KR20020039055A

KR20020039055A - 제노랍두스 네마토필러스를 이용한 살충방법 및 생물농약조성물

Info

Publication number: KR20020039055A
Application number: KR1020000068944A
Authority: KR
Inventors: 김용균; 이영근; 한상찬
Original assignee: 김용균; 이영근; 한상찬
Priority date: 2000-11-20
Filing date: 2000-11-20
Publication date: 2002-05-25

Abstract

본 발명은 제노랍두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus: Xn)를 이용한 살충방법 및 생물농약 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 Xn을 곤충체내로 운반해주는 운반체로 곤충의 세포 및 조직을 손상시키는 생물농약, 특히 비티(Bacillus thuringinesis: Bt)를 사용하는 살충방법 및 유효성분으로 Xn과 운반체 생물농약을 함유하는 살충용 생물농약 조성물이 제공된다. 본 발명에 따른 살충방법 및 생물농약 조성물은 Xn과 운반체로 사용된 생물농약의 강력한 이중 살충작용으로 기존 생물농약에 대해 감수성이 낮았던 곤충에 대해서도 강력한 살충작용을 나타내게 된다.

Description

제노랍두스 네마토필러스를 이용한 살충방법 및 생물농약 조성물 {AN INSECTICIDAL METHOD AND BIOPESTICIDE COMPOSITION USING XENORHABDUS NEMATOPHILUS}

본 발명은 제노랍두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus: Xn)를 이용한 살충방법 및 생물농약 조성물에 관한 것으로, Xn을 곤충체내로 운반해주는 운반체로 곤충의 세포 및 조직을 손상시키는 생물농약, 특히 비티(Bacillus thuringinesis: Bt)를 사용하는 살충방법 및 Xn과 운반체 생물농약을 유효성분으로 함유하는 살충용 생물농약 조성물에 관한 것이다.

농작물에 심각한 경제적 피해를 주는 곤충류를 해충이라 하며 이러한 해충을방제할 목적으로 사용하는 것이 농약중 살충제이다. 현재의 살충제는 대부분 유기 합성된 화학농약으로 지난 50년간 해충 방제에 중요 방제자로서 역할을 담당하였다. 그러나 이러한 화학 살충제의 과다 사용과 연용으로 현재 크게 3가지 문제에 봉착하게 되었다. 우선 대상 해충의 약제에 대한 저항성(resistance)의 발현이다. 약제에 대한 저항성 발현은 약제의 효과를 저하시켰으므로 사용자인 농민은 더욱 자주 살포하거나 또는 살포량을 늘려야 했고, 이는 경제적 수지면에서 농자재 및 인건비의 증가로 생산비 가중을 일으겼다. 또한, 화학농약은 기존의 생물들의 먹이사슬에 의한 평형 상태를 무너뜨려 천적의 감퇴를 초래하므로 기존의 제2차 해충이 이제는 주요 해충화되는 격발(resurgence) 현상을 일으켜 더욱 다양한 해충상을 낳게 되었다. 그리고 이러한 이유들은 화학농약의 사용을 더욱 가속화시켰으며 이를 통해 심각한 환경오염 (environmental pollution)을 초래하게 되었다.

이러한 화학농약의 폐단을 보완하고자 생물농약 (biopesticide)의 개발이 진행되어 왔다. 이중 곤충에 선택적으로 살충력을 보유하며 환경조건에서 비교적 안정한 비티(Bacillus thuringinesis: Bt) 등이 효과적인 살충제로 인정받아 현재 나비목 곤충을 대상으로 상용화되고 있다.

그러나 생물농약은 선택성 때문에 대상 해충의 종류가 제약적이고, 화학농약과 비교하여 살충효과면에서 문제점들이 지적되고 있다. 살충제로서의 유효성이 인정된 비티 살충제의 경우도 최근에는 야외에서의 저항성이 보고 되고 있으며, 특히 파밤나방과 같이 다양한 약제에 대해 저항성을 보유하는 해충들에 대해서는 매우 낮은 감수성을 보여 주고 있다.

제노랍두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus)는 곤충병원성 선충 (Steinernema carpocapsae)의 장내에 공생하는 공생세균으로서 실제적으로 이 선충의 살충작용을 담당하는 살충인자인 것으로 증명되었다 (Park and Kim, 2000). 국내에서는 최초로 본 발명자들이 국내에서 채집된 선충종에서 제노랍두스 네마토필러스를 분리하여 동정하고, 그 작용을 확인한 바 있다 (Park 등, 1999).

이 세균의 중요한 살충기작은 기주 곤충의 면역 저하를 유도하여 혈액의 폐혈증을 유발시켜 혈액 침입 후 20시간내에 기주를 치사시키는 것으로 알려져 있다 (Park 등, 1999).

그러나, 이러한 높은 살충력에도 불구하고 제노랍두스 네마토필러스를 이용한 생물농약은 제대로 실용화되지 못하고 있는 실정이다. 이는 제노랍두스 네마토필러스가 곤충의 혈액으로 침투되어야 살충작용을 할 수 있는데, 현재로서는 이 세균을 곤충의 혈액내로 넣어주는 운반체가 부족하기 때문이다.

따라서, 종래에 제노랍두스 네마토필러스를 이용한 살충제들은 이 세균으로부터 살충작용이 있는 단백질 독소를 분리하여 곤충이나 식물에 적용하거나 유전공학적으로 처리하는 방법을 사용하는 것이었다 (한국공개특허 10-1998-701244). 또한, 지금까지 보고된 제노랍두스 네마토필러스의 살충력 실험결과들도 이 세균의 배양액을 직접 주사로 곤충체내에 주입한 후 측정한 결과들로서, 곤충 또는 식물의 외부에 투여된 제노랍두스 네마토필러스가 자연적으로 살충작용을 나타내도록 한 것은 아니었다.

자연계에서는 곤충체내에 Xn이 침투할 수 있도록 하는 일을 이 세균의 공생선충(Steinernema carpocapsae)이 담당하고 있다. 그러나, 이 선충은 특히 야외 조건에 약하여 파밤나방과 같은 지상부 해충의 방제에 직접 사용하기에는 아직 해결하여야 할 문제가 많이 있다.

참고문헌 :

Akhurst RJ (1982) Antibiotic activity ofXenorhabdusspp., bacteria symbiotically associated with insect pathogenic nematodes of the families Heterorhabditidae and Steinernematidae. Journal of General Microbiology 128, 3061-3065.

Dunphy GB, Webster JM (1984) Interaction ofXenorhabdus nematophilussubs.nematophiluswith the haemolymph ofGalleria mellonella. Journal of Insect Physiology 30, 883-889.

Park Y, Kim Y (2000) Eicosanoids rescue,Spodoptera exigua, infected withXenorhabdus nematophilus, the symbiotic bacteria to the entomopathogenic nematode,Steinernema carpocapsae. Journal of Insect Physiology 46, 1469-1476

Park Y, Kim Y, Yi Y (1999) Identification and characterization of a symbiotic bacterium associated withSteinernema carpocapsaein Korea. Journal of Asis-Pacific Entomology 2, 105-111.

Webster JM, Chen G, Li J (1998) Paratitic worms: an ally in the war against the superbugs. Parasitology Today 14, 161-163.

본 발명은 방제대상 곤충 또는 식물에 살포하는 것으로 충분히 살충효과를 나타낼 수 있는 제노랍두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus: Xn)를 이용한 살충방법 및 생물농약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

제노랍두스 네마토필러스가 살포로도 충분한 살충효과를 나타낼 수 있도록 하기 위해서는 곤충체내로 Xn을 운반해주는 운반체를 함께 사용하여야 하는데, 본 발명에서는 이러한 운반체로 Xn의 공생선충을 대신하여 곤충의 세포 및 조직을 손상시키는 생물농약, 특히 비티(Bacillus thuringinesis: Bt)를 이용한다.

본 발명에서 "제노랍두스 네마토필러스(Xn)"는 제노랍두스 네마토필러스 (Xenorhabdus nematophilus) 균주 및 배양액, 그리고 이로부터 생산된 살충력 있는 유효산물을 포함하는 의미로 사용된다.

또한, 본 발명에서 "비티(Bt)"는 살충력이 있는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringinesis) 균주 및 배양액, 그리고 이로부터 생산된 살충력 있는 유효산물을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

운반체로 사용되는 생물농약은 방제대상 곤충의 세포 및 조직을 손상시키게 되어 Xn이 이런 손상된 부위를 통해 곤충의 혈액에 이르게 되고, 곧 이어 강력한 살충작용을 하게 된다.

따라서, 운반체로 사용되는 생물농약은 비티로 한정되지 않고 방제대상 곤충의 세포 또는 조직을 손상시키는 생물농약이면 모두 사용가능하다.

Xn의 운반체로 비티(Bt)를 함께 사용할 경우에는, Bt의 작용점이 곤충의 중장세포이므로 Bt 독소에 의해 중장이 손상을 입게 되고 이때 같이 투여된 Xn이 중장을 넘어 혈액에 이르게 되므로, 곧 바로 Xn의 강력한 살충 작용을 나타내게 된다.

기존 비티 농약의 효과가 파밤나방과 같은 난방제 해충에 있어서는 매우 낮았는데, Xn을 함께 사용함으로써 Xn의 강력하고 빠른 살충력으로 Bt 단독에 대해 감수성이 낮은 곤충에 대해서도 살충효과를 높일 수 있고, 특히 치사에 이르게 하는 시간을 매우 단축시킬 수 있다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 제노랍두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus: Xn)를 곤충체내로 운반해주는 운반체로 곤충의 세포 및 조직을 손상시키는 생물농약을 사용하는 살충방법이 제공된다.

상기 Xn과 생물농약은 방제대상 곤충 또는 식물에 동시에 살포되거나 또는 생물농약의 투여후 Xn이 순차적으로 연속 살포될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서 운반체로 사용되는 상기 생물농약은 비티(Bt)이다.

또한, 본 발명에서는 유효성분으로 제노랍두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus)와; 곤충의 세포 및 조직을 손상시키는 운반체 생물농약을 함유하는 살충용 생물농약 조성물이 제공된다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서 상기 생물농약은 비티(Bt)이다.

본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기에 설명될 것이며, 본 발명의 실시예에 의해 더 잘 알게 될 것이다.

도 1은 비티(Bt) 살충제에 대한 제노랍두스 네마토필러스의 살충력 상승효과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 비티(Bt) 살충제 500ppm에서의 치사속도에 대한 제노랍두스 네마토필러스의 상승효과를 나타낸 그래프이다.

제노랍두스 네마토필러스( X. nematophilus )의 분리 및 배양

곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae) 감염태 약 400마리를 파밤나방 5령충에 국부처리했다. 처리 10시간 후 파밤나방의 혈액을 채취하고 이를 제노랍두스 네마토필러스의 선택 배지인 Xem 배지를 이용하여 28℃에서 배양했다. Xem 배지의 조성은 다음 표 1과 같다.

화 합 물	조 성
Bacto beef extract	3g
Bacto peptone	5g
Bacto agar	15g
Bromothymol blue	0.025g
Triphenyltetrazolium chloride	0.04g
Penicillin G	0.0625g
Streptomycin	4g
증류수	1L

배양 24시간 후 형성된 콜로니 중 가운데가 붉은 색을 띠며 주위에 하얀 테두리를 지닌 콜로니를 제노랍두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus)로 판정하고 이 콜로니를 TSB 배지를 이용하여 액체 배양하였다.

TSB 배지의 조성은 다음 표 2와 같다.

화 합 물	조 성
Bacto tryptone	17g
Bacto soytone	3g
Bacto dextrose	2.5g
Sodium chloride	5g
Dipotassium phosphate	2.5g
증류수	1L

실시예 1

실내에서의 살충력 시험

(1) 처리용 세균 용액 준비

TSB 배양액에서 28℃ 온도 조건을 통해 24∼48시간 배양시켰다. 이때 배지내 세균의 농도는 약 1.0 x 10⁹cells/㎖이다.

(2) 비티 농약

전진산업에서 제품화한 제품명 센타리 과립수화제™를 이용하였다.

(3) 실내 치사 효과 판정

살충효과 실험을 위해 상기 비티 농약이 두 가지 Xn 세균용액 (1.0x10⁸cfu/㎖ 및 1.0x10⁹cfu/㎖)에서 0, 125, 250, 500, 1000, 2000 ppm의 농도로 만들어졌다.

파밤나방(Spodoptera exigua)의 사료를 약 1㎝³로 자른 후 5분간 각 처리용액에 침적하였다. 이후 물기를 제거한 후 직경 10㎝의 페트리디쉬에 먹이를 놓고 3령충의 파밤나방을 3마리씩 접종하였다. 각 처리 농도에서 25마리의 파밤나방이 분석되었다.

처리후 24시간 간격으로 파밤나방의 사망 유무를 조사하였다. 사망은 머리, 가슴, 배를 눌러 자의적 움직임이 없을 때 이를 사망 개체로 판정하였다.

(4) 살충력 상승 효과

1) 비티(Bt) 살충제에 대한 Xn의 살충력 상승효과

실험결과는 도 1과 같다. 이때 처리된 곤충은 파밤나방 3령충이고, 각 관측치는 25마리의 검정 결과이다. 사망조사는 매일 7일간 지속되었으며 도 1의 결과는 7일간 누적된 사망 개체수를 백분율로 나타낸 것이다.

도 1에서 보는 바와 같이 비티 단독으로 처리하였을 경우 보다 Xn와 혼합하였을 때 살충효과가 월등히 상승되는 것을 알 수 있다. 특히 Xn이 10⁹cfu/㎖로 처리될 경우 비티 처리없이도 약 24%의 살충력을 발휘하는 것으로 나타나 Xn 단독의 효과도 알 수 있었다.

2) 반수치사농도 (LC50)와 95% 치사농도 (LC95)로 비교하여 본 제노랍두스 네마토필러스( Xenorhabdus nematophilus : Xn)의 비티(Bt) 살충제에 대한 상승효과

상기 효과를 보다 수량화하기 위해 파밤나방 집단의 50%를 치사시키는 반수치사농도(LC50) 및 95% 치사농도(LC95)를 비교하여 보았다.

결과는 다음의 표 3과 같다. 표 3에서 보는 바와 같이, 비티 단독 사용에 비해 Xn과 함께 처리될 경우 월등하게 Bt의 약제효과가 상승되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 두 가지 Xn의 농도에 따른 살충력의 차이는 거의 없었다.

처리조합	LC50, ppm(95% CI)	LC95, ppm(95% CI)	Slope±SD	X²	df	P
Bt 단독	466.1(376.3∼576.4)	1462.2(1072.1∼2430.4)	3.31±0.48	5.50	3	0.8611
Bt + Xn (10⁸cfu/㎖)	178.4(120.9∼232.1)	746.6(519.3∼1506.2)	2.65±0.50	4.08	3	0.7474
Bt + Xn (10⁹cfu/㎖)	154.4(77.1∼218.5)	661.4(437.5∼1782.7)	2.60±0.65	2.96	3	0.6021

3) 반수치사속도(LT50)와 95% 치사속도(LT95)로 비교하여 본 제노랍두스 네마토필러스(Xn)의 비티 살충제에 대한 상승효과

또한, 상기 결과를 살충 속도면에서 분석하였다. 즉, 비티 농약 500ppm을 기준으로 얼마나 빨리 곤충을 죽일 수 있는지를 분석하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 처리된 곤충은 파밤나방 3령충이고 각 관측치는 25마리 검정 결과이다.

도 2에서 보는 바와 같이, 비티 단독 사용에 비해 Xn을 혼합 사용하였을 경우 월등히 치사속도가 빨라지는 것을 확인할 수 있었다. 이를 다음의 표 4에서 반수치사속도 (LT50)과 95% 치사속도(LT95)로 정량화시켰다.

처리조합	LT50, days(95% CI)	LT95, days(95% CI)	Slope±SD	X²	df	P
Bt 단독	7.6(5.7∼15.1)	55.9(23.2∼652.8)	1.90±0.47	2.92	5	0.2881
Bt + Xn (10⁸cfu/㎖)	1.7(1.2∼2.0)	5.9(4.7∼8.8)	2.99±0.45	5.08	5	0.5944
Bt + Xn (10⁹cfu/㎖)	1.2(1.0∼1.4)	2.1(1.8∼3.1)	6.85±1.36	0.13	1	0.2768

실시예 2

야외조건에서의 살충력 시험

(1) 처리용 세균 용액 준비

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 준비하였다.

(2) 비티 농약

상기 실시예 1과 동일하게 준비하였다.

(3) 야외 조건의 살충력 분석

각 땅콩 포트에 100마리씩의 파밤나방 3령충을 접종하였다. 하루 후 각 포트에 붙어 있는 파밤나방의 밀도를 조사한 후 분석하고자 하는 처리 용액을 분무하였다. 각 포트에는 약 20㎖의 약제가 분무되었다. 처리 용액은 비티 농약을 500ppm으로 고정하고 Xn의 농도를 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸및 10⁹cfu/㎖의 농도로 준비하여 살충력을 비교하였다. 처리후 24시간 간격으로 각 포트의 땅콩기주에 남아있는 파밤나방의 생존 숫자를 조사하였다.

(4) 살충효과

포장조건에서 살충력을 분석하였다. 결과는 다음의 표 5와 같다.

제노랍두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus)만을 처리하여도 비티 살충제를 단독 처리하였을 때와 같은 살충력을 보이는 것으로 나타났다. 또한 Xn과 비티를 혼합하여 처리하였을 때에는, 단독 처리시에 비해 매우 유의성있게 살충력이 증가 되었고 농도 10⁸및 10⁹cfu/㎖에서 가장 높은 방제효과가 있는 것으로 나타났다.

제노랍두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus: Xn)의 비티 (Bt) 살충제 (500ppm)에 대한 포장조건에서 살충력 상승효과

처리(cfu/㎖)	파밤나방 수/땅콩	생존율 (%)	방제가 (%)
처리(cfu/㎖)	접종 수	처리 직전밀도	48시간	96시간	48시간	96시간
무 처 리	100	88.00±6.08	33.00±5.20	27.00±6.00c¹	-	-
Bt 단독	100	86.00±2.00	24.00±5.29	21.33±1.53b	27.28	21.00
Xn 단독	100	90.00±5.0	23.00±5.57	20.67±1.53b	30.30	23.44
Bt+Xn (10⁵)	100	91.00±4.04	21.00±3	20.67±1.53b	36.36	23.44
Bt+Xn (10⁶)	100	90.00±2.00	14.00±4	20.00±5b	57.58	26.93
Bt+Xn (10⁷)	100	89.00±1.52	7.67±1.15	1.00±1.73b	76.76	64.19
Bt+Xn (10⁸)	100	86.00±3.46	13.00±2.00	6.67±2.00a	60.61	75.30
Bt+Xn (10⁹)	100	91.00±4.93	13.50±4.00	7.33±2.31a	59.09	72.85

¹서로 다른 문자로 나타낸 평균치는 통계적으로 (LSD 검정) 5% 유의성 범위에서 차이가 있음을 나타낸다.

본 발명은 제노랍두스 네마토필러스를 이용한 강력한 살충방법 및 살충용 생물농약 조성물을 제공하는 것으로, 본 발명에 따르면 Xn과 운반체로 사용된 생물농약의 강력한 이중 살충작용으로 기존 생물농약에 감수성이 낮았던 곤충에 대해서도 강력한 살충작용을 나타내게 된다. 특히, 본 발명에서는 Xn과 비티(Bt)의 혼합사용으로 기존 비티 농약에 대해 효과가 낮았던 파밤나방과 같은 난방제 해충에 대해서도 살충효과를 크게 상승시킬 수 있고 치사에 이르는 시간도 현저하게 단축시킬 수 있다.

Claims

제노랍두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus: Xn)를 곤충체내로 운반해주는 운반체로 곤충의 세포 및 조직을 손상시키는 생물농약을 사용하는 것을 특징으로 하는 Xn을 이용한 살충방법.
제1항에 있어서,

상기 Xn과 생물농약은 방제대상 곤충 또는 식물에 동시에 살포되는 것을 특징으로 하는 살충방법.
제1항에 있어서,

상기 생물농약을 방제대상 곤충 또는 식물에 살포한 후 Xn을 순차적으로 연속 살포하는 것을 특징으로 하는 살충방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생물농약이 비티(Bacillus thuringinesis: Bt)인 것을 특징으로 하는 살충방법.
유효성분으로 제노랍두스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus)와; 곤충의 세포 및 조직을 손상시키는 운반체 생물농약을 함유하는 살충용 생물농약 조성물.
제5항에 있어서,

상기 생물농약이 비티(Bacillus thuringinesis: Bt)인 것을 특징으로 하는 조성물.