KR102238620B1 - 신규한 곤충 저해 단백질 - Google Patents

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캐서린 에이. 차이
토드 에이. 시셰
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제니퍼 엘. 뤼트케
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몬산토 테크놀로지 엘엘씨
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Abstract

나비목 해충 종에 대한 독성 활성을 나타내는 살충제 단백질이 개시되고, 이는 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 및 TIC7473PL을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 개시된 살충제 단백질 중 하나 이상을 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 함유하는 DNA 작제물이 제공된다. 본 발명의 살충제 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 함유하는, 나비목 침입에 대해 내성인 형질전환 식물, 식물 세포, 종자, 및 식물 부분이 제공된다. 생물학적 샘플에서 본 발명의 재조합 핵산 서열 또는 단백질의 존재를 검출하는 방법, 및 임의의 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 및 TIC7473PL 살충제 단백질을 사용하여 나비목 종 해충을 조절하는 방법이 또한 제공된다.

Description

신규한 곤충 저해 단백질{NOVEL INSECT INHIBITORY PROTEINS}
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2015년 8월 27일자로 출원된 미국 가출원 제62/210,737호의 우선권의 이익을 주장하며, 이러한 문헌의 개시 내용은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열 목록의 포함
컴퓨터-판독 가능한 형태의 서열 목록을 포함하는 파일명 "38-21_61627US0001SEQLISTING_ST25.txt"은 2016년 8월 3일자로 생성되었다. 이러한 파일은 (미국특허청 EFS-Web 파일링 시스템을 이용하여) 전자식 제출에 의해 동시에 제출된, 94,508 바이트(MS-Windows®에서 측정됨)이며, 이는 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로, 곤충 저해 단백질(insect inhibitory protein)의 분야에 관한 것이다. 작물 및 종자의 농업 관련 해충에 대한 곤충 저해 활성을 나타내는 신규한 부류의 단백질이 개시된다. 특히, 개시된 부류의 단백질은 작물 및 종자의 농업 관련 해충, 특히 나비목 종(Lepidopteran species)의 곤충 해충에 대한 살충제 활성을 나타낸다. 개시된 독소 단백질들 중 하나 이상을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물을 함유한 식물, 식물 부분, 및 종자가 제공된다.
다른 것들 중에서 옥수수, 대두, 사탕수수, 벼, 밀, 채소, 및 면화를 포함하는 농업적으로 중요한 식물의 작물 수확량의 개선은 점차 중요해지고 있다. 인구 증가로 인해 먹이고, 입히고, 에너지를 제공하기 위한 농산물에 대한 필요성의 성장 이외에도, 기후-관련 효과 및 인구 성장에 따른 농업 실무(agricultural practices)를 위한 것 이외에 토지 사용에 대한 압력으로 농경을 위해 이용 가능한 경작 가능한 토지의 양이 감소할 것으로 예측된다. 이러한 인자들은 특히, 식물 바이오기술 및 농경 실무에서 주된 개선 없이, 식품 안보에 대한 예측을 어렵게 만든다. 이러한 압력에 비추어 볼 때, 기술, 농업 기술, 및 해충 관리의 환경적으로 지속 가능한 개선은 농경을 위해 이용 가능한 제한된 양의 경작지에서 작물 생산을 확대하는데 필수적인 도구이다.
곤충, 특히, 나비목(Lepidoptera) 및 딱정벌레목(Coleoptera)에 속하는 곤충은 농작물에 대한 주요 손상 원인으로 여겨지고, 이에 의해, 침입한 영역에서 작물 수확량을 감소시킨다. 농업에 악영향을 미치는 나비목 해충 종은 검정 거염벌레(Black armyworm)(스포도프테라 엑셈프타(Spodoptera exempta)), 검거세미나방(Black cutworm)(아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon)), 옥수수 이삭벌레(Corn earworm)(헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 목화 잎 벌레(cotton leaf worm)(알라바마 아르길라세아(Alabama argillacea)), 배추좀나방(Diamondback moth)(플루텔라 크실로스텔라(Plutella xylostella)), 유럽 조명충나방(Europeancorn borer)(오스트리니아 누빌랄리스(Ostrinia nubilalis)), 가을 거염벌레(Fall armyworm)(스포도프테라 프루기페르다(podoptera frugiperda)), Cry1Fa1 내성 가을 거염벌레(Cry1Fa1 resistant Fall armyworm)(스포도프테라 프루기페르다(podoptera frugiperda)), 구대륙 다래벌레(Old World bollworm)(OWB, 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera)), 남부 거염벌레(Southernarmyworm)(스포도프테라 에리다니아(podoptera eridania)), 대두 루퍼(Soybean loope)(크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens)), 반점 다래벌레(Spotted bollworm)(에아리아스 비텔라(Earias vittella)), 서남부 조명충나방(Southwesterncorn borer)(디아트라에아 그란디오셀라(Diatraea grandiosella)), 회색담배나방(Tobacco budworm)(헬리오티스 비레스켄스(Heliothis virescens)), 담배거세미나방(Tobacco cutworm)(스포도프테라 리투라(podoptera litura), 클러스터 애벌레(cluster caterpillar)로도 알려짐), 서부 콩 야도충(Western bean cutworm)(스트리아코스타 알비코스타(Striacosta albicosta)), 및 벨벳 콩 애벌레(Velvet bean caterpillar)(안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis))를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
역사적으로, 합성 화학 살충제의 집중적인 적용은 농업에서 해충 조절제에 의존하였다. 환경 및 인체 건강에 대한 우려는 새로운 내성 문제 이외에, 생물학적 농약의 연구 및 개발을 일으켰다. 이러한 연구 노력은 박테리아를 포함하는, 다양한 곤충 병원성 미생물 종의 점진적인 발견 및 사용을 이끌어 내었다.
곤충 병원성 박테리아, 특히, 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 박테리아의 잠재성이 발견되고 생물학적 해충 조절제로서 개발되었을 때 생물학적 조절 패러다임이 옮겨졌다. 박테리아의 균주, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)(Bt)는 Bt 균주가 특정 곤충에 대한 높은 독성을 나타낸다는 것으로 밝혀졌기 때문에, 소스(source) 또는 살충제 단백질(pesticidal protein)로서 사용되었다. Bt 균주는 포자형성(sporulation)의 개시 시에 및 정지 성장기 동안 부아포 결정질 봉입체 내에 위치되고(예를 들어, Cry 단백질), 또한, 분비된 살충제 단백질을 생산하는 델타-내독소를 생성시키는 것으로 알려져 있다. 민감한 곤충에 의한 섭취 시에, 델타-내독소뿐만 아니라 분비된 독소는 중장상피 세포(midgut epithelium)의 표면에서 이의 효과를 발휘하여, 세포막을 파괴하여, 세포 파괴 및 사멸을 일으킨다. 살충제 단백질을 인코딩하는 유전자는 또한, 다른 바실러스 및 브레비바실러스 라테로스포루스(Brevibacillus laterosporus), 라시니바실러스 스파에리쿠스(Lysinibacillus sphaericus)("Ls"는 종래에 바실러스 스파에리쿠스Bacillus sphaericus)로서 알려짐) 및 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae)와 같은, 여러 가지의 추가적인 박테리아 종을 포함하는, Bt 이외의 박테리아 종에서 식별되었다.
결정성 및 분비된 용해성 살충 독소는 이의 숙주에 대해 매우 특이적이고, 화학 살충제에 대한 대안으로서 전세계적으로 받아들여지고 있다. 예를 들어, 살충 독소 단백질은 곤충 침입으로부터 농업적으로 중요한 식물을 보호하고, 화학 살충제 적용에 대한 필요성을 감소시키고, 수확량을 증가시키기 위해 다양한 농업 적용에서 사용되고 있다. 살충 독소 단백질은 기계적 방법, 예를 들어, 식물 표면 상에 다양한 박테리아 균주를 함유한 미생물 포뮬레이션을 분산시키기 위한 스프레잉(spraying)에 의해, 그리고, 살충 독소 단백질을 발현시키는 형질전환 식물 및 종자를 생성시키기 위한 유전적 형질전환 기술을 이용함으로써, 작물의 농업 관련 해충을 조절하기 위해 사용된다.
살충 독소 단백질을 발현시키는 형질전환 식물의 사용은 전세계적으로 책택되었다. 예를 들어, 2012년에, 2610만 헥타아르(hectare)에 Bt 독소를 발현시키는 형질전환 작물이 심겨졌다[James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAA Brief No. 44]. 형절전환 곤충-보호 작물의 전세계적인 사용 및 이러한 작물에서 사용되는 살충 독소 단백질의 제한된 수는 현재 사용되고 있는 살충 단백질에 대한 내성을 부여하는 기존의 곤충 대립 유전자에 대한 선택 압력을 생성시켰다.
살충 독소 단백질에 대한 표적 해충에서의 내성의 개발은 살충 독소 단백질을 발현시키는 형질전환 작물에 대해 내성인 곤충의 증가를 관리하는데 유용한 신규한 형태의 살충 독소 단백질의 발견 및 개발을 위해 지속적인 필요성을 창출한다. 개선된 효능을 지니고 보다 넓은 스펙트럼의 민감한 곤충 종에 대한 조절을 나타내는 신규한 단백질 독소는 내성 대립 유전자를 생성시킬 수 있는 살아남는 곤충의 수를 감소시킬 것이다. 또한, 하나 식물에서, 동일한 곤충 해충에 대해 독성을 나타내고 상이한 작용 모드를 나타내는 둘 이상의 형질전환 살충 독소 단백질의 사용은 임의의 단일 표적 곤충 종에서의 내성 가능성을 감소시킨다.
이에 따라, 본 발명자는 본 명세서에서 표적 나비목 종에 대해, 특히, 검정 거염벌레(스포도프테라 엑셈프타(Spodoptera exempta)), 검거세미나방(아그로티스 입실론), 옥수수 이삭벌레(헬리코베르파 제아), 목화 잎 벌레(알라바마 아르길라세아), 배추좀나방(플루텔라 크실로스텔라), 유럽 조명충나방(오스트리니아 누빌랄리스), 가을 거염벌레(스포도프테라 프루기페르다), Cry1Fa1 내성 가을 거염벌레(스포도프테라 프루기페르다), 구대륙 다래벌레(OWB, 헬리코베르파 아르미게라), 남부 거염벌레(스포도프테라 에리다니아), 대두 루퍼(크리소데익시스 인클루덴스), 반점 다래벌레(에아리아스 비텔라), 서남부 조명충나방(디아트라에아 그란디오셀라), 회색담배나방(헬리오티스 비레스켄스), 담배거세미나방(스포도프테라 리투라, 클러스터 애벌레로도 알려짐), 서부 콩 야도충(스트리아코스타 알비코스타), 및 벨벳 콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스)에 대해 살충 활성을 나타내는 유사한 독소 단백질, 변형체 단백질, 및 예시적인 재조합 단백질과 함게, 파에니바실러스 포필리아에로부터의 신규한 단백질 독소 패밀리를 개시한다.
본 명세서에는 작물의 하나 이상의 해충에 대한 저해 활성을 나타내는 것으로 보이는, TIC6757 단백질 독소 부류에 속하는 TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473으로서 본 명세서에서 지칭되는 곤충 저해 활성을 갖는 신규한 그룹의 살충제 단백질(독소 단백질)이 개시된다. TIC6757 단백질 및 TIC6757 단백질 독소 부류에서의 단백질들은 포뮬레이션에서 그리고 식물에서, 단독으로, 또는 다른 살충 단백질 및 독성제와 조합하여 사용될 수 있고, 이에 따라, 농업 시스템에서 현재 사용되는 살충 단백질 및 살충제 화학물질에 대한 대안을 제공할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 출원에서 살충제 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 결합된 이종 프로모터 단편을 포함하는 재조합 핵산 분자가 기재되어 있으며, 여기서, (a) 상기 살충제 단백질은 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) 상기 살충제 단백질은 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 또는 서열번호 18과 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; (c) 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3, 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하거나; (d) 살충제 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3, 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 또는 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 65%, 또는 70%, 또는 75%, 또는 80%, 또는 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; (e) 상기 재조합 핵산 분자는 벡터와 작동 가능하게 결합되며, 상기 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바크미드, 코스미드, 및 박테리아 또는 효모 인공 염색체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 재조합 핵산 분자는 식물에서 살충제 단백질을 발현시키도록 기능하는 서열을 포함할 수 있거나, 살충적 유효량의 살충제 단백질을 생성시키기 위해 식물 세포에서 발현된다.
본 출원의 다른 실시형태에서, 본 출원의 재조합 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 있으며, 여기서, 숙주 세포는 박테리아 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 고려되는 박테리아 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 바실러스(Bacillus), 브레비바실러스(Brevibacillus), 에케리치아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에크(Pantoec), 및 에르비니아(Erwinia)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 바실러스 종은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)이거나, 상기 브레비바실러스는 브레비바실러스 라테로스페로우스(Brevibacillus laterosperous)이거나, 에케리치아는 에케리치아 콜라이(Escherichia coli)이다. 고려된 식물 숙주 세포는 쌍자엽 식물 세포 및 단자엽 식물 세포를 포함한다. 고려된 식물 세포는 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 브래시카, 당근, 카사바, 카스토르, 콜리플라워, 샐러리, 병아리콩, 중국 양배추, 귤, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 목화(고시피움 종(Gossypium sp.)), 조롱박, 오이, 미송(Douglas fir), 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 호프, 부추, 상추, 테다 소나무, 조, 멜론, 너트, 귀리, 올리브, 양파, 관상용, 팜, 목초, 완두콩, 땅콩, 후추, 피젼피, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디에이터 소나무(Radiata pine), 무, 평지씨, 벼, 근경, 호밀, 잇꽃, 관목, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕 옥수수, 스위트 검, 고구마, 스위치풀, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디풀, 수박, 및 밀 식물 세포를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 살충제 단백질은 벨벳 콩 애벌레, 사탕수수 천공벌레, 명충나방의 유충, 옥수수 이삭벌레, 회색담배나방, 대두 루퍼, 검정 거염벌레, 남부 거염벌레, 가을 거염벌레, 사탕무 거염벌레, 구대륙 다래벌레, 오리엔탈 잎 벌레, 분홍 다래벌레, 검거세미나방, 서남부 조명충나방, 목화 잎 벌레, 배추좀나방, 반점 보울 벌레(Spotted bowl worm), 담배거세미나방, 서부 콩 야도충, 및 유럽 조명충나방을 포함하는, 나비목 곤충에 대한 활성을 나타낸다.
또한, 본 출원에서 살충제 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 결합된 이종 프로모터 단편을 포함하는 재조합 핵산 분자가 고려되며, 여기서, (a) 상기 살충제 단백질은 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 16, 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) 상기 살충제 단백질은 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 16, 또는 서열번호 18과 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; (c) 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3, 서열번호 15, 또는 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열의 보체에 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 하이브리드화하거나; (d) 상기 식물은 검출 가능한 양의 상기 살충제 단백질을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 살충제 단백질은 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 16, 또는 서열번호 18을 포함한다. 일 실시형태에서, 식물은 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물 중 어느 하나이다. 다른 실시형태에서, 식물은 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 브래시카, 당근, 카사바, 카스토르, 콜리플라워, 샐러리, 병아리콩, 중국 양배추, 귤, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 목화, 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 호프, 부추, 상추, 테다 소나무, 조, 멜론, 너트, 귀리, 올리브, 양파, 관상용, 팜, 목초, 완두콩, 땅콩, 후추, 피젼피, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디에타 소나무, 무, 평지씨, 벼, 근경, 호밀, 잇꽃, 관목, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕 옥수수, 스위트 검, 고구마, 스위치풀, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디풀, 수박, 및 밀로 이루어진 군으로부터 추가로 선택된다.
추가 실시형태에서, 재조합 핵산 분자를 포함하는 종자가 개시된다.
다른 실시형태에서, 본 출원에 개시된 재조합 핵산 분자를 포함하는 곤충 저해 조성물이 고려된다. 곤충 저해 조성물은 상기 살충제 단백질과 상이한 적어도 하나의 다른 살충제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 다른 살충제는 곤충 저해 단백질, 곤충 저해 dsRNA 분자, 및 부수적인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 곤충 저해 조성물에서 적어도 하나의 다른 살충제가 나비목, 딱정벌레목, 또는 반시목의 하나 이상의 해충 종에 대한 활성을 나타내는 것이 고려된다. 곤충 저해 조성물에서 적어도 하나의 다른 살충제는 일 실시형태에서, Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, Cry1C 변형체, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1A/F 키메라, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, Cry3A 변형체, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113, 및 AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z 및 AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335,AXMI-R1 및 이의 변형체, IP3 및 이의 변형체, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 및 DIG-11 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
검출 가능한 양의 본 출원에 개시된 재조합 핵산 분자를 포함하는 상품이 또한 고려된다. 이러한 상품은 곡물 취급자에 의해 포장된 상품 옥수수, 콘 플레이크, 옥수수 케이크, 옥수수 가루, 옥수수 밀, 옥수수 시럽, 옥수수 오일, 옥수수 사일리지, 옥수수 전분, 옥수수 시리얼 등, 및 상응하는 대두, 벼, 밀, 수수, 피젼피, 땅콩, 과일, 멜론, 및 적절한 경우에, 쥬스, 농축물, 잼, 잴리, 마멀레이드, 및 검출 가능한 양의 본 출원의 이러한 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 함유한 다른 식용 형태의 이러한 상품, 전체 또는 가공된 목화 종자, 목화 오일, 린트, 종자 및 사료 또는 식품, 섬유, 페이퍼, 바이오매스 및 연료 제품, 예를 들어, 목화오일로부터 유도된 연료, 또는 조명기 폐기물로부터 유도된 펠렛을 위해 가공된 식물 부분, 전체 또는 가공된 대두 종자, 대두유, 대두 단백질, 대두 밀, 대두 가루, 대두 플레이크, 대두 겨, 두유, 대두 치즈, 대두 와인, 대두를 포함하는 동물 사료, 대두를 포함하는 페이퍼, 대두를 포함하는 크림, 대두 바이오매스, 및 대두 식물 및 대두 식물 부분을 사용하여 생성된 연료 생성물을 포함한다.
또한, 본 출원에서 본 출원에 개시된 재조합 핵산 분자를 포함하는 종자를 생산하는 방법이 고려된다. 본 방법은 본 출원에 개시된 재조합 핵산 분자를 포함하는 종자 중 적어도 하나를 재배하고; 종자로부터 식물을 성장시키고; 식물로부터 종자를 수확하는 것을 포함하며, 여기서, 수확된 종자는 본 출원에서 재조합 핵산 분자를 포함한다.
다른 예시적인 실시형태에서, 곤충 침입에 대해 내성인 식물이 제공되며, 여기서, 상기 식물의 세포는 (a) 살충적 유효량의 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 16, 또는 서열번호 18에 기술된 바와 같은 살충제 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 분자; 또는 (b) 살충적 유효량의 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 16, 또는 서열번호 18과 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다.
또한, 본 출원에서 나비목 종 해충을 조절하고 식물, 특히 작물의 나비목 종 해충 칩입을 조절하는 방법이 개시된다. 본 방법은 일 실시형태에서, (a) 해충을, 살충적 유효량의 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 16, 또는 서열번호 18에 기술된 바와 같은 살충제 단백질과 접촉시키거나; (b) 해추을 살충적 유효량의, 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 16, 또는 서열번호 18과 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 살충제 단백질을 접촉시키는 것을 포함한다.
또한, 본 명세서에는 살충제 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 여기서, (a) 상기 살충제 단백질은 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) 상기 살충제 단백질은 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 또는 서열번호 18과 적어도 65%, 또는 70%, 또는 75%, 또는 80%, 또는 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; (c) 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3, 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 또는 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 방법은 엄격한 하이브리드화 조건 하에서, 본 명세서에 제공된 살충제 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물로부터 게놈 DNA와 하이브리드화하고 이러한 하이브리드화 조건 하에서 세그먼트를 포함하지 않는 다른 동종 식물로부터 게놈 DNA와 하이브리드화하지 않는 핵산 프로브와 핵산 샘플을 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 프로브는 서열번호 3, 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 또는 서열번호 17, 또는 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 또는 서열번호 18과 적어도 65%, 또는 70%, 또는 75%, 또는 80%, 또는 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 살충제 단백질을 인코딩하는 서열과 동종이거나 상보적이다. 본 방법은 (a) 샘플 및 프로블르 엄격한 하이브리드화 조건으로 처리하고; (b) 샘플의 DNA와 프로브의 하이브리드화를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 단백질을 포함하는 샘플에서 살충제 단백질 또는 이의 단편의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 여기서, 상기 살충제 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 살충제 단백질은 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 또는 서열번호 18과 적어도 65%, 또는 70%, 또는 75%, 또는 80%, 또는 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 약 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 (a) 샘플을 면역반응성 항체와 접촉시키고; (b) 단백질의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 단계는 ELISA, 또는 웨스턴 블롯을 포함한다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae) 종 DSC004343으로부터 얻어진 TIC6757 살충제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 2는 TIC6757 살충제 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 식물 세포에서 발현을 위해 설계된 TIC6757PL 살충제 단백질을 인코딩하는 합성 코딩 서열이며, 여기서, 추가적인 알라닌 코돈은 메티오닌 코돈을 개시한 직후에 삽입된다.
서열번호 4는 식물 세포에서 발현하기 위해 설계된 합성 코딩 서열(서열번호 3)에 의해 인코딩된 TIC6757PL의 아미노산 서열이며, 여기서, 추가적인 알라닌 아미노산은 메티오닌을 개시한 직후에 삽입된다.
서열번호 5는 TIC6757_His 살충제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이며, 여기서, 히스티딘 태그를 인코딩하는 핵산 서열은 5'에 및 프레임에서 TIC6757 코딩 서열에 작동 가능하게 결합된다.
서열번호 6은 TIC6757_His 살충제 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 7은 파에니바실러스 포필리아에 종 DSC007648로부터 얻어진 TIC7472 살충제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 8은 TIC7242 살충제 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 9는 TIC7472_His 살충제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이며, 여기서, 히스티딘 태그를 인코딩하는 핵산 서열은 3' 및 프레임에서 TIC7472 코딩 서열에 작동 가능하게 결합된다.
서열번호 10은 TIC7472_His 살충제 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 뉴클레오타이드 위치 1-2391 및 번역 종결 코돈에서 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 TIC7473 살충제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 12는 파에니바실러스 포필리아에 종 DSC008493으로부터 얻어진 TIC7243 살충제 단백질의 아미노산 서열 번역이다.
서열번호 13은 TIC7473_His 살충제 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 서열이며, 여기서, 히스티딘 태그를 인코딩하는 핵산 서열은 3' 및 프레임에서 TIC7472 코딩 서열에 작동 가능하게 결합된다.
서열번호 14는 TIC7473_His 살충제 단백질의 아미노산 서열 번역이다.
서열번호 15는 식물 세포에서 발현을 위해 설계된 TIC7472PL 살충제 단백질을 인코딩하는 합성 코딩 서열이며, 여기서, 추가적인 알라닌 코돈은 메티오닌 코돈을 개시한 직후에 삽입된다.
서열번호 16은 식물 세포에서 발현하기 위해 설계된 합성 코딩 서열(서열번호 15)에 의해 인코딩된 TIC7472PL의 아미노산 서열이며, 여기서, 추가적인 알라닌 아미노산은 메티오닌을 개시한 직후에 삽입된다.
서열번호 17은 식물 세포에서 발현을 위해 설계된 TIC7473PL 살충제 단백질을 인코딩하는 합성 코딩 서열이며, 여기서, 추가적인 알라닌 코돈은 메티오닌 코돈을 개시한 직후에 삽입된다.
서열번호 18은 식물 세포에서 발현하기 위해 설계된 합성 코딩 서열(서열번호 17)에 의해 인코딩된 TIC7473PL의 아미노산 서열이며, 여기서, 추가적인 알라닌 아미노산은 메티오닌을 개시한 직후에 삽입된다.
상세한 설명
농업 해충 관리 분야의 문제는 표적 해충에 대해 효과적이고 표적 해충 종에 대해 넓은 스펙트럼의 독성을 나타내고, 요망되지 않는 농경 문제를 야기시키지 않으면서 식물에서 발현될 수 있고, 식물에서 상업적으로 사용되는 현재의 독소와 비교하여 대안적인 모드의 작용을 제공하는 새로운 독소 단백질에 대한 필요성으로서 특징될 수 있다.
TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 및 TIC7473PL에 의해 예시된 신규한 살충제 단백질은 본 명세서에 개시되고, 특히, 넓은 스펙트럼의 나비목 곤충 해충에 대해, 및 보다 특히, 검정 거염벌레(스포도프테라 엑셈프타), 검거세미나방(아그로티스 입실론), 옥수수 이삭벌레(헬리코베르파 제아), 목화 잎 벌레(알라바마 아르길라세아), 배추좀나방(플루텔라 크실로스텔라), 유럽 조명충나방(오스트리니아 누빌랄리스), 가을 거염벌레(스포도프테라 프루기페르다), Cry1Fa1 내성 가을 거염벌레(스포도프테라 프루기페르다), 구대륙 다래벌레(OWB, 헬리코베르파 아르미게라), 남부 거염벌레(스포도프테라 에리다니아), 대두 루퍼(크리소데익시스 인클루덴스), 반점 다래벌레(에아리아스 비텔라), 서남부 조명충나방(디아트라에아 그란디오셀라), 회색담배나방(헬리오티스 비레스켄스), 담배거세미나방(스포도프테라 리투라, 클러스터 애벌레로도 알려짐), 서부 콩 야도충(스트리아코스타 알비코스타), 및 벨벳 콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스)에 대한, 이러한 필요성 각각을 다룬다.
본 출원에서 TIC6757과 관련하여, "TIC6757 단백질", "TIC6757 단백질 독소", "TIC6757 독소 단백질", "TIC6757 살충제 단백질", "TIC6757-관련 독소", "TIC6757-관련 독소 단백질", TIC6757PL, "TIC6757PL 단백질", "TIC6757PL 단백질 독소", "TIC6757PL 독소 단백질", "TIC6757PL 살충제 단백질", "TIC6757PL-관련 독소", "TIC6757PL-관련 독소 단백질", TIC7472, "TIC7472 단백질", "TIC7472 단백질 독소", "TIC7472 독소 단백질", "TIC7472 살충제 단백질", "TIC7472-관련 독소", "TIC7472-관련 독소 단백질", TIC7472PL, "TIC7472PL 단백질", "TIC7472PL 단백질 독소", "TIC7472PL 독소 단백질", "TIC7472PL 살충제 단백질", "TIC7472PL-관련 독소", "TIC7472PL-관련 독소 단백질", TIC7473, "TIC7473 단백질", "TIC7473 단백질 독소", "TIC7473 독소 단백질", "TIC7473 살충제 단백질", "TIC7473-관련 독소", "TIC7473-관련 독소 단백질", TIC7473PL, "TIC7473PL 단백질", "TIC7473PL 단백질 독소", "TIC7473PL 독소 단백질", "TIC7473PL 살충제 단백질", "TIC7473PL-관련 독소", "TIC7473PL-관련 독소 단백질" 등은 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL을 갖는 이러한 단백질의 정렬이 약 85% 내지 약 100%의 임의의 분획 백분율의 아미노산 서열 동일성을 야기시키는 경우에, 살충제 또는 곤충 저해 활성을 나타내는 임의의 단백질을 포함하는, 나비목 해충에 대한 활성을 부여하는, TIC6757(서열번호 2), TIC6757PL(서열번호 4), TIC7472(서열번호 8), TIC7472PL(서열번호 16), TIC7473(서열번호 12), 또는 TIC7473PL(서열번호 18)의 임의의 살충제 단백질 또는 곤충 저해 단백질 서열, 및 이의 살충제 또는 곤충 저해 세그먼트, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이와 실질적으로 상동성이거나, 이와 유사하거나, 이로부터 유도된, 임의의 신규한 살충제 단백질 또는 곤충 저해 단백질을 지칭한다. TIC6757 및 TIC6757PL 단백질은 색소체(plastid)-표적화된 형태 및 비-색소체 표적화된 형태의 단백질을 둘 다 포함한다.
용어 "세그먼트" 또는 "단편"은 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질을 기술하는 완전한 아미노산 또는 핵산 서열 보다 더 짧은 연속 아미노산 또는 핵산 서열을 기술하기 위해 본 출원에서 사용된다. 서열번호 2에 기술된 TIC6757 단백질, 서열번호 4에 기술된 TIC6757PL 단백질, 서열번호 8에 기술된 TIC7472 단백질, 서열번호 16에 기술된 TIC7472PL 단백질, 서열번호 12에 기술된 TIC7473 단백질, 또는 서열번호 18에 기술된 TIC7473PL 단백질의 상응하는 섹션과 이러한 세그먼트 또는 단편의 정렬이 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질의 상응하는 섹션과 그러한 세그먼트 또는 단편 간에 약 85 내지 약 100%의 임의의 분획 백분율의 아미노산 서열 동일성을 야기시키는 경우에, 곤충 저해 활성을 나타내는 세그먼트 또는 단편은 또한, 본 출원에 개시된다.
본 출원에서, 용어 "활성적" 또는 "활성"과 관련하여, "살충제 활성" 또는 "살충제" 또는 "살충 활성", "곤충 저해" 또는 "살충"은 해충의 저해(성장, 공급, 번식력, 또는 생존력을 저해함), 저해(성장, 공급, 번식력, 또는 생존력을 저해함), 조절(해충 침입을 조절함, 유효량의 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질을 함유한 특정 작물에 대한 해충 공급 활성을 조절함) 또는 사멸(이환률, 치사율 또는 감소된 생식력을 야기시킴)에 있어서, 단백질 독소와 같은 독성제의 효능을 지칭한다. 이러한 용어는 독성 단백질에 대한 해충의 노출이 이환율, 치사율, 감소된 생식력, 또는 저성장성을 야기시키는, 살충적 유효량의 해충에 대한 독성 단백질을 제공의 결과를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 또한, 식물 중에 또는 식물 상에 살충적 유효량의 독성 단백질을 제공한 결과로서, 식물, 식물의 조직, 식물 부분, 종자, 식물 세포로부터, 또는 식물이 성장할 수 있는 특정 지리적 위치로부터 해충의 반발을 포함한다. 일반적으로, 살충제 활성은 나비목의 곤충을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 특정 표적 해충의 이러한 단백질, 단백질 단편, 단백질 세그먼트 또는 폴리뉴클레오타이드에 대한 곤충 공급에 의해 야기된, 성장, 발달, 생존력, 공급 거동, 교미 거동, 생식력 또는 부작용의 임의의 측정 가능한 감소에서 효과적인 독성 단백질의 능력을 지칭한다. 독성 단백질은 식물에 의해 생성될 수 있거나, 식물에 또는 식물이 위치되어 있는 위치 내의 환경에 적용될 수 있다. 용어 "생체활성", "유효한", "효과적인" 또는 이의 변형예는 또한, 표적 곤충 해충에 대한 본 발명의 단백질의 효과를 기술하기 위해 본 출원에서 교호적으로 사용되는 용어이다.
표적 해충의 사료에 제공될 때, 독성제의 살충적 유효량은 독성제가 해충에 접촉할 때 살충제 활성을 나타낸다. 독성제는 살충제 단백질 또는 당해 분야에 공지된 하나 이상의 화학적 작용제일 수 있다. 살충제 또는 살충 화학적 작용제 및 살충제 또는 살충 단백질 작용제는 단독으로 또는 서로 조합하여 사용될 수 있다. 화학적 작용제는 표적 해충에서 저해하기 위한 특정 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자, 유기클로라이드, 유기포스페이트, 카르바메이트, 피레드로이드, 네오니코티노이드, 및 리아노이드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 살충제 또는 살충 단백질 작용제는 본 출원에 기술된 단백질 독소, 뿐만 아니라, 나비목을 표적화하는 것을 포함하는 다른 단백성 독성제, 뿐만 아니라, 딸정벌레목, 반시목 및 동시류(Homopteran) 종을 조절하는데 사용하기 위한 당해 분야에서 이용 가능한 Cry 및 Cyt 단백질과 같은 다른 식물 해충을 조절하기 위해 사용되는 단백질 독소를 포함한다.
해충, 특히 작물의 해충에 대한 언급이 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질 독소 부류에 의해 조절되는, 작물의 곤충 해충, 특히 그러한 나비목 곤충 해충을 의미하는 것으로 의도된다. 그러나, 해충에 대한 언급은 또한, 식물의 딱정벌레목, 반시목 및 동시류 곤충 해충, 뿐만 아니라, 이러한 해충을 표적화하는 독성제가 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질, 또는 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL과 85 내지 약 100% 동일한 단백질과 함께 동시-국소화되거나 존재할 때 선충 및 진균을 포함할 수 있다.
TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 및 TIC7473PL 단백질은 공통 기능으로 관련되어 있고, 성충, 번데기, 유충, 및 신생아(neonate)를 포함하는, 나비목 곤충 종으로부터 곤충 해충에 대한 살충 활성을 나타낸다.
나비목의 곤충은 거염벌레, 거세미나방, 루퍼, 및 밤나방과(Family Noctuidae)에서의 헬리오틴(heliothine), 예를 들어, 가을 거염벌레(스포도프테라 프루기페르다), 사탕무 거염벌레(스포도프테라 엑시구아), 검정 거염벌레(스포도프테라 엑셈프타), 남부 거염벌레(스포도프테라 에리다니아), 베르싸 거염벌레(마메스타 콘피구라타(Mamestra configurata)), 검거세미나방(아그로티스 입실론), 양배추 루퍼(트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)), 대두 루퍼(슈도플루시아 인클루덴스(Pseudoplusia includens)), 벨벳 콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스), 녹색 클로버 벌레(히페나 스카브라(Hypena scabra)), 회색담배나방(헬리오티스 비레스켄스), 과립구 거세미나방(granulate cutworm)(아그로티스 서브테라네아(Agrotis subterranea)), 거염벌레(슈달레티아 유니푼크타(Pseudaletia unipuncta)), 서부 거세미나방(western cutworm)(아그로티스 오르소고니아(Agrotis orthogonia)); 명나방과(Family Pyralidae)로부터의 천곤충, 보호고치를 만드는 유충(casebearer), 나방유충, 뿔나방(coneworm), 양배추벌레, 및 스켈레토나이저(skeletonizer), 예를 들어, 유럽 조명충나방(오스트리니아 누빌랄리스(Ostrinia nubilalis)), 나벨 오렌지벌레(navel orangeworm)(아미엘로이스 트란시텔라(Amyelois transitella)), 옥수수 뿌리 나방유충(크람버스 칼리지노셀루스(Crambus caliginosellus)), 잔디 나방유충(헤르페토그라마 리카르시살리스(Herpetogramma licarsisalis)), 해바라기 나방(호모에오소마 엘렉텔룸(Homoeosoma electellum)), 명충나방의 유충(엘라스모팔푸스 리그노셀루스(Elasmopalpus lignosellus)); 잎말이나방과(Family Tortricidae)에서의 잎말이나방, 나방유충(budworm), 종자 벌레, 및 과일 벌레, 예를 들어, 코들링 나방(codling moth)(시디아 포모넬라(Cydia pomonella)), 포도 베리 나방(엔도피자 비테아나(Endopiza viteana)), 오리엔탈 과일 나방(그라폴리타 몰레스타(Grapholita molesta)), 해바라기 순 나방(술레이마 헬리안타나(Suleima helianthana)); 및 다수의 다른 경제적으로 중요한 나비목, 예를 들어, 배추좀나방(플루텔라 크실로스텔라), 분홍 다래벌레(펙티노포라 고시피엘라(Pectinophora gossypiella)), 및 매미 나방(gypsy moth)(리만트리아 디스파르(Lymantria dispar))를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 나비목의 다른 곤충 해충은 예를 들어, 목화 잎 벌레(알라바마 아르길라세아), 과일 나무 잎말이나방(아르칩스 아르기로스필라(Archips argyrospila)), 유럽 잎말이나방(아르칩스 로사나(Archips rosana)) 및 다른 아르칩 종, (칠로 수프레살리스(Chilo suppressalis), 아시아 벼 천공충, 또는 벼 줄기 천공충), 벼 잎말이나방(크나팔로크로시스 메디날리스(Cnaphalocrocis medinalis)), 옥수수 뿌리 나방유충(크람버스 칼리지노셀루스(Crambus caliginosellus)), 블루그래스 나방유충(bluegrass webworm)(크람부스 테테렐루스(Crambus teterrellus)), 서남부 조명충나방(디아트라에아 그란디오셀라), 사탕수수 천공충(surgarcane borer)(디아트라에아 사카랄리스(Diatraea saccharalis)), 스피니 다래벌레(에아리아스 인술라나(Earias insulana)), 반점 다래벌레(에아리아스 비텔라), 미국 다래벌레(헬리코베르파 아르미게라), 옥수수 이삭벌레(헬리코베르파 제아, 대두 포드웜 및 목화 다래벌레로도 알려짐), 회색담배나방(헬리오티스 비레스켄스), 잔디 나방유출(sod webworm)(헤르페토그람마 리카르시살리스(Herpetogramma licarsisalis)), 서부 콩 야도충(스트리아코스타 알비코스타), 유럽 포도나무 나방(로베시아 보트라나), 귤 잎 나방벌레(필로크니스티스 시트렐라(Phyllocnistis citrella)), 대형 화이트 나비(large white butterfly)(피에리스 브래시카에), 소형 화이트 나비(small white butterfly)(피에리스 라파에(Pieris rapae), 수입 양배추 벌레로서 알려짐)), 사탕무 거염벌레(스포도프테라 엑시구아), 담배거세미나방(스포도프테라 리투라, 클러스터 애벌레로도 알려짐), 및 토마토 입나방벌레(투타 압솔루타(Tuta absoluta))를 포함한다.
본 출원에서 "단리된 DNA 분자" 또는 균등한 용어 또는 구에 대한 언급은 DNA 분자가 단독으로 또는 다른 조성물과 조합하여 존재하지만 이의 자연 환경 내에서 존재하지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 자연에서 유기체의 게놈의 DNA 내에서 발견되는, 핵산 구성요소, 예를 들어, 코딩 서열, 인트론 서열, 비번역된 리더 서열, 프로모터 서열, 전사 종결 서열 등은 그러한 구성요소가 유기체의 게놈 내에 그리고 자연에서 발견되는 게놈 내의 위치에 존재하는 한, "단리된" 것으로 여겨지지 않는다. 그러나, 이러한 구성요소 각각, 및 이러한 구성요소의 하위부분은 그러한 구성요소가 유기체의 게놈 내에 그리고 자연에서 발견되는 게놈 내의 위치에 존재하지 않는 한, 본 개시내용의 범위 내에서 "단리"될 것이다. 유사하게, 살충 단백질 또는 그러한 단백질의 임의의 천연 발생 살충 변형체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 뉴클레오타이드 서열이 단백질을 인코딩하는 서열이 자연에서 발견되는 박테리움의 DNA 내에 존재하지 않는 한, 단리된 뉴클레오타이드 서열일 것이다. 천연 발생 살충 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 합성 뉴클레오타이드 서열은 본 개시내용의 목적을 위해 단리되는 것으로 여겨질 것이다. 본 개시내용의 목적을 위하여, 임의의 형질전환 뉴클레오타이드 서열, 즉, 식물 또는 박테리움의 세포의 게놈에 삽입되거나 염색체외 벡터에 존재하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열은 세포를 형질전환을 위해 사용되는 플라스미드 또는 유사한 구조 내에, 식물 또는 박테리움의 게놈 내에 존재하거나, 식물 또는 박테리움으로부터 유도된 조직, 자손, 생물학적 샘플 또는 상품에 검출 가능한 양으로 존재하는 지의 여부에 따라, 단리된 뉴클레오타이드 서열인 것으로 여겨질 것이다.
본 출원에서 추가로 기술되는 바와 같이, TIC6757(서열번호 19)을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)은 파에니바실러스 포필리아에 균주 DSC004343로부터 얻어진 DNA에서 발견되었다. 코딩 서열은 생물학적 검정에서 사용되는 재조합 단백질을 생성시키기 위해 미생물 숙주 세포에 클로닝되고, 여기에서 발현되었다. TIC6757에 대한 유사성을 나타내는 단백질을 인코딩하는 유전자에 대한 미생물 서열을 스크리닝하기 위해 대용량 스크리닝 및 생물정보학 기술이 사용되었다. TIC7472(서열번호 7)를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)은 파에니바실러스 포필리아에 균주 DSC007648로부터 얻어진 DNA에서 발견되었다. TIC7473(서열번호 11)을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)은 파에니바실러스 포필리아에 균주 DSC008493으로부터 얻어진 DNA에서 발견되었다. TIC6757의 미생물 숙주 세포-유도된 단백질을 사용한 생물학적 검정은 나비목 종, 사탕무 거염벌레(스포도프테라 엑시구아), 검거세미나방(아그로티스 입실론), 옥수수 이삭벌레(헬리코베르파 제아), 목화 잎 벌레(알라바마 아르길라세아), 배추좀나방(플루텔라 크실로스텔라), 유럽 조명충나방(오스트리니아 누빌랄리스), 가을 거염벌레(스포도프테라 프루기페르다), Cry1Fa1 내성 가을 거염벌레(스포도프테라 프루기페르다), 구대륙 다래벌레(OWB, 헬리코베르파 아르미게라), 남부 거염벌레(스포도프테라 에리다니아), 대두 루퍼(크리소데익시스 인클루덴스), 반점 다래벌레(에아리아스 비텔라), 서남부 조명충나방(디아트라에아 그란디오셀라), 회색담배나방(헬리오티스 비레스켄스), 담배거세미나방(스포도프테라 리투라, 클러스터 애벌레로도 알려짐), 및 벨벳 콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스)에 대한 활성을 나타내었다. TIC7472 및 TIC7473의 미생물 숙주 세포-유도된 단백질을 사용한 생물학적 검정은 나비목 종, 옥수수 이삭벌레(헬리코베르파 제아), 가을 거염벌레(스포도프테라 프루기페르다), 남부 거염벌레(스포도프테라 에리다니아), 대두 루퍼(크리소데익시스 인클루덴스), 및 서남부 조명충나방(디아트라에아 그란디오셀라)에 대한 활성을 나타내었다.
식물 세포에서 발현을 위하여, TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 및 TIC7473PL 단백질은 사이토졸에 잔류하도록 발현되거나 식물 세포의 다양한 세포 기관(organelles)에 표적화될 수 있다. 예를 들어, 엽록체에 대한 단백질의 표적화는 오프-표현형이 발생하는 것을 방지하면서, 형질전환 식물에서 발현된 단백질의 수준 증가를 야기시킬 수 있다. 표적화는 또한, 형질전환 이벤트에서 해충 내성 효능의 증가를 야기시킬 수 있다. 표적 펩타이드 또는 수송 펩타이드는 핵, 미토콘드리아, 소포체(ER), 엽록체, 아포플라스트, 퍼옥시좀, 및 원형질 막을 포함하는, 세포에서 특정 영역으로 단백질의 수송을 유도하는 짧은(3개 내지 70개의 아미노산 길이) 펩타이드 사슬이다. 일부 표적 펩타이드는 단백질이 운반된 후에 신호 펩티다아제에 의해 단백질로부터 절단된다. 엽록체에 대한 표적화를 위하여, 단백질은 대략 40개 내지 50개의 아미노산인 수송 펩타이드를 함유한다. 엽록체 수송 펩타이드의 사용의 설명을 위해, 미국 특허 제5,188,642호 및 제5,728,925호가 참조된다. 다수의 엽록체-국소화된 단백질은 전구체로서 핵 유전자로부터 발현되고, 엽록체 수송 펩타이드(CTP)에 의해 엽록체에 표적화된다. 이러한 단리된 엽록체 단백질의 예는 작은 하위단위(SSU)의 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라아제, 페레독신, 페레독신 옥시도리턱타아제, 경-수확 착물 단백질 I 및 단백질 II, 티오레독신 F, 에놀피루빌 시키메이트 포스페이트 신타아제(EPSPS), 및 미국 특허 제7,193,133호에 기술된 수송 펩타이드와 관련된 것을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 비-엽록체 단백질이 이종 CTP와 단백질 융합의 사용에 의해 엽록체에 표적화될 수 있으며, CTP가 엽록체에 대해서 단백질을 표적화하는데 충분하다는 것이 생체내 및 시험관내에서 입증되었다. 적합한 엽록체 수송 펩타이드, 예를 들어, 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) EPSPS CTP (CTP2)[문헌[Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987] 참조] 또는 페투니아 히드리다(Petunia hybrida) EPSPS CTP (CTP4)[문헌[della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877, 1986] 참조]의 도입은 형질전환 식물에서 엽록체에 대한 이종 EPSPS 단백질 서열을 표적화하는 것으로 나타났다[미국 특허 제5,627,061호; 제5,633,435호; 및 제5,312,910호; 및 EP 0218571호; EP 189707호; EP 508909호; 및 EP 924299호 참조]. 엽록체에 대한 TIC6757 또는 TIC6757PL 독소 단백질을 표적화하기 위해, 엽록체 수송 펩타이드를 인코딩하는 서열은 식물 세포에서 최적의 발현을 위해 설계된 TIC6757 또는 TIC6757PL 독소 단백질을 인코딩하는 합성 코딩 서열에 작동 가능한 연결로 5' 및 프레임에 배치된다.
TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473과 관련된 추가적인 독소 단백질 서열이 신규한 성질을 갖는 신규한 단백질을 생성시키기 위해 TIC6757, TIC7472, 또는 TIC7473의 아미노산 서열을 사용함으로써 생성될 수 있는 것으로 고려된다. TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473 독소 단백질은 새로운 아미노산 서열 변형체로의 아미노산 서열 수준의 차이를 겨랍하고 변형체를 인코딩하는 재조합 핵산 서열에 대한 적절한 변화를 만들기 위해 정렬될 수 있다.
본 개시내용은 TIC6757 단백질 독소 부류의 개선된 변형체가 당해 분야에 공지된 다양한 유전자 편집 방법을 이용함으로써 플란타에서 조작될 수 있다는 것을 추가로 고려한다. 게놈 편집을 위해 사용되는 이러한 기술은 ZFN(아연-핑거 뉴클레아제), 메가뉴클레아제, TALEN(전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제), 및 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR-관련) 시스템을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 게놈 편집 방법은 식물 세포 내에서 형질전환된 독소 단백질 코딩 서열을 상이한 독소 코딩 서열로 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 상세하게, 이러한 방법을 통해, 독소 코딩 서열 내의 하나 이상의 코돈은 새로운 단백질 아미노산 서열을 조작하기 위해 변경된다. 대안적으로, 새로운 독소 코딩 서열을 조작하기 위하여, 코딩 서열 내의 단편은 대체되거나 결실되거나, 추가적인 DNA 단편은 코딩 서열에 삽입된다. 새로운 코딩 서열은 증가된 활성 또는 곤충 해충에 대한 스펙트럼과 같은 새로운 성질을 갖는 독소 단백질을 인코딩할 수 있을 뿐만 아니라, 곤충 해충 종에 대한 활성을 제공할 수 있으며, 여기서, 본래 곤충 독소 단백질에 대한 내성이 발달하였다. 유전자 편집된 독소 코딩 서열을 포함하는 식물 세포는 새로운 독소 단백질을 발현시키는 전체 식물을 발생시키기 위해 당해 분야에 공지된 방법에 의해 사용될 수 있다.
또한, TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473의 단편, 또는 이의 단백질 변형체가 하나 이상의 아미노산이 N-말단 단부, C-말단 단부, 단백질의 중간, 또는 이들의 조합으로부터 결실되는 절단된 형태일 수 있다는 것이 고려되며, 여기서, 단편 및 변형체는 곤충 저해 활성을 보유한다. 이러한 단편은 TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473 또는 유도된 단백질 변형체의 천연 발생 또는 합성 변형체일 수 있지만, 적어도 TIC6757, TIC7472, 또는 TIC7473의 곤충 저해 활성을 보유하여야 한다.
TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 및 TIC7473PL 단백질과 닮은 단백질은 당해 분야에 공지된 다양한 컴퓨터 기반 알고리즘을 이용하여 식별되고 서로 비교될 수 있다(표 1 및 표 2 참조). 본 출원에서 보고된 아미노산 서열 동정은 이러한 디폴트 파라미터를 이용한 Clustal W 정렬의 결과이다: 중량 매트릭스; 블로섬(blosum), 갭 오픈닝 페널티(Gap opening penalty): 10.0, 갭 연장 페널티: 0.05, 친수성 갭: 온(On), 친수성 잔기: GPSNDQERK, 잔기-특이적 갭 페널티(Residue-specific gap penalties: 온(On)[Thompson, et al (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680]. 퍼센트 아미노산 동일성은 100%가 곱해진 (대상 단백질의 아미노산 정체성/길이)의 곱에 의해 추가로 계산된다. 다른 정렬 알고리즘은 또한, 당해 분야에서 입수 가능하고, Clustal W 정렬을 이용하여 얻어진 것과 유사한 결과를 제공하고, 본 명세서에서 고려된다.
나비목 곤충 종에 대한 곤충 저해 활성을 나타내는 단백질은, 단백질이 질의에서, 예를 들어, Clustal W 정렬에서 사용되는 경우에 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL에 관련이 있으며, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 16, 서열번호 12, 또는 서열번호 18에 기술된 바와 같은 본 발명의 단백질은 이러한 정렬에서 히트(hit)로서 식별되는 것으로 의도되며, 여기서, 질의 단백질은 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이러한 범위의 임의의 분획 백분율인 질의 단백질의 길이를 따라 적어도 85% 내지 약 100% 아미노산 동일성을 나타낸다.
예시적인 단백질 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 및 TIC7473PL은 Clustal W 알고리즘을 이용하여 서로 정렬되었다. 표 1에 보고된 바와 같이, 전체-길이 단백질 각각에 대한 퍼센트 아미노산 서열 동일성의 페어-방식 매트릭스(pair-wise matrix)가 생성되었다.
Figure 112018030229425-pct00001
퍼센트 동일성(percent identity) 이외에 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, TIC7473PL 및 관련된 단백질은 또한, 1차 구조(보존된 아미노산 모티프)에 의해, 길이(약 797개의 아미노산)에 의해, 및 다른 특징에 의해 관련될 수 있다. TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 및 TIC7473PL 단백질 독소의 특징은 표 2에 보고되어 있다.
Figure 112018030229425-pct00002
본 출원의 실시예에서 추가로 기술되어 있는 바와 같이, TIC6757의 변형체, TIC6757PL을 인코딩하는 합성 핵산 분자 서열은 식물에서 사용하기 위해 설계되었다. TIC6757PL 단백질을 인코딩하는 식물에서 사용하기 위해 설계된 예시적인 재조합 핵산 분자 서열은 서열번호 3으로서 제시된다. TIC6757PL 단백질은 TIC6757 단백질에 대해 메티오닌을 개시한 직후에 추가적인 알라닌 아미노산을 갖는다. TIC6757 아미노산 서열에 삽입된 추가적인 알라닌 잔기는 플란타(planta)에서 단백질의 발현을 개선시키는 것으로 여겨진다. 마찬가지로, TIC7472 및 TIC7473의 변형체를 인코딩하는 합성 핵산 분자 서열은 본 명세서에서 각각 TIC7472PL 및 TIC7473PL로서 지칭되고, 식물에서 사용하기 위해 설계되었다. TIC7472PL 및 TIC7473PL을 인코딩하는 식물에서 사용하기 위해 설계된 예시적인 합성 핵산 분자 서열은 각각 서열번호 15 및 서열번호 17로서 제시된다. TIC7472PL 및 TIC7473PL 단백질 둘 모두는 TIC7472 및 TIC7473 단백질에 대해 메티오닌을 개시한 직후에 추가적인 알라닌 아미노산을 갖는다.
재조합 핵산 분자 서열을 함유한 발현 카세트 및 벡터는 당해 분야에 공지된 형질전환 방법 및 기술에 따라 구성되고 옥수수, 대두 또는 목화 식물 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리움-매개 형질전환은 미국특허출원공개 제2009/0138985A1호(대두), 제2008/0280361A1호(대두), 제2009/0142837A1호(옥수수), 제2008/0282432호(목화), 제2008/0256667호(목화), 제2003/0110531호(밀), 제2001/0042257A1호(사탕무), 미국 특허 제5,750,871호(카놀라), 제7,026,528호(밀), 및 제6,365,807호(벼), 및 문헌[Arencibia et al. (1998) Transgenic Res. 7:213-222](사탕수수)에 기술되어 있으며, 이러한 문헌 모두는 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 형질전환 세포는 TIC6757PL, TIC7472 및 TIC7473 단백질을 발현시키는 형질전환 식물로 재생될 수 있고, 형질전환 식물로부터 얻어진 식물 엽편을 이용하여 나비목 해충 유충의 존재 하에 수행된 생물학적 검정을 통해 살충제 활성을 나타낸다. 식물은 재생, 종자, 화분, 또는 분열조직 형질전환 기술에 의해 식물 세포로부터 유도될 수 있다. 식물을 형질전환하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
전통적인 형질전환 방법에 대한 대안으로서, DNA 서열, 예를 들어, 이식 유전자, 발현 카세트(들) 등은 부위-유도 통합을 통해 식물 또는 식물 세포의 게놈 내에서 특정 부위 또는 유전자 자리에 삽입되거나 통합될 수 있다. 본 개시내용의 재조합 DNA 작제물(들) 및 분자(들)는 이에 따라, 적어도 하나의 이식 유전자, 발현 카세트, 또는 식물 또는 식물 세포의 게놈에 삽입하기 위한 다른 DNA 서열을 포함하는 도너 주형 서열(donor template sequence)을 포함할 수 있다. 부위-유도 통합을 위한 이러한 도너 주형은 삽입 서열에 인접한 하나 또는 두 개의 상동성 암(즉, 식물 게놈에 삽입되게 하기 위한 서열, 이식 유전자, 카세트 등)을 추가로 포함한다. 본 개시내용의 재조합 DNA 작제물(들)은 부위-유도 통합을 수행하기 위한 부위-특이적 뉴클레아제 및/또는 임의의 관련된 단백질(들)을 인코딩하는 발현 카세트(들)를 추가로 포함할 수 있다. 카세트(들)를 발현시키는 이러한 뉴클레아제는 도너 주형(시스 형태)과 동일한 분자 또는 벡터에, 또는 별도의 분자 또는 벡터(트랜스 형태) 상에 존재할 수 있다. 부위-유도 통합을 위한 여러 방법은 요망되는 게놈 부위 또는 유전자 자리에서 이중 가닥 브레이크(DSB; double strand break) 또는 닉(nick)을 생성시키기 위해 게놈 DNA를 절단하는 상이한 단백질(또는 단백질 및/또는 가이드 RNA의 착물)과 관련하여 당해 분야에 공지되어 있다. 간략하게 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 뉴클레아제 효소에 의해 도입된 DSB 또는 닉을 복원하는 공정 동안에, 도너 주형 DNA는 DSB 또는 닉의 부위에서 게놈에 통합될 수 있다. 도너 주형에서 상동성 암(들)의 존재는 상동성 재조합을 통한 복원 공정 동안에 식물에 삽입 서열의 채택 및 표적화를 촉진할 수 있으며, 삽입 사건은 비-상동성 말단 결합(non-homologous end joining: NHEJ)을 통해 일어날 수 있다. 사용될 수 있는 부위-특이적 뉴클레아제의 예는 아연-핑거 뉴클레아제, 조작되거나 천연 메가뉴클레아제, TALE-엔도뉴클레아제, 및 RNA-가이딩된 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)를 포함한다. RNA-가이딩된 부위-특이적 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)를 사용하는 방법을 위하여, 재조합 DNA 작제물(들)은 또한, 식물 게놈 내에서 요망되는 부위로 뉴클레아제를 유도하기 위해 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 서열을 포함할 것이다.
TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 및 TIC7473PL을 인코딩하는 재조합 핵산 분자 조성물이 고려된다. 예를 들어, TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 및 TIC7473PL 단백질은 재조합 DNA 작제물과 함께 발현될 수 있는데, 여기서, 단백질을 인코딩하는 ORF를 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자는 작제물이 의도되는 시스템에서 발현에 필요한 프로모터 및 임의의 다른 조절 요소와 같은 유전자 발현 요소에 작동 가능하게 연결된다. 비제한적인 예는 식물에서 단백질의 발현을 위한 TIC6757PL, TIC7472PL, 또는 TIC7473PL 단백질 인코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 식물-작용성 프로모터, 또는 Bt 박테리윰 또는 다른 바실러스 종에서 단백질의 발현을 위한 TIC6757, TIC7472, 또는 TIC7473 단백질 인코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 Bt-작용성 프로모터를 포함한다. 다른 요소는 인헨서, 인트론, 비번역된 리더, 인코딩된 단백질 고정화 태그(HIS-태그), 전위 펩타이드(즉, 색소체 수송 펩타이드, 신호 펩타이드), 번역후 개질 효소를 위한 폴리펩타이드 서열, 리보솜 결합 사이트, 및 RNAi 표적 부위를 포함하지만 이로 제한되지 않는 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질 인코딩 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이와 함께 제공되는 예시적인 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자는 개개 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열번호 3, 서열번호 1, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 15, 및 서열번호 17과 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 4, 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 16, 및 서열번호 18에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 단백질에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이종 프로모터는 또한, 색소체 표적화된 TIC6757PL, TIC7472PL, 또는 TIC7473PL; 또는 비표적화된 TIC6757PL, TIC7472PL, 또는 TIC7473PL을 인코딩하는 합성 DNA 코딩 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에 개시된 단백질을 위해 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 코돈은 동의어 코돈(당해 분야에서 사일런트 치환(silent substitution)으로서 알려짐)에 의해 대체될 수 있다.
TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질 인코딩 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물은 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질, TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질과는 다른 단백질, 곤충 저해 dsRNA 분자, 또는 부수적인 단백질을 인코딩하는 DNA 서열과 동시에 발현하거나 공동-발현하도록 구성될 수 있는 하나 이상의 곤충 저해제를 위해 인코딩하는 DNA의 영역을 추가로 포함할 수 있다. 부수적인 단백질은 예를 들어, 이의 발현을 돕고, 식물에서 이의 안정성에 영향을 미치고, 올리고머화를 위해 자유 에너지를 최적화하고, 이의 독성을 증가시키고, 이의 활성 스펙트럼을 증가시킴으로써, 곤충 저해제의 효능을 돕는데 기능하는 보조-인자, 효소, 결합-파트너, 또는 다른 제제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 부수적인 단백질은 예를 들어, 하나 이상의 곤충 저해제의 섭취를 촉진할 수 있거나, 독성제의 독성 효과를 강화시킬 수 있다.
재조합 DNA 작제물은 모든 단백질 또는 dsRNA 분자가 하나의 프로모터로부터 발현되거나 각 단백질 또는 dsRNA 분자가 별도의 프로모터 조절 또는 이들의 일부 조합 하에 있도록 어셈블링될 수 있다. 본 발명의 단백질은 다중-유전자 발현 시스템으로부터 발현될 수 있는데, 여기서, TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 중 하나 이상의 단백질은 또한, 선택되는 발현 시스템의 타입에 따라, 다른 오픈 리딩 프레임 및 프로모터를 함유하는 공통의 뉴클레오타이드 세그먼트로부터 발현된다. 예를 들어, 박테리아 다중-유전자 발현 시스템은 단일 오페론 내에서 다중-연결/탠뎀 오픈 리딩 프레임의 발현(즉, 폴리시스트론 발현(polycistronic expression))을 유도하기 위해 단일 프로모터를 사용할 수 있다. 다른 예에서, 식물 다중-유전자 발현 시스템은 다중-비연결 또는 연결된 발현 카세트를 사용할 수 있으며, 각 카세트는 하나 이상의 dsRNA 분자와 같은 상이한 단백질 또는 다른 제제를 발현시킨다.
TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질 인코딩 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 DNA 작제물은 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 바쿨로바이러스, 합성 염색체, 비리온, 코스미드, 파지미드, 파지, 또는 바이러스 벡터에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 이러한 벡터는 숙주 세포에서 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질 인코딩 서열의 적합한 또는 일과성 발현, 또는 인코딩된 폴리펩타이드의 후속 발현을 달성하기 위해 사용될 수 있다. TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질 인코딩 서열을 포함하고 숙주 세포에 도입되는 외인성 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 DNA 작제물은 본 출원에서 "이식 유전자"로서 지칭된다.
TIC6757 또는 관련된 패밀리 독소 단백질 인코딩 서열 중 임의의 하나 이상을 발현시키는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유한 형질전환 박테리아, 형질전환 식물 세포, 형질전환 식물, 및 형질전환 식물 부분은 본 명세서에서 제공된다. 용어 "박테리아 세포" 또는 "박테리윰"은 아그로박테리움, 바실러스, 에케리치아, 살모넬라, 슈도모나스, 브레비바실러스, 클레브시엘라, 에르비니아, 또는 리조비움 세포를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 용어 "식물 세포" 또는 "식물"은 쌍자엽 또는 단자엽을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 용어 "식물 세포" 또는 "식물"은 또한, 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 브래시카, 당근, 카사바, 카스토르, 콜리플라워, 샐러리, 병아리콩, 중국 양배추, 귤, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 목화, 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 호프, 부추, 상추, 테다 소나무, 조, 멜론, 너트, 귀리, 올리브, 양파, 관상용, 팜, 목초, 완두콩, 땅콩, 후추, 피젼피, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디에타 소나무, 무, 평지씨, 벼, 근경, 호밀, 잇꽃, 관목, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕 옥수수, 스위트 검, 고구마, 스위치풀, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디풀, 수박, 및 밀 식물 세포 또는 식물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 형질전환 식물 세포로부터 재생된 형질전환 식물 및 형질전환 식물 부분이 제공된다. 특정 실시형태에서, 형질전환 식물은 식물로부터 부분을 절단하거나, 그라인딩하거나, 그밖에 분쇄함으로써 형질전환 종자로부터 얻어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 식물 부분은 종자, 다래, 잎, 꽃, 줄기, 뿌리, 또는 이의 임의의 부분, 또는 형질전환 식물 부분의 비-재생 가능한 부분일 수 있다. 본 문맥에서 사용되는, 형질전환 식물 부분의 "비-재생 가능한" 부분은 전체 식물을 형성하기 위해 유도되지 않을 수 있거나 유성 및/또는 무성 생식이 가능한 전체 식물을 형성하기 위해 유도되지 못할 수 있는 부분이다. 특정 실시형태에서, 식물 부분의 비-재생 가능한 부분은 형질전환, 종자, 다래, 잎, 꽃, 줄기, 또는 줄기의 부분이다.
곤충, 나비목-저해 양의 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질을 포함하는 형질전환 식물을 제조하는 방법이 제공된다. 이러한 식물은 식물 세포에 본 출원에서 제공되는 임의의 단백질을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 도입하고, 곤충, 나비목-저해 양의 단백질을 발현시키는 상기 식물 세포로부터 유도된 식물을 선택함으로써 제조될 수 있다. 식물은 재생, 종자, 화분, 또는 분열조직 형질전환 기술에 의해 식물 세포로부터 유도될 수 있다. 식물을 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
검출 가능한 양의 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질, 곤충 저해 세그먼트 또는 이의 단편, 또는 이의 임의의 구별되는 부분을 포함하는 가공된 식물 생성물이 또한 본 명세서에 개시된다. 특정 실시형태에서, 가공된 생성물은 식물 부분, 식물 바이오매스, 오일, 밀, 당(sugar), 동물 사료, 가루, 플레이크, 겨, 린트, 겉겨, 가공된 종자, 및 종자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 가공된 생성물은 비-재생 가능한 것이다. 식물 생성물은 형질전환 식물 또는 형질전환 식물 부분으로부터 유도된 상품 또는 다른 상품을 포함할 수 있으며, 여기서, 상품 또는 다른 생성물은 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질의 구별되는 부분을 인코딩하거나 포함하는, 뉴클레오타이드 세그먼트 또는 발현된 RNA 또는 단백질을 검출함으로써 상거래를 통해 추적될 수 있다.
TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질을 발현시키는 식물은 다른 독소 단백질을 발현시키고/거나 다른 형질전환 형질, 예를 들어, 제초제 내성 유전자, 수확량 또는 스트레스 내성 형질 등을 부여하는 유전자를 발현시키는 형질전환 이벤트와 함께 번식함으로써 전환될 수 있거나, 이러한 형질은, 형질이 모두 연결되도록 단일 벡터에서 결합될 수 있다.
실시예에 추가로 기술되는 바와 같이, TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질-인코딩 서열 및 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL과 실질적으로 백분율 동일성을 갖는 서열은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 열적 증폭 및 하이브리드화와 같은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 단백질 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL은 관련된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성시키기 위해 사용될 수 있고, 밀접하게 관련된 다른 단백질 일원을 스크리닝하고 발견하기 위해 사용될 수 있다.
또한, TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 및 TIC7473PL 독소 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 열-사이클 또는 등온 증폭 및 하이브리드화 방법을 이용하여 그러한 부류의 다른 일원을 확인하기 위해 스크리닝하기 위한 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 3, 서열번호 15, 또는 서열번호 17에 기술된 바와 같은 서열로부터 유도된 올리고뉴클레오타이드는 상품으로부터 유도된 데옥시리보핵산 샘플에서 TIC6757PL, TIC7472PL, 또는 TIC7473PL 이식 유전자의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 특정의 핵산 검출 방법의 민감도를 고려하면, 서열번호 3, 서열번호 15, 및 서열번호 17에 기술된 바와 같은 서열로부터 유도된 올리고뉴클레오타이드가 풀링된 공급원으로부터 유도된 상품에서 TIC6757PL, TIC7472PL, 및 TIC7473PL 이식 유전자를 검출하기 위해 사용될 수 있을 것으로 예상되며, 여기서, 상품의 단지 일부분 만이 임의의 이식 유전자를 함유한 형질전환 식물로부터 유도된다. 이러한 뉴클레오타이드가 서열번호 3, 서열번호 15, 및 서열번호 17 각각에서 뉴클레오타이드 서열 변형을 도입하기 위해 사용될 수 있는 것으로 추가로 인식된다. 이러한 "돌연변이 유발" 올리고뉴클레오타이드는 형질전환 식물 숙주 세포에서 소정 범위의 곤충 저해 활성 또는 다양한 발현을 나타내는 TIC6757PL, TIC7472PL, 및 TIC7473PL 아미노산 서열 변형체의 확인을 위해 유용하다.
뉴클레오타이드 서열 동족체, 예를 들어, 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 본 출원에 개시된 각 또는 임의의 서열을 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 살충 단백질은 또한 본 발명의 일 실시형태이다. 본 발명은 또한, 제2 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열(또는 이의 역 상보적 서열)은 제2 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 살충제 단백질 또는 이의 살충제 단편을 인코딩한다. 이러한 경우에, 제2 뉴클레오타이드 서열은 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 서열번호 3, 서열번호 1, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 15, 또는 서열번호 17로서 제시된 임의의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 뉴클레오타이드 코딩 서열은 엄격한 하이브리드화 조건과 같은, 적절한 하이브리드화 조건 하에서 서로 하이브리드화하며, 이러한 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 다른 단백질 중 임의의 하나에 대해 생성된 항혈청과 교차 반응한다. 본 명세서에서 규정된 바와 같은, 엄격한 하이브리드화 조건은 적어도 42℃에서의 하이브리드화, 이후, 각각 실온에서 5분 동안 2X SSC, 0.1% SDS로의 2회 세척, 이후, 각각 65℃에서 30분 동안 0.5X SSC, 0.1% SDS로의 2회 세척을 포함한다. 보다 높은 온도에서의 세척은 더욱더 엄격한 조건, 예를 들어, 68℃의 하이브리드화 조건, 이후에, 68℃에서 0.1% SDS를 함유한 2xSSC에서의 세척을 구성한다.
당업자는, 유전자 코드의 중복으로 인하여, 다수의 다른 서열이 이러한 관련된 단백질을 인코딩할 수 있으며, 바실러스 균주 또는 식물 세포에서 살충제 단백질을 발현시키는 기능을 하는 정도로의 그러한 서열은 본 발명의 실시형태인 것으로 인식할 것이며, 이는 물론, 다수의 이러한 중복 코딩 서열이 이러한 조건 하에서 TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473을 인코딩하는 천연의 바실러스 또는 파에니바실러스 서열에 하이브리드화되지 않을 것으로 인식된다. 이러한 출원은 TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473 단백질-인코딩 서열, 및 TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473 단백질-인코딩 서열의 실질적인 백분율 동일성을 갖는 서열을 확인하게 위해, 당업자에게 공지된 이러한 및 다른 확인 방법의 사용을 고려한다.
본 개시내용은 또한, 살충제 단백질로부터 단백질의 키메라를 포함하는 상업적으로 유용한 단백질을 조작하고 클로닝하기 위해 당해 분야에 공지된 분자 방법의 사용을 고려하며, 예를 들어, 키메라는 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 및 관련된 단백질과는 다른 다양한 단백질의 세그먼트와 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질의 세그먼트의 어셈블리를 포함하는 추가적인 유용한 실시형태를 유도하기 위해 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질의 세그먼트로부터 어셈블링될 수 있다. TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질은 서로 그리고 다른 바실러스, 파에니바실러스 또는 다른 살충제 단백질(이러한 것이 계통발생학적으로 밀접하게 또는 멀리서 관련되어 있는 지의 여부)에 정렬될 수 있으며, 정렬된 단백질 사이의 치환을 위해 유용하여 키메라 단백질의 구성을 야기시키는 이러한 각 단백질의 세그먼트가 확인될 수 있다. 이러한 키메라 단백질은 해충 생물학적 검정 분석으로 처리될 수 있고, 키메라에서 이러한 각 세그먼트가 유도되는 부모 단백질과 비교하여, 증가된 바이오활성 또는 확장된 표적 해충 스펙트럼의 존재 또는 부재에 대하여 특징분석될 수 있다. 폴리펩타이드의 살충제 활성은 도메인 또는 세그먼트를 다른 단백질과 교환하거나 당해 분야에 공지된 유도된 진화 방법을 이용함으로써 특정 해충 또는 보다 광범위한 해충에 대한 활성을 위해 추가로 조작될 수 있다.
TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 단백질로 곤충, 특히, 작물의 나비목 침입을 조절하는 방법이 또한, 본 출원에 개시된다. 이러한 방법은 곤충- 또는 나비목-저해 양의 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 독소 단백질을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 방법은 (i) 식물 또는 식물을 야기시키는 종자에 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 독소 단백질을 포함하거나 인코딩하는 임의의 조성물을 적용하고; (ii) TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 독소 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 식물을 야기시키는 식물 또는 식물 세포를 형질전환시키는 것 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 독소 단백질이 조성물에 제공되거나, 미생물에 제공되거나, 나비목 곤충에 대한 곤충 저해 활성을 부여하기 위해 형질전환 식물에 제공될 수 있는 것으로 고려된다.
특정 실시형태에서, TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 독소 단백질의 재조합 핵산 분자는 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 독소 단백질을 발현시키기 위해 적합한 조건 하에서 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 독소 단백질을 발현시키도록 형질전환된 재조합 바실러스 또는 임의의 다른 재조합 박테리아 세포를 배양함으로써 제조된 곤충 저해 조성물의 살충 활성 구성성분이다. 이러한 조성물은 상기 재조합 폴리펩타이드를 발현/생성시키는 이러한 재조합 세포의 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강, 또는 농축에 의해 제조될 수 있다. 이러한 공정은 바실러스 또는 다른 곤충 병원증 박테리아 세포 추출물, 세포 현탁액, 세포 균질액, 세포 용해물, 세포 상청액, 세포 여액, 또는 세포 펠렛를 야기시킬 수 있다. 이에 따라 생성된 재조합 폴리펩타이드를 수득함으로써, 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 박테리아 세포, 박테리아 포자, 및 부아포 봉입체를 포함할 수 있고, 농업 곤충 저해 스프레이 제품으로서 또는 식이 생물학적 검정에서 곤충 저해 포뮬레이션을 포함하는, 다양한 용도를 위해 포뮬레이션될 수 있다.
일 실시형태에서, 내성 발달 가능성을 감소시키기 위해, TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL을 포함하는 곤충 저해 조성물은 동일한 나비목 곤충 종에 대한 곤충 저해 활성을 나타내는 적어도 하나의 추가적인 폴리펩타이드를 추가로 포함하지만, 이는 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 독소 단백질과는 상이하다. 이러한 조성물을 위한 가능한 추가적인 폴리펩타이드는 곤충 저해 단백질 및 곤충 저해 dsRNA 분자를 포함한다. 곤충 해충을 조절하기 위해 이러한 리보뉴클레오타이드 서열의 사용을 위한 하나의 예는 문헌[Baum, et al.(미국특허공개 2006/0021087 A1)]에 기술되어 있다. 나비목 해충의 조절을 위한 이러한 추가적인 폴리펩타이드는 곤충 저해 단백질, 예를 들어, 비제한적으로, Cry1A(미국 특허 제5,880,275호), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B(미국특허공개번호 제10/525,318호), Cry1C(미국 특허 제6,033,874호), Cry1D, Cry1Da 및 이의 변형체, Cry1E, Cry1F, 및 Cry1A/F 키메라(미국 특허 제7,070,982호; 제6,962,705호; 및 제6,713,063호), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry1-타입 키메라, 예를 들어, 비제한적으로, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, 및 TIC1100(국제출원공개 WO2016/061391(A2)호), TIC2160(국제출원공개 WO2016/061392(A2)호), Cry2A, Cry2Ab(미국 특허 제7,064,249호), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035, 및 AXMI-045(미국특허공개 제2013-0117884A1호), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100(미국특허공개 제2013-0310543A1호), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005(미국특허공개 제2013-0104259A1호), AXMI-134(미국특허공개 제2013-0167264A1호), AXMI-150(미국특허공개 제2010-0160231A1호), AXMI-184(미국특허공개 제2010-0004176A1호), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209(미국특허공개 제2011-0030096A1호), AXMI-218, AXMI-220(미국특허공개 제2014-0245491A1호), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z(미국특허공개 제2014-0196175A1호), AXMI-238(미국특허공개 제2014-0033363A1호), AXMI-270(미국특허공개 제2014-0223598A1호), AXMI-345(미국특허공개 제2014-0373195A1호), AXMI-335(국제출원공개 WO2013/134523(A2)호), DIG-3(미국특허공개 제2013-0219570A1호), DIG-5(미국특허공개 제2010-0317569A1호), DIG-11(미국특허공개 제2010-0319093A1호), AfIP-1A 및 이의 유도체(미국특허공개 제2014-0033361A1호), AfIP-1B 및 이의 유도체(미국특허공개 제2014-0033361A1호), PIP-1APIP-1B(미국특허공개 제2014-0007292A1호), PSEEN3174(미국특허공개 제2014-0007292A1호), AECFG-592740(미국특허공개 제2014-0007292A1호), Pput_1063(미국특허공개 제2014-0007292A1호), DIG-657(국제출원공개 WO2015/195594A2호), Pput_1064(미국특허공개 제2014-0007292A1호), GS-135 및 이의 유도체(미국특허공개 제2012-0233726A1호), GS153 및 이의 유도체(미국특허공개 제2012-0192310A1호), GS154 및 이의 유도체(미국특허공개 제2012-0192310A1호), GS155 및 이의 유도체(미국특허공개 제2012-0192310A1호), 미국특허공개 제2012-0167259A1호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 이의 유도체, 미국특허공개 2012-0047606 A1호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 이의 유도체, 미국특허공개 2011-0154536 A1호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 이의 유도체, 미국특허공개 2011-0112013 A1호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 이의 유도체, 미국특허공개 2010-0192256 A1호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 4 및 이의 유도체, 미국특허공개 2010-0077507 A1호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 이의 유도체, 미국특허공개 2010-0077508 A1호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 이의 유도체, 미국특허공개 2009-0313721 A1호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 이의 유도체, 미국특허공개 2010-0269221 A1호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 4 및 이의 유도체, 미국 특허 7,772,465 (B2)호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 이의 유도체, WO2014/008054 A2호에 기술된 바와 같은 CF161_0085 및 이의 유도체, 미국특허공개 US2008-0172762 A1호, US2011-0055968 A1호, 및 US2012-0117690 A1호에 기술된 바와 같은 나비목 독성 단백질 및 이의 유도체; US7510878(B2)호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 이의 유도체, 미국 특허 7812129(B1)호에 기술된 바와 같은 서열번호 2 및 이의 유도체; 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 실시형태에서, 이러한 조성물/포뮬레이션은 얻어진 곤충 저해의 스펙트럼을 확장하기 위해 본 발명의 달리 곤충 저해 단백질에 의해 저해되지 않는 곤충에 대한 곤충 저해 활성을 나타내는 적어도 하나의 추가적인 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 반시목 해충의 조절을 위해, 본 발명의 곤충 저해 단백질의 조합은 반시목-활성 단백질, 예를 들어, TIC1415(미국특허공개 2013-0097735 A1), TIC807(미국 특허 8609936), TIC834(미국특허공개 2013-0269060 A1), AXMI-036(미국특허공개 2010-0137216 A1), 및 AXMI-171(미국특허공개 2013-0055469 A1)과 함께 사용될 수 있다. 또한, 딱정벌레목 해충의 조절을 위한 폴리펩타이드는 곤충 저해 단백질, 예를 들어, 비제한적으로, Cry3Bb(미국 특허 6,501,009), Cry1C 변형체, Cry3A 변형체, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134(미국특허공개 2013-0167264 A1) AXMI-184(미국특허공개 2010-0004176 A1), AXMI-205(미국특허공개 2014-0298538 A1), AXMI-207(미국특허공개 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220(미국특허공개 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z(미국특허공개 2014-0196175 A1), AXMI-279(미국특허공개 2014-0223599 A1), AXMI-R1 및 이의 변형체(미국특허공개 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10(미국특허공개 2010-0319092 A1), eHIPs(미국특허출원공개번호 2010/0017914), IP3 및 이의 변형체(미국특허공개 2012-0210462 A1), 및
Figure 112018030229425-pct00003
-헥사독소-Hv1a(미국특허출원공개 US2014-0366227 A1)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
딱정벌레목, 나비목, 및 반시목 곤충 해충의 조절을 위한 추가적인 폴리펩타이드는 Neil Crickmore에 의해 관리되는 바실러스 투린지엔시스 독소 명명법 웹사이트(월드 와이드 웹, btnomenclature.info)에서 확인될 수 있다.
곤충이 특정 살충제에 대한 내성을 발달할 가능성은 당해 분야에 기재되어 있다. 하나의 곤충 내성 관리 전략은 상이한 작용 모드를 통해 작동하는 두 개의 별도의 곤충 저해제를 발현시키는 형질전환 작물을 사용하는 것이다. 이에 따라, 곤충 저해제들 중 하나에 대한 내성을 갖는 임의의 곤충은 다른 곤충 저해제에 의해 조절될 수 있다. 다른 곤충 내성 관리 전략은 이러한 보호되지 않은 식물에 대한 도피(refuge)를 제공하기 위해 표적화된 나비목 해충 종에 대해 보호되지 않는 식물의 사용을 이용한다. 하나의 특정 예는 미국 특허 제6,551,962호에 기술되어 있으며, 이러한 문헌은 전문이 참고로 포함된다.
종자 처리, 스프레이 온(spray on), 드립 온(drip on), 또는 와이프 온(wipe on) 포뮬레이션에서 단백질과 함께 사용되는, 본 명세서에 개시된 단백질에 의해 또한 조절되는 해충을 조절하기 위해 설계된 국소적으로 적용된 살충제 화학물질과 같은 다른 실시형태는 토양(토양 관주)에 직접적으로 적용되거나, 본 명세서에 개시된 단백질을 발현시키는 성장하는 식물에 적용되거나, 개시된 단백질 중 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 이식 유전자를 함유한 종자에 적용되도록 포뮬레이션될 수 있다. 종자 처리에서 사용하기 위한 이러한 포뮬레이션은 당해 분야에 공지된 다양한 스티커 및 점착부여제와 함께 적용될 수 있다. 이러한 포뮬레이션은 개시된 단백질과 함께 작용 모드에서 상승 작용을 갖는 살충제를 함유할 수 있으며, 이에 따라, 포뮬레이션 살충제가 개시된 단백질에 의해 조절될 수 있는 동일하거나 유사한 해충을 조절하기 위해 상이한 작용 모드를 통해 작용하거나, 이러한 살충제가 TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, 또는 TIC7473PL 살충제 단백질에 의해 효과적으로 조절되지 않는 보다 넓은 숙주 범위 또는 식물 해충 종 내에서 해충을 조절하도록 작용하게 한다.
상술된 조성물/포뮬레이션은 농업적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 베이트(bait), 분말, 더스트(dust), 펠렛, 과립, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 수용액, 바실러스 포자/결정 제조물, 종자 처리, 단백질 중 하나 이상을 발현시키도록 형질전환된 재조합 식물 세포/식물 조직/종자/식물, 또는 단백질 중 하나 이상을 발현시키도록 형질전환된 박테리윰을 추가로 포함할 수 있다. 재조합 폴리펩타이드에 내재된 곤충 저해 또는 살충 저해의 수준, 또는 식물 또는 사료 검정에 적용되는 포뮬레이션의 수준에 따라, 조성물/포뮬레이션은 다양한 중량의 양의 재조합 폴리펩타이드, 예를 들어, 0.0001 중량% 내지 0.001 중량% 내지 0.01 중량% 내지 1 중량% 내지 99 중량% 의 재조합 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
상기한 것을 고려하여, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서, 개시된 특정 양태들에서 변경 가능하고, 여전히 같거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 이에 따라, 본 명세서에 개시된 특정 구조 및 기능적 세부사항은 제한적인 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서에 인용된 각 참고문헌의 전체 개시내용이 본 출원의 개시내용 내에 도입되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1
TIC6757 의 발견, 클로닝 , 및 발현
세 가지의 신규한 파에니바실러스 포필리아에 살충제 단백질을 인코딩하는 서열을 동정하고, 클로닝하고, 서열 확인하였고, 곤충 생물학적 검정에서 시험하였다. 각각 파에니바실러스 포필리아에 균주 DSC004343, DSC007648, 및 DSC008493으로부터 단리된 살충제 단백질, TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473은 신규한 Vip3C-유사 단백질을 나타낸다. TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473에 대한 거리-관련 서열(Distant-related sequence)은 Vip3Ca2(83.7% 동일성, 가장 가까운 공지된 관련성), Vip3Aa1(66.75% 동일성), 및 Vip3B-like 단백질(60.93% 동일성)이다. TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473의 독특하고 유일한 품질은, 이러한 살충제 단백질이 신규한 작용 모드(MOA)를 가질 가능성이 있음을 지시한다.
각각 파에니바실러스 포필리아에 균주 DSC004343, DSC007648, 및 DSC008493으로부터 단리된 전체 게놈 DNA로부터 TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473에 대한 코딩 영역의 전장 복사체를 증폭시키기 위해 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머를 설계하였다. PCR 앰플리콘은 또한, 각 코딩 서열의 번역 개시 및 종결 코돈을 포함하였다.
각 앰플리콘을 Bt 발현 가능한 프로모터와 작동 가능한 연결에서 두 개의 상이한 Bt 발현 벡터에 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 클로닝하였다. 하나의 Bt 발현 벡터는 바실러스의 포자화 동안에 있는 프로모터를 포함하였다. 다른 발현 벡터는 비-포자화 프로모터를 포함하였다. 또한, 각 앰플리콘을 이. 콜라이(E. coli)에서의 단백질 발현을 위해 사용되는 벡터에 클로닝하였다. 이. 콜라이 발현된 단백질의 단리를 위하여, 히스티딘 태그를 발현된 코딩 서열에 작동 가능하게 연결시켜 단백질의 칼럼 정제를 촉진시켰다. 박테리아 발현을 위해 사용되는 코딩 서열 및 이의 개개 단백질 서열은 하기 표 3에 제시된다.
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실시예 2
TIC6757 , TIC7472 , 및 TIC7473은 곤충 생물학적 검정에서 나비목 활성을 나타냄
살충제 단백질 TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473을 Bt 및 이. 콜라이에서 발현시키고, 나비목, 딱정벌레목, 및 반시목의 다양한 종에 대한 독성에 대해 검정하였다. Bt로부터의 각 독소의 제조물을 나비목 종, 사탕무 거염벌레(BAW, 스포도프테라 엑시구아), 검거세미나방(BCW, 아그로티스 입실론), 옥수수 이삭벌레(CEW, 헬리코베르파 제아), 목화 잎 벌레(CLW, 알라바마 아르길라세아), 배추좀나방(DBM, 플루텔라 크실로스텔라), 유럽 조명충나방(ECB, 오스트리니아 누빌랄리스), 가을 거염벌레(FAW, 스포도프테라 프루기페르다), Cry1Fa1 내성 가을 거염벌레(FAWR1, 스포도프테라 프루기페르다), 미국 다래벌레(AWB, 헬리코베르파 아르미게라), 분홍 다래벌레(PBW, 펙티노포라 고시피엘라), 남부 거염벌레(SAW, 스포도프테라 에리다니아), 대두 루퍼(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스), 반점 다래벌레(SBW, 에아리아스 비텔라), 서남부 조명충나방(SWCB, 디아트라에아 그란디오셀라), 회색담배나방(TBW, 헬리오티스 비레스켄스), 담배거세미나방(TCW, 스포도프테라 리투라, 클러스터 애벌레로도 알려짐), 및 벨벳 콩 애벌레(VBW, 안티카르시아 겜마탈리스); 딱정벌레목 종, 콜로라도 감자 딱정벌레(CPB, 레프티노타르사 데세리네아타(Leptinotarsa decemlineata)), 서부 옥수수 뿌리벌레(WCB, 디아브로티카 비르기페라 비르기페라(Diabrotica virgifera virgifera)); 및 반시목 종, 타니시트 장님노린재(Tarnished plant bug)(TPB, 리구스 리네올라리스(Lygus lineolaris)), 서부 타니스트 장님노린재(WTP, 리구스 헤스페루스(Lygus hesperus)), 신열대 갈색 방구 벌레(Neotropical Brown Stink Bug)(NBSB, 에유키스투세로스(Euschistusheros)), 및 녹색 방구 벌레(GSB, 네자라 비리둘라(Nezara viridula))에 대해 검정하였다.
이. 콜라이 또는 Bt 발현 숙주에서 단백질을 생성시킴으로써 살충제 단백질 TIC6757, TIC7472, 및 TIC7473의 생체활성을 평가하였다. Bt 숙주의 경우에, TIC6757, TIC7472, 또는 TIC7473을 발현시키는 Bt 균주를 24시간 동안 성장시키고, 이후에, 배양물을 곤충 사료에 첨가하였다. TIC6757, TIC7472, 또는 TIC7473을 발현시키는 Bt 균주로부터의 배양물을 갖는 사료 상에서 곤충의 성장 및 발달을 미처리된 대조 배양물을 갖는 사료 상에서의 곤충과 비교함으로써 치사율 및 발육(stunting)을 평가하였다. TIC6757, TIC7472, 또는 TIC7473을 발현시키는 이. 콜라이 균주를 유사한 방식으로 처리하고, 또한, 곤충 사료에 제공하였다. Bt 또는 이. 콜라이 제조물 중 어느 하나 또는 둘 모두의 제조물로부터의 각 단백질에 대해 관찰된 생물학적 검정 활성은 하기 표 4 및 표 5에 제시되어 있으며, 여기서, "+"는 활성을 지시하며, "NT"는 독소가 그러한 특정 곤충 해충에 대해 검정되지 않았음을 지시한다.
Figure 112018030229425-pct00005
Figure 112018030229425-pct00006
상기 표 4 및 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 곤충 독소 TIC6757은 다수의 나비목 곤충 해충(BAW, BCW, CEW, CLW, DBM, ECB, FAW, FAWR1, AWB, SAW, SBL, SBW, SWCB, TBW, TCW, 및 VBC)에 대한 활성을 나타내었다. 활성은 TIC7472 및 TIC7473에 대해 검정된 대부분의 해충(CEW, FAW, SAW, SBL, SWCB)에 대해 관찰되었다.
실시예 3
안정적으로 형질전환된 옥수수 식물에서 나비목 해충에 대한 TIC6757PL 활성의 검정
색소체 표적화된 및 비표적화된 TIC6757PL 살충제 단백질 둘 모두를 발현시키도록 설계된 이식 유전자 카세트를 포함하는 바이너리 식물 형질전환 벡터를 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 클로닝하였다. 얻어진 벡터를 사용하여 옥수수 식물을 안정적으로 형질전환시켰다. 조직을 형질전환체로부터 수확하고, 다양한 나비목 곤충 해충에 대한 곤충 생물학적 검정에서 사용하였다.
합성 코딩 서열을 식물에서 인코딩된 단백질의 발현에서 사용하기 위해 구성하고, 바이너리 식물 형질전환 벡터에 클로닝하고, 옥수수 식물 세포를 형질전환하기 위해 사용하였다. 천연 파에니바실러스 단백질의 아미노산 서열을 보존하면서, ATTTA 및 A/T 풍부 식물 폴리아데닐화 서열과 같은 특정한 유해 문제 서열을 방지하기 위하여, 일반적으로 미국특허 제5,500,365호에 기술된 방법에 따라 합성 서열을 합성하였다. 합성 코딩 서열은 TIC6757 단백질에 대해 메티오닌을 개시한 직후에 추가적인 알라닌 잔기를 포함하는 TIC6757PL 단백질을 인코딩하였다. 색소체 표적화된 단백질에 대하여, 합성 TIC6757PL 살충제 단백질 코딩 서열을 엽록체 표적화 신호 펩타이드 코딩 서열과 프레임 내에서 작동 가능하게 연결하였다. 얻어진 식물 형질전환 벡터는 색소체 표적화된 또는 비표적화된 TIC6757PL 단백질을 인코딩하는 합성 코딩 서열에 5'를 작동 가능하게 연결된 인트론에 5'를 작동 가능하게 연결된 리더에 5'를 작동 가능하게 연결되고, 이후에, 3' UTR에 5'를 작동 가능하게 연결된, 구성 프로모터를 포함하는 TIC6757PL 살충제 단백질의 발현을 위한 제1 이식 유전자 카세트; 및 글리포세이트(glyphosate) 선택을 이용한 형질전환된 식물 세포의 선택을 위한 제2 이식 유전자 카세트를 포함하였다. TIC6757PL 살충제 단백질에 대한 합성 코딩 서열은 서열번호 3으로서 제시되고, 서열번호 4로서 제시된 단백질을 인코딩한다.
옥수수 식물을 아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 이용하여 상술된 바와 같은 4개의 상이한 바이너리 형질전환 벡터로 형질전환하였다. 바이너리 식물 형질전환 벡터 작제물 1 및 3은 색소체 표적화된 TIC6757PL 단백질을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하며, 작제물 2 및 4는 비-표적화된 TIC6757PL 단백질을 인코딩하는 코딩 서열을 포함한다. 당해 분야에 공지된 방법에 의해 식물을 형성시키기 위해 형질전환된 세포를 유도하였다. 식물 엽편을 이용한 생물학적 검정을 미국 특허 제8,344,207호에 기술된 것과 유사하게 수행하였다. 1일 미만의 단일의 새롭게 부화된 신생아 유충을 각 잎편 샘플 상에 놓고, 대략 4일 동안 먹도록 하였다. 음성 대조군으로서 사용되는 조직을 얻기 위해 비-형질전환된 옥수수 식물을 사용하였다. 각 바이너리 벡터로부터의 다수의 형질전환 R0 단일-복사체 삽입 이벤트를 검거세미나방(BCW, 아그로티스 입실론), 옥수수 이삭벌레(CEW, 헬리코베르파 제아), 가을 거염벌레(FAW, 스포도프테라 프루기페르다), 및 서남부 조명충나방(SWCB, 디아트라에아 그란디오셀라)에 대해 평가하였다.
TIC6757PL을 발현시키는 형질전환된 R0 식물은 표 6에 나타낸 바와 같이 검정된 모두 4가지 곤충 해충에 대해 매우 효과적이었다(100% 치사율과 함께 17.5 퍼센트 이하의 잎 손상을 갖는 것으로서 규정됨). 높은 침투도("(H)"에 의해 지시됨)는 100% 치사율과 함께 17.5 퍼센트 이하의 잎 손상을 갖는 각 작제물에 대한 검정된 이벤트의 50% 초과로서 규정된다. 낮은 침투도("(L)"에 의해 지시됨)는 100% 치사율과 함께 17.5 퍼센트 이하의 잎 손상을 갖는 각 작제물에 대한 검정된 이벤트의 50% 이하로서 규정된다.
Figure 112018030229425-pct00007
R0 작제물 1(색소체 표적화된) 및 작제물 2(색소체 비표적화된)로부터 유도된 선택된 R0 이벤트는 자가-수분하여, F1 자손을 생성하였다. 각 R0 이벤트로부터의 여러 이형접합 F1 자손 식물을 엽편 생물학적 검정을 위해 선택하고, 검거세미나방(BCW, 아그로티스 입실론), 옥수수 이삭벌레(CEW, 헬리코베르파 제아), 가을 거염벌레(FAW, 스포도프테라 프루기페르다), 및 서남부 조명충나방(SWCB, 디아트라에아 그란디오셀라)에 대해 검정하였다. 하기 표 7은 각 작제물/이벤트로부터 유도된 각 식물에 대한 평균 퍼센트 잎 손상 및 평균 치사율을 나타낸다. F1 자손 이물은 R0 이벤트와 관련하여 참조된다. 예를 들어, "이벤트(Event)-1_1"은 이벤트-1로부터 유도된 제1 이형접합 F1 자손 식물이며, "이벤트-1_2"는 이벤트-1로부터 유도된 제1 이형접합 F1 자손 식물이다. "N"은 검정에서 사용되는 각 식물로부터의 샘플의 수를 나타낸다. 표 7 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 각 R0 이벤트로부터 유도된 대부분의 식물은 BCW, CEW, 및 FAW에 대해 5 퍼센트 이하의 잎 손상 및 100 퍼센트 치사율을 나타내었다. SWCB에 대하여, 각 R0 이벤트로부터 유도된 다수의 식물은 10 퍼센트 미만의 잎 손상 및 50 퍼센트 초과의 치사율을 나타내었다.
Figure 112018030229425-pct00008
Figure 112018030229425-pct00009
작제물 3(색소체 표적화된) 및 작제물 4(비표적화된)로부터 유도된 선택된 R0 이벤트는 자가-수분하여, F1 자손을 생성하였다. 각 R0 이벤트로부터의 여러 이형접합 F1 자손 식물을 엽편 생물학적 검정을 위해 선택하고, 서부 콩 야도충(WBC, 스트리아코스타 알비코스타)에 대해 검정하였다. 표 9는 각 R0 이벤트 및 음성 대조군으로부터의 F1 자손 식물의 평균 퍼센트 잎 손상 및 평균 퍼센트 치사율을 나타낸다. "N"은 검정에서 사용되는 각 식물로부터의 샘플의 수를 나타낸다.
Figure 112018030229425-pct00010
상기 표 9에 나타낸 바와 같이, WBC에 대해 검정된 각 R0 이벤트로부터의 하나의 F1 자손 식물을 제외한 모든 것은 5 퍼센트 이하의 잎 손상 및 100 퍼센트 치사율을 나타내었다.
작제물 3(색소체 표적화된) 및 작제물 4(비표적화된)로 형질전환된 선택된 이형접합 F1 자손 식물로부터 유도된 묘목을 검거세미나방(BCW, 아그로티스 입실론)에 대한 내성에 대해 검정하였다. F1 자손 종자뿐만 아니라 비-형질전환된 종자(음성 대조군)를 포트에 심었다. 묘목이 토양으로부터 출현하고 8일 후에, 각 식물을 3마리의 제3령 BCW로 우글거리게 하였다. 침입하고 14일 후에, BCW에 의해 삭감된 식물의 수를 카운팅하기 위해 식물을 검사하였다. 작제물 3으로 형질전환된 10개의 상이한 R0 이벤트로부터 유도된 68개의 F1 자손 식물, 및 작제물 4로 형질전환된 4개의 상이한 R0 이벤트로부터 유도된 10개의 F1 자손 식물을 검정에서 사용하였다. 15개의 음성 대조군 식물을 또한 검정에서 사용하였다. 식물의 검사 후에, 음성 대조군의 80%가 BCW에 의해 삭감되었으며, 0%의 작제물 3 및 작제물 4 중 어느 하나로 형질전환된 F1 자손 식물은 절단을 나타낸다는 것이 관찰되었다.
상기는, TIC6757PL을 발현시키는 형질전환된 옥수수 식물이 나비목 곤충 해충, 특히, 검거세미나방(아그로티스 입실론), 옥수수 이삭벌레(헬리코베르파 제아), 가을 거염벌레(스포도프테라 프루기페르다), 서남부 조명충나방(디아트라에아 그란디오셀라), 및 서부 콩 야도충(스트리아코스타 알비코스타)에 대한 우수한 내성을 제공함을 나타낸다.
실시예 4
안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 나비목 해충에 대한 TIC6757PL 활성의 검정
색소체 표적화된 및 비표적화된 TIC6757PL 살충제 단백질 둘 모두를 발현시키기 위해 설계된 이식 유전자 카세트를 포함하는 바이너리 식물 형질전환 벡터를 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 클로닝하였다. 얻어진 벡터를 사용하여 대두 식물을 안정적으로 형질전환시켰다. 조직을 형질전환체로부터 수확하고, 다양한 나비목 곤충 해충에 대한 곤충 생물학적 검정에서 사용하였다.
상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 식물 발현을 위해 설계된 합성 코딩 서열을 바이너리 식물 형질전환 벡터에 클로닝하고, 대두 식물 세포를 형질전환시키기 위해 사용하였다. 색소체 표적화된 및 비표적화된 TIC6757PL 코딩 서열을 포함하는 바이너리 벡터를 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 구성하였다. 얻어진 식물 형질전환 벡터는 색소체 표적화된 또는 비표적화된 TIC6757PL 단백질을 인코딩하는 합성 코딩 서열에 5'를 작동 가능하게 연결된, 리더에 5'를 작동 가능하게 연결되고, 이후에, 3' UTR에 5'를 작동 가능하게 연결된, 구성 프로모터를 포함하는 TIC6757PL 살충제 단백질의 발현을 위한 제1 이식 유전자 카세트; 및 스펙티노마이신 선택을 이용한 형질전환된 식물 세포의 선택을 위한 제2 이식 유전자 카세트를 포함하였다. 작제물 1, 3 및 5는 비표적화된 TIC6757PL 살충제 단백질을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하였다. 작제물 2, 4 및 6은 색소체 표적화된 TIC6757PL 단백질을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하였다.
형질전환된 대두 세포를 유도하여 당해 분야에 공지된 방법에 의해 식물을 형성하였다. 식물 엽편을 사용한 생물학적 검정을 미국 특허 제8,344,207호에 기술된 것과 유사하게 수행하였다. 비-형질전환된 대두 식물을 사용하여 음성 대조군으로서 사용할 조직을 얻었다. 각 바이너리 벡터로부터의 다중 형질전환 이벤트를 남부 거염벌레(SAW, 스포도프테라 에리다니아), 대두 루퍼(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스), 및 대두 포드웜(SPW, 헬리코베르파 제아)에 대해 평가하였다.
TIC6757PL을 발현시키는 형질전환된 R0 대두 식물은 표 10에 나타낸 바와 같이 SAW, SBL, 및 SPW에 대해 매우 효과적이었다(잎 손상이 20% 이하인 것으로서 정의됨). 높은 침투도("(H)"로 지시됨)는 잎 손상이 20% 이하인 각 작제물에 대한 검정된 이벤트의 50% 초과로서 규정된다. 낮은 침투도("(L)"로 지시됨)는 잎 손상이 20% 이하인 각 작제물에 대한 검정된 이벤트의 50% 이하로서 규정된다.
Figure 112018030229425-pct00011
작제물 3, 4, 5 및 6의 형질전환으로부터 유도된 TIC6757PL 단백질 독소를 발현시키는 선택된 R0 형질전환 대두 식물을 R1 종자를 자기 수분 및 생성시킬 수 있다. R1 종자를 발아시켜 R1 식물을 생성하였다. TIC6757PL 발현 카세트에 대해 동형인 R1 식물을 남부 거염벌레(SAW, 스포도프테라 에리다니아), 대두 루퍼(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스), 대두 포드웜(SPW, 헬리코베르파 제아), 및 벨벳 콩 애벌레(VBW, 안티카르시아 겜마탈리스)에 대한 엽편 생물학적 검정을 위해 선택하였다. 표 11 및 표 12는 각 R1 자손 식물 및 음성 대조군, 변종 A3555에 대한 각 곤충에 의해 나타낸 잎 손상의 평균 백분율을 나타낸다. 표 11 및 표 12는 또한, 음성 대조군에 대해 검정된 각 이벤트에 대해 각 곤충에 의해 나타낸 잎 손상의 표준 오차 평균(SEM) 퍼센트를 나타낸다. "N"은 검정에서 사용되는 각 식물로부터의 샘플의 수를 나타낸다. "SEM"은 평균 백분율 손상의 표준 오차를 나타낸다.
Figure 112018030229425-pct00012
Figure 112018030229425-pct00013
표 11 및 표 12에서 알 수 있는 바와 같이, TIC6757PL 독소 단백질을 발현시키는 R1 대두 식물은 SAW, SBL, SPW, 및 VBC에 대한 우수한 내성을 제공한다. SAW에 대하여, 4 이벤트 모두는 1% 미만의 잎 손상을 나타내며, 음성 대조군은 대략 88% 잎 손상을 갖는다. SBL에 대하여, 4 이벤트 모두는 2% 미만의 잎 손상을 나타내며, 대조군은 대략 80%의 잎 손상을 갖는다. SPW에 대하여, 4 이벤트 중 3가지는 4% 미만의 잎 손상을 나타내며, 대조군은 대략 97%의 잎 손상을 갖는다. VBC에 대하여, 이벤트 중 세 가지는 1% 미만의 잎 손상을 나타내며, 1 이벤트는 2% 미만의 잎 손상을 나타내며, 음성 대조군은 89%에 가까운 잎 손상을 갖는다.
상기한 것은, TIC6757PL을 발현시키는 형질전환된 대두 식물이 나비목 곤충, 특히, 남부 거염벌레(스포도프테라 에리다니아), 대두 루퍼(크리소데익시스 인클루덴스), 대두 포드웜(헬리코베르파 제아), 및 벨벳 콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스)에 대한 우수한 내성을 제공한다.
실시예 5
안정적으로 형질전환된 목화 식물에서 나비목 해충에 대한 TIC6757PL 활성의 검정
색소체 표적화된 및 비표적화된 TIC6757PL 살충제 단백질 둘 모두를 발현시키기 위해 설계된 이식 유전자 카세트를 포함하는 바이너리 식물 형질전환 벡터를 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 클로닝하였다. 얻어진 벡터를 사용하여 목화 식물을 안정적으로 형질전환하였다. 조직을 형질전환체로부터 수확하고, 다양한 나비목 곤충 해충에 대한 곤충 생물학적 검정에서 사용하였다.
상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 식물 발현을 위해 설계된 합성 코딩 서열을 바이너리 식물 형질전환 벡터에 클로닝하고, 이를 사용하여 목화 식물 세포를 형질전환하였다. 색소체 표적화된 및 비표적화된 TIC6757PL 코딩 서열을 포함하는 바이너리 벡터를 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 구성하였다. 얻어진 식물 형질전환 벡터는 리더에 5'를 작동 가능하게 연결된, 5'를 색소체 표적화된 또는 비표적화된 TIC6757PL 단백질을 인코딩하는 합성 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되고, 이후에 3' UTR에 5'를 작동 가능하게 연결된 구성 프로모터를 포함하는 TIC6757PL 살충제 단백질의 발현을 위한 제1 이식 유전자 카세트; 및 스펙티노마이신 선택을 이용하여 형질전환된 식물 세포의 선택을 위한 제2 이식 유전자 카세트를 포함하였다.
당해 분야에 공지된 방법에 의해 식물을 형성시키기 위해 형질전환된 목화 세포를 유도하였다. 식물 엽편을 사용한 생물학적 검정을 미국 특허 제8,344,207호에 기술된 것과 유사하게 수행하였다. 음성 대조군으로서 사용되는 조직을 얻기 위해 비-형질전환된 목화 식물을 사용하였다. 각 바이너리 벡터로부터의 다수의 형질전환 이벤트를 남부 거염벌레 목화 다래벌레(CBW, 헬리코베르파 제아), 가을 거염벌레(FAW, 스포도프테라 프루기페르다), 대두 루퍼(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스), 및 회색담배나방(TBW, 헬리오티스 비레스켄스)에 대해 평가하였다.
TIC6757PL을 발현시키는 형질전환된 R0 목화 식물은 표 13에 나타낸 바와 같이 CBW, FAW, SBL 및 TBW에 대해 매우 효과적이었다(10 퍼센트 이하의 잎 손상을 갖는 것으로 규정됨). 높은 침투도("(H)"로서 지시됨)는 10 퍼센트 이하의 잎 손상을 갖는 각 작제물에 대해 50 퍼센트 초과의 검정된 이벤트로서 규정된다. 낮은 침투도("(L)"로서 지시됨)는 10 퍼센트 이하의 잎 손상을 갖는 각 작제물에 대해 50 퍼센트 이하의 검정된 이벤트로서 규정된다.
Figure 112018030229425-pct00014
실시예 6
안정적으로 형질전환된 옥수수 식물에서 나비목 해충에 대한 TIC7472PL 및 TIC74 73PL 활성의 검정
색소체 표적화된 및 비표적화된 TIC7472PL 또는 TIC7473PL 살충제 단백질 둘 모두를 발현시키기 위해 설계된 이식 유전자 카세트를 포함하는 바이너리 식물 형질전환 벡터를 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 클로닝하였다. 옥수수 식물을 안정적으로 형질전환하기 위해 얻어진 벡터를 사용하였다. 형질전환체로부터 조직을 수확하고, 다양한 나비목 곤충 해충에 대한 곤충 생물학적 검정에서 사용하였다.
합성 코딩 서열을 식물에서 인코딩된 단백질의 발현에서 사용하기 위해 구성하고, 바이너리 식물 형질전환 벡터에 클로닝하고, 이를 사용하여 옥수수 식물 세포를 형질전환하였다. 천연 파에니바실러스 단백질의 아미노산 서열을 보존하면서, ATTTA 및 A/T 풍부 식물 폴리아데닐화 서열과 같은 특정한 유해 문제 서열을 방지하기 위하여, 일반적으로 미국특허 제5,500,365호에 기술된 방법에 따라 합성 서열을 합성하였다. 합성 코딩 서열은 TIC7472 및 TIC7473 단백질에 대해 메티오닌을 개시한 직후에 추가적인 알라닌 잔기를 포함하는 TIC7472PL 및 TIC7473PL 단백질을 인코딩하였다. 색소체 단백질을 위하여, 합성 TIC7472PL 또는 TIC7473PL 살충제 단백질 코딩 서열을 엽록체 표적화 신호 펩타이드 코딩 서열로 프레임 내에서 작동 가능하게 연결하였다. 얻어진 식물 형질전환 벡터는 색소체 표적화된 또는 비표적화된 TIC7472PL 또는 TIC7473PL 단백질을 인코딩하는 합성 코딩 서열에 5'를 작동 가능하게 연결된 인트론에 5'를 작동 가능하게 연결된 리더에 5'를 작동 가능하게 연결되고, 이후에, 3' UTR에 5'를 작동 가능하게 연결된, 구성 프로모터를 포함하는 TIC7472PL 또는 TIC7473PL 살충제 단백질의 발현을 위한 제1 이식 유전자 카세트; 및 글리포세이트 선택을 이용한 형질전환된 식물 세포의 선택을 위한 제2 이식 유전자 카세트를 포함하였다. TIC7472PL 살충제 단백질을 위한 합성 코딩 서열은 서열번호 15로서 제시되고, 서열번호 16으로서 제시된 단백질을 인코딩한다. TIC7473PL 살충제 단백질을 위한 합성 코딩 서열은 서열번호 17로서 제시되고, 서열번호 18로서 제시된 단백질을 인코딩한다.
옥수수 식물을 아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 이용하여 상술된 바이너리 형질전환 벡터로 형질전환하였다. 당해 분야에 공지된 방법에 의해 식물을 형성시키기 위해 형질전환된 세포를 유도하였다. 식물 엽편을 사용한 생물학적 검정을 미국 특허 제8,344,207호에 기술된 것과 유사하게 수행하였다. 음성 대조군으로서 사용되는 조직을 얻기 위해 비-형질전환된 옥수수 식물을 사용하였다. 각 바이너리 벡터로부터의 다수의 형질전환 이벤트를 검거세미나방(BCW, 아그로티스 입실론), 옥수수 이삭벌레(CEW, 헬리코베르파 제아), 가을 거염벌레(FAW, 스포도프테라 프루기페르다), 및 서남부 조명충나방(SWCB, 디아트라에아 그란디오셀라)뿐만 아니라, 다른 나비목 곤충 해충에 대해 검정하였다.
곤충 해충은 TIC7472PL 또는 TIC7473PL을 발현시키는 제시된 엽편의 섭취로 인해 야기되는 치사율 및 저형성에 대해 관찰되고, 비-형질전환된 옥수수 식물로부터 유도된 엽편과 비교된다.
실시예 7
안정적으로 형질전환된 대두 및 목화 식물에서 나비목 해충에 대한 TIC6757PL 활성의 검정
색소체 표적화된 및 비표적화된 TIC7472PL 또는 TIC7473PL 살충제 단백질 둘 모두를 발현시키기 위해 설계된 이식 유전자 카세트를 포함하는 바이너리 식물 형질전환 벡터를 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 클로닝하였다. 얻어진 벡터를 사용하여 대두 및 목화 식물을 안정적으로 형질전환하였다. 형질전환체로부터 조직을 수확하고, 다양한 나비목 곤충 해충에 대해 곤충 생물학적 검정에서 사용하였다.
상기 실시예 6에 기술된 바와 같이 식물 발현을 위해 설계된 합성 코딩 서열을 바이너리 식물 형질전환 벡터에 클로닝하고, 대두 또는 목화 식물 세포를 형질전환시키기 위해 사용하였다. 색소체 표적화된 및 비표적화된 TIC7472PL 또는 TIC7473PL 코딩 서열을 포함하는 바이너리 벡터를 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 구성하였다. 얻어진 식물 형질전환 벡터는 색소체 표적화된 또는 비표적화된 TIC7472PL 또는 TIC7473PL 단백질을 인코딩하는 합성 코딩 서열에 5'를 작동 가능하게 연결된, 리더에 5'를 작동 가능하게 연결되고, 이후에, 3' UTR에 5'를 작동 가능하게 연결된, 구성 프로모터를 포함하는 TIC7472PL 또는 TIC7473PL 살충제 단백질의 발현을 위한 제1 이식 유전자 카세트; 및 스펙티노마이신 선택을 이용한 형질전환된 식물 세포의 선택을 위한 제2 이식 유전자 카세트를 포함하였다. 작제물 1, 2 및 7은 비표적화된 TIC6757PL 살충제 단백질을 인코딩하는 클로닝 서열을 포함하였다. 작제물 3, 4, 5 및 6은 표적화된 TIC6757PL 살충제 단백질을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하였다.
당해 분야에 공지된 방법에 의해 식물을 형성시키기 위해 형질전환된 대두 또는 목화 세포를 유도하였다. 식물 엽편을 사용한 생물학적 검정을 미국 특허 제8,344,207호에 기술된 것과 유사하게 수행하였다. 음성 대조군으로서 사용되는 조직을 얻기 위해 비-형질전환된 대두 또는 목화 식물을 사용하였다. 각 바이너리 벡터로부터의 다수의 형질전환 이벤트를 남부 거염벌레(SAW, 스포도프테라 에리다니아), 대두 루퍼(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스), 대두 포드웜(SPW, 헬리코베르파 제아) 가을 거염벌레(FAW, 스포도프테라 프루기페르다), 대두 루퍼(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스), 회색담배나방(헬리오티스 비레스켄스), 목화 다래벌레(CBW, 헬리코베르파 제아), 및 벨벳 콩 애벌레(VBW, 안티카르시아 겜마탈리스)뿐만 아니라 다른 나비목 곤충 해충에 대해 평가하였다. 곤충 해충은 TIC7472PL 또는 TIC7473PL을 발현시키는 제시된 엽편의 섭취로 인해 야기되는 치사율 및 저형성에 대해 관찰되고, 비-형질전환된 대두 또는 목화 식물로부터 유도된 엽편과 비교된다.
본 명세서에서 개시되고 청구된 모든 조성물은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물이 상기 예시적인 실시형태의 측면에서 기술되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기술된 조성물에 변화, 개질 및 변경이 가해질 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리적 면 둘다 관련이 있는 특정 작용제가 본 명세서에 기재된 작용제로 대체되면서 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있다는 것이 명확할 것이다. 당업자에게 명확한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 하기 청구의 범위에서 한정되는 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 포함되는 것으로 한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 공개된 특허 문헌은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 지시되는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Monsanto Technology LLC <120> NOVEL INSECT INHIBITORY PROTEINS <130> WO2016/035364 <140> PCT/US2016/048714 <141> 2016-08-25 <150> US 62/210,737 <151> 2015-08-27 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2394 <212> DNA <213> Paenibacillus popilliae <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2394) <223> DNA sequence derived from Paenibacillus popilliae strain DSC004343 encoding TIC6757. <400> 1 atgaagcaga ataataattt tagtgtaagg gccttaccaa gttttattga tgtttttaat 60 ggaatttatg gttttgccac tggcattcaa gatattttta acatgatttt tggaacagat 120 acaggtgatc taacactaga agaagtttta aaaaatcaag agttacttta tgatatttct 180 ggtaaacttg aggggattag tggagaccta agtgagatta ttgcgcaggg aaatttgaat 240 acagaattag ctaaggaatt gctaaaaatc gctaatgagc agaacaacgt attaactgat 300 gttaataaca aactcaatgc gataaattcg atgctccaca tctatcttcc taaaattaca 360 aatatgttaa gcgatgttat gaaacagaat tatgctctga gtcttcaaat agaatatctc 420 agtaaacaac tacaggagat atcagataaa cttgatgtta ttaacttaaa tgtactcatt 480 aactctacac 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ttctttttct ggattatggg ctaaggttat tataaaaaat 2220 tcccacggag tagtattgtt tgaaaaagta agtcagcagt cttcatacgt agatattagt 2280 gaaagtttta ctaccacatc aaataaagaa ggatttttta tagaactaac gggcgatagt 2340 cgtggtggtt ttgggtcgtt ccgtgatttt tctatgaagg aaaagtttga ataa 2394 <210> 2 <211> 797 <212> PRT <213> Paenibacillus popilliae <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(797) <223> Amino Acid sequence of TIC6757 derived from the Paenibacillus popilliae strain DSC004343 coding sequence encoding TIC6757. <400> 2 Met Lys Gln Asn Asn Asn Phe Ser Val Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile 1 5 10 15 Asp Val Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Gln Asp Ile 20 25 30 Phe Asn Met Ile Phe Gly Thr Asp Thr Gly Asp Leu Thr Leu Glu Glu 35 40 45 Val Leu Lys Asn Gln Glu Leu Leu Tyr Asp Ile Ser Gly Lys Leu Glu 50 55 60 Gly Ile Ser Gly Asp Leu Ser Glu Ile Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn 65 70 75 80 Thr Glu Leu Ala Lys Glu Leu Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Asn 85 90 95 Val Leu Thr Asp Val Asn Asn Lys Leu Asn Ala Ile Asn Ser Met Leu 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gagtgcaagg ctttcgagac tcccgagggc 2040 ccggagctta tcaagttcga tgactggatt tcgtttggca ccacctacat ccgggacgac 2100 gtgctaacca tcgacccgtc gcgcggcggc tacttccgcc aaagcctcaa gctggactcg 2160 tactccacgt acaacctatc tttcagcttc tcgggcctgt gggcgaaggt gattatcaag 2220 aactcgcacg gcgtggtcct gttcgagaag gtctcccagc agtcgtcata cgtggacatc 2280 agcgagtcct tcaccaccac cagcaacaag gagggcttct tcatcgagct gaccggcgac 2340 tcgcgcggcg ggttcggctc cttccgcgac ttctccatga aggagaaatt cgagtga 2397 <210> 4 <211> 798 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of TIC6757PL encoded by a synthetic DNA sequence wherein an additional Alanine residue has been inserted at position 2 relative to the bacterial TIC6757 amino acid sequence. <400> 4 Met Ala Lys Gln Asn Asn Asn Phe Ser Val Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 Ile Asp Val Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Gln Asp 20 25 30 Ile Phe Asn Met Ile Phe Gly Thr Asp Thr Gly Asp Leu Thr Leu Glu 35 40 45 Glu Val Leu Lys Asn Gln Glu Leu Leu Tyr Asp Ile Ser Gly Lys Leu 50 55 60 Glu Gly Ile Ser Gly Asp Leu Ser Glu Ile Ile Ala Gln Gly Asn Leu 65 70 75 80 Asn Thr Glu Leu Ala Lys Glu Leu Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn 85 90 95 Asn Val Leu Thr Asp Val Asn Asn Lys Leu Asn Ala Ile Asn Ser Met 100 105 110 Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Asn Met Leu Ser Asp Val Met 115 120 125 Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln 130 135 140 Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val Leu 145 150 155 160 Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys 165 170 175 Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Glu Leu Thr Leu Ala Thr Glu Lys Thr 180 185 190 Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ser Glu Asp Ile Ile Ala Asn Asp Thr Leu 195 200 205 Glu Asn Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn 210 215 220 Asp Met Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His Asp Val Leu 225 230 235 240 Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ala Glu 245 250 255 Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu Ile Gly Lys 260 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ttgcgcaggg aaatttgaat 300 acagaattag ctaaggaatt gctaaaaatc gctaatgagc agaacaacgt attaactgat 360 gttaataaca aactcaatgc gataaattcg atgctccaca tctatcttcc taaaattaca 420 aatatgttaa gcgatgttat gaaacagaat tatgctctga gtcttcaaat agaatatctc 480 agtaaacaac tacaggagat atcagataaa cttgatgtta ttaacttaaa tgtactcatt 540 aactctacac tcacagaaat cactcctgct tatcaacgta ttaaatatgt aaatgaaaaa 600 tttgatgaat taactcttgc tacagaaaaa actctaagag caaaacaagg tagcgaagac 660 attattgcta atgatactct tgaaaattta actgagctaa cagaactagc gaaaagtgta 720 acaaaaaatg acatggatag tttcgagttt tatctccata cattccatga tgtattgatt 780 ggcaataatt tatttggtcg ttcggcttta aaaacagctg cagaattgat tactaaagac 840 gagataaaga cgagtggaag tgagatagga aaagtttata gtttcttaat tgtactaact 900 tgtctacaag caaaagcctt tctcacttta acggcatgcc gaaaattatt gggcttatca 960 gatattgatt atactaatat tctaaatcag catctaaatg atgaaaagaa tgtatttcgt 1020 gataacatac ttcctacact gtccaataaa ttttctaacc ctaattatgt aaaaactata 1080 ggtagtgata attatgcaaa agttatttta gaagctgaac caggatatgc tttagttgga 1140 tttgaaatta tcaatgatcg aatcccggta ttaaaagcgt ataaagctaa gctaaaacaa 1200 aattatcaag ttgatcatca gtcgttatca gagattgttt atttagatat cgataaacta 1260 ttttgtccaa aaaattctga acaaaaatat tatactaaaa gtctgacatt tcctgatggc 1320 tatgttatta ctaagattac ctttgaaaaa aagctgaaca acctaagata tgaggcaaca 1380 gcaaattttt atgacccatc tacaggagat attgatttaa atgagaagca agtggaatct 1440 acttttcttc aagcagatta tatttctata aatgttagtg atgatgatgg tgtttacatg 1500 ccgttaggcg ttatcagcga aacatttttg tctccaatta atagttttga attagaagtt 1560 gacgagaaat cgaaaatctt aactttaaca tgtaaatctt atttacgaga atatttatta 1620 gaatctgatt taataaataa agagacaagc ctcattgctc cgcctaatgt ttttatcagt 1680 aatatcgtag aaaattggaa catagaagcg gataatctag aaccatgggt agcaaataac 1740 aagaatgcat atgtcgatag tacaggcggc atagagggat ctaaagctct atttactcaa 1800 ggtgatgggg aattttcaca atttattgga gataaattaa aaccaaatac agattatatt 1860 attcaatata ctgtaaaagg aaaacctgct atttatttaa aaaacaaaaa tactggatat 1920 actatgtacg aagatacaaa cggtagttct gaagaatttc aaactatagc tgtaaattat 1980 acttcagaaa ctgatccttc acaaacacat ttagttttta aaagtcaaag tggctatgag 2040 gcttgggggg acaactttat tattctagaa tgtaaggcat ttgaaactcc agaaggtcca 2100 gaattgataa aatttgatga ttggattagt tttggtacta cttacattag agatgatgta 2160 cttactatcg atccaagtcg tggaggttat tttagacaat ctcttaaatt agacagctat 2220 tcaacttata atttgagctt ttctttttct ggattatggg ctaaggttat tataaaaaat 2280 tcccacggag tagtattgtt tgaaaaagta agtcagcagt cttcatacgt agatattagt 2340 gaaagtttta ctaccacatc aaataaagaa ggatttttta tagaactaac gggcgatagt 2400 cgtggtggtt ttgggtcgtt ccgtgatttt tctatgaagg aaaagtttga ataa 2454 <210> 6 <211> 817 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of a Histidine tagged TIC6757 protein. <400> 6 Met His His His His His His His His His His Gly Thr Glu Thr Val 1 5 10 15 Arg Phe Gln Ser Met Lys Gln Asn Asn Asn Phe Ser Val Arg Ala Leu 20 25 30 Pro Ser Phe Ile Asp Val Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly 35 40 45 Ile Gln Asp Ile Phe Asn Met Ile Phe Gly Thr Asp Thr Gly Asp Leu 50 55 60 Thr Leu Glu Glu Val Leu Lys Asn Gln Glu Leu Leu Tyr Asp Ile Ser 65 70 75 80 Gly Lys Leu Glu Gly Ile Ser Gly Asp Leu Ser Glu Ile Ile Ala Gln 85 90 95 Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ala Lys Glu Leu Leu Lys Ile Ala Asn 100 105 110 Glu Gln Asn Asn Val Leu Thr Asp Val Asn Asn Lys Leu Asn Ala Ile 115 120 125 Asn Ser Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Asn Met Leu Ser 130 135 140 Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu 145 150 155 160 Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu 165 170 175 Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln 180 185 190 Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Glu Leu Thr Leu Ala Thr 195 200 205 Glu Lys Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ser Glu Asp Ile Ile Ala Asn 210 215 220 Asp Thr Leu Glu Asn Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val 225 230 235 240 Thr Lys Asn Asp Met Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His 245 250 255 Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr 260 265 270 Ala Ala Glu 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tgatatttct 180 ggtaaacttg aggggattag tggagaccta agtgagatta ttgcgcaggg aaatttgaat 240 acagaattag ctaaggaatt gctaaaaatc gctaatgagc agaacaacgt attaactgat 300 gttaataaca aactcaatgc gataaattcg atgctccaca tctatcttcc taaaattaca 360 aatatgttaa gcgatgttat gaaacagaat tatgctctga gtcttcaaat agaatatctc 420 agtaaacaac tacaggagat atcagataaa cttgatgtta ttaacttaaa tgtactcatt 480 aactctacac tcacagaaat cactcctgct tatcaacgta ttaaatatgt aaatgaaaaa 540 tttgatgaat taactcttgc tacagaaaaa actctaagag caaaacaagg tagcgaagac 600 attattgcta atgatactct tgaaaattta actgagctaa cagaactagc gaaaagtgta 660 acaaaaaatg acatggatag tttcgagttt tatctccata cattccatga tgtattgatt 720 ggcaataatt tatttggtcg ttcggcttta aaaacagctg cagaattgat tactaaagac 780 gagataaaga cgagtggaag tgagatagga aaagtttata gtttcttaat tgtactaact 840 tgtctacaag caaaagcctt tctcacttta acggcatgcc gaaaattatt gggcttatca 900 gatattgatt atactaatat tctaaatcag catctaaatg atgaaaagaa tgtatttcgt 960 gataacatac ttcctacact gtccaataaa ttttctaacc ctaattatgt aaaaactata 1020 ggtagtgata attatgcaaa agttatttta gaagctgaac caggatatgc tttagttgga 1080 tttgaaatta tcaatgatcg aatcccggta ttaaaagcgt ataaagctaa gctaaaacaa 1140 aattatcaag ttgatcatca gtcgttatca gagattgttt atttagatat cgataaacta 1200 ttttgtccaa aaaattctga acaaaaatat tatactaaaa gtctgacatt tcctgatggc 1260 tatgttatta ctaagattac ctttgaaaaa aagctgaaca acctaagata tgaggcaaca 1320 gcaaattttt atgacccatc tacaggagat attgatttaa atgagaagca agtggaatct 1380 acttttcttc aagcagatta tatttctata aatgttagtg atgatgatgg tgtttacatg 1440 ccgttaggcg ttatcagcga aacatttttg tctccaatta atagttttga attagaagtt 1500 gacgagaaat cgaaaatctt aactttaaca tgtaaatctt atttacgaga atatttatta 1560 gaatctgatt taataaataa agagacaagc ctcattgctc cgcctaatgt ttttatcagt 1620 aatatcgtag aaaattggaa catagaagcg gataatctag aaccatgggt agcaaataac 1680 aagaatgcat atgtcgatag tacaggcggc atagagggat ctaaagctct atttactcaa 1740 ggtgatgggg aattttcaca atttattgga gataaattaa aaccaaatac agattatatt 1800 attcaatata ctgtaaaagg aaaacctgct atttatttaa aaaacaaaaa tactggatat 1860 actatgtacg aagatacaaa cggtagttct gaagaatttc aaactatagc tgtaaattat 1920 acttcagaaa ctgatccttc acaaacacat ttagttttta aaagtcaaag tggctatgag 1980 gcttgggggg acaactttat tattctagaa tgtaaggcat ttgaaactcc agaaggtcca 2040 gaattgataa aatttgatga ttggattagt tttggtacta cttacattag agatgatgta 2100 cttactatcg atccaagtcg tggaggttat tttagacaat ctcttaaatt agacagctat 2160 tcaacttata atttgagctt ttctttttct ggattatggg ctaaggttat tataaaaaat 2220 tcccacggag tagtattgtt tgaaaaagta agtcagcagt cttcatacgt agatattaat 2280 gaaagtttta ctaccacatc aaataaagaa ggatttttta tagaactaac gggcgatagt 2340 cgtggtggtt ttgggtcgtt ccgtgatttt tctatgaagg aaaagtttga ataa 2394 <210> 8 <211> 797 <212> PRT <213> Paenibacillus popilliae <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(797) <223> Amino Acid sequence of TIC7472 derived from the Paenibacillus popilliae strain DSC007648 coding sequence encoding TIC7472. <400> 8 Met Lys Gln Asn Asn Asn Phe Ser Val Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile 1 5 10 15 Asp Val Phe Asn Gly Ile Tyr Asp Phe Ala Thr Gly Ile Gln 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aaaaatcaag agttacttta tgatatttct 180 ggtaaacttg aggggattag tggagaccta agtgagatta ttgcgcaggg aaatttgaat 240 acagaattag ctaaggaatt gctaaaaatc gctaatgagc agaacaacgt attaactgat 300 gttaataaca aactcaatgc gataaattcg atgctccaca tctatcttcc taaaattaca 360 aatatgttaa gcgatgttat gaaacagaat tatgctctga gtcttcaaat agaatatctc 420 agtaaacaac tacaggagat atcagataaa cttgatgtta ttaacttaaa tgtactcatt 480 aactctacac tcacagaaat cactcctgct tatcaacgta ttaaatatgt aaatgaaaaa 540 tttgatgaat taactcttgc tacagaaaaa actctaagag caaaacaagg tagcgaagac 600 attattgcta atgatactct tgaaaattta actgagctaa cagaactagc gaaaagtgta 660 acaaaaaatg acatggatag tttcgagttt tatctccata cattccatga tgtattgatt 720 ggcaataatt tatttggtcg ttcggcttta aaaacagctg cagaattgat tactaaagac 780 gagataaaga cgagtggaag tgagatagga aaagtttata gtttcttaat tgtactaact 840 tgtctacaag caaaagcctt tctcacttta acggcatgcc gaaaattatt gggcttatca 900 gatattgatt atactaatat tctaaatcag catctaaatg atgaaaagaa tgtatttcgt 960 gataacatac ttcctacact gtccaataaa ttttctaacc ctaattatgt aaaaactata 1020 ggtagtgata attatgcaaa agttatttta gaagctgaac caggatatgc tttagttgga 1080 tttgaaatta tcaatgatcg aatcccggta ttaaaagcgt ataaagctaa gctaaaacaa 1140 aattatcaag ttgatcatca gtcgttatca gagattgttt atttagatat cgataaacta 1200 ttttgtccaa aaaattctga acaaaaatat tatactaaaa gtctgacatt tcctgatggc 1260 tatgttatta ctaagattac ctttgaaaaa aagctgaaca acctaagata tgaggcaaca 1320 gcaaattttt atgacccatc tacaggagat attgatttaa atgagaagca agtggaatct 1380 acttttcttc aagcagatta tatttctata aatgttagtg atgatgatgg tgtttacatg 1440 ccgttaggcg ttatcagcga aacatttttg tctccaatta atagttttga attagaagtt 1500 gacgagaaat cgaaaatctt aactttaaca tgtaaatctt atttacgaga atatttatta 1560 gaatctgatt taataaataa agagacaagc ctcattgctc cgcctaatgt ttttatcagt 1620 aatatcgtag aaaattggaa catagaagcg gataatctag aaccatgggt agcaaataac 1680 aagaatgcat atgtcgatag tacaggcggc atagagggat ctaaagctct atttactcaa 1740 ggtgatgggg aattttcaca atttattgga gataaattaa aaccaaatac agattatatt 1800 attcaatata ctgtaaaagg aaaacctgct atttatttaa aaaacaaaaa tactggatat 1860 actatgtacg aagatacaaa cggtagttct gaagaatttc aaactatagc tgtaaattat 1920 acttcagaaa ctgatccttc acaaacacat ttagttttta aaagtcaaag tggctatgag 1980 gcttgggggg acaactttat tattctagaa tgtaaggcat ttgaaactcc agaaggtcca 2040 gaattgataa aatttgatga ttggattagt tttggtacta cttacattag agatgatgta 2100 cttactatcg atccaagtcg tggaggttat tttagacaat ctcttaaatt agacagctat 2160 tcaacttata atttgagctt ttctttttct ggattatggg ctaaggttat tataaaaaat 2220 tcccacggag tagtattgtt tgaaaaagta agtcagcagt cttcatacgt agatattaat 2280 gaaagtttta ctaccacatc aaataaagaa ggatttttta tagaactaac gggcgatagt 2340 cgtggtggtt ttgggtcgtt ccgtgatttt tctatgaagg aaaagtttga acaccaccat 2400 cacgctcacc atcactga 2418 <210> 10 <211> 805 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of a Histidine tagged TIC7472 protein. <400> 10 Met Lys Gln Asn Asn Asn Phe Ser Val Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile 1 5 10 15 Asp Val Phe Asn Gly Ile Tyr Asp Phe Ala Thr Gly Ile Gln Asp Ile 20 25 30 Phe Asn Met Ile Phe Gly Thr Asp Thr Gly Asp Leu Thr Leu Glu Glu 35 40 45 Val Leu Lys Asn Gln Glu Leu Leu Tyr Asp Ile Ser Gly Lys Leu Glu 50 55 60 Gly Ile Ser Gly Asp Leu Ser Glu Ile Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn 65 70 75 80 Thr Glu Leu Ala Lys Glu Leu Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Asn 85 90 95 Val Leu Thr Asp Val Asn Asn Lys Leu Asn Ala Ile Asn Ser Met Leu 100 105 110 His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Asn Met Leu Ser Asp Val Met Lys 115 120 125 Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu 130 135 140 Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val Leu Ile 145 150 155 160 Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr 165 170 175 Val Asn Glu Lys Phe Asp Glu Leu Thr Leu Ala Thr Glu Lys Thr Leu 180 185 190 Arg Ala Lys Gln Gly Ser Glu Asp Ile Ile Ala Asn Asp Thr Leu Glu 195 200 205 Asn Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp 210 215 220 Met Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His Asp Val Leu Ile 225 230 235 240 Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr 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Phe Leu Gln 450 455 460 Ala Asp Tyr Ile Ser Ile Asn Val Ser Asp Asp Asp Gly Val Tyr Met 465 470 475 480 Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Ser Pro Ile Asn Ser Phe 485 490 495 Glu Leu Glu Val Asp Glu Lys Ser Lys Ile Leu Thr Leu Thr Cys Lys 500 505 510 Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu Ile Asn Lys Glu 515 520 525 Thr Ser Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu 530 535 540 Asn Trp Asn Ile Glu Ala Asp Asn Leu Glu Pro Trp Val Ala Asn Asn 545 550 555 560 Lys Asn Ala Tyr Val Asp Ser Thr Gly Gly Ile Glu Gly Ser Lys Ala 565 570 575 Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys 580 585 590 Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys 595 600 605 Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Asn Thr Gly Tyr Thr Met Tyr Glu 610 615 620 Asp Thr Asn Gly Ser Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile Ala Val Asn Tyr 625 630 635 640 Thr Ser Glu Thr Asp Pro Ser Gln Thr His Leu Val Phe Lys Ser Gln 645 650 655 Ser Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu 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tggaacagat 120 acaggtgatc taacactaga agaagtttta aaaaatcaag agttacttta tgatatttct 180 ggtaaacttg aggggattag tggagaccta agtgagatta ttgcgcaggg aaatttgaat 240 acagaattag ctaaggaatt gctaaaaatc gctaatgagc agaacaacgt attaactgat 300 gttaataaca aactcaatgc gataaattcg atgctccaca tctatcttcc taaaattaca 360 aatatgttaa gcgatgttat gaaacagaat tatgctctga gtcttcaaat agaatatctc 420 agtaaacaac tacaggagat atcagataaa cttgatgtta ttaacttaaa tgtactcatt 480 aactctacac tcacagaaat cactcctgct tatcaacgta ttaaatatgt aaatgaaaaa 540 tttgatgaat taactcttgc tacagaaaaa actctaagag caaaacaagg tagcgaagac 600 attattgcta atgatactct tgaaaattta actgagctaa cagaactagc gaaaagtgta 660 acaaaaaatg acatggatag tttcgagttt tatctccata cattccatga tgtattgatt 720 ggcaataatt tatttggtcg ttcggcttta aaaacagctg cagaattgat tactaaagac 780 gagataaaga cgagtggaag tgagatagga aaagtttata gtttcttaat tgtactaact 840 tgtctacaag caaaagcctt tctcacttta acggcatgcc gaaaattatt gggcttatca 900 gatattgatt atactaatat tctaaatcag catctaaatg atgaaaagaa tgtatttcgt 960 gataacatac ttcctacact gtccaataaa ttttctaacc ctaattatgt aaaaactata 1020 ggtagtgata attatgcaaa agttatttta gaagctgaac caggatatgc tttagttgga 1080 tttgaaatta tcaatgatcg aatcccggta ttaaaagcgt ataaagctaa gctaaaacaa 1140 aattatcaag ttgatcatca gtcgttatca gagattgttt atttagatat cgataaacta 1200 ttttgtccaa aaaattctga acaaaaatat tatactaaaa gtctgacatt tcctgatggc 1260 tatgttatta ctaagattac ctttgaaaaa aagctgaaca acctaagata tgaggcaaca 1320 gcaaattttt atgacccatc tacaggagat attgatttaa atgagaagca agtggaatct 1380 acttttcttc aagcagatta tatttctata aatgttagtg atgatgatgg tgtttacatg 1440 ccgttaggcg ttatcagcga aacatttttg tctccaatta atagttttga attagaagtt 1500 gacgagaaat cgaaaatctt aactttaaca tgtaaatctt atttacgaga atatttatta 1560 gaatctgatt taataaataa agagacaagc ctcattgctc cgcctaatgt ttttatcagt 1620 aatatcgtag aaaattggaa catagaagcg gataatctag aaccatgggt agcaaataac 1680 aagaatgcat atgtcgatag tacaggcggc atagagggat ctaaagctct atttactcaa 1740 ggtgatgggg aattttcaca atttattgga gataaattaa aaccaaatac agattatatt 1800 attcaatata ctgtaaaagg aaaacctgct atttatttaa aaaacaaaaa tactggatat 1860 actatgtacg aagatacaaa cggtagttct gaagaatttc aaactatagc tgtaaattat 1920 acttcagaaa ctgatccttc acaaacacat ttagttttta aaagtcaaag tggctatgag 1980 gcttgggggg acaactttat tattctagaa tgtaaggcat ttgaaactcc agaaggtcca 2040 gaattgataa aatttgatga ttggattagt tttggtacta cttacattag agatgatgta 2100 cttactatcg atccaagtcg tggaggttat tttagacaat ctcttaaatt agacagctat 2160 tcaacttata atttgagctt ttctttttct ggattatggg ctaaggttat tataaaaaat 2220 tcccacggag tagtattgtt tgaaaaagta agtcagcagt cttcatacgt agatattagt 2280 gaaagtttta ctaccacatc aaataaagaa ggatttttta tagaactaac gggcgatagt 2340 cgtggtggtt ttgggtcgtt ccgtgatttt tctatgaagg aaaagtttga ataa 2394 <210> 12 <211> 797 <212> PRT <213> Paenibacillus popilliae <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(797) <223> Amino Acid sequence of TIC7473 derived from the Paenibacillus popilliae strain DSC008493 coding sequence encoding TIC7473. <400> 12 Met Lys Gln Asn Asn Asn Phe Ser Val Arg Ala Leu Pro Ser 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Met Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His Asp Val Leu Ile 225 230 235 240 Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ala Glu Leu 245 250 255 Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu Ile Gly Lys Val 260 265 270 Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Cys Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu 275 280 285 Thr Leu Thr Ala Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser Asp Ile Asp Tyr 290 295 300 Thr Asn Ile Leu Asn Gln His Leu Asn Asp Glu Lys Asn Val Phe Arg 305 310 315 320 Asp Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Lys Phe Ser Asn Pro Asn Tyr 325 330 335 Val Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val Ile Leu Glu Ala 340 345 350 Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile Asn Asp Arg Ile 355 360 365 Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val 370 375 380 Asp His Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp Ile Asp Lys Leu 385 390 395 400 Phe Cys Pro Lys Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr Lys Ser Leu Thr 405 410 415 Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe Glu Lys Lys Leu 420 425 430 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gatattttta acatgatttt tggaacagat 120 acaggtgatc taacactaga agaagtttta aaaaatcaag agttacttta tgatatttct 180 ggtaaacttg aggggattag tggagaccta agtgagatta ttgcgcaggg aaatttgaat 240 acagaattag ctaaggaatt gctaaaaatc gctaatgagc agaacaacgt attaactgat 300 gttaataaca aactcaatgc gataaattcg atgctccaca tctatcttcc taaaattaca 360 aatatgttaa gcgatgttat gaaacagaat tatgctctga gtcttcaaat agaatatctc 420 agtaaacaac tacaggagat atcagataaa cttgatgtta ttaacttaaa tgtactcatt 480 aactctacac tcacagaaat cactcctgct tatcaacgta ttaaatatgt aaatgaaaaa 540 tttgatgaat taactcttgc tacagaaaaa actctaagag caaaacaagg tagcgaagac 600 attattgcta atgatactct tgaaaattta actgagctaa cagaactagc gaaaagtgta 660 acaaaaaatg acatggatag tttcgagttt tatctccata cattccatga tgtattgatt 720 ggcaataatt tatttggtcg ttcggcttta aaaacagctg cagaattgat tactaaagac 780 gagataaaga cgagtggaag tgagatagga aaagtttata gtttcttaat tgtactaact 840 tgtctacaag caaaagcctt tctcacttta acggcatgcc gaaaattatt gggcttatca 900 gatattgatt atactaatat tctaaatcag catctaaatg atgaaaagaa tgtatttcgt 960 gataacatac ttcctacact gtccaataaa ttttctaacc ctaattatgt aaaaactata 1020 ggtagtgata attatgcaaa agttatttta gaagctgaac caggatatgc tttagttgga 1080 tttgaaatta tcaatgatcg aatcccggta ttaaaagcgt ataaagctaa gctaaaacaa 1140 aattatcaag ttgatcatca gtcgttatca gagattgttt atttagatat cgataaacta 1200 ttttgtccaa aaaattctga acaaaaatat tatactaaaa gtctgacatt tcctgatggc 1260 tatgttatta ctaagattac ctttgaaaaa aagctgaaca acctaagata tgaggcaaca 1320 gcaaattttt atgacccatc tacaggagat attgatttaa atgagaagca agtggaatct 1380 acttttcttc aagcagatta tatttctata aatgttagtg atgatgatgg tgtttacatg 1440 ccgttaggcg ttatcagcga aacatttttg tctccaatta atagttttga attagaagtt 1500 gacgagaaat cgaaaatctt aactttaaca tgtaaatctt atttacgaga atatttatta 1560 gaatctgatt taataaataa agagacaagc ctcattgctc cgcctaatgt ttttatcagt 1620 aatatcgtag aaaattggaa catagaagcg gataatctag aaccatgggt agcaaataac 1680 aagaatgcat atgtcgatag tacaggcggc atagagggat ctaaagctct atttactcaa 1740 ggtgatgggg aattttcaca atttattgga gataaattaa aaccaaatac agattatatt 1800 attcaatata ctgtaaaagg aaaacctgct atttatttaa aaaacaaaaa tactggatat 1860 actatgtacg aagatacaaa cggtagttct gaagaatttc aaactatagc tgtaaattat 1920 acttcagaaa ctgatccttc acaaacacat ttagttttta aaagtcaaag tggctatgag 1980 gcttgggggg acaactttat tattctagaa tgtaaggcat ttgaaactcc agaaggtcca 2040 gaattgataa aatttgatga ttggattagt tttggtacta cttacattag agatgatgta 2100 cttactatcg atccaagtcg tggaggttat tttagacaat ctcttaaatt agacagctat 2160 tcaacttata atttgagctt ttctttttct ggattatggg ctaaggttat tataaaaaat 2220 tcccacggag tagtattgtt tgaaaaagta agtcagcagt cttcatacgt agatattagt 2280 gaaagtttta ctaccacatc aaataaagaa ggatttttta tagaactaac gggcgatagt 2340 cgtggtggtt ttgggtcgtt ccgtgatttt tctatgaagg aaaagtttga acaccaccat 2400 cacgctcacc atcactga 2418 <210> 14 <211> 805 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of a Histidine tagged TIC7473 protein. <400> 14 Met Lys Gln Asn Asn Asn Phe Ser Val Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile 1 5 10 15 Asp Val Phe Asn Gly Ile Tyr Asp Phe Ala Thr Gly Ile Gln Asp Ile 20 25 30 Phe Asn Met Ile Phe Gly Thr Asp Thr Gly Asp Leu Thr Leu Glu Glu 35 40 45 Val Leu Lys Asn Gln Glu Leu Leu Tyr Asp Ile Ser Gly Lys Leu Glu 50 55 60 Gly Ile Ser Gly Asp Leu Ser Glu Ile Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn 65 70 75 80 Thr Glu Leu Ala Lys Glu Leu Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Asn 85 90 95 Val Leu Thr Asp Val Asn Asn Lys Leu Asn Ala Ile Asn Ser Met Leu 100 105 110 His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Asn Met Leu Ser Asp Val Met Lys 115 120 125 Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu 130 135 140 Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val Leu Ile 145 150 155 160 Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr 165 170 175 Val Asn Glu Lys Phe Asp Glu Leu Thr Leu Ala Thr Glu Lys Thr Leu 180 185 190 Arg Ala Lys Gln Gly Ser Glu Asp Ile Ile Ala Asn Asp Thr Leu Glu 195 200 205 Asn Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp 210 215 220 Met Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His Asp Val 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Paenibacillus popilliae strain DSC007648 encoding TIC7472. <400> 15 atggctaagc agaacaacaa cttcagcgtg cgggcgctcc cgtccttcat cgacgtcttc 60 aacggcatct acgacttcgc cacgggcatc caggacatct tcaacatgat ctttgggacg 120 gataccggcg acctcaccct cgaagaagtc cttaagaacc aggaactcct gtacgacatc 180 agcgggaagc tggagggcat ctcaggcgac ctgtcggaga tcatcgccca gggcaacctc 240 aacacggagc tcgccaagga actgcttaag atcgccaacg agcagaacaa cgttctgacc 300 gacgtcaaca acaagctcaa cgcgatcaac tccatgctcc acatctacct gccgaagatc 360 accaacatgc tgagcgacgt catgaagcag aactacgcgc tgtcgctcca gatcgagtat 420 ttgagcaagc agctccagga aatctcggac aagctcgacg tgataaacct gaacgtcctc 480 atcaactcca cgctgaccga gatcacaccc gcctaccagc gcatcaagta cgtcaacgag 540 aagttcgacg agctgacgct ggcgaccgag aagaccctgc gggcgaagca aggcagcgag 600 gacattattg cgaacgacac gcttgagaat ctcacggagc tgactgagct ggcgaagtcc 660 gtgaccaaga acgacatgga ctcgttcgag ttctacctac acacctttca tgacgtcctg 720 atcgggaaca acctcttcgg gcgcagcgcg ctcaagaccg ctgcggagct tatcacgaag 780 gacgagatca agacctccgg ctcggagatc gggaaggtgt acagcttcct gatcgtgttg 840 acgtgcctcc aggccaaggc gttcctcacg ctcactgcct gccggaagct cttgggcctc 900 tcagacatcg actacacgaa catcctcaac cagcacctca acgacgagaa gaacgtcttc 960 cgcgacaaca tccttccgac gctttcgaat aagttcagca acccgaacta cgtgaagacc 1020 atcggcagcg ataactacgc gaaggtgata ctggaggcgg agcccggcta cgccctggtc 1080 ggcttcgaga tcattaacga ccgtatcccg gtcctcaagg cgtacaaggc caagctcaag 1140 cagaactacc aagtggacca ccagtccctc tccgagatcg tgtacctgga catcgacaag 1200 ctgttctgcc cgaagaacag cgagcagaag tactacacca agtcgctgac cttcccggac 1260 gggtacgtca tcacaaagat cactttcgag aagaagctga acaacctgcg ctacgaggcg 1320 acggcgaact tctacgaccc gagcaccggt gacatcgacc tgaacgagaa gcaagtggag 1380 tccacgttcc tccaggcgga ctacatctct atcaacgtga gcgacgacga cggcgtgtac 1440 atgccgctgg gcgtcatctc cgagaccttc ctctctccca tcaactcgtt cgagcttgaa 1500 gtggacgaga aatcgaagat cctgacgctg acctgcaaga gctacctgcg cgagtacctg 1560 ctggagtccg acctcatcaa caaggagacc agcctgatcg cgccgcctaa tgtgttcatc 1620 agcaacatcg tggagaactg gaacatcgag gccgacaatt tggaaccctg ggtcgccaac 1680 aacaagaacg cctacgtgga cagcacgggc ggcatcgagg gctccaaggc cctgtttacc 1740 cagggagacg gcgagttcag tcagttcatc ggcgacaagc tcaagcccaa cacggactac 1800 atcatccagt acaccgtcaa agggaagcct gcgatctacc tcaagaacaa gaacaccgga 1860 tacacgatgt acgaggacac caacggctcc tcggaggagt tccagaccat cgcggtgaac 1920 tacacctccg agacggaccc gtcccagacg cacctcgtgt tcaagtccca gtcaggctac 1980 gaagcgtggg gtgacaactt tatcatcctg gagtgcaagg cgttcgagac gcccgagggc 2040 ccggaactca tcaagttcga cgactggatc tcattcggca ccacgtacat ccgggacgac 2100 gtcctcacca tcgacccgtc tcgcggcggc tacttccgcc agtccctcaa gctcgactcg 2160 tacagcacgt acaacctgtc cttctctttc agcgggctgt gggccaaggt catcatcaag 2220 aactcgcatg gcgtcgtcct cttcgagaag gtgtcccagc agagttccta cgtggacatc 2280 aacgagagct tcacgacgac gtccaacaag gagggattct tcatcgagct gaccggcgac 2340 agtcgcggag gcttcgggag cttccgggac ttctccatga aggagaagtt cgagtag 2397 <210> 16 <211> 798 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of TIC7472PL encoded by a synthetic DNA sequence wherein an additional Alanine residue has been inserted at position 2 relative to the bacterial TIC7472 amino acid sequence. <400> 16 Met Ala Lys Gln Asn Asn Asn Phe Ser Val Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 Ile Asp Val Phe Asn Gly Ile Tyr Asp Phe Ala Thr Gly Ile Gln Asp 20 25 30 Ile Phe Asn Met Ile Phe Gly Thr Asp Thr Gly Asp Leu Thr Leu Glu 35 40 45 Glu Val Leu Lys Asn Gln Glu Leu Leu Tyr Asp Ile Ser Gly Lys Leu 50 55 60 Glu Gly Ile Ser Gly Asp Leu Ser Glu Ile Ile Ala Gln Gly Asn Leu 65 70 75 80 Asn Thr Glu Leu Ala Lys Glu Leu Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn 85 90 95 Asn Val Leu Thr Asp Val Asn Asn Lys Leu Asn Ala Ile Asn Ser Met 100 105 110 Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Asn Met Leu Ser Asp Val Met 115 120 125 Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln 130 135 140 Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val Leu 145 150 155 160 Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys 165 170 175 Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Glu Leu Thr Leu Ala Thr Glu Lys Thr 180 185 190 Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ser Glu Asp Ile Ile Ala Asn Asp Thr Leu 195 200 205 Glu Asn Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn 210 215 220 Asp Met Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His Asp Val Leu 225 230 235 240 Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ala Glu 245 250 255 Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu Ile Gly Lys 260 265 270 Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Cys Leu Gln Ala Lys Ala Phe 275 280 285 Leu Thr Leu Thr Ala Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser Asp Ile Asp 290 295 300 Tyr Thr Asn Ile Leu Asn Gln His Leu Asn Asp Glu Lys Asn Val Phe 305 310 315 320 Arg Asp Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Lys Phe Ser Asn Pro Asn 325 330 335 Tyr Val Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val Ile Leu Glu 340 345 350 Ala Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile Asn Asp Arg 355 360 365 Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln 370 375 380 Val Asp His Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp Ile Asp Lys 385 390 395 400 Leu Phe Cys Pro Lys Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr Lys Ser Leu 405 410 415 Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe Glu Lys Lys 420 425 430 Leu Asn Asn Leu Arg Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Pro Ser 435 440 445 Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Glu Lys Gln Val Glu Ser Thr Phe Leu 450 455 460 Gln Ala Asp Tyr Ile Ser Ile Asn Val Ser Asp Asp Asp Gly Val Tyr 465 470 475 480 Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Ser Pro Ile Asn Ser 485 490 495 Phe Glu Leu Glu Val Asp Glu Lys Ser Lys Ile Leu Thr Leu Thr Cys 500 505 510 Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu Ile Asn Lys 515 520 525 Glu Thr Ser Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser Asn Ile Val 530 535 540 Glu Asn Trp Asn Ile Glu Ala Asp Asn Leu Glu Pro Trp Val Ala Asn 545 550 555 560 Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Ser Thr Gly Gly Ile Glu Gly Ser Lys 565 570 575 Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp 580 585 590 Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly 595 600 605 Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Asn Thr Gly Tyr Thr Met Tyr 610 615 620 Glu Asp Thr Asn Gly Ser Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile Ala Val Asn 625 630 635 640 Tyr Thr Ser Glu Thr Asp Pro Ser Gln Thr His Leu Val Phe Lys Ser 645 650 655 Gln Ser Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Cys 660 665 670 Lys Ala Phe Glu Thr Pro Glu Gly Pro Glu Leu Ile Lys Phe Asp Asp 675 680 685 Trp Ile Ser Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Arg Asp Asp Val Leu Thr Ile 690 695 700 Asp Pro Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Lys Leu Asp Ser 705 710 715 720 Tyr Ser Thr Tyr Asn Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu Trp Ala Lys 725 730 735 Val Ile Ile Lys Asn Ser His Gly Val Val Leu Phe Glu Lys Val Ser 740 745 750 Gln Gln Ser Ser Tyr Val Asp Ile Asn Glu Ser Phe Thr Thr Thr Ser 755 760 765 Asn Lys Glu Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Gly Asp Ser Arg Gly Gly 770 775 780 Phe Gly Ser Phe Arg Asp Phe Ser Met Lys Glu Lys Phe Glu 785 790 795 <210> 17 <211> 2397 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA sequence designed for plant expression encoding TIC7473PL with an additional Alinine residue inserted at position 2 relative to the bacterial TIC7473 amino acid sequence derived from Paenibacillus popilliae strain DSC008493 encoding TIC7473. <400> 17 atggctaagc agaacaacaa cttcagtgtc cgcgccctgc cctccttcat tgacgtcttc 60 aacggcatct acgacttcgc taccggcatc caggacatct tcaacatgat ctttggaacg 120 gataccggcg acctgacgct ggaggaggtg ctcaagaacc aggagctgct ctacgacatc 180 tccgggaagc tggagggcat ctccggcgac ctgtcggaga tcatcgccca gggcaacctc 240 aacacggagt tagccaaaga gctgctcaag atcgccaacg agcagaacaa cgtcctgacc 300 gacgtgaaca acaagctcaa cgccatcaac tccatgctcc acatctacct cccgaagatc 360 accaacatgc tctccgacgt catgaagcag aactacgccc tcagcctcca gatcgagtac 420 ctctccaagc agctacagga gatttccgac aagctggacg tcatcaacct gaacgtcctc 480 atcaattcga cgctcaccga gatcactccg gcgtaccagc gcatcaagta cgtgaacgag 540 aagttcgacg agctgacgct ggcgactgag aagaccctcc gcgccaaaca gggcagcgag 600 gacatcatcg ctaacgacac gctggagaac ctgacggaac tcacggagct ggccaagtcc 660 gtgaccaaga acgacatgga cagcttcgag ttctacctgc atacgttcca cgacgtgctc 720 atcggcaaca acctgttcgg ccgctccgcc ctcaagacgg ccgccgagct gattacaaag 780 gacgagatca agacgagcgg ctcggagatc ggcaaggtgt acagtttcct gatcgtcctg 840 acctgtctcc aggctaaggc gttcctgacg ctaaccgcct gccggaagct cctgggcctc 900 agcgacatcg actacaccaa catcctgaac cagcacctga acgacgagaa gaacgtcttc 960 cgcgacaaca tcctgcccac actgtcgaac aagttctcaa acccgaacta cgtgaagacc 1020 atcgggagcg acaactacgc caaggtgatc ctggaggccg agccgggcta cgcgctggtg 1080 ggcttcgaga tcatcaacga ccgcatcccg gtcctcaagg cgtacaaggc gaagctcaag 1140 cagaactacc aagtggacca ccagagccta tccgagatcg tgtacctgga catcgacaaa 1200 ctgttctgcc cgaagaactc cgagcagaag tactacacca agtcgctcac cttcccggac 1260 ggctacgtca tcaccaagat cacgttcgag aagaagctca acaacctgcg ttacgaggcg 1320 accgccaact tctacgaccc gtccaccggc gacatcgacc ttaacgagaa gcaagtcgag 1380 agcaccttcc tccaggccga ctacatctcc atcaacgtct cggacgacga cggcgtgtac 1440 atgccgctgg gcgtcatctc cgagaccttc ctgagcccga tcaacagctt cgagctggag 1500 gtggacgaga agtccaagat cctgacccta acgtgcaaga gctacctcag ggagtacctc 1560 ctggagtccg acctcatcaa caaggagacg agcctgatcg cgcctccaaa cgtcttcatc 1620 agcaacattg tggagaactg gaacatcgag gcggacaacc tagaaccctg ggtggcgaac 1680 aacaagaacg cctacgtgga cagcaccggc ggcatcgagg gcagcaaagc actgttcact 1740 cagggtgacg gcgagttctc gcagttcatc ggcgacaagc tcaagccaaa caccgactac 1800 atcatccagt acacggtcaa gggcaagcct gctatctacc tcaagaacaa gaacaccggc 1860 tacacgatgt acgaggacac gaacgggtcc agcgaggagt tccagaccat cgccgtgaac 1920 tacaccagcg agaccgaccc gtcccagacc cacctcgtgt tcaagtcgca gagcgggtac 1980 gaggcttggg gagataactt cattatcctg gagtgcaagg cgttcgagac gccggaaggc 2040 ccggagctca tcaagttcga cgactggatc tcgttcggga ccacctacat ccgcgacgac 2100 gtgctcacca tcgacccgag ccgtggcggc tacttccgcc agtccttgaa actcgactcg 2160 tactcgacgt acaacctctc gttcagcttc tcgggcctct gggctaaggt catcatcaag 2220 aactcccacg gcgtcgtcct gttcgagaag gtgtcgcagc agagttcgta cgtggacatc 2280 tcggagtcct tcaccaccac cagcaacaag gagggcttct ttatcgagct cacgggcgac 2340 tcgcgcggcg gcttcggctc gttccgggac tttagtatga aggagaagtt cgagtag 2397 <210> 18 <211> 798 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of TIC7473PL encoded by a synthetic DNA sequence wherein an additional Alanine residue has been inserted at position 2 relative to the bacterial TIC7473 amino acid sequence. <400> 18 Met Ala Lys Gln Asn Asn Asn Phe Ser Val Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 Ile Asp Val Phe Asn Gly Ile Tyr Asp Phe Ala Thr Gly Ile Gln Asp 20 25 30 Ile Phe Asn Met Ile Phe Gly Thr Asp Thr Gly Asp Leu Thr Leu Glu 35 40 45 Glu Val Leu Lys Asn Gln Glu Leu Leu Tyr Asp Ile Ser Gly Lys Leu 50 55 60 Glu Gly Ile Ser Gly Asp Leu Ser Glu Ile Ile Ala Gln Gly Asn Leu 65 70 75 80 Asn Thr Glu Leu Ala Lys Glu Leu Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn 85 90 95 Asn Val Leu Thr Asp Val Asn Asn Lys Leu Asn Ala Ile Asn Ser Met 100 105 110 Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Asn Met Leu Ser Asp Val Met 115 120 125 Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln 130 135 140 Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val Leu 145 150 155 160 Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys 165 170 175 Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Glu Leu Thr Leu Ala Thr Glu Lys Thr 180 185 190 Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ser Glu Asp Ile Ile Ala Asn Asp Thr Leu 195 200 205 Glu Asn Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn 210 215 220 Asp Met Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His Asp Val Leu 225 230 235 240 Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ala Glu 245 250 255 Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu Ile Gly Lys 260 265 270 Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Cys Leu Gln Ala Lys Ala Phe 275 280 285 Leu Thr Leu Thr Ala Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser Asp Ile Asp 290 295 300 Tyr Thr Asn Ile Leu Asn Gln His Leu Asn Asp Glu Lys Asn Val Phe 305 310 315 320 Arg Asp Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Lys Phe Ser Asn Pro Asn 325 330 335 Tyr Val Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val Ile Leu Glu 340 345 350 Ala Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile Asn Asp Arg 355 360 365 Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln 370 375 380 Val Asp His Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp Ile Asp Lys 385 390 395 400 Leu Phe Cys Pro Lys Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr Lys Ser Leu 405 410 415 Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe Glu Lys Lys 420 425 430 Leu Asn Asn Leu Arg Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Pro Ser 435 440 445 Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Glu Lys Gln Val Glu Ser Thr Phe Leu 450 455 460 Gln Ala Asp Tyr Ile Ser Ile Asn Val Ser Asp Asp Asp Gly Val Tyr 465 470 475 480 Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Ser Pro Ile Asn Ser 485 490 495 Phe Glu Leu Glu Val Asp Glu Lys Ser Lys Ile Leu Thr Leu Thr Cys 500 505 510 Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu Ile Asn Lys 515 520 525 Glu Thr Ser Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser Asn Ile Val 530 535 540 Glu Asn Trp Asn Ile Glu Ala Asp Asn Leu Glu Pro Trp Val Ala Asn 545 550 555 560 Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Ser Thr Gly Gly Ile Glu Gly Ser Lys 565 570 575 Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp 580 585 590 Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly 595 600 605 Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Asn Thr Gly Tyr Thr Met Tyr 610 615 620 Glu Asp Thr Asn Gly Ser Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile Ala Val Asn 625 630 635 640 Tyr Thr Ser Glu Thr Asp Pro Ser Gln Thr His Leu Val Phe Lys Ser 645 650 655 Gln Ser Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Cys 660 665 670 Lys Ala Phe Glu Thr Pro Glu Gly Pro Glu Leu Ile Lys Phe Asp Asp 675 680 685 Trp Ile Ser Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Arg Asp Asp Val Leu Thr Ile 690 695 700 Asp Pro Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Lys Leu Asp Ser 705 710 715 720 Tyr Ser Thr Tyr Asn Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu Trp Ala Lys 725 730 735 Val Ile Ile Lys Asn Ser His Gly Val Val Leu Phe Glu Lys Val Ser 740 745 750 Gln Gln Ser Ser Tyr Val Asp Ile Ser Glu Ser Phe Thr Thr Thr Ser 755 760 765 Asn Lys Glu Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Gly Asp Ser Arg Gly Gly 770 775 780 Phe Gly Ser Phe Arg Asp Phe Ser Met Lys Glu Lys Phe Glu 785 790 795

Claims (29)

  1. 살충제 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자로서,
    상기 살충제 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 숙주 세포 내에 존재하는 것으로 규정되며, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 박테리아 숙주 세포가 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 바실러스(Bacillus), 브레비바실러스(Brevibacillus), 에케리치아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 및 에르비니아(Erwinia)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아의 속으로부터인 것인, 재조합 핵산 분자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 바실러스 종이 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)이며, 상기 브레비바실러스가 브레비바실러스 라테로스페로우스(Brevibacillus laterosperous)이며, 상기 에케리치아가 에케리치아 콜라이(Escherichia coli)인, 재조합 핵산 분자.
  5. 제2항에 있어서, 상기 식물 세포가 쌍자엽 또는 단자엽 식물 세포인, 재조합 핵산 분자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물 숙주 세포가 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 브래시카, 당근, 카사바, 카스토르, 콜리플라워, 샐러리, 병아리콩, 중국 양배추, 귤, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 목화, 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 호프, 부추, 상추, 테다 소나무, 조, 멜론, 너트, 귀리, 올리브, 양파, 관상용 식물(ornamental), 팜, 목초, 완두콩, 땅콩, 후추, 피젼피, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디에타 파인, 무, 평지씨, 벼, 근경, 호밀, 잇꽃, 관목, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕옥수수, 스위트 검, 고구마, 스위치풀, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디풀, 수박, 및 밀 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 핵산 분자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 나비목 곤충(Lepidopteran insect)에 대한 활성을 나타내는, 재조합 핵산 분자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 나비목 곤충이 벨벳 콩 애벌레(Velvet bean caterpillar), 사탕수수 천공벌레(sugarcane borer), 명충나방의 유충(Lesser cornstalk borer), 옥수수 이삭벌레(Corn earworm), 회색담배나방(Tobacco budworm), 대두 루퍼(Soybean looper), 검정 거염벌레(Black armyworm), 남부 거염벌레(Southern armyworm), 가을 거염벌레(Fall armyworm), 사탕무 거염벌레(Beet armyworm), 미국 다래벌레(American bollworm), 오리엔탈 잎 벌레(Oriental leaf worm), 분홍 다래벌레(Pink bollworm), 검거세미나방(Black cutworm), 남서부 조명충 나방(Southwestern Corn Borer), 목화 잎 벌레(cotton leaf worm), 배추좀나방(Diamond back moth), 반점 다래벌레(Spotted bollworm), 담배거세미나방(Tobacco cutworm), 서부 강남콩 거세미나방(Western bean cutworm) 및 유럽 조명충나방(European corn borer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 핵산 분자.
  9. 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는, 식물.
  10. 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는, 식물 부분.
  11. 제9항의 식물에 있어서, 상기 식물이 외떡잎 또는 쌍떡잎인, 식물.
  12. 제10항의 식물 부분에 있어서, 상기 식물 부분이 외떡잎 또는 쌍떡잎인, 식물 부분.
  13. 제9항의 식물에 있어서, 상기 식물이 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 당근, 카사바, 카스토르, 콜리플라워, 샐러리, 병아리콩, 중국 양배추, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 목화, 오이,미송,가지, 유칼립투스,아마,마늘,포도, 호프, 부추, 상추, 테다 소나무, 멜론, 너트, 귀리, 올리브, 양파, 팜, 목초, 완두콩, 땅콩, 후추, 피젼피, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디에타 파인, 무, 평지씨, 벼, 호밀, 잇꽃, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕옥수수, 스위트 검, 고구마, 스위치풀, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디풀, 수박, 및 밀로 이루어진 군으로부터 선택되는, 식물.
  14. 제9항의 상기 식물의 종자에 있어서, 상기 종자가 상기 재조합 핵산 분자를 포함하는, 식물의 종자.
  15. 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는, 곤충 저해 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 살충제 단백질과는 다른 적어도 하나의 다른 살충제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 곤충 저해 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다른 살충제가 곤충 저해 단백질 및 곤충 저해 dsRNA 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 곤충 저해 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다른 살충제가 나비목, 딱정벌레목, 또는 반시목 중 하나 이상의 해충 종에 대한 활성을 나타내는, 곤충 저해 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 살충제 단백질이 Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1, IP3, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657, 및 DIG-11 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 곤충 저해 조성물.
  20. 제15항에 있어서, 제1항의 재조합 핵산 분자를 발현시키는 식물 세포를 포함하는 것으로서 규정된, 곤충 저해 조성물.
  21. 제9항의 상기 식물, 또는 제10의 상기 식물 부분으로부터 생성된 상품(commodity product)으로서, 상기 상품은 검출 가능한 양의 상기 재조합 핵산 분자 또는 살충제 단백질을 포함하는, 상품.
  22. 제21항 있어서, 상기 상품은, 옥수수, 대두, 벼, 밀, 수수, 피젼피, 땅콩, 과일, 및 멜론으로 이루어지는 군에서 선택되는 식물에서 유래되는 플레이크, 케이크, 가루, 밀, 시럽, 오일, 사일리지, 전분, 및 시리얼로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 가공된 목화 종자, 목화 오일, 린트, 섬유, 페이퍼, 바이오매스, 연료 제품, 가공된 대두 종자, 대두유, 대두 단백질, 대두 밀, 대두 가루, 대두 플레이크, 대두 겨, 두유, 대두 치즈, 대두 와인, 대두를 포함하는 동물 사료, 대두를 포함하는 페이퍼, 대두를 포함하는 크림, 대두 바이오매스, 및 대두 식물을 사용하여 생성된 연료 생성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품.
  23. 종자를 생산하는 방법으로서,
    a. 제9항의 식물의 종자를 심는 단계;
    b. 상기 종자로부터 식물을 성장시키는 단계; 및
    c. 상기 식물로부터 종자를 수확하는 단계를 포함하고, 상기 수확된 종자는 상기 재조합 핵산 분자를 포함하는, 종자를 생산하는 방법.
  24. 곤충 침입(insect infestation)에 대해 내성적인 식물로서, 상기 식물의 세포는 제1항의 상기 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물.
  25. 나비목 종 해충 또는 해충 침입을 조절하는 방법으로서,
    상기 방법은
    a. 상기 해충을, 살충적 유효량의 서열번호 4의 살충제 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 나비목 종 해충 또는 해충 침입을 조절하는 방법.
  26. 단백질을 포함하는 샘플에서, 살충제 단백질의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 살충제 단백질은 서열번호 4의 상기 아미노산 서열을 포함하되,
    a. 상기 샘플을 면역반응성 항체와 접촉시키는 단계; 및
    b. 상기 살충제 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 단백질을 포함하는 샘플에서, 살충제 단백질의 존재를 검출하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 검출 단계가 ELISA, 또는 웨스턴 블롯(Western blot)을 포함하는, 단백질을 포함하는 샘플에서, 살충제 단백질의 존재를 검출하는 방법.
  28. 제15항에 있어서, 제1항의 살충제 단백질을 추가로 포함하는, 곤충 저해 조성물.
  29. 제10항의 식물 부분에 있어서, 상기 식물 부분이 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 당근, 카사바, 카스토르, 콜리플라워, 샐러리, 병아리콩, 중국 양배추, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 목화, 오이,미송,가지, 유칼립투스,아마,마늘,포도, 호프, 부추, 상추, 테다 소나무, 멜론, 너트, 귀리, 올리브, 양파, 팜, 목초, 완두콩, 땅콩, 후추, 피젼피, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디에타 파인, 무, 평지씨, 벼, 호밀, 잇꽃, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕옥수수, 스위트 검, 고구마, 스위치풀, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디풀, 수박, 및 밀로 이루어진 군으로부터 선택되는, 식물 부분.
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