JP2012524086A - Dig−3殺虫性cryトキシン - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照により本明細書に明確に組み込まれる、2009年4月17日に出願の米国特許仮出願第61/170189号に対して利益を主張する。
(a)配列番号2の残基113〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)配列番号2の残基113〜643のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(c)配列番号2によってコードされるトキシンの発現または活性に不都合な影響を及ぼさない20個までのアミノ酸の置換、欠失または修飾を有する、配列番号2の残基113〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメントを含む、単離されたDIG−3トキシンポリペプチドを提供する。
(a)配列番号2の残基73〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)配列番号2の残基73〜643のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(c)配列番号2によってコードされるトキシンの発現または活性に不都合な影響を及ぼさない20個までのアミノ酸の置換、欠失または修飾を有する、配列番号2の残基73〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメントを含む、単離されたDIG−3トキシンポリペプチドを提供する。
(a)配列番号2の残基1〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)配列番号2の残基1〜643のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(c)配列番号2によってコードされるトキシンの発現または活性に不都合な影響を及ぼさない20個までのアミノ酸の置換、欠失または修飾を有する、配列番号2の残基1〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるDIG−3コアトキシンセグメントを含む、単離されたDIG−3トキシンポリペプチドを提供する。
配列番号1は、完全長DIG−3トキシンをコードするDNA配列である(3771個のヌクレオチド)。
配列番号2の完全長DIG−3トキシンに加えて、本発明は、殺虫活性のある変異体も包含する。用語「変異体」とは、本出願人らによれば、フラグメント、特定の欠失および挿入突然変異体、ならびに特定の融合タンパク質を包含することを意図する。DIG−3は、典型的な3ドメイン型Cryトキシンである。本発明に包含されるDIG−3トキシンの変異体を説明する前置きとして、概括的に3ドメイン型Cryトキシン、とりわけDIG−3タンパク質トキシンの構成を簡単に概観することが有用であろう。
本発明は、その一態様において、殺虫活性を改善し、昆虫による耐性の発生を回避するために、α−へリックス1、α−へリックス2A、およびα−へリックス2Bのすべてまたは一部が欠失したDIG−3変異体を提供する。これらの改変は、改善された標的有害生物の範囲、効力、および耐虫性の管理などの改善された特性を備えたDIG−3変異体を提供するために行われた。本発明の一部の実施形態において、対象とする改変は、昆虫の中毒につながるプロトキシン活性化および細孔形成の有効性に影響を及ぼす可能性がある。より具体的には、改善された特性を備えたDIG−3変異体を提供するために、DIG−3タンパク質のN末端をコードする核酸配列の一部を除去する段階的欠失が記述される。その欠失は、ドメインIのα−へリックス1のすべて、およびα−へリックス2のすべてまたは一部を、α−へリックス3〜7の構造的完全性を維持しながら除去する。したがって、本発明は一部としては、より有効な細孔形成のためのドメイン1のα−へリックス構成部分を遺伝子操作することによってなされるCryタンパク質の有効性の改善に関する。より具体的には、本発明は一部としては、Cry1タンパク質のドメインI中のα−へリックス1およびα−へリックス2に対する推定上の二次的な構造相同性を備えた領域中にN末端欠失を有するように設計された、改善されたDIG−3タンパク質に関する。
昆虫の消化管内プロテアーゼは、典型的には、飼料のタンパク質から必要なアミノ酸を得ることにおいて昆虫を助けることで機能する。最も理解されている昆虫の消化性プロテアーゼは、とりわけ鱗翅目種中で最も一般的であると思われるセリンプロテアーゼである(EnglemannおよびGeraerts、1980)。鞘翅目昆虫は、鱗翅目の消化管に比べてより中性〜酸性である消化管を有する。鞘翅目の幼虫および成虫の大部分、例えば、コロラドポテトビートル(Colorado potato beetle)は、わずかに酸性の中腸を有し、システインプロテアーゼが、重要なタンパク質分解活性を提供する(WolfsonおよびMurdock,1990)。より正確には、ThieおよびHouseman(1990)は、コロラドポテトビートル(Colorado potato beetle)中にシステインプロテアーゼ、カテプシンB様、およびカテプシンH様、ならびにアスパルチルプロテアーゼ、カテプシンD様を確認し、特徴付けた。Gillikinら(1992)は、ウェスターンコーンルートワーム(western corn rootworm)幼虫の消化管中でのタンパク質分解活性を特徴付け、主としてシステインプロテアーゼを見出した。米国特許第7230167号には、カテプシンGに帰せられるプロテアーゼ活性が、ウェスターンコーンルートワーム(western corn rootworm)中に存在することが開示されている。昆虫消化管プロテアーゼの多様性および異なる活性レベルは、特定のB.t.トキシンに対する昆虫の感受性に影響を及ぼす可能性がある。
DIG−3トキシンの分離ドメイン(および、このようなドメインに90%、95%または97%同一である変異体)は、有害生物への増大された毒性範囲、改善された有効性、または増大されたタンパク質安定性を備えた新規トキシンを提供するために、他のCryトキシンからのドメインとの組合せを形成する上で有用であると予想される。DIG−3タンパク質のドメインIは、配列番号2のアミノ酸残基56〜278からなる。DIG−3タンパク質のドメインIIは、配列番号2のアミノ酸残基283〜493からなる。DIG−3タンパク質のドメインIIIは、配列番号2のアミノ酸残基503〜641からなる。ドメインの取替えまたはシャッフリングは、変更したδ−エンドトキシンタンパク質を作り出すための機構である。ドメインIIおよびIIIは、δ−エンドトキシンタンパク質間で取替えることができ、改善された農薬活性または標的範囲を備えたハイブリッドトキシンまたはキメラトキシンをもたらす。ドメインIIは、受容体結合に関連し、DIG−3のドメインIIは、他のCry1Bトキシンから極めて逸脱している。ドメインIIIは、特定クラスの受容体タンパク質に結合し、恐らく、オリゴマートキシンプレ細孔の挿入に関与する。他のトキシン中での一部のドメインIIIの置換は、スポドプテラ・エクシグア(Spodoptera exigua)に対して優れた毒性を生じることが示され(de Maagdら、1996)、Cryトキシンドメイン取替えの設計に関する指針が存在する(Knightら、2004)。
DIG−3トキシンをコードする単離核酸は、本発明の一態様である。これは、配列番号2、および配列番号5をコードする核酸、ならびにその相補配列と、配列番号2の殺虫性変異体をコードするその他の核酸を包含する。遺伝子コードの冗長性のため、種々の異なるDNA配列が、本明細書に開示のアミノ酸配列をコードすることができる。同一または本質的に同一のトキシンをコードするこれらの代替的DNA配列を創り出すことは、十分に当業者の技量内である。
本明細書に記載の改善されたCryタンパク質をコードするDNA配列は、当技術分野で周知の種々の方法によって調製することができる。例えば、合成遺伝子セグメントおよび合成遺伝子は、亜リン酸トリエステルおよびホスホラミダイト化学物質(Caruthersら、1987)によって調製することができ、必要に応じて、DNA合成を実施するためにコマーシャルベンダーを利用可能である。完全長DIG−3タンパク質をコードする配列は、例えば、制限断片のライゲーションまたは重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応の組立てを含む、種々の方法で組み立てることができる(StewartおよびBurgin、2005)。さらに、末端欠失をコードする配列は、部位特異的末端オリコヌクレオチドを使用するPCR増幅によって調製することができる。
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列のパーセント同一性を測定するため、配列を最適な比較目的のために整列させる。2つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一位置の数の関数である(すなわち、パーセント同一性=同一位置の数/位置の総数(例えば、重複位置)×100)。一実施形態において、2つの配列は、同じ長さである。2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容するまたはしない後記技術に類似した技術を使用して測定することができる。パーセント同一性の計算では、典型的には、正確な一致を計数する。
本発明のトキシンをコードする遺伝子は、広範な種類の微生物または植物宿主中に導入することができる。トキシン遺伝子の発現は、直接的または間接的に、農薬タンパク質の細胞内産生および維持をもたらす。適切な微生物宿主、例えば、シュードモナス(Pseudomonas)の場合、該微生物を、それらが増殖し、取り込まれる有害生物の環境に適用することができる。結果は、有害生物の規制である。別法として、トキシン遺伝子を宿す微生物を、トキシンの活性を延長し、かつ細胞を安定化する条件下で処理することができる。毒性活性を維持している処理細胞を、次いで、標的有害生物の環境に適用することができる。
昆虫が、遺伝子導入植物の発現、製剤化されたタンパク質組成物(群)、噴霧可能なタンパク質組成物(群)、ベイトマトリックス、またはその他の送達システムを介して送達された有効量のトキシンと接触すると、結果は、典型的には昆虫の死亡であり、あるいは昆虫は、トキシンを昆虫にとって利用可能にする供給源を餌にしない。
対象とするタンパク質は、任意のタイプの植物を鱗翅目昆虫による損傷から実際に保護するために使用することができる。このような植物の非限定的例には、ごく一部の例を挙げれば、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、カノーラ、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、コショウ(トウガラシを含む)、サトウダイコン、果実、および芝生が含まれる。植物を形質転換する方法は、当技術分野で周知であり、例示となる形質転換法は、実施例中に記載される。
本発明のDIG−3トキシンは、鱗翅目昆虫の規制で使用するのにとりわけ適している。鱗翅目は、毎年極めて大きな総額の損害をもたらす、農業、園芸、および家庭の有害生物の重要な群である。この昆虫目は、葉および根を摂食する幼虫および成虫を包含する。鱗翅目害虫には、限定はされないが、以下がが含まれる:アコロイア・グリセラ(Achoroia grisella)、アクレリス・グロベラナ(Acleris gloverana)、アクレリス・バリアナ(Acleris variana)、アドキソフィエス・オラナ(Adoxophyes orana)、アグロチス・イプシロン(Agrotis ipsilon)(ブラックカットワーム)、アラバマ・アルギラセア(Alabama argillacea)、アルソフィラ・ポメタリア(Alsophila pometaria)、アメロイス・トランシテラ(Amyelois transitella)、アナガスタ・クエニエラ(Anagasta kuehniella)、アナルシア・リネアテラ(Anarsia lineatella)、アニソタ・セナトリア(Anisota senatoria)、アンテラエア・ペルニイ(Antheraea pernyi)、アンチカルシア・ゲマタリス(Anticarsia gemmatalis)、アルキプス(Archips)種、アルギロタエニア(Argyrotaenia)種、アテチス・ミンダラ(Athetis mindara)、ボンビクス・モリ(Bombyx mori)、ブクラトリックス・ツルベリエラ(Bucculatrix thurberiella)、カドラ・カウテラ(Cadra cautella)、コリストネウラ(Choristoneura)種、コチルス・ホスペス(Cochylls hospes)、コリアス・ユリセマ(Colias eurytheme)、コルシラ・セファロニカ(Corcyra cephalonica)、シディア・ラチフェレナス(Cydia latiferreanus)、シディア・ポモネラ(Cydia pomonella)、ダタナ・インテゲリマ(Datana integerrima)、デンドロリムス・シベリカス(Dendrolimus sibericus)、デスミア・フェネラリス(Desmia feneralis)、ジアファニア・ヒアリナタ(Diaphania hyalinata)、ジアファニア・ニチダリス(Diaphania nitidalis)、ジアトラエ・グランジオセラ(Diatraea grandiosella)(サウスウェスターンコーンボーラー)、ジアトラエ・サッカラリス(Diatraea saccharalis)(シュガーケインボーラー)、エノモス・サブシグナリア(Ennomos subsignaria)、エオレウマ・ロフチニ(Eoreuma loftini)、エスフェスチア・エルテラ(Esphestia elutella)、エラニス・チラリア(Erannis tilaria)、エスチグメネ・アクレア(Estigmene acrea)、エウリア・サルブリコラ(Eulia salubricola)、エウポコエリア・アンビグエラ(Eupocoellia ambiguella)、エウポエシリア・アンビグエラ(Eupoecilia ambiguella)、エウプロクチス・クリソロエア(Euproctis chrysorrhoea)、エウゾア・メソリア(Euxoa messoria)、ガレリア・メロネラ(Galleria mellonella)、グラホリタ・モレスタ(Grapholita molesta)、ハリシナ・アメリカナ(Harrisina americana)、ヘリコベルパ・サブフレクサ(Helicoverpa subflexa)、ヘリコベルパ・ゼア(Helicoverpa zea)(コーンイアーワーム)、ヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)(タバコバッドワーム)、ヘミロイカ・オリビア(Hemileuca oliviae)、ホモエオソマ・エレクテルム(Homoeosoma electellum)(サンフラワーヘッドモス)、ヒファンチア・クネア(Hyphantia cunea)、ケイフェリア・リコペルシセラ(Keiferia lycopersicella)、ランブジナ・フィセラリア・フィセラリア(Lambdina fiscellaria fiscellaria)、ランブジナ・フィセラリア・ルグブロサ(Lambdina fiscellaria lugubrosa)、ロイコーマ・サリシス(Leucoma salicis)、ロベシア・ボトラナ(Lobesia botrana)、ロクサグロチス・アルビコスタ(Loxagrotis albicosta)(ウェスターンビーンカットワーム)、ロクソステジ・スチクチカリス(Loxostege sticticalis)、リマントリア・ジスパル(Lymantria dispar)、マカラ・チリサリス(Macalla thyrisalis)、マラコソマ(Malacosoma)種、マメストラ・ブラシカエ(Mamestra brassicae)、マメストラ・コンフィグラタ(Mamestra configurata)(バーサアーミーワーム)、マンデュカ・キンクエマクラタ(Manduca quinquemaculata)、マンデュカ・セクスタ(Manduca sexta)(タバコホルンワーム)、マルカ・テスツラリス(Maruca testulalis)、メランクラ・ピクタ(Melanchra picta)、オペロフテラ・ブルマタ(Operophtera brumata)、オリジア(Orgyia)種、オストリニア・ヌビラリス(Ostrinia nubilalis)(ユーロピアンコーンボーラー)、パレアクリタ・ベルナタ(Paleacrita vernata)、パピアペマ・ネブリス(Papiapema nebris)(コモンストークボーラー)、パピリオ・クレスホンテス(Papilio cresphontes)、ペクチノホラ・ゴシピエラ(Pectinophora gossypiella)、フィリガニジア・カリフォルニカ(Phryganidia californica)、フィロノリクテル・ブランカルデラ(Phyllonorycter blancardella)、ピエリス・ナピ(Pieris napi)、ピエリス・ラパエ(Pieris rapae)、プラチペナ・スカブラ(Plathypena scabra)、プラチノタ・フロエンダナ(Platynota flouendana)、プラチノタ・スツルタナ(Platynota stultana)、プラチプチリア・カルヅイダクチラ(Platyptilia carduidactyla)、プロジア・インテルプンクテラ(Plodia interpunctella)、プルテラ・キシロステラ(Plutella xylostella)(ダイアモンドバックモス)、ポンティア・プロトダイス(Pontia protodice)、シューダレチア・ユニプンクタ(Pseudaletia unipuncta)(アーミーワーム)、シュードプラシア・インクルデンス(Pseudoplasia includens)、ラチプルシア・ヌ(Rachiplusia nu)(アルゼンチンルーパー)、サブロデス・アエグロタタ(Sabulodes aegrotata)、シズラ・コンシナ(Schizura concinna)、シトトロガ・セレアレラ(Sitotroga cerealella)、スピロンタ・オセラナ(Spilonta ocellana)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(フォールアーミーワーム)、スポドプテラ・エクシグア(Spodoptera exigua)(ビートアーミーワーム)、タウルンストポエア・ピチオカンパ(Thaurnstopoea pityocampa)、エンソラ・ビセリエラ(Ensola bisselliella)、トリコプルシア・ヒ(Trichoplusia hi)、ウデア・ルビガリス(Udea rubigalis)、キシロミゲス・クリアイルス(Xylomyges curiails)、およびイポノメウタ・パデラ(Yponomeuta padella)。
抗トキシン抗体。
本明細書に開示のトキシンに対する、または同等のトキシンまたはこれらのトキシンのフラグメントに対する抗体は、本技術分野の標準的手順を使用して容易に調製することができる。このような抗体は、DIG−3トキシンの存在を検出するのに有用である。
本発明のトキシンおよび遺伝子を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用による。これらのプローブは、ヌクレオチド配列を検出できる。これらの配列を、適切な放射性標識によって検出可能にすることができ、あるいは例えば米国特許第6268132号中に記載のように本質的に蛍光性にすることができる。当技術分野で周知のように、プローブ分子および核酸サンプルが、2つの分子間で強力な塩基対形成結合を形成することによってハイブリッドを形成すると、プローブおよびサンプルが実質的に配列相同性を有することを、合理的に想定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばKellerおよびManak(1993)に記載のような当技術分野で周知の技術によってストリンジェントな条件下で実施される。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを既知の方式で判定する手段を提供する。このようなプローブ分析は、本発明のトキシンコード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、DNAシンセサイザーおよび標準的手順を使用して合成することができる。これらのヌクレオチド配列はまた、本発明の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーとして使用することができる。
分子生物学の当業者にとって周知であるように、2つの核酸の類似性は、それらのハイブリダイズする傾向によって特徴付けることができる。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブがその標的配列に他の配列に比べて検出可能なより大きな程度まで(例えば、バックグラウンドの少なくとも2倍超)ハイブリダイズ(アニール)する条件を指すと解釈される。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、環境により異なる。ハイブリダイゼーション条件および/または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対して100%相補的である標的配列を同定することができる(相同プロービング)。別法として、ストリンジェンシーの条件を、配列中の一部の不一致を認めるように調節して、より低度の類似性を検出することができる(非相同プロービング)。一般に、プローブは、約1000未満のヌクレオチド長、好ましくは500未満のヌクレオチド長である。
Tm(℃)=81.5℃+16.6(logM)+0.41(%GC)−0.61(%ホルムアミド)−500/L;
ここで、Mは一価カチオンのモル濃度であり、%GCはDNA中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、%ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Lは塩基対中のハイブリッドの長さである。
Tm(℃)=81.5℃+16.6(log[Na+])+0.41(%GC)−0.61(%ホルムアミド)−600/L
ここで、[Na+]はナトリウムイオンのモル濃度であり、%GCはDNA中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、%ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Lは塩基対中のハイブリッドの長さである。
1X SSPE、0.1%SDS中、室温で15分間、2回(低ストリンジェンシーの洗浄)。
0.2X SSPE、0.1%SDS中、Tm−20℃で15分間、1回(中等度のストリンジェンシーの洗浄)。
Tm(℃)=2(T/A塩基対の数)+4(G/C塩基対の数)
1X SSPE、0.1%SDS中、室温で15分間、2回(低ストリンジェンシーの洗浄)。
1X SSPE、0.1%SDS中、ハイブリダイゼーション温度で15分間、1回(中等度のストリンジェンシーの洗浄)。
本明細書中でDIG−3と称する殺虫性Cryタンパク質をコードする核酸を、B.t.株PS46LのゲノムDNAから、配列番号1の塩基1286〜1311にハイブリダイズする縮重順方向プライマー、および配列番号1の塩基2480〜2499の相補配列にハイブリダイズするミスマッチの逆方向プライマーを使用するPCRによって単離した。このプライマー対を使用して、配列番号1のヌクレオチド1286〜2499に対応する1214bpのフラグメントを増幅した。この配列を、Genome Walker(商標)ユニバーサルキット(Clontech、Palo Alto、カリフォルニア州)から構成される方法を使用するゲノムウォーキングを開始するためのアンカーポイントとして使用した。DIG−3コード領域にまたがるフラグメントの核酸配列を決定した。配列番号1は、完全長DIG−3タンパク質をコードする3771bpのヌクレオチド配列である。配列番号2は、配列番号1に由来する完全長DIG−3タンパク質のアミノ酸配列である。バチルス(Bacillus)種において、配列番号1のその領域などのタンパク質コード領域は、翻訳すればアミノ酸メチオニンを表すTTGコドンで始まることができることに留意されたい。
DIG−3トキシンの殺虫特性を改善するために逐次的、段階的欠失を行い、そのそれぞれがDIG−3タンパク質のN末端部分を欠失させる。該欠失は、α−へリックス3からα−へリックス7までの構造的完全性を維持しながら、ドメインIのα−へリックス1の一部または全部、およびα−へリックス2の一部または全部を除去する。
植物のコドンバイアスを有するDNA配列を設計、合成して、遺伝子導入単子葉植物および遺伝子導入双子葉植物中でDIG−3タンパク質を産生させた。トウモロコシ(Zea mays L.)用のコドン使用頻度表を、GenBankに寄託された配列から得られる706のタンパク質コード配列(CD)から計算した。タバコ(Nicotiana tabacum、1268CD)、カノーラ(Brassica napus、530CD)、ワタ(Gossypium hirsutum、197CD)、およびダイズ(Glycine max、約1000CD)用のコドン使用頻度表を、ウェブサイト、http://www.kazusa.or.jp/codon/のデータからダウンロードした。適切な加重平均相対量の、トウモロコシおよび双子葉双方のデータセットに共通な高度に使用されるコドンを含むバイアス付きコドンセットを、どちらかの植物タイプ中のアミノ酸に関する全コドン使用の約10%未満で使用される任意の冗長なコドンを除外した後に計算した。DIG−3タンパク質をコードする植物最適化配列を引き出すため、得られるDNA配列が植物最適化コドンバイアス表の全コドン組成を有するように、実験的に決定したDIG−3 DNA配列へのコドン置換を行った。配列のさらに洗練させて、望ましくない制限酵素認識部位、潜在的植物イントロンスプライス部位、A/T残基またはC/G残基のロングラン、および植物細胞におけるコード領域のRNA安定性、転写、または翻訳を妨害する可能性のあるその他のモチーフを排除した。所望の制限酵素認識部位を導入し、かつ長い内部オープンリーディングフレーム(+1以外のフレーム)を排除するために、その他の変更を行った。これらの変更は、すべて、植物用バイアス付きコドン組成を維持する制約内で行われた。設計された配列の合成は、商業的供給業者によって実施された(DNA2.0、Menlo Park、カリフォルニア州)。
標準的なクローニング法を使用して、植物最適化コード領域中にコードされる完全長DIG−3タンパク質を産生するように遺伝子操作されたシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)発現プラスミドを構築した。制限酵素エンドヌクレアーゼを、New England BioLabs(NEB、Ipswich、マサチューセッツ州)から入手し、T4DNAリガーゼ(Invitrogen)をDNAのライゲーションに使用した。プラスミドの調製は、供給業者の説明書に従って、NucleoBond(登録商標)Xtraキット(Macherey−Nagel Inc、Bethlehem、ペンシルベニア州)またはPlasmid Midi Kit(登録商標)(Qiagen)を使用して実施した。DNAフラグメントは、アガローストリスアセテートゲル電気泳動の後に、Millipore Ultrafree(登録商標)−DAカートリッジ(Billerica、マサチューセッツ州)を使用して精製した。
特徴付けおよび昆虫でのバイオアッセイのためのDIG−3トキシンの製造は、発現構築物(例えば、クローンDP2826)を収容する振盪フラスコ中で増殖したP.フルオレセンス(P.fluorescens)株によって達成された。1%グルコースおよび微量元素を補足したM9培地中で増殖された種培養物を使用して、5%グリセロールを含む50mLの規定された最小培地(Teknova カタログ番号3D7426Hollister、カリフォルニア州)に播種した。振盪しながらの30℃で24時間の初期インキュベーションの後に、イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加することによって、Ptacプロモーターを介するDIG−3トキシン遺伝子の発現を誘導した。培養物を、誘導の時点、および誘導後の異なる時点でサンプリングした。細胞密度を、600nmでの光学密度(OD600)によって測定した。例えば、Huangら(2007)および米国特許出願公開第2006/0008877号中に記載のように、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)の増殖に適したその他の培養培地も利用することができる。
各サンプリングの時点で、サンプルの細胞密度を、OD600=20に調節し、1mLのアリコートを14000xgで5分間遠心分離した。細胞ペレットを−80℃で凍結した。凍結された振盪フラスコ内細胞ペレットサンプルからの可溶性画分および不溶性画分を、EasyLyse(商標)細菌タンパク質抽出溶液(EPICENTRE(登録商標)Biotechnologies、Madison、ウィスコンシン州)を使用して調製した。各細胞ペレットを、1mLのEasyLyse(商標)溶液に再懸濁し、さらに溶解緩衝液中に1:4で希釈し、振盪しながら室温で30分間インキュベートした。この溶解物を、4℃、14,000rpmで20分間遠心分離し、上清を可溶性画分として回収した。次いで、ペレット(不溶性画分)を等容積のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS;11.9mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4)に再懸濁した。
Cryタンパク質封入体(IB)の調製は、SDS−PAGEおよびMALDI−MS(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分光測定法)によって立証されるように、不溶性B.t.殺虫性タンパク質を産生するP.フルオレセンス(P.fluorescens)発酵物からの細胞で実施した。P.フルオレセンス(P.fluorescens)発酵のペレットを、37℃の水浴中で解凍した。細胞を、溶解緩衝液(50mM Tris、pH7.5、200mM NaCl、20mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)二ナトリウム塩、1%Triton X−100、および5mMジチオトレイトール(DTT)、5mL/Lの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル(P8465 Sigma−Aldrich、St.Louis、ミズーリ州)を使用直前に添加した)中に25%w/vまで再懸濁した。細胞を、最低に設定した携帯型ホモジナイザー(Tissue Tearor、BioSpec Products Inc.、Bartlesville、オクラホマ州)を使用して懸濁した。細胞懸濁液にリゾチーム(25mgのSigma L7651,ニワトリ卵白由来)を、金属スパチュラで混合して添加し、懸濁液を室温で1時間インキュベートした。懸濁液を、氷上で15分間冷却し、次いでBranson Sonifier250(1分の持続期間を2回、動作周期50%、出力30%)を使用して超音波処理した。細胞溶解物を顕微鏡法でチェックした。必要な場合、さらなる25mgのリゾチームを添加し、インキュベーションおよび超音波処理を繰り返した。細胞溶解物を顕微鏡法で確認したら、この溶解物を11500xgで25分間(4℃)遠心分離して、IBペレットを形成し、上清を廃棄した。IBペレットを、100mLの溶解緩衝液で再懸濁し、携帯型ミキサーでホモジナイズし、上記のように遠心分離した。上清が無色になり、かつIBペレットが堅くオフホワイトになるまで、IBペレットを再懸濁(50mLの溶菌緩衝液中に)、ホモジナイズ、超音波処理、および遠心分離によって反復洗浄した。最終洗浄では、IBペレットを、2mM EDTAを含む滅菌濾過(0.22μm)蒸留水中に再懸濁し、遠心分離した。最終ペレットを、2mMEDTAを含む滅菌濾過蒸留水中に再懸濁し、1mLアリコートに−80℃で貯蔵した。
PfクローンDP2826からの封入体懸濁液(32mg/mLのDIG−3タンパク質を含む)6mLを、最高に設定したEppendorfモデル5415C微量遠心管で遠心分離(ほぼ14000xg)して封入体をペレットにした。貯蔵緩衝液上清を除去し、50mLコニカル管中、25mLの100mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH11)で置き換えた。封入体を、ピペットを使用して再懸濁し、ボルテックスして完全に混合した。この遠心管を、静かに揺れる台上に4℃で一夜載せ、標的タンパク質を抽出した。抽出物を、4℃、30000xgで30分間遠心分離し、生じた上清を、Amicon Ultra−15再生セルロース遠心フィルター装置(30000の分子量カットオフ);Millipore)を使用して5分の1に濃縮した。次いで、サンプル緩衝液を、使い捨てのPD−10カラム(GE Healthcare、Piscataway、ニュージャージー州)を使用して10mM CAPS[3−(シクロヘキサミノ)1−プロパンスルホン酸]、pH10に変更した。
電気泳動のために、濃縮された抽出物を、還元剤として5mMのジチオトレイトールを含むNuPAGE(登録商標)LDSサンプル緩衝液(Invitrogen)で1:50に希釈することによって調製し、95℃で4分間加熱した。サンプルを、0.2〜2μg/レーンの範囲の5つのBSA標準(標準曲線の作出のため)と並んで、4〜12%NuPAGE(登録商標)ゲルの二つ組みのレーンにロードした。MOPS SDS展開緩衝液(Invitrogen)を使用して、トラッキングダイがゲルの底部に到達するまで、200Vの電圧を印加した。ゲルを、45%メタノール、10%酢酸中の0.2%クーマシーブルーG−250で染色し、まず45%メタノール、10%酢酸で簡単に、次いで7%酢酸、5%メタノールで、バックグラウンドが透明になるまで十分に脱染した。脱染に続いて、ゲルを、Biorad Fluor−S MultiImagerでスキャンした。装置のQuantitiy One v.4.5.2ソフトウェアを使用して、バックグラウンドを差し引いたタンパク質バンド量を取得し、BSA標準曲線を作成し、その曲線を使用して、ストック液中のDIG−3タンパク質の濃度を計算した。
DIG−3B.t.殺虫性トキシンは、ユーロピアンコーンボーラー(European corn borer)(ECB;Ostrinia nubilalis(Hubner))、cry1F耐性ECB(rECB)、ダイアモンドバックモス(diamondback moth)(DBM;Plutella xylostella(Linnaeus))、cry1A耐性DBM(rDBM)、コーンイアーワーム(corn earworm)(CEW;Helicoverpa zea(Boddie))、ブラックカットワーム(black cutworm)(BCW;Agrotis ipsilon(Hufnagel))、タバコバッドワーム(tabocco budworm)(TBW;Heliothis virescens)(Fabricius))、およびキャベツルーパー(cabbage looper)(CL;Trichoplusia ni)(Hubner))を含む鱗翅目種に対して活性であることを実証した。DIG−3タンパク質は、フォールアームワーム(fall armworm)(FAW、Spodoptera frugiperda)、Cry1F耐性FAW(rFAW)、およびウェスターンコーンルートワーム(western corn rootworm)(WCR;Diabrotica virgifera virgifera ルコント)に対する活性についても試験された。
10mM CAPS(pH10)中の封入体調製物を、10mM CAPS(pH10)で適切に希釈し、すべてのバイオアッセイに、この緩衝液からなる対照処理を含めた。この対照処理は、死亡率または成長阻害に関するバックグラウンドのチェックとして役立つ。
GI=[1−(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]
ここで、TWITは、その処理における昆虫の総重量であり、
TNITは、その処理における昆虫の総数であり、
TWIBCは、バックグラウンドチェック(緩衝液対照)における昆虫の総重量であり、
TNIBCは、バックグラウンドチェック(緩衝液対照)における昆虫の総数である。
バイナリー植物形質転換および発現プラスミドの構築では、標準的なクローニング法を使用する。制限酵素エンドヌクレアーゼおよびT4 DNAリガーゼは、NEBから入手する。プラスミド調製を、製造業者の説明書に従って、NucleoSpin(登録商標)プラスミド調製キットまたはNucleoBond(登録商標)AX Xtra Midiキット(双方ともMacherey−Nagel製)を使用して実施する。DNAフラグメントを、ゲル単離の後にQIAquick(登録商標)PCR精製キットまたはQIAEX II(登録商標)ゲル抽出キット(双方ともQiagen製)を使用して精製する。
アラビドプシス(Arabidopsis)の形質転換。
アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)Col−01を、フローラルディップ法(WeigelおよびGlazebrook、2002)を使用して形質転換する。選択されたアグロバクテリウム(Agrobacterium)コロニーを使用して、選択に適した抗生物質を含むYEPブロスの1mL〜15mL培養物に接種する。培養物を、220rpmで絶えず撹拌しながら28℃で一夜インキュベートする。各培養物を使用して、選択に適した抗生物質を含むYEPブロスの2つの培養物500mLに接種し、新たな培養物を、絶えず撹拌しながら28℃で一夜インキュベートする。細胞を、ほぼ8700xg、室温で10分間ペレット化し、生じる上清液を廃棄する。細胞ペレットを、1/2xのMurashige−Skoog塩(Sigma−Aldrich)/GamborgのB5ビタミン(Gold BioTechnology、St.Louis、ミズーリ州)、10%(w/v)ショ糖、0.044μMベンジルアミノプリン(DMSO中の1mg/mL原液の10μL/L)および300μL/L Silwet L−77を含む500mLの浸透媒体中に徐々に再懸濁させる。ほぼ1月齢の植物を、最も新しい花房のを確実に覆うよう注意して、培地中に15秒間浸漬する。次いで、植物を、それらの側面に横たえさせ、24時間覆い(透明または不透明)、水で洗浄し、直立させる。植物を、16時間の明/8時間の暗の光周期で、22℃で育成する。浸漬からほぼ4週間後に、種子を収穫する。
新たに収穫したT1種子を、乾燥剤の存在下に室温で少なくとも7日間乾燥させる。種子を、0.1%寒天/水(Sigma−Aldrich)溶液に懸濁し、次いで、4℃で2日間土の層間で保存する。植付けに備えるため、10.5インチx21インチの発芽トレー(T.O.Plastics Inc.、Clearwater、ミネソタ州)中のSunshine MixLP5(Sun Gro Horticulture Inc.、Bellevue、ワシントン州)を微細なバーミキュライトで覆い、Hoagland溶液(HoaglandおよびArnon、1950)で湿るまで潅水し、次いで24時間排水したままにする。土層間に保存した種子を、バーミキュライト上に播種し、加湿ドーム(KORD Products、Bramalea、オンタリオ州、カナダ)で7日間覆う。種子を発芽させ、植物を、Conviron(モデルCMP4030またはCMP3244;Controlled Environments Limited、Winnipeg、マニトバ州、カナダ)中で、120〜150μmol/m2秒の光強度の長日条件下(明16時間/暗8時間)に一定の温度(22℃)および湿度(40〜50%)下で育成する。植物は、初期にはHoagland溶液、その後は脱イオン水で潅水して土壌を濡らすことなく湿らせて保持する。
改変されたCryタンパク質を発現する遺伝子導入アラビドプシス(Arabidopsis)系は、人工飼料オーバーレイアッセイにおいて感受性昆虫種に対して活性であることが立証される。遺伝子導入および非導入アラビドプシス(Arabidopsis)系から抽出されたタンパク質を適切な方法で定量し、タンパク質濃度を正規化するようにサンプル量を調節する。バイオアッセイは前記のように人工飼料で実施される。非遺伝子導入アラビドプシス(Arabidopsis)および/または緩衝液および水を、バックグラウンドチェック処理としてアッセイ中に含める。
アグロバクテリウム(Agrobacterium)スーパーバイナリー系は、単子葉植物宿主の形質転換に便利に使用される。スーパーバイナリーベクターを構築および検証するための方法は、十分に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる(日本たばこ産業(東京、日本)から入手可能なプラスミドpSB1用操作マニュアル、バージョン3.1)。標準的な分子生物学および微生物学の方法を使用して、スーバーバイナリープラスミドを作製する。スーパーバイナリープラスミドの構造の確認/検証は、バイナリーベクターについて前に記載したような方法を使用して行われ、プラスミドpSB1用操作マニュアル中に提案されているように修正することができる。
トウモロコシのアグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介性形質転換。
High II F1クロスからの種子(Armstrongら、1991)を、95%Metro−Mix360無土壌育成培地(Sun Gro Horticulture、Bellevue、ワシントン州)と5%粘度/ローム土壌との混合物を含む5ガロンポット中に播種する。植物を、16:8時間の明:暗光周期による高圧ナトリウムランプおよびメタルハライドランプの組合せを使用して温室中で育成する。形質転換用の未成熟F2胚を得るために、制御された同胞受粉を実施する。未成熟胚を、胚がほぼ1.0〜2.0mmの大きさである受粉後8〜10日目に隔離する。
トウモロコシの穂を、液体石鹸でこすり洗いすること、70%エタノールに2分間浸漬すること、次いで20%市販漂白剤(0.1%次亜塩素酸ナトリウム)に30分間浸漬することによって表面滅菌した後、滅菌水ですすぎ洗う。スーパーバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム(Agrobacterium)細胞の懸濁液を、100mg/Lスペクチノマイシン、10mg/Lテトラサイクリン、および250mg/Lストレプトマイシンを含むYEP固体培地上にて28℃で2〜3日間増殖させた細菌の1〜2ループを、100μMアセトシリンゴンを含む5mLの液体感染培地(LS基本培地(LinsmaierおよびSkoog、1965)、N6ビタミン(Chuら、1975)、1.5mg/L 2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)、68.5g/L ショ糖、36.0g/L グルコース、6mM L−プロリン、pH5.2)中に移すことによって調製する。溶液を、均一な懸濁が達成されるまでボルテックスし、紫色フィルターを備えたクレット−サマーソン比色計を使用して、約200Klett単位の最終密度まで、または550nmでほぼ0.4の光学密度まで調節する。未成熟胚を、2mLの感染培地を含むミクロ遠心管中に直接単離する。培地を除去し、200Klett単位の密度を有する1mLのアグロバクテリウム(Agrobacterium)溶液で置き換え、アグロバクテリウム(Agrobacterium)および胚溶液を、室温で5分間インキュベートし、次いで、共培養培地(LS基本培地、N6ビタミン、1.5mg/L 2,4−D、30.0g/L ショ糖、6mM L−プロリン、0.85mg/L AgNO3、100μM アセトシリンゴン、3.0g/L ジェランガム(PhytoTechnology Laboratories.、Lenexa、カンザス州)、pH5.8)に、暗条件下に25℃で5日間移す。
再生のため、培養物を、「28」誘導培地(MS塩およびビタミン、30g/L ショ糖、5mg/L ベンジルアミノプリン、0.25mg/L 2,4−D、3mg/L ビアラホス、250mg/L セフォタキシン、2.5g/L ジェランガム、pH5.7)に低い明条件(14μEm−2s−1)下に1週間、次いで高い明条件(ほぼ89μEm−2s−1)下に1週間移す。続いて、組織を、「36」再生培地(植物成長調節剤を欠くことを除いて誘導培地と同様)に移す。小植物が高さ3〜5cmまで生長したら、それらを、SHGA培地(Schenk−Hildebrandt塩、およびビタミン(1972);PhytoTechnologies Labr.)、1.0g/L myo−イノシトール、10g/L ショ糖、および2.0g/L ジェランガム、pH5.8)を含むガラス培養管に移し、さらなる成長、ならびに茎および根の発育を可能にした。植物を、本明細書中で前に記載したと同様の土壌混合物に移植し、温室中で開花まで育成する。種子生産のための調節された受粉を実施する。
植物細胞中で産生されるDIG−3タンパク質および変異体の生物活性を、通常のバイオアッセイ法(例えば、Huangら、2006を参照されたい)によって立証する。例えば、DIG−3トキシンを産生する植物に由来する種々の植物組織または組織片を、調節された給餌環境中で標的昆虫に給餌することによって、有効性を立証することができる。別法として、本明細書中で前に記載したように、DIG−3トキシンを産生する植物から得られる種々の植物組織からタンパク質抽出物を調製し、抽出されたタンパク質を人工飼料でのバイオアッセイに組み込むことができる。このような給餌アッセイの結果を、DIG−3タンパク質または変異体を産生しない宿主植物からの適切な対照組織、またはその他の対照サンプルを採用する、同様に実施されるバイオアッセイに比較すべきであることを理解されたい。
Claims (12)
- (a)配列番号2の残基113〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)配列番号2の残基113〜643のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(c)配列番号2によってコードされるトキシンの発現または活性に有害な影響を及ぼさない20個までのアミノ酸の置換、欠失、または修飾を含む、配列番号2の残基113〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメント、または殺虫活性のあるそのフラグメントを含む、単離されたポリペプチド。 - (a)配列番号2の残基73〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)配列番号2の残基73〜643のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(c)配列番号2によってコードされるトキシンの発現または活性に有害な影響を及ぼさない20個までのアミノ酸の置換、欠失、または修飾を含む、配列番号2の残基73〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメント、または殺虫活性のあるそのフラグメントを含む、請求項1に記載の単離されたポリペプチド。 - (a)配列番号2の残基1〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)配列番号2の残基1〜643のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(c)配列番号2によってコードされるトキシンの発現または活性に有害な影響を及ぼさない20個までのアミノ酸の置換、欠失、または修飾を含む、配列番号2の残基1〜643のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメント、または殺虫活性のあるそのフラグメントを含む、請求項1に記載の単離されたポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドを含む植物。
- 有害生物集団を防除する方法であって、前記集団を農薬上有効な量の請求項1に記載のポリペプチドと接触させることを含む方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
- 配列番号1または配列番号3の請求項7に記載の単離された核酸。
- 配列番号2または配列番号5の請求項1に記載のポリペプチド。
- バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)に由来しないプロモーターに作動可能に連結され、植物中で発現を駆動できる、請求項1に記載のヌクレオチド配列を含むDNA構築物。
- ゲノム中に安定的に組み込まれた請求項10に記載のDNA構築体を含む遺伝子導入植物。
- 植物を有害生物から保護する方法であって、前記植物中に請求項10に記載の構築物を導入することを含む方法。
- ユーロピアンコーンボーラー(European corn borer)に対する活性を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
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