CN108495550B

CN108495550B - 生物制品及其在植物中的应用

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Publication number: CN108495550B
Application number: CN201680059820.5A
Authority: CN
Inventors: D.J.布鲁克; F.C.布恩斯二世; J.K.普雷斯奈尔
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EIDP Inc
Priority date: 2015-10-12
Filing date: 2016-10-07
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2036-10-07
Also published as: CA2998391A1; US10932471B2; US9993006B2; MX2018004475A; EP3361865A1; WO2017066094A1; BR112018007444B1; UA124380C2; HUE056337T2; US20170099844A1; CN108495550A; CA2998391C; AR106309A1; US11058119B2; EA201890945A1; CA3206286A1; EP3922100A1; US20180220658A1; MX2021004479A; EP3361865B1

Abstract

公开了昆虫病原真菌菌株、组合物、以及使用这些菌株来降低总体昆虫损伤的方法。

Description

生物制品及其在植物中的应用

发明领域

公开了昆虫病原真菌菌株、昆虫病原真菌组合物、和使用这些菌株和组合物来降低总体昆虫损伤的方法。

背景技术

长期以来人们一直需要用于控制或根除具有农业意义的昆虫有害生物的环境友好型组合物和方法，即选择性、环境上惰性、非持久性和可生物降解，并且很好地适合昆虫有害生物管理方案的方法。

发明内容

本发明的一个实施例涉及一种组合物，所述组合物包含选自罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)和金龟子绿僵菌(Metarhizium anisoplia)的昆虫病原真菌菌株。在某些实施例中，所述真菌昆虫病原体包含孢子、微菌核、或分生孢子。在一些实施例中，真菌昆虫病原体具有杀昆虫活性。

在一个实施例中，本公开涉及一种用于增加对植物有害生物、病原体、或昆虫的抗性或用于增加植物健康和/或产量的组合物，所述组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的昆虫病原真菌菌株：金龟子绿僵菌15013-1(NRRL 67073)、罗伯茨绿僵菌23013-3(NRRL 67075)、金龟子绿僵菌3213-1(NRRL 67074)、或其任何组合。在另一个实施例中，本公开涉及一种组合物，所述组合物包含农业上可接受的载体和选自由以下组成的组的真菌昆虫病原体：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、金龟子绿僵菌3213-1、或其任何组合。在再一个实施例中，所述真菌昆虫病原体包含孢子、分生孢子、或微菌核。在另一个实施例中，本公开涉及一种组合物，所述组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的昆虫病原真菌菌株：金龟子绿僵菌15013-1(NRRL 67073)、罗伯茨绿僵菌23013-3(NRRL67075)、金龟子绿僵菌3213-1(NRRL 67074)、这些菌株的突变体、由本文公开的菌株(这些菌株针对植物有害生物、病原体或昆虫、或其任何组合表现出杀昆虫活性)产生的代谢物或代谢物的组合。

在又另一个实施例中，本公开涉及一种组合物，所述组合物包含有效量的至少两种选自由以下组成的组的昆虫病原真菌菌株：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、金龟子绿僵菌3213-1、或其任何组合，以实现抑制植物病原体、有害生物或昆虫的生长的效果。在另一个实施例中，本文公开的组合物还包含选自由以下组成的组的生物控制剂：细菌、真菌、酵母、原生动物、病毒、昆虫病原线虫、植物提取物、蛋白质、次级代谢物、和接种剂。

在另一个实施例中，组合物包含真菌昆虫病原体和一种或多种选自由以下组成的组的农用化学活性化合物：杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、和杀线虫剂。在一个实施例中，所述杀真菌剂包含选自由以下组成的组的杀真菌剂组合物：嘧菌酯、噻菌灵、咯菌腈、甲霜灵、戊唑醇、丙硫菌唑、种菌唑、戊苯吡菌胺、和氟唑环菌胺。在另一个实施例中，组合物包含真菌昆虫病原体，其中所述真菌昆虫病原体对杀真菌剂有抗性。在另一个实施例中，组合物包含真菌昆虫病原体，其中所述真菌昆虫病原体在杀真菌剂的存在下保留杀昆虫活性。在还另一个实施例中，所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：安全剂、脂质几丁寡糖、异黄酮、和利阿诺定受体调节剂。

在另一个实施例中，本文公开的组合物还包含至少一个种子、植物或植物部分。在一个实施例中，所述种子、植物、或植物部分是遗传修饰的或转基因种子、植物或植物部分。在再一个实施例中，所述遗传修饰的或转基因种子、植物、或植物部分包含衍生自植物、细菌、非Bt细菌、古细菌(archea)、昆虫、或动物的杀昆虫性状。在一些实施例中，所述杀昆虫性状包含鞘翅目杀昆虫性状。在一些实施例中，杀昆虫性状可以包括Bt性状、非Bt性状、和/或RNAi性状。在一些实施例中，本文公开的组合物作为种子包衣施用、沿犁沟施用、或作为叶面施用。

在一个实施例中，公开的组合物控制一种或多种植物病原体、有害生物、或昆虫，或抑制一种或多种植物病原体、有害生物或昆虫(包括，但不限于：细菌、真菌、病毒、原生动物、线虫或节肢动物)的生长。在一个实施例中，本文公开的组合物控制或抑制昆虫(包括，但不限于：鞘翅目、半翅目、或鳞翅目昆虫)的生长。在还另一个实施例中，本文公开的组合物控制或抑制玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)的生长。

在另一个实施例中，本文公开的组合物是提供对细菌、植物、植物细胞、组织和种子有杀有害生物活性的有效量。在另一个实施例中，所述组合物是提供对鞘翅目或鳞翅目昆虫有杀有害生物活性的有效量。在还另一个实施例中，所述组合物是提供对玉米根萤叶甲有杀有害生物活性的有效量。

在另一个实施例中，本文公开的组合物是处于改进植物性能(包括但不限于增加的根形成、增加的根群、增加的根功能、增加的苗高、增加的苗功能、增加的花芽存在(flower bud presence)、增加的花芽形成、增加的种子萌发、增加的产量、增加的总植物湿重、和增加的总植物干重)的有效量。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，所述方法包括施用组合物，所述组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的昆虫病原真菌菌株：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、金龟子绿僵菌3213-1、或其任何组合。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，所述方法包括以有效量(所述有效量实现选自由以下组成的组的效果：抑制植物病原体、有害生物、或昆虫，或防止病原体、有害生物、或昆虫对植物的损伤，改进植物性能，改进植物产量，改进植物活力，增加磷酸盐可用性，增加植物激素的生产，增加根形成，增加植物的苗高，增加植物的叶长，增加植物的花芽形成，增加总植物鲜重，增加总植物干重，和增加种子萌发)将组合物(所述组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的昆虫病原真菌菌株：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、金龟子绿僵菌3213-1、或其任何组合)施用于种子、植物、植物部分或土壤。

在又另一个实施例中，本公开涉及一种方法，所述方法包括以有效量(所述有效量实现选自由以下组成的组的效果：抑制植物病原体、有害生物、或昆虫，或防止病原体、有害生物、或昆虫对植物的损伤，改进植物性能，改进植物产量，改进植物活力，增加磷酸盐可用性，增加植物激素的生产，增加根形成，增加植物的苗高，增加植物的叶长，增加植物的花芽形成，增加总植物鲜重，增加总植物干重，和增加种子萌发)将组合物(所述组合物包含至少两种选自由以下组成的组的昆虫病原真菌菌株：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、金龟子绿僵菌3213-1、或其任何组合)施用于种子、植物、植物部分或土壤。

在另一个实施例中，本文公开的方法还包括施用组合物，所述组合物还包含生物控制剂，其中所述生物控制剂选自由以下组成的组：细菌、真菌、酵母、原生动物、病毒、昆虫病原线虫、植物提取物、蛋白质、次级代谢物、和接种剂。

在又另一个实施例中，本文公开的方法还包括施用组合物，所述组合物还包含至少两种选自由以下组成的组的菌株：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、金龟子绿僵菌3213-1及其组合。

在又另一个实施例中，本文公开的方法还包括施用组合物，所述组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的农用化学活性化合物：杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、和杀线虫剂。在一个实施例中，所述杀真菌剂包含选自由以下组成的组的杀真菌剂组合物：嘧菌酯、噻菌灵、咯菌腈、甲霜灵、戊唑醇、丙硫菌唑、种菌唑、戊苯吡菌胺、氟唑环菌胺。在另一个实施例中，组合物包含真菌昆虫病原体，其中所述真菌昆虫病原体对杀真菌剂有抗性。在另一个实施例中，组合物包含真菌昆虫病原体，其中所述真菌昆虫病原体在杀真菌剂的存在下保留杀昆虫活性。

在还另一个实施例中，本文公开的方法还包括施用组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：安全剂、脂质几丁寡糖、异黄酮和利阿诺定受体调节剂。

在另一个实施例中，本文公开的方法还包括以有效量施用所述组合物，所述有效量抑制植物病原体(包括但不限于细菌、真菌、线虫、昆虫、病毒、和原生动物)的生长。

在另一个实施例中，本文公开的方法还包括以提供对细菌、植物、植物细胞、组织和种子有杀有害生物活性的有效量来施用所述组合物。在另一个实施例中，所述组合物是提供对鞘翅目、半翅目或鳞翅目昆虫有杀有害生物活性的有效量。在还另一个实施例中，所述组合物是提供对玉米根萤叶甲有杀有害生物活性的有效量。

在另一个实施例中，本文公开的方法涉及增加遗传修饰的或转基因种子、植物部分、或植物的鞘翅目杀昆虫性状对植物病原体、有害生物、或昆虫的耐久性，所述方法包括用组合物接种遗传修饰的或转基因种子、植物部分、或植物，所述组合物包含选自由以下组成的组的真菌昆虫病原体：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、和金龟子绿僵菌3213-1，其中所述遗传修饰的或转基因种子、植物部分或植物包含鞘翅目杀昆虫性状。

附图说明

图1.在昆虫压力下液体施用或顺序施用15013-1、23013-3、和3213-1菌株制剂的实地调查CRWNIS结果。

具体实施方式

本发明的实施例并不受公开的示例性方法和材料的限制，并且与所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实施例的实践或测试。数值范围包括限定范围的数值在内。

提供的标题并不是对本发明的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过将本说明书来参考而得到。

术语的其他定义可在整个本说明书中出现。应该理解，本发明的实施例不限于所述的具体实施例，并且另外的实施例可以变化。还应当理解，在此使用的术语仅是为了描述实施例，并且不旨在进行限制，因为本发明的实施例的范围将仅由所附权利要求书及其等效物限制。

所用的冠词“一个”和“一种”指一个(种)或多于一个(种)(即，指至少一个(种))所述冠词的语法对象。例如，“一个要素”意指一个或多个要素。

如本文所使用的，“施用”是指将菌株和/或组合物引入病原体、有害生物、或昆虫抑制的环境或改进植物性能的动作。

如本文所使用的，术语“农用化学活性化合物”是指是或可以惯用于处理植物的任何物质，包括但不限于：杀真菌剂、杀细菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、灭螺剂、安全剂、植物生长调节剂、和植物营养物、以及微生物。本文公开的组合物可以包含杀真菌剂，所述杀真菌剂可以包括但不限于：呼吸抑制剂，例如嘧菌酯，其靶向线粒体电子传递的复合体III；微管蛋白抑制剂，例如噻菌灵，其结合β-微管蛋白；渗透胁迫相关的激酶抑制剂咯菌腈；卵菌(一组真菌样生物)的RNA聚合酶抑制剂，例如甲霜灵；甾醇生物合成的抑制剂，其包括甾醇生物合成途径的C-14去甲基化酶的抑制剂(通常称为去甲基化酶抑制剂或DMI)，例如戊唑醇、丙硫菌唑、和种菌唑；呼吸抑制剂，其靶向复合体II线粒体电子传递，例如戊苯吡菌胺；呼吸抑制剂，其靶向复合体II线粒体电子传递，例如氟唑环菌胺。可以在frac.info/docs/default-source/publications/frac-code-list/frac-code-list-2016.pdf？sfvrsn＝2(可通过使用“www”前缀在万维网上访问；参见Hirooka和Ishii(2013)，Journalof General Plant Pathology[普通植物病理学杂志])找到具有不同或相似作用模式的其他类别的杀真菌剂。杀真菌剂可以包含如本文所述的不同类别的杀真菌剂的全部或任何的组合。在某些实施例中，本文公开的组合物包含嘧菌酯、噻菌灵、咯菌腈、和甲霜灵。在另一个实施例中，本文公开的组合物包含戊唑醇。在另一个实施例中，本文公开的组合物包含丙硫菌唑，甲霜灵、和戊苯吡菌胺。在另一个实施例中，本文公开的组合物包含种菌唑和甲霜灵。在另一个实施例中，本文公开的组合物包含氟唑环菌胺。如本文所使用的，组合物可以是液体、非均匀混合物、均匀混合物、粉末、溶液、分散体或其任何组合。

如本文所使用的，“有效量”是指足以抑制致病性微生物的生长或足以阻碍致病性微生物的生长速率的昆虫病原真菌菌株或昆虫病原真菌组合物的量。在另一个实施例中，术语“有效量”是指足以改进植物性能的昆虫病原真菌菌株或昆虫病原真菌组合物的量。在另一个实施例中，术语“有效量”是指足以控制、杀死、抑制、和降低病原体、有害生物、或昆虫昆虫病原真菌菌株或昆虫病原真菌组合物的数量、出现、或生长的量。在另一个实施例中，术语“有效量”是指足以防止来自病原体、有害生物、或昆虫的损伤的昆虫病原真菌菌株或昆虫病原真菌组合物的量。本领域的技术人员将认识到昆虫病原真菌菌株或昆虫病原真菌组合物的有效量不降低病原体、有害生物或昆虫的数量，但是有效降低由于病原体、有害生物或昆虫导致的对植物和/或植物部分的损伤。例如，杀有害生物有效量可以降低病原体、有害生物或昆虫出现，或与那些未经处理的相比，降低对经处理的植物的种子、根、苗、或叶子的损伤。

如本文所使用的，术语“昆虫病原真菌菌株”或“昆虫病原真菌组合物”包括但不限于分生孢子、孢子、菌丝体、微菌核、和/或真菌昆虫病原体的任何其他生命周期阶段。

如本文所使用的，术语“抑制”是指当与未经处理的对照中的病原体、有害生物、或昆虫的生长或存活相比，破坏、防止、降低、抵抗、控制、减少、减慢或以其他方式干扰病原体、有害生物、或昆虫的生长或存活。抑制、破坏、防止、控制、减少、减慢、干扰、抵抗、或降低的术语的任何可互换使用。在一个实施例中，“抑制”是当与未经处理的对照中的病原体、有害生物、或昆虫的生长或存活相比，将病原体、有害生物、或昆虫的生长、出现、或存活破坏、防止、控制、降低、抵抗、减少、减慢或以其他方式干扰至少约3％到至少约100％、或例如至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或100％之间的任何值。抑制量可以如本文所述或通过本领域已知的其他方法测量。如本文所使用的，“保护植物免受病原体、有害生物、或昆虫有害生物的侵害”旨在意指通过例如抑制病原体、有害生物、或昆虫生长、出现、摄食、和/或繁殖或通过杀死病原体、有害生物、或昆虫来限制或消除病原体、有害生物、或昆虫对植物和/或植物部分的相关的损伤的能力。如本文所使用的，杀有害生物和/或杀昆虫活性是指保护植物和/或植物部分免受病原体、有害生物、或昆虫侵害的化合物、组合物和/或方法的活性。

在本发明的实施例中，在将本文公开的昆虫病原真菌菌株或昆虫病原真菌组合物施用于主体材料后，病原体、有害生物、或昆虫的抑制持续或提供保护大于一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月或更长时间。在另一个实施例中，病原体、有害生物或昆虫的抑制持续从一至七天、从七至14天、从14至21天、或从21至30天或更长时间。在另一个实施例中，病原体、有害生物、或昆虫的生长的抑制持续或提供保护大于从施用于病原体、有害生物、或昆虫的成虫出现的时间。

如本文所使用的，术语“遗传修饰的”旨在意指含有在操作之前在物种或菌株中未发现的遗传性状、基因座、或序列的任何物种。遗传修饰的植物可以是转基因、同源转基因(cis-genic)、基因组编辑、或育种以含有新的遗传性状、基因座、或序列。可以通过本领域技术人员已知的手段(例如通过轰击、通过Cas/CRISPR或TALENS系统或通过育种技术进行转化)来制备遗传修饰的植物。如本文所使用的，“性状”是遗传修饰的植物(包括但不限于转基因植物)的新的或修饰的基因座或序列。性状可以为遗传修饰的植物提供对除草剂或昆虫的抗性。如本文所使用的，“转基因”植物、植物部分、或种子是指含有允许天然存在于植物中的多核苷酸或多肽的表达的至少一个异源基因的植物、植物部分、或种子。

如本文所使用的，术语“植物或植物部分的环境”旨在意指植物或植物部分周围的区域，包括但不限于土壤、空气或沿犁沟。植物或植物部分的环境可以与所述植物或植物部分接近、接触、邻近或在相同的田地中。本文所述的组合物可以作为种子处理、作为叶面施用、作为颗粒施用、作为土壤施用、或作为包封施用来被施用于植物或植物部分的环境中。如本文所使用的，“沿犁沟”旨在意指种植种子的区域内或附近。本文公开的组合物可以沿犁沟与种子同时(concurrently或simultaneously)施用。在另一个实施例中，本文公开的组合物可以在种植种子之前或之后顺序地施用。

如本文所使用的，术语“不同作用方式”用于指杀有害生物组合物通过不同于其他杀有害生物组合物的途径或受体来控制病原体、有害生物、或昆虫。如本文所使用的，术语“不同作用方式”包括一种或多种杀有害生物组合物对在昆虫的肠膜中的不同结合位点(即，不同毒素受体和/或在相同毒素受体上的不同位点)或通过RNA干扰途径对不同靶基因的杀有害生物效果。

如本文所使用的，术语“病原体、有害生物、或昆虫”包括但不限于：致病性真菌、细菌、螨类、蜱、致病性微生物、和线虫、以及来自以下目的昆虫：鞘翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、Siphonatpera、毛翅目、和其他(包括但不限于玉米根萤叶甲、斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)、南美叶甲(Diabrotica speciosa)和北方玉米根虫(Diabrotica barberi)。

本发明的实施例在抑制鞘翅目的幼虫和成虫方面是有用的，这些鞘翅目的幼虫和成虫来自长角象虫科、豆象科和象甲科(包括，但不限于：墨西哥棉铃象(Anthonomusgrandis Boheman)(棉铃象甲(boll weevil))；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilusKuschel)(稻水象虫(rice water weevil))；谷象(Sitophilus granarius Linnaeus)(谷象(granary weevil))；米象(S.oryzae Linnaeus)(米象(rice weevil))；三叶草叶象(Hypera punctata Fabricius)(车轴草叶象虫(clover leaf weevil))；密点细枝象(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stem weevil))；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红葵花籽象甲(red sunflewer seedweevil))；灰色小爪象(S.sordidus LeConte)(灰葵花籽象甲(gray sunflower seedweevil))；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis Chittenden)(玉米象虫(maizebillbug)))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫(包括但不限于：马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(马铃薯甲虫(Coloradopotato beetle))；玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)(西方玉米根虫)；北方玉米根虫(D.barberi Smith and Lawrence)(北方玉米根虫(northern cornrootworm))；黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southern com rootworm))；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer)(玉米跳甲(corn flea beetle))；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)(十字花科蔬菜跳甲(Crueifer flea beetle))；黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)(黄曲条跳甲(stripped flea beetle))；肖叶甲褐斑(Colaspis brunnea Fabricius)(葡萄肖叶甲(grape colaspis))；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(谷叶甲虫(cereal leafbeetle))；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)(向日葵叶甲(sunflowerbeetle)))；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachnavarivestis Mulsant)(墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle)))；金龟子和来自金龟子科(Scarabaeidae)的其他甲虫(包括但不限于：日本丽金龟(Popillia japomca Newman)(日本金龟子(Japanese beetle))；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis Arrow)(北方独角仙(northern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆头犀金龟(C.immaculataOlivier)(南方独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)(欧洲金龟子(European chafer))；长毛食叶然金龟(Phyllophaga crinita Burmeister)(白蛴螬(white grub))；胡萝卜金龟(Ligyrusgibbosus DeGeer)(胡萝卜金龟(carrot beetle)))；来自皮蠹科的红缘皮蠹(carpetbeetle)；来自叩甲科，伪金针虫属物种，梳爪叩头虫属物种的金针虫；宽胸叩头虫属物种；叩甲属(Limonius)物种；缺隆叩甲属物种；特尼塞拉属(Ctenicera)物种；Aeolus属物种；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫和来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫。

用于测量杀有害生物活性的方法是本领域中所熟知的。参见，例如，Czapla和Lang，(1990)，J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]，83：2480-2485；Andrews等人，(1988)，Biochem.J.[生物化学杂志]，252：199-206；Marrone等人，(1985)，J.of EconomicEntomology[经济昆虫学杂志]，78：290-293以及美国专利号5,743,477，将它们全部通过引用以其全文结合在此。总体上，在摄食测定中混合并使用了杀有害生物剂。参见，例如，Marrone等人，(1985)，J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]，78：290-293。此类测定可以包括将植物与一种或多种有害生物接触，并且确定所述植物存活和/或造成这些有害生物死亡的能力。

如本文所使用的，术语“植物”是指全部植物、植物部分、和植物群体，例如希望的和不希望的野生植物、栽培种、转基因植物、和植物品种(不论是否受植物变种或植物育种人员权利的保护)。栽培种和植物品种是可以是通过常规繁殖和育种方法(可以通过一种或多种生物技术方法(例如通过使用双单倍体、原生质体融合、随机和定向诱变、分子或遗传标记或通过生物工程和基因工程方法)辅助或补充)获得的植物。

本发明的实施例通常可以用于任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括但不限于玉米(玉蜀黍)，芸苔属(例如，甘蓝型油菜、芜菁、芥菜)(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))，稻(rice，Oryza sativa)，黑麦(rye，Secale cereale)，高粱(甜高粱(Sorghum bicolor)，高粱(Sorghum vulgare))，粟(例如，珍珠粟(御谷(Pennisetum glaucum))，黍(粟米(Panicummiliaceum))，粟(谷子(Setaria italica))，穇子(龙爪稷(Eleusine coracana)))，向日葵(sunflower，Helianthus annuus)，红花(safflower，Carthamus tinctorius)，小麦(wheat，Triticum aestivum)，大豆(soybean，Glycine max)，烟草(tobacco，Nicotianatabacum)，马铃薯(potato，Solanum tuberosum)，花生(peanut，Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))，甘薯(番薯(Ipomoeabatatas))，木薯(cassava，Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属(Coffea spp.))，椰子(coconut，Cocos nucifera)，菠萝(pineapple，Ananas comosus)，柑橘树(柑橘属(Citrusspp.))，可可(cocoa，Theobroma cacao)，茶树(tea，Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉属(Musa spp.))，鳄梨(avocado，Persea americana)，无花果(fig或(Ficus casica))，番石榴(guava，Psidium guajava)，芒果(mango，Mangifera indica)，橄榄(olive，Oleaeuropaea)，木瓜(番木瓜(Carica papaya))，腰果(cashew，Anacardium occidentale)，澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)，巴旦杏(almond，Prunus amygdalus)，甜菜(sugar beets，Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属(Saccharum spp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。

如本文所使用的，术语“植物部分”是指植物的所有地上和地下部分和器官，例如苗、叶，花和根，由此例如包括叶子、针、茎、枝、花、子实体、果实和种子、以及根、块茎、球茎和根茎。作物和营养繁殖和有性繁殖材料，例如插条、球茎、根茎、块茎、匍匐茎和种子也是植物部分。

如本文所使用的，术语“孢子”包括但不限于分生孢子、孢子、菌丝体、微菌核、和/或真菌昆虫病原体的任何其他生命周期阶段。“气生分生孢子”(AC)是指由琼脂培养基表面上的无性发育循环或适当组合物的其他固体基质形成的分生孢子。如本文所使用的，术语“浸没的孢子”是指在液体培养中发育的浸没的分生孢子和/或芽生孢子。

如本文所使用的，术语“活的”是指具有代谢活性或能够分化的微生物细胞、繁殖体或孢子。因此，繁殖体(例如孢子)在休眠并且能发芽时是“活的”。

使用微生物剂(如真菌、细菌或其他昆虫物种)对具有农业意义的昆虫有害生物进行生物控制，为合成化学杀有害生物剂提供环境友好且商业上有吸引力的替代品。一般来说，使用生物杀有害生物剂造成污染和环境危害的风险较低，并且生物杀有害生物剂提供比传统广谱化学杀昆虫剂所特有的靶特异性更强。此外，生物杀有害生物剂往往生产成本较低，并且因此能提高各种作物的经济产量。

已知芽孢杆菌属微生物的某些物种对一系列昆虫有害生物具有杀有害生物活性，所述一系列昆虫有害生物包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目等。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)和日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)是迄今发现的最成功的生物控制剂之一。昆虫致病性还归因于幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的菌株。微生物杀昆虫剂，特别是从芽孢杆菌属菌株获得的那些微生物杀昆虫剂，在农业上作为有害生物化学控制的替代方案起着重要作用。

通过将作物植物进行遗传工程改造以生产来自芽孢杆菌属(Bacillus)的杀有害生物蛋白，已经开发出昆虫抗性增强的作物植物。例如，已经对玉米和棉花植物进行基因工程化以产生从Bt(本文称为“Bt性状”)菌株分离和/或工程化的杀有害生物蛋白质。现在，这些遗传修饰的作物广泛应用于农业中，并且为农民提供了取代传统昆虫控制方法的环境友好型替代方案。虽然它们已被证明在商业上非常成功，但是这些遗传修饰的抗昆虫作物植物仅针对窄范围的经济上重要的昆虫有害生物提供抗性。在某些情况下，昆虫可以对不同杀昆虫化合物产生抗性，这就导致需要鉴别用于有害生物控制的替代性生物控制剂。

本发明的实施例涉及昆虫病原真菌菌株、昆虫病原真菌组合物和使用这些菌株和组合物的方法。在一个实施例中，昆虫病原菌株具有杀昆虫活性，并且可以用于抑制、控制、或杀死病原体、有害生物、或昆虫，包括但不限于：真菌、致病性真菌、细菌、螨类、蜱、致病性微生物、和线虫，以及来自鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、Siphonaptera、毛翅目等(特别是鞘翅目)的昆虫，包括但不限于玉米根萤叶甲、斑点黄瓜甲虫、和北方玉米根虫，以及用于生产具有杀有害生物活性的组合物。

在一个实施例中，所述一个或多个昆虫病原真菌菌株选自由以下组成的组：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、金龟子绿僵菌3213-1、及其组合。

金龟子绿僵菌15013-1(NRRL 67073)于2015年6月19日保藏于农业研究服务培养物保藏中心(NRRL)(伊利诺斯州61604皮奥瑞亚市北大学街1815号(1815North UniversityStreet，Peoria，Ill.，61604))，并给出登录号为NRRL 67073。这些保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的规定进行的。

罗伯茨绿僵菌23013-3(NRRL 67075)于2015年6月19日保藏于农业研究服务培养物保藏中心(NRRL)(伊利诺斯州61604皮奥瑞亚市北大学街1815号(1815North UniversityStreet，Peoria，Ill.，61604))，并给出登录号为NRRL 67075。这些保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的规定进行的。

金龟子绿僵菌3213-1(NRRL 67074)于2015年6月19日保藏于农业研究服务培养物保藏中心(NRRL)(伊利诺斯州61604皮奥瑞亚市北大学街1815号(1815North UniversityStreet，Peoria，Ill.，61604))，并给出登录号为NRRL 67074。这些保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的规定进行的。

在实施例中，公开了在液体发酵中产生真菌昆虫病原体产物的方法。在实施例中，方法由以下组成：首先在琼脂培养基上产生真菌昆虫病原体的气生分生孢子，然后将这些气生分生孢子接种到液体培养基中以产生真菌昆虫病原体产物。在另一个实施例中，方法由以下组成：首先在固体基质(所述固体基质包括但不限于琼脂培养基或具有适当组合物的其他固体培养基)上产生真菌昆虫病原体的气生分生孢子，然后将这些气生分生孢子接种到液体培养基中以产生真菌昆虫病原体种子培养物，接着通过将所述真菌昆虫病原体种子培养物接种到液体培养基中以产生真菌昆虫病原体产物。在另一个实施例中，第一真菌昆虫病原体种子培养物可用于产生第二真菌昆虫病原体种子培养物，其中所述第二种子培养物用于接种到液体培养基中以产生真菌昆虫病原体产物。用于生产真菌昆虫病原体产物的液体培养基可含有矿物质、维生素、碳源和复合氮源。在另一个实施例中，氮源是包含碳但不是碳源的复合源。在实施例中，公开了一种产生真菌昆虫病原体产物(包含孢子、营养菌丝体、浸没的孢子、和/或微菌核)的方法。在实施例中，组合物包含来自液体发酵的真菌昆虫病原体的发酵产物。发酵产物可以被真空干燥、喷雾干燥或流化床干燥以用于控制植物病原体、有害生物或昆虫。

在实施例中，公开了一种在液体发酵中生产真菌昆虫病原体产物的方法，其中所述液体发酵包含含有矿物质、维生素、碳源和氮源的液体培养基。在实施例中，公开了一种使用碳源和氮源在液体培养物中产生真菌昆虫病原体的方法。在另一个实施例中，公开了一种使用两种碳源和一种氮源在液体培养物中产生真菌昆虫病原体的方法。在另一个实施例中，公开了一种使用两种或更多种碳源和一种氮源在液体培养物中产生真菌昆虫病原体的方法。在实施例中，碳源是葡萄糖。在另一个实施例中，碳源包含果糖、半乳糖、山梨糖醇、山梨糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖糊精、核糖或木糖分子及其组合。在另一个实施例中，第一碳源处于极限浓度。在再一个实施例中，第二碳源产生改变真菌昆虫病原体的生理状态的非最佳或胁迫条件。在另一个实施例中，公开了一种使用碳源、第一氮源和第二氮源在液体培养物中产生真菌昆虫病原体的方法，其中所述第一氮源处于极限浓度。

在另一个实施例中，公开了一种使用碳源和氮源在液体培养物中产生真菌昆虫病原体并控制发酵参数的方法，其中控制发酵参数产生改变真菌昆虫病原体的生理状态的非最佳或胁迫条件。在实施例中，发酵参数可以包括pH水平、二氧化碳排出速率、溶解氧百分比、搅动曲线、糖摄食速率或可以产生非最佳或胁迫条件导致真菌昆虫病原体的生理状态改变的真菌昆虫病原体发酵的任何其他测量参数。对真菌昆虫病原体施加胁迫或非最佳条件，可能会导致发生生理变化(转变为无性周期)(参见Steyaert等人(2010)，Microbiol.[微生物学]和Gao等人(2007)Mycol.Res[真菌研究])。在另一个实施例中，公开了一种使用至少两种碳源和一种氮源在液体培养物中产生真菌昆虫病原体并控制发酵参数的方法，其中控制发酵参数产生导致真菌昆虫病原体的生理状态的改变的非最佳或胁迫条件。在实施例中，获得真菌昆虫病原体的气生分生孢子包含首先在琼脂培养基或固体培养基上产生真菌昆虫病原体的气中分生孢子(Dorta和Arcas(1998)，Enzyme Microb.Technol.[酶微生物技术])。

在实施例中，用于生产真菌昆虫病原产物的方法包括用作液体培养物或液体发酵的接种物的气生分分生孢子(AC)的产生。这类方法包括但不限于通过在大马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)板或VM板上接种真菌昆虫病原体菌株并在28℃孵育约2至3周来产生AC；用0.05％Tween 80的溶液铺板；并通过轻轻刮擦板培养物的表面将AC悬浮在溶液中。在实施例中，AC悬浮液可以被过滤，并且AC被合并到高浓度。在再一个实施例中，可以使用血细胞计数器、将AC离心、并且使用在0.05％Tween 80中的15％甘油的溶液重新悬浮AC粒料来测定AC浓度。在另一个实施例中，气生分生孢子也可以通过固态发酵获得(Dorta和Arcas(1998)，Enzyme Microb.Technol.[酶与微生物技术])。

在实施例中，在液体培养物中产生真菌昆虫病原体产物可以包含摇瓶发酵规模为50mL、2L台式发酵规模为1L、生物反应器发酵规模为10L、或发酵规模高达600,000L的培养基体积。用于种子或生产培养物的培养基可以包含如表1、表2和表3所示的组分。在摇瓶培养基中可以直接用最终浓度约为5x 10⁶AC/mL的气生分生孢子(AC)接种。在台式或生物反应器规模下，培养基可分别使用约40mL或400mL的种子培养物的种子培养物进行接种。可以生产种子培养物来累积(build up)用于生产培养物的生物质。种子培养物可以通过在约28℃将培养物进一步孵育约从1至7天并且以从约100rpm至300rpm的搅拌来产生。在添加接种物后，可以将生产培养物在摇瓶规模下以约300rpm在轨道摇床中在约16℃至32℃孵育从约4至7天；在台式规模上以约500rpm至1200rpm搅拌；或搅拌速度相当于生物反应器规模的台式叶轮端速。在某些实施例中，可以添加水以降低发酵期间肉汤的粘度。发酵罐中的压力可以设定为约0.5巴至1巴。在某些实施例中，在初始葡萄糖和果糖溶液耗尽后可以喂食50％(w/w)的果糖溶液。在某些实施例中，种子或生产培养物可能没有pH对照、具有单面(仅添加碱)pH对照、或具有双面(添加碱和酸)pH对照。在发酵过程中和/或发酵结束时，可以记录多种参数，例如但不限于微菌核(MS)产量、浸没的孢子(SS)产量、以每千克肉汤的干细胞重量的克数表示的生物量累积(DCW)、碳排出速率(CER)、氧气吸收速率(OUR)、溶解氧(DO)、氨浓度、pH值、摄食速率、碳源含量和搅拌。

表1.存在于所有培养基中的维生素。

表2.存在于所有培养基中的基本盐。

表3.在不同液体培养基中的碳源和氮源。

*在一些情况下，大豆粉被其他氮源(例如但不限于棉籽粉、酵母提取物或酪蛋白氨基酸)替代；在一些情况下，碳(C)与氮(N)的比例为30∶1或50∶1。

在某些实施例中，从液体培养物回收和配制真菌昆虫病原体(绿僵菌属物种)产物包括冷却和收获发酵液。可用约1倍至2倍体积的发酵液冲洗发酵罐，并将稀释的发酵液与纯净发酵液合并。可以用DE Admix来处理发酵液中稀释的昆虫病原真菌材料。经处理的发酵液可以通过布氏滤器过滤。滤饼可以立即处理、或者储存在冷室中直至处理。可以将湿滤饼打碎并在真空干燥器中干燥约48h至5天。可以研磨干燥的滤饼以产生最终的昆虫病原真菌干燥粉末产物。

一个实施例涉及一种组合物，所述组合物包含选自由以下组成的组的昆虫病原真菌菌株或由其组成或基本上由其组成：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、和金龟子绿僵菌3213-1。在另一个实施例中，所述组合物包含选自由以下组成的组的至少两种或更多种昆虫病原真菌菌株，由其组成或基本上由其组成：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、金龟子绿僵菌3213-1。在再一个实施例中，所述组合物包含选自由以下组成的组的昆虫病原真菌菌株、由其组成或基本上由其组成：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、和金龟子绿僵菌3213-1。在实施例中，组合物是金龟子绿僵菌15013-1，罗伯茨绿僵菌23013-3、和金龟子绿僵菌3213-1及其组合的生物纯的培养物。

本发明的一个实施例涉及一种组合物，所述组合物包含本文公开的昆虫病原真菌菌株和一种或多种选自由以下组成的组的化合物或试剂：农用化学活性化合物、生物控制剂、脂质几丁寡糖、化合物(LCO)、异黄酮、喹唑啉类、杀昆虫化合物、唑并嘧啶基胺(azolopyrimidinylamine)、聚合物、离子化合物、取代的噻吩、取代的二噻、氟吡菌酰胺、烯胺羰基化合物、独角金内酯化合物、和二硫代-四羧酰亚胺化合物及其组合。

再一个实施例涉及第一组合物和第二组合物的用途，所述第一组合物包含本文公开的昆虫病原真菌菌株并且所述第二组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的化合物或试剂：农用化学活性化合物、生物控制剂、脂质几丁寡糖、化合物(LCO)、异黄酮、喹唑啉类、杀昆虫化合物、唑并嘧啶基胺(azolopyrimidinylamine)、聚合物、离子化合物、取代的噻吩、取代的二噻、氟吡菌酰胺、烯胺羰基化合物、独角金内酯化合物、和二硫代-四羧酰亚胺化合物及其组合。

在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，所述组合物包含一种或多种本文公开的昆虫病原真菌菌株和一种或多种生物控制剂。如本文所使用的，术语“生物控制剂”(“BCA”)包括细菌、真菌或酵母，原生动物，病毒，昆虫病原线虫和植物提取物，或由微生物产生的产物(包括蛋白质或次级代谢产物)，以及具有以下特征中的一种或两种的接种剂(innoculant)：(1)抑制或减少病原体、有害生物或昆虫(包括但不限于致病性真菌、细菌和线虫)以及节肢动物有害生物(如昆虫、蜘蛛纲动物、蜈蚣、双足动物)的植物侵染和/或生长，或者抑制植物病原体、有害生物或昆虫的组合的植物侵染和/或生长；(2)改进植物性能；(3)改进植物产量；(4)改进植物活力；和(5)改进植物健康。

在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，所述组合物包含本文公开的昆虫病原真菌菌株和农用化学活性化合物。农用化学活性化合物是用于或可以用于处理或施用于种子、植物、植物部分、或所述种子或植物或植物部分的环境的物质，包括但不限于杀真菌剂、杀细菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、灭螺剂、安全剂、植物生长调节剂、植物营养物、具有已知作用机制的化学实体、另外的微生物、和生物控制剂。

在一个实施例中，本文公开的组合物包含一种或多种农用化学活性化合物，其中一个化合物是氯虫苯甲酰胺

在另一个实施例中，所述组合物包含一种或多种农用化学活性化合物，其中一个化合物是氰虫酰胺

在另一个实施例中，所述组合物包含氯虫苯甲酰胺和氰虫酰胺两者。

在实施例中，本文公开的第一和第二组合物可以同时施用于种子。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子，然后将第二组合物施用于所述种子。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子，然后将第一组合物施用于所述种子。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子，然后将第二组合物施用于植物。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子，然后将第一组合物施用于植物。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子，然后将第二组合物施用于植物部分。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子，然后将第一组合物施用于植物部分。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子，然后将第二组合物施用于种子的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子，然后将第一组合物施用于种子的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子，然后将第二组合物施用于植物的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子，然后将第一组合物施用于植物的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子，然后将第二组合物施用于植物部分的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子，然后将第一组合物施用于植物部分的环境。

在实施例中，本文公开的第一和第二组合物可以同时施用于植物。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物，然后将第二组合物施用于所述植物。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物，然后将第一组合物施用于所述植物。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物，然后将第二组合物施用于种子。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物，然后将第一组合物施用于种子。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物，然后将第二组合物施用于植物部分。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物，然后将第一组合物施用于植物部分。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物，然后将第二组合物施用于种子的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物，然后将第一组合物施用于种子的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物，然后将第二组合物施用于所述植物的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物，然后将第一组合物施用于所述植物的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物，然后将第二组合物施用于植物部分的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物，然后将第一组合物施用于植物部分的环境。

在实施例中，本文公开的第一和第二组合物可以同时施用于植物部分。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物部分，然后将第二组合物施用于植物部分。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物部分，然后将第一组合物施用于所述植物部分。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物部分，然后将第二组合物施用于种子。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物部分，然后将第一组合物施用于种子。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物部分，然后将第二组合物施用于植物。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物部分，然后将第一组合物施用于植物。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物部分，然后将第二组合物施用于种子的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物部分，然后将第一组合物施用于种子的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物部分，然后将第二组合物施用于植物的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物部分，然后将第一组合物施用于植物的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物部分，然后将第二组合物施用于所述植物部分的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物部分，然后将第一组合物施用于所述植物部分的环境。

在实施例中，本文公开的第一和第二组合物可以同时施用于种子的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子的环境，然后将第二组合物施用于所述种子的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子的环境，然后将第一组合物施用于所述种子的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子的环境，然后将第二组合物施用于种子。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子的环境，然后将第一组合物施用于种子。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子的环境，然后将第二组合物施用于植物。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子的环境，然后将第一组合物施用于植物。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子的环境，然后将第二组合物施用于植物部分。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子的环境，然后将第一组合物施用于植物部分。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子的环境，然后将第二组合物施用于植物的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子的环境，然后将第一组合物施用于植物的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于种子的环境，然后将第二组合物施用于植物部分的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于种子的环境，然后将第一组合物施用于植物部分的环境。

在实施例中，本文公开的第一和第二组合物可以同时施用于植物的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物的环境，然后将第二组合物施用于所述植物的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物的环境，然后将第一组合物施用于所述植物的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物的环境，然后将第二组合物施用于种子。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物的环境，然后将第一组合物施用于种子。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物的环境，然后将第二组合物施用于植物。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物的环境，然后将第一组合物施用于植物。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物的环境，然后将第二组合物施用于植物部分。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物的环境，然后将第一组合物施用于植物部分。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物的环境，然后将第二组合物施用于种子的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物的环境，然后将第一组合物施用于种子的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物的环境，然后将第二组合物施用于植物部分的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物的环境，然后将第一组合物施用于植物部分的环境。

在实施例中，本文公开的第一和第二组合物可以同时施用于植物部分的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物部分的环境，然后将第二组合物施用于所述植物部分的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物部分的环境，然后将第一组合物施用于所述植物部分的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物部分的环境，然后将第二组合物施用于种子。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物部分的环境，然后将第一组合物施用于种子。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物部分的环境，然后将第二组合物施用于植物。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物部分的环境，然后将第一组合物施用于植物。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物部分的环境，然后将第二组合物施用于种子的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物部分的环境，然后将第一组合物施用于种子的环境。在另一个实施例中，可以将第一组合物施用于植物部分的环境，然后将第二组合物施用于植物的环境。在又另一个实施例中，可以将第二组合物施用于植物部分的环境，然后将第一组合物施用于植物的环境。

在一个实施例中，本公开涉及具有包含杀昆虫蛋白质的组合物的本文公开的昆虫病原真菌菌株的用途，所述杀昆虫蛋白质来自假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)(例如PSEEN3174(Monalysin；(2011)PLoS Pathogens[公共科学图书馆：病原体]7：1-13)；来自假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf-5(以前称为荧光菌(fluorescens))(Pechy-Tarr，(2008)Environmental Microbiology[环境微生物学]10：2368-2386；GenBank登录号EU400157)；来自台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)(Liu等人，(2010)J.Agric.Food Chem.[农业食品化学学报]58：12343-12349)和来自假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(Zhang等人，(2009)Annals of Microbiology[微生物学年报]59：45-50和Li等人，(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.[植物细胞组织和器官培养]89：159-168)；来自发光杆菌属和致病杆菌属的杀昆虫蛋白(Hinchliffe等人，(2010)The Open Toxicology Journal[开放性毒理学杂志]3：101-118和Morgan等人，(2001)Applied and Envir.Micro.[应用与环境微生物学]67：2062-2069)，美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946；美国专利公开号US 20140007292的PIP-1多肽；美国专利公开号US 20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国序列号13/839702的PHI-4多肽；PCT序列号PCT/US 14/51063的PIP-47多肽；PCT序列号的PIP-72多肽；PCT公开号WO 2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽；PCT公开号WO2015/120276的PtIP-83多肽；PCT序列号PCT/US 15/55502的PtIP-96多肽；PCT/US 14/55128以及δ-内毒素，包括但不限于Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry51和Cry55类的δ-内毒素基因和苏云金芽孢杆菌溶细胞Cyt1和Cyt2基因。其他Cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见Crickmore等人，“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员所熟知的(回顾参见vanFrannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101：1-16)。使用Cry蛋白作为转基因植物性状是本领域技术人员所熟知的，并且Cry转基因植物(包括但不限于Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt)已获得监管部门的批准(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal[植物生物技术杂志]9：283-300和CERA(2010)转基因作物数据库环境风险评估中心(CERA)(GM Crop Database Centerfor Environmental Risk Assessment)，ILSI研究基金会，华盛顿特区，网址为cera-gme.org/index.php？action＝gm_crop_database，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。如本文所使用的，“非Bt性状”是指除了任何苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurengiensis)菌株以外，从天然存在的细菌、植物或动物衍生或修饰的植物中的任何杀昆虫基因或性状。非Bt性状包括但不限于RNAi或dsRNA性状、假单胞菌(Psuedomonas)衍生的性状、或植物衍生的性状。

在一个实施例中，本公开涉及具有RNAi性状的本文公开的昆虫病原真菌菌株的用途，所述性状包含一种或多种目的多核苷酸的沉默构建体，从而抑制一种或多种靶病原体、有害生物、或昆虫多肽。“沉默元件”旨在意指当被有害生物接触或摄取时能够降低或消除靶标多核苷酸或其编码的多肽的水平或表达的多核苷酸。所采用的沉默元件能够通过影响靶RNA转录物的水平或者通过影响翻译并从而影响所编码多肽的水平来降低或消除靶序列的表达水平。沉默元件可以包括但不限于：正义抑制元件、反义抑制元件、双链RNA、siRNA、amiRNA、miRNA、或发夹抑制元件。

在另一个实施例中，本公开涉及具有包含核酸分子的组合物的本文公开的昆虫病原真菌菌株的用途，所述核酸分子包括用于靶向液泡ATP酶H亚基的沉默元件，可用于控制鞘翅目有害生物群体和侵染，如美国专利申请公开2012/0198586所述。PCT公开WO 2012/055982描述了抑制或下调如下靶基因的表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)，所述靶基因编码：昆虫核糖体蛋白，如核糖体蛋白L19、核糖体蛋白L40或核糖体蛋白S27A；昆虫蛋白酶体亚基，如Rpn6蛋白，Pros 25，Rpn2蛋白，蛋白酶体β1亚基蛋白或Pros β2蛋白；COPI囊泡的昆虫β-外被体，COPI囊泡的γ-外被体，COPI囊泡的β′-外被体蛋白或ζ-外被体；昆虫四跨膜蛋白2A蛋白，其是假定跨膜结构域蛋白；属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白，如肌动蛋白5C；昆虫泛素-5E蛋白；昆虫Sec23蛋白(参与细胞内蛋白质运输的GTP酶激活子)；涉及运动活性的作为非常规肌球蛋白的昆虫皱纹蛋白质；涉及核替代mRNA剪接调节的昆虫曲颈蛋白；昆虫液泡H+-ATP酶G亚基蛋白和昆虫Tbp-1如Tat结合蛋白。PCT公开WO 2007/035650描述了抑制或下调编码Snf7的靶基因表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)。美国专利申请公开2011/0054007描述了靶向RPS10的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2014/0275208和US2015/0257389描述了靶向RyanR和PAT3的多核苷酸沉默元件。PCT公开WO 2016/060911、WO 2016/060912、WO 2016/060913、和WO 2016/060914描述了靶向赋予对鞘翅目和半翅目有害生物的抗性的COPI外被体亚单位核酸分子的多核苷酸沉默元件。国际申请号PCT/US 2016/037748描述了靶向控制鞘翅目昆虫有害生物的VgR、MAEL、NCLB、和BOULE的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2012/029750、US 20120297501和2012/0322660描述了干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，所述干扰核糖核酸在被昆虫有害生物物种摄取时起作用以下调所述昆虫有害生物中靶基因的表达，其中所述RNA包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件是包含经退火的互补链的双链RNA区域，所述双链RNA区域的一条链包含或由如下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列至少部分地与靶基因中的靶标核苷酸序列互补。美国专利申请公开2012/0164205描述了用于干扰双链核糖核酸(用于抑制无脊椎动物有害生物)的潜在靶标，包括：Chd3同源序列、β-微管蛋白同源序列、40kDa V-ATP酶同源序列、EF1α同源序列、26S蛋白质体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物酶水解酶同源序列、溶胀依赖氯通道蛋白同源序列、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白同源序列、Act42A蛋白同源序列、ADP-核糖因子1同源序列、转录因子IIB蛋白同源序列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列、泛素B同源序列、保幼激素酯酶同源物、和α微管蛋白同源序列。

本申请的一个实施例包含另外的组分，其可以是载体、助剂、增溶剂、悬浮剂、稀释剂、除氧剂、抗氧化剂、食品材料、抗污染剂或其组合。

在另一个实施例中，对将要使用菌株或组合物的施用可能需要所述一种或多种另外的组分。例如，如果菌株或组合物将用于农产品上或其中，那么所述一种或多种另外的组分可以是农业上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。同样，如果菌株或组合物将用于食品上或其中，那么所述一种或多种另外的组分可以是可食用载体、赋形剂或稀释剂。

在一方面，所述一种或多种另外的组分是载体、赋形剂、或稀释剂。

“载体”或“运载体”意指适合于化合物给予的材料，并且包括本领域已知的任何无毒且不会以有害方式与组合物的任何组分发生相互作用的这样的材料，例如像任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂或类似物。

营养上可接受的载体的实例包括(例如)水、盐溶液、醇、硅酮、蜡类、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。

赋形剂的实例包括但不限于：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖(lactose)、柠檬酸钠、碳酸钙、二碱式磷酸钙、甘氨酸、淀粉、乳糖(milk sugar)和高分子量聚乙二醇。

稀释剂的实例包括但不限于水、乙醇、丙二醇和丙三醇及其组合。

另外的组分可以与本文公开的昆虫病原真菌菌株和/或组合物同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同的途径递送)。

本文公开的昆虫病原真菌菌株和/或组合物和/或其稀释剂还可以包含螯合剂，例如EDTA、柠檬酸、酒石酸等。此外，本文公开的昆虫病原真菌菌株和/或组合物和/或其稀释剂可以含有选自脂肪酸酯(例如甘油单酯和甘油二酯)、非离子表面活性剂(例如聚山梨酯)、磷脂等的活性剂。本文公开的昆虫病原真菌菌株和/或组合物和/或其稀释剂还可以含有乳化剂，其可以增强(尤其是在稀释后)昆虫病原真菌菌株和/或组合物的稳定性。

本文公开的昆虫病原性真菌菌株和/或组合物可以以任何合适的形式(无论单独使用或当存在于组合物中)使用。本文公开的昆虫病原真菌菌株和/或组合物可以以任何合适的方式配制以确保组合物包含活性昆虫病原真菌菌株。

昆虫病原真菌菌株和/或组合物可以是处于可以喷洒在产品上或与其混合的干燥的粉末形式。本文公开的处于干燥的粉末形式的本发明实施例的昆虫病原真菌菌株和/或组合物可以包括：添加剂(例如微晶纤维素、黄蓍胶、明胶、淀粉、乳糖、藻酸、

或玉米淀粉(其可以用作崩解剂)。

在又另一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株和/或组合物可以是再悬浮于H₂O中至选自以下的百分比的喷雾干燥的发酵物：0.05％-1％、1％-3％、3％-5％、5％-7％、7％-10％、10％-15％、15％-20％、和大于20％。在另一个实施例中，澄清步骤可以在喷雾干燥之前进行。

在一个实施例中，本文公开的组合物可以包含来自本文公开的昆虫病原性真菌菌株的繁殖体(例如孢子)的悬浮液。在一个实施例中，繁殖体(例如孢子)的悬浮液可以在1x10²CFU/ml至1x 10¹⁴ CFU/ml的范围内。

在一个实施例中，本文公开的组合物可以包含来自本文公开的昆虫病原性真菌菌株的浓缩的干燥繁殖体，例如孢子。在一个实施例中，所述浓缩的干燥孢子可以在1x10²CFU/g至1x 10¹⁴CFU/g的范围内。

在一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株和/或昆虫病原真菌组合物可以以湿的或部分或完全脱水的形式或以浆液、凝胶或其他形式施用。

在至少一些实施例中，昆虫病原真菌菌株和/或组合物可以被冷冻干燥或冻干。在至少一些实施例中，昆虫病原真菌菌株和/或昆虫病原真菌组合物可以与载体混合。载体包括但不限于乳清、麦芽糖糊精、蔗糖、葡萄糖、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、干淀粉、粘土和硅铝酸钠。然而，在使用菌株之前不需要将其冷冻干燥。菌株也可以与或不与防腐剂一起使用，并且处于浓缩的、未浓缩的、或稀释的形式。在一个实施例中，菌株可以是粒料或生物纯的粒料的形式。

本文所述的昆虫病原真菌菌株和/或组合物可以添加到一种或多种载体中。在使用的情况下，可以将一种或多种载体和菌株添加到条带或桨式混合器中，并且混合约15分钟，尽管时间可以增加或减少。将这些组分共混使得产生培养物和一种或多种载体的均匀混合物。最终产物优选为干燥的可流动粉末。

在实施例中，昆虫病原真菌菌株和/或组合物可以配制成液体、干燥的粉末或颗粒。干粉或颗粒可通过本领域的技术人员已知的方式，例如在顶喷式流化床包衣器中、在Wurster型底喷式流化床中或者通过转鼓制粒(例如高剪切制粒)、挤出、锅式包衣或在微成分混合器中进行制备。

在另一个实施例中，昆虫病原真菌菌株和/或组合物可以作为喷雾干燥或冷冻干燥粉末提供。

在又另一个实施例中，所述昆虫病原真菌菌株和/或组合物在液体制剂中。此类液体消耗品可包含以下一种或多种：缓冲液、盐、山梨醇和/或甘油。

在一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株和/或组合物可以与至少一种生理上可接受的载体一起配制，所述生理上可接受的载体选自以下至少一种：麦芽糖糊精、煅烧(伊利石)粘土、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1，3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。

在一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株和/或组合物可以通过封装技术来配制以改进真菌繁殖体(例如孢子)、稳定性和作为保护真菌繁殖体免受种子施用杀真菌剂的侵害的方式。在一个实施例中，所述封装技术可以包含随时间推移真菌繁殖体(例如孢子)定时释放的珠状聚合物。在一个实施例中，包封昆虫病原真菌菌株和/或昆虫病原真菌组合物可以以沿犁沟单独施用珠的方式施用于种子。在另一个实施例中，包封昆虫病原真菌菌株和/或昆虫病原真菌组合物可以与种子同时共同施用。

可用于包封实施例的缓释微粒的包衣剂可以是用于用其上待负载的物质对该微粒形式进行包衣的物质。一般可以使用能够形成所述负载物质难以透过的包衣的包衣剂，而没有任何特别的限制。例如，可以使用饱和度更高的脂肪酸、蜡、热塑性树脂、热固性树脂等。

有用的饱和度更高的脂肪酸的实例包括硬脂酸、硬脂酸锌、硬脂酸酰胺和亚乙基双硬脂酸酰胺；蜡的实例包括合成蜡，如聚乙烯蜡、碳蜡、赫斯特(Hoechst)蜡和脂肪酸酯；天然蜡，如巴西棕榈蜡、蜂蜡和日本蜡；以及石油蜡，如固体石蜡和凡士林。热塑性树脂的实例包括聚烯烃，例如聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和聚异丁烯；乙烯基聚合物，例如聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯；二烯聚合物，例如丁二烯聚合物、异戊二烯聚合物、氯丁二烯聚合物、丁二烯-苯乙烯共聚物、乙烯-丙烯-二烯共聚物、苯乙烯-异戊二烯共聚物、MMA-丁二烯共聚物和丙烯腈-丁二烯共聚物；聚烯烃共聚物，例如乙烯-丙烯共聚物、丁烯-乙烯共聚物、丁烯-丙烯共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-丙烯酸共聚物、乙烯-甲基丙烯酸共聚物、乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、乙烯-一氧化碳共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯-一氧化碳共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯-氯乙烯共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯-丙烯酸共聚物；以及氯乙烯共聚物，例如氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物和偏二氯乙烯-氯乙烯共聚物。热固性树脂的实例包括聚氨酯树脂、环氧树脂、醇酸树脂、不饱和聚酯树脂、酚醛树脂、脲-三聚氰胺树脂、尿素树脂和硅酮树脂。在以上所述中，优选的是热塑性丙烯酸酯树脂、丁二烯苯乙烯共聚物树脂、热固性聚氨酯树脂和环氧树脂，并且在所述优选的树脂中，特别优选的是热固性聚氨酯树脂。这些包衣剂可以单独使用或者两种或更多种组合使用。

在一个实施例中，昆虫病原真菌菌株、和/或组合物可以包括种子、种子的一部分、植物或植物部分。

所有植物、植物部分、种子或土壤都可以根据本文公开的昆虫病原真菌菌株、组合物和方法进行处理。本文公开的组合物可以包括植物、植物部分、种子、种子部分、或土壤。可以将本文公开的昆虫病原真菌菌株、昆虫病原真菌组合物、和方法施用于种子、植物或植物部分、果实、或植物生长的土壤。

实施例涉及一种用于降低植物病原体、有害生物、或昆虫对植物或植物部分的损伤的方法，所述方法包括：(a)在种植之前用本文公开的昆虫病原真菌菌株或昆虫病原真菌组合物处理种子。在另一个实施例中，所述方法还包括：(b)用本文公开的昆虫病原真菌菌株或昆虫病原真菌组合物来处理获得自种子的植物部分。步骤(a)中使用的昆虫病原真菌株或昆虫病原真菌组合物可以与步骤(b)中使用的昆虫病原真菌株或昆虫病原真菌组合物相同或不同。

实施例涉及一种用于降低植物病原体、有害生物、或昆虫对植物或植物部分的损伤的方法，所述方法包括：(a)用昆虫病原真菌菌株或昆虫病原真菌组合物处理种子或植物周围的土壤。在另一个实施例中，所述方法还包括：(b)用本文公开的昆虫病原真菌菌株或昆虫病原真菌组合物来处理植物部分。步骤(a)中使用的昆虫病原真菌株或昆虫病原真菌组合物可以与步骤(b)中使用的昆虫病原真菌株或昆虫病原真菌组合物相同或不同。

实施例涉及一种用于降低植物病原体、有害生物、或昆虫对植物或植物部分的损伤的方法，所述方法包括：(a)在种植之前用本文公开的昆虫病原性真菌菌株或组合物处理种子。在另一个实施例中，所述方法还包括：(b)用本文公开的昆虫病原真菌菌株或组合物处理种子或植物周围的土壤。在还另一个实施例中，所述方法还包括：(c)用本文公开的昆虫病原真菌菌株或组合物处理由种子产生的植物的植物部分。步骤(a)中使用的昆虫病原真菌株或组合物可以与步骤(b)中使用的昆虫病原真菌株或组合物相同或不同。步骤(a)中使用的昆虫病原真菌株或组合物可以与步骤(c)中使用的昆虫病原真菌株或组合物相同或不同。步骤(b)中使用的昆虫病原真菌株或组合物可以与步骤(c)中使用的昆虫病原真菌株或组合物相同或不同。

在一个实施例中，可以用本文公开的一种或多种昆虫病原真菌菌株、组合物和方法处理野生植物物种和植物栽培种，或通过常规生物育种(例如交叉或原生质体融合)获得的那些和其部分。在另一个实施例中，可以用一种或多种本文公开的昆虫病原真菌菌株、昆虫病原真菌组合物和方法处理通过基因工程获得的转基因植物和植物栽培种及其植物部分。

在另一个实施例中，可以根据本文公开的菌株、组合物和方法处理的植物或植物栽培种(通过植物生物技术方法如遗传工程获得)是除草剂耐受性植物，即耐受一种或多种给定除草剂的植物。这类植物可以通过遗传修饰或通过选择含有赋予这种除草剂耐受性的突变的植物来获得。除草剂抗性植物是例如草甘膦耐受性植物，即耐受除草剂草甘膦或其盐的植物。植物可以通过不同的方式耐受草甘膦。例如，通过用编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因转化植物可以获得草甘膦耐受性植物。

也可以根据本文公开的实施例处理的种子、植物或植物栽培种(通过植物生物技术方法如遗传工程获得)是昆虫抗性的遗传修饰植物(或转基因植物)，即对某些靶昆虫具有抗性的植物。这类植物可以通过遗传转化获得，或通过选择含有赋予这种昆虫抗性的突变的植物来获得。

在另一个实施例中，可以根据本公开处理的种子、植物或植物栽培种(通过植物生物技术方法如基因工程获得)耐受非生物胁迫。这类植物可以通过遗传转化或通过选择含有赋予这种胁迫抗性的突变的植物来获得。

在另一个实施例中，可以根据本公开处理的种子、植物或植物栽培种(通过植物生物技术方法如基因工程获得)通常通过诱变、或基因工程育种以含有有价值性状(包括但不限于：除草剂耐受性、昆虫抗性和非生物胁迫耐受性)的组合或堆叠。本文公开的实施例也施用于未来将开发或销售、并且具有这些遗传性状或将来待开发的性状的植物品种。

如本文所使用的，将昆虫病原真菌菌株或组合物施用于种子、植物或植物部分包括与昆虫病原真菌菌株或组合物直接和/或间接地接触、喷雾、包衣、雾化和/或施用种子、植物或植物部分。在一个实施例中，昆虫病原真菌菌株或组合物可以作为喷雾剂、冲洗剂或粉末或其任何组合直接施用。接触步骤可以发生在当种子、植物或植物部分正在生长时，当植物或植物部分正在受精时，当植物或植物部分正在收获时，在收获植物或植物部分后，当植物或植物部分正在加工时，当植物或植物部分正在被包装时，或当植物或植物部分正在被储存在仓库或商店的货架上时。

如本文所使用的，喷雾是指包含本公开的昆虫病原真菌菌株或组合物的液体颗粒雾滴。在一个实施例中，当植物或植物部分正在生长时，可以将喷雾施用于种子、植物或植物部分。在另一方面，当种子、植物或植物部分正在受精时，可以将喷雾施用于种子、植物或植物部分。在另一方面，当种子、植物或植物部分正在收获时，可以将喷雾施用于种子、植物或植物部分。在另一方面，在收获种子、植物或植物部分后，可以将喷雾施用于种子、植物或植物部分。在另一方面，当植物或植物部分正在加工时，可以将喷雾施用于种子、植物或植物部分。在另一方面，当种子、植物或植物部分正在包装时，可以将喷雾施用于种子、植物或植物部分。在另一方面，当种子、植物或植物部分正在被储存时，可以将喷雾施用于种子、植物或植物部分。

在另一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株或组合物可以作为冲洗剂直接施用于种子、植物、或植物部分。如本文所使用的，冲洗剂是含有本文公开的昆虫病原真菌菌株或组合物的液体。这种冲洗剂可以倾倒在种子、植物或植物部分上。植物或植物部分也可浸泡或浸没在冲洗剂中，然后将其取出并允许干燥。

在另一个实施例中，昆虫病原真菌菌株或组合物可以施用于种子、植物或植物部分，并且可以覆盖植物材料的表面积的50％。在另一个实施例中，昆虫病原真菌菌株或组合物可以施用于植物或植物部分和可以覆盖植物材料的表面积的百分比从50％至约95％、从60％至约95％、从70％至约95％、从80％至约95％、和从90％至约95％。在另一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株或组合物可以施用于种子、植物或植物部分的环境，并且可以覆盖种子、植物或植物部分的环境的表面积的50％。在另一个实施例中，昆虫病原真菌菌株或组合物可以施用于种子、植物或植物部分的环境，并且可以覆盖种子、植物或植物部分的环境的表面积的百分比从50％至约95％、从60％至约95％、从70％至约95％、从80％至约95％、和从90％至约95％。

在另一方面，昆虫病原真菌菌株或组合物可以覆盖种子、植物或植物部分或所述种子、植物或植物部分的环境的表面积的从约20％至约30％、从约30％至约40％、从约40％至约50％、从约50％至约60％、从约60％至约70％、从约70％至约80％、从约80％至约90％、从约90％至约95％、从约95％至约98％、从约98％至约99％或100％。

在另一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株或组合物可以作为粉末直接施用于种子、植物或植物部分或所述种子、植物或植物部分的环境。如本文所使用的，粉剂是由大量非常细的颗粒组成的干燥或接近干燥的散装固体，其在振动或倾斜时可自由流动。本文公开的干燥或接近干燥的粉末组合物优选地含有低百分比的水，例如在各个方面，小于按重量计的5％、小于2.5％、或小于1％。

在另一个实施例中，昆虫病原真菌菌株或组合物可以间接施用于种子、植物或植物部分或所述种子、植物或植物部分的环境。具有已施用的昆虫病原真菌菌株或组合物的种子、植物或植物部分可以接触第二种子、植物或植物部分，使得昆虫病原真菌菌株或组合物在第二种子、植物或植物部分上摩擦掉(rub off)。在另外的方面，昆虫病原真菌菌株或组合物可以使用涂布器施用。在各个方面，涂布器可以包括但不限于：注射器、海绵、纸巾或布、或其任何组合。

接触步骤可以发生在当植物材料正在生长时，当植物材料正在受精时，当植物或植物部分正在收获时，在收获种子、植物或植物部分后，当植物或植物部分正在加工时，当植物或植物部分正在被包装时，或当植物或植物部分正在被储存在仓库时。

在另一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株或组合物可以是胶体分散体。胶体分散体是一种化学混合物类型，其中一种物质均匀地分散在另一种物质中。与其中完全溶解的溶液不同，分散的物质的颗粒仅悬浮在混合物中。发生这种情况是因为胶体分散体中的颗粒大于溶液中的颗粒：足够小以便均匀分散并保持均匀的外观，但足够大以散射光并且不溶解。胶体分散体是均匀混合物和非均匀混合物之间的中间体，并且有时根据它们的外观分类为“均匀”或“非均匀”。

在一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株、组合物和方法适合与种子一起使用。在另一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株、组合物和方法适合与先前所述的任何植物中的一种或多种的种子一起使用。

在还另一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株、组合物和方法可以用于处理转基因或遗传修饰的种子。转基因种子中的异源基因可以源自例如：芽孢杆菌属(Bacillus)、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、木霉属(Trichoderma)、棒状杆菌属(Clavibacter)、血管球属(Glomus)或胶枝霉属(Gliocladium)物种的微生物。

在一个实施例中，在足够稳定的状态下处理种子，使得处理不会造成任何损伤。一般来讲，种子处理可以在收获和播种之间的任何时间点进行。在一个实施例中，使用的种子从植物中分离出来并且脱离穗轴、壳、茎、外壳(coat)、毛或果实的果肉。因此，可以使用例如收获、清洁和干燥的种子。可替代地，也可以使用干燥后经过例如水处理然后再干燥的种子。

在一个实施例中，用本文公开的昆虫病原真菌菌株、组合物和方法处理种子，这样的方式使得种子的萌发没有受到不利影响，或者所得植物没有受到损伤。

在一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株和组合物可以直接施用于种子。例如，本文公开的昆虫病原真菌菌株、组合物和方法可以在没有另外的组分并且未被稀释的情况下施用。

在另一个实施例中，将本文公开的昆虫病原真菌菌株和昆虫病原真菌组合物以合适的制剂的形式施用于种子。用于处理种子的合适的制剂和方法是本领域技术人员已知的并且例如描述于以下文献中：US 4,272,417 A、US4,245,432 A、US 4,808,430 A、US 5,876,739 A、US 2003/0176428 A1、WO2002/080675 A1、WO 2002/028186 A2。

本文公开的昆虫病原真菌菌株和组合物可以转化为常规拌种制剂，例如溶液、乳液、悬浮液、粉末、泡沫、浆液或其他种子包衣材料、以及ULV制剂。这些制剂以已知的方式通过将本文公开的昆虫病原真菌菌株与常规添加剂(例如常规增充剂以及溶剂或稀释剂、着色剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、消泡剂、防腐剂、二级增稠剂、粘合剂、赤霉素和水)混合来制备。

在另一个实施例中，可能存在于拌种制剂中的合适的着色剂包括常用于这类目的所有着色剂。可以使用在水中溶解性很低的颜料和可溶于水的染料二者。可以提及的实例包括名称为罗丹明B(Rhodamine B)、C.I.颜料红112(C.I.Pigment Red 112)、和C.I.溶剂红1(C.I.Solvent Red 1)的已知着色剂。

在另一个实施例中，可存在于拌种制剂中的合适的润湿剂包括促进润湿且常用于活性农用化学物质的制剂中的所有物质。优选地，有可能使用烷基萘磺酸盐，如二异丙基萘磺酸盐或二异丁基萘磺酸盐。

在仍另一个实施例中，可存在于拌种制剂中的合适的分散剂和/或乳化剂包括常用与活性农用化学物质的制剂中的所有非离子、阴离子和阳离子分散剂。在一个实施例中，可以使用非离子或阴离子分散剂或者非离子或阴离子分散剂的混合物。在一个实施例中，非离子分散剂包括但不限于环氧乙烷-环氧丙烷嵌段聚合物、烷基酚聚乙二醇醚和三苯乙烯苯酚聚乙二醇醚，以及它们的磷酸化或硫酸化衍生物。

在仍另一个实施例中，可以存在于根据本发明的实施例使用的拌种制剂中的消泡剂包括常用于具有农用化学活性的化合物的制剂中的所有泡沫抑制性化合物，但不限于硅酮消泡剂、硬脂酸镁、硅酮乳剂、长链醇、脂肪酸及其盐，以及有机氟化合物及其混合物。

在仍另一个实施例中，可存在于拌种制剂中的二次增稠剂包括可用于农业化学组合物中的此类目的所有化合物，包括但不限于纤维素衍生物、丙烯酸衍生物、多糖类(例如黄原胶或硅酸铝镁(Veegum))、改性粘土、层状硅酸盐(如绿坡缕石和膨润土)、以及精细分散的硅酸。

可存在于待使用的拌种制剂中的合适的粘合剂包括可用于拌种的所有常规粘合剂。聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇和侵填体(Tylose)可以作为优选的被提及。

在又另一个实施例中，拌种制剂可以直接使用或预先用水稀释后使用以处理任何多种多样类型的种子。种子拌种制剂或其稀释制剂也可以用来对转基因植物进行拌种。在这种情况下，与通过表达形成的物质相互作用也可能产生协同效应。

用于用拌种制剂或通过添加水由其制备的制剂来处理种子的合适的混合设备包括通常可用于拌种的所有混合设备。施用时采用的具体程序包括：将种子引入混合器中、预先添加特定的所希望的量的拌种制剂(按照原样或预先用水稀释)、并进行混合直至制剂均匀分布在种子上。可选地，随后进行干燥操作。

在不同实施例中，一种或多种昆虫病原真菌菌株、昆虫病原真菌组合物或昆虫病原真菌制剂可以以每种子约10至1x10¹⁴个菌落形成单位(cfu)(包括约1x10³cfu/种子、或约1x10⁴cfu/种子、1x10⁵cfu/种子、或约1x10⁶cfu/种子、或约1x10⁷cfu/种子、或约1x10⁸cfu/种子、或约1x10⁹cfu/种子、或约1x10¹⁰cfu/种子、或约1x10¹¹cfu/种子、或约1x10¹²cfu/种子、或约1x10¹³cfu/种子，包括约1x10³至1x10⁸cfu/种子约1x10³至1x10⁷cfu/种子、约1x10³至1x10⁵cfu/种子、约1x10³至1x10⁶cfu/种子、约1x10³至1x10⁴cfu/种子、约1x10³至1x10⁹cfu/种子、约1x10³至1x10¹⁰cfu/种子、约1x10³至1x10¹¹cfu/种子、约1x10³至1x10¹²cfu/种子、约1x10³至1x10¹³cfu/种子、约1x10⁴至1x10⁸cfu/种子约1x10⁴至1x10⁷cfu/种子、约1x10⁴至1x10⁵cfu/种子、约1x10⁴至1x10⁶cfu/种子、约1x10⁴至1x10⁹cfu/种子、约1x10⁴至1x10¹⁰cfu/种子、约1x10¹¹至1x10⁹cfu/种子、约1x10⁴至1x10¹²cfu/种子约1x10⁴至1x10¹³cfu/种子、约1x10⁵至1x10⁷cfu/每种子、约1x10⁵至1x10⁶cfu/每种子、约1x10⁵至1x10⁸cfu/每种子、约1x10⁵至1x10⁹cfu/每种子、约1x10⁵至1x10¹⁰cfu/每种子、约1x10⁵至1x10¹¹cfu/每种子、约1x10⁵至1x10¹²cfu/每种子、约1x10⁵至1x10¹³cfu/每种子、约1x10⁶至1x10⁸cfu/每种子、约1x10⁶至1x10⁷cfu/每种子、约1x10⁶至1x10⁹cfu/每种子、约1x10⁶至1x10¹⁰cfu/每种子、约1x10⁶至1x10¹¹cfu/每种子、约1x10⁶至1x10¹²cfu/每种子、约1x10⁶至1x10¹³cfu/每种子、约1x10⁷至1x10⁸cfu/每种子、约1x10⁷至1x10⁹cfu/每种子、约1x10⁷至1x10¹⁰cfu/每种子、约1x10⁷至1x10¹¹cfu/每种子、约1x10⁷至1x10¹²cfu/每种子、约1x10⁷至1x10¹³cfu/每种子、约1x10⁸至1x10⁹cfu/每种子、约1x10⁸至1x10¹⁰cfu/每种子、约1x10⁸至1x10¹¹cfu/每种子、约1x10⁸至1x10¹²cfu/每种子、约1x10⁸至1x10¹³cfu/每种子、约1x10⁹至1x10¹⁰cfu/每种子、约1x10⁹至1x10¹¹cfu/每种子、约1x10⁹至1x10¹²cfu/每种子、约1x10⁹至1x10¹³cfu/每种子、约1x10¹⁰至1x10¹¹cfu/每种子、约1x10¹⁰至1x10¹²cfu/每种子、约1x10¹⁰至1x10¹³cfu/每种子、约1x10¹¹¹至1x10¹²cfu/每种子、约1x10¹¹至1x10¹³cfu/每种子、和约1x10¹²至1x10¹³cfu/每种子)的比率添加到植物、植物部分、和/或种子。如本文所使用的，术语“菌落形成单位”或“cfu”是含有能够在有利条件下生长和产生菌落的昆虫病原真菌结构的单位。cfu计数用作样品中活结构或细胞数量的估计。

在一个实施例中，昆虫病原真菌菌株和组合物可以配制成液体种子处理。该种子处理包含至少一个昆虫病原真菌菌株或组合物。使用常规的混合、喷雾或其组合的方法，种子可以基本均匀地包衣有一层或多层昆虫病原真菌或组合物。可以使用能精确、安全和高效地将种子处理产品施用于种子的设备来完成使用。这种设备使用各种类型的包衣技术，例如旋转涂覆器、鼓式涂覆器、流化床技术、喷动床、旋转雾化器或其组合。

在一个实施例中，施用经由旋转“雾化器”盘或喷雾喷嘴(当种子通过喷雾模式移动时，将种子处理均匀分布到种子上)完成。在又另一个实施例中，然后将种子混合或翻转一段时间以实现另外的处理分布和干燥。在用本发明的组合物包衣来提高萌发和出苗(emergence)的均匀性之前，可以涂覆或不涂覆种子。在可替代的实施例中，可以将干燥的粉末组合物计量加入移动的种子中。

在还另一个实施例中，种子可以通过连续或分批包衣方法进行包衣。在连续包衣过程中，连续流动设备同时测量种子流量和种子处理产品。滑动闸门、锥体和孔口、种子轮或重量装置(带或转向器)调节种子流量。一旦确定了通过处理设备的种子流量，就将种子处理的流量校准为种子流量，以便当种子流过种子处理设备时向种子输送所希望的剂量。另外，计算机系统可以监测输入包衣机的种子，从而保持适量种子的恒定流量。

在分批包衣方法中，分批处理设备称出规定量的种子并将这些种子放入封闭的处理室或碗中，然后在这里施加相应的种子处理。然后混合种子和种子处理以在每个种子上实现基本均匀的包衣。然后将该批次从处理室中排出，为下一批次的处理做准备。通过计算机控制系统，该分批方法是自动化的，可以连续重复分批处理方法。

种子处理中可以添加各种添加剂。可以添加粘合剂(binder)并且粘合剂包括优选由粘合剂(adhesive)聚合物组成的粘合剂，所述粘合剂聚合物可以是天然的或合成的，并且对待包衣的种子没有植物毒性作用。可以使用各种着色剂，包括分类为亚硝基、硝基、偶氮(包括单偶氮、双偶氮和多偶氮)、二苯基甲烷、三芳基甲烷、呫吨、甲烷、吖啶、噻唑、噻嗪、引达胺、靛酚、吖嗪、噁嗪、蒽醌和酞菁的有机发色团。其他可添加的添加剂包括微量营养素，例如铁、锰、硼、铜、钴、钼和锌的盐。可以施用聚合物或其他粉尘控制剂来将处理保留在种子表面上。

其他常规种子处理添加剂包括但不限于：包衣剂、润湿剂、缓冲剂和多糖。可以向种子处理制剂中添加至少一种农业上可接受的载体，例如水、固体或干燥的粉末。干燥的粉末可以衍生自各种材料，例如木皮、碳酸钙、石膏、蛭石、滑石、腐殖质、活性炭和各种磷化合物。

在一个实施例中，种子包衣包含至少一种填充剂(有机或无机的天然或合成组分)，其与昆虫病原真菌菌株及其组合物组合以利于将其施用到种子上。在一个实施例中，填料是惰性固体(例如粘土)、天然或合成硅酸盐、二氧化硅、树脂、蜡、固体肥料(例如铵盐)、天然土壤矿物(例如高岭土、粘土、滑石、石灰、石英、绿坡缕石、蒙脱石、膨润土或硅藻土)、或合成矿物(例如二氧化硅、氧化铝或硅酸盐，特别是硅酸铝或硅酸镁)。

在一个实施例中，本文公开的昆虫病原真菌菌株和/或组合物可以通过封装技术来配制以改进真菌孢子稳定性和作为保护真菌孢子免受种子施用杀真菌剂的侵害的方式。在一个实施例中，所述封装技术可以包含随时间推移真菌孢子定时释放的珠状聚合物。在一个实施例中，所述封装技术可以包含沸石材料。在一个实施例中，包封昆虫病原真菌菌株和/或昆虫病原真菌组合物可以以沿犁沟单独施用珠的方式施用于种子。在另一个实施例中，包封昆虫病原真菌菌株和/或昆虫病原真菌组合物可以与种子同时共同施用。

昆虫抗性管理(IRM)是用来描述旨在减少昆虫有害生物变得对昆虫管理策略具有抗性的潜力的实践的术语。Bt(苏云金芽孢杆菌)衍生的杀有害生物蛋白质、其他杀有害生物蛋白质、化学、昆虫病原生物试剂、或其他生物制品、IRM的维护是非常重要的，因为昆虫抗性对将来使用杀有害生物植物掺入保护剂和杀昆虫性状技术整体而言构成威胁。特定的IRM策略(例如庇护所策略)可以减轻昆虫对玉米、大豆、棉花和其他作物中产生的特定杀昆虫蛋白质的抗性。然而，为了确保非抗性昆虫发育并可用于与在受保护作物中产生的任何抗性有害生物交配，这样的策略导致作物的一部分容易受到一种或多种有害生物的侵害。因此，从农民/生产者的角度来看，非常希望拥有尽可能小的庇护所，但仍然能够治理昆虫抗性，从而获得最大的产量，同时仍然保持所用的有害生物控制方法(无论是Bt、不同杀有害生物蛋白质、化学、昆虫病原生物试剂或其他生物制品、一些其他方法、或其组合)的功效。

通常使用的IRM策略是种植庇护所(使用非Bt/杀有害生物性状种子的总面积的一部分)，因为通常认为这将通过保持昆虫易感性来延迟昆虫对杀有害生物性状的抗性的发展。用于延迟抗性的庇护所策略的理论基础取决于如下假设：昆虫抗性的频率和隐性与有害生物易感性成反比；只有当有害生物对毒素非常敏感时，抗性才是罕见且隐性的，并且反之，当有害生物不是非常敏感时，抗性会更加频繁且隐性也更小。此外，该策略假定对杀昆虫性状的抗性是隐性的并且由具有两个等位基因的单一基因座赋予，所述两个等位基因产生三种基因型：易感纯合体(SS)、杂合体(RS)和抗性纯合体(RR)。还假定初始抗性等位基因频率较低，并且抗性成虫和易感成虫之间会有大量的随机交配。在理想的情况下，只有罕见的RR个体将幸免于作物产生的杀有害生物毒素。SS个体和RS个体均易受到杀有害生物毒素的影响。结构化庇护所是种植者的田地或一组田地的非Bt/杀昆虫性状部分，其提供可能随机与幸免于所述杀昆虫性状作物(可能是Bt性状作物)的罕见抗性(RR)昆虫交配的易感(SS)昆虫的产生，以产生将被所述Bt/杀昆虫性状作物杀死的易感RS杂合子。整合的庇护所是种植者的田地或一组田地的随机种植的非Bt/杀昆虫性状部分的某些部分，其提供可能随机与幸免于所述杀昆虫性状作物的罕见抗性(RR)昆虫交配的易感(SS)昆虫的产生，以产生将被所述杀昆虫性状作物杀死的易感RS杂合子。每个庇护所策略将从昆虫群体中移除抗性(R)等位基因并延迟抗性的演变。

减少对庇护所的需求的另一个策略是对具有针对靶标昆虫有害生物的不同作用模式的性状进行聚合。例如，由于抗性风险降低，具有金字塔化在一种转基因植物中的不同作用模式的Bt毒素对庇护所的需求降低。金字塔组合中不同的作用模式也延长了每种性状的耐久性，因为抗性发展到每种性状的速度较慢。

目前，庇护所的规模、安置和管理通常被认为是减轻昆虫对玉米、棉花、大豆和其他作物中产生的Bt/杀有害生物性状的抗性的庇护所策略成功的关键。由于庇护所种植区的产量下降，一些农民选择避开庇护所需求，而其他农民则不遵循规模和/或安置要求。这些问题导致没有庇护所或庇护所效果不佳，而且抗性有害生物发展的风险也相应增加。

因此，仍然需要用于治理一片有害生物抗性作物植物中的有害生物抗性的方法。提供用于保护植物，特别是玉米或其他作物植物免受有害生物的摄食损伤的改良方法是有用的。如果这种方法会降低对传统化学杀有害生物剂所需的施用率，并且还将限制作物种植和栽培所需的单独田间作业的数量，这将是特别有用的。另外，有一种部署生物控制剂的方法是有用的，所述方法可以增加杀昆虫性状的耐久性或增加许多抗性管理策略的功效。

一个实施例涉及一种降低或防止群体中的有害生物对植物杀昆虫/杀有害生物组合物的抗性的发展的方法，所述方法包括为种子、植物、植物部分、或种植区域提供植物保护组合物，例如Bt杀有害生物蛋白质、转基因杀有害生物蛋白质、其他杀有害生物蛋白质、化学杀有害生物剂、或杀有害生物生物昆虫病原体。另一个实施例涉及一种降低或防止对植物杀昆虫性状的抗性的方法，所述方法包括提供组合物，所述组合物包含本文所述的植物杀昆虫性状和昆虫病原真菌菌株。再一个实施例涉及一种降低或防止对植物鞘翅目杀昆虫性状的抗性的方法，所述方法包括提供组合物，所述组合物包含本文所述的植物鞘翅目杀昆虫性状和昆虫病原真菌菌株和/或组合物。另一个实施例涉及一种降低或防止对植物玉米根萤叶甲杀昆虫性状的抗性的方法，所述方法包括提供本文所述的植物玉米根萤叶甲杀昆虫性状和昆虫病原真菌菌株和/或组合物。在某些实施例中，杀昆虫性状包含Bt性状、非Bt性状、或RNAi性状。

再一个实施例涉及一种增加植物有害生物组合物的耐久性的方法，所述方法包括为种子、植物或种植区域提供植物保护组合物，和为种子、植物、或种植区域提供本文所述的昆虫病原真菌菌株、组合物、和/或方法，其中本文所述的昆虫病原真菌菌株、组合物、和/或方法具有与植物保护组合物不同的作用方式。

在仍另外的实施例中，所需的庇护所可能因本文所述的施用于非庇护所植物的昆虫病原真菌菌株、组合物和/或方法的存在而减少或消除。在另一个实施例中，庇护所可以包括本文所述的昆虫病原真菌菌株、组合物、和/或方法作为喷雾、诱饵或作为不同作用方式。

在本发明的一个实施例中，组合物包含真菌昆虫病原体，并且非Bt杀昆虫性状加对病原体、有害生物、或昆虫的抗性。在另一个实施例中，真菌昆虫病原体选自由以下组成的组：金龟子绿僵菌15013-1、罗伯茨绿僵菌23013-3、和金龟子绿僵菌3213-1。在另一个实施例中，非Bt杀昆虫性状包含植物衍生的杀昆虫蛋白质、不来自Bt的细菌/古细菌-衍生的杀昆虫蛋白质(例如假单胞菌杀昆虫蛋白质)、动物衍生的杀昆虫蛋白质、或沉默元件。在本发明的另一个实施例中，组合物包含真菌昆虫病原体，并且非Bt杀昆虫性状增加非Bt杀昆虫性状的耐久性。在另一个实施例中，非Bt杀昆虫性状包含PCT序列号PCT/US 14/55128的PIP-72多肽。在另一个实施例中，非Bt杀昆虫性状包含靶向RyanR、HP2、或PAT3(美国专利申请公开2014/0275208和US 2015/0257389)的多核苷酸沉默元件。在另一个实施例中，非Bt杀昆虫性状包含靶向RyanR(美国专利申请公开2014/0275208)和PCT序列号PCT/US14/55128的PIP-72多肽的多核苷酸沉默元件。

在本发明的再一个实施例中，增加对病原体、有害生物、或昆虫的抗性的组合物包含真菌昆虫病原体(例如本文公开的昆虫病原真菌菌株)和增加对病原体、有害生物、或昆虫的抗性的Bt杀昆虫性状。Bt杀昆虫性状可以具有针对鞘翅目植物有害生物(例如玉米根萤叶甲)的活性。本文公开的组合物可以与Bt杀昆虫性状组合为植物或植物部分提供对病原体、有害生物、或昆虫植物的添加或协同抗性。在一个实施例中，组合物包含真菌昆虫病原体和Bt杀昆虫性状，其中所述Bt杀昆虫性状包含Cry3B毒素(公开于美国专利号8,101,826、6,551,962、6,586,365、6,593,273、和PCT公开WO 2000/011185)、mCry3B毒素(公开于美国专利号8,269,069、和8,513,492)、mCry3A毒素(公开于美国专利号8,269,069、7,276,583和8,759,620)、或Cry34/35毒素(公开于美国专利号7,309,785、7,524,810、7,985,893、7,939,651和6,548,291)、以及含有这些Bt杀昆虫毒素和其他鞘翅目活性Bt杀昆虫性状的转基因转殖项，例如，转殖项MON863(公开于美国专利号7,705,216)、转殖项MIR604(公开于美国专利号8,884,102)、转殖项5307(公开于美国专利号9,133,474)、转殖项DAS-59122(公开于美国专利号7,875,429)、转殖项DP-4114(公开于美国专利号8,575,434)、转殖项MON87411(公开于美国公开专利申请号2013/0340111)、以及转殖项MON88017(公开于美国专利号8,686,230)，其全部通过引用结合在此。

通过参考以下非限制性.实施例将进一步理解昆虫病原真菌菌株、昆虫病原真菌组合物和方法。仅仅提供了用于说明性目的的以下实例。这些实例仅用于帮助更完整地理解本发明所述的实施例。这些实例不限制所述或要求保护的本发明的实施例的范围。

实例1

生物测定方法学

使用纯化的昆虫病原真菌的单孢子培养物进行实验室生物测定以鉴定对玉米根萤叶甲感染的菌株。将二龄玉米根萤叶甲浸没在每个真菌菌株的1x10⁷/ml悬浮液1至2分钟，并用湿滤纸转移到培养皿中24小时。还将二龄玉米根萤叶甲浸没在0.01％Tween 80溶液(未经处理的对照)以及白僵菌属物种分离物(来源于来源于感染的玉米根萤叶甲并且先前在实验室中显示为感染(阳性对照))的1x10⁷/ml的悬浮液中。阳性和未经处理的对照处理用于确认每种生物测定的有效性。如果未经处理的对照中没有被感染的幼虫并且在阳性对照中有感染的幼虫，则生物测定被认为是有效的。24小时后，将幼虫无菌转移到含有湿滤纸和三个胚芽鞘阶段玉米幼苗的佩特里板中。所有真菌菌株一式三份筛选，每个重复10只幼虫。将含有幼虫和玉米幼苗的佩特里培养皿中在25℃孵育14天，然后观察幼虫的真菌感染。真菌感染通过经尸体表面分生孢子的存在而证实(表1)。

表1.

生物测定结果

实验室生物测定的结果证明菌株15013-1、23013-3和3213-1对二龄玉米根萤叶甲具有感染性。生物测定是以一种可将幼虫暴露于允许鉴定高度感染性菌株的孢子浓度的区别剂量进行的，而那些对玉米根萤叶甲没有高度感染性的菌株没有导致或具有非常低水平的幼虫感染。阳性对照在所报道的每种生物测定中导致幼虫感染，阴性对照导致无幼虫感染。

实例2

土壤掺入生物测定方法学

对实验室生物测定中鉴定的最有效的昆虫病原真菌菌株进行全植物温室生物测定。在种植到商品盆栽土和表土的50∶50共混物之前以相当于田地施用2x10¹³个孢子/英亩的量将真菌菌株立即掺入。阴性对照处理由未用真菌孢子改良的土壤组成。该实验是具有两个因素(真菌菌株和种质)的完整因子设计。使用的种子由与杀昆虫性状(DP-4114、PCT/US 10/60818)或相同遗传背景的野生型植物(未定向的(untraited))(没有对玉米根萤叶甲具有活性的杀昆虫性状)杂交的试商用杜邦先锋(DuPont Pioneer)玉米组成。将(每种类型的)15个单独的杂交玉米种子种植到3.78L塑料盆中并保存在温室(80°F，15：9L：D)中，并根据需要浇水。当植物达到V2叶子阶段时，用100个非滞育中的玉米根萤叶甲的卵对植物进行侵染。每天监测植物并且在第一只甲虫出现后14天结束测定。在GH中以与以下文献中所述的相似的方式确定产生自每个盆的成年玉米根萤叶甲的数量：Meihls等人，(2008)PNAS105：19177-19182。在那些生物测定中，成虫的出现没有被量化；在第一次甲虫出现时评估测定。在测定结束时，将植物切割至土壤线以上，并计算出现的成虫总数。然后清洗根球，并测定节点损伤评分(CRWNIS)(Oleson等人2005，Journal of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]98：1-8)。(表2)。

表2.

*比较每种真菌菌株与给定每种基因型的阴性对照来进行成对比较。使用Dunnett多重性调整，并且如果小于0.05，则调整后的p值被认为是统计学显著的。在玉米杂交基因型(WT或DP-4114)内来自具有不同字母(“a”或“b”)(CRWNIS或成虫出现)的相同GH生物测定的平均值显著不同(P＜0.05)。

统计分析

使用SAS软件版本号9.4(美国北卡罗来纳州27513卡里市100SAS校园大道SAS研究所公司(SAS Institute Inc.，100SAS Campus Drive，Cary，NC27513，USA))中的MIXED程序，分别针对每个测定运行分析由CRWNIS测量的根损伤。为了更好地满足模型假设，在分析之前，使用平方根变换对CRWINS观测值进行变换。

可以指定使用的模型：

y＝b+t+g+t*g+∈

其中y表示响应、b表示块/rep、t表示菌株处理、g表示基因型、并且∈表示植物对植物剩余误差方差。处理和基因型被认为是固定效应。所有其他效应被认为是具有零平均值的独立正态分布随机变量。

对于每种处理组合和基因型，在逆转换(即

)后报道最佳线性无偏估计。比较每种真菌处理与给定每种基因型的检查来进行成对比较。使用Dunnett多重性调整，并且如果小于0.05，则调整后的p值被认为是统计学显著的。使用SAS软件版本号9.4(美国北卡罗来纳州27513卡里市100SAS校园大道SAS研究所公司(SAS Institute Inc.，100SAS CampusDrive，Cary，NC27513，USA))中的GLIMMIX程序针对每次运行分别分析甲虫出现数据。假设出现计数和log连接函数的泊松分布，用广义线性混合模型对数据进行拟合。

可以指定使用的线性预报值：

η＝b+t+g+t*g+p

其中η表示出现的甲虫计数的对数、b表示块/rep、t表示菌株处理、g表示基因型、和p表示植物。处理和基因型被认为是固定效应。所有其他效应被认为是具有零平均值的独立正态分布随机变量。

在反向链接规模(eⁿ)上报告基因型组合的每种处理的计数估计值。比较每种真菌菌株与给定每种基因型的检查来进行成对比较。使用Dunnett多重性调整，并且如果小于0.05，则调整后的p值被认为是统计学显著的。在玉米杂交基因型(WT或DP-4114)内来自具有不同字母(CRWNIS或成虫出现)的相同GH生物测定的平均值显著不同(P＜0.05)。

土壤掺入生物测定结果

在温室生物测定1、2和3中评估的所有昆虫病原真菌菌株都显著降低了评估的两种杂交玉米基因型的根损伤量。当在种植时掺入时，每种昆虫病原性真菌所提供的功效是添加的，当与杀昆虫性状一起使用或与其不一起使用时在昆虫功效方面没有显著的相互作用。在确定成虫甲虫计数的生物测定1和2中，当在种植时将两种菌株掺入土壤中显著减少了从两种杂交玉米基因型出现的成虫玉米根萤叶甲的数量，并且没有观察到显著的相互作用。由于针对玉米根萤叶甲的直接死亡率表明这些真菌是用于开发针对该昆虫的综合有害生物管理计划的重要新工具，使用这些真菌菌株提供了显著水平的根保护并减少了成虫出现。在一方面，菌株可以用作增加杀昆虫性状的耐久性。

实例3

使用菌株15013-1作为用于玉米根萤叶甲对照的生物种子处理来进行全植物温室生物测定。在种植到商品盆栽土和表土的50∶50共混物之前将真菌孢子立即施用于实验室中的杂交玉米种子。将真菌孢子悬浮在10％阿拉伯树胶溶液中(利于将孢子粘在种子上)，其中将裸露的玉米种子浸没1至2分钟。评估的种子处理剂量为1x10⁴、1x10⁵和1x10⁶CFU/种子。阴性对照处理由未用真菌孢子处理、并浸入单独的10％阿拉伯树胶溶液中的种子组成。该实验是具有两个因素(种子处理和种质)的完整因子设计。使用的种子由与杀昆虫性状(DP-4114、PCT/US 10/60818)或相同遗传背景的野生型植物(没有对玉米根萤叶甲具有活性的杀昆虫性状)杂交的试商用杜邦先锋玉米组成。将(每种类型的)15个单独的杂交玉米种子种植到3.78L塑料盆中并保存在温室(80°F，15：9L：D)中，并根据需要浇水。当植物达到V2叶子阶段时，用100个非滞育中的玉米根萤叶甲的卵对植物进行侵染。每天监测植物并且在第一只甲虫出现后14天结束测定。在GH中以与以下文献中所述的相似的方式确定产生自每个盆的成年玉米根萤叶甲的数量：Meihls等人，(2008)PNAS 105：19177-19182。在那些生物测定中，成虫的出现没有被量化；在第一次甲虫出现时评估测定。将植物切割至土壤线以上，然后清洗根球，并测定节点损伤评分(CRWNIS)(Oleson等人2005，Journal of EconomicEntomology[经济昆虫学杂志]98：1-8)。(表3)。按照实例2计算预测的CRWNIS评分。

表3.

结果

菌株15013-1的种子处理施用于裸露的玉米种子通常降低由玉米根萤叶甲引起的根损伤量(表3)。在这种温室测定中摄食的玉米根萤叶甲的量是轻的。结果，在没有PIP的玉米基因型上，昆虫摄食量最高，这允许真菌种子处理的影响最明显。在本实例中使用10％阿拉伯树胶将真菌孢子实验施用于玉米种子，并且与实例6(表7)中观察到的优越性能相比，所得到的性能可能受到使用商品种子处理设备和商品聚合物的影响，导致更均匀和一致地将真菌孢子施用于玉米种子。

实例4

使用菌株15013-1作为用于玉米根萤叶甲对照的生物种子处理(单独或与商品种子施用化学品组合)来进行全植物温室生物测定。首先用标准的可商购的种子施用杀昆虫剂和杀真菌剂处理杂交玉米种子并使其干燥。然后在种植到商品盆栽土和表土的50∶50共混物之前立即施用真菌孢子。将真菌孢子悬浮在10％阿拉伯树胶溶液中(利于将孢子粘在种子上)，其中将玉米种子浸没1至2分钟。评估的种子处理剂量为1x10⁷和1x10⁸CFU/种子。阴性对照处理由用10％阿拉伯树胶单独处理的种子或施用化学品和10％阿拉伯树胶的种子组成。该实验是具有两个因素(种子处理和种质)的完整因子设计。使用的种子由与杀昆虫性状(DP-4114、PCT/US 10/60818)或相同遗传背景的野生型植物(没有对玉米根萤叶甲具有活性的杀昆虫性状)杂交的试商用杜邦先锋玉米组成。将(每种类型的)15个单独的杂交玉米种子种植到3.78L塑料盆中并保存在温室(80°F，15：9L：D)中，并根据需要浇水。当植物达到V2叶子阶段时，用100个非滞育中的玉米根萤叶甲的卵对植物进行侵染。每天监测植物并且在第一只甲虫出现后14天结束测定。在GH中以与以下文献中所述的相似的方式确定产生自每个盆的成年玉米根萤叶甲的数量：Meihls等人，(2008)PNAS 105：19177-19182。在那些生物测定中，成虫的出现没有被量化；在第一次甲虫出现时评估测定。将植物切割至土壤线以上，并且清洗根球，并测定节点损伤评分(CRWNIS)(Oleson等人2005，Journal ofEconomic Entomology[经济昆虫学杂志]98：1-8)。(表4)。按照实例2计算预测的CRWNIS评分和成虫出现。

表4.

种子处理结果

当单独施用或与化学种子处理组合施用时，菌株15013-1的种子处理施用降低了由玉米根萤叶甲对两种玉米基因型造成的根损伤量。在两个种子处理温室实验中摄食的玉米根萤叶甲的量都很轻。结果，在没有杀昆虫性状的玉米基因型上，昆虫摄食量最高，这允许评估的每种种子处理的影响最明显(表4)。单独施用或与化学种子处理组合施用的菌株15013-1减少了玉米根萤叶甲幼虫摄食的量(表4)。生物种子处理对成虫出现的影响更细微(表4)。在本实例中使用10％阿拉伯树胶将真菌孢子实验施用于玉米种子，并且与实例6(表7)中观察到的优越性能相比，所得到的性能可能受到使用商品种子处理设备和商品聚合物的影响，导致更均匀和一致地将真菌孢子施用于玉米种子。

实例5

土壤掺入生物测定方法学

对实验室生物测定中鉴定的最有效的昆虫病原真菌菌株进行全植物温室生物测定。在种植到商品盆栽土和表土的50：50共混物之前以相当于田地施用2x10¹³CFU/英亩的量将真菌菌株立即掺入。阴性对照处理由未用真菌孢子改良的土壤组成。该实验是具有两个因素(真菌菌株和基因型)的完整因子设计。使用的种子由与杀昆虫性状(DP-4114(DP-4114，US 8,575,434)、DP-4114x MIR604(DP-4114，US 8,575,434)、MIR604(US 8,884，102))或相同遗传背景的野生型植物(没有对玉米根萤叶甲具有活性的杀昆虫性状)杂交的试商用杜邦先锋玉米组成。将(每种类型的)15个单独的杂交玉米种子种植到3.78L塑料盆中并保存在温室(80°F，15：9L：D)中，并根据需要浇水。当植物达到V2叶子阶段时，用100个非滞育中的玉米根萤叶甲的卵对植物进行侵染。每天监测植物并且在第一只甲虫出现后14天结束测定。在GH中以与以下文献中所述的相似的方式确定产生自每个盆的成年玉米根萤叶甲的数量：Meihls等人，(2008)PNAS 105：19177-19182。在那些生物测定中，成虫的出现没有被量化；在第一次甲虫出现时评估测定。在测定结束时，将植物切割至土壤线以上，并计算出现的成虫总数(表5)。然后清洗根球，并测定节点损伤评分(CRWNIS)(Oleson等人2005，Journal of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]98：1-8)。(表6)。按照实例2计算预测的CRWNIS评分和成虫出现。

表5.

表6.

*比较每种真菌菌株与给定每种基因型的阴性检查来进行成对比较。使用Dunnett多重性调整，并且如果小于0.05，则调整后的p值被认为是统计学显著的。在玉米杂交基因型(WT、DP-4114或DP4114*MIR604、或MIR604)内来自具有不同字母(“a”或“b”)(CRWNIS或成虫出现)的相同GH生物测定的平均值显著不同(P＜0.05)。

生物测定结果

在温室生物测定中评估的所有昆虫病原真菌菌株均显著降低了所评估的杂交玉米的所有基因型的根损伤量，当施用于DP-4114xMIR604时，15013-1除外。然而，相对于单独的DP-4114xMIR604金字塔化性状，15013-1确实减少了超过50％的根摄食损伤。当在种植时掺入时，每种昆虫病原性真菌所提供的功效是添加的，当与杀昆虫性状一起使用或与其不一起使用时在昆虫功效方面没有显著的相互作用。所有真菌菌株都显著降低了在种植时在所有评估的杂交玉米基因型中掺入土壤时出现的成年玉米根萤叶甲的数量，当单独施用于DP-4114时，3213-1除外。然而，与单独的DP-4114相比，3213-1确实将出现的成虫的数量减少了20％以上。当在种植时掺入时，每种昆虫病原真菌提供的成年甲虫出现的减少是添加的，当与杀昆虫性状一起使用或与其不一起使用时没有显著的相互作用。由于针对玉米根萤叶甲的直接死亡率表明这些真菌是用于开发针对该昆虫的综合有害生物管理计划的重要新工具，使用这些真菌菌株提供了显著水平的根保护并减少了成虫出现。在一方面，菌株可以用作增加杀昆虫性状的耐久性。

实例6

商品种子处理生物测定方法学

对实例1中鉴定的昆虫病原真菌菌株进行全植物温室生物测定。真菌菌株作为生物种子处理，以1x10⁶-1x10⁷CFU/种子的靶浓度，与标准商品种子施用杀昆虫剂(噻虫嗪和氯虫苯甲酰胺)、杀真菌剂(嘧菌酯、咯菌腈、噻苯咪唑、甲霜灵和戊唑醇)和聚合物一起施用。分生孢子作为含水液体制剂施用，或者作为具有种子处理聚合物的干燥分生孢子顺序地施用至预先化学处理的种子。使用商品碗处理器施用真菌孢子的两种制剂和所有种子施用化学品。将种子种植到商品盆栽土和表土的50：50共混物中。阴性对照处理由没有真菌孢子、但用相同的标准和可商购的种子施用杀昆虫剂、杀真菌剂、着色剂、生物制品和聚合物处理的种子组成。该实验是具有两个因素(真菌菌株和基因型)的完整因子设计。使用的种子由与杀昆虫性状DP-4114(DP-4114、PCT/US 10/60818)或相同遗传背景的野生型植物(没有针对玉米根萤叶甲具有活性的杀昆虫性状)杂交的试商用杜邦先锋玉米杂交体组成。将(每种类型的)15个单独的杂交玉米种子种植到3.78L塑料盆中并保存在温室(80°F，15：9L：D)中，并根据需要浇水。当植物达到V2叶子阶段时，用100个非滞育中的玉米根萤叶甲的卵对植物进行侵染。每天监测植物并且在第一只甲虫出现后14天结束测定。在GH中以与以下文献中所述的相似的方式确定产生自每个盆的成年玉米根萤叶甲的数量：Meihls等人，(2008)PNAS 105：19177-19182。在那些生物测定中，成虫的出现没有被量化；在第一次甲虫出现时评估测定。在测定结束时，将植物切割至土壤线以上，并计算出现的成虫总数(表7)。然后清洗根球，并测定节点损伤评分(CRWNIS)(Oleson等人2005，Journal of EconomicEntomology[经济昆虫学杂志]98：1-8)。(表7)。

表7.

生物测定结果

在温室生物测定中评估的在两种制剂类型中的所有昆虫病原真菌菌株在作为种子处理以及常规种子施用化学品递送时显著减少了WT和DP-4114性状混合玉米上的根损伤的量。这是令人意想不到的，因为如实例8中所有具有针对丝状真菌的活性的玉米种子施用杀真菌剂显著减慢了绿僵菌属物种的生长和萌发。当作为种子处理施用时，每种昆虫病原性真菌提供的功效是添加的，当与DP-4114一起使用或与其不一起使用时，在昆虫功效方面没有显著的相互作用。这些真菌菌株的用途提供了显著水平的添加的根保护，并且减少了平均从每个盆中出现的成虫的数量。这些数据表明，这些真菌是用于开发针对玉米根萤叶甲的综合有害生物管理计划的重要新工具，并且甚至在存在杀真菌剂的情况下(不管是与杀真菌剂预先混合成液体还是施用于已经用杀真菌剂处理过的种子)，可以作为多种类型制剂中的种子处理来有效地递送。

实例7

土壤掺入生物测定方法学

对实验室生物测定中鉴定的有效的昆虫病原真菌菌株进行全植物温室生物测定。在种植到商品盆栽土和表土的50：50共混物之前以相当于田地施用2x10¹³CFU/英亩的量将真菌菌株立即掺入。阴性对照处理由未用真菌孢子改良的土壤组成。该实验是具有两个因素(真菌菌株和基因型)的完整因子设计。使用的种子由与杀昆虫性状(RyanR(DvSSJ1，2014/0275208和US2015/0257389))、IPD072(PCT/US 14/55128)或相同遗传背景的植物(没有针对玉米根萤叶甲的杀昆虫性状活性)杂交的玉米杂交体组成。将(每种类型的)15个单独的杂交玉米种子种植到3.78L塑料盆中并保存在温室(80°F，15：9L：D)中，并根据需要浇水。当植物达到V2叶子阶段时，用100个非滞育中的玉米根萤叶甲的卵对植物进行侵染。每天监测植物并且在第一只甲虫出现后14天结束测定。在GH中以与以下文献中所述的相似的方式确定产生自每个盆的成年玉米根萤叶甲的数量：Meihls等人，(2008)PNAS105：19177-19182。在测定结束时，将植物切割至土壤线以上，并计算出现的成虫总数(表8)。然后清洗根球，并测定节点损伤评分(CRWNIS)(Oleson等人2005，Journal of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]98：1-8)。(表8)。按照实例2计算预测的CRWNIS评分和成虫出现。

表8

*比较每种真菌菌株与给定每种基因型的阴性对照来进行成对比较。使用Dunnett多重性调整，并且如果小于0.05，则调整后的p值被认为是统计学显著的。在玉米杂种基因型(WT、DvSSJ1或IPD072)内来自相同GH生物测定的具有不同字母(“a”或“b”)(CRWNIS或成虫出现)的平均值显著不同(P＜0.05)。

生物测定结果

在温室生物测定中评估的所有昆虫病原真菌菌株均显著降低所评估的杂交玉米的所有基因型的根损伤量，当施用于DvSSJ1时，3213-1和23013-3菌株除外。当在种植时掺入时，每种昆虫病原性真菌所提供的功效是添加的，当与杀昆虫性状一起使用或与其不一起使用时在昆虫功效方面没有显著的相互作用。所有真菌菌株均显著降低了在种植时在所有评估的杂交玉米基因型中掺入土壤时出现的成年玉米根萤叶甲的数量，当施用于IPD072时，3213-1和23013-3菌株除外。然而，与单独的IPD072相比，3213-1确实将出现的成虫的数量减少了10％以上。当在种植时掺入时，每种昆虫病原真菌提供的成年甲虫出现的减少是添加的，当与杀昆虫性状一起使用或与其不一起使用时没有显著的相互作用。由于针对基于非苏云金芽孢杆菌的蛋白和RNAi杀昆虫性状的玉米根萤叶甲的直接死亡率，使用这些真菌菌株提供了显著水平的根保护和成虫出苗减少。结果表明，菌株可以用于增加非苏云金芽孢杆菌杀昆虫性状的耐久性。

实例8

绿僵菌属物种中杀真菌剂敏感性的测定

金龟子绿僵菌(15013-1)和罗伯茨绿僵菌(23013-3)的分生孢子是通过在23℃在荧光灯的连续照明下在马铃薯葡萄糖琼脂板上生长1至2周来制备的。从含有Tween-20(0.01％)的水中的板收获分生孢子并使用血细胞计数器计数。通过在24孔板中将5,000个分生孢子在0.5ml YMA(2g酵母提取物、4g麦芽提取物/升)的液体培养基中混合来确定杀真菌剂敏感性，所述液体培养基含有对丝状真菌有活性的不同浓度的可商购的杀真菌剂。将板在26℃孵育约24小时，然后用立体显微镜视觉观察评估生长情况。

表9.

15013-1(对照中为分生孢子，“无化合物”(NC)显示单一的长芽管，芽管直径＞20X。真菌生长完全填满了孔)。

“++++”意指与不含任何杀真菌剂的对照相比约50％或更多的生长。

“+++”意指与不含任何杀真菌剂的对照相比约30％或约70％抑制的生长。

“++”意指与不含任何杀真菌剂的对照相比约20％或约80％抑制的生长。

“+”意指与不含任何杀真菌剂的对照相比约10％或约90％抑制的生长。

“-”意指与不含任何杀真菌剂的对照相比不生长或完全抑制。

表10.

23013-3(对照中为分生孢子，“无化合物”(NC)分生孢子显示长芽管，芽管直径＞20X。真菌生长几乎完全填满了孔)。

结果

在具有抗丝状真菌活性的市售杀真菌种子处理中，金龟子绿僵菌和罗伯茨绿僵菌对活性成分敏感(表9和表10)。

实例9

对杀真菌剂有抗性的绿僵菌菌株的选择

分离对杀真菌剂有抗性的真菌菌株利用了这样的事实：对杀真菌剂的抗性最经常是由编码该杀真菌剂靶向的蛋白质的基因中的单点突变引起的。该点突变导致蛋白质中的氨基酸改变，这减少杀真菌剂与靶蛋白质的结合并赋予携带这种突变的菌株对杀真菌剂具有高水平的抗性。以下列方式选择对杀真菌剂有抗性的真菌分离物。绿僵菌属的分生孢子是通过在23℃在荧光灯的连续照明下在马铃薯葡萄糖琼脂板上生长1至2周来生产的。分生孢子被收获，计数并在水中稀释至10,000,000/ml。然后将分生孢子暴露于不同时间长度的诱变剂。例如，分生孢子可暴露于紫外线持续0.5至3分钟或暴露于甲磺酸乙酯(2％-3％，持续30至60分钟)。在暴露于诱变剂后，允许分生孢子通过将它们包埋在熔化的YMA低熔点琼脂糖中而恢复并表达蛋白质的抗性形式。将板在26℃孵育约24小时。在恢复期之后，通过用含有选择性杀真菌剂的第二层YMA琼脂糖覆盖分生孢子来将分生孢子暴露于选择性化合物(例如，嘧菌酯、咯菌腈、或噻菌灵)。杀真菌剂的使用浓度比抑制真菌生长所需的最低浓度高约10倍。然后将含有在杀真菌剂存在下生长的分生孢子的板孵育3天至10天并定期监测真菌生长的存在。当发现生长的菌落时，将它们从选择板上无菌地移出并转移到新的生长培养基中。在没有杀真菌剂的培养基上生长后，通过将分离物暴露于各种浓度的杀真菌剂及其与野生型菌株相比的敏感性来测试分离菌的抗真菌剂抗性。预期选择的菌株在包含杀真菌剂或对植物或植物部分的其他杀真菌施用的种子处理存在下显示出更高的抑制植物病原体、有害生物或昆虫的功效。

实例10

测试的12个位点位于北美商品玉米种植区，在此发生了玉米根萤叶甲(WCRW)和北方玉米根虫(NCRW)的侵染。位置种植包括：布鲁金斯(Brookings)，SD；古德兰(Goodland)，IN；福勒(Fowler)，IN；(2)约翰斯顿(Johnston)，IA；西摩(Seymour)，IL；曼卡多(Mankato)，MN；约克郡(York)，NE；格拉夫顿(Grafton)，NE；和罗谢尔(Rochelle)，IL。

实验单元包含如实例6中处理的种子，并种植在长度为10英尺、行距为30英寸的玉米的单排地块(single-row plot)中。每个处理4个重复，以玉米基因型作为主要地块，种子处理作为主地块的裂区设计。每个实验单位在早期营养阶段被大约750个西方玉米根虫的卵侵染，并且挖掘了2个植物/实验单位并分配了CRWNIS。使用两种未定向的玉米杂交种。将真菌菌株与标准商品种子施用杀昆虫剂(噻虫嗪和氯虫苯甲酰胺)、杀真菌剂(嘧菌酯、咯菌腈、噻苯咪唑、甲霜灵和戊唑醇)和聚合物一起施用于种子。每种杀昆虫剂(250mg活性成分/种子)的比率是控制玉米某些次生昆虫有害生物的标记率。然而，在使用的比率下，标准的杀昆虫种子处理都不能提供抗玉米根虫的活性。用于CRW控制的阳性种子处理对照是PonchoVotivo

在田间试验结束时，将植物切割至土壤线以上，然后清洗根球，并测定节点损伤评分(CRWNIS)(Oleson等人2005，Journal of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]98：1-8)。

统计分析：

使用TTRS(转基因性状研究系统)访问的ASReml软件3.0版本被用于拟合线性混合模型并测试目的对比。为了更好地满足模型假设，在分析之前，使用平方根变换对CRWINS观测值进行变换。报道了逆转换后种子处理的最佳线性无偏估计。如果差异测试的p值小于0.05，则在种子处理之间进行成对比较，其中差异被认为是统计学显著的。

结果

评估它们抗WCRW和NCRW活性的功效时；信息最丰富的位置是昆虫压力较高的那些位置(CRW摄食＞1.5个节点)。当来自2015田间试验(约翰斯敦(Johnston)，IA和约克(York)，NE)的两个高压位置合并用于分析时，在0.05置信水平与阴性对照相比，将3213-1菌株的液体制剂作为种子处理施用于未定向的基因型提供了统计上显著的根保护(图1)。在高玉米根虫压力下，来自3213-1液体制剂的未经处理的基因型的控制水平在统计学上类似于目前用于玉米根虫控制的商品化学标准种子处理(Poncho Votivo

)所提供的功效(图1)。两种制剂(液体和干燥顺序)中的所有真菌菌株的相对总体性能改善了未定向的杂交种的根保护，相对于阴性对照改善了大约0.25个节点。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请指示了本公开所属领域技术人员的水平。将所有出版物、专利和专利申请通过引用结合，其程度就像明确且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请通过引用结合一样。

虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式对前述公开进行了详细描述，但是在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。

Claims

1.一种组合物，所述组合物包含农业上可接受的载体、植物或植物部分、和作为专利保藏号NRRL 67073保藏的真菌昆虫病原体金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)15013-1。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的生物控制剂：细菌、真菌、原生动物、病毒、昆虫病原线虫、植物提取物、蛋白质、核酸、次级代谢物、和接种剂。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含酵母。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的农用化学活性化合物：杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、和杀线虫剂。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述农用化学活性化合物是杀真菌剂。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述杀真菌剂包含选自由以下组成的组的杀真菌剂组合物：嘧菌酯、噻菌灵、咯菌腈、甲霜灵、戊唑醇、丙硫菌唑、种菌唑、戊苯吡菌胺、和氟唑环菌胺。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：安全剂、脂质几丁寡糖、三葡糖胺脂质甘氨酸盐、异黄酮和利阿诺定受体调节剂。

8.如权利要求1所述的组合物，其中所述植物或所述植物部分是遗传修饰的或转基因的。

9.如权利要求8所述的组合物，其中所述遗传修饰的植物部分是种子。

10.如权利要求8所述的组合物，其中所述遗传修饰的植物部分是叶。

11.如权利要求1所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体在杀真菌剂的存在下保留杀昆虫活性或对杀真菌剂有抗性。

12.如权利要求1所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含孢子。

13.如权利要求1所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含分生孢子。

14.如权利要求1所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含微菌核。

15.一种组合物，所述组合物包含遗传修饰的或转基因的植物或植物部分和作为专利保藏号NRRL 67073保藏的真菌昆虫病原体金龟子绿僵菌15013-1，所述遗传修饰的或转基因的植物或植物部分包含性状。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述性状控制鞘翅目(Coleopteran)植物有害生物。

17.如权利要求16所述的组合物，其中所述鞘翅目植物有害生物是玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)、北方玉米根虫(Diabrotica barberi)、或南美叶甲(Diabrotica speciosa)植物有害生物。

18.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的生物控制剂：细菌、真菌、原生动物、病毒、昆虫病原线虫、植物提取物、蛋白质、核酸、次级代谢物、和接种剂。

19.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物还包含酵母。

20.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的农用化学活性化合物：杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、和杀线虫剂。

21.如权利要求20所述的组合物，其中所述农用化学活性化合物是杀真菌剂。

22.如权利要求21所述的组合物，其中所述杀真菌剂包含选自由以下组成的组的杀真菌剂组合物：嘧菌酯、噻菌灵、咯菌腈、甲霜灵、戊唑醇、丙硫菌唑、种菌唑、戊苯吡菌胺、和氟唑环菌胺。

23.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：安全剂、脂质几丁寡糖、三葡糖胺脂质甘氨酸盐、异黄酮和利阿诺定受体调节剂。

24.如权利要求15所述的组合物，其中所述遗传修饰的植物或转基因的植物或植物部分还包含选自由以下组成的组的另外的性状：杀昆虫性状和除草剂耐受性性状。

25.如权利要求15所述的组合物，其中所述遗传修饰的植物部分是种子。

26.如权利要求15所述的组合物，其中所述遗传修饰的植物部分是叶。

27.如权利要求15所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含孢子。

28.如权利要求15所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含分生孢子。

29.如权利要求15所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含微菌核。

30.如权利要求15所述的组合物，其中所述性状包含鞘翅目杀昆虫性状。

31.如权利要求30所述的组合物，其中所述鞘翅目杀昆虫性状包含选自由以下组成的组的转殖项：转殖项MON863、转殖项MIR604、转殖项5307、转殖项DAS-59122、转殖项DP-4114、转殖项MON 87411、和转殖项MON88017。

32.如权利要求30所述的组合物，其中所述鞘翅目杀昆虫性状包含选自由以下组成的组的非Bt杀昆虫性状：杀昆虫蛋白质和沉默元件。

33.如权利要求32所述的组合物，其中所述杀昆虫蛋白质选自由以下组成的组：植物衍生的杀昆虫蛋白质、非Bt细菌/古细菌衍生的杀昆虫蛋白质、动物衍生的杀昆虫蛋白质、美国专利公开US20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽、美国系列号13/839702的PHI-4多肽、PCT系列号PCT/US14/51063的PIP-47多肽、PCT系列号PCT/US 14/55128的PIP-72多肽、PCT公开号WO2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽、PCT公开号WO2015/120276的PtIP-83多肽、和PCT系列号PCT/US15/55502的PtIP-96多肽。

34.如权利要求32所述的组合物，其中所述沉默元件靶向选自由以下组成的组的基因：PAT3，RyanR，Sec23，Snf7，vATP酶，COPIα、β、或γ外被体亚基，和RPS10。

35.一种组合物，所述组合物包含杀真菌剂和作为专利保藏号NRRL 67073保藏的真菌昆虫病原体金龟子绿僵菌15013-1。

36.如权利要求35所述的组合物，其中所述组合物还包含种子处理制剂或叶面施用制剂。

37.如权利要求35所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的生物控制剂：细菌、真菌、原生动物、病毒、昆虫病原线虫、植物提取物、蛋白质、核酸、次级代谢物、和接种剂。

38.如权利要求35所述的组合物，其中所述组合物还包含酵母。

39.如权利要求35所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的农用化学活性化合物：杀昆虫剂、杀细菌剂、和杀线虫剂。

40.如权利要求39所述的组合物，其中所述农用化学活性化合物是杀昆虫剂。

41.如权利要求35所述的组合物，其中所述杀真菌剂包含选自由以下组成的组的杀真菌剂组合物：嘧菌酯、噻菌灵、咯菌腈、甲霜灵、戊唑醇、丙硫菌唑、种菌唑、戊苯吡菌胺、和氟唑环菌胺。

42.如权利要求35所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：安全剂、脂质几丁寡糖、三葡糖胺脂质甘氨酸盐、异黄酮和利阿诺定受体调节剂。

43.如权利要求35所述的组合物，所述组合物还包含遗传修饰的或转基因的植物或植物部分。

44.如权利要求43所述的组合物，其中所述遗传修饰的植物部分是种子。

45.如权利要求43所述的组合物，其中所述遗传修饰的植物部分是叶。

46.如权利要求35所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含孢子。

47.如权利要求46所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含分生孢子。

48.如权利要求46所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含微菌核。

49.如权利要求43所述的组合物，其中所述遗传修饰的或转基因的植物或植物部分包含鞘翅目杀昆虫性状。

50.如权利要求49所述的组合物，其中所述鞘翅目杀昆虫性状包含选自由以下组成的组的转殖项：转殖项MON863、转殖项MIR604、转殖项5307、转殖项DAS-59122、转殖项DP-4114、转殖项MON 87411、和转殖项MON88017。

51.如权利要求49所述的组合物，其中所述鞘翅目杀昆虫性状包含选自由以下组成的组的非Bt杀昆虫性状：杀昆虫蛋白质和沉默元件。

52.如权利要求51所述的组合物，其中所述杀昆虫蛋白质选自由以下组成的组：植物衍生的杀昆虫蛋白质、非Bt细菌/古细菌衍生的杀昆虫蛋白质、动物衍生的杀昆虫蛋白质、美国专利公开US20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽、美国系列号13/839702的PHI-4多肽、PCT系列号PCT/US14/51063的PIP-47多肽、PCT系列号PCT/US 14/55128的PIP-72多肽、PCT公开号WO2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽、PCT公开号WO2015/120276的PtIP-83多肽、和PCT系列号PCT/US15/55502的PtIP-96多肽。

53.如权利要求51所述的组合物，其中所述沉默元件靶向选自由以下组成的组的基因：PAT3，RyanR，Sec23，Snf7，vATP酶，COPIα、β、或γ外被体亚基，和RPS10。

54.一种组合物，所述组合物包含作为专利保藏号NRRL 67073保藏的真菌昆虫病原体金龟子绿僵菌15013-1和遗传修饰的或转基因的植物或植物部分，所述植物或植物部分包含非Bt杀昆虫性状，其中所述非Bt杀昆虫性状包含杀昆虫蛋白质或沉默元件。

55.如权利要求54所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的生物控制剂：细菌、真菌、原生动物、病毒、昆虫病原线虫、植物提取物、蛋白质、核酸、次级代谢物、和接种剂。

56.如权利要求54所述的组合物，其中所述组合物还包含酵母。

57.如权利要求54所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的农用化学活性化合物：杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、和杀线虫剂。

58.如权利要求57所述的组合物，其中所述农用化学活性化合物是杀真菌剂。

59.如权利要求58所述的组合物，其中所述杀真菌剂包含选自由以下组成的组的杀真菌剂组合物：嘧菌酯、噻菌灵、咯菌腈、甲霜灵、戊唑醇、丙硫菌唑、种菌唑、戊苯吡菌胺、和氟唑环菌胺。

60.如权利要求54所述的组合物，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：安全剂、脂质几丁寡糖、三葡糖胺脂质甘氨酸盐、异黄酮和利阿诺定受体调节剂。

61.如权利要求54所述的组合物，其中所述遗传修饰的植物部分是种子。

62.如权利要求54所述的组合物，其中所述遗传修饰的植物部分是叶。

63.如权利要求54所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含孢子。

64.如权利要求54所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含分生孢子。

65.如权利要求54所述的组合物，其中所述真菌昆虫病原体包含微菌核。

66.如权利要求54所述的组合物，其中所述杀昆虫蛋白质选自由以下组成的组：植物衍生的杀昆虫蛋白质、非Bt细菌/古细菌衍生的杀昆虫蛋白质、动物衍生的杀昆虫蛋白质、美国专利公开US20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽、美国系列号13/839702的PHI-4多肽、PCT系列号PCT/US14/51063的PIP-47多肽、PCT系列号PCT/US 14/55128的PIP-72多肽、PCT公开号WO2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽、PCT公开号WO2015/120276的PtIP-83多肽、和PCT系列号PCT/US15/55502的PtIP-96多肽。

67.如权利要求54所述的组合物，其中所述沉默元件靶向选自由以下组成的组的基因：PAT3，RyanR，Sec23，Snf7，vATP酶，COPIα、β、或γ外被体亚基，和RPS10。

68.一种增加植物对植物病原体、有害生物、或昆虫的抗性的方法，所述方法包括用组合物接种植物、植物部分、或植物的环境或植物部分的环境，所述组合物包含作为专利保藏号NRRL 67073保藏的真菌昆虫病原体金龟子绿僵菌15013-1。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的生物控制剂：细菌、真菌、原生动物、病毒、昆虫病原线虫、植物提取物、蛋白质、核酸、次级代谢物、和接种剂。

70.如权利要求68所述的方法，其中所述组合物还包含酵母。

71.如权利要求68所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的农用化学活性化合物：杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、和杀线虫剂。

72.如权利要求71所述的方法，其中所述农用化学活性化合物是杀真菌剂。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述杀真菌剂包含选自由以下组成的组的杀真菌剂组合物：嘧菌酯、噻菌灵、咯菌腈、甲霜灵、戊唑醇、丙硫菌唑、种菌唑、戊苯吡菌胺、和氟唑环菌胺。

74.如权利要求68所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：安全剂、脂质几丁寡糖、三葡糖胺脂质甘氨酸盐、异黄酮和利阿诺定受体调节剂。

75.如权利要求68所述的方法，其中所述植物、植物部分、或植物的环境或植物部分的环境还包含遗传修饰的或转基因的植物或遗传修饰的或转基因的植物部分、或遗传修饰的或转基因的植物的环境或遗传修饰的或转基因的植物部分的环境。

76.如权利要求75所述的方法，其中所述遗传修饰的或转基因的植物或遗传修饰的或转基因的植物部分包含鞘翅目杀昆虫性状。

77.如权利要求76所述的方法，其中所述鞘翅目杀昆虫性状包含Bt性状、沉默元件或非Bt杀昆虫蛋白质。

78.如权利要求68所述的方法，其中所述植物部分是种子。

79.如权利要求68所述的方法，其中所述植物部分是叶。

80.如权利要求68所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含孢子。

81.如权利要求68所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含分生孢子。

82.如权利要求68所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含微菌核。

83.如权利要求77所述的方法，其中所述非Bt杀昆虫蛋白质选自由以下组成的组：植物衍生的杀昆虫蛋白质、非Bt细菌/古细菌衍生的杀昆虫蛋白质、动物衍生的杀昆虫蛋白质、美国专利公开US20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽、美国系列号13/839702的PHI-4多肽、PCT系列号PCT/US14/51063的PIP-47多肽、PCT系列号PCT/US 14/55128的PIP-72多肽、PCT公开号WO2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽、PCT公开号WO2015/120276的PtIP-83多肽、和PCT系列号PCT/US15/55502的PtIP-96多肽。

84.如权利要求77所述的方法，其中所述沉默元件靶向选自由以下组成的组的基因：PAT3，RyanR，Sec23，Snf7，vATP酶，COPIα、β、或γ外被体亚基，和RPS10。

85.如权利要求77所述的方法，其中所述Bt性状包含选自由以下组成的组的转殖项：转殖项MON863、转殖项MIR604、转殖项5307、转殖项DAS-59122、转殖项DP-4114、转殖项MON87411、和转殖项MON88017。

86.一种增加遗传修饰的或转基因的植物或植物部分的鞘翅目杀昆虫性状对植物病原体、有害生物、或昆虫的耐久性的方法，所述方法包括用组合物接种遗传修饰的或转基因的植物或植物部分，所述组合物包含作为专利保藏号NRRL 67073保藏的真菌昆虫病原体金龟子绿僵菌15013-1，其中所述遗传修饰的或转基因的植物或植物部分包含鞘翅目杀昆虫性状。

87.如权利要求86所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的生物控制剂：细菌、真菌、原生动物、病毒、昆虫病原线虫、植物提取物、蛋白质、核酸、次级代谢物、和接种剂。

88.如权利要求86所述的方法，其中所述组合物还包含酵母。

89.如权利要求86所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的农用化学活性化合物：杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、和杀线虫剂。

90.如权利要求89所述的方法，其中所述农用化学活性化合物是杀真菌剂。

91.如权利要求90所述的方法，其中所述杀真菌剂包含选自由以下组成的组的杀真菌剂组合物：嘧菌酯、噻菌灵、咯菌腈、甲霜灵、戊唑醇、丙硫菌唑、种菌唑、戊苯吡菌胺、和氟唑环菌胺。

92.如权利要求86所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：安全剂、脂质几丁寡糖、三葡糖胺脂质甘氨酸盐、异黄酮和利阿诺定受体调节剂。

93.如权利要求86所述的方法，其中所述鞘翅目杀昆虫性状包含Bt性状、沉默元件或非Bt杀昆虫蛋白质。

94.如权利要求86所述的方法，其中所述遗传修饰的植物部分是种子。

95.如权利要求86所述的方法，其中所述遗传修饰的植物部分是叶。

96.如权利要求86所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含孢子。

97.如权利要求86所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含分生孢子。

98.如权利要求86所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含微菌核。

99.如权利要求93所述的方法，其中所述非Bt杀昆虫蛋白质选自由以下组成的组：植物衍生的杀昆虫蛋白质、非Bt细菌/古细菌衍生的杀昆虫蛋白质、动物衍生的杀昆虫蛋白质、美国专利公开US20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽、美国系列号13/839702的PHI-4多肽、PCT系列号PCT/US14/51063的PIP-47多肽、PCT系列号PCT/US 14/55128的PIP-72多肽、PCT公开号WO2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽、PCT公开号WO2015/120276的PtIP-83多肽、和PCT系列号PCT/US15/55502的PtIP-96多肽。

100.如权利要求93所述的方法，其中所述沉默元件靶向选自由以下组成的组的基因：PAT3，RyanR，Sec23，Snf7，vATP酶，COPIα、β、或γ外被体亚基，和RPS10。

101.如权利要求93所述的方法，其中所述Bt性状包含选自由以下组成的组的转殖项：转殖项MON863、转殖项MIR604、转殖项5307、转殖项DAS-59122、转殖项DP-4114、转殖项MON87411、和转殖项MON88017。

102.一种增加植物对植物病原体、有害生物、或昆虫的抗性的方法，所述方法包括用组合物接种植物、植物部分、或植物的环境或植物部分的环境，所述组合物包含杀真菌剂和作为专利保藏号NRRL 67073保藏的真菌昆虫病原体金龟子绿僵菌15013-1。

103.如权利要求102所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的生物控制剂：细菌、真菌、原生动物、病毒、昆虫病原线虫、植物提取物、蛋白质、核酸、次级代谢物、和接种剂。

104.如权利要求102所述的方法，其中所述组合物还包含酵母。

105.如权利要求102所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的农用化学活性化合物：杀昆虫剂、杀细菌剂、和杀线虫剂。

106.如权利要求105所述的方法，其中所述农用化学活性化合物是杀昆虫剂。

107.如权利要求106所述的方法，其中所述杀真菌剂包含选自由以下组成的组的杀真菌剂组合物：嘧菌酯、噻菌灵、咯菌腈、甲霜灵、戊唑醇、丙硫菌唑、种菌唑、戊苯吡菌胺、和氟唑环菌胺。

108.如权利要求102所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：安全剂、脂质几丁寡糖、三葡糖胺脂质甘氨酸盐、异黄酮和利阿诺定受体调节剂。

109.如权利要求102所述的方法，其中所述植物、植物部分、或植物的环境或植物部分的环境还包含遗传修饰的或转基因的植物、遗传修饰的或转基因的植物部分、或遗传修饰的或转基因的植物的环境或遗传修饰的或转基因的植物部分的环境。

110.如权利要求109所述的方法，其中所述遗传修饰的或转基因的植物或遗传修饰的或转基因的植物部分包含鞘翅目杀昆虫性状。

111.如权利要求110所述的方法，其中所述鞘翅目杀昆虫性状包含Bt性状、沉默元件或非Bt杀昆虫蛋白质。

112.如权利要求102所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含孢子。

113.如权利要求102所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含分生孢子。

114.如权利要求102所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含微菌核。

115.如权利要求111所述的方法，其中所述非Bt杀昆虫蛋白质选自由以下组成的组：植物衍生的杀昆虫蛋白质、非Bt细菌/古细菌衍生的杀昆虫蛋白质、动物衍生的杀昆虫蛋白质、美国专利公开US20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽、美国系列号13/839702的PHI-4多肽、PCT系列号PCT/US14/51063的PIP-47多肽、PCT系列号PCT/US 14/55128的PIP-72多肽、PCT公开号WO2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽、PCT公开号WO2015/120276的PtIP-83多肽、和PCT系列号PCT/US15/55502的PtIP-96多肽。

116.如权利要求111所述的方法，其中所述沉默元件靶向选自由以下组成的组的基因：PAT3，RyanR，Sec23，Snf7，vATP酶，COPIα、β、或γ外被体亚基，和RPS10。

117.如权利要求111所述的方法，其中所述Bt性状包含选自由以下组成的组的转殖项：转殖项MON863、转殖项MIR604、转殖项5307、转殖项DAS-59122、转殖项DP-4114、转殖项MON87411、和转殖项MON88017。

118.一种增加遗传修饰的或转基因的植物或植物部分的非Bt杀昆虫性状对植物病原体、有害生物、或昆虫的耐久性的方法，所述方法包括用包含作为专利保藏号NRRL 67073保藏的真菌昆虫病原体金龟子绿僵菌15013-1的组合物接种遗传修饰的或转基因的植物或植物部分，其中所述遗传修饰的或转基因的植物或植物部分包含鞘翅目杀昆虫性状。

119.如权利要求118所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的生物控制剂：细菌、真菌、原生动物、病毒、昆虫病原线虫、植物提取物、蛋白质、核酸、次级代谢物、和接种剂。

120.如权利要求118所述的方法，其中所述组合物还包含酵母。

121.如权利要求118所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的农用化学活性化合物：杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、和杀线虫剂。

122.如权利要求121所述的方法，其中所述农用化学活性化合物是杀真菌剂。

123.如权利要求121所述的方法，其中所述杀真菌剂包含选自由以下组成的组的杀真菌剂组合物：嘧菌酯、噻菌灵、咯菌腈、甲霜灵、戊唑醇、丙硫菌唑、种菌唑、戊苯吡菌胺、和氟唑环菌胺。

124.如权利要求118所述的方法，其中所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：安全剂、脂质几丁寡糖、三葡糖胺脂质甘氨酸盐、异黄酮和利阿诺定受体调节剂。

125.如权利要求118所述的方法，其中所述鞘翅目杀昆虫性状包含沉默元件或非Bt杀昆虫蛋白质。

126.如权利要求118所述的方法，其中所述遗传修饰的植物部分是种子。

127.如权利要求118所述的方法，其中所述遗传修饰的植物部分是叶。

128.如权利要求118所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含孢子。

129.如权利要求118所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含分生孢子。

130.如权利要求118所述的方法，其中所述真菌昆虫病原体包含微菌核。

131.如权利要求125所述的方法，其中所述非Bt杀昆虫蛋白质选自由以下组成的组：植物衍生的杀昆虫蛋白质、非Bt细菌/古细菌衍生的杀昆虫蛋白质、动物衍生的杀昆虫蛋白质、美国专利公开US20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽、美国系列号13/839702的PHI-4多肽、PCT系列号PCT/US14/51063的PIP-47多肽、PCT系列号PCT/US 14/55128的PIP-72多肽、PCT公开号WO2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽、PCT公开号WO2015/120276的PtIP-83多肽、和PCT系列号PCT/US15/55502的PtIP-96多肽。

132.如权利要求125所述的方法，其中所述沉默元件靶向选自由以下组成的组的基因：PAT3，RyanR，Sec23，Snf7，vATP酶，COPIα、β、或γ外被体亚基，和RPS10。