CN103002744A

CN103002744A - Dig-11杀虫cry毒素

Info

Publication number: CN103002744A
Application number: CN2010800320758A
Authority: CN
Inventors: J.里拉; K.纳瓦; A.伍斯利; I.拉里努阿; T.海伊
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2009-06-16
Filing date: 2010-06-14
Publication date: 2013-03-27
Also published as: US8304605B2; AU2010260305A1; CA2765744A1; WO2010147880A2; JP2012532586A; CO6470904A2; KR20120039625A; RU2012101276A; MX2011013675A; BRPI1011950A2; CL2011003184A1; EP2442658A2; WO2010147880A3; AR077096A1; US20100319093A1

Abstract

公开了DIG-11Cry毒素、编码此类毒素的多核苷酸、此类毒素控制害虫的用途、和生成此类毒素的转基因植物。

Description

DIG-11杀虫CRY毒素

对相关申请的交叉引用

本申请要求2009年6月16日提交的美国临时申请61/187,460的权益，通过述及明确将其收入本文。

发明领域

本发明涉及新的杀虫Cry毒素及其控制昆虫的用途。

发明背景

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，B.t.)是一种土壤传播的细菌，其生成称作德尔塔内毒素或Cry蛋白的杀虫晶体蛋白。Cry蛋白是通过作用于易感昆虫的中肠细胞来发挥功能的口服毒药。已经显示了一些Cry毒素具有针对线虫的活性。http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html处维护和定期更新德尔塔内毒素的广泛列表。

西方玉米根虫/玉米根萤叶甲(Western corn rootworm，WCR，Diabroticavirgifera virgifera LeConte)，是一种在经济上重要的玉米害虫，由于作物产量损失和昆虫管理支出，其在北美洲每年引起估计10亿美元收入损失(Metcalf，1986)。WCR管理实践包括与大豆的轮作、化学杀虫剂和新进的表达B.t.Cry蛋白的转基因作物。然而，至今只有少数B.t.Cry蛋白实例提供商业水平的针对WCR的功效，包括Cry34Ab1/Cry35Ab1(Ellis等，2002)、经修饰Cry3Aa1(Walters等，2008)和经修饰Cry3Bb1(Vaughn等，2005)。这些B.t.蛋白在转基因玉米的根中生成时高度有效地防止WCR玉米根损伤(Moellenbeck等，2001；Vaughn等，2005；美国专利No.7361813)。

虽然WCR抗性转基因玉米获得了成功，但是数个因素产生了发现和开发新的Cry蛋白来控制WCR的需要。第一，尽管转基因玉米植物中当前采用的Cry蛋白的生成针对WCR根损伤提供有力的保护，由此保护谷物产量，但是在人工侵袭试验中出现了一些WCR成虫，指示昆虫幼虫控制不够完全。第二，抗性昆虫群体的发生威胁Cry蛋白在根虫控制中的长期耐久性。已经在田地了发生了小菜蛾(Plutella xylostella)(Tabashnik，1994)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Janmaat和Myers，2003，2005)、和谷实夜蛾(Helicoverpazea)(Tabashnik等，2008)的对Cry蛋白有抗性的鳞翅类昆虫。可经由数种机制发生对B.t.Cry蛋白有抗性的昆虫(Heckel等，2007；Pigott和Ellar，2007)。已经在昆虫内鉴定了Cry蛋白的多个受体蛋白类别，而且每个受体类别内存在多个实例。例如可以依靠受体蛋白的钙粘蛋白域的毒素结合部分内的突变发生对特定Cry蛋白的抗性。抗性的另一种手段可以经由原毒素加工蛋白酶介导。鳞翅目物种中对Cry毒素的抗性具有复杂的遗传基础，有至少四种不同的主要的抗性基因。类似地，预测多种基因控制鞘翅目物种中对Cry毒素的抗性。开发新的高效力Cry蛋白会为WCR管理提供额外的工具。可以在转基因玉米中组合生成具有不同作用模式的Cry蛋白来防止发生WCR昆虫抗性和保护B.t.技术用于根虫控制的长期效用。

发明概述

本发明提供杀虫Cry毒素(包括本文中称作DIG-11的蛋白质毒素以及DIG-11的变体)、编码这些毒素的核酸、使用该等毒素控制害虫的方法、在转基因宿主细胞中生成该等毒素的方法、和表达该等毒素的转基因植物。SEQ ID NO：2给出野生型DIG-11蛋白的预测氨基酸序列。

本发明提供容易施用的功能性蛋白质。本发明还提供用于投递针对许多目的昆虫(优选鞘翅类昆虫)在功能上有活性和有效的昆虫毒素的方法。“功能活性”(或“针对...有活性”)在本文中意为蛋白质毒素作为口服活性昆虫控制剂(单独的或与其它蛋白质组成的)发挥功能，蛋白质具有毒效应(单独的或与其它蛋白质组合的)，或者能够干扰或阻止昆虫生长和/或进食，这可以引起或不引起昆虫死亡。当昆虫与经转基因植物表达、配制的蛋白质组合物、可喷洒的蛋白质组合物、诱饵基质或其它投递系统投递的有效量的本发明“毒素”接触时，结果通常是昆虫死亡，抑制昆虫的生长和/或繁殖，和/或阻止昆虫以使得昆虫可得到毒素的来源(优选转基因植物)为食。本发明的功能性蛋白质也可一起或单独运转以增强或改善一种或多种其它毒素蛋白的活性。如本文中使用的，术语“有毒的”、“毒性、“毒素”意图表示主题“毒素”具有本文中定义的“功能活性”。

对进食昆虫的完全致死是优选的，但是不要求实现功能活性。如果昆虫回避毒素或停止进食的话，该回避在有些应用中会是有用的，即使效果是亚致死的或致死是延迟的或间接的。例如，如果想要昆虫抗性转基因植物的话，昆虫不愿以植物为食就像对昆虫的致死毒性一样有用，因为终极目的是避免昆虫诱导的植物损害。

如实施例1中描述的，自Dow AgroSciences LLC内部称作PS184M1的B.t.菌株分离了编码DIG-11蛋白的核酸。测定了全长编码区的核酸序列，并自该核酸序列推导了全长蛋白质序列。DIG-11蛋白与Cry7Ab3(Genbank登录号ABX24522.1)和其它苏云金芽孢杆菌Cry7型蛋白(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html)具有一些相似性。本文中还描述DIG-11毒素的昆虫活性变体，而且统称为DIG-11昆虫毒素。

可以通过具体DIG-命名来鉴别DIG-11昆虫毒素的各变体。毒素可以单独使用，或者与其它Cry毒素组合使用，诸如Cry34Ab1/Cry35Ab1(DAS-59122-7)、Cry3Bb1(MON88017)、Cry3A(MIR604)、嵌合Cry1Ab/Cry3Aa(FR8A，WO 2008/121633 A1)、CryET33和CryET34、Vip1A、Cry1Ia、CryET84、CryET80、CryET76、CryET71、CryET69、CryET75、CryET39、CryET79、和CryET74，来控制发生抗性鞘翅类昆虫群体。

DIG-11昆虫毒素也可以与RNAi方法组合使用，来控制其它昆虫害虫。例如，DIG-11昆虫毒素可以与用于阻抑玉米根虫中的必需基因或昆虫害虫中的必需基因的dsRNA组合用于转基因植物。此类靶基因包括例如液泡ATP酶、ARF-1、Act42A、CHD3、EF-1α、和TFIIB。合适靶基因的一个实例是液泡ATP酶，如WO2007/035650中披露的。

在一个实施方案中，本发明提供一种分离的DIG-11昆虫毒素多肽，其包含选自下组的核心毒素区段：

(a)包含SEQ ID NO：2残基142至664的氨基酸序列的多肽；

(b)包含与SEQ ID NO：2残基142至664的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；

(c)多肽，包含SEQ ID NO：2的残基142至664的氨基酸序列及多至20个氨基酸的替代、删除、或修饰，其对由SEQ ID NO：2编码的毒素的表达或活性没有不利影响；

或其杀虫活性片段。

在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的DIG-11昆虫毒素多肽，其包含选自下组的DIG-11核心毒素区段：

(a)包含SEQ ID NO：2残基1至664的氨基酸序列的多肽；

(b)包含与SEQ ID NO：2残基1至664的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列多肽；

(c)多肽，包含SEQ ID NO：2的残基1至664的氨基酸序列及多至20个氨基酸的替代、删除、或修饰，其对由SEQ ID NO：2编码的毒素的表达或活性没有不利影响；

或其杀虫活性片段。

(a)包含SEQ ID NO：2残基142至1164的氨基酸序列的多肽；

(b)包含与SEQ ID NO：2残基142至1164的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；

(c)多肽，包含SEQ ID NO：2的残基142至1164的氨基酸序列及多至20个氨基酸的替代、删除、或修饰，其对由SEQ ID NO：2编码的毒素的表达或活性没有不利影响；

或其杀虫活性片段。

在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的DIG-11昆虫毒素多肽，其包含选自下组的的DIG-11核心毒素区段：

(a)包含SEQ ID NO：2残基1至1164的氨基酸序列的多肽；

(b)包含与SEQ ID NO：2残基1至1164的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；

(c)多肽，包含SEQ ID NO：2的残基1至1164的氨基酸序列及多至20个氨基酸的替代、删除、或修饰，其对由SEQ ID NO：2编码的毒素的表达或活性没有不利影响；

或其杀虫活性片段。

在另一个实施方案中，本发明提供一种植物，其包含DIG-11昆虫毒素。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于控制害虫群体的方法，其包括使所述群体与杀虫有效量的DIG-11昆虫毒素接触。

在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的核酸，其编码DIG-11毒素。

在另一个实施方案中，本发明提供一种DNA构建体，其包含可操作连接至启动子的编码DIG-11昆虫毒素的核苷酸序列，该启动子不是自苏云金芽孢杆菌衍生的且能够在植物中驱动表达。本发明还提供一种转基因植物，其包含稳定并入其基因组中的DNA构建体和一种用于针对害虫保护植物的方法，其包括将该构建体导入所述植物中。

序列简述

SEQ ID NO：1编码全长DIG-11昆虫毒素的DNA序列；3492nt。

SEQ ID NO：2全长DIG-11蛋白序列；1164aa。

SEQ ID NO：3经玉蜀黍优化的编码DIG-84、DIG-11核心毒素的DNA序列；1992nt。

SEQ ID NO：4Cry1Ab原毒素区段；545aa。

SEQ ID NO：5嵌合毒素：DIG-84核心毒素区段/Cry1Ab原毒素区段；1209aa。

SEQ ID NO：6经双子叶优化的编码Cry1Ab原毒素区段的DNA序列；1635nt

SEQ ID NO：7经玉蜀黍优化的编码Cry1Ab原毒素区段的DNA序列；1635nt

发明详述

DIG-11昆虫毒素，和昆虫活性变体。在SEQ ID NO：2的全长DIG-11昆虫毒素之外，本发明涵盖昆虫活性变体。通过术语“变体”，申请人意图包括片段、某些删除和插入突变体、和某些融合蛋白。DIG-11蛋白是一种经典的三域Cry毒素。作为描述本发明中包括的DIG-11昆虫毒素变体的前言，简要回顾一般的三域Cry毒素和特殊的DIG-11昆虫毒素的结构会是有益的。

大多数苏云金芽孢杆菌德尔塔-内毒素晶体蛋白分子由两个功能性区段构成。蛋白酶抗性核心毒素是第一个区段，而且对应于该蛋白质分子的大约前一半。完整的～130kDa原毒素分子被昆虫肠中的蛋白酶快速加工成抗性核心区段。被此加工删除的区段在本文中称作“原毒素区段”。认为原毒素区段参与毒素晶体形成(Arvidson等，1989)。通过降低蛋白酶对毒素分子的加工(Haider等，1986)或通过降低毒素溶解度(Aronson等，1991)，原毒素区段可能如此通过限制核心对昆虫的可及性而赋予毒素以部分昆虫特异性。即使在某一个类别内，B.t.毒素在长度方面和在核心毒素部分至原毒素部分的过渡的精确位置方面有一定程度的变化。核心毒素部分至原毒素部分的过渡通常会位于全长毒素的约50％至约60％之间。SEQ ID NO：2公开全长DIG-11多肽1164个氨基酸的序列，其中N端664个氨基酸构成DIG-11蛋白DIG-84核心毒素区段。SEQ ID NO：1的5′端1992个核苷酸是DIG-84核心毒素区段的编码区。

已经为Cry1Aa1、Cry2Aa1、Cry3Aa1、Cry3Bb1、Cry4Aa、Cry4Ba和Cry8Ea1测定了三维晶体结构。核心毒素的这些结构非常相似，而且由具有下文所述特征的三个不同域构成(综述见de Maagd等，2003)。

域I是一束七个α螺旋，其中螺旋5被六个兼性螺旋包围。此域涉及孔形成，而且与其它孔形成蛋白共享同源性，包括溶血素和大肠杆菌素。DIG-11蛋白的域I包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基86至306。

域II由在β柱中填充到一起的三个反向平行的β片层形成。此域的环在结合昆虫中肠受体中发挥重要作用。在Cry1A蛋白中，在域IIβ片层的顶点处表面暴露的环涉及结合鳞翅类钙粘蛋白受体。Cry3Aa域II环以相似方式结合马铃薯叶甲/科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata Say，Coloradopotato beetle)的膜结合金属蛋白酶(Ochoa-Campuzano等，2007)。域II与某些碳水化合物结合蛋白共享同源性，包括卵黄磷蛋白(vitelline)和榴莲凝素(jacaline)。DIG-11蛋白的域II包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基311至508。

域III是两个反向平行的β片层的β三明治。在结构上，此域涉及诸如葡聚糖酶、半乳糖氧化酶、唾液酸酶等蛋白质的碳水化合物结合域。域III结合某些类别的受体蛋白，而且可能参与与第二类别的受体相互作用的寡聚毒素前孔的插入，在Cry1A蛋白的情况中，实例有氨肽酶和碱性磷酸酶(Honée等，1991；Pigott和Ellar，2007)。鞘翅目中的类似Cry域III受体仍有待鉴定。保守的B.t.序列段2和3分别位于域II的N端和C端附近。因此，这些保守的序列段2和3是三个功能域之间的大致边界区。已经为工程化重组B.t.毒素开发了这些具有保守DNA和蛋白质同源性的区(美国专利No.6,090,931；WO91/01087；WO 95/06730；WO 1998022595)。DIG-11蛋白的域III包含SEQ IDNO：2的氨基酸残基518至662。

已经报告了域I的α-螺旋1在受体结合后被消除。Aronson等(1999)证明了结合至BBMV的Cry1Ac受到保护免于刚好在α-螺旋1后面的残基59处开始的蛋白酶K切割；为Cry1Ab引用了相似的结果。Gomez等(2002)发现了在BBMV受体结合时形成的Cry1Ab寡聚体缺少域I的α-螺旋1部分。还有，Soberon等(2007)显示了Cry1Ab和Cry1Ac的缺少在三维Cry结构上涵盖α-螺旋1的大约60个氨基酸的N端删除突变体能够在钙粘蛋白结合缺失下将分子量约60kDa的单体装配成前孔。报告了这些N端删除突变体对Cry抗性昆虫幼虫有活性。另外，Diaz-Mendoza等(2007)记载了保留对地中海玉米蛀虫/蛀茎夜蛾(Mediterranean corn borer，Sesamia nonagrioides)的活性的43kDa和46kDa的Cry1Ab片段。证明了这些片段包括氨基酸残基116至423；然而，没有阐明精确氨基酸序列，而且这些蛋白水解片段的活性的机制未知。Gomez等(2002)；Soberon等(2007)；及Diaz-Mendoza等(2007)的结果与Hofte等(1986)报告的自Cry1Ab的N端删除36个氨基酸导致杀虫活性丧失的结果形成对比。

通过比较DIG-11蛋白序列与结构已知的Cry8Ea1蛋白序列，我们已经推导了DIG-11毒素的域I中螺旋1、2A、2B、和3的起点和终点，及它们之间的间隔区的位置。表1中描述这些位置。

表1。DIG-11蛋白凸出的α-螺旋的氨基酸坐标。

DIG-11的氨基端删除变体。在一个方面，本发明提供DIG-11昆虫毒素变体，其中删除整个或部分螺旋1、2A、和2B以改善昆虫活性和避免昆虫发生抗性。进行这些修饰来提供具有改善的属性的DIG-11变体，诸如改善的靶害虫谱、效力、和昆虫抗性管理。在本发明的一些实施方案中，主题修饰可影响导致昆虫中毒的原毒素活化和孔形成的效率。更具体地，为了提供具有改善的属性的DIG-11昆虫毒素变体，描述了消除基因编码N端的部分的逐步删除。删除消除域I中整个α-螺旋1和整个或部分α-螺旋2，而维持α-螺旋3至7的结构完整性。本发明因此部分涉及通过为更有效的孔形成改造域I的α-螺旋构件而实现的Cry蛋白功效的改善。更具体地，本发明部分涉及改良DIG-11昆虫毒素，其设计成在与Cry1蛋白域I中α-螺旋1和2具有推定二级结构同源性的区域中具有N端删除。

为了改善DIG-11昆虫毒素的杀虫特性的删除可以在预测的α-螺旋2A起点之前开始，并在α-螺旋2B终点之后结束，但是优选不延伸入α-螺旋3中。

在设计N端删除变体的编码序列时，在为了表达删除变体设计的核苷酸序列的5’端处插入编码甲硫氨酸的ATG起始密码子。对于为了在转基因植物中使用设计的序列，遵守Varshavsky(1997)的“N端规则”可能是有益的。教导了一些氨基酸在作为蛋白质的N端残基展示时可能促进蛋白质在真核细胞中的降解和不稳定性。例如，自酵母和哺乳动物细胞中的观察结果收集的数据指示N端失稳性氨基酸为F、L、W、Y、R、K、H、I、N、Q、D、E和可能的P。虽然蛋白质降解机制的细节在生物间可以有一些不同，但是上文看到的N端失稳性氨基酸的身份的保守性提示类似机制可能在植物细胞中发挥功能。例如，Worley等(1998)发现了在植物中，N端规则包括碱性和芳香族残基。有可能植物蛋白酶在主题B.t.杀虫蛋白α-螺旋3起点附近的蛋白水解切割可能暴露失稳性N端氨基酸。此类加工可将经过切割的蛋白质靶向快速衰变和限制B.t.杀虫蛋白积累至不足以实现有效昆虫控制的水平。因而，对于以一个失稳性氨基酸开始的N端删除变体，申请人更喜欢在翻译起始甲硫氨酸和失稳性氨基酸之间添加规定G(甘氨酸)氨基酸的密码子。

实施例2给出依照本发明的DIG-11昆虫毒素氨基端删除变体的具体实例。

嵌合毒素。先前已经报告了利用融合至一种Cry毒素之原毒素区段的另一种Cry毒素之核心毒素域的嵌合蛋白。DIG-11变体包括如下的昆虫毒素，其包含DIG-11昆虫毒素的N端核心毒素区段(其可以是全长或具有上文所述N端删除)，在核心毒素部分终点后的某点处融合至异源原毒素区段。对异源原毒素区段的过渡可以位于大约核心毒素/原毒素接点，或者，可以保留部分天然原毒素(核心毒素部分后的延伸)，对异源原毒素的过渡位于下游。例如，本发明的嵌合毒素具有DIG-11的整个核酸毒素区段(即DIG-84；DIG-11的氨基酸1-664)和异源原毒素(氨基酸665至C端)。在一个优选实施方案中，原毒素的异源部分是自Cry1Ab德尔塔-内毒素衍生的，如SEQ ID NO：5中例示的。

SEQ ID NO：4公开在本发明的DIG-11昆虫毒素变体中有用的Cry1Ab原毒素区段545个氨基酸的序列。注意此原毒素区段最后约100至150个氨基酸，最关键的是在本发明的嵌合毒素中包括它们。

蛋白酶敏感性变体。昆虫肠蛋白酶通常发挥帮助昆虫自食物蛋白质获得所需氨基酸的功能。了解最多的昆虫消化蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，其表现为最常见的类型(Englemann和Geraerts，1980)，特别是在鳞翅类物种中。鞘翅类昆虫具有比鳞翅类肠更加中性至酸性的肠。大多数鞘翅类幼虫和成虫，例如科罗拉多马铃薯甲虫，具有略微酸性的中肠，而且半胱氨酸蛋白酶提供主要蛋白水解活性(Wolfson和Murdock，1990)。更精确地，Thie和Houseman(1990)鉴定和表征了科罗拉多马铃薯甲虫中的半胱氨酸蛋白酶，B样组织蛋白酶和H样组织蛋白酶，及天冬氨酰蛋白酶，D样组织蛋白酶。Gillikin等(1992)表征了西方玉米根虫幼虫的肠中的蛋白水解活性，而且主要发现了半胱氨酸蛋白酶。美国专利No.7230167披露了西方玉米根虫中存在的丝氨酸蛋白酶，组织蛋白酶G。昆虫肠蛋白酶的多样性和不同活性水平可影响昆虫对特定B.t.毒素的敏感性。

在本发明的另一个实施方案中，可以在期望位置处改造蛋白酶切割位点以影响某些昆虫害虫的易感幼虫的中肠内的蛋白质加工。可以通过诸如化学基因合成或剪接交叠PCR(Horton等，1989)等方法引入这些蛋白酶切割位点。例如可以任选在Cry蛋白结构中的特定位点处插入丝氨酸蛋白酶识别序列以影响易感幼虫的中肠内的期望删除点处的蛋白质加工。可以以此类方式利用的丝氨酸蛋白酶包括鳞翅类中肠丝氨酸蛋白酶诸如胰蛋白酶或胰蛋白酶样酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、等(Christeller等，1992)。另外，可以改造通过对用未分级幼虫中肠蛋白酶制备物生成的Cry蛋白消化产物测序或通过结合至刷状缘膜囊凭经验鉴定的删除位点以实现蛋白质活化。通过基因删除或通过引入蛋白酶切割位点任一生成的经修饰Cry蛋白具有改善的对鳞翅类害虫诸如欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、玉米杆草螟(Diatraeagrandiosella)、谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜贪夜蛾(Spodoptera exigua)、小蔗杆草螟(Diatraea saccharalis)、豆白缘切根虫(Loxagrotis albicosta)，鞘翅类害虫诸如西方玉米根虫、南方玉米根虫、北方玉米根虫(即叶甲(Diabroticaspp.))和其它靶害虫的活性。

通过在期望加工位点处改造适宜识别序列，可以进一步利用鞘翅类丝氨酸蛋白酶诸如胰蛋白酶、糜蛋白酶和组织蛋白酶G样蛋白酶，鞘翅类半胱氨酸蛋白酶诸如组织蛋白酶(B样、L样、O样、和K样蛋白酶)(Koiwa等，2000；及Bown等，2004)，鞘翅类金属蛋白酶诸如ADAM10(Ochoa-Campuzano等，2007)，和鞘翅类天冬氨酸蛋白酶诸如组织蛋白酶D样和E样、胃蛋白酶、plasmepsin、和凝乳酶以影响某些昆虫害虫的易感幼虫的中肠内的Cry蛋白加工。

引入此类蛋白酶切割位点的一个优选位置可以在α-螺旋2B和α-螺旋3之间的“间隔”区内，例如在全长DIG-11蛋白(SEQ ID NO：2和表1)的氨基酸137至141内。引入蛋白酶切割位点的第二个优选位置可以在α-螺旋3和α-螺旋4(表1)之间的间隔区内，例如在SEQ ID NO：2的全长DIG-11蛋白的氨基酸172至175内。通过基因删除或通过引入蛋白酶切割位点任一生成的经修饰Cry蛋白具有改善的对昆虫害虫包括但不限于西方玉米根虫、南方玉米根虫、北方玉米根虫、等等的活性。

存在多种能够测定包含多肽N端或C端残基的氨基酸序列的技术。例如，可以以连续方式使用自动化Edman降解法以测定多至30个氨基酸残基的N端氨基酸序列，每个残基的准确度为98％。另外，测定包含多肽羧基端的氨基酸序列也是可能的(Bailey等，1992；美国专利No.6046053)。如此，在一些实施方案中，可以表征依靠蛋白水解加工(例如通过自昆虫的肠制备的蛋白酶)活化的B.t.Cry蛋白，并鉴定活化的毒素片段的N端或C端氨基酸。为了容许或消除昆虫、植物或微生物蛋白酶对较大变体蛋白的蛋白水解切割通过在编码序列中的适宜位置处引入或消除蛋白酶加工位点生成的DIG-11昆虫毒素变体在本发明的范围内。理解，此类操作的最终结果是生成具有与完整(全长)毒素蛋白相同或更好的活性的毒素片段分子。

DIG-11昆虫毒素的域。预期DIG-11昆虫毒素的各个域(及与此类域90、95、或97％相同的变体)可用于与来自其它Cry毒素的域形成组合以提供具有增大的害虫毒性谱、改善的效力、或升高的蛋白质稳定性的新毒素。DIG-11蛋白的域I包含SEQ ID NO：2氨基酸残基86至306。DIG-11蛋白的域II包含SEQ ID NO：2氨基酸残基311至508。DIG-11蛋白的域III包含SEQ ID NO：2氨基酸残基518至662。域交换或穿梭是用于生成改变的德尔塔-内毒素蛋白的另一种机制。域II和III可以在德尔塔-内毒素蛋白之间交换，产生具有改善的杀虫活性或靶谱的杂合或嵌合毒素。域II涉及受体结合，而域III结合某些类别的受体蛋白且可能参与插入寡聚毒素前孔。已经显示了其它毒素中的一些域III替代生成优异的针对贪夜蛾(Spodoptera exigua)的毒性(de Maagd等，1996)，而且存在关于设计Cry毒素域交换的指导(Knight等，(2004)。

用于生成重组蛋白和对它们测试杀虫活性的方法是本领域公知的(参见例如Naimov等，2001；de Maagd等，1996；Ge等，1991；Schnepf等，1990；Rang等，1999)。已经对来自Cry1A和Cry3A蛋白的域I研究了在膜中插入或形成孔的能力。域I的α-螺旋4和5在膜插入或孔形成中发挥关键作用(Walters等，1993；Gazit等，1998；Nunez-Valdez等，2001)，提出其它螺旋像伞骨那样接触膜表面(Bravo等，2007；Gazit等，1998)。

通过进行有限数目的氨基酸删除、替代、或添加而创建的DIG-11昆虫毒素变体。可以容易地以连续方式进行对SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸删除、替代、和添加，而且可以通过生物测定法测试此类变异对杀虫活性的影响。倘若变化的数目在数目方面是有限的，此类测试不涉及不合理的实验。本发明包括其中已经进行了多至10个、多至15个、或多至20个氨基酸的添加、删除、或替代的核心毒素(SEQ ID NO：2氨基酸1-664或SEQ ID NO：2氨基酸142-664)的杀虫活性变体。

本发明包括具有与SEQ ID NO：2氨基酸1-664或SEQ ID NO：2氨基酸142-664 90％、95％或97％相同的核心毒素区段的DIG-11昆虫毒素变体。

可以通过随机突变来生成不同，或者可以设计变体。在设计突变体的情况中，当毒素的关键区中的氨基酸同一性得到维持时，有生成具有与天然毒素相似的活性的变体的高概率，该关键区负责生物学活性或涉及决定最终负责生物学活性的三维构象。如果替代是保守的话，也会发生保留活性的高概率。可以将氨基酸归入下述类别：非极性的，不带电荷的极性的，碱性的，和酸性的。其中一个类别的氨基酸用同一类型的另一种氨基酸替换的保守替代不大可能实质性改变变体的生物学活性。表2提供属于每一个类别的氨基酸实例的列表。

表2。

氨基酸的类别	氨基酸的实例
		非极性侧链	Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Phe，Trp
不带电荷的极性侧链	Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn，Gln
		酸性侧链	Asp，Glu

碱性侧链	Lys，Arg，His
		β-分支的侧链	Thr，Val，Ile
芳香族侧链	Tyr，Phe，Trp，His

在一些情况中，也可以进行非保守替代。关键因素是这些替代不能显著降低毒素的生物学活性。变体包括因诱变而氨基酸序列不同的多肽。本发明涵盖的变体蛋白是有生物学活性的，就是说它们继续拥有天然蛋白的期望生物学活性，就是说保留杀虫活性。

也可以设计在序列水平不同但保留相同或相似总体实质三维结构、表面电荷分布、等等的变体蛋白。参见例如美国专利No.7058515；Larson等，2002；Stemmer，1994a，1994b，1995；及Crameri等，1996a，1996b，1997。

核酸。编码DIG-11昆虫毒素的分离的核酸是本发明的一个方面。这包括编码SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的核酸及其互补物，以及编码SEQ ID NO：2的昆虫活性变体的其它核酸。通过“分离的”，申请人意指核酸分子已经人工地自其天然环境移除，而且已经放置在不同环境中。由于遗传密码的简并性，因此多种不同DNA序列可编码本文中公开的氨基酸序列。创建编码相同或本质上相同的毒素的这些备选DNA序列完全在本领域技术人员的技术之内。

基因合成。可以通过多种本领域公知方法来生成编码本文所述改良Cry蛋白的基因。例如，可以通过亚磷酸三酯和亚磷酰胺化学来生成合成基因区段和合成基因(Caruthers et al，1987)，而且有商业销售商在要求时实施基因合成。可以以多种方式来装配全长基因，包括例如通过限制性片段的连接或交叠寡核苷酸的(Stewart和Burgin，2005)。另外，可以通过使用位点特异性末端寡核苷酸PCR扩增进行末端基因删除。

可以例如通过数个商业供应商任一当前实行的方法通过合成构建来生成编码DIG-11昆虫毒素的核酸(参见例如美国专利No.7482119 B2)。也可以合成构建这些基因或其部分或变体，例如通过使用基因合成仪和设计方法(例如美国专利No.5380831)。或者，可以容易地使用用于进行点突变的标准分子生物学技术来构建合成或天然存在基因的变异。也可以依照标准规程使用商品化外切核酸酶或内切核酸酶来生成这些基因的片段。例如，可以使用诸如Bal31等酶或定点诱变自这些基因的末端切掉核苷酸。还有，可以使用多种限制酶来获得编码活性毒素片段的基因片段。

在DIG-11昆虫毒素的氨基酸序列已知下，可以如下设计编码序列，即使用计划宿主优选的密码子逆翻译编码序列，然后使用备选密码子改进序列以消除可能引起问题的序列和提供周期性终止密码子以消除非编码读码框中的长开放编码序列。

定量序列同一性。为了确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的而比对序列。两种序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数目的函数(即百分比同一性＝相同位置的数目/位置总数(例如交叠位置)x100)。在一个实施方案中，两种序列的长度相同。可以使用与下文描述的技术相似的技术来确定两种序列之间的百分比同一性，容许或不容许缺口。在计算百分比同一性时，通常对精确匹配计数。

可以使用数学算法来实现两种序列之间百分比同一性的确定。此类算法的一个非限制性实例是Altschul等(1990)及Karlin和Altschul(1990)的，经过Karlin和Altschul(1993)改良，并掺入BLASTN和BLASTX程序的算法。可以方便地使用BLAST搜索来鉴定核酸或蛋白质数据库中与检索序列同源(相似)的序列。可以实施BLASTN搜索(得分＝100，词长＝12)来鉴定与本发明要求保护的核酸分子具有同源性的核苷酸序列。可以实施BLASTX搜索(得分＝50，词长＝3)来鉴定与本发明要求保护的杀虫蛋白分子具有同源性的氨基酸序列。

可以利用带缺口的BLAST(Altschul等，1997)来获得带缺口的比对用于比较目的。或者，可以使用PSI-Blast来实施检测分子间远缘关系的迭代搜索(Altschul等，1997)。在利用BLAST、带缺口的BLAST、和PSI-Blast程序时，可使用各程序的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

用于比较序列的数学算法的一个非限制性实例是ClustalW算法(Thompson等，1994)。ClustalW比较序列且比对整个氨基酸或DNA序列，如此能提供关于整个氨基酸序列或核苷酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法用于数种商品化DNA/氨基酸分析软件包，诸如Vector NTI程序套件(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)的ALIGNX模块。在用ALIGNX比对氨基酸序列时，可以方便地使用缺省设置，缺口打开罚分10、缺口延伸罚分为0.1和blosum63mt2比较矩阵来评估两种序列之间的百分比氨基酸相似性(一致性)或同一性。在用ALIGNX比对DNA序列时，可以方便地使用缺省设置，缺口打开罚分15、缺口延伸罚分6.6和swgapdnamt比较矩阵来评估两种序列之间的百分比同一性。

数学算法用于比较序列的另一个非限制性实例是Myers和Miller(1988)的算法。此类算法掺入wSTR等HER程序，该程序是wEMBOSS序列比对软件包(http://emboss.sourceforge.net/处可得)的一部分。wSTR等HER使用利用线性空间的经典动力学编程算法的一种改良来计算两种序列的最佳全局比对。可以规定用于计算比对的替代矩阵、缺口插入罚分和缺口延伸罚分。在利用wSTRETCHER程序来比较核苷酸序列时，可以使用缺口打开罚分16和缺口延伸罚分4及评分矩阵文件EDNAFULL。在用于比较氨基酸序列时，可以使用缺口打开罚分12和缺口延伸罚分2及EBLOSUM62评分矩阵文件。

用于比较序列的数学算法的又一个非限制性实例是Needleman和Wunsch(1970)的，掺入序列比对软件包GAP 10版和wNEEDLE(http://emboss.sourceforge.net/)的算法。可以使用下述参数使用GAP 10版来确定序列同一性或相似性：对于核苷酸序列，使用缺口权重50和长度权重3，及nwsgapdna。cmp评分矩阵来查明％同一性和％相似性。对于氨基酸序列比较，使用GAP权重8和长度权重2，及BLOSUM62评分程序来确定％同一性或％相似性。

wNEEDLE阅读两种输入序列，沿着它们的整个长度找到最佳比对(包括缺口)，并将它们的最佳全局序列比对书写至文件。该算法使用含有每一个可能残基或核苷酸匹配的值的评分矩阵，探索所有可能比对并选择最佳者。wNEEDLE找到具有最大可能得分的比对，其中比对的得分等于取自评分矩阵的匹配之和减去在比对序列中打开和延伸缺口引起的罚分。替代矩阵及缺口打开和延伸罚分由使用者规定。在比较氨基酸序列时，使用缺省缺口打开罚分10、缺口延伸罚分0.5、和EBLOSUM62比较矩阵。在使用wNEEDLE比较DNA序列时，使用缺口打开罚分10、缺口延伸罚分0.5、和EDNAFULL比较矩阵。

也可以使用等同的程序。“等同的程序”意指对于讨论的任何两种序列，与由ALIGNX、wNEEDLE、或wSTRETCHER生成的相应比对相比，生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同百分比序列同一性的比对的任何序列比较程序。％同一性为在报告的比对区(包括长度中的任何缺口)上两种序列之间相同匹配的百分比，而％相似性为在报告的比对区(包括长度中的任何缺口)上两种序列之间匹配的百分比。

也可以通过检查手动实施比对。

重组宿主。可以将本发明的昆虫毒素编码基因导入极其多种微生物或植物宿主。昆虫毒素基因的表达直接或间接导致杀虫蛋白的胞内生成和维持。凭借合适的微生物宿主，例如假单胞菌属(Pseudomonas)，可以将微生物应用于害虫的环境，在那里它们会繁殖和被摄取。结果是控制害虫。或者，可以在延长毒素活性和稳定细胞的条件下处理包含昆虫毒素基因的微生物。然后可以将经过处理的保留毒素活性的细胞应用于靶害虫的环境。

在经合适的载体将B.t.毒素基因导入微生物宿主中，并将所述宿主以活的状态应用于环境的情况中，必须使用某些宿主微生物。选择已知占据一种或多种感兴趣作物的“植物圈”(叶轴、叶圈、根圈、和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物从而能够在特定环境(作物和其它昆虫栖息地)中成功地与野生型本土微生物竞争，提供表达多肽杀虫剂的基因的稳定维持和表达，及期望地提供针对环境降解和灭活对杀虫剂改善的保护。

已知多种微生物栖息于极其多种重要作物的叶轴(植物叶的表面)和/或根圈(植物根周围的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类、和真菌。特别感兴趣的是微生物，诸如细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌(Sinorhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，例如糖酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、和短柄霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是植物圈细菌物种，诸如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、类球红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)(以前的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti))、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)、和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)；和植物圈酵母物种，诸如深红酵母(Rhodotorularubra)、胶粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗仑氏隐球酵母(C.laurentii)、罗茜糖酵母(Saccharomyces rosei)、善地糖酵母(S.pretoriensis)、啤酒糖酵母/酿酒酵母(S.cerevisiae)、红色掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维氏酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短柄霉(Aureobasidium pollulans)。特别感兴趣的是有色微生物。

控制昆虫害虫的方法

当昆虫与经转基因植物表达、配制的蛋白质组合物、可喷洒的蛋白质组合物、诱饵基质或其它投递系统投递的有效量的毒素接触时，结果通常是昆虫死亡，或者昆虫不摄食使得昆虫可得到毒素的来源。

可以以多种方式“应用”或提供主题蛋白质毒素以接触靶昆虫。例如，可以使用本发明公知的转基因植物(其中由植物生成且在植物中存在蛋白质)。也可以在植物的特定组织中选择性地实现毒素基因的表达，诸如根、叶、等。这可以经例如使用组织特异性启动子来实现。喷洒应用是本领域也已知的另一个实例。可以为了期望最终用途适当配制主题蛋白质，然后喷洒(或以其它方式应用)到要保护的植物上和/或植物周围/至植物附近-在发现侵袭之前、在发现靶昆虫之后，二者之前和之后，等等。也可以使用例如本领域已知的诱饵颗粒。

转基因植物

可以使用主题蛋白质来保护实际上任何类型的植物免于昆虫害虫的损伤。此类植物的实例包括但不限于玉蜀黍、向日葵、大豆、棉、芸苔、稻、高粱、小麦、大麦、蔬菜、观赏植物、胡椒(包括辣椒)、(糖用)甜菜、水果、和草皮。用于转化植物的方法是本领域公知的，而且实施例中描述了例示性转化方法。

本发明的一个优选实施方案是用编码主题杀虫蛋白或其变体的基因转化植物。依靠经转化植物的细胞中控制量的主题杀虫蛋白或其变体的存在，经转化植物对昆虫靶害虫的攻击有抗性。通过将编码B.t.杀虫毒素的杀虫特性的遗传材料并入特定昆虫害虫吃的植物的基因组中，成虫或幼虫会在食用植物食物之后死亡。已经转化了单子叶植物和双子叶植物分类的众多成员。转基因农作物以及水果和植物是商业上感兴趣的。此类作物包括但不限于玉蜀黍、稻、大豆、芸苔、向日葵、苜蓿、高粱、小麦、棉、花生、番茄、马铃薯、等等。存在用于将外来遗传材料倒入植物细胞中，及用于获得稳定维持并表达导入的基因的植物的数种技术。此类技术包括直接加速包被到微粒上的遗传材料进入细胞中(美国专利No.4945050及美国专利No.5141131)。可以使用土壤杆菌技术来转化植物，参见美国专利No.5177010；美国专利No.5104310；欧洲专利申请No.0131624B1；欧洲专利申请No.120516；欧洲专利申请No.159418B1；欧洲专利申请No.176112；美国专利No.5149645；美国专利No.5469976；美国专利No.5464763；美国专利No.4940838；美国专利No.4693976；欧洲专利申请No.116718；欧洲专利申请No.290799；欧洲专利申请No.320500；欧洲专利申请No.604662；欧洲专利申请No.627752；欧洲专利申请No.0267159；欧洲专利申请No.0292435；美国专利No.5231019；美国专利No.5463174；美国专利No.4762785；美国专利No.5004863；及美国专利No.5159135。其它转化技术包括WHISKERS^TM技术，参见美国专利No.5302523及美国专利No.5464765。还已经使用电穿孔技术来转化植物，参见WO 87/06614；美国专利No.5472869；美国专利No.5384253；WO 9209696；及WO 9321335。通过述及收录所有这些转化专利和出版物。在用于转化植物的众多技术之外，与外来基因接触的组织的类型同样可以变化。此类组织会包括但不限于胚胎发生组织、愈伤组织I和II型、下胚轴、分生组织、等等。可以使用技术人员技术之内的适宜技术在去分化期间转化几乎所有植物组织。

可以使用本领域公知的多种技术将编码DIG-11昆虫毒素的基因插入植物细胞中，如上文公开的。例如，包含容许选择经转化微生物细胞的标志物和在大肠埃希氏菌/大肠杆菌(Escherichia coli)中有功能的复制系统的多种克隆载体可用于制备和修饰外来基因，用于插入高等植物中。此类操作可包括例如计划用途期望的插入突变、截短、添加、或替代。载体包括例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184、等。因而，可以在合适限制性位点处将编码Cry蛋白或变体的序列插入载体中。将所得质粒用于转化大肠杆菌，在合适的营养培养基中培养其细胞，然后收获并裂解，从而回收可工作数量的质粒。一般进行序列分析、限制性片段分析、电穿孔、和其它生物化学-分子生物学方法作为分析方法。在每次操作之后，可以切割使用的DNA序列，并连接至下一种DNA序列。可以在相同或不同的质粒中克隆每种操作的DNA序列。

含有T-DNA的载体用于转化植物细胞的用途已经在欧洲专利申请No.120516；Lee和Gelvin，2008；Fraley等，1986；及An等，1985中深入研究及充分记载，而且是本领域完善建立的。

一旦插入的DNA整合入植物基因组中，它贯穿后续世代是相对稳定的。用于转化植物细胞的载体通常含有选择编码赋予经转化植物细胞以对除草剂或抗生素诸如双丙氨磷(bialaphos)、卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素、等等的抗性的蛋白质的标记基因。各个采用的选择标记基因因而应当容许选择经转化细胞，而不含插入的DNA的细胞的生长受到选择化合物的阻抑。

多种技术可用于将DNA插入宿主植物细胞中。那些技术包括用通过根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂投递的T-DNA进行的转化。另外，可采用植物原生质体与含有要投递的DNA的脂质体的融合、DNA直接注射、生物射弹转化(微粒轰击)、或电穿孔，以及其它可能的方法。

在本发明的一个优选实施方案中，会用其中蛋白质编码区的密码子选择已经为植物优化的基因转化植物。参见例如美国专利No.5380831，通过述及将其收入本文。还有，有利地，会使用编码截短型毒素的植物。截短型毒素通常会编码全长毒素的约55％至约80％。用于创建合成B.t.基因以用于植物的方法是本领域已知的(Stewart，2007)。

不管转化技术，优选将基因并入通过在载体中包括植物启动子而适合于在植物细胞中表达B.t.杀虫毒素基因和变体的基因转移载体中。在植物启动子之外，可以在植物细胞中有效使用来自多种来源的启动子来表达外来基因。例如，可以使用细菌起源的启动子，诸如章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子；病毒起源的启动子，诸如花椰菜花叶病毒的35S和19S启动子；等等。植物启动子包括但不限于核酮糖-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)、β-伴球蛋白(conglycinin)启动子、菜豆蛋白启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、热休克启动子、ADF(肌动蛋白解聚因子)启动子、和组织特异性启动子。启动子也可以含有某些可改善转录效率的增强子序列元件。典型的增强子包括但不限于ADH1-内含子1和ADH1-内含子6。可使用组织性启动子。组织性启动子指导几乎所有细胞类型中及几乎所有时间时的连续基因表达(例如肌动蛋白、遍在蛋白质、CaMV 35S)。组织特异性启动子负责特定细胞或组织类型，诸如叶或种子中的基因表达(例如玉米醇溶蛋白、油质蛋白、油菜籽蛋白、ACP(酰基载体蛋白))，而且也可以使用这些启动子。也可以使用在某些植物发育阶段期间有活性的以及在特定植物组织和器官中有活性的启动子。此类启动子的实例包括但不限于根特异性的、花粉特异性的、胚特异性的、玉米穗丝特异性的、棉纤维特异性的、种子胚乳特异性的、韧皮部特异性的、等等启动子。

在某些情况下，可能希望使用诱导型启动子。诱导型启动子负责基因响应特定信号的表达，诸如：物理刺激(例如热休克基因)；光(例如RUBP羧化酶)；激素(例如糖皮质激素)；抗生素(例如四环素)；代谢产物；和应激(例如干旱)。可以使用在植物中发挥功能的其它期望转录和翻译元件，诸如5′非翻译前导序列、RNA转录终止序列和聚腺苷酸添加信号序列。众多植物特异性基因转移载体是本领域已知的。

含有昆虫抗性(IR)性状的转基因作物遍及北美洲流行于玉米和棉植物，而且这些性状的使用正在扩大至全球。多家种子公司已经开发了组合IR和除草剂耐受(HT)性状的商业转基因作物。这些包括由B.t.杀虫蛋白赋予的IR性状和HT性状诸如对乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂诸如磺脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶、磺酰苯胺类、等等，谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂诸如双丙氨磷、草铵膦(glufosinate)、等等，4-羟基苯基丙酮酸酯双加氧酶(HPPD)抑制剂诸如甲基磺草酮(mesotrione)、异

唑草酮(isoxaflutole)、等等，5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂诸如草甘磷(glyphosate)等等，和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂诸如氟吡氯禾灵/氟吡甲禾灵(haloxyfop)、喹禾灵(quizalofop)、氯甲草/禾草灵(diclofop)、等等的耐受的组合。知道其它实例，其中转基因提供的蛋白质给植物提供对至除草剂化学类别诸如苯氧基酸除草剂和吡啶基氧乙酸酯生长素除草剂(参见WO2007/053482 A2)，或苯氧基酸除草剂和芳基氧苯氧基丙酸酯除草剂(参见WO 2005107437 A2，A3)的耐受。经由IR性状控制多种害虫问题的能力是一个有价值的商业产品概念，而且如果在同一植物中组合昆虫控制性状和杂草控制性状的话，这个产品概念的便利得到增强。另外，可以经由B.t.杀虫蛋白(诸如本发明的)赋予的IR性状与一种或多种别的HT性状(诸如上文提到的)，加上一种或多种别的输入性状(例如由B.t.衍生的或其它的杀虫蛋白赋予的其它昆虫抗性、由诸如RNAi等等机制赋予的昆虫抗性、疾病抗性、应激耐受、改善的氮利用、等等)或输出性状(例如高油含量、健康油组成、营养改善、等等)的单一植物组合获得提高的价值。可以经由常规育种(育种堆叠)或共同作为涉及同时导入多种基因的新颖转化事件(分子堆叠)任一获得此类组合。好处包括作物植物中管理昆虫害虫的能力和改善的杂草控制，这给生产者和/或消费者提供次级好处。如此，本发明可用于与其它性状组合以提供作物品质改善的完整农业包，其具有灵活且划算地控制任何数目的农业问题的能力。

靶害虫

本发明的DIG-11昆虫毒素特别适合用于控制昆虫害虫。鞘翅类是一组重要的农业、园艺、和家庭害虫，其每年引起很大量的损害。此昆虫目涵盖以叶和根为食的幼虫和成虫，包括：来自长角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)、和象虫科(Curculionidae)的象鼻虫[例如棉铃象(boll weevil，Anthonomus grandis Boheman)、稻水象(rice water weevil，Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel)、谷象(granary weevil，Sitophilus grananus Linnaeus)、米象(rice weevil，Sitophilus oryzae Linnaeus)、三叶草叶象(clover leaf weevil，Hypera punctata Fabricius)、和玉米尖隐缘象(maize billbug，Sphenophorusmaidis Chittenden)]；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜甲虫、根虫、叶甲、薯虫、和潜叶虫[例如科罗拉多马铃薯甲虫/马铃薯叶甲(Colorado potatobeetle，Leptinotarsa decemlineata Say)、西方玉米根虫/玉米根萤叶甲(westerncorn rootworm，Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北方玉米根虫(northern corn rootworm，Diabrotica barben Smith & Lawrence)、南方玉米根虫/黄瓜十一星叶甲(southern corn rootworm，Diabrotica undecimpunctatahowardi Barber)、玉米跳甲(corn flea beetle，Chaetocnema pulicaraMelsheimer)、十字花菜跳甲(crucifer flea beetle，Phyllotreta cruciferaeGoeze)、葡萄肖叶甲(grape colaspis，Colaspis brunnea Fabricius)、黑角负泥虫(cereal leaf beetle，Oulema melanopus Linnaeus)、和向日葵叶甲(sunflower beetle，Zygogramma exclamationis Fabricius)]；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫[例如墨西哥豆甲虫(Mexican bean beetle，Epilachnavarivestis Mulsant)]；来自金龟科(Scarabaeidae)的金龟子和其它甲虫[例如日本弧丽金龟(Japanese beetle，Popillia japonica Newman)、北方圆头犀金龟(northern masked chafer，白色蛴螬，Cyclocephala borealis Arrow)、南方圆头犀金龟(southern masked chafer，白色蛴螬，Cyclocephala immaculataOlivier)、欧洲金龟子(European chafer，Rhizotrogus majalis Razoumowsky)、白色蛴螬、Phyllophaga crinita Burmeister、和胡萝卜甲虫(carrot beetle，Ligyrusgibbosus De Geer)]；来自皮蠹科(Dermestidae)的地毯甲虫；来自叩甲科(Elateridae)的线虫[例如疏爪叩甲属(Melanotus spp.)、宽胸叩甲属(Conoderus spp.)、Limonius spp.、细胸叩甲属(Agriotes spp.)、Ctenicera spp.、Aeolus spp.]；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫，和来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫(例如拟步甲属(Eleodes spp))。一般也可靶向任何上文所列属(及其它)作为本发明的一部分。任何这些属中任何别的昆虫(作为靶)也包括在本发明的范围内。

鳞翅类是另一组重要的农业、园艺、和家庭害虫，其每年引起很大量的损害。此昆虫目涵盖以叶和根为食的幼虫和成虫。鳞翅类昆虫害虫包括但不限于：小蜡螟(Achoroia grisella)、西黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana)、黑头长翅卷蛾(Acleris variana)、棉褐带卷蛾(Adoxophyes orana)、小地老虎(Agrotis ipsilon，black cutworm)、棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea)、波林尺蠖(Alsophila pometaria)、脐橙螟(Amyelois transitella)、地中海斑螟(Anagasta kuehniella)、桃条麦蛾(Anarsia lineatella)、橙纹犀额蛾(Anisotasenatoria)、柞蚕(Antheraea pernyi)、大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、黄卷蛾属(Archips sp.)、带卷蛾属(Argyrotaenia sp.)、Athetis mindara、家蚕蛾(Bombyx mori)、棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella)、干果斑螟(Cadracautella)、色卷蛾属(Choristoneura sp.)、Cochylls hospes、苜蓿黄蝶(Coliaseurytheme)、米螟(Corcyra cephalonica)、Cydia latiferreanus、苹果皮小卷蛾(Cydia pomonella)、核桃配片舟蛾(Datana integerrima)、西伯利亚松毛虫(Dendrolimus sibericus)、葡萄小卷叶野螟(Desmia feneralis)、甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata)、黄瓜绢野螟(Diaphania nitidalis)、玉米杆草螟(Diatraea grandiosella，southwestern corn borer)、小蔗杆草螟(Diatraeasaccharalis)、榆林黄尺蠖(Ennomos subsignaria)、蛀茎螟蛾(Eoreuma loftini)、烟草粉螟(Esphestia elutella)、菩提松尺蠖(Erannis tilaria)、盐泽灯蛾(Estigmene acrea)、Eulia salubricola、Eupocoellia ambiguella、环针单纹卷蛾(Eupoecilia ambiguella)、黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea)、暗缘地老虎(Euxoa messoria)、蜡螟(Galleria mellonella)、梨小食心虫(Grapholitamolesta)、葡萄叶烟翅斑蛾(Harrisina americana)、Helicoverpa subflexa、谷实夜蛾/玉米穗虫(Helicoverpa zea，corn earworm)、烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)、行列半白大蚕蛾(Hemileuca oliviae)、向日葵酮斑螟(Homoeosomaelectellum)、美国白蛾(Hyphantia cunea)、番茄茎麦蛾(Keiferialycopersicella)、铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria fiscellaria)、西方铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria lugubrosa)、雪毒蛾(Leucoma salicis)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、豆白缘切根虫(Loxagrotis albicosta，western beancutworm)、网锥额野螟(Loxostege sticticalis)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、Macalla thyrisalis、天幕毛虫属(Malacosoma sp.)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)、蓓带夜蛾(Mamestra configurata)、番茄天蛾(Manducaquinquemaculata)、烟草天蛾(Manduca sexta)、豆荚野螟(Maruca testulalis)、Melanchra picta、果园秋尺蠖(Operophtera brumata)、古毒蛾属(Orgyia sp.)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis，European corn borer)、苹尺蠖(Paleacritavernata)、蛀茎夜蛾(Papiapema nebris，常见茎蛀虫)、巨燕尾蝶(Papiliocresphontes)、红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)、加州栎石蛾(Phryganidiacalifornica)、斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella)、暗脉菜粉蝶(Pierisnapi)、菜粉蝶(Pieris rapae)、苜蓿綠夜蛾(Plathypena scabra)、Platynotaflouendana、荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)、洋薊羽蛾(Platyptiliacarduidactyla)、印度谷斑螟(Plodia interpunctella)、小菜蛾/菱纹背蛾(Plutellaxylostella，diamondback moth)、美国纹白蝶(Pontia protodice)、白点粘虫(Pseudaletia unipuncta，粘虫)、大豆尺夜蛾(Pseudoplasia includens)、Sabulodes aegrotata、红山背舟蛾(Schizura concinna)、麦蛾(Sitotrogacerealella)、苹白小卷蛾(Spilonta ocellana)、草地贪夜蛾/秋粘虫(Spodopterafrugiperda，fall armyworm)、甜菜夜蛾/贪夜蛾(Spodoptera exigua，beetarmyworm)、Thaurnstopoea pityocampa、Ensola bisselliella、粉纹夜蛾(Trichoplusia hi)、温室螟蛾(Udea rubigalis)、Xylomyges curiails、和苹果巢蛾(Yponomeuta padella)。

涵盖使用DIG-11昆虫毒素来控制作物植物的鞘翅类害虫。在一些实施方案中，可以经济地采用Cry蛋白来控制昆虫害虫，包括但不限于例如根虫诸如南方玉米根虫/黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi，southern corn rootworm)、北方玉米根虫/长角叶甲(Diabrotica longicornisbarberi，northern corn rootworm)、和西方玉米根虫/玉米根萤叶甲(Diabroticavirgifera，western corn rootworm)，和蛴螬诸如北方圆头犀金龟(Cyclocephalaborealis，northern masked chafer)、南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculate，southern masked chafer)、和日本弧丽金龟(Popillia japonica，Japanese beetle)的幼虫。

还涵盖使用DIG-11昆虫毒素来控制寄生性线虫，包括但不限于根结线虫(root knot nematode，Meloidogyne icognita))和大豆包囊线虫(soybean cystnematode，Heterodera glycines)。

DIG-11昆虫毒素的抗体检测

抗毒素抗体。可以容易地使用本领域标准规程制备针对本文中公开的昆虫毒素、或针对等同的毒素、或这些毒素的片段的抗体。此类抗体可用于检测DIG-11昆虫毒素的存在。

一旦分离了B.t.杀虫毒素，可以通过本领域公知的常规方法生成对毒素特异性的抗体。在几周或几月的时段里重复注射入选定宿主中会引发免疫应答并导致显著抗B.t.毒素血清滴度。优选是宿主是哺乳动物物种，而且更加高度优选的物种是家兔、山羊、绵羊和小鼠。可以通过已建立的方法加工自此类经免疫动物采集的血液以获得B.t.杀虫毒素反应性抗血清(多克隆抗体)。然后可以依照本领域已知技术通过吸附至毒素来亲和纯化抗血清。可以通过使用本领域已知规程分离抗血清内的免疫球蛋白级分来进一步纯化经亲和纯化的抗血清。所得材料会是B.t.杀虫毒素反应性免疫球蛋白的异质群体。

也可以通过制备由缀合至免疫原性载体的B.t.杀虫毒素合成肽片段组成的半合成免疫原来生成抗B.t.毒素抗体。本领域公知可用于生成肽片段的众多方案和设备。本领域还公知许多合适免疫原性载体诸如牛血清清蛋白或匙孔血蓝蛋白，正如用于偶联免疫原和载体蛋白的技术。一旦构建了半合成免疫原，用于生成对B.t.杀虫毒素片段特异性的抗体的规程与用于生成天然B.t.毒素反应性抗体的规程相同。

易于使用纯化的B.t.杀虫毒素来制备抗B.t.毒素单克隆抗体(单抗)。用于生成单抗的方法已经实行了超过15年，而且是本领域普通技术人员公知的。重复腹膜内或皮下注射佐剂中纯化的B.t.杀虫毒素会在大多数动物中引发免疫应答。自动物取出超免疫的B-淋巴细胞，并与能够无限期培养的合适融合配偶细胞系融合。其B-淋巴细胞可以超免疫且用于生成单抗的优选动物是哺乳动物。更优选的动物是大鼠和小鼠，而且最优选的是BALB/c小鼠品系。

众多哺乳动物细胞系是用于生成杂交瘤的合适融合配偶。许多此类系可得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)和商业供应商。优选的融合配偶细胞系衍生自小鼠骨髓瘤，而且HL-1

Friendly骨髓瘤-653细胞系(Ventrex，Portland，ME)是最优选的。一旦融合，将所得杂交瘤在选择性生长培养基中培养1至2周。有两种公知的选择系统可用于自混合杂交瘤培养物消除未融合的骨髓瘤细胞或骨髓瘤细胞之间的融合。选择系统的选择取决于免疫的小鼠的品系和使用的骨髓瘤融合配偶。可使用Taggart和Samloff(1983)记载的AAT选择系统；然而，由于它与上文所述优选小鼠品系和融合配偶的相容性，Littlefield(1964)记载的HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)选择系统是优选的。然后对用过的生长培养基筛选免疫特异性单抗分泌。酶联免疫吸附测定法(ELISA)规程最适合于此目的；虽然适合于大体积筛选的放射免疫测定法也是可接受的。可以实施多重筛选，其设计用来连续削减可观数目的无关或不太期望的培养物。可以对分泌B.t.杀虫毒素反应性单抗的培养物筛选与已知B.t.杀虫毒素的交叉反应性。可以使用商品化测定法测定优先结合优选B.t.杀虫毒素的单抗的同种型。优选的单抗是IgG类的，而且更加高度优选的单抗是IgG1和IgG2a同种亚型的。

可以将分泌优选单抗的杂交瘤培养物亚克隆数次以建立单克隆性和稳定性。用于亚克隆真核、非贴壁细胞培养物的公知方法包括有限稀释、软琼脂糖和荧光活化的细胞分选技术。在每次亚克隆之后，优选对所得培养物再测定抗体分泌和同种型以确保建立了分泌优选单抗的稳定培养物。

抗B.t.毒素抗体可用于检测本发明要求保护的B.t.杀虫毒素、及其变体或片段的各种方法。公知经报告基团标记的抗体可用于鉴定多种环境中抗原的存在。经放射性同位素标记的抗体已经使用几十年，在放射免疫测定法中以极大精确度和敏感性鉴定多种生物学流体中抗原的存在。新进，经酶标记的抗体已经用作ELISA测定法中放射性标记的抗体的替代物。另外，可以将本发明B.t.杀虫毒素免疫反应性抗体结合至固定化物质诸如聚苯乙烯孔或颗粒并用于免疫测定法以测定测试样品中是否存在B.t.毒素。

使用探针的检测

另一种用于鉴定本发明毒素和基因的方法是经由使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。可以依靠适宜放射性标记物使得这些序列可检测，或者可以将这些序列制成内在发荧光，如美国专利No.6268132记载的。正如本领域公知的，如果探针分子和核酸样品通过在两种分子之间形成强碱基配对键而杂交的话，可以合理地假设探针和样品具有实质性序列同源性。优选地，通过本领域公知技术在严格条件下进行杂交，如记载于例如Keller和Manak(1993)。探针的检测提供用于以已知方式测定是否发生了杂交的手段。此类探针分析提供用于鉴定本发明的毒素编码基因的快速方法。可以使用DNA合成仪和标准规程来合成依照本发明用作探针的核苷酸区段。这些核苷酸序列也可以用作PCR引物以扩增本发明的基因。

杂交

正如分子生物学技术人员公知的，可以通过两种核酸杂交的倾向来表征它们的相似性。如本文中使用的，术语“严格条件”或“严格杂交条件”意图指探针会以可检测地比其它序列大的程度(例如胜过背景至少2倍)杂交(退火)至其靶序列的条件。严格条件是序列依赖性的，而且在不同情况中会是不同的。通过控制杂交和/或清洗条件的严格性，能鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探查)。或者，可以调整严格条件以容许序列中的一些错配，使得检测较低程度的相似性(异源探查)。一般地，探针的长度不到约1000个核苷酸，优选长度不到500个核苷酸。

典型地，严格条件会是那些其中盐浓度不到约1.5M Na离子，通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，处于pH 7.0至pH 8.3，且温度为用于短探针(例如10至50个核苷酸)的至少约30℃和用于长探针(例如大于50个核苷酸)的至少约60℃。也可以添加去稳定剂诸如甲酰胺实现严格条件。例示性低严格条件包括用30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液于37℃杂交并在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中于50℃至55℃清洗。例示性中等严格条件包括在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交并在0.5X至1X SSC中于55℃至60℃清洗。例示性高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃杂交并在0.1X SSC中于60℃至65℃清洗。任选地，清洗缓冲液可包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间一般小于约24小时，通常约4至约12小时。

特异性通常是杂交后清洗的函数，关键因素是最终清洗溶液的离子强度和温度。对于DNA/DNA杂合物，热熔点(Tm)为50％的互补靶序列杂交至完全匹配的探针的温度(在限定的离子强度和pH下)。对于每1％的错配，Tm降低约1℃；如此，可以调整Tm、杂交条件、和/或清洗条件以推动期望同一性的序列退火。例如，如果寻找同一性＞90％的序列的话，可以将Tm降低10℃。一般地，选择比特定序列和其互补物在限定离子强度和pH的Tm低约5℃的严格条件。然而，高严格条件可利用比Tm低1℃、2℃、3℃、或4℃的杂交和/或清洗；中等严格条件可利用比Tm低6℃、7℃、8℃、9℃、或10℃的杂交和/或清洗；而低严格条件可利用比Tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、或20℃的杂交和/或清洗。

Tm(以℃为单位)可以通过实验来测定，或者可以通过计算来估算。对于DNA-DNA杂合物，可以自Meinkoth和Wahl(1984)的方程来估算Tm：Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；

其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞苷核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，且L是杂合物以碱基对计的长度。

或者，Tm由下式(Beltz等，1983)记载。

Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log[Na+])+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-600/L

其中[Na+]是钠离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞苷核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，且L是杂合物以碱基对计的长度。

使用该等方程、杂交和清洗组合物、及期望Tm，普通技术人员会理解，内在描述了杂交和/或清洗溶液的严格性的变化。如果期望错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的话，优选提高SSC浓度，使得可使用更高的温度。关于核酸杂交的广泛指导可见于Tijssen(1993)及Ausubel等(1995)。还可参见Sambrook等(1989)。

可以通过标准方法来实施Southern印迹上固定化DNA与放射性标记的基因特异性探针的杂交(Sambrook等，见上文)。用于标记多核苷酸探针的放射性同位素可以包括32P、33P、14C、或3H。可以通过分子生物学领域技术人员公知的数种方法任一来进行将放射性同位素并入多核苷酸探针分子(参见例如Sambrook等，见上文)。一般地，可以在容许检测与要求保护的毒素编码基因具有同源性的靶序列的严格条件下进行杂交和后续清洗。对于双链DNA基因探针，杂交可以于比DNA组合物的Tm低20℃至25℃，在6X SSPE、5X Denhardt氏溶液、0.1％SDS、0.1mg/mL变性DNA中进行过夜[20X SSPE为3M NaCl、0.2M NaHPO4、和0.02M EDTA(乙二胺四乙酸钠盐)，100XDenhardt氏溶液为20gm/L聚乙烯吡咯烷酮、20gm/L Ficoll 400型和20gm/L牛血清清蛋白(级分V)]。

通常可如下进行清洗：

于室温在1X SSPE、0.1％SDS中进行15分钟两次(低严格清洗)。

于Tm-20℃在0.2X SSPE、0.1％SDS中进行15分钟一次(中等严格清洗)。

对于寡核苷酸探针，杂交可以于比杂合物的Tm低10℃至20℃，在6XSSPE、5X Denhardt氏溶液、0.1％SDS、0.1mg/mL变性DNA中进行过夜。可以通过下式确定用于寡核苷酸探针的Tm(Suggs等，1981)。

Tm(℃)＝2(T/A碱基对的数目)+4(G/C碱基对的数目)

通常可如下进行清洗：

于室温在1X SSPE、0.1％SDS中进行15分钟两次(低严格清洗)。

于杂交温度在1X SSPE、0.1％SDS中进行15分钟一次(中等严格清洗)。

可以通过放射性标记以外的手段使得用于杂交的探针分子及探针和靶分子之间形成的杂合物分子可检测。此类备选方法意图在本发明的范围内。

通过述及完整收录本文中提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物，到它们与本说明书中的清楚教导不矛盾的程度。

通过本文中使用的术语“遗传材料”，它意图包括所有基因、核酸、DNA和RNA。术语“dsRNA”指双链RNA。对于多核苷酸、DNA、RNA、寡核苷酸、和引物的核苷酸残基称谓，及对于蛋白质的氨基酸残基称谓，贯穿本文件采用标准IUPAC缩写。以标准的5′至3′方向来呈现核酸序列，而且以标准的氨基(N)端至羧基(C)端方向来呈现蛋白序列。

应当理解，本文中描述的实施例和实施方案仅用于例示目的，而且根据它们的各种变更或变化是本领域技术人员会想到的且包括在本申请的精神和范围及所附权利要求的范围内。这些实施例不应解释为限制。

除非明确指明或暗示，术语“一个”、“一种”、和“所述”表示“至少一个/种”，如本文中使用的。

除非另外注明，所有百分比以重量计，而且所有溶剂混合比例以体积计。所有温度以摄氏度计。

实施例1

编码DIG-11毒素的基因的分离

除非另外指明，通过例如Ausubel等(1995)、Sambrook等(1989)及其更新中披露的标准方法来实施此实施例和后续实施例中描述的分子生物学和生物化学操作。自B.t.菌株PS184M1分离了编码本文中称作DIG-11昆虫毒素的杀虫Cry蛋白的核酸。基于每一类的B.t.杀虫毒素的多重序列比对设计了简并引物，其要在使用PS184M1基因组DNA作为模板的PCR反应中用作正向和反向引物。正向引物对应于SEQ ID NO：1碱基841至865，而反向引物对应于SEQ ID NO：1碱基2227至2250的互补物。使用这对引物来扩增1410bp的片段，其对应于SEQ ID NO：1核苷酸841至2250。使用此序列作为锚点来开始基因组步查，使用自GenomeWalker^TM通用试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)修改的方法进行。测定了跨越DIG-11编码区的片段的核酸序列。SEQ IDNO：1为编码全长DIG-11蛋白的3492bp核苷酸序列。SEQ ID NO：2为自SEQID NO：1推导的全长DIG-11蛋白氨基酸序列。

实施例2

自DIG-11删除域Iα-螺旋

为了改进DIG-11昆虫毒素的昆虫活性特性，进行系列、逐步删除，每一次移除DIG-11蛋白N端的一部分。删除移除域I中的部分或整个α-螺旋1和部分或整个α-螺旋2，而维持α-螺旋3至α-螺旋7的结构完整性。

删除设计如下。此实施例利用编码全长DIG-11蛋白的全长嵌合DNA序列(例如分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1)来例示设计原理及73种特定变体。它利用SEQ ID NO：5的嵌合序列(编码融合至Cry1Ab原毒素区段的DIG-84核心毒素区段的DNA)来提供另73种特定变体。本领域技术人员会认识到可以类似地操作编码DIG-11蛋白整个或N端部分的其它DNA序列以实现期望结果。为了设计第一种删除变体编码序列，移除编码α-螺旋1的所有碱基，包括α-螺旋2A起点附近亮氨酸残基的密码子(即SEQ ID NO：2的全长DIG-11蛋白的L100)。如此，消除SEQ ID NO：1碱基1至300移除SEQ IDNO：2氨基酸1至100的编码序列。在起点处(即在与全长蛋白氨基酸101对应的密码子前面)再引入翻译起始ATG(甲硫氨酸)密码子提供包含3195个碱基的可读框的删除变体编码序列，其编码包含1065个氨基酸的删除变体DIG-11蛋白(即甲硫氨酸加全长DIG-11蛋白氨基酸101至1164)。系列、逐步删除移除别的与SEQ ID NO：2的全长DIG-11蛋白残基101至141对应的单一氨基酸的密码子提供缺失部分或整个α-螺旋2A和α-螺旋2B的变体。如此，第二种设计删除变体编码序列要求消除SEQ ID NO：1碱基1至303，由此移除氨基酸1至101的编码序列。再次通过在剩余编码序列的起点处再引入翻译起始甲硫氨酸密码子来实现恢复功能性可读框，如此提供具有3192个碱基的可读框的第二种删除变体编码序列，其编码包含1064个氨基酸的删除变体DIG-11蛋白(即甲硫氨酸加全长DIG-11蛋白氨基酸102至1164)。最后一种设计删除变体编码序列要求移除SEQ ID NO：1碱基1至423，如此消除氨基酸1至141的编码序列，并在再引入翻译起始甲硫氨酸密码子之后，提供具有3069个碱基的可读框的删除变体编码序列，其编码1023个氨基酸的删除变体DIG-11蛋白(即甲硫氨酸加全长DIG-11蛋白氨基酸142至1164)。正如例示的，在消除删除序列之后，将起始甲硫氨酸密码子添加至剩余编码序列的起点以恢复功能性可读框。也正如描述的，在移除删除序列使得在全长蛋白的剩余部分N端处暴露上文提供的不稳定性决定氨基酸之一的情况中，将额外的甘氨酸密码子添加至甲硫氨酸密码子和不稳定性决定氨基酸的密码子之间。

表3描述依照上文所述策略设计的特定变体。

表3。SEQ ID NO：2的全长DIG-11蛋白的删除变体蛋白序列和SEQ ID NO：5的融合蛋白序列。

编码表3所述毒素的核酸是依照用于意图在植物中表达的合成基因的一般原理设计的，如上文讨论的。

实施例3

DIG-84和Cry1Ab原毒素蛋白的编码序列的植物优化型式的设计

设计并合成了具有植物密码子偏爱的DNA序列以在转基因单子叶植物和双子叶植物中生成DIG-84蛋白及在单子叶植物或双子叶植物中生成Cry1Ab原毒素区段。自得自GenBank中存储的序列的706种蛋白质编码序列(CD)计算了玉蜀黍(Zea mays L.)的密码子选择表。自万维网站http://www.kazusa.or.jp/codon/处的数据下载了烟草(Nicotiana tabacum，1268种CD)、芸苔(Brassica napus，530种CD)、棉(Gossypium hirsutum，197种CD)、和大豆(Glycine max；大约1000种CD)的密码子选择表。在忽略在任一植物类型中的使用不到该氨基酸的总密码子使用的约10％的任何同义密码子之后计算了包含玉蜀黍和CDS、及合并的双子叶植物CDS数据集中以适当重定标相对量高度使用的密码子的偏爱密码子集。为了推导经玉蜀黍优化的编码DIG-84蛋白的序列，对通过实验测定的DIG-11 DNA序列进行同义密码子替代，使得所得DNA序列具有玉蜀黍密码子偏爱表的整体密码子组成，同时保留编码的氨基酸序列。对序列进行进一步改进以消除不想要的限制酶识别位点、潜在植物内含子剪接位点、大段A/T或C/G残基、和可能干扰植物细胞中编码区的RNA稳定性、转录、或翻译的其它基序。进行其它改变以引入期望的限制酶识别位点，及消除长内部可读框(+1以外的框)。这些改变都在保留玉蜀黍偏爱的密码子组成的约束内进行。由商业销售商(DNA2.0，Menlo Park，CA)实施设计序列的合成。

别的关于生成合成基因的指导可见于例如WO 97/13402及美国专利No.5380831。

SEQ ID NO：3给出经玉蜀黍优化的编码DIG-84核心毒素区段(其包含SEQ ID NO：2的全长DIA-11蛋白的氨基酸1至664)的DNA序列。使用类似的方法来设计SEQ ID NO：6公开的经双子叶植物优化的编码Cry1Ab原毒素区段的DNA序列和SEQ ID NO：7公开的经玉蜀黍优化的编码Cry1Ab原毒素区段的DNA序列。

实施例4

编码DIG-84昆虫毒素的表达载体的构建及在细菌宿主中的表达

在改造成生成由经玉蜀黍优化的编码区编码的DIG-84蛋白的荧光假单胞菌(Pf)表达质粒构建中使用标准克隆方法。限制性内切核酸酶得自NewEngland BioLabs(NEB；Ipswich，MA)，而T4 DNA连接酶(NEB)用于DNA连接。使用Nucleospin质粒试剂盒(Macherey-Nagel Inc，Bethlehem，PA)遵循供应商的指令实施质粒制备。在琼脂糖Tris-乙酸盐凝胶电泳之后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化DNA片段。用NEBAntarctic磷酸酶磷酸化线性化载体以增强重组分子的形成。

基本克隆策略要求将具有SEQ ID NO：3提供的DIG-84昆虫毒素编码序列(CDS)的DNA片段在例如SpeI和XhoI限制性位点处亚克隆入pDOW1169中，由此将其放置在来自质粒pKK223-3(PL Pharmacia，Milwaukee，WI)的Ptac启动子和rrnBT1T2终止子的表达控制下。pDOW1169是一种中等拷贝质粒，在可插入含有蛋白编码区的DNA片段的限制酶识别位点前面有RSF1010复制起点、pyrF基因、和核糖体结合位点(美国专利申请No.20080193974)。通过电穿孔将表达质粒pDAB102007转化入DC454(一种近似野生型的荧光假单胞菌菌株，其具有突变ΔpyrF和lsc::lacI^QI)或其衍生物中，在SOC-大豆水解产物培养基中回收，并涂布到选择性培养基(缺少尿嘧啶的M9葡萄糖琼脂，Sambrook等，见上文)上。微生物学操作的详情可见于Squires等，2004；美国专利申请No.20060008877；美国专利申请No.20080193974；及美国专利申请No.20080058262，通过述及收入本文。通过对小量制备的质粒DNA的限制酶消化来鉴定重组菌落，并选择了一个(DPf13591)用于进一步的工作。自pDAB102007表达载体生成的DIG-84蛋白包含SEQ ID NO：2公开的DIG-11蛋白的氨基酸1至664，N端添加两个氨基酸(亮氨酸和谷氨酰胺)，由构成pDAB102007中用于终止DIG-84 CDS的XhoI限制酶识别位点的碱基翻译产生。

摇瓶中的生长和表达分析通过摇瓶培养的包含表达构建体(例如质粒pDAB102007)的荧光假单胞菌菌株DPf13591来实现DIG-84蛋白的生成，以用于表征和昆虫生物测定法。使用在补充有1％葡萄糖和痕量元素的M9培养基中培养的种子培养物来接种50mL含5％甘油(Teknova产品目录#3D7426，Hollister，CA)的确定成分极限培养基。在摇动下于30℃初始温育24小时之后通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来诱导DIG-84毒素基因经Ptac启动子的表达。在诱导时及在诱导后的多个时间对培养物取样。通过600nm处的光密度(OD₆₀₀)来测量细胞密度。也可以利用适合于荧光假单胞菌生长的其它培养基，例如如Huang等，2007及美国专利申请No.20060008877中记载的。

摇瓶样品的细胞分级和SDS-PAGE分析在每个取样时间，将样品的细胞密度调整至OD₆₀₀＝20，并将1mL等分试样以14000x g离心5分钟。将细胞团粒冷冻于-20℃。自冷冻的摇瓶细胞团粒生成可溶性和不溶性级分，即将团粒重悬浮于0.5mL Butterfield氏磷酸钾缓冲液pH7.2(Thermo-FisherScientific，Rockford，IL)。使用2mm直径探针和Branson Sonifier 250(Danbury，CT)以恒定输出20将样品超声处理45秒两次，破裂之间有结冰。将溶胞产物于4℃以14,000rpm离心20分钟，并作为可溶性级分回收上清液。然后将团粒(不溶性级分)重悬浮于等体积的Butterfields氏磷酸盐缓冲液( )。

将样品与2X含有β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液1∶1混合(Sambrook等，见上文)，并煮沸5分钟，之后加载到Criterion XT Bis-Tris 12％凝胶(Bio-Rad Inc.，Hercules，CA.)上。在推荐的XT MOPS缓冲液中实施电泳。将凝胶用Bio-Safe考马斯染料依照制造商(Bio-Rad)的方案染色，并使用Alpha Innotech成像系统(San Leandro，CA)成像。

DIG-84昆虫毒素制备自400mL裂解缓冲液(100mM CAPS，5mMEDTA，5mM TCEP(盐酸三(2-羧乙基)-膦)pH11)中重悬浮的45.5克重组假单胞菌细胞浆富集DIG-84昆虫毒素。使悬浮液两次通过M-11OYMicrofluidizer

(Microfluidics Inc.，Newton，MA)。此装置配备有两个室：H30Z辅助加工模块(APM)，其具有200微米的标称通过大小，和HlOZ相互作用室(IXC)，其具有100微米的标称通过大小。如制造商推荐的那样，将APM放置在IXC下游。在11,000和15,000psi之间破碎细胞，并通过离心(SLC1500转子，12,000rpm，20分钟)来澄清。倾倒出上清液并过滤(0.8μm)，之后进行阴离子交换层析。

将假单胞菌细胞溶胞产物拆分两半并分两批加工。通过使溶胞产物通过五个头尾串联连接的5mL High Trap Capto^TM Q柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)来富集DIG-84蛋白。以5mL/min将溶胞产物注射通过一系列五个柱。用缓冲液A(50mM Bis Tris丙烷，5mM EDTA，5mM DTT，pH9)洗脱不结合的蛋白质，直至280nm处的吸光度达到接近基线。用含有0.15M NaCl的缓冲液A继续洗脱以除去别的污染物。对于第一个半份溶胞产物，将NaCl浓度提高至0.2M以继续洗脱污染物，然后用240mL里到0.5MNaCl的线性梯度洗脱结合的蛋白质，同时收集10mL级分。对于第二个半份溶胞产物，在第一次用缓冲液A洗脱之后，通过用0.15M NaCl(消除了0.2MNaCl洗脱步骤)洗脱来除去污染物，然后用上文所述到0.5M的NaCl梯度洗脱结合的蛋白质。

用Amicon Ultra-15再生纤维素离心过滤装置(50,000分子量截留；Millipore)浓缩合并的级分，然后注射入Slide-A-Lyzer

盒(10,000分子量截留；Thermo Fisher Scientific)中，并于4℃针对两个4升体积的透析缓冲液(10mM CAPS(3-(环己氨基)1-丙磺酸)，pH10)透析过夜。随后通过Bradford总蛋白质测定法测定总蛋白质浓度。

凝胶电泳为电泳准备浓缩提取物，即在含有5mM二硫苏糖醇作为还原剂的NuPAGE

LDS样品缓冲液(Invitrogen)中1∶50稀释，并于95℃加热4分钟。在4-12％ NuPAGE

凝胶的双份道中在范围为0.2至2μg/道的5份BSA标准品(用于生成标准曲线)旁边加载样品。使用MOPS SDS运行缓冲液(Invitrogen)以200V应用电压，直至示踪染料到达凝胶底部。将凝胶用含0.2％考马斯蓝G-250的45％甲醇、10％乙酸染色，并如下脱色，首先用45％甲醇、10％乙酸短时间脱色，然后用7％乙酸、5％甲醇长时间脱色，直至背景清澈。脱色后，用BioRad Fluor-S MultiImager扫描凝胶。使用该仪器的Quantity One v.4.5.2软件来获得染色的蛋白质条带减去背景后的容量及生成BSA标准曲线，其用于计算储藏溶液中DIG-84蛋白的浓度。

实施例5

荧光假单胞菌中生成的DIG-84昆虫毒素的昆虫活性

对DIG-84昆虫毒素测试对鞘翅类昆虫西方玉米根虫(WCR，Diabroticavirgifera virgifera LeConte)的幼虫的活性。对DIG-84昆虫毒素进一步测试对鳞翅类昆虫，包括例如菱纹背蛾/小菜蛾(diamondback moth，DBM；Plutellaxylostella Linnaeus)和cry1A抗性DBM(rDBM)的幼虫的活性。

样品制备和生物测定法在10mM CAPS pH10中制备DIG-84样品，而且所有生物测定法含有由此缓冲液组成的对照处理，其充当死亡或生长抑制的背景检验。

通过凝胶电泳来评估生物测定缓冲液中的蛋白质浓度，其中使用BSA来为凝胶密度测定创建标准曲线，这是使用BioRad成像系统(Fluor-SMultiImager及Quantity One软件4.5.2版)测量的。在读出之前将凝胶基质中的蛋白质用基于考马斯蓝的染料染色并脱色。

在用食用人造昆虫食物的新生昆虫幼虫进行的生物测定法中对经过纯化的蛋白质测试昆虫活性。自得自由商业养虫室(Benzon Research Inc.，Carlisle，PA)维持的集群的卵孵化DBM和rDBM的幼虫。WCR卵得自CropCharacteristics，Inc.(Farmington，MN)。

在专门为昆虫生物测定法设计的128孔塑料盘中进行生物测定法(C-DInternational，Pitman，NJ)。每个孔装有1.0mL多物种鳞翅目食物(SouthlandProducts，Lake Village，AR)或为培养鞘翅类昆虫设计的专属食物(DowAgroSciences LLC，Indianapolis，IN)。通过移液器将40μL或60μL等分试样的蛋白质样品投递到每个孔的1.5cm²食物表面上(27μL/cm²或40μL/cm²)。计算食物浓度，即孔中每平方厘米(cm²)表面积的DIG-84蛋白量(ng)。将经过处理的盘保持在通风橱中，直至食物表面上的液体蒸发或吸收到食物中。

在孵化后的几个小时内，用弄湿的骆驼毛刷拾起各幼虫，并存放在经过处理的食物上，每个孔一只或两只幼虫。然后用粘性透明塑料膜密封感染孔，通气以容许气体交换(C-D International，Pitman，NJ)。将生物测定盘在受控环境条件(28℃，～40％相对湿度，16∶8[亮∶暗])下保持5天，之后将昆虫全数暴露于每一份蛋白质样品，记录死亡昆虫的数目和存活昆虫的重量。计算每种处理的百分比死亡、平均活重量、和生长抑制。发育障碍定义为平均活重量的降低。如下计算生长抑制(GI)：

GI＝[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]

其中TWIT为处理中活昆虫的总重量，

TNIT为处理中昆虫的总数目，

TWIBC为背景检验(缓冲液对照)中活昆虫的总重量，而

TNIBC为背景检验(缓冲液对照)中昆虫的总数目。

测定GI₅₀，即GI值为50％时食物中的DIG-84蛋白浓度。记录LC₅₀(50％致死浓度)，即50％的测试昆虫被杀死时食物中的DIG-84蛋白浓度。使用JMP软件(SAS，Cary，NC)进行统计分析。

重复的生物测定法证明了摄取DIG-84昆虫毒素导致西方玉米根虫幼虫发育障碍，如表4所示。没有观察到针对测试的其它昆虫的活性。

表4。通过西方玉米根虫幼虫调查的DIG-84蛋白的发育障碍效果。

^*不是由相同字母连接的处理是显著不同的。

实施例6

土壤杆菌转化

在二元植物转化和表达质粒的构建中使用标准克隆方法。限制性内切核酸酶和T4 DNA连接酶得自NEB。使用NucleoSpin

质粒制备试剂盒或NucleoBond

AX Xtra Midi试剂盒(均来自Macherey-Nagel)遵循制造商的指令实施质粒制备。在凝胶分离之后使用QIAquick PCR纯化试剂盒或QIAEXII凝胶提取试剂盒(均来自Qiagen)纯化DNA片段。

包含编码经修饰DIG-11昆虫毒素或其片段的核苷酸序列的DNA片段可以由商业供应商(例如DNA2.0，Menlo Park，CA)合成并作为标准质粒载体中克隆的片段供应，或者可以通过对其它含有适宜核苷酸序列的构建体的标准分子生物学操作获得。可以鉴定每种基因内部的唯一限制性位点，并合成每种基因的片段，每种含有特定删除或插入。可以在适宜限制性位点处将经修饰Cry片段亚克隆入其它Cry片段编码区中以获得编码期望全长蛋白、融合蛋白、或删除变体蛋白的编码区。例如，可以鉴定基因起点处的适宜限制性识别位点和每种基因特异性的第二内部限制性位点，其可用于构建变体克隆。

在一个非限制性实例中，基本克隆策略可以是在NcoI和SacI限制性位点处将全长或经修饰Cry编码序列(CDS)亚克隆入植物表达质粒中。利用例如Gateway

技术或标准限制酶片段克隆规程，将所得含有植物表达元件(例如植物可表达启动子、3′端转录终止和聚腺苷酸添加决定子、等等)控制下的适宜Cry编码区的植物表达盒亚克隆入二元载体质粒。如果利用Gateway

技术的话，可以使用例如LR Clonase^TM(Invitrogen)将全长和经修饰基因植物表达盒重组入二元植物转化质粒中。方便的是采用包含当质粒存在于大肠杆菌和土壤杆菌细胞中时赋予对抗生素大观霉素的抗性的细菌基因的二元植物转化载体。同样方便的是采用含有在期望宿主植物中有功能的植物可表达选择标记基因的二元载体质粒。植物可表达选择标记基因的实例包括但不限于编码对抗生素卡那霉素、新霉素和G418的抗性的转座子Tn5氨基糖苷磷酸转移酶基因(Aph II)，以及那些编码对草甘磷；潮霉素；甲氨蝶呤；膦丝菌素(双丙氨磷)、咪唑啉酮类、磺脲类和三唑并嘧啶除草剂，诸如氯磺隆(chlorosulfuron)、溴苯腈/溴草腈(bromoxynil)、茅草枯(dalapon)等等的抗性或耐受的基因。

制备根癌土壤杆菌菌株Z707S(Z707的一种链霉素抗性衍生物；Hepburn等，1985)的电感受态细胞，并使用电穿孔(Weigel和Glazebrook，2002)转化。在电穿孔之后，将1mL YEP培养基(gm/L：酵母提取物，10；胨，10；NaCl，5)添加至杯，并将细胞-YEP悬浮液转移至15mL培养管，在恒定摇动下在水浴中于28℃温育4小时。将细胞涂布到含大观霉素(200μg/mL)和链霉素(250μg/mL)的YEP加琼脂(25gm/L)上，并将板于28℃温育2-4天。选择完全分开的单菌落，在新鲜的如前含大观霉素和链霉素的YEP+琼脂板上划线，并于28℃温育1-3天。

通过使用载体特异性引物及自选定土壤杆菌菌落制备的模板质粒DNA的PCR分析来展示二元植物转化载体中DIG-11昆虫毒素基因插入物的存在。使用Qiagen Spin Mini Preps遵循制造商的指令提取来自在如前含大观霉素和链霉素的YEP中培养的15mL过夜培养物的4mL等分试样的细胞团粒。包括来自土壤杆菌电穿孔转化中使用的二元载体的质粒DNA作为对照。使用来自Invitrogen的Taq DNA聚合酶遵照制造商的指令于0.5X浓度进行PCR反应。在以下述条件编程的MJ Research Peltier热循环仪中进行PCR反应：步骤1)94℃，3分钟；步骤2)94℃，45秒钟；步骤3)55℃，30秒钟；步骤4)72℃，1分钟每kb延伸产物长度；步骤5)29次返回步骤2；步骤6)72℃，10分钟。在循环之后将反应维持于4℃。通过琼脂糖凝胶电泳(例如0.7％至1％琼脂糖，w/v)分析扩增产物，并通过溴化乙啶染色来显现。选择其PCR产物与质粒对照相同的菌落。

或者，经由对通过土壤杆菌操作领域技术人员公知的标准分子生物学方法自候选土壤杆菌隔离群制备的质粒DNA的限制性消化物指纹作图来展示含有DIG-11基因插入物的二元植物转化载体的质粒结构。

经土壤杆菌介导的转化方法获得转化植物领域技术人员会理解可以有利地使用Z707S以外的其它土壤杆菌菌株，而且菌株的选择可取决于要转化的宿主植物物种的身份。

实施例7

双子叶植物中DIG-11昆虫毒素和变体的生成

拟南芥转化使用花浸法(Weigel和Glazebrook，2002)来转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-01。使用选定的土壤杆菌菌落接种1mL至15mL含有用于选择的适宜抗生素的YEP培养基的培养物。将培养物于28℃温育过夜，以220rpm恒速摇动。使用每一份培养物接种两份500mL含有用于选择的适宜抗生素的YEP培养基的培养物，并将新培养物于28℃温育过夜，恒速摇动。将细胞于室温以大约8700x g沉淀10分钟，并丢弃所得上清液。将细胞团粒温和重悬浮于500mL渗透培养基，其含有：1/2x Murashige和Skoog盐(Sigma-Aldrich)/Gamborg氏B5维生素(Gold BioTechnology，St.Louis，MO)，10％(w/v)蔗糖，0.044μM苄基氨基嘌呤(10μL/L 1mg/mL DMSO中的储液)和300μL/L Silwet L-77。将大约1个月龄的植物在培养基中浸泡15秒，小心确保淹没最新的花序。然后将植物侧放并覆盖(透明的或不透明的)24小时，用水清洗，并竖放。以16小时亮/8小时暗光周期于22℃培养植物。浸泡后大约4周，收获种子。

拟南芥培养和选择容许新鲜收获的T1种子在干燥剂存在下于室温干燥至少7天。将种子悬浮于0.1％琼脂/水(Sigma-Aldrich)溶液，然后于4℃沙藏2天。为了准备种植，将10.5英寸 x 21英寸发芽盘(T.O.Plastics Inc.，Clearwater，MN)中的Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture Inc.，Bellevue，WA)用细蛭石覆盖，用Hoagland氏溶液(Hoagland和Arnon，1950)地下灌溉直至弄湿，然后容许排水24小时。将沙藏的种子播种到蛭石上，并用湿盖(KORD Products，Bramalea，Ontario，Canada)覆盖7天。种子发芽，并且植物在Conviron(CMP4030或CMP3244型；Controlled Environments Limited，Winnipeg，Manitoba，Canada)中在长日照条件(16小时亮/8小时暗)下以光强120-150μmol/m²sec于恒定温度(22℃)和湿度(40-50％)生长。首先给植物浇水Hoagland氏溶液，随后是去离子水以保持土壤湿润但不湿。

播种后5-6天移除盖，并给植物喷洒化学选择剂以杀死自非转化种子发芽的植物。例如，如果由二元植物转化载体提供的植物可表达选择标记基因是pat或bar基因(Wehrmann等，1996)的话，可以通过喷洒Finale的1000X溶液(5.78％草铵膦，Farnam Companies Inc.，Phoenix，AZ.)来选择转化植物。以5-7天间隔实施两次后续喷洒。最后一次喷洒后7-10天鉴定存活者(积极生长的植物)，并移植入用Sunshine Mix LP5准备的盆。将移植的植物用湿盖覆盖3-4天，并放置于Conviron中上文所述生长条件下。

双子叶植物转化领域技术人员会理解，在使用其它植物可表达选择标记基因(例如除草剂耐受基因)时可使用其它选择转化植物的方法。

转基因拟南芥的昆虫生物测定法在人造食物覆盖测定法中证明表达经修饰Cry蛋白的转基因拟南芥系对敏感性昆虫物种有活性。通过适宜方法对自转基因和非转基因拟南芥系提取的蛋白质定量，并调整样品体积以标准化蛋白质浓度。如上所述在人造食物上进行生物测定法。测定法中包括非转基因拟南芥和/或缓冲液和水作为背景检验处理。

实施例8

用于生成超二元载体的土壤杆菌转化

土壤杆菌超二元系统方便地用于转化单子叶植物宿主。用于构建和验证超二元载体的方法是完善建立的。参见例如欧洲专利No.EP604662B1和美国专利No.7060876。使用标准分子生物学和微生物学方法来生成超二元质粒。使用上文关于二元载体描述的方法来进行超二元质粒的结构的检验/验证。

实施例9

单子叶植物中DIG-11昆虫毒素和变体的生成

土壤杆菌介导的玉蜀黍转化。将来自High II F1杂交的种子(Armstrong等，1991)种入装有95％Metro-Mix 360无土生长介质(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)和5％粘土/壤土的混合物的5加仑盆中。在温室中使用高压钠和金属卤化物灯的组合以16∶8小时亮∶暗光周期培养植物。为了获得未成熟的F2胚用于转化，实施受控近缘授粉。在授粉后8-10天时分离未成熟的胚，此时胚的大小为大约1.0至2.0mm。

感染和共培养。将玉蜀黍穗表面灭菌，即用液体皂擦洗，在70％乙醇中浸泡2分钟，然后在20％商品化漂白剂(0.1％次氯酸钠)中浸泡30分钟，之后用无菌水漂洗。制备含有超二元载体的土壤杆菌细胞的悬浮液，即将1-2环在含有100mg/L大观霉素，10mg/L四环素，和250mg/L链霉素的YEP固体培养基上于28℃培养2-3天的细菌转移入5mL含有100μM乙酰丁香酮的液体感染培养基(LS基础培养基(Linsmaier和Skoog，1965)，N6维生素(Chu等，1975)，1.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，68.5gm/L蔗糖，36.0gm/L葡萄糖，6mM L-脯氨酸，pH 5.2)中。将溶液漩涡震动直至获得均匀的悬浮液，并使用Klett-Summerson比色计用紫色滤器将浓度调整至终密度200个Klett单位。直接将未成熟胚分离入装有2mL感染培养基的微量离心管中。移除培养基，更换成1mL密度为200个Klett单位的土壤杆菌溶液，并将土壤杆菌和胚溶液于室温温育5分钟，然后转移至共培养培养基(LS基础培养基，N6维生素，1.5mg/L 2，4-D，30.0gm/L蔗糖，6mM L-脯氨酸，0.85mg/LAgNO₃，100μM乙酰丁香酮，3.0gm/L Gellan胶(PhytoTechnologyLaboratories.，Lenexa，KS)，pH 5.8)，在暗条件下于25℃5天。

共培养之后，将胚转移至选择性培养基，之后在大约8周的过程里获得转化隔离群。为了选择经含有植物可表达pat或bar选择标记基因的超二元质粒转化的玉蜀黍组织，使用基于LS的培养基(LS基础培养基，N6维生素，1.5mg/L 2，4-D，0.5gm/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物；PhytoTechnologies Labr.)，30.0gm/L蔗糖，6mM L-脯氨酸，1.0mg/L AgNO₃，250mg/L头孢噻肟，2.5gm/L Gellan胶，pH 5.7)及双丙氨磷(GoldBioTechnology)。将胚转移至含有3mg/L双丙氨磷的选择培养基，直至获得胚胎发生隔离群。通过以2周间隔转移至新鲜的选择培养基来扩大回收的隔离群，用于再生和进一步分析。

玉蜀黍转化领域技术人员会理解，在使用其它植物可表达选择标记基因(例如除草剂耐受基因)时可使用其它选择转化植物的方法。

再生和种子生成。为了再生，将培养物转移至“28”诱导培养基(MS盐和维生素，30gm/L蔗糖，5mg/L苄基氨基嘌呤，0.25mg/L 2，4-D，3mg/L双丙氨磷，250mg/L头孢噻肟，2.5gm/L Gellan胶，pH 5.7)，在低光照条件(14μEm^-2s^-1)下1周，然后在高光照条件(大约89μEm^-2s^-1)下一周。随后将组织转移至“36”再生培养基(与诱导培养基相同，只是缺少植物生长调节剂)。当小植株生长至长度为3-5cm时，将它们转移至装有SHGA培养基(Schenk和Hildebrandt盐和维生素(1972)；PhytoTechnologies Labr.)，1.0gm/L肌肉-肌醇，10gm/L蔗糖和2.0gm/L Gellan胶，pH 5.8)的玻璃培养管以容许芽和根的进一步生长和发育。将植物移植至与上文前面所述相同的土壤混合物，并在温室中培养至开花。为了生成种子进行受控授粉。

实施例10

转基因玉蜀黍的生物测定法

通过常规生物测定方法来证明植物细胞中生成的DIG-11昆虫毒素和变体的生物活性(参见例如Huang等，2006)。能够例如通过在受控喂养环境中给靶昆虫喂食生成DIG-11昆虫毒素的植物所衍生的各种植物组织或组织碎片来证明功效。或者，可以自生成DIG-11昆虫毒素的植物所衍生的各种植物组织制备蛋白质提取物，并将提取的蛋白质并入本文中前面描述的人造食物生物测定法。要理解，将此类喂养测定法的结果与采用来自不生成DIG-11昆虫毒素或变体的宿主植物的适宜对照组织或其它对照样品类似进行的上文测定法比较。

参考文献

An，G.，Watson，B.D.，Stachel，S.，Gordon，M.P.，Nester，E.W.(1985)New cloningvehicles for transformation of higher plants.EMBO J.4：277-284.

Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.，Lipman，D.J.(1990)Basic localalignment search tool.J.Mol.Biol.215：403-410.

Altschul，S.F.，Madden，T.L.，

A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.，Lipman，D.J.(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database searchprograms.Nucl.Acids Res.25：3389-3402.

Armstrong，C.L.，Green，C.E.，Phillips，R.L.(1991)Development and availability ofgermplasm with high TypeII culture formation response.Maize Genet.Coop.Newslett.65：92-93.

Aronson，A.I.，Han，E.-S.，McGaughey，W.，Johnson，D.(1991)The solubility ofinclusion proteins from Bacillus thuringiensis is dependent upon protoxin composition and is afactor in toxicity to insects.Appl.Environ.Microbiol.57：981-986.

Aronson，A.I.，Geng，C.，Wu.L.(1999)Aggregation of Bacillus thuringiensis Cry1Atoxins upon binding to target insect larval midgut vesicles.Appl.Environ.Microbiol.65：2503-2507.

Arvidson，H.，Dunn，P.E.，Strand，S.，Aronson，A.I.(1989)Specificity of Bacillisthuringiensis for lepidopteran larvae：factors involved in vivo and in the structure of a purifiedtoxin.Molec.Microbiol.3：1533-1543.

Ausubel et al.，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2(GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York).

Bailey，J.M.，Shenov，N.R.，Ronk，M.，and Shively，J.E.，(1992)Automatedcarboxy-terminal sequence analysis of peptides.Protein Sci.1：68-80.

Beltz，G.A.，Jacobs，K.A.，Eickbush，T.H.，Cherbas，P.T.，Kafatos，F.C.(1983)Isolationof multigene families and determination of homologies by filter hybridization methods.In Wu，R.，Grossman，L.，Moldave，K.(eds.)Methods of Enzymology，Vol.100 Academic Press，NewYork pp.266-285.

Bown，D.P.，Wilkinson，H.S.，Jongsma，M.A.，Gatehouse，J.A.(2004)Characterisationof cysteine proteinases responsible for digestive proteolysis in guts of larval western cornrootworm(Diabrotica virgifera)by expression in the yeast Pichia pastoris.Insect Biochem.Molec.Biol.34，：305-320.

Bravo，A.，Gill，S.S.，Soberon，M.(2007)Mode of action of Bacillus thuringiensis Cryand Cyt toxins and their potential for insect control.Toxicon 49：423-435.

Caruthers，M.H.，Kierzek，R.，Tang，J.Y.(1987)Synthesis of oligonucleotides using thephosphoramidite method.Bioactive Molecules(Biophosphates Their Analogues)3：3-21.

Christeller，J.T.，Laing，W.A.，Markwick，N.P.，Burgess，E.P.J.(1992)Midgut proteaseactivities in 12 phytophagous lepidopteran larvae：dietary and protease inhibitor interactions.Insect Biochem.Molec.Biol.22：735-746.

Chu，C.C.，Wand，C.C.，Sun，C.S.，Hsu，C.，Yin，K.C.，Chu，C.Y.，Bi，F.Y.(1975)Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experimentson the nitrogen sources.Scientia Sinica 18：659-668.

Crameri，A.，Cwirla，S.，Stemmer，W.P.C.(1996a)Construction and evolution ofantibody-phage libraries by DNA shuffling.Nat.Med.2：100-103.

Crameri，A.，Dawes，G.，Rodriguez，E.，Silver，S.，Stemmer，W.P.C.(1997)Molecularevolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling.Nat.Biotech.15：436-438.

Crameri，A.，Whitehom，E.A.，Tate，E.，Stemmer，W.P.C.(1996b)Improved greenfluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling.Nat.Biotech.14：315-319.

de Maagd，R.A.，Kwa，M.S.，van der Klei，H.，Yamamoto，T.，Schipper，B.，Vlak，J.M.，Stiekema，W.J.，Bosch，D.(1996)Domain III substitution in Bacillus thuringiensisdelta-endotoxin CryIA(b)results in superior toxicity for Spodoptera exigua and altered membraneprotein recognition.Appl.Environ.Microbiol.62：1537-1543.

de Maagd，R.A.，Bravo，A.，Berry，C.，Crickmore，N.，Schnepf，E.(2003)Structure，diversity，and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria.Annu.Rev.Genet.37：409-433.

Diaz-Mendoza，M.，Farinos，G.P.，Castanera，P.，Hernandez-Crespo，P.，Ortego，F.(2007)Proteolytic processing of native Cry1Ab toxin by midgut extracts and purified trypsins from theMediterranean corn borer Sesamia nonagrioide.J.Insect Physiol.53：428-435.

Ellis，R.T.，Stockhoff，B.A.，Stamp，L.，Schnepf，H.E.，Schwab，G.E.，Knuth，M.，Russell，J.，Cardineau，G.A.，Narva，K.E.(2002)Novel Bacillus thuringiensis binary insecticidalcrystal proteins active on western corn rootworm，Diabrotica virgifera virgifera LeConte.Appl.Environ.Microbiol.68：1137-1145.

Englemann，F.，Geraerts，W.P.M.，(1980)The proteases and the protease inhibitor in themidgut of Leucophaea maderae.J.Insect Physiol.261：703-710.

Fraley，R.T.，Rogers，S.G.，Horsch，R.B.(1986)Genetic transformation in higher plants.Crit.Rev.Plant Sci.4：1-46.

Gazit，E.，La Rocca，P.，Sansom，M.S.P.，Shai，Y.(1998)The structure and organizationwithin the membrane of the helices composing the pore-forming domain of Baicllus thuringiensisdelta-endotoxin are consistent with an″umbrella-like″structure of the pore.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：12289-12294.

Ge，A.，Rivers，D.，Milne，R.，Dean，D.H.(1991)Functional domains of Bacillusthuringiensis insecticidal crystal proteins.Refinement of Heliothis virescens and Trichoplusia nispecificity domains on CryIA(c).J.Biol.Chem.266：17954-17958.

Gillikin，J.W.，Bevilacqua，S.，Graham，J.S.(1992)Partial characterization of digestivetract proteinases from western corn rootworm larvae，Diabrotica virgifera.Arch.Insect Biochem.Physiol.19：285-298.

Gomez，I.，Sanchez，J.，Miranda，R.，Bravo，A.，Soberon，M.(2002)Cadherin-likereceptor binding facilitates proteolytic cleavage of helix alpha-1 in domain I and oligomerpre-pore formation of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin.FEBS Lett.513：242-246.

Haider，M.Z.，Knowles，B.H.，Ellar，D.J.(1986)Specificity of Bacillus thuringiensisvar.colmeri insecticidal δ-endotoxin is determined by differential proteolytic processing of theprotoxin by larval gut proteases.Eur.J.Biochem.156：531-540.

Heckel，D.G.，Gahan，L.J.，Baxter，S.W.，Zhao，J-Z.，Shelton，A.M.，Gould，F.，Tabashnik，B.E.(2007)The diversity of Bt resistance genes in species of Lepidoptera.J.Invert.Pathol.95：192-197.

Hepburn，A.G.，White，J.，Pearson，L.，Maunders，M.J.，Clarke，L.E.，Prescott，A.G.Blundy，K.S.(1985)The use of pNJ5000 as an intermediate vector for the genetic manipulationof Agrobacterium Ti-plasmids.J.Gen.Microbiol.131：2961-2969.

Hoagland，D.R.，Arnon，D.I.(1950)The water-culture method of growing plants withoutsoil.Calif.Agr.Expt.Sta.Circ.347.

Hofte，H.，de Greve，H.，Seurinck，J.，Jansens，S.，Mahillon，J.，Ampe，C.，Vandekerckhove，J.，Vanderbruggen，H.，van Montagu，M.，Zabeau，M.，Vaeck，M.(1986)“Structural and functional analysis of a cloned delta endotoxin of Bacillus thuringiensis berliner1715.”Eur.J.Biochem.161：273-280.

Honée，G.，Convents，D.，Van Rie，J.，Jansens，S.，Peferoen，M.，Visser，B.(1991)TheC-terminal domain of the toxic fragment of a Bacillus thuringiensis crystal protein determinesreceptor binding.Mol.Microbiol.5：2799-2806

Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.，Pease，L.R.(1989)Engineering hybridgenes without the use of restriction enzymes：gene splicing by overlap extension.Gene 77：61-68.

Huang，F.，Rogers，L.B.，Rhett，G.H.(2006)Comparative susceptibility of Europeancorn borer，southwestern corn borer，and sugarcane borer(Lepidoptera：Crambidae)to Cry1Abprotein in a commercial Bacillus thuringiensis corn hybrid.J.Econ.Entomol.99：194-202.

Huang，K-X.，Badger，M.，Haney，K.，Evans，S.L.(2007)Large scale production ofBacillus thuringiensis PS149B1 insecticidal proteins Cry34Ab1 and Cry35Ab1 fromPseudomonas fluorescens.Prot.Express.Purific.53：325-330.

Janmaat，A.F.，Myers，A.H.(2003)Rapid evolution and the cost of resistance to Bacillusthuringiensis in greenhouse populations of cabbage loopers，Trichoplusia ni.Proc.Royal Soc.London.Ser.B，Biolog.Sci.270：2263-2270.

Janmaat，A.F.，Myers，A.H.(2005)The cost of resistance to Bacillus thuringiensis varieswith the host plant of Trichoplusia ni.Proc.Royal Soc.London.Ser.B，Biolog.Sci.272：1031-1038.

Karlin，S.，Altschul，S.F.(1990)Methods for assessing the statistical significance ofmolecular sequence features by using general scoring schemes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-2268.

Karlin，S.，Altschul，S.F.(1993)Applications and statistics for multiple high-scoringsegments in molecular sequences.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877.

Keller，G.H.，Manak，M.M.(1993)DNA Probes，Background，Applications，Procedures.Stockton Press，New York，NY.

Knight，J.S.，Broadwell，A.H.，Grant，W.N.，Shoemaker，C.B.(2004)A Strategy forShuffling Numerous Bacillus thuringiensis Crystal Protein Domains.J.Econ.Entomol.97：1805-1813.

Koiwa，H.，Shade，R.E.，Zhu-Salzman，K.，D′Urzo，M.P.，Murdock，L.L.，Bressan，R.A.，Hasegawa，P.M.(2000)A plant defensive cystatin(soyacystatin)targets cathepsin L-likedigestive cysteine proteinases(DvCALs)in the larval midgut of western corn rootwormDiabrotica virgifera virgifera.FEBS Letters 471：67-70.

Larson，S.M.，England，J.L.，Desjarlais，J.R.，Pande，V.S.(2002)Thoroughly samplingsequence space：Large-scale protein design of structural ensembles.Protein Sci.11：2804-2813.

Lee，L.-Y.，Gelvin，S.B.(2008)T-DNA binary vectors and systems.Plant Physiol.146：325-332.

Linsmaier，E.M.，Skoog，F.(1965)Organic growth factor requirements of tobacco tissue.Physiologia Plantarum 18：100-127.

Littlefield，J.W.(1964)Selection of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and theirpresumed recombinants.Science 145：709-710.

Meinkoth，J.，Wahl，G.(1984)Hybridization of nucleic acids immobilized on solidsupports.Anal.Biochem.138：267-284.

Metcalf，R.L.(1986)The ecology of insecticides and the chemical control of insects.pp.251-297.In(Marcos Kogan(ed.))Ecological theory and integrated pest management practice.John Wiley & Sons，N.Y.362pp.

Moellenbeck，D.J.，Peters，M.L.，Bing，J.W.，Rouse，J.R.，Higgins，L.S.，Sims，L.，Nevshemal，T.，Marshall，L.，Ellis，R.T.，Bystrak，P.G.，Lang，B.A.，Stewart，J.L.，Kouba，K.，Sondag，V.，Gustafson，V.，Nour，K.，Xu，D.，Swenson，J.，Zhang，J.，Czapla，T.，Schwab，G.，Jayne，S.，Stockhoff，B.A.，Narva，K.，Schnepf，H.E.，Stelman，S.J.，Poutre，C.，Koziel，M.，Duck，N.(2001)Insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis protect corn from cornrootworms.Nat.Biotech.19：668-672.

Myers，E.，Miller，W.(1988)Optimal alignments in linear space.CABIOS 4：11-17.

Naimov，S.，Weemen-Hendriks，M.，Dukiandjiev，S.，de Maagd，R.A.(2001)Bacillusthuringiensis delta-endotoxin Cry1 hybrid proteins with increased activity against the ColoradoPotato Beetle.Appl.Environ.Microbiol.11：5328-5330.

Needleman，S.B.，Wunsch，C.D.(1970)A general method applicable to the search forsimilarities in the amino acid sequence of two proteins.J.Mol.Biol.48：443-453.

Nunez-Valdez，M.-E.，Sanchez，J.，Lina，L.，Guereca，L.，Bravo，A.(2001)Structural andfunctional studies of alpha-helix 5 region from Bacillus thuringiensis Cry1Ab delta-endotoxin.Biochim.Biophys.Acta，Prot.Struc.Molec.Enzymol.1546：122-131.

Ochoa-Campuzano，C.，Real，M.D.，Martinez-Ramirez，A.C.，Bravo，A.，Rausell，C.(2007)An ADAM metalloprotease is a Cry3Aa Bacillus thuringiensis toxin receptor.Biochem.Biophys.Res.Commun.362：437-442.

Pigott，C.R.，Ellar，D.J.(2007)Role of receptors in Bacillus thuringiensiscrystal toxinactivity.Microbiol.Molec.Biol.Rev.71：255-281.

Rang，C.，Vachon，V.，de Maagd，R.A.，Villalon，M.，Schwartz，J.-L.，Bosch，D.，Frutos，R.，Laprade R.(1999)Interaction between functional domains of Bacillus thuringiensisinsecticidal crystal proteins.Appl.Environ.Microbiol.65：2918-2925.

Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.)

Schenk，R.U.，Hildebrandt，A.C.(1972)Medium and techniques for induction andgrowth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.Can.J.Bot.50：199-204

Schnepf，H.E.，Tomczak，K.，Ortega，J.P.，Whiteley，H.R.(1990)Specificity-determining regions of a Lepidopteran-specific insecticidal protein produced byBacillus thuringiensis.J.Biol.Chem.265：20923-20930.

Soberon，M.，Pardo-Lopez，L.，Lopez，I.，Gomez，I.，Tabashnik，B.E.，Bravo，A.(2007)Engineering modified Bt toxins to counter insect resistance.Science 318：1640-1642.

Squires，C.H.，Retallack，D.M.，Chew，L.C.，Ramseier，T.M.，Schneider，J.C.，Talbot，H.W.(2004)Heterologous protein production in P.fluorescens.Bioprocess Intern.2：54-59.

Stemmer，W.P.C.(1994a)DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：invitro recombination for molecular evolution.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751

Stemmer，W.P.C.(1994b)Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.Nature 370：389-391.

Stemmer，W.P.C.(1995)Searching sequence space.Bio/Technology 13：549-553.

Stewart，L.(2007)Gene synthesis for protein production.Encylopedia of Life Sciences.John Wiley and Sons，Ltd.

Stewart，L.，Burgin，A.B.，(2005)Whole gene synthesis：a gene-o-matic future.Frontiersin Drug Design and Discovery 1：297-341.

Suggs，S.V.，Miyake，T.，Kawashime，E.H.，Johnson，M.J.，Itakura，K.，R.B.Wallace，R.B.(1981)ICN-UCLA Symposium.Dev.Biol.Using Purified Genes，D.D.Brown [ed.]，Academic Press，New York，23：683-69

Tabashnik，B.E.，Finson，N.，Groeters，F.R.，Moar，W.J.，Johnson，M.W.，Luo，K.，Adang，M.J.(1994)Reversal of resistance to Bacillus thuringiensis in Plutella xylostella.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：4120-4124.

Tabashnik，B.E.，Gassmann，A.J.，Crowder，D.W.，Carriere，T.(2008)Insect resistanceto Bt crops：evidence versus theory.Nat.Biotech.26：199-202.

Taggart，R.T.，Samloff，I.M.(1983)Stable antibody-producing murine hybridomas.Science 219：1228-1230.

Thie，N.M.R.，Houseman J.G.(1990)Identification of cathepsin B，D and H in the larvalmidgut of Colorado potato beetle，Leptinotarsa decemlineata say(Coleoptera：Chrysomelidae)Insect Biochem.20：313-318.

Thompson，J.D.，Higgins，D.G.，Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucl.Acids Res.22：4673-4680.

Tijssen，P.(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2.P.C.van der Vliet [ed.]，(Elsevier，N.Y.)

Varshavsky，A.(1997)The N-end rule pathway of protein degradation.Genes to Cells2：13-28.

Vaughn，T.，Cavato，T.，Brar，G.，Coombe，T.，DeGooyer，T.，Ford，S.，Groth，M.，Howe，A.，Johnson，S.，Kolacz，K.，Pilcher，C.，Prucell，J.，Romano，C.，English，L.，Pershing，J.(2005)Amethod of controlling corn rootworm feeding using a Bacillus thuringiensis protein expressed intransgenic maize.Crop.Sci.45：931-938.

Walters，F.S.，Slatin，S.L.，Kulesza，C.A.，English，L.H.(1993)Ion channel activity ofN-terminal fragments from CryIA(c)delta-endotoxin.Biochem.Biophys.Res.Commun.196：921-926.

Walters，F.S.，Stacy，C.M.，Lee，M.K.，Palekar，N.，Chen，J.S.(2008)An engineeredchymotrypsin/cathepsin G site in domain I renders Bacillus thuringiensis Cry3A active againstwestern corn rootworm larvae.Appl.Environ.Microbiol.74：367-374.

Wehrmann，A.，Van Vliet，A.，Opsomer，C.，Botterman，J.，Schulz，A.(1996)Thesimilarities of bar and pat gene products make them equally applicable for plant engineers.Nat.Biotechnol.14：1274-1278.

Weigel，D.，Glazebrook，J.[eds.](2002)Arabidopsis：A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY，354 pages.

Wolfson，J.L.，Murdock，L.L.(1990)Diversity in digestive proteinase activity amonginsects.J.Chem.Ecol.16：1089-1102.

Worley，C.K.，Ling，R.，Callis，J.(1998)Engineering in vivo instability of fireflyluciferase and Escherichia coli β-glucuronidase in higher plants using recognition elements fromthe ubiquitin pathway.Plant Molec.Biol.37：337-347.