RU2590708C2

RU2590708C2 - Инсектицидные cry-токсины dig-3

Info

Publication number: RU2590708C2
Application number: RU2011146535/10A
Authority: RU
Inventors: Джастин ЛИРА; Холли БАТЛЕР; Дуг СМИТ; Кеннет НАРВА; Томас МИД
Original assignee: ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи
Priority date: 2009-04-17
Filing date: 2010-03-24
Publication date: 2016-07-10
Also published as: KR20140014371A; AR076537A1; AU2010236944A1; US20130219570A1; AU2010236944A2; CA2758885A1; US9006520B2; ES2532145T3; EP2419441A1; WO2010120452A1; JP5873005B2; CL2011002585A1; JP2012524086A; US8304604B2; NZ595734A; CN102459315A; CN102459315B; MX2011010967A; DK2419441T3; ZA201107475B

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному полипептиду, обладающему инсектицидной активностью, нуклеиновой кислоте его кодирующей, а также к конструкции ДНК, содержащей вышеуказанную нуклеиновую кислоту. Также изобретение относится к трансгенному растению, устойчивому к воздействию насекомых группы Lepidoptera, а также к клетке овощного растения или кукурузы. Кроме того, раскрыт способ уменьшения популяции насекомого группы Lepidoptera с использованием вышеуказанного полипептида. Изобретение позволяет эффективно бороться с насекомыми группы Lepidoptera. 11 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 табл., 10 пр.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной патентной заявке США № 61/170189, поданной 17 апреля 2009 года, включенной в качестве ссылки в настоящий документ.

Область изобретения

Данное изобретение относится к новым инсектицидным Cry-токсинам и их применению для контроля насекомых.

Предпосылки изобретения

Bacillus thuringiensis (B.t.) является передающейся через почву бактерией, продуцирующей пестицидные кристаллические белки, известные как дельта-эндотоксины или Cry-белки. Cry-белки являются пероральными интоксикантами, действующими на клетки средней кишки восприимчивых насекомых. Подробный список дельта-эндотоксинов сохраняют и регулярно обновляют на http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html.

Мотылек кукурузный (ECB) Ostrinia nubilalis (Hϋbner) является наиболее вредоносным насекомым-вредителем кукурузы на всем протяжении Соединенных Штатов и Канады и вызывает потерю приблизительно 1 миллиарда долларов дохода каждый год по причине потери урожая и расходов на способы воздействия на насекомых-вредителей (Witkowski et al., 2002). Трансгенная кукуруза, экспрессирующая гены, кодирующие Cry-белки, прежде всего, Cry1Ab, Cry1Ac или Cry1F, обеспечивает коммерческие уровни эффективности против ECB.

Несмотря на успех ECB-устойчивой трансгенной кукурузы, возможность развития устойчивых популяций насекомых угрожает долговременной стойкости Cry-белков в контроле ECB и создает потребность обнаруживать и разрабатывать новые Cry-белки для контроля ECB и других насекомых-вредителей. Устойчивость насекомых к Cry-белкам B.t. может развиваться несколькими механизмами (Heckel et al., 2007, Pigott and Ellar, 2007). У насекомых идентифицировали многочисленные классы рецепторных белков для Cry-белков, и существуют многочисленные примеры в каждом классе рецепторов. Может развиваться устойчивость к конкретному Cry-белку, например, посредством мутации в токсин-связывающей части кадгеринового домена рецепторного белка. Дополнительные механизмы устойчивости могут опосредоваться через протоксин-процессирующую протеазу. Таким образом, устойчивость к Cry-токсинам в видах Lepidoptera обладает комплексной генетической основой, по меньшей мере, с четырьмя отдельными основными генами устойчивости. На практике устойчивость насекомых Lepidoptera к Cry-белкам развивается в видах Plutella xylostella (Tabashnik, 1994), Trichoplusia ni (Janmaat and Myers 2003, 2005) и Helicoverpa zea (Tabashnik et al., 2008). Разработка новых высокопотенциальных Cry-белков будет предоставлять дополнительные инструменты для воздействия на ECB и других насекомых-вредителей. Продуцируемые в трансгенной кукурузе в сочетании Cry-белки с различными способами действия будут предотвращать развитие устойчивости насекомых ECB и обеспечивать долговременную полезность технологии B.t. для контроля насекомых-вредителей.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к инсектицидным Cry-токсинам, включая токсин, обозначаемый в настоящем документе как DIG-3, а также вариантам DIG-3, нуклеиновым кислотам, кодирующим данные токсины, способам контроля насекомых-вредителей с применением токсинов, способам получения токсинов в трансгенных клетках-хозяевах, и трансгенным растениям, продуцирующим токсины. Предсказанная аминокислотная последовательность токсина DIG-3 дикого типа указана в SEQ ID NO: 2.

Как описано в Примере 1, нуклеиновую кислоту, кодирующую белок DIG-3, выделяют из штамма B.t., обозначаемого внутри Dow AgroSciences LLC как PS46L. Определяли последовательность нуклеиновой кислоты для полноразмерной кодирующей области и из последовательности нуклеиновой кислоты делали вывод о последовательности полноразмерного белка. Токсин DIG-3 обладает некоторым сходством с Cry1BII (образец в GenBank № AAM93496) и другими белками типа Cry1B B. thuringiensis (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html).

Инсектицидно активные варианты токсина DIG-3 также описывают в настоящем документе и собирательно обозначают как токсины DIG-3.

Токсины DIG-3 также можно применять в сочетании со способами РНКи для контроля других насекомых-вредителей. Например, DIG-3 можно применять в трансгенных растениях в сочетании с дцРНК для супрессии основного гена в диабротика или основного гена в насекомом-вредителе. Такие гены-мишени включают, например, вакуолярную АТФазу, ARF-1, Act42A, CHD3, EF-1α и TFIIB. Примером подходящего гена-мишени является вакуолярная АТФаза, как описывают в WO2007/035650.

Неожиданным результатом, опубликованным в настоящем документе, является то, что токсины DIG-3 являются активными против популяций мотылька кукурузного и моли капустной, устойчивых к токсинам Cry1F и Cry1A. Таким образом, токсины DIG-3 являются идеальными кандидатами для применения для контроля насекомых Lepidoptera. Токсины можно применять в отдельности или в сочетании с другими Cry-токсинами, такими как Cry1F, Cry1Ab и Cry1Ac, для контроля развития устойчивости популяций насекомых.

Инсектицидно активные фрагменты SEQ ID NO: 2 и нуклеотиды, кодирующие такие фрагменты, являются другим аспектом изобретения.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду токсина DIG-3, содержащему сегмент основного токсина, выбранный из группы, состоящей из

(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 113 по 643 SEQ ID NO: 2;

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью из остатков с 113 по 643 SEQ ID NO: 2;

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 113 по 643 SEQ ID NO: 2 с наличием до 20 замен, делеций или модификаций аминокислот, не обладающих неблагоприятным действием на экспрессию или активность токсина, кодируемого SEQ ID NO: 2.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду токсина DIG-3, содержащего сегмент основного токсина, выбранного из группы, состоящей из

(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 73 по 643 SEQ ID NO: 2;

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью из остатков с 73 по 643 SEQ ID NO: 2;

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 73 по 643 SEQ ID NO: 2 с наличием до 20 замен, делеций или модификаций аминокислот, не обладающих неблагоприятным действием на экспрессию или активность токсина, кодируемого SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду токсина DIG-3, содержащему сегмент основного токсина DIG-3, выбранный из группы, состоящей из

(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 1 по 643 SEQ ID NO: 2;

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью из остатков с 1 по 643 ID NO: 2;

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 1 по 643 SEQ ID NO: 2 с наличием до 20 замен, делеций или модификаций аминокислот, не обладающих неблагоприятным действием на экспрессию или активность токсина, кодируемого SEQ ID NO: 2.

Термином "выделенный" заявители обозначают, что молекулы полипептида или ДНК удаляют из их природного окружения и помещают в отличающееся окружение руками человека.

В другом варианте осуществления изобретение относится к растению, содержащему токсин DIG-3.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу контроля популяции насекомого-вредителя, включающему контакт указанной популяции с пестицидно эффективным количеством токсина DIG-3.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей токсин DIG-3.

В другом варианте осуществления изобретение относится к конструкции ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую токсин DIG-3, функционально связанную с промотором, получаемым не из Bacillus thuringiensis и способным запускать экспрессию в растении. Изобретение также относится к трансгенному растению, содержащему конструкцию ДНК, стабильно встроенную в его геном, и способу защиты растения от насекомого-вредителя, включающему встраивание конструкции в указанное растение.

Краткое описание последовательностей

Последовательность ДНК SEQ ID NO: 1, кодирующая полноразмерный токсин DIG-3; 3771 оснований.

SEQ ID NO: 2 Последовательность полноразмерного белка DIG-3; 1256 аминокислот.

SEQ ID NO: 3 Оптимизированная для растений последовательность ДНК полноразмерного DIG-3; 3771 оснований.

SEQ ID NO: 4 сегмент протоксина Cry1Ab; 545 аминокислот.

SEQ ID NO: 5 Химерный токсин: Сегмент основного токсина DIG-3/сегмент протоксина Cry1Ab; 1188 аминокислот.

SEQ ID NO: 6 Оптимизированная для двудольного растения последовательность ДНК, кодирующая сегмент протоксина Cry1Ab; 1635 оснований.

SEQ ID NO: 7 Оптимизированная для кукурузы последовательность ДНК, кодирующая сегмент протоксина Cry1Ab; 1635 оснований.

Подробное описание изобретения

Токсины DIG-3 и инсектицидно активные варианты. В дополнение к полноразмерному токсину DIG-3 SEQ ID NO: 2, данное изобретение относится к инсектицидно активным вариантам. Посредством термина "вариант" заявители намереваются включать фрагменты, конкретные делетационные и инсерционные мутации и конкретные слитые белки. DIG-3 является классическим трехдоменным Cry-токсином. В качестве предисловия к описанию вариантов токсина DIG-3, включенных в изобретение, будет полезно кратко рассмотреть архитектуру трехдоменных Cry-токсинов вообще и белкового токсина DIG-3 в частности.

Большинство кристаллических белковых молекул дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis состоит из двух функциональных сегментов. Устойчивый к протеазе основной токсин является первым сегментом и относится приблизительно к первой половине молекулы белка. Полная молекула протоксина с молекулярной массой 130 кДа быстро процессируется протеазами в кишечнике насекомого до устойчивого основного сегмента. Удаляемый посредством данного процессинга сегмент будут обозначать в настоящем документе как "сегмент протоксина". Полагают, что сегмент протоксина участвует в образовании кристалла токсина (Arvidson et al., 1989). Таким образом, сегмент протоксина может передавать частичную специфичность к насекомому токсину, ограничивая доступность основы насекомому посредством снижения процессинга протеазами молекулы токсина (Haider et al., 1986) или посредством снижения растворимости токсина (Aronson et al, 1991). Даже внутри конкретного класса токсины B.t. до некоторой степени варьируются по длине и по точной локализации перехода от сегмента основного токсина к сегменту протоксина. Переход от сегмента основного токсина к сегменту протоксина, как правило, находится в приблизительно от 50% до приблизительно 60% полноразмерного токсина. SEQ ID NO: 2 описывает последовательность 1256 аминокислот полноразмерного полипептида DIG-3, 643 N-концевые аминокислоты которого содержат сегмент основного токсина DIG-3. 1929 5'-концевых нуклеотидов SEQ ID NO: 1 содержат кодирующую область сегмента основного токсина.

Определяли трехмерные кристаллические структуры для Cry1Aa1, Cry2Aa1, Cry3Aa1, Cry3Bb1, Cry4Aa, Cry4Ba и Cry8Ea1. Данные структуры для основных токсинов являются исключительно схожими и состоят из трех отдельных доменов с описанными ниже свойствами (обзор в de Maagd et al., 2003).

Домен I является узлом из семи альфа-спиралей, где α-спираль 5 окружают шесть амфипатических спиралей. Данный домен вовлечен в образование поры и обладает гомологией с другими образующими поры белками, включая гемолизины и колицины. Домен I белка DIG-3 содержит аминокислотные остатки с 56 по 278 SEQ ID NO: 2.

Домен II образуют три антипараллельных бета-слоя, упакованных вместе в бета-призму. Петли данного домена играют важную роль в связывании рецепторов средней кишки насекомого. В белках Cry1A поверхностные петли у верхушек бета-слоев домена II вовлечены в связывание с кадгериновыми рецепторами Lepidoptera. Петли домена II Cry3Aa аналогично связывают мембрано-связанную металлопротеазу Leptinotarsa decemlineata (Say) (колорадского жука) (Ochoa-Campuzano et al., 2007). Домен II обладает гомологией с конкретными углевод-связывающими белками, включая вителлин и джакалин. Домен II белка DIG-3 содержит аминокислотные остатки с 283 по 493 SEQ ID NO: 2.

Домен III является бета-сэндвичем из двух анти-параллельных бета-слоев. Структурно данный домен относится к углевод-связывающим доменам белков, таких как глюканазы, галактозоксидаза, сиалидаза и других. Домен III связывает конкретные классы рецепторных белков и, возможно, участвует во встраивании олигомерной пре-поры, взаимодействующей со вторым классом рецепторов, примерами которых являются аминопептидаза и щелочная фосфатаза в случае белков Cry1A (Pigott and Ellar, 2007). Аналогичный Cry-домен в рецепторах необходимо идентифицировать в Coleoptera. Сохраненные блоки 2 и 3 последовательности B.t. картировали вблизи N-конца и C-конца домена 2, соответственно. Таким образом, данные сохраненные блоки последовательности 2 и 3 являются приблизительными пограничными областями между тремя функциональными доменами. Данные области сохраненной гомологии ДНК и белка применяли для конструирования токсинов B.t. (патент США № 6090931, WO 91/01087, WO 95/06730, WO 1998022595). Домен в белке DIG-3 содержит аминокислотные остатки с 503 по 641 SEQ ID NO: 2.

Сообщали, что α-спираль 1 домена I удаляется после связывания рецептора. Aronson et al. (1999) показывали, что Cry1Ac, связанный с BBMV, защищен от расщепления протеиназой K, начинающегося на остатке 59, сразу после α-спирали 1; схожие результаты приводят для Cry1Ab. Gomez et al. (2002) обнаруживали, что олигомеры Cry1Ab, образующиеся после связывания рецептора BBMV, не обладали частью α-спирали 1 домена I. Кроме того, Soberon et al. (2007) показывали, что мутанты Cry1Ab и Cry1Ac с N-концевой делецией без приблизительно 60 аминокислот, включающих α-спираль 1 в трехмерной структуре Cry, способны к сборке мономеров с молекулярной массой приблизительно 60 кДа в пре-поры в отсутствие связывания кадгерина. Сообщали, что данные мутанты по N-концевой делеции являются активными по отношению к Cry-устойчивым личинкам насекомых. Кроме того, Diaz-Mendoza et al. (2007) описывали фрагменты Cry1Ab 43 кДа и 46 кДа, сохраняющие активность по отношению к средиземноморскому мотыльку кукурузному (Sesamia nonagrioides). Показывали, что данные фрагменты включают аминокислотные остатки с 116 по 423; однако точные аминокислотные последовательности не выяснены, и механизм активности данных протеолитических фрагментов является неизвестным. Результаты Gomez et al. (2002), Soberon et al. (2007) и Diaz-Mendoza et al. (2007) отличаются от таковых Hofte et al. (1986), сообщавших, что делеция 36 аминокислот из N-конца Cry1Ab приводила к потере инсектицидной активности.

Заявители расшифровывали начала и концы α-спирали 1, α-спирали 2A, α-спирали 2B и α-спирали 3 и положение спейсерных областей между ними в домене I токсина DIG-3 посредством сравнения последовательности белка DIG-3 с последовательностью белка Cry8Ea1, для которого структура известна. Данные положения описывают в таблице 1.

Варианты DIG-3 с амино-концевой делецией. В одном из аспектов изобретение относится к вариантам DIG-3, в которых вся или часть α-спирали 1, α-спирали 2A и α-спирали 2B делетирована для улучшения инсектицидной активности и во избежание развития устойчивости у насекомых. Данные модификации осуществляли для предоставления вариантов DIG-3 с улучшенными свойствами, такими как улучшенный спектр целевых насекомых-вредителей и контроль устойчивости насекомых. В некоторых вариантах осуществления изобретения заявленные модификации могут действовать на эффективность активации протоксина и образования поры, приводя к интоксикации насекомого. Более конкретно, для предоставления вариантов DIG-3 с улучшенными свойствами описывали пошаговые делеции, удаляющие часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей N-конец белка DIG-3. Посредством делеций удаляли всю α-спираль 1 и всю или часть α-спирали 2 в домене I, в то же время поддерживая структурную целостность α-спиралей с 3 по 7. Таким образом, заявленное изобретение частично относится к усовершенствованиям эффективности белка Cry, осуществляемым посредством конструирования α-спирального компонента домена 1 для более эффективного образования пор. Более конкретно, заявленное изобретение частично относится к улучшенным белкам DIG-3, сконструированным с N-концевыми делециями в областях с предполагаемой гомологией вторичной структуры с α-спиралью 1 и α-спиралью 2 в домене I белков Cry1.

Делеции для улучшения инсектицидных свойств токсинов DIG-3 можно вводить до прогнозируемого начала α-спирали 2A и можно заканчивать после конца α-спирали 2B, но предпочтительно не продлевать в α-спираль 3.

При конструировании кодирующих последовательностей для вариантов с N-концевой делецией инициирующий кодон ATG, кодирующий метионин, встраивают на 5'-конец нуклеотидной последовательности, сконструированной для кодирования варианта с делецией. Для последовательностей, сконструированных для применения в трансгенных растениях, может являться полезным соблюдать "N-концевое правило" Варшавского (1997). Научно известно, что некоторые аминокислоты могут способствовать нестабильности и деградации белка в эукариотических клетках, если представлены в качестве N-концевого остатка белка. Например, данные, полученные при наблюдениях за дрожжами и клетками млекопитающих, свидетельствуют, что N-концевыми дестабилизирующими аминокислотами являются F, L, W, Y, R, K, H, I, N, Q, D, E и, возможно, P. В то время как особенности механизмов деградации белка могут до некоторой степени отличаться между организмами, сохранение идентичности указанных выше N-концевых дестабилизирующих аминокислот означает, что схожие механизмы могут функционировать в растительных клетках. Например, Worley et al. (1998) обнаруживали, что в растениях N-концевое правило включает основные и ароматические остатки. Возможно, протеолитическое расщепление растительными протеазами вблизи начала α-спирали 3 заявленных инсектицидных белков B.t. может раскрывать дестабилизирующую N-концевую аминокислоту. Такой процессинг может иметь целью расщепленные белки для быстрого разрушения и ограничения накопления инсектицидных белков B.t. до уровней, недостаточных для эффективного контроля насекомых. Таким образом, для вариантов с N-концевой делецией, начинающихся с одной из дестабилизирующих аминокислот, заявители предпочитают добавлять кодон, специфический для аминокислоты G (глицин), между инициирующим трансляцию метионином и дестабилизирующей аминокислотой.

В примере 2 приведены конкретные примеры вариантов DIG-3 с амино-концевой делецией по изобретению. Дополнительные применимые фрагменты, сохраняющие токсичность, можно идентифицировать расщеплением трипсином или химотрипсином полноразмерного растворимого кристаллического белка. Фрагменты кодирующей области DIG-3 могут кодировать дополнительные примеры токсических фрагментов белка DIG-3. Активные в отношении насекомых варианты DIG-3, в основном, обладают коротким N-концевым укорочением и длинным C-концевым укорочением. N-конец наименьшего токсического фрагмента общепринято определяют посредством определения N-концевой аминокислотной последовательности обработанного трипсином или химотрипсином растворимого кристаллического белка общепринято доступными в данной области способами.

Химерные токсины. Ранее сообщали о химерных белках, задействующих сегмент основного токсина одного Cry-токсина, слитый с сегментом протоксина другого Cry-токсина. Варианты DIG-3 включают токсины, содержащие N-концевой сегмент основного токсина токсина DIG-3 (который может являться полноразмерным или обладать описанными выше N-концевыми делециями), слитый с гетерологичным сегментом протоксина в некоторой точке после конца сегмента основного токсина. Переход в гетерологичный сегмент протоксина может иметь место приблизительно в природном соединении основной токсин/протоксин или, альтернативно, может сохранять часть природного протоксина (продолжающуюся после сегмента основного токсина) с находящимся ниже переходом в гетерологичный протоксин. В качестве примера, химерный токсин по заявленному изобретению обладает полным сегментом основного токсина DIG-3 (аминокислоты 1-643) и гетерологичным сегментом протоксина (аминокислоты с 643 до C-конца). В предпочтительном варианте осуществления гетерологичный сегмент протоксина получают из дельта-эндотоксина Cry1Ab, как показано в SEQ ID NO: 5.

В SEQ ID NO: 4 описывают 545-аминокислотную последовательность сегмента протоксина Cry1Ab, применимую в вариантах DIG-3 по изобретению. Привлекают внимание приблизительно от 100 до 150 последних аминокислот данного сегмента протоксина, являющихся наиболее критичными для включения в химерный токсин по заявленному изобретению.

Варианты чувствительности протеазы. Протеазы кишечника насекомого, как правило, функционируют, помогая насекомому получать необходимые аминокислоты из белка пищи. Наиболее распространенными пищеварительными протеазами насекомых являются сериновые протеазы, вероятно, являющиеся наиболее распространенным типом (Englemann and Geraerts (1980)), в частности, в видах Lepidoptera. Насекомые Coleoptera обладают средой кишечника от более нейтральной до более кислой, чем кишечник Lepidoptera. Большинство личинок и взрослых особей Coleoptera, например, колорадского жука, обладают слегка кислой средой средней кишки, и цистеиновые протеазы обеспечивают основную протеолитическую активность (Wolfson и Murdock, 1990). Более точно, Thie и Houseman (1990) идентифицировали и охарактеризовывали цистеиновые протеазы, катепсин B-подобную и катепсин H-подобную, и аспартатную протеазу, катепсин D-подобную, у колорадского жука. Gillikin et al. (1992) охарактеризовывали протеолитическую активность в кишечнике личинок западного кукурузного жука и обнаруживали, главным образом, цистеиновые протеазы. В патенте США № 7230167 описывают, что протеазная активность, приписываемая катепсину G, существует у западного кукурузного жука. Разнообразие и различные уровни активности протеаз кишечника насекомых могут влиять на чувствительность насекомого к конкретному токсину B.t.

В другом варианте осуществления изобретения участки расщепления протеазами можно конструировать в желаемых положениях для воздействия на процессинг белка внутри средней кишки восприимчивых личинок конкретных насекомых-вредителей. Данные участки расщепления протеазами можно встраивать такими способами, как химический синтез гена или ПЦР по способу перекрывающегося сплайсинг-расширения (Horton et al., 1989). Последовательности распознавания сериновых протеаз, например, необязательно можно встраивать в специфические участки в структуре Cry-белка для воздействия на процессинг белка в желаемых точках делеции внутри средней кишки восприимчивых личинок. Сериновые протеазы, которые можно применять, таким образом, включают сериновые протеазы средней кишки Lepidoptera, такие как трипсин или трипсин-подобные ферменты, химотрипсин, эластаза и т.д. (Christeller et al., 1992). Кроме того, для воздействия на активацию белка можно конструировать участки делеции, эмпирически идентифицированные секвенированием продуктов расщепления Cry-белков, полученных с помощью нефракционированных препаратов протеаз личиночной средней кишки или связывания с мембранными везикулами щеточной каймы. Модифицированные Cry-белки, получаемые делецией гена или встраиванием участков расщепления протеаз, обладают улучшенной активностью по отношению к насекомым-вредителям Lepidoptera, включая Ostrinia nubilalis, Diatraea grandiosella, Helicoverpa zea, Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Diatraea saccharalis, Loxagrotis albicosta и другим целевым насекомым-вредителям.

Сериновые протеазы Coleoptera, такие как трипсин, химотрипсин и катепсин G-подобная протеаза, цистеиновые протеазы Coleoptera, такие как катепсины (B-подобные, L-подобные, O-подобные и K-подобные протеазы) (Koiwa et al., (2000) и Bown et al, (2004)], металлопротеазы Coleoptera, такие как ADAM10 [Ochoa-Campuzano et al., (2007)), и аспартатные протеазы Coleoptera, такие как катепсин D-подобные и E-подобные, пепсин, плазмепсин и химозин, можно дополнительно применять посредством конструирования соответствующих последовательностей распознавания в желаемых участках процессинга для воздействия на процессинг Cry-белка в средней кишке восприимчивых личинок конкретных насекомых-вредителей.

Предпочтительная локализация для встраивания таких участков расщепления протеазой может находиться внутри "спейсерной" области между α-спиралью 2B и α-спиралью 3, например, между аминокислотами с 109 по 113 полноразмерного белка DIG-3 (SEQ ID NO: 2 и таблица 1). Модифицированные Cry-белки, получаемые делецией гена или встраиванием участков расщепления протеазой, обладают улучшенной активностью по отношению к насекомым-вредителям, включая, в качестве неограничивающих примеров, западного кукурузного жука, 11-точечную блошку Говарда, блошку длинноусую и т.п.

Существуют различные технологии, делающие возможным определение последовательности аминокислот, включающей N-концевые или C-концевые остатки полипептидов. Например, автоматизированный способ деградации по Эдману можно последовательно применять для определения N-концевой аминокислотной последовательности до 30 аминокислотных остатков с 98% точностью на остаток. Кроме того, также является возможным определение последовательности аминокислот, включающей карбоксильный конец полипептидов [Bailey et al., (1992); патент США № 6046053]. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления можно охарактеризовывать Cry-белки B.t., активированные средствами протеолитического процессинга, например, полученными из кишечника насекомого протеазами, и идентифицировать N-концевые или C-концевые аминокислоты фрагмента активированного токсина. В объем изобретения включены варианты DIG-3, получаемые встраиванием или удалением участков процессинга протеазами в соответствующих положениях кодирующей последовательности для того, чтобы делать возможным или устранять протеолитическое расщепление большего варианта белка протеазами насекомого, растения или микроорганизма. Конечным результатом такой манипуляции следует понимать получение молекул фрагмента токсина, обладающих такой же или лучшей активностью, чем интактный (полноразмерный) белок токсина.

Домены токсина DIG-3. Ожидают, что отдельные домены токсина DIG-3 (и варианты, на 90%, 95% или 97% идентичные таким доменам) будут применимы в образовании комбинаций с доменами из других Cry-токсинов для предоставления новых токсинов с расширенным спектром токсичности для насекомых-вредителей, улучшенной эффективностью или повышенной стабильностью белка. Домен I белка DIG-3 состоит из аминокислотных остатков с 56 по 278 SEQ ID NO: 2. Домен II белка DIG-3 состоит из аминокислотных остатков с 283 по 493 SEQ ID NO: 2. Домен III белка DIG-3 состоит из аминокислотных остатков с 503 по 641 SEQ ID NO: 2. Обмен доменами или перетасовка доменов является механизмом для получения измененных белков дельта-эндотоксина. Домены II и III могут обмениваться между белками дельта-эндотоксина, приводя к гибридным или химерным токсинам с улучшенной пестицидной активностью или спектром мишеней. Домен II вовлечен в связывание рецептора, и домен II DIG-3 является очень дивергентным по отношению к другим Cry1B-токсинам. Домен III связывает конкретные классы рецепторных белков и, возможно, участвует во встраивании олигомерной пре-поры токсина. Показано, что некоторые замены в домене III вызывают лучшую токсичность против Spodoptera exigua (de Maagd et al., 1996), и существует руководство по конструированию замен доменов Cry-токсина (Knight et al., 2004).

Способы получения рекомбинантных белков и их тестирования на пестицидную активность хорошо известны в данной области (см., например, Naimov et al., (2001), de Maagd et al., (1996), Ge et al., (1991), Schnepf et al., (1990), Rang et al., (1999)). Домен I из белков Cry1A и Cry3A исследовали на способность встраиваться и образовывать поры в мембранах, α-спираль 4 и α-спираль 5 домена I играют ключевую роль во встраивании в мембрану и образование поры [Walters et al., (1993), Gazit et al., (1998)]; Nunez-Valdez et al., (2001)], и полагают, что другие альфа-спирали контактируют с поверхностью мембраны подобно ребрам зонта (Bravo et al., (2007); Gazit et al., (1998)).

Варианты DIG-3, создаваемые посредством осуществления ограниченного количества делеций, замен или добавлений аминокислот. Делеции, замены и добавления аминокислот в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 легко можно получать последовательным образом, и с помощью биологического анализа можно тестировать эффекты таких изменений на инсектицидную активность. При условии, что количество изменений является ограниченным, такое тестирование не включает чрезмерную экспериментальную работу. Изобретение включает инсектицидно активные варианты сегмента основного токсина (аминокислоты 1-643 SEQ ID NO: 2 или аминокислоты 73-643 SEQ ID NO: 2), в которых можно осуществлять до 10, до 15 или до 20 независимых добавлений, делеций или замен аминокислот.

Изобретение включает варианты DIG-3, обладающие сегментом основного токсина, на 90%, 95% или 97% идентичным аминокислотам 1-643 SEQ ID NO: 2 или аминокислотам 73-643 SEQ ID NO: 2.

Можно получать варианты посредством осуществления случайных мутаций или можно конструировать варианты. В случае сконструированных мутантов существует большая вероятность получения вариантов со схожей с природным токсином активностью, если идентичность аминокислот сохраняется в критичных областях токсина, объясняющих биологическую активность или вовлеченных в определение трехмерной конфигурации, в конечном итоге ответственной за биологическую активность. Также существует высокая вероятность сохранения активности, если замены являются консервативными. Аминокислоты можно разделять на следующие классы: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислые. Наименее вероятно, что консервативные замены существенно изменяют биологическую активность варианта, при условии что аминокислоту одного класса заменяют аминокислотой того же типа. В таблице 2 приводят список примеров аминокислот, принадлежащих каждому классу.

В некоторых случаях также можно осуществлять неконсервативные замены. Критическим фактором является то, что данные замены не должны значительно снижать биологическую активность токсина. Варианты включают полипептиды, отличающиеся по аминокислотной последовательности по причине мутагенеза. Варианты белков, включенные в настоящее изобретение, являются биологически активными, т.е. они продолжают обладать желаемой биологической активностью природного белка, а именно, сохраняют пестицидную активность.

Также можно конструировать варианты белков, отличающиеся на уровне последовательности, но сохраняющие ту же или схожую общую основную трехмерную структуру, распределение поверхностного заряда и т.п. См., например, патент США № 7058515; Larson et al. (2002); Stemmer (1994a,1994b, 1995); и Crameri et al. (1996a, 1996b, 1997).

Нуклеиновые кислоты. Одним из аспектов настоящего изобретения являются выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие токсины DIG-3. Они включают нуклеиновые кислоты, кодирующие SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 5, и комплементарные им, а также другие нуклеиновые кислоты, кодирующие инсектицидные варианты SEQ ID NO: 2. Из-за вырожденности генетического кода, многообразие различных последовательностей ДНК может кодировать описываемые в настоящем документе аминокислотные последовательности. Специалист в данной области может создавать данные измененные последовательности ДНК, кодирующие те же или по существу те же токсины.

Синтез гена. Последовательности ДНК, кодирующие описываемые в настоящем документе улучшенные Cry-белки, можно получать множеством хорошо известных в данной области способов. Например, синтетические сегменты гена и синтетические гены можно получать фосфит-триэфирным и фосфорамидитным способами (Caruthers et al, 1987) и существуют коммерческие производители для осуществления синтеза ДНК по заказу. Последовательности, кодирующие полноразмерные белки DIG-3, можно собирать множеством способов, включая, например, лигирование рестрикционных фрагментов или сборку посредством полимеразной цепной реакции с перекрывающимися олигонуклеотидами (Stewart и Burgin, 2005). Кроме того, последовательности, кодирующие концевые делеции, можно получать амплификацией ПЦР с применением сайт-специфических концевых олигонуклеотидов.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие токсины DIG-3, можно получать, например, синтетическим конструированием способами, применяемыми в настоящее время любым из отдельных коммерческих поставщиков. (См., например, патент США № 7482119 B2). Данные нуклеиновые кислоты или их части или варианты также можно конструировать синтетически, например, с применением синтезатора ДНК и способов конструирования, например, по патенту США № 5380831. Альтернативно, варианты синтетических или природных генов легко можно конструировать с применением стандартных техник молекулярной биологии для получения точечных мутаций. Фрагменты данных генов также можно получать стандартными способами с применением коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз. Например, для систематического отрезания нуклеотидов с концов данных генов можно применять ферменты, такие как Bal31, или сайт-специфический мутагенез. Кроме того, фрагменты генов, кодирующие активные фрагменты токсина, можно получать с применением множества ферментов рестрикции.

С учетом аминокислотной последовательности токсина DIG-3 кодирующую последовательность можно конструировать посредством обратной трансляции кодирующей последовательности с применением кодонов, предпочтительных для предполагаемого хозяина, и затем оптимизации последовательности с применением альтернативных кодонов для удаления последовательностей, которые могут вызывать проблемы и привносить периодические стоп-кодоны, для удаления длинных открытых кодирующих последовательностей в некодирующих рамках считывания.

Количественный анализ идентичности последовательности. Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновой кислоты последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. процент идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающиеся положения)Ч100). В одном из вариантов осуществления две последовательности обладают одной и той же длиной. Процент идентичности между двумя последовательностями можно определять с применением техник, схожих с описанными выше, с допусканием пропусков или без него. При вычислении процента идентичности, как правило, подсчитывают точные соответствия.

Определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществлять с применением математического алгоритма. Неограничивающим примером такого алгоритма является таковой Karlin и Altschul (1990), модифицированный в Karlin и Altschul (1993), и включенный в программное обеспечение BLASTN и BLASTX. Поиски в BLAST удобно применять для идентификации последовательностей, гомологичных (схожих) поисковой последовательности в базах данных нуклеиновых кислот или белков. Поиски в BLASTN можно осуществлять (баллы=100, длина слова=12) для идентификации нуклеотидных последовательностей, обладающих гомологией с заявляемыми молекулами нуклеиновой кислоты по изобретению. Поиски в BLASTX можно осуществлять (баллы=50, длина слова=3) для идентификации аминокислотных последовательностей, обладающих гомологией с заявляемыми инсектицидными молекулами белка по изобретению.

BLAST с пропусками (Altschul et al., 1997) можно применять для получения выравниваний с пропусками в целях сравнения. Альтернативно, PSI-Blast можно применять для осуществления итерационного поиска, определяющего отдаленные взаимосвязи между молекулами (Altschul et al., 1997). При применении программного обеспечения BLAST, BLAST с пропусками и PSI-Blast можно применять параметры по умолчанию соответствующего программного обеспечения. См. www.ncbi.nlm.nih.gov.

Неограничивающим примером математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, является алгоритм ClustalW (Thompson et al., 1994). ClustalW сравнивает последовательности и выравнивает всю протяженность последовательности аминокислот или ДНК, и, таким образом, может представлять данные о сохранении последовательности целой аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности. Алгоритм ClustalW применяют в некоторых коммерчески доступных пакетах программного обеспечения для анализа ДНК/аминокислот, таких как модуль ALIGNX Vector NTI Program Suite (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). При выравнивании аминокислотных последовательностей с помощью ALIGNX можно удобно применять настройки по умолчанию с штрафом за начало пропуска в последовательности 10, штрафом за удлинение пропуска 0,1 и матрицей сравнения blosum63mt2 для оценки процента сходства аминокислот (консенсус) или идентичности между двумя последовательностями. При выравнивании последовательностей ДНК с помощью ALIGNX удобно применять настройки по умолчанию с штрафом за начало пропуска в последовательности 15, штрафом за удлинение пропуска 6,6 и матрицей сравнения swgapdnamt для оценки процента идентичности между двумя последовательностями.

Другим неограничивающим примером математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, является таковой Myers и Miller (1988). Такой алгоритм встраивают в программное обеспечение wSTRETCHER, являющегося частью пакета программного обеспечения для выравнивания последовательностей wEMBOSS (доступного на http://emboss.sourceforge.net/). wSTRETCHER вычисляет оптимальное глобальное выравнивание двух последовательностей с применением модификации классического алгоритма динамического программирования с применением векторного пространства. Можно устанавливать подстановочную матрицу, штраф за встраивание пропуска и штрафы за удлинение пропуска, применяемые для вычисления выравнивания. При применении программного обеспечения wSTRETCHER для сравнивания нуклеотидных последовательностей можно применять штраф за начало пропуска 16 и штраф за удлинение пропуска 4 с матрицей замен EDNAFULL. При применении для выравнивания аминокислотных последовательностей можно применять штраф за начало пропуска 12 и штраф за удлинение пропуска 2 с матрицей замен EBLOSUM62.

Дополнительным неограничивающим примером математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, является таковой Needleman и Wunsch (1970), встроенный в пакеты программного обеспечения для выравнивания последовательностей GAP Version 10 и wNEEDLE (http://emboss.sourceforge.net/). GAP Version 10 можно применять для определения идентичности или сходства последовательностей с применением следующих параметров: для нуклеотидной последовательности % идентичности и % сходства обнаруживают с применением штрафа за начало пропуска 50 и штрафа за удлинение пропуска 3 и матрицы замен nwsgapdna. cmp. Для сравнения аминокислотных последовательностей % идентичности или % сходства определяют с применением штрафа за начало пропуска 8 и штрафа за удлинение пропуска 2 и матрицы замен BLOSUM62.

wNEEDLE считывает две вводимые последовательности, обнаруживает оптимальное выравнивание (включая пропуски) по всей их длине и записывает их оптимальное глобальное выравнивание последовательностей в файл. Алгоритм исследует все возможные выравнивания и выбирает лучшее с применением матрицы замен, содержащей значения для каждого возможного остатка или пары нуклеотидов. wNEEDLE обнаруживает выравнивание с максимально возможными баллами, где балл выравнивания равен сумме соответствий, взятых из матрицы замен, минус штрафы за начало и удлинение пропусков в выравниваемых последовательностях. Подстановочная матрица и штрафы за начало и удлинение пропуска определяет пользователь. Когда сравнивают аминокислотные последовательности, по умолчанию применяют штраф за начало пропуска 10, штраф за удлинение пропуска 0,5 и матрицу сравнения EBLOSUM62. Когда сравнивают последовательности ДНК с применением wNEEDLE, применяют штраф за начало пропуска 10, штраф за удлинение пропуска 0,5 и матрицу сравнения EDNAFULL.

Также можно применять эквивалентное программное обеспечение. "Эквивалентное программное обеспечение" обозначает любое программное обеспечение для сравнения последовательностей, которое для любых двух интересующих последовательностей получает выравнивание, обладающее идентичными соответствиями нуклеотидов или аминокислотных остатков и идентичным процентом идентичности последовательности при сравнении с соответствующим выравниванием, получаемым посредством ALIGNX, wNEEDLE или wSTRETCHER. % идентичности является процентным отношением идентичных соответствий между двумя последовательностями в указанной выравниваемой области (включая любые пропуски по длине), и % сходства является процентным отношением соответствий между двумя последовательностями в указанной выравниваемой области (включая любые пропуски по длине).

Выравнивание также можно осуществлять вручную посредством осмотра.

Рекомбинантные хозяева. Кодирующие токсин гены по заявленному изобретению можно встраивать в широкий спектр микробных или растительных хозяев. Экспрессия гена токсина прямо или косвенно приводит к внутриклеточной продукции и сохранению пестицидного белка. С подходящими микробными хозяевами, например Pseudomonas, микробы можно помещать в окружающую среду насекомых-вредителей, где они могут размножаться и поглощаться. Результатом является контроль насекомых-вредителей. Альтернативно, микроб, являющийся хозяином для гена токсина, можно обрабатывать в условиях, продлевающих активность токсина и стабилизирующих клетку. Затем обработанную клетку, сохраняющую токсическую активность, можно помещать в окружающую среду целевого насекомого-вредителя.

Когда ген токсина B.t. встраивают в микробного хозяина посредством подходящего вектора и указанного хозяина помещают в окружающую среду в живом состоянии, важно применять конкретных микробов-хозяев. Выбирают те микроорганизмы-хозяева, про которые известно, что они заселяют "фитосферу" (филлоплан, филосферу, ризосферу и/или ризоплан) одной или нескольких интересующих сельскохозяйственных культур. Данные микроорганизмы выбирают таким образом, что они способны успешно конкурировать в конкретной окружающей среде (сельскохозяйственные культуры и другие среды обитания насекомых) с природными микроорганизмами дикого типа, обеспечивая стабильное поддержание и экспрессию гена, экспрессирующего полипептидный пестицид, и, желательно, обеспечивая улучшенную защиту пестицида от деградации и инактивации в окружающей среде.

Известно большое количество микроорганизмов, населяющих филлоплан (поверхность листьев растения) и/или ризосферу (окружающий корни растения грунт) широкого спектра важных сельскохозяйственных культур. Данные микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют микроорганизмы, такие как бактерии, например, родов Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Sinorhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcaligenes; грибы, в частности, дрожжи, например, родов Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие бактериальные виды фитосферы, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Sinorhizobium meliloti (ранее Rhizobium meliloti), Alcaligenes eutrophus и Azotobacter vinelandii; и виды дрожжей фитосферы, такие как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.

Способы контроля насекомых-вредителей

Когда насекомое контактирует с эффективным количеством токсина, доставляемого через экспрессию трансгенным растением, составленной композицией (композициями) белка, распыляемой композицией (композициями) белка, матрицей приманки или другой системой доставки, как правило, результатом является гибель насекомого, или насекомые не питаются на источнике, который делает токсины доступными для насекомых.

Заявленные белковые токсины можно "помещать" или обеспечивать их контакт с насекомыми-мишенями различными путями. Например, можно применять трансгенные растения (где белок продуцируют растения, и он присутствует в них), и они являются хорошо известными в данной области. Экспрессии генов токсина также можно достигать избирательно в специфических тканях растений, таких как корни, листья и т.д. Это можно осуществлять, например, с применением тканеспецифичных промоторов. Распыляемые препараты являются другим примером и также известны в данной области. Заявленные белки можно соответствующим образом составлять для желаемого конечного применения и затем распылять (или иначе помещать) на растения и/или вокруг растения/вблизи защищаемого растения до обнаружения заражения, после обнаружения насекомых-мишеней, и до, и после и т.п. Например, гранулы приманки также можно применять, и они известны в данной области.

Трансгенные растения

Заявленные белки можно применять для защиты практически любого типа растений от повреждения насекомым Lepidoptera. Неограничивающие примеры таких растений включают кукурузу, подсолнечник, сою, хлопок, канолу, рис, сорго, пшеницу, ячмень, овощи, декоративные растения, перцы (включая острый перец), сахарную свеклу, фрукты и газонные растения, и это лишь немногие. Способы трансформации растений хорошо известны в данной области, и иллюстративные способы трансформации описывают в Примерах.

Предпочтительным вариантом осуществления по заявленному изобретению является трансформация растений генами, кодирующими заявленный инсектицидный белок или его варианты. Трансформированные растения являются устойчивыми к воздействию целевых насекомых вредителей из-за наличия контролирующих количеств заявленного инсектицидного белка или его вариантов в клетках трансформированного растения. Посредством встраивания генетического материала, кодирующего инсектицидные свойства инсектицидных токсинов B.t., в геном растения, поедаемого конкретным насекомым-вредителем, взрослая особь или личинка будет погибать после потребления растительной пищи. Трансформируют многочисленных членов семейств однодольных и двудольных. Трансгенные агрономические сельскохозяйственные культуры, а также фрукты и овощи представляют коммерческий интерес. Такие сельскохозяйственные культуры включают в качестве неограничивающих примеров кукурузу, рис, сою, канолу, подсолнечник, люцерну, сорго, пшеницу, хлопок, арахис, томаты, картофель и т.п. Существует несколько техник для встраивания чужеродного генетического материала в растительные клетки и для получения растений, стабильно сохраняющих и экспрессирующих встроенный ген. Такие техники включают введение покрывающего микрочастицы генетического материала напрямую в клетки (патент США № 4945050 и патент США № 5141131). Растения можно трансформировать с применением технологии Agrobacterium, см. патент США № 5177010, патент США № 5104310, европейскую патентную заявку № 0131624B1, европейскую патентную заявку № 120516, европейскую патентную заявку № 159418B1, европейскую патентную заявку № 176112, патент США № 5149645, патент США № 5469976, патент США № 5464763, патент США № 4940838, патент США № 4693976, европейскую патентную заявку № 116718, европейскую патентную заявку № 290799, европейскую патентную заявку № 320500, европейскую патентную заявку № 604662, европейскую патентную заявку № 627752, европейскую патентную заявку № 0267159, европейскую патентную заявку № 0292435, патент США № 5231019, патент США № 5463174, патент США № 4762785, патент США № 5004863 и патент США № 5159135. Другие технологии трансформации включают технологию WHISKERS™, см. патент США № 5302523 и патент США № 5464765. Для трансформации растений также применяют технологию электропорация, см. WO 87/06614, патент США № 5472869, патент США № 5384253, WO 9209696 и WO 9321335. Все данные патенты и публикации по трансформации включены в качестве ссылки. В дополнение к многочисленным технологиям для трансформации растений, можно варьировать тип ткани, контактирующей с чужеродными генами. Такая ткань может включать в качестве неограничивающих примеров эмбриогенную ткань, ткань каллюса типа I и II, гипокотиль, меристему и т.п. Почти все ткани растения можно трансформировать в течение дедифференцировки с применением соответствующих техник, известных специалисту в данной области.

Гены, кодирующие токсины DIG-3, можно встраивать в растительные клетки с применением различных хорошо известных в данной области техник, описываемых выше. Например, для получения и модификации чужеродных генов для встраивания в высшие растения доступно множество клонирующих векторов, содержащих маркер, позволяющий селекцию трансформированных микробных клеток, и система репликации в Escherichia coli. Такие манипуляции могут включать, например, встраивание мутаций, урезание, добавления или замены, желаемые для предполагаемого применения. Векторы включают, например, pBR322, серию pUC, серию M13mp, pACYC184 и т.д. Таким образом, последовательность, кодирующую Cry-белок или его варианты, можно встраивать в вектор в подходящий участок рестрикции. Получаемую плазмиду применяют для трансформации клеток E. coli, клетки которых культивируют в подходящей питательной среде, собирают и лизируют таким образом, что извлекают рабочие количества плазмиды. Анализ последовательности, анализ рестрикционных фрагментов, электрофорез и другие биохимические и молекулярно-биологические способы, как правило, осуществляют как способы анализа. После каждой манипуляции применяемую последовательность ДНК можно расщеплять и присоединять к следующей последовательности ДНК. Каждую обрабатываемую последовательность ДНК можно клонировать в одни и те же или другие плазмиды.

Интенсивно исследовали применение Т-ДНК-содержащих векторов для трансформации растительных клеток и достаточно описывали его в EP 120516; Lee и Gelvin (2008), Fraley et al. (1986), и An et al. (1985), и оно является общепринятым в данной области.

Когда встраиваемая ДНК встроилась в геном растения, она является относительно стабильной на всем протяжении последующих поколений. Вектор, применяемый для трансформации растительной клетки, в норме содержит ген селективного маркера, кодирующий белок, придающий трансформированным растительным клеткам устойчивость к гербициду или антибиотику, такому как биалафос, канамицин, G418, блеомицин или гигромицин в том числе. Индивидуально применяемый ген селективного маркера, таким образом, должен делать возможной селекцию трансформированных клеток, в то время как селективное соединение подавляет рост клеток, не содержащих встроенную ДНК.

Доступно большое количество техник для встраивания ДНК в растительную клетку-хозяина. Данные техники включают трансформацию с Т-ДНК, доставляемую Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве трансформирующего средства. Дополнительно можно применять слияние растительных протопластов с липосомами, содержащими доставляемую ДНК, прямую инъекцию ДНК, биолистическую трансформацию (бомбардировку микрочастицами) или электропорацию, а также другие возможные способы.

В предпочтительном варианте осуществления по заявленному изобретению растения трансформируют генами, где применение кодонов кодирующей области белка оптимизируют для растений. См., например, патент США № 5380831, таким образом, включенный в качестве ссылки. Кроме того, преимущественно применяют растения, кодирующие урезанный токсин. Урезанный токсин, как правило, будет кодировать приблизительно от 55% приблизительно до 80% полноразмерного токсина. Способы для создания синтетических генов B.t. для применения в растениях известны в данной области (Stewart, 2007).

Независимо от способа трансформации ген предпочтительно встраивают в вектор для переноса гена, адаптированный для экспрессии генов инсектицидного токсина B.t и его вариантов в растительной клетке посредством включения в вектор растительного промотора. В дополнение к растительным промоторам можно применять промоторы из множества источников, эффективные в экспрессии чужеродных генов в растительных клетках. Например, можно применять промоторы бактериального происхождения, такие как октопинсинтазный промотор, нопалинсинтазный промотор и маннопинсинтазный промотор. Можно применять промоторы растительных вирусов, например, промоторы 35S и 19S вируса мозаики цветной капусты, промотор вируса мозаики маниоки и т.п. Растительные промоторы включают, в качестве неограничивающих примеров, малую единицу рибулозо-1,6-бисфосфат (RUBP) карбоксилазы (ssu), промотор бета-конглицинина, промотор фазеолина, промотор ADH (алкогольдегидрогеназы), промоторы теплового шока, промотор ADF (фактора деполимеризации актина), убиквитиновый промотор, промотор актина и тканеспецифические промоторы. Промоторы также могут содержать конкретные элементы энхансерной последовательности, которые могут улучшать эффективность транскрипции. Типичные энхансеры включают, в качестве неограничивающих примеров, ADH1-интрон 1 и ADH1-интрон 6. Можно применять конститутивные промоторы. Конститутивные промоторы направляют постоянную экспрессию гена почти во всех типах клеток почти все время (например, актин, убиквитин, CaMV 35S). Тканеспецифические промоторы отвечают за экспрессию гена в специфических типах тканей и клеток, таких как листья или семена (например, промоторы зеина, олеозина, напина, ACP (ацил-переносящего белка)), и данные промоторы также можно применять. Также можно применять промоторы, активные в течение конкретной стадии развития растения, а также активные в специфических тканях и органах растения. Примеры таких промоторов включают, в качестве неограничивающих примеров, специфичные для корней, специфичные для пыльцы, эмбриоспецифичные, специфичные для кукурузных рылец, специфичные для хлопкового волокна, специфичные для эндосперма семени, специфичные для флоэмы и т.п. промоторы.

В определенных условиях желательным может являться применение индуцибельного промотора. Индуцибельный промотор отвечает за экспрессию генов в ответ на специфический сигнал, такой как: физический стимул (например, гены теплового шока); свет (например, RUBP-карбоксилаза); гормон (например, глюкокортикоид); антибиотик (например, тетрациклин); метаболиты; и стресс (например, засуху). Можно применять другие желаемые транскрипционные и трансляционные элементы, функционирующие в растениях, такие как 5'-нетранслируемые лидерные последовательности, РНК-последовательности терминации транскрипции и сигнальные последовательности полиаденилирования. В данной области известны многочисленные растение-специфичные векторы для переноса генов.

Трансгенные сельскохозяйственные культуры, обладающие признаками устойчивости к насекомым (IR), широко распространены среди растений кукурузы и хлопка на всем протяжении Северной Америки, и применение данных признаков глобально распространяется. Коммерческие трансгенные сельскохозяйственные культуры, сочетающие признаки IR и сопротивляемости гербицидам (HT), разрабатывают во многих сельскохозяйственных компаниях. Они включают сочетания признаков IR, придаваемых инсектицидными белками B.t., и признаков HT, таких как сопротивляемость ингибиторам ацетолактатсинтазы (ALS), таким как сульфонилкарбамиды, имидазолиноны, триазолопиримидин, сульфонанилиды и т.п., ингибиторам глутаминсинтетазы (GS), таким как биалафос, глуфосинат и т.п., ингибиторам 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы (HPPD), таким как мезотрион, изоксафлютол и т.п., ингибиторам 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтетазы (EPSPS), таким как глифосат и т.п., и ингибиторам ацетилкоэнзим-A-карбоксилазы (ACCase), таким как галоксифоп, квизалофоп, диклофоп и т.п. Известны другие примеры, в которых трансгенными способами предоставляют белки, обеспечивающие сопротивляемость растений к таким химическим классам гербицидов, как феноксикислотные гербициды и пиридилоксиацетатные ауксиновые гербициды (см. WO 2007/053482 A2), или феноксикислотные гербициды и арилоксифеноксипропионатные гербициды (см. WO 2005107437 A2, A3). Способность контролировать проблемы, связанные с многочисленными насекомыми-вредителями, через признаки IR является важной концепцией коммерческого продукта, и преимущество данной концепции продукта усиливается, если признаки контроля насекомых и признаки контроля сорняков сочетают в одном и том же растении. Кроме того, можно получать улучшенную ценность через сочетания в одном растении признаков IR, придаваемых инсектицидным белком B.t., таким как белок по заявленному изобретению, с одним или несколькими дополнительными признаками HT, такими как указанные выше, и одним или несколькими дополнительными вводимыми признаками (например, устойчивостью к другим насекомым, придаваемой B.t.-производными или другими инсектицидными белками, устойчивостью к насекомым, придаваемой механизмами, такими как РНКи и т.п., устойчивостью к нематодам, устойчивостью к заболеваниям, сопротивляемостью стрессу, улучшенным потреблением азота и т.п.) или признаками "на выходе" (например, высоким содержанием масел, композицией полезных для здоровья масел, питательным улучшениям и т.п.). Такие сочетания можно получать общепринятой селекцией (селекционный набор) или совместно в качестве нового трансформационного события, включающего одновременное встраивание многочисленных генов (молекулярный набор). Преимущества включают способность контролировать насекомых-вредителей и улучшенный контроль сорняков в сельскохозяйственной культуре, что обеспечивает вторичные преимущества производителю и/или потребителю. Таким образом, заявленное изобретение можно применять в сочетании с другими признаками для предоставления полного агротехнического пакета улучшенного качества сельскохозяйственной культуры со способностью гибко и с оптимальными затратами контролировать любое количество агротехнических проблем.

Целевые насекомые-вредители

Токсины DIG-3 по изобретению, в частности, являются подходящими для применения в контроле насекомых Lepidoptera. Lepidoptera являются важной группой сельскохозяйственных, садоводческих и домашних насекомых-вредителей, каждый год вызывающих чрезвычайно большой объем повреждений. Данный отряд насекомых включает поедающих листья и корни личинок и взрослых особей. Насекомые-вредители Lepidoptera включают, в качестве неограничивающих примеров: Achoroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon (совку-ипсилон), Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athens mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia feneralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella (огневка кукурузная юго-западная), Diatraea saccharalis (огневка сахарного тростника), Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Esphestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea (совка хлопковая), Heliothis virescens (табачная листовертка), Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum (огневка подсолнечниковая), Hyphantia cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxagrotis albicosta, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata (совка латуковая), Manduca quinquemaculata, Manduca sexta (бражник каролинский), Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis (мотылек кукурузный), Paleacrita vernata, Papiapema nebris, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella (моль капустная), Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta (совка луговая), Pseudoplasia includens, Rachiplusia nu, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonta ocellana, Spodoptera frugiperda (совка травяная), Spodoptera exigua (совка малая), Thaurnstopoea pityocampa, Ensola bisselliella, Trichoplusia hi, Udea rubigalis, Xylomyges curtails и Yponomeuta padella.

Также рассматривают применение токсинов DIG-3 для контроля насекомых-вредителей сельскохозяйственных культур Coleoptera. В некоторых вариантах осуществления Cry-белки можно экономически применять для контроля насекомых-вредителей, включающих в качестве неограничивающих примеров, например, повреждающих корни личинок, таких как Diabrotica undecimpunctata howardi (блошка 11-точечная Говарда), Diabrotica longicornis barberi (блошка длинноусая) и Diabrotica virgifera (западный кукурузный жук), и личинки, такие как личинки Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculate и Popillia japonica (хрущик японский).

Также рассматривают применение токсинов DIG-3 для контроля паразитических нематод, включая, в качестве неограничивающих примеров, южную галловую нематоду (Meloidogyne icognita) и соевую нематоду (Heterodera glycines).

Определение токсинов DIG-3 с помощью антител

Антитела против токсина. Антитела к токсинам, описываемым в настоящем документе, или к эквивалентным токсинам, или фрагментам данных токсинов, легко можно получать с применением стандартных способов в данной области. Такие антитела применимы для определения наличия токсинов DIG-3.

Если выделяют инсектицидный токсин B.t., специфичные к токсину антитела можно индуцировать общепринятыми хорошо известными в данной области способами. Повторяемые инъекции в выбранного хозяина в течение периода недель или месяцев будут вызывать иммунный ответ и приводить к значительным титрам антител к токсину B.t. в сыворотке. Предпочтительными хозяевами являются виды млекопитающих, и более предпочтительными видами являются кролики, козы, овцы и мыши. Взятую из таких иммунизированных животных кровь можно обрабатывать общепринятыми способами для получения антисыворотки (поликлональных антител), реагирующей с инсектицидным токсином B.t. Затем антисыворотку можно аффинно очищать посредством адсорбции к токсину по известным в данной области техникам. Аффинно очищенную антисыворотку дополнительно можно очищать выделением иммуноглобулиновой фракции в антисыворотке с применением известных в данной области способов. Получаемый материал будет являться гетерогенной популяцией иммуноглобулинов, реагирующих с инсектицидным токсином B.t.

Антитела против токсина B.t. также можно получать, готовя полусинтетический иммуноген, состоящий из синтетического пептидного фрагмента инсектицидного токсина B.t., конъюгированного с иммуногенным носителем. Многочисленные схемы и инструменты, применимые для получения пептидных фрагментов, хорошо известны в данной области. Многие подходящие иммуногенные носители, такие как бычий сывороточный альбумин или гемоцианин морского блюдца, также являются хорошо известными в данной области, также как и техники соединения белков иммуногена и носителя. Если конструируют полусинтетический иммуноген, способ получения антител, специфичных для фрагмента инсектицидного токсина B.t., является идентичным применяемому для получения антител, реагирующих с природным токсином B.t.

Моноклональные антитела против токсина B.t. (MAb) легко получать с применением очищенного инсектицидного токсина B.t. Способы получения MAb применяют более 20 лет, и они хорошо известны специалистам в данной области. Повторяемые интраперитонеальные или подкожные инъекции очищенного инсектицидного токсина B.t. в адъюванте будут вызывать иммунный ответ у большинства животных. Гипериммунизированные B-лимфоциты удаляют из животного и сливают с подходящей для слияния клеточной линией-партнером, способным являться культивируемым неопределенно долго. Предпочтительными животными, чьи B-лимфоциты можно гипериммунизировать и применять в получении Mab, являются млекопитающие. Более предпочтительными животными являются крысы и мыши, и наиболее предпочтительными являются мыши линии BALB/c.

Многочисленные клеточные линии млекопитающих являются подходящими партнерами для слияния для получения гибридом. Многие такие линии являются доступными в American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) и у коммерческих поставщиков. Предпочтительными клеточными линиями-партнерами для слияния являются получаемые из мыши миеломы, и наиболее предпочтительной является клеточная линия HL-1® Friendly myeloma-653 (Ventrex, Portland, ME). При слиянии получаемые гибридомы культивируют в селективной среде для выращивания в течение от одной до двух недель. Доступны две хорошо известные системы селекции для удаления не подвергшихся слиянию миеломных клеток или слияний между миеломными клетками из смешанной гибридомной культуры. Выбор системы селекции зависит от применяемой линии иммунизированных мышей и миеломного партнера по слиянию. Можно применять систему селекции AAT, описываемую Taggart и Samloff, (1983),; однако система селекции HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин), описываемая Littlefield, (1964), является предпочтительной из-за своей совместимости с предпочтительной линией мышей и указанным выше партнером для слияния. Использованную среду для выращивания исследуют на иммуно-специфичную секрецию MAb. Способы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) лучше всего подходят для данных целей; хотя радиоиммунологические анализы, приспособленные для скрининга большого объема, также являются приемлемыми. Можно осуществлять многочисленные анализы, предназначенные для последовательного сокращения существенного количества несоответствующих или менее желаемых культур. Культуры, секретирующие Mab, реагирующие с инсектицидным токсином B.t., можно исследовать на перекрестную реактивность с известными инсектицидными токсинами B.t. Можно выделять MAb, преимущественно связывающиеся с предпочтительным инсектицидным токсином B.t. с применением коммерчески доступных анализов. Предпочтительными MAb является класс IgG, и более предпочтительными MAb являются субизотипы IgG₁ и IgG_2a.

Гибридомные культуры, секретирующие предпочтительные Mab, можно субклонировать несколько раз для установления моноклональности и стабильности. Хорошо известные способы для субклонирования культур эукариотических неприлипающих клеток включают способы предельных разведений, мягкой агарозы и активируемой флуоресценцией сортировки клеток. После каждого субклонирования получаемые культуры предпочтительно снова анализируют на секрецию антител и изотип для обеспечения установления стабильной предпочтительной секретирующей MAb культуры.

Антитела против токсина B.t. применимы в различных способах определения заявленного инсектицидного токсина B.t. по настоящему изобретению и его вариантов или фрагментов. Хорошо известно, что для идентификации наличия антигенов в различных средах можно применять антитела, меченные репортерной группой. Меченные радиоактивными изотопами антитела в течение десятилетий применяют в радиоиммунологических анализах для идентификации наличия антигенов в различных биологических жидкостях с высокой точностью и чувствительностью. В последнее время меченные ферментом антитела применяют в качестве замены меченных радиоактивными изотопами антител в анализе ELISA. Кроме того, антитела, иммунореактивные по отношению к инсектицидному токсину B.t. по настоящему изобретению, можно связывать с иммобилизованным веществом, таким как полистироловая лунка или частица, и применять в иммунологических анализах для определения наличия токсина B.t. в тестируемом образце.

Определение с применением зондов нуклеиновых кислот

Дополнительным способом идентификации токсинов и генов по заявленному изобретению является применение олигонуклеотидных зондов. Данные зонды являются определяемыми нуклеотидными последовательностями. Данные последовательности можно предоставлять меченными соответствующей радиоактивной меткой или можно получать по существу флуоресцентными, как описано, например, в патенте США № 6268132. Как хорошо известно в данной области, если молекулу зонда и образец нуклеиновой кислоты гибридизовать посредством образования сильных связей между парами оснований между двумя молекулами, разумно предполагать, что зонд и образец обладают существенной гомологией последовательности. Предпочтительно, гибридизацию осуществляют в строгих условиях хорошо известными в данной области техниками, как описывают, например, в Keller и Manak (1993). Определение зонда предоставляет средства для определения известным способом, если происходит гибридизация. Такой анализ с помощью зонда предоставляет быстрый способ идентификации кодирующих токсин генов по заявленному изобретению. Нуклеотидные сегменты, применяемые в качестве зондов по изобретению, можно синтезировать с применением синтезатора ДНК и стандартных способов. Данные нуклеотидные последовательности также можно применять в качестве праймеров для ПЦР для амплификации генов по заявленному изобретению.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Как известно специалисту в молекулярной биологии, сходство двух нуклеиновых кислот можно охарактеризовывать по их тенденции к гибридизации. Как применяют в настоящем документе, термины "строгие условия" или "строгие условия гибридизации" предназначены для определения условий, в которых зонд будет гибридизоваться (отжигаться) с его последовательностью-мишенью с определяемо более высокой степенью, чем другие последовательности (например, по меньшей мере, в 2 раза по сравнению с фоном). Строгие условия зависят от последовательности и будут отличаться в различных обстоятельствах. Посредством контроля точности гибридизации и/или условий промывки можно идентифицировать последовательность-мишень, на 100% комплементарную зонду (гомологичное зондирование). Альтернативно, точность условий можно регулировать, делая возможным несоответствие в последовательностях таким образом, что определяют более низкие степени сходства (гетерологичное зондирование). Как правило, зонд составляет менее чем приблизительно 1000 нуклеотидов в длину, предпочтительно - менее чем 500 нуклеотидов в длину.

Как правило, строгие условия будут такими, в которых концентрация соли составляет менее чем приблизительно 1,5 M иона Na, как правило, концентрация иона Na (или других солей) составляет приблизительно от 0,01 до 1,0 M при pH от 7,0 до 8,3, и температура составляет, по меньшей мере, приблизительно 30°C для коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и, по меньшей мере, приблизительно 60°C для длинных зондов (например, более чем 50 нуклеотидов). Строгих условий также можно достигать добавлением дестабилизирующих средств, таких как формамид. Примерные условия с низкой строгостью включают гибридизацию с раствором буфера с наличием от 30% до 35% формамида, 1 M NaCl, 1% SDS (додецилсульфата натрия) при 37°C и промывку в 1X-2X SSC (20X SSC=3,0 M NaCl/0,3 M трицитрата натрия) при температуре от 50°C до 55°C. Примерные условия с умеренной строгостью включают гибридизацию в растворе с наличием от 40% до 45% формамида, 1,0 M NaCl, 1% SDS при 37°C и промывку в 0,5X-1X SSC при температуре от 55°C до 60°C. Примерные условия с высокой строгостью включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 M NaCl, 1% SDS при 37°C и промывку в 0,1X SSC при температуре от 60°C до 65°C. Необязательно, промывочный буфер может содержать приблизительно от 0,1% до приблизительно 1% SDS. Продолжительность гибридизации составляет, как правило, менее чем приблизительно 24 часа, как правило, приблизительно от 4 приблизительно до 12 часов.

Как правило, специфичность является функцией постгибридизационных промывок, критическими факторами являются ионная сила и температура окончательного промывочного раствора. Для гибридов ДНК/ДНК температурой плавления (Tm) является температура (при определенной ионной силе и pH), при которой 50% комплементарной последовательности-мишени гибридизуется с соответствующим зондом. Tm снижают на приблизительно 1°C для каждого 1% несоответствия; таким образом, Tm, условия гибридизации и/или условия промывки можно регулировать для облегчения отжига последовательностей с желаемой идентичностью. Например, если желаемыми являются последовательности с >90% идентичностью, Tm можно повышать на 10°C. Как правило, строгие условия выбирают на приблизительно 5°C ниже Tm для специфической последовательности, и она является комплементарной при определенной ионной силе и pH. Однако при высоко строгих условиях можно применять гибридизацию и/или промывку при температуре на 1°C, 2°C, 3°C или 4°C ниже чем Tm; при умеренно строгих условиях можно применять гибридизацию и/или промывку при температуре на 6°C, 7°C, 8°C, 9°C или 10°C ниже чем Tm, и при условиях с низкой строгостью можно применять гибридизацию и/или промывку при температуре на 11°C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C или 20°C ниже чем Tm.

Tm (в °C) можно определять экспериментально или приблизительно вычислять. Для гибридов ДНК-ДНК Tm можно приблизительно вычислять из уравнения Meinkoth и Wahl (1984):

Tm(°C)=81,5°C+16,6(log M)+0,41(%GC)-0,61(% формамида)-500/L,

где M являются молярностью одновалентных катионов, %GC является процентным отношением гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % формамида является процентной долей формамида в гибридизационном растворе, и L является длиной гибрида в парах оснований.

Альтернативно, Tm описывают следующей формулой (Beltz et al., 1983).

Tm(°C)=81,5°C+16,6(log[Na+])+0,41(%GC)-0,61(% формамида)-600/L,

где [Na+] является молярностью ионов натрия, %GC является процентным отношением гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % формамида является процентной долей формамида в гибридизационном растворе, и L является длиной гибрида в парах оснований.

Специалистам будет понятно, что с применением уравнений, композиций для гибридизации и промывки и желаемого Tm, по существу, описывают варианты строгости гибридизационных и/или промывочных растворов. Если желаемая степень несоответствий приводит к Tm менее чем 45°C (водный раствор) или 32°C (раствор формамида), предпочтительно повышать концентрацию SSC таким образом, что можно применять более высокую температуру. Обширное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот представлено в Tijssen (1993) и Ausubel et al. (1995) Также смотри Sambrook et al. (1989).

Гибридизацию иммобилизованной ДНК с помощью блоттинга по Саузерну с меченными радиоактивными изотопами геноспецифичными зондами можно осуществлять стандартными способами по Sambrook et al., указанному выше. Радиоактивные изотопы, применяемые для мечения полинуклеотидных зондов, могут включать ³²P, ³³P, ¹⁴C или ³H. Встраивание радиоактивных изотопов в молекулы полинуклеотидного зонда можно осуществлять любым из нескольких способов, хорошо известных специалисту в молекулярной биологии (см., например Sambrook et al., указанный выше.) В основном, гибридизацию и последующие промывки осуществляют в строгих условиях, что позволяет определять последовательности-мишени с гомологией с заявленными кодирующими токсин генами. Для зондов к двухцепочечной ДНК гена гибридизацию можно осуществлять в течение ночи при температуре на 20-25°C ниже Tm гибридной ДНК в 6X SSPE, 5X растворе Денхардта, 0,1% SDS, 0,1 мг/мл денатурированной ДНК [20X SSPE является 3M NaCl, 0,2 M NaHPO₄ и 0,02M ЭДТА (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты); 100X раствор Денхардта является 20 г/л поливинилпиролидона, 20 г/л фиколла типа 400 и 20 г/л бычьего сывороточного альбумина (фракция V)].

Как правило, промывки можно осуществлять следующим образом.

Дважды при комнатной температуре в течение 15 минут в 1X SSPE, 0,1% SDS (промывка низкой строгости).

Однократно при Tm - 20°C в течение 15 минут в 0,2X SSPE, 0,1% SDS (промывка умеренной строгости).

Для олигонуклеотидных зондов гибридизацию можно осуществлять в течение ночи при температуре на 10-20°C ниже Tm гибрида в 6X SSPE, 5X растворе Денхардта, 0,1% SDS, 0,1 мг/мл денатурированной ДНК. Tm для олигонуклеотидных зондов можно определять по следующей формуле (Suggs et al., 1981).

Tm(°C)=2(количество пар оснований T/A) + 4(количество пар оснований G/C)

Как правило, промывки можно осуществлять следующим образом:

Однократно при температуре гибридизации в течение 15 минут в 1X SSPE, 0,1% SDS (промывка умеренной строгости).

Можно предоставлять молекулы зондов для гибридизации и гибридные молекулы, образовавшиеся между зондом и молекулами-мишенями, определяемые средствами, иными, чем мечение радиоактивными изотопами. Такие измененные способы предназначены для включения в объем по данному изобретению.

Все патенты, патентные заявки, предварительные заявки и публикации, упомянутые или цитируемые в настоящем документе, в полном объеме включены в качестве ссылки до тех пор, пока они не противоречат определенным идеям в настоящем описании. Если не указывают специально или предполагают, термины в единственном числе означают "по меньшей мере, один", как применяют в настоящем документе. Посредством применения термина "генетический материал" в настоящем документе обозначают включение всех генов, нуклеиновых кислот, ДНК и РНК.

Для обозначения нуклеотидных остатков полинуклеотидов, ДНК, РНК, олигонуклеотидов и праймеров и для обозначения аминокислотных остатков белков на всем протяжении настоящего документа применяют стандартные сокращения IUPAC. Последовательности нуклеиновой кислоты присутствуют в стандартном направлении от 5' к 3', и белковые последовательности присутствуют в стандартном направлении от амино(N)-конца к карбокси(C)-концу.

Далее следуют примеры, иллюстрирующие способы осуществления изобретения. Следует понимать, что описываемые в настоящем документе примеры и варианты осуществления приводят исключительно в иллюстративных целях, и что, учитывая их, специалист в данной области может предполагать различные модификации или изменения, которые включают в суть и объем настоящей заявки и объем формулы изобретения. Данные примеры не предназначены для ограничения. Все процентные отношения представляют отношения по массе, и все соотношения смеси растворителей представляют соотношения по объему, если не указано иначе. Все температуры указывают в градусах Цельсия.

ПРИМЕР 1

Выделение гена, кодирующего токсин DIG-3

Нуклеиновую кислоту, кодирующую инсектицидный Cry-белок, обозначаемый в настоящем документе как DIG-3, выделяли из геномной ДНК B.t. штамма PS46L посредством ПЦР с применением вырожденного прямого праймера, гибридизованного с основаниями с 1286 по 1311 SEQ ID NO: 1, и несоответствующего обратного праймера, гибридизованного с комплементарными основаниями с 2480 по 2499 SEQ ID NO: 1. Данную пару праймеров применяли для амплификации фрагмента 1214 п.н., соответствующего нуклеотидам с 1286 по 2499 SEQ ID NO: 1. Данную последовательность применяли в качестве опорной точки для начала "прогулки по геному" с применением способов, приспособленных из универсального набора GenomeWalker™ (Clontech, Palo Alto, CA). Определяли последовательность нуклеиновой кислоты фрагмента, перекрывающего кодирующую область DIG-3. SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность 3771 п.н., кодирующую полноразмерный белок DIG-3. SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность полноразмерного белка DIG-3, выведенную из SEQ ID NO: 1. Констатировали, что в видах Bacillus, кодирующие белок области, такие как SEQ ID NO: 1, могут инициироваться кодоном TTG, трансляционно представленным аминокислотой метионин.

ПРИМЕР 2

Делеция α-спиралей домена I из DIG-3

Для улучшения инсектицидных свойств токсина DIG-3 осуществляют серийные пошаговые делеции, каждой из которых удаляют часть N-конца белка DIG-3. Делециями удаляют часть или всю α-спираль 1 и часть или всю α-спираль 2 в домене I, в то же время сохраняя структурную целостность с α-спирали 3 по α-спираль 7.

Делеции конструировали следующим образом. В данном примере применяют полноразмерную химерную последовательность ДНК, кодирующую полноразмерный белок DIG-3, например, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно, для иллюстрации принципов конструирования с 67 специфическими вариантами. В нем применяют химерную последовательность SEQ ID NO: 5 (ДНК, кодирующую сегмент основного токсина DIG-3, слитого с сегментом протоксина Cry1Ab) для обеспечения дополнительных 67 конкретных вариантов. Специалисту в данной области будет понятно, что для достижения желаемого результата аналогично можно воздействовать на другие последовательности ДНК, кодирующие весь белок DIG-3 или его N-концевую часть. Для конструирования первого варианта кодирующей последовательности с делецией удаляют все основания, кодирующие α-спираль 1 до кодона для пролинового остатка рядом с началом α-спирали 2A (т.е. P73 для полноразмерного белка DIG-3 SEQ ID NO: 2). Таким образом, удалением оснований с 1 по 216 SEQ ID NO: 1 удаляют кодирующую последовательность для аминокислот с 1 по 72 SEQ ID NO: 2. Обеспечивают реинтродукцию трансляции инициирующего кодона ATG (метионин) в начале (т.е. перед кодоном, соответствующим аминокислоте 73 полноразмерного белка) для варианта кодирующей последовательности с делецией, содержащего открытую рамку считывания в 3555 оснований, кодирующую вариант белка DIG-3 с делецией, содержащий 1185 аминокислот (т.е. метионин и аминокислоты с 73 по 1256 полноразмерного белка DIG-3). Серийные пошаговые делеции, которыми удаляют дополнительные кодоны для отдельной аминокислоты, соответствующие остаткам с 73 по 112 полноразмерного белка DIG-3 SEQ ID NO: 2, обеспечивают варианты без части или всей α-спирали 2A и α-спирали 2B. Таким образом, второй сконструированный вариант кодирующей последовательности с делецией требует удаления оснований с 1 по 219 SEQ ID NO: 1, таким образом, удаления кодирующей последовательности для аминокислот 1-73. Восстановление функциональной открытой рамки считывания снова осуществляют реинтродукцией трансляции инициирующего кодона метионина в начале оставшейся кодирующей последовательности, таким образом предоставляя второй вариант кодирующей последовательности с делецией, обладающий открытой рамкой считывания в 3552 оснований, кодирующих вариант белка DIG-3 с делецией, содержащий 1184 аминокислот (т.е. метионин и аминокислоты с 74 по 1256 полноразмерного белка DIG-3). Последний сконструированный вариант кодирующей последовательности с делецией требует удаления оснований с 1 по 336 SEQ ID NO: 1, таким образом, удаления кодирующей последовательности для аминокислот с 1 по 112, и после реинтродукции трансляции инициирующего кодона метионина предоставляют вариант кодирующей последовательности с делецией, обладающий открытой рамкой считывания в 3435 оснований, кодирующих вариант белка DIG-3 с делецией, содержащий 1145 аминокислот (т.е. метионин и аминокислоты с 113 по 1256 полноразмерного белка DIG-3). В качестве примера, после удаления последовательности делеции инициирующий кодон метионина добавляют в начало кодирующей последовательности для восстановления функциональной открытой рамки считывания. Как также описывают, необходимо добавлять дополнительный кодон глицина между кодоном метионина и кодоном для определяющей нестабильность аминокислоты в случаях, когда удаление делетированной последовательности оставляет открытыми на N-конце оставшейся части полноразмерного белка одну из определяющих нестабильность аминокислот, как указывают выше.

В таблице 3 описывают конкретные варианты, обозначаемые по стратегии, описанной выше.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие токсины, описываемые в таблице 3, обозначают по общепринятым принципам для синтетических генов, предназначенных для экспрессии в растениях, как указано выше.

ПРИМЕР 3

Конструирование оптимизированной для растений версии кодирующей последовательности для инсектицидного белка DIG-3 B.t.

Конструировали и синтезировали последовательность ДНК, обладающую растительным отклонением в применении кодонов, для получения белка DIG-3 в трансгенных однодольных и двудольных растениях. Таблицу применения кодонов для кукурузы (Zea mays L.) вычисляли из 706 кодирующих белки последовательностей (CD), получаемых из последовательностей, хранящихся в GenBank. Таблицы применения кодонов для табака (Nicotiana tabacum, 1268 CD), канолы (Brassica napus, 530 CD), хлопка (Gossypium hirsutum, 197 CDs) и сои (Glycine max; ca. 1000 CD) загружали из данных на веб-сайте http://www.kazusa.or.jp/codon/. Отклоняющийся набор кодонов, содержащий часто применяемые кодоны, общие для массивов данных кукурузы и двудольных, в соответствующих средневзвешенных относительных количествах вычисляли после исключения любого лишнего кодона, применяемого менее чем приблизительно в 10% общего применения кодонов для данной аминокислоты в любом типе растений. Для получения оптимизированной для растений последовательности, кодирующей белок DIG-3, осуществляли замены кодонов экспериментально определенной последовательности DIG-3 ДНК таким образом, что получаемая последовательность ДНК обладала общей композицией кодонов таблицы оптимизированного для растений отклонения от применения кодонов. Дополнительные обработки последовательности осуществляли для удаления нежелательных участков распознавания ферментов рестрикции, потенциальных участков сплайсинга в интронах растений, длинных участков остатков A/T или C/G и других мотивов, которые могут помешать стабильности РНК, транскрипции или трансляции кодирующей области в растительных клетках. Осуществляли другие изменения для встраивания желаемых участков распознавания ферментов рестрикции и для удаления длинных внутренних открытых рамок считывания (рамок, иных чем +1). Данные изменения полностью осуществляли в условиях сохранения растительного отклонения в композиции кодонов. Синтез сконструированной последовательности осуществляли посредством коммерческого производителя (DNA 2.0, Menlo Park, CA).

Дополнительное руководство в отношении получения синтетических генов можно найти, например, в WO 97/13402 и патенте США № 5380831.

Оптимизированную для растений последовательность ДНК, кодирующую полноразмерный токсин DIG-3, указывают в SEQ ID NO: 3. Оптимизированную для двудольных последовательность ДНК, кодирующую сегмент протоксина Cry1Ab, описывают как SEQ ID NO: 6. Оптимизированную для кукурузы последовательность ДНК, кодирующую сегмент протоксина Cry1Ab, описывают как SEQ ID NO: 7.

ПРИМЕР 4

Конструирование экспрессирующих плазмид, кодирующих инсектицидный токсин DIG-3, и экспрессия в бактериальных хозяевах

В конструировании экспрессирующих плазмид Pseudomonas fluorescens (Pf), сконструированных для получения полноразмерных белков DIG-3, кодируемых оптимизированными для растений кодирующими областями, применяли стандартные способы клонирования. Эндонуклеазы рестрикции получали в New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) и для лигирования ДНК применяли ДНК-лигазу T4 (Invitrogen). Получение плазмид осуществляли с применением NucleoBond® Xtra Kit (Macherey-Nagel Inc, Bethlehem, PA) или Plasmid Midi Kit® (Qiagen), следуя руководству производителя. Фрагменты ДНК очищали с применением картриджа Millipore Ultrafree®-DA (Billerica, MA) после электрофореза в агарозном геле с применением Трис-ацетата.

Основная стратегия клонирования включает субклонирование кодирующей последовательности (CDS) токсина DIG-3 в pDOW1169 в участках рестрикции SpeI и XhoI, таким образом, что ее помещают под контроль экспрессии промотором Ptac и терминатором rrnBT1T2 из плазмиды pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). pDOW1169 является плазмидой средней копийности с участком начала репликации RSF1010, геном pyrF и участком связывания рибосомы, предшествующим участкам распознавания ферментов рестрикции, в которые можно встраивать фрагменты ДНК, содержащие кодирующие белок области (патентная заявка США № 20080193974). Экспрессирующую плазмиду, обозначаемую pDAB4171, трансформировали электропорацией в DC454 (близкий дикому типу штамм P. fluorescens, обладающий мутациями ΔpyrF и lsc::lacl^QI), или его производные, выделяли в гидролизатной среде SOC-Soy и высевали на селективную среду (M9 глюкозный агар с недостатком урацила, Sambrook et al., выше). Подробности микробиологических работ доступны в Squires et al., (2004), патентной заявке США № 20060008877, патентной заявке США № 20080193974 и патентной заявке США № 20080058262, включенных в настоящий документ в качестве ссылки. Сначала колонии исследовали ПЦР и затем исследовали положительные колонии посредством рестрикционной обработки минипрепарата плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК выбранных клонов, содержащую вставки, секвенировали с применением Big Dye® Terminator version 3.1 по рекомендациям производителя (Applied Biosystems/Invitrogen) или по договору с коммерческим производителем, осуществляющим секвенирование (MWG Biotech, Hunts ville, AL). Данные о последовательности собирали и анализировали с применением программного обеспечения Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).

Анализ роста и экспрессии во встряхиваемых колбах. Получение токсина DIG-3 для определения характеристик и биологический анализ насекомых осуществляли выращиванием во встряхиваемых колбах штаммов P. fluorescens, несущих экспрессирующие конструкции (например, клон DP2826). Для инокуляции 50 мл определенной минимальной среды с 5% глицерином (Teknova Catalog No. 3D7426, Hollister, CA) применяли высеваемые культуры, выращиваемые в среде M9, дополненной 1% глюкозой и микроэлементами. Экспрессию гена токсина DIG-3 через промотор Ptac индуцировали добавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) после начальной инкубации в течение 24 часов при 30°C со встряхиванием. Культуры отбирали во время индукции и в различное время после индукции. Плотность клеток измеряли по оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀). Также можно применять другие среды для культивирования, подходящие для выращивания Pseudomonas fluorescens, например, как описано в Huang et al. (2007) и патентной заявке США № 20060008877.

Фракционирование клеток и электрофоретический анализ образцов во встряхиваемых колбах в SDS-ПААГ. В каждый момент отбора проб плотность клеток в образцах доводили до OD₆₀₀=20 и центрифугировали аликвоты 1 мл при 14000×g в течение пяти минут. Клеточный осадок замораживали при -80°C. Получали растворимые и нерастворимые фракции из образцов клеточного осадка из встряхиваемых колб с применением раствора для экстракции бактериальных белков EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Каждый клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл раствора EasyLyse™ и дополнительно разводили в отношении 1:4 в лизирующем буфере и инкубировали со встряхиванием при комнатной температуре в течение 30 минут. Лизат центрифугировали при 14000 об./мин в течение 20 минут при 4°C и восстанавливали супернатант в качестве растворимой фракции. Затем осадок (нерастворимую фракцию) ресуспендировали в равном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS; 11,9 мМ Na₂HPO₄, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, pH 7,4).

Образцы смешивали в отношении 1:1 с 2X буфером для образцов Лемли, содержащим β-меркаптоэтанол (Sambrook et al., указанный выше), и кипятили в течение 5 минут до нанесения в 12% бис-Трис гели Criterion XT® (Bio-Rad Inc., Hercules, CA.) Электрофорез осуществляли в рекомендуемом буфере XT MOPS. Гели окрашивали биологически безопасным красителем Кумасси по протоколу производителя (Bio-Rad) и визуализировали с применением системы визуализации Alpha Innotech (San Leandro, CA).

Получение телец включения. Получение телец включения (IB) Cry-белка осуществляли на клетках из культур P. fluorescens, продуцирующих нерастворимый инсектицидный белок B.t., как показано SDS-электрофорезом в ПААГ и MALDI-MS (масс-спектрометрией с лазерной десорбцией/ионизацией в присутствии матрицы). Осадки культур P. fluorescens оттаивали на водяной бане при 37°C. Клетки ресуспендировали до 25% масс./об. в лизирующем буфере (50 мМ Трис, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 20 мМ динатриевой соли ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты), 1% Тритон X-100 и 5 мМ дитиотреитола (DTT); 5 мл/л смеси бактериальных ингибиторов протеазы (P8465 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) добавляли непосредственно перед применением. Клетки суспендировали с применением ручного гомогенизатора при самых низких параметрах (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Лизоцим (25 мг Sigma L7651 из белка куриного яйца) добавляли в клеточную суспензию посредством смешивания металлическим шпателем и суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Суспензию охлаждали на льду в течение 15 минут, затем подвергали воздействию ультразвуком с применением Branson Sonifier 250 (два сеанса по 1 минуте при 50% рабочем цикле, 30% мощности). Лизис клеток проверяли микроскопией. В случае необходимости добавляли дополнительные 25 мг лизоцима и повторяли инкубацию и воздействие ультразвуком. После подтверждения лизиса клеток микроскопией лизат центрифугировали при 11500×g в течение 25 минут (4°C) для образования осадка IB и отбрасывали супернатант. Осадок IB ресуспендировали с 100 мл лизирующего буфера, гомогенизировали ручным миксером и центрифугировали, как указано выше. Осадок IB последовательно промывали ресуспендированием (в 50 мл лизирующего буфера), гомогенизацией, воздействием ультразвука и центрифугированием, пока супернатант не становился бесцветным и осадок IB не становился твердым и грязно-белым по цвету. Для окончательной промывки осадок IB ресуспендировали в стерильно фильтрованной (0,22 мкм) дистиллированной воде, содержащей 2 мМ ЭДТА, и центрифугировали. Конечный осадок ресуспендировали в стерильно фильтрованной дистиллированной воде, содержащей 2 мМ ЭДТА, и хранили в 1 мл аликвотах при -80°C.

Электрофоретический анализ в SDS-ПААГ и количественный анализ белка в IB препаратах осуществляли оттаиванием 1 мл аликвоты осадка IB и разведением в отношении 1:20 стерильно фильтрованной дистиллированной водой. Затем разведенный образец кипятили с 4X восстанавливающим буфером для образцов [250 мМ Трис, pH 6,8, 40% глицерин (об./об.), 0,4% бромфеноловый синий (масс./об.), 8% SDS (масс./об.) и 8% β-меркаптоэтанол (об./об.)] и наносили на 4-20% Трис-глициновый Novex®, в геле с 12+2 лунками (Invitrogen) проводили электрофорез с 1X буфером Трис/Глицин/SDS (BioRad). Электрофорез в геле проводили в течение 60 мин при 200 вольтах, затем окрашивали Кумасси синим (50% G-250/50% R-250 в 45% метанола, 10% уксусной кислоты) и обесцвечивали 7% уксусной кислотой, 5% метанолом в дистиллированной воде. Количественный анализ целевых полос осуществляли сравнением денситометрических величин полос с образцами бычьего сывороточного альбумина (BSA), нанесенного на тот же гель для получения стандартной кривой.

Растворение телец включения. Шесть мл суспензии телец включения из клона Pf DP2826 (содержащей 32 мг/мл белка DIG-3) центрифугировали при самых высоких параметрах на микроцентрифуге Eppendorf модели 5415C (приблизительно 14000×g) для осаждения включений. Удаляли супернатант буфера для хранения и заменяли его на 25 мл 100 мМ буфера карбоната натрия, pH 11 в конической пробирке 50 мл. Включения ресуспендировали с применением пипетки и перемешивали на центрифуге типа вортекс для тщательного перемешивания. Помещали пробирку на тихо качающуюся платформу при 4°C в течение ночи для экстракции целевого белка. Экстракт центрифугировали при 30000×g в течение 30 мин при 4°C и получаемый супернатант концентрировали в 5 раз с применением центрифужного фильтрационного устройства Amicon Ultra-15 с регенерируемой целлюлозой (отсечение по молекулярной массе 30000; Millipore). Буфер для образцов меняли на 10 мМ CAPS [3-(циклогексамино)1-пропансульфоновую кислоту] pH 10 с применением одноразовых колонок PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Электрофорез в геле. Концентрированный экстракт готовили для электрофореза, разводя в отношении 1:50 в буфере для образцов NuPAGE® LDS (Invitrogen), содержащем 5 мМ дитиотреитол в качестве восстановителя, и нагревали при 95°C в течение 4 минут. Образец наносили в дублированные дорожки в 4-12% гель NuPAGE® рядом с пятью стандартами BSA в диапазоне от 0,2 до 2 мкг/дорожку (для получения стандартной кривой). Применяли вольтаж 200 В с применением электродного буфера MOPS SDS (Invitrogen) до достижения подвижным красителем низа геля. Гель окрашивали 0,2% Кумасси синим G-250 в 45% метанола, 10% уксусной кислоты и обесцвечивали сначала кратко 45% метанола, 10% уксусной кислоты, и затем продолжительно 7% уксусной кислоты, 5% метанола до осветления фона. После обесцвечивания гель сканировали с помощью Biorad Fluor-S Multilmager. Прилагаемое к инструменту программное обеспечение Quantity One v.4.5.2 применяли для получения объемов полос окрашиваемого белка с вычитанием фона и для получения стандартной кривой BSA, применяемой для вычисления концентрации белка DIG-3 в стоковом растворе.

ПРИМЕР 5

Инсектицидная активность модифицированного белка DIG-3, продуцируемого в Pseudomonas fluorescens

Инсектицидный токсин DIG-3 B.t. демонстрировал активность на видах Lepidoptera, включая мотылька кукурузного(ECB; Ostrinia nubilalis (Hϋbner)), Cry1F-устойчивый ECB (rECB), моль капустную (DBM; Plutella xylostella (Linnaeus)), Cry1A-устойчивый DBM (rDBM), совку хлопковую (CEW; Helicoverpa zea (Boddie)), совку-ипсилон (BCW; Agrotis ipsilon (Hufnagel)), табачную листовертку (TBW; Heliothis virescens (Fabricius)) и совку капустную (CL; Trichoplusia ni (Hϋbner)). Также белок DIG-3 тестировали на активность в отношении совки травяной (FAW, Spodoptera frugiperda), Cry1F-устойчивого FAW (rFAW) и западного кукурузного жука (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte).

Получение образца и биологические анализы. Препараты телец включения в 10 мМ CAPS pH 10 разбавляли соответствующим образом в 10 мМ CAPS pH 10, и все биологические анализы включали контрольную обработку, состоящую из данного буфера, служившего в качестве проверки данных для смертности или ингибирования роста.

Концентрации белка в буфере для биологического анализа оценивали электрофорезом в геле с применением BSA для получения стандартной кривой для денситометрии геля, измеряемой с применением системы визуализации BioRad (Fluor-S Multilmager с программным обеспечением Quantity One version 4.5.2). Белки в матрице геля окрашивали красителем на основе Кумасси синего и обесцвечивали до считывания.

Очищенные белки тестировали на инсектицидную активность в биологических анализах, проводимых с новорожденной личинкой Lepidoptera на искусственной пище для насекомых. Личинки BCW, CEW, CL, DBM, rDBM, ECB, FAW и TBW вылуплялись из яиц, получаемых из колоний, поддерживаемых в коммерческом инсектарии (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). Яйца WCR получали из Crop Characteristics, Inc. (Farmington, MN). Личинки rECB и rFAW вылуплялись из яиц, собираемых из собственных колоний (Dow AgroSciences LLC, Indianapolis, IN).

Биологические анализы проводили в 128-луночных пластиковых лотках, специально сконструированных для биологических анализов насекомых (C-D International, Pitman, NJ). Каждая лунка содержала 1,0 мл мультивидовой пищи Lepidoptera (Southland Products, Lake Village, AR). Аликвоту образца белка 40 мкл переносили пипеткой на 1,5 см² поверхности пищи в каждой лунке (26,7 мкл/см²). Концентрации пищи вычисляли как количество (нг) белка DIG-3 на сантиметр квадратный (см²) площади поверхности в лунке. Обработанные лотки хранили в вытяжном шкафу до испарения жидкости на поверхности пищи или абсорбировании в пищу.

В течение нескольких часов вылупления отдельные личинки собирали увлажненной кистью из верблюжьей шерсти и наносили на обработанную пищу, одну личинку на лунку. Затем наполненные лунки плотно закрывали листами чистого пластика с отверстиями, делающими возможным газообмен (C-D International, Pitman, NJ). Лотки для биологического анализа хранили в контролируемых условиях окружающей среды (28°C, относительная влажность ~40%, 16:8 [Светлое время:Темное время]) в течение 5 дней, после чего записывали общее количество насекомых, подвергнутых воздействию каждого образца белка, количество погибших насекомых и вес выживших насекомых. Процент смертности и процент ингибирования роста вычисляли для каждой обработки. Ингибирование роста (GI) вычисляли следующим образом:

GI=[1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)],

где TWIT является общим весом насекомых при обработке,

TNIT является общим количеством насекомых при обработке,

TWIBC является общим весом насекомых при проверке данных (контроль буфера), и

TNIBC является общим количеством насекомых при проверке данных (контроль буфера).

GI50 определяли как концентрацию белка DIG-3 в пище, при которой величина GI составляла 50%. LC50 (50% летальная концентрация) записывали как концентрацию белка DIG-3 в пище, при которой 50% тестируемых насекомых погибало. Статистический анализ (односторонний ANOVA) осуществляли с применением программного обеспечения JMP (SAS, Cary, NC).

В таблице 6 представлены результаты тестов биологического анализа белка DIG-3 на мотыльке кукурузном и Cry1F-устойчивом мотыльке кукурузном (rECB). Неожиданным и удивительным результатом являлось то, что тестируемые насекомые rECB являлись также восприимчивы к действию белка DIG-3, как и насекомые ECB дикого типа.

В таблице 7 представлены результаты биологических анализов на широком спектре Lepidoptera и насекомом-вредителе Coleoptera (WCR). Белок DIG-3 обладал неожиданной и удивительной активностью по отношению к моли капустной, а также rDBM. Кроме того, Cry-белок DIG-3 является эффективным в контроле роста нескольких других насекомых Lepidoptera.

*GI=Ингибирование роста. P-value=статистический критерий, df=степени свободы, α (альфа) уровень 0,05=уровень тестовой значимости.

ПРИМЕР 6

Трансформация Agrobacterium

В конструировании бинарных плазмид для трансформации растений и экспрессии применяли стандартные способы клонирования. Эндонуклеазы рестрикции и ДНК-лигазу T4 получали из NEB. Получение плазмид осуществляли с применением набора для получения плазмид NucleoSpin® или NucleoBond® AX Xtra Midi kit (оба из Macherey-Nagel), следуя инструкциям производителя. Фрагменты ДНК очищали с применением набора для очистки продуктов ПЦР QIAquick® или набора для экстракции из геля QIAEX II® (оба из Qiagen) после выделения из геля.

Фрагменты ДНК, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие белок DIG-3 в нативной или модифицированной формах или его фрагменты, можно синтезировать с помощью коммерческого поставщика (например, DNA 2.0, Menlo Park, CA), и их могут поставлять в качестве клонированных фрагментов в стандартных плазмидных векторах, или их можно получать стандартной молекулярно-биологической манипуляцией с другими конструкциями, содержащими подходящие нуклеотидные последовательности. Можно идентифицировать уникальные участки рестрикции внутри кодирующей области DIG-3 и можно синтезировать фрагменты ДНК, содержащие последовательности между участками рестрикции кодирующей области DIG-3, каждый такой фрагмент, кодирующий специфическую делецию, инсерцию или другой вариант DIG-3. Фрагменты ДНК, кодирующие модифицированные фрагменты DIG-3, можно соединять с другими фрагментами DIG-3 или другими фрагментами кодирующей области Cry в соответствующих участках рестрикции для получения кодирующей области, кодирующей желаемый полноразмерный белок DIG-3, белок DIG-3 с делецией или вариант белка DIG-3, или слитый белок. Например, можно идентифицировать соответствующий участок распознавания рестриктазы у начала первой кодирующей области DIG-3, и второй участок рестрикции внутри кодирующей области DIG-3. Расщепление первой кодирующей области DIG-3 в данных участках рестрикции будет приводить к образованию фрагмента ДНК, содержащего часть первой кодирующей области DIG-3. Второй фрагмент ДНК, фланкируемый аналогично расположенными совместимыми участками рестрикции, специфичными для другой кодирующей области DIG-3 или другой кодирующей области Cry, можно применять в сочетании с первым рестрикционным фрагментом ДНК для конструирования варианта или слитого клона.

В неограничивающем примере основной стратегией клонирования может являться субклонирование полноразмерных или модифицированных кодирующих последовательностей (CDS) DIG-3 в растительную экспрессирующую плазмиду по участкам рестрикции NcoI и SacI. Получаемые растительные экспрессирующие кассеты, содержащие соответствующую кодирующую область DIG-3 под контролем растительных экспрессирующих элементов (например, растительных экспрессируемых промоторов, 3'-концевых детерминант терминации транскрипции и полиаденилирования и т.п.), субклонируют в бинарный плазмидный вектор с применением, например, технологии Gateway® или стандартных способов клонирования фрагментов с применением ферментов рестрикции. Например, если применяют технологию Gateway®, для рекомбинации полноразмерного и модифицированного гена в растительных экспрессирующих кассетах в бинарной растительной трансформирующей плазмиде можно применять LR Clonase™ (Invitrogen). Удобно применять бинарный растительный трансформирующий вектор, содержащий бактериальный ген, придающий устойчивость к антибиотику спектиномицину, когда плазмида присутствует в клетках E. coli и Agrobacterium. Также удобно применять бинарный плазмидный вектор, содержащий экспрессируемый растениями ген селективного маркера, являющийся функциональным в желаемых растениях-хозяевах. Примеры экспрессируемых растениями генов селективных маркеров включают, в качестве неограничивающих примеров, кодирующие ген аминогликозидфосфотрансферазы (aphII) транспозона Tn5, придающего устойчивость к антибиотикам канамицину, неомицину и G418, а также гены, кодирующие устойчивость или сопротивляемость глифосату; гигромицину; метотрексату; фосфинотрицину (биалафосу), имидазолинонам, сульфонилкарбамидам и триазолопиримидиновым гербицидам, таким как хлорсульфурон, бромоксинил, далапон и т.п.

Электрокомпетентные клетки Agrobacterium tumefaciens штамма Z707S (стрептомицин-устойчивое производное Z707; Hepburn et al., 1985) получали и трансформировали с применением электропорации (Weigel и Glazebrook, 2002). После электропорации добавляли в кювету 1 мл жидкой среды YEP (г/л: дрожжевого экстракта, 10; пептона, 10; NaCl, 5) и суспензию клеток и YEP переносили в 15 мл культуральную пробирку для инкубации при 28°C на водяной бане с постоянным перемешиванием в течение 4 часов. Клетки высевали на YEP и агар (25 г/л) со спектиномицином (200 мкг/мл) и стрептомицином (250 мкг/мл) и чашки инкубировали в течение 2-4 дней при 28°C. Выбирают хорошо отделенные колонии и высевают штрихами на чашки со свежим YEP + агар со спектиномицином и стрептомицином, как указано выше, и инкубируют при 28°C в течение 1-3 дней.

Наличие гена DIG-3, встроенного в бинарный растительный трансформирующий вектор, анализируют посредством ПЦР с применением вектор-специфичных праймеров с матрицей плазмидной ДНК, получаемой из выбранных колоний Agrobacterium. Осадок клеток из 4 мл аликвоты 15 мл ночной культуры, выращенной на YEP со спектиномицином и стрептомицином, как указано выше, выделяют с применением Qiagen Spin® Mini Preps по инструкциям производителя. Плазмидную ДНК из бинарного вектора, применяемого в трансформации Agrobacterium электропорацией, включают в качестве контроля. Реакцию ПЦР осуществляют с применением ДНК-полимеразы Taq из Invitrogen по инструкциям производителя при 0,5X концентрациях. Реакции ПЦР осуществляют в программируемом термоциклере с элементами Пельтье MJ Research со следующими условиями: Шаг 1) 94°C в течение 3 минут; Шаг 2) 94°C в течение 45 секунд; Шаг 3) 55°C в течение 30 секунд; Шаг 4) 72°C в течение 1 минуты на т.п.н. длины ожидаемого продукта; Шаг 5) 29 раз до Шага 2; Шаг 6) 72°C в течение 10 минут. Реакцию поддерживают при 4°C после цикла. Продукты амплификации анализируют электрофорезом в агарозном геле (например, от 0,7% до 1% агарозы, масс./об.) и визуализируют окрашиванием бромистым этидием. Выбирают те колонии, продукты которых являются идентичными контрольной плазмиде.

Альтернативно, анализ структуры плазмиды бинарного растительного трансформирующего вектора, содержащего вставку гена DIG-3, осуществляют расщеплением рестриктазами при картировании фингерпринтингом плазмидной ДНК, получаемой из подходящих изолятов Agrobacterium стандартными способами молекулярной биологии, хорошо известными специалистам в области манипуляций с Agrobacterium.

Специалистам в области получения трансформированных растений через Agrobacterium-опосредованные способы трансформации будет понятно, что с успехом можно применять другие штаммы Agrobacterium помимо Z707S, и выбор штамма может зависеть от идентичности трансформируемых видов растений-хозяев.

ПРИМЕР 7

Получение инсектицидных белков DIG-3 B.t. и их вариантов в двудольных растениях

Трансформация Arabidopsis . Arabidopsis thaliana Col-01 трансформировали с применением способа обмакивания цветка (Weigel и Glazebrook, 2002). Для инокуляции от 1 мл до 15 мл культур в жидкой среде YEP, содержащей соответствующие антибиотики для селекции, применяют выбранную колонию Agrobacterium. Культуру инкубируют в течение ночи при 28°C с постоянным перемешиванием при 220 об./мин. Каждую культуру применяют для инокуляции двух 500 мл культур в жидкой среде YEP, содержащей соответствующие антибиотики для селекции, и новые культуры инкубируют в течение ночи при 28°C с постоянным перемешиванием. Клетки осаждают при приблизительно 8700×g в течение 10 минут при комнатной температуре и отбрасывают получаемый супернатант. Осадок клеток осторожно ресуспендируют в 500 мл инфильтрационных сред, содержащих: 1/2x солей Мурашиге-Скуга (Sigma-Aldrich)/витамины B5 по Gamborg (Gold BioTechnology, St. Louis, MO), 10% (масс./об.) сахарозы, 0,044 мкМ бензиламинопурина (10 мкл/литр из 1 мг/мл стока в DMSO) и 300 мкл/литр Silwet L-77. Растения возрастом приблизительно 1 месяц погружают в среды в течение 15 секунд, осторожно собирая для обеспечения погружения новейших соцветий. Затем растения кладут набок и покрывают (прозрачным или непрозрачным) в течение 24 часов, промывают водой и помещают вертикально. Растения выращивают при 22°C с фотопериодом 16 часов светлого времени/8 часов темного времени. Приблизительно через 4 недели после погружения собирают семена.

Выращивание и селекция Arabidopsis . Свежесобранному семени T1 позволяют высыхать, по меньшей мере, в течение 7 дней при комнатной температуре в присутствии осушителя. Семя суспендируют в 0,1% растворе агар/вода (Sigma-Aldrich) и затем кладут слоями при 4°C в течение 2 дней. Для приготовления к высадке Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) в лотках для проращивания размером 10,5 дюймов×21 дюйм (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN) покрывают тонким вермикулитом, орошаемым раствором Хогланда (Hoagland и Arnon, 1950) до увлажнения, затем позволяют стекать в течение 24 часов. Разложенные слоями семена сеют на вермикулит и покрывают увлажняющими куполами (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada) на 7 дней. Семена прорастают, и растения выращивают в Conviron (модели CMP4030 или CMP3244; Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) в условиях длинного дня (16 часов светлого времени/8 часов темного времени) при интенсивности света 120-150 мкмоль/м²сек при постоянной температуре (22°C) и влажности (40-50%). Исходно растения смачивали раствором Хогланда и затем деионизированной водой для сохранения почвы влажной, но не мокрой.

Купола удаляли через 5-6 дней после высевания и растения опрыскивали средством химической селекции для гибели растений, проросших из нетрансформированных семян. Например, если экспрессируемый растением ген селективного маркера, введенный бинарным растительным трансформирующим вектором, является геном pat или bar (Wehrmann et al., 1996), трансформированные растения можно отбирать распылением 1000X раствора Finale (5,78% глуфосинат аммония, Farnam Companies Inc., Phoenix, AZ.). Два последовательных распыления осуществляли с 5-7-дневными интервалами. Выживших (активно растущие растения) идентифицировали через 7-10 дней после конечного распыления и пересаживали в горшки, подготовленные с Sunshine Mix LP5. Пересаженные растения покрывали увлажняющим куполом на 3-4 дня и помещали в Conviron в указанных выше условиях роста.

Специалистам в области трансформации двудольных растений будет понятно, что доступными являются другие способы селекции трансформированных растений, когда применяют другие экспрессируемые растениями гены селективных маркеров {например, гены сопротивляемости гербицидам).

Биологические анализы действия на насекомых трансгенного Arabidopsis . Трансгенные линии Arabidopsis, экспрессирующие модифицированные Cry-белки, демонстрируют активность против чувствительных видов насекомых в анализах с наложением искусственной пищи. Белок, экстрагированный из трансгенных и нетрансгенных линий Arabidopsis, количественно анализировали соответствующими способами и регулировали объемы образцов для нормализации концентрации белка. Биологические анализы проводили на искусственной пище, как описано выше. Нетрансгенный Arabidopsis и/или буфер и воду включают в анализы в качестве обработок при проверке данных.

ПРИМЕР 8

Трансформация Agrobacterium для получения супербинарных векторов

Супербинарную систему Agrobacterium общепринято применяют для трансформации однодольных растений-хозяев. Способы конструирования и валидации супербинарных векторов хорошо описаны и включены в настоящий документ в качестве ссылки (Operating Manual for Plasmid pSB1, Version 3.1, поставляемый Japan Tobacco, Inc., Tokyo, Japan). Для получения супербинарных плазмид применяют стандартные молекулярно-биологические и микробиологические способы. Верификацию/валидацию структуры супербинарной плазмиды осуществляют с применением способов, описанных выше для бинарных векторов, и их можно модифицировать, как указано в Operating Manual for Plasmid pSB1.

ПРИМЕР 9

Получение инсектицидных белков DIG-3 B.t. и их вариантов в однодольных растениях

Agrobacterium -опосредованная трансформация кукурузы. Семена из гибрида High II F1 (Armstrong et al., 1991) высаживают в 5-галонные горшки, содержащие смесь 95% беспочвенной среды для выращивания Metro-Mix 360 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) и 5% глины/суглинка. Растения выращивают в теплице с применением сочетания натриевых и металлогалогеновых ламп высокого давления с фотопериодом 16:8 часов светлого времени:темного времени. Для получения незрелых зародышей F2 для трансформации осуществляют контролируемые родственные опыления. Незрелые зародыши выделяют на 8-10 день после опыления, когда зародыши обладают размером приблизительно от 1,0 до 2,0 мм.

Инфицирование и совместное культивирование. Початки кукурузы поверхностно стерилизуют чисткой с жидким мылом, погружением в 70% этанол в течение 2 минут и затем погружением в 20% коммерческий отбеливатель (0,1% гипохлорит натрия) в течение 30 минут до ополаскивания стерильной водой. Суспензию клеток Agrobacterium, содержащую супербинарный вектор, готовят переносом 1-2 петель бактерий, выращенных на твердой среде YEP, содержащей 100 мг/л спектиномицина, 10 мг/л тетрациклина и 250 мг/л стрептомицина, при 28°C в течение 2-3 дней в 5 мл жидкой среды для инфицирования (минимальная среда LS (Linsmaier и Skoog, 1965), витамины N6 (Chu et al, 1975), 1,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D), 68,5 г/л сахарозы, 36,0 г/л глюкозы, 6 мМ L-пролин, pH 5,2), содержащей 100 мкМ ацетосирингона. Раствор перемешивали на центрифуге типа вортекс до достижения однородной суспензии, и концентрацию доводили до конечной плотности приблизительно 200 единиц Клетта с применением колориметра Клетта-Саммерсона с фиолетовым фильтром или оптической плотности приблизительно 0,4 при 550 нм. Незрелые зародыши выделяют непосредственно в микроцентрифужной пробирке, содержащей 2 мл среды для инфицирования. Среду удаляют и заменяют на 1 мл раствора Agrobacterium с плотностью 200 единиц Клетта, и раствор Agrobacterium и эмбрионов инкубируют в течение 5 минут при комнатной температуре и затем переносят в среду для совместного культивирования (минимальная среда LS, витамины N6, 1,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, 30,0 г/л сахарозы, 6 мМ L-пролин, 0,85 мг/л AgNO₃, 100 мкМ ацетосирингон, 3,0 г/л геллановой камеди (PhytoTechnology Laboratories., Lenexa, KS), pH 5,8) в течение 5 дней при 25°C в темноте.

После совместного культивирования зародыши переносили на селективную среду, после чего за курс из приблизительно 8 недель получали трансформированные изоляты. Для селекции тканей кукурузы, трансформированных супербинарной плазмидой, содержащей экспрессируемые в растениях гены селективного маркера pat или bar, применяли среду на основе LS (минимальная среда LS, витамины N6, 1,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, 0,5 г/л MES (моногидрата 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты; PhytoTechnologies Labr.), 30,0 г/л сахарозы, 6 мМ L-пролин, 1,0 мг/л AgNO₃, 250 мг/л цефотаксима, 2,5 г/л геллановой камеди, pH 5,7) с биалафосом (Gold BioTechnology). Зародыши переносят на селективные среды, содержащие 3 мг/л биалафоса, до получения изолятов способных к росту зародышей. Повышают массу извлеченных изолятов переносом на свежую селективную среду с 2-недельными интервалами для регенерации и дополнительного анализа.

Специалистам в области трансформации кукурузы будет понятно, что доступными являются другие способы селекции трансформированных растений, когда применяют другие экспрессируемые растениями гены селективных маркеров (например, гены сопротивляемости гербицидам).

Регенерация и получение семян. Для регенерации культуры переносят на индукционную среду "28" (соли и витамины MS, 30 г/л сахарозы, 5 мг/л бензиламинопурина, 0,25 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, 3 мг/л биалафоса, 250 мг/л цефотаксима, 2,5 г/л геллановой камеди, pH 5,7) на 1 неделю в условиях низкой освещенности (14 мкЕ·м^-2·сек^-1), затем на 1 неделю в условиях высокой освещенности (приблизительно 89·мкЕ м^-2·сек^-1). Затем ткани переносят на регенерационную среду "36" (ту же, что и индукционная среда за исключением отсутствия регуляторов роста растений). Когда ростки вырастают до 3-5 см в длину, их можно переносить в стеклянную культуральную пробирку, содержащую среду SHGA (соли Шенка и Хильдебрандта и витамины (1972); PhytoTechnologies Labr.), 1,0 г/л миоинозитола, 10 г/л сахарозы и 2,0 г/л геллановой камеди, pH 5,8), для того, чтобы делать возможным дальнейший рост и развитие побега и корней. Растения пересаживают в ту же смесь почв, как описано выше в настоящем документе, и выращивают до цветения в теплице. Осуществляют контролируемые опыления для получения семян.

ПРИМЕР 10

Биологический анализ трансгенной кукурузы

Биоактивность белка DIG-3 и его вариантов, получаемых в растительных клетках, демонстрируют общепринятыми способами биологического анализа (см., например, Huang et al., 2006). Можно демонстрировать эффективность, например, кормя насекомых-мишеней различными тканями растений или кусками тканей, получаемых из растения, продуцирующего токсин DIG-3, в контролируемых условиях питания. Альтернативно, можно получать экстракты белка из различных тканей растений, получаемых из растения, продуцирующего токсин DIG-3, и вводить экстрагированные белки в биологический анализ с искусственной пищей, описываемый выше в настоящем документе. Следует понимать, что результаты такого анализа кормления необходимо сравнивать с проводимыми схожим образом биологическими анализами, в которых применяют соответствующие контрольные ткани из растений-хозяев, не продуцирующих белок DIG-3 или его варианты, или с другими контрольными образцами.

Источники информации

Claims

1. Выделенный полипептид, обладающий инсектицидной активностью, по существу состоящий из сегмента основного токсина, при этом указанный сегмент состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

2. Трансгенное растение, устойчивое к воздействию мотылька кукурузного и моли капустной, содержащее полипептид по п. 1.

3. Способ уменьшения популяции насекомого, выбранного из группы Lepidoptera, состоящей из мотылька кукурузного (ЕСВ), моли капустной (DBM), совки капустной, совки хлопковой, табачной листовертки и совки-ипсилон, где указанный способ включает кормление указанной популяции пестицидно-эффективным количеством полипептида по п. 1.

4. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п. 1.

5. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 4 с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

6. Конструкция ДНК, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 4, функционально связанную с промотором, получаемым не из Bacillus thuringiensis, и запускающая экспрессию нуклеотидной последовательности по п. 1 в растении.

7. Трансгенное растение, устойчивое к насекомым группы Lepidoptera, состоящей из мотылька кукурузного (ЕСВ), моли капустной (DBM), совки капустной, совки хлопковой, табачной листовертки и совки-ипсилон, где указанное трансгенное растение содержит конструкцию ДНК по п. 6, стабильно встроенную в его геном.

8. Способ защиты растения от насекомых, выбранных из группы Lepidoptera, состоящей из мотылька кукурузного (ЕСВ), моли капустной (DBM), совки капустной, совки хлопковой, табачной листовертки и совки-ипсилон, где указанный способ включает встраивание в указанное растение конструкции по п. 6.

9. Полипептид по п. 1, где инсектицидная активность направлена против ЕСВ, устойчивого к Cry1F, или DBM, устойчивого к Cry1A.

10. Трансгенное растение по п. 7, дополнительно содержащее полинуклеотид, кодирующий белок Cry1F.

11. Трансгенное растение по п. 7, где указанное растение является кукурузой.

12. Растительная клетка кукурузы для получения растения, которое устойчиво к вредителю ЕСВ с устойчивостью к Cry1F, где указанная растительная клетка содержит конструкцию ДНК по п. 6 и полинуклеотид, кодирующий белок Cry1F.

13. Способ уменьшения популяции насекомых мотыльков кукурузных, где указанный способ включает предоставление указанным насекомым для приема внутрь полипептида по п. 1 и белка Cry1F.

14. Трансгенное растение по п. 7, дополнительно содержащее полинуклеотид, кодирующий белок Cry1A.

15. Трансгенное растение по п. 14, где указанное растение является овощным растением.

16. Клетка овощного растения для получения растения, которое устойчиво к атаке вредителя DBM с устойчивостью к Cry1A, где указанная клетка растения содержит конструкцию ДНК по п. 7 и полинуклеотид, кодирующий белок Cry1A.

17. Способ уменьшения популяции насекомых моль капустная, где указанный способ включает предоставление указанным насекомым для приема внутрь полипептида по п. 1 и белка Cry1A.