CN1137137C - 来自致病杆菌的杀昆虫蛋白毒素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组合物，其中包含有效量的具有抵抗昆虫的功能性活性的致病杆菌蛋白毒素，所述蛋白毒素来自天然分子大小至少100KDa的蛋白，并且由嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdusnematophilus)、波氏致病杆菌(Xenorhabdus poinarii)、伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)、贝氏致病杆菌(Xenorhabdusbeddingii)或其它致病杆菌属种类的纯化培养物产生。本发明还涉及通过对昆虫施用有效量的所述致病杆菌蛋白毒素来控制昆虫的方法。

Description

来自致病杆菌的杀昆虫蛋白毒素
本专利申请要求出自美国临时专利申请序号60/045,641(1997年5月5日提交)的优先权。
发明领域
本发明涉及从细菌中分离的毒素及其该毒素作为杀昆虫剂的应用。
发明背景
过去，一直对用生物制剂作为控制害虫的一种选择感兴趣。得到开发的一种这样的方法是使用某些线虫属控制昆虫的潜力。诸如Steinernema和Heterorhabditis属的线虫可用做生物制剂的部分原因是它们分别可转播致病杆菌属和光杆状菌属的杀昆虫细菌共生体。一旦进入昆虫体内，这些线虫将它们的细菌共生体释放至昆虫血淋巴中，这些细菌在昆虫血淋巴中繁殖并最终导致昆虫死亡。然后线虫在昆虫尸体内发育和繁殖。含有细菌的线虫后代作为侵染性幼虫离开昆虫尸体，然后它可以侵入其它的幼虫，从而重复导致线虫繁殖的循环。尽管此循环易于微量操作，但是为了有效地作为广泛使用的杀昆虫剂，需要在实验室条件下向大规模进行此循环转变，这是非常困难和昂贵的，并且不能有效地生产、维持、分装和应用。
除了诸如线虫的控制害虫的生物方法，目前还有一些天然来源的可商业购买的杀虫控制试剂。这些天然来源方法与化学合成方法同样有效。这样的天然存在的试剂之一是从细菌苏云金芽孢杆菌(Bt)得到的晶体蛋白毒素。这些蛋白毒素已配制成可喷洒的昆虫控制试剂。Bt技术更近期的应用已将合成毒素的基因分离并转入植物中。随后转基因植物合成Bt毒素，由此控制昆虫(见美国专利号5,380,831、5,567,600和5,567,862，授予Mycogen，San Diego，CA)。
转Bt基因植物十分有效并且预计将在某些作物和地区中大量使用。这种方法引起了一种关注，即比传统的喷洒施用更快产生的抗性控制问题。因此，非常需要开发其它与Bt不同的合成毒素的细菌来源，这种细菌来源可用于转基因植物策略，或与Bt结合用于产生控制昆虫的转基因植物。
现有技术已知，致病杆菌属与Steinernema属线虫共生。不利地是，如在许多文章中所报道的，此细菌只有在注射入昆虫幼虫体内时才有杀昆虫活性，而在经口摄入时不表现生物活性[见Jarosz J.等，“杀幼虫毒素参与杆状线虫(Steinernema Feltiae和Heterorhabfitis bacteriophora)昆虫寄生的致病机理”Entomophage，36(3)，1991，361-368；Balcerzak，Malgorzata“对由内生线虫(Steinernema Feltiae和Heterorhabditisbacteriophors I)引起的寄生进行比较研究，线虫-细菌复合物及相关细菌本身在致病机理中的作用”Acta Parasitologica Polonica，1991，36(4)，175-181]。
因为上述原因，难以有效地利用线虫或其细菌共生体的杀昆虫特性。因此，很有必要发掘来自致病杆菌属细菌的具有经口摄入活性的蛋白试剂，以便能将由此得到的产物配制成可喷洒的杀昆虫剂或者分离编码该蛋白试剂的细菌基因以用于产生转基因植物。在申请人的发明之前，还没有可合成确定具有经口摄入活性的蛋白毒素的已知致病杆菌属菌种或菌株。
发明概述
由致病杆菌属正在生长的细菌细胞合成和分泌的天然毒素是蛋白复合物。此蛋白复合物具有从约800到约3300KDa之间变动的天然分子大小，经SDA-PAGE凝胶分析可分成很多蛋白组分。该毒素一旦与昆虫接触，表现出针对多种昆虫的明显毒性。而且，通过改变培养基条件可改进毒素活性。另外，该毒素具有蛋白的特性，其特征在于其活性是热不稳定性的并且对蛋白水解敏感。
本发明提供了易于施用的杀昆虫蛋白。
本发明也提供了施用杀昆虫毒素的方法，所述毒素具有功能性活性并有效地抵抗多种目的昆虫。
通过下面的说明，本发明的目的、优点及特征将变得更加清楚。
附图简述
图1是通过使用一套特定引物的rep-PCR确定的致病杆菌属菌株的亲缘关系图。图1上方的轴线是根据rep-PCR产物记录测量的菌株间相似百分数[即，0.0(无相似性)-1.0(100％相似)]。在右边的轴线上，数字和字母表示所测的各种菌株。分离的水平平线之间的垂直线表示以水平线上表示的菌株或菌株群(例如菌种DEX1与菌种X.nem有约83％的相似性)之间的相关程度(从垂直线与上方轴线的外推交叉点读出)。
发明详述
本发明涉及由致病杆菌属细菌合成的独特杀昆虫蛋白毒素种类的开发，该毒素如此处所述的具有经口摄入的抵抗昆虫的功能性活性。致病杆菌属菌种/菌株可从各种来源分离。这样的来源之一是昆虫致病线虫，更具体地Steinernema属线虫或由这些线虫侵染的昆虫尸体。也可能是可以容纳合成杀昆虫毒素的致病杆菌属细菌的其它来源。所述毒素具有如此处定义的功能性活性。在自然环境中这样的来源可以是陆生的或水生的。
致病杆菌属在分类学上为肠杆菌科的成员，尽管它有某些非此科典型特征的特征。例如，该属的菌株是典型的硝酸盐还原阴性和过氧化氢酶阴性。约三年前，致病杆菌属又分出第二个属；即只含一种发光光杆状菌(以前称发光致病杆菌)的光杆状菌属(Boemare等，1993，国际系统细菌学杂志，43，249-255)。这种区别是基于几个容易由熟练技术人员鉴定的不同特征。这些不同包括：DNA-DNA杂交研究结果；过氧化氢酶表型存在(光杆状菌属)或缺失(致病杆菌属)；生物发光现象的存在(光杆状菌属)或缺失(致病杆菌属)；线虫宿主的家族，其中致病杆菌属在Steinernematidae科中发现而光杆状菌属在Heterorhabditidae科中发明；以及细胞脂肪酸的比较分析(Janse等，1990，应用微生物学通讯，10，131-135；Suzuki等，1990，普通应用微生物杂志，36，393-401)。另外，最近集中于16s rRNA基因的序列(Rainey等，1995，国际系统细菌学杂志，45，379-381)和限制性分析(Brunel，等，1997，应用环境微生物学，63，574-580)的分子研究也支持这两个属的分开。这种命名法的改变包括在本说明书中，将来命名法的改变不应改变此处所述的本发明的范围。
为了确定此处公开的菌株是致病杆菌属菌株，这些菌株通过定义致病杆菌属菌种/菌株并将它们与其它肠杆菌科和光状杆菌属菌种/菌株区分开的识别特征来鉴定(Farmer，1984，Bergey系统细菌学手册，第1卷，第510-511页，Akhurst和Boemare，1988，普通微生物学杂志，134，第1835-1845页，Boemare等，1993，国际系统细菌学杂志，43，第249-255页；此处引用作为参考)。致病杆菌属的特征如下：革兰氏染色阴性杆菌，微生物大小0.3-2×2-10μm，白色-黄色/褐色菌落的色素形成，包涵体的存在，过氧化氢酶的缺失，不能还原硝酸盐，没有生物发光现象，从培养基摄入染料的能力，白明胶水解阳性，能够在肠杆菌科选择培养基上生长，生长温度低于37℃，厌氧条件下存活，和移动性。
目前，细菌致病杆菌属包括4种确认的种，嗜线虫致病杆菌、波氏致病杆菌、伯氏致病杆菌及贝氏致病杆菌(Brunel等，1997，应用环境微生物学，63，574-580)。文献中已描述一系列的相关菌株(例如Akhurst和Boemare，1988，普通微生物学杂志，134，1835-1845；Boemare等，1993，国际系统细菌学杂志，43，第249-255页，Putz等，1990，应用环境微生物学，56，181-186；Brunel等，1997，应用环境微生物学，63，574-580，Rainey等，1995，国际系统细菌学杂志，45，379-381)。此处已有多种致病杆菌属菌株得到鉴定。这些菌株及其特征列于实施例的表1中。这些菌株已保藏于农业研究机构保藏中心(NRRL)，地址为1815 North UnivesityStreet Peoria，Illinosi 61604，美国。如从图1可看到的，这些菌株是不同的。可以预见，将来可能有其它的致病杆菌属种类，它们将具有所述菌种的一些或全部特征和目前未定义为致病杆菌属特性的不同特征。然而，不管其它的特性和特征，此处本发明的范围是任何合成如此处所述的具有作为经口活化的昆虫控制试剂的功能性活性的蛋白的致病杆菌属菌种或菌株。本发明进一步包括此处指定的菌株及其突变株或相变体。
此处所用的具特定含义的其它术语如下：
对于“功能性活性(functional activity)”，此处是指蛋白毒素作用为经口活化的昆虫控制试剂，即该蛋白具有毒性效力或能够中断或推迟昆虫进食，它可能导致昆虫死亡也可能不导致昆虫死亡。当昆虫与经转基因植物表达、配制蛋白组合物、可喷洒的蛋白组合物、诱饵基质或其它传递系统传递的有效剂量的来自致病杆菌属的毒素接触时，结果通常是昆虫的死亡或昆虫不从将毒素提供给昆虫的来源进食。
对于“天然大小”，是指由感兴趣的致病杆菌属菌株合成的蛋白毒素或蛋白毒素亚单位在任何处理或修饰之前的非变性大小。蛋白的天然大小可以通过熟练技术人员可用的一系列方法测定，这些方法包括但不限于凝胶过滤层析、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳，质谱分析、沉淀系数等。可以通过蛋白水解、突变、基因截短、蛋白去折叠和其它这样的蛋白质生物化学和分子生物学领域的技术人员熟知可使用的技术进行改变蛋白质天然大小的处理或修饰。
此处讨论的蛋白毒素通常称为“杀昆虫剂”。对于“杀昆虫剂”，此处是指具有如此处进一步定义的功能性活性并用作昆虫控制试剂的蛋白毒素。
此处所用的术语“有毒的”或“毒性”是指提供由致病杆菌合成的具有如此处定义的“功能性活性”的毒素。
术语“致病杆菌毒素”包括由致病杆菌属微生物菌株合成的具有抵抗昆虫的功能性活性的任何蛋白，其中致病杆菌毒素可配制成可喷洒的组合物、可由转基因植物表达、可配制成诱饵基质、可通过以杆状病毒、植物RNA病毒为基础的系统传递或通过其它适用的宿主或载体系统传递。
表1中列出的所选菌株的发酵培养基用来检测下列项目：由致病杆菌属细菌合成的杀昆虫毒素的广度、这些毒素的杀昆虫范围、该毒素的蛋白成分。此处鉴定的菌株已表明具有抵抗各种昆虫目昆虫的经口摄入的毒性。这些昆虫目包括但不限于鞘翅目、鳞翅目、双翅目、蜱螨目。
与其它细菌毒素一样，种群中细菌的突变几率可能导致毒素基因序列的变异。此处感兴趣的毒素是那些产生具有如此所述的接触后抵抗一系列昆虫的功能性活性的蛋白的毒素。优选地，这些毒素对鳞翅目，鞘翅目，双翅目和蜱螨目昆虫有活性。此处本发明预期包括与由此处菌株及其衍生菌株合成的蛋白毒素同源的蛋白毒素以及任何致病杆菌合成的具功能性活性的毒素。这些同源蛋白与此处所述的这些毒素在序列上可以不同，但在功能性活性上必须相同。同源毒素包括100KDa-3200KDa之间的蛋白复合物，并且至少包含至少一个肽亚基，该亚基可以与其它亚基相同或不同。各种蛋白亚基已在本文实施例中得到鉴定和描述。典型地，这些蛋白亚基在约20KDa至约350KDa之间；约130KDa至约300KDa之间；40KDa至80KDa之间；约20KDa至约40KDa之间。
此处所述的毒素非常独特，其独特性在于这些毒素具有对发展昆虫控制策略至关重要的功能性活性。在发展昆虫控制策略时，可能通过将蛋白直接注射入有机体并躲开消化道来延迟或防止蛋白降解。在这种情况下，施用给有机体的蛋白在变性、非特异性降解或由高等生物免疫系统消除之前保留其功能。将杀昆虫毒素注射入昆虫体内仅能在实验室中有效应用。
已发现，具如此处所定义的功能性活性的杀昆虫蛋白毒素在经口摄入或与昆虫接触时表现出活性，从而可以发展仅基于将蛋白毒素掺入昆虫食物的能力的昆虫控制策略。这样的策略可导致昆虫诱饵的生产。
致病杆菌毒素可以以纯化和非纯化的形式施用于昆虫。该毒素可以以约1到约1000mg/升培养基的含量提供。这可能随配制条件、接种来源情况、分离毒素的技术等情况变动。此处发现的毒素可以作为可喷洒的杀虫剂施用。致病杆菌的发酵培养液可以得到制备、稀释、如果需要使用超滤或其它熟练技术人员掌握的技术浓缩100-1000倍。可用注射喷雾器、履带式喷雾器或其它熟练技术人员掌握的任何此类装置进行处理。处理后，培养液可通过将所选昆虫放置到所述喷洒过的植物上，然后对叶子的损伤进行评分测试。如果需要，可加入佐剂和光保护剂以提高毒素在环境中的半衰期。在实验室条件下，可用熟练技术人员掌握的方法施用培养液及其稀释液或浓缩液。随后，可以使材料干燥，将将所测的昆虫直接放在适当的植物组织上。一个星期后，可使用改良的Guthrie评分法对植物损伤进行评分(Koziel，M.G.，Beland，G.L.，Bowmand，C.，Carozzi，N.B.，Crenshaw，R.，Crossland，L.，Dawson，J.，Desai，N.，Hill，M.，Kadwell，S.，Launis，K.，Lewis，K.，Maddox，D.，McPherson，K.，Meghji，M.Z.，Merlin，E.，Rhodes，R.，Warren，G.W.，Wright，M.t Evola.S.V.，1993)。用这种方法，当以可喷洒的配制物提供或当将编码此蛋白或其部分的基因或基因衍生物通过转基因植物或微生物提供时，培养液或其它含蛋白的组分可提供针对特异昆虫虫害的保护。
毒素可以作为在异源原核或真核宿主中原始表达的分泌物或细胞蛋白施用。细菌通常是蛋白表达的宿主。真核宿主可以包括但不限于植物、昆虫和酵母。选择性地，此毒素可以在细菌或田间的转基因植物中表达或用杆状病毒载体在昆虫中表达。典型地，通过将一种或多种所述毒素掺入昆虫食物中使昆虫与毒素接触。
饲喂昆虫的完全致命性是优选的，但这不是达到功能性活性所必需的。如果昆虫躲避毒素或停止进食，即使效果是次致命的(sublethal)或致命性得到延迟或是间接的，这种躲避在一些应用中也是有用的。例如，如果需要转基因昆虫抗性，昆虫不愿食用此植物与对昆虫的致死毒性一样有用，因为最终目标是保护植物免受昆虫引起的破坏而不是使昆虫死亡。
有许多方法可用来将毒素掺入到昆虫的食物中。例如，可以通过如此处公开的用蛋白溶液喷洒食物将毒性蛋白掺入到幼虫食物来源中。选择性地，可以用基因操作将纯化蛋白导入无害的细菌中，然后细菌可以在培养基中生长，并施用于食物来源或存在于要消灭昆虫的区域的土壤中。而且，可用基因操作直接将此蛋白导入昆虫的食物来源。例如，多种昆虫幼虫的主要食物来源是植物材料。
转基因植物的商业开发有关的一个考虑是抗性控制。这特别涉及到苏云金芽孢杆菌毒素。已有很多商业开发苏云金芽孢杆菌的公司，并且已有很多对产生Bt毒素抗性的关注。昆虫抗性控制的一个策略是将由致病杆菌产生的毒素与Bt[来自芽孢杆菌菌株的植物性(vegetative)杀昆虫蛋白(Ciba Geigy；WO 94/21795)]或其它昆虫毒素结合。这些组合可以配制成可喷洒的施用物或是分子水平上的结合。可以用合成昆虫毒素的致病杆菌基因和其它昆虫毒素基因如Bt转化植物。
欧洲专利申请0400246A1描述了用2个Bt基因转化植物。这可以是任意两个基因，不仅仅是Bt基因。另一种产生含有多于一种昆虫抗性基因的转基因植物的途径是产生两种植物，每种植物含有一种昆虫抗性基因。然后这些植物可以使用传统的植物育种技术回交以产生含有多于一种昆虫抗性基因的植物。
除了产生转化植物，还有其它载体系统，其中重新加工细菌基因是可行的。使用标准的众所周知的技术，在同一菌株中，通过将吸引昆虫的作为食物来源的分子与毒素的功能性活性结合在一起构建基因工程的易于分离的蛋白毒素，并使其在细菌或真核细胞中表达。经实验室纯化后，这样的含“固定”诱饵的毒素试剂可包装在标准的昆虫诱捕网罩中。
另一施用方案是将毒素的基因物质整合入杆状病毒载体中。杆状病毒侵染特定的昆虫宿主，包括那些致病杆菌毒素适当的目的昆虫。可将含致病杆菌毒素的表达构建体的侵染性杆状病毒导入昆虫侵袭的区域，由此麻醉或毒杀侵袭的昆虫。
功能性特征的转移需要将编码致病杆菌毒素氨基酸序列的核苷酸序列整合到蛋白质表达载体中，所述表达载体应适合于载体将要存在的宿主。一种得到编码具功能性特征的蛋白的核苷酸序列的方法是使用从毒素的氨基酸序列推测的信息，从致病杆菌分离合成毒素的天然遗传物质，此方法的大部分在下文中列出。如下文所述的，纯化具毒素活性的蛋白的方法也已公开。
已知昆虫病毒或杆状病毒可以侵染某些昆虫并对其有不利影响，病毒对昆虫的影响缓慢，并且病毒不会立即终止昆虫的进食。因此，不认为病毒是最佳的昆虫虫害控制剂。然而，将致病杆菌毒素基因连接入杆状病毒载体可以提供有效的传递毒素途径。另外，因为不同的杆状病毒对不同的昆虫特异，所以有可能用特定的毒素选择性地导向特定的破坏性昆虫虫害。对毒素基因特别有用的载体是核型多角体病毒载体。已有描述利用这个病毒的转移载体，并且目前已选择这些载体将外源基因转入昆虫。病毒-毒素基因重组子可以以经口传播的形式构建。杆状病毒一般通过中肠肠道粘膜侵染目的昆虫。毒素基因插入到很强的病毒外壳蛋白启动子之后将得到表达并且能迅速地杀死受侵染的昆虫。
对于本发明的蛋白毒素，除了昆虫病毒或杆状病毒或转基因植物载体系统，也可使用苏云金芽孢杆菌胶囊化技术包裹此蛋白，这些技术例如但不限于美国专利4,695,455、4,695,462和4,861,595，此处引用所有这些作为参考。本发明的蛋白毒素的另一种载体系统是将此蛋白配制成诱饵基质，然后可用于地上和地下的昆虫引诱位置。这样的技术的例子包括但不限于PCT专利申请WO93/23998，此处引用作为参考。
可使用标准的分子生物学技术对此处所述的毒素进行克隆和序列测定。其它信息可见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，(1989)，分子克隆：实验指南，冷泉港出版社，此处引用作为参考。
在整个实施例中使用于下列缩写：Tris＝三(羟甲基)氨基甲烷；SDS＝十二烷基磺酸钠；EDTA＝乙二胺四乙酸；IPTG＝异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，X-gal＝5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，CTAB＝十六烷基三乙基溴化铵；kbp＝千碱基对；dATP，dCTP，dGTP，dTTP，I分别等于2′-脱氧-5′-三磷酸腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和次黄嘌呤；ATP＝腺苷三磷酸。
本发明特定的实施方案在实施例中得到进一步说明。然而，本领域技术人员将很容易理解具体的实验细节只是如随后的权利要求书中更充分描述的本发明的举例说明。实施例1致病杆菌属菌株的鉴定
为了确定此处所述的收集物由致病杆菌属分离物组成，根据致病杆菌属I型变体典型的和使其与其它肠杆菌科和发光杆菌属种类区分的可识别的微生物特性评估菌株。[Farmer，J.J.，1984，Berger系统细菌学手册，第1卷，第510-511页(Kreig N.R.和Holt，J.G.编缉)。Williams &Wilkins，Baltimore；Akhurst和Boemare，1988，普通微生物学杂志，134，1835-1845；Forst和Nealson，1996，微生物学评沦，60，21-43]这些典型特性如下：革兰氏染色阴性杆菌；有机体大小为0.3-2μm宽和2-10μm长；偶尔为丝状(15-50μm)和球状；在营养琼脂上有白色至黄色/褐色菌落的色素形成；结晶包涵体的存在；过氧化氢酶的缺失，氧化酶阴性；不能还原硝酸盐；没有生物发光现象；从生长培养基中摄取染料的能力；蛋白酶合成阳性；生长温度低于37℃；在厌氧条件下存活；和积极地移动(表1)。使用大肠杆菌、致病杆菌和发光杆菌菌株做为对照检测此方法。表1所示的全部结果与所有作为肠杆菌科和致病杆属成员的菌株一致。
使用光度计确定与致病杆菌属菌株相关的生物发光现象的缺少。为测定相对发光单元的有元，在液体培养基中接种之后多达3个时间间隔(24，48和/或72小时)对每个菌株的培养液(细胞和培养基)进行测定，并与背景发光度(未接种的培养基)比较。也测定几个光杆状菌属菌株作为发光度的阳性对照。在测定所选培养液的发光之前，通过使用Sipper杯在Gilford Systems(Oberlin，OH)分光光度计中测定A560nm值来确定细胞密度。然后将得到的发光单元按细胞浓度标准化。将每份培养液加入96孔微量滴定板上(每孔100μl)并然后在PackardLumicount光度计(Packard Instrument公司，Meriden CT)上读数。每个样品的测量时间为0.1-10秒。在读取数值之前，在光度计中将样品搅拌10秒钟。当达到背景发光度的≥3倍(～1-15相对光单元)时，确定为阳性。另外，通过照相胶卷覆盖和在暗室中视觉适应后肉眼分析来确定一些菌株菌落发光性的缺乏。
用商品革兰氏染色试剂盒(BBL，Cockeysville，MD)结合革兰氏染色对照玻片(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)来确定每个菌株的革兰氏染色特性。然后用Zeiss显微镜(Carl Zeiss，德国)100倍油浸物镜(结合10倍目镜和2倍放大率)进行显微镜评估。使用湿的封固玻片和具测微计的相差显微镜(10倍目镜，2倍和40倍物镜放大率)显微检测每个菌株的有机体大小，细胞描述及包涵体(后两项的观察在对数生长后进行)[Akhurst，R.J.和Boemare，N.E.，1990，在生物防治中的昆虫病原线虫(Gaugler，R.和Kaya，H.编缉)，第75-90页，CRC Press，Boca Raton，USA；Baghdiguian S.，Boyer-Giglio M.H.，Thaler，J.O.，Bonnot G.，Boemare N.，1993，细胞生物学，79，177-185]。在接种到Bacto营养琼脂(Difco Laboratories，Detroit，MI，按每个标鉴的说明制备)上之后观察克隆的色素形成。于28℃温育5-7天后记录描述结果。
为了测试过氧化氢酶活性的存在，将1ml液体培养物或小块营养琼脂上所测微生物的克隆放入玻璃试管中。沿着试管壁缓慢加入1ml普通过氧化氢溶液。如果立即或在5秒钟内出现气泡(推测为氧气)，那么记录为阳性反应。也对阴性对照未接种的营养琼脂或液体培养基和过氧化氢溶液进行检测。
通过将24小时克隆刮到DrySlide氧化酶玻片(Difco，Inc.；Detroit，MI)上以测定每个菌株的氧化酶反应。在将微生物刮到玻片上20秒内，氧化酶阳性菌株会形成暗紫色，暗示着细胞色素氧化酶C。不能产生暗紫色表明此微生物为氧化酶阴性。
为了检测硝酸盐还原，将每种培养物接种到10ml Bacto硝酸培养基(Difco Laboratories，Detroit，MI)中。28℃温育24小时后，通过加入2滴对氨基苯磺酸试剂和2滴α-萘胺试剂(Difco。操作指南，第10版，Difco Laboratories，Detroit，MI，1984)测定硝酸盐还原。清晰的粉红或红色的出现表明已由硝酸盐形成亚硝酸盐，而没有颜色形成表明此菌株为硝酸盐还原阴性。在后一种情况下，加入细密锌粉以进一步证实由亚硝酸盐的形成和所形成的红色确定的未还原的硝酸盐的存在。
用含有中性红染料的Bacto MacConkey琼脂；含有溴麝香草酚蓝染料的Bacto Tergitol-7琼脂和含有亚甲蓝和黄色曙红染料的Bacto EMB琼脂(配制好的琼脂来自Difco Laboratories，Detroit，MI；都根据标签的说明制备)检测每个菌株从生长培养基摄入染料的能力。在接种到上述培养基后，在28℃培育5天后记录染料的摄入。在Bacto MacConkey和Bacto Tergitol-7培养基上生长是肠杆菌科成员的特征。用Bacto移动性检测培养基溶液(Difco Labortories，Detroit，MI；按每个标签的说明制备)测定每个菌株的移动性。对每个菌株进行穿刺培养，在28℃温育后，通过肉眼观察从接种线展开生长的扩散带来判断阳性移动性。
蛋白酶的合成通过使用Bacto白明胶(Difco Laboratories，DetroitMI)平板，观察白明胶水解情况来测定，白明胶平板按每个标签的说明制备。在评估白明胶水解之前，接种培养物并将平板置于22℃温育3-5天。为了评估在不同温度下的生长情况，用相同的接种物来源在琼脂平板[2％
Figure C9880079100161
蛋白胨#3，2％Bacto-琼脂(Difco，Detroit，MI)，在去离子水中]上划线。将平板置于20，28和37℃下培养5天。用电子热电偶控制和测量培养箱的温度以保证正确的温度条件。
致病杆菌属菌株的氧需求用下述方法测定。在液体巯基乙醇培养基(Difco，Detroit，MI)内进行穿刺接种。将试管置于室温下1周培养后检查培养物的生长类型和生长程序。用指示剂刃天青来指示培养基中充氧作用或需氧生活区的存在(Difco操作指南，第10版，Difco Laboratories，Detroit，MI)。在结果不清晰时，将液体巯基乙醇培养基的琼脂糖终浓度提高到0.75％并重新检查生长特性。
致病杆菌属菌株的多样性可以使用每个菌株的基因组DNA通过PCR(聚合酶链反应)介导的基因组指纹分析进行测定。这种技术的根据是遍及不同细菌种类的基因组中存在重复DNA序列家族(由Versalovic J.，Schneider，M.，DE Bruijn，F.J.和Lupski，J.R.，1994，分子细胞生物学方法，5，25-40综述)。有三个重复序列，即重复性基因外回文序列(REP)，肠杆菌重复性基因间保守序列(ERIC)和BOX元件被认为在细菌基因组的组成中起重要作用。可以相信，基因组组成是由这些元件的选择形成的并且这些元件在亲缘关系相近的细菌菌株基因组中的不同分散方式可用于区别这些菌株(例如，Louws.F.J.，Fulbright，D.W.，Stephens.C.T.和DE Bruijn，F.J.，1994，应用环境微生物学，60，2286-2295)。Rep-PCR利用与这些重复序列互补的寡核苷酸引列来扩增它们之间的不定大小的DNA片段。通过电泳分离得到的产物以确定每个菌株的DNA“指纹”。
表1致病杆菌菌株的分类特征
    Strain   A*   B  C   D   E   F G   H   I   Js   K   L  M   N   O   P   Q   R
    S.carp   -1   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    X.Wi   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    X.nem   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    X.NH3   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    X.riobravis   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    DEX1   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    DEX6   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILM037   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   C   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILM039   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILM070   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILM078   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILM079   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   C   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILM080   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILM081   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILM082   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILM083   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILM084   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILMI02   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   C   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILMI03   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   C   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILMI04   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   C   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILMI29   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   Y   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILMI33   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   Y   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILMI35   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   Y   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILMI38   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   Y   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILMI42   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   Y   +   +   +   +   +   +   -   -
    ILMI43   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   Y   +   +   +   +   +   +   -   -
    GLX26   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   C   +   +   +   +   +   +   -   -
    GLX40   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   C   +   +   +   +   +   +   -   -
    GLXI66   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   C   +   +   +   +   +   +   -   -
    SEX20   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   C   +   +   +   +   +   +   -   -
    SEX76   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   C   +   +   +   +   +   +   -   -
    SEX180   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   C   +   +   +   +   +   +   -   -
    GL133B   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   Y   +   +   +   +   +   +   -   -
    DEX2   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    DEX3   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   Y   +   +   +   +   +   +   -   -
    DEX4   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    DEX5   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   -   -
    DEX7   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   ND   -
    DEX8   -   +  -   rαS   +   - -   +   +   W   +   +   +   +   +   +   ND   -
*：A＝革兰氏染色；B＝晶体包涵体，C＝生物发光，D＝细胞形状，E＝运动性，F＝硝酸盐还原；G＝过氧化氢酶的存在，H＝白明胶水解，I＝染料摄取，J＝营养琼脂上的色素形成，K＝在EMB琼脂上的生长，L＝在MacConkdy琼脂上的生长，M＝在Tergitol-7琼脂上的生长，N＝兼性厌氧菌，O＝于20℃的生长，P＝于28℃的生长，Q＝于37℃的生长，R＝氧化酶。+：+＝阳性特征；-＝阴性特征；rd＝杆状；S＝在该属描述特征之内的大小，ND＝未测定。S：W＝白色，C＝乳状，Y＝黄色。
为了从菌株中分离基因组DNA，将细胞沉淀重新悬浮于TE缓冲液(10或50mMTris-HCl，1或50mM EDTA，pH8.0)中至终体积10ml并加入12ml 5M NaCl。以15,000xg将混合物离心20分钟。将得到的沉淀重新悬浮于5.7mlTE中并加入300μl 10％SDS和60μl 20mg/mL蛋白酶K(Gibco BRL产品，Grand Island，NY)混合物，于37℃温育1个小时，加入约10mg溶菌酶，然后将混合物继续温育30至45分钟。然后加入1ml 5M NaCl和800μl CTAB/NaCl溶液(10％重量/体积CTAB，0.7MNaCl)，并于65℃温育10至20分钟(在某些情况下，轻轻搅拌)，然后继续搅拌温育20分钟以使细胞物质变得澄清。加入等体积的氯仿/异戊醇溶液(24∶1，体积/体积)，轻轻混匀后离心。用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(PCI；50∶49∶1)抽提两次。用0.6体积的异丙醇沉淀基因组DNA，用灭菌塑料环或玻璃棒移走沉淀的DNA，用70％的乙醇洗两次，使之干燥并溶于2ml STE(10mM Tris-Hcl pH8.0，10mM NaCl，1mM EDTA)中。然后于A260nm进行DNA定量。在第二种方法中，加入0.01体积的RNAaseA(50ug/ml终浓度)并在37℃温育2个小时。然后用等体积的PCI抽提样品。然后用2倍体积的100％乙醇沉淀样品并如上所述收集样品。空气干燥并将样品其悬浮于250-1000μl TE中。
为了进行致病杆菌基因组DNA的rep-PCR分析，使用了下列引物：REPIR-I；5′-IIIICGICGICATCTGGC-3′和REP2-I；5′-ICGICTTATCIGGCCTAC-3′。PCR使用下述25μl反应体系进行：7.75μl H2O，2.5μl 10×LA缓冲液(PanVera公司，Madison.WI)，16μl dNTP混合物(每种2.5mM)，每种引物(50pM/μl)各1μl，1μl DMSO，1.5μl基因组DNA(浓度0.075-0.480ug/μl)和0.25μl TakaRa EX Taq酶(PanVera公司，Madison，WI)。PCR扩增在Perkin Elmer DNA热循环仪(Norwalk，CT)中进行，使用下述条件：95℃进行7分钟，然后[94℃1分钟，44℃1分钟，65℃8分钟]进行35个循环，65℃进行15分钟。循环后，向25μl反应体系中加入5ul 6×凝胶上样缓冲液(在水中含0.25％溴酚蓝和40％重量/体积蔗糖)在15×20cm 1％琼脂糖凝胶上使用8μl每种反应物在TBE缓冲液(0.09M Tris-硼酸，0.002M EDTA)中电泳。凝胶于45V电泳约16个小时。然后将凝胶在20μg/ml溴化乙啶中染色1个小时并在TBE缓冲液中脱色约3个小时。在紫外光照射下拍摄凝胶的Polaroid照片。
用RFLP扫描软件(Scanalytics，Billerica，MA)记录照片上每一菌株特异大小条带的有无并将其输入数字分类学软件程序，NTSYS-pc(Exeter软件，Setauket，NY)为相似性矩阵(similarity matrix)。在同样的条件下分析对照大肠杆菌菌株HB101和水稻黄单胞菌水稻致病变种，产生的PCR指纹与公开报道一致(Versalovic，J.，Koeuth，T.和Lupski，J.R.1991，核酸研究，19，6823-6831；Vera Cruz，C.M.，halda-Alija，L.，Louws，F.，Skinner，D.Z.，George，M.L.，Nelson，R.J.，DE Bruijn，F.J.，Rice，C.和Leach，J.E.，1995，Int.Rice Res.Notes，20，23-24；Vera Cruz.C.M.，Ardales，E.Y.，Skinner，D.Z.，Talag，J.，Nelson，R.J.，Louws，F.J.，Leung.H.，Mew，T.W.和Leach，J.E.，1996，植物病理学，86，1352-1359).然后在NTSYS-pc中用一系列程序分析来自致病杆菌属菌株的数据；SIMQUAL(性质数据相似性)以产生相似系数矩阵(用Jaccard系数)和SAHN[连续的(sequential)、集合的(AgglomeratiVe)、Heriarchical和嵌套的(nested)]聚类(Clustering)，SAHN聚类使用UPGMA方法[使用算术平均数的未加权配对法(Unweighted Pair-Group Method withArithmetic Averages)，UPGMA方法聚集相关菌株并可表现为亲缘关系图(图1)。COPH(cophenetic)和MXCOMP(矩阵比较)程序用于产生一个cophenetic值矩阵并将此矩阵与作为聚类基础的原始矩阵比较相关性。产生作为结果的标准化框架(Mantel)统计量(r)来评估聚类分析的区配程度(r＝0.8-0.9代表很好的匹配)。在我们的实验中r＝0.9，表明了非常好的匹配。因此，此处公开的菌株包括不同的代表致病杆菌属的容易区分的菌株群体。
此处公开的菌株在申请递交以前已保藏于如下国际保藏单位：农业研究机构保藏中心(NRRL)，国家农业应用研究中心，ARS-USDA，1815 North University St.，Peoria，IL 61604。1997年4月29日保藏了以下具NRRL名称的菌株：S.Carp(NRRL-B-21732)；X.Wi(NRRL-B-21733)；X.nem(NRRL-B-21734)；X.NH3(NRRL-B-21735)；X.riobravis(NRRL-B-21736)；GL 133B(NRRL-B-21737)；DEX1(NRRL-B-21738)；DEX2(NRRL-B-21739)；DEX3(NRRL-B-21740)；DEX4(NRRL-B-21741)；DEX5(NRRL-B-21742)；和DEX6(NRRL-B-21743)。此处公开的其它菌株于1998年4月30日保藏于NRRL。总共保藏了39个菌株。实施例2由各种致病杆菌属菌株合成的毒素的功能性用途
通过将I期变体菌落接种于装有175ml 2％
Figure C9880079100211
蚤白胨#3(PP3)(Difco laboratories，Detroit，MI)液体培养基的带三重挡板的500ml培养瓶中来产生各种致病杆菌属菌株的“贮备”培养物，其中培养瓶具有Delong颈部并用Kaput盖子覆盖。接种后，三角瓶在旋转摇床上以150rpm于28℃温育24-72小时。然后将培养物转移至装有无菌磁力搅棒的无菌瓶中，然后用无菌矿物油覆盖以防止暴露于空气中。贮备培养物在室温下保存于黑暗中。然后将这些培养物用作每个菌株发酵的接种源。I期变体克隆也在-70℃冷冻贮存以用作接种源。I期单菌落从含有溴麝香草酚蓝(0.0025％)的PP3平板上挑取并放入3.0ml PP3中；在旋转摇床(150rpm)上于28℃培养过夜。然后加入甘油(以PP3稀释的)以得到20％的终浓度，并将培养物以小份冷冻于-70℃。培养物接种时，在无菌条件下取出冷冻小份的一部分在含有溴麝香草酚蓝的PP3平板上划线以重新筛选I期克隆。
通过接种2ml油覆盖的贮备培养物或通过转移I期变体菌落至装有175ml灭菌培养基的带三重档板的用kaput盖子覆盖的500ml培养瓶中来预生产“接种”培养瓶或培养物。通常在旋转摇床上以150rpm于28℃温育16个小时后，将接种培养物转移至生产培养瓶中。生产培养瓶通常通过将约1％的活跃生长的接种培养物加入无菌PP3或胰胨豆胨培养基(TSB，Difco Laboratories，Detroit，MI)中进行接种。对于小规模生产，培养瓶用I期变体菌落直接接种。在用Kaput盖子覆盖的带三重挡板的500ml烧瓶中进行培养液的生产。生产培养瓶于28℃在旋转摇床上以150rpm摇动。生产发酵在24-72小时后终止。
适当温育后，将培养液装入1.0升无菌的聚乙烯瓶中，于10℃以2600xg旋转1小时，将培养液从细胞和碎片沉淀上倒出。将培养液过滤除菌或用切向流动微过滤装置(Pall Filtron，Northborough，MA)使用具0.5μm开放通道的聚醚砜(PES)滤膜进一步使培养液澄清。然后用10,000或100,000分子量阻挡膜、M12超滤装置(Amicon，BeverlyMA)或具10,000或100,000分子量孔经的离心浓缩仪(Millipore，Bedford，MA和Pall Filtron，North borough，MA)将得到的培养液浓缩(高达10倍)。在用离心浓缩仪时，将培养液于2000xg旋转约2小时。将膜透过液加入相应的滞留物中以得到比所用孔经更大的组分的所需浓度。经过这些步骤后，培养液用于生化分析和生物学评估。通过将1ml加工的培养液样品在填满沙子的加热仪中于100℃加热10-20分钟来达到热失活。
来自不同致病杆菌属菌株的培养液和毒素复合物可用于减少昆虫数量并在抑制昆虫群体的方法中使用，此方法包括将有效灭活昆虫量的上述活性物质施用到昆虫的活动场所。从如上所述发酵的所选致病杆菌菌株的培养液中观察到的功能性活性的范围在表2中表示。通过提高培养液的浓度或使用此处公开的其它的发酵方法可能提高或增加用这些菌株可测到的活性。和与蛋白相关的活性一致，培养液经浓缩后，其功能性活性表现了热不稳定性和/或存在于高分子量滞留物中(大于10KDa，主要是大于100KDa)。表2来自不同致病杆菌菌株的培养液的功能性活性
    致病杆菌菌杆     敏感的*昆虫种类
    S.carp 1**，2，3，4，5，6，7
    X.riobravis 1，2，3，5，6，7
    X.NH3 1，2，3，6
    X.wi 1，2，3，5，6，7，9，10
    X.nem 3，5，6
    DEX1 1，2，3，6
    DEX6 1，2，3，4，5，6
    IIM037 1，4
    ILM039 4，
    ILM070 4，8
    ILM078 3，4
    ILM079 3
    ILM080 3
    ILM081 3
    ILM082 3
    ILM803 3
    ILM084 3
    ILM102 1，2，4
    ILM103 1，3，4，8
    ILM104 3，4，8
    ILM116 1，4
    ILM129 1，4
    ILM133 1，4
    ILM135 1，2，4
    ILM138 4
    ILM142 1，2，3，4，8
    ILM143 4
    GLX26 8
    GLX40 3，8
    GLX166 4
    SEX20 1，4，8
    SEX76 1，4
    SEX180 4
    GL133B 4
    DEX2 6，7
    DEX3 3，6
    DEX4 6，7
    DEX5 3，6
    DEX7 3
    DEX8 3
*＝与对照比较的死亡率和/或生长抑制≥25％**＝1，烟草夜蛾；2，玉米螟；3，烟草天蛾；4，黄瓜十一星叶甲；5，棉铃象甲；6，蚊；7，棉叶螨；8，棉蛉虫；9，稻夜蛾；10，甜菜夜蛾.
来自不同的致病杆菌菌株的培养液表现出抵抗多种昆虫的不同的功能性活性(致死率和/或生长抑制)。更具体地，可见到抵抗玉米根草螟幼虫和棉铃象甲的活性，这两种昆虫属于鞘翅目昆虫。鞘翅目的其它成员包括狭体叩头虫，油菜花露尾甲，恶性叶虫，豆象科和马铃薯叶甲。培养液和纯化的毒素复合物也有抵抗鳞翅目成员烟草夜蛾，烟草天蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾，稻夜蛾和玉米螟的活性。此昆虫目的其它典型成员是粉纹夜蛾，小地老虎，苹果蠹蛾，织网衣蛾，印度谷螟，卷叶蛾科，菜粉蝶，顿蓑蛾，美国天幕虫和草螟亚科。也可见到抵抗双翅目成员蚊幼虫的活性。双翅目的其它成员有：豌豆瘿蚊，胡萝卜蝇，甘蓝根花蝇，芜菁根蝇，葱地种蝇，大蚊和家蝇及各种蚊。也可见培养液有抵抗蜱螨目成员棉叶螨的活性，蜱螨目包括草莓蛛螨，茶半跗线螨，桔红蜘螨，榆全爪螨，梨埃瘿螨和番茄叶刺皮瘿螨。
按下达对抵抗玉米根草螟幼虫的活性进行测定。将致病杆菌培养液(10倍浓缩，过滤灭菌)、PP3或TSB(10倍浓缩)、纯化的毒素复合物或10mM磷酸钠冲液(pH7.0)以40μl小份直接施用到人工饲料(约1.5cm2)的表面(Rose，R.I和McCabe，J.M，1973，J.Econ.Entomol.，66，398-400)。毒素复合物以10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)稀释。使饲料盘在无菌的通风橱中空气干燥，并且用单个的从表面消毒的卵孵出的新生黄瓜十一星叶甲(Southern com rootworm，SCR)侵染加样孔。将平板并置于潮湿的培养箱中在27℃放置适当时间(3-5天)。然后记录死亡率和测定的幼虫重量。在所有实验中一般每次处理用8-16昆虫。对照死亡率一般低于5％。
按下述对抵抗棉铃象甲(Anthomonas grandis)的活性进行测定。将浓缩(10倍)的致病杆菌培养液或对照培养基(PP3)以60μl小份施用到0.35g人工饲料表面(Stoneville Yellow鳞翅目饲料)并使之干燥。将单个的12-24小时的棉铃象甲幼虫置于饲料上，密封加样孔并在25℃，50％相对湿度(RH)下放置5天。然后记录死亡率和幼虫重量。对照死亡率在0-25％之间变动。
按下述对抵抗蚊幼虫的活性进行测定。测定在96孔微量滴定板上进行。每个加样孔含有200μl水溶液[10倍浓缩的致病杆菌培养液，对照培养基(2％PP3)和约20只1天龄的幼虫(埃及伊蚊)]。每种处理有6个加样孔。在感染后24小时读取结果。对照没有观察到死亡。
按下述对抵抗鳞翅目幼虫的活性进行测定。将浓缩(10倍)的致病杆菌培养液、对照培养基(PP3或TSB)、纯化的毒素复合物或10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)以40μl小份直接施用于标准人工鳞翅目饲料(Stoneville Yeoolw饲料)的表面(约1.5cm2)。使饲料平板在无菌的通风橱中空气干燥，并用单个新生幼虫侵染每个加样孔。玉米螟(Ostrinia nubilalis)，稻夜蛾armyworm(Spodoptera frugiperda)，棉铃虫(Helicoverpa zea)和烟草天蛾(Manduca sexta)卵来自商业途经并由人工孵化而烟草夜蛾(Heliothis virescens)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼虫由内部提供。用幼虫侵染后，密封饲料平板并置于潮湿的培养箱中于27℃在黑暗中放置适当的时间。在第5天记录死亡率和重量的测定结果。在所有实验中每种处理用16只昆虫。对照死亡率一般为0-12.5％。
按下述对抵抗棉叶螨(Tetranychus urticae)的活性进行检测。将幼小南瓜修剪成单个子叶并用10倍浓缩的培养液或对照培养基(PP3)喷洒。干燥后，以混合的红蜘蛛群体侵染植物并将其在潮湿和室温条件下放置72小时。然后计算存活螨的数量以确定控制水平、实施例3来自致病杆菌菌株X.riobravis的高度纯化的毒素蛋白的功能性活性
如引处所述的从致病杆菌菌株X.riobravis的发酵培养液中纯化功能性毒素蛋白。按照实施例2所述的方法，针对5种昆虫种类的新生幼虫测定此毒素的活性，这5种昆虫是黄瓜十一星叶甲，玉米螟，烟草天蛾，棉铃虫和烟草夜蛾。结果见表3。当与400g毒素/cm2饲料剂量的毒素接触5天后，所有种类都表现出生长抑制和/或致死效应。表3高度纯化的X.riobravis毒素作用于各种昆虫种类
    处理 黄瓜十一星叶甲 玉米螟 烟草天蛾    棉铃虫 烟草夜蛾
X.riobravis     19/46* 75/61   75/75     25/95   13/98
*数值是以对照效应校正后的死亡率百分数/生长抑制百分数。实施例4不同培养基对所选致病杆菌菌株发酵培养液的功能性活性的影响。
使用几种不同的培养基进一步优化测定几种致病杆菌菌株发酵培养液功能性活性的条件。如此处所述的将GL133B，X.riobravis，X.wi，DEX8和DEX1培养于PP3，TSB和含1.25％NaCl的PP3(PP3S)中。然后按此处所述制备培养液并进行针对新生烟草天蛾的实验以确定功能性活性的改变。在两种实验情况下(情况A为PP3与TSB比较，情况B为PP3与PP3S比较)，在PP3S和/或TSB中的发酵物的功能性活性与同时得到的PP3发酵物相比有所提高(表4)。在某些实验中，发现用PP3的发酵物活性不明显。在情况A和情况B时产生的功能性活性表现出热不稳定性并且由高分子量膜(＞100,000KDa)保留。在细菌完全生长后加入NaCl不提高毒素活性，这表明所看到的功能活性的提高不是由于提高培养基中的NaCl浓度而是由于增加了毒素。
如此处所述的，所看到的PP3S发酵物中的X.riobravis的活性增加通过从PP3和PP3S中的发酵物部分纯化毒素得到研究。与使用培养液时的观察结果一致，来自PP3S培养液的活性组分(如此处所述的从阴离子交换和大小排阻层析得到)含有增加的生物活性，蛋白浓度和如由SDS-PAGE分析确定的更复杂的蛋白模式。表4不同培养基对所选致病杆病发酵培养液的功能性活性的影响
                          情况A                          情况B
    菌株     PP3    TSB     PP3   PP3S
   GL133BX.riobravisX.wiDEX8DEX6对照     -*                           -+                             ++++                             +++-                             ++                             ++-                             -     -                           ++                           ++++                           +++-                           -+                           +++-                           -
*+＝25-50％死亡率，++＝51-75％死亡率，+++＝＞76％死亡率，-＝＜25％死亡率实施例5致病杆菌X.nem、X.riobravis和X.Wi：纯化、鉴定及活性
以纯化那些具有如生物分析中确定的(见实施例2)抵抗烟草天蛾(Manduca sexta，下文称THW)最大活性的组分为基础建立如下方法。通常，收集如此处所述在PP3液体培养基中生长并过滤的4-20L致病杆菌培养液并用装在Amicon M-12过滤装置(Amicon Inc.，Beverly，MA)上的Amicon S1Y100型螺旋形超滤柱浓缩。滞留物含有其中大部分分子量大于100KDa的天然蛋白，而滤过物含有分子量小于100KDa的天然蛋白。大部分抵抗THW的活性包含在100KDa的滞留物中。然后用10mM磷酸钠(pH＝7.0)对滞留物连续渗滤直到滤液达到A280＜0.100。除非另有说明，此后所有步骤都在10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中进行。然后将滞留物浓缩至终体积0.20L并用0.45uM的无菌过滤器(Corning，Corning，NY)过滤。
将经过过滤的物质以7.5ml/分钟上样到pharmacia HR 16/10柱上，该柱装有PerSeptive Biosystem POROS 50 HQ强阴离子交换基质并已在使Perseptive Biosystem SPRINT HPLC系统(Perseptive Biosystems，Framingham，MA)的缓冲液中平衡。上样后，用缓冲液洗柱直到A280＜0.100。然后用总体积为50ml的含0.4M NaCl的缓冲液以2.5ml/分钟的速度从柱上洗脱蛋白20分钟。然后用含1.0M NaCl的缓冲液以相同的流速洗柱20分钟(终体积为50ml)。将用0.4M和1.0M NaCl洗脱的蛋白放在分开的透析袋(SPECTRA/POR膜MWCO：2000Spectrum，Houston，TX)中并于4℃在12L缓冲液中透析过夜。在某些情况下，0.4M组分不透析而是立即通过凝胶过滤去盐(见下述)。大部分抵抗THW的活性包含在0.4M组分中。
通过将20ml 0.4M组分上样到Pharmacia XK26/100柱上进一步纯化此组分，该柱预先使用0.75ml/分钟的流速装有Sepharose CL4B(Pharmacia)。当纯化X.nem和X.wi时，0.4M组分在Sepharose CL4B柱上分离产生4至5个明显的峰。来自X.riobravis菌株的蛋白尽管有一个相当于空柱体积的明显的峰，也有一个很宽的低吸收区，在800分钟洗脱的约280分钟至约448分钟处。通常，在450分钟以后和800分钟之前，可看到两个较大的吸收峰。X.wi和X.nem的活性部分通常在800分钟洗脱的约256分钟至416分钟处。
如此处所述的根据A280nm处峰的轮廓收集各组分并使用MilliporeULTRAFREE-15离心过滤装置Biomax-50K NMWL膜(Millipore Inc.Bedford，MA)浓缩至0.75ml终体积或通过结合到Pharmacia MonoQHR10/10柱上浓缩。使用BioRad蛋白分析试剂盒(BioRad，Hercules，CA)以牛γ球蛋白作为标准测定蛋白浓度。
用Pharmacia HR 16/50柱确定THW毒素复合物的天然分子量，该柱已预先装有所述磷酸盐缓冲液中的Sepharose CL4B。然后用已知分子大小的蛋白校准此柱，由此能够计算毒素复合物大约的天然分子大小。如表5中所示，毒素复合物的分子大小如下：菌株X.nem为1500±530KDa；菌株X.riobravis为1000±350KDa，菌株X.wi为3290KDa+1150KDa，菌株ILM078为980±245；菌株DEX6为1013±185；菌株ILM080为956±307。然后如此处公开的经离子交换、凝胶过滤、离子交换、疏水作用层析、离子交换层析纯化的X.wi的高度纯化的组分使用定量凝胶过滤来分析其大小。发现此物质的天然分子大小为1049±402KDa(表5)。
使用SDS-PAGE分析测定毒素复合物中蛋白质单个多肽的大小。通常，将20μg来自每个菌株的毒素复合物蛋白上样到2-15％聚丙烯酰胺凝胶(Integrated Separation Sytems，Natick，MA)上并于20mA在SDS-PAGE缓冲液(BioRad)中电泳。电泳结束后，凝胶在BioRad考马斯亮蓝R-250[0.2％，在甲醇∶乙酸∶水为40∶10∶40(体积/体积/体积)的溶液中]中染色。随后，凝胶在甲醇∶乙酸∶水；40∶10∶40(体积/体积/体积)中脱色。用水冲洗凝胶15分钟并用MolecularDynamics PERSONAL LASER DENSITOMETER(Sunnyvale，CA)扫描。与BioRad高分子标准(200-45KDa)相比对每一泳道定量并计算分子大小。
来自每个菌株的组成THW毒素复合物的单个多肽的大小在表6中列出。单个多肽的大小为32KDa至330KDa。每个X.wi，X.nem，X.riobravis，ILM080，ILM078和DEX6菌株都有在160-330KDa，100-160KDa和50-80KDa范围内的组成毒素复合物的多肽。这些数据表明菌株之间毒素复合物的肽组分不同；但是在所有例子中，可看出毒素是由23KDa-330KDa亚单位组成的大的寡聚蛋白复合物。实施例5：来自X.reobravis和X.wi的致病杆菌毒素复合物的次级分离
为了次级分离，如上所述分离出10mg来自X.riobravis的致病杆菌蛋白毒素复合物并将其以2ml/分钟的流速上样到用10mM磷酸缓冲液(pH7.0)平衡的pharmacia MonoQ HR 10/10柱上。用该缓冲液洗柱直至280mm的吸收值回到基线。用在该缓冲液中的0-1.0M NaCl线性梯度以2ml/分钟洗脱与柱结合的蛋白1小时。收集2ml级分并用于如此处所述的抵抗THW的生物分析。在HTW生物分析中通过测定每个组分的2倍稀释液以确定在活性峰。在0.3-0.4M NaCl时的洗脱观察到抵抗THW的活性峰。收集具有抵抗THW活性的组分并通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分析。观察到有四种主要的大小约为220KDa，190KDa，130KDa和54KDa的多肽。
上述肽在4-20％SDS-PAGE(Integrated SeparationSystems)上电泳并转印到PROBLOTT聚氟乙烯(PVDF)膜(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上。分别将印迹送至Harvard MicroChem和Cambridge Pro Chem以进行氨基酸分析和N末端氨基酸序列测定。
对于X.wi的次级分离实验，将约10mg毒素以2ml/分钟的流速上样到用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡的MonoQ HR 10/10柱上。用该缓冲液洗柱直至A280mm回到基线。用在该缓冲液的0-1.0M Nacl线性梯度以2ml/分钟洗脱与柱结合的蛋白1小时。收集2ml级分并用于如此处所述的抵抗THW的生物分析。在A280mm处至少观察到两个主要的可测峰。在约0.10-0.25M NaCl的洗脱中观察到主要的功能性THW活性。收集具有抵抗THW活性的组分并通过凝胶电泳分析。通过SDS-PAGE观察到有多达8个主要的大小约为330KDa，320KDa，270KDa，220KDa，200KDa，190KDa，170KDa，130KDa，91KDa，76KDa，55Kda，和36KDa的多肽。
将收集的THW活性峰组分上样到phenyl-sepharose HR 5/5柱上。加入固体硫酸铵至终浓度1.7M。然后将此溶液于1ml/分钟上样到用含1.7M硫酸铵的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的柱上。用含1.7M硫酸铵的50mM磷酸钾(pH7.0)到10mM磷酸钾(pH7.0)的线性梯度于0.5ml/分钟洗脱与柱结合的蛋白60分钟。经THW生物分析后确定，在A280nm时在约40至约50分钟之间洗脱活性峰。将组分逆着10mM磷酸钠(pH7.0)透析过夜。通过SDS-PAGE观察到有6个主要的大小约为270KDa，220KDa，170KDa，130KDa和76KDa的多肽。
来自5/5或10/10 Phenyl-sepharose柱的THW活性组分肽在4-40％SDS-PAGE凝胶(Integrated Separation Systems)上电泳并转印到PROBLOTT PVDF膜(Applied Biosystems，Foster City，CA)上。将印迹分别送至Harvard MicroChem和Cambridge ProChem以进行氨基酸分析和N末端氨基酸序列测定。130KDa(SEQ IN NO：1)、76KDa(SEQ.ID NO：2)和38KDa(SEQ.ID NO：3)肽的N末端氨基酸序列在本文中列出。
用毒素复合物或THW phenly-sepharose纯化组分进行昆虫生物分析。对于草地夜虫蛾，甜菜夜蛾，烟草天蛾，烟草夜蛾，玉米螟和黄瓜十一星叶甲，可观察到功能性活性(至少20％死亡率和/或至少40％生长抑制)。在所测的毒素复合物试剂中观察到抵抗烟草天蛾和烟草夜蛾的活性比抵抗黄瓜十一星叶甲幼虫的活性更高。X.wi毒素复合物和任何其它纯化组分的昆虫活性表现为热敏感性。实施例6致病杆菌菌株X.carpoeapsae的生产、分离和鉴定。
将1％X.carpocapsae(也被称为X.Carp)分离株的过夜培养接种物加入含25ml PP3的125ml培养瓶中，并在旋转摇床上以250rpm于28℃温育72小时。随后，如此处所述将培养物以10,000xg离心20分钟，再使用0.2um的滤膜过滤上清。将15ml样品上清加入Ultrafree-15100,000 NMWL离心过滤装置(Millipore MA)，并以2000xg离心。滞留物用100mM磷酸钾(pH6.9)洗两次并重新悬浮于1.0ml相同溶液中。如此处公开的通过使用10％分离胶和4％浓缩胶的SDS-PAGD对蛋白进行分析，胶的大小用BioRad预染色的标准(Hercules，CA)校准。凝胶在15℃以40v电泳16个小时，然后用来自Novex.Inc.(SanDiego，CA)的胶态蓝染色。表5来自致病杆菌菌株的毒素复合物的鉴定
    菌株    毒素复合物大小a
    X.wi   3290Kda±1150KDa
    X.wi(高度纯化的)   1049KDa±402KDa
    X.nem   1010Kda±350KDa
    X.riobravis   1520KDa±530KDa
    ILM 078   980KDa±245KDa
    ILM 080   1013KDa±185KDa
    DEX 6   956KDa±307KDa
a使用装有Sepharose CL4B的pharmacia HR 16/50柱确定的天然分子量。高度纯化的X.wi是从Mono Q5/5柱上分离的组分。
对于进一步的分离，将样品在使用100mM磷酸钾(pH6.9)的无梯度系统下上样到内径7.5mm、柱高60cm的BIO-SEP S4000柱(Phenomenex，Torrance，CA)上。每个样品的总上样量为250-500μg蛋白。根据蛋白大小(大小排阻层析)将组分收集为如下3组：大小1,000KDa的蛋白；800-1000KDa的蛋白和小于800KDa的蛋白。选取800,000-1,000,000Da的组分用于进一步分析。表6来自致病菌株的毒素复合物肽的分子大小(KDa)
    X.wi   X.nem  X.riobravis   ILM080   ILM078    DEX6
    330     220     220     200     203     201
    320     190     190     197     200     181
    270     170     100     173     173     148
    220     150     96     112     150     138
    200     140     92     106     144     128
    190     85     85     90     106     119
    170     79     79     80     80     90
    130     65     65     74     62     75
    91     56     56     61     58     65
    76     50     50     60     54     59
    55     42     47     58     50     55
    49     38     42     55     45     45
    46     31     38     53     41
    43     29     34     48     37
    40     26     31     46     32
    36     26     43
    32     23     42
    40
收集具有最大功能性活性的800-1000KDa组分并用100,000NMWL离心过滤装置(Millipore，Bedford，MA)浓缩。每个收集的滞留物组分用100mM磷酸钾(pH6.9)洗两次并重新悬浮。使用bicinchoninic酸蛋白分析试剂盒(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白浓度。此组分中的蛋白通过如此处所述的SDS-PAGE得到分析并发现有一些不同大小的蛋白。然后将这些物质在DEAE柱上进一步分离，其中以逐渐增加的盐浓度洗脱蛋白。然后又通过SDS-PAGE检测具有最大活性的组分并发现该组分由4种主要蛋白组成，它们的大小如下：200，190，175和45KDa。将来自DEAE步骤的活性组分过HPLC凝胶过滤柱(如上述，Biosep S4000)并发现抵抗烟草天蛾的毒性活性存在于含大于800KDa的天然蛋白的组分中。
按下述进行生物分析。烟草天蛾卵购自Carolina生物供应公司。这些卵在新鲜的小麦胚饲料(ICN，CA)上孵化和饲养，于25℃培养在16小时光照/8小时黑暗光循环培养箱中。通过将12只烟草天蛾幼虫放在含300μg如上述得到的超滤滞留物的昆虫食物块上来测定经口摄入的毒性数据。连续观察5天。对于HPLC排阻层析组分，将20ug总蛋白用于小麦胚饲料。实验重复两次。
                 序列表(1)基本信息(i)申请人
    Ensign，Jerald C.
    Bowen，David J.
    Tenor，Jennifer L.
    Ciche，Todd A.
    Petell，James K.
    Strickland，James A.
    Orr，Gregory L.
    Fatig，Raymond
    Bintrim，Scott B.(ii)发明名称：来自致病杆菌的杀昆虫蛋白毒素(iii)序列数目：3(iv)联系地址
  (A)联系人：Dow AgroSciences，LLC
  (B)街名：9330 Zionsville Road
  (C)城市：Indianapolis
  (D)州名：IN
  (E)国家：US
  (F)邮政编码(ZIP)：46268(v)计算机可读形式
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机；IBM PC兼容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)目前申请资料：
  (A)申请号：
  (B)申请日：
(viii)律师/代理人信息
      (A)姓名：Borucki，Andrea T.
      (B)登记号：33651
      (C)参考/著录号：50612P1
(ix)电信信息
      (A)电话：317-337-4846
      (B)传真：317-337-4847(2)关于SEQ ID NO：1的信息
(i)序列特征
      (A)长度：12个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：N端
(vi)序列描述：SEQ ID NO：1
      Asn Gln Asn Val Glu Pro Ser Ala Gly Asp Ile Val
      1               5                    10(2)关于SEQ ID NO：2的信息
(i)序列特征
      (A)长度：8个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(v)片段类型：N端(vi)序列描述：SEQ ID NO：2
Ser Gln Asn Val Tyr Arg Tyr Pro
1                5(2)关于SEQ ID NO：3的信息(i)序列特征
(A)长度：7个氯基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(v)片段类型：内部的(vi)序列描述：SEQ ID NO：3
Met Thr Lys Gln Glu Tyr Leu
1                5

Claims (7)

1.一种组合物，其中包含有效量的具有抵抗昆虫的功能性活性的致病杆菌(Xenorhabdus)蛋白毒素，所述蛋白毒素来自天然分子大小为至少100KDa的蛋白，并且由嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdusnematophilus)、波氏致病杆菌(Xenorhabdus poinarii)、伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)、贝氏致病杆菌(Xenorhabdusbeddingii)或其它致病杆菌属种类的纯化培养物产生，该纯化致病杆菌培养物选自：
           S.carp             NRRL-B-21732，
           X.Wi               NRRL-B-21733，
           X.nem              NRRL-B-21734，
           X.NH3              NRRL-B-21735，
           X.riobravis        NRRL-B-21736
           GL133B             NRRL-B-21737，
           DEX1               NRRL-B-21738 ，
           DEX2               NRRL-B-21739，
           DEX3               NRRL-B-21740，
           DEX4               NRRL-B-21741，
           DEX5               NRRL-B-21742，
           DEX6               NRRL-B-21743.
2.一种组合物，其中包含有效量的具有抵抗昆虫的功能性活性的致病杆菌蛋白毒素，所述蛋白毒素来自天然分子大小为至少100KDa的蛋白，并且由命名为
           S.carp             NRRL-B-21732，
           X.Wi               NRRL-B-21733，
           X.nem              NRRL-B-21734，
           X.NH3              NRRL-B-21735，
           X.riobravis        NRRL-B-21736
           GL133B             NRRL-B-21737，
           DEX1               NRRL-B-21738，
           DEX2               NRRL-B-21739，
           DEX3               NRRL-B-21740，
           DEX4               NRRL-B-21741，
           DEX5               NRRL-B-21742，
           DEX6               NRRL-B-21743，
           DEX7               NRRL-B-30008，
           DEX8               NRRL-B-30028，
           ILM037             NRRL-B-30009，
           ILM039             NRRL-B-30010，
           ILM070             NRRL-B-30011，
           ILM078             NRRL-B-30012，
           ILM079             NRRL-B-30013，
           ILM080             NRRL-B-30014，
             ILM081             NRRL-B-30015，
             ILM082             NRRL-B-30016，
             ILM083             NRRL-B-30017，
             ILM084             NRRL-B-30018，
             ILM102             NRRL-B-30019，
             ILM103             NRRL-B-30020，
             ILM104             NRRL-B-30021，
             ILM129             NRRL-B-30022，
             ILM133             NRRL-B-30023，
             ILM135             NRRL-B-30024，
             ILM138             NRRL-B-30025，
             ILM142             NRRL-B-30026，
             ILM143             NRRL-B-30027，
             GLX26              NRRL-B-30002，
             GLX40              NRRL-B-30003，
             GLX166             NRRL-B-30004，
             SEX20              NRRL-B-30005，
             SEX76              NRRL-B-30006，和
             SEX180             NRRL-B-30007.的致病杆菌菌株的纯化培养物产生。
3.权利要求2的组合物，其中具有抵抗昆虫的功能性活性的毒素是由致病杆菌纯化培养物产生的一种或多种毒素的混合物。
4.权利要求1的组合物，其中具有抵抗昆虫的功能性活性的毒素由所述致病杆菌的纯化培养物产生，该毒素是一种或多种毒素的混合物，所述纯化培养物选自：
           S.carp        NRRL-B-21732，
           X.Wi          NRRL-B-21733，
           X.nem         NRRL-B-21734，
           X.NH3         NRRL-B-21735，
           X.riobravis   NRRL-B-21736
           GL133B        NRRL-B-21737，
           DEX1          NRRL-B-21738，
           DEX2          NRRL-B-21739，
           DEX3          NRRL-B-21740，
           DEX4          NRRL-B-21741，
           DEX5          NRRL-B-21742，
           DEX6          NRRL-B-21743，
           DEX7          NRRL-B-30008.
5.基本上纯的含有致病杆菌属菌株的微生物培养物，其中致病杆菌属菌株选自：
           S.carp        NRRL-B-21732，
           X.Wi          NRRL-B-21733，
           X.nem         NRRL-B-21734，
           X.NH3         NRRL-B-21735，
           X.riobravis   NRRL-B-21736
           GL133B        NRRL-B-21737，
           ILM037        NRRL-B-30009，
           ILM039        NRRL-B-30010，
           ILM070        NRRL-B-30011，
           ILM078        NRRL-B-30012，
           ILM079        NRRL-B-30013，
           ILM080        NRRL-B-30014，
           ILM081        NRRL-B-30015，
           ILM082        NRRL-B-30016，
           ILM083        NRRL-B-30017，
           ILM084        NRRL-B-30018，
           ILM102        NRRL-B-30019，
           ILM103        NRRL-B-30020，
           ILM104        NRRL-B-30021，
           ILM129        NRRL-B-30022，
           ILM133        NRRL-B-30023，
           ILM135        NRRL-B-30024，
           ILM138        NRRL-B-30025，
           ILM142        NRRL-B-30026，
           ILM143        NRRL-B-30027，
           GLX26         NRRL-B-30002，
           GLX40         NRRL-B-30003，
           GLX166        NRRL-B-30004，
           SEX20         NRRL-B-30005，
           SEX76         NRRL-B-30006，和
           SEX180        NRRL-B-30007.
6.控制昆虫的方法，包括对昆虫施用有效量的具有抵抗昆虫的功能性活性的蛋白毒素，其中所述蛋白具有至少为100KDa的分子量，并且由嗜线虫致病杆菌、波氏致病杆菌、伯氏致病杆菌、贝式致病杆菌或致病杆菌属种类的纯化培养物合成，该纯化培养物选自：
             S.carp        NRRL-B-21732，
             X.Wi          NRRL-B-21733，
             X.nam         NRRL-B-21734，
             X.NH3         NRRL-B-21735，
             X.riobravis   NRRL-B-21736，
             GL133B        NRRL-B-21737，
             DEX1          NRRL-B-21738，
             DEX2          NRRL-B-21739，
             DEX3          NRRL-B-21740，
             DEX4          NRRL-B-21741，
             DEX5          NRRL-B-21742，
             DEX6          NRRL-B-21743，
             DEX7          NRRL-B-30008.
7.控制昆虫的方法，包括对昆虫施用有效量的具有抵抗昆虫的功能性活性的蛋白毒素，其中所述蛋白具有至少为100KDa的分子量，并且由命名为
          S.carp        NRRL-B-21732，
          X.Wi          NRRL-B-21733，
          X.nem         NRRL-B-21734，
          X.NH3         NRRL-B-21735，
          X.riobravis   NRRL-B-21736
          GL133B        NRRL-B-21737，
          DEX1          NRRL-B-21738，
          DEX2          NRRL-B-21739，
          DEX3          NRRL-B-21740，
          DEX4          NRRL-B-21741，
          DEX5          NRRL-B-21742，
          DEX6          NRRL-B-21743，
          DEX7          NRRL-B-30008，
          DEX8          NRRL-B-30028，
          ILM037        NRRL-B-30009，
          ILM039        NRRL-B-30010，
          ILM070        NRRL-B-30011
          ILM078        NRRL-B-30012
          ILM079        NRRL-B-30013，
          ILM080        NRRL-B-30014，
          ILM081        NRRL-B-30015，
          ILM082        NRRL-B-30016，
          ILM083        NRRL-B-30017，
          ILM084        NRRL-B-30018，
          ILM102        NRRL-B-30019，
          ILM103        NRRL-B-30020，
          ILM104        NRRL-B-30021，
          ILM129        NRRL-B-30022，
          ILM133        NRRL-B-30023，
          ILM135        NRRL-B-30024，
          ILM138        NRRL-B-30025，
          ILM142        NRRL-B-30026，
          ILM143        NRRL-B-30027，
          GLX26         NRRL-B-30002，
          GLX40         NRRL-B-30003，
          GLX166        NRRL-B-30004，
          SEX20         NRRL-B-30005，
          SEX76         NRRL-B-30006，和
          SEX180        NRRL-B-30007.
的致病杆菌菌株的纯化培养物合成。
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