CN106544278A - 一种用于蟑螂生物防治的病原真菌 - Google Patents

一种用于蟑螂生物防治的病原真菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于蟑螂生物防治的病原真菌，该菌株的分类命名是金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae），编号为EB0732，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为保藏编号为CGMCC No.13170。有益效果：（1）该病原真菌不易对害虫产生抗药性。（2）该病原真菌对寄主有较强的选择性，对环境安全。（3）本发明的金龟子绿僵菌对不同虫龄的雌雄害虫具有较强的致死作用。

Description

一种用于蟑螂生物防治的病原真菌
技术领域
本发明具体涉及一种用于蟑螂生物防治的病原真菌。
背景技术
蜚蠊，俗称蟑螂，泛指属于蜚蠊目(Blattodea)的昆虫，有文献记载，当前的分类学者将蟑螂分成6000种左右，其中约有50种是害虫，例如大家所常见的亚洲蟑螂。此外美洲蟑螂(美洲大蠊)、德国蟑螂(德国小蠊)、棕色蟑螂和澳洲蟑螂的分布也十分广泛。我国约有200余种，常见的室内蟑螂有10种左右，各地有所不同，常见的有德国小蠊和美洲大蠊。德国小蠊(学名Blattella germanica)，又叫德国蟑螂、德国姬蠊，原自非洲，是亚洲蟑螂的近亲品种。德国小蠊繁殖速度快，每个卵囊可孵出多只若虫，这些若虫由出生至交配期的所需时间短暂，因此人们难以将之彻底驱除。另外雌性德国小蠊在产卵期间不会即时把卵囊排出，而是留在体内孵化一段时间，使人们不会发现它们的卵囊，而将之清除。
蟑螂是一种对人类具有严重危害的害虫，主要体现在两个方法，第一，传播疾病，携带很多致病菌，蟑螂爬了垃圾、粪便，身上沾染了很多致病菌，再爬到我们的食品、食物上，通过这样的途径把致病菌传播给人类；第二，如苍蝇一般对我们正常的生活和工作的骚扰。因此需要对蟑螂进行有效防治。
目前防治德国小蠊的方法和药物有很多种，主要以化学防治为主，然而大量化学杀虫剂的使用，不仅对生态环境具有长期的破坏作用，而且造成德国小蠊产生了广泛的抗药性，还对人畜有着直接或间接的危害。
关于生物防治的金龟子绿僵菌属于子囊菌门、麦角菌科、绿僵菌属，是一种昆虫寄生真菌。它对寄主侵染过程包括粘附、孢子萌发、产生附着胞、穿透虫体、体内发育和致死。这一过程是附着胞、表皮降解酶和破坏菌素等物质的生理生化作用的综合结果。由于其寄主范围广、致病力强，对人、畜、农作物无害，容易进行大规模生产，以及能够产生持续控制效果等，具有广阔的害虫生物防治应用前景。然而，尽管目前存在一些绿僵菌产品，但是其毒力较弱，致死率低，杀虫时间较长，以及对寄主的选择性较差；另外，绿僵菌对各个生长阶段的德国小蠊是否都具有致死效果，无确切证据。
因此寻找更为有效的害虫防治方法具有重要的意义。
发明内容
本发明针对现有技术中防治蟑螂产生的广泛的抗药性，环境污染，对人畜的危害以及毒力较弱，致死率低，杀虫时间较长，对寄主的选择性较差，以及是否可以杀灭各个生长阶段的德国小蠊等诸多问题，提供一种金龟子绿僵菌，利用该昆虫病原真菌防治害虫不易产生抗药性，对寄主有较强的选择性，且对环境安全等特点，作为生物杀虫剂开发进行利用，从而达到病虫害防治的目的。
本发明采用以下技术方案：
针对以上现有技术，本发明的第一个方面是提供一种金龟子绿僵菌。
本发明所提供的金龟子绿僵菌的分类命名是金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)，编号为EB0732，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.13170。
菌落来源：
本发明从感染绿僵菌的德国小蠊僵虫尸体中分离获得1株病原真菌，经形态、分子生物学鉴定该菌株为金龟子绿僵菌。
菌落特征及菌体形态：
金龟子绿僵菌属于真菌界，子囊菌门、麦角菌科、绿僵菌属。本发明的金龟子绿僵菌EB0732(Metarhizium anisopliae)在PDA培养基上培养，菌落呈绒毛状，最初为白色，随着培养时间延长，菌落颜色逐渐变成浅黄色，产孢子时逐渐变为绿色；中间有白色凸起，周围是短绒状菌丝，菌落边缘规则圆滑，菌丝向四周放射状平铺生长，之后菌落中央的孢子圈扩大，孢子疏松或紧密聚集形成分生孢子，成熟孢子易脱落。(图1)。显微观察孢子呈柱形至卵圆形，通常中部稍细，孢子大小约为4.7-5.4×2.1-2.6μm(图2)，菌丝分枝，具隔，无色光滑，宽约2.8-3.2μm。挑取菌丝，提取DNA，进行DNA的PCR扩增、序列测定和真菌分类地位的确定。经PCR扩增，结果得到约650bp的PCR产物(图3)，与目的片段大小一致。测序产物片段长度为530bp(如序列表所示)。将该序列进行BLAST搜索并利用MEGA 4软件构建系统发育树(图4)，并结合该菌形态学生理生化特征，将菌株定为金龟子绿僵菌。
本发明的第二个方面是提供一种微生物混合物，其特点是至少包含本发明的菌株。
其中，所述菌株为为分生孢子或/和菌丝体。
所述微生物混合物可以包含其他用于防治蟑螂的、并与本发明的菌株共生的微生物。
本发明的第三个方面是提供一种包含以本发明菌株为活性成分的杀虫菌剂。
优选的，所述杀虫菌剂用于防治德国小蠊。
所述杀虫菌剂包括载体；所述载体可以为液体载体，所述液体载体为常规的载体材料，比如水、植物油或矿物油等；所述杀虫剂的形式可以为溶液形式或悬浮剂形式。
本发明的第四个方面是提供一种本发明的菌株、本发明的微生物混合物或者本发明的杀虫剂在防治蜚蠊目昆虫中的应用。
尤其是在防治德国小蠊中的应用。
本发明的第五个方面是提供一种生物防治蟑螂的方法，该方法包括将蟑螂与本发明菌株金龟子绿僵菌EB0732(Metarhizium anisopliae)相接触的步骤。
其中，所述相接触是指将菌株涂抹或喷洒到蟑螂的体表上。
上述技术方案具有如下有益效果：
(1)该病原真菌不易对害虫产生抗药性。
(2)该病原真菌对德国小蠊有较强的选择性，对环境安全，有利于保护天敌，且对脊椎动物未见有毒害作用，可以作为生物杀虫剂进行开发利用。
(3)本发明的金龟子绿僵菌对不同虫龄的雌雄害虫具有较强的致死作用，对1～3龄若虫的防治效果能够达到100％，对死亡率较低的5～7龄雌雄虫的防治效果也比较突出；使用该昆虫病原真菌可以引起德国小蠊昆虫种群内流行病，从而达到控制昆虫种群数量，防治害虫的目的。
(4)在较低用量的金龟子绿僵菌作用下，德国小蠊能够短时间死亡，与其他绿僵菌产品相比，具有较强的毒力作用。该发明的菌株将成为最具应用前景的害虫防治手段。
附图说明
图1是金龟子绿僵菌在PDA培养基上的菌落形态图。
图2是显微镜下绿僵菌孢子形态(1000X)图。
图3是菌株的ITS序列特征图。
图4是ITSl—5.8S—ITS2rDNA区域分支系统发育树图。
图5是感染绿僵菌虫照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1金龟子绿僵菌EB0732(Metarhizium anisopliae)的筛选
(1)筛选过程
分离纯化均在超净工作台下进行：用接种针蘸取德国小蠊僵虫表面孢子粉划线在直径为90mm的涂抹有0.5％庆大霉素的PDA培养基上，或者用灭菌的镊子夹取僵虫轻轻且快速在上述培养基上震动几下。放入26℃恒温培养箱中黑暗条件下培养。3天后，挑取培养基上的培养物转移到新的装有直径为90mm的涂抹有庆大霉素的平板PDA培养基上，重复操作几次就可得到纯的菌种。并用分离到的绿僵菌纯培养物，回复感染健康的德国小蠊，并从回复感染致病的德国小蠊虫尸中，重新分离得到了相同的绿僵菌，确定为德国小蠊的致病菌。
(2)菌落特征及菌体形态
本发明的金龟子绿僵菌EB0732(Metarhizium anisopliae)在PDA培养基上培养，菌落呈绒毛状，最初为白色，随着培养时间延长，菌落颜色逐渐变成浅黄色，产孢子时逐渐变为绿色；中间有白色凸起，周围是短绒状菌丝，菌落边缘规则圆滑，菌丝向四周放射状平铺生长，之后菌落中央的孢子圈扩大，孢子疏松或紧密聚集形成分生孢子，成熟孢子易脱落。(图1)。显微观察孢子呈柱形至卵圆形，通常中部稍细，孢子大小约为4.7-5.4×2.1-2.6μm(图2)，菌丝分枝，具隔，无色光滑，宽约2.8-3.2μm。
(3)ITSl-5.8S—ITS2rDNA序列分析
挑取菌丝，提取DNA，进行ITSl-5.8S—ITS2rDNA的PCR扩增、序列测定和真菌分类地位的确定。经PCR扩增，结果得到约650bp的PCR产物(图3)，与目的片段大小一致。测序产物片段长度为530bp(如序列表所示)。将该序列进行BLAST搜索并利用MEGA 4软件构建系统发育树(图4)，并结合该菌形态学生理生化特征，将菌株定为金龟子绿僵菌。
金龟子绿僵菌EB0732(Metarhizium anisopliae)已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.13170。
实施例2金龟子绿僵菌EB0732(Metarhizium anisopliae)对德国小蠊的毒力测定
取PDA培养基上的绿僵菌分生孢子，进行浓度梯度点滴生测，将绿僵菌孢子分别配制成1×105，1×106，1×107，1×108，1×109个CFU/ml五个孢子浓度，滴加0.5％(w/w，占孢子溶液质量)吐温80混匀后备用。取敏感品系1-3龄若虫，3-5龄若虫，5-7龄雌雄若虫，雌雄成虫德国小蠊健康个体，每组20只，用微量移液器吸取不同浓度的孢子悬液1μL点滴到德国小蠊背板，24h后开始死亡，观察至20d，记录德国小蠊累计死亡率，实验数据用SPSS20进行处理，每组试验重复三次。收集具有典型病死特征的虫体，恒温培养，以死亡虫体长出菌丝为有效侵染标志(图5)。染病后德国小蠊行动迟缓，身体僵硬，24h后开始死亡，身体颜色有变深症状，并从感染致病的虫尸中，重新分离得到了相同的病原菌，确定为德国小蠊的致病菌-金龟子绿僵菌EB0732(Metarhizium anisopliae)。
表1不同浓度绿僵菌感染德国小蠊的死亡率
表2不同虫龄德国小蠊的半致死浓度
结果显示绿僵菌菌悬液对德国小蠊有明显的致死作用，并且随着孢子浓度的增加，死亡率随之增加；在1×109个CFU/ml个孢子浓度时，1-3龄若虫校正死亡率达100％，因德国小蠊若虫居多，本发明具有较大应用前景；死亡率最低的5-7龄雌虫也能达到63.16％(表1)。计算不同虫龄德国小蠊的半致死浓度，1-3龄若虫最低：68.12孢子/ml，5-7龄雌虫最高为2.8×107孢子/ml(表2)。
本发明德国小蠊接种绿僵菌处理24h后开始死亡，2-3天病症最为明显，表现出身体僵硬，行动力缓慢，身体变深等病症，且死亡时间集中在前10天，从死亡时间来看，本发明的感染时间较短。
另外，与现有技术中的金龟子绿僵菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心保存，菌种编号3，3676，在中国科学院微生物研究所可以购买得到)的毒力相比较，经过试验验证得到，本发明的病原菌毒力更强。
本发明配制悬浮液使用的是无菌水，还可以使用油剂作为载体，比如植物油或矿物油，由于绿僵菌通过体表感染德国小蠊，油剂的感染效果更强，经过试验验证，油剂确实比水剂的感染效果更强。
全身浸菌感染实验：
本发明配制孢子浓度为1×106个/ml的无菌水悬浮液，对健康的德国小蠊成虫进行全身的浸菌感染，5天死亡率达95％，6天全部死亡，可见，死亡时间短，发病快，致死效果明显。
综上可见，本发明的金龟子绿僵菌转基因菌种对德国小蠊灭杀效果好，毒力较好，能够在短时间内实现对德国小蠊种群的有效控制。
实施例3
本发明的绿僵菌的选择性较强，经过试验可得，该真菌对蜚蠊目昆虫尤其是德国小蠊有突出的致病能力，对其他的蜚蠊目昆虫的致病能力相对较低，效果不显著；对脊椎动物(鱼类等)和其他常见的有益经济昆虫(比如蜘蛛、寄生蜂等)未见有毒害，有利于保护天敌，并且对环境安全。
实施例4
一种包含金龟子绿僵菌EB0732(Metarhizium anisopliae)的杀虫菌剂，该菌剂包含载体水、金龟子绿僵菌EB0732(Metarhizium anisopliae)和吐温80，其原料配比量根据所需情况进行设定。经过实验验证，该菌剂对德国小蠊有较强的致病能力，能够较好的防治德国小蠊。另外，该载体可替换为植物油或矿物油，得到的杀虫菌剂对德国小蠊的感染效果更强。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种用于蟑螂生物防治的病原真菌
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 530
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta ccgagttatc caactcccaa cccctgtgaa 60
tcataccttt aattgttgct tcggcgggac ttcgcgcccg ccggggaccc aaaccttctg 120
aattttttaa taagtatctt ctgagtggtt aaaaaaaatg aatcaaaact ttcaacaacg 180
gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg 240
cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gcccgtcagt attctggcgg 300
gcatgcctgt tcgagcgtca ttacgcccct caagtcccct gtggacttgg tgttggggat 360
cggcgaggct ggttttccag cacagccgtc ccttaaatta attggcggtc tcgccgtggc 420
cctcctctgc gcagtagtaa agcactcgca acaggagccc ggcgcggtcc actgccgtaa 480
aaccccccaa ctttttatag tgacctcgac tcaggaggat atccaacgct 530

Claims (10)

1. 一种金龟子绿僵菌，其特征是：该菌株的分类命名是金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae），编号为EB0732，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为保藏编号为CGMCC No.13170。
2.一种微生物混合物，其特征是：至少包含权利要求1所述的金龟子绿僵菌。
3.包含以权利要求1所述的金龟子绿僵菌为活性成分的杀虫菌剂。
4.如权利要求3所述的杀虫菌剂，其特征是：所述杀虫菌剂用于防治德国小蠊。
5.如权利要求3所述的杀虫菌剂，其特征是：所述杀虫菌剂包括载体。
6.如权利要求3所述的杀虫菌剂，其特征是：所述载体为液体载体，所述液体载体为常规的载体材料，所述常规的载体材料为水、植物油或矿物油。
7.如权利要求3所述的杀虫菌剂，其特征是：所述杀虫剂的形式为溶液形式或悬浮剂形式。
8.权利要求1所述的金龟子绿僵菌或权利要求2所述的微生物混合物或权利要求3所述的杀虫菌剂在防治蜚蠊目昆虫中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征是：所述蜚蠊目昆虫具体是德国小蠊。
10.一种生物防治蟑螂的方法，该方法包括将蟑螂与权利要求1所述的金龟子绿僵菌相接触的步骤。
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