DE60224410T2

DE60224410T2 - Modifizierte cry3a toxine und die dafür kodierende nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60224410T2
Application number: DE60224410T
Authority: DE
Inventors: Eric Syngenta Bio Research Triangle Park CHEN; Cheryl Syngenta Bio Research Triangle Park STACY
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2001-08-31
Filing date: 2002-09-02
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2022-09-03
Also published as: US7276583B2; ZA200401140B; DE60224410D1; AU2002337055A1; BR0212262A; US8247369B2; MXPA04001558A; US20080044907A1; WO2003018810A2; ATE382701T1; EP1425397B1; CN100374562C; US20090265809A1; CO5560624A2; CN1639338A; CA2458514A1; US8216806B2; BR0212262B1; AR036311A1; RU2314345C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Protein-Biotechnologie, der Pflanzen-Molekularbiologie und der Ungezieferkontrolle. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung neue modifizierte Cry3A-Toxine und Nukleinsäuresequenzen, deren Expression in modifizierten Cry3A-Toxinen resultiert und Verfahren zur Herstellung und Verfahren zur Verwendung der modifizierten Cry3A-Toxine und korrespondierender Nukleinsäuresequenzen zur Kontrolle von Insekten.
Arten des Maiswurzelbohrers werden als die destruktivsten Maisungeziefer betrachtet. In den Vereinigten Staaten sind die drei wichtigen Spezies Diabrotica virgifera virgifera, der Westliche Maiswurzelbohrer; D. longicornis barberi, der Nördliche Maiswurzelbohrer und D. undecimpunctata howardi, der Südliche Maiswurzelbohrer. Nur der Westliche und der Nördliche Maiswurzelbohrer werden als Hauptungeziefer von Mais im Maisgürtel der USA betrachtet. Maiswurzelbohrerlarven erzeugen den meisten substantiellen Pflanzenschaden, da sie sich fast ausschließlich von Maiswurzeln ernähren. Diese Verletzung erhöht erwiesenermaßen die Standfestigkeit der Pflanzen, reduziert den Kornertrag und vegetativen Ertrag und verändert außerdem den Nährstoffgehalt des Korns. Die Ernährung der Larven führt auch zu indirekten Wirkungen auf den Mais durch eine Öffnung von Wegen durch die Wurzeln für bakterielle und pilzliche Infektionen, die zu einem Verrotten von Wurzeln und Stengeln führen. Erwachsene Maiswurzelbohrer sind in Maisfeldern im späten Sommer aktiv, während sie sich an Ähren, Seide (silks) und Pollen ernähren und dadurch in die normale Befruchtung eingreifen.
Maiswurzelbohrer werden im wesentlichen durch intensive Anwendung chemischer Pestizide kontrolliert, die durch Inhibition des Insektenwachstums, Verhinderung der Insektenernährung oder Reproduktion aktiv sind oder den Tod auslösen. Eine gute Maiswurzelbohrerkontrolle kann so erreicht werden, jedoch beeinträchtigen diese Chemikalien manchmal auch andere hilfreiche Organismen. Ein weiteres Problem, das sich aus der breiten Verwendung von chemischen Pestiziden ergibt, ist das Auftreten resistenter Insektenvarietäten. Noch ein weiteres Problem ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß sich die Maiswurzelbohrerlarven unter der Erde ernähren und es so schwierig machen, Rettungsbehandlungen von Insektiziden anzuwenden. Daher werden die meisten Insektizidanwendungen prophylaktisch zum Zeitpunkt des Pflanzens durchgeführt. Diese Praxis führt zu einer großen Umweltbelastung. Dies wurde teilweise durch verschiedene Farm-Management-Praktiken abgeschwächt, jedoch gibt es einen steigenden Bedarf an alternativen Ungezieferkontrollmechanismen.
Biologische Ungezieferkontrolimittel wie Bacillus thuringiensis (Bt)-Stämme, die Pestizide Toxine wie δ-Endotoxine exprimieren, wurden ebenfalls auf Erntepflanzen mit zufriedenstellenden Ergebnissen gegen im wesentlichen Lepidoptera-Insektenungeziefer angewandt. Die δ-Endotoxine sind Proteine, die innerhalb einer kristallinen Matrix gehalten werden und von denen bekannt ist, daß sie eine insektizide Aktivität besitzen, wenn sie von bestimmten Insekten aufgenommen werden. Die verschiedenen δ-Endotoxine wurden basierend auf ihrem Aktivitätsspektrum und der Sequenzhomologie klassifiziert. Vor 1990 wurden die Hauptklassen durch ihr Aktivitätsspektrum definiert, wobei die Cry1-Proteine gegen Lepidoptera (Motten und Schmetterlinge) aktiv sind, Cry2-Proteine gegen sowohl Lepidoptera als auch Diptera (Fliegen und Mücken), Cry3-Proteine gegen Coleoptera (Käfer) und Cry4-Proteine gegen Diptera aktiv sind (Hofte und Whitely, 1989, Microbiol. Rev. 53: 242–255). Kürzlich wurde eine neue Nomenklatur entwickelt, die die Cry-Proteine systematisch klassifiziert, basierend auf einer Aminosäuresequenzhomologie anstelle von Insektenzieleigenheiten (Crickmore et al., 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62: 807–813).
Das Spektrum der insektiziden Aktivität eines individuellen δ-Endotoxins von Bt ist recht eng, wobei ein gegebenes δ-Endotoxin gegen nur einige wenige Arten innerhalb einer Ordnung aktiv ist. Beispielsweise ist bekannt, daß das Cry3A-Protein gegen die Colorado-Kartoffelkäfer sehr toxisch ist, nämlich Leptinotarsa decemlineata, jedoch wird wenig oder keine Toxizität gegenüber verwandten Käfern der Gattung Diabrotica gezeigt (Johnson et al., 1993, J. Econ. Entomol. 86: 330–333). Gemäß Slaney et al. (1992, Isect. Biochem. Molec. Biol. 22: 9–18) ist das Cry3A-Protein mindestens 2000-fach weniger toxisch gegenüber Südlichen Maiswurzelbohrerlarven als gegenüber dem Colorado-Kartoffelkäfer. Es ist auch bekannt, daß Cry3A wenig oder keine Toxizität gegenüber dem Westlichem Maiswurzelbohrer aufweist.
Die Spezifität der δ-Endotoxine ist das Ergebnis der Effizienz der verschiedenen Schritte, die an der Produktion eines aktiven Toxinproteins beteiligt sind wie auch der darauffolgenden Interaktion mit den Epithelzellen in dem mittleren Verdauungstrakt der Insekten. Um insektizid zu sein, müssen die meisten bekannten δ-Endotoxine zunächst vom Insekt aufgenommen werden und proteolytisch aktiviert werden, um ein aktives Toxin zu bilden. Die Aktivierung der insektiziden Kristallproteine ist ein Vielstufenverfahren. Nach der Verdauung müssen die Kristalle zunächst im Verdauungstrakt der Insekten löslich gemacht werden. Sobald sie löslich gemacht wurden, werden die δ-Endotoxine durch spezifische proteolytische Spaltungen aktiviert. Die Proteasen im Insektenverdauungstrakt können eine Rolle bei der Spezifität spielen, indem sie bestimmen, wo das δ-Endotoxin verarbeitet wird. Sobald das δ-Endotoxin löslich gemacht und verarbeitet wurde, bindet es an spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche des Epithels des mittleren Verdauungstrakts der Insekten und integriert sich darauffolgend in einer Lipid-Doppelschicht der Brush-Border-Membran. Innenkanäle bilden sich dann, die die normale Funktion des mittleren Verdauungstrakts unterbrechen und schließlich zum Tod des Insekts führen. Bei den Lepidoptera verarbeiten Verdauungstrakt-Proteasen δ-Endotoxine von 130–140 kDa Protoxin zu toxischen Proteinen mit ungefähr 60–70 kDa. Über die Verarbeitung des Protoxins zum Toxin wurde berichtet, daß sie durch Entfernung beider N- als auch C-terminaler Aminosäuren fortschreitet, wobei die genaue Stellung der Verarbeitung von den beteiligten spezifischen Verdauungstraktflüssigkeiten des Insekts abhängt (Ogiwara et al., 1992, J. Invert. Pathol. 60: 121–126). Die proteolytische Aktivierung eines δ-Endotoxins kann eine signifikante Rolle bei der Bestimmung seiner Spezifität spielen. Beispielsweise wurde ein δ-Endotoxin von Bt var. aizawa, genannt ICl, basierend auf seiner Sequenzhomologie mit anderen bekannten Cry1Ab-Proteinen, als ein Cry1Ab-Protein klassifiziert. Cry1Ab-Proteine sind typischerweise gegen Lepidoptera-Insekten aktiv. Das ICl-Protein hat jedoch eine Aktivität sowohl gegen Lepidoptera als auch Diptera-Insekten, abhängig davon, wie das Protein verarbeitet wird (Haider et al., 1986, Euro. J. Biochem. 156: 531–540). Im Verdauungstrakt der Diptera wird eine 53 kDa aktives ICl-Toxin erhalten, während im Lepidoptera-Verdauungstrakt ein 55 kDa aktives ICl-Toxin erhalten wird. ICl unterscheidet sich von dem Holotyp-HD-l-Cry1Ab-Protein nur in vier Aminosäuren, so daß grobe Veränderungen in der Rezeptorbindungsregion diese Unterschiede in der Aktivität nicht ausmachen können. Die unterschiedlichen proteolytischen Spaltungen in den zwei unterschiedlichen Verdauungstrakten der Insekten ermöglicht es möglicherweise den aktivierten Molekülen sich unterschiedlich zu falten und so unterschiedliche Regionen zu exponieren, die unterschiedliche Rezeptoren binden können. Die Spezifität scheint daher in den Verdauungstrakt-Proteasen der unterschiedlichen Insekten zu liegen.
Coleoptera-Insekten haben Verdauungstrakte, die eher neutral bis sauer sind, und Coleoptera-spezifische δ-Endotoxine sind in ihrer Größe ähnlich wie aktivierte Lepidoptera-spezifische Toxine. Daher wurde früher angenommen, daß die Verarbeitung von Coleoptera-spezifischen δ-Endotoxinen für die Toxizität unnötig war. Kürzliche Daten legen jedoch nahe, daß Coleoptera-aktive δ-Endotoxine löslich gemacht und proteolysiert wurden, und zwar zu kleineren toxischen Polypeptiden. Das vom B. thuringiensis var. tenebrionis erzeugte 73 kDa Cry3A-δ-Endotoxin-Protein wird in den Bakterien am N-Terminus einfach verarbeitet, verliert sein 49–57 Reste während oder nach der Kristallbildung um die üblicherweise isolierte 67 kDa-Form zu bilden (Carroll et al., 1989, Biochem. J. 261: 99–105). McPherson et al., 1988 (Biotechnology 6: 61–66) demonstrierte auch, daß das native cry3A-Gen zwei funktionelle Translations-Initiationscodons im selben Leserahmen enthält, wobei eins für das 73 kDa-Protein und das andere für das 67 kDa-Protein codiert, beginnend an Met-1 bzw. Met-48, der deduzierten Aminosäuresequenz (siehe SEQ ID NO: 2). Beide Proteine können so als natürlich auftretende Gesamtlängen Cry3A-Proteine betrachtet werden. Die Behandlung von löslichem 67 kDa Cry3A-Protein entweder mit Trypsin oder mit Insektenverdauungstrakt-Extrakt führt zu einem Spaltungsprodukt von 55 kDa, mit Asn-159 der deduzierten Aminosäuresequenz am N-Terminus. Es ergibt sich, daß dieses Polypeptid gegenüber einem empfänglichen Coleoptera-Insekt so toxisch war wie das native 67 kDa Cry3A-Toxin (Carroll et al. Ibid.). So existiert eine natürliche Trypsin-Erkennungsstelle zwischen Arg-158 und Asn-159 der deduzierten Aminosäuresequenz des nativen Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 2). Cry3A kann auch durch Chymotrypsin gespalten werden, was zu drei Polypeptiden mit 49, 11 und 6 kDa führt. Eine N-terminale Analyse der 49 und 6 kDa-Komponenten zeigte, daß die ersten Aminosäurereste Ser-162 bzw. Tyr-588 waren (Carroll et al., 1997, J. Invert. Biol. 70: 41–49). So existiert eine natürliche Chymotrypsin-Erkennungsstelle im Cry3A zwischen His-161 und Ser-162 und zwischen Tyr-587 und Tyr-588 der deduzierten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2). Das 49 kDa-Chymotrypsin-Produkt scheint bei neutralem pH löslicher zu sein als das native 67 kDa-Protein- oder das 55 kDa-Proteinprodukt und erhält sich seine vollständige insektizide Aktivität gegen Cry3A-empfängliche Insekten, Colorado-Kartoffelkäfer und Meerrettichblattkäfer (Phaedon cochleariae). Insekten-Verdauungsproteasen wirken typischerweise bei der Unterstützung des Insekts, um benötige Aminosäuren aus Diätprotein zu erhalten. Die am besten verstandenen Insekten-Verdauungstrakt-Proteasen sind Serin-Proteasen, die besonders üblich zu sein scheinen (Englemann und Geraerts, 1980, J. Insect Physiol. 261: 703–710), insbesondere bei Lepidoptera-Arten. Die Hauptzahl der Choleoptera-Larven und Erwachsenen, beispielsweise des Colorado-Kartoffelkäfers haben leicht saure mittlere Verdauungstrakte, und Cysteinproteasen stellen die hauptproteolytische Aktivität bereit (Wolfson und Mudock, 1990, J. Chem. Ecol. 16: 1089–110.2). Genauer gesagt identifizierten Thie und Houseman (1990, Insect Biochem. 20: 313–318) die Cysteinproteasen Cathepsin B und H und die Aspartylprotease, Cathepsin D beim Colorado-Kartoffelkäfer und charakterisierten diese. Gillikin et al. (1992, Arch. Insect Biochem. Physiol. 19: 285–298) charakterisierten die proteolytische Aktivität im Verdauungstrakt von Westlichen Maiswurzelbohrerlarven und fanden 15, im wesentlichen Cystein-, Proteasen. Bis zu der Offenbarung dieser Erfindung haben keine Berichte angezeigt, daß die Serinprotease, Cathepsin G, im Westlichen Maiswurzelbohrer existiert. Die Diversität und unterschiedlichen Aktivitätsniveaus der Insektenverdauungstraktproteasen kann eine Empfindlichkeit des Insekts gegenüber einem bestimmten Bt-Toxin beeinflussen.
Viele neue und neuartige Bt-Stämme und δ-Endotoxine mit verbesserten oder neuen biologischen Aktivitäten wurden während der letzten 5 Jahre beschrieben, einschließlich Stämmen, die gegen Nematoden aktiv sind ( EP 0517367A1 ). Jedoch haben relativ wenige dieser Stämme und Toxine eine Aktivität gegen Coleoptera-Insekten. Weiterhin weisen keine der jetzt bekannten Coleoptera-aktiven δ-Endotoxine, beispielsweise Cry3A, Cry3B, Cry3C, Cry7A, Cry8A, Cry8B und Cry8C eine ausreichende orale Toxizität gegenüber dem Maiswurzelbohrer auf, um eine adäquate Feldkontrolle bereitzustellen, wenn sie beispielsweise durch Mikroben oder transgene Pflanzen verabreicht werden. Daher müssen andere Ansätze erforscht werden, um neue Toxine zu erzeugen, die gegen Maiswurzelbohrer aktiv sind.
Während Kenntnisse gesammelt wurden, wie die δ-Endotoxine wirken, wurden Versuche vermehrt durchgeführt, δ-Endotoxine technologisch herzustellen, die neue Aktivität aufwiesen. Die biotechnologische Herstellung von δ-Endotoxinen wurde einfacher, nachdem die dreidimensionale Struktur von Cry3A 1991 aufgelöst wurde (Li et al., 1991, Nature 353: 815–821). Das Protein hat drei Strukturdomänen: die N-terminale Domäne I, von den Resten 1–290, besteht aus 7 alpha-Helices, die Domäne II von den Resten 291–500 enthält drei beta-Sheets und die C-terminale Domäne III von den Resten 501–644 ist ein beta-Sandwich. Basierend auf dieser Struktur wurde die Hypothese hinsichtlich der Struktur/Funktionsbeziehung der δ-Endotoxine formuliert. Es wird allgemein angenommen, daß die Domäne I im wesentlichen für die Porenbildung in der Insektenverdauungstrakt-Membran verantwortlich ist (Gazit und Shai, 1993, Appl. Environ. Microbiol. 57: 2816–2820), daß die Domäne II im wesentlichen für die Wechselwirkung mit dem Verdauungstrakt-Rezeptor verantwortlich ist (Ge et al., 1991, J. Biol. Chem. 32: 3429–3436) und daß die Domäne III vermutlich an der Proteinstabilität beteiligt ist (Li et al. 1991, supra) wie auch eine regulatorische Auswirkung auf die Ionenkanalaktivität aufweist (Chen et al., 1993, PNAS 90: 9041–9045).
Lepitoptera-aktive δ-Endotoxine wurden biotechnologisch manipuliert, um die spezifische Aktivität zu verbessern oder das Spektrum der Insektiziden Aktivität zu verbreitern. Beispielsweise wurde die Seidenspinner (Bombyx mori)-Spezifitätsdomäne von Cry1Aa zu Cry1Ac verlagert und verlieh so eine neue insektizide Aktivität an das resultierende chimäre Protein (Ge et al., 1989, PNAS 86: 4037–4041). Außerdem erzeugten Bosch et al. 1998 ( US-Patent 5,736,131 ) ein neues Lepidoptera-aktives Toxin, indem sie die Domäne III von Cry1E durch Domäne III von Cry1C ersetzten und so ein Cry1E-Cry1C-Hybridtoxin mit einem breiteren Spektrum einer Lepidoptera-Aktivität erzeugten.
Über etliche Versuche, die Coleopetra-aktiven δ-Endotoxine biotechnologisch zu manipulieren, wurde berichtet. Van Rie et al., 1997 ( US-Patent Nr. 5,659,123 ) manipulierte Cry3A biotechnologisch durch statistischen Ersatz von Aminosäuren, von denen angenommen wurde, daß sie für die Lösungsmittelzugänglichkeit wichtig sind, und zwar in Domäne II durch die Aminosäure Alanin. Etliche dieser statistischen Substitutionen, die auf die Rezeptor-Bindungsdomäne II begrenzt waren, waren erwiesenermaßen an einer erhöhten Westlichen Maiswurzelbohrer-Toxizität beteiligt. Andere haben jedoch gezeigt, daß einige Alanin-Substitutionen in der Domäne II von Cry3A zur Störung der Rezeptorbindung oder einer strukturellen Instabilität führen (Wu und Dean, 1996, J. Mol. Biol. 255: 628–640). English et al., 1999 (Int. Patentveröffentlichung Nr. WO 99/31248 ) berichteten über Aminosäure-Substitutionen in Cry3Bb, die Anstiege in der Toxizität gegenüber Südlichen und Westlichen Maiswurzelbohrer auslösten. Von den 35 berichteten Cry3Bb-Mutanten waren jedoch nur drei, im wesentlichen mit Mutationen in Domäne II und der Domänen II–I Grenzfläche gegenüber dem Westlichen Maiswurzelbohrer aktiv. Weiterhin waren die Unterschiede in der Toxizität von Wild-Typ Cry3Bb gegenüber Westlichem Maiswurzelbohrer in denselben Assays größer als irgendwelche der Unterschiede zwischen den mutierten Cry3Bb-Toxinen und dem Wild-Typ Cry3Bb. Daher scheinen Verbesserungen in der Toxizität der Cry3Bb-Mutanten im wesentlichen auf den Südlichen Maiswurzelbohrer beschränkt zu sein.
Es bleibt ein Bedarf neue und effektive Ungezieferkontrollmittel zu entwerfen, die einen ökonomischen Nutzen für Bauern bereitstellen und für die Umwelt akzeptabel sind. Insbesondere werden modifizierte Cry3A-Toxine benötigt, um den Westlichen Maiswurzelbohrer, das Hauptungeziefer von Mais in den Vereinigten Staaten, kontrollieren, die gegenüber existierenden Insektenkontrollmittel resistent sind oder dies werden könnten.
Weiterhin sind Mittel wünschenswert, deren Anwendung die Belastung der Umwelt, wie durch transgene Pflanzen, minimiert.
Im Hinblick auf diese Bedürfnisse ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung neue Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen, die modifizierte Cry3A-Toxine mit erhöhter Toxizität gegenüber Maiswurzelbohrer codieren. Indem eine Protease-Erkennungsstelle in mindestens einer Position eines Cry3A-Toxins, gemäß der vorliegenden Erfindung inseriert wird, die von der Ziel-Insektenverdauungstraktprotease erkannt wird, wird ein modifiziertes Cry3A-Toxin mit signifikant größerer Toxizität, insbesondere gegenüber Westlichem und Nördlichem Maiswurzelbohrer entworfen. Die Erfindung betrifft weiter neue modifizierte Cry3A-Toxine, die sich aus der Expression der Nukleinsäuresequenzen ergeben und Zusammensetzungen und Formulierungen, enthaltend die modifizierten Cry3A-Toxine, die dazu in der Lage sind, die Fähigkeit von Insekten-, Ungeziefern zum Überleben, Wachsen und sich zu reproduzieren zu inhibieren oder einen von Insekten ausgelösten Schaden zu limitieren oder den Verlust von Erntepflanzen. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung modifizierter Cry3A-Toxine und Verfahren zur Verwendung der modifizierten cry3A-Nukleinsäuresequenzen, beispielsweise in Mikroorganismen zur Kontrolle von Insekten oder in transgenen Pflanzen, um einen Schutz vor Insektenschaden zu verleihen und ein Verfahren zur Verwendung der modifizierten Cry3A-Toxine und Zusammensetzungen und Formulierungen, umfassend die modifizierten Cry3A-Toxine, beispielsweise Anwendung der modifizierten Cry3A-Toxine oder Zusammensetzungen oder Formulierungen auf Insekten befallene Gebiete oder die prophylaktische Behandlung von Insekten-empfänglichen Gebieten oder Pflanzen, um einen Schutz gegen die Insektenungeziefer zu verleihen.
Die hier beschriebenen neuen modifizierten Cry3A-Toxine sind gegen Insekten hoch aktiv. Beispielsweise können die modifizierten Cry3A-Toxine der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ökonomisch wichtige Insektenungeziefer wie den Westlichen Maiswurzelbohrer (Diabrotica virgifera virgifera) und den Nördlichen Maiswurzelbohrer (D. longicornis barberi) zu kontrollieren. Die modifizierten Cry3A-Toxine können einzeln oder in Kombination mit anderen Insektenkontrollstrategien verwendet werden, um eine maximale Ungezieferkontrolle effizient mit minimalen Umweltauswirkungen zu erreichen.
Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert, wobei das modifizierte Cry3A-Toxin mindestens eine zusätzliche Protease-Erkennungsstelle umfaßt, die im Cry3A-Toxin natürlicherweise nicht auftritt. Die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle, die von einer Verdauungstrakt-Protease eines Zielinsekts erkannt wird, wird an ungefähr derselben Position inseriert wie eine natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle im Cry3A-Toxin. Das modifizierte Cry3A-Toxin löst eine höhere Mortalität für ein Zielinsekt aus, als die von einem Cry3A-Toxin gegenüber demselben Zielinsekt ausgelöste Mortalität. Vorzugsweise löst das modifizierte Cry3A-Toxin mindestens ungefähr 50% Mortalität gegenüber einem Zielinsekt aus, bei dem ein Cry3A-Toxin nur bis zu ungefähr 30% Mortalität auslöst.
Gemäß einer Ausführungsform dieses Aspekts wird die Verdauungstrakt-Protease des Zielinsekts gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Serinproteasen, Cysteinproteasen und Asparaginsäureproteasen. Vorzugsweise beinhalten Serinproteasen gemäß dieser Ausführungsform Cathepsin G, Trypsin, Chymotrypsin, Carboxypeptidase, Endopeptidase und Elastase, besonders bevorzugt Cathepsin G.
In einer anderen Ausführungsform dieses Aspekts wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle entweder in die Domäne I oder Domäne III oder sowohl in Domäne I als auch Domäne III des Cry3A-Toxins inseriert.
Vorzugsweise wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle entweder in die Domäne I oder die Domäne III oder sowohl die Domäne I als auch die Domäne III an einer Stelle inseriert, die die natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle ersetzt, zu dieser benachbart ist oder darin liegt.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren inseriert, die zu den Aminosäurezahlen 154 und 162 von SEQ ID NO: 2 korrespondieren. Vorzugsweise wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle zwischen den Aminosäuren Nrn. 154 und 162 von SEQ ID NO: 2 oder zwischen den Aminosäuren Nrn. 107 und 115 von SEQ ID NO: 4 inseriert.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird die zusätzliche Proteaseerkennungsstelle zwischen den Aminosäuren inseriert, korrespondierend zu den Aminosäuren Nrn. 154 und 160 von SEQ ID NO: 2. Vorzugsweise wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle zwischen den Aminosäure-Nrn. 154 und 160 von SEQ ID NO: 2 oder zwischen den Aminosäure-Nrn. 107 und 113 von SEQ ID NO: 4 inseriert.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäure-Nrn. 154 und 158 von SEQ ID NO: 2 inseriert. Vorzugsweise wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen den Aminosäuren Nrn. 154 und 158 von SEQ ID NO: 2 oder den Aminosäure-Nrn. 107 und 111 von SEQ ID NO: 4 inseriert.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäure-Nrn. 583 und 589 von SEQ ID NO: 2 inseriert. Vorzugsweise wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nrn. 583 und 589 von SEQ ID NO: 2 oder den Aminosäure-Nrn. 536 und 542 von SEQ ID NO: 4 inseriert.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäure-Nrn. 583 und 588 von SEQ ID NO: 2 inseriert. Vorzugsweise wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nrn. 583 und 588 von SEQ ID NO: 2 oder den Aminosäure-Nrn. 536 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäure-Nrn. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2 inseriert. Vorzugsweise wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nrn. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2 oder den Aminosäure-Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert.
In einer Ausführungsform wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I und Domäne III des unmodifizierten Cry3A-Toxin inseriert. Vorzugsweise wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I an einer Position inseriert, die eine natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle ersetzt oder benachbart dazu liegt und in Domäne III an einer Stellung, die sich innerhalb einer natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle befindet, diese ersetzt oder zu dieser benachbart ist.
In einer Ausführungsform wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren inseriert, korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 154 und 160 und in Domäne III zwischen Aminosäuren, korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2. Vorzugsweise wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren Nrn. 154 und 160 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nr. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2 oder in Domäne I zwischen den Aminosäuren Nrn. 107 und 113 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert.
In einer anderen Ausführungsform wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren lokalisiert, korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 154 und 158 und in Domäne III zwischen Aminosäuren, korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2. Vorzugsweise wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren Nrn. 154 und 158 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nr. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2 oder in Domäne I zwischen den Aminosäuren Nrn. 107 und 111 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert.
In einer anderen Ausführungsform wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren inseriert, korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 154 und 158 und in Domäne III zwischen Aminosäuren, korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 583 und 588 von SEQ ID NO: 2. Vorzugsweise wird die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren Nrn. 154 und 158 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nr. 583 und 588 von SEQ ID NO: 2 oder in Domäne I zwischen den Aminosäuren Nrn. 107 und 111 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren 536 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das isolierte Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung die Nukleotide 1-1791 von SEQ ID NO: 6, Nukleotide 1-1806 von SEQ ID NO: 8, Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 10, Nukleotide 1-1794 von SEQ ID NO: 12, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 14, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 16, Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 18 oder Nukleotide 1-1791 von SEQ ID NO: 20.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein modifiziertes Cry3A-Toxin, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül ein modifiziertes Cry3A-Toxin, das gegen ein Coleoptera-Insekt aktiv ist. Vorzugsweise hat das modifizierte Cry3A-Toxin eine Aktivität gegen den Westlichem Maiswurzelbohrer.
Die vorliegende Erfindung stellt ein chimäres Gen bereit, umfassend eine heterologe Promotorsequenz, die an das Nukleinsäuremolekül der Erfindung operativ gebunden ist. Die vorliegende Erfindung stellt auch einen rekombinanten Vektor bereit, umfassend ein solches chimäres Gen. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine transgene nicht-menschliche Wirtszelle bereit, umfassend ein solches chimäres Gen. Ein transgene Wirtszelle gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann eine bakterielle oder pflanzliche Zelle sein, vorzugsweise ein Pflanzenzelle. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine transgene Pflanze bereit, umfassend eine solche Pflanzenzelle. Eine transgene Pflanze gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann Sorghum, Weizen, Sonnenblume, Tomate, Kartoffel, Kohl (cole crop), Baumwolle, Reis, Soja, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Tabak, Gerste, Ölsamenraps oder Mais, vorzugsweise Mais sein. Die vorliegende Erfindung stellt auch Saat von der Gruppe der transgenen Pflanzen bereit, bestehend aus Sorghum, Weizen, Sonnenblume, Tomate, Kartoffel, Kohl, Baumwolle, Reis, Soja, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Tabak, Gerste, Ölsamenraps oder Mais. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt die Saat von einer transgenen Maispflanze. Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Toxine bereit, erzeugt durch Expression der Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Toxin durch Expression des Nukleinsäuremoleküls erzeugt, umfassen die Nukleotide 1-1791 von SEQ ID NO: 6, Nukleotide 1-1806 von SEQ ID NO: 8, Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 10, Nukleotide 1-1794 von SEQ ID NO: 12, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 14, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 16, Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 18 oder Nukleotide 1-1791 von SEQ ID NO: 20.
Gemäß einer anderen Ausführungsform sind die Toxine der Erfindung gegen Coleoptera-Insekten, vorzugsweise gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer aktiv.
In einer Ausführungsform umfaßt das Toxin der vorliegenden Erfindung die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, umfassend eine effektive Insekten-kontrollierende Menge eines Toxins gemäß der Erfindung.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines Toxins bereit, das gegen Insekten aktiv ist, umfassend: (a) Erhalt einer Wirtszelle, umfassend ein chimäres Gen, das selbst eine heterologe Promotorsequenz, operativ gebunden an das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, umfaßt und (b) Expression des Nukleinsäuremoleküls in der transgenen Wirtszelle, was zu mindestens einem Toxin führt, das gegen Insekten aktiv ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Insekten-resistenten transgenen Pflanze bereit, umfassend die Einführung eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung in die transgene Pflanze, wobei das Nukleinsäuremolekül in der transgenen Pflanze in effektiver Menge zur Kontrolle von Insekten exprimierbar ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Insekten Coleoptera-Insekten, vorzugsweise der Westliche Maiswurzelbohrer.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle von Insekten bereit, umfassend die Zufuhr einer effektiven Menge eines Toxins der Erfindung an die Insekten. Gemäß einer Ausführungsform sind die Insekten Coleoptera-Insekten, vorzugsweise der Westliche Maiswurzelbohrer. Vorzugsweise wird das Toxin den Insekten oral zugeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Toxin oral über eine transgene Pflanze zugeführt, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein Toxin der vorliegenden Erfindung exprimiert.
Ebenfalls durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Cry3A-Toxins bereitgestellt, umfassend: (a) Erhalt eines cry3A-Toxingens, das ein Cry3A-Toxin codiert; (b) Identifizieren einer Verdauungstrakt-Protease eines Zielinsekts; (c) Erhalt einer Nukleotidsequenz, die eine Erkennungssequenz für die Verdauungstrakt-Protease codiert; (d) Insertion der Nukleotidsequenz von (c) in entweder Domäne I oder Domäne III oder sowohl Domäne I als auch Domäne III an einer Position, die eine Nukleotidsequenz ersetzt, darin liegt oder dazu benachbart ist, die für eine natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle in einem cry3A-Toxingen codiert und so Erzeugung eines modifizierten cry3A-Toxingens; (e) Insertion des modifizierten cry3A-Toxingens in eine Expressionskassette; (f) Expression des modifizierten cry3A-Toxingens in einer nicht-menschlichen Wirtszelle, was zu einer Wirtszelle führt, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin erzeugt; und (g) Durchführung eines Bioassays an dem modifizierten Cry3A-Toxin gegen ein Zielinsekt, wobei das modifizierte Cry3A-Toxin eine höhere Mortalität auf das Zielinsekt auslöst als die durch ein Cry3A-Toxin ausgelöste Mortalität. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform löst das modifizierte Cry3A-Toxin mindestens ungefähr 50% Mortalität gegenüber dem Zielinsekt aus, wenn das Cry3A-Toxin bis zu ungefähr 30% Mortalität auslöst. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Kontrolle von Insekten bereit wobei die transgene Pflanze weiterhin eine zweite Nukleinsäuresequenz oder Gruppe von Nukleinsäuresequenzen umfaßt, die einen zweiten Pestizidwirkstoff codiert. Besonders bevorzugte zweite Nukleinsäuresequenzen sind diejenigen, die ein δ-Endotoxin codieren, diejenigen, die ein vegetativ insektizides Proteintoxin codieren, wie offenbart in US-Patenten 5,849,870 und 5,877,012 , hier durch Bezugnahme eingeschlossen, oder diejenigen, die einen Weg für die Erzeugung eines nicht-proteinartigen Pestizidwirkstoffs codieren.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Mutagenese eines Nukleinsäuremoleküls gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Nukleinsäuremolekül in Populationen von doppelsträngigen statistischen Fragmenten einer gewünschten Größe gespalten wurde, umfassend: (a) die Zugabe von doppelsträngigen statistischen Fragmenten von ein oder mehr einzel- oder doppelsträngigen Oligonukleotiden zu der Population, wobei die Oligonukleotide jeweils einen Bereich einer Identität und einen Bereich einer Heterologie zu einem doppelsträngigen Matrizenpolynukleotid umfassen; (b) Denaturieren der resultierenden Mischung doppelsträngiger statistischer Fragmente und Oligonukleotide in einzelsträngige Fragmente; (c) Inkubation der resultierenden Population einzelsträngiger Fragmente mit Polymerase unter Bedingungen, die zu einem Anhaften der einzelsträngigen Fragmente an die Bereiche der Identität führen, zur Bildung von Paaren angehafteter Fragmente, wobei die Identitätsbereiche für ein Mitglied des Paars ausreichen, um eine Replikation des anderen auszulösen, wodurch ein mutagenisiertes doppelsträngiges Polynukleotid gebildet wird; und (d) Wiederholung der zweiten und dritten Schritte für mindestens zwei weitere Zyklen, wobei die resultierende Mischung im zweiten Schritt eines weiteren Zyklus das mutagenisierte doppelsträngige Polynukleotid von dem dritten Schritt des vorherigen Zyklus beinhaltet und wobei der weitere Zyklus ein weiteres mutagenisiertes doppelsträngiges Polynukleotid bildet.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann auf dem Gebiet aus dem Studium der folgenden Beschreibung der Erfindung und der nicht-begrenzenden Beispielen deutlich werden.

SEQ ID NO: 1 ist der native cry3A-codierende Bereich.
SEQ ID NO: 2 ist die Aminosäuresequenz des Cry3A-Toxins, codiert durch das native cry3A-Gen.
SEQ ID NO: 3 ist der Mais-optimierte cry3A-codierende Bereich, beginnend an Nukleotid 144 des nativen cry3A-codierenden Bereichs.
SEQ ID NO: 4 ist die Aminosäuresequenz des cry3A-Toxins, codiert durch das Mais-optimierte cry3A-Gen.
SEQ ID NO: 5 ist die Nukleotidsequenz von pCIB6850.
SEQ ID NO: 6 ist die Mais-optimierte modifizierte cry3A054-codierende Sequenz.
SEQ ID NO: 7 ist die von der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 codiere Aminosäuresequenz.
SEQ ID NO: 8 ist die Mais-optimierte modifizierte cry3A055-codierende Sequenz.
SEQ ID NO: 9 ist die Aminosäuresequenz, codiert von der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 8.
SEQ ID NO: 10 ist die Mais-optimierte modifizierte cry3A085-codierende Sequenz.
SEQ ID NO: 11 ist die Aminosäuresequenz, codiert von der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 10.
SEQ ID NO: 12 ist die Mais-optimierte modifizierte cry3A082-codierende Sequenz.
SEQ ID NO: 13 ist die Aminosäuresequenz, codiert von der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 12.
SEQ ID NO: 14 ist die Mais-optimierte modifizierte cry3A058-codierende Sequenz.
SEQ ID NO: 15 ist die Aminosäuresequenz, codiert von der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 14.
SEQ ID NO: 16 ist die Mais-optimierte modifizierte cry3A057-codierende Sequenz.
SEQ ID NO: 17 ist die Aminosäuresequenz, codiert von der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 16.
SEQ ID NO: 18 ist die Mais-optimierte modifizierte cry3A056-codierende Sequenz.
SEQ ID NO: 19 ist die Aminosäuresequenz, codiert von der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 18.
SEQ ID NO: 20 ist die Mais-optimierte modifizierte cry3A083-codierende Sequenz.
SEQ ID NO: 21 ist die Aminosäuresequenz, codiert von der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 20.
SEQ ID NOS: 22–34 sind PCR-Primer, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind.
SEQ ID NO: 35 ist eine Aminosäuresequenz, umfassend eine Cathepsin-G-Erkennungsstelle.
SEQ ID NO: 36 ist eine Aminosäuresequenz, umfassend eine Cathepsin-G-Erkennungsstelle.
SEQ ID NO: 37 ist eine Aminosäuresequenz, umfassend eine Cathepsin-G-Erkennungsstelle.
SEQ ID NO: 38 ist eine Aminosäuresequenz, umfassend eine Cathepsin-G-Erkennungsstelle.

Aus Klarheitsgründen werden bestimmte in der Beschreibung verwendete Bezeichnungen definiert und wie folgt präsentiert: "Aktivität" der modifizierten Cry3A-Toxine der Erfindung bedeutet, daß die modifizierten Cry3A-Toxine als oral-aktive Insektenkontrollmittel wirken, mit einer toxischen Wirkung oder dazu in der Lage sind, die Insektenernährung zu unterbrechen oder abzulenken, was den Tod des Insekts auslösen kann oder auch nicht. Wenn ein modifiziertes Cry3A-Toxin der Erfindung dem Insekt zugeführt wird, ist das Resultat typischerweise der Tod des Insekts oder das Insekt ernährt sich nicht mehr von der Quelle, die das modifizierte Cry3A-Toxin dem Insekt zur Verfügung stellt.
"Benachbart zu" Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine zusätzliche Protease-Erkennungsstelle "benachbart zu" einer natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle, wenn die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle sich innerhalb von vier Resten, vorzugsweise innerhalb von drei Resten, noch bevorzugter innerhalb von zwei Resten und besonders bevorzugt innerhalb von einem Rest einer natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle befindet. Beispielsweise ist eine zusätzliche Protease-Erkennungsstelle, inseriert zwischen Pro-154 und Arg-158 der deduzierten Aminosäuresequenz eines Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 2) zu der natürlich auftretenden Trypsin-Erkennungsstelle, lokalisiert zwischen Arg-158 und Asn-159 der deduzierten Aminosäuresequenz des Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 2) "benachbart".
Der Begriff "ungefähr dieselbe Position" wie hier verwendet, beschreibt die Stellung, wo eine zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in ein Cry3A-Toxin in Beziehung zu einer natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle inseriert ist und bedeutet, daß sich die Stellung höchstens 4 Reste von einer natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle entfernt befindet. Die Stellung kann auch drei oder zwei Reste entfernt von der natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle sein. Die Stellung kann einen Rest von der natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle entfernt sein. "Ungefähr dieselbe Position" kann auch bedeuten, daß die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle innerhalb einer natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle inseriert ist.
"Assoziiert mit/operativ gebunden an" bezieht sich auf zwei Nukleinsäuresequenzen, die physikalisch oder funktionell verwandt sind. Beispielsweise wird eine Promotor- oder regulatorische DNA-Sequenz als "mit" einer DNA-Sequenz "assoziiert" angesehen, die für eine RNA oder ein Protein codiert, wenn die beiden Sequenzen operativ gebunden sind oder so situiert sind, daß die regulatorische DNA-Sequenz dieses Expressionsniveau der codierenden Struktur-DNA-Sequenz beeinflussen wird.
Ein "chimäres Gen" oder "chimäres Konstrukt" ist eine rekombinante Nukleinsäuresequenz, worin eine Promotor- oder regulatorische Nukleinsäuresequenz operativ an eine Nukleinsäuresequenz gebunden ist und damit assoziiert ist, die eine mRNA codiert oder die als Protein exprimiert wird, so daß die regulatorische Nukleinsäuresequenz dazu in der Lage ist, die Transkription der Expression der assoziierten Nukleinsäure-Codierungssequenz zu regulieren. Die regulatorische Nukleinsäuresequenz des chimären Gens ist nicht üblicherweise operativ an die assoziierte Nukleinsäuresequenz angebunden, wie in der Natur angetroffen.
Eine "codierende Sequenz" ist eine Nukleinsäuresequenz, die in RNA transkribiert wird, wie beispielsweise mRNA, rRNA, tRNA und snRNA, Sense-RNA oder Antisense-RNA. Vorzugsweise wird die RNA dann in einen Organismus translatiert um ein Protein zu erzeugen.
Insekten zu "kontrollieren" bedeutet über eine toxische Wirkung die Fähigkeit von Insektenungeziefern zu überleben, zu wachsen, sich zu ernähren und/oder zu reproduzieren zu inhibieren oder einen durch Insekten vermittelten Schaden oder Verlust bei Erntepflanzen zu begrenzen. Insekten zu "kontrollieren" kann das Töten der Insekten bedeuten oder auch nicht, obwohl es vorzugsweise das Töten der Insekten bedeutet.
Korrespondierend zu: im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet "korrespondierend zu", daß wenn die Aminosäuresequenzen von Varianten Cry3A-δ-Endotoxinen miteinander ausgerichtet werden, die Aminosäuren, die zu bestimmten aufgezählten Positionen der vorliegenden Erfindung "korrespondieren" diejenigen sind, die sich mit diesen Positionen im Cry3A-Toxin (SEQ ID NO: 2) ausrichten, die sich jedoch nicht notwendigerweise in diesen exakten numerischen Positionen relativ zu der bestimmten Cry3A-Aminosäuresequenz der Erfindung befinden. Beispielsweise codiert das Mais-optimierte cry3A-Gen (SEQ ID NO: 3) der Erfindung ein Cry3A-Toxin (SEQ ID NO: 4), das am Met-48 des Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 2) beginnt, codiert durch das native cry3A-Gen (SEQ ID NO: 1). Daher korrespondieren gemäß der vorliegenden Erfindung die Aminosäuren-Nrn. 107–115, einschließlich aller Nummern dazwischen und 536–451, einschließlich aller Nummern dazwischen von SEQ ID NO: 4 zu den Aminosäuren-Nrn. 154–163 bzw. allen Nummern dazwischen und 583–588 und allen Nummern dazwischen von SEQ ID NO: 2.
Ein "Cry3A-Toxin" wie hier verwendet, bezieht sich auf ein ungefähr 73 kDa Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Kreig et al., 1983, Z. Angew. Entomol. 96: 500–508) (Bt) Coleoptera-aktives Protein (Sekar et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 7036–7040), beispielsweise SEQ ID NO: 2, wie auch trunkierte niedermolekulare Varianten, ableitbar von einem Cry3A-Toxin, beispielsweise SEQ ID NO: 4, die sich im wesentlichen dieselbe Toxizität wie das Cry3A-Toxin erhalten. Die niedermolekulareren Varianten können durch Proteasespaltung der natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstellen des Cry3A-Toxins oder durch ein zweites Translationsinitiationscodon im selben Rahmen wie das Translationsinitiationscodon, codierend das 73 kDa Cry3A-Toxin, erhalten werden. Die Aminosäuresequenz eines Cry3A-Toxins und der niedermolekularen Varianten davon können in einem Toxin angetroffen werden, das natürlich in Bt auftritt. Ein Cry3A-Toxin kann durch ein natives Bt-Gen wie in SEQ ID NO: 1 codiert werden oder durch eine synthetische codierende Sequenz wie in SEQ ID NO: 3. Ein "Cry3A-Toxin" hat keine zusätzliche Protease-Erkennungsstellen über die Protease-Erkennungsstellen hinaus, die natürlicherweise im Cry3A-Toxin auftreten. Ein Cry3A-Toxin kann in einem heterologen System isoliert, gereinigt oder exprimiert werden.
Ein "cry3A-Gen" wie hier verwendet, bezieht sich auf die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3. Ein cry3A-Gen (Sekar et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 7036–7040) kann natürlich auftreten, wie angetroffen in Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Krieg et al., 1983, Z. Angew. Entomol. 96: 500–508) oder kann synthetisch sein und codiert ein Cry3A-Toxin. Das cry3A-Gen dieser Erfindung kann als natives cry3A-Gen wie in SEQ ID NO: 1 bezeichnet werden oder das Mais-optimierte-cry3A-Gen wie in SEQ ID NO: 3 betreffen.
Ein Toxin "zuzuführen" bedeutet, daß das Toxin in Kontakt mit einem Insekt kommt, was zu einer toxischen Wirkung und Kontrolle des Insekts führt. Das Toxin kann in vielen anerkannten Weisen zugeführt werden, z. B. oral durch Verdau durch das Insekt oder durch Kontakt mit dem Insekt über transgene Pflanzenexpression, formulierte Proteinzusammensetzung(en), sprühfähige Proteinzusammensetzung(en), eine Ködermatrix oder jedes andere auf dem Gebiet anerkannte Toxinzufuhrsystem.
"Effektive Insekten-kontrollierende Menge" bedeutet die Konzentration des Toxins, die durch die toxische Wirkung die Fähigkeit von Insekten zum Überleben, Wachsen, sich ernähren und/oder sich reproduzieren inhibiert oder die den durch Insekten entstandenen Schaden oder den Verlust bei Erntepflanzen limitieren kann. "Effektive Insekten-kontrollierende Menge" kann das Töten der Insekten bedeuten oder auch nicht. obwohl es vorzugsweise das Töten der Insekten bedeutet.
"Expressionskassette" wie hier verwendet, bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, die die Expression einer bestimmten Nukleotidsequenz in einer geeigneten Wirtszelle steuern kann, umfassend einen Promotor, der an die Nukleinsäuresequenz von Interesse operabel gebunden ist, die operabel an Terminationssignale gebunden ist. Sie umfaßt auch typischerweise Sequenzen, die für die richtige Translation der Nukleotidsequenz benötigt werden. Die Expressionskassette, die die Nukleotidsequenz von Interesse umfaßt, kann chimär sein, was bedeutet, daß mindestens eine ihrer Komponenten im Hinblick auf mindestens eine ihrer anderen Komponenten heterolog ist. Die Expressionskassette kann auch eine solche sein, die natürlich auftritt, jedoch in einer rekombinanten Form, die für die heterologe Expression nützlich ist, erhalten wurde. Typischerweise ist jedoch die Expressionskassette im Hinblick auf den Wirt heterolog, d. h. die bestimmte Nukleinsäuresequenz der Expressionskassette tritt natürlicherweise in ihrer Wirtszelle nicht auf und muß in die Wirtszelle oder einen Vorläufer der Wirtszelle durch ein Transformationsereignis eingeführt worden sein. Die Expression der Nukleotidsequenz in der Expressionskassette kann sich unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder eines induzierbaren Promotors befinden, der die Transkription nur initiiert, wenn die Wirtszelle gegenüber bestimmten externen Stimuli ausgesetzt wird. Im Fall eines multizellulären Organismus, wie einer Pflanze, kann der Promotor für ein bestimmtes Gewebe, oder Organ oder eine Entwicklungsstufe spezifisch sein.
Ein "Gen" ist eine definierte Region, die innerhalb eines Genoms lokalisiert ist und die neben der oben erwähnten codierenden Nukleinsäuresequenz andere im wesentlichen regulatorische Nukleinsäuresequenzen umfaßt, die für die Kontrolle der Expression verantwortlich sind, d. h. die Transkription und Translation des codierenden Bereichs. Ein Gen kann auch andere 5'- und 3'-nicht-translatierte Sequenzen und Terminationssequenzen umfassen. Weitere Elemente, die vorliegen können, sind beispielsweise Introns.
"Gen von Interesse" bezieht sich jedes Gen, das, wenn es in eine Pflanze übertragen wird, der Pflanze eine gewünschte Eigenschaft wie eine Antibiotikaresistenz, Virusresistenz, Insektenresistenz, Resistenz gegen Krankheiten oder Resistenz gegen andere Ungeziefer, Herbizid-Toleranz, verbesserten Nährwert, verbesserte Leistung in industriellen Verfahren oder eine veränderte Reproduktionsfähigkeit verleiht. Das "Gen von Interesse" kann auch ein solches sein, das in Pflanzen zur Produktion kommerziell wertvoller Enzyme oder Metaboliten in der Pflanze übertragen wird.
Eine "Verdauungstrakt-Protease" ist eine Protease, die normalerweise im Verdauungstrakt eines Insekts angetroffen wird. Diese Protease ist üblicherweise am Verdau von Proteinen beteiligt.
Eine "heterologe" Nukleinsäuresequenz ist eine Nukleinsäuresequenz, die natürlicherweise nicht mit einer Wirtszelle, in die sie eingeführt wird, assoziiert ist, einschließlich nicht-natürlich auftretender multipler Kopien einer natürlich auftretenden Nukleinsäuresequenz.
Eine "homologe" Nukleinsäuresequenz ist eine Nukleinsäuresequenz, die natürlich mit der Wirtszelle, in die sie eingeführt wird, assoziiert ist.
"Homologe Rekombination" ist der reziproke Austausch von Nukleinsäure-Fragmenten zwischen homologen Nukleinsäuremolekülen.
"Insektizid" ist als toxische biologische Aktivität definiert, die Insekten kontrollieren kann, vorzugsweise indem diese getötet werden.
Eine Nukleinsäuresequenz ist mit einer Referenz-Nukleinsäuresequenz "isocodierend", wenn die Nukleinsäuresequenz an ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das Polypeptid, das von der Referenz-Nukleinsäuresequenz codiert wird.
Eine "isoliertes" Nukleinsäuremolekül oder ein isoliertes Toxin ist ein Nukleinsäuremolekül oder Toxin, das durch die Hand von Menschen getrennt von seiner nativen Umgebung existiert und daher nicht ein Produkt der Natur ist. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül oder Toxin kann in gereinigter Form existieren oder kann in nicht-nativer Umwelt existieren wie beispielsweise einer rekombinanten Wirtszelle.
Ein "modifiziertes Cry3A-Toxin" dieser Erfindung bezieht sich auf ein vom Cry3A abstammendes Toxin mit mindestens einer zusätzlichen Protease-Erkennungsstelle, die durch ein Verdauungstrakt-Protease eines Zielinsekts erkannt wird, die nicht natürlicherweise in einem Cry3A-Toxin auftritt. Ein modifiziertes Cry3A-Toxin ist nicht natürlich auftretend und umfaßt durch die Hand des Menschen eine Aminosäuresequenz, die nicht zu einem natürlich auftretenden Toxin identisch ist, das in Bacillus thuringiensis angetroffen wird. Das modifizierte Cry3A-Toxin löst eine höhere Mortalität gegenüber einem Zielinsekt aus als die Mortalität, die durch das Cry3A-Toxin gegen dasselbe Zielinsekt ausgelöst wird.
Ein "modifiziertes cry3A-Gen" gemäß dieser Erfindung bezieht sich auf ein von cry3A abgeleitetes Gen, umfassend die codierende Sequenz von mindestens einer zusätzlichen Protease-Erkennungsstelle, die nicht natürlicherweise in einem nicht-modifizierten cry3A-Gen auftritt. Das modifizierte cry3A-Gen kann von einem nativen cry3A-Gen abstammen oder von einem synthetischen cry3A-Gen.
Eine "natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle" ist eine Stellung innerhalb eines Cry3A-Toxins, die durch eine nicht von Insekten abstammende Protease oder durch ein Protease oder einen Verdauungstraktextrakt von einer Insektenart abgespalten wird, die gegenüber dem Cry3A-Toxin empfänglich ist. Beispielsweise existiert eine natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle, erkannt von Trypsin und Proteasen, die in empfänglichen Insekten-Verdauungstraktextrakten angetroffen werden, zwischen Arg-158 und Asn-159 der deduzierten Cry3A-Toxin-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2). Natürlich auftretende Protease-Erkennungsstellen, die von Chymotrypsin erkannt werden, existieren zwischen His-161 und Ser-162 wie auch zwischen Tyr-587 und Tyr-588 der deduzierten Cry3A-Toxin-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2).
Ein "Nukleinsäuremolekül" oder eine "Nukleinsäuresequenz" ist ein lineares Segment einzel- oder doppelsträngiger DNA oder RNA, das aus jeder Quelle isoliert werden kann. Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül vorzugsweise eine Segment von DNA.
Eine "Pflanze" ist jede Pflanze auf jeder Entwicklungsstufe, insbesondere eine Saatpflanze.
Eine "Pflanzenzelle" ist eine strukturelle und physiologische Einheit einer Pflanze, umfassend einen Protoplasten und eine Zellwand. Die Pflanzenzelle kann sich in Form einer isolierten einzelnen Zelle oder einer kultivierten Zelle oder als Teil einer höher organisierten Einheit befinden, wie beispielsweise ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan oder einer ganzen Pflanze.
"Pflanzenzellkultur" bedeutet Kulturen von Pflanzeneinheiten wie beispielsweise Protoplasten, Zellkulturzellen, Zellen in Pflanzengeweben, Pollen, Pollenröhrchen, Ovula, Embryonen-Säcke, Zygoten und Embryos aus verschiedenen Entwicklungsstufen.
"Pflanzenmaterial" bezieht sich auf Blätter, Stengel, Wurzeln, Blüten oder Blütenteile, Früchte, Pollen, Eizellen, Zygoten, Saat, Ableger, Zell- oder Gewebekulturen oder jeden anderen Teil oder jedes Produkt einer Pflanze.
Ein "Pflanzenorgan" ist ein deutlich und sichtbar strukturierter und differenzierter Teil einer Pflanze wie eine Wurzel, ein Stengel, ein Blatt, eine Blütenknospe oder ein Embryo.
"Pflanzengewebe" wie hier verwendet, bedeutet eine Gruppe von Pflanzenzellen, die in eine Struktur und funktionelle Einheit organisiert sind. Jedes Gewebe einer Pflanze in planta oder in Kultur ist beinhaltet. Diese Bezeichnung beinhaltet ganze Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzensaat, Gewebekultur und alle Gruppen von Pflanzenzellen, die in Struktur und/oder funktionelle Einheiten organisiert sind, ist jedoch nicht hierauf begrenzt. Die Verwendung dieser Bezeichnung zusammen mit oder in Abwesenheit von irgendeinem spezifischen Typ von Pflanzengewebe wie oben aufgeführt, oder anders von dieser Definition umfaßt, soll nicht für irgendeinen anderen Typ eines Pflanzengewebes ausschließend sein.
Ein "Promotor" ist eine nicht-translatierte DNA-Sequenz, stromaufwärts vom codierenden Bereich, der die Bindungsstelle für RNA-Polymerase enthält und die Transkription der DNA initiiert. Die Promotorregion kann auch andere Elemente beinhalten, die als Regulatoren der Gen-Expression wirken.
Ein "Protoplast" ist eine isolierte Pflanzenzelle ohne eine Zellwand oder mit nur Teilen der Zellwand.
"Regulatorische Elemente" beziehen sich auf Sequenzen, die an der Kontrolle der Expression einer Nukleotidsequenz beteiligt sind. Regula torische Elemente umfassen einen Promotor, der operabel an die Nukleotidsequenz von Interesse gebunden ist und Terminationssignale. Sie umfassen auch typischerweise Sequenzen, die für eine richtige Translation der Nukleotidsequenz benötigt werden.
"Ersetzt" eine natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle – Gemäß der vorliegenden Erfindung "ersetzt" eine zusätzliche Protease-Erkennungsstelle eine natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle, wenn die Insertion der zusätzlichen Protease-Erkennungsstelle die natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle eliminiert. Beispielsweise "ersetzt" eine zusätzliche Protease-Erkennuntgsstelle, inseriert zwischen Pro-154 und Pro-160 der deduzierten Aminosäuresequenz eines Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 2), was die Arg-158- und Asn-159-Reste eliminiert, die natürlich auftretende Trypsin-Erkennungsstelle, die zwischen Arg-158 und Asn-159 der deduzierten Aminosäuresequenz des Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 2) lokalisiert ist.
"Serinproteasen" beschreiben dieselbe Gruppe von Enzymen, die die Hydrolyse von kovalenten peptidischen Bindungen katalysieren, wobei ein Mechanismus verwendet wird, der auf einer nukleophilen Attacke auf die Peptidzielbindung durch ein Serin basiert. Serinproteasen sind sequenz-spezifisch. D. h. daß jede Serinprotease eine spezifische Sub-Sequenz innerhalb eines Proteins erkennt, wo eine enzymatische Erkennung stattfindet.
Ein "Zielinsekt" ist eine Insektenungezieferart, die wenig oder keine Empfänglichkeit gegenüber einem Cry3A-Toxin aufweist und als Kandidat zur Verwendung der Technologie der vorliegenden Erfindung für die Kontrolle identifiziert wird. Diese Kontrolle kann auf etlichen Wegen erreicht werden, besonders bevorzugt jedoch durch Expression der Nukleinsäuremoleküle der Erfindung in transgenen Pflanzen.
Eine "Zielinsekt-Verdauungstrakt-Protease" ist eine Protease, die im Verdauungstrakt eines Zielinsekts angetroffen wird, deren Erkennungsstelle in ein Cry3A-Toxin inseriert werden kann, um ein modifiziertes Cry3A-Toxin der Erfindung zu erzeugen.
"Transformation" ist ein Prozeß zur Einführung einer heterologen Nukleinsäure in eine Wirtszelle oder einen Organismus. Insbesondere bedeutet "Transformation" die stabile Integration eines DNA-Moleküls in das Genom eines Organismus von Interesse.
"Transformiert/transgen/rekombinant" bezieht sich auf einen Wirtsorganismus wie ein Bakterium oder eine Pflanze, in das/die ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingeführt wurde. Das Nukleinsäuremolekül kann in das Genom des Wirts stabil integriert sein oder das Nukleinsäuremolekül kann auch als extrachromosomales Molekül vorliegen. Ein solches extrachromosomales Molekül kann autoreplizierend sein. Transformierte Zellen, Gewebe oder Pflanzen sollen nicht nur das Endprodukt des Transformationsprozesse umfassen, sondern auch die transgene Vorfahrenschaft. Ein "nicht-transformierter", "nicht-transgener" oder "nicht-rekombinanter" Wirt bezieht sich auf einen Wild-Typ-Organismus, zum Beispiel ein Bakterium oder eine Pflanze, der/die das heterologe Nukleinsäuremolekül nicht enthält.
"Innerhalb einer natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle" – Gemäß der vorliegenden Erfindung befindet sich eine zusätzliche Protease-Erkennungsstelle "innerhalb" einer natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle, wenn die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle zwischen dem Aminosäurerest liegt, der vor der natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle kommt und demjenigen, der danach kommt. Beispielsweise befindet sich eine zusätzliche Protease-Erkennungsstelle, inseriert zwischen Tyr-587 und Tyr-588 der deduzierten Aminosäuresequenz eines Cry3A-Toxin (SEQ ID NO: 2) "innerhalb" einer natürlich auftretenden Chymotrypsin-Erkennungsstelle, lokalisiert zwischen Tyr-587 und Tyr-588 der deduzierten Aminosäuresequenz des Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 2). Die Insertion einer zusätzlichen Protease-Erkennungsstelle innerhalb einer natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle kann die Erkennung der natürlich auftretenden Protease-Erkennungsstelle durch eine Protease verändern oder auch nicht.
Nukleotide werden durch ihre Basen durch die folgenden Standardabkürzungen angegeben: Adenin (A), Cytosin (C), Thymin (T) und Guanin (G). Aminosäuren werden ähnlich durch die folgenden Standardabkürzungen angegeben: Alanin (Ala; A), Arginin (Arg; R), Asparagin (Asn; N), Asparaginsäure (Asp; D), Cystein (Cys; C), Glutamin (Gln; Q), Glutaminsäure (Glu; E), Glycin (Gly; G), Histidin (His; H), Isoleucin (Ile; I), Leucin (Leu; L), Lysin (Lys; K), Methionin (Met; M), Phenylalanin (Phe; F), Prolin (Pro; P), Serin (Ser; S), Threonin (Thr; T), Tryptophan (Trp; W), Tyrosin (Tyr, Y) und Valin (Val; V).
Diese Erfindung betrifft modifizierte cry3A-Nukleinsäuresequenzen, deren Expression zu modifizierten Cry3A-Toxinen führt und die Herstellung und Verwendung der modifizierten Cry3A-Toxine zur Kontrolle von Insekten-ungeziefer. Die Expression der modifizierten cry3A-Nukleinsäuresequenzen führt zu modifizierten Cry3A-Toxinen, die verwendet werden können, um Coleoptera-Insekten wie den Westlichen Maiswurzelbohrer wie auch den Nördlichen Maiswurzelbohrer zu kontrollieren. Ein modifiziertes Cry3A-Toxin der vorliegenden Erfindung umfaßt mindestens eine zusätzliche Protease-Erkennungsstelle, die in einem Cry3A-Toxin nicht natürlicherweise auftritt. Die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle, die von einer Verdauungstrakt-Protease eines Zielinsekts erkannt wird, wird an ungefähr derselben Position wie eine natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle in ein Cry3A-Toxin inseriert. Das modifizierte Cry3A-Toxin löst eine höhere Mortalität gegenüber einem Zielinsekt aus als die durch ein Cry3A-Toxin ausgelöste Mortalität gegenüber demselben Zielinsekt. Vorzugsweise löst das modifizierte Cry3A-Toxin mindestens ungefähr 50% Mortalität gegenüber dem Zielinsekt aus, gegenüber dem das Cry3A-Toxin ungefähr 30% Mortalität auslöst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert, wobei die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle von der Zielinsekten-Verdauungstrakt-Protease, Cathepsin G, erkannt wird. Die Cathepsin G-Aktivität wird als im Verdauungstrakt des Zielinsekts, dem Westlichen Maiswurzelbohrer vorliegend, bestimmt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Vorzugsweise wird die Substrat-Aminosäuresequenz AAPF (SEQ ID NO: 35), die verwendet wird um die Gegenwart der Cathepsin G-Aktivität zu bestimmen, in das Cry3A-Toxin gemäß der vorliegenden Erfindung inseriert. Andere Cathepsin G-Erkennungsstellen können auch gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beispielsweise AAPM (SEQ ID NO: 36), AVPF (SEQ ID NO: 37), PFLF (SEQ ID NO: 38) oder andere Cathepsin G-Erkennungsstellen, wie bestimmt durch das Verfahren von Tanaka et al., 1985 (Biochemistry 24: 2040–2047), hier durch Bezugnahme enthalten. Protease-Erkennungsstellen von anderen Proteasen, die in einem Zielinsekt-Verdauungstrakt identifiziert wurden, können verwendet werden, beispielsweise Protease-Erkennungsstellen, die von anderen Serinproteasen, Cysteinproteasen und Asparaginsäureproteasen erkannt werden. Bevorzugte Serinproteasen, die in dieser Ausführungsform umfaßt sind, beinhalten Trypsin, Chymotrypsin, Carboxypeptidase, Endopeptidase und Elastase.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert, wobei die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle entweder in Domäne I oder Domäne III oder sowohl Domäne I als auch Domäne III des Cry3A-Toxins inseriert ist. Vorzugsweise ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I, Domäne III oder Domäne I und Domäne III an einer Position inseriert, die die natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle in dem Cry3A-Toxin ersetzt, dazu benachbart liegt oder innerhalb derselben liegt. Spezifisch als Beispiele sind hier Nukleinsäuremoleküle genannt, die modifizierte Cry3A-Toxine codieren, die eine Cathepsin G-Erkennungsstelle umfassen, inseriert in Domäne I, Domäne III oder Domäne I und Domäne III an einer Position, die eine natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle im unmodifizierten cry3A-Toxin ersetzt, dazu benachbart ist oder innerhalb derselben liegt.
Spezifisch als beispielhaft genannte Lehren für Verfahren um modifizierte cry3A-Nukleinsäuremoleküle herzustellen, die modifizierte Cry3A-Toxine codieren, können in Beispiel 3 gefunden werden. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, daß andere Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, ebenfalls verwendet werden können, um zusätzliche Protease-Erkennungsstellen in Cry3A-Toxine gemäß der vorliegenden Erfindung zu inserieren.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert, wobei die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren inseriert ist, die zu Aminosäuren Nrn. 154 und 162 von SEQ ID NO: 2 korrespondieren. Vorzugsweise ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle zwischen Aminosäure-Nrn. 154 und 162 von SEQ ID NO: 2 oder zwischen Aminosäure-Nrn. 107 und 115 von SEQ ID NO: 4 inseriert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle zwischen Aminosäuren inseriert, korrespondierend zu Aminosäure-Nrn. 154 und 160 von SEQ ID NO: 2. Vorzugsweise ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle zwischen den Aminosäuren Nrn. 154 und 160 von SEQ ID NO: 2 oder zwischen den Aminosäure-Nrn. 107 und 113 von SEQ ID NO: 4 inseriert. Spezifisch als Beispiel genannt wird ein Nukleinsäuremolekül, das als cry3A054 (SEQ ID NO: 6) bezeichnet wird, das das modifizierte Cry3A054-Toxin (SEQ ID NO: 7) codiert, umfassend eine Cathepsin-G-Erkennungsstelle, die in Domäne I zwischen den Aminosäuren 107 und 113 von SEQ ID NO: 4 inseriert ist. Die Cathepsin G-Erkennungsstelle ersetzt eine natürlich auftretende Trypsin-Erkennungsstelle und liegt benachbart zu einer natürlich auftretenden Chymotrypsin-Erkennungsstelle. Wenn das Nukleinsäuremolekül von SEQ ID NO: 6 in einem heterologen Wirt exprimiert wird, führt dies zu einer Insektenkontrollaktivität gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer und den Nördlichen Maiswurzelbohrer, was zeigt, daß die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 für eine solche Insektenkontrollaktivität genügt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren, korrespondierend zu Aminosäure-Nrn. 154 und 158 von SEQ ID NO: 2 inseriert. Vorzugsweise ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen den Aminosäuren Nrn. 154 und 158 von SEQ ID NO: 2 oder zwischen den Aminosäuren Nrn. 107 und 111 von SEQ ID NO: 4 inseriert. Spezifisch als Beispiele genannt werden hier Nukleinsäuremoleküle, die als cry3A055 (SEQ ID NO: 8) bezeichnet werden und die das modifizierte Cry3A055-Toxin (SEQ ID NO: 9) codieren und cry3A085 (SEQ ID NO: 10), das das modifizierte Cry3A085-Toxin (SEQ ID NO: 11) codiert, umfassend eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, inseriert in Domäne I zwischen den Aminosäuren Nrn. 107 und 111 von SEQ ID NO: 4. Die Cathepsin G-Erkennungsstelle liegt benachbart zu natürlich auftretenden Trypsin- und Chymotrypsin-Erkennungsstellen. Wenn das Nukleinsäuremolekül von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 in einem heterologen Wirt exprimiert wird, führt dies zu einer Insektenkontrollaktivität gegen Westlichen und Nördlichen Maiswurzelbohrer und zeigt, daß die in SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 dargestellte Nukleinsäuresequenz für eine solche Insektenkontrollaktivität genügt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert, wobei die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen Aminosäuren, korrespondierend zu Aminosäure Nrn. 583 und 589 von SEQ ID NO: 2 inseriert ist. Vorzugsweise ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nr. 583 und 589 von SEQ ID NO: 2 oder zwischen den Aminosäuren Nrn. 536 und 542 von SEQ ID NO: 4 inseriert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert, wobei die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen Aminosäuren, korrespondierend zu Aminosäure Nrn. 583 und 588 von SEQ ID NO: 2 inseriert ist. Vorzugsweise ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nr. 583 und 588 von SEQ ID NO: 2 oder zwischen den Aminosäuren Nrn. 536 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert. Spezifisch als Beispiel genannt wird ein Nukleinsäuremolekül, das als cry3A082 (SEQ ID NO: 12) bezeichnet wird, das das modifizierte Cry3A082-Toxin (SEQ ID NO: 13) codiert, umfassend eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, die in Domäne III zwischen den Aminosäuren 536 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert ist. Die Cathepsin G-Erkennungsstelle ersetzt eine natürlich auftretende Chymotrypsin-Erkennungsstelle. Wenn das Nukleinsäuremolekül von SEQ ID NO: 12 in einem heterologen Wirt exprimiert wird, führt dies zu einer Insektenkontrollaktivität gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer und den Nördlichen Maiswurzelbohrer, was zeigt, daß die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12 für eine solche Insektenkontrollaktivität genügt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen Aminosäuren, korrespondierend zu Aminosäure-Nrn. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2 inseriert. Vorzugsweise ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nrn. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2 oder zwischen den Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert. Spezifisch als Beispiele genannt werden hier Nukleinsäuremoleküle genannt, die als cry3A058 (SEQ ID NO: 14) bezeichnet werden und das modifizierte Cry3A058-Toxin (SEQ ID NO: 15) codiert, umfassend eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, inseriert in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4. Die Cathepsin G-Erkennungsstelle liegt innerhalb einer natürlich auftretenden Chymotrypsin-Erkennungsstelle. Wenn das Nukleinsäuremolekül von SEQ ID NO: 14 in einem heterologen Wirt exprimiert wird, führt dies zu einer Insektenkontrollaktivität gegen Westlichen und Nördlichen Maiswurzelbohrer und zeigt, daß die in SEQ ID NO: 14 dargestellte Nukleinsäuresequenz für eine solche Insektenkontrollaktivität genügt.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert, wobei die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäure Nrn. 154 und 160 und in Domäne III zwischen Aminosäuren, korrespondierend zu Aminosäure Nrn. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2 inseriert ist. Vorzugsweise ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen den Aminosäuren Nrn. 154 und 160 und in Domäne III zwischen den Aminosäure Nrn. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2 oder in Domäne I zwischen den Aminosäure Nnr. 107 und 113 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert. Spezifisch als Beispiel genannt wird ein Nukleinsäuremolekül, das als cry3A057 (SEQ ID NO: 16) bezeichnet wird, das das modifizierte Cry3A057-Toxin (SEQ ID NO: 17) codiert, umfassend eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, die in Domäne I zwischen den Aminosäuren 107 und 113 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert ist. Die Cathepsin G-Erkennungsstelle ersetzt eine natürlich auftretende Trypsin-Erkennungsstelle und liegt benachbart zu einer natürlich auftretenden Chymotrypsin-Erkennungsstelle in Domäne I und innerhalb einer natürlich auftretenden Chymotrypsin-Erkennungsstelle in Domäne III. Wenn das Nukleinsäuremolekül von SEQ ID NO: 16 in einem heterologen Wirt exprimiert wird, führt dies zu einer Insektenkontrollaktivität gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer und den Nördlichen Maiswurzelbohrer, was zeigt, daß die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 16 für eine solche Insektenkontrollaktivität genügt.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäure Nrn. 154 und 158 und in Domäne III zwischen Aminosäuren, korrespondierend zu Aminosäure Nrn. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2 inseriert. Vorzugsweise ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen den Aminosäuren Nrn. 154 und 158 und in Domäne III zwischen den Aminosäure Nrn. 587 und 588 von SEQ ID NO: 2 oder in Domäne I zwischen den Aminosäure Nrn. 107 und 111 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert. Spezifisch als Beispiel genannt wird ein Nukleinsäuremolekül, das als cry3A056 (SEQ ID NO: 18) bezeichnet wird, das das modifizierte Cry3A056-Toxin (SEQ ID NO: 19) codiert, umfassend eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, die in Domäne I zwischen den Aminosäuren 107 und 111 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert ist. Die Cathepsin G-Erkennungsstelle ersetzt eine natürlich auftretende Trypsin- und Chymotrypsin-Erkennungsstelle innerhalb in Domäne I und innerhalb einer natürlich auftretenden Chymotrypsin-Erkennungsstelle in Domäne III. Wenn das Nukleinsäuremolekül von SEQ ID NO: 18 in einem heterologen Wirt exprimiert wird, führt dies zu einer Insektenkontrollaktivität gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer und den Nördlichen Maiswurzelbohrer, was zeigt, daß die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 18 für eine solche Insektenkontrollaktivität genügt.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäure Nrn. 154 und 158 und in Domäne III zwischen Aminosäuren, korrespondierend zu Aminosäure Nrn. 583 und 588 von SEQ ID NO: 2 inseriert. Vorzugsweise ist die zusätzliche Protease-Erkennungsstelle in Domäne I zwischen den Aminosäuren Nrn. 154 und 158 und in Domäne III zwischen den Aminosäure Nrn. 583 und 588 von SEQ ID NO: 2 oder in Domäne I zwischen den Aminosäure Nnr. 107 und 111 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nrn. 536 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert. Spezifisch als Beispiel genannt wird ein Nukleinsäuremolekül, das als cry3A083 (SEQ ID NO: 20) bezeichnet wird, das das modifizierte Cry3A083-Toxin (SEQ ID NO: 21) codiert, umfassend eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, die in Domäne I zwischen den Aminosäuren 107 und 111 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren Nrn. 536 und 541 von SEQ ID NO: 4 inseriert ist. Die Cathepsin G-Erkennungsstelle liegt benachbart zu natürlich auftretenden Trypsin- und Chymotrypsin-Erkennungsstellen in Domäne I und ersetzt eine natürlich auftretende Chymotrypsin-Erkennungsstelle in Domäne III. Wenn das Nukleinsäuremolekül von SEQ ID NO: 20 in einem heterologen Wirt exprimiert wird, führt dies zu einer Insektenkontrollaktivität gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer und den Nördlichen Maiswurzelbohrer, was zeigt, daß die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 20 für eine solche Insektenkontrollaktivität genügt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das isolierte Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung die Nukleotide 1-1791 von SEQ ID NO: 6, Nukleotide 1-1806 von SEQ ID NO: 8, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 10, Nukleotide 1-1794 von SEQ ID NO: 12, Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 14, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 16, Nukleotide 1-1791 von SEQ ID NO: 18 und Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 20.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung das isolierte Nukleinsäuremolekül, das ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch rekombinante Vektoren, umfassend die Nukleinsäuresequenzen dieser Erfindung. In solchen Vektoren sind die Nukleinsäuresequenzen vorzugsweise in Expressionskassetten umfaßt, umfassend regulatorische Elemente für die Expression der Nukleotidsequenzen in einer Wirtszelle, die die Nukleotidsequenzen exprimieren kann. Solche regulatorischen Elemente umfassen in der Regel Promotor- und Terminationssignale und vorzugsweise umfassen sie auch Elemente, die eine effiziente Translation der Polypeptide ermöglichen, die von den Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung codiert werden. Vektoren, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, sind üblicherweise zu einer Replikation in bestimmten Wirtszellen in der Lage, vorzugsweise als extrachromosomale Moleküle und werden daher zur Amplifikation der Nukleinsäuresequenzen dieser Erfindung in den Wirtszellen verwendet. In einer Ausführungsform sind Wirtszellen für solche Vektoren Mikroorganismen wie Bakterien, insbesondere Bacillus thuringiensis oder E. coli. In einer weiteren Ausführungsform sind Wirtszellen für solche rekombinanten Vektoren Endophyten oder Epiphyten. Eine bevorzugte Wirtszelle für solche Vektoren ist eine eukaryontische Zelle, wie eine Pflanzenzelle. Pflanzenzellen wie Maiszellen sind die besonders bevorzugten Wirtszellen. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind solche Vektoren virale Vektoren und werden zur Replikation der Nukleotidsequenzen in bestimmten Wirtszellen verwendet, zum Beispiel Insekten- oder Pflanzenzellen. Rekombinante Vektoren werden auch zur Transformation der Nukleotidsequenzen dieser Erfindung in Wirtszellen verwendet, wobei die Nukleotidsequenzen stabil in die DNA solcher Wirtszellen integriert werden. In einer Ausführungsform sind solche Wirtszellen prokaryontische Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind solche Wirtszellen eukaryontische Zellen wie Pflanzenzellen. In der besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Wirtszellen Pflanzenzellen wie Maiszellen.
Gemäß einem anderen Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung modifizierte Cry3A-Toxine, die durch die Expression der Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung erzeugt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die modifizierten Cry3A-Toxine der Erfindung ein Polypeptid, codiert durch eine Nukleotidsequenz der Erfindung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das modifizierte Cry3A-Toxin durch Expression des Nukleinsäuremoleküls erzeugt, umfassend Nukleotide 1-1791 von SEQ ID NO: 6, Nukleotide 1-1806 von SEQ ID NO: 8, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 10, Nukleotide 1-1794 von SEQ ID NO: 12, Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 14, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 16, Nukleotide 1-1791 von SEQ ID NO: 18 und Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 20.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein modifiziertes Cry3A-Toxin der vorliegenden Erfindung die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21.
Die modifizierten Cry3A-Toxine der vorliegenden Erfindung haben eine Insektenkontrollaktivität, wenn sie gegen Insektenungeziefer in Bioassays untersucht werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die modifizierten Cry3A-Toxine der Erfindung gegen Coleoptera-Insekten, vorzugsweise gegen den Westlichen und Nördlichen Maiswurzelbohrer aktiv.
Die Insektenkontrolleigenschaften der modifizierten Cry3A-Toxine der Erfindung werden weiter in den Beispielen 4 und 6 illustriert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Zusammensetzung, umfassend eine effektive Insekten-kontrollierende Menge eines modifizierten Cry3A-Toxins gemäß der Erfindung.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines modifizierten Cry3A-Toxin, das gegen Insekten aktiv ist, umfassend: (a) Erhalt einer Wirtszelle, umfassend ein chimäres Gen, das selbst eine heterologe Promotorsequenz umfaßt, operativ gebunden an das Nukleinsäuremolekül der Erfindung und (b) Expression des Nukleinsäuremoleküls in der transgenen Wirtszelle, was zu mindestens einem modifizierten Cry3A-Toxin führt, das gegen Insekten aktiv ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Insekten-resistenten transgenen Pflanze, umfassend die Einführung eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung in die transgene Pflanze, wobei das Nukleinsäuremolekül in der transgenen Pflanze in einer effektiven Menge zur Kontrolle von Insekten exprimierbar ist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Insekten Coleoptera-Insekten, vorzugsweise der Westliche und Nördliche Maiswurzelbohrer.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle von Insekten, umfassend die Zufuhr einer effektiven Menge eines modifizierten Cry3A-Toxins der Erfindung zu den Insekten. Gemäß dieser Ausführungsform sind die Insekten Coleoptera-Insekten, vorzugsweise der Westliche und Nördliche Maiswurzelbohrer. Vorzugsweise wird das modifizierte Cry3A-Toxin den Insekten oral zugeführt. In einem bevorzugten Aspekt wird das Toxin oral durch eine transgene Pflanze zugeführt, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin der vorliegenden Erfindung exprimiert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Cry3A-Toxins, umfassend: (a) Erhalt eines cry3A-Toxin-Gens, das ein Cry3A-Toxin codiert; (b) Identifizieren einer Verdauungstrakt-Protease eines Zielinsekts; (c) Erhalt einer Nukleotidsequenz; die eine Erkennungsstelle für die Verdauungstrakt-Protease codiert; (d) Insertion der Nukleotidsequenz von (c) in entweder Domäne I oder Domäne III oder sowohl Domäne I als auch Domäne III an einer Position, die eine Nukleotidsequenz ersetzt, darin liegt oder dazu benachbart ist, die für eine natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle in einem cry3A-Toxingen codiert und so Erzeugung eines modifizierten cry3A-Toxingens; (e) Insertion des modifizierten cry3A-Toxingens in eine Expressionskassette; (f) Expression des modifizierten cry3A-Toxingens in einer nicht-menschlichen Wirtszelle, was zu einer Wirtszelle führt, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin erzeugt; und (g) Durchführung eines Bioassays an dem modifizierten Cry3A-Toxin gegen ein Zielinsekt, wobei das modifizierte Cry3A-Toxin eine höhere Mortalität auf das Zielinsekt auslöst als die durch ein Cry3A-Toxin ausgelöste Mortalität. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform löst das modifizierte Cry3A-Toxin mindestens ungefähr 50% Mortalität gegenüber dem Zielinsekt aus, wenn das Cry3A-Toxin bis zu ungefähr 30% Mortalität auslöst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Kontrolle von Insekten bereit, wobei die transgene Pflanze weiterhin eine zweite Nukleinsäuresequenz oder Gruppe von Nukleinsäuresequenzen umfaßt, die einen zweiten Pestizidwirkstoff codiert. Besonders bevorzugte zweite Nukleinsäuresequenzen sind diejenigen, die ein δ-Endotoxin codieren, diejenigen, die ein vegetativ insektizides Proteintoxin codieren, wie offenbart in US-Patenten 5,849,870 und 5,877,012 , hier durch Bezugnahme eingeschlossen, oder diejenigen, die einen Weg für die Erzeugung eines nicht-proteinartigen Pestizidwirkstoffs codieren.
In weiteren Ausführungsformen können die Nukleotidsequenzen der Erfindung weiter durch Einbau von statistischen Mutationen in einer Technik, die als In-vitro-Rekombination oder DNA-Shuffling bekannt ist, modifiziert werden. Dieses Verfahren wird in Stemmer et al., Nature 370: 389–391 (1994) und US-Patent 5,605,793 beschrieben, die hier durch Bezugnahme inkorporiert sind. Millionen mutanter Kopien einer Nukleotidsequenz werden erzeugt, basierend auf einer ursprünglichen Nukleotidsequenz dieser Erfindung und Varianten mit verbesserten Eigenschaften, wie einer erhöhten insektiziden Aktivität, erhöhten Stabilität oder unterschiedlichen Spezifität oder Bereichen von Zielinsektenungeziefern werden gewonnen. Das Verfahren umfaßt die Bildung eines mutagenisierten Doppelstrang-Polynukleotids von einem Matrizendoppelstrang-Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz dieser Erfindung, wobei das Matrizendoppelstrang-Polynukleotid in statistische Doppelstrang-Fragmente einer gewünschten Größe gespalten wurde und umfaßt den Schritt der Zugabe zu der resultierenden Population der doppelsträngigen statistischen Fragmente von ein oder mehr einzel- oder doppelsträngigen Oligonukleotiden, wobei die Oligonukleotide einen Identitätsbereich und einen Heterologiebereich, zu dem doppelsträngigen Matrizen-Polynukleotid umfassen; Denaturieren der resultierenden Mischung doppelsträngiger statistischer Fragmente und Oligonukleotide in einzelsträngige Fragmente; Inkubation der resultierenden Population einzelsträngiger Fragmente mit Polymerase unter Bedingungen, die zu einem Anhaften der einzelsträngigen Fragmente an die Bereiche der Identität führen, zur Bildung von Paaren angehafteter Fragmente, wobei die Identitätsbereiche für ein Mitglied des Paars ausreichen, um eine Replikation des anderen auszulösen, wodurch ein mutagenisiertes doppelsträngiges Polynukleotid gebildet wird; und Wiederholung der zweiten und dritten Schritte für mindestens zwei weitere Zyklen, wobei die resultierende Mischung im zweiten Schritt eines weiteren Zyklus das mutagenisierte doppelsträngige Polynukleotid von dem dritten Schritt des vorherigen Zyklus beinhaltet und wobei der weitere Zyklus ein weiteres mutagenisiertes doppelsträngiges Polynukleotid bildet. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Konzentration der einzelnen Spezies von doppelsträngigen statistischen Fragmenten in der Population der doppelsträngigen statistischen Fragmenten bei weniger als 1 Gew.% der Gesamt-DNA. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Matrizen-doppelsträngige Polynukleotid mindestens ungefähr 100 Arten Polynukleotide. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform liegt die Größe der doppelsträngigen statistischen Fragmente bei ungefähr 5 bp bis 5 kb. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform umfaßt der vierte Schritt des Verfahrens die Wiederholung der zweiten und dritten Schritte für mindestens 10 Zyklen.
Expression der Nukleotidsequenzen in heterologen mikrobiellen Wirten
Als biologische Insektenkontrollmittel werden die insektiziden modifizierten Cry3A-Toxine durch Expression der Nukleotidsequenzen in heterologen Wirtszellen erzeugt, die die Nukleotidsequenzen exprimieren können. In einer ersten Ausführungsform werden B. thuringiensis-Zellen hergestellt, die Modifikationen der Nukleotidsequenz dieser Erfindung umfassen. Solche Modifikationen umfassen Mutationen oder Deletionen existierender regulatorischer Elemente und führen so zu veränderter Expression der Nukleotidsequenz oder dem Einbau neuer regulatorischer Elemente, die die Expression der Nukleotidsequenz kontrollieren. In einer anderen Ausführungsform werden zusätzliche Kopien von ein oder mehr der Nukleotidsequenzen zu Bacillus thuringiensis-Zellen entweder durch Insertion in das Chromosom oder durch Einführung extrachromosomal sich replizierende Moleküle, enthaltend die Nukleotidsequenzen, zugefügt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird mindestens eine der Nukleotidsequenzen der Erfindung in eine geeignete Expressionskassette inseriert, umfassend einen Promotor und ein Terminationssignal. Die Expression der Nukleotidsequenz ist konstitutiv oder ein induzierbarer Promotor, der auf verschiedene Arten von Stimuli zur Initiation der Transkription reagiert, wird verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle, in der das Toxin exprimiert wird, ein Mikroorganismus, wie ein Virus, ein Bakterium oder ein Pilz. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein Virus wie ein Baculovirus, eine Nukleotidsequenz der Erfindung in seinem Genom und exprimiert große Mengen des korrespondierenden insektiziden Toxins nach Infektion geeigneter eukaryontischer Zellen, die für die Virusreplikation und Expression der Nukleotidsequenz geeignet sind. Das so erzeugte insektizide Toxin wird als insektizides Mittel verwendet. Alternativ werden so genetisch manipulierte Baculoviren, daß sie die Nukleotidsequenz enthalten, verwendet, um Insekten in vivo zu infizieren und sie entweder durch Expression des insektiziden Toxins oder durch eine Kombination einer viralen Infektion und Expression des insektiziden Toxins zu töten.
Bakterielle Zellen sind ebenfalls Wirte für die Expression der Nukleotidsequenzen der Erfindung. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden nicht-pathogene symbiotische Bakterien, die sich in Pflanzengeweben replizieren können und dort leben können, sogenannte Endophyten oder nicht-pathogene symbiotische Bakterien, die die Phyllosphäre oder die Rhizosphäre kolonisieren können, sogenannte Epiphyten verwendet. Solche Bakterien beinhalten Bakterien der Gattung Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces und Xanthomonas. Symbiontische Pilze wie Trichoderma und Gliocladium sind ebenfalls mögliche Wirte zur Expression der erfinderischen Nukleotidsequenzen für denselben Zweck.
Techniken für diese genetischen Manipulationen sind für die unterschiedlichen zur Verfügung stehenden Wirte spezifisch und sind auf dem Gebiet bekannt. Beispielsweise können die Expressionsvektoren pKK223-3 und pKK223-2 verwendet werden, um heterologe Gene in E. coli zu exprimieren, entweder in transkriptionaler oder translationaler Fusion, hinter dem tac- oder trc-Promotor. Für die Expression von Operons, die multiple ORFs codieren, ist das einfachste Verfahren die Insertion des Operons in einen Vektor wie pKK223-3 in transkriptionaler Fusion, was es der verwandten Ribosomen-Bindungsstelle der verwendeten heterologen Gene ermöglicht, verwendet zu werden. Techniken für die Überexpression in Gram-positiven Arten wie Bacillus sind ebenfalls auf dem Gebiet bekannt und können im Kontext dieser Erfindung verwendet werden (Quax et al., In: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Hrsg. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)). Alternative Systeme für die Überexpression verlassen sich beispielsweise auf Hefevektoren und beinhalten die Verwendung von Pichia, Saccharomyces und Kluyveromyces (Sreekrishna, In: Industrial Microorganisms: basic and applied molecular genetic, Baltz, Hegeman und Skatrud Hrsg., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2: 173–177 (1994); van den Berg et al., Biotechnology 8: 135–139 (1990)).
Pflanzentransformation
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird mindestens eines der insektizid modifizierten Cry3A-Toxine der Erfindung in einem höheren Organismus, zum Beispiel einer Pflanze, exprimiert. In diesem Fall schützen sich transgene Pflanzen, die effektive Menge der modifizierten Cry3A-Toxine exprimieren, selbst vor Insektenungeziefer. Wenn das Insekt damit beginnt, sich an einer solchen transgenen Pflanze zu ernähren, nimmt es auch die exprimierten modifizierten Cry3A-Toxin auf. Das wird das Insekt von weiterem Hineinbeißen in Pflanzengewebe ablenken oder das Insekt sogar schädigen oder töten. Eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung wird in eine Expressionskassette inseriert, die dann vorzugsweise stabil in das Genom der Pflanze integriert wird. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleotidsequenz in ein nicht-pathogenes sich selbst replizierendes Virus eingeschlossen. Pflanzen, die gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert sind, können Mono- oder Dicotyledonen sein und beinhalten Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Süßkartoffel, Bohnen, Erbsen, Chicorée, Salat, Kohl, Blumenkohl, Brokkoli, Rübe, Rettich, Spinat, Spargel, Zwiebel, Knoblauch, Pfeffer, Sellerie, alle Kürbisarten, Hanf, Zucchini, Apfel, Birnen, Quitten, Melonen, Pflaumen, Kirsche, Pfirsich, Nektarine, Aprikose, Erdbeere, Traube, Himbeere, Blaubeere, Ananas, Avocado, Papaya, Mango, Banane, Soja, Tomate, Sorghum, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Sonnenblume, Rapssamen, Nelke, Tabak, Karrotte, Baumwolle, Alfalfa, Reis, Kartoffel, Aubergine, Gurke, Arabidopsis und holzartige Pflanzen wie Koniferen und Laubbäume. Sobald eine gewünschte Nukleotidsequenz in eine bestimmte Pflanzenart transformiert wurde, kann sie in der Art propagiert werden oder in andere Varietäten derselben Art übertragen werden, insbesondere einschließlich kommerzieller Varietäten, wobei traditionelle Zuchtverfahren verwendet werden. Eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz wird vorzugsweise in transgenen Pflanzen exprimiert und löst so die Biosynthese des korrespondierenden modifizierten Cry3A-Toxins in den transgenen Pflanzen aus. Auf diese Weise werden transgene Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Insekten erzeugt. Für ihre Expression in transgenen Pflanzen können die Nukleotidsequenzen der Erfindung andere Modifikationen und Optimierungen benötigen. Obwohl Gene von mikrobiellen Organismen in vielen Fällen in Pflanzen auf hohes Niveaus ohne Modifikation exprimiert werden können, kann sich eine niedrige Expression in den transgenen Pflanzen aus mikrobiellen Nukleotidsequenzen ergeben, die Codons aufweisen, die in Pflanzen nicht bevorzugt werden. Es ist auf dem Gebiet bekannt, daß alle Organismen spezifische Präferenzen für die Codon-Verwendung aufweisen und daß die Codons der Nukleotidsequenzen, die in dieser Erfindung beschrieben werden, so verändert werden können, daß sie mit den Pflanzenpräferenzen übereinstimmen, während die dadurch codierten Aminosäuren beibehalten werden. Weiterhin wird eine hohe Expression in Pflanzen am besten aus codierenden Sequenzen erreicht, die mindestens ungefähr 35% GC-Gehalt aufweisen, vorzugsweise mehr als ungefähr 45%, noch bevorzugter mehr als ungefähr 50% und besonders bevorzugt mehr als ungefähr 60%. Mikrobielle Nukleotidsequenzen, die niedrige GC-Gehalte aufweisen, können in Pflanzen aufgrund der Existenz von ATTTA-Motiven, die die Botschaften destabilisieren können und AATAAA-Motiven, die zu einer nicht richtigen Polyadenylierung führen schlecht exprimierbar sein. Obwohl bevorzugte Gensequenzen adäquat sowohl in Mono- als auch Dicotyledonen-Pflanzenarten exprimiert werden können, können die Sequenzen modifiziert werden, um den spezifischen Codon-Präferenzen und GC-Gehaltpräferenzen von Mono- oder Dictyledonen zu entsprechen, da gezeigt wurde, daß sich diese Präferenzen unterscheiden (Murray et al., Nucl. Acid Res. 17: 477–498 (1989)). Zusätzlich werden die Nukleotidsequenzen im Hinblick auf die Existenz illegitimer Spleißstellen einem Screening unterzogen, die zu einer Botschaftsverkürzung führen können. Alle benötigten Änderungen können innerhalb der Nukleotidsequenzen so wie den oben beschriebenen durchgeführt werden, wobei wohl bekannte Techniken einer ortsgerichteten Mutagenese, PCR und synthetische Gen-Konstruktion verwendet werden, wobei die Verfahren verwendet werden, die in der veröffentlichten Patentanmeldung EP 0 385 962 (für Monsanto), EP 0 359 472 (für Lubrizol) und WO 93/07278 (für Ciba-Geigy) beschrieben sind.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein cry3A-Gen gemäß dem im US-Patent 5,625,136 , hier durch Bezugnahme inkorporiert, offenbarten Verfahren hergestellt. Bei diesem Verfahren werden von Mais bevorzugte Codons, d. h. das einzelne Codon, das eine Aminosäure in Mais besonders häufig codiert, verwendet. Das von Mais bevorzugte Codon für eine bestimmte Aminosäure kann beispielsweise von bekannten Gensequenzen von Mais abgeleitet werden. Die Mais-Codonverwendung für 28 Gene von Maispflanzen wird in Murray et al., Nucleic Acids Research 17: 477–498 (1989) gefunden, dessen Offenbarung hier durch Inbezugnahme enthalten ist. Eine synthetische Sequenz, hergestellt mit für Mais optimierten Codons ist in SEQ ID NO: 3 dargestellt.
Auf diese Weise können die Nukleotidsequenzen für die Expression in jeder Pflanze optimiert werden. Es wird anerkannt, daß die Gesamtheit oder jeder Teil der Gensequenz optimiert werden kann oder synthetisch ist. Das heißt, es können auch synthetische oder teilweise optimierte Sequenzen verwendet werden.
Für die effiziente Initiation der Translation können Sequenzen, die benachbart zum Initiations-Methionin liegen, eine Modifikation benötigen. Beispielsweise können sie durch Einschluß von Sequenzen modifiziert werden, von denen bekannt ist, daß sie in Pflanzen effektiv sind. Joshi hat einen geeigneten Konsensus für Pflanzen vorgeschlagen (NAR 15: 6643–6653 (1987)) und Clontech schlägt einen weiteren Konsensus-Translationsinitiator vor (1993/1994 Katalog, Seite 210). Diese Konsensussequenzen sind zur Verwendung in den Nukleotidsequenzen dieser Erfindung geeignet. Die Sequenzen werden in Konstruktionen eingebaut, umfassend die Nukleotidsequenzen, bis zu und einschließlich des ATGs (während die zweite Aminosäure nicht-modifiziert verbleibt) oder alternativ bis zu und einschließlich des auf das ATG folgenden GTC (mit der Möglichkeit der Modifikation der zweiten Aminosäure des Transgens).
Die Expression der Nukleotidsequenzen in transgenen Pflanzen wird durch Promotoren angetrieben, die in Pflanzen wirken. Die Wahl des Promotors wird abhängig von den zeitlichen und räumlichen Bedürfnissen für die Expression variieren und auch abhängig von der Zielspezies. So wird eine Expression der Nukleotidsequenzen dieser Erfindung in Blättern, Stengeln oder Stielen, in den Ähren, in Blütenständen (z. B. Stacheln, Rispen, Kolben, usw.) in Wurzeln und/oder Sämlingen bevorzugt. In vielen Fällen sucht man jedoch nach einem Schutz gegen mehr als eine Art von Insektenungeziefer und so ist eine Expression in multiplen Geweben wünschenswert. Obwohl viele Promotoren für Dicotyledonen auch als operationsfähig in Monocotyledonen gezeigt wurden oder umgekehrt, sind idealerweise Dicotyledonen-Promotoren für die Expression in Dicotyledonen zu selektieren und Monocotyledonen-Promotoren für die Expression in Monocotyledonen. Es gibt jedoch keine Begrenzung für die Herkunft der gewünschten Promotoren; es ist ausreichend, daß sie für den Antrieb der Expression der Nukleotidsequenzen in der gewünschten Zelle wirksam sind.
Bevorzugte Promotoren, die konstitutiv exprimiert werden, beinhalten Promotoren von Genen, die Actin oder Ubiquitin codieren und die CaMV35S- und 19S-Promotoren. Die Nukleotidsequenzen dieser Erfindung können auch unter der Regulation von Promotoren exprimiert werden, die chemisch reguliert werden. Die ermöglicht es, daß die insektizid modifizierten Cry3A-Toxine nur synthetisiert werden, wenn die Erntepflanzen mit den induzierenden Chemikalien behandelt werden. Die bevorzugte Technologie für die chemische Induktion der Gen-Expression wird im Detail in der veröffentlichten Anmeldung EP 0 322 104 (an Ciba-Geigy) und US-Patent 5,614,395 dargestellt. Ein bevorzugter Promotor für die chemische Induktion ist der Tabak-PR-1a-Promotor.
Eine bevorzugte Kategorie von Promotoren ist diejenige, die Wund-induzierbar ist. Vielzählige Promotoren wurden beschrieben, die an Wundstellen exprimiert werden und ebenfalls an Stellen einer phyto-pathogenen Infektion. Idealerweise sollte ein solcher Promotor nur lokal an den Infektionsstellen aktiv sein, und auf diese Weise akkumulieren sich die Insektizid modifizierten Cry3A-Toxine nur in den Zellen, die das Insektizid modifizierte Cry3A-Toxin synthetisieren müssen um das eindringende Insektenungeziefer zu töten. Bevorzugte Promotoren dieser Art beinhalten diejenigen, die von Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215: 200–208 (1989), Xu et al., Plant Molec. Biol. 22: 573–588 (1993), Logemann et al., Plant Cell 1: 151–158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783–792 (1993), Firek et al., Plant Molec. Biol. 22: 129–142 (1993) und Warner et al., Plant J. 3: 191–201 (1993) beschrieben werden. Gewebe-spezifische oder Gewebe-bevorzugende Promotoren, die für die Expression der modifizierten cry3A-Toxin-Gene in Pflanzen nützlich sind, insbesondere Mais, sind diejenigen, die die Expression in Wurzeln, Mark, Blatt oder Pollen, insbesondere den Wurzeln steuern. Solche Promotoren, z. B. diejenigen von PEPC oder trpA isolierten, sind offenbart in US-Patent 5,625,136 oder MTL, offenbart in US-Patent 5,466,785 . Beide US-Patente werden hier durch Inbezugnahme in ihrer Gesamtheit inkorporiert.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind transgene Pflanzen, die die Nukleotidsequenzen in Wund-induzierbarer oder Pathogen-Infektions-induzierbarer Weise exprimieren.
Zusätzlich zu Promotoren ist eine Vielzahl von Transkriptionsterminatoren zur Verwendung in einem chimären Genkonstrukt unter Verwendung der modifizierten cry3A-Toxingene der vorliegenden Erfindung verfügbar. Transkriptionsterminatoren sind für die Termination der Transkription jenseits des Transgens und sein korrekte Polyadenylierung verantwortlich. Geeignete Transkriptionsterminatoren und diejenigen, von denen bekannt ist, daß sie in Pflanzen wirken, beinhalten den CaMV35S-Terminator, den tml-Terminator, den Nopalin-Synthaseterminator, den Erbsen-rbcS E9-Terminator und andere, die auf dem Gebiet bekannt sind. Diese können sowohl bei Mono- als auch Dicotyledonen verwendet werden. Jeder verfügbare Terminator, von dem bekannt ist, daß er in Pflanzen wirkt, kann im Kontext dieser Erfindung verwendet werden.
Vielzählige andere Sequenzen können in die Expressionskassetten, die in dieser Erfindung beschrieben werden, eingebaut werden. Diese beinhalten Sequenzen, von denen gezeigt wurde, daß sie die Expression verstärken wie beispielsweise Intronsequenzen (z. B. von AdhI und bronzeI) und virale Leadersequenzen (z. B. von TMV, MCMV und AMV).
Es kann bevorzugt werden, die Expression der Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung auf unterschiedliche zelluläre Stellungen in der Pflanze zu richten. In einigen Fällen kann die Lokalisierung im Cytosol wünschenswert sein, während in anderen Fällen die Lokalisierung in einer subzellulären Organelle bevorzugt werden kann. Eine subzelluläre Lokalisierung von transgen codierten Enzymen wird unter Verwendung von Techniken, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind, unternommen. Typischerweise wird die DNA, die das Zielpeptid codiert, von einem bekannten Organellen-Zielgen-Produkt, manipuliert und stromaufwärts von der Nukleotidsequenz fusioniert. Viele solcher Zielsequenzen sind für Chloroplasten bekannt und es wurde gezeigt, daß sie in heterologen Konstruktionen wirken. Die Expression der Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung wird auch auf das endo-plasmatische Retikulum oder die Vacuolen der Wirtszellen gerichtet. Techniken, um dieses zu erreichen, sind auf dem Gebiet wohl bekannt.
Für eine Pflanzentransformation geeignete Vektoren werden an anderer Stelle in der Beschreibung beschrieben. Für eine durch Agrobacterium vermittelte Transformation sind binäre Vektoren oder Vektoren, die mindestens eine T-DNA-Border-Sequenz tragen, geeignet, während für den direkten Gen transfer jeder Vektor geeignet ist und eine lineare DNA, enthaltend nur die Konstruktion von Interesse kann bevorzugt werden. Im Fall des direkten Gen-Transfers kann eine Transformation mit einer einzelnen DNA-Art oder eine Co-Transformation verwendet werden (Schorcher et al., Biotechnology 4: 1093–1096 (1986)). Sowohl für den direkten Gentransfer als auch für den durch Agrobacterium vermittelten Transfer wird die Transformation üblicherweise (aber nicht notwendigerweise) mit einem selektierbaren Marker durchgeführt, der eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum (Kanamycin, Hygromycin oder Methotrexat) oder einem Herbizid (Basta) verleihen kann. Pflanzentransformationsvektoren, die die modifizierten cry3A-Toxingene der vorliegenden Erfindung umfassen, können auch Gene (z. B. Phosphomannose-Isomerase; PMI) umfassen, die eine positive Selektion der transgenen Pflanzen bereitstellen, wie offenbart in US-Patenten 5,767,378 und 5,994,629 , hier durch Inbezugnahme enthalten. Die Wahl des selektierbaren Markers ist jedoch für die Erfindung nicht kritisch.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung direkt in das Plasmidgenom transformiert. Ein Hauptvorteil der Plastidtransformation ist derjenige, daß Plastide allgemein dazu in der Lage sind bakterielle Gene ohne substantielle Codon-Optimierung zu exprimieren und daß Plastide dazu in der Lage sind, multiple offene Leserahmen unter Kontrolle eines einzelnen Promotors zu exprimieren. Die Plastid-Transformationstechnologie wird ausführlich in US-Patenten 5,451,513 , 5,545,817 und 5,545,818 , in PCT-Anmeldung WO 95/16783 und in McBride et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301–7305 beschrieben. Die zugrundeliegende Technik für die Chloroplasten-Transformation involviert das Einführen von Regionen klovierter Plastid-DNA, die einen selektierbaren Marker flankieren, zusammen mit einem Gen von Interesse in ein geeignetes Zielgewebe, zum Beispiel unter Verwendung von Biolistics oder Protoplasten-Transformation (z. B. Calciumchlorid oder PEG-vermittelte Transformation). Die 1 bis 1,5 kb flankierenden Bereiche, die als Zielsequenzen bezeichnet werden, erleichtern eine homologe Rekombination mit dem Plastidgenom und ermöglichen so den Ersatz oder die Modifikation spezifischer Regionen des Plastoms. Anfänglich werden Punktmutationen der Chloroplasten 16S-rRNA und rps12-Genen, die eine Resistenz gegenüber Spectinomycin und/oder Streptomycin verleihen als selektierbare Marker für die Transformation verwendet (Z. Svab, P. Hajdukiewicz und P. Laliga (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526–8530; J. M. Staub und P. Maliga (1992), Plant Cell 4, 39–45). Dies führte zu stabilen homoplasmischen Transformanten mit einer Frequenz von ungefähr 1 pro 100 Bombardierungen von Zielblättern. Die Gegenwart von Klonierungsstellen zwischen diesen Markern ermöglichte eine Erzeugung eines Plastid-Targeting-Vektors zur Einführung von Fremdgenen (J. M. Staub und P. Maliga (1993), EMBO J. 12, 601–606). Substantielle Erhöhungen der Transformationsfrequenz werden durch Ersatz der rezessiven rRNA oder der r-Protein-Antibiotika-Resistenzgene durch einen dominant selektierbaren Marker erhalten, das bakterielle aadA-Gen, das das Spectinomycin-detoxifizierende Enzym Aminoglycosid-3'-adenyl-transferase codiert (Z. Svab und P. Maliga (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913–917). Früher wurde dieser Marker erfolgreich für eine Hochfrequenztransformation des Plastid-Genoms von der grünen Alge Chlamydomonas reinhardtii verwendet (M. Goldschmidt-Clermont (1991), Nucl. Acids Res. 19: 4083–4089). Andere selektierbare Marker, die für eine Plastid-Transformation nützlich sind, sind auf dem Gebiet bekannt und im Umfang dieser Erfindung enthalten. Typischerweise werden ungefähr 15–20 Zellteilungszyklen folgend auf die Transformation benötigt, um einen Homoplastidzustand zu erreichen. Die Plastid-Expression, worin Gene durch homologe Rekombination in alle der etlichen 1000 Kopien des zirkulären Plastid-Genoms inseriert werden, die in jeder Pflanzenzelle vorliegen, bedient sich in vorteilhafter Weise der enormen Kopiezahl gegenüber nukleär exprimierten Genen, um Expressionsniveaus zu ermöglichen, die leicht 10% des gesamten löslichen Pflanzenproteins überschreiten können. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in einen Plastid-Targetingvektor inseriert und in das Plastid-Genom der gewünschten Pflanzenwirtszelle transformiert. Pflanzen, die für Plastid-Genome homoplastisch sind, enthaltend eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, werden erhalten und sind vorzugsweise zu hoher Expression der Nukleotidsequenz in der Lage.
Kombination von Insekten-Kontrollbestandteilen
Die modifizierten Cry3A-Toxine der Erfindung können in Kombination mit Bt δ-Endotoxinen oder anderen Pestiziden Wirkstoffen verwendet werden um den Ungezieferzielbereich zu erhöhen. Weiterhin hat die Verwendung der modifizierten Cry3A-Toxine der Erfindung in Kombination mit Bt δ-Endotoxinen oder anderen Pestiziden Wirkstoffen einer unterschiedlichen Natur eine besondere Nützlichkeit für die Prävention und/oder des Management einer Insektenresistenz.
Andere insektizide Wirkstoffe beinhalten beispielsweise Lectine, α-Amylase, Peroxidase und Cholesterinoxidase. Vegetative insektizide Protein-Gene wie vip1A(a) und vip2A(a) wie offenbart in US-Patent 5,889,174 und hier durch Bezugnahme eingeschlossen, sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung nützlich.
Diese Co-Expression von mehr als einem insektiziden Wirkstoff in derselben transgenen Pflanze kann durch genetische Manipulation einer Pflanze erreicht werden, damit diese alle notwendigen Gene enthält und exprimiert. Alternativ kann eine Pflanze, Elternteil 1, genetisch für die Expression von Genen der vorliegenden Erfindung manipuliert werden. Eine zweite Pflanze, Elternteil 2, kann für die Expression eines zusätzlichen Insekten-Kontrollwirkstoffs genetisch manipuliert werden. Durch Kreuzen von Elternteil 1 mit Elternteil 2 werden Nachkommenpflanzen erhalten, die all die in die Eltern 1 und 2 eingeführten Gene exprimieren. Die transgene Saat der vorliegenden Erfindung kann auch mit einer insektiziden Saatbeschichtung wie beschrieben in den US-Patenten 5,849,320 und 5,876,739 , hier durch Inbezugnahme eingeschlossen, behandelt werden. Wenn sowohl die insektizide Saatbeschichtung als auch die transgene Saat der Erfindung gegen dasselbe Zielinsekt aktiv sind, ist die Kombination nützlich für (i) ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität eines modifizierten Cry3A-Toxins der Erfindung gegen das Zielinsekt und für (ii) ein Verfahren zur Verhinderung der Entwicklung der Resistenz gegen ein modifiziertes Cry3A-Toxin der Erfindung durch Bereitstellung eines zweiten Mechanismus der Wirkung gegen das Zielinsekt. So stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung der Aktivität gegen oder Verhinderung der Entwicklung von einer Resistenz bei einem Zielinsekt bereit, beispielsweise einem Maiswurzelbohrer, umfassend die Anwendung einer insektiziden Saatbeschichtung auf eine transgene Saat, umfassend ein oder mehr modifizierte Cry3A-Toxine der Erfindung.
Selbst wenn die insektizide Saatbeschichtung gegen ein unterschiedliches Insekt aktiv ist, ist die insektizide Saatbeschichtung nützlich um den Bereich der Insektenkontrolle zu vergrößern, beispielsweise durch Zufügung einer insektiziden Saatbeschichtung, die eine Aktivität gegen Lepidoptera-Insekten aufweist zu der transgenen Saat der Erfindung, die eine Aktivität gegen Coleoptera-Insekten aufweist, wobei die beschichtete transgene Saat, die erzeugt wurde, sowohl Lepidoptera- als auch Coleoptera-Insektenungeziefer kontrolliert.
Beispiele
Die Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die folgenden detaillierten Beispiele beschrieben. Diese Beispiele werden nur zu illustrativen Zwecken bereitgestellt und sollen nicht limitierend sein, wenn nicht anders angegeben. Standard-rekombinante DNA und molekulare Klonierungstechniken, die hier verwendet werden, sind auf dem Gebiet wohl bekannt und werden beschrieben von J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); von T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und von F. M. Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons Inc. (1988), Reiter et al., Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press (1992) und Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998).
Beispiel 1: Für Mais-optimierte cry3A-Genkonstruktion
Das Mais-optimierte cry3A-Gen wird gemäß dem im US-Patent 5,625,136 offenbarten Verfahren hergestellt. Bei diesem Verfahren werden von Mais bevorzugte Codons, d. h. jedes einzelne Codon, das besonders häufig eine bestimmte Aminosäure in Mais codiert, verwendet. Das von Mais bevorzugte Codon für eine bestimmte Aminosäure stammt von bekannten Gensequenzen von Mais ab. Die Mais-Codonverwendung für 28 Gene von Maispflanzen wird in Murray et al., Nucleic Acids Research 17: 477–498 (1989) gefunden. Die synthetische Sequenz, die mit den für Mais optimierten Codons hergestellt wurde, ist in SEQ ID NO: 3 dargestellt.
Beispiel 2: Identifikation von Cathepsin-G-enzymatischer Aktivität in dem Verdauungstrakt vom Westlichen Maiswurzelbohrer
Cathepsin G-ähnliche (Serinprotease) und Cathepsin B-ähnliche (Cysteinprotease) enzymatische Aktivitäten im Verdauungstrakt vom Westlichen Maiswurzelwurm, werden unter Verwendung kolorimetrischer Substrate gemessen. Jeweils 1 ml Reaktion enthält 5 homogenisierte mittlere Verdauungstrakte des 3. Nymphenstadiums des Westlichen Maiswurzelbohrers und 1 mg Substrat, gelöst in Reaktionspuffer (10 mm Tris, 5,0 mM NaCl, 0,01 M DTT, pH 7,5). Das getestete Cathepsin G-Substrat ist Ala-Ala-Pro-Phe (SEQ ID NO: 35)-pNA und das Cathepsin B-Substrat, ist Arg-Arg-pNA. Die Reaktionen werden bei 28°C für 1 h inkubiert. Die Intensität der gelben Farbbildung, die die Effizienz einer Protease anzeigt, das geeignete Substrat zu erkennen, wird bei Behandlungen vs. Kontrollen verglichen. Die Reaktionen werden als negativ (–) bewertet, wenn keine Farbe oder nur eine leichte Hintergrundfarbe nachgewiesen wird. Reaktionen, die 25%, 50%, 75% oder 100% oberhalb des Hintergrunds liegen, werden als +, ++, +++ bzw. ++++ bewertet.

Die Ergebnisse der enzymatischen Assays sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Tabelle 1

Reaktion	Produkt-Farbintensität
Nur WCR-Verdauungstrakt	–
Nur Cathepsin B-Substrat	–
Nur Cathepsin G-Substrat	–
WCR-Verdauungstrakt + Cathepsin B-Substrat	+
WCR-Verdauungstrakt + Cathepsin G-Substrat	+++

Dies ist das erste Mal, daß die Serinprotease Cathepsin G-Aktivität in dem Verdauungstrakt von Westlichen Maiswurzelbohrern identifiziert wurde. Der Verdauungstrakt von Westlichen Maiswurzelbohrern hat eine stärkere Cathepsin G, Serinprotease, Aktivität im Vergleich zu der Cathepsin B, Cysteinprotease, Aktivität. Die AAPF-Sequenz (SEQ ID NO: 35) wird als Cathepsin G-Protease-Erkennungsstelle zur Erzeugung modifizierter Cry3A-Toxine der vorliegenden Erfindung gewählt.
Beispiel 3: Konstruktion modifizierter cry3A-Gene
Modifizierte cry3A-Gene, umfassend eine Nukleotidsequenz, die die Cathepsin G-Erkennungsstelle in Domäne I, Domäne III oder Domäne I und Domäne III codiert, werden hergestellt unter Verwendung von überlappender PCR. Das für Mais optimierte cry3A-Gen (SEQ ID NO: 2), umfaßt im Plasmid pCIB6850 (SEQ ID NO: 5) wird als Startmatrize verwendet. 8 modifizierte cry3A-Genkonstrukte, die modifizierte Cry3A-Toxine codieren, werden hergestellt: cry3A054, cry3A055 und cry3A085, die die Cathepsin G-Erkennungsstelle-Codierungssequenz in Domäne I umfassen, cry3A058, cry3A082, die die Cathepsin G-Erkennungsstellen codierende Sequenz in Domäne III umfassen; cry3A056, cry3A057, cry3A083, die die Cathepsin G-Erkennungsstellen codiere Sequenz in Domäne I und III umfassen. Die acht modifizierten cry3A-Gene und die modifizierten Cry3A-Toxine, die sie codieren, werden wie folgt beschrieben:
cry3A054, umfaßt in pCMS054
cry3A054 (SEQ ID NO: 6) umfaßt eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert. Drei überlappende PCR-Primerpaare werden verwendet, um die Nukleotidsequenz, codierend die Cathepsin G-Erkennungsstelle, in das unmodifizierte Mais-optimierte cry3A zu inserieren:
Primerpaar 1 und Primerpaar 2 erzeugen zwei einzigartige PCR-Produkte. Diese Produkte werden dann in gleichen Teilen kombiniert und Primerpaar 3 wird verwendet um die Produkt zu verbinden, um ein PCR-Fragment zu erzeugen, das zurück in die ursprüngliche pCIB6850-Matrize kloniert wird. Das modifizierte cry3A054-Gen wird dann in pBluescript (Stratagene) übertragen., Das resultierende Plasmid wird als pCMS054 bezeichnet und umfaßt das cry3A054-Gen (SEQ ID NO: 6).
Das modifizierte Cry3A054-Toxin (SEQ ID NO: 7), codiert durch das modifizierte cry3A-Gen, umfaßt in pCMS054 hat eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, umfassend die Aminosäuresequenz AAPF (SEQ ID NO: 35), inseriert in Domäne 1 zwischen den Aminosäuren 107 und 113 des nicht-modifizierten Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 4). Die Cathepsin G-Erkennungsstelle ersetzt die natürlich auftretende Trypsin-Erkennungsstelle und befindet sich benachbart zu einer natürlich auftretenden Chymotrypsin-Erkennungsstelle.
cry3A055, umfaßt in pCMS055
cry3A055 (SEQ ID NO: 8) umfaßt eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert. Drei überlappende PCR-Primerpaare werden verwendet, um die Nukleotidsequenz, codierend die Cathepsin G-Erkennungsstelle, in das unmodifizierte Mais-optimierte cry3A zu inserieren:
Primerpaar 1 und Primerpaar 2 erzeugen zwei einzigartige PCR-Produkte. Diese Produkte werden dann in gleichen Teilen kombiniert und Primerpaar 3 wird verwendet um die Produkt zu verbinden, um ein PCR-Fragment zu erzeugen, das zurück in die ursprüngliche pCIB6850-Matrize kloniert wird. Das modifizierte cry3A055-Gen wird dann in pBluescript (Stratagene) übertragen. Das resultierende Plasmid wird als pCMS055 bezeichnet und umfaßt das cry3A055-Gen (SEQ ID NO: 8).
Das modifizierte Cry3A055-Toxin (SEQ ID NO: 9), codiert durch das modifizierte cry3A-Gen, umfaßt in pCMS055 hat eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, umfassend die Aminosäuresequenz AAPF (SEQ ID NO: 35), inseriert in Domäne 1 zwischen den Aminosäuren 107 und 111 des nicht-modifizierten Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 4). Die Cathepsin G-Erkennungsstelle befindet sich benachbart zu einer natürlichen Trypsin- und Chymotrypsin-Erkennungsstelle.
cry3A058, umfaßt in pCMS058
cry3A058 (SEQ ID NO: 14) umfaßt eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert. Drei überlappende PCR-Primerpaare werden verwendet, um die Nukleotidsequenz, codierend die Cathepsin G-Erkennungsstelle, in das unmodifizierte Mais-optimierte cry3A zu inserieren:
Primerpaar 1 und Primerpaar 2 erzeugen zwei einzigartige PCR-Produkte. Diese Produkte werden dann in gleichen Teilen kombiniert und Primerpaar 3 wird verwendet um die Produkt zu verbinden, um ein PCR-Fragment zu erzeugen, das zurück in die ursprüngliche pCIB6850-Matrize kloniert wird. Das modifizierte cry3A058-Gen wird dann in pBluescript (Stratagene) übertragen. Das resultierende Plasmid wird als pCMS058 bezeichnet und umfaßt das cry3A058-Gen (SEQ ID NO: 14).
Das modifizierte Cry3A058-Toxin (SEQ ID NO: 15), codiert durch das modifizierte cry3A-Gen, hat eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, umfassend die Aminosäuresequenz AAPF (SEQ ID NO: 35), inseriert in Domäne III zwischen den Aminosäuren 540 und 541 des nicht-modifizierten Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 4). Die Cathepsin G-Erkennungsstelle befindet sich innerhalb einer natürlich auftretenden Chymotrypsin-Erkennungsstelle.
cry3A082, umfaßt in pCMS082
cry3A082 (SEQ ID NO: 12) umfaßt eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert. Ein QuikChange-Site-Directed-Mutagenese-PCRPrimerpaar wird verwendet, um die Nukleotidsequenz, codierend die Cathepsin G-Erkennungsstelle, in das unmodifizierte Mais-optimierte cry3A zu inserieren:
Das Primerpaar erzeugt ein einzigartiges PCR-Produkt. Dieses Produkt wird zurück in die ursprüngliche pCIB6850-Matrize kloniert. Das modifizierte cry3A082-Gen wird dann in pBluescript (Stratagene) übertragen. Das resultierende Plasmid wird als pCMS082 bezeichnet und umfaßt das cry3A082-Gen (SEQ ID NO: 12).
Das modifizierte Cry3A082-Toxin(SEQ ID NO: 13), codiert durch das modifizierte cry3A-Gen, hat eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, umfassend die Aminosäuresequenz AAPF (SEQ ID NO: 35), inseriert in Domäne III zwischen den Aminosäuren 539 und 542 des nicht-modifizierten Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 4). Die Cathepsin G-Erkennungsstelle ersetzt eine natürlich auftretende Chymotrypsin-Erkennungsstelle.
cry3A056, umfaßt in pCMS056
cry3A056 (SEQ ID NO: 18) umfaßt eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert. Sechs überlappende PCR-Primerpaare werden verwendet, um zwei Cathepsin G-Erkennungsstellen in das unmodifizierte cry3A zu inserieren:
Primerpaar 1 und Primerpaar 2 erzeugen zwei einzigartige PCR-Produkte. Diese Produkte werden in gleichen Teilen kombiniert und Primerpaar 3 wird verwendet, um die Produkte zu verbinden, um ein PCR-Fragment zu erzeugen, das zurück in das ursprüngliche pCIB6850 Plasmid kloniert wird. Das modifizierte cry3A055-Gen wird dann in pBluescript (Stratagene) übertragen. Das resultierende Plasmid wird als pCMS055 bezeichnet. Primerpaar 4 und Primerpaar 5 erzeugen einen anderen einzig-artigen Satz von Fragmenten, die durch eine andere PCR mit Primerpaar 6 verbunden werden. Dieses Fragment wird in Domäne III des modifizierten cry3A055-Gens kloniert, umfaßt in pCMS055. Das resultierende Plasmid wird als pCMS056 bezeichnet und umfaßt das cry3A056-Gen (SEQ ID NO: 18).
Das modifizierte Cry3A056-Toxin (SEQID NO: 19), codiert durch das modifizierte cry3A-Gen, hat eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, umfassend die Aminosäuresequenz AAPF (SEQ ID NO: 35), inseriert in Domäne 1 zwischen den Aminosäuren 107 und 111 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren 540 und 541 des nicht-modifizierten Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 4). Die Cathepsin G-Erkennungsstelle befindet sich benachbart zu einer natürlich auftretenden Trypsin- und Chymotrypsin-Erkennungsstelle in Domäne 1 und liegt innerhalb einer natürlich auftretenden Chymotrypsin-Erkennungsstelle in Domäne III.
cry3A057, umfaßt in pCMS057
cry3A057 (SEQ ID NO: 16) umfaßt eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert. Sechs überlappende PCR-Primerpaare werden verwendet, um zwei Cathepsin G-Erkennungsstellen in das unmodifizierte cry3A zu inserieren:
Primerpaar 1 und Primerpaar 2 erzeugen zwei einzigartige PCR-Produkte. Diese Produkte werden in gleichen Teilen kombiniert und Primerpaar 3 wird verwendet, um die Produkte zu verbinden, um ein PCR-Fragment zu erzeugen, das zurück in das ursprüngliche pCIB6850 Plasmid kloniert wird. Das modifizierte cry3A054-Gen wird dann in pBluescript (Stratagene) übertragen. Das resultierende Plasmid wird als pCMS054 bezeichnet. Primerpaar 4 und Primerpaar 5 erzeugen einen anderen einzig-artigen Satz von Fragmenten, die durch eine andere PCR mit Primerpaar 6 verbunden werden. Dieses Fragment wird in Domäne III des modifizierten cry3A054-Gens kloniert, umfaßt in pCMS054. Das resultierende Plasmid wird als pCMS057 bezeichnet und umfaßt das cry3A057-Gen (SEQ ID NO: 16).
Das modifizierte Cry3A057-Toxin (SEQ ID NO: 17), codiert durch das modifizierte cry3A-Gen, hat eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, umfassend die Aminosäuresequenz AAPF (SEQ ID NO: 35), inseriert in Domäne 1 zwischen den Aminosäuren 107 und 113 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren 540 und 541 des nicht-modifizierten Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 4). Die Cathepsin G-Erkennungsstelle ersetzt eine natürlich auftretende Trypsin-Erkennungsstelle und befindet sich benachbart zu einer natürlich auftretenden Chymotrypsin-Erkennungsstelle in Domäne 1 und befindet sich innerhalb einer natürlichen Chymotrypsin-Erkennungsstelle in Domäne III.
cry3A083, umfaßt in pCMS083
cry3A083 (SEQ ID NO: 20) umfaßt eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert. Drei überlappende PCR-Primerpaare und ein Quik Change Site Directed Mutagenesis PCR Primerpaar werden verwendet, um zwei Cathepsin G-Erkennungsstellen in das unmodifizierte cry3A zu inserieren:
Primerpaar 1 und Primerpaar 2 erzeugen zwei einzigartige PCR-Produkte. Diese Produkte werden in gleichen Teilen kombiniert und Primerpaar 3 wird verwendet, um die Produkte zu verbinden, um ein PCR-Fragment zu erzeugen, das zurück in das ursprüngliche pCIB6850 Plasmid kloniert wird. Das modifizierte cry3A055-Gen wird dann in pBluescript (Stratagene) übertragen. Das resultierende Plasmid wird als pCMS055 bezeichnet. Primerpaar 4 erzeugt ein anderes einzigartige Fragment, das in Domäne III des modifizierten cry3A kloniert wird, umfaßt in pCMS055. Das resultierende Plasmid wird als pCMS083 bezeichnet und umfaßt das cry3A083-Gen (SEQ ID NO: 20).
Das modifizierte Cry3A083-Toxin (SEQ ID NO: 21), codiert durch das modifizierte cry3A-Gen, hat eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, umfassend die Aminosäuresequenz AAPF (SEQ ID NO: 35), inseriert in Domäne 1 zwischen den Aminesäuren 107 und 111 und in Domäne III zwischen den Aminosäuren 539 und 542 des nicht-modifizierten Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 4). Die Cathepsin G-Erkennungsstelle befindet sich benachbart zu einer natürlich auftretenden Typsin- und Chymotrypsin-Erkennungsstelle in Domäne 1 und ersetzt eine natürlich auftretende Chymotrypsin-Erkennungsstelle in Domäne III.
cry3A085 umfaßt in pCMS085
Das cry3A085-Gen (SEQ ID NO: 10) umfaßt eine Cathepsin G-codierende Sequenz an derselben Position wie in dem oben beschriebenen cry3A055-Gen. Das cry3A085-Gen hat zusätzlich 24 Nukleotide, die am 5'-Ende inseriert sind, die die Aminosäuren 41 bis 47 der deduzierten Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 codieren wie außerdem ein zusätzliches Methionin. Die zusätzlichen Nukleotide werden am 5'-Ende des cry3A055-Gens unter Verwendung des folgenden PCR-Primerpaares inseriert:
Das modifizierte Cry3A085-Toxin (SEQ ID NO: 11), codiert durch das modifizierte cry3A-Gen hat eine Cathepsin G-Erkennungsstelle, umfassend die Aminosäuresequenz AAPF (SEQ ID NO: 35), inseriert in Domäne 1 zwischen Aminosäuren, die zu 107 und 111 des nicht-modifizierten Cry3A-Toxins (SEQ ID NO: 4) korrespondieren und weist zusätzliche 8 Aminosäurereste am N-Terminus auf, wovon der zweite Rest zu der Aminosäure Nr. 41 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 korrespondiert.
Beispiel 4: Insektizide Aktivität der modifizierten Cry3A-Toxine
Modifizierte Cry3A-Toxine werden im Hinblick auf ihre insektizide Aktivität gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer, den Nördlichen Maiswurzelbohrer und den Südlichen Maiswurzelbohrer in Insektenbioassays getestet. Die Bioassays werden unter Verwendung eines Diäteinbauverfahrens durchgeführt. E. coli-Klone, die eins der modifizierten Cry3A-Toxine der Erfindung exprimieren werden über Nacht gezüchtet. 500 μl einer Übernacht-Kultur werden beschallt und dann mit 500 μl einer geschmolzenen künstlichen Diät (Marrone et al. (1985), J. of Economic Entomology 78: 290–293) vermischt. Sobald die Diät sich verfestigt wird sie in eine Petrischale ausgegeben und 20 neugeborene Maiswurzelbohrer werden auf die Diät plaziert. Die Petrischalen werden bei 30°C gehalten. Die Mortalität wird nach 6 Tagen aufgezeichnet. Alle modifizierten Cry3A-Toxine lösen 50 bis 100% Mortalität gegenüber dem Westlichen und Nördlichen Maiswurzelbohrer aus, während das nicht-modifizierte Cry3A-Toxin 0 bis 30% Mortalität auslöst. Keines der modifizierten Cry3A-Toxine hat eine Aktivität gegen den Südlichen Maiswurzelbohrer.
Beispiel 5: Erzeugung transgener Maispflanzen, umfassen modifizierte cry3A-codierende Sequenzen
Drei modifizierte cry3A-Gene, cry3A055, repräsentativ für eine Domänen I-Modifikation, cry3A058, repräsentativ für eine Domänen III-Modifikation und cry3A056, repräsentativ für eine Domäne I- und Domäne III-Modifikation werden zur Transformation in Maispflanzen gewählt. Eine Expressionskassette, umfassend eine modifizierte cry3A-codierende Sequenz wird in einem geeigneten Vektor für eine von Agrobacterium vermittelte Maistransformation übertragen. Für dieses Beispiel umfaßt eine Expressionskassette eine Addition zu dem modifizierten cry3A-Gen, den MTL-Promotor ( US-Patent 5,466,785 ) und den nos-Terminator, der auf dem Gebiet bekannt ist.
Die Transformation unreifer Maisembryos wird im wesentlichen wie in Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798–803 durchgeführt. Für dieses Beispiel sind alle Medienbestandteile wie in Negrotto et al., supra, beschrieben. Verschiedene Medienbestandteile, die auf dem Gebiet bekannt sind, können jedoch ersetzt werden.
Die für die Transformation verwendeten Gene werden in einen für eine Maistransformation geeigneten Vektor kloniert. Die in diesem Beispiel verwendeten Vektoren enthalten das Phosphomannoseisomerase (PMI)-Gen für eine Selektion transgener Linien (Negrotto et al. (2000), Plant Cell Reports 19: 798–803).
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404 (pSB1), der das Pflanzentransformationsplasmid enthält, wird auf YEP (Hefeextrakt (5 g/l), Pepton (10 g/l), NaCl (5 g/l), 15 g/l Agar, pH 6,8)-Festmedium für 2–4 Tage bei 28°C gezüchtet. Ungefähr 0,8 × 10⁹ Agrobacterium werden in LS-inf-Medien suspendiert, supplementiert mit 10 μM As (Negrotto et al. (2000), Plant Cell Rep. 19: 798–803). Die Bakterien werden in diesem Medium für 30 bis 60 Minuten präinduziert.
Unreife Embryos von A188 oder einem anderen geeigneten Genotyp werden aus 8 bis 12 Tage alten Ähren ausgeschnitten, in flüssige LS-inf+100 μM As. Die Embryos werden einmal mit frischen Infektionsmedium gespült. Agrobacterium-Lösung wird dann zugefügt und die Embryos werden 30 Sekunden mit einem Vortex behandelt und man läßt sie sich mit den Bakterien 5 Minuten absetzen. Die Embryos werden dann mit der Scutellum-Seite nach oben in LSAs-Medium übertragen und sie werden im Dunkeln 2 bis 3 Tage kultiviert. Darauffolgend werden 20 bis 25 Embryos pro Petrischale in LSDc-Medium, supplementiert mit Cefotaxim (250 mg/l) und Silbernitrat (1,6 mg/l) übertragen und im Dunkeln 10 Tage bei 28°C kultiviert.
Unreife Embryos, die embryogene Kallus erzeugen, werden in LSDlM0, 5S-Medium übertragen. Die Kulturen werden auf diesem Medium für 6 Wochen mit einem Subkulturschritt alle 3 Wochen selektiert.
Überlebende Calli werden in RegI-Medium übertragen, das mit Mannose supplementiert ist. Folgend auf eine Kultivierung in Licht (16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkel-Wechsel) werden die grünen Gewebe dann in Reg2-Medium ohne Wachstumsregulatoren übertragen und 1 bis 2 Wochen inkubiert. Kleine Pflänzchen werden auf Magenta GA-7-Boxen (Magenta Corp, Chicago III) enthaltend Reg3-Medium übertragen und in Licht gezüchtet. Nach 2 bis 3 Wochen werden die Pflanzen im Hinblick auf die Gegenwart der PMI-Gene und der modifizierten cry3A-Gene durch PCR getestet. Aus dem PCR-Assay positive Pflanzen werden in ein Gewächshaus übertragen und im Hinblick auf ihrer Resistenz gegenüber dem Maiswurzelbohrer getestet.
Beispiel 6: Analyse der transgenen Maispflanzen
Maiswurzelbohrereffizienz
Wurzelexzisions-Bioassay
Proben von Pflanzen werden genommen, wie sie sind, transplantiert von Magenta GA-7-Boxen in Erde. Dies ermöglicht es den Wurzeln, als Proben aus einer vernünftig sterilen Umgebung im Vergleich zu Erdbedingungen genommen zu werden. Das Probennehmen besteht aus dem Schneiden kleiner Stücke der Wurzeln (ca. 2 bis 4 cm lang) und dem Plazieren derselben auf angereichertem Phytagar (12 g Phytagar, 9 g Saccharose, 3 ml MS-Salze, 3 ml MS-Vitamine, 3 ml (Nystatin (25 mg/ml), 7 ml Cefotaxim (50 mg/ml), 7 ml Aureomycin (50 mg/ml), 7 ml Streptomycin (50 mg/ml), 600 ml dH₂O) in einer kleinen Petrischale. Negative Kontrollen sind entweder transgene Pflanzen, die für das modifizierte cry3A-Gen aus denselben Experimenten PCR negativ waren oder von nicht-transgenen Pflanzen (derselben Größe wie die Testpflanzen), die in dem Phytotron gezüchtet wurden. Wenn Kontrollwurzeln aus der Erde als Proben genommen werden, werden die Wurzelproben mit Wasser gewaschen, um Erdreste zu entfernen, in Nystatin-Lösung (5 mg/ml) eingetaucht, aus der Eintauchlösung entfernt, mit Papiertüchern trockengetupft und in einer Phytagar-Schale plaziert.
Wurzelproben werden mit Westlichen Maiswurzelbohrern inokuliert, indem 10 erste Nymphenstadien auf die innere Oberfläche des Deckels jeder Phytagarschale plaziert werden und die Deckel dann dicht wieder versiegelt werden. Die Larven werden unter Verwendung eines feinen spitzen Malpinsels behandelt. Nachdem alle Schalen inokuliert wurden, wird das Tablett mit den Schalen im Dunkeln bei Raumtemperatur bis zur Sammlung der Daten plaziert.
3 bis 4 Tage nach der Inokulation werden die Daten gesammelt. Die prozentuale Mortalität der Larven wird zusammen mit einer visuellen Schadensbewertung der Wurzel berechnet. Der Futterschaden wird als hoch bewertet, moderat, niedrig oder nicht vorliegend und mit einem numerischen Wert von 3, 2, 1 oder 0 versehen. Wurzelproben, die mindestens 40% Mortalität und eine Schadenbewertung von 2 oder weniger aufweisen, werden als positiv betrachtet.

Die Ergebnisse in der folgenden Tabelle zeigen, daß Pflanzen, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin exprimieren, 40–100% Mortalität gegenüber dem Westlichen Maiswurzelbohrer auslösen, während Kontrollpflanzen 0 bis 30% Mortalität erzeugen. Außerdem erleben die Pflanzen, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin exprimieren signifikant weniger Futterschaden als Kontrollpflanzen. Tabelle 2

T0	Modifiziertes	Prozentuale Mortalität pro					Mittlere Scha
Ereignis	Cry3A-Toxin wie	Pflanze					densbewertung
	exprimiert						pro Ereignis
		A	B	C	D	E
240A7	Cry3A055	80	40	80	60		0,8
240B2	Cry3A055	60	60	60	80		1,25
240B9	Cry3A055	40	60	60	100		1
240B10	Cry3A055	80	40	60	60		1
240A15	Cry3A055	80	60	50	70	70	0,6
240A5	Cry3A055	60	80	60			0,33
240A9	Cry3A055	50	60	60	70	70	1,6
244A4	Cry3A058	50					1
244A7	Cry3A058	40	40	60			1,3
244A5	Cry3A058	50					1
244B7	Cry3A058	90					1
244B6	Cry3A058	50	40	60			1
243A3	Cry3A056	50	90	80	60		1,25
243A4	Cry3A056	50	80	60			1,7
243B1	Cry3A056	80	90				0,5
243B4	Cry3A056	70	60	50	80		1,5
245B2	Cry3A056	90	50	70	60		1
WTI	-	0	10	20	10	0	2,6
WT2	-	0	30	0	0	20	2,8

Gesamtpflanzen-Bioassay
Einige positive Pflanzen, die unter Verwendung des Wurzelexzisions-Bioassays, wie oben beschrieben, identifiziert wurden, werden im Hinblick auf eine Westliche Maiswurzelbohrer-Resistenz unter Verwendung eines Gesamtpflanzen-Bioassays bewertet. Die Pflanzen werden im allgemeinen innerhalb von 3 Tagen mit den Schädlingen befallen, nachdem der Wurzelexzisions-Assay abgeschlossen wurde.
Westliche Maiswurzelbohrereier werden präinkubiert, so daß das Ausschlüpfen 2 bis 3 Tage nach der Pflanzeninokulation auftritt. Die Eier werden in 0,2% Agar suspendiert und auf die Erde um die Testpflanzen aufgebracht, mit ungefähr 200 Eiern pro Pflanze.
Zwei Wochen nach dem Ausschlüpfen aus den Eiern werden die Pflanzen im Hinblick auf die Schäden bewertet, die durch die Westlichen Maiswurzelbohrerlarven ausgelöst werden. Die erreichte Pflanzenhöhe, eine Standfestigkeit und Wurzelmasse sind Kriterien, die verwendet werden, um zu bestimmen, ob Pflanzen gegenüber einem Futterschaden durch Westlichen Maiswurzelbohrer resistent sind. Zum Zeitpunkt der Bewertung sind die Kontrollpflanzen typischerweise kleiner als modifizierte Cry3A-Pflanzen.
Außerdem sind nicht-transgene Kontrollpflanzen und Pflanzen, die das nicht-modifizierte Cry3A-Toxin exprimieren, codiert durch das Mais-optimierte cry3A-Gen während dieser Zeit aufgrund eines schweren Befalls (pruning) der meisten Wurzeln festgewachsen, was zu keinerlei Wurzelmasseanhäufung führt.
Zum Zeitpunkt der Bewertung sind Pflanzen, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin der Erfindung exprimieren, größer als Kontrollpflanzen, sind nicht festgewachsen und haben eine große intakte Wurzelmasse aufgrund der insektiziden Aktivität des modifizierten Cry3A-Toxins.
ELISA-Assay

ELISA-Analyse gemäß dem im US-Patent 5,625,136 offenbarten Verfahren wird für die quantitative Bestimmung des Niveaus des modifizierten und nicht-modifizierten Cry3A-Proteins in transgenen Pflanzen verwendet. Tabelle 3: Gesamtpflanzen-Bioassayergebnisse und Proteinniveaus

Transgene	Typ des exprimierten	Cry3A-Protein	Festge	Intakte
Maispflanze	Cry3A-Toxins	niveau in	wachsene	Wurzel
		Wurzeln (ng/mg)	Pflanzen	masse
240A2E	modifiziert, Cry3A055	224	–	+
240A9C	modifiziert, Cry3A055	71	–	+
240B9D	modifiziert, Cry3A055	204	–	+
240B9E	modifiziert, Cry3A055	186	–	+
240B10D	modifiziert, Cry3A055	104	–	+
240B10E	modifiziert, Cry3A055	70	–	+
240A15E	modifiziert, Cry3A055	122	–	+
240B4D	modifiziert, Cry3A055	97	–	+
243B5A	modifiziert, Cry3A056	41	–	+
244A7A	modifiziert, Cry3A058	191	–	+
710-2-51	für Mais optimiert	39	+	–
710-2-54	für Mais optimiert	857	+	–
710-2-61	für Mais optimiert	241	+	–
710-2-67	für Mais optimiert	1169	+	–
710-2-68	für Mais optimiert	531	+	–
710-2-79	für Mais optimiert	497	+	–
710-2-79	für Mais optimiert	268	+	–
WT1-	-	0	+	–
Kontrolle
WT2-	-	0	+	–
Kontrolle

Sequenzprotokoll

Claims

Modifiziertes Cry3A-Toxin, umfassend eine nicht natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle, wobei die Protease-Erkennungsstelle ein Cry3A-Toxin modifiziert und an einer Position lokalisiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Position zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 107 und 115 von SEQ ID NO: 4, b) einer Position zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 536 und 542 von SEQ ID NO: 4 und c) einer Position zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 107 und 115 von SEQ ID NO: 4 und zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 536 und 542 von SEQ ID NO: 4; wobei die Protease-Erkennungsstelle durch eine Verdauungstraktprotease des Westlichen Maiswurzelbohrers (Diabrotica virgifera virgifera) erkennbar ist, und wobei das modifizierte Cry3A-Toxin eine höhere Mortalität auf Westlichen Maiswurzelbohrer auslöst als die durch das Cry3A-Toxin ausgelöste Mortalität auf Westlichen Maiwurzelbohrer in einem künstlichen Diätbioassay.
Modifiziertes Cry3A-Toxin gemäß Anspruch 1, wobei die Verdauungstraktprotease eine Serinprotease ist.
Modifiziertes Cry3A-Toxin gemäß Anspruch 2, wobei die Verdauungstraktprotease Cathepsin G ist.
Modifiziertes Cry3A-Toxin gemäß Anspruch 1, wobei die Protease-Erkennungsstelle (i) zwischen Aminosäuren Nrn. 107 und 115 von SEQ ID NO: 4 oder (ii) zwischen Aminosäuren Nrn. 536 und 542 von SEQ ID NO: 4 oder (iii) zwischen Aminosäuren Nrn. 107 und 155 und zwischen Aminosäuren Nrn. 536 und 542 von SEQ ID NO: 4 lokalisiert ist.
Modifiziertes Cry3A-Toxin gemäß Anspruch 1, wobei die Protease-Erkennungsstelle (i) zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 107 und 113 von SEQ ID NO: 4 oder (ii) zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 107 und 111 von SEQ ID NO: 4 oder (iii) zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 536 und 541 von SEQ ID NO: 4 oder (iv) zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 oder (v) zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 107 und 113 von SEQ ID NO: 4 und zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 oder (vi) zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 107 und 111 von SEQ ID NO: 4 und zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 536 und 541 von SEQ ID NO: 4 oder (vii) zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 107 und 111 von SEQ ID NO: 4 und zwischen Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 lokalisiert ist.
Modifiziertes Cry3A-Toxin gemäß Anspruch 5, wobei die Protease-Erkennungsstelle (i) zwischen Aminosäuren Nrn. 107 und 113 von SEQ ID NO: 4 oder (ii) zwischen Aminosäuren Nrn. 107 und 111 von SEQ ID NO: 4 oder (iii) zwischen Aminosäuren Nrn. 536 und 541 von SEQ ID NO: 4 oder (iv) zwischen Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 oder (v) zwischen Aminosäuren Nrn. 107 und 113 von SEQ ID NO: 4 und zwischen Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 oder (vi) zwischen Aminosäuren Nrn. 107 und 111 von SEQ ID NO: 4 und zwischen Aminosäuren Nrn. 536 und 541 von SEQ ID NO: 4 oder (vii) zwischen Aminosäuren Nrn. 107 und 111 von SEQ ID NO: 4 und zwischen Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 lokalisiert ist.
Modifiziertes Cry3A-Toxin gemäß Anspruch 1, wobei das modifizierte Cry3A-Toxin mindestens 50% Mortalität auf Westlichen Maiswurzelbohrer auslöst, wobei das Cry3A-Toxin bis zu 30% Mortalität auslöst.
Modifiziertes Cry3A-Toxin gemäß Anspruch 1, das (i) durch die Nukleotide 7-1791 von SEQ ID NO: 6, Nukleotide 1-1806 von SEQ ID NO: 8, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 10, Nukleotide 1-1794 von SEQ ID NO: 12, Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 14, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 16, Nukleotide 1-1791 von SEQ ID NO: 18 oder Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 20 codiert wird oder (ii) die Aminosäuresequenz umfaßt wie dargestellt in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21.
Modifiziertes Cry3A-Toxin gemäß Anspruch 1, das gegen den Nördlichen Maiswurzelbohrer (Diabrotica barberi) aktiv ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin gemäß Anspruch 1 codiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 10, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9 codiert.
Modifiziertes cry3A-Gen, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert, umfassend eine nicht natürlich auftretende Protease-Erkennungsstelle, wobei das modifizierte cry3A-Gen eine Codierungssequenz umfaßt, die die Protease-Erkennungsstelle codiert, wobei die Codierungssequenz ein cry3A-Gen modifiziert und an einer Position inseriert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Position zwischen den Codons, die die Aminosäuren codieren, korrespondierend zu den Aminosäuren Nrn. 107 und 115 von SEQ ID NO: 4, b) einer Position zwischen den Codons, die die Aminosäuren codieren, korrespondierend zu den Aminosäuren Nrn. 536 und 542 von SEQ ID NO: 4 und c) einer Position zwischen den Codons, die die Aminosäuren codieren, korrespondierend zu den Aminosäuren Nrn. 107 und 115 von SEQ ID NO: 4 und einer Position zwischen den Codons, die die Aminosäuren codieren, korrespondierend zu den Aminosäuren Nrn. 536 und 542 von SEQ ID NO: 4; wobei die Protease-Erkennungsstelle durch eine Verdauungstraktprotease des Westlichen Maiswurzelbohrers erkennbar ist, und wobei das modifizierte Cry3A-Toxin eine höhere Mortalität auf Westlichen Maiswurzelbohrer auslöst als die durch das Cry3A-Toxin ausgelöste Mortalität auf Westlichen Maiwurzelbohrer in einem künstlichen Diätbioassay.
Modifiziertes cry3A-Gen gemäß Anspruch 12, wobei die Verdauungstraktprotease eine Serinprotease ist.
Modifiziertes cry3A-Gen gemäß Anspruch 13, wobei die Verdauungstraktprotease Cathepsin G ist.
Modifiziertes cry3A-Gen gemäß Anspruch 12, worin (i) die Nukleotidsequenz die Nukleotide 7-1791 von SEQ ID NO: 6, Nukleotide 1-1806 von SEQ ID NO: 8, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 10, Nukleotide 1-1794 von SEQ ID NO: 12, Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 14, Nukleotide 1-1812 von SEQ ID NO: 16, Nukleotide 1-1791 von SEQ ID NO: 18 oder Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 20 umfaßt oder (ii) das modifizierte Cry3A-Toxin die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 umfaßt.
Modifiziertes cry3A-Gen gemäß Anspruch 12, wobei das modifizierte Cry3A-Toxin gegen den Nördlichen Maiswurzelbohrer (Diabrotica barberi) aktiv ist.
Transgene Maispflanze, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin gemäß Anspruch 1 codiert, wobei die transgene Pflanze das modifizierte Cry3A-Toxin im Wurzelgewebe auf einem Niveau exprimiert, das eine Mortalität auf den Westlichen Maiswurzelbohrer auslöst.
Transgene Maispflanze, umfassend ein modifiziertes cry3A-Gen, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes Cry3A-Toxin codiert, wobei das modifizierte cry3A-Gen wie in Anspruch 12 definiert ist, wobei die transgene Pflanze das modifizierte Cry3A-Toxin im Wurzelgewebe auf einem Niveau exprimiert, das eine Mortalität auf den Westlichen Maiswurzelbohrer auslöst.
Transgene Maispflanze gemäß Anspruch 18, wobei die Protease-Erkennungsstelle (i) zwischen den Aminosäuren Nrn. 107 und 111 von SEQ ID NO: 4 oder (ii) zwischen den Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 oder (iii) zwischen den Aminosäuren Nrn. 107 und 111 von SEQ ID NO: 4 und zwischen den Aminosäuren Nrn. 540 und 541 von SEQ ID NO: 4 lokalisiert ist.
Transgene Maispflanze gemäß Anspruch 17 oder 18, worin (i) die Nukleotidsequenz die Nukleotide 1-1806 von SEQ ID NO: 8, Nukleotide 1-1818 von SEQ ID NO: 14 oder Nukleotide 1-1791 von SEQ ID NO: 18 umfaßt oder (ii) das modifizierte Cry3A-Toxin die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 19 umfaßt.
Transgene Maispflanze gemäß Anspruch 17, wobei das Wurzelgewebe 40% Mortalität auf Westlichen Maiswurzelbohrer auslöst.
Transgene Maispflanze gemäß Anspruch 17, wobei die transgene Pflanze das modifizierte Cry3A-Toxin auf einem ausreichenden Niveau exprimiert, um (i) den Westlichen Maiswurzelbohrer daran zu hindern, die Wurzeln der transgenen Pflanze deutlich zu reduzieren oder (ii) den Westlichen Maiswurzelbohrer-Ernährungsschaden daran zu hindern, daß die Pflanze steckenbleibt.
Verfahren zur Kontrolle des Befalls von Maispflanzen durch den Westlichen Maiswurzelbohrer, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Bereitstellung der transgenen Maispflanze gemäß Anspruch 17 und (b) Kontaktieren des Westlichen Maiswurzelbohrers mit der Pflanze.
Verfahren zur Erzeugung eines modifizierten Cry3A-Toxins, umfassend: (a) Erhalt eines transgenen bakteriellen Wirtszelle, umfassend ein chimäres Konstrukt, umfassend eine heterologe Promotorsequenz, die an die Nukleinsäure von Anspruch 10 operativ gebunden ist; (b) Kultivieren der transgenen Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des modifizierten Cry3A-Toxins ermöglichen und (c) Gewinnen des exprimierten modifizierten Cry3A-Toxins.
Verfahren zur Erzeugung insektenresistenter Pflanzen, umfassend: (a) stabile Integration des Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 10 in das Genom von Pflanzenzellen und (b) Regeneration stabil transformierter Pflanzen von den transformierten Pflanzenzellen, wobei die stabil transformierten Pflanzen eine effektive Menge eines modifizierten Cry3A-Toxins exprimieren, um die transformierte Pflanze gegenüber mindestens dem Westlichen Maiswurzelbohrer resistent zu machen.
Verfahren zur Kontrolle von mindestens dem Westlichen Maiswurzelbohrer, umfassend die orale Zufuhr zu dem Westlichen Maiswurzelbohrer einer effektiven Menge eines Toxins gemäß Anspruch 1.
Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Cry3A-Toxins, umfassend: (a) Erhalt eines cry3A-Gens, das ein Cry3A-Toxin codiert; (b) Identifizieren einer Verdauungstraktprotease des Westlichen Maiswurzelbohrers; (c) Erhalt einer Nukleotidsequenz, die eine Erkennungsstelle für die Verdauungstraktprotease codiert; (d) Insertion des Nukleotidsequenz in das cry3A-Gen, so daß die Erkennungsstelle in dem Cry3A-Toxin an einer Position zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 107 und 115 von SEQ ID NO: 4 oder einer Position zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 536 und 542 von SEQ ID NO: 4 oder einer Position zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 107 und 115 von SEQ ID NO: 4 und zwischen den Aminosäuren korrespondierend zu Aminosäuren Nrn. 536 und 542 von SEQ ID NO: 4 lokalisiert ist, wodurch ein modifiziertes cry3A-Gen erzeugt wird; (e) Insertion des modifizierten cry3A-Gens in eine Expressionskassette und (f) Transformation der Expressionskassette in eine nicht-menschliche Wirtszelle, wobei die Wirtszelle ein modifiziertes Cry3A-Toxin erzeugt.
Chimäres Konstrukt, umfassend eine heterologe Promotorsequenz operativ gebunden an (i) das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 10 oder (ii) das modifizierte cry3A-Gen von Anspruch 12.
Rekombinanter Vektor umfassend das chimäre Konstrukt gemäß Anspruch 28.
Transgene nicht-menschliche Wirtszelle umfassend das chimäre Konstrukt gemäß Anspruch 28.
Transgene Wirtszelle gemäß Anspruch 30, wobei es sich um eine bakterielle oder eine Pflanzenzelle handelt.
Transgene Pflanze, umfassend die transgene Pflanzenzelle gemäß Anspruch 31.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 32, wobei die Pflanze eine Maispflanze ist.
Transgene Maispflanze gemäß einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei es sich um eine (i) Inzuchtpflanze oder (ii) eine Hybridpflanze handelt.
Transgene Saat von der transgenen Pflanze gemäß Anspruch 32 oder der transgenen Maispflanze von Anspruch 33 oder 34.
Zusammensetzung, umfassend eine effektive Menge des Toxins gemäß Anspruch 1, um eine Mortalität auf Westlichen Maiswurzelbohrer auszulösen.