CN1244697C - 改造合成的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因Cry2A - Google Patents

Abstract

一种改造合成的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白DNA序列Cry2A。其特征在于：设计并合成了苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白DNA序列Cry2A；与原始Cry2A DNA序列比较，该DNA序列编码蛋白的氨基酸组成不变，植物偏爱性密码子的使用频率较高，消除了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重复序列以及不明确的真核DNA序列内含子序列，C+G含量为59.04%，与原始DNA序列的同源性为69.45%。在编码序列的5’端添加有引导序列和3’端添加加尾识别信号序列。本发明的DNA序列可在植物细胞种表达，并可应用于转基因抗虫植物的育种上。

Description

改造合成的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因Cry2A

                              技术领域

本发明属于人工改造合成苏云金芽胞杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白(ICP)基因的DNA序列及其制备方法。本发明的DNA序列可作为在转基因抗虫植物中高效表达的分子育种的技术领域。

                              背景技术

虫害是造成农业生产损失的一个重要因素。据统计，虫害每年给农业生产造成的直接经济损失高达13％。

化学杀虫剂曾对防治虫害、稳定农业生产做出过重要贡献。随着人们对化学杀虫剂环境危害的认识、环保意识的日益加强，对环境安全的生物杀虫剂已成为研究的热点。在生物杀虫剂中，目前研究最清楚、应用最成功的是一类Bt制剂。Bt制剂的有效成分是Bt杀虫晶体蛋白(ICP)。Bt杀虫晶体蛋白(ICP)是苏云金芽胞杆菌在芽胞形成过程中产生的。但生产上也发现，Bt制剂存在着不稳定的问题，一方面在田间易被雨水冲刷流失，药效短；另一方面，因为Bt杀虫剂的活性成份是蛋白质，在阳光中紫外线的照射下易被分解而失效。植物转基因的成功为Bt杀虫晶体蛋白的应用提供了一条崭新途径。

Bt杀虫晶体蛋白(ICP)是由Bt基因编码产生。许多ICP的氨基酸序列存在不同程度的同源性。1989年，Hfte和Whiteley(Hfte H and Whiteley HR，Microbio.Rev.，53：241-255)根据ICP的杀虫谱及氨基酸序列的同源性将当时发现的大约42个基因分为五大类、15个亚类。其中前四类为晶体蛋白的基因家族(Cry)，第五类被称为细胞溶解蛋白基因(Cyt)。CryI基因编码对鳞翅目昆虫有毒性的CryI蛋白，CryII基因编码对鳞翅目和双翅目昆虫有毒性的CryII蛋白，CryIII基因编码对鞘翅目昆虫有毒性的CryIII蛋白，CryIV基因编码对双翅目昆虫有毒性的CryIV蛋白。由于新的杀虫基因的不断分离鉴定，根据Hfte和Whiteley的双重分类方法，1992年，Feitelson等(Feitelson et al.，Bio/Technology，10：271-275，1992)对原有的分类进行了补充，将Bt基因分为7大类，29亚类。除原来的5大类，新增加了CryV和CryVI两大类。随着新Bt基因数量的不断增加，人们发现原有的分类方法存在氨基酸同源性与杀虫特异性相互矛盾的问题。因此，在1995年无脊椎病理学会年会上专门成立了由Crickmore等人组成的Bt基因命名委员会，提出了以杀虫蛋白氨基酸序列同源性为唯一标准的分类命名体系，将Bt基因分为17大类、36亚类(Crickmore et al，1995)，1996年增补为21大类、44亚类；至2002年8月2日，Bt基因达到42大类、110亚类，总计200多个Bt基因序列。

典型的ICP由两部分组成，N端的活性片段和C端的结构片段，带有结构片段的ICP被称为原毒素。它经过蛋白酶的消化作用后，产生有活性的毒性肽。最近有人指出，在N端的活性片段又分为毒性区和细胞结合区。当Bt杀虫晶体蛋白被靶昆虫取食后，经溶解和酶解两个步骤产生活性毒素分子，释放出的活性毒素可穿过昆虫中肠道滋养层细胞空隙直接与消化道上皮细胞作用。细胞结合区与昆虫中肠道上皮细胞的受体特异结合后，毒性区直接作用于细胞膜，使细胞膜穿孔，破坏细胞的渗透平衡，最后引起细胞的裂解。

1987年，Vaeck等(Vaeck et al.，Nature，328：33-37，1987)、Barton等(Barton etal.，Plant Physiol.85：1103-1109，1987)、Fischoff等(fisehoff et al.，Bio/Technology，5：807-813，1987)获得了转Bt基因植物。但他们获得的这些早期的转Bt基因植株的抗虫性都很弱，难以检测出mRNA的转录，蛋白质表达量很低。造成Bt基因在植物中表达量低的原因有许多：例如，1、野生Bt基因中富含AT序列，在植物中表达的mRNA不稳定；2、野生Bt基因中可能存在真核基因的内含子切割位点、转录终止信号序列，造成转录本不完整或转录本的异常加工；3、微生物与植物在翻译中对密码子的使用频率上有很大差异，使翻译效率降低；4、真核基因的5’-UTR序列与原核基因有很大的不同，以及真核基因的3’端需要加尾识别信号序列。因此，要使得Bt基因在转基因植物中高效表达，必须对野生Bt基因进行有效的改造。

1990年Adang等(Adang et al，EP0359472，1990)通过调整野生基因的A+T含量和密码子的使用频率，使其与双子叶植物基因保持一致，去除了影响基因在植物中表达的AATGAA，合成了一个新Btt基因：新基因与原基因的同源性为85％，A+T含量下降到正常植物基因的水平(55％)。利用改造的基因转化植物，Bt蛋白的表达量得到提高。

1991年，Perlak等人(Perlak et al.，PNAS USA，7164 88：3324-3328 1991)在不改变晶体蛋白氨基酸序列的情况下，对CrylAb基因进行了部分改造或通过人工合成进行完全改造，选用植物偏爱的密码子，去除了原序列中干扰基因在植物中表达的元件，如ATTTA序列，获得了PM和FM基因；结果，转PM和FM基因植物的目标蛋白表达量获得提高。

1992年，郭三堆等人(郭三堆等，95119563.8，C12N5/32，1995)通过双链合成DNA方法，人工合成了全长1824bp的CrylAb和CrylAc融合的GFM杀虫基因，结果Bt毒蛋白在植物中的表达量大幅度提高，全合成基因比原基因的表达量提高了约100倍。之后，许多科学工作者对Bt杀虫基因进行了大量的改造研究，并利用改造的Bt杀虫基因做了大量的植物转化工作，为培育Bt抗虫植物打下了基础。据不完全统计，至今已有部分改良或人工合成的Bt基因(用于转基因植物)专利四十多项。

                                发明内容

本发明的目的在于保持原始苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry2A杀虫蛋白的氨基酸序列不变的前提下，通过人工改造合成新的Cry2A基因(DNA)序列及其制备方法。本发明的DNA序列将能够在植物细胞中高效表达，进而用于生产转基因抗虫植物

本发明通过以下方案实现：

一种Cry2A的苏云金芽胞杆菌(Bt)DNA序列，它具有核苷酸编码序列表SEQ.ID No.1所示的序列。还具有如序列表SEQ.ID No.2所示的5’端非编码的引导序列和序列表SEQID No.3所示的3’端的加尾识别的序列。

所述的的编码核苷酸序列SEQ.ID No.1的C+G含量为59.04％，与原始DNA序列的同源性为69.45％。

所述的DNA序列的密码子组成如图1所示。

一种改造合成苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry2A基因DNA序列的方法，所述的方法包括它具有编码核苷酸序列表SEQ.ID No.1、序列表SEQ.ID No.2所示的5’端非编码的引导序列和序列表SEQ ID No.3所示的3’端的加尾识别的核苷酸序列。

所述的DNA序列，包括该DNA序列在植物细胞中的表达，更进一步的在植物转基因抗虫育种上的应用。

具体步骤包括：

(1)找出植物偏爱的密码子，在保持原Cry2A蛋白的氨基酸组成不变的情况下，用植物基因偏爱的密码子置换Cry2A基因对应的密码子，初步获得一个改造的DNA序列。

(2)排除DNA序列中存在的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列以及常用限制性内切酶位点，然后通过置换密码子的方法进行改正消除。

(3)用改进的Cry2A基因的编码序列的正链和对应的负链进行Blast2分析，通过置换密码子的方法排除基因内存在大的反向重复序列。

(4)确定Cry2A基因如序列表SEQ ID NO：1所示的编码序列。

(5)在确定的Cry2A基因的编码序列的5’端添加如序列表SEQ ID NO：2所示的序列，在3’端添加如序列表SEQ ID NO：3所示的序列。

(6)在序列两端加上进一步克隆需要的限制性内切酶识别位点序列。最终确定如序列表SEQ ID NO：4所示的序列。

(7)化学合成如如序列表SEQ ID NO：4所示的序列。

                                附图说明

1、序列表SEQ ID NO.1是设计的Cry2A的编码序列

2、序列表SEQ ID NO..2是序列2 5’端引导序列：

3、序列表SEQ ID NO.3是3’端加尾识别信号和转录终止序列：

4、序列表SEQ ID NO.4是合成的Cry2A基因序列

图1：是本发明改造合成的新Cry2A的编码序列与原始Cry2A编码序列的密码子特征比较。

与已有的Cry2A基因相比，本发明构建合成的新Cry2A基因(DNA)序列可在植物细胞中进行表达，并将可用于转基因抗虫植物的育种上。

                              具体的实施方式

实施例1  植物基因和Cry2A密码子偏爱性分析：

从Genbank中查找原始Cry2A基因的核苷酸编码序列、找出984条植物基因编码序列及20条高度表达的核糖体蛋白基因编码序列，分别统计各类基因的密码子使用频率，列表1。从中可以发现，Cry2A基因与植物基因在密码子的使用上有较大差异，主要表现在：Cry2A基因对第三位摇摆碱基为A或T的密码子有偏爱性，而植物基因密码子的第三位摇摆碱基偏爱使用G或C。

          表1    各类基因密码子使用频率统计

Codon  氨基酸  植物基因   植物核糖体蛋白基因  原始Cry2A

TAA      $       292             5                1

TGA      $       465             5                0

TAG      $       227             10               0

GCT      A       7061            80               9

GCC      A       10110           181              7

GCA      A       5519            38               9

GCG      A       7736            89               5

TGT      C       1663            15               3

TGC      C       4454            54               1

GAT      D       8003            65               24

GAC      D       10376           111              0

GAA      E       6316            41               15

GAG      E       13956           200              4

TTT      F       4189            20               28

TTC      F       8711            108              5

GGT      G       5567            82               17

GGC      G       10549           120              2

GGA      G       5193            49               16

GGG      G       5470            49               7

CAT      H       3123            21               8

CAC      H       4565            72               3

ATT      I       5047            46               16

ATC      I       8608            147              5

ATA      I       2781            6                18

AAA      K       4817            38               8

AAG      K       13807           375              1

TTA      L       1698            1                29

TTG      L       4270            35               9

CTT      L       5304            53               12

CTC      L       8852            160              4

CTA        L        1966            5            6

CTG        L        7342            71           3

ATG        M        8337            88           11

AAT        N        4672            25           55

AAC        N        8376            81           13

CCT        P        4137            43           12

CCC        P        3893            78           1

CCA        P        4245            32           11

CCG        P        4866            62           2

CAA        Q        4091            31           20

CAG        Q        8188            109          8

CGT        R        2145            40           7

CGC        R        4596            127          0

CGA        R        1239            13           4

CGG        R        2808            25           1

AGA        R        2676            16           18

AGG        R        5024            93           6

TCT        S        3586            26           15

TCC        S        5603            103          4

TCA        S        3536            22           15

TCG        S        3296            34           4

AGT        S        2524            11           18

AGC        S        5339            41           4

ACT        T        3639            31           21

ACC        T        6012            122          6

ACA        T        3558            17           23

ACG        T        3356            29           7

GTT        V        5612            61           15

GTC        V        7167            125          2

GTA        V        1989            9            14

GTG        V        8343            119          6

TGG        W        4236            29           8

TAT        Y        3410            24           24

TAC        Y        6851            77           3

实施例2：Cry2A基因的密码子改造及合成的新Cry2A基因的密码子特征分析

依据表1分析结果，采用植物基因的偏爱性密码子置换原始Cry2A的对应密码子，消除Cry2A基因中ATTTA、AATGAA等富含AT序列和不明确的内含子序列，以及排除基因中存在的大的反向重复序列和常用限制性内切酶识别位点序列；设计出目标合成的Cry2A基因的编码序列如序列表SEQ ID NO..1所示。目标合成的Cry2A基因的密码子特征如图2所示。

实施例3：合成的新Cry2A编码序列特征分析

将原始Cry2A与合成的新Cry2A编码序列进行Blast2分析，两条序列的同源性为69.45％。碱基组成的统计结果为：原始基因的C+G％为34.75％，新合成基因的C+G％为59.04％。编码的氨基酸序列的Blast2分析显示，两者编码的氨基酸序列完全一致。实施例4提高基因转录本在植物细胞中的稳定性和表达效率的末端序列的添加

通过对植物基因的5’端引导序列的结构分析，设计序列2，该序列如序列表序列表SEQ ID NO..2所示，并加在新Cry2A基因编码序列的5’端。另设计的序列如序列表SEQ ID NO..3所示，该序列添加在新Cry2A基因编码序列的3’端

实施例5  进一步克隆的限制性内切酶识别位点序列的添加

根据基因进一步克隆的需要，在设计序列的5’端添加BamH I内切酶识别位点序列ggatcc，3’端添加Sac I、BamH I和Hind III内切酶识别位点序列gagctcggatccaagctt。

实施例6：新Cry2A基因的合成

通过以上步骤，设计出改造合成的新Cry2A基因序列如序列表序列表SEQ ID NO..4所示。然后通过化学合成该基因，装载在质粒载体pUC18上。

实施例6  合成基因在大肠杆菌细胞中表达和表达产物的毒性检测

将合成的新Cry2A基因构建到大肠杆菌质粒表达载体pGEX-KG，转化大肠杆菌DH10B：接种单菌落至20mL LB培养基培养4小时，加入IPTG诱导表达试剂，继续培养2-3小时；然后离心收集菌体，加入20mL无菌水重悬；液氮反复冻溶6次，离心去菌体，上清液喂食鳞翅目昆虫菜青虫和二化螟；毒性鉴定结果见表2和表3所示：

表2  本发明合成的基因表达产物对菜青虫的毒性鉴定

一、喂食24小时的统计结果	处理(三次重复)	试虫数(只)	平均死亡率(％)	校正死亡率(％)
						清水	18	5.56
	空白载体	18	11.11	5.88
						Cry2A	18	27.76	23.51
二、喂食48小时的统计结果	处理(三次重复)	试虫数(只)	平均死亡率(％)	校正死亡率(％)
						清水	18	5.56
	空白载体	18	22.22	17.64
						Cry2A	18	66.67	64.71

表3本发明合成的基因表达产物对二化螟的毒性鉴定

一、喂食48小时的统计结果	处理(三次重复)	试虫数(只)	平均死亡率(％)	校正死亡率(％)
						清水	30	0	0
	空白载体	30	10.0	10.0
						Cry2A	30	30.0	30.0
二、喂食72小时的统计结果	处理(三次重复)	试虫数(只)	平均死亡率(％)	校正死亡率(％)
						清水	30	0	0
	空白载体	30	16.67	16.67
						Cry2A	30	66.67	64.29

例7  植物转基因载体的构建

用Sac I和BamH I酶切装载有新Cry2A基因的质粒载体pUC18，电泳回收新Cry2A基因片段，将回收片段装载到含Ubiquitin启动子的中间过渡质粒；然后，用Sma I和Sac I酶切和回收，装载到植物转基因的双元Ti质粒载体，构建成完整的用于植物转基因的表达载体。

                            序列表

Organization Applicant

     Street：狮子山街

     City：武汉

     State：湖北省

     Country：中国

     PostalCode：430070

     PhoneNumber：86-27-87282038

     FaxNumber：86-27-87397735

     EmailAddress：zhanghb@mail.hzau.edu.cn

<110>OrganizationName：华中农业大学

Application Project

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<120>Title：改造合成的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因Cry2A

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<141>CurrentFilingDate：2002-09-04

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<213>OrganismName：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

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tggaagcgca cggaccacag cctctacgtc gccccagtgg tcggcactgt gtcgagcttc     180

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atcttcccca gcggtagcac caacctgatg caggatatcc tgcgcgagac cgaacagttc     300

ctgaaccagc gcctgaacac tgacaccctc gctcgtgtca atgcggacct gatcggcctg     360

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gtagcaccaa cctgatgcag gatatcctgc gcgagaccga acagttcctg aaccagcgcc    420

tgaacactga caccctcgct cgtgtcaatg cggacctgat cggcctgcag gccaacatca    480

gggagttcaa tcaacaggtg gacaacttcc tcaaccccac ccagaaccca gtgccgctgt    540

ccatcacgag ctccgtgaac accatgcagc agctgttcct gaatcgcctc ccgcagttcc    600

agatccaagg ctaccagctc ttgctgctgc ccctcttcgc tcaggcggcc aacatgcacc    660

tgagcttcat ccgcgacgtg atcctgaacg ctgacgagtg gggtatctcc gccgccaccc    720

tcaggaccta ccgcgattac ctgcgcaact acacccgtga ctattccaac tactgcatca    780

acacctacca gaccgccttc aggggcctca acacccgcct gcacgacatg cttgagttcc    840

gcacatacat gttcctgaac gtgttcgaat acgtctccat ctggagcctc ttcaagtacc    900

agagcctgat ggtgagctcc ggcgctaacc tctacgccag cggttccggc ccacagcaaa    960

cccagagctt caccgcccag aactggccct tcctctacag cctgttccaa gtgaatagca   1020

actacatcct gtccggcatc tccggtacca ggctgtcgat caccttcccc aacatcggcg   1080

gtctgccagg cagcacgacc actcactccc tgaacagcgc cagggtgaac tacagcggcg   1140

gtgtgagcag cggtctcatc ggcgccacca atctcaacca caacttcaac tgcagcaccg   1200

tgctgccacc cctgtccacc cccttcgttc gcagctggct ggacagcggc accgataggg   1260

agggcgtggc taccagcacc aactggcaga ccgaatcctt ccagaccact ctgagcctca   1320

ggtgcggtgc cttcagcgcc cgcggcaata gcaactactt ccccgactac ttcatccgca   1380

acattagcgg cgtcccactc gtgatccgca acgaggacct gaccaggccc ctccactaca   1440

accaaatccg caacatcgag tcccccagcg gcaccccagg tggcgctagg gcctacctgg   1500

tgagcgtgca caaccgcaag aacaatatct acgccgctaa cgagaacggc accatgatcc   1560

atctggcccc cgaagactac accggcttca ccatcagccc aatccacgcc acgcaggtga   1620

acaatcaaac ccgcactttc atcagcgaga agttcggcaa ccagggcgac agcctgaggt   1680

tcgagcagag caacaccaca gcccgctaca ccctgcgtgg caatggtaac tcctacaacc   1740

tctacctgag ggtcagcagc atcggcaaca gcaccatccg cgtgaccatt aacggccgtg   1800

tgtacaccgt gagcaacgtg aacaccacta cgaacaacga cggtgtcaac gataacggcg   1860

ctcgcttctc cgacatcaac atcggtaata tcgtggccag cgataacacc aacgtcaccc   1920

tggacatcaa cgtgaccctc aactccggca cccccttcga cctgatgaac atcatgttcg   1980

tgcccaccaa cctgccgcca ctctactaat gacgaattcc cgatctagta acatagatga   2040

caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta   2100

aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcacct   2160

gaatagatct tggacaagcg ttaggcctat ctgtgcatta catgttaatt attacatgct   2220

taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca ggattcaatc   2280

ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa attcgagctc ggatccaagc   2340

ttc                                                                 2343

<212>Type：DNA

<211>Length：2343

    SequenceName：SEQ ID NO：4

    SequenceDescription：

Feature

-------

Sequence：SEQ ID NO：4：

<221>FeatureKey：gene

<222>LocationFrom：1

<222>LocationTo：2343

     Other Information：

     CDSJoin：No

Claims (5)

1一种Cry2A的苏云金芽胞杆菌DNA序列，它具有核苷酸核编码序列表SEQ ID NO：1所示的序列。

2、如权利要求1所述的DNA序列，它具有如序列表SEQ IDNO：2所示的5’端非编码的引导序列和序列表SEQ ID NO：3所示的3’端的加尾识别序列。

3、根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于：编码核苷酸序列的C+G含量为59.04％，与原始DNA序列的同源性为69.45％。

4、根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于密码子组成如图1所示。

5、一种获得如权利要求1所述的DNA序列的方法，其步骤包括：

(1)找出植物偏爱的密码子，在保持原Cry2A蛋白的氨基酸组成不变的情况下，用植物基因偏爱的密码子置换Cry2A基因对应的密码子，初步获得一个改造的DNA序列；

(2)排除步骤(1)所述的DNA序列中存在的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列以及常用限制性内切酶位点，然后通过置换密码子的方法进行改正消除；

(3)用改进的Cry2A基因的编码序列的正链和对应的负链进行Blast2分析，通过置换密码子的方法排除基因内存在大的反向重复序列；

(4)确定Cry2A基因如序列表SEQ ID NO：1所示的编码序列；

(5)在确定的Cry2A基因的编码序列的5’端添加如序列表SEQ ID NO：2所示的序列，在3’端添加如序列表SEQ ID NO：3所示的序列；

(6)在序列两端加上进一步克隆需要的限制性内切酶识别位点序列，最终确定如序列表SEQID NO：4所示的序列；

(7)化学合成如如序列表SEQ ID NO：4所示的序列。

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