CN109997876A - 一种复配生物杀虫剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种复配生物杀虫剂及其制备方法和应用，该复配杀虫剂以两种微生物为活性成分或由两种微生物复配组成的杀虫组合物为主剂，所述两种微生物为真菌孢子和细菌，其中，真菌孢子为绿僵菌孢子，所述细菌为沙雷氏菌。将绿僵菌和沙雷氏菌进行复配的增效作用明显，防效明显加强，可以克服单剂作用缓慢、效果持续时间短、杀虫范围有限的缺点。

Description

一种复配生物杀虫剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及昆虫防治领域，具体涉及一种复配生物杀虫剂及其制备方法和应用。

背景技术

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)属于半知菌亚门绿僵菌属，是一种广谱的昆虫病原真菌，可寄生于多种昆虫体内。其具有分布范围大，寄生广谱等特点，对人、畜和作物无毒害，是当前世界上研究和应用最多的虫生真菌之一。据不完全统计，全世界约有200多种昆虫能被这种真菌感染致死。绿僵菌具有显著的杀虫效果，并且具有不同于现有杀虫剂的全新的作用机理，主要作用于昆虫血淋巴免疫系统，使之丧失免疫防御功能。绿僵菌在发酵过程中会产生虫草素等多种毒素，这些毒性产物其中一方面的作用就是扰乱昆虫肠道菌群稳态，使昆虫抵抗力降低；且能分泌表皮降解酶等物质破坏昆虫体壁。绿僵菌感染后的死亡虫体有大量菌丝分布。全球对绿僵菌的研究已有100多年的历史，1879年，Metchnikoff首次利用绿僵菌防治金龟子幼虫并且取得成功，但由于受到许多因素的制约，导致其大田实际防效不稳定，极大地制约了其规模化生产和应用。

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌，目前只应用于鳞翅目、直翅目、同翅目和鞘翅目昆虫中。研究表明，用含PS-1菌株的人工饲料饲喂甜菜夜蛾幼虫表现出较好的胃毒作用，部分存活试虫的生长发育也会受到明显抑制。致病力主要表现在造成昆虫停食，行动迟缓，对刺激反映迟钝，幼虫生长期缩短，不能正常羽化等方面。粘质沙雷氏菌通过产生几丁质酶、磷脂酶、灵菌红素等次级代谢产物水解鳞翅目、直翅目、同翅目和鞘翅目昆虫幼虫体表和围食膜结构，导致肠道微绒毛变形甚至脱落，影响昆虫肠道抵御病原微生物入侵和营养摄取等正常生命活动。灵菌红素是沙雷氏菌重要的毒性产物，是一种深红色的天然化合物，能水解昆虫幼虫体表和围食膜结构，具有抗菌、抗肿瘤和抗疟疾等多种生物活性，能引起细胞凋亡、DNA的裂解作用及对丝裂原激活蛋白激酶家族相关信号分子的影响，致使线粒体和核仁发生病变，部分细胞器消失，对昆虫产生极大的毒害。

发明人发现目前对德国小蠊的防治仍以化学防治为主，然而大量化学杀虫剂的使用，不仅对生态环境具有长期的破坏作用，而且使德国小蠊产生了广泛的抗药性，而纯粹的生物防治有着起效慢、周期长、防治效果持续性短的缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种复配的杀虫组合物及含有该组合物的杀虫剂，该杀虫组合物或杀虫剂以两种微生物为活性成分，两种微生物分别为真菌孢子和细菌，其中真菌孢子为绿僵菌孢子(比如金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)大孢变种EB0732)，细菌为沙雷氏菌(比如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)EB0732)。

本发明中发明人以特定的浓度将绿僵菌孢子和沙雷氏菌进行复配用于防治咀嚼式口器昆虫，尤其对蜚蠊目昆虫(比如蟑螂、小蠊等)具有特别卓越的防治效果。这种效果体现在相对于绿僵菌孢子或沙雷氏菌单剂而言，其效果是增效的，即具有“1+1＞2”的效果，并且半数致死时间显著缩短，缩短程度最高可缩短近7倍，20天内的实际杀虫率(以死亡为准)可大于76％，相较于单剂绿僵菌孢子或沙雷氏菌，提升效果显著；并且本发明的生物杀虫剂可实现长期、持续、连锁、二次杀虫(尤其灭蟑)的效果。

本发明所述的增效作用通过采用孙云沛的共毒因子法进行分析确定，其计算公式为：

其计算公式为：

共毒系数

其中，LD₅₀(A剂)为A成分的半数致死剂量；LD₅₀(B剂)为成分B的半数致死剂量；LD₅₀(混剂)为成分A和成分B的混剂的半数致死剂量；P_A为成分A在混剂有效成分中所占质量比例；P_B为成分B在混剂有效成分中所占质量比例。

判断标准：共毒系数当CTC≤80时，组合物表现为拮抗作用；当80＜CTC＜120时，组合物表现为相加作用；当CTC≥120时，则组合物表现为增效作用。

具体地，本发明是通过如下技术方案实现的：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种杀虫组合物，其以两种微生物为活性成分或由两种微生物复配组成，所述两种微生物为真菌孢子和细菌，其中，真菌孢子为绿僵菌孢子，细菌为沙雷氏菌。

在本发明的一些实施方式中，所述真菌孢子为金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)大孢变种EB0732，分离自染病的德国小蠊虫尸，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13170。该菌株已在本发明申请人的专利CN201611044989.1、发明名称为“一种用于蟑螂生物防治的病原真菌”中公开。

在本发明的一些实施方式中，所述细菌为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)EB0732，其分离自野外采集的地鳖虫虫尸，该菌株的GenBank登录号为MH780739。

常规操作中，以纯生物复配的方式防治昆虫往往因致死率较低、效果不佳而不被选择，因此，目前使用的杀虫剂往往是化学成分为主，或者是化学成分配合多种植物提取物，再者，即便使用微生物源成分，为了保证杀虫效果其组成中也必然加入化学成分，比如拟除虫菊酯类物质例如胺菊酯、炔咪菊酯、氯氰菊酯等以及硼酸等。

然而，本发明中以特定的浓度将绿僵菌孢子和沙雷氏菌进行复配用于防治咀嚼式口器昆虫，尤其对蜚蠊目昆虫(比如蟑螂、小蠊等)具有特别卓越的防治效果。这种效果体现在相对于绿僵菌孢子或沙雷氏菌单剂而言，其效果是增效的，即具有“1+1＞2”的效果，并且半数致死时间显著缩短，缩短程度最高可缩短近7倍，20天内的实际杀虫率(以死亡为准)可大于76％，相较于单剂绿僵菌孢子或沙雷氏菌，提升效果显著；并且本发明的生物杀虫剂可实现长期、持续、连锁、二次杀虫(尤其灭蟑)的效果。

在本发明的一些实施方式中，本发明所述的绿僵菌孢子为绿僵菌孢子悬液(比如以无菌水制备)，悬液中孢子的浓度为1×10⁶-1×10¹⁰CFU/mL。

在本发明的实施方式中，在1×10⁶-1×10⁹CFU/mL的范围内，绿僵菌孢子的浓度可以为1×10⁶CFU/mL、1×10⁷CFU/mL、1×10⁸CFU/mL、1×10⁹CFU/mL，也可以为上述任意两个浓度组成的范围或所组成的范围间的任意浓度。比如，孢子浓度可以为1×10⁶～1×10⁹CFU/mL、1×10⁶～1×10⁸CFU/mL、1×10⁶～1×10⁷CFU/mL、1×10⁷～1×10⁹CFU/mL、1×10⁷～1×10⁸CFU/mL、1×10⁸～1×10⁹CFU/mL。

在较为优选的实施方式中，绿僵菌孢子的浓度为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL，优选为1×10⁸～1×10⁹CFU/mL，更优选为1×10⁹CFU/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述沙雷氏菌为沙雷氏菌悬液(比如以无菌水制备)，悬液中沙雷氏菌的浓度为1×10⁷-1×10⁹CFU/mL。

在本发明的实施方式中，在1×10⁷-1×10¹⁰CFU/mL的范围内，沙雷氏菌的浓度可以为1×10⁷CFU/mL、1×10⁸CFU/mL、1×10⁹CFU/mL。也可以为上述任意两个浓度组成的范围或所组成的范围间的任意浓度。比如，沙雷氏菌的浓度可以为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL、1×10⁷～1×10⁸CFU/mL、1×10⁸～1×10⁹CFU/mL。

在较为优选的实施方式中，沙雷氏菌的浓度为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL，更优选为1×10⁹CFU/mL。

在本发明的一些实施方式中，本发明所述组合物中，绿僵菌孢子以1×10⁷～1×10⁹CFU/mL的浓度与浓度为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL的沙雷氏菌复配时，组合物表现出增效的效果，其共毒系数在120以上。

在这样的复配方式中，绿僵菌孢子的浓度与沙雷氏菌的浓度可以在其浓度范围内以任意浓度进行复配，这些浓度可以如上文中所述，举例而言，比如绿僵菌孢子以1×10⁹CFU/mL的浓度与浓度为1×10⁹CFU/mL的沙雷氏菌复配，或者绿僵菌孢子以1×10⁹CFU/mL的浓度与浓度为1×10⁸CFU/mL的沙雷氏菌复配，或者绿僵菌孢子以1×10⁸CFU/mL的浓度与浓度为1×10⁹CFU/mL的沙雷氏菌复配，或者绿僵菌孢子以1×10⁸CFU/mL的浓度与浓度为1×10⁸CFU/mL的沙雷氏菌复配等等。

在本发明的一些实施方式中，所述组合物中，沙雷氏菌以1×10⁸-1×10⁹CFU/mL的浓度与绿僵菌孢子以1×10⁸-1×10⁹CFU/mL的浓度复配时组合物表现出较好的杀灭效果，组合物的共毒系数在140以上，半数致死时间小于16天，20天内的致死率在60％以上；在又一些实施方式中，所述组合物中，沙雷氏菌以1×10⁹CFU/mL的浓度与1×10⁸-1×10⁹CFU/mL浓度的绿僵菌孢子复配时组合物表现出更好的杀灭效果，组合物的半数致死时间可显著缩短到14天以下，20天内的致死率超过66％，能够显著缩短起效时间并提升致死率。

本发明强调特定的浓度配比在于，虽然两种微生物复配具有杀虫作用，然而，当其以不同浓度组合时，所体现出的防治效果具有差异，比如，在一些实施方式中，绿僵菌孢子以1×10⁵CFU/mL的浓度与1×10⁹CFU/mL沙雷氏菌复配组合，组合物的共毒系数是小于80的，表现出了拮抗效果，组合物在20天内的杀虫致死率仅有20％，半数致死时间为62.6天；以及，比如在又一些实施方式中，绿僵菌孢子以1×10⁶CFU/mL的浓度与1×10⁹CFU/mL沙雷氏菌复配组合，组合物的共毒系数是大于80小于120的，表现出了相加的作用效果，组合物在20天内的杀虫致死率有所提高，半数致死时间也缩短到了38天左右。

本发明中所述杀虫组合物可以以任意方便施用且不影响稳定性及成分有效性的形式将上述两种有效成分绿僵菌孢子和沙雷氏菌混合使用，比如在本发明的一些实施方式中，所述杀虫组合物的制备方式为：将绿僵菌孢子与沙雷氏菌分别制备成相应浓度的无菌水悬液后混合均匀。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种复配生物杀虫剂，其由主剂和辅剂组成，其中主剂在杀虫剂中的含量为不少于0.03wt％，其余为辅剂，所述主剂为如上所述的杀虫组合物。

在本发明的一些实施方式中，所述主剂在杀虫剂中的含量为0.037wt％-0.353wt％。

在本发明的一些较为具体的实施方式中，所述主剂具有下表所示的组成：

在本发明的一些实施方式中，所述辅剂由溶剂和辅料组成，其中，所述辅料选自小鼠全价饲料和红糖，或者与此类似的物质。

在本发明的一些实施方式中，所述溶剂为不饱和脂肪酸，优选选自油酸和亚油酸。使用时优选为熟的油酸，比如所述油酸经加热处理，油温70-100℃，比如85℃。

本发明的辅剂中，溶剂与辅料的用量以混匀便于磨碎为宜，其用量为辅料的质量大于或等于溶剂的用量，比如，在一个具体的实施方式中，溶剂与辅料的重量比为1：2.7。

在本发明的第三方面，本发明还提供了上述复配生物杀虫剂的制备方法，其包括将绿僵菌孢子与沙雷氏菌分别制备成无菌水悬液后混合均匀(即该混合方法可得到本发明的杀虫组合物)，然后将该混合液混匀进辅剂中压制成粉末即得。其中，辅剂由辅料和溶剂混合均匀后磨碎制成。

以及，在本发明的第四方面，本发明提供了上述杀虫组合物或上述复配生物杀虫剂在防治咀嚼式口器昆虫中的应用；所述咀嚼式口器昆虫为蜚蠊目昆虫和蝗虫；优选地，所述蜚蠊目昆虫为蟑螂，选自德国蟑螂、褐带蟑螂长须皮蠊(Supella longipaloa)、东方蟑螂东方蜚蠊(Blatta orientalis)、烟褐蟑螂烟色大蠊(Periplaneta fuliginosa)、美洲蟑螂美洲大蠊(Periplaneta Americana)、土耳其斯坦蟑螂(Blatta lateralis)、德国小蠊(Blatella germanica)、田野蟑螂(Blatta vaga)等。

相同条件下，本发明的杀虫组合物或以本发明的杀虫组合物为主剂的复配生物杀虫剂(主剂为活性部分)能够显著缩短杀虫时间，使试虫(比如德国小蠊)达到半数致死的平均时间比单用沙雷氏菌或绿僵菌孢子所用平均时间都要短，最快可提升6-7倍。20天内的实际杀虫率(以死亡为准，即死亡率)可超过76％，相较于单剂绿僵菌孢子或沙雷氏菌，其提升分别可达2.35-10.45倍以及2.16-4.65倍，提升效果显著，将绿僵菌孢子和沙雷氏菌进行复配的增效作用明显，可以克服单剂反应缓慢和控制时间有限的缺陷。此外，绿僵菌孢子和沙雷氏菌的复配成功实现了昆虫种群内的流行病，并且干预幼虫的生长，使其无法正常羽化，能够实现大面积的连锁灭蟑效应，此外，蟑螂因食用或接触本发明的生物杀虫剂或杀虫组合物死亡后，因蟑螂的食粪食尸行为，可通过二次食入或间接食入产生二次灭蟑效果，防治效果持久。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明实施例中所述绿僵菌孢子：选用金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)大孢变种EB0732：分离自野外采集的地鳖虫虫尸，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13170。该菌株已在本发明申请人的专利CN201611044989.1、发明名称为“一种用于蟑螂生物防治的病原真菌”中公开。在下述实施例中表述为绿僵菌孢子，表格中简写为绿僵菌。

沙雷氏菌：选用粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)EB0732。分离自野外采集的地鳖虫虫尸，该菌株的GenBank登录号为MH780739，由山东师范大学提供。在下述实施例中表述为沙雷氏菌。

制备例1-15

将绿僵菌孢子与沙雷氏菌分别制备成无菌水悬液后混合均匀制备主剂(即绿僵菌孢子与沙雷氏菌组成的杀虫组合物)，其中，绿僵菌孢子无菌水悬液中的孢子浓度以及沙雷氏菌的浓度配比分别表1所示，然后将主剂混匀进磨碎的辅剂(油酸与红糖以质量比1：2.7混合磨碎制成辅剂，油酸为经加热处理的热油酸，油温85℃)中压制成粉末制剂，即得复配生物杀虫剂，其中，主剂的含量为0.037-0.353wt％wt％，辅剂的含量为99.647-99.963wt％。

表1

实施例

发明人通过大量的室内筛选试验，发现金龟子绿僵菌和沙雷氏菌混配对德国小蠊具有协同增效作用。为了更好的理解发明的实质，下面结合实例对本发明的技术内容作详细的说明，但本发明的内容并不局限如此，不能因此而理解为对本发明保护范围的限制。

实验对象为山东师范大学动物抗性重点实验室饲养的德国小蠊雄性敏感品系成虫，试验中简称为试虫。

实验分为三个大组分别为绿僵菌孢子试验组、沙雷氏菌试验组和绿僵菌孢子和沙雷氏菌复配试验组(制备方式同实施例1-15)。经过大量的筛选试验与分析，本实施例中单剂组：绿僵菌孢子的浓度为1×10⁵～1×10⁹CFU/mL，沙雷氏菌的浓度为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL。设计给试虫投放的单剂绿僵菌孢子浓度梯度为：1×10⁵CFU/mL，1×10⁶CFU/mL，1×10⁷CFU/mL，1×10⁸CFU/mL，1×10⁹CFU/mL；单剂沙雷氏菌的浓度梯度为1×10⁷CFU/mL，1×10⁸CFU/mL，1×10⁹CFU/mL。每个大组内均含有一个对照组(即不含绿僵菌孢子和沙雷氏菌的空白对照)，如若对照组试虫死亡率超过10％则重新进行试验。单剂的制备方法同实施例1-15中相同浓度的实施例，其区别仅在于在制备时不再添加另一有效成分。复配制剂组的制备同实施例1-15。

投放药剂(也称试药)后按照一定的时间间隔定时观察和记录各组试虫的死亡数，以备后期进行数据分析。复配药剂增效与否分析采用孙云沛的共毒因子法。

其计算公式为：

共毒系数

其中，LD₅₀(A剂)为A成分的半数致死剂量；LD₅₀(B剂)为成分B的半数致死剂量；LD₅₀(混剂)为成分A和成分B的混剂的半数致死剂量；P_A为成分A在混剂有效成分中所占质量比例；P_B为成分B在混剂有效成分中所占质量比例。

判断标准：共毒系数当CTC≤80时，组合物表现为拮抗作用；当80＜CTC＜120时，组合物表现为相加作用；当CTC≥120时，则组合物表现为增效作用。

实验结果如表1-4中所示，其中表3中的质量比为称量绿僵菌孢子无菌水悬液的质量和沙雷氏菌无菌水悬液的质量后得到：

表1各试验回归方程及单剂20天(d)理论死亡率

表2复配试剂组20天(d)死亡率

表3共毒系数

表4半数致死时间比较

此外，本实施例在投药后持续观察了3个月，其中，在各组别中的试虫全部死亡后，清除试药后投放相同数量、品种的新的试虫，发现仍然有试虫不断死亡，新试虫在20天内的死亡率相比投药后的死亡率略有增长，半数致死时间也有缩短。

结果分析：

(1)共毒因子方面：

全部15组不同配比的复配剂的共毒因子数值中，复配剂的共毒因子数值中有11组值大于120，为增效作用；有1组值介于80-120为相加作用；有3组低于80，为拮抗作用。

(2)第20d累积死亡率方面：

两种单剂理论死亡率之和在第20d时最高死亡率为35.54％，而复配制剂在第20d时，最高死亡率可达76.67％。

(3)达到半数致死的时间方面：

相同条件下，单独使用绿僵菌或沙雷氏菌时各种浓度药剂使试虫累计死亡率达到50％的平均时间分别为49d和40d，而将两者复配后各浓度的药剂使试虫累计死亡率达到50％的平均时间只需37d，平均缩短了8天。

综上所述，在绿僵菌孢子与沙雷氏菌按一定浓度复配之后是可以起到增效作用，且沙雷氏菌对绿僵菌孢子的增强作用较为明显，而且复配之后起效时间大大缩短，将二者复配更有利于发挥两单剂的灭蟑功效，复配后有“1+1＞2”的效果。相同条件下，复配剂使试虫达到半数致死的平均时间比两种单剂所用平均时间都要短，其起效速度超过单一微生物作用。所以将绿僵菌和沙雷氏菌进行复配的增效作用明显，防治明显加强，可以克服单剂作用缓慢的缺点。依据现在的杀虫剂市场来看，都是化学杀虫剂和生物化学复配杀虫剂，还有起效慢的单剂生物防治，几乎没有两种微生物复配进行生物防治。生物防治的优点是对环境无污染，且两种生物杀虫剂复配后弥补了单剂起效慢的缺陷，发挥作用时间缩短，有效控制期长。不仅如此，绿僵菌还有对人和其他哺乳动物无毒无害，沙雷氏菌对人低毒，复配之后具有高效环保的优点。

Claims (10)

1.一种杀虫组合物，其以两种微生物为活性成分或由两种微生物复配组成，所述两种微生物为真菌孢子和细菌，其中，真菌孢子为绿僵菌孢子，细菌为沙雷氏菌。

2.根据权利要求1所述的杀虫组合物，其特征在于，所述真菌孢子为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)大孢变种EB0732，分离自染病的德国小蠊虫尸，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13170。

3.根据权利要求1或2所述的杀虫组合物，其特征在于，所述细菌为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)EB0732，其分离自野外采集的地鳖虫虫尸，该菌株的GenBank登录号为MH780739。

4.根据权利要求1所述的杀虫组合物，其特征在于，所述绿僵菌孢子为绿僵菌孢子水悬液，悬液中孢子的浓度为1×10⁶-1×10⁹CFU/mL。

5.根据权利要求1所述的杀虫组合物，所述沙雷氏菌为沙雷氏菌水悬液，悬液中沙雷氏菌的浓度为1×10⁷-1×10⁹CFU/mL。

6.根据权利要求1所述的杀虫组合物，其特征在于，所述组合物中，绿僵菌孢子的浓度为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL，沙雷氏菌的浓度为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL。

7.一种复配生物杀虫剂，其由主剂和辅剂组成，其中主剂在杀虫剂中的含量为不少于0.03wt％，其余为辅剂；主剂为权利要求1至6中任一项所述的杀虫组合物。

8.根据权利要求7所述的杀虫剂，其特征在于，所述主剂含量为0.037wt％-0.353wt％。

优选地，所述辅剂由溶剂和辅料组成，其中，所述辅料选自小鼠全价饲料、红糖；

优选地，所述溶剂为不饱和脂肪酸，优选选自油酸、亚油酸；

优选地，所述辅剂由辅料和溶剂混匀后磨碎制得。

9.权利要求7或8所述的复配生物杀虫剂的制备方法，其包括将绿僵菌孢子与沙雷氏菌分别制备成无菌水悬液后混合均匀，然后将该混合液混匀进磨碎的辅剂中压制成粉末，即得。

10.权利要求1至6中任一项所述的杀虫组合物或权利要求7或8所述的复配生物杀虫剂在防治咀嚼式口器昆虫中的应用；

优选地，所述咀嚼式口器昆虫为为蜚蠊目昆虫或蝗虫；

优选地，所述蜚蠊目昆虫为蟑螂，选自德国蟑螂褐带蟑螂长须皮蠊、东方蟑螂东方蜚蠊、烟褐蟑螂烟色大蠊、美洲蟑螂美洲大蠊、德国小蠊、土耳其斯坦蟑螂和田野蟑螂。