣接し、ドメインIIIにおいては天然発生型キモトリプシン認識部位と置き換わる。
【0130】
pCMS085に含まれるCry3A085
Cry3A085(SEQ ID NO:10)は、上述のCry3A055遺伝子内の位置と同じ位置にカテプシンGコーディング配列を含む。Cry3A085遺伝子は、SEQ ID NO:2に示された演繹アミノ酸配列のアミノ酸41-47をコードする、5'末端に挿入された付加的な24個のヌクレオチド、並びに、付加的なメチオニンを有している。付加的なヌクレオチドは、下記PCRプライマー対を使用して、Cry3A055遺伝子の5'末端に挿入される:
mo3Aext-5'-GGATCCACCATGAACTACAAGGAGTTCCTCCGC-
ATGACCGCCGACAAC-3' (SEQ ID NO:33)
CMS16-5'-CCTCCACCTGCTCCATGAAG-3' (SEQ ID NO:34)
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A085毒素(SEQ ID NO:11)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111とに対応するアミノ酸の間に挿入されている。修飾Cry3A085毒素(SEQ ID NO:11)はまた、N末端に8つの付加的なアミノ酸残基を有している。これらの残基のうちの第2残基は、SEQ ID NO:2に示されたアミノ酸配列のアミノ酸番号41に対応する。
【0131】
実施例4:修飾Cry3A毒素の殺虫活性
ウェスタン・コーン・ルートワーム、ノーザン・コーン・ルートワーム及びサザン・コーン・ルートワームに対する殺虫活性に関して、昆虫バイオアッセイにおいて、修飾Cry3A毒素を試験する。食餌取込み法を用いてバイオアッセイを実施する。本発明の修飾Cry3A毒素のうちの1つを発現させるE.coliクローンを一晩にわたって成長させる。一晩経過後の培養500μlを超音波処理し、次いで、500μlの溶融人工食餌(Marrone他、(1985)J. of Economic Entomology 78:290-293)と混合する。食餌が凝固したら、これをペトリ皿に小分けし、20匹の新生コーン・ルートワームを食餌上に置く。これらのペトリ皿を30℃で保持する。6日後の死亡率を記録する。修飾Cry3A毒素の全ては、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに50%-100%の死亡率をもたらすのに対し、未修飾Cry3A毒素は0%-30%の死亡率をもたらす。サザン・コーン・ルートワームに対する活性を有する修飾Cry3A毒素はない。
【0132】
実施例5:修飾Cry3Aコーディング配列を含むトランスジェニック・トウモロコシ植物の形成
3つの修飾Cry3A遺伝子、すなわち、ドメインIの修飾形の代表であるCry3A055と、ドメインIIIの修飾形の代表であるCry3A058と、ドメインI及びドメインIIIの修飾形の代表であるCry3A056とを、トウモロコシ植物中への形質転換のために選択する。修飾Cry3Aコーディング配列を含む発現カセットを、アグロバクテリウム媒介性トウモロコシ形質転換に適したベクターに導入する。例えば、発現カセットは、修飾Cry3A遺伝子に加えて、MTLプロモーター(米国特許第5,466,785号明細書)及び当業者に知られたnosターミネーターを含む。
【0133】
未熟なトウモロコシ胚の形質転換を、事実上、Negrotto他、2000、Plant Cell Reports 19:798-803に記載されたように実施する。この例の場合、全ての培地構成成分は、Negrotto他、前掲書に記載されている通りである。しかしその代わりに、当業者に知られた種々の培地を使用することができる。
形質転換に使用される遺伝子を、トウモロコシ形質転換に適したベクター中にクローニングする。この例で使用されるベクターは、トランスジェニック系統を選択するためのホスホマンノース・イソメラーゼ(PMI)遺伝子を含有する(Negrotto他、(2000)、Plant Cell Reports 19:798-803)。
【0134】
植物形質転換プラスミドを含有するAgrobacterium菌株LBA4404(pSB1)を、YEP(酵母抽出物(5g/L)、ペプトン(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l寒天、pH6.8)固形培地上で、2-4日にわたって28℃で成長させる。100μMのAsが補足されたLS-inf培地中に約0.8 x 109個のAgrobacteriumを懸濁する。30-60分にわたってこの培地中で細菌を前誘発する。
A188又は他の好適な遺伝子型に由来する未熟胚を日齢8-12日の穂から摘出し、液体LS-inf + 100μM As中に入れる。新鮮な感染培地で胚を一度濯ぐ。次いでAgrobacterium溶液を添加し、胚を30秒間にわたって渦流処理し、5分間にわたって細菌と共に鎮静させておく。次いで、胚を、胚盤側を上にしてLSA培地に移し、2-3日間にわたって暗所内で培養する。続いて、セフォタキシム(250mg/l)及び硝化銀(1.6mg/l)が補足されたLSD培地に、ペトリ板1つ当たり20-25個の胚を移し、28℃で10日間にわたって暗所内で培養する。
【0135】
胚生成カルスを生成する未熟胚をLSD1M0.5S培地に移す。3週目の継代培養ステップを含む6週間にわたって、この培地上で培養を淘汰する。
マンノースが補足されたReg1培地に、生き残ったカルスを移す。明所(16時間明/8時間暗の編成)における培養に続いて、未熟な組織を成長レギュレーターを有さないReg2培地に移し、そして1-2週間にわたってインキュベートする。小植物を、Reg3培地を含有するMagenta GA-7ボックス(Magenta Corp, Chicago I11)に移し、明所で成長させる。2-3週間後、PMI遺伝子及び修飾Cry3A遺伝子の存在に関してPCRによって植物を試験する。PCRアッセイで陽性であった植物を温室に移し、コーン・ルートワームに対する抵抗性を試験する。
【0136】
実施例6:トランスジェニック・トウモロコシ植物の分析
コーン・ルートワームに対する効果
根摘出バイオアッセイ
Magenta GA-7ボックスから土壌中に植物を移植するのに伴い、これらの植物をサンプリングする。これにより、土壌条件に対して十分に滅菌性の環境から根をサンプリングすることが可能になる。サンプリングは、根の小片(約2-4cm長)を切断して、小型ペトリ皿内の富化されたフィトアガー(phytagar)(フィトアガー12g、スクロース9g、MS塩3ml、MSビタミン3ml、ナイスタチン(25mg/ml)3ml、セフォタキシミン(50mg/ml)7ml、オーレオマイシン(50mg/ml)7ml、ストレプトマイシン(50mg/ml)7ml、dH2O 600ml)上にこれを載せることから成る。負の対照は、同じ試験から生じた修飾Cry3A遺伝子に対してPCR陰性のトランスジェニック植物であるか、又は、フィトトロン中で成長中の非トランスジェニック植物(試験植物と同様のサイズ)に由来する。土壌から対照の根をサンプリングする場合、根試料を水で洗浄し、土壌残留物を除去し、ナイスタチン溶液(5mg/ml)中に浸漬し、浸漬液から取り出し、ペーパータオルで拭き取って乾かし、そしてファイトアガール皿に入れる。
【0137】
それぞれのフィトアガー皿の蓋の内面に10匹の第1齢の幼虫を置くことにより、根試料にウェスタン・コーン・ルートワームを接種し、次いで蓋を密に再シールする。幼虫は、細い先端の絵筆で取り扱う。全ての皿での接種後、皿のトレイをデータ収集まで室温で暗所に置く。
接種から3-4日後に、データを捕集する。幼虫の死亡百分率を、根の視覚的な損害評価と共に計算する。摂食損害を高、中、低又は無しと格付けし、これにそれぞれ数値3,2,1又は0を与える。40%以上の死亡率をもたらし、且つ2以下の損害格付けを有する根試料を陽性と考える。
下記表の結果が示すように、修飾Cry3A毒素を発現する植物は、ウェスタン・コーン・ルートワームに40-100%の死亡率をもたらし、これに対して対照植物は0-30%の死亡率をもたらす。また、修飾Cry3A毒素を発現させる植物は、対照植物よりも有意に低い摂食損害を維持する。
【0138】
【表2】
【0139】
植物全体のバイオアッセイ
上述の根摘出バイオアッセイを用いて同定されたいくつかの陽性植物を、植物全体のバイオアッセイを用いて、ウェスタン・コーン・ルートワーム抵抗性に関して評価する。根摘出アッセイを完了してから概ね3日以内に、植物にウェスタン・コーン・ルートワームをはびこらせる。
ウェスタン・コーン・ルートワームの卵を予めインキュベートし、植物の接種から2-3日後に孵化が発生するようにする。卵は0.2%寒天中に懸濁し、卵約200個/植物で試験植物の周りの土壌に塗布する。
卵の孵化から2週間後に、ウェスタン・コーン・ルートワームの幼虫による損害に関して植物を評価する。植物がウェスタン・コーン・ルートワームの摂食損害に対して抵抗性を有するか否かを見極めるのに用いられる基準は、達成された植物の高さ、倒伏、及び根塊である。評価時点では、対照植物は典型的には、修飾Cry3A植物よりも小さい。また、非トランスジェニック対照植物、及び、トウモロコシ最適化Cry3A遺伝子によってコードされた未修飾Cry3A毒素を発現させる植物は、根のほとんどが重度に取り除かれる結果、根塊の蓄積がなくなることにより、この時間中に倒伏した。評価時点で、本発明の修飾Cry3A毒素を発現させる植物は、修飾Cry3A毒素の殺虫活性により、対照植物よりも背が高く、倒伏せず、大きな無傷の根塊を有する。
【0140】
ELISAアッセイ
トランスジェニック植物中の修飾Cry3Aタンパク質及び未修飾Cry3Aタンパク質のレベルを定量するために、米国特許第5,625,136号明細書に開示された方法に基づくELISA分析を用いる。
【0141】
【表3】
【0001】
本発明は、タンパク質工学、植物分子生物学及び害虫駆除の分野に関する。より具体的には、本発明は新規の修飾Cry3A毒素、及び、発現により修飾Cry3A毒素をもたらす核酸配列に関し、また、修飾Cry3A毒素及び対応する核酸配列の形成方法、及び、昆虫を駆除するために修飾Cry3A毒素及び対応する核酸配列を使用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
コーン・ルートワーム(corn rootworm)種は、最も破壊的なトウモロコシ害虫であると考えられている。米国内で、3つの重要な種は、Diabrotica virgifera virgifera(ウェスタン・コーン・ルートワーム)、D. longicornis barberi(ノーザン・コーン・ルートワーム)及びD. undecimpunctata howardi(サザン・コーン・ルートワーム)である。米国トウモロコシ地帯において一次害虫と考えられるのは、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームだけである。コーン・ルートワームの幼虫はほとんど専らトウモロコシの根を食べることにより、最も大きな植物損害を引き起こす。このような損傷は、植物の倒伏量を増大させ、穀物収穫高及び植物収穫高を低減し、また、穀物の栄養含有率を変化させる。幼虫による摂食はまた、根腐れ病及び茎腐れ病を招く細菌及び真菌感染のために根を通して道を開くことによって、トウモロコシに間接的な影響を与える。成熟したコーン・ルートワームは晩夏にトウモロコシ畑で活動し、穂、毛及び花粉を食べ、正常な受粉を妨げる。
【0003】
コーン・ルートワームは主に化学農薬の集中的な使用により駆除される。化学農薬は、昆虫の成長の阻害、昆虫の摂食又は繁殖の予防を通して活性であるか、又は昆虫を死に至らしめる。従ってコーン・ルートワームを良好に駆除することはできるが、しかしこれらの化学物質は他の有益な有機体に影響を与えることもある。化学農薬を広く使用することに起因する別の問題は、耐性の昆虫品種の出現である。さらに別の問題は、コーン・ルートワームの幼虫が地中で摂食し、従って殺虫剤の救援処理を適用することが難しくなるという事実による。従って殆どの殺虫剤は、植え付け時に予防的に使用される。このような方法は結果として環境の大きな負荷となる。このような負荷は種々の農場管理方法によって部分的に緩和されてはいるが、しかし代わりとなる害虫駆除メカニズムがますます必要になっている。
【0004】
生物学的な害虫駆除剤、例えばδ-エンドトキシンのような殺虫性毒素を発現させるBacillus thuringiensis(Bt)菌株も作物に使用されており、主に鱗翅目の害虫に対して申し分のない結果をもたらしている。δ-エンドトキシンは、或る特定の昆虫による摂取時に殺虫活性を有することが知られている、結晶マトリックス内に保持されたタンパク質である。種々のδ-エンドトキシンは、活性スペクトル及び配列相同性に応じて分類されている。1990年以前には、主要なクラスは、これらの活性スペクトルによって、鱗翅目(蛾及び蝶)に対して活性のCry1タンパク質、鱗翅目及び双翅目(蝿及び蚊)の両方に対して活性のCry2タンパク質、鞘翅目(甲虫)に対して活性のCry3タンパク質、及び双翅目に対して活性のCry4タンパク質と定義された(Hofte及びWhitely, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255)。最近は、昆虫の標的特異性ではなくアミノ酸配列相同性に基づいて、Cryタンパク質を系統的に分類する新しい命名法が開発された(Crickmore他、1998、Microbiol. Molec. Biol. Rev.62:807-813)。
【0005】
Btに由来する個々のδ-エンドトキシンの殺虫活性スペクトルは極めて狭く、所与のδ-エンドトキシンは所定の系列内の数種に対してしか活性ではない。例えば、Cry3Aタンパク質は、コロラドハムシ(Lapinotarsa decemlineata)に対して極めて毒性であるが、しかしDiabrotica属における関連甲虫に対する毒性はきわめて低いか又は全くない(Johnson他、1993、J. Econ. Entomol. 86:330-333)。Slaney他(1992, Insect Biochem. Molec. Biol. 22:9-18)によれば、Cry3Aタンパク質のサザン・コーン・ルートワームに対する毒性は、コロラドハムシに対する毒性の2000分の1以下である。Cry3Aのウェスタン・コーン・ルートワームに対する毒性はほとんど又は全くないことも知られている。
【0006】
δ-エンドトキシンの特異性は、活性毒素タンパク質を生成するのに関与する種々のステップ、及び、昆虫の中腸内の上皮細胞とのその後の相互作用の効率の結果である。殺虫活性を発揮するために、殆どの既知のδ-エンドトキシンは先ず昆虫によって摂取され、そして活性毒素を形成するためにタンパク質分解により活性化されなければならない。殺虫性結晶タンパク質の活性化は、多段プロセスである。摂取後、結晶は昆虫消化管内でまず可溶化されなければならない。可溶化されると、δ-エンドトキシンは特異的なタンパク質分解によって活性化される。昆虫消化管内のプロテアーゼは、δ-エンドトキシンがどこでプロセッシングされるかを決定することにより、特異性の役割を果たすことができる。δ-エンドトキシンは可溶化されプロセッシングされると、昆虫の中腸上皮の表面上の特異的な受容体に結合し、続いて刷子縁膜の脂質二重層内に組込まれる。次いでイオンチャネルが形成され、中腸の正常な機能を乱し、最終的には昆虫を死に至らしめる。
【0007】
鱗翅目において、消化管プロテアーゼはδ-エンドトキシンをプロセッシングして、130-140kDaのプロトキシンをほぼ60-70kDaの毒性タンパク質にする。プロトキシンから毒素へのプロセッシングは、N末端アミノ酸及びC末端アミノ酸の双方を除去することにより進められることが報告されている。この場合正確なプロセッシング位置は、関与する特異的な昆虫消化管液に依存する(Ogiwara他、1992、J.Invert. Pathol. 60:121-126)。δ-エンドトキシンのタンパク質分解活性化は、その特異性を決定する上で有意な役割を演じることができる。例えばIC1と呼ばれる、Bt var. aizawaに由来するδ-エンドトキシンは、他の既知のCry1 Abタンパク質との配列相同性に基づいて、Cry1Abタンパク質として分類されている。Cry1 Abタンパク質は典型的には鱗翅目の昆虫に対して活性である。しかし、IC1タンパク質は、これがどのようにプロセッシングされるか如何では鱗翅目及び双翅目の昆虫の双方に対して活性を有する(Haider他、1986、Euro. J. Biochem. 156:531-540)。双翅目の消化管においては、53kDaの活性IC1毒素が得られるのに対して、鱗翅目の消化管においては、55kDaの活性1C1毒素が得られる。1C1は、4つのアミノ酸によってだけしか、正基準標本HD-1 Cry1Abタンパク質とは異ならないので、受容体結合部位の全体的な変化が活性の差異の原因になるとは考えられない。2つの異なる昆虫消化管におけるタンパク質分解の差異は、活性化された分子が異なる状態に折り畳まれ、ひいては異なる受容体と結合可能な異なる領域を暴露することを可能にすると考えられる。従って特異性は、異なる昆虫の消化管プロテアーゼと共に存在すると考えられる。
【0008】
鞘翅目昆虫は、中性寄りの酸性である消化管を有しており、鞘翅目特異的δ-エンドトキシンは、活性化された鱗翅目特異的毒素のサイズと類似している。従って、鞘翅目特異的δ-エンドトキシンのプロセッシングは、かつては毒性には不要と考えられていた。しかし、最近のデータが示唆するところによれば、鞘翅目活性δ-エンドトキシンは可溶化されタンパク質分解されて、より小さな毒性ポリペプチドにされる。B. thuringiensis var. tenebrionisによって生成される73kDaのCry3Aδ-エンドトキシンタンパク質は、N-末端において細菌中で容易にプロセッシングされ、結晶形成中又は結晶形成後に49-57残基を失い、これにより一般には単離された67kDa形を生成する(Carroll他、1989, Biochem. J. 261:99-105)。またMcPherson他、1988(Biotechnology 6:61-66)によって実証されたように、天然型Cry3A遺伝子は、2つの機能性翻訳開始コドンを同じリーディング・フレーム内に含有し、その一方は、演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2参照)のMet-1で始まる73kDaタンパク質をコードし、他方は、Met-48で始まる67kDaタンパク質をコードする。この場合、両タンパク質は天然発生型全長Cry3Aタンパク質と考えることができる。可溶性の67kDA Cry3Aタンパク質をトリプシン又は昆虫消化管抽出物で処理すると、演繹アミノ酸配列のAsn-159をN末端に有する55kDaの開裂生成物が得られる。このポリペプチドは、天然型67kDA Cry3A毒素と同じ毒性を、鋭敏な鞘翅目昆虫に対して有することが見出された(Carroll他、同書)。従って、天然型Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のArg-158とAsn-159との間には天然型トリプシン認識部位が存在する。Cry3Aはキモトリプシンによって開裂することもでき、その結果49、11及び6kDaの3つのポリペプチドが生じる。49kDa成分及び6kDa成分のN末端分析は、最初のアミノ酸残基がそれぞれSer-162及びTyr-588であることを示した(Carroll他、1997、J. Invert. Biol. 70:41-49)。従って、天然型キモトリプシン認識部位は、演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のHis-161とSer-162との間、及びTyr-587とTyr-588との間でCry3A中に存在する。49kDaキモトリプシン生成物は、天然型67kDAタンパク質又は55kDaトリプシン生成物よりも中性pHでより高い可溶性を有すると考えられ、Cry3Aに対して鋭敏な昆虫、コロラドハムシ及びマスタード・ビートル(Phaedon cochleariae)に対する完全な殺虫活性を維持する。昆虫消化管プロテアーゼは典型的には、昆虫が食餌性タンパク質から必須アミノ酸を得るのを助ける機能を果たす。最も良く理解される昆虫消化プロテアーゼは、特に鱗翅目種において最も一般的と考えられるセリン・プロテアーゼである(Englemann及びGeraerts, 1980, J. Insect Physiol. 261:703-710)。鞘翅目の幼虫及び成虫の大部分、例えばコロラドハムシは、弱酸性の中腸を有しており、システイン・プロテアーゼが主要な蛋白質分解作用を提供する(Wolfson及びMudock, 1990, J.Chem.Ecol.16:1089-1102)。より正確には、Thie及びHouseman(1990, Insect Biochem. 20:313-318)が、コロラドハムシにおいてシステイン・プロテアーゼ、カテプシンB及びH、並びにアスパルチル・プロテアーゼ、カテプシンDを同定して特徴付けした。Gillikin他(1992, Arch. Insect Biochem. Physiol. 19:285-298)はウェスタン・コーン・ルートワーム幼虫の消化管内のタンパク質分解作用を特徴付けし、そして15個の、主としてシステイン・プロテアーゼを見出した。本発明において開示されるまで、セリン・プロテアーゼ、カテプシンGがウェスタン・コーン・ルートワーム中に存在することを示す報告はなかった。昆虫消化管プロテアーゼの多様性及び種々異なる活性レベルは、特にBt毒素に対する昆虫の感受性に影響を与えると云える。
【0009】
線虫に対して活性の菌株(欧州特許出願公開第0517367号明細書)を含む、改善された又は新規の生体活性を有する新たな及び新規のBt菌株及びδ-エンドトキシンが数多く過去5年間にわたって発表されている。しかしこれらの菌株及び毒性のうち、鞘翅目の昆虫に対して活性を有するものは相対的に少ない。さらに、現在既知の鞘翅目活性δ-エンドトキシン、例えばCry3A、Cry3B、Cry3C、Cry7A、Cry8A、Cry8B及びCry8Cには、例えば微生物又はトランスジェニック植物を通して送達された場合に、適切な畑管理を可能にするのに十分な、コーン・ルートワームに対する経口毒性を有するものはない。従って、コーン・ルートワームに対して活性の新規毒性を生成するための他のアプローチを究明する必要がある。
【0010】
δ-エンドトキシンがどのように機能するかに関する知識が増えるのに伴って、新しい活性を有するようにδ-エンドトキシンを遺伝子工学的に改変しようという試みが多くなっている。1991年にCry3Aの三次元構造が解明されたことにより(Li他、1991, Nature 353:815-821)、δ-エンドトキシンの改変は一層可能になった。タンパク質は3つの構造ドメインを有している。すなわち、残基1-290から成るN末端ドメインIは、7つのα螺旋から形成され、残基291-500から成るドメインIIは、3つのβシートを含有し、残基501-644から成るC末端ドメインIIIはβサンドイッチである。このような構造に基づき、δ-エンドトキシンの構造と機能との関係に関して、仮説が成り立っている。ドメインIは主に昆虫消化管膜内の孔形成に寄与し(Gazit及びShai, 1993, Appl. Environ. Microbiol. 57:2816-2820)、ドメインIIは主に消化管受容体との相互作用に寄与し(Ge他、1991、J. Biol. Chem. 32:3429-3436)、及びドメインIIIは、おそらくタンパク質安定性(Li他、1991、前掲書)と関連し、またイオンチャネル活性に対して調節上の影響を与える(Chen他、1993, PNAS 90:9041-9045)と、一般には考えられている。
【0011】
特異的活性を改善しようという目的、或いは、殺虫活性スペクトルを広げようという目的で、鱗翅目活性δ-エンドトキシンが遺伝子工学的に作成されている。例えば、Cry1Aaに由来するコイコガ(Bombyx mori)特異性ドメインをCry1Acに移し、こうして、結果として生じたキメラタンパク質に新しい殺虫活性を付与した(Ge他、1989、PNAS 86:4037-4041)。また、1998年にBosch他(米国特許第5,736,131号)は、Cry1EのドメインIIIをCry1CのドメインIIIと置換し、こうしてより広い鱗翅目活性スペクトルを有するCry1E-Cry1Cハイブリッド毒素を生成することにより、新しい鱗翅目活性毒素を作成した。
【0012】
鞘翅目活性δ-エンドトキシンを遺伝子工学的に作成しようという幾つかの試みが報告されている。Van Rie他,1997(米国特許第5,659,123号明細書)は、溶媒接触可能性において重要であると考えられるドメインII内のアミノ酸をアミノ酸アラニンとランダムに置換することにより、Cry3Aを作成した。受容体結合ドメインIIに限定されたこれらのランダム置換のうちのいくつかは、報告によれば、ウェスタン・コーン・ルートワーム毒性の増大に関与する。しかし、その他の報告では、Cry3AのドメインIIにおける幾つかのアラニン置換が、受容体結合の分裂又は構造的な不安定性を招くことが示されている(Wu及びDean, 1996, J. Mol. Biol. 255:628-640)。English他が1999年に(国際公開第99/31248号パンフレット)報告したCry3Bb中のアミノ酸置換は、サザン・コーン・ルートワーム及びウェスタン・コーン・ルートワームに対する毒性を増大させる。しかし、報告された35種のCry3Bb突然変異体のうち、主としてドメインII及びドメインII-ドメインI界面における3つの突然変異体しか、ウェスタン・コーン・ルートワームに対して活性ではなかった。さらに、同じアッセイにおけるウェスタン・コーン・ルートワームに対する野生型Cry3Bbの毒性の差異は、突然変異型Cry3Bb毒素と野生型Cry3Bb毒素との間の差異のうちのいずれよりも大きい。従ってCry3Bb突然変異体の毒性の改善形は、主としてサザン・コーン・ルートワームに限定されると考えられる。
【0013】
農業従事者に経済的な利益を提供し、環境的に許容可能である新しく効果的な害虫駆除剤を構成することが依然として必要である。具体的に必要なのは、既存の昆虫駆除剤に対して耐性の、又は耐性と成り得る米国内の主要な害虫であるウェスタン・コーン・ルートワームを駆除する修飾Cry3A毒素である。さらに、使用しても環境に負荷を最小限にしか加えない、トランスジェニック植物を介して使用されるような作用物質が望ましい。
【発明の開示】
【0014】
これらの必要性から、本発明の目的は、コーン・ルートワームに対する毒性が高められた修飾Cry3A毒素をコードする新規の核酸配列を提供することである。本発明により、標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識部位を、Cry3A毒素の1つ以上の位置に挿入することにより、具体的にはサザン・コーン・ルートワーム及びウェスタン・コーン・ルートワームに対して有意に毒性が高められた修飾Cry3A毒素が構成される。本発明はさらに、核酸配列の発現から生じる新規の修飾Cry3A毒素、及び、修飾Cry3A毒素を含有する組成物及び配合物に関し、これらの修飾Cry3A毒素は、害虫の生存、成長及び繁殖の能力を阻害するか、或いは、作物に対する昆虫関連の損害又は損失を制限することができる。本発明はさらに、修飾Cry3A毒性の形成方法、及び、昆虫駆除のために微生物中で、又は昆虫による損害からの保護のためにトランスジェニック植物中で、修飾Cry3A核酸配列を使用する方法、そして、修飾Cry3A毒素、並びに修飾Cry3A毒素を含む組成物及び配合物を使用する方法であって、例えば修飾Cry3A毒素又は組成物及び配合物を、昆虫が蔓延する領域に使用する方法、或いは、昆虫に対して鋭敏な領域又は植物を予防的に処理することにより害虫に対して保護するために、修飾Cry3A毒素、並びに修飾Cry3A毒素を含む組成物及び配合物を使用する方法に関する。
【0015】
本明細書中に記載された新規の修飾Cry3A毒素は、昆虫に対して高活性である。例えば、本発明の修飾Cry3A毒素は、重要な害虫、例えばウェスタン・コーン・ルートワーム(Diabrotica virgifera virgifera)、ノーザン・コーン・ルートワーム(D. longicornis barberi)を経済的に駆除するために使用することができる。修飾Cry3A毒素は、単独で、又は他の昆虫駆除戦略との組み合わせで使用することにより、環境に対して最小限にしか影響を及ぼさずに、最大の害虫駆除効率を与えることができる。
【0016】
1つの観点によれば、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、該修飾Cry3A毒素が、Cry3A毒素中に天然には発生しない少なくとも1つの付加的なプロテアーゼ認識部位を含む。標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識されるこの付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位とほぼ同じ位置に挿入される。修飾Cry3A毒素が標的昆虫にもたらす死亡率は、Cry3A毒素が同じ標的昆虫にもたらす死亡率よりも高い。好ましくは、Cry3A毒素が標的昆虫に最大約30%の死亡率しかもたらさないのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【0017】
この観点の1実施態様の場合、標的昆虫の消化管プロテアーゼは、セリン・プロテアーゼ、システイン・プロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼから成る群から選択される。この実施態様による好ましいセリン・プロテアーゼは、カテプシンG、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ及びエラスターゼ、最も好ましくはカテプシンGを含む。
【0018】
この観点の別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素のドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置、該認識部位に隣接する位置、又は該認識部位内の位置で、ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。
【0019】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間に挿入される。
【0020】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入される。
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入される。
【0021】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に挿入される。
【0022】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。
【0023】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。
【0024】
1実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、修飾されていないCry3A毒素のドメインI及びドメインIIIに挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置又は該認識部位に隣接する位置で、ドメインIに挿入され、天然発生型プロテアーゼ認識部位内の位置、該認識部位と置き換わる位置、又は該認識部位に隣接する位置で、ドメインIIIに挿入される。
【0025】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。
【0026】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。
【0027】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。
【0028】
好ましい実施態様の場合、本発明の単離された核酸分子は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1818、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1791を含む。
【0029】
別の好ましい実施態様の場合、本発明の単離された核酸分子は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む修飾Cry3A毒素をコードする。
本発明の1実施態様によれば、単離された核酸分子は、鞘翅目昆虫に対して活性の修飾Cry3A毒素をコードする。好ましくは、修飾Cry3A毒素は、ウェスタン・コーン・ルートワームに対する活性を有する。
【0030】
本発明は、本発明の核酸分子に作用連関された異種プロモーター配列を含むキメラ遺伝子を提供する。本発明はまた、このようなキメラ遺伝子を含む組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、このようなキメラ遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト宿主細胞を提供する。本発明のこの観点によるトランスジェニック宿主細胞は細菌細胞又は植物細胞、好ましくは植物細胞であってよい。本発明はさらに、このような植物細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。本発明のこのような観点によるトランスジェニック植物は、サトウモロコシ、小麦、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、アブラナ属植物、綿、稲、大豆、甜菜、サトウキビ、タバコ、大麦、脂肪種子ナタネ、又はトウモロコシ、好ましくはトウモロコシであってよい。本発明はまた、サトウモロコシ、小麦、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、アブラナ属植物、綿、稲、大豆、甜菜、サトウキビ、タバコ、大麦、脂肪種子ナタネ、及びトウモロコシから成るトランスジェニック植物の群から選択された種子を提供する。特に好ましい実施態様の場合、種子はトランスジェニック・トウモロコシ植物に由来する。
【0031】
別の観点において、本発明は、本発明の核酸分子の発現により生成された毒素を提供する。好ましい実施態様において、毒素は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1818、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1791を含む核酸分子の発現によって生成される。
【0032】
別の実施態様の場合、本発明の毒素は、鞘翅目昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワームに対して活性である。
【0033】
1実施態様の場合、本発明の毒素は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む。
【0034】
本発明はまた、本発明による効果的な昆虫駆除量の毒素を含む組成物を提供する。
別の観点において、本発明は、昆虫に対して活性の毒素を生成する方法であって、(a)本発明の核酸分子に作用連関された異種プロモーター配列をそれ自体が含むキメラ遺伝子を含む宿主細胞を獲得し;そして(b)トランスジェニック宿主細胞内に核酸分子を発現させることにより、昆虫に対して活性の1種以上の毒素を生じさせる、ことを含む方法を提供する。
【0035】
さらに別の観点において、本発明は、昆虫に対して抵抗性のトランスジェニック植物を生成する方法であって、トランスジェニック植物中に本発明の核酸分子を導入することを含み、この核酸分子が昆虫駆除に有効な量でトランスジェニック植物において発現可能である、方法を提供する。好ましい実施態様の場合、これらの昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワームである。
【0036】
さらに別の観点において、本発明は昆虫駆除の方法であって、本発明の有効量の毒素を昆虫に送達することを含む方法を提供する。1実施態様によれば、昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワームである。好ましくは、毒素は昆虫に経口送達される。好ましい1実施態様の場合、毒素は、本発明の毒素を発現させる核酸配列を含むトランスジェニック植物を通して経口送達される。
【0037】
本発明によりさらに提供されるのは、修飾Cry3A毒素の形成方法であって:(a) Cry3A毒素をコードするCry3A遺伝子を獲得し;(b) 標的昆虫の消化管プロテアーゼを同定し;(c) 前記消化管プロテアーゼのための認識部位をコードするヌクレオチド配列を獲得し;(d) ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に、Cry3A毒素遺伝子内の天然発生型プロテアーゼ認識部位をコードするヌクレオチド配列と置き換わる位置、該ヌクレオチド配列内の位置、又は該ヌクレオチド配列に隣接する位置で前記(c)のヌクレオチド配列を挿入し、こうして修飾Cry3A毒素遺伝子を作成し;(e) 前記修飾Cry3A遺伝子を発現カセット中に挿入し;(f) 前記修飾Cry3A遺伝子を非ヒト宿主細胞中に発現させることにより、修飾Cry3A毒素を生成する宿主細胞を生じさせ;そして(g) 標的昆虫に対して修飾Cry3A毒素をバイオアッセイし、これにより、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされる標的昆虫の死亡率よりも高い死亡率を標的昆虫にもたらすことを含む、方法である。好ましい実施態様の場合、Cry3A毒素が標的昆虫に最大約30%の死亡率をもたらすのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【0038】
本発明はさらに昆虫駆除の方法であって、トランスジェニック植物が、第2の殺虫成分をコードする第2の核酸配列又は核酸配列群を含む方法を提供する。特に好ましい第2の核酸配列は、δ-エンドトキシンをコードする核酸配列、米国特許第5,849,870号明細書及び同第5,877,012号明細書(これらを参考のため本明細書中に引用する)に開示された栄養殺虫性タンパク質(Vegetative Insecticidal Protein) 毒素をコードする核酸配列、又は非タンパク質殺虫成分を生成するための経路をコードする核酸配列である。
【0039】
本発明のさらに別の観点は、開裂によって所望のサイズの二本鎖ランダム・フラグメント個体群にされた核酸分子に、本発明に基づいて突然変異を誘発する方法であって:(a) 二本鎖ランダム・フラグメントの個体群に、1又は2種以上の一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドを添加し、これのオリゴヌクレオチドはそれぞれ二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対して同一性領域及び異種性領域を含み;(b) 結果として生じた二本鎖ランダム・フラグメントとオリゴヌクレオチドとの混合物を変性して一本鎖フラグメントにし;(c) 結果として生じた単鎖フラグメント個体群を、同一性領域で単鎖フラグメントをアニーリングすることになる条件下で、ポリメラーゼと一緒にインキュベートすることにより、アニールされたフラグメント対を形成し、同一性領域は、対の一方の員が他方の員の複製をプライムするのに十分であり、これにより、突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成し;(d) 2回以上の更なるサイクルにわたって第2ステップ及び第3ステップを反復し、更なるサイクルの第2ステップにおいて結果として得られた混合物が、前のサイクルの第3ステップから得られた突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを含み、そして、前記更なるサイクルは、更なる突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成する、方法を提供することである。
【0040】
本発明の他の観点及び利点は、本発明の以下の説明、及び本発明を限定しない実施例を検討することにより、当業者に明らかになる。
SEQ ID NO:1は、天然型Cry3Aコーディング領域である。
SEQ ID NO:2は、天然型Cry3A遺伝子によってコードされたCry3A毒素のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:3は、天然型Cry3Aコーティング領域のヌクレオチド144で始まる、トウモロコシに対して最適化されたCry3Aコーティング領域である。
SEQ ID NO:4は、トウモロコシに対して最適化されたCry3A遺伝子によってコードされたCry3A毒素のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:5は、pCIB6850のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:6は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A054コーディング配列である。
SEQ ID NO:7は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:8は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A055コーディング配列である。
SEQ ID NO:9は、SEQ ID NO:8のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:10は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A085コーディング配列である。
【0041】
SEQ ID NO:11は、SEQ ID NO:10のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:12は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A082コーディング配列である。
SEQ ID NO:13は、SEQ ID NO:12のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:14は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A058コーディング配列である。
SEQ ID NO:15は、SEQ ID NO:14のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:16は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A057コーディング配列である。
SEQ ID NO:17は、SEQ ID NO:16のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:18は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A056コーディング配列である。
SEQ ID NO:19は、SEQ ID NO:18のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:20は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A083コーディング配列である。
【0042】
SEQ ID NO:21は、SEQ ID NO:20のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:22-34は、本発明において有用なPCRプライマーである。
SEQ ID NO:35は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:36は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:37は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:38は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
【0043】
本明細書中に使用される特定の用語を明確にするために下記のように定義して示す:
本発明の修飾Cry3A毒素の「活性」は、修飾Cry3A毒素が経口活性の昆虫駆除剤として機能するか、毒性効果を有するか、又は昆虫の摂食を妨害又は抑制することができることを意味し、このことは昆虫の死を招いても招かなくてもよい。本発明の修飾Cry3A毒素が昆虫に送達されると、結果として昆虫は死に至らしめられるのが典型的であり、或いは、昆虫は、修飾Cry3A毒素を昆虫に利用可能にする源を食べなくなる。
【0044】
「隣接する」という用語に関しては、本発明によれば、付加的なプロテアーゼ認識部位が天然発生型プロテアーゼ認識部位の4つの残基以内、好ましくは3つの残基以内、より好ましくは2つの残基以内、及び最も好ましくは1つの残基以内にある場合、この付加的なプロテアーゼ認識部位は天然発生型プロテアーゼ認識部位に「隣接」しているという。例えば、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)の演繹アミノ酸配列のPro-154とArg-158との間に挿入された付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)の演繹アミノ酸配列のArg-158とAsn-159との間に位置する天然発生型トリプシン認識部位に「隣接」している。
【0045】
本明細書において使用される「ほぼ同じ位置」という言い方は、天然発生型プロテアーゼ認識部位に関連して、付加的なプロテアーゼ認識部位が挿入されるCry3A毒素中の場所を記述するのに使用され、この場所が天然発生型プロテアーゼ認識部位から多くても残基4つ分だけ隔たっていることを意味する。この場所は、天然発生型プロテアーゼ認識部位から残基3又は2つ分だけ隔たっていてもよい。この場所は、天然発生型プロテアーゼ認識部位から残基1つ分だけ隔たっていてもよい。「ほぼ同じ位置」という言い方はまた、付加的なプロテアーゼ認識部位が天然発生型プロテアーゼ認識部位内に挿入されることを意味することもできる。
【0046】
「関連/作用連関」という用語は、物理的又は機能的に関係する2つの核酸配列を意味する。例えば、プロモーター又は調節DNA配列と、RNA又はタンパク質をコードするDNA配列とが作用連関しているならば、或いは、調節DNA配列がコーディングDNA配列又は構造DNA配列の発現レベルに影響を与えるように位置しているならば、プロモーター又は調節DNA配列は、RNA又はタンパク質をコードするDNA配列と「関連」していると云われる。
【0047】
「キメラ遺伝子」又は「キメラ構造」は組換え核酸配列であって、この配列において、プロモーター又は調節核酸配列が、mRNAをコードするか又はタンパク質として発現される核酸配列と作用連関又は関連し、これにより、調節核酸配列が関連核酸コーディング配列の転写又は発現を調節することができる。キメラ遺伝子の調節核酸配列は、天然に見出されるような関連核酸配列に通常は作用連関されていない。
【0048】
「コーディング配列」は、RNA、例えばmRNA、rRNA、tRNA、snRNA、センスRNA又はアンチセンスRNAに転写される核酸配列である。好ましくはRNAは次いで生物内で翻訳され、これによりタンパク質が生成される。
【0049】
昆虫を「駆除」することは、害虫の生存、成長、摂食及び/又は繁殖の能力を毒性効果を通して阻害するか、或いは、作物の昆虫に関係する損害又は損失を制限することを意味する。昆虫を「駆除」することは、昆虫を殺すことを意味する場合と意味しない場合とがあるが、好ましくは、昆虫を殺すことを意味する。
【0050】
本発明との関連において、「対応する」は、変異体Cry3Aδ-エンドトキシンのアミノ酸配列が互いに整列させられる場合、本発明において列挙した所定の位置に「対応する」アミノ酸が、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)におけるこれらの位置と整合するアミノ酸であることを意味するが、しかし、これらのアミノ酸は、本発明の特定のCry3Aアミノ酸に関してこれらの正確な数値的な位置に必ずしもあるわけではない。例えば、本発明のトウモロコシ最適化Cry3A遺伝子(SEQ ID NO:3)は、Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)をコードし、このCry3A毒素(SEQ ID NO:4)は、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)のMet-48で始まり、このCry3A毒素(SEQ ID NO:2)は天然型Cry3A遺伝子(SEQ ID NO:1)によってコードされる。従って本発明によれば、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107-115(その間の全ての番号を含む)は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154-163及びその間の全ての番号に対応し、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536-541(その間の全ての番号を含む)は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号583-588及びその間の全ての番号に対応する。
【0051】
本明細書中に使用される「Cry3A毒素」は、73kDaのBacillus thuringiensis var. tenebrionis(Kreig他、1983、Z. Angew. Entomol. 96:500-508)(Bt)鞘翅目活性タンパク質(Sekar他、1987、Proc. Nalt. Acad. Sci. 84:7036-7040)、例えばSEQ ID NO:2、並びに、Cry3A毒素、例えばSEQ ID NO:4から誘導可能で、Cry3A毒素とほぼ同じ毒性を維持する、先端切除された任意の低分子量変異体を意味する。低分子量変異形は、Cry3A毒素の天然発生型プロテアーゼ認識部位のプロテアーゼ開裂によって、又は、73kDaのCry3A毒素をコードする翻訳開始コドンと同じフレーム内の第2の翻訳開始コドンによって得ることができる。Cry3A毒素及びその低分子量変異形のアミノ酸配列は、Btにおいて天然発生する毒素に見出すことができる。Cry3A毒素は、SEQ ID NO:1におけるような天然型Bt遺伝子、又は、SEQ ID NO:3におけるような合成コーディング配列によってコードすることができる。「Cry3A毒素」は、Cry3A毒素中に天然発生するプロテアーゼ認識部位以上の付加的なプロテアーゼ認識部位を有することはない。Cry3A毒素は異種系において分離、精製、又は発現することができる。
【0052】
本明細書に使用された「Cry3A遺伝子」は、SEQ ID NO:1又はSEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を意味する。Cry3A遺伝子(Sekar他、1987、Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7036-7040)は、Bacillus thuringiensis var. tenebrionis(Kreig他、1983、Z. Angew. Entomol. 96:500-508)に見出されるような天然発生型、又は合成型であってよく、Cry3A毒素をコードする。本発明のCry3A遺伝子は、SEQ ID NO:1におけるような天然型Cry3A遺伝子、又はSEQ ID NO:3におけるようなトウモロコシ最適化Cry3A遺伝子と呼ぶことができる。
【0053】
毒素を「送達する」ことは、毒素が昆虫と接触し、その結果毒性効果をもたらし、昆虫を駆除することを意味する。毒素は、認識された多くの方法、例えば昆虫による経口摂取、又はトランスジェニック植物の発現、調製されたタンパク質組成物、噴霧可能なタンパク質組成物、ベイト・マトリックス、又は当業者に認識されているその他の毒素送達システムを介して昆虫と接触させることにより、送達することができる。
【0054】
「効果的な昆虫駆除量」は、害虫の生存、成長、摂食及び/又は繁殖の能力を毒性効果を通して阻害するか、或いは、作物の昆虫に関係する損害又は損失を制限する毒素の濃度を意味する。「効果的な昆虫駆除量」は、昆虫を殺すことを意味する場合と意味しない場合とがあるが、好ましくは、昆虫を殺すことを意味する。
【0055】
本明細書中に使用される「発現カセット」という用語は、適切な宿主細胞中に特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる核酸配列を意味する。発現カセットは、当該ヌクレオチド配列に作用連関されたプロモーターを含み、当該ヌクレオチド配列は終止シグナルに作用連関されている。発現カセットはまた典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要な配列を含む。当該ヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであってよく、すなわちこれは、その成分の少なくとも1つがその他の成分のうちの少なくとも1つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然発生型ではあるが、しかし異種発現に有用な組換え形として獲得されているカセットであってもよい。しかし典型的には、発現カセットは宿主に対して異種であり、すなわち、発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞中に天然発生することはなく、宿主細胞又は宿主細胞の原種中に、形質転換事象によって導入されていなければならない。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成性プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下で行われてよい。このプロモーターは、宿主細胞が或る特定の外部刺激に暴露されたときにのみ転写を開始する。多細胞生物、例えば植物の場合、プロモーターは特定の組織又は器官、或いは発育段階に対して特異的であってもよい。
【0056】
「遺伝子」は、ゲノム内に位置する定義済領域であって、上述のコーディング核酸配列以外に、コーディング部分の発現の制御、つまり転写及び翻訳に寄与する他の一次調節核酸配列を含む領域である。遺伝子はその他の5'及び3'未翻訳配列及び終止配列を含んでもよい。存在し得る更なる要素は例えばイントロンである。
【0057】
「当該遺伝子」とは、植物に導入されたときに、その植物に所望の特性、例えば抗生物質抵抗性、ウィルス抵抗性、昆虫抵抗性、疾患抵抗性又は他の害虫に対する抵抗性、除草剤耐性、改善された栄養価、産業プロセスにおける生産能力向上、又は改変された繁殖能力を付与する任意の遺伝子を意味する。「当該遺伝子」とは、植物中で商業的に高価値の酵素又は代謝産物を生成するために、植物に導入された遺伝子であってもよい。
【0058】
「消化管プロテアーゼ」は、昆虫の消化管内に天然に見出されるプロテアーゼである。このプロテアーゼは通常、摂取されたタンパク質の消化に関与する。
「異種」核酸配列は、これが導入される宿主細胞と天然では関連しない核酸配列であり、天然発生型核酸配列の非天然発生型多コピーを含む。
「相同」核酸配列は、これが導入される宿主細胞と天然で関連する核酸配列である。
「相同組換え」は、相同核酸分子間の核酸フラグメントの相互交換である。
「殺虫」は、昆虫を好ましくは殺すことによって駆除することができる毒性生体活性として定義される。
核酸配列が、基準核酸配列によってコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合、その核酸配列は、基準核酸配列と「等コード性」である。
【0059】
「単離された」核酸分子又は単離された毒素は、人手によってその天然環境から離されて存在する核酸分子又は毒素であり、従って天然の生成物ではない。単離された核酸分子又は毒素は、精製された形で存在してよく、或いは、非天然環境、例えば組換え宿主細胞中に存在してもよい。
本発明の「修飾Cry3A毒素」は、付加的なプロテアーゼ認識部位を少なくとも1つ有するCry3A誘導型毒素を意味し、この付加的なプロテアーゼ認識部位は、標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識され、Cry3A毒素中で天然には発生しない。修飾Cry3A毒素は天然発生せず、Bacillus thuringiensis中に見出される天然発生型毒素とは同一ではないアミノ酸配列を人手によって含む。修飾Cry3A毒素は、Cry3A毒素が標的昆虫にもたらす死亡率よりも高い死亡率を、同じ標的昆虫にもたらす。
【0060】
本発明による「修飾Cry3A遺伝子」は、未修飾Cry3A遺伝子中には天然発生しない少なくとも1つの付加的なプロテアーゼ認識部位のコーディング配列を含むCry3A誘導型遺伝子を意味する。修飾Cry3A遺伝子は、天然型Cry3A遺伝子又は合成型Cry3A遺伝子から誘導することができる。
「天然発生型プロテアーゼ認識部位」は、昆虫以外のものに由来するプロテアーゼ、又は、Cry3A毒素に対して鋭敏な昆虫種に由来するプロテアーゼ又は消化管抽出物によって開裂されるCry3A毒素内の位置である。例えば、Cry3A毒素に対して鋭敏な昆虫の消化管抽出物中に見出されるトリプシン及びプロテアーゼによって認識される天然発生型プロテアーゼ認識部位は、演繹Cry3A毒素アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のArg-158とAsn-159との間に存在する。キモトリプシンによって認識される天然発生型プロテアーゼ認識部位は、演繹Cry3A毒素アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のHis-161とSer-162との間並びにTys-587とTyr-588との間に存在する。
「核酸分子」又は「核酸配列」は、任意の源から分離することができる一本鎖又は二本鎖DNA又はRNAの線状セグメントである。本発明との関連において、核酸分子はDNAセグメントであることが好ましい。
【0061】
「植物」は、任意の発育段階にある任意の植物、具体的には種子植物である。
「植物細胞」は、植物の構造的且つ生理学的な単位であり、プロトプラストと細胞壁とを含む。植物細胞は、単離された単一細胞又は培養された細胞の形で、又は、より高度に組織された単位、例えば植物組織、植物器官、又は植物全体の一部であってよい。
「植物細胞培養」とは、植物単位、例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織内の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合体及び種々の発育段階の胚の培養を意味する。
「植物材料」とは、葉、茎、根、花又は花部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、切断部、細胞又は組織培養、又は植物のその他の任意の部分又は生成物を意味する。
本明細書中に使用される「植物組織」とは、構造的及び機能的な単位に組織化された植物細胞の群を意味する。in planta又は培養における任意の植物組織が含まれる。この用語の一例としては、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養及び、構造的単位及び/又は機能的単位に組織化された植物細胞の任意の群が含まれる。上述の又はこの定義によってそれ以外に包含される任意の特定のタイプの植物細胞との関連においてこの用語を使用するとしても、又はこのような植物細胞の存在なしにこの用語を使用するとしても、他のタイプの植物組織を排除するものではない。
【0062】
「プロモーター」はRNAポリメラーゼ結合部位を含有し、DNAの転写を開始するコーティング領域の上流の未翻訳DNA配列である。プロモーター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして作用するその他の要素を含んでもよい。
「プロトプラスト」は、細胞壁を有さないか又は細胞壁の一部しか有さない、単離された植物細胞である。
「調節要素」とは、ヌクレオチド配列の発現の制御に関与する配列を意味する。調節要素は、当該ヌクレオチド配列に作用連関されるプロモーターと終止シグナルとを含む。調節要素は典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要な配列をも包含する。
天然発生型プロテアーゼ認識部位を「置き換える」ことに関して、本発明によれば、付加的なプロテアーゼ認識部位は、付加的なプロテアーゼ認識部位の挿入が天然発生型プロテアーゼ認識部位を排除する場合に、天然発生型プロテアーゼ認識部位を「置き換える」と云う。例えば、Arg-158残基とAsn-159残基とを排除する、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のPro-154とPro-160との間に挿入された付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のArg-158とAsn-159との間に配置された天然発生型トリプシン認識部位と置き換わる。
【0063】
「セリン・プロテアーゼ」は、セリンによる標的ペプチド結合の求核攻撃に基づいたメカニズムを用いて、共有ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素から成る同一群を表す。セリン・プロテアーゼは、配列に対して特異的である。すなわち、それぞれのセリン・プロテアーゼは、酵素認識が発生するタンパク質内の特異的サブ配列を認識する。
「標的昆虫」は、Cry3A毒素に対する感受性を殆ど又は全く有していない害虫種であり、本発明の技術を用いて駆除するための候補として同定される。このような駆除は、幾つかの手段を介して達成することができるが、しかし、最も好ましくは、トランスジェニック植物中に本発明の核酸分子を発現させることによって達成することができる。
【0064】
「標的昆虫消化管プロテアーゼ」は、標的昆虫の消化管内に見出されるプロテアーゼであって、その認識部位をCry3A毒素中に挿入して、本発明の修飾Cry3A毒素を形成することができるプロテアーゼである。
「形質転換」は、宿主細胞又は生物中に異種核酸を導入するプロセスである。具体的には、「形質転換」は、当該生物のゲノム中にDNA分子を安定的に組込むことを意味する。
「形質転換された/トランスジェニック/組換え」は、異種核酸分子が導入された宿主生物、例えば細菌又は植物を意味する。核酸分子は宿主のゲノム中に安定的に組込むことができ、或いは、核酸分子は染色体外分子として存在していてもよい。このような染色体外分子は自己複製性である。形質転換された細胞、組織又は植物が、形質転換プロセスの最終生成物だけでなく、そのトランスジェニック子孫をも包含することは明らかである。「非形質転換」、「非トランスジェニック」又は「非組換え」ホストは野生型生物、例えば細菌又は植物であって、異種核酸分子を含有しないものを意味する。
天然発生型プロテアーゼ認識部位「内」に関しては、本発明によれば、付加的なプロテアーゼ認識部位が天然型プロテアーゼ認識部位の前に来るアミノ酸残基と、天然型プロテアーゼ認識部位の後に来るアミノ酸残基との間にある場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は天然発生型プロテアーゼ認識部位「内」にあると云う。例えば、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のTyr-587とTyr-588との間に挿入された付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のTyr-587とTyr-588との間に配置された天然発生型キモトリプシン認識部位「内」にある。天然発生型プロテアーゼ認識部位内の付加的なプロテアーゼ認識部位の挿入は、プロテアーゼによる天然発生型プロテアーゼ認識部位の認識を変化させても変化させなくてもよい。
【0065】
ヌクレオチドは、下記の標準省略形によってこれらの塩基で示される:アデニン(A)、シトシン(C)、チミン(T)及びグアニン(G)。アミノ酸は同様に下記の標準省略形によって示される:アラニン(Ala;A)、アルギニン(Arg;R)、アスパラギン(Asn;N)、アスパラギン酸(Asp;D)、システイン(Cys;C)、グルタミン(Gln;Q)、グルタミン酸(Glu;E)、グリシン(Gly;G)、ヒスチジン(His;H)、イソロイシン(Ile;l)、ロイシン(Leu;L)、リシン(Lys;K)、メチオニン(Met;M)、フェニルアラニン(Phe;F)、プロリン(Pro;P)、セリン(Ser;S)、トレオニン(Thr;T)、トリプトファン(Trp;W)、チロシン(Tyr;Y)及びバリン(Val;V)。
【0066】
本発明は、発現により修飾Cry3A毒素をもたらす修飾Cry3A核酸配列に関し、また、害虫を駆除するための修飾Cry3A毒素の形成及び使用に関する。修飾Cry3A核酸配列を発現させることにより、修飾Cry3A毒素がもたらされ、この修飾Cry3A毒素は、鞘翅目昆虫、例えばウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームを駆除するのに使用することができる。本発明の修飾Cry3A毒素は、Cry3A毒素中で天然発生しない少なくとも1つの付加的なプロテアーゼ認識部位を含む。標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識されるこの付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位とほぼ同じ位置に挿入される。修飾Cry3A毒素が標的昆虫にもたらす死亡率は、Cry3A毒素が同じ標的昆虫にもたらす死亡率よりも高い。好ましくは、Cry3A毒素が標的昆虫に最大30%の死亡率をもたらすのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【0067】
好ましい1実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、標的昆虫の消化管プロテアーゼ、カテプシンGによって認識される。カテプシンG活性は、実施例2において説明するように、標的昆虫ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管内に存在することが見極められる。好ましくは、カテプシンG活性の存在を見極めるのに使用される基質アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)が、本発明に従ってCry3A毒素中に挿入される。その他のカテプシンG認識部位、例えばAAPM(SEQ ID NO:36)、AVPF(SEQ ID NO:37)、PFLF(SEQ ID NO:38)、又はTanaka他、1985の方法(Biochemistry 24:2040-2047)によって見極められるようなその他のカテプシンG認識部位を、本発明に従って使用することもできる。上記文献の内容を参考のため本明細書中に引用する。標的昆虫の消化管中で同定されるその他のプロテアーゼのプロテアーゼ認識部位、例えば、その他のセリン・プロテアーゼ、システイン・プロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識部位を使用することができる。この実施態様によって包含される好ましいセリン・プロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ及びエラスターゼを含む。
【0068】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素のドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置、該認識部位に隣接する位置、又は該認識部位内の位置で、ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、未修飾Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置、該認識部位に隣接する位置、又は該認識部位内の位置で、ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入されるカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A毒素をコードする核酸分子である。
【0069】
修飾Cry3A毒素をコードする修飾Cry3A核酸分子を形成する方法の具体的な教示例は、実施例3に見出すことができる。当業者には明らかなように、本発明に従ってCry3A毒素中に付加的なプロテアーゼ認識部位を挿入するために、当業者に知られているその他の方法を用いることもできる。
【0070】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間に挿入される。好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A054 (SEQ ID NO:6)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A054毒素(SEQ ID NO:7)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位は、天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接する。SEQ ID NO:6の核酸分子は異種宿主中に発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:6に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0071】
別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む、修飾Cry3A055毒素(SEQ ID NO:9)をコードするCry3A055(SEQ ID NO:8)と呼ばれる核酸分子、及び、修飾Cry3A085毒素(SEQ ID NO:11)をコードするCry3A085(SEQ ID NO:10)と呼ばれる核酸分子である。SEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:10の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:10に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0072】
好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に挿入される。
【0073】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A082 (SEQ ID NO:12)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A082毒素(SEQ ID NO:13)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位は、天然発生型キモトリプシン認識部位と置き換わる。SEQ ID NO:12の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことはSEQ ID NO:12に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0074】
別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A058 (SEQ ID NO:14)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A058毒素(SEQ ID NO:15)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位は、天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。SEQ ID NO:14の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことはSEQ ID NO:14に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0075】
さらに別の好ましい実施態様の場合、本発明は修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A057 (SEQ ID NO:16)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A057毒素(SEQ ID NO:17)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位はドメインIにおいて、天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接し、またドメインIIIにおいて、天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。SEQ ID NO:16の核酸分子は異種宿主中に発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:16に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0076】
さらに別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A056 (SEQ ID NO:18)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A056毒素(SEQ ID NO:19)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位はドメインIにおいて、天然発生型トリプシン認識部位及び天然発生型キモトリプシン部位に隣接し、またドメインIIIにおいて、天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。SEQ ID NO:18の核酸分子は異種宿主中に発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:18に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0077】
さらに別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A058 (SEQ ID NO:20)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A083毒素(SEQ ID NO:21)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位はドメインIにおいて、天然発生型トリプシン認識部位及び天然発生型キモトリプシン部位に隣接し、またドメインIIIにおいて、天然発生型キモトリプシン認識部位と置き換わる。SEQ ID NO:20の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:20に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【0078】
好ましい実施態様の場合、本発明の単離された核酸分子は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む。
【0079】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む修飾Cry3A毒素をコードする、単離された核酸分子を包含する。
本発明はまた、本発明の核酸配列を含む組換えベクターを包含する。このようなベクターにおいて、核酸配列は好ましくは、ヌクレオチド配列を発現させることができる宿主細胞中にヌクレオチド配列を発現させるための調節要素を含む発現カセット内に含まれる。このような調節要素は普通、プロモーター及び終止シグナルを含み、また好ましくは、本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドの効率的な翻訳を可能にする要素をも含む。核酸配列を含むベクターは普通、特定の宿主細胞中で、好ましくは染色体外分子として複製することができ、従って、宿主細胞内で本発明の核酸配列を増幅するのに使用される。1実施態様の場合、このようなベクターのための宿主細胞は、微生物、例えば細菌、具体的にはBacillus thuringiensis又はE.coliである。別の実施態様の場合、このような組換えベクターのための宿主細胞は、内生植物又は着生植物である。このようなベクターの好ましい宿主細胞は、真核細胞、例えば植物細胞である。植物細胞、例えばトウモロコシ細胞が最も好ましい宿主細胞である。別の好ましい実施態様の場合、このようなベクターはウィルス・ベクターであり、特定の宿主細胞、例えば昆虫細胞又は植物細胞中のヌクレオチド配列の複製のために使用される。宿主細胞中に本発明のヌクレオチド配列を形質転換するために、組換えベクターも使用される。これにより、ヌクレオチド配列は、このような宿主細胞のDNA中に安定的に組込まれる。1実施態様の場合、このような宿主細胞は原核細胞である。好ましい実施態様の場合、このような宿主細胞は真核細胞、例えば植物細胞である。最も好ましい実施態様の場合、宿主細胞は植物細胞、例えばトウモロコシ細胞である。
【0080】
別の観点において、本発明は、本発明の核酸分子を発現させることにより生成された修飾Cry3A毒素を包含する。
【0081】
好ましい実施態様の場合、本発明の修飾Cry3A毒素は、本発明のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを含む。別の好ましい実施態様の場合、修飾Cry3A毒素は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む核酸分子を発現させることによって生成される。
【0082】
好ましい実施態様の場合、本発明の修飾Cry3A毒素は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む。
【0083】
本発明の修飾Cry3A毒素は、バイオアッセイで害虫に対して試験した場合に、昆虫駆除活性を有する。別の好ましい実施態様の場合、本発明の修飾Cry3A毒素は、鞘翅目昆虫に対して、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対して活性である。本発明の修飾Cry3A毒素の昆虫駆除特性は、さらに実施例4及び6において示す。
【0084】
本発明はまた、本発明による効果的な昆虫駆除量の修飾Cry3A毒素を含む組成物を包含する。
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、昆虫に対して活性の修飾Cry3A毒素を生成する方法であって、(a)本発明の核酸分子に作用連関された異種プロモーター配列をそれ自体が含むキメラ遺伝子を含む宿主細胞を獲得し;そして(b)トランスジェニック宿主細胞内に核酸分子を発現させることにより、昆虫に対して活性の1種以上の修飾Cry3A毒素を生じさせる、ことを含む方法を包含する。
【0085】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、昆虫に対して抵抗性のトランスジェニック植物を生成する方法であって、トランスジェニック植物中に本発明の核酸分子を導入することを含み、この核酸分子が昆虫駆除に有効な量でトランスジェニック植物において発現可能である、方法を包含する。好ましい実施態様の場合、これらの昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームである。
【0086】
さらに別の好ましい実施態様の場合、本発明は昆虫駆除の方法であって、本発明の有効量の修飾Cry3A毒素を昆虫に送達することを含む方法を包含する。1実施態様によれば、昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームである。好ましくは、修飾Cry3A毒素は昆虫に経口送達される。好ましい1実施態様の場合、毒素は、本発明の修飾Cry3A毒素を発現させる核酸配列を含むトランスジェニック植物を通して経口送達される。
【0087】
本発明はまた、修飾Cry3A毒素の形成方法であって:(a) Cry3A毒素をコードするCry3A毒素遺伝子を獲得し;(b) 標的昆虫の消化管プロテアーゼを同定し;(c) 前記消化管プロテアーゼのための認識部位をコードするヌクレオチド配列を獲得し;(d) ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に、Cry3A毒素遺伝子内の天然発生型プロテアーゼ認識部位をコードするヌクレオチド配列と置き換わる位置、該ヌクレオチド配列内の位置、又は該ヌクレオチド配列に隣接する位置で前記(c)のヌクレオチド配列を挿入し、こうして修飾Cry3A毒素遺伝子を作成し;(e) 前記修飾Cry3A毒素遺伝子を発現カセット中に挿入し;(f) 前記修飾Cry3A毒素遺伝子を非ヒト宿主細胞中に発現させることにより、修飾Cry3A毒素を生成する宿主細胞を生じさせ;そして(g) 標的昆虫に対して修飾Cry3A毒素をバイオアッセイし、これにより、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされる標的昆虫の死亡率よりも高い死亡率を標的昆虫にもたらすことを含む、方法を包含する。好ましい実施態様の場合、Cry3A毒素が標的昆虫に最大30%の死亡率をもたらすのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【0088】
本発明はさらに、昆虫駆除の方法であって、トランスジェニック植物がさらに、第2の殺虫成分をコードする第2の核酸配列又は核酸配列群を含む方法を包含する。特に好ましい第2の核酸配列は、δ-エンドトキシンをコードする核酸配列、米国特許第5,849,870号明細書及び同第5,877,012号明細書(これらを参考のため本明細書中に引用する)に開示された栄養殺虫剤タンパク質毒素をコードする核酸配列、又は非タンパク質成分を生成するための経路をコードする核酸配列である。
【0089】
別の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列はさらに、in vitroでの組換え又はDNAシャッフリングとして知られている技術で、ランダムな突然変異を組込むことにより修飾することができる。この技術はStemmer他、Nature 370:389-391(1994)及び米国特許第5,605,793号明細書に記載されている。これらの文献を参考のため本明細書中に引用する。本発明の元のヌクレオチド配列に基づいて、ヌクレオチド配列の数百万の突然変異体コピーが生成され、改善された特性、例えば増大した殺虫活性、向上した安定性、又は標的昆虫の異なる特異性又は範囲を有する変異形が回収される。この方法は、本発明のヌクレオチド配列を含む鋳型二本鎖ポリヌクレオチドから、突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを包含し、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドは開裂によって所望のサイズの二本鎖ランダム・フラグメントにされている。そしてこの方法は、結果として生じた二本鎖ランダム・フラグメント個体群に、1又は2種以上の一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドを添加し、前記オリゴヌクレオチドは二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対して同一性領域及び異種性領域を含み;結果として生じた二本鎖ランダム・フラグメントとオリゴヌクレオチドとの混合物を変性して一本鎖フラグメントにし;結果として生じた単鎖フラグメント個体群を、同一性領域で前記単鎖フラグメントをアニーリングすることになる条件下で、ポリメラーゼと一緒にインキュベートすることにより、アニールされたフラグメント対を形成し、同一性領域は、対の一方の員が他方の員の複製をプライムするのに十分であり、これにより、突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成し;2回以上の更なるサイクルにわたって第2ステップ及び第3ステップを反復し、更なるサイクルの第2ステップにおける混合物が、前のサイクルの第3ステップから得られた突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを含み、そして、前記更なるサイクルは、更なる突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成する、ステップを含む。好ましい実施態様の場合、二本鎖ランダム・フラグメント個体群における二本鎖ランダム・フラグメントの単一種の濃度は、総DNAの1重量%未満である。別の好ましい実施態様の場合、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドは、約100種以上のポリヌクレオチドを含む。別の好ましい実施態様の場合、二本鎖ランダム・フラグメントのサイズは、約5bp-5kbである。別の好ましい実施態様の場合、この方法の第4ステップは、10サイクル以上にわたって第2ステップ及び第3ステップを反復することを含む。
【0090】
異種微生物宿主におけるヌクレオチド配列の発現
生物学的な昆虫駆除剤として、殺虫性修飾Cry3A毒素は、ヌクレオチド配列を発現させることができる異種宿主中にヌクレオチド配列を発現させることにより生成される。第1の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列の修飾形を含むB. thuringiensis細胞が形成される。このような修飾形は、既存の調節要素を突然変異させるか又は抹消し、こうしてヌクレオチド配列の発現を変化させるか、又はヌクレオチド配列の発現を制御する新しい調節要素を組込むことを包含する。別の実施態様の場合、ヌクレオチド配列のうちの1又は2つ以上の付加的なコピーが、染色体中に挿入することにより、又は、これらのヌクレオチド配列を含有する染色体外複製分子を導入することにより、Bacillus thuringiensis細胞に添加される。
【0091】
別の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、プロモーター及び終止シグナルを含む適切な発現カセット内に挿入される。ヌクレオチド配列の発現は構成的であるか、或いは、転写を開始するための種々のタイプの刺激に応答する誘導性プロモーターが使用される。好ましい実施態様の場合、毒素が発現される細胞は微生物、例えばウィルス、細菌又は菌類である。好ましい実施態様の場合、ウィルス、例えばバキュロウィルスは、そのゲノム中に本発明のヌクレオチド配列を含有し、ウィルス複製及びヌクレオチド配列の発現に適した真核細胞の感染後に、対応する多量の殺虫性毒素を発現させる。こうして生成された殺虫性毒素は、殺虫剤として使用される。或いは、ヌクレオチド配列を含むように遺伝子工学的に作り出されたバキュロウィルスを使用することにより、in vivoで昆虫を感染させ、そして、殺虫性毒素を発現させるか、又はウィルス感染と殺虫性毒素の発現とを組み合わせることにより、これらの昆虫を殺す。
【0092】
細菌細胞は、本発明のヌクレオチド配列を発現させるための宿主でもある。好ましい実施態様の場合、植物細胞内で生存し複製することができる非病原性共生細菌、いわゆる内生植物、又は、葉圏又は根圏をコロニー化することができる非病原性共生細菌、いわゆる着生植物が使用される。このような細菌は、Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces及びXanthomonasの属から成る細菌を含む。共生菌類、例えばTrichoderma及びGliocladiumも、同じ目的で本発明のヌクレオチド配列を発現させるのに考えられ得る宿主である。
【0093】
これらの遺伝子操作の技術は、利用可能な種々異なる宿主に対して特異的であり、当業者に知られている。例えば、発現ベクターpKK223-3及びpKK223-2を使用することにより、tac及びtrcプロモーターの後ろで、転写融合又は翻訳融合の際にE.coli中に異種遺伝子を発現させることができる。複数のORFをコードするオペロンを発現させるために、最も簡単な手順は、転写融合の際にpKK223-3のようなベクター内にオペロンを挿入し、異種遺伝子の同系リボソーム結合部位の使用を可能にすることである。グラム陽性種、例えばBacillusにおける過剰発現技術も当業者に知られており、本発明の関連において使用することができる(Quax他、「Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics」 Baltz他編、American Society for Microbiology, Washington (1993))。過剰発現の代替系は、例えば酵母ベクターに依存し、Pichia, Saccharomyces 及びKluyveromycesの使用を含む(Sreekrishna 「Industrial Microorganisms: basic and applied molecular genetics」 Baltz, Hegeman及びSkatrud編、American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173-177(1994); van den Berg他、Biotechnology 8:135-139(1990))。
【0094】
植物の形質転換
特に好ましい実施態様の場合、本発明の殺虫性修飾Cry3A毒素の少なくとも1種が、より高等な生物、例えば植物において発現される。この場合、有効量の修飾Cry3A毒素を発現させるトランスジェニック植物は、害虫から自らを守る。昆虫がこのようなトランスジェニック植物を食べはじめると、その昆虫は、発現された修飾Cry3A毒素をも摂取することになる。このことは、昆虫がこれ以上植物組織に食い付くことを阻止することになり、或いは、昆虫に危害を加えるか又は殺しさえすることができる。本発明のヌクレオチド配列は発現カセット内に挿入され、この発現カセットは次いで好ましくは前記植物のゲノム中に安定的に組込まれる。別の好ましい実施態様の場合、ヌクレオチド配列は、非病原性自己複製ウィルス中に含まれる。本発明に従って形質転換される植物は、単子葉植物又は双子葉植物であってよく、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、サツマイモ、豆、エンドウ豆、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、蕪、大根、ほうれん草、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、胡椒、セロリ、スカッシュ、カボチャ、麻、ズッキーニ、リンゴ、西洋ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、桃、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、大豆、トマト、サトウモロコシ、サトウキビ、甜菜、ヒマワリ、菜種、クローバー、タバコ、ニンジン、綿、アルファルファ、稲、ジャガイモ、茄子、キュウリ、アラビドプシス、及び樹木植物、例えば針葉樹及び落葉樹を含む。所望のヌクレオチド配列が特定の植物種内に形質転換されると、このヌクレオチド配列は伝統的な繁殖技術を用いて、その種内で増殖するか、又は、具体的には実用品種を含む同一種の他の亜種に移動することができる。本発明のヌクレオチド配列は好ましくはトランスジェニック植物中で発現され、こうしてトランスジェニック植物中で、対応する修飾Cry3A毒素を生合成させる。このようにして、昆虫に対して抵抗性が増強されたトランスジェニック植物が生成される。トランスジェニック植物中の発現のために、本発明のヌクレオチド配列は、他の修飾及び最適化を必要とすることがある。多くの場合、微生物に由来する遺伝子は植物中に修飾なしに高レベルで発現させることができるものの、植物において好ましくないコドンを有する微生物ヌクレオチド配列からは、トランスジェニック植物における発現率が低くなることがある。全ての生物がコドン使用頻度に対して特異的な優先傾向を有していることが当業者に知られており、本発明において記載されたヌクレオチド配列のコドンを変更することにより、植物の優先傾向と一致させる一方、これによりコードされたアミノ酸を維持することができる。さらに、GC含有率が約35%以上、好ましくは45%超、より好ましくは約50%超、最も好ましくは約60%超のコーディング配列から、植物中の高発現率が最良に達成される。GC含有率が低い微生物ヌクレオチド配列は、メッセージを不安定化させるATTTAモチーフ、及び、不適切なポリアデニル化を引き起こすAATAAAモチーフの存在に起因して植物中の発現率を悪くするおそれがある。好ましい遺伝子配列は、単子葉植物種及び双子葉植物種の両方において十分に発現させることができるものの、単子葉植物及び双子葉植物の特異的なコドン優先傾向及びGC含有率優先傾向に寄与するように配列を修飾することができる。それというのも、これらの優先傾向は互いに異なることが判っているからである(Murray他、Nucl. Acids Res. 17:477-498(1989))。加えてヌクレオチド配列は、メッセージを切断するおそれのある非正統的なスプライス部位の存在に関してスクリーニングされる。上述のような、ヌクレオチド配列内で行われる必要のある全ての変更は、特定部位の突然変異誘発、PCR、及び、欧州特許出願公開第0385962号明細書(Monsanto)、同第0359472号明細書(Lubrizol)及び国際公開第93/07278号パンフレット(Ciba-Geigy)に記載された方法による合成遺伝子構成の良く知られた技術を用いて実施される。
【0095】
本発明の1実施態様の場合、Cry3A遺伝子は、米国特許第5,625,136号明細書に開示された手順に従って形成される。上記明細書を参考のため本明細書中に引用する。この手順において、トウモロコシ優先コドン、すなわちトウモロコシ中のそのアミノ酸を最も頻繁にコードする単一コドンが使用される。特定のアミノ酸に対応するトウモロコシ優先コドンは、例えばトウモロコシに由来する既知の遺伝子配列から誘導されてよい。トウモロコシ植物に由来する28個の遺伝子に対応するトウモロコシ・コドン使用頻度が、Murray他、Nucleic Acids Research 17:477-498(1989)に見出される。この文献の開示内容を参考のため本明細書中に引用する。トウモロコシ最適化コドンで形成された合成配列はSEQ ID NO:3に示される。
このようにして、ヌクレオチド配列は任意の植物における発現のために最適化することができる。すなわち、合成最適化配列又は部分最適化配列を使用することもできる。
効率的な翻訳開始のために、開始メチオニンに隣接する配列は修飾を必要する場合がある。例えばこれらの配列は、植物において効果的であることが知られている配列を含むことにより修飾することができる。Joshiは、植物のための適切なコンセンサスを示唆しており(NAR 15:6643-6653(1987))、そしてClonetechは、更なるコンセンサス翻訳イニシエーター(1993/1994カタログ、第210頁)を示唆する。これらのコンセンサスは、本発明のヌクレオチド配列と共に使用するのに適している。これらの配列は、ATGまでの(ATGを含む)ヌクレオチド配列(第2アミノ酸は未修飾のままにする)、或いは、ATGに続くGTCまでの(GTCを含む) ヌクレオチド配列(導入遺伝子の第2アミノ酸を修飾することが可能である)を含む構造中に組込まれる。
【0096】
トランスジェニック植物におけるヌクレオチド配列の発現は、植物中で機能するプロモーターによって推進される。プロモーターは、発現に必要な時間的及び空間的な要件に応じて、また標的種に応じて選択される。従って、葉、軸及び茎、穂、花部(例えば下穂、円錐花序、穂軸)、根、及び/又は苗中に、本発明のヌクレオチド配列が発現されることが好ましい。しかし多くの場合、2つ以上のタイプの害虫に対する保護が求められ、ひいては複数の組織における発現が望ましい。双子葉植物に由来する多くのプロモーターが単子葉植物において作用可能であり、その逆も云えることが判っているが、理想的には、双子葉植物における発現のためには双子葉植物プロモーターが選択され、単子葉植物における発現のためには単子葉植物プロモーターが選択される。しかし、選択されるプロモーターの起源に対する制限はなく、これらが所望の細胞におけるヌクレオチド配列の発現を推進する上で作用可能であれば十分である。
【0097】
構成的に発現される好ましいプロモーターは、アクチン又はユビキチンをコードする遺伝子に由来するプロモーターと、CaMV 35S及び19Sプロモーターを含む。本発明のヌクレオチド配列は、化学的に調節されるプロモーターによって調節されながら発現させることもできる。このことは、作物が誘導性化学物質で処理されるときにだけ、殺虫性修飾Cry3A毒素が合成されることを可能にする。遺伝子発現の化学的誘導のための好ましい技術に関しては、欧州特許出願公開第0332104号明細書(Ciba-Geigy)及び米国特許第5,614,395号明細書に詳細に記載されている。化学的誘導のための好ましいプロモーターは、タバコPR-1aプロモーターである。
【0098】
プロモーターの好ましいカテゴリーは、傷誘導性のプロモーターである。傷部位で、また植物病原体感染部位でも発現される多くプロモーターが記述されている。理想的には、このようなプロモーターは感染部位で局所的にのみ活性であることが望ましく、このようになっていれば、殺虫性修飾Cry3A毒素は、侵入する害虫を殺すために殺虫性修飾Cry3A毒素を合成するのを必要とする細胞にだけ蓄積する。このような種類の好ましいプロモーターは、Stanford他、Mol.Gen. Genet. 215:200-208(1989), Xu他、Plant Molec. Biol. 22:573-588(1993), Logemann他、Plant Cell 1:151-158(1989), Rormeier及びLehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792(1993), Firek他、Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993)及びWarner他、Plant J.3:191-201(1993)によって記載されたプロモータを含む。植物、具体的にはトウモロコシにおいて修飾Cry3A毒素遺伝子を発現させるのに有用な組織特異的又は組織優先的なプロモーターは、根、髄、葉又は花粉、特に根において発現を導くプロモーターである。このようなプロモーターは、例えば米国特許第5,625,136号明細書に開示されたPEPC又はtrpA、又は、米国特許第5,466,785号明細書に開示されたMTLから単離されたプロモーターである。上記両米国特許明細書全体を参考のため本明細書中に引用する。
【0099】
別の好ましい実施態様は、傷誘導式又は病原体感染誘導式に、ヌクレオチド配列を発現させるトランスジェニック植物である。
プロモーターに加えて、本発明の修飾Cry3A毒素遺伝子を使用したキメラ遺伝子構造において、種々の転写ターミネーターを使用することもできる。転写ターミネーターは、導入遺伝子を超えた転写の終結、及びその正確なポリアデニル化に寄与する。適切な転写ターミネーター及び植物において機能することが知られているターミネーターは、CaMV 35Sターミネーター、tmlターミネーター、ノパリン・シンターゼ・ターミネーター、pea rbcS E9ターミネーター及び当業者に知られたその他のターミネーターを含む。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方において使用することができる。植物中で機能することが知られている任意の利用可能なターミネーターを、本発明の関連において使用することができる。
【0100】
本発明において記載された発現カセット内に、その他の多くの配列を組込むことができる。これらの配列は、発現を増強することが判っている配列、例えばイントロン配列(例えばAdhl及びbronzel由来)及びウィルス・リーダー配列(例えばTMV, MCMV及びAMV由来)を含む。
【0101】
植物中の種々異なる細胞部位を標的として本発明のヌクレオチド配列を発現させることが好ましい。幾つかの場合には、細胞質ゾルにおける局在化が望ましいのに対して、他の場合には、何らかの亜細胞小器官における局在化が望ましい。導入遺伝子によってコードされた酵素の亜細胞局在化が、当業者に良く知られた技術によって行われる。典型的には、小器官を標的とした既知の遺伝子生成物に由来する標的ペプチドをコードするDNAが操作され、ヌクレオチド配列の上流で融合される。多くのこのような標的配列が葉緑体に関して知られており、異種構造においてこれらの配列が機能することが判っている。本発明のヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞の小胞体又は液胞を標的とする。これを達成するための技術は当業者に良く知られている。
【0102】
植物の形質転換に適したベクターは、本明細書の別の箇所に記載されている。アグロバクテリウム媒介性形質転換の場合、二元ベクター、又は少なくとも1つのT-DNAボーダー配列を担持する二元ベクターが好適であり、これに対して、直接的な遺伝子導入の場合には、いかなるベクターも好適であり、当該構造だけを含有する線状DNAが好ましい。直接的な遺伝子導入の場合、単一DNA種による形質転換又は同時形質転換を用いることができる(Schocher他、Biotechnology 4:1093-1096(1986))。直接的な遺伝子導入の場合にも、アグロバクテリウム媒介性導入の場合にも、形質転換は普通(必ずというわけではない)、選択マーカーを用いて行われる。この選択マーカーは抗生物質(カナマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキサート)又は除草剤(バスタ)に対する耐性を提供することができる。本発明の修飾Cry3A毒素遺伝子を含む植物形質転換ベクターは、米国特許第5,767,378号明細書及び同第5,994,629号明細書(これらを参考のため本明細書中に引用する)に開示されているような、トランスジェニック植物をポジティブに選択することを可能にする遺伝子(例えばホスホマンノース・イソメラーゼ;PMI)を含んでもよい。しかし選択マーカーの選択肢は、本発明にとってさほど重要ではない。
【0103】
別の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列は、プラスチド・ゲノム中に直接的に形質転換される。プラスチド形質転換の主な利点は、プラスチドが一般に、コドンが実質的に最適化されていない細菌遺伝子を発現させることができること、及び、プラスチドが単一プロモーターの制御下で複数のオープン・リーディング・フレームを発現させることができること、である。プラスチド形質転換技術は、米国特許第5,451,513号明細書、同第5,545,817号明細書及び同第5,545,818号明細書、国際公開第95/16783号パンフレット、及びMcBride他(1994)Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305に広範囲にわたって記載されている。葉緑体形質転換のための基本技術は、バイオリスティクス又はプロトプラスト形質転換(例えば塩化カルシウム又はPEGを媒介とする形質転換)を用いて、選択マーカーを側面に有するクローニングされたプラスチドDNAの領域を、当該遺伝子と一緒に好適な標的組織中に導入することを伴う。ターゲティング配列と呼ばれる1-1.5kbの側面領域は、プラスチド・ゲノムとの相同組換えを容易にし、ひいては、プラストムの特定領域の置換又は修飾を可能にする。先ず、スペクチノマイシン及び/又はストレプトマイシンに対する耐性を付与する葉緑体16S rRNA及びrps12の遺伝子中の点突然変異体が、形質転換のための選択マーカーとして利用される(Svab,Z., Hajdukiewicz, P.及びMaliga, P.(1990)Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J.M.及びMaliga, P.(1992)Plant Cell 4, 39-45)。その結果、標的となる葉に対する衝撃100回当たりほぼ1回の頻度で、安定的な同種形成性の形質転換体が得られる。これらのマーカーの間にクローニング部位が存在することにより、外来遺伝子を導入するためのプラスチド標的ベクターの形成が可能になった(Staub, J.M及びMaliga, P.(1993)EMBO J.12,601-606)。劣性rRNA又はr-タンパク質抗生物質耐性遺伝子を、主要な選択マーカー、スペクチノマイシン解毒酵素、アミノグリコシド-3'-アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌aadA遺伝子と置換することにより、形質転換頻度が実質的に増大する(Svab,Z及びMaliga, P.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917)。既に、このマーカーは、緑藻Chlamydomonas reinhardtiiのプラスチド・ゲノムの高頻度形質転換に使用することに成功している(Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089)。プラスチド形質転換に有用な他の選択マーカーが当業者に知られており、これらは本発明の範囲に含まれる。典型的には、同種形成性の状態に達するには、形質転換に続いてほぼ15-20回の細胞分裂サイクルが必要となる。それぞれの植物細胞内に存在する環状プラスチドゲノムの数千個のコピーの全てに、相同組換えにより遺伝子が挿入されるプラスチド発現は、コピー数が莫大であるという、核発現遺伝子を凌ぐ利点を利用することにより、可溶性植物タンパク質全体の10%を容易に上回ることができる発現レベルを可能にする。好ましい実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列は、プラスチド標的ベクター中に挿入され、所望の植物宿主のプラスチド・ゲノム中に形質転換される。本発明のヌクレオチド配列を含有するプラスチド・ゲノムに対して同種形成性の植物が得られ、これらの植物は、このヌクレオチド配列を優先的に高発現させることができる。
【0104】
昆虫駆除成分の組み合わせ
本発明の修飾Cry3A毒素をBtδ-エンドトキシン又はその他の殺虫性成分と組み合わせて使用することにより、害虫の標的範囲を広くすることができる。さらに、Btδ-エンドトキシン又は明確な性質を有するその他の殺虫性成分と組み合わせて、本発明の修飾Cry3A毒素を使用することは、昆虫における抵抗性の予防及び/又は管理に特に有用である。
他の殺虫性成分は例えば、レクチン、α-アミラーゼ、ペルオキシダーゼ及びコレステロール・オキシダーゼを含む。栄養殺虫性タンパク質遺伝子、例えば米国特許第5,889,174号明細書に開示されたVip1A(a)及びvip2A(a)も本発明において有用である。上記明細書を参考のため本明細書中に引用する。
必要な遺伝子全てを含有し発現させるように植物を遺伝子工学的に作り出すことにより、同じトランスジェニック植物中に2つ以上の殺虫性成分を同時発現させることができる。或いは、本発明の遺伝子を発現させるために、植物「親1」を遺伝子工学的に作成することができる。補足的な昆虫駆除成分を発現させるために、第2の植物「親2」を遺伝子工学的に作成することができる。親1と親2とを交配することにより、親1と親2とに導入された遺伝子全てを発現させる子孫植物が得られる。本発明のトランスジェニック種子は、米国特許第5,849,320号明細書及び同第5,876,739号明細書に記載されているような殺虫性種子コーティングで処理することもできる。上記明細書を参考のため本明細書中に引用する。殺虫性種子コーティングと本発明のトランスジェニック種子との双方が同じ標的昆虫に対して活性である場合、その組み合わせは、(i)標的昆虫に対する本発明の修飾Cry3A毒素の活性を増強する方法、及び(ii)標的昆虫に対する第2の作用メカニズムを提供することにより、本発明の修飾Cry3A毒素に対する抵抗性の発生を予防する方法、において有用である。従って本発明は、標的昆虫、例えばコーン・ルートワームに対する活性を増強するか、又は該標的昆虫における抵抗性の発生を予防する方法であって、本発明の1又は2種以上の修飾Cry3A毒素を含むトランスジェニック種子に殺虫性種子コーティングを塗布することを含む、方法を提供する。
【0105】
殺虫性種子コーティングが異なる昆虫に対して活性である場合にも、例えば、鞘翅目昆虫に対して活性を有する本発明のトランスジェニック種子に、鱗翅目昆虫に対して活性を有する殺虫性種子コーティングを添加することにより、殺虫性種子コーティングは昆虫駆除範囲を広げるのに有用である。生成されたコーティング済トランスジェニック種子は、鱗翅目及び鞘翅目双方の害虫を駆除する。
【0106】
実施例
下記に詳述する実施例を参照することにより、本発明をさらに説明する。これらの実施例は例示を目的としてのみ提供され、特に断りのない限り、本発明を限定するものではない。これらの実施例において使用した標準的な組換えDNA及び分子クローニング技術は当業者に良く知られており、J. Sambrook他著、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第3版、Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001);T.J.Silhavy, M.L. Berman及びL.W.Enquist著、Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY: (1984)及びAusubel, F.M.他著、Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter他著、Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press(1992)及びSchultz他著、Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers(1998)によって記述されている。
【0107】
実施例1:トウモロコシ最適化Cry3A遺伝子の構成
トウモロコシに対して最適化されたCry3A遺伝子を、米国特許第5,625,136号明細書に開示された手順に従って形成する。この手順において、トウモロコシ優先コドン、すなわちトウモロコシ中のそのアミノ酸を最も頻繁にコードする単一コドンを使用する。特定のアミノ酸に対応するトウモロコシ優先コドンは、例えばトウモロコシに由来する既知の遺伝子配列から誘導する。トウモロコシ植物に由来する28個の遺伝子に対応するトウモロコシ・コドン使用頻度が、Murray他、Nucleic Acids Research 17:477-498(1989)に見出される。トウモロコシ最適化コドンで形成された合成配列をSEQ ID NO:3に示す。
【0108】
実施例2: ウェスタン・コーン・ルートワーム消化管におけるカテプシンG酵素活性の同定
ウェスタン・コーン・ルートワーム消化管におけるカテプシンG様(セリン・プロテアーゼ)及びカテプシンB様(システイン・プロテアーゼ)酵素活性を、比色分析基質を使用して測定する。それぞれ1mlの反応物は、第3齢のウェスタン・コーン・ルートワームの5つの均質化中腸と、反応緩衝液(10mM Tris, 5mM NaCl, 0.01 M DTT, pH7.5)中に溶解された基質1mgとを含有する。試験されるカテプシンG基質は、Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO:35)-pNAであり、カテプシンB基質はArg-Arg-pNAである。反応物を1時間にわたって28℃でインキュベートする。プロテアーゼが適切な基質を認識する効率を示す、黄色形成強度を処理物と対照とで比較する。色が検出されない場合、又は僅かなバックグラウンド色が検出される場合には、反応物には負(-)のスコアを与える。バックグラウンドを25%、50%、75%又は100%上回る反応物には、それぞれ+, ++, +++又は++++のスコアを与える。酵素アッセイの結果を下記表に示す。
【0109】
【表1】
セリン・プロテアーゼ、カテプシンGの活性がウェスタン・コーン・ルートワーム消化管中で同定されたのはこれが初めてである。ウェスタン・コーン・ルートワーム消化管は明らかに、カテプシンB(システイン・プロテアーゼ)活性よりも強いカテプシンG(セリン・プロテアーゼ)活性を有している。本発明の修飾Cry3A毒素を形成するためのカテプシンGプロテアーゼ認識部位として、AAPF配列(SEQ ID NO:35)を選択する。
【0110】
実施例3:修飾Cry3A遺伝子の構築
ドメインI又はドメインIII、或いはドメインI及びドメインIIIの両方においてカテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を含む修飾Cry3A遺伝子を、オーバーラップPCRを用いて形成する。プラスミドpCIB6850(SEQ ID NO:5)に含まれる、トウモロコシ最適化Cry3A遺伝子(SEQ ID NO:2)を、開始鋳型として使用する。修飾Cry3A毒素をコードする8つの修飾Cry3A遺伝子構造、すなわち、ドメインI内にカテプシンG認識部位コーティング配列を含むCry3A054, Cry3A055, Cry3A085; ドメインIII内にカテプシンG認識部位コーティング配列を含むCry3A058, Cry3A082; ドメインI及びドメインIII内にカテプシンG認識部位コーティング配列を含むCry3A056, Cry3A057, Cry3A083を形成する。これら8つの修飾Cry3A遺伝子及びこれらがコードする修飾Cry3A毒素を以下に説明する:
【0111】
pCMS054に含まれるCry3A054
Cry3A054(SEQ ID NO:6)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する:
1. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3' (SEQ ID NO:23)
2. TAIL5mod-5'-GCTGCACCGTTCCCCCACAGCCAGGGCCG-3' (SEQ ID NO:24)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
3. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
【0112】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を次いで等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A054遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS054と呼ばれ、Cry3A054遺伝子(SEQ ID NO:6)を含む。
【0113】
pCMS054に含まれる修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A054毒素(SEQ ID NO:7)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と113との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接している。
【0114】
pCMS055に含まれるCry3A055
Cry3A055(SEQ ID NO:8)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する:
1. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3' (SEQ ID NO:23)
2. AAPFtail4-5'-GCTGCACCGTTCCGCAACCCCCACAGCCA-3' (SEQ ID NO:26)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
3. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
【0115】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を次いで等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS055と呼ばれ、Cry3A055遺伝子(SEQ ID NO:8)を含む。
pCMS055に含まれる修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A055毒素(SEQ ID NO:9)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然型トリプシン・キモトリプシン認識部位に隣接している。
【0116】
pCMS058に含まれるCry3A058
Cry3A058(SEQ ID NO:14)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する:
1. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
AAPF-Y2-5'-GAACGGTGCAGCGTATTGGTTGAAGGGGGC-3' (SEQ ID NO:28)
2. AAPF-Y1-5'-GCTGCACCGTTCTACTTCGACAAGACCATC-3' (SEQ ID NO:29)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
3. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
【0117】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を次いで等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A058遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS058と呼ばれ、Cry3A058遺伝子(SEQ ID NO:14)を含む。
【0118】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A058毒素(SEQ ID NO:15)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸540と541との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然型キモトリプシン認識部位内にある。
【0119】
Cry3A082を含むpCMS082
Cry3A082(SEQ ID NO:12)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。QuikChange Site Directed Mutagenesis PCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する:
BBmod1-5'-CGGGGCCCCCGCTGCACCGTTCTACTTCGACA-3' (SEQ ID NO:31)
BBmod2-5'-TGTCGAAGTAGAACGGTGCAGCGGGGGCCCCG-3' (SEQ ID NO:32)
【0120】
プライマー対が固有のPCR生成物を発生させる。この生成物をクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A082遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS082と呼ばれ、Cry3A082遺伝子(SEQ ID NO:12)を含む。
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A082毒素(SEQ ID NO:13)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸539と542との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然型キモトリプシン認識部位と置き換わる。
【0121】
pCMS056に含まれるCry3A056
Cry3A056(SEQ ID NO:18)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。6つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾Cry3A中に、2つのカテプシンG認識部位を挿入する:
1. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3' (SEQ ID NO:23)
2. AAPFtail4-5'-GCTGCACCGTTCCGCAACCCCCACAGCCA-3' (SEQ ID NO:26)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
3. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
4. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
AAPF-Y2-5'-GAACGGTGCAGCGTATTGGTTGAAGGGGGC-3' (SEQ ID NO:28)
5. AAPF-Y1-5'-GCTGCACCGTTCTACTTCGACAAGACCATC-3' (SEQ ID NO:29)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
6. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
【0122】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850プラスミドに戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS055と呼ばれる。プライマー対4及びプライマー対5が別の固有のフラグメント・セットを発生させる。これらのフラグメントをプライマー対6で別のPCRによって接合する。このフラグメントを、pCMS055内に含まれる修飾Cry3A055遺伝子のドメインIII中にクローニングする。その結果生じたプラスミドはpCMS056と呼ばれ、Cry3A056遺伝子(SEQ ID NO:18)を含む。
【0123】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A056毒素(SEQ ID NO:19)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111との間に挿入されており、ドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸540と541との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、ドメインIにおいては天然発生型トリプシン・キモトリプシン認識部位に隣接し、ドメインIIIにおいては天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。
【0124】
pCMS057に含まれるCry3A057
Cry3A057(SEQ ID NO:16)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。6つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾Cry3A中に、2つのカテプシンG認識部位を挿入する:
1. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3' (SEQ ID NO:23)
2. TAIL5mod-5'-GCTGCACCGTTCCCCCACAGCCAGGGCCG-3' (SEQ ID NO:24)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
3. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
4. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
AAPF-Y2-5'-GAACGGTGCAGCGTATTGGTTGAAGGGGGC-3' (SEQ ID NO:28)
5. AAPF-Y1-5'-GCTGCACCGTTCTACTTCGACAAGACCATC-3' (SEQ ID NO:29)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
6. SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3' (SEQ ID NO:27)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:30)
【0125】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850プラスミドに戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS054と呼ばれる。プライマー対4及びプライマー対5が別の固有のフラグメント・セットを発生させる。これらのフラグメントをプライマー対6で別のPCRによって接合する。このフラグメントを、pCMS054内に含まれる修飾Cry3A054遺伝子のドメインIII中にクローニングする。その結果生じたプラスミドはpCMS057と呼ばれ、Cry3A057遺伝子(SEQ ID NO:16)を含む。
【0126】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A057毒素(SEQ ID NO:17)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と113との間に挿入されており、ドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸540と541との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、ドメインIにおいては天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、且つ天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接し、ドメインIIIにおいては天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。
【0127】
pCMS083に含まれるCry3A083
Cry3A083(SEQ ID NO:20)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対と1つのQuikChange Site Directed Mutagenesis PCRプライマー対とを使用して、未修飾Cry3A中に、2つのカテプシンG認識部位を挿入する:
1. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3' (SEQ ID NO:23)
2. AAPFtail4-5'-GCTGCACCGTTCCGCAACCCCCACAGCCA-3' (SEQ ID NO:26)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
3. BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3' (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3' (SEQ ID NO:25)
BBmod1-5'-CGGGGCCCCCGCTGCACCGTTCTACTTCGACA-3' (SEQ ID NO:31)
BBmod2-5'-TGTCGAAGTAGAACGGTGCAGCGGGGGCCCCG-3' (SEQ ID NO:32)
【0128】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850プラスミドに戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS055と呼ばれる。プライマー対4が別の固有のフラグメントを発生させる。このフラグメントを、pCMS055内に含まれる修飾Cry3AのドメインIII中にクローニングする。その結果生じたプラスミドはpCMS083と呼ばれ、Cry3A083遺伝子(SEQ ID NO:20)を含む。
【0129】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A083毒素(SEQ ID NO:21)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111との間に挿入されており、ドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸539と542との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、ドメインIにおいては天然発生型トリプシン・キモトリプシン認識部位に隣接し、ドメインIIIにおいては天然発生型キモトリプシン認識部位と置き換わる。
【0130】
pCMS085に含まれるCry3A085
Cry3A085(SEQ ID NO:10)は、上述のCry3A055遺伝子内の位置と同じ位置にカテプシンGコーディング配列を含む。Cry3A085遺伝子は、SEQ ID NO:2に示された演繹アミノ酸配列のアミノ酸41-47をコードする、5'末端に挿入された付加的な24個のヌクレオチド、並びに、付加的なメチオニンを有している。付加的なヌクレオチドは、下記PCRプライマー対を使用して、Cry3A055遺伝子の5'末端に挿入される:
mo3Aext-5'-GGATCCACCATGAACTACAAGGAGTTCCTCCGC-
ATGACCGCCGACAAC-3' (SEQ ID NO:33)
CMS16-5'-CCTCCACCTGCTCCATGAAG-3' (SEQ ID NO:34)
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A085毒素(SEQ ID NO:11)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111とに対応するアミノ酸の間に挿入されている。修飾Cry3A085毒素(SEQ ID NO:11)はまた、N末端に8つの付加的なアミノ酸残基を有している。これらの残基のうちの第2残基は、SEQ ID NO:2に示されたアミノ酸配列のアミノ酸番号41に対応する。
【0131】
実施例4:修飾Cry3A毒素の殺虫活性
ウェスタン・コーン・ルートワーム、ノーザン・コーン・ルートワーム及びサザン・コーン・ルートワームに対する殺虫活性に関して、昆虫バイオアッセイにおいて、修飾Cry3A毒素を試験する。食餌取込み法を用いてバイオアッセイを実施する。本発明の修飾Cry3A毒素のうちの1つを発現させるE.coliクローンを一晩にわたって成長させる。一晩経過後の培養500μlを超音波処理し、次いで、500μlの溶融人工食餌(Marrone他、(1985)J. of Economic Entomology 78:290-293)と混合する。食餌が凝固したら、これをペトリ皿に小分けし、20匹の新生コーン・ルートワームを食餌上に置く。これらのペトリ皿を30℃で保持する。6日後の死亡率を記録する。修飾Cry3A毒素の全ては、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに50%-100%の死亡率をもたらすのに対し、未修飾Cry3A毒素は0%-30%の死亡率をもたらす。サザン・コーン・ルートワームに対する活性を有する修飾Cry3A毒素はない。
【0132】
実施例5:修飾Cry3Aコーディング配列を含むトランスジェニック・トウモロコシ植物の形成
3つの修飾Cry3A遺伝子、すなわち、ドメインIの修飾形の代表であるCry3A055と、ドメインIIIの修飾形の代表であるCry3A058と、ドメインI及びドメインIIIの修飾形の代表であるCry3A056とを、トウモロコシ植物中への形質転換のために選択する。修飾Cry3Aコーディング配列を含む発現カセットを、アグロバクテリウム媒介性トウモロコシ形質転換に適したベクターに導入する。例えば、発現カセットは、修飾Cry3A遺伝子に加えて、MTLプロモーター(米国特許第5,466,785号明細書)及び当業者に知られたnosターミネーターを含む。
【0133】
未熟なトウモロコシ胚の形質転換を、事実上、Negrotto他、2000、Plant Cell Reports 19:798-803に記載されたように実施する。この例の場合、全ての培地構成成分は、Negrotto他、前掲書に記載されている通りである。しかしその代わりに、当業者に知られた種々の培地を使用することができる。
形質転換に使用される遺伝子を、トウモロコシ形質転換に適したベクター中にクローニングする。この例で使用されるベクターは、トランスジェニック系統を選択するためのホスホマンノース・イソメラーゼ(PMI)遺伝子を含有する(Negrotto他、(2000)、Plant Cell Reports 19:798-803)。
【0134】
植物形質転換プラスミドを含有するAgrobacterium菌株LBA4404(pSB1)を、YEP(酵母抽出物(5g/L)、ペプトン(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l寒天、pH6.8)固形培地上で、2-4日にわたって28℃で成長させる。100μMのAsが補足されたLS-inf培地中に約0.8 x 109個のAgrobacteriumを懸濁する。30-60分にわたってこの培地中で細菌を前誘発する。
A188又は他の好適な遺伝子型に由来する未熟胚を日齢8-12日の穂から摘出し、液体LS-inf + 100μM As中に入れる。新鮮な感染培地で胚を一度濯ぐ。次いでAgrobacterium溶液を添加し、胚を30秒間にわたって渦流処理し、5分間にわたって細菌と共に鎮静させておく。次いで、胚を、胚盤側を上にしてLSA培地に移し、2-3日間にわたって暗所内で培養する。続いて、セフォタキシム(250mg/l)及び硝化銀(1.6mg/l)が補足されたLSD培地に、ペトリ板1つ当たり20-25個の胚を移し、28℃で10日間にわたって暗所内で培養する。
【0135】
胚生成カルスを生成する未熟胚をLSD1M0.5S培地に移す。3週目の継代培養ステップを含む6週間にわたって、この培地上で培養を淘汰する。
マンノースが補足されたReg1培地に、生き残ったカルスを移す。明所(16時間明/8時間暗の編成)における培養に続いて、未熟な組織を成長レギュレーターを有さないReg2培地に移し、そして1-2週間にわたってインキュベートする。小植物を、Reg3培地を含有するMagenta GA-7ボックス(Magenta Corp, Chicago I11)に移し、明所で成長させる。2-3週間後、PMI遺伝子及び修飾Cry3A遺伝子の存在に関してPCRによって植物を試験する。PCRアッセイで陽性であった植物を温室に移し、コーン・ルートワームに対する抵抗性を試験する。
【0136】
実施例6:トランスジェニック・トウモロコシ植物の分析
コーン・ルートワームに対する効果
根摘出バイオアッセイ
Magenta GA-7ボックスから土壌中に植物を移植するのに伴い、これらの植物をサンプリングする。これにより、土壌条件に対して十分に滅菌性の環境から根をサンプリングすることが可能になる。サンプリングは、根の小片(約2-4cm長)を切断して、小型ペトリ皿内の富化されたフィトアガー(phytagar)(フィトアガー12g、スクロース9g、MS塩3ml、MSビタミン3ml、ナイスタチン(25mg/ml)3ml、セフォタキシミン(50mg/ml)7ml、オーレオマイシン(50mg/ml)7ml、ストレプトマイシン(50mg/ml)7ml、dH2O 600ml)上にこれを載せることから成る。負の対照は、同じ試験から生じた修飾Cry3A遺伝子に対してPCR陰性のトランスジェニック植物であるか、又は、フィトトロン中で成長中の非トランスジェニック植物(試験植物と同様のサイズ)に由来する。土壌から対照の根をサンプリングする場合、根試料を水で洗浄し、土壌残留物を除去し、ナイスタチン溶液(5mg/ml)中に浸漬し、浸漬液から取り出し、ペーパータオルで拭き取って乾かし、そしてファイトアガール皿に入れる。
【0137】
それぞれのフィトアガー皿の蓋の内面に10匹の第1齢の幼虫を置くことにより、根試料にウェスタン・コーン・ルートワームを接種し、次いで蓋を密に再シールする。幼虫は、細い先端の絵筆で取り扱う。全ての皿での接種後、皿のトレイをデータ収集まで室温で暗所に置く。
接種から3-4日後に、データを捕集する。幼虫の死亡百分率を、根の視覚的な損害評価と共に計算する。摂食損害を高、中、低又は無しと格付けし、これにそれぞれ数値3,2,1又は0を与える。40%以上の死亡率をもたらし、且つ2以下の損害格付けを有する根試料を陽性と考える。
下記表の結果が示すように、修飾Cry3A毒素を発現する植物は、ウェスタン・コーン・ルートワームに40-100%の死亡率をもたらし、これに対して対照植物は0-30%の死亡率をもたらす。また、修飾Cry3A毒素を発現させる植物は、対照植物よりも有意に低い摂食損害を維持する。
【0138】
【表2】
【0139】
植物全体のバイオアッセイ
上述の根摘出バイオアッセイを用いて同定されたいくつかの陽性植物を、植物全体のバイオアッセイを用いて、ウェスタン・コーン・ルートワーム抵抗性に関して評価する。根摘出アッセイを完了してから概ね3日以内に、植物にウェスタン・コーン・ルートワームをはびこらせる。
ウェスタン・コーン・ルートワームの卵を予めインキュベートし、植物の接種から2-3日後に孵化が発生するようにする。卵は0.2%寒天中に懸濁し、卵約200個/植物で試験植物の周りの土壌に塗布する。
卵の孵化から2週間後に、ウェスタン・コーン・ルートワームの幼虫による損害に関して植物を評価する。植物がウェスタン・コーン・ルートワームの摂食損害に対して抵抗性を有するか否かを見極めるのに用いられる基準は、達成された植物の高さ、倒伏、及び根塊である。評価時点では、対照植物は典型的には、修飾Cry3A植物よりも小さい。また、非トランスジェニック対照植物、及び、トウモロコシ最適化Cry3A遺伝子によってコードされた未修飾Cry3A毒素を発現させる植物は、根のほとんどが重度に取り除かれる結果、根塊の蓄積がなくなることにより、この時間中に倒伏した。評価時点で、本発明の修飾Cry3A毒素を発現させる植物は、修飾Cry3A毒素の殺虫活性により、対照植物よりも背が高く、倒伏せず、大きな無傷の根塊を有する。
【0140】
ELISAアッセイ
トランスジェニック植物中の修飾Cry3Aタンパク質及び未修飾Cry3Aタンパク質のレベルを定量するために、米国特許第5,625,136号明細書に開示された方法に基づくELISA分析を用いる。
【0141】
【表3】
Claims (105)
- 修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、該修飾Cry3A毒素が、非天然発生型プロテアーゼ認識部位を含み、前記プロテアーゼ認識部位がCry3A毒素を修飾し、そして、
a) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間の位置;
b) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置;及び、
c) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間、及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置
から成る群から選択された位置に配置されており、
前記プロテアーゼ認識部位が、ウェスタン・コーン・ルートワーム(western corn rootworm)の消化管プロテアーゼによって認識可能であり、そして人工食餌バイオアッセイで、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされるウェスタン・コーン・ルートワームの死亡率よりも高い死亡率をウェスタン・コーン・ルートワームにもたらすことを特徴とする、単離された核酸分子。 - 前記消化管プロテアーゼがカテプシンGである、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間に配置されている、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に配置されている、請求項4に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に配置されている、請求項6に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に配置されている、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記付加的なプロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に配置されている、請求項9に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項11に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に配置されている、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項14に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に配置されている、請求項16に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項18に記載の単離された核酸分子。
- 前記Cry3A毒素がウェスタン・コーン・ルートワームに最大30%の死亡率をもたらすのに対して、前記修飾Cry3A毒素が該ウェスタン・コーン・ルートワームに最小50%の死亡率をもたらす、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記修飾Cry3A毒素が、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記修飾Cry3A毒素が、ノーザン・コーン・ルートワームに対して活性である、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- キメラ構造体であって、請求項1に記載の核酸分子に作用連関された異種プロモーター配列を含むことを特徴とする、キメラ構造体。
- 組換えベクターであって、請求項24に記載のキメラ構造体を含むことを特徴とする、組換えベクター。
- トランスジェニック非ヒト宿主細胞であって、請求項24に記載のキメラ構造体を含むことを特徴とする、トランスジェニック非ヒト宿主細胞。
- 細菌細胞である、請求項26に記載のトランスジェニック宿主細胞。
- 植物細胞である、請求項26に記載のトランスジェニック宿主細胞。
- トランスジェニック植物であって、請求項28に記載のトランスジェニック植物細胞を含むことを特徴とする、トランスジェニック植物。
- 前記植物がトウモロコシ植物である、請求項29に記載のトランスジェニック植物。
- トランスジェニック種子であって、請求項29に記載のトランスジェニック植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
- トランスジェニック種子であって、請求項30に記載のトウモロコシ植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
- 単離された毒素であって、請求項1に記載の核酸分子の発現によって生成されることを特徴とする、単離された毒素。
- 前記毒素が、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む核酸分子の発現によって生成される、請求項33に記載の単離された毒素。
- 前記毒素が、ノーザン・コーン・ルートワームに対して活性である、請求項33に記載の単離された毒素。
- 前記毒素が、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の単離された毒素。
- 組成物であって、ウェスタン・コーン・ルートワームを死亡させるのに効果的な量の請求項33に記載の毒素を含むことを特徴とする、組成物。
- 修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック・トウモロコシ植物であって、該修飾Cry3A毒素が、非天然発生型プロテアーゼ認識部位を含み、前記プロテアーゼ認識部位がCry3A毒素を修飾し、そして、
a) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間の位置;
b) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置;及び、
c) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間、及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置
から成る群から選択された位置に配置されており、
前記プロテアーゼ認識部位が、ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管プロテアーゼによって認識可能であり、そして前記トランスジェニック植物が、ウェスタン・コーン・ルートワームを死亡させるレベルで、根組織内に前記修飾Cry3A毒素を発現させることを特徴とする、トランスジェニック・トウモロコシ植物。 - 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に配置されている、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、又はSEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791を含む、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記修飾Cry3A毒素が、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、又はSEQ ID NO:19に示されたアミノ酸配列を含む、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに100%の死亡率をもたらす、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに90%の死亡率をもたらす、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに80%の死亡率をもたらす、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに70%の死亡率をもたらす、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに60%の死亡率をもたらす、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに50%の死亡率をもたらす、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに40%の死亡率をもたらす、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニック・トウモロコシ植物が、ウェスタン・コーン・ルートワームが該トランスジェニック植物の根を大幅に取り除くのを防止するのに十分なレベルで、前記修飾Cry3A毒素を発現させる、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニック・トウモロコシ植物が、ウェスタン・コーン・ルートワームの摂食損害により該植物が倒伏するのを防止するのに十分なレベルで、前記修飾Cry3A毒素を発現させる、請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 同系繁殖植物である、請求項38から52までのいずれか1項に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 雑種植物である、請求項38から52までのいずれか1項に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- トランスジェニック種子であって、請求項53に記載の植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
- トランスジェニック種子であって、請求項54に記載の植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
- 非天然発生型プロテアーゼ認識部位を含む修飾Cry3A毒素であって、前記プロテアーゼ認識部位がCry3A毒素を修飾し、そして、
a) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間の位置;
b) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置;及び、
c) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間、及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置
から成る群から選択された位置に配置されており、
前記プロテアーゼ認識部位が、ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管プロテアーゼによって認識可能であり、そして人工食餌バイオアッセイで、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされるウェスタン・コーン・ルートワームの死亡率よりも高い死亡率をウェスタン・コーン・ルートワームにもたらすことを特徴とする、修飾Cry3A毒素。 - 前記消化管プロテアーゼがカテプシンGである、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間に配置されている、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に配置されている、請求項60に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に配置されている、請求項62に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に配置されている、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記付加的なプロテアーゼ部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に配置されている、請求項65に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項67に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に配置されている、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項70に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に配置されている、請求項72に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項74に記載の修飾Cry3A毒素。
- 前記Cry3A毒素がウェスタン・コーン・ルートワームに最大30%の死亡率をもたらすのに対して、前記修飾Cry3A毒素が該ウェスタン・コーン・ルートワームに最小50%の死亡率をもたらす、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818によってコードされる、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- ノーザン・コーン・ルートワームに対して活性である、請求項57に記載の修飾Cry3A毒素。
- ウェスタン・コーン・ルートワームがトウモロコシ植物にはびこるのを抑止する方法であって、
(a) 請求項38に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物を準備し;そして
(b) 該植物に前記ウェスタン・コーン・ルートワームを接触させる
ことを含むことを特徴とする、ウェスタン・コーン・ルートワームがトウモロコシ植物にはびこるのを抑止する方法。 - 修飾Cry3A毒素の生成方法であって:
(a) 請求項27に記載のトランスジェニック宿主細胞を獲得し;
(b) 該修飾Cry3A毒素の発現を可能にする条件下でトランスジェニック宿主細胞を培養し;そして
(c) 発現された修飾Cry3A毒素を回収する
ことを含むことを特徴とする、修飾Cry3A毒素の生成方法。 - 昆虫抵抗性植物の生成方法であって:
(a) 植物細胞のゲノム中に、請求項1に記載の核酸分子を安定的に組込み;そして
(b) 前記形質転換植物細胞から、安定的に形質転換された植物を再生し、前記安定的に形質転換された植物が有効量の修飾Cry3A毒素を発現させ、これにより前記形質転換植物が少なくともウェスタン・コーン・ルートワームに対して抵抗性を有するようにする
ことを含むことを特徴とする、昆虫抵抗性植物の生成方法。 - 少なくともウェスタン・コーン・ルートワームを駆除する方法であって、請求項33に記載の有効量の毒素をウェスタン・コーン・ルートワームに経口送達することを含むことを特徴とする、少なくともウェスタン・コーン・ルートワームを駆除する方法。
- 修飾Cry3A毒素の形成方法であって:
(a) Cry3A毒素をコードするCry3A遺伝子を獲得し;
(b) ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管プロテアーゼを同定し;
(c) 前記消化管プロテアーゼのための認識部位をコードするヌクレオチド配列を獲得し;
(d) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間の位置、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置で、前記認識部位が前記Cry3A毒素中に配置されるように、前記ヌクレオチド配列を前記Cry3A遺伝子中に挿入し、これにより修飾Cry3A遺伝子を作成し;
(e) 前記修飾Cry3A遺伝子を発現カセット中に挿入し;そして
(f) 前記発現カセットを、修飾Cry3A毒素を生成する非ヒト宿主細胞中に形質転換する
ことを含むことを特徴とする、修飾Cry3A毒素の形成方法。 - 修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む修飾Cry3A遺伝子であって、該修飾Cry3A毒素が、非天然発生型プロテアーゼ認識部位を含み、前記修飾Cry3A遺伝子が前記プロテアーゼ認識部位をコードするコーディング配列を含み、前記コーティング配列がCry3A遺伝子を修飾し、そして、
a) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置;
b) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置;及び、
c) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間、及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置
から成る群から選択された位置に挿入されており、
前記プロテアーゼ認識部位が、ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管プロテアーゼによって認識可能であり、そして人工食餌バイオアッセイで、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされるウェスタン・コーン・ルートワームの死亡率よりも高い死亡率をウェスタン・コーン・ルートワームにもたらすことを特徴とする、修飾Cry3A遺伝子。 - 前記消化管プロテアーゼがカテプシンGである、請求項85に記載の修飾Cry3A遺伝子。
- 前記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む、請求項85に記載の修飾Cry3A遺伝子。
- 前記修飾Cry3A毒素が、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む、請求項85に記載の修飾Cry3A遺伝子。
- 前記修飾Cry3A毒素が、ノーザン・コーン・ルートワームに対して活性である、請求項85に記載の修飾Cry3A遺伝子。
- キメラ構造体であって、請求項85に記載の修飾Cry3A遺伝子に作用連関された異種プロモーター配列を含むことを特徴とする、キメラ構造体。
- 組換えベクターであって、請求項90に記載のキメラ構造体を含むことを特徴とする、組換えベクター。
- トランスジェニック非ヒト宿主細胞であって、請求項90に記載のキメラ構造体を含むことを特徴とする、トランスジェニック非ヒト宿主細胞。
- 細菌細胞である、請求項92に記載のトランスジェニック宿主細胞。
- 植物細胞である、請求項92に記載のトランスジェニック宿主細胞。
- トランスジェニック植物であって、請求項94に記載のトランスジェニック植物細胞を含むことを特徴とする、トランスジェニック植物。
- 前記植物がトウモロコシ植物である、請求項95に記載のトランスジェニック植物。
- トランスジェニック種子であって、請求項95に記載のトランスジェニック植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
- トランスジェニック種子であって、請求項96に記載のトウモロコシ植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
- 修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む修飾Cry3A遺伝子を含むトランスジェニック・トウモロコシ植物であって、該修飾Cry3A毒素が、非天然発生型プロテアーゼ認識部位を含み、前記修飾Cry3A遺伝子が前記プロテアーゼ認識部位をコードするコーディング配列を含み、前記コーティング配列がCry3A遺伝子を修飾し、そして、
a) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置;
b) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置;及び、
c) SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間;及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置
から成る群から選択された位置に挿入されており、
前記プロテアーゼ認識部位が、ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管プロテアーゼによって認識可能であり、そして前記トランスジェニック植物が、ウェスタン・コーン・ルートワームを死亡させるレベルで、根組織内に前記修飾Cry3A毒素を発現させることを特徴とする、トランスジェニック・トウモロコシ植物。 - 前記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、又はSEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791を含む、請求項99に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 前記修飾Cry3A毒素が、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、又はSEQ ID NO:19に示されたアミノ酸配列を含む、請求項99に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 同系繁殖植物である、請求項99から101までのいずれか1項に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- 雑種植物である、請求項99から101までのいずれか1項に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
- トランスジェニック種子であって、請求項102に記載の植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
- トランスジェニック種子であって、請求項103に記載の植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US31642101P | 2001-08-31 | 2001-08-31 | |
PCT/EP2002/009789 WO2003018810A2 (en) | 2001-08-31 | 2002-09-02 | Modified cry3a toxins and nucleic acid sequences coding therefor |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005500849A true JP2005500849A (ja) | 2005-01-13 |
Family
ID=23228981
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003523658A Withdrawn JP2005500849A (ja) | 2001-08-31 | 2002-09-02 | 修飾Cry3A毒素及び該毒素をコードする核酸配列 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (9) | US7230167B2 (ja) |
EP (1) | EP1425397B1 (ja) |
JP (1) | JP2005500849A (ja) |
CN (1) | CN100374562C (ja) |
AR (2) | AR036311A1 (ja) |
AT (1) | ATE382701T1 (ja) |
AU (1) | AU2002337055A1 (ja) |
BR (1) | BR0212262B1 (ja) |
CA (1) | CA2458514C (ja) |
CO (1) | CO5560624A2 (ja) |
DE (1) | DE60224410T2 (ja) |
ES (1) | ES2299601T3 (ja) |
MX (1) | MXPA04001558A (ja) |
RU (1) | RU2314345C2 (ja) |
WO (1) | WO2003018810A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200401140B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012516700A (ja) * | 2009-02-05 | 2012-07-26 | アテニックス・コーポレーション | 変異AXMI−R1δ−エンドトキシン遺伝子及びその使用方法 |
Families Citing this family (1151)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080182796A1 (en) * | 2001-08-31 | 2008-07-31 | Syngenta Participations Ag | Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor |
US7230167B2 (en) | 2001-08-31 | 2007-06-12 | Syngenta Participations Ag | Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor |
US20040091505A1 (en) * | 2002-06-26 | 2004-05-13 | E.I Du Pont De Nemours And Company | Genes encoding proteins with pesticidal activity |
US7462760B2 (en) * | 2002-06-26 | 2008-12-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genes encoding plant protease-resistant pesticidal proteins and method of their use |
US7524810B1 (en) | 2003-10-03 | 2009-04-28 | Dow Agrosciences Llc | Modified Cry34 proteins |
US7309785B1 (en) * | 2003-10-03 | 2007-12-18 | Dow Agrosciences Llc | Modified chimeric Cry35 proteins |
BRPI0418365A (pt) * | 2003-12-23 | 2007-05-15 | Pioneer Hi Bred Int | ativação por planta de toxina de inseto |
AR048669A1 (es) | 2004-03-03 | 2006-05-17 | Syngenta Ltd | Derivados biciclicos de bisamida |
KR101268897B1 (ko) * | 2004-03-25 | 2013-05-30 | 신젠타 파티서페이션즈 아게 | 옥수수 이벤트 mir604 |
EP1818405B1 (en) | 2004-04-09 | 2015-06-03 | Monsanto Technology, LLC | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
GB0418047D0 (en) | 2004-08-12 | 2004-09-15 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
GB0422401D0 (en) | 2004-10-08 | 2004-11-10 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
WO2007050103A2 (en) * | 2004-11-29 | 2007-05-03 | Phyllom Llc | Recombinant bacteria without selection marker |
ATE519778T1 (de) * | 2005-06-08 | 2011-08-15 | Pioneer Hi Bred Int | Insektenspezifische proteaseerkennungssequenzen |
UA95248C2 (ru) | 2005-07-21 | 2011-07-25 | Сингента Партисипейшнс Аг | Фунгицидная смесь, композиция на ее основе, способ борьбы с поражением патогенами или поражением вредителями и способ защиты материала для размножения растений |
SI1763998T1 (sl) | 2005-09-16 | 2007-10-31 | Syngenta Participations Ag | Fungicidni sestavki |
EP1776864A1 (en) | 2005-10-20 | 2007-04-25 | Syngenta Participations AG | Fungicidal compositions |
AR059035A1 (es) | 2006-01-16 | 2008-03-12 | Syngenta Participations Ag | Insecticidas derivados de antranilamida |
TW200813091A (en) | 2006-04-10 | 2008-03-16 | Amgen Fremont Inc | Targeted binding agents directed to uPAR and uses thereof |
CA2661180A1 (en) | 2006-09-18 | 2008-03-27 | Basf Se | Ternary pesticidal mixtures |
US9092434B2 (en) * | 2007-01-23 | 2015-07-28 | Symantec Corporation | Systems and methods for tagging emails by discussions |
RU2532838C2 (ru) * | 2007-03-28 | 2014-11-10 | Зингента Партисипейшнс Аг | Инсектицидные белки |
US9522937B2 (en) | 2007-03-28 | 2016-12-20 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
CA2682199C (en) * | 2007-03-30 | 2016-06-28 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Chloroplasts engineered to express pharmaceutical proteins in edible plants |
EP3199026A1 (en) | 2007-04-12 | 2017-08-02 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising cyanosulfoximine compounds |
ES2377588T3 (es) | 2007-07-16 | 2012-03-29 | Syngenta Participations Ag | Insecticidas de antranilamida condensada |
GB0716414D0 (en) | 2007-08-22 | 2007-10-03 | Syngenta Participations Ag | Novel insecticides |
EP4248976A3 (en) | 2007-08-23 | 2024-04-10 | Amgen Inc. | Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9) |
PT2292098T (pt) | 2007-09-20 | 2020-01-21 | Bayer Cropscience Lp | Combinações compreendendo uma estirpe fungicida e pelo menos um fungicida adicional |
US8349877B2 (en) | 2007-09-26 | 2013-01-08 | Basf Se | Ternary fungicidal compositions comprising boscalid and chlorothalonil |
KR20100116675A (ko) * | 2008-02-22 | 2010-11-01 | 바스프 에스이 | 3'-브로민-2,3,4,6'-테트라메톡시-2',6-디메틸벤조페논을 포함하는 살진균성 조성물 |
EP2315760B1 (de) | 2008-07-29 | 2013-03-06 | Basf Se | Piperazinverbindungen mit herbizider wirkung |
US8269069B1 (en) | 2008-07-30 | 2012-09-18 | Dow Agrosciences, Llc | Modified Bacillus thuringiensis cry proteins that inhibit coleopterans |
EP2183969A3 (en) | 2008-10-29 | 2011-01-05 | Basf Se | Method for increasing the number of seedlings per number of sowed grains of seed |
KR20110063849A (ko) | 2008-10-02 | 2011-06-14 | 바스프 에스이 | 제초 효과를 갖는 피페라진 화합물 |
AR075465A1 (es) | 2008-10-22 | 2011-04-06 | Basf Se | Uso de herbicidas de sulfonilurea en plantas cultivadas |
AR075466A1 (es) | 2008-10-22 | 2011-04-06 | Basf Se | Uso de herbicidas tipo auxina en plantas cultivadas |
US20120114667A1 (en) | 2008-12-23 | 2012-05-10 | Medimmune Limited | TARGETED BINDING AGENTS DIRECTED TO a5BETA1 AND USES THEREOF |
EA021068B1 (ru) | 2009-01-27 | 2015-03-31 | Басф Се | Способ обработки семян, препаративная форма для дражирования семян и набор |
WO2010089244A1 (en) | 2009-02-03 | 2010-08-12 | Basf Se | Method for dressing seeds |
AR075573A1 (es) | 2009-02-11 | 2011-04-20 | Basf Se | Dimethomorph como protector de plaguicidas con efectos fitotoxicos |
US20120021905A1 (en) | 2009-02-11 | 2012-01-26 | Basf Se | Pesticidal Mixtures |
WO2010092031A2 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP2395841A1 (en) | 2009-02-11 | 2011-12-21 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2010092014A2 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
CA2751724A1 (en) | 2009-02-19 | 2010-08-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Blended refuge deployment via manipulation during hybrid seed production |
UY32471A (es) | 2009-03-04 | 2010-08-31 | Basf Se | Compuestos de 3-arilquinazolin-4-ona para combatir plagas de invertebrados |
WO2010103065A1 (en) | 2009-03-11 | 2010-09-16 | Basf Se | Fungicidal compositions and their use |
CN102348380B (zh) | 2009-03-16 | 2013-10-23 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含氟吡菌酰胺和苯菌酮的杀真菌组合物 |
HUE030498T2 (en) | 2009-03-20 | 2017-05-29 | Basf Se | A method of treating sowing with an encapsulated pesticide |
CA2753150C (en) | 2009-03-26 | 2017-04-18 | Basf Se | Use of synthetic and biological fungicides in combination for controlling harmful fungi |
WO2010112545A1 (en) | 2009-04-01 | 2010-10-07 | Basf Se | Isoxazoline compounds for combating invertebrate pests |
US9232785B2 (en) | 2009-04-02 | 2016-01-12 | Basf Se | Method for reducing sunburn damage in plants |
NZ595734A (en) | 2009-04-17 | 2013-12-20 | Dow Agrosciences Llc | Dig-3 insecticidal cry toxins |
BRPI1009073A2 (pt) | 2009-06-12 | 2016-03-01 | Basf Se | compostos de triazol das fórmulas i e ii, compostos das fórmulas i e ii, composição agrícola, uso de um composto da fórmula i ou ii, método para controlar fungos nocivos, semente, composição farmacêutica, uso de um composto da fórmula i ou ii e método para tratar câncer ou infecções por vírus ou para combater fungos patogênicos para seres humanos e para animais |
WO2019106641A2 (en) | 2017-12-03 | 2019-06-06 | Seedx Technologies Inc. | Systems and methods for sorting of seeds |
WO2010146032A2 (de) | 2009-06-16 | 2010-12-23 | Basf Se | Fungizide mischungen |
BRPI1009656A2 (pt) | 2009-06-18 | 2016-08-09 | Basf Se | composto triazol das fórmulas i e ii, composição agrícola, uso de um composto de fórmula i, ii e/ou iv, méeodo para o controle de fungos nocivos, semente, composição farmacêutical e método para tratamento contra o câncer ou infecções virais, ou para o combate de fungos zoopatogênicos ou humanopatogênicos |
MA33361B1 (fr) | 2009-06-18 | 2012-06-01 | Basf Se | Composés de triazole portant un substituant soufré |
EP2442653A2 (de) | 2009-06-18 | 2012-04-25 | Basf Se | Fungizide mischungen |
WO2010146116A1 (en) | 2009-06-18 | 2010-12-23 | Basf Se | Triazole compounds carrying a sulfur substituent |
BRPI1010096A2 (pt) | 2009-06-18 | 2016-03-15 | Basf Se | compostos de formulas i e ii, composição agrícola, uso de um composto, método de controle de fungos nocivos, semente, composição farmacêutica, uso de um composto e método de tratamento contra o câncer ou infecções por vírus ou para combater a fungos zoopatogênicos ou humanopatogênicos |
CN102459201A (zh) | 2009-06-18 | 2012-05-16 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀真菌的1,2,4-三唑衍生物 |
WO2010146115A1 (en) | 2009-06-18 | 2010-12-23 | Basf Se | Triazole compounds carrying a sulfur substituent |
PT2443102E (pt) | 2009-06-19 | 2013-06-05 | Basf Se | Benzoxazinonas herbicidas |
WO2010149758A1 (en) | 2009-06-25 | 2010-12-29 | Basf Se | Antifungal 1, 2, 4-triazolyl derivatives |
UA116809C2 (uk) | 2009-06-25 | 2018-05-10 | Басф Се | Застосування агрохімічних сумішей для збільшення життєздатності рослини |
US20110156696A1 (en) * | 2009-06-29 | 2011-06-30 | Fluke Corporation | Multimeter |
ES2472918T3 (es) | 2009-07-06 | 2014-07-03 | Basf Se | Compuestos de piridazina para controlar plagas de invertebrados |
WO2011003776A2 (de) | 2009-07-09 | 2011-01-13 | Basf Se | Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung |
WO2011003775A2 (de) | 2009-07-09 | 2011-01-13 | Basf Se | Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung |
WO2011006886A2 (en) | 2009-07-14 | 2011-01-20 | Basf Se | Azole compounds carrying a sulfur substituent xiv |
BR112012001597A2 (pt) | 2009-07-24 | 2015-09-01 | Basf Se | Método para controlar e/ou combater pestes de invertebrados, método para a proteção do material de propagação de planta e/ou das plantas que crescem do mesmo, material de propagação de planta e método para tratar ou proteger um animal de infestação ou infecção por parasitas |
WO2011012458A1 (en) | 2009-07-28 | 2011-02-03 | Basf Se | A method for increasing the level of free amino acids in storage tissues of perennial plants |
CN102480937B (zh) | 2009-07-28 | 2014-12-10 | 巴斯夫欧洲公司 | 悬浮乳液农药组合物 |
BR112012002164B1 (pt) | 2009-07-30 | 2021-04-20 | Merial, Inc | compostos inseticidas de 4-amino-tieno[2,3-d]-pirimidina e métodos para seu uso |
WO2011018486A2 (en) | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Basf Se | Herbicidally active composition comprising benzoxazinones |
US11096345B2 (en) | 2009-09-01 | 2021-08-24 | Basf Se | Method for treating post-emergent rice |
TW201113377A (en) | 2009-09-01 | 2011-04-16 | Basf Agrochemical Products Bv | Herbicide-tolerant plants |
CN102574817A (zh) | 2009-09-24 | 2012-07-11 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于抵抗无脊椎动物害虫的氨基喹唑啉化合物 |
US20120178625A1 (en) | 2009-09-25 | 2012-07-12 | Basf Se | Method for reducing pistillate flower abortion in plants |
KR20120105434A (ko) | 2009-09-29 | 2012-09-25 | 바스프 에스이 | 살충 혼합물 |
RU2012117559A (ru) | 2009-09-29 | 2013-11-10 | Басф Се | Пестицидные смеси |
EP2638803B1 (en) | 2009-09-30 | 2016-11-30 | BASF Corporation | Low volatile amine salts of anionic pesticides |
WO2011042378A1 (de) | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Basf Se | Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung |
WO2011048120A1 (en) | 2009-10-22 | 2011-04-28 | Syngenta Participations Ag | Synergistic fungicidal composition containing a n-2-(pyrazolyl) ethylphenylcarboxamide |
WO2011051212A1 (de) | 2009-10-28 | 2011-05-05 | Basf Se | Verwendung heteroaromatischer verbindungen als herbizide |
DE102010042867A1 (de) | 2009-10-28 | 2011-06-01 | Basf Se | Verwendung heterozyklischer Verbindungen als Herbizide |
DE102010042864A1 (de) | 2009-10-30 | 2011-06-01 | Basf Se | Substituierte Thioamide mit herbizider Wirkung |
US8445407B2 (en) | 2009-11-02 | 2013-05-21 | Basf Se | Herbicidal tetrahydrophthalimides |
US8329619B2 (en) | 2009-11-03 | 2012-12-11 | Basf Se | Substituted quinolinones having herbicidal action |
KR20120115492A (ko) | 2009-11-06 | 2012-10-18 | 바스프 에스이 | 4―히드록시 벤조산 및 선택된 살충제의 결정질 복합체 |
WO2011057989A1 (en) | 2009-11-11 | 2011-05-19 | Basf Se | Heterocyclic compounds having herbicidal action |
WO2011057942A1 (en) | 2009-11-12 | 2011-05-19 | Basf Se | Insecticidal methods using pyridine compounds |
WO2011058036A1 (en) | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Basf Se | Tricyclic compounds having herbicidal action |
JP2013510810A (ja) | 2009-11-13 | 2013-03-28 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 除草剤としての3−(3,4−ジヒドロ−2h−ベンゾ[1,4]オキサジン−6−イル)−1h−ピリミジン−2,4−ジオン化合物 |
NZ600320A (en) | 2009-11-17 | 2013-10-25 | Merial Ltd | Fluorinated oxa or thia heteroarylalkylsulfide derivatives for combating invertebrate pests |
WO2011064188A1 (en) | 2009-11-27 | 2011-06-03 | Basf Se | Insecticidal methods using nitrogen-containing heteroaromatic compounds |
WO2011067184A1 (de) | 2009-12-01 | 2011-06-09 | Basf Se | 3- (4, 5 -dihydroisoxazol- 5 -yl) benzoylpyrazolverbindungen und ihre mischungen mit safenern |
EA201200825A1 (ru) | 2009-12-02 | 2013-01-30 | Басф Се | Пестицидные смеси |
US20120283095A1 (en) | 2009-12-02 | 2012-11-08 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
GB0921343D0 (en) | 2009-12-04 | 2010-01-20 | Syngenta Participations Ag | Chemical compounds |
GB0921346D0 (en) | 2009-12-04 | 2010-01-20 | Syngenta Participations Ag | Chemical compounds |
BR112012013482B1 (pt) | 2009-12-04 | 2018-11-06 | Basf Se | compostos de bis-organossulfurados pesticidas |
GB0921344D0 (en) | 2009-12-04 | 2010-01-20 | Syngenta Participations Ag | Chemical compounds |
WO2011069912A1 (de) | 2009-12-07 | 2011-06-16 | Basf Se | Triazolverbindungen, ihre verwendung sowie sie enthaltende mittel |
WO2011069955A1 (en) | 2009-12-07 | 2011-06-16 | Basf Se | Sulfonimidamide compounds for combating animal pests |
MX2012006008A (es) | 2009-12-08 | 2012-06-19 | Basf Se | Mezclas de plaguicidas. |
EA022245B1 (ru) | 2009-12-08 | 2015-11-30 | Басф Се | Пестицидные смеси |
WO2011069916A1 (de) | 2009-12-08 | 2011-06-16 | Basf Se | Triazolverbindungen, ihre verwendung als fungizide sowie sie enthaltende mittel |
WO2011069894A1 (de) | 2009-12-08 | 2011-06-16 | Basf Se | Triazolverbindungen, ihre verwendung sowie sie enthaltende mittel |
CA2782883A1 (en) | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2011069930A2 (en) | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
US20120291159A1 (en) | 2009-12-18 | 2012-11-15 | Basf Se | Azoline Compounds for Combating Invertebrate Pests |
EP2512237A2 (en) | 2009-12-18 | 2012-10-24 | Syngenta Participations AG | 2 -aryl-3 -hydroxy-cyclopentenones as insecticides, acaricides, nematocides and molluscicides |
WO2011073143A1 (en) | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Basf Se | Substituted cyanobutyrates having herbicidal action |
MX341874B (es) | 2010-01-18 | 2016-09-05 | Basf Se | Composicion que comprende un pesticida y un alcoxilato de 2-propilheptilamina. |
ES2546417T3 (es) | 2010-02-01 | 2015-09-23 | Basf Se | Compuestos de isoxazolina cetónica sustituidos y derivados para combatir plagas animales |
WO2011098417A1 (en) | 2010-02-10 | 2011-08-18 | Basf Se | Substituted cyanobutyrates having herbicidal action |
WO2011101303A2 (de) | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Basf Se | Zusammensetzung umfassend ein pestizid und ein alkoxylat von iso-heptadecylamin |
US20130085064A1 (en) | 2010-02-25 | 2013-04-04 | Syngenta Crop Protection Llc | Pesticidal mixtures containing isoxazoline derivatives and insecticide or nematoicidal biological agent |
EP2538789A1 (en) | 2010-02-25 | 2013-01-02 | Syngenta Participations AG | Pesticidal mixtures containing isoxazoline derivatives and a fungicide |
US8735560B1 (en) | 2010-03-02 | 2014-05-27 | Monsanto Technology Llc | Multiple domain lepidopteran active toxin proteins |
EP2363023A1 (en) | 2010-03-04 | 2011-09-07 | Basf Se | Synergistic fungicidal and insecticidal mixtures |
WO2011110583A2 (en) | 2010-03-10 | 2011-09-15 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising triazole derivatives |
BR112012023244B1 (pt) | 2010-03-17 | 2018-02-14 | Basf Se | Composição, alcoxilato de amina (A), método para controlar fungos fitopatogénicos, processo para tratar semente e uso do alcoxilato de amina (A) |
HUE038864T2 (hu) | 2010-03-17 | 2018-12-28 | Basf Agrochemical Products Bv | Herbicid-toleráns növények |
WO2011117806A2 (en) | 2010-03-23 | 2011-09-29 | Basf Se | Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests |
AR081526A1 (es) | 2010-03-23 | 2012-10-03 | Basf Se | Piridazinas sustituidas que tienen accion herbicida |
US8809535B2 (en) | 2010-03-23 | 2014-08-19 | Basf Se | Substituted pyridines having herbicidal action |
EP2550280B1 (en) | 2010-03-23 | 2014-02-26 | Basf Se | Pyridothiazines having herbicidal action |
CN102834391A (zh) | 2010-03-23 | 2012-12-19 | 巴斯夫欧洲公司 | 防治无脊椎动物害虫的哒嗪化合物 |
JP2013522340A (ja) | 2010-03-23 | 2013-06-13 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 除草作用を有する置換されたピリジン |
WO2011117286A1 (en) | 2010-03-23 | 2011-09-29 | Basf Se | Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests |
BR112012023935A2 (pt) | 2010-03-23 | 2015-09-15 | Basf Se | piridazina substituída da fórmula i, composto para fórmula i, composição e método para o controle de vegetação indesejada |
CN102822179A (zh) | 2010-03-23 | 2012-12-12 | 巴斯夫欧洲公司 | 具有除草作用的吡嗪并噻嗪 |
CA2792133A1 (en) | 2010-03-24 | 2011-09-29 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures |
US20130023412A1 (en) | 2010-03-26 | 2013-01-24 | Basf Se | Fungicidal Mixtures Based on Azolopyrimidinylamines |
EP2371219A1 (en) | 2010-04-01 | 2011-10-05 | Basf Se | Herbicidal acylhydrazides |
BR112012026785B1 (pt) | 2010-04-20 | 2022-04-05 | Basf Se | Mistura fungicida, composição agroquímica, método para controlar fungos fitopatogênicos e método para aprimorar a saúde da planta |
JP5922646B2 (ja) * | 2010-04-23 | 2016-05-24 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | コーンルートワーム(ジアブロティカ種(Diabroticaspp.))に関する抵抗性の発生を予防するためのCry34Ab/35Ab及びCry3Baタンパク質を含む組み合わせ |
WO2011134867A1 (en) | 2010-04-26 | 2011-11-03 | Basf Se | Herbicidal azolopyrimidines |
WO2011134539A1 (en) | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Basf Se | Use of oxylipins as safeners and safening herbicidal compositions comprising oxylipins |
WO2011138345A2 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Basf Se | Fungicidal mixtures based on gallic acid esters |
US9234208B1 (en) | 2010-05-10 | 2016-01-12 | Dow Agrosciences Llc | DIG-13 insecticidal cry toxins |
WO2011144593A1 (en) | 2010-05-18 | 2011-11-24 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising insecticides and pyraclostrobin |
US20130131091A1 (en) | 2010-05-24 | 2013-05-23 | Kimihiko Goto | Harmful organism control agent |
CN102917593B (zh) | 2010-05-28 | 2015-08-12 | 巴斯夫欧洲公司 | 农药混合物 |
JP5948320B2 (ja) | 2010-05-28 | 2016-07-06 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 殺有害生物混合物 |
WO2011151197A1 (en) | 2010-05-31 | 2011-12-08 | Syngenta Participations Ag | 1, 8 -diazaspiro [4.5] decane- 2, 4 -dione derivatives useful as pesticides |
US20130085066A1 (en) | 2010-05-31 | 2013-04-04 | Basf Se | Method for Increasing the Health of a Plant |
US9023760B2 (en) | 2010-05-31 | 2015-05-05 | Syngenta Participations Ag | 1, 8-diazaspiro [4.5] decane-2, 4-dione derivatives useful as pesticides |
CN103003239A (zh) | 2010-05-31 | 2013-03-27 | 先正达参股股份有限公司 | 基于螺杂环吡咯烷衍生物的杀虫剂 |
BR112012030415B1 (pt) | 2010-05-31 | 2020-06-23 | Syngenta Participations Ag | Composição pesticida e método para combater e controlar pragas com a referida composição |
UY33413A (es) | 2010-05-31 | 2011-12-30 | Syngenta Participations Ag | Composiciones pesticidas con dionas cíclicas y un regulador de crecimiento |
EP2575468A1 (en) | 2010-05-31 | 2013-04-10 | Syngenta Participations AG | Method of crop enhancement |
US20130261069A1 (en) | 2010-06-09 | 2013-10-03 | Syngenta Crop Protection Llc | Pesticidal mixtures comprising isoxazoline derivatives |
WO2011154433A2 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures including isoxazoline derivatives |
BR112012031093A8 (pt) | 2010-06-09 | 2017-10-10 | Syngenta Participations Ag | Misturas de pesticidas incluindo derivados da isoxazolina |
US20130102463A1 (en) | 2010-06-24 | 2013-04-25 | Basf Se | Herbicidal Compositions |
WO2011161131A1 (en) | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Basf Se | Herbicidal mixtures |
WO2011161132A1 (en) | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP2402340A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
EP2402339A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
EP2402345A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazole fused bicyclic compounds |
EP2402344A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazole fused bicyclic compounds |
EP2402336A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
EP2401915A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
EP2402335A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
EP2409570A3 (en) | 2010-06-29 | 2013-11-13 | Basf Se | Fungicidal mixtures based on pyrazolopyridine compounds |
EP2402343A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazole-fused bicyclic compounds |
EP2402338A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
UA111592C2 (uk) | 2010-07-07 | 2016-05-25 | Сінгента Партісіпейшнс Аг | Спосіб контролю над твердокрилими комахами-шкідниками |
WO2012007426A1 (en) | 2010-07-13 | 2012-01-19 | Basf Se | Azoline substituted isoxazoline benzamide compounds for combating animal pests |
CN105685064B (zh) | 2010-07-22 | 2018-06-22 | 巴斯夫欧洲公司 | 除草的异噁唑并[5,4-b]吡啶 |
US20130130898A1 (en) | 2010-08-03 | 2013-05-23 | Markus Gewehr | Fungicidal Compositions |
WO2012019981A1 (en) | 2010-08-09 | 2012-02-16 | Basf Se | Fungicidal mixtures |
DE102011080568A1 (de) | 2010-08-16 | 2012-02-16 | Basf Se | Substituierte Cyanobutyrate mit herbizider Wirkung |
WO2012022729A2 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | Basf Se | Method for improving the health of a plant |
WO2012025472A1 (en) | 2010-08-24 | 2012-03-01 | Basf Se | Agrochemical mixtures for increasing the health of a plant |
WO2012034961A1 (en) | 2010-09-13 | 2012-03-22 | Basf Se | Pyridine compounds for controlling invertebrate pests i |
BR112013005869A2 (pt) | 2010-09-13 | 2019-09-24 | Basf Se | ''método para controlar pragas invertebradas, uso de um composto, método, material de propagação vegetal e composição agrícola'' |
WO2012034960A1 (en) | 2010-09-13 | 2012-03-22 | Basf Se | Pyridine compounds for controlling invertebrate pests ii |
ES2534745T3 (es) | 2010-09-14 | 2015-04-28 | Basf Se | Composición que contiene un insecticida de piripiropeno y un adyuvante |
AU2011303965B9 (en) | 2010-09-14 | 2014-12-18 | Basf Se | Composition containing a pyripyropene insecticide and a base |
AR083112A1 (es) | 2010-10-01 | 2013-01-30 | Syngenta Participations Ag | Metodo para controlar enfermedades fitopatogenas y composiciones fungicidas utiles para dicho control |
CA2812154A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Basf Se | Imine substituted 2, 4 - diaryl - pyrroline derivatives as pesticides |
BR112013007056A2 (pt) | 2010-10-01 | 2019-09-24 | Basf Se | compostos de imina |
WO2012041789A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Basf Se | Herbicidal benzoxazinones |
BR112013008319A2 (pt) | 2010-10-07 | 2016-06-14 | Basf Se | uso de uma estrobilurina (composto a) e método para aumentar a resistência do glúten em cereais de inverno |
CN103179853A (zh) | 2010-10-11 | 2013-06-26 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含农药和聚羧酸化物醚的组合物 |
EP2443923A1 (de) | 2010-10-25 | 2012-04-25 | Basf Se | Zusammensetzung umfassend ein Pestizid und ein Polycarboxylatether |
CN103328496A (zh) * | 2010-10-25 | 2013-09-25 | 中央研究院 | 癌靶向肽及其于癌症治疗与诊断的应用 |
US20130281467A1 (en) | 2010-10-28 | 2013-10-24 | Syngenta Participations Ag | Novel microbicides |
EP2447262A1 (en) | 2010-10-29 | 2012-05-02 | Basf Se | Pyrrole, furane and thiophene derivatives and their use as fungicides |
EP2447261A1 (en) | 2010-10-29 | 2012-05-02 | Basf Se | Pyrrole, furane and thiophene derivatives and their use as fungicides |
EP2460404A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Basf Se | Compositions containing identical polyamine salts of mixed anionic pesticides |
WO2012066122A1 (en) | 2010-11-18 | 2012-05-24 | Syngenta Participations Ag | 2 - (pyridin- 2 -yl) -quinazoline derivatives and their use as microbicides |
CN103221395A (zh) | 2010-11-23 | 2013-07-24 | 先正达参股股份有限公司 | 杀虫化合物 |
WO2012069601A1 (en) | 2010-11-25 | 2012-05-31 | Syngenta Participations Ag | Substituted quinazolines as fungicides |
WO2012077077A1 (en) | 2010-12-08 | 2012-06-14 | Basf Se | Fungicidal mixtures |
EP2462807A1 (en) | 2010-12-08 | 2012-06-13 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising pyraclostrobin |
WO2012076563A1 (en) | 2010-12-08 | 2012-06-14 | Basf Se | Fungicidal mixtures |
WO2012076704A2 (en) | 2010-12-10 | 2012-06-14 | Basf Se | Pyrazole compounds for controlling invertebrate pests |
EP2465350A1 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-20 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2012080419A1 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-21 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures |
AU2011344311B2 (en) | 2010-12-15 | 2015-05-14 | Basf Se | Herbicidal compositions |
WO2012080415A1 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-21 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures |
AR084308A1 (es) | 2010-12-17 | 2013-05-08 | Syngenta Participations Ag | Compuestos insecticidas derivados de triazol |
BR112013014913A2 (pt) | 2010-12-20 | 2016-07-19 | Basf Se | misturas pesticidas, composição pesticida ou parasiticida, método para proteger os vegetais do ataque ou da infestação por insetos, para o controle dos insetos, para o controle dos fungos fitopatogênicos prejudiciais, para a proteção dos vegetais dos fungos fitopatogênicos prejudiciais, para a proteção do material de propagação dos vegetais, para a proteção dos animais contra a infestação ou infecção por parasitas, para o tratamento dos aminais infectados ou infectados por parasitas e utilização |
WO2012085081A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Basf Se | Sulfoximinamide compounds for combating invertebrate pests ii |
CN103298346A (zh) | 2010-12-22 | 2013-09-11 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于增加植物健康的农用化学品混合物 |
CA2818897A1 (en) | 2010-12-23 | 2012-06-28 | Basf Se | Substituted pyridines having herbicidal activity |
EP2474226A1 (en) | 2011-01-07 | 2012-07-11 | Basf Se | Herbicidally active composition comprising cyanobutyrates |
EP2476313A1 (en) | 2011-01-14 | 2012-07-18 | Basf Se | Synergistic pesticidal compositions comprising a dithiocarbamate and an insecticide |
EP2481284A3 (en) | 2011-01-27 | 2012-10-17 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP2484210A1 (en) | 2011-02-08 | 2012-08-08 | Basf Se | Pesticidal compositions |
UY33895A (es) | 2011-02-09 | 2012-09-28 | Syngenta Participations Ag | Compuestos insecticidas, método para combatir y controlar insectos, ácaros, nematodos o moluscos, y composición insecticida, acaricida o nematicida |
EP2672826B1 (en) | 2011-02-11 | 2015-05-20 | Basf Se | Herbicidal compositions comprising topramezone, pinoxaden and cloquintocet |
US9109231B2 (en) | 2011-02-11 | 2015-08-18 | Pioneer Hi Bred International Inc | Synthetic insecticidal proteins active against corn rootworm |
WO2012110439A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-23 | Basf Se | Method for controlling phytopathogenic fungi |
US9814233B2 (en) | 2011-02-28 | 2017-11-14 | Basf Se | Composition comprising a pesticide, a surfactant and an alkoxylate of 2-propyheptylamine |
US20140005235A1 (en) | 2011-03-22 | 2014-01-02 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal compounds |
ES2660555T3 (es) | 2011-03-23 | 2018-03-22 | Basf Se | Composiciones que contienen compuestos iónicos, poliméricos que comprenden grupos imidazolio |
WO2012130823A1 (en) | 2011-03-30 | 2012-10-04 | Basf Se | Suspension concentrates |
JP2014512359A (ja) | 2011-04-06 | 2014-05-22 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 動物有害生物を駆除するための置換ピリミジニウム化合物 |
AR085872A1 (es) | 2011-04-08 | 2013-10-30 | Basf Se | Derivados heterobiciclicos n-sustituidos utiles para combatir parasitos en plantas y/o animales, composiciones que los contienen y metodos para combatir dichas plagas |
CA2832939C (en) | 2011-04-15 | 2022-06-21 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal compositions comprising a nematode-antagonistic biocontrol agent |
WO2012143395A1 (en) | 2011-04-20 | 2012-10-26 | Syngenta Participations Ag | 4,5-dihydro-isoxazole derivatives as fungicides |
US20140045689A1 (en) | 2011-04-21 | 2014-02-13 | Richard Riggs | 3,4-disubstituted pyrrole 2,5-diones and their use as fungicides |
CA2833190C (en) | 2011-05-02 | 2020-04-28 | Basf Se | A method for enhancing the performance of a pesticide with guanidines |
US8895587B2 (en) | 2011-05-18 | 2014-11-25 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal compounds based on arylthioacetamide derivatives |
EP2524596A1 (en) | 2011-05-18 | 2012-11-21 | Basf Se | Seed treatment uses |
AR086587A1 (es) | 2011-05-31 | 2014-01-08 | Syngenta Participations Ag | Compuestos insecticidas |
CA2835391A1 (en) | 2011-06-01 | 2012-12-06 | Basf Se | Method of preparing an aqueous tank mix comprising a base |
US9574002B2 (en) | 2011-06-06 | 2017-02-21 | Amgen Inc. | Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor |
WO2012168210A1 (en) | 2011-06-06 | 2012-12-13 | Basf Se | Seed treatment formulation aid containing polymeric sticker and silicon oil |
WO2012168241A1 (en) | 2011-06-09 | 2012-12-13 | Basf Se | Substituted pyrazines having herbicidal activity |
JP2014517000A (ja) | 2011-06-09 | 2014-07-17 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 除草活性を有する置換ピリジン |
EP2532661A1 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-12 | Syngenta Participations AG | Novel insecticides |
BR112013030476A2 (pt) | 2011-06-17 | 2017-06-20 | Basf Se | mistura, composição agroquímica, método para controlar fungos nocivos fitopatogênicos e material de propagação de planta |
EA201400026A1 (ru) | 2011-06-17 | 2014-05-30 | Басф Се | Применение тетрацианодитиинов в качестве фунгицидов |
WO2012175474A1 (en) | 2011-06-20 | 2012-12-27 | Syngenta Participations Ag | 1,2,3 triazole pesticides |
AR087008A1 (es) | 2011-06-22 | 2014-02-05 | Syngenta Participations Ag | Derivados de n-oxi-pirazolo-triazepina-diona |
EP2540718A1 (en) | 2011-06-29 | 2013-01-02 | Syngenta Participations AG. | Novel insecticides |
WO2013007550A1 (en) | 2011-07-08 | 2013-01-17 | Syngenta Participations Ag | Fungicide mixtures |
MY163323A (en) | 2011-07-13 | 2017-09-15 | Basf Agro Bv | Fungicidal substituted 2-[2-halogenalkyl-4-(phenoxy)-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds |
EP2731936A1 (en) | 2011-07-15 | 2014-05-21 | Basf Se | Fungicidal phenylalkyl-substituted 2-[2-chloro-4-(4-chloro-phenoxy)-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds |
KR20140048257A (ko) | 2011-07-15 | 2014-04-23 | 바스프 에스이 | 동물 해충을 퇴치하기 위해 치환된 3-피리딜 티아졸 화합물 및 유도체 i을 사용하는 살충 방법 |
CN103649058A (zh) | 2011-07-15 | 2014-03-19 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀真菌的烷基-和芳基取代的2-[2-氯-4-(二卤代苯氧基)苯基]-1-[1,2,4]三唑-1-基乙醇化合物 |
PE20140837A1 (es) | 2011-07-15 | 2014-07-10 | Basf Se | Compuestos fungicidas 2-[2-cloro-4-(4-cloro-fenoxi)-fenil]-1-[1,2,4]triazol-1-il-etanol alquilo sustituidos |
WO2013011010A1 (en) | 2011-07-19 | 2013-01-24 | Syngenta Participations Ag | Fungizide mixtures |
JP2014521672A (ja) | 2011-08-02 | 2014-08-28 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 農薬とアルカリ炭酸水素塩から選択される塩基とを含む水性組成物 |
US20140179519A1 (en) | 2011-08-12 | 2014-06-26 | Basf Se | N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides |
EA201400213A1 (ru) | 2011-08-12 | 2014-08-29 | Басф Се | Соединения анилинового типа |
BR112014003112A2 (pt) | 2011-08-12 | 2017-02-21 | Basf Se | composto da fórmula geral (i), métodos para preparar um composto da fórmula (i), composição agrícola ou veterinária, método para combater ou controlar pragas invertebradas, método para proteger o cultivo de plantas, método para a proteção de sementes, semente, usos de um composto e método para tratar um animal |
MX2014001510A (es) | 2011-08-12 | 2014-05-12 | Basf Se | Compuestos de antranilamida y sus usos como plaguicidas. |
KR20140051402A (ko) | 2011-08-12 | 2014-04-30 | 바스프 에스이 | N-티오-안트라닐아미드 화합물 및 살충제로서의 그의 용도 |
WO2013024003A1 (en) | 2011-08-12 | 2013-02-21 | Basf Se | N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides |
CA2843083A1 (en) | 2011-08-12 | 2013-02-21 | Basf Se | Anthranilamide compounds and their use as pesticides |
AU2012296893A1 (en) | 2011-08-15 | 2014-03-06 | Basf Se | Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-alkoxy-2-alkynyl/alkenyl-ethyl}-1H-[1,2,4]triazole compounds |
EP2559688A1 (en) | 2011-08-15 | 2013-02-20 | Basf Se | Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-butoxy-ethyl}-1h [1,2,4]triazole compounds |
EP2744791B1 (en) | 2011-08-15 | 2015-10-28 | Basf Se | Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-alkoxy-3-methyl-butyl}-1h-[1,2,4]triazole compounds |
EP2744793B1 (en) | 2011-08-15 | 2015-10-14 | Basf Se | Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-ethoxy-ethyl}-1h- [1,2,4]triazole compounds |
JP2014529594A (ja) | 2011-08-15 | 2014-11-13 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 殺菌性置換1−{2−シクリルオキシ−2−[2−ハロ−4−(4−ハロゲン−フェノキシ)−フェニル]−エチル}−1h−[1,2,4]トリアゾール化合物 |
JP2014524431A (ja) | 2011-08-15 | 2014-09-22 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 殺菌性置換1−{2−[2−ハロ−4−(4−ハロゲン−フェノキシ)−フェニル]−2−アルコキシ−ヘキシル}−1h−[1,2,4]トリアゾール化合物 |
AR087537A1 (es) | 2011-08-15 | 2014-04-03 | Basf Se | Compuestos fungicidas de 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-fenoxi)-fenil]-2-alcoxi-2-ciclil-etil}-1h-[1,2,4]triazol sustituidos |
AR087536A1 (es) | 2011-08-15 | 2014-04-03 | Basf Se | Compuestos fungicidas de 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-fenoxi)-fenil]-2-alquiniloxi-etil}-1h-[1,2,4]triazol sustituidos |
WO2013024170A1 (en) | 2011-08-18 | 2013-02-21 | Basf Se | Carbamoylmethoxy- and carbamoylmethylthio- and carbamoylmethylamino benzamides for combating invertebrate pests |
EP2744782A1 (en) | 2011-08-18 | 2014-06-25 | Basf Se | Carbamoylmethoxy- and carbamoylmethylthio- and carbamoylmethylamino benzamides for combating invertebrate pests |
BR112014003649A2 (pt) | 2011-08-18 | 2017-03-21 | Basf Se | composto da fórmula (i), método, composição agrícola ou veterinária, semente e uso de um composto definido |
US20140343049A1 (en) | 2011-08-22 | 2014-11-20 | Syngenta Participations Ag | Dihydrofuran derivatives as insecticidal compounds |
EP2748137A1 (en) | 2011-08-22 | 2014-07-02 | Syngenta Participations AG | Dihydrofuran derivatives as insecticidal compounds |
WO2013026900A1 (en) | 2011-08-23 | 2013-02-28 | Syngenta Participations Ag | Pyridine derivatives as microbiocides |
CN103747675B (zh) | 2011-08-25 | 2016-06-29 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含氯代乙酰胺类的除草组合物 |
WO2013026929A1 (en) | 2011-08-25 | 2013-02-28 | Syngenta Participations Ag | Dihydropyrrole derivatives as insecticidal compounds |
EP2747570B1 (en) | 2011-08-25 | 2018-09-19 | Syngenta Participations AG | Isoxazoline derivatives as insecticidal compounds |
CN103764644A (zh) | 2011-08-25 | 2014-04-30 | 先正达参股股份有限公司 | 作为杀虫化合物的异噁唑啉衍生物 |
WO2013026695A1 (en) | 2011-08-25 | 2013-02-28 | Syngenta Participations Ag | Isoxazoline derivatives as insecticidal compounds |
JP2014529618A (ja) | 2011-09-02 | 2014-11-13 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | アリールキナゾリノン化合物を含む殺虫活性混合物 |
WO2013030338A2 (en) | 2011-09-02 | 2013-03-07 | Basf Se | Agricultural mixtures comprising arylquinazolinone compounds |
AU2012300875A1 (en) | 2011-09-02 | 2014-03-20 | Basf Se | Use of pesticidal active 3-arylquinazolin-4-one derivatives in soil application methods |
BR122018069466B1 (pt) | 2011-09-13 | 2019-04-02 | Syngenta Participations Ag | Derivados isotiazolina como compostos inseticidas |
EP2755479B1 (en) | 2011-09-13 | 2016-07-27 | BASF Agrochemical Products, B.V. | Method of controlling parasitic weeds with mixtures comprising imazamox and plant growth regulators |
WO2013050317A1 (en) | 2011-10-03 | 2013-04-11 | Syngenta Limited | Polymorphs of an isoxazoline derivative |
KR20140080528A (ko) | 2011-10-03 | 2014-06-30 | 신젠타 파티서페이션즈 아게 | 살곤충 2메톡시벤즈아미드 유도체 |
BR112014007847A2 (pt) | 2011-10-03 | 2017-04-18 | Syngenta Participations Ag | derivados de isoxazolina como compostos inseticidas |
AU2012320382B2 (en) | 2011-10-07 | 2015-11-26 | Syngenta Participations Ag | Method for protecting useful plants or plant propagation material |
MX2014005197A (es) | 2011-11-04 | 2014-05-28 | Syngenta Participations Ag | Compuestos plaguicidas. |
US9040708B2 (en) | 2011-11-04 | 2015-05-26 | Syngenta Limited | Pesticidal compounds |
US20140287916A1 (en) | 2011-11-04 | 2014-09-25 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal compounds |
EP2773631B1 (en) | 2011-11-04 | 2015-09-09 | Syngenta Participations AG | Pesticidal compounds |
HUE037444T2 (hu) | 2011-11-11 | 2018-09-28 | Gilead Apollo Llc | ACC inhibitorok és azok felhasználása |
CN104039770A (zh) | 2011-11-14 | 2014-09-10 | 巴斯夫欧洲公司 | 取代的1,2,5-噁二唑化合物及其作为除草剂的用途 |
CN104053656A (zh) | 2011-11-16 | 2014-09-17 | 巴斯夫欧洲公司 | 取代的1,2,5-噁二唑化合物及其作为除草剂的用途ii |
KR20140107280A (ko) | 2011-11-18 | 2014-09-04 | 바스프 에스이 | 치환된 1,2,5-옥사디아졸 화합물 및 이의 제초제 iii 로서의 용도 |
JP6063953B2 (ja) | 2011-11-29 | 2017-01-18 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 殺虫性トリアジノン誘導体 |
TWI572282B (zh) | 2011-11-30 | 2017-03-01 | 先正達合夥公司 | 含有螺雜環吡咯啶二酮的殺有害生物混合物 |
EA025875B1 (ru) | 2011-12-05 | 2017-02-28 | Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. | Способы борьбы с нежелательной растительностью среди устойчивых к гербицидам сельскохозяйственных культур с помощью имидазолиноновых гербицидов и адъювантов |
EP2790507B1 (en) | 2011-12-14 | 2017-01-18 | Syngenta Participations AG | Pesticidal mixtures |
BR112014014375A2 (pt) | 2011-12-14 | 2017-06-13 | Syngenta Participations Ag | misturas pesticidas |
WO2013092244A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-27 | Basf Se | Herbicidal triazines |
WO2013092868A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Basf Se | N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides |
CA2858766A1 (en) | 2011-12-23 | 2013-06-27 | Basf Se | Isothiazoline compounds for combating invertebrate pests |
BR112014017209A8 (pt) | 2012-01-12 | 2017-07-04 | Basf Se | compostos, composição, método para a preparação de uma composição e método para o controle da vegetação indesejável |
US9603367B2 (en) | 2012-01-17 | 2017-03-28 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones |
WO2013107793A2 (en) | 2012-01-17 | 2013-07-25 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones |
WO2013107795A2 (en) | 2012-01-17 | 2013-07-25 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones |
WO2013107794A2 (en) | 2012-01-17 | 2013-07-25 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones |
WO2013113789A1 (en) | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Basf Se | N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides |
WO2013113791A1 (en) | 2012-02-03 | 2013-08-08 | Basf Se | Fungicidal pyrimidine compounds |
CN104114025B (zh) | 2012-02-14 | 2017-11-07 | 先正达参股股份有限公司 | 杀线虫的顺式(杂)芳基环丙基甲酰胺衍生物 |
WO2013124250A2 (en) | 2012-02-20 | 2013-08-29 | Basf Se | Fungicidal substituted thiophenes |
WO2013127818A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in soybeans |
WO2013127859A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in soybeans |
BR112014021520A2 (pt) | 2012-03-01 | 2017-07-11 | Basf Se | uso de uma composição agroquímica e método para controlar vegetação indesejada |
WO2013127857A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in cereals |
WO2013127629A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Adjuvants based on optionally alkoxylated reaction products of glycerol carbonate and alkylamines |
WO2013127780A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Syngenta Participations Ag | Chemical compounds |
WO2013127821A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in rapeseed |
WO2013127860A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with herbicidal action in cereals |
WO2013127820A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in rapeseed |
WO2013127846A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in corn |
CA2863752A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Agrochemical compositions |
BR112014021525A2 (pt) | 2012-03-01 | 2017-07-18 | Basf Se | usos de uma composição, método para controlar vegetação indesejada e método para dessecação e/ou desfolhação de plantas de soja |
WO2013127768A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Syngenta Participations Ag | Pyridine carboxamide pesticides |
WO2013127848A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in corn |
WO2013127845A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in sunflowers |
WO2013127862A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with herbicidal action in rapeseed |
WO2013127855A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in cereals |
WO2013127843A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in sunflowers |
BR112014022497B1 (pt) | 2012-03-12 | 2021-02-23 | Basf Se | Formulação de concentrado líquido, preparação aquosa, métodos paraproteger plantas de ataque ou infestação por pragas invertebradas, nãoterapêutico para controlar pragas invertebradas e para proteger material depropagação de planta contra pragas invertebradas e usos de uma formulação |
KR102055551B1 (ko) | 2012-03-12 | 2019-12-13 | 바스프 에스이 | 피리피로펜 살충제 i 함유 액체 농축 제형 |
WO2013135674A1 (en) | 2012-03-12 | 2013-09-19 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal 2-aryl-acetamide compounds |
WO2013135606A1 (en) | 2012-03-12 | 2013-09-19 | Basf Se | Method for producing an aqueous suspension concentrate formulation of a pyripyropene insecticide |
JP6088552B2 (ja) | 2012-03-13 | 2017-03-01 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | ピリピロペン殺虫剤iii含有液体濃厚製剤 |
EA201491667A1 (ru) | 2012-03-13 | 2015-03-31 | Басф Се | Фунгицидные соединения пиримидина |
WO2013135672A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Basf Se | Fungicidal pyrimidine compounds |
JP2015512378A (ja) | 2012-03-21 | 2015-04-27 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 炭酸塩及び炭酸水素塩の混合物から選択される塩基を含む液体又は粒子タンクミックス用アジュバント |
WO2013139779A1 (en) | 2012-03-21 | 2013-09-26 | Basf Se | Glyphosate tank mix adjuvant comprising a base selected from a carbonate and/or a phosphate |
EA025901B1 (ru) | 2012-03-21 | 2017-02-28 | Басф Се | Адъювант баковой смеси, содержащий алкилполиглюкозид и основание |
US20150051076A1 (en) | 2012-03-21 | 2015-02-19 | Basf Se | Solid particulate tank mix adjuvant comprising a base selected from a carbonate and/or a phosphate |
EP2644595A1 (en) | 2012-03-26 | 2013-10-02 | Syngenta Participations AG. | N-Cyclylamides as nematicides |
WO2013144224A1 (en) | 2012-03-27 | 2013-10-03 | Syngenta Participations Ag | Acetylenic microbiocides |
WO2013144228A1 (en) | 2012-03-29 | 2013-10-03 | Basf Se | Pesticidal methods using heterocyclic compounds and derivatives for combating animal pests |
WO2013143927A1 (en) | 2012-03-29 | 2013-10-03 | Basf Se | Co-crystals of dicamba and a co-crystal former b |
US9334238B2 (en) | 2012-03-30 | 2016-05-10 | Basf Se | N-substituted pyridinylidenes for combating animal pests |
WO2013144223A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Basf Se | N-substituted pyrimidinylidene compounds and derivatives for combating animal pests |
US20150065343A1 (en) | 2012-04-02 | 2015-03-05 | Basf Se | Acrylamide compounds for combating invertebrate pests |
EP2647626A1 (en) | 2012-04-03 | 2013-10-09 | Syngenta Participations AG. | 1-Aza-spiro[4.5]dec-3-ene and 1,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-ene derivatives as pesticides |
MX2014011995A (es) | 2012-04-03 | 2015-09-04 | Basf Se | Compuestos de furanona heterobicíclicos n-sustituidos y derivados para combatir plagas de animales. |
WO2013150115A1 (en) | 2012-04-05 | 2013-10-10 | Basf Se | N- substituted hetero - bicyclic compounds and derivatives for combating animal pests |
US20150305336A1 (en) | 2012-04-05 | 2015-10-29 | Basf Se | Soluble liquid formulations of quinclorac ammonium salts |
EP2649879A1 (en) | 2012-04-10 | 2013-10-16 | Basf Se | Pesticidal mixtures containing fluxapyroxad |
WO2013156331A1 (en) | 2012-04-16 | 2013-10-24 | Basf Se | Synergistic compositions comprising pyraclostrobin and an insecticidal compound |
WO2013156433A1 (en) | 2012-04-17 | 2013-10-24 | Syngenta Participations Ag | Insecticidally active thiazole derivatives |
WO2013156431A1 (en) | 2012-04-17 | 2013-10-24 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole and thiadiazole derivatives |
AU2013206392B2 (en) | 2012-04-27 | 2016-05-12 | Basf Se | Substituted N-(tetrazol-5-yl)- and N-(triazol-5-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides |
IN2014MN02211A (ja) | 2012-04-27 | 2015-07-10 | Basf Se | |
US20150291570A1 (en) | 2012-04-27 | 2015-10-15 | Basf Se | Substituted N-(tetrazol-5-yl)- and N-(triazol-5-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides |
CN104411698A (zh) | 2012-04-27 | 2015-03-11 | 巴斯夫欧洲公司 | 取代的n-(四唑-5-基)-和n-(三唑-5-基)杂芳基羧酰胺化合物及其作为除草剂的用途 |
EP2659777A1 (en) | 2012-05-04 | 2013-11-06 | Syngenta Participations AG. | New use of a pesticide |
WO2013164295A1 (en) | 2012-05-04 | 2013-11-07 | Basf Se | Substituted pyrazole-containing compounds and their use as pesticides |
BR112014027133A2 (pt) | 2012-05-09 | 2017-06-27 | Basf Se | compostos, composição agrícola ou veterinária, método para o controle das pragas de invertebrados, material de propagação dos vegetais e método para o tratamento ou proteção de um animal. |
WO2013174645A1 (en) | 2012-05-24 | 2013-11-28 | Basf Se | N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides |
CN104379588A (zh) | 2012-06-01 | 2015-02-25 | 巴斯夫欧洲公司 | 具有除草活性的取代吡啶化合物 |
EP2858981A1 (en) | 2012-06-06 | 2015-04-15 | Basf Se | Pyrazolopyrans having herbicidal and pharmaceutical properties |
EP2671881A1 (en) | 2012-06-07 | 2013-12-11 | Syngenta Participations AG. | Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole derivatives |
JP2015525223A (ja) | 2012-06-14 | 2015-09-03 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 動物有害生物を駆除するための置換3−ピリジルチアゾール化合物および誘導体を使用する有害生物防除方法 |
BR122019015121B1 (pt) | 2012-06-20 | 2020-04-07 | Basf Se | mistura pesticida, composição, composição agrícola, métodos para o combate ou controle das pragas de invertebrados, para a proteção dos vegetais em crescimento ou dos materias de propagação vegetal, para a proteção de material de propagação vegetal, uso de uma mistura pesticida e métodos para o combate dos fungos fitopatogênicos nocivos e para proteger vegetais de fungos fitopatogênicos nocivos |
JP2015521609A (ja) | 2012-06-21 | 2015-07-30 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | ジカンバとドリフト抑制剤とを含む水性組成物 |
IN2015DN00093A (ja) | 2012-06-21 | 2015-05-29 | Basf Se | |
WO2014001121A1 (en) | 2012-06-25 | 2014-01-03 | Syngenta Participations Ag | Isothiazole derivatives as insecticidal compounds |
WO2014001120A1 (en) | 2012-06-25 | 2014-01-03 | Syngenta Participations Ag | Isothiazole derivatives as insecticidal compounds |
JP2015521989A (ja) | 2012-07-03 | 2015-08-03 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | アニオン性殺有害生物剤及び塩基を含む高濃度水性製剤 |
EP2684879A1 (en) | 2012-07-09 | 2014-01-15 | Basf Se | Substituted mesoionic compounds for combating animal pests |
KR20150036462A (ko) | 2012-07-09 | 2015-04-07 | 바스프 코포레이션 | 폴리프로필렌 글리콜 및 3블록 중합체를 포함하는 비산방지제 |
WO2014009293A1 (en) | 2012-07-13 | 2014-01-16 | Basf Se | New substituted thiadiazoles and their use as fungicides |
BR112015000648A2 (pt) | 2012-07-13 | 2017-10-03 | Basf Se | Uso de um composto, composições agrícolas para o controle de fungos fitopatogênicos, semente e método para controle de fungos fitopatogênicos |
US20150189883A1 (en) | 2012-08-03 | 2015-07-09 | Syngenta Participations Ag | Methods of controlling insects |
WO2014023531A1 (en) | 2012-08-07 | 2014-02-13 | Syngenta Participations Ag | Trifluoromethylpyridine carboxamides as pesticides |
EP2700635A1 (en) | 2012-08-20 | 2014-02-26 | Basf Se | 5-Trifluoromethylpyrazole amides having herbicidal activity |
EP2700634A1 (en) | 2012-08-20 | 2014-02-26 | Basf Se | 5-difluoromethylpyrazole amides having herbicidal activity |
WO2014029709A1 (en) | 2012-08-24 | 2014-02-27 | Syngenta Participations Ag | Methods of controlling insects |
US9474279B2 (en) | 2012-08-24 | 2016-10-25 | Syngenta Participations Ag | Methods of controlling insects |
BR112015003589A2 (pt) | 2012-08-24 | 2017-07-04 | Syngenta Participations Ag | métodos de controle de pragas do solo |
WO2014033241A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in rice |
WO2014033242A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with herbicidal action in rice |
WO2014045228A1 (en) | 2012-09-21 | 2014-03-27 | Basf Se | Pyrethroid insecticide for protecting plants and seed |
WO2014053403A1 (en) | 2012-10-01 | 2014-04-10 | Basf Se | Method of controlling insecticide resistant insects |
US20150305331A1 (en) | 2012-10-01 | 2015-10-29 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising jasmonic acid or a derivative thereof |
WO2014053407A1 (en) | 2012-10-01 | 2014-04-10 | Basf Se | N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides |
WO2014053401A2 (en) | 2012-10-01 | 2014-04-10 | Basf Se | Method of improving plant health |
WO2014053404A1 (en) | 2012-10-01 | 2014-04-10 | Basf Se | Pesticidally active mixtures comprising anthranilamide compounds |
WO2014053405A1 (en) | 2012-10-01 | 2014-04-10 | Basf Se | Pesticidally active mixtures comprising anthranilamide compounds |
AR093772A1 (es) | 2012-10-01 | 2015-06-24 | Basf Se | Metodo para controlar insectos resistentes a insecticidas moduladores de rianodina |
US20150250174A1 (en) | 2012-10-01 | 2015-09-10 | Basf Se | Use of n-thio-anthranilamide compounds on cultivated plants |
US9510595B2 (en) | 2012-10-10 | 2016-12-06 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures |
US20150257383A1 (en) | 2012-10-12 | 2015-09-17 | Basf Se | Method for combating phytopathogenic harmful microbes on cultivated plants or plant propagation material |
CN104755457A (zh) | 2012-10-31 | 2015-07-01 | 先正达参股股份有限公司 | 杀虫化合物 |
WO2014079935A1 (en) | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal compounds based on arylthioacetamide derivatives |
WO2014079804A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079772A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
ES2785070T3 (es) | 2012-11-22 | 2020-10-05 | Basf Corp | Mezclas de pesticidas |
PL2922395T3 (pl) | 2012-11-22 | 2019-11-29 | Basf Corp | Mieszaniny szkodnikobójcze |
WO2014079766A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079728A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079770A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079820A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Use of anthranilamide compounds for reducing insect-vectored viral infections |
WO2014079841A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079774A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
CN105101797A (zh) | 2012-11-22 | 2015-11-25 | 巴斯夫公司 | 农药混合物 |
WO2014079813A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079752A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014082871A1 (en) | 2012-11-27 | 2014-06-05 | Basf Se | Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds and their use as fungicides |
US20150313229A1 (en) | 2012-11-27 | 2015-11-05 | Basf Se | Substituted [1,2,4] Triazole Compounds |
US20160029630A1 (en) | 2012-11-27 | 2016-02-04 | Basf Se | Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds and their use as fungicides |
WO2014082879A1 (en) | 2012-11-27 | 2014-06-05 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds |
EP2738171A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-04 | Syngenta Participations AG. | Pesticidally active tricyclic pyridyl derivatives |
JP2016501206A (ja) | 2012-12-04 | 2016-01-18 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 新規な置換1,4−ジチイン誘導体および殺菌剤としてのそれらの使用 |
AU2013357564A1 (en) | 2012-12-14 | 2015-07-02 | Basf Se | Malononitrile compounds for controlling animal pests |
CN104981459A (zh) | 2012-12-19 | 2015-10-14 | 巴斯夫欧洲公司 | 新型取代三唑类和咪唑类及其作为杀真菌剂的用途 |
EP2746276A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2746255A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746277A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
WO2014095555A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2935237A1 (en) | 2012-12-19 | 2015-10-28 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds and their use as fungicides |
EP2746266A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2745691A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted imidazole compounds and their use as fungicides |
WO2014095534A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2746274A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds |
EP2746275A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
WO2014095381A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
EP2746279A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
EP2746256A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
EP2746264A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746262A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds for combating phytopathogenic fungi |
EP2746263A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Alpha-substituted triazoles and imidazoles |
EP2935236B1 (en) | 2012-12-19 | 2017-11-29 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds and their use as fungicides |
EP2746278A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
US10759767B2 (en) | 2012-12-20 | 2020-09-01 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising a triazole compound |
CN105007739A (zh) | 2012-12-21 | 2015-10-28 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于防治无脊椎动物害虫的环棒麦角素及其衍生物 |
EP2746260A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746259A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746257A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746258A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
US20150368236A1 (en) | 2012-12-27 | 2015-12-24 | Basf Se | 2-(pyridin-3-yl)-5-hetaryl-thiazole compounds carrying an imine or imine-derived substituent for combating invertebrate pests |
JP6325572B2 (ja) | 2012-12-31 | 2018-05-16 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | コルネキスチンを含む除草組成物 |
WO2014118099A1 (en) | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Basf Se | Fungicidal naphthoquinones and derivatives |
AR095109A1 (es) | 2013-01-31 | 2015-09-30 | Univ Guelph | Plantas tolerantes a herbicidas auxínicos |
JP6404235B2 (ja) | 2013-02-04 | 2018-10-10 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 新規な殺微生物剤 |
WO2014124850A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
WO2014128136A1 (en) | 2013-02-20 | 2014-08-28 | Basf Se | Anthranilamide compounds and their use as pesticides |
US9738595B2 (en) | 2013-02-27 | 2017-08-22 | Syngenta Participations Ag | Carboxamide compounds |
WO2014131837A1 (en) | 2013-02-28 | 2014-09-04 | Syngenta Participations Ag | Isoxaline derivatives for use in cotton plants |
WO2014135392A1 (en) | 2013-03-07 | 2014-09-12 | Basf Se | Co-crystals of pyrimethanil and selected dithiine tetracarboximide |
EP2783569A1 (en) | 2013-03-28 | 2014-10-01 | Basf Se | Compositions comprising a triazole compound |
CN105072911A (zh) | 2013-03-28 | 2015-11-18 | 先正达参股股份有限公司 | 控制新烟碱抗性有害生物的方法 |
CN113336699A (zh) | 2013-04-02 | 2021-09-03 | 先正达参股股份有限公司 | 杀虫化合物 |
US9402395B2 (en) | 2013-04-02 | 2016-08-02 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal compounds |
WO2014167133A1 (en) | 2013-04-12 | 2014-10-16 | Syngenta Participations Ag | Fungicides comprising boron |
WO2014170853A1 (en) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Agresearch Limited | Methods and materials for encapsulating proteins |
JP2016522173A (ja) | 2013-04-19 | 2016-07-28 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 有害動物を駆除するためのn−置換アシル−イミノ−ピリジン化合物および誘導体 |
WO2014173880A1 (en) | 2013-04-22 | 2014-10-30 | Syngenta Participations Ag | Novel microbiocides |
MX2015015422A (es) | 2013-05-10 | 2016-06-21 | Nimbus Apollo Inc | Inhibidores de acetil-coa carboxilasa (acc) y usos de los mismos. |
EA030958B1 (ru) | 2013-05-10 | 2018-10-31 | Джилид Аполло, Ллс | Ингибиторы акк и их применение |
WO2014184014A1 (en) | 2013-05-15 | 2014-11-20 | Basf Se | N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)carboxamide compounds and their use as herbicides |
WO2014184058A1 (en) | 2013-05-15 | 2014-11-20 | Basf Se | Substituted 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides |
CN105209441A (zh) | 2013-05-15 | 2015-12-30 | 巴斯夫欧洲公司 | 取代的n-(四唑-5-基)-和n-(三唑-5-基)芳基羧酰胺化合物及其作为除草剂的用途 |
WO2014184019A1 (en) | 2013-05-15 | 2014-11-20 | Basf Se | N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)carboxamide compounds and their use as herbicides |
BR112015029268B1 (pt) | 2013-05-23 | 2020-10-20 | Syngenta Participations Ag | composição pesticida, pacote de combinação, utilização, método de aumento da eficácia e redução da fitotoxicidade de compostos de ácido tetrâmico ativos em termos pesticidas, método não terapêutico para combater e controlar pragas |
CN105246900A (zh) | 2013-05-24 | 2016-01-13 | 巴斯夫欧洲公司 | 具有除草活性的取代吡啶化合物 |
DK3004167T3 (en) | 2013-05-30 | 2018-11-12 | Kiniksa Pharmaceuticals Ltd | ONCOSTATIN M-RECEPTOR ANTIGIN BINDING PROTEINS |
EP2813499A1 (en) | 2013-06-12 | 2014-12-17 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2815647A1 (en) | 2013-06-18 | 2014-12-24 | Basf Se | Novel strobilurin-type compounds for combating phytopathogenic fungi |
EP2815649A1 (en) | 2013-06-18 | 2014-12-24 | Basf Se | Fungicidal mixtures II comprising strobilurin-type fungicides |
WO2014206835A1 (en) | 2013-06-26 | 2014-12-31 | Basf Se | Methods for improving the efficacy of anionic herbicides under hard water conditions and suitable compositions |
US10939682B2 (en) | 2013-07-02 | 2021-03-09 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active bi- or tricyclic heterocycles with sulfur containing substituents |
CN105431414B (zh) | 2013-07-08 | 2018-06-15 | 先正达参股股份有限公司 | 用作杀线虫剂的4元环甲酰胺 |
WO2015003991A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Syngenta Participations Ag | Novel microbiocides |
WO2015004091A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Syngenta Participations Ag | Nicotinamide derivatives and their use against nematodes |
EP3022185B1 (en) | 2013-07-15 | 2017-09-06 | Basf Se | Pesticide compounds |
WO2015007564A1 (en) | 2013-07-18 | 2015-01-22 | Basf Se | Substituted n-(1,2,4-triazol-3-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides |
EP2835052A1 (en) | 2013-08-07 | 2015-02-11 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising pyrimidine fungicides |
WO2015022634A2 (en) | 2013-08-12 | 2015-02-19 | Basf Se | Herbicide-resistant hydroxyphenylpyruvate dioxygenases |
WO2015021991A1 (en) | 2013-08-16 | 2015-02-19 | Cheminova A/S | Combination of 2-methylbiphenyl-3-ylmethyl (z)-(1r)-cis-3-(2-chloro-3,3,3-trifluoroprop-1-enyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate with at least one insecticide, acaricide, nematicide and/or fungicide. |
CA2920339C (en) | 2013-08-16 | 2023-10-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
EP2839745A1 (en) | 2013-08-21 | 2015-02-25 | Basf Se | Agrochemical formulations comprising a 2-ethyl-hexanol alkoxylate |
ES2776730T3 (es) | 2013-09-13 | 2020-07-31 | Pioneer Hi Bred Int | Proteínas insecticidas y métodos para su uso |
WO2015036059A1 (en) | 2013-09-16 | 2015-03-19 | Basf Se | Fungicidal pyrimidine compounds |
CA2923101A1 (en) | 2013-09-16 | 2015-03-19 | Basf Se | Fungicidal pyrimidine compounds |
JP6404357B2 (ja) | 2013-09-19 | 2018-10-10 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | N−アシルイミノ複素環式化合物 |
WO2015040141A1 (en) | 2013-09-23 | 2015-03-26 | Syngenta Participations Ag | Cyclobutylcarboxamides as nematicides |
PT3051945T (pt) | 2013-10-03 | 2023-01-17 | Syngenta Participations Ag | Composições fungicidas |
WO2015052178A1 (en) | 2013-10-10 | 2015-04-16 | Basf Se | 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides |
CN105636950A (zh) | 2013-10-10 | 2016-06-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 取代的n-(四唑-5-基)-和n-(三唑-5-基)芳基羧酰胺化合物及其作为除草剂的用途 |
WO2015052173A1 (en) | 2013-10-10 | 2015-04-16 | Basf Se | Tetrazole and triazole compounds and their use as herbicides |
AR097995A1 (es) | 2013-10-14 | 2016-04-27 | Syngenta Participations Ag | Método para sembrar filas de cultivos |
UA121106C2 (uk) | 2013-10-18 | 2020-04-10 | Басф Агрокемікал Продактс Б.В. | Застосування пестицидної активної похідної карбоксаміду у способах застосування і обробки насіння та ґрунту |
EP2868197A1 (en) | 2013-11-05 | 2015-05-06 | Basf Se | Herbicidal compositions |
EP2868196A1 (en) | 2013-11-05 | 2015-05-06 | Basf Se | Herbicidal compositions |
EP2873668A1 (en) | 2013-11-13 | 2015-05-20 | Syngenta Participations AG. | Pesticidally active bicyclic heterocycles with sulphur containing substituents |
EP2881388A1 (en) | 2013-12-09 | 2015-06-10 | Basf Se | Pyrazolone compounds having herbicidal activity |
EP2881387A1 (en) | 2013-12-09 | 2015-06-10 | Basf Se | Pyrazolone compounds having herbicidal activity |
WO2015086462A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
CN105829296A (zh) | 2013-12-18 | 2016-08-03 | 巴斯夫欧洲公司 | 带有亚胺衍生的取代基的唑类化合物 |
US20160326153A1 (en) | 2013-12-18 | 2016-11-10 | Basf Se | N-substituted imino heterocyclic compounds |
JP2017510246A (ja) | 2013-12-20 | 2017-04-13 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | 鞘翅目害虫に対する抵抗性を付与するrnapII−140核酸分子 |
BR102014031844A2 (pt) | 2013-12-20 | 2015-10-06 | Dow Agrosciences Llc | ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros |
JP6469111B2 (ja) | 2013-12-20 | 2019-02-13 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 有害生物防除活性を有する硫黄含有置換基を伴う置換5,5−二環式複素環 |
MX2016008348A (es) | 2013-12-23 | 2016-09-08 | Syngenta Participations Ag | Compuestos insecticidas. |
EP3086644A1 (en) | 2013-12-23 | 2016-11-02 | Syngenta Participations AG | Benzoxaborole fungicides |
WO2015104422A1 (en) | 2014-01-13 | 2015-07-16 | Basf Se | Dihydrothiophene compounds for controlling invertebrate pests |
AR100304A1 (es) | 2014-02-05 | 2016-09-28 | Basf Corp | Formulación de recubrimiento de semillas |
EP3705489A1 (en) | 2014-02-07 | 2020-09-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
EP2907807A1 (en) | 2014-02-18 | 2015-08-19 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
US11291146B2 (en) | 2014-03-07 | 2022-03-29 | Bridge Semiconductor Corp. | Leadframe substrate having modulator and crack inhibiting structure and flip chip assembly using the same |
US10420204B2 (en) * | 2014-03-07 | 2019-09-17 | Bridge Semiconductor Corporation | Wiring board having electrical isolator and moisture inhibiting cap incorporated therein and method of making the same |
CN106132935A (zh) | 2014-03-26 | 2016-11-16 | 巴斯夫欧洲公司 | 作为杀真菌剂的取代的[1,2,4]三唑和咪唑化合物 |
EP2924027A1 (en) | 2014-03-28 | 2015-09-30 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole fungicidal compounds |
US20170144985A1 (en) | 2014-04-03 | 2017-05-25 | Basf Se | Diaminotriazine compound useful as herbicide |
WO2015150465A2 (en) | 2014-04-03 | 2015-10-08 | Basf Se | Plants having increased tolerance to herbicides |
EP2930174A1 (en) | 2014-04-07 | 2015-10-14 | Basf Se | Diaminotriazine derivatives as herbicides |
EP3174841A4 (en) | 2014-04-17 | 2018-05-16 | Basf Se | Combination of novel nitrification inhibitors and biopesticides as well as combination of (thio)phosphoric acid triamides and biopesticides |
WO2015081349A2 (en) | 2014-04-17 | 2015-06-04 | Basf Se | Combination of novel nitrification inhibitors and herbicides as well as combination of (thio)phosphoric acid triamides and herbicides |
EP3134400B1 (en) | 2014-04-23 | 2018-10-17 | Basf Se | Diaminotriazine compounds as herbicides |
RU2016146483A (ru) | 2014-05-07 | 2018-06-09 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Молекулы нуклеиновой кислоты dre4, сообщающие резистентность к жесткокрылым вредителям |
US9701659B2 (en) | 2014-05-19 | 2017-07-11 | Syngenta Participations Ag | Insecticidally active amide derivatives with sulfur-substituted phenyl or pyridine groups |
EP2949649A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-02 | Basf Se | Fungicide substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2949216A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-02 | Basf Se | Fungicidal substituted alkynyl [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
AR100743A1 (es) | 2014-06-06 | 2016-10-26 | Basf Se | Compuestos de [1,2,4]triazol sustituido |
CA2950084C (en) | 2014-06-06 | 2022-04-19 | Basf Se | Use of substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
EP2952506A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-09 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2952512A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-09 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds |
EP2952507A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-09 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds |
MX2016015857A (es) | 2014-06-20 | 2017-03-20 | Dow Agrosciences Llc | Proteinas insecticidas vegetativas utiles para controlar plagas de insectos. |
US10212934B2 (en) | 2014-06-25 | 2019-02-26 | BASF Agro B.V. | Pesticidal compositions |
RS60016B1 (sr) | 2014-06-26 | 2020-04-30 | Basf Agrochemical Products Bv | Tretiranje semena inhibitorima acetolaktat sintaze (als) |
EP2962567A1 (en) | 2014-07-01 | 2016-01-06 | Basf Se | Ternary mixtures comprising biopesticides and at least two chemical insecticides |
WO2016008740A1 (en) | 2014-07-14 | 2016-01-21 | Basf Se | Pesticidal compositions |
WO2016016131A1 (en) | 2014-07-31 | 2016-02-04 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active cyclic enaminones |
EP2979549A1 (en) | 2014-07-31 | 2016-02-03 | Basf Se | Method for improving the health of a plant |
BR112017002598B1 (pt) | 2014-08-12 | 2022-03-03 | Syngenta Participations Ag | Derivados heterocíclicos ativos do ponto de vista pesticida com substituintes contendo enxofre |
WO2016034615A1 (en) | 2014-09-02 | 2016-03-10 | BASF Agro B.V. | Aqueous insecticide formulation containing hyperbranched polymer |
MX2017004745A (es) | 2014-10-16 | 2017-10-20 | Pioner Hi-Bred Int Inc | Proteinas insecticidas y metodos de uso. |
TW201615095A (zh) | 2014-10-31 | 2016-05-01 | 陶氏農業科學公司 | Dig-303殺蟲cry毒素 |
WO2016071331A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Basf Se | Agrochemical adjuvant containing 2-oxo-1,3-dioxolan-4 carboxylates |
WO2016071168A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP3028573A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-08 | Basf Se | Use of a triazole fungicide on transgenic plants |
JP6695879B2 (ja) | 2014-12-11 | 2020-05-20 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な四環式誘導体 |
WO2016091675A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Basf Se | Method for improving the health of a plant |
WO2016091674A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Basf Se | Use of cyclaniliprole on cultivated plants |
AU2015372474B2 (en) | 2014-12-30 | 2019-02-14 | Dow Agrosciences Llc | Modified Cry1Ca toxins useful for control of insect pests |
CN107426979B (zh) | 2015-01-21 | 2022-07-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 具有增加的除草剂耐受性的植物 |
US10221137B2 (en) | 2015-01-29 | 2019-03-05 | Basf Se | Herbicidal phenylpyridines |
CA2974768C (en) | 2015-01-30 | 2023-11-14 | Basf Se | Herbicidal phenylpyrimidines |
WO2016120182A1 (en) | 2015-01-30 | 2016-08-04 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active amide heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents |
CN107207443A (zh) | 2015-02-06 | 2017-09-26 | 巴斯夫欧洲公司 | 作为硝化抑制剂的吡唑化合物 |
WO2016128470A1 (en) | 2015-02-11 | 2016-08-18 | Basf Se | Herbicide-resistant hydroxyphenylpyruvate dioxygenases |
BR112017019419B1 (pt) | 2015-03-11 | 2022-10-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Construto de dna, método de obtenção de uma planta transgênica e método para controlar uma população de praga de verme da raiz do milho |
EP3070080A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-21 | Basf Se | Herbicidal fluoromethanesulfonamides |
EP3070079A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-21 | Basf Se | Herbicidal fluoromethanesulfonamides |
HUE049090T2 (hu) | 2015-03-27 | 2020-09-28 | Syngenta Participations Ag | Heterobiciklusos származékok mint mikrobiocidek |
WO2016156075A1 (en) | 2015-03-31 | 2016-10-06 | Basf Se | Composition comprising a pesticide and isononanoic acid n,n-dimethyl amide |
CA2980505A1 (en) | 2015-04-07 | 2016-10-13 | Basf Agrochemical Products B.V. | Use of an insecticidal carboxamide compound against pests on cultivated plants |
ES2945313T3 (es) | 2015-04-17 | 2023-06-30 | Amgen Res Munich Gmbh | Construcciones de anticuerpos biespecificos para CDH3 y CD3 |
JP2018513190A (ja) | 2015-04-24 | 2018-05-24 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄置換5員環複素環を有する有害生物防除に活性な多環式誘導体 |
WO2016169886A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur substituted five-membered ring heterocyles |
WO2016174042A1 (en) | 2015-04-27 | 2016-11-03 | BASF Agro B.V. | Pesticidal compositions |
RU2017143177A (ru) | 2015-05-12 | 2019-06-13 | Басф Се | Тиоэфирные соединения в качестве ингибиторов нитрификации |
WO2016186986A1 (en) | 2015-05-19 | 2016-11-24 | Pioneer Hi Bred International Inc | Insecticidal proteins and methods for their use |
EP3103798A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-14 | Basf Se | Herbicidal fluoromethanesulfonamides |
EP3310172A1 (en) | 2015-06-16 | 2018-04-25 | BASF Agrochemical Products B.V. | Method for managing flea beetles of the family chrysomelidae in brassica crops |
CN107683288B (zh) | 2015-06-24 | 2021-09-24 | 先正达参股股份有限公司 | 用于在植物中赋予杀昆虫特性的核酸分子 |
EP3317275B1 (en) | 2015-07-01 | 2019-09-18 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active tetracyclic derivatives with sulfur containing substituents |
JP2018524336A (ja) | 2015-07-01 | 2018-08-30 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄含有置換基を有する有害生物防除に活性な多環式誘導体 |
PL3316692T3 (pl) | 2015-07-02 | 2021-10-11 | BASF Agro B.V. | Kompozycje owadobójcze zawierające związek triazolowy |
EP3111763A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-04 | BASF Agro B.V. | Pesticidal compositions comprising a triazole compound |
EP3319433B1 (en) | 2015-07-10 | 2019-09-11 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and specific non-accase lipid synthesis inhibitors |
CN107846892B (zh) | 2015-07-10 | 2024-02-20 | 巴斯夫农业公司 | 包含环庚草醚和特异性喹啉羧酸的除草组合物 |
EP3162209A1 (en) | 2015-10-27 | 2017-05-03 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and imazamox |
EP3319429A1 (en) | 2015-07-10 | 2018-05-16 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin, metazachlor and quinolinecarboxylic acids |
AU2016292546B2 (en) | 2015-07-10 | 2020-12-17 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and pendimethalin |
WO2017009145A1 (en) | 2015-07-10 | 2017-01-19 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and specific inhibitors of protoporphyrinogen oxidase |
US20180199568A1 (en) | 2015-07-10 | 2018-07-19 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and pethoxamid |
EP3319426B1 (en) | 2015-07-10 | 2019-04-24 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and metazachlor |
MY189197A (en) | 2015-07-10 | 2022-01-31 | Basf Agro Bv | Herbicidal composition comprising cinmethylin and acetochlor or pretilachlor |
US20180184659A1 (en) | 2015-07-10 | 2018-07-05 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and specific pigment synthesis inhibitors |
EP3319427B1 (en) | 2015-07-10 | 2019-04-17 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and dimethenamid |
TW202346349A (zh) | 2015-07-31 | 2023-12-01 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Dll3及cd3抗體構築體 |
TWI744242B (zh) | 2015-07-31 | 2021-11-01 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Egfrviii及cd3抗體構築體 |
TWI829617B (zh) | 2015-07-31 | 2024-01-21 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Flt3及cd3抗體構築體 |
TWI796283B (zh) | 2015-07-31 | 2023-03-21 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Msln及cd3抗體構築體 |
UA124495C2 (uk) | 2015-08-06 | 2021-09-29 | Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. | Інсектицидний білок рослинного походження та спосіб його застосування |
UA122695C2 (uk) | 2015-08-12 | 2020-12-28 | Сінгента Партісіпейшнс Аг | Мікробіоцидні гетеробіциклічні похідні |
EP3135113A1 (en) | 2015-08-31 | 2017-03-01 | Basf Se | Use of herbicidal compositions for controlling unwanted vegetation |
US10736320B2 (en) | 2015-09-25 | 2020-08-11 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active polycyclic derivatives with 5-membered sulfur containing heterocyclic ring systems |
BR112018005888A2 (pt) | 2015-09-25 | 2018-10-16 | Syngenta Participations Ag | derivados heterocíclicos ativos em termos pesticidas com substituintes contendo enxofre. |
BR112018006197A2 (pt) | 2015-09-28 | 2018-10-09 | Syngenta Participations Ag | derivados heterocíclicos ativos do ponto de vista pesticida com substituintes contendo enxofre |
PL3356358T3 (pl) | 2015-10-02 | 2020-11-02 | Syngenta Participations Ag | Mikrobiocydowe pochodne oksadiazolowe |
EP3359530A1 (en) | 2015-10-05 | 2018-08-15 | Basf Se | Pyridine derivatives for combating phytopathogenic fungi |
CN108495550B (zh) | 2015-10-12 | 2021-10-01 | 先锋国际良种公司 | 生物制品及其在植物中的应用 |
WO2017067839A1 (en) | 2015-10-23 | 2017-04-27 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal phenylamidine derivatives |
WO2017067837A1 (en) | 2015-10-23 | 2017-04-27 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal phenylamidine derivatives |
US20180319753A1 (en) | 2015-10-28 | 2018-11-08 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
WO2017076757A1 (en) | 2015-11-02 | 2017-05-11 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
EP3165094A1 (en) | 2015-11-03 | 2017-05-10 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
US20180317490A1 (en) | 2015-11-04 | 2018-11-08 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
CN108349915A (zh) | 2015-11-04 | 2018-07-31 | 先正达参股股份有限公司 | 杀微生物的苯胺衍生物 |
EP3165093A1 (en) | 2015-11-05 | 2017-05-10 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
WO2017080870A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
EP3167716A1 (en) | 2015-11-10 | 2017-05-17 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
AU2016354357A1 (en) | 2015-11-12 | 2018-05-24 | Basf Se | Herbicidal compositions comprising isoxazolo[5,4-b]pyridines |
WO2017081310A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
EP3373733A1 (en) | 2015-11-13 | 2018-09-19 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
BR112018008413A2 (pt) | 2015-11-19 | 2018-10-23 | Basf Se | compostos, mistura, composição agroquímica e método para combater fungos nocivos fitopatogênicos |
WO2017085100A1 (en) | 2015-11-19 | 2017-05-26 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
WO2017089190A1 (en) | 2015-11-23 | 2017-06-01 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur and cyclopropyl containing substituents |
MX2018006288A (es) | 2015-11-25 | 2018-09-07 | Gilead Apollo Llc | Inhibidores de acc tipo ester y usos de los mismos. |
WO2017091600A1 (en) | 2015-11-25 | 2017-06-01 | Gilead Apollo, Llc | Pyrazole acc inhibitors and uses thereof |
BR112018010453B1 (pt) | 2015-11-25 | 2022-06-14 | Gilead Apollo, Llc | Compostos triazólicos inibindores de acetil coa carboxilase (acc) |
EP3383849B1 (en) | 2015-12-01 | 2020-01-08 | Basf Se | Pyridine compounds as fungicides |
CN108290839A (zh) | 2015-12-01 | 2018-07-17 | 巴斯夫欧洲公司 | 作为杀真菌剂的吡啶化合物 |
US10640497B2 (en) | 2015-12-02 | 2020-05-05 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
EP3389379B1 (en) | 2015-12-15 | 2021-01-20 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal phenylamidine derivatives |
WO2017102275A1 (en) | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
WO2017102006A1 (en) | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
US20180325119A1 (en) | 2015-12-18 | 2018-11-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
EP3393245A1 (en) | 2015-12-22 | 2018-10-31 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active pyrazole derivatives |
BR112018014103B1 (pt) | 2016-01-22 | 2022-07-19 | Basf Se | Microcápsulas, processo para a fabricação de microcápsulas, método para o controle de ataques indesejados, sementes revestidas e uso das microcápsulas |
UA126657C2 (uk) | 2016-02-03 | 2023-01-11 | Емджен Рісерч (Мюнік) Ґмбг | ОДНОЛАНЦЮГОВА КОНСТРУКЦІЯ АНТИТІЛА ДО BCMA І CD3<font face="Symbol">e</font> |
EA201891753A1 (ru) | 2016-02-03 | 2019-01-31 | Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх | Биспецифические конструкции антител к psma и cd3, вовлекающие т-клетки |
EP3202267A1 (en) | 2016-02-05 | 2017-08-09 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
US20190031667A1 (en) | 2016-02-05 | 2019-01-31 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents |
EP3205209A1 (en) | 2016-02-09 | 2017-08-16 | Basf Se | Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or metabolites thereof and other biopesticides |
EP3205208A1 (en) | 2016-02-09 | 2017-08-16 | Basf Se | Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or fusaricidins and chemical pesticides |
JP6850300B2 (ja) | 2016-02-18 | 2021-03-31 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 殺有害生物活性ピラゾール誘導体 |
UY37137A (es) | 2016-02-24 | 2017-09-29 | Merial Inc | Compuestos antiparasitarios de isoxazolina, formulaciones inyectables de acción prolongada que los comprenden, métodos y usos de los mismos |
HUE050995T2 (hu) | 2016-03-10 | 2021-01-28 | Syngenta Participations Ag | Mikrobiocid kinolin (TIO)karboxamid származékok |
EP3426044A1 (en) | 2016-03-10 | 2019-01-16 | Basf Se | Fungicidal mixtures iii comprising strobilurin-type fungicides |
CN108779109B (zh) | 2016-03-15 | 2022-03-11 | 先正达参股股份有限公司 | 杀微生物的噁二唑衍生物 |
BR112018069412B1 (pt) | 2016-03-24 | 2022-09-20 | Syngenta Participations Ag | Compostos derivados de oxadiazol microbiocidas, composição agroquímica, método de controle ou prevenção de infestação de plantas úteis por microrganismos fitopatogênicos e uso do referido composto |
BR112018070411A2 (pt) | 2016-04-07 | 2019-02-05 | Syngenta Participations Ag | derivados heterocíclicos com substituintes contendo enxofre ativos em termos pesticidas |
BR112018070568B1 (pt) | 2016-04-08 | 2022-03-08 | Syngenta Participations Ag | Compostos derivados de oxadiazol microbiocidas, composição agroquímica, método de controle ou prevenção da infestação de plantas úteis por microrganismos fitopatogênicos e uso do referido composto |
JP2019516670A (ja) | 2016-04-12 | 2019-06-20 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 殺微生物性オキサジアゾール誘導体 |
WO2017178408A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal silicon containing aryl derivatives |
EA201892293A1 (ru) | 2016-05-04 | 2019-04-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
EP3245872A1 (en) | 2016-05-20 | 2017-11-22 | BASF Agro B.V. | Pesticidal compositions |
UA123514C2 (uk) | 2016-05-24 | 2021-04-14 | Басф Се | Гербіцидні урацилпіридини |
WO2017202774A1 (en) | 2016-05-24 | 2017-11-30 | Basf Se | Method for controlling ppo resistant weeds |
HUE052020T2 (hu) | 2016-05-30 | 2021-04-28 | Syngenta Participations Ag | Mikrobiocid tiazol-származékok |
WO2017207368A1 (en) | 2016-06-02 | 2017-12-07 | BASF Agro B.V. | Fungicidal compositions |
EP3464251B1 (en) | 2016-06-03 | 2021-03-03 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
US11064701B2 (en) | 2016-06-03 | 2021-07-20 | Basf Se | Benzoxaborole compounds |
AR108745A1 (es) | 2016-06-21 | 2018-09-19 | Syngenta Participations Ag | Derivados de oxadiazol microbiocidas |
BR112018077339A2 (pt) | 2016-07-01 | 2019-04-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | polipeptídeo inseticida recombinante, composição, polinucleotídeo recombinante, construto de dna, planta transgênica e métodos |
EP3269246A1 (en) | 2016-07-13 | 2018-01-17 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP3484291A1 (en) | 2016-07-15 | 2019-05-22 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising a carboxamide |
US11499162B2 (en) | 2016-07-15 | 2022-11-15 | Basf Se | Plants having increased tolerance to herbicides |
CA3029873A1 (en) | 2016-07-20 | 2018-01-25 | Basf Se | Herbicidal compositions comprising phenylpyrimidines |
JP2019526535A (ja) | 2016-07-22 | 2019-09-19 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 殺微生物オキサジアゾール誘導体 |
WO2018015447A1 (en) | 2016-07-22 | 2018-01-25 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
WO2018015449A1 (en) | 2016-07-22 | 2018-01-25 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
CN109561685A (zh) | 2016-07-25 | 2019-04-02 | 巴斯夫欧洲公司 | 除草的嘧啶化合物 |
BR112018076518A2 (pt) | 2016-07-25 | 2019-04-02 | Basf Se | compostos de pirimidina, utilização de compostos de pirimidina, composições herbicidas, composição, método para o controle da vegetação indesejada e utilização das composições |
EA201990347A1 (ru) | 2016-07-26 | 2019-08-30 | Басф Се | Гербицидные пиримидиновые соединения |
WO2018019755A1 (en) | 2016-07-26 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
WO2018019721A1 (en) | 2016-07-26 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
WO2018019758A1 (en) | 2016-07-26 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
WO2018019767A1 (en) | 2016-07-27 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
BR112019001483A2 (pt) | 2016-07-27 | 2019-09-10 | Basf Agro Bv | método para controlar a vegetação indesejada em um local de cultivo de plantas |
WO2018019765A1 (en) | 2016-07-27 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
EP3275877A1 (en) | 2016-07-28 | 2018-01-31 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
WO2018019770A1 (en) | 2016-07-28 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
CN109561684A (zh) | 2016-07-28 | 2019-04-02 | 巴斯夫欧洲公司 | 除草的嘧啶化合物 |
CA3030354A1 (en) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Basf Se | Method for controlling ppo resistant weeds |
WO2018019845A1 (en) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Basf Se | Method for controlling ppo resistant weeds |
EP3278667A1 (en) | 2016-08-05 | 2018-02-07 | Basf Se | Method for controlling ppo-inhibitor resistant weeds |
US20210368793A1 (en) | 2016-08-05 | 2021-12-02 | Basf Se | Method for Controlling PPO Resistant Weeds |
US20210352900A1 (en) | 2016-08-05 | 2021-11-18 | Basf Se | Method for Controlling PPO Resistant Weeds |
US11723365B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-08-15 | Basf Se | Method for controlling PPO resistant weeds |
EP3281525A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-14 | Basf Se | Method for controlling ppo resistant weeds |
US20190166841A1 (en) | 2016-08-09 | 2019-06-06 | Basf Se | Method for Controlling PPO Resistant Weeds |
EP3281523A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-14 | Basf Se | Method for controlling ppo resistant weeds |
CA3032223A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | Basf Se | Method for controlling ppo resistant weeds |
EP3281524A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-14 | Basf Se | Method for controlling ppo resistant weeds |
WO2018029242A1 (en) | 2016-08-11 | 2018-02-15 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
WO2018041729A2 (en) | 2016-09-01 | 2018-03-08 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents |
US20190208783A1 (en) | 2016-09-01 | 2019-07-11 | Basf Se | Fungicidal Mixtures Comprising a Formamidine |
CN109788758A (zh) | 2016-09-13 | 2019-05-21 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀虫混合物 |
WO2018055133A1 (en) | 2016-09-23 | 2018-03-29 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal tetrazolone derivatives |
CN109923112A (zh) | 2016-09-23 | 2019-06-21 | 先正达参股股份有限公司 | 杀微生物的噁二唑衍生物 |
WO2018054711A1 (en) | 2016-09-26 | 2018-03-29 | Basf Se | Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi |
WO2018054721A1 (en) | 2016-09-26 | 2018-03-29 | Basf Se | Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi |
WO2018054723A1 (en) | 2016-09-26 | 2018-03-29 | Basf Se | Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi |
RU2019111946A (ru) | 2016-09-27 | 2020-10-29 | Басф Се | Пестицидные смеси |
WO2018065182A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Basf Se | Reduced quinoline compounds as antifuni agents |
PL3522715T3 (pl) | 2016-10-06 | 2021-06-28 | Syngenta Participations Ag | Mikrobiocydowe pochodne oksadiazolowe |
WO2018069106A1 (en) | 2016-10-10 | 2018-04-19 | Basf Se | Pesticidal mixture |
BR112019006434A2 (pt) | 2016-10-10 | 2019-06-25 | Basf Se | misturas pesticidas, composição pesticida, métodos para controlar pragas fitopatogênicas, para melhorar a saúde de plantas e para a proteção do material de propagação vegetal contra pragas e material de propagação vegetal |
WO2018069110A1 (en) | 2016-10-10 | 2018-04-19 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
BR112019005932A2 (pt) | 2016-10-10 | 2019-06-11 | Basf Se | misturas pesticidas, composição pesticida, métodos para controlar pragas fitopatogênicas, método para melhorar a saúde de plantas, método para a proteção do material de propagação vegetal contra pragas e material de propagação vegetal |
WO2018073110A1 (en) | 2016-10-20 | 2018-04-26 | Basf Se | Quinoline compounds as fungicides |
CN114456164B (zh) | 2016-10-27 | 2024-03-12 | 先正达参股股份有限公司 | 具有硫和羟胺取代基的杀有害生物活性杂环衍生物 |
BR112019008800A2 (pt) | 2016-11-01 | 2019-07-16 | Pioneer Hi Bred Int | polipeptídeo inseticida, composição inseticida, polinucleotídeo recombinante, construto de dna, célula de planta ou planta transgênica, método para inibir o crescimento ou exterminar uma população de praga de inseto agrícola, método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de inseto, método para controlar infestação de inseto lepidoptera e/ou coleoptera em uma planta transgênica e fornecer gerenciamento de resistência de inseto e uso de pelo menos um polipeptídeo inseticida |
US10925283B2 (en) | 2016-11-15 | 2021-02-23 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal phenylamidine derivatives |
WO2018091389A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents |
WO2018095795A1 (en) | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur containing substituents |
US20200383329A1 (en) | 2016-11-28 | 2020-12-10 | Basf Se | Diaminotriazine compounds |
EP3329777A1 (en) | 2016-11-30 | 2018-06-06 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
DK3548466T3 (da) | 2016-12-01 | 2022-04-19 | Syngenta Participations Ag | Fremgangsmåde til fremstilling af et mellemprodukt af pesticidaktive heterocykliske derivater med svovlindeholdende substituenter |
WO2018108612A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Basf Se | Herbicidal compositions comprising isoxazolo[5,4-b]pyridines |
BR112019012127A2 (pt) | 2016-12-15 | 2019-11-05 | Syngenta Participations Ag | derivados heterocíclicos ativos em termos pesticidas com substituintes contendo enxofre |
KR20190092539A (ko) | 2016-12-16 | 2019-08-07 | 바스프 에스이 | 살충 화합물 |
BR112019010732B1 (pt) | 2016-12-16 | 2023-01-31 | Basf Se | Feniltriazolinonas, processo para a preparação de feniltriazolinonas, composições herbicidas, processo para a preparação de composições ativas de herbicida, método para controlar vegetação indesejada e uso das feniltriazolinonas |
WO2018114657A1 (en) | 2016-12-20 | 2018-06-28 | Syngenta Participations Ag | N-cyclobutyl-thiazol-5-carboxamides with nematicidal activity |
WO2018116072A1 (en) | 2016-12-20 | 2018-06-28 | Pi Industries Ltd. | Heterocyclic compounds |
CN110382702A (zh) | 2016-12-20 | 2019-10-25 | 巴斯夫农业公司 | 具有增加的除草剂耐性的植物 |
EP3339297A1 (en) | 2016-12-20 | 2018-06-27 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
EP3338552A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-27 | Basf Se | Use of a tetrazolinone fungicide on transgenic plants |
WO2018134127A1 (en) | 2017-01-23 | 2018-07-26 | Basf Se | Fungicidal pyridine compounds |
BR112019014953A2 (pt) | 2017-02-01 | 2020-04-28 | Basf Se | concentrado emulsionável, processo para a preparação do concentrado, emulsão, e, método para controlar fungos fitopatogênicos e/ou o crescimento indesejado de plantas e/ou a infestação indesejada de insetos ou acarídeos e/ou para regular o crescimento de plantas. |
JOP20190189A1 (ar) | 2017-02-02 | 2019-08-01 | Amgen Res Munich Gmbh | تركيبة صيدلانية ذات درجة حموضة منخفضة تتضمن بنيات جسم مضاد يستهدف الخلية t |
BR112019014905A2 (pt) | 2017-02-02 | 2020-03-03 | Basf Se | Método para controlar a vegetação indesejada, composição e uso do agente do mobilizador de solo |
MX2019009371A (es) | 2017-02-08 | 2019-09-23 | Pionner Hi Bred Int Inc | Combinaciones insecticidas de proteinas insecticidas derivadas de plantas y metodos para su uso. |
WO2018149754A1 (en) | 2017-02-16 | 2018-08-23 | Basf Se | Pyridine compounds |
TWI793104B (zh) | 2017-02-21 | 2023-02-21 | 瑞士商先正達合夥公司 | 具有含硫取代基的殺有害生物活性雜環衍生物 |
UY37623A (es) | 2017-03-03 | 2018-09-28 | Syngenta Participations Ag | Derivados de oxadiazol tiofeno fungicidas |
EP3592738A1 (en) | 2017-03-10 | 2020-01-15 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
MX2019011002A (es) | 2017-03-14 | 2019-12-16 | Basf Se | Azinas herbicidas. |
WO2018172133A1 (en) | 2017-03-20 | 2018-09-27 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives |
ES2950451T3 (es) | 2017-03-28 | 2023-10-10 | Basf Se | Compuestos plaguicidas |
EP3599852A1 (en) | 2017-03-31 | 2020-02-05 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal phenylamidine derivatives with improved plant safety properties |
EP3606913B1 (en) | 2017-04-03 | 2022-04-27 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
WO2018184986A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
WO2018185185A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
EP3606919A1 (en) | 2017-04-05 | 2020-02-12 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active pyrazole derivatives |
BR112019021019B1 (pt) | 2017-04-05 | 2023-12-05 | Syngenta Participations Ag | Compostos derivados de oxadiazol microbiocidas, composição agrícola, método para controlar ou prevenir a infestação de plantas úteis por microrganismos fitopatogênicos e uso de um composto derivado de oxadiazol |
WO2018185187A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
WO2018184982A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
BR112019020819B1 (pt) | 2017-04-05 | 2023-12-05 | Syngenta Participations Ag | Composto de fórmula (i), composição agroquímica, método para controlar ou prevenir a infestação de plantas úteis por micro-organismos fitopatogênicos e uso de um composto de fórmula (i) |
WO2018184984A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
WO2018184985A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
BR112019020879A2 (pt) | 2017-04-06 | 2020-04-28 | Basf Se | compostos, composição, uso de um composto de formula i, método para combater fungos fitopatogênicos, semente e intermediários |
WO2018185211A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
WO2018189001A1 (en) | 2017-04-13 | 2018-10-18 | Basf Se | Fungicide mixtures for use in rice |
US11109591B2 (en) | 2017-04-24 | 2021-09-07 | Taminco Bvba | Single phase liquids of alkanolamine salts of dicamba |
US20200216441A1 (en) | 2017-04-25 | 2020-07-09 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
EP3619203A1 (en) | 2017-05-02 | 2020-03-11 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
JP7214657B2 (ja) | 2017-05-08 | 2023-01-30 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄含有フェニル及びピリジル置換基を有するイミダゾピリミジン誘導体 |
WO2018206419A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal heterobicyclic derivatives |
WO2018210659A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Basf Se | Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides |
WO2018210658A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Basf Se | Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides |
WO2018210661A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Basf Se | Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides |
WO2018210660A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Basf Se | Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides |
WO2018215304A1 (en) | 2017-05-22 | 2018-11-29 | Syngenta Participations Ag | Tetracyclic pyridazine sulphur containing compounds and their use as pesticides |
EP3630734A1 (en) | 2017-05-30 | 2020-04-08 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
CA3063306A1 (en) | 2017-05-30 | 2018-12-06 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides ii |
BR112019025295A2 (pt) | 2017-05-30 | 2020-06-23 | Basf Se | Compostos, composição, uso de um composto da fórmula i, método para combater fungos fitopatogênicos e semente |
US11447481B2 (en) | 2017-06-02 | 2022-09-20 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
EP3412150A1 (en) | 2017-06-06 | 2018-12-12 | Basf Se | Mixtures of meptyldinocap with sdhi fungicides |
WO2018229041A1 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-20 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
CA3070497A1 (en) | 2017-06-19 | 2018-12-27 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
AR112112A1 (es) | 2017-06-20 | 2019-09-18 | Basf Se | Compuestos de benzamida y su uso como herbicidas |
US20200214293A1 (en) | 2017-06-23 | 2020-07-09 | Basf Se | Pesticidal Mixtures Comprising A Pyrazole Compound |
EP3648604A1 (en) | 2017-07-05 | 2020-05-13 | BASF Agro B.V. | Fungicidal mixtures of mefentrifluconazole |
US11399542B2 (en) | 2017-07-05 | 2022-08-02 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2019007717A1 (en) | 2017-07-06 | 2019-01-10 | Basf Se | PESTICIDE MIXTURES |
WO2019008115A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Syngenta Participations Ag | HETEROCYCLIC DERIVATIVES HAVING PESTICIDE ACTIVITY HAVING SUBSTITUENTS CONTAINING SULFUR |
WO2019007719A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Basf Se | PESTICIDE MIXTURES |
EP3652133A4 (en) | 2017-07-10 | 2021-04-21 | Basf Se | MIXTURES INCLUDING A UREASE INHIBITOR (IU) AND A NITRIFICATION INHIBITOR SUCH AS 2- (3,4-DIMETHYL-1H-PYRAZOL-1-YL) SUCCINIC ACID (DMPSA) OR 3,4-DIMETHYL PYRAZOLIUM GLYCOLATE (DMPG) |
EP3427587A1 (en) | 2017-07-10 | 2019-01-16 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
BR112020000465B1 (pt) | 2017-07-11 | 2024-02-20 | Syngenta Participations Ag | Derivados oxadiazol microbiocidas |
WO2019011929A1 (en) | 2017-07-11 | 2019-01-17 | Syngenta Participations Ag | MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES |
BR112020000457A2 (pt) | 2017-07-11 | 2020-07-21 | Syngenta Participations Ag | derivados oxadiazol microbiocidas |
WO2019011928A1 (en) | 2017-07-11 | 2019-01-17 | Syngenta Participations Ag | MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES |
BR112020000371A2 (pt) | 2017-07-12 | 2020-07-14 | Syngenta Participations Ag | derivados de oxadiazol microbiocidas |
BR112020000414A2 (pt) | 2017-07-12 | 2020-07-21 | Syngenta Participations Ag | derivados de oxadiazol microbicidas |
BR112020000463A2 (pt) | 2017-07-13 | 2020-07-21 | Syngenta Participations Ag | derivados oxadiazol microbiocidas |
AR112342A1 (es) | 2017-07-21 | 2019-10-16 | Basf Se | Compuestos de benzamida y su uso como herbicidas |
WO2019020540A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Basf Se | PESTICIDE MIXTURES |
AR112673A1 (es) | 2017-08-11 | 2019-11-27 | Syngenta Participations Ag | Derivados de pirazol activos como plaguicidas |
US20200288713A1 (en) | 2017-08-11 | 2020-09-17 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
AR112672A1 (es) | 2017-08-11 | 2019-11-27 | Syngenta Participations Ag | Derivados de tiofeno activos como plaguicidas |
WO2019030358A1 (en) | 2017-08-11 | 2019-02-14 | Syngenta Participations Ag | ACTIVE PYRAZOLE DERIVATIVES ON THE PESTICIDE PLAN |
EP3447048A1 (en) | 2017-08-23 | 2019-02-27 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives |
WO2019042800A1 (en) | 2017-08-29 | 2019-03-07 | Basf Se | PESTICIDE MIXTURES |
ES2904910T3 (es) | 2017-09-13 | 2022-04-06 | Syngenta Participations Ag | Derivados de quinolina (tio)carboxamida microbiocidas |
WO2019053019A1 (en) | 2017-09-13 | 2019-03-21 | Syngenta Participations Ag | MICROBIOCIDE DERIVATIVES OF QUINOLINE (THIO) CARBOXAMIDE |
ES2906980T3 (es) | 2017-09-13 | 2022-04-21 | Syngenta Participations Ag | Derivados de quinolina (tio)carboxamida microbiocidas |
CN111093372B (zh) | 2017-09-13 | 2022-05-27 | 先正达参股股份有限公司 | 杀微生物的喹啉(硫代)羧酰胺衍生物 |
BR112020004754A2 (pt) | 2017-09-13 | 2020-09-15 | Syngenta Participations Ag | derivados de (tio)carboxamida de quinolina microbiocidas |
WO2019053024A1 (en) | 2017-09-13 | 2019-03-21 | Syngenta Participations Ag | MICROBIOCIDE DERIVATIVES OF QUINOLINE (THIO) CARBOXAMIDE |
EP3681870B1 (en) | 2017-09-13 | 2021-08-04 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives |
CN111108107B (zh) | 2017-09-18 | 2023-09-29 | 先正达参股股份有限公司 | 具有含硫取代基的杀有害生物活性杂环衍生物 |
WO2019057660A1 (en) | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Basf Se | INDOLE AND AZAINDOLE COMPOUNDS HAVING 6-CHANNEL SUBSTITUTED ARYL AND HETEROARYL CYCLES AS AGROCHEMICAL FUNGICIDES |
UY37913A (es) | 2017-10-05 | 2019-05-31 | Syngenta Participations Ag | Derivados de picolinamida fungicidas que portan un grupo terminal cuaternario |
UY37912A (es) | 2017-10-05 | 2019-05-31 | Syngenta Participations Ag | Derivados de picolinamida fungicidas que portan grupos terminales heteroarilo o heteroariloxi |
EP3692038A1 (en) | 2017-10-06 | 2020-08-12 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active pyrrole derivatives |
EP3692031B1 (en) | 2017-10-06 | 2021-09-01 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active pyrrole derivatives |
WO2019076778A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Syngenta Participations Ag | HETEROCYCLIC DERIVATIVES HAVING PESTICIDAL ACTIVITY HAVING SUBSTITUENTS CONTAINING SULFUR AND SULFONIMIDAMIDES |
WO2019086474A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active mesoionics heterocyclic compounds |
EP3710429B1 (en) | 2017-11-15 | 2023-04-05 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal picolinamide derivatives |
AU2018367015A1 (en) | 2017-11-15 | 2020-04-23 | Basf Se | Tank-mix |
WO2019097054A1 (en) | 2017-11-20 | 2019-05-23 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
WO2019101580A1 (en) | 2017-11-21 | 2019-05-31 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
PL3713418T3 (pl) | 2017-11-22 | 2022-01-10 | Basf Se | Związki benzoksaborolowe |
AU2018373436C1 (en) | 2017-11-23 | 2023-10-19 | Basf Se | Herbicidal pyridylethers |
BR112020008084B1 (pt) | 2017-11-23 | 2023-11-14 | Basf Se | Fenil éteres, composição herbicida, processo de preparação de composições ativas, método de controle de vegetação indesejada e uso dos fenil éteres |
AR114807A1 (es) | 2017-11-29 | 2020-10-21 | Basf Se | Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas |
KR20200094164A (ko) | 2017-11-29 | 2020-08-06 | 신젠타 파티서페이션즈 아게 | 살미생물 티아졸 유도체 |
CA3080432A1 (en) | 2017-11-29 | 2019-06-06 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
US11541428B2 (en) | 2017-12-03 | 2023-01-03 | Seedx Technologies Inc. | Systems and methods for sorting of seeds |
WO2019106639A1 (en) | 2017-12-03 | 2019-06-06 | Seedx Technologies Inc. | Systems and methods for sorting of seeds |
US10934265B2 (en) | 2017-12-04 | 2021-03-02 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal phenylamidine derivatives |
WO2019115404A1 (en) | 2017-12-13 | 2019-06-20 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active mesoionic heterocyclic compounds |
BR112020011768A2 (pt) | 2017-12-15 | 2020-11-17 | Syngenta Participations Ag | ligantes diferentes de anticorpos para detecção de proteínas alvo |
US11535594B2 (en) | 2017-12-19 | 2022-12-27 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal picolinamide derivatives |
WO2019121408A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
WO2019121373A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
CA3085651A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Pi Industries Ltd. | Fluoralkenyl compounds, process for preparation and use thereof |
WO2019121374A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
WO2019121352A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
CN111491925B (zh) | 2017-12-21 | 2023-12-29 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀害虫化合物 |
WO2019122345A1 (en) | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
WO2019122347A1 (en) | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Basf Se | N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)-benzamide compounds and their use as herbicides |
EP3508480A1 (en) | 2018-01-08 | 2019-07-10 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
MX2020007342A (es) | 2018-01-09 | 2020-09-09 | Basf Se | Compuestos de sililetinilo hetarilo como inhibidores de la nitrificacion. |
JP7337810B2 (ja) | 2018-01-15 | 2023-09-04 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体 |
EA202091721A1 (ru) | 2018-01-17 | 2020-11-27 | Басф Се | Растения с повышенной устойчивостью к гербицидам |
WO2019141552A1 (en) | 2018-01-18 | 2019-07-25 | Basf Se | Herbicidal triazine compounds |
WO2019143526A1 (en) | 2018-01-18 | 2019-07-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Alginate encapsulation of fungal microsclerotia |
UA127503C2 (uk) | 2018-01-30 | 2023-09-13 | Пі Індастріз Лтд. | Оксадіазоли, призначені для використання у контролі фітопатогенних грибів |
WO2019150311A1 (en) | 2018-02-02 | 2019-08-08 | Pi Industries Ltd. | 1-3 dithiol compounds and their use for the protection of crops from phytopathogenic microorganisms |
WO2019162309A1 (en) | 2018-02-21 | 2019-08-29 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
WO2019162308A1 (en) | 2018-02-21 | 2019-08-29 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
EP3530118A1 (en) | 2018-02-26 | 2019-08-28 | Basf Se | Fungicidal mixtures |
EP3530116A1 (en) | 2018-02-27 | 2019-08-28 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising xemium |
US20210000115A1 (en) | 2018-02-28 | 2021-01-07 | Basf Se | Use of alkoxypyrazoles as nitrification inhibitors |
EP3758491A1 (en) | 2018-02-28 | 2021-01-06 | Basf Se | Use of pyrazole propargyl ethers as nitrification inhibitors |
BR112020015467A2 (pt) | 2018-02-28 | 2020-12-08 | Basf Se | Misturas fungicidas, composição fungicida, métodos para controlar fungos fitopatogênicos, para melhorar a saúde das plantas e para proteção de material de propagação de plantas contra fungos fitopatogênicos e material de propagação de planta |
CN111683938B (zh) | 2018-02-28 | 2024-01-23 | 巴斯夫欧洲公司 | N-官能化的烷氧基吡唑化合物作为硝化抑制剂的用途 |
EP3533331A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-04 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising pydiflumetofen |
EP3533333A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-04 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising pydiflumetofen |
EP3536150A1 (en) | 2018-03-06 | 2019-09-11 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising fluxapyroxad |
BR112020018403A2 (pt) | 2018-03-09 | 2020-12-22 | Pi Industries Ltd. | Compostos heterocíclicoscomo fungicidas |
EP3539384A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-18 | Basf Se | 3-components mixtures comprising fluxapyroxad |
BR112020021645A2 (pt) | 2018-04-26 | 2021-01-26 | Syngenta Participations Ag | derivados de oxadiazol microbicidas |
WO2019209700A1 (en) | 2018-04-27 | 2019-10-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize event dp-023211-2 and methods for detection thereof |
BR112020022659A2 (pt) | 2018-05-08 | 2021-02-02 | Syngenta Crop Protection Ag | métodos de aplicação de um ou mais determinados compostos de heteroaril-1,2,4-triazol e heteroaril-tetrazol para o controle de danos em plantas, seu material de propagação e produtos derivados de plantas |
WO2019219689A1 (en) | 2018-05-18 | 2019-11-21 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents |
WO2019224160A1 (en) | 2018-05-25 | 2019-11-28 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal picolinamide derivatives |
WO2019229088A1 (en) | 2018-05-30 | 2019-12-05 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2019229089A1 (en) | 2018-05-31 | 2019-12-05 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
EP4342297A3 (en) | 2018-06-06 | 2024-05-15 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents |
AR115495A1 (es) | 2018-06-06 | 2021-01-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados heterocíclicos con sustituyentes que contienen azufre activos como plaguicidas |
WO2020002472A1 (en) | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Basf Se | Use of alkynylthiophenes as nitrification inhibitors |
JOP20200340A1 (ar) | 2018-06-29 | 2020-12-27 | Syngenta Participations Ag | مركبات آزول-أميد النشطة من الناحية المبيدة للآفات |
US20210269426A1 (en) | 2018-06-29 | 2021-09-02 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
WO2020007646A1 (en) | 2018-07-02 | 2020-01-09 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
BR112020024823A2 (pt) | 2018-07-02 | 2021-03-02 | Basf Se | misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método de controle de pragas fitopatogênicas |
BR112020027003A2 (pt) | 2018-07-02 | 2021-04-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados de 3-(2-tienil)-5-(trifluorometil)-1,2,4-oxadiazol como fungicidas agroquímicos |
WO2020011808A1 (en) | 2018-07-13 | 2020-01-16 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds |
CN112689631A (zh) | 2018-07-16 | 2021-04-20 | 先正达农作物保护股份公司 | 杀微生物的噁二唑衍生物 |
US20210276930A1 (en) | 2018-07-23 | 2021-09-09 | Basf Se | Use of a substituted thiazolidine compound as nitrification inhibitor |
WO2020020777A1 (en) | 2018-07-23 | 2020-01-30 | Basf Se | Use of substituted 2-thiazolines as nitrification inhibitors |
WO2020025658A1 (en) | 2018-08-03 | 2020-02-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds |
GB201812692D0 (en) | 2018-08-03 | 2018-09-19 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal compounds |
EP3833663A1 (en) | 2018-08-07 | 2021-06-16 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds |
US20210251232A1 (en) | 2018-08-08 | 2021-08-19 | Basf Se | Use of fungicidal active compound i derivative and mixtures thereof in seed application and treatment methods |
WO2020030754A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds |
AR115984A1 (es) | 2018-08-17 | 2021-03-17 | Pi Industries Ltd | Compuestos de 1,2-ditiolona y sus usos |
WO2020035565A1 (en) | 2018-08-17 | 2020-02-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds |
AU2019330847A1 (en) | 2018-08-27 | 2021-03-18 | Basf Se | Aqueous compositions of topramezone |
UY38366A (es) | 2018-09-13 | 2020-04-30 | Syngenta Participations Ag | Compuestos de azol-amida pesticidamente activos |
UY38367A (es) | 2018-09-13 | 2020-04-30 | Syngenta Participations Ag | Compuestos de azol-amida pesticidamente activos |
MX2021003240A (es) | 2018-09-18 | 2021-05-12 | Basf Se | Compuestos de diaminotriazina. |
US20210368794A1 (en) | 2018-09-19 | 2021-12-02 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising a mesoionic compound |
ES2935972T3 (es) | 2018-09-19 | 2023-03-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados de quinolina carboxamida microbiocidas |
BR112021004526A2 (pt) | 2018-09-28 | 2021-06-08 | Basf Se | uso do composto, métodos de proteção de plantas, de controle ou combate a pragas invertebradas e de tratamento de sementes e semente |
UY38395A (es) | 2018-10-01 | 2020-04-30 | Pi Industries Ltd | Nuevos oxadiazoles |
AU2019351944A1 (en) | 2018-10-01 | 2021-04-15 | Pi Industries Ltd | Oxadiazoles as fungicides |
EP3860987B1 (en) | 2018-10-02 | 2023-07-19 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active benzene- and azine-amide compounds |
US20220400668A1 (en) | 2018-10-03 | 2022-12-22 | Basf Se | Microemulsion compositions of topramezone |
EP3860993B1 (en) | 2018-10-06 | 2022-08-10 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives |
WO2020070132A1 (en) | 2018-10-06 | 2020-04-09 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives |
EP3863670A1 (en) | 2018-10-11 | 2021-08-18 | Amgen Inc. | Downstream processing of bispecific antibody constructs |
BR112021007156A2 (pt) | 2018-10-17 | 2021-07-20 | Syngenta Crop Protection Ag | derivados de oxadiazol microbiocidas |
AR116628A1 (es) | 2018-10-18 | 2021-05-26 | Syngenta Crop Protection Ag | Compuestos microbiocidas |
WO2020078797A1 (en) | 2018-10-19 | 2020-04-23 | Basf Se | Ternary mixtures containing fenpropimorph, succinate dehydrogenase inhibitors and one other compound |
BR112021006045A2 (pt) | 2018-10-19 | 2021-06-29 | Basf Se | misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método para o combate de parasitas fitopatogênicos |
EP3867237B1 (en) | 2018-10-19 | 2023-06-07 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active azole-amide compounds |
BR112021006011A2 (pt) | 2018-10-19 | 2021-06-29 | Basf Se | misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método para controlar pragas fitopatogênicas |
EP3643705A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-29 | Basf Se | Pesticidal compounds |
EP3643175A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-29 | Basf Se | Ternary pesticidal mixtures containing metyltetraprole and fenpropimorph |
TW202035404A (zh) | 2018-10-24 | 2020-10-01 | 瑞士商先正達農作物保護公司 | 具有含亞碸亞胺的取代基之殺有害生物活性雜環衍生物 |
WO2020094363A1 (en) | 2018-11-05 | 2020-05-14 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active azole-amide compounds |
WO2020095161A1 (en) | 2018-11-05 | 2020-05-14 | Pi Industries Ltd. | Nitrone compounds and use thereof |
CN113166063A (zh) | 2018-11-28 | 2021-07-23 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀害虫化合物 |
AR117183A1 (es) | 2018-11-30 | 2021-07-14 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados de tiazol microbiocidas |
AR117200A1 (es) | 2018-11-30 | 2021-07-21 | Syngenta Participations Ag | Derivados de tiazol microbiocidas |
US20220015372A1 (en) | 2018-12-14 | 2022-01-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Biologicals and their use in plants |
AR117291A1 (es) | 2018-12-14 | 2021-07-28 | Syngenta Crop Protection Ag | Compuestos heterocíclicos de cianamida con actividad pesticida |
WO2020120694A1 (en) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds |
EA202191655A1 (ru) | 2018-12-18 | 2021-11-01 | Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. | Гербицидные комбинации |
WO2020126580A1 (en) | 2018-12-18 | 2020-06-25 | Basf Agrochemical Products B.V. | Herbicidal composition |
EP3897139A1 (en) | 2018-12-18 | 2021-10-27 | BASF Agrochemical Products B.V. | Herbicidal combinations |
EA202191606A1 (ru) | 2018-12-18 | 2021-10-26 | Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. | Гербицидные комбинации |
EP3897138A1 (en) | 2018-12-18 | 2021-10-27 | BASF Agrochemical Products B.V. | Herbicidal combinations |
EA202191652A1 (ru) | 2018-12-18 | 2022-03-11 | Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. | Гербицидные комбинации |
WO2020127345A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
GB201821036D0 (en) | 2018-12-21 | 2019-02-06 | Syngenta Participations Ag | Nematicidal compositions |
CN113348169A (zh) | 2018-12-31 | 2021-09-03 | 先正达农作物保护股份公司 | 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物 |
WO2020141135A1 (en) | 2018-12-31 | 2020-07-09 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
EP3680223A1 (en) | 2019-01-10 | 2020-07-15 | Basf Se | Mixture comprising an urease inhibitor (ui) and a nitrification inhibitor (ni) such as an ni mixture comprising 2-(3,4-dimethyl-1h-pyrazol-1-yl)succinic acid (dmpsa) and dicyandiamide (dcd) |
WO2020164994A1 (en) | 2019-02-13 | 2020-08-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
WO2020164993A1 (en) | 2019-02-13 | 2020-08-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
WO2020165403A1 (en) | 2019-02-15 | 2020-08-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Phenyl substituted thiazole derivatives as microbiocidal compounds |
EP3696175A1 (en) | 2019-02-18 | 2020-08-19 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active azole-amide compounds |
WO2020169526A1 (en) | 2019-02-18 | 2020-08-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active cyanamide heterocyclic compounds |
EP3698632A1 (en) | 2019-02-21 | 2020-08-26 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP3698634A1 (en) | 2019-02-25 | 2020-08-26 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP3698633A1 (en) | 2019-02-25 | 2020-08-26 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
TW202100015A (zh) | 2019-02-28 | 2021-01-01 | 瑞士商先正達農作物保護公司 | 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物 |
TW202045011A (zh) | 2019-02-28 | 2020-12-16 | 瑞士商先正達農作物保護公司 | 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物 |
JP2022523434A (ja) | 2019-03-08 | 2022-04-22 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 殺有害生物的に活性なアゾール-アミド化合物 |
CN113825753A (zh) | 2019-03-08 | 2021-12-21 | 先正达农作物保护股份公司 | 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物 |
EP3941912B1 (en) | 2019-03-20 | 2023-12-13 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active azole amide compounds |
EP3941915A1 (en) | 2019-03-20 | 2022-01-26 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active azole amide compounds |
GB201903942D0 (en) | 2019-03-22 | 2019-05-08 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
WO2020193341A1 (en) | 2019-03-22 | 2020-10-01 | Syngenta Crop Protection Ag | N-[1-(5-bromo-2-pyrimidin-2-yl-1,2,4-triazol-3-yl)ethyl]-2-cyclopropyl-6-(trifluoromethyl)pyridine-4-carboxamide derivatives and related compounds as insecticides |
BR112021019096A2 (pt) | 2019-03-27 | 2021-11-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados de tiazol microbicidas |
UY38623A (es) | 2019-03-29 | 2020-10-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Compuestos de diazina-amida activos como pesticidas |
KR20210149113A (ko) | 2019-04-05 | 2021-12-08 | 신젠타 크롭 프로텍션 아게 | 살충 활성 디아진-아미드 화합물 |
CA3133029A1 (en) | 2019-04-08 | 2020-10-15 | Pi Industries Limited | Novel oxadiazole compounds for controlling or preventing phytopathogenic fungi |
US20220135531A1 (en) | 2019-04-08 | 2022-05-05 | Pi Industries Ltd. | Novel oxadiazole compounds for controlling or preventing phytopathogenic fungi |
AU2020270549A1 (en) | 2019-04-08 | 2021-09-30 | Pi Industries Limited | Novel oxadiazole compounds for controlling or preventing phytopathogenic fungi |
WO2020208095A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal picolinamide derivatives |
JOP20210273A1 (ar) | 2019-04-11 | 2023-01-30 | Syngenta Crop Protection Ag | مركبات دايازين - أميد نشطة بشكل مبيد للآفات |
EP3730489A1 (en) | 2019-04-25 | 2020-10-28 | Basf Se | Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides |
EP3744174A1 (en) | 2019-05-27 | 2020-12-02 | Basf Se | Use of metyltetraprol and mixtures of metyltetraprol for combating phytopathogenic fungi on cotton |
AR119009A1 (es) | 2019-05-29 | 2021-11-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados de alcoxipiridina y alcoxipirimidina microbicidas |
AR119011A1 (es) | 2019-05-29 | 2021-11-17 | Syngenta Crop Protection Ag | DERIVADOS DE [1,3]DIOXOLO[4,5-c]PIRIDIN-4-CARBOXAMIDA, COMPOSICIONES AGROQUÍMICAS QUE LOS COMPRENDEN Y SU EMPLEO COMO FUNGICIDA PARA CONTROLAR O PREVENIR LA INFESTACIÓN DE PLANTAS ÚTILES |
CN113924294A (zh) | 2019-05-29 | 2022-01-11 | 先正达农作物保护股份公司 | 杀微生物衍生物 |
JP2022534914A (ja) | 2019-05-29 | 2022-08-04 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 殺微生物性誘導体 |
CA3137494A1 (en) | 2019-06-13 | 2020-12-17 | Amgen Inc. | Automated biomass-based perfusion control in the manufacturing of biologics |
WO2020254530A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Syngenta Crop Protection Ag | 7-sulfonyl-n-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)-quinoxaline-6-carboxamide derivatives and the respective -benzimidazole-5-, -imidazo[4,5-b]pyridine-5-, -3h-furo[3,2b]pyridine-5-, -quinoline-2-, and -naphthalene-2-carboxamide derivatives as pesticides |
WO2021005009A1 (en) | 2019-07-05 | 2021-01-14 | Iomx Therapeutics Ag | Antibodies binding igc2 of igsf11 (vsig3) and uses thereof |
BR112021026861A2 (pt) | 2019-07-05 | 2022-02-22 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados de picolinamida microbiocidas |
GB201910037D0 (en) | 2019-07-12 | 2019-08-28 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
WO2021009311A1 (en) | 2019-07-17 | 2021-01-21 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
EP3766879A1 (en) | 2019-07-19 | 2021-01-20 | Basf Se | Pesticidal pyrazole derivatives |
EP4004041A1 (en) | 2019-07-26 | 2022-06-01 | Amgen Inc. | Anti-il13 antigen binding proteins |
AR119774A1 (es) | 2019-08-19 | 2022-01-12 | Pi Industries Ltd | Compuestos de oxadiazol que contienen un anillo heteroaromático de 5 miembros para controlar o prevenir hongos fitopatogénicos |
JP2022545266A (ja) | 2019-08-23 | 2022-10-26 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 殺有害生物的に活性なピラジン-アミド化合物 |
US20220287301A1 (en) | 2019-09-03 | 2022-09-15 | Basf Se | Polymers for spray drift control of pesticide spray |
AU2020345787A1 (en) | 2019-09-10 | 2022-03-24 | Amgen Inc. | Purification method for bispecific antigen-binding polypeptides with enhanced protein L capture dynamic binding capacity |
UY38885A (es) | 2019-09-20 | 2021-04-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Compuestos de azetidinil-, pirrolidinil-,piperdinil- o piperazinil-piridinil carbonilo pesticidamente activos |
BR112022005137A2 (pt) | 2019-09-20 | 2022-06-14 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados heterocíclicos com substituintes contendo enxofre e sulfoximina ativos em termos pesticidas |
WO2021076346A1 (en) | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize event dp-202216-6 and dp-023211-2 stack |
CN114630825A (zh) | 2019-11-01 | 2022-06-14 | 先正达农作物保护股份公司 | 杀有害生物活性的稠合二环杂芳香族化合物 |
AR120374A1 (es) | 2019-11-08 | 2022-02-09 | Pi Industries Ltd | Compuestos de oxadiazol que contienen anillos de heterociclilo fusionados para controlar o prevenir hongos fitopatogénicos |
CA3156683A1 (en) | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Amgen Inc. | METHOD FOR REDUCING AGGREGATE FORMATION IN DOWNSTREAM PROCESSING OF BI-SPECIFIC ANTIGEN-BINDING MOLECULES |
US20220386602A1 (en) | 2019-11-15 | 2022-12-08 | Basf Corporation | Methods of using a composition comprising an anionic pesticide and a buffer |
US20230053607A1 (en) | 2019-12-04 | 2023-02-23 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic amino compounds |
WO2021122645A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active azole-amide compounds |
EP4075975A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-10-26 | BASF Corporation | Low volatile polyamine salts of anionic pesticides |
AU2020414327A1 (en) | 2019-12-23 | 2022-07-07 | Basf Se | Enzyme enhanced root uptake of agrochemical active compound |
AU2020414409A1 (en) | 2019-12-27 | 2022-06-16 | Affimed Gmbh | Method for the production of bispecific FcyRIIl x CD30 antibody construct |
BR112022012873A2 (pt) | 2019-12-31 | 2022-09-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados heterocíclicos ativos em termos pesticidas com substituintes contendo enxofre |
AR120982A1 (es) | 2020-01-06 | 2022-04-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados heterocíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre |
WO2021144354A1 (en) | 2020-01-15 | 2021-07-22 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds |
BR112022013890A2 (pt) | 2020-01-16 | 2022-09-13 | Basf Se | Mistura |
CN114981230A (zh) | 2020-01-16 | 2022-08-30 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含含有脲酶抑制剂的固体载体和含有硝化抑制剂的另一固体载体的混合物 |
JP2023511201A (ja) | 2020-01-24 | 2023-03-16 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 殺有害生物的に活性な縮合二環式芳香族複素環式化合物 |
JP2023513047A (ja) | 2020-01-30 | 2023-03-30 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 殺有害生物的に有効な縮合二環式芳香族複素環式アミノ化合物 |
EP4102973A1 (en) | 2020-02-11 | 2022-12-21 | Syngenta Crop Protection AG | Method of controlling fungi |
US20230146180A1 (en) | 2020-02-11 | 2023-05-11 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active cyclic amine compounds |
WO2021170881A1 (en) | 2020-02-27 | 2021-09-02 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active diazine-bisamide compounds |
WO2021175822A1 (en) | 2020-03-02 | 2021-09-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally amidine-substituted benzoic acid amide compounds |
EP4118113A1 (en) | 2020-03-12 | 2023-01-18 | Amgen Inc. | Method for treatment and prophylaxis of crs in patients comprising a combination of bispecifc antibodies binding to cds x cancer cell and tnfalpha or il-6 inhibitor |
CN115243547A (zh) | 2020-03-13 | 2022-10-25 | 先正达农作物保护股份公司 | 控制或预防植物被植物病原性微生物多主棒孢菌侵染的方法 |
EP4117437A1 (en) | 2020-03-13 | 2023-01-18 | Syngenta Crop Protection AG | Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola |
BR112022018267A2 (pt) | 2020-03-13 | 2022-10-25 | Syngenta Crop Protection Ag | Métodos de controle ou prevenção de infestação de plantas pelo microrganismo fitopatogênico corynespora cassiicola |
CN115334885A (zh) | 2020-03-13 | 2022-11-11 | 先正达农作物保护股份公司 | 控制或预防植物被植物病原性微生物多主棒孢菌、大豆灰斑病菌和/或大豆紫斑病菌侵染的方法 |
US20230098995A1 (en) | 2020-03-13 | 2023-03-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola |
US20230112306A1 (en) | 2020-03-13 | 2023-04-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Methods of controlling or preventing infestation of soybean plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola |
BR112022018111A2 (pt) | 2020-03-19 | 2022-10-25 | Amgen Inc | Anticorpos contra mucina 17 e usos dos mesmos |
WO2021197884A1 (en) | 2020-04-01 | 2021-10-07 | Basf Se | Ternary mixtures containing fenpropimorph, succinate dehydrogenase inhibitors and strobilurins |
BR112022019582A2 (pt) | 2020-04-01 | 2022-11-16 | Basf Se | Misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método para controlar pragas fitopatogênicas |
US20230148590A1 (en) | 2020-04-02 | 2023-05-18 | Basf Corporation | Aqueous Formulations of Dicamba |
BR112022020134A2 (pt) | 2020-04-06 | 2022-11-22 | Basf Corp | Composição agroquímica aquosa, métodos para produzir a composição agroquímica, para controlar vegetação indesejada e para reduzir a deriva de pulverização e composição adjuvante |
EP4132924B1 (en) | 2020-04-08 | 2024-02-21 | Syngenta Crop Protection AG | Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives |
AR121734A1 (es) | 2020-04-08 | 2022-07-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados microbicidas de tipo dihidropirrolopirazina de quinolina |
AR121733A1 (es) | 2020-04-08 | 2022-07-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados microbiocidas de tipo dihidro-(tiazina)oxazina de quinolina |
WO2021213929A1 (en) | 2020-04-20 | 2021-10-28 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active substituted 1,3-dihydro-2h-imidazo[4,5-c]pyridin-2-one derivatives with sulfur containing substituents |
EP4143167B1 (en) | 2020-04-28 | 2024-05-15 | Basf Se | Pesticidal compounds |
GB202006386D0 (en) | 2020-04-30 | 2020-06-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal Compounds |
JP2023523456A (ja) | 2020-04-30 | 2023-06-05 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体 |
GB202006399D0 (en) | 2020-04-30 | 2020-06-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
GB202006480D0 (en) | 2020-05-01 | 2020-06-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
GB202006606D0 (en) | 2020-05-05 | 2020-06-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
WO2021224409A1 (en) | 2020-05-06 | 2021-11-11 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
CN111574599B (zh) * | 2020-05-18 | 2022-10-28 | 福建农林大学 | 一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法 |
CA3183756A1 (en) | 2020-05-19 | 2021-11-25 | Amgen Inc. | Mageb2 binding constructs |
CR20220615A (es) | 2020-06-03 | 2023-01-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
EP4161924A1 (en) | 2020-06-03 | 2023-04-12 | Syngenta Crop Protection AG | Microbiocidal derivatives |
IL298217A (en) | 2020-06-03 | 2023-01-01 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicides |
AR122485A1 (es) | 2020-06-04 | 2022-09-14 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
AR122189A1 (es) | 2020-06-04 | 2022-08-24 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
AR122484A1 (es) | 2020-06-04 | 2022-09-14 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
CA3179042A1 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Olivier Loiseleur | Fungicidal compositions |
AR122187A1 (es) | 2020-06-04 | 2022-08-24 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
AR122199A1 (es) | 2020-06-04 | 2022-08-24 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
IL298987A (en) | 2020-06-15 | 2023-02-01 | Basf Se | A stable concentrate without solvents that turns into an emulsion |
CA3184928A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-13 | Hagalavadi M. Venkatesha | A pesticidally active mixture comprising thietanyloxy compound, oxides or salts thereof |
EP4182466A2 (en) | 2020-07-14 | 2023-05-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
WO2022013417A1 (en) | 2020-07-17 | 2022-01-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2022017975A1 (en) | 2020-07-18 | 2022-01-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
AR123052A1 (es) | 2020-07-27 | 2022-10-26 | Pi Industries Ltd | Una mezcla pesticidamente activa que comprende el compuesto de pirazolopiridina antranilamida, sus óxidos o sales de los mismos |
UY39385A (es) | 2020-08-18 | 2022-02-25 | Pi Industries Ltd | Nuevos compuestos heterocíclicos para combatir los hongos fitopatógenos |
JP2023540480A (ja) | 2020-08-31 | 2023-09-25 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体 |
BR112023003835A2 (pt) | 2020-09-01 | 2023-04-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados heterocíclicos com substituintes contendo enxofre ativos em termos pesticidas |
CN116234811A (zh) | 2020-09-02 | 2023-06-06 | 先正达农作物保护股份公司 | 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物 |
EP4208464A1 (en) | 2020-09-02 | 2023-07-12 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
UY39411A (es) | 2020-09-09 | 2022-04-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados de indazolil pirazolo[3,4-c] piridina pesticídicamente activos con sustituyentes que contienen azufre |
UY39423A (es) | 2020-09-15 | 2022-03-31 | Pi Industries Ltd | Nuevos compuestos de picolinamida para combatir hongos fitopatógenos |
WO2022058878A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Pi Industries Limited | Novel picolinamide compounds for combating phytopathogenic fungi |
GB202014840D0 (en) | 2020-09-21 | 2020-11-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
TW202229241A (zh) | 2020-09-26 | 2022-08-01 | 印度商皮埃企業有限公司 | 殺線蟲化合物及其用途 |
WO2022074206A1 (en) | 2020-10-08 | 2022-04-14 | Affimed Gmbh | Trispecific binders |
WO2022073797A1 (en) | 2020-10-08 | 2022-04-14 | Basf Se | Mixtures containing cyclobutrifluram |
CN112225786B (zh) * | 2020-10-28 | 2022-12-27 | 福建农林大学 | 对松墨天牛具有毒力的Bt毒素 |
KR20230098317A (ko) | 2020-11-03 | 2023-07-03 | 도이체스크레브스포르슝스젠트룸스티프퉁데스외펜트리헨레크츠 | 표적 세포가 제한되는, 공동자극, 이중특이적 및 2가 항-cd28 항체 |
JP2023548345A (ja) | 2020-11-06 | 2023-11-16 | アムジエン・インコーポレーテツド | クリッピング率の低減した抗原結合ドメイン |
JP2023547662A (ja) | 2020-11-06 | 2023-11-13 | アムジェン リサーチ (ミュニック) ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Cldn6及びcd3に選択的に結合するポリペプチド構築物 |
EP4240768A2 (en) | 2020-11-06 | 2023-09-13 | Amgen Inc. | Multitargeting bispecific antigen-binding molecules of increased selectivity |
KR20230104229A (ko) | 2020-11-06 | 2023-07-07 | 암젠 인크 | Cd3에 결합하는 폴리펩티드 구축물 |
WO2022101265A1 (en) | 2020-11-13 | 2022-05-19 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds |
WO2022106205A1 (en) | 2020-11-18 | 2022-05-27 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Corona virus spike protein binding compounds |
US20240016150A1 (en) | 2020-12-01 | 2024-01-18 | Basf Se | Mixtures containing metarylpicoxamid |
WO2022128554A1 (en) | 2020-12-15 | 2022-06-23 | Basf Se | Mixtures containing n-methoxy-n-[[4-[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]phenyl]methyl]cyclopropanecarboxamide |
EP4263579A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-10-25 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidal hexatoxin polypeptides and methods of use thereof |
EP4018830A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-29 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
JP2024505178A (ja) | 2021-01-21 | 2024-02-05 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体 |
US20240108006A1 (en) | 2021-01-23 | 2024-04-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heteroaromatic compounds |
CR20230359A (es) | 2021-01-27 | 2023-10-03 | Basf Se | Compuestos de diaminotriazina |
CR20230358A (es) | 2021-01-27 | 2023-10-03 | Basf Se | Compuestos de diaminotriazina |
EP4284422A1 (en) | 2021-01-28 | 2023-12-06 | Vaccinvent GmbH | Method and means for modulating b-cell mediated immune responses |
WO2022162203A1 (en) | 2021-01-28 | 2022-08-04 | Vaccinvent Gmbh | Method and means for modulating b-cell mediated immune responses |
CN117120084A (zh) | 2021-01-28 | 2023-11-24 | 维肯芬特有限责任公司 | 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段 |
CN116829521A (zh) | 2021-02-02 | 2023-09-29 | 巴斯夫欧洲公司 | Dcd和烷氧基吡唑作为硝化抑制剂的协同增效作用 |
GB202102147D0 (en) | 2021-02-16 | 2021-03-31 | Syngenta Crop Protection Ag | New use |
EP4294187A1 (en) | 2021-02-19 | 2023-12-27 | Syngenta Crop Protection AG | Insect and acarina pest control |
JP2024507216A (ja) | 2021-02-19 | 2024-02-16 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 昆虫及びダニ目有害生物の防除 |
WO2022180096A1 (en) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidal compositions |
AR124935A1 (es) | 2021-03-01 | 2023-05-24 | Syngenta Crop Protection Ag | Formulaciones plaguicidas |
WO2022200364A1 (en) | 2021-03-25 | 2022-09-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
MX2023011368A (es) | 2021-03-27 | 2023-10-05 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados microbiocidas de amidas isonicotinicas. |
WO2022207462A1 (en) | 2021-03-30 | 2022-10-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active cyclic amine compounds |
EP4066643A1 (en) | 2021-03-30 | 2022-10-05 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
TW202313681A (zh) | 2021-04-02 | 2023-04-01 | 美商安進公司 | Mageb2結合構建體 |
AR125342A1 (es) | 2021-04-16 | 2023-07-05 | Syngenta Crop Protection Ag | Compuestos de amina cíclica activos como plaguicidas |
AU2022260028A1 (en) | 2021-04-20 | 2023-10-12 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal quinoline/quinoxaline isoquinoline derivatives |
TW202309047A (zh) | 2021-05-05 | 2023-03-01 | 印度商皮埃企業有限公司 | 用以防治植物病原真菌的新穎稠合雜環化合物 |
AU2022269312A1 (en) | 2021-05-06 | 2023-10-19 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Cd20 and cd22 targeting antigen-binding molecules for use in proliferative diseases |
EP4337015A1 (en) | 2021-05-14 | 2024-03-20 | Syngenta Crop Protection AG | Insect, acarina and nematode pest control |
CN117320551A (zh) | 2021-05-14 | 2023-12-29 | 先正达农作物保护股份公司 | 种子处理组合物 |
EP4341245A1 (en) | 2021-05-21 | 2024-03-27 | Basf Se | Use of ethynylpyridine compounds as nitrification inhibitors |
CA3219128A1 (en) | 2021-05-21 | 2022-11-24 | Barbara Nave | Use of an n-functionalized alkoxy pyrazole compound as nitrification inhibitor |
EP4094579A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-11-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising metyltetraprole |
KR20240016327A (ko) | 2021-06-01 | 2024-02-06 | 신젠타 크롭 프로텍션 아게 | 살미생물 테트라하이드로이소퀴놀린 유도체 |
BR112023025278A2 (pt) | 2021-06-02 | 2024-02-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados heterocíclicos com substituintes contendo sulfoximina ativos em termos pesticidas |
EP4352050A1 (en) | 2021-06-09 | 2024-04-17 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active diazine-amide compounds |
BR112023027004A2 (pt) | 2021-06-21 | 2024-03-12 | Basf Se | Estrutura de metal-orgânica, uso da estrutura de metal-orgânica, composição para uso na redução da nitrificação, mistura agroquímica e métodos de redução da nitrificação, de tratamento de fertilizante ou composição de fertilizante e de preparação de uma estrutura de metal-orgânica |
WO2022268815A1 (en) | 2021-06-24 | 2022-12-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
CA3221180A1 (en) | 2021-06-24 | 2022-12-29 | Syngenta Crop Protection Ag | 2-[3-[1 [(quinazolin-4-yl)amino]ethyl]pyrazin-2-yl]thiazole-5-carbonitrile derivatives and similar compounds as pesticides |
WO2022268813A1 (en) | 2021-06-24 | 2022-12-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2023280999A1 (en) | 2021-07-07 | 2023-01-12 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2023006634A1 (en) | 2021-07-27 | 2023-02-02 | Syngenta Crop Protection Ag | Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor |
EP4377312A1 (en) | 2021-07-29 | 2024-06-05 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds |
AU2022320948A1 (en) | 2021-07-30 | 2024-01-18 | Affimed Gmbh | Duplexbodies |
BR112024001979A2 (pt) | 2021-08-02 | 2024-04-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados de pirazol microbicidas |
WO2023012081A1 (en) | 2021-08-05 | 2023-02-09 | Syngenta Crop Protection Ag | Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor |
AR126729A1 (es) | 2021-08-10 | 2023-11-08 | Syngenta Crop Protection Ag | Mezcla fungicida |
WO2023017094A1 (en) | 2021-08-10 | 2023-02-16 | Syngenta Crop Protection Ag | 2,2-difluoro-5h-[1,3]dioxolo[4,5-f]isoindol-7-one derivatives as pesticides |
AR126789A1 (es) | 2021-08-19 | 2023-11-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Método para controlar plagas resistentes a diamidas y compuestos para esto |
WO2023031161A1 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Plants having increased tolerance to herbicides |
CN117998986A (zh) | 2021-09-23 | 2024-05-07 | 先正达农作物保护股份公司 | 昆虫、蜱螨目和线虫类有害生物控制 |
WO2023061838A1 (en) | 2021-10-14 | 2023-04-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives |
WO2023072945A1 (en) | 2021-10-25 | 2023-05-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2023072849A1 (en) | 2021-10-27 | 2023-05-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active pyridazinone compounds |
AU2022381918A1 (en) | 2021-11-03 | 2024-06-13 | Affimed Gmbh | Bispecific cd16a binders |
AR127568A1 (es) | 2021-11-03 | 2024-02-07 | Affimed Gmbh | Ligandos biespecíficos de cd16a |
AR127682A1 (es) | 2021-11-19 | 2024-02-21 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas de aureobasidina |
WO2023089049A2 (en) | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal isonicotinic amide derivatives |
WO2023094304A1 (en) | 2021-11-25 | 2023-06-01 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal heterobiaryl amide derivatives |
WO2023094303A1 (en) | 2021-11-25 | 2023-06-01 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal heterobiaryl amide derivatives |
WO2023099460A1 (en) | 2021-12-02 | 2023-06-08 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
TW202332376A (zh) | 2021-12-02 | 2023-08-16 | 瑞士商先正達農作物保護公司 | 在熱緊迫下保留玉蜀黍花粉活力之方法 |
WO2023105065A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2023104714A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active pyridazinone compounds |
WO2023105064A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2023110710A1 (en) | 2021-12-13 | 2023-06-22 | Syngenta Crop Protection Ag | Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor |
AR127922A1 (es) | 2021-12-15 | 2024-03-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados heterocíclicos bicíclicos microbiocidas |
EP4197333A1 (en) | 2021-12-15 | 2023-06-21 | Syngenta Crop Protection AG | Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor |
EP4198023A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-21 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
AR127972A1 (es) | 2021-12-17 | 2024-03-13 | Pi Industries Ltd | Novedosos compuestos de piridina carboxamida bicíclica sustituida fusionada para combatir hongos fitopatogénicos |
WO2023111215A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal pyridine-substituted benzothiazine derivatives |
WO2023110871A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal pyrazole derivatives |
AR127992A1 (es) | 2021-12-21 | 2024-03-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Composición agroquímica |
WO2023118011A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal aza-heterobiaryl derivatives |
WO2023139166A1 (en) | 2022-01-19 | 2023-07-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Methods for controlling plant pathogens |
WO2023144711A1 (en) | 2022-01-27 | 2023-08-03 | Pi Industries Ltd. | 1,2,3-triazole carbonyl sulfonylamide compounds and use thereof |
WO2023148206A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal n-amide derivatives |
WO2023148369A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2023148368A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2023152340A1 (en) | 2022-02-10 | 2023-08-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2023156402A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
WO2023166067A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal pyridazinone amide derivatives |
WO2023187191A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2023203038A1 (en) | 2022-04-19 | 2023-10-26 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2023203066A1 (en) | 2022-04-21 | 2023-10-26 | Basf Se | Synergistic action as nitrification inhibitors of dcd oligomers with alkoxypyrazole and its oligomers |
WO2023217989A1 (en) | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Syngenta Crop Protection Ag | Alkoxy heteroaryl- carboxamide or thioamide compounds |
TW202346368A (zh) | 2022-05-12 | 2023-12-01 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | 具有增加的選擇性的多鏈多靶向性雙特異性抗原結合分子 |
WO2023247360A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds |
TW202408362A (zh) | 2022-06-21 | 2024-03-01 | 瑞士商先正達農作物保護公司 | 殺微生物的雙環雜環甲醯胺衍生物 |
WO2024018016A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-25 | Syngenta Crop Protection Ag | Crystalline forms of 1,2,4-oxadiazole fungicides |
WO2024022910A1 (en) | 2022-07-26 | 2024-02-01 | Syngenta Crop Protection Ag | 1-[1-[2-(pyrimidin-4-yl)-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-3-[2,4-dichloro-5-phenyl]urea derivatives and similar compounds as pesticides |
WO2024028243A1 (en) | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Basf Se | Pyrazolo pesticidal compounds |
WO2024033374A1 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds |
WO2024038054A1 (en) | 2022-08-16 | 2024-02-22 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
WO2024059675A2 (en) | 2022-09-14 | 2024-03-21 | Amgen Inc. | Bispecific molecule stabilizing composition |
WO2024056732A1 (en) | 2022-09-16 | 2024-03-21 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active cyclic amine compounds |
WO2024068947A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal pyrazole derivatives |
WO2024068950A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal pyrazole derivatives |
WO2024089023A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-02 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2024089191A1 (en) | 2022-10-27 | 2024-05-02 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal heterobicyclic dihydrooxadiazine derivatives |
WO2024089216A1 (en) | 2022-10-27 | 2024-05-02 | Syngenta Crop Protection Ag | Novel sulfur-containing heteroaryl carboxamide compounds |
WO2024094575A1 (en) | 2022-10-31 | 2024-05-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2024100069A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-16 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal pyridine derivatives |
WO2024105104A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal tetrahydroisoquinoline derivatives |
WO2024110554A1 (en) | 2022-11-23 | 2024-05-30 | Syngenta Crop Protection Ag | N-[(1 -[2-[6-(pyridazin-3-yl]-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-quinazolin-4-amine and n-[1-[3-(6-(pyridazin-3-yl)pyrazin-2-yl]ethyl]-8-quinazolin-4-amine derivatives as pesticides |
WO2024110215A1 (en) | 2022-11-24 | 2024-05-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active cyclic amine compounds |
WO2024115509A1 (en) | 2022-11-29 | 2024-06-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal tetrahydroisoquinoline derivatives |
WO2024115512A1 (en) | 2022-11-30 | 2024-06-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal tetrahydroisoquinoline derivatives |
WO2024115546A1 (en) | 2022-11-30 | 2024-06-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
WO2024121263A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Insecticidal compound based on pyrazole derivatives |
WO2024121262A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Insecticidal compound based on pyrazole derivatives |
WO2024121264A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Insecticidal compound based on pyrazole derivatives |
WO2024121261A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Insecticidal compound based on pyrazole derivatives |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TR27832A (tr) | 1987-04-29 | 1995-08-31 | Monsanto Co | Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler. |
NZ230375A (en) * | 1988-09-09 | 1991-07-26 | Lubrizol Genetics Inc | Synthetic gene encoding b. thuringiensis insecticidal protein |
US5659123A (en) | 1994-08-26 | 1997-08-19 | Plant Genetic Systems, N.V. | Diabrotica toxins |
CA2290718A1 (en) | 1997-06-27 | 1999-01-07 | Plant Genetic Systems N.V. | Improved bacillus thuringiensis toxin |
US6013253A (en) | 1997-08-15 | 2000-01-11 | Amgen, Inc. | Treatment of multiple sclerosis using consensus interferon and IL-1 receptor antagonist |
FR2768211B1 (fr) | 1997-09-09 | 1999-10-22 | Curty Payen Sa | Joint statique d'etancheite |
US6063597A (en) | 1997-12-18 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects |
DE69835538T2 (de) | 1997-12-18 | 2008-01-03 | Monsanto Technology Llc | Insekten-resistante transgene pflanzen und verfahren zur verbesserung von der aktivität von delta-endotoxine gegen insekte |
US6551962B1 (en) * | 2000-10-06 | 2003-04-22 | Monsanto Technology Llc | Method for deploying a transgenic refuge |
US7230167B2 (en) * | 2001-08-31 | 2007-06-12 | Syngenta Participations Ag | Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor |
US20080182796A1 (en) * | 2001-08-31 | 2008-07-31 | Syngenta Participations Ag | Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor |
US7276853B2 (en) | 2002-04-11 | 2007-10-02 | Koninklijke Philips Electronics, N.V. | Low-pressure mercury vapor discharge lamp |
-
2002
- 2002-02-09 US US10/487,846 patent/US7230167B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-27 US US10/229,346 patent/US7030295B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-29 AR ARP020103249A patent/AR036311A1/es active IP Right Grant
- 2002-09-02 BR BRPI0212262-6A patent/BR0212262B1/pt active IP Right Grant
- 2002-09-02 AT AT02772258T patent/ATE382701T1/de active
- 2002-09-02 AU AU2002337055A patent/AU2002337055A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-02 DE DE60224410T patent/DE60224410T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-02 JP JP2003523658A patent/JP2005500849A/ja not_active Withdrawn
- 2002-09-02 CA CA2458514A patent/CA2458514C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-02 WO PCT/EP2002/009789 patent/WO2003018810A2/en active IP Right Grant
- 2002-09-02 MX MXPA04001558A patent/MXPA04001558A/es active IP Right Grant
- 2002-09-02 ZA ZA200401140A patent/ZA200401140B/en unknown
- 2002-09-02 ES ES02772258T patent/ES2299601T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-02 EP EP02772258A patent/EP1425397B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-02 CN CNB028194179A patent/CN100374562C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-02 RU RU2004109918/13A patent/RU2314345C2/ru active
-
2004
- 2004-02-27 CO CO04017803A patent/CO5560624A2/es not_active Application Discontinuation
-
2005
- 2005-12-05 US US11/294,220 patent/US7276583B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-08-06 US US11/834,037 patent/US7569363B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-06-22 US US12/488,759 patent/US8008248B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-08-06 AR ARP090103014A patent/AR072923A2/es unknown
-
2011
- 2011-07-25 US US13/189,888 patent/US8216806B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2011-07-25 US US13/189,966 patent/US8247369B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-06-18 US US13/525,413 patent/US8541655B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-06-12 US US13/915,673 patent/US8759620B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012516700A (ja) * | 2009-02-05 | 2012-07-26 | アテニックス・コーポレーション | 変異AXMI−R1δ−エンドトキシン遺伝子及びその使用方法 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8759620B2 (en) | Transgenic plants expressing modified CRY3A | |
US10934330B2 (en) | Methods for modulating the activity of insecticidal proteins | |
EP2512222B1 (en) | COMBINED USE OF CRY1Ca AND CRY1Fa PROTEINS FOR INSECT RESISTANCE MANAGEMENT | |
US20190112343A1 (en) | Insecticidal proteins | |
CN113179823A (zh) | 小地老虎的控制 | |
US20080182796A1 (en) | Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor | |
CN114680127A (zh) | 夜蛾、草螟和螟蛾有害生物的防治 | |
CN114680126A (zh) | 夜蛾、草螟和螟蛾有害生物的防治 | |
CN114747590A (zh) | 夜蛾、草螟和螟蛾有害生物的防治 | |
CN113179822A (zh) | 棉铃虫的控制 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050707 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20080324 |