CN101001957B - 质体转运肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供新型质体转运肽，其引导所连接的部分(例如多肽)定位于植物质体中。本发明还涉及将多肽定位于植物质体中的方法和组合物，其包括但不限于转基因植物生产。
Description
1.发明领域
总的来讲，本发明涉及蛋白靶向领域，提供引导所连接的多肽定位于植物质体中的肽。本发明还涉及将多肽定位于植物质体的方法和组合物，其包括但不限于转基因植物生产。
2.发明背景
质体转运肽是N-末端延伸物，其通过翻译后机制促进胞质合成的前体蛋白靶向和转运入质体中(Bruce的综述，Biochim.Biophys.Acta1541：2-21(2001))。随着现在整个拟南芥属(Arabidopsis)基因组测序的完成，估计在典型植物的一生中有超过3500种的不同蛋白被靶向入质体中。一直难以开发有关所有这些靶向序列如何起引导正确靶向作用的模型，因为它们在一级序列水平上就长度、组成和结构而言是高度分化的。仅可获得少数质体转运肽的二级和三级结构信息，并且结果显著不同，其取决于实验是在水性环境中还是在膜拟态环境中进行。因此，尚未清晰地描绘出共同的结构特征或特性。
将重组蛋白靶向转基因植物中的不同亚细胞区室的能力是植物基因工程的重要组成部分。例如，许多重要的植物生理过程发生在质体中，包括但不限于光合作用、脂肪酸合成、氨基酸合成、类胡萝卜素生物合成、类萜生物合成和淀粉生物合成。因此，需要将重组多肽靶向质体的能力，以调节或改变发生在质体中的生理过程。另外，某些多肽在胞质中重组表达时是有毒的。因为质体是亚细胞区室，所以有可能将重组多肽靶向质体，以使其与胞质隔离，由此允许较高的表达水平。而且，重组多肽在质体中的表达可能便于各种用途的多肽的分离。
3.发明概述
本发明涉及质体转运肽，其选自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57。除了SEQ ID NO：1-57的多肽序列以外，应当意识到，本发明的肽还包含其变体，其包括但不限于其任意片段、衍生物或类似物。
本发明还涉及编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID
NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQID NO：56和SEQ ID NO：57或其任意变体(例如任意片段、衍生物或类似物)中任一个的核酸分子。本发明还包括编码有质体转运功能活性(例如将所连接的部分导入质体中的能力)的肽并在严格条件下与编码SEQ ID NO：1-57中任一个的任意核酸分子杂交的核酸分子。
本发明还包括含本发明核酸分子的载体或表达盒。本发明还包括含本发明载体的细胞、植物或种子。
本发明还涉及表达本发明的核酸分子和/或肽的转基因植物。转基因植物可以本领域已知的任意方式表达转基因，包括但不限于组成型表达、由发育调节的表达、组织特异性表达等。本发明还包括得自本发明转基因植物的种子。
本发明还提供例如通过重组方法生产本发明的肽和/或含一种或多种本发明肽的多肽的方法。本发明还包括组合物，其含有本发明的一种或多种肽和/或含本发明的一种或多种肽的多肽。
本发明还提供通过将本发明的质体转运肽连接至目标多肽而将多肽靶向植物中的质体的方法。在某些实施方案中，该方法包括将编码本发明的质体转运肽的第一个核酸分子重组连接至编码目标多肽的第二个核酸分子，使得核酸分子的翻译产生融合多肽。
本发明包括鉴别质体转运肽的方法，其包括i)将包含编码候选质体转运肽的第一个核酸分子的载体导入到植物或植物细胞中，其中第一个核酸分子连接至编码仅在质体中有活性的多肽的第二个核酸分子，使得第一个和第二个核酸分子的翻译产生融合蛋白，和ii)根据多肽活性进行筛选，其中所述活性表明多肽定位于质体，则候选质体转运肽是有功能的。
3.1定义
“质体转运肽”指介导与其相连的氨基酸序列(例如作为融合多肽)靶向或定位于质体的氨基酸序列。
“质体”指植物细胞或某些原生生物的小双膜细胞器，其包含核糖体、DNA，并经常含有色素。质体可以未分化的形式(前质体)存在，又可以几种分化形式存在，包括但不限于叶绿体、黄化质体、造粉体、色质体、油质体和白色体。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非另有具体限制，否则该术语包括含天然核苷酸的已知类似物的核酸分子，其具有和参比核苷酸相似的结合特性，并以和天然核苷酸相似的方式代谢。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于含天然氨基酸残基的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基为对应天然氨基酸的人工化学模拟物(例如非标准氨基酸)的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物中的氨基酸残基一般通过共价肽键相连，但可通过本领域已知的任何其它方法连接。本文使用的这些术语包含任意长度的氨基酸聚合物，包括全长蛋白。
术语“氨基酸”指天然氨基酸、合成氨基酸以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸。氨基酸类似物包括但不限于经过后来修饰的天然氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。在本文中可以公知的3字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号指代氨基酸。
术语“启动子”指位于转录起点上游和/或下游的区域或序列，其参与识别和结合RNA聚合酶和其它蛋白，以启动转录。启动子包含转录起点附近的必需核酸序列，例如就聚合酶II型启动子来说包含TATA元件。启动子可选地还包含远端增强子或阻抑子元件，其可位于距转录起始位点多达数千个碱基对的位置。“组成型”启动
子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。术语“有效连接的”指核酸表达控制序列(例如启动子或一系列转录因子结合位点)和第二个核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列引导对应于第二个序列的核酸转录。
“载体”指能够在宿主细胞中独立于宿主染色体和/或整合入宿主染色体中复制的核酸分子。载体可为例如质粒，可具有复制起点和/或表达元件，例如转录/翻译起始子和终止子以及用于调节特定核酸分子表达的启动子。
“表达盒”指当导入宿主细胞中时导致对应于表达盒的至少一部分的RNA转录物转录并由该RNA转录物翻译肽或多肽的核酸分子。该核酸分子可包含转录起始密码子和/或终止密码子。
术语“植物”包括全株、植物地上部(shoot)营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)和细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)及其子代。可用于本发明方法的植物类别一般来说可宽泛至可经受转化技术的高等和低等植物类别，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。其包括各种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。
术语“Bt毒素”指分离自或源自苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)细菌的杀虫蛋白。该术语包括天然和非天然变体，包括天然Bt毒素的片段和修饰形式。(参见例如美国专利第6,489,542、5,281,530、5,322,932号；2005年2月25日提交的美国专利申请序号11/067,557；以及PCT公开号WO 92/04453)。
术语“重组体”指经过人工操作的多核苷酸、其拷贝或互补物。例如，含有效连接第二个多核苷酸的启动子的重组表达盒可包含由
于人工操作而可能与第二个多核苷酸异源的多核苷酸(例如通过在Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)或CurrentProtocols in Molecular Biology 1-3卷，John Wiley & Sons，Inc.(1994-1998)中描述的方法)。在另一个实例中，重组表达盒可包含以多核苷酸天然极不可能存在的方式组合的多核苷酸。例如，经人工操作的限制位点或质粒载体序列可位于第二个多核苷酸的启动子侧翼或将该启动子与第二个多核苷酸分开。技术人员会认识到，多核苷酸可以多种方式操作，不限于以上实例。
术语“变体多肽”指与SEQ ID NO：1-57中的任一个相关但在某些方面已被改变(例如缺失/添加一个或多个残基，或产生衍生或类似多肽)的多肽。在某些实施方案中，变体多肽与未改变的多肽相比具有至少50％、60％、70％、75％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的至少部分质体转运功能活性(例如将所连接的部分导入质体中的能力)。在其它实施方案中，变体多肽与未改变的多肽相比具有相同或更佳的质体转运功能活性。一般来说，构建变体多肽是为了加强质体转运肽或含质体转运肽的多肽的所需特征(例如增加靶向效力、赋予质体特异性、使转录和/或翻译更有效)或降低其不需要的特征(例如降解敏感性)。变体多肽不包括任何天然质体转运肽。
本领域中可获得并描述了各种不同的生产方案。参见例如Ling等(1997)Anal Biochem.254(2)：157-178；Dale等(1996)Methods Mol.Biol.57：369-374；美国专利第5,605,793号、美国专利第5,811,238号、美国专利第5,830,721号、美国专利第5,834,252号、美国专利第5,837,458号、WO 95/22625、WO 96/33207、WO 97/20078、WO97/35966、WO 99/41402、WO 99/41383、WO 99/41369、EP 752008、EP 0932670、WO 99/23107、WO 99/21979、WO 98/31837、WO98/27230、WO 98/13487、WO 00/09679、WO 98/42832、WO 99/29902、WO 98/41653、WO 98/41622、WO 00/42561、WO 00/42560、WO
01/75767和WO 98/42727。
术语“衍生多肽”指与SEQ ID NO：1-57中的任一个相关的多肽，但其已通过一个或多个氨基酸残基改变而被改变，不过仍保留至少部分质体转运功能活性。在某些实施方案中，被取代的氨基酸残基是化学上相似的氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守置换列表在本领域众所周知(参见例如Creighton，Proteins(1984))。例如，以下的6组各自包含彼此间为保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。在其它实施方案中，被置换的氨基酸残基不是保守置换。衍生多肽与未改变多肽相比，其具有的被改变残基可低于30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、1％。
可通过定向分子进化技术之类的标准技术导入序列改变，例如DNA改组(参见例如Christians等，1999，Nature Biotechnology 17：259-264；Crameri等，1998，Nature，391：288-291；Crameri等，1997，NatureBiotechnology 15：436-438；Crameri等，1996，Nature Biotechnology14：315-319；Stemmer，1994，Nature 370：389-391；Stemmer等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，91：10747-10751；美国专利第5,605,793、6,117,679、6,132,970、5,939,250、5,965,408、6,171,820号；国际公开号WO 95/22625、WO 97/0078、WO 97/35966、WO 98/27230、WO00/42651和WO 01/75767)；定点诱变(参见例如Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，82：488-492；Oliphant等，1986，Gene 44：177-183)；寡核苷酸定向诱变(参见例如Reidhaar-Olson等，1988，Science 241：53-57)；化学诱变(参见例如Eckert等，1987，Mutat.Res.178：1-10)；易错PCR(参见例如Caldwell & Joyce，1992，PCR Methods Applic.2：28-33)；和盒式诱变(参见例如Arkin等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1992，89：7871-7815)；(一般参见例如Arnold，1993，Curr.Opinion Biotechnol.
4：450-455；Ling等，1997，Anal.Biochem.，254(2)：157-78；Dale等，1996，Methods Mol.Biol.57：369-74；Smith，1985，Ann.Rev.Genet.19：423-462；Botstein等，1985，Science，229：1193-1201；Carter，1986，Biochem.J.237：1-7；Kramer等，1984，Cell 38：879-887；Wells等，1985，Gene34：315-323；Minshull等，1999，Current Opinion in Chemical Biology3：284-290)。
另外，可全部或部分地对编码衍生多肽的核酸分子进行密码子优化。因为任一个氨基酸(甲硫氨酸除外)都由多个密码子编码，所以可改变核酸分子的序列，而不改变所编码的氨基酸。密码子优化是当一个或多个密码子被改变时，在核酸水平上与特定宿主的密码子选择一致或更接近。可通过将宿主细胞表达的大量基因中的优选密码子选择的频率平均，计算宿主细胞具有的优选密码子选择频率。该分析可能受限于宿主细胞高度表达的基因。例如，美国专利第5,824,864号借助于双子叶植物和单子叶植物具有的高表达基因提供了密码子选择频率。本领域普通技术人员知道，本领域可获得提供广泛生物的优选信息的表和其它参考资料。
术语“类似多肽”指所具有的残基已被修饰(即通过共价连接任意类型的分子)的多肽。例如但非限制性地，例如可通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、利用已知的保护/封闭基团衍化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其它蛋白等，修饰类似多肽。可使用本领域技术人员已知的技术，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等，通过化学修饰来修饰类似多肽。而且，多肽类似物可包含一个或多个非标准氨基酸。
术语“同一性”在与核酸分子和多肽关联时，指在如下所述对比最大对应性时具有相同残基的两个序列。
术语“同一性百分率”在与核酸分子和多肽关联时，指在对比窗内比较和比对最大对应性时两个序列中相同残基的百分率，其使用以下序列比较算法中的一种或通过人工比对和目测进行检测。
当序列同一性百分率用于指示蛋白或肽时，一般认为不相同的残基位置通常差别在于其中氨基酸残基置换具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基的保守氨基酸置换，因此不改变分子的功能特性。当序列差别在于保守置换时，可上调序列同一性百分率，以修正置换的保守特性。进行此调整的方法对本领域技术人员来说众所周知。通常，其包括将保守置换记录为部分错配而不是完全错配，由此增加序列同一性百分率。因此，例如，当相同氨基酸分值为1和非保守置换分值为0时，保守置换分值在0和1之间。按照例如Meyers和Miller，Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17(1988)的算法，如在PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)程序中执行，计算保守置换的分值。
当序列同一性百分率用于指示核酸分子时，可使用本领域已知的任意方法。例如可通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性检索法、这些算法的计算机化工具(在Wisconsin Genetics Software Package(遗传分析软件包)，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过人工比对和目检，对用于比较的序列进行最优比对。
适于测定序列同一性和序列相似性百分率的一个算法实例是BLAST算法，其描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。实施BLAST分析的软件公众可由the National Center for BiotechnologyInformation(美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。该算法包括鉴别查询序列中长度W的短字串，其在与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足一定的正值阈值T，由此首先鉴别高分值序列对(HSP)。T被称为邻近字串阈值(Altschul等，出处同上)。这些初始邻近字串选中充当启动检索的种子，以查找包含
其的更长的HSP。字串选中在两个方向上沿着每个序列延伸，直到累积的比对分值可增加为止。当：累积比对分值由其最大实现值跌至值X时；累积分值由于累积了一个或多个负分残基比对而达到0以下时；或达到任一个序列的末端时，命中字串在各个方向的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序默认使用字长(W)11、BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1989)10915(1989))比对值(B)50、期望阈值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链对比。
BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见例如Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性检测是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸序列或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率示值。例如，如果测试核酸与参比核酸对比中的最小和概率低于约0.2，更优选低于约0.01，最优选低于约0.001，则认为该核酸与参比序列相似。
术语“严格条件”与核酸杂交关联时指这样的杂交条件：在该条件下，核酸分子与通常在核酸分子的复杂混合物中的其靶核酸分子杂交，但基本上不与其它核酸杂交。严格条件是序列依赖性的，在不同环境中是不同的。较长核酸在较高温度特异性杂交。在本领域可获得关于核酸杂交的全面指引(例如Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”(1993))。一般来说，高严格条件选定为比特定核酸在限定离子强度、pH下的热解链温度(Tm)低约5-10℃。低严格条件选定为一般在Tm下约15-30℃。Tm是处于平衡状态时(因为靶核酸过量存在，所以在Tm时，平衡状态下50％的探针被占据)与靶互补的探针中有50％与靶核酸杂交的温度(在限定离子强度、pH和核酸浓度下)。严格条件通常为：在pH7.0-8.3下，盐浓度低于约1.0M钠离子浓度(或其它盐)，通常约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，对于短探针(例
如10-50个核苷酸)，温度为至少约30℃，对于长探针(例如超过50个核苷酸)，温度为至少约60℃。严格条件还可通过加入去稳定剂(例如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号为至少2倍背景杂交，优选为10倍背景杂交。在一个实施方案中，严格条件包括在至少约50℃的温度(通常约55℃，或有时为60℃或65℃)以0.2×SSC进行至少1次(通常2次)20分钟的漂洗或基本相同的条件。在一个具体的实施方案中，本发明的核酸分子在55℃以0.2×SSC进行至少1次20分钟的漂洗之后，与编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57中任一个的核酸分子特异性杂交。在另一个实施方案中，严格条件包括在约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在50-65℃以0.2X SSC、0.1％SDS进行一次或多次漂洗。
表述“特异性杂交”指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下某分子仅与该序列结合、双链化或杂交。
术语“基本相似的”当用于关联质体转运肽功能活性时，指两种质体转运肽具有彼此相似的活性水平。在某些实施方案中，当经实验检测，质体转运肽活性彼此相距1个标准偏差或更少时，所述质体转运肽具有基本相似的活性。在其它实施方案中，经同一实验检测，一种肽活性为另一种肽活性的至少75％、80％、85％、90％、95％、99％时，质体转运肽具有基本相似的活性。
4.发明详述
本发明提供质体转运肽。还提供编码本发明多肽的核酸分子。本发明包括使用本发明的肽和核酸分子将多肽靶向植物质体(例如叶绿体、黄化质体、造粉体、色质体、油质体和白色体)的方法。
4.1本发明的多肽
本发明涉及质体转运肽，其选自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57。除了SEQ ID NO：1-57的多肽序列以外，应当意识到，本发明的肽还包含其变体，包括但不限于其任意片段、衍生物或类似物。在优选的实施方案中，变体质体转运肽和非变体质体转运肽相比，具有基本相似的或改善的活性。
在一个实施方案中，本发明包含的肽具有质体转运功能活性(例如将所连接的部分导入质体中的能力)，并与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57中任一个的肽序列至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
在另一个实施方案中，本发明包含的肽具有质体转运功能活性(例如将所连接的部分导入质体中的能力)，并为含SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID
NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57中任一个的至少70％、75％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的连续氨基酸残基的片段。
在另一个实施方案中，本发明包含的肽具有质体转运功能活性(例如将所连接的部分导入质体中的能力)，并由含下列核苷酸序列的核酸分子编码，其中所述核苷酸序列与编码SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57中任一个的任意核酸分子至少95％相同。
本发明提供例如通过重组方法生产本发明肽和/或含本发明肽的多肽的方法(参见4.6节)。
本发明还包括组合物，其含有本发明的一种或多种肽和/或含本发明肽的多肽。本发明的组合物可进一步包含另外的物质，其包括但不限于粘展剂助剂、稳定剂、稀释剂、优化组合物的流变性或稳定性的物质，例如表面活性剂、乳化剂、分散剂和/或聚合物。
4.2融合多肽
本发明提供通过将本发明的质体转运肽连接至目标多肽而将多肽靶向植物质体的方法。在优选的实施方案中，该方法包括将编码本发明质体转运肽的第一个核酸分子重组连接至编码目标多肽的第二个核酸分子，使得核酸分子的翻译产生融合多肽。融合多肽也包括在本发明中。
质体转运肽一般N-末端融合至目标多肽(例如融合配偶体)。在一个实施方案中，融合蛋白基本由质体转运肽和目标多肽组成。在另一个实施方案中，融合蛋白包含质体转运肽和目标多肽。在这样的实施方案中，质体转运肽优选位于融合蛋白的N-末端。但是，另外的氨基酸残基可位于质体转运肽的N-末端，前提是融合蛋白至少部分地被靶向质体。在具体的实施方案中，质体转运肽位于融合蛋白N末端的1/2、N末端的1/3或N末端的1/4。
一般来说，大部分或全部质体转运肽在插入到质体中时被由融合蛋白上切割下来。在不同的植物发育阶段，由于具体的胞间条件或所使用的转运肽/融合配偶体特定组合，切割位置在植物物种之间可能稍微有变化。在一个实施方案中，质体转运肽切割是均一的，使得融合蛋白群中的切割位点是相同的。在另一个实施方案中，质体转运肽是非均一的，使得融合蛋白群中的切割位点变化1-10个氨基酸。
质体转运肽可以几种方式中的一种重组融合至第二种蛋白。例如，可将限制性核酸内切酶识别位点导入到转运肽的核苷酸序列中对应于其C-末端的位置，并可将相同或相容的位点工程入目标蛋白
核苷酸序列中的其N-末端。必须小心设计这些位点，以确保转运肽的编码序列和第二种蛋白“按照读框”保持，以允许所需融合蛋白的合成。在某些情况下，优选可在导入新限制位点时，去除第二种蛋白的起始子甲硫氨酸密码子。通过重组DNA技术在两个亲代分子上导入限制性内切核酸酶识别位点及随后将其连接，可导致在转运肽和第二种蛋白之间加入一个或多个额外的氨基酸。这一般不影响靶向活性，只要转运肽切割位点仍可及，并且在第二种蛋白的N-末端加入这些额外的氨基酸并不改变其功能。或者，本领域技术人员可使用基因合成(Stemmer等，Gene 164：49-53(1995))或相似的方法，在转运肽和第二种蛋白(有或没有其起始子甲硫氨酸)之间建立精确的融合。
另外，转运肽融合体可有意地包括切割位点下游的氨基酸。成熟蛋白N末端的氨基酸可影响转运肽将蛋白靶向质体的能力和/或蛋白进入后的切割效力。这可能取决于目标蛋白。参见例如Comai等，JBiol.Chem.263(29)：15104-9(1988)。
融合配偶体(例如目标多肽)可为需要定位质体的任何多肽。融合配偶体可为全长蛋白(例如以其天然存在的形式)，或者可为该蛋白的修饰形式(例如其部分或片段、变体或其它非天然形式的蛋白)。融合配偶体可来自任何生物，包括但不限于细菌、藻类、酵母、植物、动物以及合成蛋白。例如，可包含在融合蛋白中的多肽包括但不限于Bt毒素蛋白(参见例如美国专利第6,489,542、5,281,530、5,322,932号；2005年2月25日提交的美国专利申请序号11/067,557；和PCT公开号WO 92/04453)；5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP合酶)(参见例如美国专利第4,971,908、6,225,114号)；草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)(参见例如美国专利申请第2003/0083480号)；乙酰乳酸合酶(ALS)(参见例如美国专利5,013,659)；修饰质体中存在的生理过程(例如光合作用或脂肪酸、氨基酸、油、类胡罗卜素、类萜、淀粉组成/合成)的酶，包括但不限于核酮糖1，5-二磷酸羧化/加氧酶、核酮糖
1，5-二磷酸羧化/加氧酶活化酶、脂肪酸合酶、脂肪酸去饱和酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素去饱和酶、淀粉合酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶。
不同的质体转运肽当与不同的融合配偶体组合使用时，具有不同程度的效力(例如较高的靶向融合配偶体对非靶向融合配偶体比率)。可使用例如4.4节描述的实验，凭经验确定与特定融合配偶体组合使用的具体质体转运肽。
4.3本发明的核酸分子
本发明还涉及编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ IDNO：57中任一个或其任意变体(例如任意片段、衍生物或类似物)的核酸分子。
在一个实施方案中，本发明包括的核酸分子具有质体转运功能活性(例如将所连接的部分导入质体中的能力)，并在严格条件下与编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID
NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57中任一个的任意核酸分子杂交。
在另一个实施方案中，本发明包括的核酸分子具有质体转运功能活性(例如将所连接的部分导入质体中的能力)，并为含有编码SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID
NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57中任一个的任意核酸分子的至少70％、75％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的连续核酸残基的片段。
在另一个实施方案中，本发明包括的核酸分子具有质体转运功能活性(例如将所连接的部分导入质体中的能力)，并包含编码肽的核苷酸序列，其中所述肽与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ IDNO：57中任一个的氨基酸序列至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
在另一个实施方案中，本发明包括的核酸分子具有质体转运功能活性(例如将所连接的部分导入质体中的能力)，并包含与编码SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID
NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57中任一个的任意核酸分子至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
本发明还包括含本发明的核酸分子的载体或表达盒(参见4.6节)。本发明还包括含本发明载体的细胞、植物或种子(参见4.7节)。
4.4检测质体转运肽活性的方法
可通过本领域已知的任意方法检测质体转运肽功能或活性(参见例如Lee等，2002，Mol.Cells.14：388-97；Archer和Keegstra，1993，PlantMol Biol.23：1105-15；Reiss等，1989，Proc Natl Acad Sci USA.86：886-90；Rensink等，1998，Plant Physiol.118：691-9；Kindle和Lawrence，1998，Plant Physiol.116：1179-90；Jin等，2003，Plant Mol Biol.51：493-507)。本文使用的质体转运肽活性或功能指质体转运肽将所连接的部分(例如多肽)导入质体的能力。当连接至功能性质体转运肽时，所连接的部分在一种或多种质体中富集(例如与未连接至质体转运肽的部分相比富集达至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％)。
通常，将质体转运肽的活性与阳性对照(即已知靶向特定融合配偶体的转运肽)和/或阴性对照(即没有质体转运肽或含无功能质体转运
肽的多肽)对比。分析转运肽活性的实验可包括但不限于在候选质体转运肽和融合配偶体多肽之间建立重组融合，并在植物或植物细胞中表达融合体。
在一个实施方案中，融合多肽仅在或基本上仅在质体中起作用；因此，利用融合配偶体的功能性测定融合配偶体的质体定位。在一个具体的实施方案中，测定融合配偶体的酶活性(例如通过产生比色分析品或其它容易检测的产物)。例如，可将赖氨酸脱羧酶靶向质体，监测尸胺的累积，作为酶靶向效力的指示(参见例如Herminghaus等，1991，Plant Mol.Biol.17：475-486和Herminghaus等，1996，TransgenicResearch 5：193-201)。可检测L-色氨酸利用被靶向质体的色氨酸脱羧酶向色胺的转变，作为酶靶向效力的指示(参见例如Fiore等，2002，Plant Physiol.129：1160-1169)。可检验存在的类胡萝卜素色素分布的变化或非天然类胡萝卜素的累积，作为各种类胡萝卜素生物合成酶的正确靶向和活性的指示(参见例如Kumagai等，1998，Plant J 14：305-315)。
在另一个实施方案中，融合多肽发荧光；因此，使用例如荧光显微镜，通过监测质体中的荧光累积，测定融合配偶体的质体定位。优选的荧光蛋白是绿色荧光蛋白及其变体(参见例如Nakrieko等，2004，Eur J Biochem.271：509-516；Belluci等，2003，Plant Cell Rep.22：328-337；Chiu等，1996，Curr Biol.6：325-330)。
在另一个实施方案中，通过测定融合配偶体的大小确定融合配偶体的质体定位。当融合体插入到质体中时，质体转运肽通常完整或部分地被切下来。如果质体转运肽包含可及的切割位点作为融合蛋白的一部分，则质体转运肽将被切下，多肽的长度将降低，并因此降低多肽的分子量。如果切割位点的序列不容易接近，(例如如果周围的序列阻止切割位点的正确识别或者如果融合蛋白以使基质蛋白酶不能接近切割位点的方式折叠)，则切割将无效，并可能发生在一个或多个替代位置。尽管在此情况下经加工的融合配偶体多肽长
度会稍微变化，但其仍比未经加工的多肽降低了长度和分子量。
在另一个实施方案中，从植物组织中分离出质体，然后分析融合配偶体多肽的存在情况。可使用本领域已知的任意多肽检测方法测试融合配偶体的存在情况，这些方法包括免疫印迹、免疫沉淀、ELISA或检测融合配偶体的性状(例如荧光或酶活性)。
如果在以上实验中终产物生产水平、质体内部的荧光蛋白累积或成熟蛋白累积超过阴性对照，则认为转运肽是有功能的。如果以上参数达到或超过阳性对照所达到水平的50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％，则认为质体转运肽是有效力的。在一个实施方案中，用作阳性对照的质体转运肽是核酮糖二磷酸羧化酶-氧化酶小亚基基因的转运肽(参见例如Comai等，J.Biol.Chem.263：15104-15109，1988；Herminghaus等，Plant Mol.Biol.17：475-486，1991)。
4.5使用方法
质体转运肽可用于将所连接的部分(例如多肽)靶向植物质体。在一个实施方案中，质体转运肽引导向所有组织类型中的所有质体定位。在另一个实施方案中，质体转运肽引导向所有组织类型中的一个亚组质体定位。在另一个实施方案中，质体转运肽引导向一个亚组组织类型中的所有质体定位。在另一个实施方案中，质体转运肽引导向一个亚组组织类型中的一个亚组质体定位。
在一个实施方案中，被靶向质体的连接多肽参与发生在质体中的生理过程(包括但不限于光合作用或脂肪酸、氨基酸、油、类胡罗卜素、类萜、淀粉组成/生物合成)。因此，被靶向的重组多肽可调节或改变发生在质体中的该生理过程(例如通过改变酶的水平和/或提供具有稍微不同于野生型酶的功能的改变的酶)。在一个具体实施方案中，融合配偶体以使植物抗一种或多种除草剂的方式被改变。在一个更具体的实施方案中，融合配偶体是突变为抗一种或多种除草剂
的乙酰乳酸合酶(ALS)(参见例如美国专利5,013,659)。
在另一个实施方案中，利用本发明方法表达重组多肽并将其导入质体中，以促进更高的表达水平。例如，某些多肽当在植物细胞的胞质中重组表达时是有毒的，和/或某些多肽对引起降解的胞质蛋白酶和其它成分敏感。因为质体是亚细胞区室，所以有可能将重组多肽靶向质体，以将其与胞质隔离，由此允许较高的表达水平。在一个具体的实施方案中，融合配偶体具有杀虫活性。在一个更具体的实施方案中，融合配偶体为一种或多种Bt毒素蛋白(参见例如美国专利第6,489,542、5,281,530、5,322,932号；2005年2月25日提交的美国专利申请序号11/067,557；和PCT公开号WO 92/04453)。
在另一个实施方案中，利用本发明方法表达重组多肽并将其导入质体，以避免对植物的不利的农艺学作用。某些多肽当在植物细胞的胞质中重组表达时有毒或产生不想要的植物表型。通过将重组多肽隔离到质体，经常可降低或消除这些有害作用。
在另一个实施方案中，利用本发明方法表达重组多肽并将其导入质体，以便于更容易地分离多肽。可通过本领域已知的任何方法将质体由植物组织中分离出来，并提取包含在其中的多肽。
在另一个实施方案中，利用本发明方法表达重组多肽并将其导入质体，以促进更高的表达水平。某些多肽对胞质的蛋白酶和其它成分敏感。因为质体是亚细胞区室，所以有可能将重组多肽靶向质体，以将其与胞质隔离，由此允许更高的表达水平。
在另一个实施方案中，利用本发明方法表达重组多肽并将其导入质体，以调节其对位于不同亚细胞区室中的底物的活性。通过将多肽/酶和底物分隔入不同的亚细胞区室，可通过加热、研磨或机械提取之类导致酶和底物混合在一起的处理控制酶活性。
在另一个实施方案中，利用本发明方法表达形成异聚复合物的重组多肽并将其导入质体，以调节组装的酶复合物的活性。通过将复合物的组分分隔入不同的亚细胞区室，可通过加热、研磨或机械
提取之类导致多肽组分混合在一起的的处理控制组装的复合物的活性。
4.6重组表达
可使用本领域众所周知的标准重组DNA和分子克隆技术(例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989)，重组表达本发明的核酸分子和多肽。另外，可使用重组DNA技术建立适用于制备转基因植物的核酸构建体(参见4.7节)。
因此，本发明的一个方面涉及含本发明核酸分子或其变体的载体，优选表达载体。本文使用的术语“载体”指能够转运与其连接的另一种核酸的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其指另外的DNA节段可导入其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA节段可导入到病毒基因组中。
某些载体能够在其导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型载体)。其它载体(例如非游离型载体)在导入到宿主细胞中时整合入宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组复制。一般来说，在重组DNA技术中使用的表达载体经常为质粒(载体)形式。但是，本发明意欲包括其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒)。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸分子，其形式适合于该核酸分子在宿主细胞中表达。这意味着重组表达载体包含一个或多个以拟用于表达的宿主细胞为基础选择的调节序列，其与待表达多核苷酸有效连接。在重组表达载体中，“有效连接的”意指目的核苷酸序列以允许该核苷酸序列表达的方式(例如在体外转录/翻译系统中或在宿主细胞中(当载体导入到宿主细胞中时))连接至调节序列。术语“调节序列”意欲包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。本领域描述了这样的调节序列(例如Goeddel，Gene
Expression Technology：Methods in Enzymology，1990，Academic Press，San Diego，CA)。调节序列包括在众多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列组成型表达的那些调节序列和引导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些调节序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员会意识到，表达载体的设计可能取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白表达水平、要求表达的生物部位等之类的因素。本发明的表达载体可导入到宿主细胞中，由此产生由本文描述的核酸分子编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。
在某些实施方案中，可将用作启动子或增强子元件的分离核酸导入到非异源形式的本发明多核苷酸的合适位置(一般为上游)，以便上调或下调本发明多核苷酸的表达。例如，可通过突变、缺失和/或置换，体内改变内源启动子(参见美国专利第5,565,350号；国际专利申请号PCT/US93/03868)，或者可以相对于本发明多核苷酸的关连基因适宜的方向和距离将分离的启动子导入到植物细胞中，以便控制基因表达。可在适于植物生长的条件下调节基因表达，以便改变植物细胞中本发明多肽的总浓度和/或组成。因此，本发明提供用于制备有效连接至天然、内源(即非异源)形式的本发明多核苷酸的异源启动子和/或增强子的组合物和方法。
如果需要多肽表达，则一般理想的是在多核苷酸编码区的3′末端包含聚腺苷酸化区。聚腺苷酸化区可源自天然基因、各种其它植物基因或T-DNA。要加入的3′末端序列可源自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或源自另一种植物基因，或较不优选地来自任何其它真核基因。
本发明的重组表达载体可设计用于在原核细胞(例如肠杆菌科(Ehterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizoboceae)，例如根瘤菌属(Rhizobium)和根瘤杆菌属(Rhizobacter)；螺菌科(Spirillaceae)，例如发光杆菌属(photobacterium)；发酵单胞菌属(Zymomonas)；沙雷氏菌属(Serratia)；
气单胞菌属(Aeromonas)；弧菌属(Vibrio)；脱硫弧菌属(Desulfovibrio)；螺菌属(Spirillum)；乳杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，例如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋杆菌属(Acetobacter)；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae))或真核细胞(例如使用杆状表达载体的昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞)中表达本发明多肽(有关合适宿主细胞的论述，参见Goeddel，出处同上)。或者，例如可使用T7启动子调节序列和T7聚合酶，体外转录和翻译重组表达载体。
蛋白在原核生物中的表达最经常用载体在大肠杆菌中进行，其中所述载体含引导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子。融合载体将许多氨基酸加入到其中编码的蛋白中，通常加至重组蛋白的氨基末端。这样的融合载体通常起至少3个作用：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解性；和/或3)通过在亲和纯化中起配体作用帮助纯化重组蛋白。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的接合处引入蛋白水解切割位点，以能够在纯化融合蛋白后分离重组蛋白和融合部分。这样的酶及其关连识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson，1988，Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或A蛋白融合至目标重组蛋白。
在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体实例包括pYepSecl(Baldari等，1987，EMBO J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982，Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等，1987，Gene 54：113-123)、pYES2(InvitrogenCorp.，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)。
或者，表达载体是杆状病毒表达载体。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，
1983，Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers，1989，Virology 170：31-39)。
在再一个实施方案中，使用植物表达载体(包括但不限于烟草花叶病毒和马铃薯病毒表达载体)在植物细胞中表达本发明的核酸。
适合原核细胞和真核细胞这二者的其它表达系统是本领域所知晓的(参见例如Sambrook等，1990，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY的第16和17章)。
许多启动子可用于实施本发明。可根据需要的结果选择启动子。核酸可与用于在宿主生物中表达的组成型、组织特异性、诱导型或其它启动子组合。
“组织特异性启动子”可引导本发明的核酸在特定组织、器官或细胞类型中表达。组织特异性启动子可为诱导型的。同样，组织特异性启动子可在该组织中仅于某一时间范围内或发育阶段内启动转录。其它组织特异性启动子可在特定组织的整个生命周期内有活性。本领域普通技术人员会认识到，组织特异性启动子可驱动有效连接的序列在靶组织以外的组织中表达。因此，如本文所述，组织特异性启动子是驱动优先在靶组织或细胞类型中表达、但也可在其它组织中产生一些表达的启动子。许多组织特异性启动子可用于本发明。使用合适的启动子，可靶向任何器官，例如植物地上部营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实。为使本发明的多核苷酸在植物的气生营养器官中表达，可使用光合作用器官特异性启动子，例如RBCS启动子(Khoudi等，Gene197：343，1997)。可在根特异性启动子(例如ANR1基因的启动子)控制下实现本发明多核苷酸的根特异性表达(Zhang和Forde，Science，279：407，1998)。其它典型的启动子包括大豆的根特异性谷氨酰胺合成酶基因(Hirel等，1992，Plant Molecular Biology 20：207-218)和四季豆
(French bean)的GRP1.8基因的根特异性控制元件(Keller等，1991，ThePlant Cell 3：1051-1061)。
“组成型启动子”被定义为引导基因在全部组织中表达并在大部分环境条件和发育或细胞分化状态下有活性的启动子。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、得自根癌农杆菌(Agrobacterium tumafaciens)T-DNA的1′-或2′-启动子以及本领域普通技术人员已知的各种植物基因的其它转录起始区。这样的基因包括例如拟南芥(Arabidopsis)的ACT11(Huang等，1996，Plant Mol.Biol.33：125-139)、拟南芥(Arabidopsis)的Cat3(Genbank登录号U43147，Zhong等，1996，Mol.Gen.Genet.251：196-203)、编码油菜(Brassicanapus)的硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶的基因(Genbank登录号X74782，Solocombe等，1994，Plant Physiol.104：1167-1176)、玉米的GPc1(GenBank登录号X15596，Martinez等，1989，J.Mol.Biol.208：551-565)和玉米的Gpc2(GenBank登录号U45855，Manjunath等，1997，Plant Mol.Biol.33：97-112)。任何强组成型启动子，例如CaMV35S启动子，都可用于在整个植株中表达本发明的多核苷酸。
术语“诱导型启动子”指处于精确的环境或发育控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件、升高的温度、光的存在或喷洒化学物质/激素。
适用于植物宿主细胞的组成型启动子实例包括例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)35S转录起始区、紫茉莉花叶病毒(mirabilis mosaic virus)全长转录物启动子(Dey和Maiti，Plant Mol.Biol.40：771-782，(1999))、得自根癌农杆菌T-DNA的1′-或2′-启动子、花生褪绿条纹病毒(peanut chlorotic streak virus)的全长转录物启动子(Maiti和Shepherd，Biochem.Biophys.Res.Comm.244：440-444(1998))、玄参花叶病毒(figwort mosaic virus)的34S启动子(Maiti等，Transgen.Res.6：143-156(1997)；Sanger等，Plant Mol.Biol.14：433-443(1990))和草莓沿脉变色病毒(strawberry vein banding virus)的全长转录
物启动子(美国专利公开第2002/0182593号)，以及技术人员已知的各种植物基因的其它转录起始区。这样的基因包括例如拟南芥(Arabidopsis)的ACT11(Huang等，Plant Mol.Biol.33：125-139，(1996))、拟南芥(Arabidopsis)的Cat3(Genbank登录号U43147，Zhong等，Mol.Gen.Genet.251：196-203，(1996))、编码油菜(Brassica napus)的硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶的基因(Genbank登录号X74782，Solocombe等，Plant Physiol.104：1167-1176(1994))、玉米的GPc1(GenBank登录号X15596，Martinez等，J.Mol.Biol 208：551-565(1989))和玉米的Gpc2(GenBank登录号U45855，Manjunath等，Plant Mol.Biol.33：97-112(1997))、稻肌动蛋白(McElroy等，1990，Plant Cell 2：163-171)、泛素(Christensen等，1989，Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等，1992，Plant Mol.Biol.18：675-689)、pEMU(Last等，1991，Theor.Appl.Genet.81：581-588)。
本发明的另一个方面涉及本发明的重组表达载体已导入其中的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可交互使用。要理解的是，这样的术语不仅指具体谈论的细胞，而且指该细胞的子代或潜在子代。由于突变或环境影响，在后代中可能出现某些修饰，所以该子代实际上可能与亲代细胞不同，但仍包含在本文使用的术语范围内。
因此，本发明提供具有含本发明核酸或其变体的表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任意原核生物(例如大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))或真核细胞(例如昆虫细胞、酵母细胞或植物细胞)。本发明还提供表达本发明核酸并由此产生所编码多肽的方法，其包括以下步骤：i)在允许生产所编码多肽的条件下培养含本发明核酸分子的细胞；和ii)分离表达的多肽。
可通过常规转化或转染技术将载体DNA导入到原核或真核细胞中。本文使用的术语“转化”和“转染”意指本领域公认的各种将外源核酸分子导入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、
DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。适于转化或转染宿主细胞的方法可见于本领域(例如Sambrook等，出处同上)。
4.7转基因植物的生产
可使用本领域已知的任何方法，用本发明的核酸分子转化植物或植物细胞。核酸分子可掺入到植物DNA(例如基因组DNA或叶绿体DNA)中，或保持而不插入到植物DNA中(例如通过使用人工染色体)。适于将核酸分子导入到植物细胞中的方法包括微注射(Crossway等，1986，Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs等，1986，Proc.Natl.Acad Sci.83：5602-5606；D′Halluin等，1992，Plant Cell 4：1495-1505)；农杆菌介导的转化(美国专利第5,563,055和5,981,840号；Osjoda等，1996，Nature Biotechnology 14：745-750；Horsch等，1984，Science233：496-498；Fraley等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.80：4803和GeneTransfer to Plants，Potrykus编辑，Springer-Verlag，Berlin 1995)、定向基因转移(Paszkowski等，1984，EMBO J.3：2717-2722)、弹道粒子加速(美国专利第4,945,050、5,879,918、5,886,244、5,932,782号；Tomes等，1995，“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment”，载于Plant Cell，Tissue，and OrganCulture；Fundamental Methods，Gamborg和Phillips编辑，Springer-Verlag，Berlin；和McCabe等，1988，Biotechnology 6：923-926)、病毒介导的转化(美国专利第5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931号)、花粉转化(De Wet等，1985，载于The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues，Chapman等编辑，Longman，New York，197-209页)、Lec 1转化(美国专利申请序号09/435,054；国际公开号WO 00/28058)、颈须介导的转化(Kaeppler等，1990，Plant Cell Reports9：415-418；Kaeppler等，1992，Theor.Appl.Genet.84：560-566)和叶绿体转化技术(Bogorad，2000，Trends in Biotechnology 18：257-263；Ramesh等，2004，Methods Mol Biol.274：301-7；Hou等，2003，
Transgenic Res.12：111-4；Kindle等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.88：1721-5；Bateman和Purton，2000，Mol Gen Genet.263：404-10；Sidorov等，1999，Plant J.19：209-216)。
用于产生转基因植物和植物细胞的转化方案的选择可根据待转化的植物或植物细胞类型(即单子叶或双子叶)而有所变化。特别适合于特定植物类型的转化方案的实例包括用于以下植物的转化方案：马铃薯(Tu等，1998，Plant Molecular Biology 37：829-838；Chong等，2000，Transgenic Research 9：71-78)、大豆(Christou等，1988，PlantPhysiol.87：671-674；McCabe等，1988，BioTechnology 6：923-926；Finer和McMullen，1991，In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182；Singh等，1998，Theor.Appl.Genet.96：319-324)、玉米(Klein等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85：4305-4309；Klein等，1988，Biotechnology 6：559-563；Klein等，1988，Plant Physiol.91：440-444；Fromm等，1990，Biotechnology 8：833-839；Tomes等，1995，“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment，”载于Plant Cell，Tissue，and OrganCulture：Fundamental Methods，Gamborg编辑(Springer-Verlag，Berlin))、谷物(Hooykaas-Van Slogteren等，1984，Nature 311：763-764；美国专利第5,736,369号)。
在某些实施方案中，在转基因植物和植物细胞的生产中使用不止一种构建体进行转化。可以顺式或反式位置包含多个构建体。在优选实施方案中，每个构建体都具有启动子和其它调节序列。
可培养利用以上转化技术中的任一种获得的转化植物细胞，以再生具有转化基因型并由此具有所需表型的全株。这样的再生技术依赖于在组织培养生长培养基中某些植物激素的控制，通常依赖于已和所需核苷酸序列一起导入的杀生物剂和/或除莠剂标记。本领域描述了由培养的原生质体再生植株(例如Evans等，Protoplasts Isolationand Culture，Handbook of Plant Cell Culture，124-176页，MacMillilanPublishing Company，New York，1983；和Binding，Regeneration of
Plants，Plant Protoplasts，21-73页，CRC Press，Boca Raton，1985)。再生还可由植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得。本领域也描述了这样的再生技术(例如Klee等，1987，Ann.Rev.of Plant Phys.38：467-486)。
本发明的核酸分子可用于将多肽靶向基本上任意植物中的质体。因此，本发明对广泛的植物有用，包括翦股颖属(Agrotis)、葱属(Allium)、凤梨属(Ananas)、腰果属(Anacardium)、芹属(Apium)、落花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、Athamantha、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、山白竹属(Bambusa)、甜菜属(Beta)、芸苔属(Brassica)、雀麦属(Bromus)、(Browaalia、山茶属(Camellia)、大麻属(Cannabis)、番木瓜属(Carica)、长角豆属(Ceratonia)、鹰嘴豆属(Cicer)、藜属(Chenopodium)、苣属(Chicorium)、柑桔属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Coffea)、薏苡属(Coix)、甜瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、曼陀罗属(Datura)、胡萝卜属(Daucus)、石竹属(Dianthus)、毛地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、Eliusine、大戟属(Euphorbia)、羊茅属(Festuca)、榕属(Ficus)、草莓属(Fragaria)、老鹳草属(Geranium)、大豆属(Glycine)、禾本科(Graminae)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、Heterocallis、橡胶树属(Hevea)、木槿属(Hibiscus)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、番薯属(Ipomoea)、莴苣属(Lactuca)、山黧豆属(Lathyrus)、兵豆属(Lens)、百合属(Lilium)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、百脉根属(Lotus)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、澳洲坚果属(Macadamia)、Macrophylla、苹果属(Malus)、芒果属(Mangifera)、木薯属(Manihot)、Majorana、苜蓿属(Medicago)、芭蕉属(Musa)、水仙属(Narcissus)、龙面花属(Nemesia)、烟草属(Nicotiana)、驴食豆属(Onobrychis)、木犀榄属(Olea)、Olyreae、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pannisetum)、
矮牵牛属(Petunia)、天竺葵属(Pelargonium)、鳄梨属(Persea)、Pharoideae、菜豆属(Phaseolus)、梯牧草属(Phleum)、云杉属(Picea)、早熟禾属(Poa)、松属(Pinus)、黄连木属(Pistachia)、豌豆属(Pisum)、杨属(Populus)、黄杉属(Pseudotsuga)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、黄杉属(Pseutotsuga)、番石榴属(Psidium)、栎属(Quercus)、毛茛属(Ranunculus)、萝卜属(Raphanus)、茶藨子属(Ribes)、蓖麻属(Ricinus)、杜鹃属(Rhododendron)、蔷薇属(Rosa)、甘蔗属(Saccharum)、美人襟属(Salpiglossis)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、狗尾草属(Setaria)、北美红杉属(Sequoia)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、钝叶草属(Stenotaphrum)、可可树属(Theobromus)、胡卢巴属(Trigonella)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、铁杉属(Tsuga)、郁金香属(Tulipa)、野豌豆属(Vicia)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和玉蜀黍属(Zea)的物种。
在具体的实施方案中，转基因植物为玉米、西红柿、马铃薯、稻、大豆、棉株、向日葵、苜蓿、莴苣或烟草。
培育转基因植物并用相同转化株或不同株授粉。可培养两代或多代植物，以确保所需核酸分子、多肽的表达和/或表型特征稳定保持和遗传。本领域普通技术人员会认识到，在本发明的核酸分子稳定掺入到转基因植物中并证实有效后，可通过有性杂交将其引入到其它植物中。根据要杂交的物种，可使用众多标准育种技术中的任一种。
4.8转基因植物中表达的测定
可使用本领域已知的任意方法测定本发明的核酸分子或由其编码的多肽在植物中的表达水平。例如，可通过免疫测定、免疫印迹、定量凝胶电泳等测定由本发明的核酸分子编码的多肽在植物中的表达水平。
另外，可通过转基因植物表型被改变的程度，测定由本发明的
核酸分子编码的多肽在植物中的表达水平。在一个具体的实施方案中，多肽靶向质体增强是要检测的表型。这样的表型包括但不限于种子或其它组织中脂肪酸、氨基酸、油、类萜或淀粉量或组成的变化、对施用的除草剂的耐受增强、对害虫(例如昆虫和/或线虫)的抗性增强和/或可收获的种子/产量和/或植物生物量增加。
可使用全株、其组织、植物细胞培养物或由其纯化的质体进行测定。
本文引用的所有公开文献、书籍、参考资料和摘要的内容都全文在此引入作为参考，以更全面地描述本发明所属领域的现状。
由于可对上述主题实施各种改变而不背离本发明的范围和精神，所以意将以上描述中包含的和/或所附权利要求书中定义的所有主题都理解为用于描述和阐述本发明。按照以上讲述有可能修改和变更本发明。
5.实施例
以下实施例是为了阐述目的，而不是限制要求保护的发明。
5.1 实施例1
将非天然肽序列文库重组融合至大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶(LDC)基因，并经农杆菌(Agrobacterium)介导的转化在烟草(Nicotianatabacum)BY-2悬浮液细胞中瞬时表达(一般参见Newman等，PlantCell 5：701-714，1993)。在4天后，快速冻融细胞，在水+0.5％甲酸中再水合至少1小时，用96孔针式复制器(96-well replicator pin device)分配，然后经过Millipore MAHVN45滤板通过旋转混合物收集上清液。如下使用LC-质谱分析法(MS)分析上清液稀释液中终产物尸胺的存在情况：
将配备电喷雾LC/MS界面的三重四极MS仪器(Quattro LC，Micromass)与HPLC泵(Agilent 1050)连接，该泵以0.3ml/分钟恒定流
速传送40/60 H2O/MeOH w/0.1％甲酸。在分析中使用流动注射法和Twin Pal自动注射器(Leap Technology)，以每次注射半分钟的速率将5μl样品溶液注射入MS中。以MRM模式操作质谱仪，用于定量尸胺(MS/MS处理(transaction)：102.8＞85.8)和D-赖氨酸(MS/MS处理：146.8＞83.6)。测定转运肽文库克隆的峰高和面积，并与阳性对照(烟草小亚基转运肽)和阴性对照(无转运肽)对比。(关于额外的背景信息，参见Herminghaus等，Plant Mol.Biol.17：475-486，1991和Herminghaus等，Transgenic Research 5：193-201，1996)。
使用上述测定，发现示于表1的肽序列在融合至赖氨酸脱羧酶蛋白的N-末端时，有效地将该蛋白靶向质体。
表1.用LDL融合配偶体鉴别的有效质体转运肽
| 克隆 | SEQ ID NO | 序列 |
| sCTP-6H1 | 1 | MAATTLTSALPGAFSSSQRPSAPFNLQRSPRVLRRFNRKTGRQPRGLVRAAKAQ |
| sCTP-8B6 | 2 | MAATAVTSASLGAFSSSQRPGASSNSQRSPRLLRRFNRKTGRQPRGLVLAAKAQ |
| sCTP-1F7 | 3 | MAATAVSSVLPGAFSSSQRSSSPFNSQRSLIVLRRFNRKRRRQRRGRVLAAKAQ |
| sCTP-1H1 | 4 | MAATTVSSALLSAFSSSQSPSASFSLQTLPIVLRRFNRKTGRKPRGRVLAAKAQ |
| sCTP-2B4 | 5 | MAATTLTSASPSAFSSSQSSGAPSNLQRSLRLLRRFNRKTGRQRLGRIRAAKAQ |
| sCTP-2C7 | 6 | MASSALSSASPGAFSSSQRPSAPFNLKTSPIVLRRFNRNTGRQPRRRIRAAKAQ |
| sCTP-2E7 | 7 | MAASALSSASLSAFSSSQSSSAPSSSKTSLRVLRRFNRKRGRQPRGLIRAAKAQ |
| sCTP-2F2 | 8 | MAATAVTSASLGAFSSSQSPSAPSSSKKSLRVLRRFNRKTGRKPRGRVRAAKAQ |
| sCTP-2G8 | 9 | MASTAVSSASPGAFSSSQSSGAPSNLQRSPILLRFNRKRGRKPLGRIRAAKAQ |
| sCTP-2G9 | 10 | MASTTLTSASPSAFSSSQRPSAPSNSQRSPRVLRRFNRKRGRKPLRRVLAAKAQ |
| sCTP-3B9 | 11 | MAATALTSVLPGAFSSSQSPSAPFSLQRSPIVLRRFNRNRGRQPRGRVRAAKAQ |
| sCTP-3C1 | 12 | MAASALTSASLGAFSSSQRPSAPSNLQTSPIVLRRFNRKTGLQPRRRVRAAKAQ |
| sCTP-3C12 | 13 | MAATALTSASPSAFSSSQRPGAPSSSKTSPRLLRRFNRNTRRQRRGLVRAAKAQ |
| sCTP-3E10 | 14 | MASTAVSSASLGAFSSSQSSGASSSSKTLPILLRRFNRKTRRQPLRLVRAAKAQ |
| sCTP-3E12 | 15 | MAASALTSASLGAFSSSQSPGAPSSSQTSLRVLRRFNRKTGPQRLRRVRA AKAQ |
| sCTP-3E7 | 16 | MASTALSSASPGAFSSSQRPSSPSSSKTSLRVLRRFNRKTGLQRRGLVRA AKAQ |
| sCTP-3E9 | 17 | MASSALSSASPGAFSSSQRPGSSSSSQTSPILLRRFNRKTGRQRLRRVRAA KAQ |
| sCTP-3F7 | 18 | MAASALTSALPGAFSSSQRPSAPSSSQRLPRLLRRFNRNTGRQRLRRIRA AKAQ |
| sCTP-4B7 | 19 | MASTAVTSVSPSAFSSSQRFGAPSSLQRSPRVLRRFNRKTGRQRLGLVLA AKAQ |
| sCTP-4D6 | 20 | MASTAVSSALPSAFSSSQRSSSPSSLQTLPRLLRRFNRKRGRQRRRRVRA AKAQ |
| sCTP-4E1 | 21 | MAASTVSSVSPSAFSSSQRPGAPFSSQRLPRVLRRFNRNTRRQRRGRVLA AKAQ |
| sCTP-4E7 | 22 | MASTALTSALLGAFSSSQRPGASSSLKRSPRVLRRFNRNRRLKRLGRVRA AKAQ |
| sCTP-4F1 | 23 | MASTTVSSASPGAFSSSQRSSSPSNSQTSPRVLRRFNRKTGRKPRGLVRA AKAQ |
| sCTP-4F12 | 24 | MAATAVTSALPGAFSSSQRPSAPFNSKTSPIVLRRFNRKTGRQPRRRVRA AKAQ |
| sCTP-5D1 | 25 | MAASTLSSVSPGAFSSSQSPGAPSSSQRSPRVLRRFNRNTGLQPRGRIRAA KAQ |
| sCTP-5E1 | 26 | MASSALTSASPGAFSSSQRPSAPFNSQRSPILLRRFNRNTRRQRRGLIRAA KAQ |
| sCTP-5G1 | 27 | MAASALTSVSLSAFSSSQRPGAPSSLKTSPRLLRRFNRNTGLQRRGRVRA AKAQ |
| sCTP-5H1 | 28 | MASTAVSSALLSAFSSSQSSGSPFSSQTLLRLLRRFNRNTGRQPLRRVLA AKAQ |
| sCTP-5H10 | 29 | MAATALTSASLGAFSSSQRSGSPSNSQTLPIVLRRFNRKTRLKPRGRVLA AKAQ |
| sCTP-5H2 | 30 | MASSAVTSALPGAFSSSQSPSAPSSSKRLPIVLRRFNRKTGRKPRGLVRA AKAQ |
| sCTP-5H5 | 31 | MAASALTSVSPGAFSSSQSPGAPSNSQTSLRVLRRFNRNTRRKPRGLVRA AKAQ |
| 克隆 | SEQ ID NO | 序列 |
| sCTP-5H6 | 32 | MAATALTSASLGAFSSSQRPGSSSNSQTSPILLRRFNRKTRLQRRRRVRA AKAQ |
| sCTP-6B1 | 33 | MAATTVTSASLGAFSSSQSPSAPFNSQTSPRVLRRFNRKTGRQPRGRVRA AKAQ |
| sCTP-6F1 | 34 | MASSTLTSALPGAFSSSQSSSASSSSQTSLRVLRRFNRKTGLKRLGRVRA AKAQ |
| sCTP-6G2 | 35 | MAASALTSASLSAFSSSQSSGASSSSQRSLRVLRRFNRKTGRQRRRRVLA AKAQ |
| sCTP-7D6 | 36 | MASTTVSSASPGAFSSSQRPGASSSLQRSPRVLRRFNRNRGRQRRGRVLA AKAQ |
| sCTP-7H1 | 37 | MASTTLSSASPGAFSSSQSPSAPFSSQRSLRVLRRFNRKRGRQPRGLVRA AKAQ |
| sCTP-8H1 | 38 | MASTTLSSASLGAFSSSQSPSAPFSSQRLLRVLRRFNRKRGRKPRGRVRA AKAQ |
| sCTP-5G11 | 39 | MASTTLSSASLASVSLGAFSSSQSPSAPSSSQTSPIVLRRFNRNTGRQPRRL VRAAKAQ |
5.2实施例2
将非天然肽序列文库重组融合至Cry2Bt毒素，并经农杆菌(Agrobacterium)介导的转化在本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中瞬时表达(参见Kapila等，Plant Science 122：101-108，1997)。由浸润的叶组织中提取蛋白，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。因为被靶向质体的蛋白的加工包括将转运肽序列与蛋白的剩余部分切开，所以Cry2蛋白的分子量相对于初始的转运肽-Cry2融合体下降，这是肽序列介导向质体的正确靶向和随后在进入时切割的指示。使用上述测定，发现示于表2的肽序列在融合至Cry2蛋白的N-末端时有效地将该蛋白靶向质体。
表2.用Cry2融合配偶体鉴别的有效质体转运肽
| 克隆 | SEQ ID NO | 序列 |
| sCTP-6H1 | 1 | MAATTLTSALPGAFSSSQRPSAPFNLQRSPRVLRRFNRKTGRQPRGLVRA AKAQ |
| sCTP-20 | 40 | MAASTLSSASPSAFSSSQRPSAPSSLKTSLIVLRRFNRKTGRQPRGLVLAA KAQ |
| sCTP-A1 | 41 | MAASTLSSVSPGAFSSSQRSGAPSNLQRSPILLRRFNRKTGRQPRGRVRA AKAQ |
| sCTP-28 | 42 | MAATTVSSALPGAFSSSQSSGSSFNSKTLPRVLRRFNRNTGRQPLGLVRA AKAQ |
| sCTP-27 | 43 | MASTAVTSALPGAFSSSQSPSAPSSLQTSPILLRRFNRNRGLKRLGRIRAA KAQ |
| sCTP-F1 | 44 | MASSALTSASPSAFSSSQSSSAPFNSQTSPIVLRRFNRNTGRQRRGRVLAA KAQ |
| sCTP-G4 | 45 | MASSAVTSASPSAFSSSQSPSAPFNSKRSPILLRRFNRKTGLQPRRLVRAA KAQ |
| sCTP-I7 | 46 | MAATALTSALPGAFSSSQSPGAPSNLQTSPIVLRRFNRNTGRKPRGRILAA KAQ |
| sCTP-5 | 47 | MAATTLSSALPGAFSSSQSSSAPSNSQTSPILLRRFNRKTGLQPRRRVLAA KAQ |
| sCTP-11 | 48 | MAATALSSASLGAFSSSQRPGASSSLQRSLIVLRRFNRKTGRQRRGRVLA AKAQ |
| sCTP-12 | 49 | MASSAVTSASLSAFSSSQRPSASFNLQTSPRVLRRFNRKTGRQRLGLVRA AKAQ |
| sCTP-19 | 50 | MAATALTSALLGAFSSSQSPGASSSLQTSLIVLRRFNRNRGRQPRGRILAA KAQ |
| sCTP-21 | 51 | MAASTLSSVSPGAFSSSQSPGAPSSSQRSPRVLRRFNRNTGLQPRGRIRAA KAQ |
| sCTP-30 | 52 | MAASAVSPGAFSSSQSPGASSNSQRLLRVLRRFNRKTGLQPLGRIRAAKA Q |
| sCTP-G1 | 53 | MAATALSSASPGAFSSSQRPSAPSNSQTLPRVLRRFNRNTRRQPRGLVLA AKAQ |
| sCTP-A2 | 54 | MAATAVSSASPGAFSSSQRSSAPSSSQRLPIVLRRFNRKRGRQRRGLVLA AKAQ |
| SCTP-G2 | 55 | MAASALTSVLPGAFS SSQRPSAPSNSKRLPRLLRRFNRNTGLQPRGRILA AKAQ |
| sCTP-D3 | 56 | MASSALSSASLGAFSSSQSPSASFSSQTSPRLLRRFNRKTGLKRLGRVRA AKAQ |
5.3实施例3
使用实施例2中描述的本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶浸润测定，用草甘膦乙酰转移酶蛋白测试表1中列出的一个小亚组合成质体转运肽的效力(参见Science 304：1151-1154，2004)。使用该测定，发现质体转运肽sCTP-6H1和sCTP-6F1在融合至GAT蛋白的N-末端时以合理的效力将该蛋白靶向质体(未列出数据)。
不言而喻，本文描述的实施例和实施方案仅用于阐述目的，本领域技术人员会提出其各种改进或改变，这些改进或改变包括在本
申请的精神和范围内，并包括在所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请都全文在此引入作为参考用于各种目的。
序列表
<110>先锋高级育种国际公司
<120>质体转运肽
<130>2119-4284PC
<150>60/578,535
<151>2004-06-09
<160>57
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>1
Met Ala Ala Thr Thr Leu Thr Ser Ala Leu Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Ser Ala Pro Phe Asn Leu Gln Arg Ser Pro Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Gln Pro Arg Gly Leu Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>2
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>2
Met Ala Ala Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Gly Ala Ser Ser Asn Ser Gln Arg Ser Pro Arg Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Gln Pro Arg Gly Leu Val
35 40 45
Leu Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>3
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>3
Met Ala Ala Thr Ala Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Ser Ser Ser Pro Phe Asn Ser Gln Arg Ser Leu Ile Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Arg Arg Arg Gln Arg Arg Gly Arg Val
35 40 45
Leu Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>4
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>4
Met Ala Ala Thr Thr Val Ser Ser Ala Leu Leu Ser Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Pro Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gln Thr Leu Pro Ile Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Lys ProArg Gly Arg Val
35 40 45
Leu Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>5
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>5
Met Ala Ala Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ser Pro Ser Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Ser Gly Ala Pro Ser Asn Leu Gln Arg Ser Leu Arg Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Gln Arg Leu Gly Arg Ile
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>6
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>6
Met Ala Ser Ser Ala Leu Ser Ser Ala Ser Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Ser Ala Pro Phe Asn Leu Lys Thr Ser Pro Ile Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Asn Thr Gly Arg Gln Pro Arg Arg Arg Ile
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>7
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>7
Met Ala Ala Ser Ala Leu Ser Ser Ala Ser Leu Ser Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Ser Ser Ala Pro Ser Ser Ser Lys Thr Ser Leu Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Arg Gly Arg Gln Pro Arg Gly Leu Ile
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>8
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>8
Met Ala Ala Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Ser Lys Lys Ser Leu Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Lys Pro Arg Gly Arg Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>9
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>9
Met Ala Ser Thr Ala Val Ser Ser Ala Ser Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Ser Gly Ala Pro Ser Asn Leu Gln Arg Ser Pro Ile Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Arg Gly Arg Lys Pro Leu Gly Arg Ile
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>10
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>10
Met Ala Ser Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ser Pro Ser Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Ser Ala Pro Ser Asn Ser Gln Arg Ser Pro Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Arg Gly Arg Lys Pro Leu Arg Arg Val
35 40 45
Leu Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>11
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>11
Met Ala Ala Thr Ala Leu Thr Ser Val Leu Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Pro Ser Ala Pro Phe Ser Leu Gln Arg Ser Pro Ile Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Asn Arg Gly Arg Gln Pro Arg Gly Arg Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>12
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>12
Met Ala Ala Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Ser Ala Pro Ser Asn Leu Gln Thr Ser Pro Ile Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Leu Gln Pro Arg Arg Arg Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>13
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>13
Met Ala Ala Thr Ala Leu Thr Ser Ala Ser Pro Ser Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Gly Ala Pro Ser Ser Ser Lys Thr Ser Pro Arg Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Asn Thr Arg Arg Gln Arg Arg Gly Leu Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>14
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>14
Met Ala Ser Thr Ala Val Ser Ser Ala Ser Leu Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser Ser Lys Thr Leu Pro Ile Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Arg Arg Gln Pro Leu Arg Leu Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>15
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>15
Met Ala Ala Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Pro Gly Ala Pro Ser Ser Ser Gln Thr Ser Leu Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Pro Gln Arg Leu Arg Arg Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>16
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>16
Met Ala Ser Thr Ala Leu Ser Ser Ala Ser Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Ser Ser Pro Ser Ser Ser Lys Thr Ser Leu Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Leu Gln Arg Arg Gly Leu Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>17
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>17
Met Ala Ser Ser Ala Leu Ser Ser Ala Ser Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gln Thr Ser Pro Ile Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Gln Arg Leu Arg Arg Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>18
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>18
Met Ala Ala Ser Ala Leu Thr Ser Ala Leu Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gln Arg Leu Pro Arg Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Asn Thr Gly Arg Gln Arg Leu Arg Arg Ile
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>19
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>19
Met Ala Ser Thr Ala Val Thr Ser Val Ser Pro Ser Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Gly Ala Pro Ser Ser Leu Gln Arg Ser Pro Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Gln Arg Leu Gly Leu Val
35 40 45
Leu Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>20
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>20
Met Ala Ser Thr Ala Val Ser Ser Ala Leu Pro Ser Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Ser Ser Ser Pro Ser Ser Leu Gln Thr Leu Pro Arg Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Arg Gly Arg Gln Arg Arg Arg Arg Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>21
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>21
Met Ala Ala Ser Thr Val Ser Ser Val Ser Pro Ser Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Gly Ala Pro Phe Ser Ser Gln Arg Leu Pro Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Asn Thr Arg Arg Gln Arg Arg Gly Arg Val
35 40 45
Leu Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>22
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>22
Met Ala Ser Thr Ala Leu Thr Ser Ala Leu Leu Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Gly Ala Ser Ser Ser Leu Lys Arg Ser Pro Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Asn Arg Arg Leu Lys Arg Leu Gly Arg Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>23
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>23
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1 5 10 15
Ser Gln Arg Ser Ser Ser Pro Ser Asn Ser Gln Thr Ser Pro Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Lys Pro Arg Gly Leu Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>24
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>24
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1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Ser Ala Pro Phe Asn Ser Lys Thr Ser Pro Ile Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Gln Pro Arg Arg Arg Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>25
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>25
Met Ala Ala Ser Thr Leu Ser Ser Val Ser Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Pro Gly Ala Pro Ser Ser Ser Gln Arg Ser Pro Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Asn Thr Gly Leu Gln Pro Arg Gly Arg Ile
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>26
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>26
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1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Ser Ala Pro Phe Asn Ser Gln Arg Ser Pro Ile Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Asn Thr Arg Arg Gln Arg Arg Gly Leu Ile
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>27
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>27
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Asn Thr Gly Leu Gln Arg Arg Gly Arg Val
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Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
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<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>28
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1 5 10 15
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Leu Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>29
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>29
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1 5 10 15
Ser Gln Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asn Ser Gln Thr Leu Pro Ile Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Arg Leu Lys Pro Arg Gly Arg Val
35 40 45
Leu Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>30
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>30
Met Ala Ser Ser Ala Val Thr Ser Ala Leu Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Ser Lys Arg Leu Pro Ile Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Lys Pro Arg Gly Leu Val
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Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>31
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>31
Met Ala Ala Ser Ala Leu Thr Ser Val Ser Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Pro Gly Ala Pro Ser Asn Ser Gln Thr Ser Leu Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Asn Thr Arg Arg Lys Pro Arg Gly Leu Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>32
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>32
Met Ala Ala Thr Ala Leu Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
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20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Arg Leu Gln Arg Arg Arg Arg Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>33
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>33
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1 5 10 15
Ser Gln Ser Pro Ser Ala Pro Phe Asn Ser Gln Thr Ser Pro Arg Val
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Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Gln Pro Arg Gly Arg Val
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Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>34
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>34
Met Ala Ser Ser Thr Leu Thr Ser Ala Leu Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Gln Thr Ser Leu Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Leu Lys Arg Leu Gly Arg Val
35 40 45
Arg Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>35
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>35
Met Ala Ala Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ser Leu Ser Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser Ser Gln Arg Ser Leu Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Lys Thr Gly Arg Gln Arg Arg Arg Arg Val
35 40 45
Leu Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>36
<211>54
<212>PRT
<213>合成序列
<400>36
Met Ala Ser Thr Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro Gly Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Arg Pro Gly Ala Ser Ser Ser Leu Gln Arg Ser Pro Arg Val
20 25 30
Leu Arg Arg Phe Asn Arg Asn Arg Gly Arg Gln Arg Arg Gly Arg Val
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Leu Ala Ala Lys Ala Gln
50
<210>37
<211>54
<212>PRT
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50
Claims (16)
1.一种由SEQ ID NO：1组成的、且具有质体转运肽的活性的分离的肽。
2.一种融合多肽，其含权利要求1的肽。
3.一种分离的核酸分子，其由编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补物组成。
4.一种分离的核酸分子，其编码融合多肽，并含有权利要求3的核酸分子。
5.一种载体，其含权利要求3的核酸分子。
6.一种载体，其含权利要求4的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其含权利要求5的载体。
8.一种宿主细胞，其含权利要求6的载体。
9.一种转基因植物细胞，其含有的转基因表达：
a)含权利要求1的肽的多肽；或
b)权利要求3的核酸分子。
10.权利要求9的转基因植物细胞，其中所述植物选自玉米、大豆、西红柿、马铃薯、棉花、向日葵、苜蓿、莴苣、烟草。
11.一种将多肽靶向植物中质体的方法，其包括将含编码质体转运肽的第一个核酸分子的载体导入植物中，其中所述第一个核酸分子连接至编码所述多肽的第二个核酸分子，使得第一个和第二个核酸分子的翻译产生融合蛋白，其中所述质体转运肽由SEQ ID NO：1组成。
12.权利要求11的方法，其中所述质体转运肽在融合蛋白中处于多肽的N-末端。
13.权利要求11的方法，其中所述多肽为改变质体中存在的生理过程的酶。
14.权利要求11的方法，其中所述多肽选自Bt毒素蛋白、EPSP合酶、GAT和ALS。
15.权利要求13的方法，其中所述生理过程为光合作用、脂肪酸合成、氨基酸合成、油合成、类胡萝卜素合成、类萜合成和淀粉合成。
16.权利要求11的方法，其中所述多肽分离自植物质体。
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