JP2002534966A - オリゴヌクレオチド媒介核酸組換え - Google Patents

オリゴヌクレオチド媒介核酸組換え

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Abstract

(57)【要約】 相同核酸を含む核酸を組換える方法を提供する。遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのファミリーおよび組換え手順でのそれらの使用、ならびにポリメラーゼおよびリガーゼ媒介組換え方法もまた提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の引用） 本出願は、Ｃｒａｍｅｒｉらによる１９９９年９月２８日出願の米国特許出願
第０９／４０８，３９２号「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＭＥＤＩＡＴＥ
Ｄ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」の一部継続出願
である。米国特許出願第０９／４０８，３９２号は、Ｃｒａｍｅｒｉらによる１
９９９年２月５日出願の米国特許出願第６０／１１８，８１３号「ＯＬＩＧＯＮ
ＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＲＥＣＯ
ＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」の非仮出願であり、そしてまたＣｒａｍｅｒｉらによる１
９９９年６月２４日出願の米国特許出願第６０／１４１，０４９号「ＯＬＩＧＯ
ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＲＥＣ
ＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」の非仮出願である。
【０００２】 本出願はまた、同日出願した、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖらによる代理人整理番号０
２−２８９−３ＵＳ「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴ
ＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ，ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＯＬＹＰ
ＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩ
ＣＳ」の一部継続出願である。代理人整理番号０２−２８９−３ＵＳによる出願
は、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖらによる１９９９年１０月１２日出願の米国特許出願第
０９／４１６，３７５号「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡ
ＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ，ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＯＬ
ＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳ
ＴＩＣＳ」の一部継続出願である。米国特許出願第０９／４１６，３７５号は、
ＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによる１９９９年１月１９日出願の米
国特許出願第６０／１１６，４４７号「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ
ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ，ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ Ａ
ＮＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡ
ＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」の非仮出願であり、そしてまたＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよ
びＳｔｅｍｍｅｒによる１９９９年２月５日出願の米国特許出願第６０／１１８
，８５４号「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ Ｓ
ＴＲＩＮＧＳ，ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩ
ＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳの非
仮出願である。
【０００３】 本出願はまた、ＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによる代理人整理番
号３２７１．００２ＷＯ０（Ｍａｊｅｓｔｉｃ，Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｓｉｅｂｅｒ
ｔ ＆ Ｈｓｕｅによって出願）の同時出願した出願「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ
ＰＯＰＵＬＡＴＩＮＧ ＤＡＴＡ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＵＳＥ Ｉ
Ｎ ＥＶＯＬＵＴＩＯＮＡＲＹ ＳＩＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」の一部継続出願であ
る。代理人整理番号３２７１．００２ＷＯ０による出願は、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ
およびＳｔｅｍｍｅｒによる１９９９年１０月１２日出願の米国特許出願第０９
／４１６，８３７号「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＯＰＵＬＡＴＩＮＧ ＤＡＴＡ
ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＵＳＥ ＩＮ ＥＶＯＬＵＴＩＯＮＡＲＹ
ＳＩＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」の一部継続出願である。
【０００４】 本出願はまた、Ｗｅｌｃｈらによる１９９９年９月２８日出願の米国特許出願
第０９／４０８，３９３号「ＵＳＥ ＯＦ ＣＯＤＯＮ ＶＡＲＩＥＤ ＯＬＩ
ＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＦＯＲ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ
ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ」に関連する。
【０００５】 本出願は、適切に、米国特許法第１１９条（ｅ）および／または米国特許法第
１２０条に提供されるように、この節に列挙した出願の各々に対する優先権を主
張し、そして各々の利益を請求する。
【０００６】 （著作権の告知） 米国特許法施行規則１．７１（ｅ）に従って、出願人は、本開示の一部が著作
権の保護を受けるものを含むことを示す。著作権者は、米国特許商標庁の特許フ
ァイルまたは記録に現れるので、特許書類または特許の開示の誰によるファクシ
ミリでの複製に対しても拒絶を有さないが、他の点では、どんなことでも全ての
著作権の権利を受ける。
【０００７】 （発明の背景） ＤＮＡシャッフリングは、組換え核酸の生成、操作、および選択におけるパラ
ダイムシフトを提供した。本発明者らおよびその共同研究者らは、改善された工
業的、農業的、および治療的な遺伝子およびコードされるタンパク質を生成する
ための迅速な人工進化方法論を開発した。これらの方法、ならびにこれらの本発
明の方法を実施するための関連の組成物および装置は、本発明者らおよびその共
同研究者らによる開拓的な研究本体を示す。
【０００８】 本発明者らおよび共同研究者らによる多数の刊行物により、ＤＮＡシャッフリ
ングが記載される。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９４）「Ｒａｐｉｄ Ｅｖ
ｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−
３９１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ Ｒ
ａｎｄｏｍ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ９１：１０７
４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ、米国特許第５，６０３，７９３号、ＭＥＴ
ＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ；Ｓｔｅｍ
ｍｅｒら、米国特許第５，８３０，７２１号、ＤＮＡ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ
ＢＹ ＲＡＮＤＯＭ ＦＲＡＧＭＥＮＴＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＥＡＳＳＥＭ
ＢＬＹ；Ｓｔｅｍｍｅｒら、米国特許第５，８１１，２３８号、ＭＥＴＨＯＤＳ
ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩ
ＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ ＢＹ ＩＴＥＲＡＴ
ＩＶＥ ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮは、例えば
、種々の形式（例えば、変異誘発、シャッフリング、および選択の反復サイクル
による）でのインビトロおよびインビボでの核酸、ＤＮＡ、およびタンパク質の
シャッフリング、ならびに提示されたペプチドおよび抗体のライブラリーの生成
方法を記載する。
【０００９】 ＤＮＡシャッフリング技術の適用はまた、本発明者らおよびその共同研究者ら
により開発されている。上記の刊行物に加えて、Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、米国特許
第５，８３７，４５８号、ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ
ＦＯＲ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＡＮＤ ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲ
ＩＮＧは、例えば、代謝経路の進化および反復シャッフリング技術によるバイオ
プロセシングの増強を提供する。Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）、「Ｃｏｎｓｔ
ｒｕｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｐｈ
ａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｂｙ ＤＮＡ Ｓｇｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１）：１００−１０３は、例えば、抗体ファージラ
イブラリーのための抗体シャッフリングを記載する。ＤＮＡシャッフリングに関
するさらなる詳細は、ＷＯ９５／２２６２５、ＷＯ９７／２００７８、ＷＯ９６
／３３２０７、ＷＯ９７／３３９５７、ＷＯ９８／２７２３０、ＷＯ９７／３５
９６６、ＷＯ９８／３１８３７、ＷＯ９８／１３４８７、ＷＯ９８／１３４８５
、およびＷＯ９８９／４２８３２、ならびに本発明者らおよびその共同研究者ら
による多数の他の刊行物に見出され得る。
【００１０】 本発明者らおよびその共同研究者ら、ならびに当該分野における他の研究者ら
の多数の刊行物はまた、例えば、小さなフラグメントからの、またはさらにはオ
リゴヌクレオチドからの遺伝子の再アセンブリを提供することによりＤＮＡシャ
ッフリングを容易にする技術を記載する。例えば、上記の刊行物に加えて、Ｓｔ
ｅｍｍｅｒら（１９９８）米国特許第５，８３４，２５２号、ＥＮＤ ＣＯＭＰ
ＬＥＭＥＮＴＡＲＹ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＲＥＡＣＴＩＯＮは、標的配列を
（例えば、核酸の混合物中で）増幅および検出するためのプロセス、ならびに大
きなポリヌクレオチドを核酸フラグメントからアセンブリするためのプロセスを
記載する。
【００１１】 上記の刊行物の概要は、遺伝子シャッフリングによる強制進化が、多くの実用
的かつ強力な適用について重要な新規技術であることを示す。従って、遺伝子シ
ャッフリングを容易にする新規な技術が非常に所望される。本発明は、重要な新
規の遺伝子シャッフリングプロトコル、ならびに本開示の完全な概観から明らか
である多くの他の特徴を提供する。
【００１２】 （発明の要旨） 本発明は、核酸のオリゴヌクレオチド補助シャッフリングを提供する。これら
のオリゴヌクレオチド補助アプローチは、ファミリーシャッフリング手順を特に
容易にして、実質的に単純化されたシャッフリングプロトコルを提供する。この
プロトコルは、全長の相同核酸を単離またはクローニングすることなく、ファミ
リーシャッフリングされた核酸を生成するために用いられ得る。さらに、本明細
書中のオリゴヌクレオチド補助アプローチは、さらに、非相同核酸のシャッフリ
ングにまで拡張され得、それにより、得られる組換え分子における、より大きな
配列スペースを増大し、従ってより大きな分子多様性を増大し得る。この技術は
また、古典的なＤＮＡシャッフリングプロトコル（例えば、ＤＮＡｓｅ媒介方法
）と、または他の多様性生成手順（例えば、古典的変異誘発）と合わされて、こ
れらの方法の融通性および処理能力を増加させ得る。
【００１３】 ファミリーシャッフリング手順に適用可能であるいくつかの方法が提供される
。これらの方法の１つの局面では、重複するファミリー遺伝子シャッフリングオ
リゴヌクレオチドのセットがハイブリダイズおよび伸長され、所望の形質および
特性について選択され得る組換え核酸の集団を提供する。代表的には、重複する
ファミリーシャッフリング遺伝子のオリゴヌクレオチドのセットは、複数の相同
性標的核酸に由来するコンセンサス領域のサブ配列を有する複数のオリゴヌクレ
オチドメンバー型を含む。オリゴのセットは、必要に応じて、他の区別し得る特
徴（交差能力、コドンのバリエーションまたは選択などを含む）を提供する。
【００１４】 組換え核酸の集団は、変性および再アニーリングされ得、変性した組換え核酸
を提供し、次いでこの変性した組換え核酸が再アニーリングされ得る。得られる
組換え核酸もまた選択され得る。これらの任意のまたは全ての工程は、反復して
繰り返され得、複数の組換え事象および選択事象を提供して、所望の形質または
特性を有する核酸を生成する。
【００１５】 関連の局面では、核酸組換えの間に核酸ファミリー多様性を導入するための方
法は、ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドの集団を含む、少な
くとも１セットのフラグメント化核酸を有する組成物を提供する工程、および少
なくとも１つのフラグメント化核酸を少なくとも１つのファミリー遺伝子シャッ
フリングオリゴヌクレオチドと組換える工程により行われる。次いで、この少な
くとも１つのファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドに対応する核
酸サブ配列を有する組換え核酸が再生されて、代表的には全長分子（例えば、全
長タンパク質）をコードする。
【００１６】 代表的には、ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドは、相同核
酸配列をアラインメントして、配列同一性の保存された領域および配列多様性の
領域を選択することにより提供される。配列多様性の少なくとも１つの領域に対
応する複数のファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドは（連続して
、または並行して）合成される。対照的に、フラグメントのセットは、（例えば
、ＤＮａｓｅを用いて）１以上の相同核酸を切断するか、または少なくとも１つ
の核酸の複数の領域に対応する１セットのオリゴヌクレオチドを合成することに
より、提供される（代表的には、全長核酸に対応するオリゴヌクレオチドが１セ
ットの核酸フラグメントのメンバーとして提供される）。本明細書中のシャッフ
リング手順では、これらの切断フラグメントは、ファミリー遺伝子シャッフリン
グオリゴヌクレオチドと共に、例えば、１以上の組換え反応において用いられ得
る。 オリゴヌクレオチドシャッフリングの反復方法が提供される。本明細書中
で示すように、オリゴヌクレオチドを用いて合成により生成された組換え核酸は
、切断され得、そして標準的な核酸シャッフリング方法論によりシャッフリング
され得るか、またはこの核酸が配列決定され得、そしてこの組換え核酸を組換え
るために用いられる第２のセットのファミリーシャッフリングオリゴヌクレオチ
ドを設計するために用いられ得る。これらの反復技術の一方または両方が続く回
の組換えのために用いられ得、そしてまた組換え産物の選択の回で共に用いられ
得る。選択工程は、組換え核酸の所望の多様性に依存して、１回または数回の組
換えの後であり得る（組換えを行う回数が多いほど、得られる組換え核酸集団の
多様性が高い）。
【００１７】 本明細書中の組換え反応におけるファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌク
レオチドの使用は、例えば、組換え反応により生じる組換え体が第２の核酸に対
応する配列内に埋め込まれた第１の核酸に由来する配列ドメインを有する組換え
核酸を提供し、例えば、第２の核酸に由来する埋め込まれた領域に最も類似する
領域が、組換え核酸に存在しない場合、相同な核酸の間での配列同一性ドメイン
または配列多様性ドメインのドメイン交換を提供する。
【００１８】 本発明の１つの特定の利点は、低い配列類似性を有する相同な核酸を組換える
能力、またはさらに非相同核酸を組換える能力である。これらの方法では、１以
上のセットのフラグメント化核酸が、１セットの交差ファミリー多様性オリゴヌ
クレオチドと組換えられる。これらの交差オリゴヌクレオチドの各々は、低い配
列類似性を有する相同核酸または非相同核酸に由来する複数の配列多様性ドメイ
ンに対応する複数の配列多様性ドメインを有する。１以上の相同核酸または非相
同核酸に由来するフラグメント化オリゴヌクレオチドは、交差オリゴの１以上の
領域にハイブリダイズし得、組換えを容易にする。
【００１９】 ファミリー多様性オリゴヌクレオチドプライマーを用いるファミリーシャッフ
リングＰＣＲアンプリコンの方法もまた提供される。これらの方法では、複数の
非均質相同テンプレート核酸が提供される。この複数の非均質相同テンプレート
核酸にハイブリダイズする複数のＰＣＲプライマーもまた提供される。複数のＰ
ＣＲアンプリコンは、複数のＰＣＲプライマーを用いる複数のテンプレート核酸
のＰＣＲ増幅により生成され、次いでこれは組換えられる。代表的には、ＰＣＲ
プライマーについての配列が、複数の不均質相同テンプレート核酸の配列につい
てアラインメントし、そして配列類似性の領域に対応するＰＣＲプライマーを選
択することにより選択される。
【００２０】 上記方法を実施するための種々の組成物、および上記の方法を実施することに
より得られる組成物もまた提供される。複数のオリゴヌクレオチドメンバー型の
オリゴヌクレオチドのライブラリーを含む組成物は、一例である。このライブラ
リーは、少なくとも約２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００以上
の異なるオリゴヌクレオチドメンバーを含み得る。このオリゴヌクレオチドメン
バー型は、選択されたセットの複数の相同標的配列の複数のメンバーの複数のサ
ブ配列領域に対応する。複数のサブ配列領域は、例えば、相同標的配列の選択さ
れたセットの複数の重複するかまたは重複しない配列領域を含み得る。オリゴヌ
クレオチドメンバー型は各々、代表的には、相同標的配列の選択されたセットの
少なくとも１つに由来する少なくとも１つのサブ配列に同一な配列を有する。上
記の、または本明細書のどこかに記載される、任意のオリゴヌクレオチド型およ
びセット（例えば、ファミリーシャッフリングオリゴヌクレオチド、交差オリゴ
ヌクレオチド、ドメイン交換オリゴヌクレオチドなど）は、本発明の組成物中に
含まれ得る。オリゴヌクレオチドメンバー型は、複数の相同標的配列に由来する
相同領域に対応する複数の相同オリゴヌクレオチドを含み得る。この実施態様で
は、複数の相同オリゴヌクレオチドの各々は、少なくとも１つの改変体サブ配列
を有する。本明細書中に示されるオリゴヌクレオチド媒介組換えを実施すること
により生じる、核酸およびコードされるタンパク質のライブラリーもまた、本発
明の１つの特徴である。
【００２１】 組成物は、必要に応じて、組換え反応を容易にする成分、例えば、ポリメラー
ゼ（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｔａｑ、ｖｅｎｔ、または
任意の多くの他の市販のポリメラーゼ））、リコンビナーゼ、核酸合成試薬、緩
衝剤、塩、マグネシウム、相同標的配列の選択されたセットの１以上の複数のメ
ンバーを有する１以上の核酸などを含む。
【００２２】 本発明の組成物を、例えば、本発明の方法を実施するための説明書とともに、
例えば、容器または他の包装材料中に含むキットもまた提供される。この方法を
実施するための本明細書中の組成物およびキットについての使用もまた提供され
る。
【００２３】 （定義） 他に示さない限り、以下の定義は、当該分野における定義を補う。
【００２４】 核酸は、核酸が、自然にまたは人工的に、共通の祖先配列に由来する場合、「
相同」である。自然進化の間に、２以上の子孫配列が、親配列から時間をかけて
、すなわち、変異および自然選択に起因して分岐する場合にこれは起きる。人工
的な条件下では、多様性は、例えば、２つの基本的方法のうちの一方において生
じる。第１に、所定の配列は、例えば、代表的なクローニングの間に生じるよう
に、人工的に別の配列と組換えられて子孫核酸を生じ得るか、または所定の配列
が化学的に改変され得るか、さもなければ得られる分子を改変するように操作さ
れ得る。あるいは、核酸は、選択された親核酸配列とは配列が異なる核酸を合成
することにより、新規に合成され得る。２つの核酸の先祖についての明白な知識
が存在しない場合、相同性は代表的には、２つの配列間の配列比較により推論さ
れる。２つの核酸配列が、各々の核酸の有意な部分にわたって配列類似性を示す
場合、この２つの核酸は共通の祖先を共有すると推論される。相同性を確立する
配列類似性の正確なレベルは、種々の因子に依存して、当該分野において変化す
る。本発明の目的のために、分岐中間体（２以上の関連する核酸の特徴を共有す
る、提案される配列）は相同な核酸である。
【００２５】 本開示の目的のために、２つの核酸は、これらが十分な配列同一性を有して、
この２つの核酸分子間での直接的な組換えが生じるのを可能にする場合、相同で
あるとみなされる。代表的には、核酸は、ほぼ同じ距離間隔をあけた密接な類似
性の領域を利用して、組換えが生じるのを可能にする。組換えはインビトロまた
はインビボにおいてであり得る。
【００２６】 しかし、本発明の特定の特徴の１つの利点は、標準の組換え技術が可能にする
のよりもより遠く関連した核酸を組換える能力であることが認識されるべきであ
る。特に、遠く関連するか、さらには検出可能には関連しない２つの核酸由来の
配列は、２つ以上の異なる非相同標的核酸または２つ以上の遠く関連する核酸由
来のサブ配列を有する交差オリゴヌクレオチドを用いて組換えられ得る。しかし
、２つの核酸が、本明細書中に示すとおりのオリゴヌクレオチド中間体を用いて
間接的にしか組換え可能でない場合、これらは、本開示の目的のために「非相同
」であるとみなされる。
【００２７】 本明細書中に用いられる「セット」とは、少なくとも２つの分子型のコレクシ
ョンをいい、代表的には、セットの意図される正確な用途に依存して、例えば、
少なくとも約５、１０、５０、１００、５００、１，０００以上のメンバーを含
む。
【００２８】 「ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチド」のセットは、相同核
酸の選択されたセットに由来する合成されたオリゴヌクレオチドのセットである
。これらオリゴヌクレオチドは、これらが（個々にまたは集合的に）１より多く
の相同核酸を伴う配列同一性の領域（および必要に応じて配列多様性の領域）を
有する場合、相同核酸の選択されたセットに由来する。集合的に、これらオリゴ
ヌクレオチドは、代表的に、相同核酸のセットの相同核酸の全長の実質的な部分
に対応する（例えば、相同核酸の長さの実質的な部分にわたって対応するオリゴ
ヌクレオチド）（例えば、セットのこれらオリゴヌクレオチドは、集合的に、相
同核酸の各々の全長の例えば２５％以上、しばしば３５％以上、一般に５０％以
上、代表的に６０％以上、より代表的に７０％以上、そしていくつかの適用では
８０％、９０％、または１００％に対応する）。最も通常では、これらファミリ
ー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドは、複数のメンバー型を含み、その
メンバー型の各々は、選択された相同核酸のセットの少なくとも１つのメンバー
（例えば、約２、３、５、１０、５０以上のメンバー型）に対する配列同一性領
域を有する。
【００２９】 「交差」オリゴヌクレオチドは、必要に応じて相同または非相同である、選択
された核酸のセットの少なくとも２つの異なるメンバーに対する配列同一性領域
を有する。
【００３０】 核酸が代表的には溶液中で会合する場合、核酸は、「ハイブリダイズする」。
核酸は、種々の十分に特徴付けられた物理化学的力（例えば、水素結合、溶媒排
除、塩基スタッキングなど）に起因してハイブリダイズする。核酸のハイブリダ
イゼーションに対する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉ
ｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第Ｉ部第２章、「Ｏｖｅｒｖ
ｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂ
ｅ ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ならびにＡｕｓｕ
ｂｅｌ、前出に見出される。
【００３１】 ２つの核酸が、同じ配列もしくは相補的な配列を有する場合、または一方の核
酸が他方のサブ配列である場合、または一方の配列が自然にもしくは人工操作に
よって他方に由来する場合、２つの核酸は、「対応する」。
【００３２】 さらなるヌクレオチド（または他の類似の分子）が核酸に取り込まれる場合、
この核酸は、「伸長」される。最も通常には、このことは、ポリメラーゼ（例え
ば、ＤＮＡポリメラーゼ）、例えば、核酸の３’末端で配列を付加するポリメラ
ーゼを用いて行われる。
【００３３】 ２つの核酸の各々に由来する配列が子孫核酸において合わされる場合、２つの
核酸は「組換え」られる。２つの配列は、両方の核酸が組換えの基質である場合
、「直接的に」組換えられる。２つの配列は、これらの配列が交差オリゴヌクレ
オチドのような中間体を用いて組換えられる場合、「間接的に組換え」られる。
間接的組換えに関して、わずか１つの配列が組換えの実際の基質であり、そして
いくつかの場合（すなわち、この核酸に対応する１以上のオリゴヌクレオチドが
ハイブリダイズおよび伸長される場合）には、いずれの配列も組換えの基質では
ない。
【００３４】 「フラグメント化核酸」のコレクションは、１以上の親核酸を（例えば、ヌク
レアーゼを用いて、または化学的切断を介して）切断することにより、または任
意の他の方法（例えば、相補的核酸の部分的鎖伸長）で親配列のサブ配列を生成
することにより誘導される核酸のコレクションである。
【００３５】 「全長タンパク質」は、天然の遺伝子によりコードされる対応のタンパク質と
実質的に同じ配列ドメインを有するタンパク質である。このタンパク質は、少な
くとも９５％が天然でコードされる遺伝子である限りは、（例えば、組換えおよ
び選択に起因して）対応する天然でコードされる遺伝子に対して改変された配列
を有し得る。
【００３６】 「ＤＮａｓｅ酵素」は、インビトロまたはインビボでＤＮＡの切断を触媒する
、ＤＮＡｓｅＩのような酵素である。広範な種々のＤＮａｓｅ酵素が周知であり
、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌ（全て
前出）に記載され、そしてその多くは市販される。
【００３７】 「核酸ドメイン」は、核酸の領域またはサブ配列である。このドメインは、複
数の相同核酸の間で保存されてもよいし、保存されなくともよい。代表的には、
ドメインが、２以上の配列間の比較により詳述される。すなわち、配列間の配列
多様性領域が、「配列多様性ドメイン」であり、一方、類似性領域が「配列類似
性ドメイン」である。「ドメイン交換」とは、１つの核酸に由来する１つの核酸
領域を、第２の核酸に由来する第２のドメインと交換する能力をいう。
【００３８】 「高い配列類似性」の領域とは、（例えば、手動で、またはデフォールトパラ
メータに設定された通常のプログラムＢＬＡＳＴを用いて）最大に対応するよう
にアラインメントされた場合に第２の選択された領域に対して９０％以上同一で
ある領域をいう。「低い配列類似性」の領域は、（例えば、手動で、またはデフ
ォールトパラメータに設定されたＢＬＡＳＴを用いて）最大に対応するようにア
ラインメントされた場合に第２の選択された領域に対して６０％以下が同一であ
り、より好ましくは４０％以下が同一である。
【００３９】 「ＰＣＲアンプリコン」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて作製さ
れる核酸である。代表的には、この核酸は、選択された核酸のコピーである。「
ＰＣＲプライマー」は、適切な反応条件下で、テンプレート核酸にハイブリダイ
ズし、そして熱安定性ポリメラーゼを用いて鎖伸長を可能にする核酸である。
【００４０】 「オリゴヌクレオチドのライブラリー」は、オリゴヌクレオチドのセットであ
る。このセットは、プールされ得るかまたは個々に入手可能であり得る。オリゴ
ヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡとの組合せ（例えば、
キメラプラスト（ｃｈｉｍｅｒａｐｌａｓｔ））であり得る。
【００４１】 （発明の詳細な説明） 本発明は、核酸シャッフリングに関する改良された形式に関する。特に、選択
されたオリゴヌクレオチドセットを組換えおよび／または遺伝子合成の基質とし
て使用することにより、シャッフリングプロセスを劇的に加速することが可能で
ある。さらに、オリゴヌクレオチド中間体を使用して、他の方法では組換えられ
得ない核酸を間接的に組換えることが可能である。結合されるべき配列に対応す
る物理的核酸への直接の接近は必要ではない。なぜなら、その配列は、オリゴヌ
クレオチド中間体を介して間接的に組換えられ得るからである。
【００４２】 簡潔には、最初に、相同な核酸配列のファミリーが、例えば、同一性／類似性
の領域および多様性の領域を選択するために利用可能なコンピューターソフトウ
ェアを使用して整列される。少なくとも１つの多様性の領域（および通常、少な
くとも１つの類似性の領域）に対応する、複数（例えば、２、５、１０、２０、
５０、７５、または１００以上）のオリゴヌクレオチドが合成される。これらの
オリゴヌクレオチドは直接シャッフルされ得るか、または１つ以上のそのファミ
リーの核酸と組換えられ得る。
【００４３】 関連する核酸のオリゴヌクレオチドベースの組換えは、多数の利用可能な標準
的シャッフリング方法と組合せられ得る。例えば、相同的な核酸をシャッフルす
るために、現在利用可能な手順（例えば、核酸をＤＮａｓｅで消化し、組換えを
生じさせ、次いで全長のテンプレートを再生することによる（例えば、Ｓｔｅｍ
ｍｅｒ（１９９８）ＤＮＡ ＭＵＹＡＧＥＮＥＳＩＳ ＢＹ ＲＡＮＤＯＭ Ｆ
ＲＡＧＭＥＮＴＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＥＡＳＳＥＭＢＬＹ、米国特許第５，８
３０，７２１号に記載される））がいくつか存在する。。従って、本発明の１つ
の実施態様において、少なくとも１つの相同的な核酸と同一な（または、相同的
な）全長核酸が提供され、ＤＮＡａｓｅで切断され、そして得られた核酸フラグ
メントのセットが、複数のファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチド
と組換えられる。この組換え方法は有利であり得る。なぜなら、このＤＮＡａｓ
ｅ切断フラグメントは、全長配列に再構成され得る「足場」を形成するからであ
り−この合成されたセット中で１つ以上の合成されたオリゴは欠損するという事
象における利点−からである。
【００４４】 しかし、本発明の１つの利点は、相同的な核酸間のいくつかの多様性領域を、
その相同的核酸またはその切断フラグメントが組換え混合物中に存在しなくとも
、組換える能力である。得られたシャッフルされた核酸は、異なる核酸由来の多
様性領域を含み得、これは単一の核酸中に異なる多様性ドメインを組合せる能力
を提供する。このことは、天然の配列の多様性を評価する非常に強力な方法を提
供する。
【００４５】 一般に、本明細書中の方法は、「オリゴヌクレオチド媒介シャッフリング」を
提供する。この方法において、関連する相同的核酸のファミリーに対応するオリ
ゴヌクレオチドは、組換えられて選択可能な核酸を生成する。この技術を使用し
て、相同的な核酸配列、または非相同的核酸配列でさえ、組換え得る。相同的な
核酸を組換える場合に、重複するファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレ
オチドのセット（これらは、例えば、相同的核酸の比較、およびオリゴヌクレオ
チドフラグメントの合成により派生する）が、ハイブリダイズされ、そして伸長
され（例えば、再アセンブリＰＣＲによって）、組換えられた核酸の集団を提供
する。この集団は、所望の特徴または特性ついて選択され得る。代表的には、重
複するファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセットは、複数の
相同的標的核酸由来のコンセンサス領域サブ配列を有する、複数のオリゴヌクレ
オチドメンバーのタイプを含む。
【００４６】 代表的には、ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドは、相同的
核酸配列を整列して配列同一性の保存領域および配列多様性の領域を選択するこ
とにより提供される。少なくとも１つの配列多様性領域に対応する複数のファミ
リー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドが（連続して、または並行して）
合成される。
【００４７】 オリゴヌクレオチドシャッフリングアプローチにおいて使用される、フラグメ
ントのセットまたはフラグメントのサブセットは、１つ以上の相同核酸を（例え
ば、ＤＮａｓｅで）切断する工程によって、ならびに少なくとも１つの核酸の複
数の領域に対応するオリゴヌクレオチドのセットを合成する工程（代表的には、
部分的核酸または全長核酸に対応するオリゴヌクレオチドが、核酸「フラグメン
ト」（切断フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドの両方を包含する用語）
のセットのメンバーとして提供される）によって部分的に提供され得る。本明細
書中のシャッフリング手順において、これらの切断フラグメントは、例えば、１
つ以上の組換え反応において、ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオ
チドと組合せて使用されて、組換え核酸を生成し得る。
【００４８】 以下は、本発明の、配列整列、オリゴヌクレオチド構築およびライブラリー生
成、シャッフリング手順ならびに他の局面に関する、詳細および実施例を提供す
る。
【００４９】 （相同的核酸配列を整列して、配列同一性の保存領域および配列多様性領域を
選択すること） １つの局面において、本発明は、配列同一性領域または配列類似性領域、およ
び多様性領域を決定するための、核酸配列の整列を提供する。重複するファミリ
ーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオチドのセットは、複数の相同的標的核酸
由来のコンセンサス領域サブ配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドメンバータ
イプを含み得る。これらのコンセンサス領域のサブ配列を、相同核酸の整列、お
よび同一性領域の同定または類似性領域の同定によって決定する。
【００５０】 １つの実施態様において、相同的核酸配列を整列し、そして少なくとも１つの
配列同一性の保存領域、および複数の配列多様性領域を選択する。複数の配列多
様性領域は、複数の配列多様性ドメインを提供する。代表的には、複数の配列多
様性ドメインに対応するファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドを
合成し、そして本明細書中に記載の種々の組換えプロトコルか、または他の利用
可能な種々の組換えプロトコルにおいて使用する。これらの組換え方法によって
合成される遺伝子は、必要に応じて、任意の利用可能な方法（組換えおよび／ま
たは変異誘発を含む）によって、さらにスクリーニングされるかまたはさらに多
様化される。
【００５１】 （相同的核酸の整列） 代表的には、本発明は、第１に、例えば、公に利用可能な核酸データベースま
たは独自の核酸データベースのいずれかから利用可能な配列に対して、同一の核
酸、あるいは核酸類似性の領域を整列する工程を包含する。公のデータベース／
検索サービスは、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）、Ｅｎｔｒｅｚ（登録商標）、Ｅ
ＭＢＬ、ＤＤＢＪ、およびＮＣＢＩに提供されるデータベース／検索サービスを
含む。多くのさらなる配列データベースが、インターネット上で、またはゲノム
情報の作成および／もしくは貯蔵を専門とする種々の企業からの契約ベースで、
利用可能である。
【００５２】 用語「同一な」または「同一性」パーセントとは、２つ以上の核酸配列または
ポリペプチド配列の文脈において、最大の一致について比較および整列した場合
に、下記の配列比較アルゴリズム（または当業者が利用可能な他のアルゴリズム
）の１つを使用して測定した時または目視検査によって、同一な２つ以上の配列
もしくはサブ配列をいう。あるいは、最大の一致について比較および整列した場
合に、下記の配列比較アルゴリズム（または当業者が利用可能な他のアルゴリズ
ム）の１つを使用して測定した時または目視検査によって、同一の、特定のパー
センテージのアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列もし
くはサブ配列をいう。
【００５３】 慣用句「実質的に同一な」とは、２つの核酸もしくはポリペプチドの文脈にお
いて、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して測定した時または目視検査
によって、最大の一致について比較および整列した場合に、少なくとも約５０％
、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％の、ヌクレオチド同一性また
はアミノ酸残基同一性を有する、２つ以上の配列あるいは部分配列をいう。この
ような「実質的に同一な」配列は、代表的には、相同性であると考えられる。
【００５４】 配列比較および相同性決定のために、代表的には、１つの配列が、試験配列が
比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試
験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要ならば、配列座標を指定
し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列
比較アルゴリズムは、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを、指
定のプログラムパラメーターに基づいて計算する。
【００５５】 比較のために最適な配列の整列を、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａ
ｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アル
ゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４
８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎお
よびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：
２４４４（１９８８）の同様の方法のための検索によって、これらのアルゴリズ
ムのコンピューター化による実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およ
びＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ
、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査（
一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌら、下記を参照のこと）によって行い得る。
【００５６】 配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適切なアル
ゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈ
ｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）に記載さ
れている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公
に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、問い合わせ配列中の長さＷの
短いワードを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する工程を
包含する。このワードは、データベース配列中で同じ長さのワードを用いて整列
した場合に、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはＴを満たすかのい
ずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、
前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを発
見するための検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）として働く。次いで、ワ
ードヒットは、各配列に沿って両方向に、累積整列スコアが増加し得る限りの間
伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一
致する残基の対に関する褒賞スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基
に関する罰則スコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列について
は、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向でのワ
ードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積整列スコアが、その最大到
達値から量Ｘだけ減少する；１つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積に起因して
、累積スコアがゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に到達する。ＢＬ
ＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を
決定する。ＢＬＡＳＴプログラム（核酸配列に関する）は、デフォルトとして、
ワード長（Ｗ） １１、期待値（Ｅ） １０、カットオフ １００、Ｍ＝５、Ｎ
＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴ
Ｐプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ） ３、期待値（Ｅ） １０
、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏ
ｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）。
【００５７】 配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはま
た、２つの配列間の類似性の統計的解析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎおよ
びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９０：５８７３〜５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによ
り提供される類似性の１つの尺度は、最小の合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これ
は、２つヌクレオチド間またはアミノ酸間の一致が偶然生じる確率の指標を提供
する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が約０．
１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未
満である場合に、核酸は、参照配列に類似（従って、相同である可能性がある）
と考えられる。他の利用可能な配列整列プログラムは、例えば、ＰＩＬＥＵＰを
含む。
【００５８】 多くのさらなる配列整列プロトコルは、例えば、本明細書とともに提出された
（代理人整理番号０２−２８９−３ＵＳ）、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖら、による「Ｍ
ＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ、
ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶ
ＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」に見出され得る。
【００５９】 （オリゴヌクレオチド合成） １つの局面において、本発明は、例えば、少なくとも１つの配列多様性領域に
対応する、複数のファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドを合成す
る工程を包含する。代表的には、ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレ
オチドのセットは、例えば、連続的オリゴヌクレオチド合成プロトコルまたは並
行オリゴヌクレオチド合成プロトコルにより、作製される。
【００６０】 オリゴヌクレオチドは、例えば、インビトロ増幅／遺伝子再構成／再アセンブ
リ方法における使用のためであろうと、またはファミリー遺伝子シャッフリング
オリゴヌクレオチドのセットを提供するためであろうと、代表的には、Ｂｅａｕ
ｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９〜１８６２に記載される固相ホスホルアミダ
イトトリエステル法に従って、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅ
ｒら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１
６８に記載されるような自動化合成装置を使用して、化学的に合成される。広範
な種類の装置が、自動化オリゴヌクレオチド合成のために市販される。前出で議
論されるような、多重ヌクレオチド合成アプローチ（例えば、トリヌクレオチド
合成）もまた、有用である。
【００６１】 さらに、基本的に任意の核酸が、種々の市販の供給源（例えば、Ｔｈｅ Ｍｉ
ｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ
＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ
Ｃｏｍｐａｎｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、Ｅｘｐｒｅ
ｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏ
ｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）およびその
他多数）のいずれかから、特別注文され得る。
【００６２】 （合成ライブラリーアセンブリ） ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのライブラリーを提供す
る。例えば、目的の相同遺伝子を、上記のようにＢＬＡＳＴのような配列整列プ
ログラムを使用して整列する。相同体間のアミノ酸変化に対応するヌクレオチド
に注意する。合成遺伝子シャッフリングのためのオリゴを設計する。このオリゴ
は、整列された相同的配列のいずれに対しても１つ（以上）のヌクレオチドの差
異を含む。すなわち、第１の核酸と同一であるが、第１の核酸と相同であるが同
一ではない核酸の残基に対応する位置に、残基を組み込むオリゴを設計する。
【００６３】 好ましくは、全ての可能な核酸改変体を組み込む、選択された長さのオリゴヌ
クレオチド（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、ま
たは１００以上のヌクレオチド）の全てを作製する。これは、Ｘ個の配列変異に
つきＸ個のオリゴヌクレオチドを含む（ここで、Ｘは、１つの遺伝子座で異なる
配列の数である）。Ｘ個のオリゴヌクレオチドは、改変体ヌクレオチドを示すヌ
クレオチドを除いて、配列中ではほとんど同一である。この類似性のために、単
一の合成反応、または試薬のセットを使用して各オリゴヌクレオチドの共通部分
を作製する、並行合成ストラテジーあるいはプールされた合成ストラテジーを利
用することが、有利であり得る。これは、例えば、周知の固相核酸合成技術によ
って、または、例えば、アレイベースのオリゴヌクレオチド合成方法（例えば、
Ｆｏｄｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７〜７７７；Ｆｏｄｏ
ｒ（１９９７）「Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｉｐｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｏｍｅ」ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ．１１：１２１〜１２１；Ｆｏｄｏｒ（
１９９７）「Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ．２７７：３９３〜３９５；およびＣｈｅｅら（１９９６）「Ａｃｃ
ｅｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ−
Ｄｅｎｓｉｔｙ ＤＮＡ Ａｒｒａｙｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０〜６
１４を参照のこと）を利用して、実施され得る。さらなるオリゴヌクレオチド合
成ストラテジーは、例えば、本明細書とともに提出された（代理人整理番号０２
−２８９−３ＵＳ）、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖら、による「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ
ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ、ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯ
ＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥ
Ｄ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」に見出され得る。
【００６４】 １つの局面において、オリゴヌクレオチドを、その合成ストラテジーにおいて
、コードされるアミノ酸変化のみが考慮されるように選択する。このストラテジ
ーにおいて、相同的核酸のファミリーの整列後に、塩基変化によってコードされ
るポリペプチド配列において変更が生じる位置のみで縮重するように、ファミリ
ーシャッフリングオリゴを合成する。このことは、コードされる産物における同
程度の多様性を達成するために、より少ない縮重オリゴヌクレオチドしか必要と
せず、それによりファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセット
の合成が簡単になるという利点を有する。
【００６５】 一般に、合成ストラテジーにおいて、オリゴヌクレオチドは、適度に効率の良
いハイブリダイゼーションおよびアセンブリを保証するために、変化の領域の各
々の側と同一の配列の少なくと約１０塩基を有する。しかし、同一の塩基に隣接
する領域は、同一の塩基をより少なく（例えば、５、６、７、８、または９）有
し得、そしてもちろん、同一のより大きい領域（例えば、１１、１２、１３、１
４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、５０以上）を有し得る
。
【００６６】 遺伝子アセンブリの間、オリゴヌクレオチドを一緒にインキュベートし、そし
て例えば、本明細書中に記載のように、そして当業者に公知のように、様々のポ
リメラーゼ媒介再アセンブリ方法のいずれかを使用して再アセンブリし得る。選
択されたオリゴヌクレオチドは、任意の選択された濃度の組換え混合物中に「ス
パイク」され、それにより所望の改変の優先的組み込みを引き起こし得る。
【００６７】 例えば、オリゴヌクレオチドの伸長の間、ハイブリダイズされたオリゴヌクレ
オチドは、核酸ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ、Ｋｌｅｎｏｗなど）およびｄＮ
ＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の存在下で
インキュベートされる。配列同一性領域が大きい場合、Ｔａｑまたは他の高温ポ
リメラーゼを、およそ室温と、例えば、約６５℃との間のハイブリダイゼーショ
ン温度で使用し得る。同一性領域が小さい場合、Ｋｌｅｎｏｗ、Ｔａｑ、または
ポリメラーゼを、室温より低いハイブリダイゼーション温度で使用し得る。ポリ
メラーゼを、オリゴヌクレオチドおよび他の組換え成分のハイブリダイゼーショ
ンの前、同時、または後に、核酸フラグメント（オリゴヌクレオチドおよび組任
意のさらなる核酸は、換え混合物を形成する）に添加し得る。本開示中の他の部
分で記載されるように、本発明の特定の実施態様は、得られた伸長された二本鎖
核酸配列を変性し、次いでそれらの配列を再びハイブリダイズおよび伸長する工
程を含み得る。このサイクルを、所望の任意の回数反復し得る。このサイクルは
、例えば、約２〜約１００回反復される。
【００６８】 （ライブラリーのスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）） ファミリーオリゴヌクレオチドをまた使用して、代表的なシャッフリング混合
物（例えば、遺伝子の相同なセット由来の１つ以上の遺伝子のＤＮａｓｅフラグ
メントの混合物）中に存在する核酸を変化し得る。１つの局面において、シャッ
フルされる全ての核酸を、上記のように整列する。アミノ酸変化に注意および／
または注目する（例えば、適切な配列整列ソフトウェアを実行するコンピュータ
ーを含む統合されたシステム中で、または、例えば、配列のプリントアウトもし
くは配列整列のプリントアウト上で手動で）。また、本明細書とともに提出され
た（代理人整理番号０２−２８９−３ＵＳ）、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖら、による「
ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ
、ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡ
ＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」を参照のこと。
上記のように、整列された核酸についての天然の配列多様性によってコードされ
る、いくつかまたは全てのアミノ酸変異を組み込むように、ファミリーシャッフ
リングオリゴを設計する。整列された核酸の相同的なセットに対応する１つ以上
の核酸を切断する（例えば、ＤＮａｓｅを使用して、または化学的切断により）
。ファミリーシャッフリングオリゴを、切断された核酸の混合物中にスパイクし
、次いで、標準的技術を使用して、組換え、全長配列へと再アセンブリする。
【００６９】 オリゴヌクレオチドの組み込みの程度を決定するために、類似の核酸を区別す
る任意のアプローチを使用し得る。例えば、再アセンブリされた核酸を、クロー
ン化し得、および配列決定し得、または増幅し得（インビトロで、もしくは、例
えば、標準的クローニングベクターへのクローニングにより）、ならびにファミ
リーシャッフリングオリゴ中に存在するが、切断されたもともとの核酸中の同じ
位置に存在しない、特定の多型配列を特異的に認識する制限酵素により切断し得
る。
【００７０】 別の実施態様において、アミノ酸多型に対応する１つ以上の配列変異を組み込
むが、サイレント置換に対応する核酸配列間の多型ヌクレオチド変異を除去する
、オリゴヌクレオチドを選択する。このストラテジーの１つの利点は、サイレン
ト置換の除去が、組換えのための所定の基質（例えば、選択された標的核酸）に
対してより類似する所定の配列を作製し得ることである。この類似性の増加は、
他の方法では、有効な組換えのためにはあまりにも多様であり得る配列の間での
、核酸組換えを可能にする。
【００７１】 例えば、選択された核酸を、標準的方法を使用してＰＣＲ増幅し得る。選択さ
れた核酸を切断し、ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのライ
ブラリーと混合する。このファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチド
は、選択された核酸において見出されるのと同じサイレント置換のセットを含む
オリゴヌクレオチドを作製することにより、選択される核酸の対応する配列に可
能な限り類似するようにされている。このオリゴヌクレオチドを、選択される濃
度で切断混合物中にスパイクし、次いで、全長配列へと再アセンブリする。得ら
れたライブラリーの特性（例えば、このオリゴが、再アセンブリされた配列へ組
み込まれる頻度）を、上記のように、再アセンブリされた配列を、クローニング
（またはさもなければ増幅）および配列決定および／または制限酵素消化するこ
とにより、チェックする。
【００７２】 ＰＣＲ伸長ストラテジーもまた、組換え混合物中で異なるモル比のオリゴヌク
レオチドを使用してライブラリーを作製するために、使用し得る（例えば、ＷＯ
９７／２００７８、ＷＯ ９８／４２８３２およびＷＯ ９８／０１５８１も
また参照のこと）。
【００７３】 （反復オリゴヌクレオチド形式） １つの局面において、本発明は、反復オリゴヌクレオチド媒介組換え形式を提
供する。これらの形式を、標準的組換え方法と、また必要ならば反復形式で、組
合せ得る。
【００７４】 詳細には、オリゴヌクレオチド媒介組換えにより生成される組換え核酸を、活
性についてスクリーニングし、そして配列決定し得る。配列決定された組換え核
酸を整列し、そして同一性領域および多様性領域を同定する。次いで、ファミリ
ーシャッフリングオリゴヌクレオチドを、配列決定された組換え核酸の組換えの
ために選択する。活性な組換え核酸をスクリーニングし、配列決定し、そして活
性な組換え核酸を組換えるこのプロセスを、所望の特性を有する分子を得るまで
反復して繰り返し得る。
【００７５】 さらに、ファミリーシャッフリングオリゴヌクレオチドを使用して作製された
組換え核酸を、必要に応じて反復性である標準的組換え方法を使用して切断およ
びシャッフルし得る。標準的組換えを、オリゴヌクレオチドシャッフリングと組
合せて使用し得、そしていずれかの工程または両方の工程を、必要ならば反復し
て繰り返す。
【００７６】 ファミリーオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド媒介組換えによる反復シ
ャッフリングの１つの有用な例は、極端な微粒子シャッフリングが所望される場
合に生じる。例えば、小さいタンパク質（例えば、デフェンシン（約５０アミノ
酸の抗真菌性タンパク質）、ＥＦ４０（約２８アミノ酸の抗真菌性タンパク質フ
ァミリー）、ペプチド抗生物質、ペプチド殺虫性タンパク質、ペプチドホルモン
、多くのサイトカイン、および多くの他の小さいタンパク質）をコードする小さ
い遺伝子は、標準的方法により組換えることが困難である。なぜなら、組換えは
、しばしば、組換えられるべき遺伝子のサイズとほぼ同じ頻度で生じ、組換えか
ら生じる多様性を制限するからである。対照的に、オリゴヌクレオチド媒介組換
え方法は、任意の配列のセットにおける実質的に任意の多様性の領域を、選択さ
れた任意の塩基対で生じる組換え事象（例えば、交差）を用いて組換え得る。
【００７７】 従って、反復オリゴヌクレオチド媒介組換えにより調製された配列のライブラ
リーを、必要に応じて、所望の特性についてスクリーニングおよび選択し、そし
て改良された（または、さもなければ所望の）クローンを、さらなる核酸ライブ
ラリーを作製するために反復されるプロセスによって、配列決定する（またはさ
もなければ、例えば、リアルタイムＰＣＲ分析（例えば、ＦＲＥＴもしくはＴａ
ｑＭａｎ）により、あるいは制限酵素分析を使用して、脱回旋（ｄｅｃｏｎｖｏ
ｌｕｔｅｄ）する）。従って、さらなる回の組換えを、標準的フラグメント化ベ
ースの組換え方法か、または陽性クローンの配列決定のいずれかによって実行し
、適切なファミリーシャフリングオリゴヌクレオチドを設計し、そして第２回の
組換え／選択を実行して、さらなるライブラリー（これは、記載されるように組
換えられ得る）を作製する。さらに、異なる回の組換えから作製されたライブラ
リーもまた、配列決定／オリゴヌクレオチド組換え、または標準的組換え方法の
いずれかによって、組換え得る。
【００７８】 （交差ＰＣＲシャッフリング） １つの局面において、本発明は、遠縁の配列（または非相同性配列でさえ）の
シャッフリングを提供する。この実施態様において、ＰＣＲ交差オリゴヌクレオ
チドを、第１の核酸由来の第１の領域、および第２の核酸に対応する第２の領域
を用いて設計する。第１の核酸または第２の核酸のいずれかに対応するさらなる
オリゴ、および交差オリゴに相補的（または同一）の配列を有するさらなるオリ
ゴを設計する。これらのオリゴを組換える（すなわち、連続するポリメラーゼ媒
介伸長反応中で、これらのオリゴをハイブリダイズさせ、次いで、そのハイブリ
ダイズされたオリゴヌクレオチドを伸長する）ことにより、第１の核酸または第
２の核酸のいずれかと組換え得る、そして他の核酸由来の配列を同時に組み込む
基質を提供する。
【００７９】 （ファミリーシャッフリングキメラプラストを利用するインビボのオリゴヌク
レオチド組換え） キメラプラスト（ｃｈｉｍｅｒａｐｌａｓｔ）は、「遺伝的手術」のために使
用されている合成ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子であり、ここで、キメラ分子
での組換えによってゲノムＤＮＡ中において１つまたはいくつかの塩基が変化さ
れる。キメラプラストは、分子の末端上に二重のヘアピンキャップを有する二重
鎖の立体配座におけるＲＮＡおよびＤＮＡ残基の隣接ストレッチからなるキメラ
核酸である（Ｙｏｏｎら、（１９９６）ＰＮＡＳ ９３：２０７１−２０７６）
。ＲＮＡ−ＤＮＡ配列は、キメラプラストでの組換えによって改変されるべき遺
伝子座の配列を用いて、その遺伝子座についての塩基配列において所望の変化を
有するキメラプラストと整列するように設計される。宿主細胞の修復機構は、宿
主細胞の配列をキメラプラストの配列に変換する。この技術の簡潔な総説として
、Ｂａｒｔｌｅｔｔ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１６：１３１２；Ｓｔｒａｕｓｓ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
４：２７４−２７５を参照のこと。
【００８０】 このストラテジーは、哺乳動物細胞のエピソームＤＮＡ上にコードされるヒト
の肝臓／腎臓／骨のアルカリホスファターゼについての遺伝子における、点変異
の標的化された修正のために使用されている（Ｙｏｏｄ、同上）。このストラテ
ジーはまた、リンパ芽球腫細胞中のゲノムＤＮＡにおいて鎌状赤血球貧血の原因
である変異の修正のために使用された（Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓら（１９９６
）Ｓｃｉｅｎｃｅ １３８６−１３８９）。ＡｌｅｘｅｅｖおよびＹｏｏｎ（１
９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３４３−１３４６は、
マウスチロシナーゼ遺伝子における点修正（これは、マウス細胞における白子変
異の修正、およびその細胞による黒色色素沈着の産生を生じる）を作製するため
の、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド（「ＲＤＯ」）の使用を記
載する。Ｋｒｅｎら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４（３）：
２８５−２９０は、キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドによる、インビボ
での第ＩＸ因子遺伝子の部位特異的突然変異誘発を記載する。Ｘｉａｎｇら（１
９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：８２９−８３５は、キメラＲＮＡ−ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドを使用した、哺乳動物のＣＤ３４+富化細胞集団における標
的化された遺伝子変換を記載する。Ｋｒｅｎら（１９９７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇ
ｙ ２５（６）：１４６２−１４６８は、キメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオ
チドによって媒介される、Ｈｕ−Ｈ−７細胞のアルカリホスファターゼ遺伝子に
おける標的化されたヌクレオチド変換を記載する。
【００８１】 本発明の１つの局面において、ファミリーシャッフリングオリゴヌクレオチド
はキメラプラストである。この実施態様において、ファミリーシャッフリングす
るオリゴヌクレオチドは、本明細書中に示されるように作製されて、構造的なキ
メラプラストの特徴をさらに含む。例えば、上記の参考文献において、ＤＮＡ−
ＲＮＡオリゴは、標準的なホスホラミダイト連結化学に従って合成される（利用
されるヌクレオチドは、必要に応じて標準的でないヌクレオチド（例えば、２−
Ｏメチル化ＲＮＡヌクレオチド）を含む）。このオリゴは、上記の参考文献に示
されるように、「二重のヘアピン」構造（例えば、構造の末端にＴループを有す
る）を有する。
【００８２】 ファミリーシャッフリングキメラプラストの各々のセットは、目的の標的遺伝
子と同一の領域、および目的の標的遺伝子において見出される多様性（すなわち
、特定の部分配列についての配列変異）に対応する多様性の領域を含む。図１に
示されるように、オリゴヌクレオチドのセットは、細胞（例えば、植物細胞）内
に形質導入される。ここで、キメラプラストは細胞のゲノム中の目的の配列と再
び結合し、それによって目的の標的遺伝子において少なくとも１つの多様性の領
域を有する細胞のライブラリーを作製する。次いで、本明細書中に記載のように
ライブラリーをスクリーニングし、そして選択する。必要に応じて、選択された
ライブラリーのメンバーを、同じかまたは異なるセットのキメラプラストオリゴ
ヌクレオチドを用いるキメラプラスト組換えのさらなる回、次いで記載されるよ
うな選択／スクリーニングアッセイに供する。
【００８３】 例えば、キメラプラストは、相同性核酸の整列後に観察される配列多様性の領
域に対応する配列を用いて合成される。すなわち、キメラプラストは各々、１つ
以上の標的配列内へのキメラプラストの組み込み後に、相同性遺伝子中に見出さ
れる部分配列への遺伝子の部分配列の変換を生じる、１つかまたはいくつかのヌ
クレオチドを含む。相同性のキメラプラスト配列のライブラリーを細胞の集団中
に形質導入することによって、細胞内の目的の標的遺伝子を、１つ以上の相同性
配列に由来する配列に対して１つ以上の位置で変換する。従って、キメラプラス
トライブラリーで細胞集団を形質導入することの効果は、標的配列に相同な遺伝
子において見出される配列多様性に対応する標的遺伝子のライブラリーを作製す
ることである。
【００８４】 キメラプラストはまた、選択された位置で、非相同性配列の選択を用いて標的
遺伝子を変換するため（例えば、構造的または他の情報が、そのような変換の所
望性を示唆する場合）に、同様に用いられ得る。この実施態様において、キメラ
プラストは、非相同性の配列置換に対応する配列を含む。
【００８５】 必要に応じて、キメラプラスト、または同時トランスフェクトされるＤＮＡは
、標的遺伝子をキメラプラストで組換えた細胞の選択または回収を可能にするよ
うに、配列タグ、選択マーカー、または他の構造的な特徴を組み込み得る。例え
ば、同時トランスフェクトされたＤＮＡは、薬物耐性、または検出可能なマーカ
ー（例えば、ＬａｃＺ、または緑色蛍光タンパク質）の発現のようなマーカーを
含み得る。
【００８６】 さらに、キメラプラスト中の配列は、精製または増幅のタグとして使用され得
る。例えば、キメラプラストの一部分が、ＰＣＲプライマーに対して相補的であ
り得る。この実施態様において、ＰＣＲプライマーは、ライブラリーの細胞から
組換え遺伝子を合成するために使用される。同様に、ＰＣＲプライマーは目的の
領域（キメラプラストと標準的ＤＮＡとの間で組換えが生じる領域を含む）を一
まとめにし得る。他のＰＣＲ、制限酵素消化および／またはキメラプラストとの
間の組換えに起因する核酸の単離を生じるクローニングストラテジーもまた使用
して、組換え核酸を回収し得る。この組換え核酸を、必要に応じてさらなる核酸
と組換える。キメラプラスト媒介組換え、組換え核酸の回収、および回収された
核酸の組換えの反復サイクルを、標準的な組換え方法を使用して実施し得る。選
別サイクルは、所望の核酸について選択するための任意の組換え事象の後に実施
され得、または代わりに、選択工程を実施する前に数回の組換えを実施し得る。
【００８７】 （キメラプラストのライブラリーおよび他の遺伝子組換えビヒクル） 上記のように、キメラプラストは、インビボでの標的遺伝子におけるヌクレオ
チド配列の改変のために、一般的に有用な構造である。従って、キメラプラスト
の活性を最適化する構造が所望される。従って、上述のようなインビトロまたは
インビボでの組換え形式におけるキメラプラストの使用に加えて、本発明はまた
、インビトロおよびインビボでのキメラプラスト活性の最適化、ならびに多くの
関連ライブラリーおよび他の組成物を提供する。
【００８８】 特に、マーカーを関連のキメラプラストのライブラリーに組み込み得る。この
マーカーは、キメラプラストと標的核酸との間での組換えに続いて、標的核酸中
に組み込まれる分子の領域内のキメラプラストの末端間に配置される。例えば、
マーカーは組換えの生じる細胞中で検出可能な表現型効果を生じ得るか、または
マーカーは単に、標準的な核酸配列検出技術（例えば、その配列またはその隣接
配列のＰＣＲ増幅、ＬＣＲ、組換え事象によって作製される配列の制限酵素消化
、アレイに対する組換え核酸の結合（例えば、遺伝子チップ）、および／または
組換え核酸の配列決定など）によって検出され得る、標的配列における変化をも
たらし得る。通常は、配列が異なる領域を決定して、配列が組換え率を増加した
ことの指標を提供する。
【００８９】 関連のキメラプラストのライブラリーは、Ｔループのヘアピン領域およびマー
カーに隣接するＴループヘアピン領域の間の領域において配列開散性（ｄｉｖｅ
ｒｇｅｎｃｅ）の領域を有するキメラプラストを含む。この開散性は、本明細書
中に記載のような異種配列の生成を提供する合成ストラテジーによって生成され
得る。
【００９０】 例えば、改変ヌクレオチドを除いて、配列がほとんど同一であるキメラプラス
トを利用する合成的ストラテジーを、合成ストラテジーを単純化するために作製
する。この類似性の理由で、並行する合成ストラテジーまたはプールされた合成
ストラテジーが使用され得、ここでは単回の合成反応かまたは試薬のセットを使
用して各オリゴヌクレオチドの共通部分を作製する。これは、例えば、市販のオ
リゴヌクレオチド合成装置において、例えば、周知の固相の核酸合成技術によっ
て、または例えば、アレイに基づいたオリゴヌクレオチド合成方法（例えば、Ｆ
ｏｄｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７７；Ｆｏｄｏｒ
（１９９７）「Ｇｅｎｅｓ、Ｃｈｉｐｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｏｍｅ」ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ．１１：１２１−１２１；Ｆｏｄｏｒ（１
９９７）「Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７７：３９３−３９５；およびＣｈｅｅら（１９９６）「Ａｃｃｅ
ｓｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ−
Ｄｅｎｓｉｔｙ ＤＮＡ Ａｒｒａｙｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０−６
１４を参照のこと）を利用することによって実施される。従って、本発明の１つ
の特徴は、これらの方法によって作製されるキメラプラストのライブラリー（す
なわち、共通の配列エレメント（例えば、共通のマーカーを含む）ならびに異な
る領域（例えば、分子のヘアピン領域における異なる配列）を共有するキメラプ
ラストのライブラリー）である。
【００９１】 これらの方法によって作製されるライブラリーは、上記のように組換え率の増
加についてスクリーニングされる。増加した組換え率を有するとして同定される
ライブラリーのメンバーを、必要に応じて、それ自身で組換えて組換えキメラプ
ラストのライブラリーを生成する。組換えは通常、最初に増大した組換え率を示
すメンバーの配列をアッセイすること、次いでこれらのメンバーの少なくとも２
つに対して構造的な類似性を示すキメラプラストの合成によって実施され得る。
このプロセスは、増加した組換え活性を有する新たな「組換え」キメラプラスト
を作製するため、ならびにそのようなキメラプラストのライブラリーを作製する
ために反復的に繰り返され得る。
【００９２】 他の組換え分子は、同様に、これらの方法によって作製され得る。例えば、細
胞形質導入／形質転換ベクター中のＣｒｅ−Ｌｏｘ部位、Ｃｈｉ部位および他の
組換えを促進する配列が上記と同様の様式で改変され、そして選択される。配列
が単純なＤＮＡ配列である場合、それらは本明細書中に述べられた合成方法、お
よび／または標準的なＤＮＡシャッフリング方法のいずれかによって組換えられ
得る。
【００９３】 （コドン改変オリゴヌクレオチド） コドン改変オリゴヌクレオチドは、配列は類似であるが１つ以上の塩基の改変
を有するオリゴヌクレオチドであり、ここでこの改変は少なくとも１つのコード
アミノ酸の差異に対応する。これはトリヌクレオチド（すなわち、コドンに基づ
くホスホラミダイト連結化学）を利用して合成され得る。ここで２０個のアミノ
酸の全てについてのコドンを示す、トリヌクレオチドホスホラミダイトを使用し
て、この固相技術によって合成されるオリゴヌクレオチド配列中に完全なコドン
を導入する。好ましくは、選択される核酸配列を組み込んだ、選択される全ての
長さのオリゴヌクレオチド（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、もしくは１００か、またはそれ以上のヌクレオチド）を合成する。
本発明において、コドン改変オリゴヌクレオチド配列は、選択される相同性核酸
のセット由来の配列に基づき得る。
【００９４】 トリヌクレオチドホスホラミダイトの合成、オリゴヌクレオチド合成における
それらの引き続いての使用、および関連の問題は、例えば、以下において記載さ
れる；Ｖｉｒｎｅｋａｓ，Ｂ．ら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、２２、５６００−５６０７、Ｋａｙｕｓｈｉｎ，Ａ．Ｌ．ら（１９９
６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２４、３７４８−３７５５、Ｈｕ
ｓｅ、米国特許第５，２６４，５６３号「ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＳＹＮＴＨ
ＥＳＩＺＩＮＧ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＷＩＴＨ ＲＡＮＤＯＭ
ＣＯＤＯＮＳ」、Ｌｙｔｔｌｅら、米国特許第５，７１７，０８５号「ＰＲＯ
ＣＥＳＳ ＦＯＲ ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ ＣＯＤＯＮ ＡＭＩＤＩＴＥＳ」、Ｓ
ｈｏｒｔｌｅら、米国特許第５，８６９，６４４号、「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ Ｏ
Ｆ ＤＩＶＥＲＳＥ ＡＮＤ ＵＳＥＦＵＬ ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮＳ ＯＦ
ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ」；Ｇｒｅｙｓｏｎ、米国特許第５，７８９
，５７７号「ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＴＨＥ ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ ＳＹＮＴ
ＨＥＳＩＳ ＯＦ ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＭＩＸＴＵＲＥＳ ＷＨＩ
ＣＨ ＥＮＣＯＤＥ ＤＥＳＩＲＥＤ ＭＩＸＴＵＲＥＳ ＯＦ ＰＥＰＴＩＤ
ＥＳ」；およびＨｕｓｅ、ＷＯ９２／０６１７６「ＳＵＲＦＡＣＥ ＥＸＰＲＥ
ＳＳＩＯＮ ＬＩＢＲＡＲＩＥＳ ＯＦ ＲＡＮＤＯＭＩＺＥＤ ＰＥＰＴＩＤ
ＥＳ」。
【００９５】 コドン改変オリゴヌクレオチドは、種々のトリヌクレオチド関連技術（例えば
、トリヌクレオチド合成形式および分断プール（ｓｐｌｉｔ−ｐｏｏｌ）合成形
式）を使用して合成され得る。トリヌクレオチドおよび分断プールコドンの両方
のコドン改変オリゴヌクレオチドの合成方法に関連する化学は、当業者に周知で
ある。一般的に、両方の方法は、ホスホラミダイト固相化学合成を利用し、ここ
で核酸基質配列の３’末端を、固体支持体（例えば、コントロールの細孔ガラス
）に共有結合的に接着する。５’保護基は、例えば、トリフェニルメチル基（例
えば、ジメトキシルトリチル（ＤＭＴ）またはモノメトキシトリチル）；カルボ
ニル含有基（例えば、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）ま
たはレブリノイル）；酸クリアラブル（ｃｌｅａｒａｂｌｅ）基（例えば、ピキ
シル（ｐｉｘｙｌ））；フッ化物クリアラブルアルキルシリル基（例えば、ｔｅ
ｒｔ−ブチルジメチルシリル（Ｔ−ＢＤＭＳｉ）、トリイソプロピルシリル、ま
たはトリメチルシリル）であり得る。３’保護基は、例えば、β−シアノエチル
基であり得る。
【００９６】 トリヌクレオチド合成形式は、５’末端および少なくとも１つの塩基（これら
の両方は、その上に保護基を有する）を有する基質配列を提供する工程を含む。
次いで、基質配列の５’保護基を、除去して５’脱保護された基質配列を提供し
、次いでこれは選択されたトリヌクレオチドホスホラミダイト配列と連結される
。トリヌクレオチドは、３’末端、５’末端、および３つの塩基（これらの各々
はその上に保護基を有する）を有する。連結工程は、伸長したオリゴヌクレオチ
ド配列を産生する。その後、この除去工程および連結工程を、必要に応じて反復
する。これらの工程を反復する場合、各々の反復の連結工程により産生される伸
長したオリゴヌクレオチド配列は、所望のコドン改変オリゴヌクレオチドが得ら
れるまで、次の反復される除去工程の基質配列となる。この基本的な合成形式は
、必要に応じて１つ以上の以下に挙げるヌクレオチドを共に連結する工程を含み
得る：モノヌクレオチド、トリヌクレオチドホスホラミダイト配列、およびオリ
ゴヌクレオチド。
【００９７】 分断プール合成形式は、各々５’末端および少なくとも１つの塩基（これらの
両方は、その上に保護基を有する）を有する基質配列を提供する工程を含む。基
質配列の５’保護基を、除去して５’脱保護された基質配列を提供し、次いでこ
れを選択されたトリヌクレオチドホスホラミダイト配列と連結する。各トリヌク
レオチドは、３’末端、５’末端、および３つの塩基（これらは全て、その上に
保護基を有する）を有する。連結工程は、伸長したオリゴヌクレオチド配列を産
生する。その後、この除去工程および連結工程を、必要に応じて反復する。これ
らの工程を反復する場合、各々の反復される連結工程により産生される伸長オリ
ゴヌクレオチド配列は、伸長した中間体オリゴヌクレオチド配列が生成されるま
で、次の反復の除去工程の基質配列となる。
【００９８】 分断プール形式のさらなる工程は、必要に応じて、伸長した中間体のオリゴヌ
クレオチド配列を２つ以上の別々のプールへと分断する工程を含む。これを実施
した後、伸長した中間体オリゴヌクレオチド配列の５’保護基を除去して、５’
を脱保護した伸長した中間体オリゴヌクレオチド配列を２つ以上の別々のプール
中に提供する。これに続き、これらの５’を脱保護した中間体を、２つ以上の別
々のプール中で、１つ以上の選択されたモノヌクレオチド、トリヌクレオチドホ
スホラミダイト配列、またはオリゴヌクレオチドと連結し、さらに伸長した中間
体オリゴヌクレオチド配列を産生する。次に、これらのさらなる伸長配列を単一
のプール中にプールする。その後、基質配列の５’保護基の除去で始まり５’を
脱保護した基質配列を提供する工程を、必要に応じて反復する。これらの工程が
反復される場合、これらの特異的配列を生成する各々の反復された連結工程によ
り産生される、さらなる伸長したオリゴヌクレオチド配列は、所望のコドン改変
オリゴヌクレオチドが得られるまで、それらの特異的配列を含む、次の反復され
る除去工程の基質配列となる。
【００９９】 上記した両方の合成プロトコルは、必要に応じて、この工程を自動的に実施す
る自動合成装置において実施され得る。この局面は、文字ストリング情報をコン
ピューターに入力する工程を含み、次いでこの出力が、この自動合成装置が、所
望のコドン改変オリゴヌクレオチドを合成するために必要である工程を実施する
ように指向する。
【０１００】 トリヌクレオチド合成に関するさらなる詳細は、「ＵＳＥ ＯＦ ＣＯＤＯＮ
ＶＡＲＩＥＤ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＦＯ
Ｒ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ」Ｗｅｌｃｈら、ＵＳＳＮ ０９
／４０８，３９３（１９９９年９月２８日出願）に見出される。
【０１０１】 （オリゴヌクレオチド媒介混合を使用する、核酸組換えの調整（ｔｕｎｉｎｇ
）） １つの局面において、等モルでない比のファミリーシャッフリングオリゴヌク
レオチドを使用して、本明細書中に記載の手順の間に組換えの偏りを生じさせる
。このアプローチにおいて、１セットのファミリーシャッフリングオリゴヌクレ
オチドにおける等モル比のファミリーシャッフリングを使用せずに、本明細書中
の特定の他の方法の場合のように、組換え核酸のライブラリーを作製する。代わ
りに、ファミリーシャッフリングオリゴヌクレオチドが由来する核酸のファミリ
ーの選択されるメンバーまたは選択されるメンバーのセットの配列に対応する、
特定のオリゴヌクレオチドの比率は、実施者によって選択される。
【０１０２】 従って、１つの単純な例示的な例において、本明細書中に記載のオリゴヌクレ
オチド媒介組換えを使用して、例えば、カエル遺伝子およびヒト遺伝子（これら
は５０％同一性である）を組換える。全ての多型性の位置で、ヒト配列およびカ
エル配列の両方をコードするファミリーオリゴヌクレオチドを合成する。しかし
、等モル比のヒトおよびカエル由来オリゴヌクレオチドを使用するよりもむしろ
、この比率は、使用者が、最も密接に模倣させる（ｅｍｕｌａｔｅ）ことを望む
遺伝子に有利なように偏る。例えば、ヒト様の遺伝子を生成する場合、多型性の
位置でのヒト配列に対応するオリゴヌクレオチドの比率は、５０％より多く（例
えば、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％以上のオリゴがヒト配列に
対応し得、これは例えばカエル配列に対応する約４０％、約３０％、約２０％、
約１０％以下のオリゴを有する）偏り得る。同様に、カエル様遺伝子が所望され
る場合、多型性の位置でのカエル配列に対応するオリゴヌクレオチドの比率が５
０％より多く偏り得る。いずれの場合においても、次いで、得られる「混合」遺
伝子（すなわち、１つより多い親遺伝子の特徴を有する、得られた組換え遺伝子
）を、混合遺伝子に対する配列に密接に関連する遺伝子ファミリーのメンバーで
組換え得る。従って、上記の場合において、よりヒト様の混合遺伝子を生成する
ようにオリゴヌクレオチドの比率を選択する場合、混合遺伝子は、必要に応じて
本来のヒト遺伝子とより密接に類似する遺伝子を用いて、さらに組換えられる。
同様に、よりカエル様の混合遺伝子を生成するようにオリゴヌクレオチドの比率
を選択する場合、混合遺伝子は、必要に応じて本来のカエル遺伝子とより密接に
類似する遺伝子を用いて、さらに組換えられる。このストラテジーを図２に示す
。このストラテジーは、一般的に、オリゴヌクレオチド媒介組換えによる任意の
２つ以上の核酸の組換えに対して適用可能である。
【０１０３】 偏りの作製（ｂｉａｓｉｎｇ）は、不均衡な量の関連オリゴヌクレオチドを合
成すること、または関連の遺伝子合成方法（例えば、上記のようなＰＣＲ合成方
法）に対して不均衡な量を単純に適用することにを含む、種々の様式で達成され
得る。
【０１０４】 上記のように、この偏りの作製のアプローチは、２つ以上の関連する核酸の任
意のセットの組換えに適用され得る。配列は、進められる選択のために密接に類
似である必要はない。実際、生じる偏りの作製のために検出可能な程度に相同性
である必要さえない。この場合、「ファミリー」オリゴヌクレオチドは、コード
タンパク質の構造的類似性の考慮から導かれる非配列相同性のオリゴヌクレオチ
ドのセットに対して置換される。例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーは
、ほとんどまたは全く検出可能な配列相同性を示さない（特に、核酸レベルにお
いて）、構造的に類似のメンバーを含む。これらの場合、非相同性の配列は、構
造的相同性を考慮することによって（例えば、機能的に類似のペプチド残基の整
列によって）「整列」される。目的の組換え領域は、整列によって提示されるア
ミノ酸多様性の全ての順列を含むことが規定され得る。関連する構造的に類似の
アミノ酸配列をコードする所望の比率のヌクレオチドを有する配列を混合するた
めに、上記の偏りの作製方法が必要に応じて使用される。
【０１０５】 任意の２つ以上の配列は、目的の任意のアルゴリズムまたは判断基準によって
整列され得、そして配列を混合するために使用される偏りの作製方法は、任意の
所望の判断基準に基づく。これらは、配列相同性、構造的類似性、推定構造的類
似性（特定される任意の類似性判断基準に基づく）などを含む。定常性である構
造的コアが存在するが、コアの周辺に構築された多くの構造的な改変を有する状
況（例えば、Ｉｇドメインは構造的コアであり、そのコアに結合する多くの異な
るループ長および立体配座を有し得る）に対して、これらは適用され得る。
【０１０６】 標準的な遺伝子組換え方法と比較して、このアプローチに対する一般的な利点
とは、混合されるべき２つの配列の全体的な配列同一性が、より標準的な方法に
よって組換えを生じる為に必要とされる同一性よりも低いものであり得るという
ことである。さらに、時としては選択される領域のみが組み換えられる。このこ
とは、いかにして混合遺伝子を構築するかを特定する際に、利用可能な任意の構
造的または機能的なデータを考慮に入れることを可能にする。従って、いくつか
の他のシャッフリングのプロトコルによって生成されない配列領域が、この混合
遺伝子アプローチによって利用可能であり、そして構造的な情報が考慮される場
合に、より高いパーセンテージで活性クローンを時として獲得し得る。構造的な
情報の考慮に関してのさらなる詳細は、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮ
Ｇ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ、ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ
ＡＮＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲ
ＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖら、代理人整理番号０２−２８９
−３ＵＳに見出される。
【０１０７】 上記の一般的なストラテジーは、例えば、低い配列類似性を有する任意の遺伝
子のセットに対して適用可能である。例えば、配列同一性が約３０％の範囲にあ
るＴＮＦ相同体の大きなファミリーが存在し、これは標準的なシャッフリングプ
ロトコルを達成させるを困難にする。もちろん、オリゴヌクレオチドの比率を選
択することによって組換えを調整することもまた、任意の２つの核酸（これは、
高類似性の相同体および低類似性の相同体の両方を含む）の組換えに対して、一
般的に適用可能である。２つ以上の配列を整列するために、任意の整列プロトコ
ルが選択され得、そして得られる整列は、組換えを達成するために適切なオリゴ
ヌクレオチドを作製ために使用され得る。そして、親の配列と比較して、配列の
相対的頻度においてあらゆる偏りの作製が達成され得る。
【０１０８】 （オリゴヌクレオチドシャッフリングのための標的） 本質的に任意の核酸が、本明細書中のオリゴヌクレオチド媒介方法によってシ
ャッフリングされ得る。数十万の既知の核酸を同定する試みは、全くなされてい
ない。上記のように、既知のタンパク質についての一般的な配列の寄託所として
は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、およびＮＣＢＩが挙げられる。他の
寄託所は、インターネットを検索することによって容易に同定され得る。
【０１０９】 活性化に対する好ましい標的の１つの種類としては、治療的タンパク質（例え
ば、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモンのようなペ
プチドホルモン；上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ，ＧＲ
Ｏβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、上皮増殖因子、線
維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、インターフェロン
、インターロイキン、ケラチノサイト増殖因子、白血病阻害因子、オンコスタチ
ンＭ、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、プレイオトロピン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ
）、ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＶＥＧＥＦ、Ｇ−ＣＳＦなどのような増殖因
子およびサイトカイン）が挙げられる。これらのタンパク質多くが市販され（例
えば、Ｓｉｇｍａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ １９９７のカタログおよび価格表
を参照のこと）、そしてその対応する遺伝子は周知である。
【０１１０】 別の種類の好ましい標的は、転写および発現のアクチベーターである。例示的
な転写および発現のアクチベーターとしては、細胞の増殖、分化、調節などを調
節する遺伝子およびタンパク質が挙げられる。発現および転写のアクチベーター
は、原核生物、ウイルス、および真核生物（これは、真菌、植物、および動物（
これは、哺乳動物を含む）を含む）において見出され、これは広範な治療剤を提
供する。発現および転写のアクチベーターは、多くのメカニズム（例えば、レセ
プターへの結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現の調節、プロ
モーターおよびエンハンサーへの結合、プロモーターおよびエンハンサーに結合
するタンパク質への結合、ＤＮＡの巻き戻し、プレｍＲＮＡのスプライシング、
ＲＮＡのポリアデニル化、およびＲＮＡの分解によって転写を調節することが理
解される。発現アクチベーターとしては、サイトカイン、炎症性分子、増殖因子
、それらのレセプター、およびオンコジーン産物（例えば、インターロイキン（
例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８など）、インターフェロン、ＦＧＦ、Ｉ
ＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β
、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／
ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１およびヒアルリン（ｈｙａｌｕｒｉｎ
）／ＣＤ４４）；シグナル伝達分子および対応するオンコジーン産物（例えば、
Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、およびＭｅｔ）；ならびに転写アクチベーターおよび
サプレッサー（例えば、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒ
ｅｌ、ならびにエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロ
ン、ＬＤＬレセプターリガンドおよびコルチコステロンに対するレセプターのよ
うなステロイドホルモンレセプター）が挙げられる。
【０１１１】 オンコナーゼ（ｏｎｃｏｎａｓｅ）およびＥＤＮのようなＲＮアーゼは、本明
細書中の合成方法、特に遺伝子の混合を利用する合成方法についての好ましい標
的である。当業者は、カエルおよびヒトのＲＮアーゼの両方が公知であり、そし
て多くの重要な薬理学的活性を有することが公知であることを理解する。これら
の遺伝子の間の進化的多様性のため、オリゴヌクレオチド媒介の組換え方法は、
この核酸を組換える際に特に有用である。
【０１１２】 同様に、以下でより詳細に記載される、可能なワクチン適用のための感染性生
物体からのタンパク質としては、以下が挙げられる：感染性真菌（例えば、Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特にＥ．ｃｏｌｉ（これは、
病原性細菌についてのモデルとして役立つ）、ならびに以下のような医学的に重
要な細菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えば、ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｉ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ（例
えば、ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、ｇｏｎｏｒｒ
ｈｏｅａ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、ｃｏｌｉ）、Ｈ
ｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（例えば、ｐｙｌｏｒｉ）、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（例えば、ｊｅｊｕｎｉ）、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ（例えば、ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えば、ｐｅ
ｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｕ
ｒｅａｐｌａｓｍａ（例えば、ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌ
ａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ（例えば、
Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ）、Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ｓｍｅｇｍａｔｉ
ｓ）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、ｉｓｒａｅｌｉｉ）、Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ（例えば、ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（例えば、ｔｒａｃ
ｈｏｍａｔｉｓ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ、Ｅｈｒｉｌｉｃ
ｈｉａ、Ｒｏｃｈｏｌｉｍａｅａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｆｒ
ａｎｃｉｓｅｌｌａ、およびＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ；胞子虫のような原生動物
（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫（例えば、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）およ
び鞭毛虫（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏ
ｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａなど）；ウイルス（例えば、（＋）ＲＮＡウイルス（例
としては、ポックスウイルス（例えば、ワクシニア）；ピコルナウイルス（例え
ば、ポリオ）；トガウイルス（例えば、風疹）；フラビウイルス（例えば、ＨＣ
Ｖ）；およびコロナウイルスが挙げられる）、（−）ＲＮＡウイルス（例として
は、ラブドウイルス（例えば、ＶＳＶ）；パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘ
ｏｖｉｍｓｅｓ）（例えば、ＲＳＶ）；オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙ
ｘｏｖｉｍｓｅｓ）（例えば、インフルエンザ）；ブンヤウイルス；およびアレ
ナウイルスが挙げられる）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、レオウイルス属）、
ＲＮＡ−ＤＮＡウイルス（すなわち、レトロウイルス（例えば、特にＨＩＶおよ
びＨＩＬＶ））、ならびに特定のＤＮＡ−ＲＮＡウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウ
イルス）。
【０１１３】 非医学的使用に関連する他のタンパク質（例えば、転写インヒビター、または
作物病害虫の毒素（例えば、昆虫、真菌、雑草植物など）はまた、オリゴヌクレ
オチドシャッフリングのための好ましい標的である。モノオキシゲナーゼ（例え
ば、ｐ４５０）、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、およびリパーゼのような工業的
に重要な酵素もまた、好ましい標的である。例として、サブチリシンは、サブチ
リシンについての遺伝子の相同形態についてファミリーオリゴヌクレオチドをシ
ャッフリングすることによって進化され得る。Ｖｏｎ ｄｅｒ Ｏｓｔｅｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：５５〜６８（１９９３）は、サブチリシンを
コードする核酸の例を提供し、そしてさらなる核酸はＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標
）に存在する。シャペロニンのような折り畳みを助けるタンパク質もまた、好ま
しい標的である。
【０１１４】 オリゴヌクレオチド媒介シャッフリングのために適切な、好ましい公知の遺伝
子としてはまた、以下が挙げられる：α−１アンチトリプシン、アンギオスタチ
ン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、抗溶血性因子、アポリポタンパク質、アポタン
パク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房
性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えば、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮ
Ａ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、Ｎ
ＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（
例えば、単球化学誘引タンパク質（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃ
ｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、単球化学誘引タンパク質−２、単球化学誘引
タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１α、単球炎症性タンパク質−１β、
ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４
７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、コラーゲン、コロニー
刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体インヒビター、補体レセプター１、第
ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、フィブリノゲン、フィブ
ロネクチン、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、ヘッジホッグ（Ｈｅｄ
ｇｅｈｏｇ）タンパク質（例えば、Ｓｏｎｉｃ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｄｅｓｅｒｔ）
、ヘモグロビン（代用血液について；放射線増感について）、ヒルジン、ヒト血
清アルブミン、ラクトフェリン、ルシフェラーゼ、ニューロツリン（Ｎｅｕｒｔ
ｕｒｉｎ）、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、骨原性タンパク質、上皮小体ホルモン
、プロテインＡ、プロテインＧ、レラキシン、レニン、サケカルシトニン、サケ
成長ホルモン、可溶性補体レセプターＩ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インター
ロイキンレセプター（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦレセプター、ソマトメジン、ソマトスタ
チン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原（すなわち、ブドウ
球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥ
Ｄ、ＳＥＥ））、トキシックショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、剥離作用性
（Ｅｘｆｏｌｉａｔｉｎｇ）毒素ＡおよびＢ、発熱性体外毒素Ａ、Ｂ、およびＣ
、ならびにＭ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓマイトジェン、スーパーオキシドジスム
ターゼ、サイモシンα１、組織プラスミノゲンアクチベータ、腫瘍壊死因子β（
ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα
）、ならびにウロキナーゼ。
【０１１５】 ディフェンシン（約５０アミノ酸の抗真菌類タンパク質）、ＥＦ４０（２８ア
ミノ酸の抗真菌類タンパク質）、ペプチド抗生物質、およびペプチド殺虫性タン
パク質のような低分子タンパク質もまた、好ましい標的であり、そして関連した
タンパク質のファミリーとして存在する。低分子タンパク質をコードする核酸は
、特に好ましい標的である。なぜなら、従来の組換え方法は、限定された産物の
配列多様性のみを提供するからである。これは、従来の組換え方法論が、約５０
〜１００塩基対毎の相同配列間に交差を生成するからである。これは、非常に短
い組換え標的に関して、標準技術によって１分子あたり約１回の交差が生じるこ
とを意味する。対照的に、本明細書中のオリゴヌクレオチドシャッフリング形式
は、当業者が所望の任意の「交差」を選択する場合、小さな核酸の組換えを提供
する。
【０１１６】 さらなる好ましい標的は、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖらによる、「ＭＥＴＨＯＤＳ
ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ，ＰＯＬＹＮＵＣＬ
ＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩ
ＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」、代理人整理番号０２−２８９−３
ＵＳおよび本明細書中の他の参考文献に記載される。
【０１１７】 （ＤＮＡシャッフリングおよび遺伝子再アセンブリ−ハイブリッド合成シャッ
フリング方法） 本発明の１つの局面は、ファミリーシャッフリングオリゴヌクレオチドを使用
する能力、および種々のＤＮＡシャッフリング方法において組換えテンプレート
／中間体としてオリゴヌクレオチドを交差する能力である。さらに、本明細書中
の新しい合成技術によって作製される核酸は、他の利用可能なシャッフリング方
法論によって再びシャッフリングされ得る。
【０１１８】 種々のこのような方法は公知であり、発明者らおよび共同研究者によって教示
される方法を含む。以下の刊行物は、種々の再帰的な組換え手順および／または
本発明のプロセスに関連して実行され得る関連する方法を記載する：
【０１１９】
【表１】
【０１２０】 ＤＮＡシャッフリング方法のさらなる詳細は、以下に挙げられる発明者らおよ
び共同研究者らによる米国特許において見出される：Ｓｔｅｍｍｅｒに対する米
国特許第５，６０５，７９３号（１９９７年２月２５日）、「ＭＥＴＨＯＤＳ
ＦＯＲ ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」；Ｓｔｅｍｍｅｒ
らに対する米国特許第５，８１１，２３８号（１９９８年９月２２日）、「ＭＥ
ＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ
Ｓ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ ＢＹ
ＩＴＥＲＡＴＩＶＥ ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯ
Ｎ」；Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８３０，７２１号（１９９８年
１１月３日）、「ＤＮＡ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ ＢＹ ＲＡＮＤＯＭ ＦＲ
ＡＧＭＥＮＴＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＥＡＳＳＥＭＢＬＹ」；Ｓｔｅｍｍｅｒら
に対する米国特許第５，８３４，２５２号（１９９８年１１月１０日）、「ＥＮ
Ｄ−ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＲＹ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＲＥＡＣＴＩＯＮ」
、およびＭｉｎｓｈｕｌｌらに対する米国特許第５，８３７，４５８号（１９９
８年１１月１７日）、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ
ＦＯＲ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＡＮＤ ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩ
ＮＧ」。
【０１２１】 さらに、核酸シャッフリングについての詳細および形式は、以下を含む種々の
ＰＣＴおよび外国特許出願公開において見出される：
【０１２２】
【表２】
【０１２３】 特定の米国特許出願は、以下を含むＤＮＡシャッフリングおよび関連する技術
に関するさらなる詳細を提供する：Ｐａｔｔｅｎらによって１９９８年９月２９
日（ＵＳＳＮ６０／１０２，３６２）、１９９９年１月２９日（ＵＳＳＮ６０／
１１７，７２９）、および１９９９年９月２８日（ＵＳＳＮ ＰＣＴ／ＵＳ９９
／２２５８８）に出願された「ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ ＯＦ ＣＯＤＯＮ ＡＬＴ
ＥＲＥＤ ＧＥＮＥＳ」；ｄｅｌ Ｃａｒｄｙｒｅらによって１９９８年７月１
５日（ＵＳＳＮ０９／１６６，１８８）、および１９９９年７月１５日（ＵＳＳ
Ｎ０９／３５４，９２２）に出願された「ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ ＯＦ ＷＨＯＬ
Ｅ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳ ＢＹ ＲＥＣＵＲＳＩＶＥ Ｓ
ＥＱＵＥＮＣＥ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」；Ｃｒａｍｅｒｉらによって１
９９９年２月５日に出願され（ＵＳＳＮ６０／１１８，８１３）、そして１９９
９年６月２４日に出願され（ＵＳＳＮ６０／１４１，０４９）、そして１９９９
年９月２８日に出願された（ＵＳＳＮ０９／４０８，３９２）「ＯＬＩＧＯＮＵ
ＣＬＥＯＴＩＤＥ ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＲＥＣＯＭ
ＢＩＮＡＴＩＯＮ」、ならびに、Ｗｅｌｃｈらによって１９９９年９月２８日に
出願された（ＵＳＳＮ０９／４０８，３９３）「ＵＳＥ ＯＦ ＣＯＤＯＮ−Ｂ
ＡＳＥＤ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＦＯＲ Ｓ
ＹＮＴＨＥＴＩＣ ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ」。最終的に、「関連出願の引用」と題
された節において、上記に列挙された出願が関連形式を提供する。
【０１２４】 前述の参考文献はまた、核酸組換えを達成するために核酸をハイブリダイズお
よび伸長するプロセスにおけるさらなる詳細を提供する。
【０１２５】 １つの局面において、より伝統的な組換えに基づくシャッフリング方法と組み
合わせたファミリー遺伝子シャッフリングを使用するハイブリッド方法が、使用
される。例えば、活性な核酸は、所定の標的遺伝子に関して相同置換をほとんど
またはさらには全く有さないオリゴヌクレオチドから再アセンブリされ得る。再
アセンブリされる「骨格」核酸は、標準的な方法におけるようにＤＮａｓｅで処
理され、そして生じるＤＮａｓｅ処理フラグメントは、所定の核酸において配列
同一性および多様性の領域に対応する配列を含むファミリーオリゴヌクレオチド
でスパイクされる。次いで、この核酸は、以下の方法（例えば、ＰＣＲ再アセン
ブリ、または他の再アセンブリ方法）によって相同配列のライブラリーへ再アセ
ンブリされる。この手順は、骨格核酸の使用を組み入れないオリゴヌクレオチド
合成方法に対して比較した場合に見出され、活性なクローンのパーセンテージの
増加を生じ得る。
【０１２６】 発明者らおよび共同研究者、ならびに当該分野における他の研究者の多くの刊
行物は、ＤＮＡシャッフリングを容易にする技術（例えば、本発明に関連した小
さなフラグメント（オリゴヌクレオチドを含む）からの遺伝子の再アセンブリを
提供することによる）を記載する。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９８）米国
特許第５，８３４，２５２号のＥＮＤ ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＲＹ ＰＯＬＹ
ＭＥＲＡＳＥ ＲＥＡＣＴＩＯＮは、（例えば、核酸の混合物中の）標的配列を
増幅および検出するためのプロセス、ならびにフラグメントから大きなポリヌク
レオチドをアセンブリするプロセスを記載する。Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）
Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８〜２９１は、Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８（２）１９４〜１９６のような、遺伝子の再アセ
ンブリについての基本的な方法論を提供する。
【０１２７】 他の多様性を生成するアプローチはまた、本明細書中の方法によって生成され
る核酸を改変するために使用され得、または、本明細書中の方法のためのテンプ
レートとして使用され得る。例えば、さらなる多様性は、個々のヌクレオチドま
たは連続した、もしくは連続していないヌクレオチドの群の変更を生じる方法（
すなわち、変異誘発方法）によって導入され得る。変異誘発方法としては、例え
ば以下が挙げられる：組換え（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０５２２３；公開番号ＷＯ９
８／４２７２７）；オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（総説についてはＳｍｉ
ｔｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３〜４６２（１９８５）；Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３〜１２
０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１〜７（１９
８６）；Ｋｕｎｋｅｌ、Ｎｅｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ中の「Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｅｃｋｓｔ
ｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ
（１９８７）を参照のこと）。これらの方法の中に含まれる方法としては、以下
が挙げられる：オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉ
ｔｈ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５００（１９８２）
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８〜５００（１９８３
）、およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９〜３５０（
１９８７））、ホスホチオエート改変ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７４９〜８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏ
ｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７６５〜８７８７（１９８５）
；ＮａｋａｍａｙｅおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１４：９６７９〜９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１６：７９１〜８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８０３〜８１４（１９８８））、ウラシル含有テン
プレートを使用する変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８〜４９２（１９８５）、およびＫｕｎｋｅｌら
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２）；ギャッ
プを入れた（ｇａｐｐｅｄ）二重鎖ＤＮＡを使用する変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら
、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：９４４１〜９４５６（１９８４）；Ｋ
ｒａｍｅｒおよびＦｒｉｔｚ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４
：３５０〜３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１６：７２０７（１９８８））；ならびにＦｒｉｔｚら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１６：６９８７〜６９９９（１９８８））。さらなる方法として
は、以下が挙げられる：点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ ３８：
８７９〜８８７（１９８４））、修復欠損宿主株を使用する変異誘発（Ｃａｒｔ
ｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１〜４４４３（１９８５
）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２〜
４０３（１９８７））、欠失変異誘発（ＥｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈおよびＨｅ
ｎｉｋｏｆｆ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６））
、制限−選択および制限−精製（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓ
ｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ ３１７：４１５〜４２３（１９８６））、全遺伝子合成に
よる変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９〜１３０
１（１９８４）；ＳａｋａｍａｒおよびＫｈｏｒａｎａ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
．Ｒｅｓ．１４：６３６１〜６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ
３４：３１５〜３２３（１９８５）；ならびにＧｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍら、Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３３０５〜３３１６（１９８５）。変異誘発
のためのキットは、市販されている（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ）。
【０１２８】 他の多様性生成手順は、以下において提案される：米国特許第５，７５６，３
１６号；米国特許第５，９６５，４０８号；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９
）「Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄ
ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｈｏｍｏｌｏｇｙ
」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１２０５；米国特許第５，７８３，４
３１号；米国特許第５，８２４，４８５号；米国特許第５，９５８，６７２号；
Ｊｉｒｈｏｌｔら（１９９８）「Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓ
ｐａｃｅ：ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｒｍｅｄ ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ａ
ｍａｓｔｅｒ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ」Ｇｅｎｅ ２１５：４７１；米国特許第
５，９３９，２５０号；ＷＯ９９／１０５３９；ＷＯ９８／５８０８５；ＷＯ９
９／１０５３９など。これらの多様性を生成する方法は、使用者によって選択さ
れる任意の組合せにおいて互いに、またはシャッフリング反応もしくはオリゴシ
ャッフリング方法と組み合わせられて、任意の利用可能なスクリーニング方法を
使用してスクリーニングされ得る核酸の多様性を産生し得る。
【０１２９】 組換えまたは他の多様性の反応に続いて、生成される任意の核酸は、所望の活
性について選択され得る。本発明の状況において、これは、当該分野における任
意の関連するアッセイによって、任意の検出可能な活性またはアッセイ可能な活
性について試験し、そして同定することを含み得る。種々の関連する（または関
連していなくとも）特性は、任意の利用可能なアッセイを使用してアッセイされ
得る。
【０１３０】 （ＰＣＲを使用しないＤＮＡシャッフリング） 遺伝子の再アセンブリのための１つの好ましい形式はＰＣＲを使用するが、他
の形式もまた有用である。例えば、部位特異型またはオリゴヌクレオチド特異型
変異誘発方法を使用して、２つ以上の親遺伝子間（相同性であろうと、または非
相同性であろうと）でキメラを生成し得る。このことについては、本発明の１つ
の局面は、組換えられるべき核酸に対応するオリゴヌクレオチドのライブラリー
の連結による核酸間の組換えを実行する新しい方法に関する。
【０１３１】 この形式において、複数の親核酸からの複数の核酸配列を含む、複数のオリゴ
ヌクレオチドのセットは、１つ以上の組換え核酸、代表的には全長タンパク質を
コードする組換え核酸を産生するために連結される（しかし、連結はまた、次い
で組換えられ得る部分的核酸配列のライブラリーを作製して、例えば、部分的ま
たは全長組換え核酸を産生するために連結され得る）。オリゴヌクレオチドのセ
ットは、代表的に、少なくとも第１のオリゴヌクレオチド（これは、第１の領域
の配列多様性において少なくとも第１の親核酸に相補的である）、および少なく
とも第２のオリゴヌクレオチド（これは、第２の領域の多様性において少なくと
も第２の親核酸に相補的である）を含む。この親核酸は相同的であってもよいし
、または非相同的であってもよい。
【０１３２】 しばしば、オリゴのような核酸は、リガーゼを用いて連結される。１つの代表
的な形式において、オリゴヌクレオチドは、テンプレートとして作用する第１の
親核酸にハイブリダイズされ、そしてリガーゼを用いて連結される。このオリゴ
はまた、ポリメラーゼを用いて伸長され得、そして連結される。このポリメラー
ゼは、例えば、通常のＤＮＡポリメラーゼまたは熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ
であり得る。このリガーゼは、例えば、通常のＤＮＡリガーゼまたは熱安定性の
ＤＮＡリガーゼであり得る。多くのこのようなポリメラーゼおよびリガーゼは、
市販されている。
【０１３３】 １つのセットのアプローチにおいて、ＰＣＲに基づかない組換え方法について
の共通要素は、プライマーがアニーリングされて、次いで、ｄＮＴＰおよび適切
な緩衝液の存在下でＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、一本鎖テンプレー
トの調製である。ギャップを入れた二重鎖は、Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換または
エレクトロポレーションの前に、リガーゼを用いて埋められ得る。新しく合成さ
れた鎖は複製され、そして一本鎖（ｓｓ）の親の状況においてオリゴからの寄与
を有するキメラ遺伝子を生成する。
【０１３４】 例えば、ｓｓテンプレートは、糸状ファージ粒子へｓｓプラスミドをパッケー
ジングするために、プラスミドへのファージＩＧ領域の組込み、およびＭ１３Ｋ
Ｏ７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＲ４０８のようなヘルパー
ファージの使用によって調製され得る。このｓｓテンプレートはまた、二本鎖テ
ンプレートの変性およびプライマーの存在下でのアニーリングによって生成され
得る。この方法は、親のテンプレート鎖にわたって新しく合成されたキメラ鎖の
単離のための濃縮方法において変化する。二本鎖テンプレートの単離および選択
は、利用可能な方法を使用して実行され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｌｉ
ｎｇら（１９９７）「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．」 Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２月１５
日；２５４（２）：１５７〜７８；Ｄａｌｅら（１９９６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ」 Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５７：３６９〜７４；Ｓｍｉｔｈ（１９８５
）「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」 Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１９：４２３〜４６２；ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌｅ（１９８５
）「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３〜
１２０１；ならびにＣａｒｔｅｒ（１９８６）「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２３７：１〜７；Ｋｕｎｋｅ
ｌ（１９８７）「Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」 Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）；Ｅｃｋｓ
ｔｅｉｎ，Ｆ．およびＬｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅ
ｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ。
【０１３５】 例えば、１つの局面において、「Ｋｕｎｋｅｌ式」方法は、ウラシル含有テン
プレートを使用する。同様に、「Ｅｃｋｓｔｅｉｎ」方法は、ホスホロチオエー
ト改変ＤＮＡを使用する
【０１３６】
【表３】
【０１３７】 制限選択の使用、または例えば、精製は、ミスマッチ修復欠失株と共に使用され
得る（例えば、Ｃａｒｔｅｒら（１９８５）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ」 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１３、４４３１〜４４４３ Ｃａｒｔｅｒ（１９８７）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ
ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ．」 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．１５４：３８２〜４０３；Ｗｅｌｌｓ（１９８６）「Ｉｍｐｏｒｔａｎ
ｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａ
ｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓｉｎ．」Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３１７、４１５〜４
２３を参照のこと）。
【０１３８】 これらの方法において使用される「変異促進性の」プライマーは、任意の型の
無作為化、挿入、欠失をコードする合成オリゴヌクレオチド、相同性遺伝子の配
列多様性に基づくファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドなどであ
り得る。このプライマーはまた、ｓｓ親テンプレートに対してアニーリングされ
る相同性遺伝子のフラグメントであり得る。このようにして、２つ以上の親遺伝
子間のキメラが生成され得る。
【０１３９】 複数のプライマーを、所定のテンプレートにアニーリングして、そして複数の
キメラ遺伝子を作製するために伸長し得る。ファージＴ４またはファージＴ７か
らのＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼの使用は、これらがテンプ
レートから下流のプライマーを分解せず、また置換もしないので、この目的のた
めに適切である。
【０１４０】 例えば、１つの局面において、ＤＮＡシャッフリングは、ウラシル含有テンプ
レートを使用して実行される。この実施態様において、目的の遺伝子は、糸状フ
ァージ遺伝子間（ＩＧ、ｏｒｉ）領域を含むＥ．ｃｏｌｉプラスミドへクローニ
ングされる。一本鎖（ｓｓ）プラスミドＤＮＡは、Ｍ１３ＫＯ７（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）またはＲ４０８のようなヘルパーファージでの感染に際してファージ粒
子中にパッケージングされ、そしてフェノール／クロロホルム抽出およびエタノ
ール沈殿のような方法によって容易に精製され得る。このＤＮＡがＥ．ｃｏｌｉ
のｄｕｔ−ｕｎｇ−株において調製される場合、少数のウラシル残基は、正常な
チミン残基の代わりにその中へ組み込まれる。上記のような１つ以上のプライマ
ーまたは他のオリゴは、９０℃までの加熱および室温までの緩徐な冷却によって
ｓｓウラシル含有テンプレートにアニーリングされる。４つ全てのデオキシリボ
ヌクレオチド、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む
適切な緩衝液を、アニーリングされたテンプレート／プライマー混合物に添加し
、そして室温と約３７℃との間で１時間以上インキュベートする。Ｔ７ ＤＮＡ
ポリメラーゼはプライマーの３’末端から伸長し、そしてプライマーを組み込む
テンプレートに対して相補的な鎖を合成する。ＤＮＡリガーゼは、新しく合成さ
れた鎖の３’末端とプライマーの５’末端との間のギャップを埋める。
【０１４１】 複数のプライマーが使用される場合、ポリメラーゼは次のプライマーまで伸長
され、停止し、そしてリガーゼはギャップを埋める。次いで、この反応物は、Ｅ
．ｃｏｌｉのｕｎｇ＋株中に形質転換され、そしてプラスミドについての抗生物
質の選択が適用される。宿主細胞中のウラシルＮ−グリコシラーゼ（ｕｎｇ遺伝
子産物）酵素は、テンプレート鎖中のウラシルを認識し、そしてウラシルを除去
し、複製されないかまたは宿主修復系が新しく合成された鎖をテンプレートとし
て使用することによってウラシルを訂正するかのいずれかである無ピリミジン部
位を作製する。得られるプラスミドは主に、目的であれば、遺伝子に所望の変化
を含む。複数のプライマーが使用される場合、単一の反応において、多くの変化
を同時に導入することが可能である。プライマーが相同性遺伝子のフラグメント
由来か、または相同性遺伝子のフラグメントに対応する場合、複数のキメラ遺伝
子が生成され得る。
【０１４２】 （コドン改変） １つの局面において、本明細書中の方法において利用されるオリゴヌクレオチ
ドは、親の配列（このオリゴヌクレオチドの起源）と比較してコドンの使用を変
えている。特に、例えば、コドンの優先を改変し、オリゴヌクレオチドシャフリ
ング手順の組換え産物が評価されるかまたは他の点で選択される細胞において、
発現を最適化することは有用である。組換え核酸を、選択されるべき特定の細胞
のコドンバイアスと一致させることは、代表的には組換え核酸の発現の最大化を
引き起こす。本明細書中の種々のストラテジーにおいて使用されるオリゴヌクレ
オチドは、代表的には合成的に作製されるので、最適なコドンの優先を選択する
ことは、周知のコドンバイアス表を参照することによって単純になされる。コド
ンベースの合成方法（前出に記載される）は、合成プロトコルにおいてコドンを
改変するために、必要に応じて使用される。
【０１４３】 発現を最適にするためのオリゴヌクレオチド配列の選択に加え、コドンの優先
はまた、遠く隔たって関連する、組換えされるべき核酸の間の配列類似性を増大
するために使用され得る。コドンが特定の位置において使用されるように選択す
ることによって、核酸間での類似性を増大させることが可能であり、そして順に
、その核酸間での組換え頻度を増大させる。コドン改変手順についておよびそれ
らのＤＮＡシャッフリングへの適用についてのさらなる詳細は、Ｐａｔｅｎおよ
びＳｔｅｍｍｅｒ、ＵＳＳＮ ６０／１０２，３６２「ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ Ｏ
Ｆ ＣＯＤＯＮ ＡＬＴＥＲＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ」（１９９８年９
月２９日出願）およびＰａｔｅｎおよびＳｔｅｍｍｅｒの関連出願（１９９９年
１月２９日に出願、Ａｔｔｏｒｎｅｙ整理番号０１８０９７−０２８５１０、「
ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ ＯＦ ＣＯＤＯＮ ＡＬＴＥＲＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ Ａ
ＣＩＤ」と称される）に見出される。
【０１４４】 （モジュラーシャッフリングによる長さのバリエーション） 遺伝子および遺伝子エレメントについての多くの機能的配列ドメインは、機能
的サブ配列ドメインから構成される。例えば、プロモーター配列は、転写因子を
結合する多くの機能的配列エレメントから作製され、そして遺伝子発現を調節す
る。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントと結合し、所定の遺伝
子の発現を増強し得る。同様に、少なくともいくつかのエキソンはコードされる
タンパク質のモジュラードメインを示し、そしてエキソンは野生型遺伝子に関連
して多量体化または欠失され得、そして生じた核酸は、組換えられて、変化させ
た遺伝子（またはコードされたタンパク質）モジュールのライブラリー（すなわ
ち、核酸を挿入もしくは欠失したモジュールのライブラリー）を提供する。モジ
ュラー配列の数および配置、ならびにそれらの配列組成は、プロモーター、エキ
ソン、または他の遺伝子モジュールの全体活性に影響を及ぼし得る。
【０１４５】 遺伝子およびコードされるタンパク質（特に真核生物において発生するタンパ
ク質について）のモジュールとしてのエキソンの概念が確立される。例えば、Ｇ
ｉｌｂｅｒｔおよびＧｌｙｎｉａｓ（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７−１４４；Ｄ
ｏｌｉｔｔｌｅおよびＢｏｒｋ（１９９３年１０月）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ ５０−５６；ならびにＰａｔｔｈｙ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １：３
５１−３６１を参照のこと。エキソンモジュールのシャッフリングは、エキソン
シャッフリングルールの理解によって最適化される。イントロン（および結果的
にエキソン）が、３つの異なるフェーズにおいて生じ、これはエキソン−イント
ロン境界でコドンのスプライス接合部に依存する。Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５４９−５５３；Ｐａｔｔｈｙ（１９９４
）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ４：３８３−３９２およびＰａｔｔｈｙ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １：３５１
−３６１を参照のこと。
【０１４６】 本質的に、シャッフルされたエキソンのスプライス接合部は、隣接するエキソ
ンのスプライス接合部を有する「フェーズ適合性」である必要がある−そうでな
い場合、次いで、リーディングフレームにおけるシフトが生じ、エキソンモジュ
ールの情報が除去される。イントロンの３つの可能なフェーズは、イントロンが
生じるイントロン−エキソン境界でコドン内の塩基の位置についてフェーズ１、
２または０である。リーディングフレームに関連したそれらの位置に従うイント
ロンの分類は、以下である：フェーズ０イントロンは、隣接するエキソンの２つ
のコドンの間に位置する；フェーズ１イントロンは、コドンの第１ヌクレオチド
と第２のヌクレオチドとの間に位置し、そしてフェーズ２イントロンは、コドン
の第２のヌクレオチドと第３のヌクレオチドとの間に位置する。フェーズ１イン
トロンは、性質的に大部分が共通している。
【０１４７】 本発明の１つの局面は、このようなモジュールの配列、モジュールの反復の数
（０（すなわち、エレメントの欠失）から所望のコピー数）、およびモジュール
の長さを変化させるためのモジュラー配列（例えば、プロモーターエレメントお
よびエキソンを含む）のシャッフリングである。特に、標準的なシャッフリング
の方法、および／または本明細書中のオリゴヌクレオチド媒介方法は、単に適切
に設計されたフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを組換え混合物にスパイク
することによって、エレメントの複製および長さの改変のアプローチと組み合わ
せ得る。
【０１４８】 例えば、反復されるエレメントを含むＰＣＲ生成フラグメントは、相補的であ
るように設計された末端とともに、組換え反応にスパイクされる。これにより、
引き続く組換え反応において多量体の生成を引き起こす。これらの多量体は、最
終のシャッフリング産物に、多量体の末端での相同組換えによって、多量体化さ
れるモジュールのモル比に依存しているこのような多量体の全長と組込まれ得る
。多量体は、別々に生成され得るか、または前出で議論されるような遺伝子の再
集合／組換え反応においてオリゴであり得る。
【０１４９】 好ましい局面において、オリゴヌクレオチド組換えおよび遺伝子アセンブリの
間、オリゴは選択されて、多量体を生成および／または選択されたモジュール（
例えば、エキソン、プロモーターエレメント、エンハンサーなど）を欠失し、こ
れによって多量体またはモジュールの欠失を別々に含む核酸を作製する必要を回
避する。従って、１つの局面において、重複ファミリー遺伝子シャッフリングオ
リゴヌクレオチドのセットは、配列モジュールエレメントの欠失または多量体化
を提供するオリゴを含むように構築される。これらの「モジュールシャッフリン
グ」オリゴヌクレオチドは、相同な核酸を組換えるために本明細書中の他の任意
のアプローチとともに用いられ得る。従って、配列モジュールエレメントは、選
択される核酸の活性もしくは異なる成分の活性を提供する所定の核酸のサブ配列
のモジュールエレメントであり、一方、モジュールシャッフリングオリゴヌクレ
オチドは配列モジュールの挿入、欠失または多量体化を提供するオリゴヌクレオ
チドである。このようなオリゴヌクレオチドの例には、１つより多い配列モジュ
ール（選択された位置での介入配列の欠失および／またはモジュールの挿入を提
供する）に対応するサブ配列を有するオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド
混合物のハイブリダイゼーションおよび伸長などの間、１つ以上のオリゴヌクレ
オチド（および、必要に応じて関連配列の）の多量体化を許容する同一性の領域
を有する末端を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１５０】 上記のモジュールの欠失、挿入のストラテジーから生じるライブラリーは、対
応するまたは相同な親の核酸に関連する所定のモジュールのコピー数および配置
を変化させる。このモジュールがエキソンである場合、代表的には、組換え方法
において使用されるオリゴヌクレオチドは、同じフェーズ（すなわち、同じリー
ディングフレームを有する）において結合されるエキソンを生じるよう選択され
て、任意の所定のライブラリーメンバーが機能的に活性である見込みを増大する
。これは、図３に模式的に例証される。異なって影がつけられたモジュールは、
別々のエキソンを示し、エキソンのフェーズを１、２、または０と示す。
【０１５１】 （分岐学的中間体のシャッフリング） 本発明は、「進化的中間体」のシャッフリングを提供する。本発明の文脈にお
いて、進化的中間体は、２つ以上の相同な配列の間の特徴において中間である（
例えば、配列が進化樹状図において分類される場合）人工構築物である。
【０１５２】 核酸はしばしば、進化的分岐点および、必要に応じて関連性を示す進化樹状図
（「樹形図」）に分類される。例えば、分岐学的分析は、生物体または形質（核
酸またはポリペプチド配列を含む）が、仮定される共通の祖先（多岐した形質ま
たは生物体の中間形態）からの起源を反映する基準に基づいて順に並べられ、そ
して分類される、分類方法である。分岐学的分析は主に、関連性を示す関連樹形
図（または樹状図）の分岐に関連するが、差異の程度はまた、評価され得る（差
異は時折、差異の程度を考慮し、そして進化樹状図における分岐点を単に決定す
る進化的分類学者の間で作製される（古典的分岐学的分析）；しかし、本発明の
目的のために、いずれかの方法によって作製される関連樹形図は、進化的中間体
を作製し得る）。
【０１５３】 分岐学的または他の進化的中間体は、２つ以上の現存の核酸の間において、次
々と、中間である核酸を選択することによって決定され得る。この配列は、天然
に存在しなくてもよいが、選択された天然の配列に類似する配列をなお示す（す
なわち、２つ以上の配列の中間体が２つ以上の現存する核酸の共通の祖先と類似
した配列を示す）。従って、進化的中間体は、それらが「擬似選択された」配列
を示すので、１つの好ましいシャフリング基質であり、そしてこれは、無作為に
選ばれた活性を有する配列よりも見込みがある。
【０１５４】 シャッフリングのための基質として進化的中間体を使用する（または、このよ
うな配列に対応するオリゴヌクレオチドの使用の）１つの利点は、重要な配列多
様性がより少ない出発基質において示され得ることである（すなわち、親Ａおよ
びＢで出発する場合、単一の中間体「Ｃ」はＡおよびＢの両方の少なくとも部分
的代表である）。このことは、遺伝子の再構築／組換え方法についてのオリゴヌ
クレオチドの合成を簡単にし、手順の効率を改善する。さらに、進化的中間体を
用いた配列データーベースの検索により、標準的な検索プログラム（例えば、Ｂ
ＬＡＳＴ）を使用して関連した核酸を同定する機会が増大する。
【０１５５】 中間体の配列はまた、単に２つの合成配列から出発することによって、天然に
おいて示されない２つ以上の合成配列の間で選択され得る。このような合成配列
には、進化的中間体、提案された遺伝子配列、または配列に関連した目的の他の
配列が挙げられ得る。これらの「人工中間体」はまた、遺伝子の再構築方法の複
雑性を減少させる際、および進化のデーターベースを検索する能力の改善につい
て有用である。
【０１５６】 従って、本発明の１つの重要な実施態様において、進化的または人工中間体を
提示する文字列は、アラインメントおよび配列関連ソフトウェア（ＢＬＡＳＴ、
ＰＩＬＥＵＰなど）を用いて最初に決定され、次いでオリゴヌクレオチド再構築
方法を用いて合成される。あるいは、中間体はまた、本明細書中の遺伝子再構築
方法において使用されるオリゴヌクレオチドの選択についての基礎を形成し得る
。
【０１５７】 分岐学的中間体の作製についての発展した手順（隠れたＭａｒｋｏｖモデルス
レッディングを用いたシリコンシャッフリングを含む）に関するさらなる詳細は
、同時に出願されたＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによる、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ
ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ、ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴ
ＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ
ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」Ａｔｔｏｒｎｅｙ整理番号０２−２８９−
３０ＵＳおよび同時に出願されたＰＣＴ出願（米国で称される）Ｓｅｌｉｆｏｎ
ｏｖらによる、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ
ＳＴＲＩＮＧＳ、ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＯＬＹＰＥＰ
ＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ
」Ａｔｔｏｒｎｅｙ整理番号０２−２８９−３０ＰＣに示される。
【０１５８】 （タンパク質ドメインシャフリング） 遺伝子のファミリーシャッフリングは、コードされたタンパク質の機能的多様
性を評価するのに良好な方法である。しかし、目的の活性を提供するコードされ
たタンパク質の一部分のみをシャッフルすること、特に、タンパク質が多機能的
であり、かつ１つ以上の活性がタンパク質全体のサブ配列（ドメイン）にマッピ
ングされ得る場合は、有利であり得る。
【０１５９】 例えば、グリコシルトランスフェラーゼのような酵素は、２つの基質を有する
：アクセプターおよび活性化糖ドナー。アクセプターを変えずに転移するべき糖
を変化させるために、糖結合ドメインのみをファミリーシャッフルすることは、
好ましくあり得る。なぜならば、糖アクセプタードメインのファミリーシャッフ
リングは、より少ない数の所望のアクセプターを生じ得るからである。
【０１６０】 １つの実施例において、糖ａ〜ｅをアクセプターＡ〜Ｅに転移する５つの酵素
、ｅＡ〜ｅＥ（それぞれ５００アミノ酸）が存在する。糖ａ〜ｅをアクセプター
Ａに転移する酵素のライブラリーを作製するために、ｅＡ〜ｅＥの糖結合ドメイ
ンをシャッフリングし、それらをｅＡのアクセプター結合ドメインと結合させる
ことは好ましくあり得る。
【０１６１】 このストラテジーの実施における１つの技術的挑戦は、目的のタンパク質にお
けるこのような機能的ドメインを同定するためのデータが不十分であり得ること
である。この場合、ライブラリーのセットは、無作為な酵素部分のファミリーシ
ャッフリングによって作製され得る。例えば、酵素ｅＡ〜ｅＥ（上記）のファミ
リーシャフリングに適用する場合、第１のライブラリーは、組換えおよび延長の
ためのオリゴヌクレオチドセットを適切に選択することによって、ｅＡ〜ｅＥの
うちのいずれか１つの最後の４００アミノ酸と組み合わせてｅＡ〜ｅＥの第１の
１００アミノ酸をコードして作製され得る。第２のライブラリーは、ファミリー
が、ｅＡ〜Ａｅのいずれか１つの第１の１００アミノ酸およびｅＡ〜Ａｅのうち
いずれか１つの最後の３００アミノ酸をコードしたものなどと組み合わせて、ｅ
Ａ〜ｅＥの第２の１００アミノ酸をファミリーシャッフルして作製され得る。こ
れらのライブラリーの小サブセットは、第１の所望の機能についてスクリーニン
グされる。第１の所望の機能（例えば、上記実施例におけるアクセプター活性）
を保持するライブラリーは、選択可能な機能（例えば、上記実施例における糖転
移）に加え、比較的高い割合の改変体を有する。
【０１６２】 このアプローチは、１つの特性が所望されて保存される任意の多機能性タンパ
ク質の多様化のために使用され得る。このストラテジーは、保存されるべき特性
が複雑である場合（例えば、ポリケチド、非リボソームペプチドまたは他の天然
産物に対する基質特異性）、特に利点である。
【０１６３】 一般的に、個々のドメインのシャッフリングを提供するためのオリゴヌクレオ
チドの選択（既知の機能的サブ配列、または上記の未知の機能のサブ配列に対応
するかに関わらず）は、配列に関連したオリゴヌクレオチドの２つの一般的な型
を提供することによって、実施される。第１の型は、組換えが所望される領域に
対応する（すなわち、本明細書中にしるされるストラテジーに従って）配列に関
連した重複オリゴヌクレオチドセットを選択することによって提供されるが、第
２の型は、シャフルされるべきドメインとシャッフルされないドメインであるド
メインの間の組換え接合物（すなわち、本明細書中に記載の交差オリゴヌクレオ
チドと類似である）を提供する。シャッフルされないドメインは、単なるオリゴ
ヌクレオチド遺伝子の再構築方法によって（すなわち、オリゴヌクレオチドを結
合する連結またはポリメラーゼ媒介伸長反応を用いて）作製され得るか、または
シャッフルされないドメインは、より大きな核酸の酵素的切断によって作製され
得る。
【０１６４】 （延長されたファミリーシャッフリング組込み分子モデリングおよびアラニン
走査） ファミリーに基づくオリゴシャッフリングは、遺伝子合成において組換えられ
るファミリーシャッフリングオリゴヌクレオチドのセットを作製することによる
相同な核酸の組換え、および前出で議論されたような組換えプロトコルを含む。
記載されるように、相同な核酸は、天然の相同体または非天然（例えば、人工の
）の相同体であり得る。
【０１６５】 非天然の相同体の組換えの１つの利点は、天然に生じる配列の空間以外の配列
の空間が、生じた組換え核酸によって接近されることである。このさらなる多様
性は、天然の多様性を提示する核酸の組換えによって提供されない機能的特性の
発達または獲得を可能にする。
【０１６６】 組換えのための相同体を無作為に作製することの主な欠点は、生じた相同体の
多くが、関連する特徴に関して機能的でないことである。これらの相同体につい
て、選択可能な配列空間において生じた増大の多くは、所望されない「ノイズ」
であり、これは集団から選択される必要がある。対照的には、天然の多様性は、
進化的に試験された分子を示し、このことは、より多くの、標的化された、組換
えが生じる潜在的な配列空間全体を示す。
【０１６７】 所望しない配列空間の有意な増大がなく、非天然の多様性を捕捉する１つの方
法は、コードされる分子（タンパク質、ＲＮＡなど）の所望される機能的特性を
有意に退化させることなく所定の遺伝子において改変され得るそれらの位置を規
定することである。少なくとも２つの基本的なアプローチが使用され得る。
【０１６８】 第１に、点変異（例えば、アラニン走査）は、機能の有意な欠失なしに変異さ
れ得る位置を規定するために実施され得る。原則として、機能に関して、基本的
に中性である点変異の大きなスペクトルを規定するために、全ての２０アミノ酸
が各位置について試験され得る。次いで、シャッフリングオリゴのセットは、こ
れらの非天然（しかしなお活性化である）相同体を捕捉するよう作製される。多
くの市販の重要なタンパク質について、アラニン走査の情報はすでに入手可能で
ある。例えば、Ｙｏｕｎｇら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６
：１２２８−１２３６は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のアラニン走
査を記載する。
【０１６９】 第２に、構造情報がタンパク質について入手可能である場合（および、例えば
タンパク質がどのようにリガンドと相互作用するか）、機能においてほとんど変
異しないかまたは全く変化しないと予想される領域が規定され得る。次いで、フ
ァミリーシャッフリングオリゴのセットは、これらの非天然（しかしなお活性化
であると予想される）の相同体を捕捉するように作製される。種々のタンパク質
の結晶構造が入手可能である（例えば、Ｇ−ＣＳＦの結晶構造：Ｈｉｌｌら（１
９９３）ＰＮＡＳ ９０：５１６７を含む）。
【０１７０】 同様に、構造情報が入手可能でない場合でさえ、分子モデリングが実行され、
予測された構造が提供され得る。これをまた使用して、残基が、機能を変化する
ことなく変化され得ることが予測され得る。タンパク質の構造を予測するための
種々のタンパク質構造のモデリングプログラムは、市販されている。さらに、ス
ーパー構造（ヘリックス、β−シートなど）の領域を形成するアミノ酸の相対的
な傾向が良好に確立される。例えば、Ｏ’ＮｅｉｌおよびＤｅＧｒａｄｏ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ｖ．２５０は、共通して生じるアミノ酸のヘリックスを形成する傾
向の議論を提供する。活性を形成する相対的な構造のアミノ酸についての表は、
残基が所定の部分において機能的に置換され得ると予測される置換表として使用
され得る。次いで、ファミリーシャッフリングオリゴのセットは、これらの非天
然（しかしなお活性化であると予測される）の相同体を捕捉するように作製され
る。
【０１７１】 例えば、タンパク質設計自動装置（ＰＤＡ）は、タンパク質およびペプチドの
設計および最適化、ならびにタンパク質およびペプチドの設計について計算的に
駆動される１つの系である。代表的には、ＰＤＡは、タンパク質骨格構造で始ま
り、そしてタンパク質の特性を改変するためにアミノ酸配列を設計するが、一方
、三次元折り畳み特性を維持する。多数の配列は、ＰＤＡを用いて操作され得、
これはタンパク質構造（配列、サブ配列など）の設計を可能にする。ＰＤＡは、
例えば以下を含む多くの刊行物に記載される：ＭａｌａｋａｕｓｋａｓおよびＭ
ａｙｏ（１９９８）「Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔａｂｉ
ｌｉｔｙ ｏｆ ａ Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｖａｒｉａｎｔ」Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．５：４７０；Ｄａｈｉ
ｙａｔおよびＭａｙｏ（１９９７）「Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓ
ｉｇｎ：Ｆｕｌｌｙ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｅｌｅｃｔｉ
ｏｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８、８２−８７．ＤｅＧｒａｄｏ、（１９９７）「
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｓｃｒａｔｃｈ」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８：８０
−８１；Ｄａｈｉｙａｔ、ＳａｒｉｓｋｙおよびＭａｙｏ（１９９７）「Ｄｅ
Ｎｏｖｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｏｗａｒｄｓ Ｆｕｌｌｙ Ａｕ
ｔｏｍａｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２７３：７８９−７９６；ＤａｈｉｙａｔおよびＭａｙｏ（１９９７）「Ｐ
ｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐａｃｋｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉ
ｔｙ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１０１７２−１０１７７；Ｈｅｌｌｉｎｇａ（１９９７
）「Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ−Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ
Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１００１５−１００１７；ＳｕおよびＭａｙｏ（１９
９７）「Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ａｎ
ｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ」Ｐｒｏｃ．Ｓｃｉ．６：１７０１−１７０７；Ｄ
ａｈｉｙａｔ，ＧｏｒｄｏｎおよびＭａｙｏ（１９９７）「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｈｅｌｉｃｅｓ」Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．、６：１３３３−１３３７；Ｄａ
ｈｉｙａｔおよびＭａｙｏ（１９９６）「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ａｕ
ｔｏｍａｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｓｃｉ．，５：８９５−９０３。ＰＤＡに関する
さらなる詳細は、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｘｅｎｃｏｒ．ｃｏｍ／で入手
可能である。ＰＤＡを使用して、活性を保持するようである改変体の配列を同定
し得、オリゴヌクレオチド媒介組換えについての基礎として使用され得る相同な
核酸のセットを提供する。
【０１７２】 （組換え後のスクリーニング技術） 本明細書中の種々のシャッフリング手順において使用される正確なスクリーニ
ング方法は、本発明の重要な局面ではない。一般に、当業者は、選択される活性
を参考として、適切なスクリーニング（すなわち、選択）方法を実施し得る。
【０１７３】 いずれかの場合において、１つ以上の組換えサイクルが、通常は、所望される
特性、形質、または特徴を有する分子、形質転換細胞もしくは生物体についてス
クリーニングまたは選択する１つ以上のサイクルが続く。組換えサイクルがイン
ビトロで実施される場合、組換え産物（すなわち、組換えセグメント）は時折、
スクリーニング工程の前に細胞に導入される。組換えセグメントはまた、スクリ
ーニング前に、適切なベクターまたは他の調節配列に連結され得る。あるいは、
インビトロで生成した組換え産物は時折、スクリーニング前にウイルス中（例え
ば、バクテリオファージ）中にパッケージングされる。組換えがインビボで実施
される場合、組換え産物は時折、組換えが起こる細胞においてスクリーニングさ
れ得る。他の適用において、組換えセグメントは、細胞から抽出され、そして必
要に応じてスクリーニング前にウイルスのようにパッケージされる。
【０１７４】 スクリーニングまたは選択の性質は、どの特性もしくは特徴が要求されるか、
またはどの特性もしくは特徴の改善が求められるかに依存し、そして多くの実施
例を以下に記載する。特定の組換え産物（組換えセグメント）が、出発基質に対
して新しいまたは改善された特性もしくは特徴を獲得することによって分子の基
礎を理解することは、通常必要とされない。例えば、遺伝子は、多くの構成要素
配列を有し得、それぞれの配列は、種々の意図される役割（例えば、コード配列
、調節配列、標的配列、安定性を授与する配列、サブユニット配列および組込み
に影響を与える配列）を有する。これらの構成要素配列のそれぞれは、変化し得
、そして同時に組換えられ得る。次いで、例えば、このような改善がベクターの
任意の個々の構成要素配列に起因する必要なしに、細胞に対して活性を与える能
力を増大させる組換えセグメントについて、スクリーニング／選択が実施され得
る。
【０１７５】 所望の特性について使用される特定のスクリーニングプロトコルに依存して、
初回のスクリーニングは、時折、高いトランスフェクション効率でありかつ培養
が容易であるために、細菌細胞を用いて実施され得る。しかし、細菌の発現は、
しばしば実践的でもなく、所望もされず、そして酵母、真菌または他の真核動物
系がまた、ライブラリーの発現およびスクリーニングについて使用される。同様
に、細菌または単純な真核動物ライブラリー細胞においてスクリーニングしにく
いスクリーニングの他の型は、それらの意図する使用に近い環境における使用の
ために選択された細胞において実施される。最終回のスクリーニングは、意図さ
れる使用の正確な細胞型において実施され得る。
【０１７６】 多様なライブラリーをスクリーニングするための１つのアプローチは、シャッ
フルされた核酸産物（例えば、コードされた酵素）を増強された活性についてス
クリーニングするための大量並行する固相手順を使用することである。吸着、蛍
光またはＦＲＥＴを用いる大量並行固相スクリーニング装置が入手可能である。
例えば、Ｂｙｌｉｎａら（１９９９）に対する米国特許第５，９１４，２４５号
を参照のこと；また、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｉｒｏｓ−ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ．ｃｏｍ／；Ｙｏｕｖａｎら（１９９９）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉ
ｍａｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏ−Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＩＭＳ）
」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｅｔ ａｌｉａ＜ｗｗｗ．ｅｔ−ａｌ．ｃｏｍ
＞１：１−１６；Ｙａｎｇら（１９９８）「Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＨＩＲＩＭ）」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ｅｔ ａｌｉａ，＜ｗｗｗ．ｅｔ−ａｌ．ｃｏｍ＞４：１−２０；なら
びにＹｏｕｖａｎら（１９９９）「Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｅｄ ＧＦＰ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｎ Ｎｉｃｋｅｌ Ｃｈｅｌａ
ｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ」ｗｗｗ．ｋａｉｒｏｓ−ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．ｃｏｍ
に掲示される。これらの技術によるスクリーニング後、目的の配列が代表的には
単離され、必要に応じて配列決定され、そしてこの配列は、本明細書中に示され
るように使用され、新規のオリゴヌクレオチドシャッフリング方法を設計する。
【０１７７】 特性においてさらなる改善が所望される場合、少なくとも１つの組換えセグメ
ントおよび通常、初回のスクリーニング／選択で生存している組換えセグメント
の収集物は、さらなる回の組換えに供される。これらの組換えセグメントは、互
いに組換えられ得るか、または本来の基質もしくはそれらのさらなる改変体を提
示する外因性セグメントで組換えられ得る。再び、組換えをインビトロまたはイ
ンビボで行い得る。先のスクリーニング工程が所望の組換えセグメントを細胞の
構成要素として同定する場合、この構成要素はさらなるインビボでの組換えに供
され得るか、またはインビトロでのさらなる組換えに供され得るか、あるいはイ
ンビトロでの組換えの回を実行する前に単離され得る。逆に、先のスクリーニン
グ工程が所望の組換えセグメントを裸の形態において、またはウイルスの構成要
素として同定する場合、これらのセグメントは、細胞に導入され得、インビボの
組換えの回が実施される。２回目の組換えでは、実施方法に関係なく、前回に生
じた組換えセグメントに存在するものより、さらなる多様性を含むさらなる組換
えセグメントを生成する。
【０１７８】 ２回目の組換えの後、初回について上記で議論されるような原理に従って、さ
らなる回のスクリーニング／選択が行われ得る。スクリーニング／選択のストリ
ンジェンシーは、回数ごとに増大され得る。１つより多くの特性における改善が
所望される場合か、または１つより多くの新規な特性を獲得することが所望され
る場合、スクリーニングの性質およびスクリーニングされる特性もまた、回数ご
とに変化し得る。次いで、組換えセグメントが十分発達し、所望の新しいまたは
改善された特性もしくは機能を獲得するまで、さらなる回の組換えおよびスクリ
ーニングが実施され得る。
【０１７９】 （シャッフリング後の手順） 本発明の方法によって生成される核酸は、必要に応じて、活性のスクリーニン
グのために細胞中にクローニングされる（または、インビトロ転写反応において
使用されて、スクリーニングされる産物を作製する）。さらに、この核酸は、配
列決定され得、発現され得、インビトロで増殖され得、または他の任意の一般的
な組換え方法において処置され得る。
【０１８０】 クローニング、変異誘発、ライブラリ構築、スクリーニングアッセイ、細胞培
養などを含む、本明細書において有用な分子生物学的技術を記載する一般的な教
科書としては、以下が挙げられる：ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄ
ｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１巻〜第３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕ
ｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｉｎｃ．との間の合弁事業，（１９９８年までの補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ
」））。細胞（植物細胞および動物細胞を含む）を核酸を用いて形質導入する方
法は、そのような核酸によってコードされるタンパク質を発現する方法と同様に
一般的に利用可能である。Ｂｅｒｇｅｒ、ＡｕｓｕｂｅｌおよびＳａｍｂｒｏｏ
ｋに加えて、動物細胞の培養についての有用な一般的な参考文献としては、Ｆｒ
ｅｓｈｎｅｙ（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第三版 Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４））およびそこで引用されている参考文献、Ｈ
ｕｍａｎｓｏｎ（Ａｎｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第四版
Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９７９））およびＲｉ
ｃｃｉａｒｄｅｌｌｉら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２
５：１０１６−１０２４（１９８９）が挙げられる。植物細胞クローニング、培
養および再生についての参考文献としては、Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，ＮＹ（Ｐａｙｎｅ）；ならびにＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（
編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ
Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈ
ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（Ｇａｍｂｏｒｇ）が挙げられる。種
々の細胞培養培地がＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（Ａｔｌａｓ）に記載されている。植
物細胞培養についてのさらなる情報は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．
（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（１９９８）（Ｓｉｇｍａ
−ＬＳＲＣＣＣ）、および例えば、またＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．
（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＰｌａｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｔａｌｏ
ｇｕｅおよび補遺（１９９７）（Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳ）のような市販の文献に
見出される。
【０１８１】 例えば、オリゴヌクレオチドがシャッフルされた核酸を増幅するために有用な
、当業者にインビトロ増幅方法を指示するに十分な技術の例としては、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ増幅
および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
これらの技術は、Ｂｅｒｇｅｒ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌ（前出
）、ならびにＭｕｌｌｉｓら、（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；
ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈ
ｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ ３６−４７；Ｔ
ｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３、８１
−９４；Ｋｗｏｈら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８６，１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ ３５，１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４１，１０７７−１０８０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８、２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ
（１９８９）Ｇｅｎｅ ４、５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎ
ｅ ８９，１１７，ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３−５６４に見出される。インビトロ
で増幅された核酸をクローニングする改善された方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米
国特許第５，４２６，０３９号に記載される。大きな核酸をＰＣＲによって増幅
する改善された方法は、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６８
４−６８５およびその中の参考文献にまとめられる。そこでは、４０ｋｂまでの
ＰＣＲアンプリコンが生成される。当業者は、本質的に任意のＲＮＡが、制限消
化、ＰＣＲ拡張、ならびに逆転写酵素およびポリメラーゼを用いた配列決定につ
いて適切な、二本鎖ＤＮＡに変換され得ることを理解する。Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ（すべて前出）を参照のこと。１つの好まし
い方法において、再アセンブルされた配列を、ファミリー遺伝子シャッフリング
オリゴヌクレオチドの取り込みについてチェックする。これは、その核酸をクロ
ーニングおよび配列決定することならびに／または制限消化によって（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌ（上記）に本質的に教示
されるように）なされ得る。さらに、配列は、ＰＣＲ増幅され得、そして直接配
列決定され得る。従って、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ、Ａｕｓｕ
ｂｅｌおよびＩｎｎｉｓ（前出および上記）に加えて，さらなるＰＣＲ配列決定
ＰＣＲ配列決定方法論もまた、特に有用である。例えば、ホウ素化ヌクレアーゼ
抵抗性ヌクレオチドをＰＣＲの間にそのアンプリコンに選択的に取り込むこと、
およびそのアンプリコンをヌクレアーゼで消化して、大きさ順のテンプレートフ
ラグメントを生成することによって、ＰＣＲ生成したアンプリコンの直接の配列
決定がなされた（Ｐｏｒｔｅｒら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５（８）：１６１１−１６１７）。この方法において、１
つのテンプレートに対して４回のＰＣＲ反応を行った。その各々の反応において
、そのＰＣＲ反応混合物におけるヌクレオチド三リン酸の１つを、部分的に、２
’デオキシヌクレオシド５’−［Ｐ−ボラノ］−三リン酸に置換する。このホウ
素化ヌクレオチドを、そのテンプレートのＰＣＲフラグメントのネスティドセッ
トにおいて、そのＰＣＲアンプリコンにそって種々の位置で、化学量論的に、Ｐ
ＣＲ産物へ取り込ませる。取り込まれたホウ素化ヌクレオチドによってブロック
されるエキソヌクレアーゼを使用して、そのＰＣＲアンプリコンを切断する。次
いで、この切断されたアンプリコンを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い
て大きさによって分離する。これは、そのアンプリコンの配列を提供する。この
方法の１つの利点は、それがＰＣＲアンプリコンのサンガー式の標準的な配列決
定を実施するより少ない生化学的操作を使用することである。
【０１８２】 （インシリコシャッフリング） 「インシリコ」シャッフリングは、コンピュータアルゴリズムを利用して、コ
ンピュータにおいて遺伝的演算子を用いて「仮想」シャッフリングを行う。本発
明に適用する場合、遺伝子配列ストリングを、コンピュータシステムにおいて組
換えし、そして例えば、本明細書において記載されるような合成オリゴヌクレオ
チドのＰＣＲの再アセンブリによって、所望の産物が作製される。インシリコシ
ャッフリングは、詳細には、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖらによる「ＭＥＴＨＯＤＳ Ｆ
ＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ，ＰＯＬＹＮＵＣＬ
ＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩ
ＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（代理人整理番号０２−２８９−３
ＵＳ、本願に同封する）に記載されている。
【０１８３】 手短には、遺伝的演算子（所定の遺伝的事象（例えば、点変異、相同な核酸の
２本の鎖の組換えなどを表すアルゴリズム）を使用して、組換えまたは変異事象
をモデル化する。これらの事象は、例えば、核酸配列ストリング（例えば、相同
な核酸を表すものおよび組換え出力を予測するもののような）を整列すること（
標準的な整列ソフトウェアを使用するか、もしくは手動の調査および整列による
）によって、１つの以上の核酸において生じ得る。推測された組換え出力を使用
して、例えば、オリゴヌクレオチド合成および再アセンブリＰＣＲによって、対
応する分子を生成する。
【０１８４】 （一体化されたアッセイおよび一体化されたシステム構成要素） いたるところで記載するように、本発明の１つの好ましい局面は、コンピュー
タおよび配列整列ソフトウェアを用いた核酸の整列である。同様に、適切なソフ
トウェアを有するコンピュータを使用して、物理的オリゴヌクレオチド合成の前
に、「インシリコ」シャッフリングを実施し得る。さらに、他の重要な一体化さ
れたシステム成分は、高処理スクリーニングアッセイ、ならびにそのようなアッ
セイを、オリゴヌクレオチド選択、合成および組換えと結びつけることを提供し
得る。
【０１８５】 当然、関連するアッセイは、その適用に依存する。タンパク質、レセプター、
リガンドなどについての多くのアッセイが公知である。形式としては、固定され
た成分への結合、細胞または生物の生存性、レポーター組成物の産生などが挙げ
られる。
【０１８６】 本発明の高処理アッセイにおいて、数千までの異なるシャッフリング改変体を
単一の日でスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレ
ートの各ウェルを使用して、別個のアッセイを行い得、または、濃度もしくはイ
ンキュベーション時間の効果を観察する場合は、５〜１０ウェルごとに単一の改
変体を試験し得る。従って、単一の標準的なマイクロタイタープレートは、約１
００（例えば、９６）の反応をアッセイし得る。１５３６ウェルプレートが使用
される場合は、単一のプレートは、約１００〜約１５００の異なる反応を容易に
アッセイし得る。１日あたりいくつかの異なるプレートをアッセイすることが可
能であり；約６，０００〜２０，０００の異なるアッセイ（すなわち、異なる核
酸、コードタンパク質、濃度などを含む）までについてのスクリーニングをアッ
セイすることは、本発明の一体化されたシステムを用いて可能である。より最近
になって、試薬操作についての微小流体アプローチが、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって開
発されている。
【０１８７】 １つの局面において、ライブラリーメンバー（例えば、細胞、ウイルスプラー
ク、胞子など）が固形培地上で分離されて個々のコロニー（またはプラーク）を
産生する。自動化コロニー採取機（例えば、Ｑ−ｂｏｔ、Ｇｅｎｅｔｉｘ、Ｕ．
Ｋ．）を用いて、コロニーまたはプラークを同定し、採取し、そして１０，００
０個までの異なる変異体を、２つの３ｍｍガラスボール／ウェルを含む９６ウェ
ルマイクロタイターディッシュに接種する。Ｑ−ｂｏｔは、コロニー全体を採取
するのではなく、むしろ、そのコロニーの中心を通るピンを挿入し、そして細胞
（または菌糸）および胞子（またはプラーク適用においてはウイルス）の小さな
サンプリングとともに抜け出る。このピンがそのコロニー内に存在する時間、そ
の培養培地に接種する浸漬物の数、およびそのピンがその培地に存在する時間は
各々、接種の大きさをもたらし、そして各々は、制御され得そして最適化され得
る。Ｑ−ｂｏｔの均一なプロセスは、人間の手による誤差を減じ、そして培養物
を確立する速度を上昇させる（およそ１０，０００／４時間）。次いで、これら
の培養物を、温度および湿度が制御されたインキュベータ中で振盪する。マイク
ロタイタープレートにおけるガラスボールは、細胞の均一な通気を促進するよう
に作用し、そして醗酵層の羽根と同様に菌糸のフラグメントが分散することを促
進するにように作用する。目的の培養物からのクローンを、限界希釈によってク
ローニングし得る。上記にもまた記載したように、プラークまたは細胞が構成す
るライブラリーはまた、タンパク質の生産について、ハイブリダイゼーション、
タンパク質活性、抗体へのタンパク質の結合などのいずれかを検出することによ
って、直接スクリーニングされ得る。
【０１８８】 多数の周知のロボットシステムもまた、アッセイシステムにおいて有用な溶液
相化学について開発されてきている。これらのシステムは、武田薬品工業株式会
社（日本国大阪府大阪市）によって開発された自動化合成装置、および科学者に
よって実施される手動の合成操作を模倣するロボットアーム（Ｚｙｍａｔｅ Ｉ
Ｉ、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ；
Ｏｒｃａ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，
ＣＡ））を利用する多くのロボットシステムのような自動化ワークステーション
を含む。任意の上記デバイスが、本発明での使用について、例えば，本明細書に
おいて記載した種々のオリゴヌクレオチドセットから集めた分子の高処理スクリ
ーニングのために、適切である。（ある場合）一体化システムに関して本明細書
において議論されるように操作し得るような、これらのデバイスの改変の性質お
よび実行は、関連分野の当業者には明白である。
【０１８９】 高処理スクリーニングシステムは市販されている（例えば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃ
ｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ａｉｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
，Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，
Ｉｎｃ．Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡなどを参照のこと）。これらのシステムは、代表的
に、全てのサンプルおよび試薬のピペッティング、液体分配、時限インキュベー
ション、およびそのアッセイについて適切な検出器におけるマイクロプレートの
最終読み取りを含む手順全体を自動化する。これらの構成可能なシステムは、高
処理および迅速な起動ならびに高度の可撓性およびカスタム化を提供する。この
ようなシステムの製造者は、種々の高処理についての詳細なプロトコルを提供す
る。従って、例えば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写、リガンド結合
などの調節を検出するためのスクリーニングシステムを記載する技術報を提供す
る。
【０１９０】 カメラまたは他の記録デバイス（例えば、光ダイオードおよびデータ記録デバ
イス）によって可視化される（および必要に応じて記録される）光学イメージは
、本明細書における任意の実施態様において必要に応じて、例えば、そのイメー
ジをデジタル処理すること、および／またはそのイメージをコンピュータにおい
て記録および分析することによってさらに処理される。例えば、ＰＣ（Ｉｎｔｅ
ｌ ｘ８６またはＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）チップ互換ＤＯＳTM、ＯＳ２TM、 ＷＩＮＤＯＷＳTM、ＷＩＮＤＯＷＳ ＮＴTMまたはＷＩＮＤＯＷＳ９５TMベース のコンピュータ）、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨTM、またはＵＮＩＸ（登録商標）ベース （例えば、ＳＵＭTMワークステーション）のコンピュータを用いて、デジタルビ デオまたはデジタル化した光イメージのデジタル化、記録、および分析のための 種々の市販の末端装置およびソフトウェアが利用可能である。１つの従来システ ムは、当該分野において一般に使用される、アッセイデバイスから冷却した電荷 結合素子（ＣＣＤ）カメラへの光を有する。ＣＣＤカメラは、画像素子（ピクセ ル）のアレイを含む。検体からの光は、ＣＣＤ上で画像化される。その検体の領 域（例えば、生物学的ポリマーのアレイ上での個々のハイブリダイゼーション部 位）に対応する特定のピクセルをサンプリングして、各位置についての光強度読 み取りを入手する。複数のピクセルを並行に処理して、速度を上昇させる。本発 明の装置および方法は、例えば、蛍光暗場顕微鏡技術によって任意のサンプルを 概観するために、容易に使用される。
【０１９１】 本発明におけるアッセイ分析のための一体化システムは、代表的に、配列の整
列ソフトウェアを備えたデジタルコンピュータおよび以下の１つ以上を含む：高
処理液体制御ソフトウェア、画像分析ソフトウェア、データ解釈ソフトウェアな
ど。
【０１９２】 溶液を供給源から目的地へ移動させるためのロボット液体制御電機子は、デジ
タルコンピュータに作動可能に連結され、そして入力デバイス（例えば、コンピ
ュータキーボード）は、例えば、ロボット液体制御電機子によって、高処理液体
移動、オリゴヌクレオチド合成などを制御するためのデジタルコンピュータへの
データを入力するために使用され得る。画像スキャナは、標識されたアッセイ成
分から標識シグナルをデジタル化するために使用され得る。画像スキャナは、画
像分析ソフトウェアを接続して、プローブ標識強度の測定を提供する。
【０１９３】 当然、これらのアッセイシステムはまた、オリゴヌクレオチド選択構成要素（
例えば、コンピュータ、目的の核酸配列を有するデータベース、配列整列ソフト
ウェア、およびオリゴヌクレオチド選択ソフトウェア）を組み込んだ一体化され
たシステムを含み得る。さらに、このソフトウェアは、選択されたオリゴヌクレ
オチドを注文するため、および／または作動可能に連結されたオリゴヌクレオチ
ド合成機によるオリゴヌクレオチドの合成を指示するための構成要素を含み得る
。従って、本発明の一体化システムの構成要素に、必要に応じて、上記の成分の
いずれかを備えさせて、高処理組換えおよび選択を容易にする。これらの高処理
組換え構成要素が、システムにおいて選択アッセイを実行するための構成要素か
ら別個であり得るか、またはそれら２つが一体化され得ることが認識される。
【０１９４】 １つの局面において、本発明は、本明細書において記載される方法を用いて１
セットのファミリーシャッフリングオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオ
チドのセットを選択するための指示セットとともに、コンピュータまたはコンピ
ュータ読み取り可能な媒体を含む。この指示セットは、相同な核酸を整列して、
類似性の領域および多様性の領域を同定し（例えば、ＢＬＡＳＴのような代表的
な整列ソフトウェアにおけるように）、次いで類似性および多様性の領域を包含
する重複オリゴヌクレオチドのセットを選択する（必要に応じて、本明細書にお
いて記載した重み付け因子（例えば、本明細書における遺伝子混和方法における
ように、組換えされる１つ以上の核酸に対応するオリゴヌクレオチドの優性選択
）のいずれかを用いる）。このコンピュータまたはコンピュータ読み取り可能な
媒体は、必要に応じて、ユーザによる使用を容易にする特徴を備える（例えば、
（例えば、自動化合成機における）そのユーザによるオリゴヌクレオチド選択の
入力のための入力場、ユーザーが概観可能な出力を制御するためのディスプレー
出力システム（例えば、ＧＵＩ）、オリゴヌクレオチドの合成を指示する出力フ
ァイルなど）。
【０１９５】 （実施例：３つの架橋オリゴを用いたβラクタマーゼのシャッフリング） 本実施例において、２つのβラクタマーゼ遺伝子（ＣＦＡＭＰＣおよびＦＯＸ
）を、３つの架橋オリゴヌクレオチドを用いてシャッフルした。そのオリゴンは
、以下の通りであった：
【０１９６】
【化１】
【０１９７】 組換え反応を、２μｇのＤＮアーゼ処理したＣＦＡＭＰＣおよびＦＯＸ由来の
フラグメントを用いて実施した。３つ全てのオリゴを、１×Ｔａｑ−ｍｉｘ（７
０７０μｌのＨ2Ｏ、１００μｌのＴａｑ緩衝液、６００μｌのＭｇＣｌ2（２５
ｍＭ）、８０μｌのｄＮＴＰ（１００ｍＭ））合計容量６０μｌの反応物に１：
１で添加した。
【０１９８】 反応を、１５０ｎｇのプライマー（２×モル濃度）、７５０ｎｇのプライマー
（１０×モル濃度）、および１５００ｎｇ（２０×モル濃度）を用いて実施した
。２０μｌのアセンブル混合物を、６０μｌの１×Ｔａｑ ｍｉｘに添加し、９
４℃（３０秒）、４０℃（３０秒）、および７２℃（３０秒）での４０回のサー
マルサイクルを実施した。次いで、得られた産物の１μｌ、２μｌ、４μｌ、お
よび８μｌを、βラクタマーゼ遺伝子の末端領域についてのプライマーを用いて
、４０サイクル（以前と同じサーマルサイクル条件）ＰＣＲ増幅した。次いで、
得られた材料を、Ｓｆｉで一晩５０℃にて消化し、ゲル精製し、そしてベクター
Ｓｆｉ−ＢＬＡ−Ｓｆｉ（ＭＧ１８）に連結し、ＴＧ１へと形質転換し、そして
Ｔｅｔ２０にプレートした。５０コロニーを、そのＴｅｔ２０プレートから選択
し、そしてコロニーＰＣＲによって増幅した。次いで、ＰＣＲアンプリコンを、
３７℃で一晩ＨｉｎＦ１で消化した。制限分析によって、各親の遺伝子について
、２つのｗｔ配列、およびに７つの異なる組換え産物（１０×モル濃度反応につ
いて）または８つの異なるクローン（２０×反応について）が産生されたことが
示された。
【０１９９】 （実施例：オリゴスパイキングによる半合成ライブラリーの作製） 使用される遺伝子は、ｃｒｙ２Ａａ、ｃｒｙ２Ａｂおよびｃｒｙ２Ａｃである
。ＤＮＡ整列を、ｅｄｉｔｓｅｑ．およびｍｅｇａｌｉｇ．を使用するＤＮＡ
ｓｔａｒを用いて行った。オリゴは、５０マイクロモル合成（ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ
ｃｈ）である。アミノ酸２６０〜６３０の間の領域についてのオリゴを、ｃｒｙ
２Ａについて、この領域の多様性に鑑み設計した。オリゴを２００μｌのＨ2Ｏ
中に再懸濁した。これらオリゴは以下のとおりである：
【０２００】
【化２】
【０２０１】 ファミリーシャッフリングを、Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）Ｂｉｏ／ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ １８（２）：１９４−１９６に記載されるアセンブル混合物へ
オリゴをスパイクすることを除いて、Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９５）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３９１：２８１−２９１に記載されるアセンブリ条件を使用して、行う。外
側プライマー １ ｆｏｒ ＡＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＧＡＡＴＡおよび１
ｒｅｖ ＴＴＡＡＴＡＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＴを用いたＰＣＲ反応を
、Ｔａｑ／Ｐｆｕ（９：１）混合物（ＱｉａｇｅｎからのＴａｑ，Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅからのＰｆｕ）、ＰＣＲプログラム（９６℃（３０秒）、５０℃（３０
秒）、７２℃（１分）を２５サイクル）を用いて、行う。この反応物を、１０倍
希釈し、そしてさらなるサイクルを行う。この遺伝子を、ベクターに連結し、そ
してＴＧＩコンピテント細胞へと形質転換し、そしてＬＢ＋Ａｍｐ１００プレー
トにプレートする。単一のコロニーをコロニーＰＣＲのために拾い、次いで限界
希釈によって分析する。
【０２０２】 （実施例：ライブラリーのオリゴシャッフリング） オリゴヌクレオチド媒介シャッフリング方法の利点は、目的の遺伝子における
多数の異なる部位について生成されたオリゴのライブラリーの間の核酸の組換え
を行う能力である。１つの標的遺伝子の異なる領域におけるランダム化の複雑な
組合せを有するライブラリーを生成することは、オリゴヌクレオチド媒介シャッ
フリングアプローチによって容易になる。
【０２０３】 例えば、抗体または抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）または
Ｆａｂ）の抗原結合部位は、主に、６つの相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む。こ
れらはＣＤＲは、適切に折り畳まれた分子の１つの面に存在するが、直鎖状の遺
伝子配列においては別個に存在する。合成オリゴヌクレオチドまたは１つ以上の
抗体遺伝子のＰＣＲによって生成されたオリゴヌクレオチドを用いて、個々のＣ
ＤＲでの配列多様性を生成し得る。このプロセスは、第二のＣＤＲを用いて、次
いで、第三のＣＤＲを用い、多様性抗体のライブラリーが形成されるまで、反復
され得る。ＤＮＡシャッフリング形式は、各々のＣＤＲのライブラリーが同時に
生成されることを可能とし、そしてＣＤＲ間の組換え事象が、頻繁に生じて、異
なるＣＤＲのすべての可能な組合せを潜在的に生成するという顕著な利点を有す
る。改良された形質または特性のための再帰性ＤＮＡシャッフリングおよびスク
リーニングを使用して、タンパク質機能を最適化し得る。
【０２０４】 同様に、多くのサイトカインの三次元構造は、共通の４−ヘリックス束構造を
、長い連結ループとともに共有する。これらタンパク質のいくつかのためのレセ
プター結合部位が決定されており、そして直鎖状遺伝子配列において別個に存在
するタンパク質の２以上の領域に位置付けされている。関連するタンパク質のモ
デリングを使用して、ライブラリーを標的化するために未知のタンパク質の機能
的領域を予測し得る。これらの領域の各々におけるライブラリーは、合成オリゴ
、ファミリーシャッフリングオリゴ、相同遺伝子のフラグメントまたは本明細書
におけるようなそれらの組合せを使用して生成され得る。オリゴヌクレオチド媒
介シャッフリングによって、これらの領域の各々におけるライブラリーを同時に
生成すること、および各ライブラリー間の組換えを生成することが可能となる。
このようにして、各ライブラリーのメンバーの間の組合せは、改良された機能に
ついてスクリーニングされ得る。次いで、改良された機能を有するこれら単離物
は、逐次回のＤＮＡシャッフリングに供され得る。このようにして、各ライブラ
リーにおいて最高の活性を有する単離物および異なるライブラリーのメンバー間
の潜在的相互作用が選択され得る。各ライブラリーを独立して最適化する他の方
法は、そのような相互作用を単離しないかもしれない。
【０２０５】 別の例は、活性部位および基質結合部位が折り畳みタンパク質の三次元構造に
おいて互いに近いが、その遺伝子の線形の配列において別個である残基を含む。
ＤＮＡシャッフリングは、基質と相互作用する各領域において同時にライブラリ
ーを生成し得る。ＤＮＡシャッフリングはまた、各ライブラリー間の変化のすべ
ての可能な組合せを生成することを可能とし、そして改良された形質または特性
について評価され得る。
【０２０６】 請求されるとおりの本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本明細書
においてこれまでに記載されてきた方法および材料に対して改変がなされ得、そ
して、本発明は、多数の異なる使用に供され得る。これは、以下を含む。
【０２０７】 ファミリーシャッフリングオリゴヌクレオチドを選択するため（例えば、親の
核酸の配列整列を含むプロセスによって）、および反復プロセスにおけるものを
含む、シャッフルされた核酸を、活性について試験するための、一体化されたシ
ステムの使用。
【０２０８】 本明細書においてこれまでに記載された選択ストラテジー、材料、成分、方法
または基質のいずれか１つを利用するアッセイ、キットまたはシステム。キット
は、必要に応じて、方法またはアッセイを実施するための指示書、包装材料、ア
ッセイ、デバイスまたはシステム構成要素などを含む１つ以上の容器をさらに備
え得る。
【０２０９】 さらなる局面において、本発明は、本明細書における方法および装置を具現化
するキットを提供する。本発明のキットは、必要に応じて、以下のうち１つ以上
を備える：（１）本明細書において記載されるような組換え成分；（２）本明細
書において記載される方法を実施するため、および／または本明細書におけるオ
リゴヌクレオチド合成またはアセンブルされた遺伝子選択手順を実行するための
指示書；（３）１つ以上のアッセイ成分；（４）核酸または酵素、他の核酸、ト
ランスジェニック植物、動物、細胞などを保持するための容器、（５）包装材料
、ならびに（６）標的核酸を整列するため、およびハイブリダイゼーションおよ
び伸長の際に、その標的核酸のシャッフリング形態を生ずるオリゴヌクレオチド
を選択するための指示書を備える、コンピュータまたはコンピュータ読み取り可
能な媒体。
【０２１０】 さらなる局面において、本発明は、本明細書における任意の成分またはキット
の使用、本明細書における任意の方法またはアッセイの実施、および／あるいは
本明細書における任意のアッセイもしくは方法を実施するための任意の装置また
はキットの使用を提供する。
【０２１１】 上記の本発明は、明確さおよび理解の目的のためにいくらか詳細に記載されて
いるが、本開示を読めば、形態および詳細における種々の変更が、本発明の真の
範囲を逸脱することなくなされ得ることは、当業者には明らかである。例えば、
上記に記載のすべての技術および材料は、種々の組合せにおいて使用され得る。
本願において引用された全ての刊行物および特許文献は、各個々の刊行物または
特許文献が個々にそのように示されるのと同じ程度に、全ての目的でその全体が
参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、キメラプラストを用いるオリゴヌクレオチド指向性インビボシャッフ
リングを示す模式図である。
【図２】 図２は、合成遺伝子混和を提供する低相同性シャッフリング手順の模式図であ
る。
【図３】 図３は、モジュラーエキソン欠失／挿入ライブラリーの模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／１１８，８５４ (32)優先日 平成11年２月５日(1999．2．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４１，０４９ (32)優先日 平成11年６月24日(1999．6．24) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４０８，３９２ (32)優先日 平成11年９月28日(1999．9．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４０８，３９３ (32)優先日 平成11年９月28日(1999．9．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４１６，３７５ (32)優先日 平成11年10月12日(1999．10．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４１６，８３７ (32)優先日 平成11年10月12日(1999．10．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ミンシュル， ジェレミー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025， メンロ パーク， ホーマー レーン 11 (72)発明者 バス， スティーブン エイチ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， ヒルズボロー， パロット ドライブ 950 (72)発明者 ウェルチ， マーク アメリカ合衆国 カリフォルニア 94536， フレモント， モンタルバン ドライブ 25 (72)発明者 ネス， ジョン イー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94089， サニーベイル， エヌ． フェイローク ス アベニュー ナンバー3115 1220 (72)発明者 グスタフソン， クラエス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94002， ベルモント， ベイビュー アベニュー 1813 (72)発明者 パッテン， フィリップ エイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94040， マウンテン ビュー， フェイエット ドライブ 2680， アパートメント 506 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA19 4B063 QA13 QQ42 QR32 QR62 QS25 QS32 QS38 4B065 AA90X AA99Y AB01 BA02 CA46

Claims (104)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 相同核酸を組換える方法であって、該方法は、以下の工程、
    （ｉ）ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセットをハイブリ
    ダイズする工程；および、 （ｉｉ）該ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセットを伸長
    することにより、組換えた核酸の集団を提供する工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドの
    セットが重複している、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記伸長工程が、ポリメラーゼまたはリガーゼを用いて行わ
    れる、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドの
    セットが、進化的に中間体である核酸をコードする、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、該方法がさらに、以下の工
    程： （ｉｉｉ）組換え核酸の集団を変性させることにより、変性した組換え核酸を提
    供する工程； （ｉｖ）該変性した組換え核酸を再アニーリングする工程； （ｖ）得られる該再アニーリングした組換え核酸を伸展または連結する工程；お
    よび、必要に応じて、 （ｖｉ）所望の特性について、１以上の得られる該組換え核酸を選択する工程、
    を包含する、方法。
  6. 【請求項６】 前記再アニーリングした組換え核酸が、工程（ｖｉ）を行う
    前に組換えられる、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 請求項５に記載の方法であって、該方法がさらに、 （ｖｉｉ）得られる前記選択された組換え核酸を組み換える工程、 を包含する、方法。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の方法であって、該方法がさらに、 得られる前記複数回選択され複数回組換えられた核酸を、所望の形質または特
    性について選択する工程、 を包含する、方法。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載の方法であって、該方法がさらに、以下の工
    程： （ｉｉｉ）前記組換え核酸の集団を変性させることにより、変性した組換え核酸
    を提供する工程； （ｉｖ）該変性した核酸を再アニーリングする工程； （ｖ）得られる該再アニーリングした組換え核酸を伸展する工程；および 工程ｉｉｉ〜ｖを少なくとも１回反復する工程、 を包含する、方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載の方法であって、該方法がさらに、 １以上の得られる前記再アニーリングした組換え核酸を、所望の形質または特
    性について選択する工程、 を包含する、方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法であって、該方法がさらに、 １以上の前記組換え核酸の集団のメンバーを、所望の特性について選択する工
    程、 を包含する、方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記組換え核
    酸の集団の複数のメンバーが、所望の特性についてスクリーニングされ、そして
    該所望の特性を有することが決定され、それにより、初回のスクリーニングした
    核酸を提供し、 該方法がさらに、以下の工程： 第２のファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセットをハイブ
    リダイズする工程であって、該第２のファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌ
    クレオチドのセットが、該初回のスクリーニングした核酸から誘導される、工程
    ；および 該第２のファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセットを伸長
    することにより、さらに組換えた核酸の集団を提供する、工程、 を包含する、方法。
  13. 【請求項１３】 前記第２のファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレ
    オチドのセットが重複している、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の方法であって、該方法がさらに、以下
    の工程： 前記初回のスクリーニングした核酸を配列決定する工程であって、ここで、前
    記第２のファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセットが、該初
    回のスクリーニングした核酸における同一性領域および多様性領域を同定するよ
    うに該初回のスクリーニングした核酸の配列を整列することによって、該初回の
    スクリーニングした核酸から誘導される、工程、および、 該第２のファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセットを、複
    数のオリゴヌクレオチドを含むように合成する工程であって、該複数のオリゴヌ
    クレオチドの各々が、少なくとも１つの多様性領域に対応するサブ配列を含む、
    工程、 を包含する、方法。
  15. 【請求項１５】 前記初回のスクリーニングした核酸が、約５０以下のアミ
    ノ酸ポリぺプチドをコードする、請求項１２に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記第２のファミリーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレ
    オチドのセットが、複数の前記初回のスクリーニングした核酸に由来するコンセ
    ンサスな領域のサブ配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドのメンバー型を含む
    、請求項１２に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記ファミリーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオチド
    のセットが、複数の相同標的核酸に由来するコンセンサス領域のサブ配列を含む
    、複数のオリゴヌクレオチドのメンバー型を含む、請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記ファミリーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオチド
    のセットが、少なくとも１つのモジュールシャッフリングオリゴヌクレオチドを
    含む、請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ファミリーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオチド
    のセットが、複数のモジュールシャッフリングオリゴヌクレオチドを含み、該複
    数のモジュールシャッフリングオリゴヌクレオチドの各々が、少なくとも、第１
    の配列モジュールに由来する第１のサブ配列および第２の配列モジュールに由来
    する第２のサブ配列を含む、請求項１に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記ファミリーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオチド
    のセットが、複数のモジュールシャッフリングオリゴヌクレオチドを含み、ここ
    で、１以上の複数のオリゴヌクレオチドの各々が、少なくとも、第１の配列モジ
    ュールに由来する第１のサブ配列および第２の配列モジュールに由来する第２の
    サブ配列を含む、請求項１に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記ファミリーシャッフリングオリゴヌクレオチドのセッ
    トが、複数の、コドン改変オリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 複数のオリゴヌクレオチドのメンバー型を含む前記ファミ
    リーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオチドのセットが、少なくとも３つのメ
    ンバー型を含む、請求項１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 複数のオリゴヌクレオチドのメンバー型を含む前記ファミ
    リーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオチドのセットが、少なくとも５つのメ
    ンバー型を含む、請求項１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 複数のオリゴヌクレオチドのメンバー型を含む前記ファミ
    リーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオチドのセットが、少なくとも１０のメ
    ンバー型を含む、請求項１に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記ファミリーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオチド
    のセットが、複数の相同オリゴヌクレオチドのメンバー型を含み、ここで、該相
    同オリゴヌクレオチドのメンバー型が約等モル量存在する、請求項１に記載の方
    法。
  26. 【請求項２６】 前記ファミリーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオチド
    のセットが、複数の相同オリゴヌクレオチドのメンバー型を含み、ここで、該相
    同オリゴヌクレオチドのメンバー型が非等モル量存在する、請求項１に記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】 核酸を組換える間に核酸ファミリー多様性を導入するため
    の方法であって、該方法は、以下の工程： 少なくとも１つのフラグメント化核酸のセットおよびファミリー遺伝子シャッ
    該フリングオリゴヌクレオチドの集団を含む組成物を提供する工程； 少なくとも１つの前記ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドを
    、少なくとも１つのフラグメント化核酸のセットの少なくとも１つの該フラグメ
    ント化核酸を用いて組換える工程；ならびに 組換え核酸を再生し、それにより少なくとも１つの該ファミリー遺伝子シャッ
    フリングオリゴヌクレオチドに対応する核酸サブ配列を含む再生された組換え核
    酸を提供する工程 を包含する、方法。
  28. 【請求項２８】 前記組み換え核酸が、１以上の所望の形質または特性につ
    いて選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の方法であって、ここで、組換え核酸の
    複数のメンバーが、所望の特性についてスクリーニングされ、そして所望の特性
    を有することが決定され、それにより、初回のスクリーニングした核酸を提供し
    、該方法がさらに、以下の工程： 第２の重複ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセットをハ
    イブリダイズする工程であって、該第２の重複ファミリー遺伝子シャッフリング
    オリゴヌクレオチドのセットが、該初回のスクリーニングした核酸に由来する、
    工程；および 該第２の重複ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセットを
    伸長することにより、さらに組み換えられた核酸の集団を提供する工程、 を包含する、方法。
  30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の方法であって、該方法がさらに、以下
    の工程、 前記初回のスクリーニングした核酸を配列決定する工程であって、ここで、前
    記第２の重複ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセットが、
    該初回のスクリーニングした核酸における同一性領域および多様性領域を同定す
    るように該初回のスクリーニングした核酸の配列を整列することによって、該初
    回のスクリーニングした核酸から誘導される、工程、ならびに 該第２の重複ファミリーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオチドのセットを
    、複数のオリゴヌクレオチドを含むように合成する工程であって、該複数のオリ
    ゴヌクレオチドの各々が、少なくとも１つの多様性領域に対応するサブ配列を含
    む、工程、 を包含する、方法。
  31. 【請求項３１】 前記第２の重複ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌ
    クレオチドのセットが、複数の前記初回のスクリーニングした核酸に由来するコ
    ンセンサス領域のサブ配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドのメンバー型を含
    む、請求項２９に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記重複ファミリーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオ
    チドのセットが、少なくとも１つのモジュールシャッフリングオリゴヌクレオチ
    ドを含む、請求項２７に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記重複ファミリーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオ
    チドのセットが、複数のモジュールシャッフリングオリゴヌクレオチドを含み、
    該複数のモジュールシャッフリングオリゴヌクレオチドの各々が、少なくとも、
    第１の配列モジュールに由来する第１のサブ配列および第２の配列モジュールに
    由来する第２のサブ配列を含む、請求項２７に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記重複ファミリーシャッフリング遺伝子オリゴヌクレオ
    チドのセットが、複数のモジュールシャッフリングオリゴヌクレオチドを含み、
    ここで、１以上の該複数のオリゴヌクレオチドの各々が、少なくとも、第１の配
    列モジュールに由来する第１のサブ配列および第２の配列モジュールに由来する
    第２のサブ配列を含む、請求項２７に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記重複ファミリーシャッフリングオリゴヌクレオチドの
    セットが、複数の、コドン改変オリゴヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の
    方法。
  36. 【請求項３６】 前記再生された組換え核酸が、全長タンパク質をコードす
    る、請求項２７に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 請求項２７に記載の方法であって、ここで、少なくとも１
    つのフラグメント化核酸およびファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオ
    チドの集団を含む前記組成物が、以下の工程： 相同核酸配列を整列して、保存された配列同一性の領域および配列多様性の領
    域を選択する工程； 少なくとも１つの配列多様性の領域に対応する複数のファミリー遺伝子シャッ
    フリングオリゴヌクレオチドを合成する工程； 少なくとも１つの相同核酸に同一、または相同である全長核酸を提供する工程
    ； 該全長核酸をフラグメント化する工程；ならびに 得られる該核酸フラグメントのセットを該複数のファミリー遺伝子シャッフリ
    ングオリゴヌクレオチドと混合することにより、フラグメント化核酸およびファ
    ミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドの集団を含む該組成物を提供す
    る工程、 によって提供される、方法。
  38. 【請求項３８】 前記全長核酸が、ＤＮａｓｅ酵素での切断によってフラグ
    メント化される、請求項３６に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記全長核酸が、部分鎖伸長によってフラグメント化され
    る、請求項３６に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 請求項３６に記載の方法であって、該方法がさらに、以下
    の工程、 少なくとも第２の全長核酸を選択する工程、および 該選択された全長核酸を切断して、第２の核酸フラグメントのセットを提供す
    る工程、 を包含し、ここで、 該第２の核酸フラグメントのセットがまた、前記遺伝子シャッフリングオリゴ
    ヌクレオチドの集団と混合される、方法。
  41. 【請求項４１】 請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記ファミリ
    ー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドが、以下の工程： 相同核酸配列を整列し、そして少なくとも１つの保存された配列同一性の領域
    および複数の配列多様性の領域を選択する工程であって、ここで、該複数の配列
    多様性の領域が、複数の配列多様性のドメインを提供する工程、ならびに、 該複数の配列多様性のドメインに対応する複数のファミリー遺伝子シャッフリ
    ングオリゴヌクレオチドを合成する工程、 によって前記組成物に提供される、方法。
  42. 【請求項４２】 前記複数の配列多様性のドメインに対応する前記複数のフ
    ァミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドの、前記フラグメント化核酸
    との組換えが、前記相同核酸配列と比較して、前記再生された組換え核酸におけ
    るドメイン交換を生じる、請求項４０に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記複数の配列多様性のドメインに対応する前記複数のフ
    ァミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドが、１以上の前記相同核酸配
    列に対応する１以上の配列多様性のドメインをコードするファミリー遺伝子シャ
    ッフリングオリゴヌクレオチドを合成することにより合成される、請求項４０に
    記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記フラグメント化核酸が、以下の１以上の工程： （ｉ）クローン化核酸を切断する工程、および （ｉｉ）核酸配列を選択し、そして該選択した核酸配列に対応するオリゴヌク
    レオチドフラグメントを合成する工程、 により提供される、請求項２７記載の方法。
  45. 【請求項４５】 低い配列類似性を有する相同核酸配列または非相同核酸配
    列を組換える方法であって、該方法は、以下の工程、 フラグメント化核酸の１以上のセットを、交差オリゴヌクレオチドの１つのセ
    ットと組換える工程であって、該交差オリゴヌクレオチドのそれぞれが、低い配
    列類似性を有する相同核酸または非相同核酸に由来する複数の配列多様性ドメイ
    ンに対応する複数の配列多様性ドメインを含み、それにより組換え核酸を提供す
    る、工程、 を包含する、方法。
  46. 【請求項４６】 請求項４４に記載の方法であって、該方法がさらに、 前記組換え核酸を、所望の形質または特性について選択する工程、 を包含する、方法。
  47. 【請求項４７】 請求項４４に記載の方法であって、該方法がさらに、 １以上の前記相同核酸または非相同核酸をフラグメント化することにより、前
    記フラグメント化核酸のセットを提供する工程、 を包含する、方法。
  48. 【請求項４８】 前記１以上の前記相同核酸または非相同核酸が、ＤＮａｓ
    ｅ酵素でフラグメント化される、請求項４６に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 請求項４４に記載の方法であって、該方法がさらに、 １以上の相同核酸または非相同核酸に対応する複数のオリゴヌクレオチドフラ
    グメントを合成し、それにより前記１以上のフラグメント化核酸を提供する工程
    、 を包含する、方法。
  50. 【請求項５０】 相同核酸の組換えのためのオリゴヌクレオチドセットを提
    供する方法であって、該方法が、以下の工程： 複数の相同核酸配列を整列して、１以上の配列不均質性の領域を同定する工程
    ；および、 少なくとも１つの該１以上の不均質性の領域に対応する複数の異なるオリゴヌ
    クレオチドメンバー型を合成し、それにより、少なくとも１つの該相同核酸に対
    応する少なくとも１つの配列不均質性の領域を含む少なくとも１つのメンバー型
    を含むオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程、 を包含する、方法。
  51. 【請求項５１】 前記複数のオリゴヌクレオチドメンバー型が、連続してま
    たは平行して合成される、請求項４９に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記相同核酸配列が、配列整列に関するソフトウエアを有
    するコンピューターを含むシステムにて整列されるか、または該相同配列が、手
    動整列により整列される、請求項４９に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記オリゴヌクレオチドセットを組換える工程、をさらに
    包含する、請求項４９に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記オリゴヌクレオチドセットを組み換えることにより生
    じた任意の組換えオリゴヌクレオチドを、所望の形質または特性について選択す
    る工程をさらに包含する、請求項５２に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記オリゴヌクレオチドセットの１以上のメンバーを、１
    以上の相同核酸配列に対応する１以上の相同核酸と組換える工程、 をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 ファミリーシャッフリングＰＣＲアンプリコンの方法であ
    って、該方法は、以下の工程： 複数の不均質な相同テンプレート核酸を提供する工程； 複数のＰＣＲプライマーを提供する工程であって、該ＰＣＲプライマーが、複
    数の該複数の非均質相同テンプレート核酸にハイブリダイズする、工程； 複数のＰＣＲアンプリコンを、該複数のＰＣＲプライマーを用いる該複数のテ
    ンプレート核酸のＰＣＲ増幅により生成する工程；および、 複数のＰＣＲアンプリコンを組換えることにより、組換え核酸を提供する工程
    、 を包含する、方法。
  57. 【請求項５７】 前記組換え核酸を選択する工程をさらに包含する、請求項
    ５５に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記ＰＣＲプライマーについての配列が、前記複数の非均
    質な相同テンプレート核酸についての配列を整列し、そして配列類似性の領域に
    対応するＰＣＲプライマーを選択することにより選択される、請求項５５に記載
    の方法。
  59. 【請求項５９】 複数の親核酸を組換える方法であって、該方法が、以下の
    工程： 複数のオリゴヌクレオチドのセットを連結または伸長する工程であって、該セ
    ットが、全長タンパク質をコードする組換え核酸を生成するように複数の該親核
    酸に由来する複数の核酸配列を含む、工程、 を包含する、方法。
  60. 【請求項６０】 前記セットが、配列多様性の第１の領域の少なくとも第１
    の前記親核酸に相補的な少なくとも第１のオリゴヌクレオチド、および多様性の
    第２の領域の少なくとも第２の前記親核酸に相補的な少なくとも第２のオリゴヌ
    クレオチドを含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 前記核酸がリガーゼを用いて連結される、請求項５９に記
    載の方法。
  62. 【請求項６２】 前記オリゴヌクレオチドが第１の親核酸にハイブリダイズ
    されそしてリガーゼを用いて連結される、請求項５９に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 前記親核酸が相同である、請求項５９に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 前記オリゴヌクレオチドのセットが、ファミリー遺伝子シ
    ャッフリングオリゴヌクレオチドのセットを含む、請求項５９に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 請求項５９に記載の方法であって、該方法が、さらに、 前記オリゴヌクレオチドのセットを１以上の前記親核酸にハイブリダイズする
    工程、および該オリゴヌクレオチドを、実質的に全長のタンパク質をコードする
    核酸を生成するようにポリメラーゼを用いて伸長する工程、 を包含する、方法。
  66. 【請求項６６】 組換え核酸を生成する方法であって、該方法が、以下の工
    程： （ｉ）細胞の集団に、重複ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチ
    ドのセットを導入する工程；および （ｉｉ）該重複ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドのセット
    と、該細胞の集団の複数の細胞内に含まれた１以上の核酸との間で組換えが生じ
    ることを可能にし、それにより、得られる該組換え細胞の集団内に組換え核酸の
    集団を提供する工程、 を包含する、方法。
  67. 【請求項６７】 前記組換え細胞の集団を所望の形質または特性について選
    択する工程をさらに包含する、請求項６６に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 前記組換え核酸の集団をＰＣＲ増幅する工程をさらに包含
    する、請求項６６に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 前記ＰＣＲ増幅した核酸を細胞、ベクター、またはウイル
    スに導入する工程をさらに包含する、請求項６８に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記重複ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオ
    チドのセットがキメラプラストである、請求項６６に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 前記キメラプラストがコドン改変オリゴヌクレオチドであ
    る、請求項７０に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 前記重複ファミリー遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオ
    チドのセットが、複数のコドン改変オリゴヌクレオチドを含む、請求項６４に記
    載の方法。
  73. 【請求項７３】 請求項６６に記載の方法により生成される、組換え核酸の
    集団。
  74. 【請求項７４】 請求項６６に記載の方法により生成される、前記組換え細
    胞の集団。
  75. 【請求項７５】 請求項６８に記載の方法により生成される、増幅された核
    酸。
  76. 【請求項７６】 請求項６９に記載の方法により生成される、細胞、ベクタ
    ー、またはウイルス。
  77. 【請求項７７】 複数のオリゴヌクレオチドメンバー型を含むオリゴヌクレ
    オチドのライブラリーを含む組成物であって、該オリゴヌクレオチドメンバー型
    が、選択された複数の相同標的配列のセットの複数のメンバーの複数のサブ配列
    領域に対応する、組成物。
  78. 【請求項７８】 前記ライブラリーが、少なくとも約１０、２０、３０、４
    ０、５０以上の異なるオリゴヌクレオチドメンバーを含む、請求項７７に記載の
    組成物。
  79. 【請求項７９】 前記オリゴヌクレオチドメンバー型が非等モル量で存在す
    る、請求項７７に記載の組成物。
  80. 【請求項８０】 前記複数のサブ配列領域が、前記選択された相同標的配列
    のセットの複数の非重複配列領域を含む、請求項７７に記載の組成物。
  81. 【請求項８１】 前記オリゴヌクレオチドメンバー型の各々が、少なくとも
    １つの前記選択された相同標的配列のセットに由来する少なくとも１つのサブ配
    列に同一な配列を有する、請求項７７に記載の組成物。
  82. 【請求項８２】 前記オリゴヌクレオチドメンバー型が、前記複数の相同標
    的配列に由来する相同領域に対応する複数の相同オリゴヌクレオチドを含み、こ
    こで、該複数の相同オリゴヌクレオチドの各々が、少なくとも１つの改変サブ配
    列を含む、請求項７７に記載の組成物。
  83. 【請求項８３】 請求項７７に記載の組成物であって、さらに、１以上の以
    下： ポリメラーゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸合成試薬、緩衝液、塩、マグ
    ネシウム、および前記選択された相同標的配列のセットの１以上の前記複数のメ
    ンバーを含む１以上の核酸 を含む、組成物。
  84. 【請求項８４】 請求項７７に記載の組成物であって、ここで、前記複数の
    オリゴヌクレオチドメンバー型が、前記複数の相同標的配列を整列し、少なくと
    も１つの同一性の領域および少なくとも１つの変化の領域を決定し、そして該オ
    リゴヌクレオチドを、該少なくとも１つの同一性の領域の少なくとも一部分、ま
    たは該少なくとも１つの変化の領域の少なくとも一部分、あるいは該少なくとも
    １つの同一性の領域および該少なくとも１つの変化の領域の両方の少なくとも一
    部分をコードするように合成することによって選択される、組成物。
  85. 【請求項８５】 請求項７７に記載の組成物であって、ここで、前記複数の
    オリゴヌクレオチドメンバー型が、少なくとも１つの配列多様性ドメインを含む
    少なくとも１つのメンバー型を含む、組成物。
  86. 【請求項８６】 請求項７７に記載の組成物であって、ここで、前記複数の
    オリゴヌクレオチドメンバー型が、複数の配列多様性ドメインを含む、組成物。
  87. 【請求項８７】 請求項７７に記載の組成物であって、ここで、前記ライブ
    ラリーが、交差ファミリー多様性オリゴヌクレオチドのセットを含み、該交差フ
    ァミリー多様性オリゴヌクレオチドのセットの各オリゴヌクレオチドのメンバー
    が、複数の相同核酸に対応する複数の配列多様性ドメインを含む、組成物。
  88. 【請求項８８】 請求項８６に記載の組成物であって、ここで、前記配列多
    様性ドメインが、前記相同核酸が整列される場合、複数の前記複数の相同配列核
    酸上の隣接配列領域に対応する、組成物。
  89. 【請求項８９】 ２つ以上の配列を組換える方法であって、該方法が以下の
    工程： （ｉ）２つ以上の核酸を整列し、同一性の領域および多様性の領域を同定する
    工程； （ｉｉ）少なくとも１つの多様性の領域の該２つ以上の核酸の少なくとも２つ
    に配列において対応する複数のオリゴヌクレオチドを含む非等モル量のオリゴヌ
    クレオチドのセットを提供する工程であって、該オリゴヌクレオチドが非等モル
    量で存在する、工程；および、 （ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチドをポリメラーゼを用いて伸長することにより
    、複数の組換え核酸を提供する工程、 を包含する、方法。
  90. 【請求項９０】 前記２つ以上の核酸が相同である、請求項８９に記載の方
    法。
  91. 【請求項９１】 前記２つ以上の核酸が非相同である、請求項８９に記載の
    方法。
  92. 【請求項９２】 請求項８９に記載の方法がさらに、以下の工程： （ｉｖ）前記複数の組換え核酸を、所望の形質または特性について選択する工
    程、 を包含する、方法。
  93. 【請求項９３】 請求項９２に記載の方法であって、さらに、 工程（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの工程を反復する工程、 を包含する、方法。
  94. 【請求項９４】 請求項８９に記載の方法であって、さらに、 前記組換え核酸をさらなる核酸と組み換える工程、 を包含する、方法。
  95. 【請求項９５】 請求項９４に記載の方法であって、さらに、 得られる該さらなる組換え核酸を、所望の形質または特性について選択する工
    程、 を包含する、方法。
  96. 【請求項９６】 キメラプラストのライブラリーを作成する方法であって、
    該方法が、以下の工程： 複数の相同キメラプラストを提供する工程であって、該複数の相同キメラプラ
    ストの各々が、マーカーまたは他の類似する配列の領域、および少なくとも１つ
    の異なる配列の領域を含み、それにより、キメラプラストのライブラリーを生成
    する、工程 を包含する、方法。
  97. 【請求項９７】 前記複数のキメラプラストが、コドン改変オリゴヌクレオ
    チドである、請求項９６に記載の方法。
  98. 【請求項９８】 請求項９６に記載の方法により生成される、ライブラリー
    。
  99. 【請求項９９】 請求項９６に記載の方法であって、さらに、以下の工程： 細胞の集団を前記キメラプラストのライブラリーを用いて形質導入し、そして
    前記マーカーまたは他の類似する領域の、細胞内の１つ以上の核酸での組換えを
    検出し、そして該細胞内の１つ以上の核酸で組換えられた前記相同キメラプラス
    トを同定することにより、活性な相同キメラプラストを同定する、工程、 を包含する、方法。
  100. 【請求項１００】 請求項９９に記載の方法であって、さらに、 複数の前記活性相同キメラプラストを組換えて、組換え活性相同キメラプラス
    トのライブラリーを生成する工程、 を包含する、方法。
  101. 【請求項１０１】 請求項１００に記載の方法により生成される、ライブラ
    リー。
  102. 【請求項１０２】 請求項１００に記載の方法であって、さらに、前記組換
    え活性相同キメラプラストのライブラリーを用いて第２の細胞の集団を形質導入
    し、そして該組換え活性相同キメラプラストを、該細胞内の前記１以上の核酸と
    組換えることにより、それにより、さらなる活性相同キメラプラストを同定する
    、工程 を包含する、方法。
  103. 【請求項１０３】 請求項１０２に記載の方法であって、さらに、 前記さらなる活性相同キメラプラストのライブラリーを提供する工程、 を包含する、方法。
  104. 【請求項１０４】 請求項１０３に記載の方法により生成される、ライブラ
    リー。
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