CN109077069A - 一种复配生物杀虫剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种复配生物杀虫剂及其制备方法和应用，该杀虫剂以绿僵菌孢子与硼酸为活性成分，其中，硼酸的质量百分含量≤2％。该杀虫剂在害虫防治害虫时不仅可以实现相加作用，还可以实现增效作用，并且复配之后起效时间大大缩短且在更短的时间内实现杀害效果，且硼酸的使用量大大低于市面上普通的化学杀虫剂。
Description
技术领域
本发明涉及昆虫防治领域，具体涉及一种复配生物杀虫剂及其制备方法和应用。
背景技术
金龟子绿僵菌属于半知菌亚门绿僵菌属，是一种广谱的昆虫病原真菌，可寄生于多种昆虫体内。其具有分布范围大，寄生广谱等特点，对人、畜和作物无毒害，是当前世界上研究和应用最多的虫生真菌之一。据不完全统计，全世界约有200多种昆虫能被这种真菌感染致死。绿僵菌具有显著的杀虫效果，并且具有不同于现有杀虫剂的全新的作用机理，主要作用于昆虫血淋巴免疫系统，使之丧失免疫防御功能。绿僵菌在发酵过程中会产生虫草素等多种毒素，这些毒性产物其中一方面的作用就是扰乱昆虫肠道菌群稳态，使昆虫抵抗力降低；且能分泌表皮降解酶等物质破坏昆虫体壁。绿僵菌感染后的死亡虫体有大量菌丝分布。全球对绿僵菌的研究已有100多年的历史，1879年，Metchnikoff首次利用绿僵菌防治金龟子幼虫并且取得成功，但由于受到许多因素的制约，导致其大田实际防效不稳定，极大地制约了其规模化生产和应用。
硼酸是传统的无机杀虫剂，可对抗多种农业和室内重要害虫。硼酸具有神经毒性作用，影响德国小蠊乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-硫酮S-转移酶(GSTs)的活性，即能够诱导谷胱甘肽-硫酮S-转移酶并降低乙酰胆碱酯酶的活性，并伴随着出现中毒症状；硼酸还能改变虫体中肠结构，而且使虫体失水干燥，导致虫体死亡。
目前对德国小蠊的防治仍以化学防治为主，然而大量化学杀虫剂的使用，不仅对生态环境具有长期的破坏作用，而且使德国小蠊产生了广泛的抗药性。而纯粹的生物防治有着起效慢、周期长的缺点，因此寻找更为安全、有效的害虫防治方法具有重要的意义。
发明内容
本发明通过实验发现特定浓度的绿僵菌孢子与硼酸复配在害虫(如蟑螂、蝗虫等)的防治中不仅可以实现相加作用，还可以实现增效作用，并且复配之后起效时间大大缩短且在更短的时间内实现杀害效果，且硼酸的使用量(≤2％)大大低于市面上普通的化学杀虫剂(如美国专利US10010082B中所述的，其硼酸含量为8.5-11.5％)。
本发明所述的增效作用通过采用Mansour法，即共毒因子法进行分析确定。当共毒因子数值超过+20为增效作用，低于-20为拮抗作用，在+20～-20之间为相加作用，其中，共毒因子的计算公式为：
本发明是通过如下技术方案实现的：
首先，本发明提供了一种杀虫组合物，其以绿僵菌孢子与硼酸为活性成分或由绿僵菌孢子、水和硼酸组成，其中，硼酸的质量百分含量≤2％。
本发明所述的质量百分含量或质量百分比或质量百分比浓度或质量浓度或wt％均表示相同意义，以及本发明下文所述的硼酸含量或硼酸浓度均表示硼酸的质量百分含量。
硼酸的质量百分含量可以为0.4～2.0％中的任意浓度，比如0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％，或者以上任意两个浓度组成的范围间的任意浓度，比如，硼酸的质量百分含量可以为1.2～2.0％、1.2～1.9％、1.2～1.8％、1.2～1.7％、1.2～1.6％、1.2～1.5％、1.2～1.6％、1.2～1.5％、1.2～1.4％、1.2～1.3％、1.3～2.0％、1.3～1.9％、1.3～1.8％、1.3～1.7％、1.3～1.6％、1.3～1.5％、1.3～1.6％、1.3～1.5％、1.3～1.4％、1.4～2.0％、1.4～1.9％、1.4～1.8％、1.4～1.7％、1.4～1.6％、1.4～1.5％、1.4～1.6％、1.4～1.5％、1.5～2.0％、1.5～1.9％、1.5～1.8％、1.5～1.7％、1.5～1.6％、1.5～1.5％、1.5～1.6％、1.6～2.0％、1.6～1.9％、1.6～1.8％、1.6～1.7％、1.7～1.9％、1.7～1.8％、1.8～1.9％、1.9～2.0％等。
优选地，所述硼酸的质量百分比为0.4～2.0％，优选为0.8-2.0％，更优选为1.2-2.0％，进一步优选为1.6-2.0％，最优选为1.6％或2.0％。
优选地，所述杀虫组合物由绿僵菌孢子水悬液与硼酸复配组成。
优选地，所述绿僵菌孢子为金龟子绿僵菌大孢变种EB0732，分离自感染绿僵菌的德国小蠊虫尸，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为保藏编号为CGMCCNo.13170。
优选地，所述绿僵菌孢子水悬液为无菌水孢子悬液，悬液中孢子的浓度为1×105～1×109CFU/mL。
悬液中孢子的浓度可以为1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL、1×109CFU/mL，也可以为任意两个浓度组成的范围间的任意浓度。比如，孢子浓度可以为1×105～1×108CFU/mL、1×105～1×107CFU/mL、1×105～1×106CFU/mL、1×106～1×109CFU/mL、1×106～1×108CFU/mL、1×106～1×107CFU/mL、1×107～1×109CFU/mL、1×107～1×108CFU/mL、1×108～1×109CFU/mL。
优选地，所述绿僵菌孢子为无菌水孢子悬液，悬液中孢子的浓度为1×106～1×107CFU/mL。
在本发明的某些实施方式中，当硼酸含量为1.2-2.0％，且绿僵菌孢子无菌水悬液中孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL时，对害虫(比如蟑螂、蝗虫等)的杀害率在第7天可达到90％以上，尤其当硼酸含量为1.6-2％时，对害虫(比如蟑螂、蝗虫等)的杀害在第7天可达到100％。
在本发明的某些实施方式中，当硼酸含量为1.2-1.6％，且绿僵菌孢子无菌水悬液中孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL时，对害虫(比如蟑螂、蝗虫等)的防治可实现增效作用，其共毒因子均在+20以上，且尤其当硼酸含量为1.2％，且绿僵菌孢子无菌水悬液中孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL时，其共毒因子可达到+59以上，可实现极好的增效效果。
根据本发明的实施方式，当硼酸的硼酸含量为0.4-2.0％，且绿僵菌孢子无菌水悬液中孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL时，杀害害虫(比如蟑螂、蝗虫等)的半数致死时间的平均值可低至5.8天。
在本发明的某些实施方式中，当硼酸的硼酸含量为1.2-2.0％，且绿僵菌孢子无菌水悬液中孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL时，杀害害虫(比如蟑螂、蝗虫等)的半数致死时间可在5天内实现。
优选地，所述杀虫组合物，其以绿僵菌孢子与硼酸为活性成分，其中，硼酸以1.6-2.0％的质量百分含量与孢子浓度为1×106～1×107CFU/mL的绿僵菌孢子无菌水悬液复配；优选地，硼酸以1.6％的质量百分含量与孢子浓度为1×107CFU/mL的绿僵菌孢子无菌水悬液复配；优选地，硼酸以2.0％的质量百分含量与孢子浓度为1×106CFU/mL的绿僵菌孢子无菌水悬液复配。
根据如上所述的杀虫组合物，本发明还提供了一种复配生物杀虫剂，其由主剂和辅剂组成，所述主剂为以绿僵菌孢子与硼酸为活性成分或由或由绿僵菌孢子、水和硼酸组成的组合物(即如上所述的杀虫组合物)，其中，主剂含量为0.4～2wt％，辅剂含量为98～99.6wt％。
优选地，所述辅剂由溶剂和辅料组成，其中，所述辅料选自小鼠全价饲料和红糖；
优选地，所述溶剂与辅料的重量比为1：2.7；
优选地，所述溶剂为不饱和脂肪酸，优选选自油酸和亚油酸；
其次，本发明提供一种制备上述复配生物杀虫剂的方法，其包括将绿僵菌孢子制备成无菌水悬液后与硼酸混合均匀，然后混匀进磨碎的辅剂中压制成固体块状剂，即得。
优选地，固体块状剂可进一步做成固体颗粒剂，既可以进行体内感染，也可以进行体壁感染，大大增加感染效率，使灭蟑效果更明显。
优选地，所述绿僵菌孢子为金龟子绿僵菌大孢变种EB0732；
优选地，所述绿僵菌的孢子悬液中孢子的浓度为1×105～1×109CFU/mL，优选为1×106～1×107CFU/mL。
优选地，所述硼酸的浓度≤2％，优选为0.4-2％，优选为0.8-2.0％，更优选为1.2-2.0％，进一步优选为1.6-2.0％，最优选为1.6％或2.0％。
优选地，所述辅剂由溶剂和辅料组成，其中，所述辅料选自小鼠全价饲料和红糖；
优选地，所述溶剂与辅料的重量比为1：2.7；
优选地，所述溶剂为不饱和脂肪酸，优选选自油酸和亚油酸；
优选地，所述绿僵菌孢子悬液与硼酸混合物的含量为0.4～2wt％，辅剂98～99.6wt％。
此外，本发明还提供了上述杀虫组合物或复配生物杀虫剂在防治咀嚼式口器昆虫中的应用。
优选地，所述咀嚼式口器昆虫选自蟑螂、蝗虫等。
优选地，所述蟑螂选自德国蟑螂、褐带蟑螂长须皮蠊(Supella longipaloa)、东方蟑螂东方蜚蠊(Blatta orientalis)、烟褐蟑螂烟色大蠊(Periplaneta fuliginosa)、美洲蟑螂美洲大蠊(Periplaneta Americana)、土耳其斯坦蟑螂(Blatta lateralis)、德国小蠊(Blatella germanica)、田野蟑螂(Blatta vaga)等。
相同条件下，本发明的杀虫组合物或以本发明的杀虫组合物为主剂的复配生物杀虫剂使试虫达到半数致死的平均时间比两种单剂所用平均时间都要短，其起效速度超过纯化学药剂。所以将绿僵菌孢子和低浓度硼酸进行复配的增效作用明显，可以克服绿僵菌反应缓慢和硼酸控制时间有限且易使试虫(比如德国小蠊)产生抗药性的缺陷。低浓度的硼酸作为安全的无机杀虫剂，与对人畜无害的绿僵菌复配，可有效控制杀灭德国小蠊。复配之后具有高效环保、安全健康、降低成本、不易产生抗药性的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明实施例中使用的绿僵菌孢子为金龟子绿僵菌大孢变种EB0732，分离自染病的德国小蠊虫尸，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为保藏编号为CGMCC No.13170。
在本发明的某些实施方式中，本发明所述的杀虫组合物由1.2-2.0wt％的硼酸和孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL的绿僵菌孢子无菌水悬液复配组成，当硼酸含量为1.2-2.0％，且绿僵菌孢子无菌水悬液中孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL时，对害虫(比如蟑螂、蝗虫等)的杀害率在第7天可达到90％以上，尤其当硼酸含量为1.6-2％时，对害虫(比如蟑螂、蝗虫等)的杀害在第7天可达到100％。
在本发明的某些实施方式中，本发明所述的杀虫组合物由1.2-1.6wt％的硼酸和孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL的绿僵菌孢子无菌水悬液复配组成，当硼酸含量为1.2-1.6％，且绿僵菌孢子无菌水悬液中孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL时，对害虫(比如蟑螂、蝗虫等)的防治可实现增效作用，其共毒因子均在+20以上，且尤其当硼酸含量为1.2％，且绿僵菌孢子无菌水悬液中孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL时，其共毒因子可达到+59以上，可实现极好的增效效果。
在本发明的某些实施方式中，本发明所述的杀虫组合物由0.4-2.0wt％的硼酸和孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL的绿僵菌孢子无菌水悬液复配组成，当硼酸的硼酸含量为0.4-2.0％，且绿僵菌孢子无菌水悬液中孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL时，杀害害虫(比如蟑螂、蝗虫等)的半数致死时间的平均值可低至5.8天。
在本发明的某些实施方式中，本发明所述的杀虫组合物由1.2-2.0wt％的硼酸和孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL的绿僵菌孢子无菌水悬液复配组成，当硼酸的硼酸含量为1.2-2.0％，且绿僵菌孢子无菌水悬液中孢子浓度为1×105～1×109CFU/mL时，杀害害虫(比如蟑螂、蝗虫等)的半数致死时间可在5天内实现。
实施例1-25
将绿僵菌孢子制备成无菌水悬液后与硼酸混合均匀制备主剂，其中，绿僵菌孢子无菌水悬液中的孢子浓度以及硼酸的浓度配比分别表1所示，然后将主剂混匀进磨碎的辅剂(油酸与红糖以质量比1:2.7混合制成辅剂)中压制成固体块状剂，即得复配生物杀虫剂，其中，主剂的含量为2％，辅剂的含量为98％。
表1
| 实施例 | 硼酸与绿僵菌孢子浓度配比 |
| 1 | 0.4％硼酸·1×10<sup>5</sup>CFU/ml |
| 2 | 0.8％硼酸·1×10<sup>5</sup>CFU/ml |
| 3 | 1.2％硼酸·1×10<sup>5</sup>CFU/ml |
| 4 | 1.6％硼酸·1×10<sup>5</sup>CFU/ml |
| 5 | 2.0％硼酸·1×10<sup>5</sup>CFU/ml |
| 6 | 0.4％硼酸·1×10<sup>6</sup>CFU/ml |
| 7 | 0.8％硼酸·1×10<sup>6</sup>CFU/ml |
| 8 | 1.2％硼酸·1×10<sup>6</sup>CFU/ml |
| 9 | 1.6％硼酸·1×10<sup>6</sup>CFU/ml |
| 10 | 2.0％硼酸·1×10<sup>6</sup>CFU/ml |
| 11 | 0.4％硼酸·1×10<sup>7</sup>CFU/ml |
| 12 | 0.8％硼酸·1×10<sup>7</sup>CFU/ml |
| 13 | 1.2％硼酸·1×10<sup>7</sup>CFU/ml |
| 14 | 1.6％硼酸·1×10<sup>7</sup>CFU/ml |
| 15 | 2.0％硼酸·1×10<sup>7</sup>CFU/ml |
| 16 | 0.4％硼酸·1×10<sup>8</sup>CFU/ml |
| 17 | 0.8％硼酸·1×10<sup>8</sup>CFU/ml |
| 18 | 1.2％硼酸·1×10<sup>8</sup>CFU/ml |
| 19 | 1.6％硼酸·1×10<sup>8</sup>CFU/ml |
| 20 | 2.0％硼酸·1×10<sup>8</sup>CFU/ml |
| 21 | 0.4％硼酸·1×10<sup>9</sup>CFU/ml |
| 22 | 0.8％硼酸·1×10<sup>9</sup>CFU/ml |
| 23 | 1.2％硼酸·1×10<sup>9</sup>CFU/ml |
| 24 | 1.6％硼酸·1×10<sup>9</sup>CFU/ml |
| 25 | 2.0％硼酸·1×10<sup>9</sup>CFU/ml |
实施例26-50
按照实施例1的方法制备复配生物杀虫剂，其中，主剂中绿僵菌孢子与硼酸浓度配比如表1所示，主剂的含量为0.4％，辅剂的含量为99.6％。
实施例51-75
按照实施例1的方法制备复配生物杀虫剂，其中，主剂中绿僵菌孢子与硼酸浓度配比如表1所示，辅剂由小鼠全价饲料与油酸以质量比2.7:1混合制备。
实施例76-100
按照实施例1的方法制备复配生物杀虫剂，其中，主剂中绿僵菌孢子与硼酸浓度配比如表1所示，辅剂由小鼠全价饲料与亚油酸以质量比2.7:1混合制备。
实施例101-125
按照实施例1的方法制备复配生物杀虫剂，其中，主剂中绿僵菌孢子与硼酸浓度配比如表1所示，辅剂由红糖与亚油酸以质量比2.7:1混合制备。
实验例
绿僵菌孢子：选用金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)大孢变种EB0732：分离自感染绿僵菌的德国小蠊虫尸，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为保藏编号为CGMCC No.13170。
实验对象：山东师范大学动物抗性实验室饲养的德国小蠊雄性敏感品系雄性成虫。
实验方法：实验分为三个大组分别为绿僵菌孢子试验组、硼酸试验组和绿僵菌孢子硼酸复配试验组(即实施例26-50制备的杀虫剂，下方试验中以浓度配比表示)。每只试虫上投放的绿僵菌孢子浓度应在1×105～1×109CFU/mL之间，硼酸最佳含量范围为0.4％～2％。所以设计给试虫投放的绿僵菌孢子浓度梯度为：1×105，1×106，1×107，1×108，1×109CFU/mL；复配剂中硼酸含量梯度为：0.4％、0.8％、1.2％、1.6％、2％。每个大组内均含有一个对照组，如若对照组试虫死亡率超过10％则重新进行试验。投放药剂后每24h观察和记录各组试虫的死亡数，以备后期进行数据分析。
复配药剂增效与否分析采用Mansour法，即共毒因子法。共毒因子数值超过+20为增效作用，低于-20为拮抗作用，在+20～-20之间为相加作用。其计算公式为：
“混剂观察死亡率”是实际观察的各组混剂实际死亡率，“混剂的理论死亡数”是从各单剂的毒力回归线上直接查出或由单剂的回归方程计算出相应的死亡率相加而成。
实验结果如表2-4所示。
表2各试验回归方程及单剂7d(即7天，d即天)理论死亡率
表3复配剂7d共毒因子
表4半数致死时间比较
实验结果：
1、共毒因子方面：
全部25组不同配比的复配剂的共毒因子数值中，全部复配剂共有17组的共毒因子数值超过+20，属于增效作用，无一出现拮抗作用。
2、第7d累积死亡率方面：
两种单剂理论死亡率之和在第7d时最高死亡率为86.22％，而复配制剂在第7d时，有13组实验的试虫死亡率超过90％，更有5组实验的试虫死亡率达到100％。
3、达到半数致死的时间方面：
相同条件下，单独使用绿僵菌孢子或硼酸时各种浓度药剂使试虫累计死亡率达到50％的平均时间分别为32d和9d，而将两者复配后各浓度的药剂使试虫累计死亡率达到50％的平均时间只需5.8d，并且至少有15组实验的试虫在5天内即可实现50％的累积死亡率。
Claims (10)
1.一种杀虫组合物，其以绿僵菌孢子与硼酸为活性成分或由绿僵菌孢子、水和硼酸组成，其中，硼酸的质量百分含量≤2％。
2.根据权利要求1所述的杀虫组合物，其特征在于，所述杀虫组合物由绿僵菌孢子水悬液与硼酸复配组成；
优选地，所述硼酸的质量百分含量为0.4-2.0wt％，优选为0.8-2.0wt％，更优选为1.2-2.0wt％，最优选为1.6-2.0wt％。
3.根据权利要求1或2所述的杀虫组合物，其特征在于，所述绿僵菌孢子为金龟子绿僵菌大孢变种EB0732，分离自染病的德国小蠊虫尸，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为保藏编号为CGMCC No.13170。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的杀虫组合物，其特征在于，所述绿僵菌孢子水悬液为无菌水孢子悬液，悬液中孢子的浓度为1×105～1×109CFU/mL。
5.一种复配生物杀虫剂，其特征在于，所述杀虫剂由主剂和辅剂组成，其含量分别为主剂0.4～2wt％，辅剂98～99.6wt％，其中，所述主剂为权利要求1至4中任一项所述的杀虫组合物。
6.根据权利要求5所述的杀虫剂，其特征在于，所述辅剂由溶剂和辅料组成，其中，所述辅料选自小鼠全价饲料、红糖；
优选地，所述溶剂与辅料的重量比为1：2.7；
优选地，所述溶剂为不饱和脂肪酸，优选选自油酸、亚油酸。
7.权利要求5或6所述的复配生物杀虫剂的制备方法，其包括将绿僵菌孢子制备成无菌水悬液后与硼酸混合均匀，然后混匀进磨碎的辅剂中压制成固体块状剂，即得。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述绿僵菌为金龟子绿僵菌大孢变种EB0732；
优选地，所述绿僵菌的孢子悬液中孢子的浓度为1×105～1×109CFU/mL；
优选地，所述硼酸的浓度≤2wt％，优选为0.4-2wt％，优选为0.8-2.0wt％，更优选为1.2-2.0wt％，最优选为1.6-2.0wt％；
优选地，所述辅剂由溶剂和辅料组成，其中，所述辅料选自小鼠全价饲料、红糖；
优选地，所述溶剂与辅料的重量比为1：2.7；
优选地，所述溶剂为不饱和脂肪酸，优选选自油酸、亚油酸；
优选地，所述绿僵菌孢子悬液与硼酸混合物的含量为0.4～2wt％，辅剂98～99.6wt％。
9.权利要求1至4中任一项所述的杀虫组合物或权利要求5或6所述的复配生物杀虫剂在防治咀嚼式口器昆虫中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述咀嚼式口器昆虫选自蟑螂和蝗虫；
优选地，所述蟑螂选自德国蟑螂褐带蟑螂长须皮蠊、东方蟑螂东方蜚蠊、烟褐蟑螂烟色大蠊、美洲蟑螂美洲大蠊、德国小蠊、土耳其斯坦蟑螂和田野蟑螂。
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