MX2011013675A - Toxinas cry dig-11 insecticidas. - Google Patents

Abstract

Se describen las toxinas Cry DIG-11, los polinucleótidos que codifican dichas toxinas, el uso de tales toxinas para controlar las plagas y las plantas transgénicas que producen tales toxinas.

Description

TOXINAS CRY DIG-11 INSECTICIDAS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta Solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U.A. 61/187,460, presentada el 16 de junio de 2009, que se incorpora expresamente a la presente por referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a nuevas toxinas Cry insecticidas y a su uso para controlar insectos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria que proviene del suelo que produce proteínas cristal plaguicidas conocidas como endotoxinas delta o proteínas Cry. Las proteínas Cry son productos tóxicos orales que funcionan al actuar en células del intestino medio de insectos susceptibles. Se ha demostrado que algunas toxinas Cry tienen actividad contra nematodos. Una lista extensa de endotoxinas delta se mantiene y se actualiza regularmente en http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html.

El gusano de raíz del maíz occidental (WCR, por sus siglas en inglés), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, es una plaga del maíz económicamente importante que provoca una pérdida de ingresos estimada de 1 mil millones cada año en Norteamérica causada por la pérdida de rendimiento del cultivo y gastos para el manejo de insectos (Metcalf 1986). Las prácticas del manejo de WCR incluyen la rotación de cultivos con soya, insecticidas químicos y, más recientemente, cultivos transgénicos que expresan proteínas Cry de B.t. Sin embargo, hasta la fecha sólo algunos ejemplos de proteínas Cry de B.t. proporcionan niveles comerciales de eficacia contra WCR, incluyendo Cry34Ab1/Cry35Ab1 (Ellis et al., 2002), Cry3Aa1 modificadas (Walters et al., 2008) y Cry3Bb1 modificadas (Vaughn et al., 2005). Estas proteínas de B.t. son altamente efectivas para evitar el daño de la raíz del maíz de WCR cuando se producen en raíces de maíz transgénico (Moellenbeck et al., 2001 , Vaughn et al., 2005, Patente de E.U.A No. 7361813).

A pesar del éxito del maíz transgénico resistente a WCR, varios factores crean la necesidad de descubrir y desarrollar nuevas proteínas Cry para controlar WCR. En primer lugar, aunque la producción de las proteínas Cry actualmente desplegadas en plantas de maíz transgénico proporciona protección sólida contra el daño de la raíz de WCR, protegiendo así la producción del grano, algunos WCR adultos surgen en ensayos de infestación artificiales, indicando menos del control de insectos larval completo. En segundo lugar, el desarrollo de poblaciones de insectos resistentes amenaza la durabilidad a largo plazo de las proteínas Cry en el control del gusano de raíz. Los insectos lepidópteros resistentes a las proteínas Cry se han desarrollado en el campo para Plutella xylostella (Tabashnik, 1994), Tríchoplusia ni (Janmaat y yers 2003, 2005), y Helicoverpa zeae (Tabashnik et al., 2008). La resistencia de los insectos a las proteínas Cry de B.t. se puede desarrollar a través de varios mecanismos (Heckel et al., (2007), Pigott y Ellar, 2007). Múltiples clases de proteínas receptoras para proteínas Cry se han identificado dentro de insectos, y existen múltiples ejemplos dentro de cada clase receptora. Se puede desarrollar resistencia a una proteína Cry particular, por ejemplo, por medio de una mutación dentro de la porción de unión a toxina de un dominio de cadherina de una proteína receptora. Un medio adicional de resistencia puede mediarse a través de una proteasa de procesamiento de protoxina. La resistencia a toxinas Cry en especies de Lepidópteros tiene una base genética compleja, con por lo menos cuatro genes de resistencia mayor, diferentes. De igual manera, se predicen múltiples genes para controlar la resistencia a toxinas Cry en especies de Coleóptera. El desarrollo de nuevas proteínas Cry de alta potencia proporcionará herramientas adicionales para el manejo de WCR. Se pueden producir proteínas Cry con modos diferentes de acción en combinación en maíz transgénico para prevenir el desarrollo de la resistencia de insectos a WCR y proteger la utilidad a largo plazo de tecnología de B.t. para el control de gusanos de raíz.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona toxinas Cry insecticidas, incluyendo la toxina de proteína designada en la presente como DIG-1 1 como también variantes de DIG-11 , ácidos nucleicos que codifican estas toxinas, métodos para controlar las plagas utilizando las toxinas, métodos para producir las toxinas en células hospederas transgénicas, y plantas transgénicas que expresan las toxinas. La secuencia de aminoácidos predicha de la proteína DIG-1 1 tipo silvestre se da en la SEQ ID NO: 2.

La presente invención proporciona proteínas funcionales fáciles de administrar. La presente invención también proporciona un método para suministrar toxinas de insectos que son funcionalmente activas y efectivas contra muchas órdenes de insectos, preferiblemente insectos coleópteros. Por "actividad funcional" (o "activo contra") se entiende en la presente que las toxinas de proteínas funcionan como agentes de control de insectos oralmente activos (solos o en combinación con otras proteínas), que las proteínas tienen un efecto tóxico (solas o en combinación con otras proteínas), o son capaces de interrumpir o disuadir el crecimiento y/o alimentación de los insectos que puede o no causar la muerte del insecto. Cuando un insecto entra en contacto con una cantidad efectiva de una "toxina" de la invención en cuestión suministrada por medio de expresión de plantas transgénicas, composición(es) proteicas formuladas, composición(es) proteicas asperjables, una matriz de cebo u otro sistema de suministro, normalmente los resultados son la muerte del insecto, inhibición del crecimiento y/o proliferación del insecto y/o prevención de los insectos de alimentarse de la fuente (preferiblemente una planta transgénica) que hace que las toxinas estén disponibles para los insectos. Proteínas funcionales de la invención en cuestión también pueden trabajar juntas o solas para aumentar o mejorar la actividad de una o más de las otras proteínas de toxinas. Los términos "tóxico", "toxicidad" o "toxina" como se utiliza en la presente quieren expresar que las "toxinas" en cuestión tienen "actividad funcional" como se define en la presente.

Se prefiere la letalidad completa para alimentar insectos, pero no es necesario lograr actividad funcional. Si un insecto evita la toxina o se deja de alimentar, esa abstención será útil en algunas aplicaciones, incluso si los efectos son subletales o la letalidad se retrasa o es indirecta. Por ejemplo, si se desean plantas transgénicas resistentes a insectos, la renuencia de los insectos a alimentarse de las plantas es tan útil como la toxicidad letal para los insectos debido a que el objetivo final es evitar el daño en plantas inducido por insectos.

Como se describió en el ejemplo 1 , un ácido nucleico que codifica la proteína DIG-1 1 se aisló de la cepa de B.t. internamente designada por Dow AgroSciences LLC como PS184M1. Se determinó la secuencia de ácido nucleico para la región codificadora de longitud completa y se dedujo la secuencia de proteína de longitud completa de la secuencia de ácido nucleico. La proteína DIG-11 tiene alguna similitud con Cry7Ab3 (No. de Acceso de Genbank ABX24522.1 ) y otras proteínas tipo Cry7 de S. thuringiensis (http://wwwJifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html).

Variantes activas de insectos de la toxina DIG-1 1 también se describen aquí, y se refieren colectivamente como toxinas de insectos DIG-11. Variantes individuales de toxinas DIG-1 1 de insectos pueden identificarse por nomenclatura DIG- específica. Las toxinas se pueden utilizar solas o en combinación con otras toxinas Cry, tales como Cry34Ab1/Cry35Ab1 (DAS-59 22-7), Cry3Bb1 (MON88017), Cry3A (MIR604), Cry1Ab/Cry3Aa quiméricas (FR8A, WO 2008/121633 A1 ), CryET33 y CryET34, ViplA, Cryl la, CryET84, CryET80, CryET76, CryET71 , CryET69, CryET75, CryET39, CryET79, y CryET74 para controlar el desarrollo de poblaciones de insectos coleópteros resistentes.

Las toxinas DIG-1 1 de insectos también pueden utilizarse en combinación con metodologías de ARNi para controlar otras plagas de insectos. Por ejemplo, las toxinas DIG- 1 de insectos se pueden utilizar en plantas transgénicas en combinación con un ARNds para la supresión de un gen esencial en gusanos de raíz del maíz o un gen esencial en una plaga de insectos. Dichos genes objetivo incluyen, por ejemplo, ATPasa vacuolar, ARF- , Act42A, CHD3, EF-1a, y TFIIB. Un ejemplo de un gen objetivo adecuado es ATPasa vacuolar, como se describe en WO2007/035650.

En una modalidad la invención proporciona un polipéptido de toxina DIG-3 de insecto aislado que comprende un segmento de toxina del núcleo seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 142 a 664 de SEQ ID NO:2; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos 142 a 664 de SEQ ID NO:2; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de residuos 142 a 664 de SEQ ID NO. 2 con hasta 20 sustituciones, supresiones o modificaciones de aminoácidos que no afectan adversamente la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2; o un fragmento insecticidamente activo del mismo.

En otra modalidad la invención proporciona un polipéptido de toxina DIG-1 1 de insecto aislado que comprende un segmento de toxina del núcleo DIG-1 1 seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 664 de SEQ ID NO:2; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de residuos 1 a 664 de SEQ ID NO:2; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 664 de SEQ ID NO: 2 con hasta 20 sustituciones, supresiones o modificaciones de aminoácidos que no afectan adversamente la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2; o un fragmento insecticidamente activo del mismo.

En otra modalidad la invención proporciona un polipéptido de toxina DIG-1 1 de insecto aislado que comprende un segmento de toxina del núcleo DIG-1 1 seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido que comprende la secuencia,de aminoácidos de residuos 142 a 164 de SEQ ID NO:2; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos 142 a 1 164 de SEQ ID NO:2; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de residuos 142 a 1164 de SEQ ID NO: 2 con hasta 20 sustituciones, supresiones o modificaciones de aminoácidos que no afectan adversamente la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2; o un fragmento insecticidamente activo del mismo.

En otra modalidad la invención proporciona un polipéptido de toxina DIG- de insecto aislado que comprende un segmento de toxina del núcleo DIG-1 1 seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 1 164 de SEQ ID NO:2; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 1 164 de SEQ ID NO:2; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 1 164 de SEQ ID NO: 2 con hasta 20 sustituciones, supresiones o modificaciones de aminoácidos que no afectan adversamente la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2; o un fragmento insecticidamente activo del mismo.

En otra modalidad la invención proporciona una planta que comprende una toxina DIG-1 1 de insecto.

En otra modalidad la invención proporciona un método para controlar una población de plagas que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad plaguicidamente efectiva de una toxina DIG- de insecto.

En otra modalidad, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una toxina DIG-1 1.

En otra modalidad la invención proporciona una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una toxina DIG-1 1 de insecto enlazada operativamente a un promotor que no se deriva de Bacillus thuringiensis y es capaz de impulsar la expresión en una planta. La invención también proporciona una planta transgénica que comprende la construcción de ADN incorporada de manera estable en su genoma y un método para proteger a una planta de una plaga que comprende introducir la construcción en dicha planta.

BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO:1 secuencia de ADN que codifica la toxina DIG-1 1 de insecto de longitud completa; 3492 nt.

SEQ ID NO:2 Secuencia de la proteína DIG-1 1 de longitud completa; 164 aa.

SEQ ID NO:3 secuencia de ADN optimizada con maíz que codifica DIG-84, una toxina del núcleo DIG- 1 ; 1992 nt.

SEQ ID NO:4 Segmento de protoxína CrylAb; 545 aa. SEQ ID NO:5 Toxina quimérica: segmento de toxina del núcleo DIG-84/segmento de protoxina CrylAb; 1209 aa.

SEQ ID NO:6 Secuencia de ADN optimizada con dicotiledónea que codifica el segmento de protoxina CrylAb; 1635 nt SEQ ID NO:7 Secuencia de ADN optimizada con maíz que codifica el segmento de protoxina CrylAb; 1635 nt DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Toxinas DIG-1 1 de insectos, y variantes activas de insectos Además de la toxina DIG-1 1 de insecto de longitud completa de SEQ ID NO:2, la invención abarca variantes activas de insectos. Por el término "variante" los solicitantes tienen el propósito de incluir fragmentos, ciertos mutantes de supresión e introducción, y ciertas proteínas de fusión.

La proteína DIG- 1 es una toxina Cry de tres dominios clásica. Como un preámbulo para describir las variantes de la toxina DIG- 1 de insecto que se incluyen en la invención, será útil revisar brevemente la arquitectura de toxinas Cry de tres dominios en general y de la toxina DIG-11 de insecto en particular.

La mayoría de las moléculas de proteína cristal de endotoxina delta Bacillus thuríngiensis se componen de dos segmentos funcionales. La toxina del núcleo resistente a proteasa es el primer segmento y corresponde a aproximadamente la primera mitad de la molécula de la proteína. La molécula de protoxina de ~130 kDa completa se procesa rápidamente con el segmento del núcleo resistente por las proteasas en el intestino del insecto. El segmento que se suprime por medio de este procesamiento se mencionará en la presente como el "segmento de protoxina." Se cree que el segmento de protoxina participa en la formación de cristal de toxina (Arvidson et a/., (1989). El segmento de protoxina puede de esta manera transportar una especificidad de insectos parcial para la toxina limitando la accesibilidad del núcleo al insecto reduciendo el procesamiento de la proteasa de la molécula de toxina (Haider et Al,. (1986) o reduciendo la solubilidad de la toxina (Aronson er al., (1991). Las toxinas B.t. incluso dentro de una cierta clase, varían hasta cierto punto en cuanto al largo y en la ubicación precisa de la transición desde la porción de la toxina del núcleo a la porción de la protoxina. La transición de la porción de la toxina del núcleo a la porción de la protoxina ocurrirá típicamente entre alrededor de 50% a aproximadamente 60% de la toxina de longitud completa. SEQ ID NO: 2 describe la secuencia de 1 164 aminoácidos del polipéptido DIG-1 1 de longitud completa, de los cuales los 664 aminoácidos N-terminales comprenden el segmento de toxina de núcleo DIG-84 de la proteína DIG-1 1. Los 1992 nucleótidos 5'-term¡nales de SEQ ID NO: 1 comprenden la región de codificadora para el segmento de toxina del núcleo DIG-84.

Las estructuras cristal tridimensionales se han determinado por Cry1Aa1 , Cry2Aa1 , Cry3Aa1 , Cry3Bb1 , Cry4Aa, Cry4Ba y Cry8Ea1 . Estas estructuras para las toxinas del núcleo son notablemente semejantes y están comprendidas por tres dominios diferentes con las características descritas abajo (revisado en Maagd et al., 2003).

El dominio I es un conjunto de siete hélices alfa en donde la hélice cinco está rodeada por seis hélices anfipáticas. Este dominio ha sido implicado en la formación del poro y comparte la homología con otras proteínas formadoras de poros que incluyen hemolisinas y colicinas. El dominio I de la proteína DIG-1 1 comprende residuos de aminoácidos 86 a 306 de SEQ ID NO:2.

El dominio II se forma por tres hojas beta anti- paralelas empacadas juntas en un prisma beta. Los bucles de este dominio juegan papeles importantes en la unión de los receptores del intestino medio de los insectos. En las proteínas Cry A, los bucles expuestos en su superficie en los ápices de las hojas beta del dominio II están implicados en la unión a los receptores de cadherina de lepidópteros. Los bucles del dominio II Cry3Aa unen una metaloproteasa relacionada con la membrana de Leptinotarsa decemlineata (Say) (escarabajo de papa de Colorado) en una forma similar (Ochoa-Campuzano et al., 2007). El dominio II comparte homología con ciertas proteínas de unión a carbohidratos incluyendo vitelina y jacalina. El dominio II de la proteína DIG-11 comprende residuos de aminoácidos 31 1 a 508 de SEQ ID NO:2.

El dominio III es un beta-sándwich de dos hojas beta antiparalelas. Estructuralmente este dominio se relaciona con dichos dominios de unión a carbohidratos de proteínas tales como glucanasas, galactosa oxidasa, sialidasa y otros. El dominio III une ciertas clases de proteínas receptoras y quizás participa en la inserción de un pre-poro de toxina oligomérica que interactúa con una segunda clase de receptores, ejemplos de los cuales son aminopeptidasa y alcalín fosfatasa en el caso de proteínas CryIA (Honée et el,. (1991 ), Pígott y Ellar, 2007)). Los receptores del dominio III Cry análogos aún tienen que ser identificados en coleópteros. Los bloques 2 y 3 de la secuencia de B.t. conservada se mapean cerca de la N-terminal y C-terminal del Dominio 2, respectivamente. Por lo tanto, estos bloques 2 y 3 de secuencia conservada son regiones limítrofes aproximadas entre los tres dominios funcionales. Estas regiones de ADN conservado y homología de proteínas se han explotado para diseñar toxinas de B.t. recombinantes (Patente de E.U.A No. 6,090,931 , WO 91/01087, WO 95/06730, WO 1998022595). El dominio III de la proteína DIG-1 1 comprende residuos de aminoácidos 518 a 662 de SEQ ID NO:2.

Se ha reportado que la a-hélice 1 del dominio I se remueve después de la unión del receptor. Aronson et al. (1999) demostró que CryIAc unida a BBMV se protegió de la escisión de la proteinasa K iniciando en el residuo 59, justo después de la a-hélice 1 ; resultados similares se citan para CryIAb. Gómez et al., (2002) encontró que los oligómeros Cry Ab formados tras la unión del receptor BBMV carecían de la porción de la a-hélice 1 del dominio I. También, Soberon et al., (2007) ha demostrado que los mutantes de supresión de N-terminal de CryIAb y CryIAc que carecen de aproximadamente 60 aminoácidos que abarcan la a-hélice 1 en la estructura Cry tridimensional son capaces de ensamblar los monómeros con peso molecular de aproximadamente 60 kDa en pre-poros en ausencia de unión de cadherina. Se reportó que estos mutantes de supresión N-terminal son activos en larvas de insecto resistentes a Cry. Además, Diaz-Mendoza et al., (2007) describió fragmentos CryIAb de 43 kDa y 46 kDa que retuvieron actividad en el taladro mediterráneo del maíz {Sesamia nonagrioides). Se demostró que estos fragmentos incluyen residuos de aminoácidos 1 16 a 423; sin embargo las secuencias precisas de aminoácidos no fueron aclaradas y el mecanismo de actividad de estos fragmentos proteolíticos es desconocido. Los resultados de Gómez et al., (2002), Soberon et al., 2007 y Diaz-Mendoza et al., (2007) contrastan con aquéllos de Hofte et al., (1986), quien reportó que la supresión de 36 aminoácidos de la N-terminal de CryIAb dio como resultado la pérdida de actividad insecticida.

Se ha deducido el principio y el fin de las hélices 1 , 2A, 2B, y 3, y la ubicación de las regiones separadoras entre las mismas en el dominio I de la toxina DIG-1 1 al comparar la secuencia de la proteína DIG-1 con la secuencia de la proteína para Cry8Ea1 , para la cual se conoce la estructura. Estas ubicaciones de describen en el cuadro 1 .

CUADRO 1 Coordenadas del aminoácido de a-hélices proyectadas de la proteína Hélicel separador Hélice 2A separador Hélice2B separador Hélice3 separador Hélice4 Residuos de 82-99 100-102 103-1 17 1 18-126 127-136 137-141 142-171 172-175 176-196 SEQ ID NO:2 Variantes de supresión amino terminales de DIG-1 1 En uno de sus aspectos la invención provee variantes de toxina DIG-1 1 de insecto en donde todas o parte de las hélices 1 , 2A, and 2B se suprimen para mejorar la actividad insecticida y evitar el desarrollo de resistencia a los insectos. Estas modificaciones se hacen para proporcionar variantes DIG-1 1 con atributos mejorados, tal como espectro de plaga objetivo, potencia, y manejo de resistencia de insectos mejorados. En algunas modalidades de la invención en cuestión, las modificaciones en cuestión pueden afectar la eficiencia de la activación de protoxina y la formación de poros, conduciendo a la intoxicación de insectos. Más específicamente, para proporcionar variantes de toxina DIG-1 1 de insectos con atributos mejorados, se describen supresiones progresivas para remover parte del gen que codifica la N-terminal. Las supresiones remueven todo de la a-hélice 1 y todo o parte de la a-hélice 2 en el dominio I, mientras mantiene la integridad estructural de las a-hélices 3 a 7. La invención en cuestión se refiere por lo tanto en parte a las mejoras en la eficacia de la proteína Cry hechas por medio de ingeniería de los componentes a-helicoidales del dominio I para formación de poros más eficiente. Más específicamente, la invención en cuestión se refiere en parte a toxinas de insecto DIG-1 1 mejoradas designadas para tener las supresiones N-terminales en las regiones con homología estructural secundaria putativa a las a-hélices 1 y 2 en el dominio I de las proteínas Cry1.

Las supresiones para mejorar las propiedades insecticidas de las toxinas de insecto DIG-11 pueden iniciar antes del inicio predicho de la a-hélice 2A, y puede terminar después del final de la a-hélice 2B, pero preferiblemente no se extiende en la a-hélice 3.

Al diseñar las secuencias codificantes para las variantes de eliminación N-terminales, un codón de inicio de ATG, que codifica la metionina, se inserta en el extremo 5' de la secuencias de nucleótidos designada para expresar la variante de eliminación. Para secuencias designadas para utilizarse en plantas transgénicas, puede ser benéfico adherirse a la "regla del extremo N" de Varshavsky (1997). Se piensa que algunos aminoácidos pueden contribuir a la inestabilidad de la proteína y a la degradación en células eucarióticas cuando se despliegan como el residuo N- terminal de una proteína. Por ejemplo, los datos recolectados de observaciones en levadura y células de mamíferos indican que los aminoácidos desestabilizantes N-terminales son F, L, W, Y, R, K, H, I, N, Q, D, E y posiblemente P. Mientras los detalles de los mecanismos de degradación de proteína pueden variar algo entre los organismos, la conservación de la identidad de aminoácidos desestabilizantes N-terminales vistos anteriormente sugiere que mecanismos semejantes pueden funcionar en células de plantas. Por ejemplo, Worley et al., (1998) encontró que en plantas, la regla del extremo N incluye residuos básicos y aromáticos. Es posible que la escisión proteolítica por medio de proteasas cerca del inicio de la a-hélice 3 de las presentes proteínas B.t. insecticidas, pueda exponer un aminoácido N-terminal desestabilizante. Dicho procesamiento puede tener como objetivo las proteínas escindidas para un decaimiento rápido y limitar la acumulación de las B.t. proteínas insecticidas a niveles insuficientes para el control efectivo de insectos. Por lo tanto, para las variantes de supresión N-terminal que empiezan con uno de los aminoácidos desestabilizadores, los solicitantes se refieren a la adición de un codón que especifica un aminoácido de G (glicina) entre la metionina de inicio de transición y el aminoácido desestabilízador.

Ejemplo 2 proporciona ejemplos específicos de variantes de supresión amino-terminal de toxinas de insecto DIG-1 1 de acuerdo con la invención.

Toxinas quiméricas Ya se han reportado previamente las proteínas quiméricas que utilizan el dominio de toxina central de una toxina Cry fusionada al segmento de protoxina de otra toxina Cry. Las variantes de DIG-1 1 incluyen toxinas de insecto que comprenden un segmento de toxina central N-terminal de una toxina de insecto DIG-1 1 (que puede ser de longitud completa o puede tener las supresiones N-terminales que se describieron antes) fusionado a un segmento de protoxina heteróloga en algún punto pasando el extremo de la porción de toxina central. La transición al segmento de protoxina heteróloga puede ocurrir en aproximadamente la unión de toxina central/protoxina o, alternativamente, una porción de la protoxina nativa (que se extiende pasando la porción de toxina central) puede ser retenida con la transición a la protoxina heteróloga que ocurre corriente abajo. Por ejemplo, una toxina quimérica de la presente invención tiene un segmento de toxina central completa de DIG-1 1 (/.e. DIG-84; los aminoácidos 1-664 de DIG-1 1) y una protoxina heteróloga (aminoácidos 665 al término C). En una modalidad preferida, la porción heteróloga de la protoxina se deriva de una delta-endotoxina CryIAb, como se ilustra en SEQ ID NO:5.

SEQ ID NO: 4 describe la secuencia de 545 aminoácidos de un segmento de protoxina CryIAb útil en variantes de toxina de insecto DIG-1 1 de la invención. La atención se dirige a los últimos aproximadamente 100 a 150 aminoácidos de este segmento de protoxina, que es más importante incluirlos en la toxina quimérica de la presente invención.

Variantes de sensibilidad a proteasa Normalmente las proteasas de intestino de insecto funcionan para ayudar al insecto a obtener los aminoácios necesarios de la protema de la dieta. Las proteasas digestivas de' insecto mejor entendidas son las proteasas de serina, que parecen ser el tipo más común (Englemann and Geraerts, (1980) , particularmente en la especie lepidópteros. Los insectos coleópteros tienen intestinos más neutrales al ácido que los intestinos de lepidóptero. La mayoría de las larvas y adultos de los coleópteros, por ejemplo el escarabajo de la patata, tienen un intestino medio ligeramente ácido, y las cisteina proteasas proporcionan la mayor actividad proteolítica (Wolfson and Murdock, (1990)). Más precisamente, Thie and Houseman (1990) identificaron y caracterizaron las cisteina proteasas, catepsina tipo B y catepsina tipo H, y la aspartil proteasa, catepsina tipo D, en el escarabajo de la patata. Gillikin ef al., (1992) caracterizaron la actividad proteolítica en el intestino de larvas del gusano de la raíz del maíz, y encontraron principalmente cisteina proteasas. La patente de E.U.A. 7230167 describe que la serina proteasa, catepsina G, existe en el gusano de la raíz del maíz. La diversidad y los diferentes niveles de actividad de las proteasas de intestino de los insectos pueden tener una influencia en la sensibilidad del insecto a una toxina B.t. particular.

En otra modalidad de la invención, los sitios de escisión de proteasa pueden ser diseñados en ubicaciones deseadas para afectar el procesamiento de proteínas dentro del intestino medio de larvas susceptibles a ciertas plagas de insectos. Estos sitios de escisión de proteasa pueden ser introducidos por métodos como la síntesis genética química o empalme por superposición de PCR (Horton et al., 1989). Por ejemplo, las secuencias de reconocimiento de serina proteasa pueden ser insertadas opcionalmente en sitios específicos en la estructura de proteína Cry, para afectar el procesamiento de proteínas en los puntos de supresión deseados en el intestino medio de larvas susceptibles. Las serina proteasas que pueden ser explotadas de esta manera incluyen serina proteasas del intestino medio de lepidópteros, como tripsina o enzimas tipo tripsina, quimiotripsina, elastasa, etc. (Christeller et al., 1992). También, los sitios de supresión identificados empíricamente por medio de la secuenciación de productos de digestión de proteína Cry generados con preparaciones no fraccionadas de proteasa de intestino medio larval, o uniendo a vesículas de la membrana de borde en cepillo, pueden ser diseñados para efectuar la activación de proteínas. Las proteínas Cry modificadas, generadas ya sea por supresión de genes o por la introducción de sitios de escisión de proteasa, tienen una actividad mejorada sobre las plagas de lepidópteros como Ostrinia nubilalis, Diatraea grandiosella, Helicoverpa zea, Agrotis ípsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Diatraea saccharalis, Loxagrotis albicosta, las plagas de coleópteros como el gusano de la raíz del maíz, el escarabajo manchado del maíz, el gusano radicular norteño del maíz (i.e. Diabrotica spp.) y otras plagas objetivo.

Las proteasas de serina de coleóptero, como proteasa tipo G de tripsina, quimiotripsina y catepsina (proteasas tipo B, tipo L, tipo O y tipo K) (Koiwa et al., (2000) y Bown et al. , (2004), metaloproteasas de coleóptero tales como ADAM10 (Ochoa-Campuzano et al., (2007)), y proteasas de ácido aspártico de coleóptero como catepsinas tipo D y tipo E, pepsina, plasmepsina, y quimiosina, también pueden ser explotadas con una modificación genética adecuada de las secuencias de reconocimiento en los sitios de procesamiento deseados para afectar el procesamiento de la proteína Cry dentro del intestino medio de larvas susceptibles de ciertas plagas de insectos.

Una ubicación preferida para la introducción de dichos sitios de escisión de proteasa puede estar dentro de la región "separadora" entre a-hélice2B y a-hélice3, por ejemplo, en los aminoácidos 137 a 141 de la proteína DIG-1 1 de longitud completa (SEQ ID NO:2 y cuadro 1 ). Una segunda ubicación preferida para la introducción de sitios de escisión de proteasa puede estar dentro de la región separadora entre a-hélice3 y cc-hél¡ce4 (cuadro 1 ), por ejemplo, dentro de los aminoácidos 127 a 175 de la proteína DIG-1 1 de longitud completa de SEQ ID NO:2. Las proteínas Cry modificadas que son generadas ya sea por supresión de genes o por introducción de sitios de supresión de proteasa, tienen una actividad mejorada sobre las plagas de insectos incluyendo, pero no están limitadas a, gusano de la raíz del maíz, escarabajo manchado del pepino, gusano radicular norteño del maíz, y similares.

Existen varias tecnologías para hacer posible la determinación de la secuencia de aminoácidos que comprenden los residuos N-terminales o C-terminales de polipéptidos. Por ejemplo, se puede utilizar una metodología automatizada de degradación de Edman, en una forma secuencial, para determinar la secuencia de aminoácidos N-terminal de hasta 30 residuos de aminoácido con una precisión del 98% por residuo. Además, también es posible la determinación de la secuencia de los aminoácidos que comprenden el extremo carboxi de polipéptidos (Bailey et al., (1992); la patente de E.U.A. No. 6046053). Así, en algunas modalidades, se pueden caracterizar proteínas B.t. Cry que han sido activadas por medio de un procesamiento proteolítico, por ejemplo, por proteasas preparadas a partir de intestino de insecto, y se pueden identificar los aminoácidos N-terminales o C-terminales del gragmento de toxina activada. Las variantes de la toxina de insecto DIG-11 , que son producidas por la introducción o eliminación de sitios de procesamiento de proteasa en posiciones apropiadas en la secuencia de codificación, para permitir, o eliminar, la escisión proteolítica de una proteína variante más grande por medio de proteasas de insecto, planta o microorganismo, están dentro del alcance de la invención. Se entenderá que el resultado final de dicha manipulación es la generación de moléculas de fragmento de toxina que tienen la misma, o una mejor actividad que la proteína de toxina intacta (longitud completa).

Dominios de la toxina de insecto DIG-1 1 Se espera que los dominios separados de la toxina de insecto DIG-1 1 , (y variantes que son 90, 95, ó 97% idénticas a dichos dominios) sean útiles en la formación de combinaciones con dominios de otras toxinas Cry para proporcionar nuevas toxinas con un incrementado espectro de toxicidad de plaga, una potencia mejorada o una estabilidad de proteína mejorada. El dominio I de la proteína DIG-1 1 comprende residuos de aminoácidos 86 a 306 de SEQ ID NO:2. El dominio II de la proteína DIG-1 1 comprende residuos de aminoácidos 31 1 a 508 de SEQ ID NO:2. El dominio III de la proteína DIG-1 1 comprende residuos de aminoácidos 518 a 662 de SEQ ID NO:2. La alternancia o intercambio de dominios es otro mecanismo para generar proteínas de delta-endotoxina alteradas. Los dominios II y III pueden ser alternados entre proteínas de delta-endotoxina, dando como resultado toxinas híbridas o quiméricas con una actividad pesticida mejorada o espectro objetivo. El dominio II está involucrado en la unión a receptor, y el dominio III se une a ciertas clases de proteínas receptoras y tal vez participa en la inserción de un pre-poro de toxina oligomérica. Algunas sustituciones del dominio III en otras toxinas han demostrado producir una toxicidad superior contra Spodoptera exigua (de Maagd et al., (1996) y existe una guía para el diseño de alternancia de dominio de la toxina Cry (Knight et al., (2004).

Se conocen bien en la técnica métodos para generar proteínas recombinantes y para probar la actividad pesticida de las mismas (ver, por ejemplo, Naimov et al., (2001 ), de aagd et al., (1996), Ge et al., (1991 ), Schnepf et al., (1990), Rang et al., (1999)). Se ha estudiado la capacidad del dominio I de las proteínas CryIA y Cry3A para insertarse y formar poros en membranas, a-helices 4 y 5 del dominio I juegan un papel importante en la inserción de membrana y en la formación de poro (Walters et al., 1993, Gazit et al., 1998; Nunez-Valdez et al., 2001), con las otras hélices propuestas para hacer contacto con la superficie de membrana como las aristas de un paraguas (Bravo er a/., (2007); Gazit et al., (1998)).

Variantes de toxina de insecto DIG-1 1 creadas marcando un número limitado de supresiones, sustituciones o adiciones de aminoácidos Las supresiones, sustituciones y adiciones de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 se pueden hacer fácilmente de una manera secuencial, y los efectos de dichas variaciones sobre la actividad insecticida se pueden probar por medio de un bioensayo. Dado que el número de cambios es limitado, dicha prueba no comprende una experimentación irracional. La invención incluye variantes activas como insecticidas de la toxina central (los aminoácidos 1-664 de SEQ ID NO:2, o los aminoácidos 142-664 de SEQ ID NO:2) en los cuales se han hecho hasta 10, hasta 15, o hasta 20 adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos.

La invención incluye variantes de toxina de insecto DIG-1 1 que tienen un segmento de toxina central que es 90%, 95% o 97% idéntico a los aminoácidos 1-664 de SEQ ID NO: 2 o amino ácidos 142-664 de SEQ ID NO: 2.

Se pueden hacer variantes haciendo mutaciones aleatorias, o las variantes pueden ser diseñadas. En el caso de mutantes designados, hay una alta probabilidad de generar variantes con actividad similar a la toxina nativa, cuando se mantiene la identidad de aminoácido en regiones críticas de la toxina, lo que ocurre para la actividad biológica, o están involucrados en la configuración tridimensional que finalmente es la responsable de la actividad biológica. También habrá una alta probabilidad de retener la actividad si las sustituciones son conservadoras. Los aminoácidos se pueden dividir en las siguientes clases: no polares, polares sin cambios, básicos y acidicos. Las sustituciones conservadorea por medio de las cuales un aminoácido de una clase en reemplazado con otro aminoácido del mismo tipo, son menos propensas a alterar materialmente la actividad biológica de la variante. El cuadro 2 proporciona una lista de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

CUADRO 2 Clase de Aminoácido Ejemplos de Aminoácidos Cadenas Laterales No polares Ala, Val, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp Cadenas Laterales Polares Sin Carga Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Cadenas Laterales Acidas Asp, Glu Cadenas Laterales Básicas Lys, Arg, His Cadenas Laterales Beta-ramificadas Thr, Val, lie Cadenas Laterales Aromáticas Tyr, Phe, Trp, His En algunos casos también se pueden hacer sustituciones no conservadoras. El factor crítico es que estas sustituciones no se deben apartar significativamente de la actividad biológica de la toxina. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, que siguen teniendo la actividad biológica de la proteína nativa, es decir, que conservan la actividad pesticida.

También se pueden diseñar proteínas variantes que difieran a nivel de secuencia, pero que conserven la misma estructura o una estructura tri-dimensional esencial general similar, la distribución de carga de superficie, y similares. Ver por ej. la patente de E.U.A No. 7058515; Larson et al., (2002); Stemmer (1994a, 1994b, 1995); y Crameri et al., (1996a, 1996b, 1997). Ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados que codifican las toxinas de insecto DIG-1 1 son un aspecto de la presente invención. Éstos incluyen ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO.5, y complementos de las mismas, así como otros ácidos nucleicos que codifican variantes activas en insectos de SEQ ID NO:2. Aspirantes "aislados" significa que las moléculas de ácido nucleico han sido removidas de su ambiente nativo y que han sido colocadas en un ambiente diferente por la mano del hombre. Debido a la redundancia del código genético, una variedad diferente de secuencias de ADN puede codificar las secuencias de aminoácidos que se describen en la presente. Un experto en la técnica tiene la capacidad de crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican a las mismas, o esencialmente las mismas, toxinas.

Síntesis de genes Los genes que codifican las proteínas Cry mejoradas que se describen en la presente, se pueden hacer por medio de una variedad de métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden hacer segmentos sintéticos de gen y genes sintéticos por química de fosfito tri-éster y fosforamidita (Caruthers et al, 1987), y hay proveedores comerciales que están disponibles para realizar síntesis genética en demanda. Los genes de longitud completa pueden ser ensamblados en una variedad de formas que icluyen, por ejemplo, la ligadura de fragmentos de restricción o el ensamble por reacción en cadena de polimerasa de oligonucleótidos traslapados (Stewart y Burgin, 2005). También se pueden hacer supresiones terminales por amplificación de PCR, usando oligonucleótidos terminales de sitio específico.

Los ácidos nucleicos que codifican toxinas de insecto DIG- 1 se pueden hacer, por ejemplo, por medio de construcción sintética por métodos practicados actualmente por varios proveedores comerciales. (Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 74821 19 B2). Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, también pueden ser construidos sintéticamente, por ejemplo, con el uso de un sintetizador genético y el diseño de métodos de, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5380831. Alternativamente, se pueden construir fácilmente variaciones de genes sintéticos o naturales utilizando técnicas biológicas moleculares estándar para hacer mutaciones de punto. También se pueden hacer fragmentos de estos genes, utilizando exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles, de acuerdo con procedimientos estándar. Por ejemplo, se pueden usar enzimas como fía/31 o mutagénesis dirigida a sitio, para cortar sistemáticamente nucleotidos de los extremos de estos genes. También se pueden obtener fragmentos de gen que codifican fragmentos activos de toxina, utilizando una variedad de enzimas de restricción.

Dada la secuencia de aminoácidos para una toxina de insecto DIG-1 1 , se puede diseñar una secuencia de codificación por medio de la traducción inversa de la secuencia de codificación, usando codones preferidos por el hospedero objetivo, y después refinando la secuencia con el uso de codones alternativos para remover las secuencias que pudieran causar problemas, y proporcionando codones de detención periódica para eliminar las largas secuencias de codificación abiertas en los marcos de lectura no codificadores.

Cuantificación de la identidad de secuencia Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias son alineadas con el propósito de una comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (i.e. porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ej. posiciones traslapadas) x100). En una modalidad, las dos secuencias tienen la misma longitud. El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las que se describirán a continuación, dejando o no dejando espacios. Al calcular el porcentaje de identidad de secuencia, se cuentan las coincidencias típicamente exactas.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograrse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de dicho algoritmo es el de AltschuI et al. (1990), y Karlin y AltschuI ( 990), modificado como en Karlin y AltschuI (1993), e incorporado en los programas BLASTN y BLASTX. Las investigaciones de BLAST se pueden usar conveniente para identificar secuencias homologas (similares) a una secuencia de consulta en bases de datos nucléicas o de proteínas. Las investigaciones de BLASTN se pueden realizar, (puntuación = 100, longitud de palabra = 12) para identificar las secuencias nucleotídicas que tienen homología con las moléculas de ácido nucleico reclamadas de la invención. Las investigaciones de BLASTX se pueden realizar (puntuación = 50, longitud de palabra = 3) para identificar las secuencias de aminoácidos que tienen homología con las moléculas de proteína insecticida reclamadas de la invención.

Se puede usar Gapped BLAST AltschuI et al., (1997) para obtener alineaciones con espacios para propósitos de comparación. Alternativamente se puede utilizar el PSI-Blast para realizar una investigación iterada que detecte las relaciones distantes entre moléculas Altschul et al., (1997). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas. Véase www.ncbi.nlm.nih.gov.

Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Thompson et al., (1994). El ClustalW compara las secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o de ADN, y de esta manera puede proporcionar datos sobre la conservación de secuencia de toda la secuencia de aminoácidos y la secuencia nucleotídica. El algoritmo ClustalW se usa en en varios paquetes de software para el análisis de ADN/aminoácidos, como el módulo ALIGNX del programa Vector NTI Program Suite (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Cuando se alinean secuencias de aminoácidos con el ALIGNX, se puede usar convenientemente los ajustes predeterminados con una penalidad abierta de Gap (espacio) de 10, una penalidad de extensión de Gap de 0.1 y la matriz de comparación blosum63mt2 para calcular el porcentaje de similitud de aminoácidos (consenso) o la identidad entre las dos secuencias. Cuando se alinean secuencias de ADN con el ALIGNX, se puede usar convenientemente los ajustes predeterminados con una penalidad abierta de Gap (espacio) de 15, una penalidad de extensión de Gap de 6.6 y la matriz de comparación swgapdnamt para calcular el porcentaje de identidad entre las dos secuencias.

Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático que se usa para la comparación de secuencias, es el de Myers y Miller (1988). Dicho algoritmo está incorporado en el programa wSTRETCHER, que forma parte del paquete de software para alineación de secuencias wEMBOSS (disponible en http://emboss.sourceforge.net/). El wSTRETCHER calcula una alineación óptima global de dos secuencias usando una modificación del clásico algoritmo de programación dinámica, que usa un espacio lineal. Se pueden especificar la matriz de sustitución, la penalidad de inserción de espacio (gap) y las penalidades de extensión de espacio que se usan para calcular la alineación. Cuando se usa el programa wSTRETCHER para comparar secuencias nucleotídicas, se puede utilizar una penalidad abierta de Gap de 16 y una penalidad de extensión de Gap de 4 con el archivo de matriz de puntuación EDNAFULL. Cuando se usa para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una penalidad abierta de Gap de 12 y una penalidad de extensión de Gap de 2 con el archivo de matriz de puntuación EBLOSUM62.

Otro ejemplo no limitante de algoritmo matemático que se usa para la comparación de secuencias, es el de Needleman y Wunsch (1970), que está incorporado en los paquetes de software para alineación de secuencias GAP Versión 10 y wNEEDLE (http://emboss.sourceforge.net/). El GAP Versión 10 se puede usar para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros: para una secuencia nucleotídica, el % de identidad y el % de similitud se encuentran usando el GAP Weight de 50 y el Length Weight de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna. cmp. Para la comparación de secuencias de aminoácidos, el % de identidad o el % de similitud se determinan usando el peso de espacio (GAP weight) de 8 y el peso de longitud (length weight) de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. wNEEDLE lee dos secuencias de entrada, se encuentra la alineación óptima (incluyendo aberturas) a lo largo de toda su longitud, y escribe su alineación óptima de secuencia global para registro. El algoritmo explora todas las alineaciones posibles y elige la mejor, usando una matriz de puntuación que contiene valores de cada coincidencia posible de residuo o nucleótido. El wNEEDLE encuentra la alineación con la puntuación máxima posible, en donde la puntuación de una alineación es igual a la suma de las coincidencias tomadas de la matriz de puntuación, menos las penalidades que surgen de los espacios de apertura y extensión en las secuencias alineadas. La matriz de sustitución y las penalidades de apertura y extensión de espacio son especificadas por el usuario. Cuando se comparan secuencias de aminoácidos, se usa una penalidad de apertura de espacio de 10, una penalidad de extensión de espacio de 0.5, y la matriz de comparación EBLOSUM62. Cuando se comparan secuencias de ADN usando el wNEEDLE, se usa una penalidad de espacio abierto de 10, una penalidad de extensión de espacio de 0.5, y la matriz de comparación EDNAFULL.

También se pueden usar programas equivalentes. "Programa equivalente" quiere decir cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene coincidencias idénticas de nucleótidos o residuos de aminoácidos, y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia, en comparación con la alineación correspondiente generada por ALIGNX, wNEEDLE, o wSTRETCHER. El % de identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias sobre la región alineada reportada (incluyendo cualquier espacio en la longitud) y el % de similitud es el porcentaje de coincidencias entre las dos secuencias sobre la región alineada reportada (incluyendo cualquier espacio en la longitud).

La alineación también se puede realizar manualmente por inspección.

Hospederos recombinantes Los genes codificadores de toxinas de insecto de la presente invención pueden ser introducidos en una amplia variedad de hospederos microbianos o vegetales. La expresión de genes de toxina de insecto da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento de la proteína pesticida. Con hospederos microbianos adecuados, por ej. Pseudomonas, los microbios pueden ser aplicados al medio ambiente de la plaga, en donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es un control de la plaga. Alternativamente, el microbio que alberga el gen de toxina de insecto puede ser tratado bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. Después la célula tratada, que conserva la actividad tóxica, puede ser aplicada al medio ambiente de la plaga objetivo.

En donde el gen de toxina B.t. es introducido a través de un vector adecuado dentro de un hospedero microbiano, y dicho hospedero es aplicado al medio ambiente en un estado vivo, es esencial utilizar ciertos microbios hospederos. Se seleccionan hospederos microorganismos de los cuales se sepa que ocupan la "fitoesfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más granos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de manera que puedan competir exitosamente en el ambiente particular (granos y otros habitats de insectos) con los microorganismos nativos de tipo silvestre, que proporcionen un mantenimiento y expresión estables del gen que expresa el pesticida de polipéptido y, de preferencia, que proporcione una protección mejorada del pesticida contra la degradación y la desactivación del medio ambiente.

Se conoce un gran número de microorganismos que habitan en el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizosfera (el suelo que rodea a las raíces de la planta) de una gran variedad de granos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de particular interés los microorganismos, como bacterias, por ej. los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Sinorhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaügenes; hongos, particularmente levadura, por ej. los génerosSaccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. Son de particular interés las especies bacterianas de fitoesfera como Pseudomonas syríngae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Sinorhizobium meliloti (antes Rhizobium meliloti), Alcaligenes eutrophus, y Azotobacter vinelandii; y especies de levadura de la fitoesfera, como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. Son de particular interés los microorganismos pigmentados.

Métodos para controlar las plagas de insectos Cuando un insecto entra en contacto con una cantidad efectiva de toxina suministrada por medio de expresión de plantas transgéncicas, composición(es) proteicas formuladas, composición(es) proteicas asperjables, una matriz de cebo u otro sistema de suministro, normalmente los resultados son la muerte del insecto, o los insectos no se alimentan de la fuente que hace que las toxinas estén disponibles para los insectos.

Las presentes toxinas de proteína pueden ser "aplicadas" o proporcionadas para hacer contacto con los insectos objetivo de varias maneras. Por ejemplo, se pueden usar plantas transgénicas (en donde la proteína es producida por, y está presente en la planta) y son bien conocidas en la técnica. La expresión de genes de toxina también se puede lograr selectivamente en tejidos específicos de las plantas, como en las raices, hojas, etc. Esto se puede lograr, por ejemplo, con el uso de promotores específicos de tejido. Otro ejemplo son las aplicaciones asperjables, y también son conocidas en la técnica. Las presentes proteínas pueden ser formuladas en forma adecuada para el uso final deseado, y después pueden ser asperjadas (o aplicadas) sobre la planta y/o alrededor de la planta/en las cercanías de la planta que se quiere proteger - antes de descubrir la infestación, después de descubrir los insectos objetivo, tanto antes como después, y similares. También se pueden usar, por ejemplo, gránulos de cebo, y éstos se conocen en la técnica.

Plantas transqénicas Las proteínas objeto se pueden utilizar para proteger prácticamente cualquier tipo de planta del daño causado por una plaga de insectos. Ejemplos de dichas plantas incluyen maíz, girasol, soya, algodón, cañóla, arroz, sorgo, trigo, cebada, vegetales, plantas ornamentales, pimientos (incluyendo pimientos picantes), remolachas azucareras, frutas, y césped, por nombrar sólo algunos. Métodos para la transformación de las plantas son bien conocidos en la técnica, y métodos de transformación ilustrativos se describen en los ejemplos.

Una modalidad preferida de la invención objetivo es la transformación de plantas con genes que codifican la proteína insecticida objeto o sus variantes. Las plantas transformadas son resistentes al ataque de una plaga de insectos en virtud de la presencia de cantidades de control de la proteína insecticida objeto o sus variantes en las células de la planta transformada. Incorporando material genético que codifica las propiedades insecticidas de las toxinas insecticidas de B.t. en el genoma de una planta de comida por una plaga de insectos particular, el adulto o larva se mueren después de consumir la planta de alimento. Numerosos miembros de las clasificaciones de monocotiledóneas y dicotiledóneas, se han transformado. Los cultivos agronómicos transgénicos, así como frutas y vegetales son de interés comercial. Estos cultivos incluyen, pero no se limitan a, maíz, arroz, soya, cañóla, girasol, alfalfa, sorgo, trigo, algodón, cacahuates, jitomates, papas, y lo similar. Existen varias técnicas para introducir el material genético extraño en las células vegetales, y para la obtención de plantas que mantienen y expresan de forma estable el gen introducido. Dichas técnicas incluyen la aceleración de material genético recubierto en microparticulas directamente en las células (Patente de E.U.A. No. 4945050 y Patente de E.U.A. No. 5141 131 ). Plantas se pueden transformar usando tecnología de Agrobacterium, véase Patente de E.U.A. No. 5177010, Patente de E.U.A. No. 5104310, Solicitud de patente europea No. 0131624B1 , Solicitud de patente europea No. 120516, Solicitud de patente europea No. 159418B1 , Solicitud de patente europea No. 1761 12, Patente de E.U.A. No. 5149645, Patente de E.U.A. No. 5469976, Patente de E.U.A. No. 5464763, Patente de E.U.A. No. 4940838, Patente de E.U.A. No. 4693976, Solicitud de patente europea No. 116718, Solicitud de patente europea No. 290799, Solicitud de patente europea No. 320500, Solicitud de patente europea No. 604662, Solicitud de patente europea No. 627752, Solicitud de patente europea No. 0267159, Solicitud de patente europea No. 0292435, Patente de E.U.A. No. 5231019, Patente de E.U.A. No. 5463174, Patente de E.U.A. No. 4762785, Patente de E.U.A. No. 5004863, y Patente de E.U.A. No. 5159135. Otra tecnología de transformación incluye tecnología WHISKERS™, véase Patente de E.U.A. No. 5302523 y Patente de E.U.A. No. 5464765. Tecnología de electroporación también se ha utilizado para transformar plantas, véase WO 87/06614, Patente de E.U.A. No. 5472869, Patente de E.U.A. No. 5384253, WO 9209696 y WO 9321335. Todas estas patentes y publicaciones de transformación se incorporan para referencia. Además de numerosas tecnologías para la transformación de plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes extraños puede variar también. Dicho tejido puede incluir, pero no se limita a los tejidos embriogénicos, los tipos I y II de tejido de calloso, hipocótilo, meristemo, y similares. Casi todos los tejidos vegetales se pueden transformar durante la des-diferenciación utilizando técnicas apropiadas dentro de la experiencia de una persona en la técnica.

Los genes que codifican toxinas de insecto DIG-1 1 se pueden insertar en las células vegetales usando una variedad de procedimientos que son bien conocidos en la técnica como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, un gran número de vectores de clonación que comprende un marcador que permite la selección de las células microbianas transformadas y un sistema de replicación funcional en Escherichia coli están disponibles para la preparación y modificación de genes extraños para su inserción en las plantas superiores. Dichas manipulaciones pueden incluir, por ejemplo, la inserción de mutaciones, truncamientos, adiciones o sustituciones como se desee para el uso destinado. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. En consecuencia, la secuencia que codifica la proteína Cry o variantes se pueden insertar en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se utiliza para la transformación de E. coli, las células de las cuales se cultivan en un medio nutritivo adecuado, después se cosechan y lisan de modo que cantidades viables del plásmido se recuperan. Análisis de secuencia, análisis de fragmento de restricción, electroforesis, y otros métodos biológicos moleculares bioquímicos se llevan a cabo generalmente como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede ser escindida y unida a la secuencia de ADN siguiente. Cada secuencia de ADN manipulada se puede clonar en los mismos u otros plásmidos.

El uso de vectores que contienen T-ADN para la transformación de células de planta ha sido intensamente investigado y suficientemente descrito en la solicitud de patente europea No. 120516, Lee and Gelvin (2008), Fraley et al. (1986), y An et al. (1985), y es bien establecido en el campo.

Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma de planta, es relativamente estable a lo largo de las generaciones posteriores. El vector utilizado para transformar las células vegetales normalmente contiene un gen marcador que se puede seleccionar que codifica una proteína que confiere en las células vegetales transformadas la resistencia a herbicida o un antibiótico, tal como bialafos, canamicina, G418, bleomicina, o higromicina, inter alia. El gen marcador que se puede seleccionar empleado individualmente en consecuencia debe permitir la selección de células transformadas mientras el crecimiento de células que no contienen el ADN insertado se suprime por el compuesto selectivo.

Un gran número de técnicas son disponibles para la inserción de ADN en una célula de planta huésped. Esos procedimientos incluyen la transformación con T-ADN suministrado por Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como el agente de transformación. Adicionalmente, la fusión de protoplastos de planta con liposomas que contienen el ADN que se suministran, inyección directa de ADN, transformación biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporación, así como otros métodos posibles, se pueden emplear.

En una modalidad preferida de la invención objetivo, las plantas serán transformadas con genes en donde el uso de codones de la región de codificación de proteína ha sido optimizado para plantas. Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5380831 , la cual se incorpora para referencia. También, de manera ventajosa, las plantas que codifican una toxina truncada serán utilizadas. La toxina truncada normalmente codificará alrededor de 55% a aproximadamente 80% de la toxina de longitud completa. Métodos para crear genes sintéticos de B.t. para su uso en plantas son conocidos en la técnica (Stewart, 2007).

Sin importar la técnica de transformación, el gen se incorpora preferiblemente en un vector de transferencia de genes adaptados para expresar los genes de toxina insecticida B.t. y las variantes en la célula vegetal al incluir en el vector un promotor de planta. Además de los promotores de planta, los promotores de una variedad de fuentes se pueden utilizar de manera eficiente en células vegetales para expresar genes extraños. Por ejemplo, se pueden usar promotores de origen bacteriano, tales como el promotor octopina sintasa, el promotor de nopalina sintetasa, el promotor de manopina sintasa; promotores de origen viral, como los promotores 35S y 19S del virus mosaico de la coliflor, y lo similar. Los promotores de planta incluyen, pero no se limitan a, ribulosa-1 ,6-bisfosfato (RuBP) carboxilasa subunidad pequeña (ssu), promotor de beta-conglicinina, promotor de faseolina, promotor de ADH (alcohol deshidrogenasa), promotores de choque térmico, promotor de ADF (factor de despolimerización de actina) y promotores específicos de tejido. Los promotores también pueden contener ciertos elementos de secuencia potenciadores que pueden mejorar la eficiencia de transcripción. Los potenciadores típicos incluyen pero no se limitan a ADH1-intrón 1 y ADH1-intrón 6. Promotores constitutivos se pueden utilizar. Los promotores constitutivos dirigen la expresión génica continua en casi todos los tipos de células y en casi todas las ocasiones (por ej., la actina, la ubiquitina, CaMV 35S). Los promotores específicos de tejido son responsables de la expresión de gen en tipos de célula o tejido específico, tales como hojas o semillas (por ejemplo, zeína, oleosína, napina, ACP (proteína de portador de acilo)), y estos promotores también se pueden utilizar. Se pueden utilizar también promotores que son activos durante una determinada etapa del desarrollo de las plantas, y pueden ser activos en tejidos y órganos de plantas específicos. Ejemplos de dichos promotores incluyen pero no se limitan a promotores que son específicos de raíz, específicos de polen, específicos de embrión, específicos de seda de maíz, específicos de fibra de algodón, específicos de endosperma de semilla, específicos de floema, y lo similar.

Bajo ciertas circunstancias puede ser deseable usar un promotor inducible. Un promotor inducible es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, tal estímulo físico (por ejemplo, genes de choque térmico); luz (por ejemplo, carboxilasa RUBP); hormona (por ejemplo, glucocorticoides); antibiótico (por ejemplo, tetraciclína); metabolitos; y el estrés (por ejemplo, sequías). Otros elementos de transcripción y traducción deseables que funcionan en las plantas pueden utilizarse, tal como secuencias líder 5' sin traducir, secuencias de terminación de la transcripción de ARN y secuencias señal de adición de polí-adenilato. Numerosos vectores de transferencia de genes específicos de planta son conocidos en la técnica.

Cultivos transgénicos que contienen rasgos de resistencia a insectos (IR) son frecuentes en las plantas de maíz y algodón en toda América del Norte, y el uso de estos rasgos se está expandiendo a nivel mundial. Cultivos transgénicos comerciales que combinan IR y rasgos de tolerancia a herbicidas (HT) han sido desarrolladas por varias compañías de semillas. Estos incluyen combinaciones de rasgos IR conferidos por las proteínas insecticidas S.f. y rasgos HT como la tolerancia a los inhibidores de la Acetolactato sintasa (ALS) tal como sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidina, sulfonanilidas y similares, inhibidores de glutamina sintetasa (GS) tales como bialafos, glufosinato y similares, inhibidores de 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) como mesotriona, isoxaflutol y similares, inhibidores de 5-EnolPiruvilShikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) como el glifosato y similares, y los inhibidores de acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) tal como haloxifop, quizalofop, diclofop y similares. Otros ejemplos son conocidos en donde proteínas proporcionadas transgénicamente brindan a la planta tolerancia a clases químicas de herbicidas como herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas de auxinas piridiloxiacetatos (véase WO 2007/053482 A2), o herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas ariloxifenoxipropionatos (véase WO 2005107437 A2, A3). La capacidad para controlar varios problemas de plagas a través de rasgos de IR es un concepto valioso de producto comercial, y la conveniencia de este concepto de producto es mayor si se combinan las características de control de insectos y rasgos de control de malezas en la misma planta. Además, mayor valor puede obtenerse mediante combinaciones de planta sencilla de rasgos de IR atribuidas por una proteína insecticida B.t. como aquel de la invención en cuestión, con uno o más rasgos adicionales HT tales como los mencionadas antes, más uno o más rasgos de entrada adicionales (por ejemplo, otra resistencia a insectos conferida por proteínas derivadas de B.t. u otras proteínas insecticidas, resistencia a insectos conferida por mecanismos tales como ARNi y lo similar, resistencia a nemátodos, resistencia a enfermedades, tolerancia a estrés, utilización de nitrógeno mejorado y similares), o rasgos de salida (por ejemplo, alto contenido de aceites, composición de aceite saludable, mejora nutricional y similares). Tales combinaciones pueden obtenerse a través de crianza convencional (pila de crianza) o conjuntamente como un evento de transformación novedoso que implica la introducción simultánea de varios genes (pila molecular). Los beneficios incluyen la capacidad para manejar las plagas de insectos y control de maleza mejorado en una planta de cultivo que proporciona beneficios secundarios para el productor y/o el consumidor. Así, la invención en cuestión puede utilizarse en combinación con otros rasgos para proporcionar un completo paquete agronómico de calidad de cultivo mejorada con la capacidad de controlar flexiblemente y rentablemente cualquier número de problemas agronómicos.

Plagas objetivo Las toxinas de insecto DIG-1 de la invención son especialmente adecuadas para su uso en el control de plagas de insectos.

Los coleópteros son un importante grupo de plagas agrícolas, hortícolas y domésticas que causan una gran cantidad de daño cada año. Este orden de insectos engloba larvas y adultos que se alimentan de hojas y raíces, incluyendo: gorgojos de las familias Anthribidae , Bruchidae y Curculionidae [por ejemplo, picudo del algodonero {Anthonomus grandis Boheman), gorgojo acuático del arroz (Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel), picudo negro de los graneros {Sitophilus grananus Linnaeus), gorgojo del arroz (Sitophllus oryzae Linnaeus), picudo negro de las hojas de trébol {Hypera punctata Fabricius) y picudo del maíz {Sphenophorus maidis Chittenden)]; escarabajuelos, escarabajos del pepino, gusanos de las raíces, escarabajos de las hojas, escarabajos de la papa y minadores de las hojas de la familia Chrysomelidae [por ejemplo, escarabajo de la papa de Colorado {Leptinotarsa decemlineata Say), gusano de las raíces del maíz del oeste (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), gusano de las raíces del maíz del norte (Diabrotica barbes Smith & Lawrence); gusano de las raíces del maíz del sur (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber), escarabajuelo del maíz (Chaetocnema pulicara Melsheimer), escarabajuelo de las cruciferas (Phyllotreta cruciferae Goeze), escarabajo de la uva (Colaspis brunnea Fabricius), escarabajos de las hojas de cereal (Oulema melanopus Linnaeus) y escarabajo del girasol (Zygogramma exclamationis Fabricius)]; escarabajos de la familia Coccinellidae [por ejemplo, escarabajo mexicano del frijol (Epilachna varívestis Mulsant)]; parpallas y otros escarabajos de la familia Scarabaeidae (por ejemplo escarabajo japonés (Popillia japónica Newman), parpalla enmascarada del norte (larva blanca, cyclocephala borealis Arrow), parpalla enmascarada de sur (larva blanca, cyclocephala inmaculada Olivier), parpalla europea (Rhizotrogus majalis Razoumowsky), larva blanca (Phyllophaga crinita Burmeister), y escarabajo de la zanahoria (Ligyrus gibbosus geer)]; escarabajos de alfombra de la familia Dermestidae ; larva del escarabajo de resorte de la familia Elateridae [por ejemplo, Melanotus spp., Conoderus spp., Limonius spp., Agriotes spp., Ctenicera spp., aeolus spp.)]; escarabajo de la corteza de la familia Scolytidae , y escarabajos de la familia Tenebrionidae (por ejemplo, Eleodes spp). Cualquier género listado anteriormente (y otros), por lo general, puede considerarse también como parte del objetivo de la invención. Cualesquiera insectos adicionales en cualesquiera de estos géneros (como objetivos) están incluidos dentro del alcance de esta invención.

Los lepidópteros son otro grupo importante de plagas agrícolas, hortícolas y domésticas que causan una gran cantidad de daño cada año. Esta orden de insectos abarca adultos y larvas de alimentación foliar y raíz. Las plagas de insectos lepidópteros incluyen, pero no se limitan a: Achoroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ípsilon (gusano cortador negro), Alabama argillacea, AIsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx morí, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia feneralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella (barrenador del suroeste), Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Esphestia elutella, Erannis filaría, Estigmene aerea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Gallería mellonella, Grapholita molesta, Harrísina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea (choclo), Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantia cunea, Keifería lycopersicella, Lambdina fiscellaría fiscellaría, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxagrotis albicosta (barrenador del frijo del oestej, Loxostege sticticalis, Lymantría dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis (barrenador europeo), Paleacrita vernata, Papiapema nebris (barrenador común de los tallos), Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella (palomilla dorso), Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta (gusano cogollero), Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonta ocellana, Spodoptera frugiperda (gusano cogollero de otoño), Spodoptera exigua (gusano cogollero del betabel), Thaurnstopoea pityocampa, Ensola bisselliella, Tríchoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curiails e Yponomeuta padella.

Se contempla el uso de toxinas de insecto DIG-1 1 para controlar las plagas de coleópteros de cultivos. En algunas modalidades, se pueden desplegar económicamente las proteínas Cry para el control de plagas de insectos que incluyen pero no se limitan, por ejemplo, a gusanos de las raíces tales como Diabrotica undecimpunctata howardi (gusano de las raíces del sur), Diabrotica longicornis barberi (gusano de las raíces del maíz del norte), y Diabrotica virgifera (gusano de las raices del maíz del oeste), y larvas tales como larvaa de Cyclocephala borealis (parpalla enmascarada del norte), Cyclocephala immaculate (parpalla enmascarada del sur), y Popillia japónica (escarabajo japonés).

También se contempla el uso de las toxinas de insecto DIG-1 1 para controlar nematodos parásitos, incluyendo pero no limitándose a, nematodo de nudo de raíz {Meloidogyne icognita) y el nematodo de quiste de la soya {Heterodera glycines).

Detección de anticuerpos de las toxinas de insecto DIG-1 1 Antianticuerpos antitoxina.

Anticuerpos a las toxinas de insecto descritos aquí o a las toxinas equivalentes, o fragmentos de estas toxinas, pueden fácilmente prepararse utilizando procedimientos estándar de esta técnica. Estos anticuerpos son útiles para detectar la presencia de las toxinas de insecto DIG-1 1.

Una vez que las toxinas insecticidas B.t. han sido aisladas, anticuerpos específicos para la toxina pueden plantearse por métodos convencionales que son bien conocidos en la técnica. Inyecciones repetidas en un hospedero de elección en un periodo de semanas o meses provocarán una respuesta inmune y darán lugar a títulos significativos de suero de toxina anti-S.r. Hospederos preferidos son especies de mamíferos y más altamente especies preferidas son conejos, cabras, ovejas y ratones. Sangre extraída de estos animales inmunizados puede ser procesada por métodos establecidos para obtener antisuero (anticuerpos policlonales) reactivo con la purificada. El antisuero entonces puede ser purificado por afinidad por adsorción a la toxina de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica. Antisuero purificado por afinidad puede ser aún más purificado aislando la fracción de inmunoglobulina dentro del antisuero utilizando procedimientos conocidos en la técnica. El material resultante será una población heterogénea de inmunoglobulinas reactivas con la toxina insecticida B.t..

También se pueden generar anticuerpos de toxina anti-fí.f. También se pueden generar anticuerpos de toxina anti-ß.?. al preparar un inmunógeno semi-sintético que consiste en un fragmento de péptidos sintético de la toxina insecticida B.t. conjugada con un portador inmunitario. Numerosos esquemas e instrumentos útiles para la fabricación de fragmentos de péptidos son bien conocidos en la técnica. Muchos portadores inmunogénicos adecuados como albúmina de suero bovino o hemocianina de lapa de punta también son bien conocidos en la técnica, como son técnicas de acoplamiento de las proteínas inmunogeno y portadoras. Una vez que se ha construido el inmunogeno semi-sintético, el procedimiento para elaborar los anticuerpos específicos para el fragmento de toxina insecticida de B. t. es idéntico a los que se emplean para producir anticuerpos reactivos con toxina natural B. t.

Los anticuerpos monoclonales de toxina anti-fí.f. (MAbs) se preparan fácilmente usando toxina insecticida de B.t. purificada. Métodos para producir MAbs han sido practicados durante más de 15 años y son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Reiteradas inyecciones intraperitoneales o subcutáneas de toxina purificada B.t. insecticida en adyuvante provocarán una respuesta inmune en la mayoría de los animales. Los linfocitos B hiperinmunizados se eliminan de los animales y fusionan con una línea celular asociada de fusión adecuada capaz de ser cultivada indefinidamente. Animales preferidos cuyos linfocitos B pueden ser hiperinmunizados y utilizados en la producción de MAb son mamíferos. Animales más preferidos son las ratas y ratones y más preferida es la cepa de ratón BALB/c.

Numerosas líneas de células de mamífero son asociados de fusión adecuados para la producción de hibridomas. Muchas de estas líneas están disponibles en la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC, Manassas, VA) y proveedores comerciales. Las líneas celulares de asociado preferido de fusión se derivan de mielomas de ratón y la línea celular de mieloma-653 HL-1® amigablemente (Ventrex, Portland, ME) es más preferida.

Una vez fusionados, hibridomas resultantes son cultivados en un medio de cultivo selectivo para una o dos semanas. Dos sistemas de selección conocidos están disponibles para la eliminación de las células de mieloma no fusionadas, o fusiones entre las células de mieloma, del cultivo mixto de hibridoma. La elección del sistema de selección depende de la cepa de ratón inmunizado y asociado de fusión de mieloma utilizado. Se puede utilizar el sistema de selección de AAT, descrito por Taggart y Samloff, (1983); Sin embargo, el sistema de selección de HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina), descrito por Littlefield, (1964), es preferible debido a su compatibilidad con la cepa de ratón preferido y asociado de fusión mencionados anteriormente. Medio de crecimiento gastado es tamizado luego para la secreción inmunoespecífica MAb. Procedimientos de ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) son los más adecuados para este propósito; sin embargo, también son aceptables radioinmunoensayos adaptados para tamizado de gran volumen. Se pueden realizar múltiples tamizados diseñados para cortar consecutivamente el número considerable de cultivos irrelevantes o menos deseados. Los cultivos que secretan MAbs reactivo con la toxina insecticida B.t. pueden tamizarse para reactividad cruzada con toxinas insecticidas de B.t. conocidas. Mabs que se unen preferentemente a la toxina insecticida B. t. preferida pueden ser isotipadas mediante ensayos disponibles comercialmente. MAbs preferidos son de la clase IgG, y Mabs más altamente preferidos son de los subisotipos IgGi y lgG2a.

Cultivos de hibridoma que secretan los MAbs preferidos pueden ser sub-clonados varias veces para establecer monoclonalidad y estabilidad. Métodos bien conocidos para sub-clonar cultivos de células eucariotas, no adherentes incluyen la limitación de dilución, agarosa suave y técnicas de clasificación de células activadas con fluorescencia. Después de cada sub-clonación, los cultivos resultantes preferentemente son re-ensayados para la secreción de anticuerpos e isotipo para garantizar que un cultivo preferido de secreción de MAb estable ha sido establecido.

Los anticuerpos de toxina anti-S.f. son útiles en diversos métodos para detectar la toxina insecticida B. t. reclamada de la presente invención, y variantes o fragmentos de los mismos. Es bien sabido que los anticuerpos etiquetados con un grupo de informe pueden utilizarse para identificar la presencia de antígenos en una variedad del medio ambiente. Anticuerpos marcados con radioisótopos se han utilizado durante décadas en radio-inmunoensayos para identificar, con gran precisión y sensibilidad, la presencia de antígenos en una variedad de fluidos biológicos. Más recientemente, los anticuerpos marcados con enzima se han utilizado como un sustituto de anticuerpos radio-marcados en el ensayo de ELISA. Además, los anticuerpos inmunorreactivos a las toxinas insecticidas B.t. de la presente invención pueden unirse a una sustancia de inmovilización como un pozo de poliestireno o partícula y utilizada en inmunoensayos para determinar si la toxina B.t. está presente en una muestra de prueba.

Detección usando sondas Otro método para identificar las toxinas y los genes de la invención en cuestión es mediante el uso de sondas de oligonucleótido. Estas sondas son secuencias de nucleótidos detectables. Estas secuencias pueden hacerse detectables en virtud de una etiqueta adecuada radiactiva o pueden hacerse inherentemente fluorescentes como se describe en la Patente de E.U.A. No. 6268132. Como es bien sabido en la técnica, si la molécula de la sonda y muestra de ácido nucleico híbrida formando fuertes enlaces de apareado de base entre las dos moléculas, cabe razonablemente suponer que la sonda y la muestra tienen homología de secuencia sustancial. Preferiblemente, la hibridación se realiza bajo estrictas condiciones por técnicas bien conocidas en la técnica, como se describe, por ejemplo, en Keller y Manak (1993). Detección de la sonda proporciona un medio para determinar de manera conocida si se ha producido la hibridación. Este tipo de análisis de sonda proporciona un método rápido para identificar genes de codificación de toxina de la invención en cuestión. Los segmentos de nucleótidos que son usados como sondas según la invención pueden sintetizarse mediante procedimientos estándar y de sintetizador de ADN. Estas secuencias de nucleótidos también pueden utilizarse como iniciadores de PCR para amplificar genes de la invención en cuestión.

Hibridación Como es bien sabido por los expertos en biología molecular, la similitud de dos ácidos nucleicos puede caracterizarse por su tendencia a hibridarse. En este documento los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" son destinadas para referirse a las condiciones bajo las cuales se híbrida una sonda (templar) a su secuencia objetivo a un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo). Condiciones severas son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Controlando la severidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda pueden ser identificadas (sondeo homólogo). Alternativamente, se pueden ajustar condiciones de severidad para permitir algunos desajustes en secuencias para que menores grados de similitud sean detectados (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda es menor de unos 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Normalmente, condiciones severas serán aquellas en que la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1.5 M ion Na, normalmente aproximadamente concentración de 0.01 a 1.0 M ion Na (u otras sales) a pH 7.0 a pH 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largos (por ejemplo por ejemplo, más de 50 nucleótidos). Condiciones severas también pueden lograrse con la adición de agentes de desestabilización como formamida. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen hibridación con una solución reguladora de pH de 30% a 35% de formamida, 1 M NaCI, 1 % de SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37°C y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCI/0.3 M de citrato trisódico) entre 50°C y 55°C. Las condiciones de severidad moderada ejemplares incluyen hibridación en 40% a 45% de formamida, 1.0 M NaCI, 1 % de SDS a 37°C y un lavado en 0.5X a 1X SSC entre 55°C y 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen hibridación en 50% de formamida, 1 M NaCI, 1 % de SDS a 37°C y un lavado en 0.1X SSC entre 60°C y 65°C. Opcionalmente, los reguladores de pH de lavado pueden comprender aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1 % de SDS. Duración de hibridación es generalmente menor de aproximadamente 24 horas, usualmente de 4 a aproximadamente 12 horas.

Especificidad suele ser la función de lavados de post-hibridación, los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN/ADN, el punto de fusión térmico (Tm) es la temperatura (bajo fuerza iónica definida y pH) en donde 50% de una secuencia objetivo complementaria híbrida a un sonda perfectamente coincidente. Tm se reduce por aproximadamente 1 °C para cada 1 % de desajuste; por lo tanto, Tm, condiciones de hibridación y/o condiciones de lavado pueden ajustarse para facilitar el recocido de secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si secuencias con >90% de identidad son buscadas, la Tm puede disminuir 10°C. En general, condiciones severas son seleccionadas para ser aproximadamente 5°C menor a la Tm para la secuencia específica y su complemento en una fuerza iónica definida y pH. Sin embargo, condiciones muy severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1 °C, 2°C, 3°C o 4°C inferiores a la Tm; condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6°C, 7°C, 8°C, 9°C o 10°C inferior a la Tm, y condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1 1 °C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C o 20°C menor a la Tm.

Tm (en °C) puede ser determinado experimentalmente o puede ser aproximado por cálculo. Para los híbridos ADN-ADN, se puede aproximar la Tm de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984): Tm(°C) = 81.5°C + 16.6(log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% formamida) - 500/L; donde [M] es la molaridad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % de formamida es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud de los híbridos en pares base Por otra parte, la Tm es descrita por la siguiente fórmula (Beltz et al., 1983).

Tm(°C) = 81.5°C + 16.6(log[Na+]) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% formamida) - 600/L donde [Na+] es la molaridad de iones de sodio, % GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % de formamida es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud de los híbridos en pares base.

Utilizando las ecuaciones, composiciones de hibridación y lavado y Tm deseada, aquellos de experiencia ordinaria comprenderán que variaciones en la severidad de soluciones de hibridación y/o lavado son inherentemente descritas. Si el grado deseado de resultados no coincidentes en una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), es preferido para aumentar la concentración de SSC por lo que puede utilizarse una temperatura más alta. Una guía amplia de la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) y Ausubel et al (1995) Véase también Sambrook et al (1989).

Hibridación de ADN inmovilizado en Southern blot con sondas radiactivamente etiquetadas específicas de gen puede realizarse por métodos estándar Sambrook ef al., supra.). Isótopos radiactivos utilizados para marcar las sondas de polinucleótido pueden incluir 32P, 33P, 14C o 3H. Incorporación de isótopos radiactivos en moléculas de sonda de polinucleótido puede hacerse por cualquiera de los varios métodos bien conocidos por los calificados en el campo de la biología molecular. (Véase, por ejemplo. Sambrook et al., supra.) En general, la hibridación y lavados posteriores pueden llevarse a cabo bajo severas condiciones que permiten la detección de secuencias objetivo con homología a los genes de codificación de toxina reclamados. Para sondas de genes de ADN de doble cadena, hibridación podrá llevarse a cabo durante la noche a 20° a 25°C por debajo de Tm del híbrido de ADN en 6X SSPE, 5X solución de Denhardt, 0.1 % SDS, ADN desnaturalizado 0.1 mg/ml [20X SSPES es 3 M NaCI, 0.2 M NaHP04, y 0.02 M EDTA (sal de sodio ácido tetra-acético de etilendiamina); solución de Denhardt 100X es 20 mg/l de polivinilpirolidona, 20 mg/l de ficol tipo 400 y 20 mg/l de albúmina de suero bovino (fracción V)].

Lavados pueden llevarse a cabo normalmente como sigue: Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1X SSPE, 0.1 % SDS (lavado de baja severidad).

Una vez a Tm - 20°C durante 15 minutos en 0.2 X SSPE, 0.1 % SDS (lavado de severidad moderada).

Para las sondas de oligonucleótido, hibridación podrá realizarse durante la noche a 10° a 20°C por debajo de la Tm del híbrido en 6 X SSPE, solución Denhardt 5X, 0.1 % SDS, ADN desnaturalizado 0.1 mg/ml. Tmpara sondas de oligonucleótido puede determinarse mediante la siguiente fórmula (Suggs er a/., 1981 ).

Tm(°C) = 2(número de pares base T/A) + 4(número de pares base G/C) Lavados pueden llevarse a cabo normalmente como sigue: Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos 1X SSPE, 0.1 % SDS (lavado de baja severidad).

Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en 1X SSPE, 0.1 % SDS (lavado de severidad moderada).

Moléculas de sonda para las moléculas de hibridación e híbrido formadas entre las moléculas de sonda y objetivo pueden hacerse detectables por medios distintos de etiquetado radiactivo. Tales métodos alternativos se destinan para estar dentro del alcance de esta invención.

Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes provisionales y publicaciones mencionadas o citadas aquí son incorporadas por referencia en su totalidad en la medida que no sea incompatible con las enseñanzas explícitas de esta especificación.

Mediante el uso del término "material genético" en el presente documento, se pretende incluir todos los genes, ácido nucleico, ADN y ARN. El término "ARNds" se refiere al ARN de doble cadena. Para las designaciones de los residuos de nucleótidos de polinucleótidos, ADN, ARN, oligonucleótidos e iniciadores y las denominaciones de residuos de aminoácidos de proteínas, abreviaturas estándar de IUPAC se emplean a lo largo de este documento. Secuencias de ácido nucleico se presentan en la dirección estándar 5' a 3' y secuencias de proteína se presentan en la dirección estándar amino terminal (N) a carboxi terminal (C).

Debe entenderse que los ejemplos y las modalidades aquí descritas son únicamente para propósitos ilustrativos y que se sugerirán varias modificaciones o cambios en vista de los mismos a los expertos en la técnica y se incluirán en la esencia y ámbito de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Estos ejemplos no se deben interpretar como una limitación.

A menos que específicamente se indique o implique, los términos "un", "una" y "el, la" significa "al menos un" como se utiliza en el presente documento.

Todos los porcentajes son en peso, y todas las proporciones de mezcla de solventes son por volumen a menos que se indique lo contrario. Todas las temperaturas están en grados Celsius.

EJEMPLO 1 Aislamiento de un gen que codifica la toxina DIG-11 A menos que se especifique lo contrario, las manipulaciones moleculares biológicas y bioquímicas descritas en el presente y en los ejemplos posteriores se realizaron con metodologías estándares como se divulga en, por ejemplo, Ausubel et al. (1995), y Sambrook et al. (1989), y actualizaciones de las mismas. El ácido nucleico que codifica la proteína Cry insecticida designada aquí como DIG-1 1 se aisló de la cepa B.t. PS184M1. Los iniciadores degenerados a usarse como iniciadores delanteros e inversos en reacciones de PCR con el ADN genómico PS184M1 como plantilla se designaron con base en múltiples alineaciones de secuencia de cada clase de toxina insecticida de B.t. El iniciador delantero corresponde a las bases 841 a 865 de SEQ ID NO:1 y el iniciador inverso corresponde al complemento de las bases 2227 a 2250 de SEQ ID NO:1. Este par de iniciadores se utilizó para amplificar un fragmento de 1410 pb, correspondiente a los nucleótidos 841 a 2250 de SEQ ID NO:1. Esta secuencia se utilizó como punto de anclaje para comenzar la caminata del genoma usando métodos adaptados desde el Kit Universal GenomeWalker™ (Clontech, Palo Alto, CA). Se determinó la secuencia de ácido nucleico de un fragmento que abarca la región de codificación de DIG-11. SEQ ID NO:1 es la secuencia de nucleótidos 3492 bp de codificación de la proteína DIG-11 de longitud completa. SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de la proteína DIG-1 1 de longitud completa deducida de SEQ ID NO:1.

EJEMPLO 2 Supresión del dominio l a-hélices de DIG-11 Para mejorar las propiedades de acción para insectos de la toxina para insectos DIG-11 , se realizan eliminaciones seriales, graduales, cada una de las que quita parte de la N-terminal de la proteína DIG-1 1. Las supresiones eliminan parte o todo de a-hélice 1 y parte o todo de a-hélice 2 en dominio I, manteniendo la integridad estructural de a-hélice 3 a través de a-hélice 7.

Las supresiones fueron diseñadas como sigue. Este ejemplo utiliza la secuencia de ADN quimérica de longitud completa de codificación de la proteína DIG-1 1 de longitud completa, por ejemplo SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente) para ilustrar los principios de diseño con 73 variantes específicas. Utiliza la secuencia quimérica de SEQ ID NO: 5 (segmento de toxina central DIG-84 de codificación de ADN fusionado al segmento protoxina CryIAb) para proporcionar 73 variantes específicas adicionales. Un experto en la técnica se dará cuenta que otras secuencias de ADN de codificación de toda o una porción N-terminal de la proteína DIG-11 puede ser manipulada igualmente para lograr el resultado deseado. Para elaborar la primera variante eliminada de codificación de secuencia, todas las bases que codifican a-hélice 1 hasta el codón para el residuo de leucina cerca del inicio de a-hélice 2A (es decir L100 para la proteína de longitud total DIG-1 1 de SEQ ID NO: 2), se eliminan. Por lo tanto, la eliminación de bases 1 a 300 de SEO. ID NO: 1 elimina la secuencia de codificación para aminoácidos 1 a 100 de SEQ ID NO:2. Reintroducción de una iniciación de traducción de codón ATG (metionina) al principio (es decir en frente del codón correspondiente al aminoácido 101 de la proteína de longitud completa) proporciona la secuencia de codificación variante suprimida que comprende un marco abierto de lectura de 3195 bases que codifica una proteína de DIG-1 1 variante eliminada que comprende 1065 aminoácidos (es decir metionina más aminoácidos 101 a 1164 de la proteína DIG-1 1 de longitud completa). Las supresiones seriales, escalonadas que quitan codones adicionales para un aminoácido sencillo correspondiente a residuos 101 a 141 de la proteína DIG-1 1 de longitud completa de SEQ ID NO: 2 ofrecen variantes que carecen parte o toda la a-hélice 2A y a-hélice 2B. Así una segunda secuencia de codificación variante suprimida designada requiere la eliminación de bases 1 a 303 de SEQ ID NO:1 , eliminando así la secuencia de codificación para los aminoácidos 1 al 101. Restauración de un cuadro de lectura abierta funcional nuevamente se logra mediante la reintroducción de un codón de metionina de iniciación de traducción al comienzo de la secuencia de codificación restante, proporcionando así una segunda secuencia variante eliminada de codificación con un marco de lectura abierta de 3192 bases que codifican una proteína DIG-1 variante eliminada que comprende 1064 aminoácidos (es decir, metionina además de aminoácidos 102 a 1 164 de la proteína DIG-1 1 de longitud completa). La última secuencia de codificación variante suprimida designada requiere la eliminación de bases 1 a 423 de SEQ ID NO: 1 , así eliminando la secuencia de codificación de aminoácidos 1 a 141 y después la reintroducción de un codón de metionina de iniciación de traducción, proporcionando una secuencia de codificación variante de eliminación que tiene un marco de lectura abierta de 3069 bases que codifica una proteína DIG-1 1 variante de eliminación de 1023 aminoácidos (es decir metionina más aminoácidos 142 a 1 164 de la proteína DIG-1 1 de longitud completa). Como se ejemplifica, después de la eliminación de la secuencia de eliminación, se agrega un codón de metionina iniciadora al principio de la secuencia de codificación restante para restaurar un marco funcional de lectura abierta. También como se describe, un codón glicina adicional es agregado entre el codón de metionina y el codón para el aminoácido de determinación de inestabilidad en la instancia que la eliminación de la secuencia eliminada deje expuesto en la N-terminal de la parte restante de la proteína de longitud completa uno de los aminoácidos de determinación de inestabilidad como se indica anteriormente.

El cuadro 3 describe variantes específicas diseñadas de acuerdo on la estrategia descrita anteriormente.

CUADRO 3 Secuencias de proteína variante de supresión de la proteína DIG-11 de longitud completa de SEQ ID NO: 2 y la secuencia de proteína de fusión de SEQ IDNO:5 Variante Residuos Residuos de Variante Residuos Residuos de de agregados en SEQIDNO:2 de agregados en SEQ ID NO:5 Supresión terminal NH2 supresión terminal NH2 de DIG-11 de DIG-11 1 M 101-1164 74 M 101-1209 2 M 102-1164 75 M 102-1209 3 M 103-1164 76 M 103-1209 4 M 104-1164 77 M 104-1209 5 MG 104-1164 78 MG 104-1209 6 M 105-1164 79 M 105-1209 7 MG 105-1164 80 MG 105-1209 8 M 106-1164 81 M 106-1209 9 M 107-1 64 82 M 107-1209 10 M 108-1 64 83 M 108-1209 11 MG 108-1 64 84 MG 108-1209 12 M 109-1164 85 M 109-1209 13 MG 109-1 64 86 MG 109-1209 14 M 110-1164 87 M 110-1209 15 M 111-1164 88 M 111-1209 16 M 112-1164 89 M 112-1209 17 M 113-1164 90 M 113-1209 18 MG 113-1164 91 MG 113-1209 19 M 114-1 64 92 M 114-1209 20 MG 114-1164 93 MG 114-1209 21 M 115-1164 94 M 115-1209 22 MG 115-1164 95 MG 115-1209 23 M 1 6-1164 96 M 116-1209 24 MG 116-1164 97 MG 116-1209 25 M 117-1164 98 M 117-1209 26 MG 117-1164 99 MG 117-1209 27 M 118-1164 100 M 118-1209 28 MG 118-1164 101 MG 118-1209 29 M 119-1164 102 M 119-1209 30 M 120-1164 103 M 120-1209 31 MG 120-1164 104 MG 120-1209 32 M 121-1164 105 M 121-1209 33 M 122-1164 106 M 122-1209 34 MG 122-1164 107 MG 122-1209 35 M 123-1164 108 M 123-1209 36 MG 123-1 64 109 MG 123-1209 37 M 124-1164 110 M 124-1209 38 MG 124-1164 111 MG 124-1209 39 M 125-1164 112 M 125-1209 40 MG 125-1164 113 MG 125-1209 41 M 126-1164 114 M 126-1209 42 MG 126-1164 115 MG 126-1209 43 M 127- 164 116 M 127-1209 44 MG 127-1164 117 MG 127-1209 45 M 128-1164 118 M 128-1209 46 MG 128-1164 119 MG 128-1209 47 M 129- 164 120 M 129-1209 48 MG 129-1 64 121 MG 129-1209 49 M 130-1164 122 M 130-1209 50 MG 130-1164 123 MG 130-1209 51 M 131-1164 124 M 131-1209 52 MG 131-1164 125 MG 131- 209 53 M 132-1164 126 M 132-1209 54 M 133-1164 127 M 133-1209 55 MG 133-1 64 128 MG 133-1209 56 M 134-1164 129 M 134-1209 57 MG 134-1164 130 MG 134-1209 58 M 135-1164 131 M 135-1209 59 MG 35-1164 132 MG 135-1209 60 M 36-1164 133 M 136-1209 61 MG 36-1164 134 MG 136-1209 62 M 137-1164 135 M 137-1209 63 MG 37-1164 136 MG 137-1209 64 M 138-1164 137 M 138-1209 65 MG 138-1164 138 MG 138-1209 66 M 139-1164 139 M 139-1209 67 MG 139-1164 140 MG 139-1209 68 M 140-1164 141 M 140- 209 69 MG 140-1164 142 MG 140-1209 70 M 141-1164 143 M 141-1209 71 MG 141-1164 144 MG 141-1209 72 M 142-1164 145 M 142-1209 73 MG 142-1164 146 MG 142- 209 Ácidos nucleicos de codificación de toxinas que se describen en el cuadro 3 están diseñados de conformidad con los principios generales de genes sintéticos destinados para expresión en plantas, como se señaló anteriormente.

EJEMPLO 3 Diseño de versiones optimizadas de planta de secuencias de codificación para la proteínas protoxinas DIG-84 y CrvIAb Las secuencias de ADN que tienen sesgos de codón vegetal fueron diseñadas y sintetizadas para producir la proteína DIG-84 en monocotiledóneas transgénicas y el segmento de la protoxina CryIAb en plantas mono- o dicotiledóneas. Una tabla de uso codón de maíz (Zea mays L.) se calculó de 706 secuencias de codificación de proteínas (CDs) obtenidas de secuencias depositadas en GenBank. Tablas de uso de codón para el tabaco (Nicotiana tabacum, 1268 CDs), cañóla {Brassica napus, 530 CDs), algodón (Gossypium hirsutum, 197 CDs) y soya (Glycine max; alrededor de 1000 CDs)fueron descargadas de datos en el sitio webhttp://www.kazusa. or.jp/codon/. Los conjuntos de codones sesgados que comprenden los codones altamente utilizados en conjuntos de datos CDS de maíz CDS y de CDS de dicotiledóneas fusionadas, en cantidades relativas reajustadas, se calcularon después de omitir cualquier codón sinónimo utilizado menos que aproximadamente el 10% del total del codón utilizado para dicho aminoácido en cualquier tipo de planta. Para derivar una secuencia de maíz optimizada de codificación de la proteína DIG-84, sustituciones de codón a la secuencia de ADN DIG-11 determinada experimentalmente se hacen de tal manera que la secuencia de ADN resultante tuviera la composición general de codón del cuadro de sesgo de codón del maíz, conservando simultáneamente la secuencia de aminoácidos codificada. Mejoras adicionales de la secuencia se hicieron para eliminar los sitios de reconocimiento de enzima de restricción indeseables, posibles sitios de empalme de intrón de planta, corridas largas de residuos A/T o C/G y otros motivos que podrían interferir con la estabilidad del ARN, transcripción o traducción de la región de codificación en las células vegetales. Otros cambios se hicieron para introducir los sitios de reconocimiento de enzima de restricción deseada y para eliminar los cuadros de lectura abierta internos largos (cuadros distintos de +1 ). Estos cambios fueron hechos dentro de las limitaciones de retener la composición de codón sesgado del maíz. Síntesis de la secuencia diseñada fue realizada por un proveedor comercial (DNA2.0, Menlo Park, California).

Orientación adicional con respecto a la producción de genes sintéticos puede encontrarse en, por ejemplo, WO 97/13402 y Patente de E.U.A. No. 5380831.

Una secuencia de ADN optimizada para el maíz que codifica el segmento de toxina central de DIG-84, que comprende los aminoácidos 1 a 664 de la proteína DIG-1 1 de longitud completa de SEQ ID NO:2 se da en SEQ ID NO:3. Métodos análogos se utilizaron para diseñar una secuencia de ADN optimizada para dicotiledóneas que codifica el segmento de la protoxina CryIAb que se dio a conocer como SEQ ID NO:6, y una secuencia de ADN optimizada para maíz que codifica el segmento de la protoxina CryIAb, como se reveló en SEQ ID NO:7.

EJEMPLO 4 Construcción de plásmidos de expresión de codificación de toxina de insecto DIG-84 y expresión en hospederos bacterianos Se utilizaron métodos de clonación estándar en la construcción de los plásmidos de expresión Pseudomonas fluorescens (Pf) diseñados para producir proteínas de DIG-84 codificadas por una región de codificación optimizadas de maíz. Endonucleasas de restricción se obtuvieron de New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) y T4 ADN ligasa (NEB) se utilizó para la ligación de ADN. Preparaciones de plásmido se realizaron mediante el kit de plásmidos Nucleospin® (Macherey-Nagel Inc, Bethlehem, PA) siguiendo las instrucciones del proveedor. Fragmentos de ADN fueron purificados mediante el kit de extracción con gel QIAquick (Qiagen, Valencia, CA) después de la electroforesis en gel de agarosa y Tris acetato. El vector linearízado se fosfató con fosfatasa NEB Antartic para mejorar la formación de moléculas recombinantes.

La estrategia de clonación básica comprende subclonar la secuencia de codificación de la toxina de insecto DIG-84 (CDS) proporcionada por la SEQ ID NO:3 en pDOW1 169 en por ejemplo, los sitios de restricción Spel y Xhol, con lo cual se coloca bajo el control de expresión del promotor Ptac y el terminador rmBT1T2 del plásmido pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, Wl). pDOW1169 es un plásmido de copia de medio con el origen de replicación RSF1010, un gen pyrF y un sitio de unión a ribosoma que precede a los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción en los cuales se pueden introducir fragmentos de ADN que contienen regiones de codificación de proteína (solicitud de patente de los EUA No. 20080193974). El plásmido de expresión pDAB102007 fue transformado por electroporación en DC454 (una cepa casi tipo salvaje P. fluorescens que tiene mutaciones kpyrF and lsc::laclQI) o sus derivados, se recuperó en medio hidrolizado de soya-SOC y colocados en placa en medio selectivo (agar de glucosa M9 carente de uracilo, Sambrook et al., supra). Detalles de las manipulaciones microbiológicas están disponibles en Squires et al., (2004), Solicitud de Patente de EUA 20060008877, Solicitud de Patente de EUA 20080193974 y Solicitud de Patente de EUA 20080058262, incorporado en el presente por referencia. Las colonias recombinantes se identificaron por digestión de la enzima de restricción del ADN del plásmido minipreparado y un plásmido (DPf 13591 ) fue seleccionado para trabajar. La proteína DIG-84, tal como se produce con el vector de expresión pDAB102007, está formada por los aminoácidos 1 a 664 de la proteína DIG- 1 divulgada en SEQ ID NO:2, con la adición N-terminal de dos aminoácidos (leucina y glutamina) aportados por la traducción de las bases que comprenden el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xhol utilizado para terminar la CDS de DIG-84 en pDAB102007.

Análisis de crecimiento y expresión en matraces de agitación La producción de la proteína DIG-84 para bioensayo de insectos y de caracterización fue realizado por la cepa cultivada en matraz de agitación P. fluorescens DPf 13591 que alberga las construcciones de expresión (por ejemplo el plásmido pDAB102007). Cultivos de semilla desarrollados en medio M9 complementado con 1 % de glucosa y elementos traza se utilizaron para inocular 50 mi de medio mínimo definido con 5% de glicerol (Teknova catálogo # 3D7426, Hollister, CA). Expresión del gen de la toxina DIG-84 mediante el promotor Ptac fue inducida por adición de isopropil- -D-1 -tiogalactopiranosida (IPTG) después de una incubación inicial de 24 horas a 30° con agitación. Cultivos fueron muestreados en el momento de inducción y en distintos momentos post-inducción. Densidad celular fue medida por la densidad óptica a 600 nm (??ß??)- Otros medios de cultivo adecuados para el crecimiento de Pseudomonas fluorescens pueden también ser utilizados, por ejemplo, como se describe en Huang et al. , 2007 y Solicitud de Patente de EUA 20060008877.

Fraccionado celular y análisis SDS-PAGE de las muestras de matraces de agitación En cada período de muestreo, la densidad celular de muestras fue ajustada a OD6oo= 20 y 1 mi alícuotas se centrifugaron a 14000 x g durante cinco minutos. Las pellas celulares se congelaron a -20°. Las fracciones solubles e insolubles de pellas celulares en matraz congeladas y agitadas fueron generados tras la re-suspensión de las pellas en 0.5 mi de una solución reguladora de fosfato de potasio de Butterfield pH7.2 (Thermo-Fisher Scientific, Rockford, IL). Las muestras fueron sonicadas dos veces durante 45 segundos a una producción constante de 20, utilizando una sonda de 2 mm de diámetro y un sonicador Branson 250 (Danbury, CT), con hielo entre ráfagas. El lisado se centrifuga a 14,000 rpm durante 20 minutos a 4o y el sobrenadante se recuperó como la fracción soluble. La pella (fracción insoluble) fue luego resuspendida en un volumen igual en solución reguladora de fosfato de Butterfield ().

Muestras fueron mezcladas 1 :1 con regulador de pH de muestra 2X Laemmli que contienen ß-mercaptoetanol (Sambrook et al., supra.) y bullen por 5 minutos antes de la carga sobre gel Criterion XT® Bis-Tris 12% (Bio-Rad Inc., Hercules, CA.) Electroforesis se realizó en el regulador de pH recomendado MOPS XT. Geles se tiñeron con tinta Bio-Safe Coomassie según el protocolo del fabricante (Bio-Rad) y con formación de imagen utilizando el sistema Alpha Innotech Imaging (San Leandro, CA).

Preparación de toxina de insecto DIG-84 La toxina de insecto DIG-84 se enriqueció con 45.5 gramos pasta celular de Pseudomonas recombinante resuspendida en 400 mL de solución reguladora de lisis (100 mM CAPS, 5 mM EDTA, 5 mM TCEP (clorhidrato de Tris(2-carboxietil)-fosfina)) pH1 1 ). La suspensión se pasó dos veces a través de un microfluidizador M-1 10Y Microfluidizer® (Microfluidics Inc., Newton, MA). Este dispositivo está equipado con dos cámaras: el módulo de procesamiento auxiliar H30Z (APM), que tiene un tamaño de paso nominal de 200 mieras y la cámara de interacción HIOZ (IXC), que tiene un tamaño de paso nominal de 100 mieras. El APM se colocó aguas abajo de la IXC según lo recomendado por el fabricante. Las células fueron interrumpidas entre 773 y 1054 kg/cm2 y se aclararon mediante centrifugado (rotor SLC1500, 12,000 rpm, por 20 minutos). El sobrenadante se decantó y filtró (0.8 µ?t?) antes de la cromatografía con intercambio aniónico.

El lisado celular de Pseudomonas se dividió por la mitad y se procesó en dos lotes. La proteína DIG-84 se enriqueció al pasar el lisado a través de cinco columnas Trap Capto™ Q de 5 mi de alto (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) conectadas en serie de extremo a extremo. Se inyectó el lisado a través de la serie de 5 columnas a 5 ml/min. Las proteínas que no son de unión se eluyeron con solución reguladora (50 mM Bis Tris propano, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, pH9) hasta que la absorbancia a 280 nm alcanzó la línea basal. La elución continuó con la solución reguladora A conteniendo 0.15 M de NaCI para remover los contaminantes adicionales. Con la primera mitad del lisado, la concentración de NaCI se incrementó a 0.2 M para la elución continua de los contaminantes, luego las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal a 0.5 M de NaCI sobre 240 mi, mientras se recolectaban fracciones de 10 mi. Con la segunda mitad del lisado, después de la primera elución con la solución reguladora A, los contaminantes fueron removidos por elución con 0.15 M NaCI (el paso de elución con 0.2 M NaCI se eliminó), luego las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente de NaCI a 0.5 M como se describió anteriormente.

Las fracciones acumuladas se concentraron con un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerada Amicon Ultra-15 (corte de peso molecular 50,000, Millipore), luego se inyectó en en cassettes Slide-A-Lyzer® (corte de peso molecular 10,000; Thermo Fisher Scientific) y dializadas por la noche a 4 contra dos volúmenes de 4 litros de solución reguladora de diálisis (10 mM CAPS (ácido 3-(ciclohexamino)1-propanosulfónico), pH10). Las concentraciones totales de proteínas se determinaron posteriormente mediante un ensayo de proteína total Bradford.

Electroforesis con gel El extracto concentrado se preparó para electroforesis por dilución 1 :50 en regulador de pH de muestra NuPAGE® LDS (Invitrogen) que contiene 5 mM ditiotreitol como un agente reductor y se calienta a 95° durante 4 minutos. La muestra fue cargada en carriles duplicados de gel 4-12% NuPAGE® a lo largo de cinco estándares BSA que van desde 0.2 a 2 g/fila (para la generación de la curva estándar). Se aplica un voltaje a 200V utilizando regulador de pH que corre SDS MOPS (Invitrogen) hasta la tinta de seguimiento alcance la parte inferior del gel. El gel se tiñó con 0.2% Coomassie azul G-250 en metanol 45%, ácido acético 10%, y desteñido, primero brevemente con metanol 45%, ácido acético 10% y luego en longitud con ácido acético 7%, metanol 5% hasta que el fondo se clarifique. Tras el desteñido, el gel es analizado con un Biorad Fluor-S Multilmager. El software Instrument's Quantity One fue utilizado para obtener volúmenes sustraídos del fondo de las bandas de proteína teñida y para generar la curva estándar de BSA que se utilizó para calcular la concentración de proteína DIG-84 en la solución madre.

EJEMPLO 5 Actividad para insectos de la toxina de insecto DIG-84 modificada producida en Pseudomonas fluorescens La toxina de insecto DIG-84 se probó en cuanto a la actividad sobre las larvas de un insecto coleóptero, el gusano de raíz del maíz occidental (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte). La toxina de insecto DIG-84 se probó adicionalmente en cuanto a actividad sobre las larvas de insectos lepidópteros, incluyendo por ejemplo palomilla dorso (DBM; Plutella xylostella (Linnaeus) y DBM resistente a cryIA (rDBM).

Preparación de muestra y bioensavos Muestras de DIG-84 se prepararon en 10 mM CAPS pH 10 y todos los bioensayos contuvieron un tratamiento de control consistente en este regulador de pH, que sirve como una comprobación de fondo para la inhibición del crecimiento o la mortalidad.

Las concentraciones de proteínas en el regulador de pH de bioensayo se calcularon por electroforesis en gel con BSA para crear una curva estándar para densitometría en gel, que fue medido utilizando un sistema de imagen BioRad (Fluor-S Multilmager con un software Quantity One versión 4.5.2). Las proteínas en la matriz de gel fueron teñidas con tinta de azul de Coomassie y desteñidas antes de la lectura.

Proteínas purificadas fueron probadas para la actividad de insectos en bioensayos con larvas de insecto neonato en dieta artificial de insecto. Larvas de DBM y rDBM fueron incubadas de huevos procedentes de una colonia mantenida por un insectario comercial (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). Huevos WCR se obtuvieron Crop Characteristics, Inc. (Farmington, MN).

Los bioensayos se realizaron en bandejas de plástico de 128 pozos diseñados específicamente para bioensayos de insectos (C-D International, Pitman, NJ). Cada pozo contuvo 1.0 mL de Productos dietéticos de múltiples especies de Lepidoptera (Southland Products, Lake Village, AR) o una dieta patentada diseñada para el crecimiento de insectos coleópteros (Dow AgroSciences LLC, Indianapolis, IN). Un alícuota de 40 µ? o 60 pL de muestra de proteína fue suministrada por la pipeta sobre la superficie de dieta de 1.5 cm2 de cada pozo (27 pL/cm2 o 40 pL/cm2). Las concentraciones de dieta se calcularon como la cantidad (ng) de proteína DIG-84 por centímetro cuadrado (cm2) del área de superficie en el pozo. Las bandejas tratadas se mantuvieron en una campana hasta que el líquido en la superficie de dieta se haya evaporado o absorbido en la dieta.

Dentro de unas horas de eclosión, las larvas individuales fueron recogidas con un pincel de pelo de camello humedecido y depositadas en el alimento tratado, una o dos larvas por pozo. Los pozos infestados luego fueron sellados con hojas adhesivas de plástico transparente, ventilados para permitir el intercambio de gases (C-D International, Pitman, NJ). Las bandejas de bioensayo se mantuvieron en condiciones ambientales controladas (28°C, ~40% de humedad relativa, 16:8 [luz:oscuridad]) durante 5 días, tras lo cual se registró el número total de insectos expuestos a cada muestra de proteína, el número de insectos muertos y el peso de insectos sobrevivientes. La mortalidad porcentual, los pesos en vivo promedio y la inhibición del crecimiento se calcularon para cada tratamiento. El retraso de crecimiento se definió como una disminución en los pesos en vivo promedio. Inhibición de crecimiento (Gl) se calculó como sigue: Gl = [1 -(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] donde TWIT es el peso total de insectos vivos en el tratamiento, TNIT es el número total de insectos en el tratamiento TWIBC es el peso total de insectos vivos en la verificación de antecedentes (control de regulador de pH) y TNIBC es el número total de insectos en la comprobación de fondo (control de regulador de pH).

El GI5o se determinó que es la concentración de la proteína DIG-84 en la dieta en donde el valor de Gl era de 50%. La LC50 (50% de concentración letal) fue registrada como la concentración de proteína DIG-84 en la dieta en donde 50% de insectos de prueba fueron asesinados El análisis estadístico se llevó a cabo al utilizar un software JMP (SAS, Cary, NC).

Los bioensayos duplicados demostraron que la ingesta de la toxina DIG-84 de insectos resulta en un retraso de crecimiento de las larvas del gusano de la raíz del maíz, como se muestra en el cuadro 4. No se observó la actividad analizada contra otros insectos.

CUADRO 4 Retraso de crecimiento de la proteína DIG-84 ingerida por las larvas del gusano de la raíz de maíz Medios para análisis unidrecional de variación de peso promedio (mg) por insecto Número de 95% Tratamiento Promedio Error est. 95% inferior pruebas superior Regulador de 6 0.464032 0.03030 0.39979 0.52827 pH CAPS 10 DIG-84 3 0.246928 0.04285 0.15608 0.33777 Agua 6 0.436942 0.03030 0.37270 0.501 18 Comparaciones para todos los pares (Peso promedio (mg) por insecto) utilizando Tukey- Kramer HSD Tratamiento Clase* Clase* Promedio Regulador de A 0.464032 pH CAPS 10 Water A 0.436942 DIG-84 B 0.246928 * TRATAMIENTOS NO CONECTADOS POR LA MISMA LETRA SON SIGNIFICATIVAMENTE DIFERENTES EJEMPLO 6 Transformación de Aqrobacterium Métodos de clonación estándar se utilizan en la construcción de los plásmidos de transformación y expresión de plantas binarias. Endonucleasas de restricción y T4 ADN ligasa son obtenidas de NEB. Preparación de plásmido se realizan utilizando el kit NucleoSpi® plásmido o el kit NucleoBond® AX Xtra Midi (ambos de Macherey-Nagel), siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Los fragmentos de ADN son purificados mediante el Kit de purificación QIAquick® PCR o el kit de extracción QIAEX II® Gel (ambos de Qiagen) después del aislamiento de gel.

Los fragmentos de ADN que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican las toxinas de insectos DIG-1 1 modificadas, o sus fragmentos, pueden ser sintetizados por un proveedor comercial (por ejemplo. DNA2.0, Menlo Park, CA) y suministrado como fragmentos clonados en vectores plásmidos estándar, o pueden ser obtenidos por manipulación de biología molecular estándar de otras construcciones que contengan secuencias de nucleótidos apropiadas. Los únicos sitios de restricción internos para cada gen pueden identifcarse y un fragmento para cada gen sintetizado, cada uno con una supresión o inserción específica. Los fragmentos Cry modificados pueden subclonarse en otras regiones codificadoras de fragmentos Cry en un sitio de restricción adecuado para obtener una región codificadora que codifica la proteína de longitud completa deseada, las proteínas fusionadas o proteínas variables suprimidas. Por ejemplo, uno puede identificar un sitio de reconocimiento de restricción apropiado al comienzo del gen y un segundo sitio de restricción interna específico para cada gen, que puede utilizarse para construir clones variables.

En un ejemplo no limitante, una estrategia básica de clonación puede ser subclonar las secuencias de longitud completa o de codificación de Cry modificada (CDS) en un plásmido de expresión de planta en sitios de restricción Ncol y Sacl. Los cartuchos resultantes de expresión de planta que contienen la región apropiada de codificación Cry bajo el control de elementos de expresión de planta, (por ejemplo, promotores expresables de planta, terminal de transcripción terminal 3' y determinantes de adición de poliadenilato, y similares) se subclonan en un plásmido de vector binario, utilizando, por ejemplo, la tecnología de Gateway® o los procedimientos de clonación de fragmento de enzima de restricción estándar. LR Clonase™ (Invitrogen) por ejemplo, puede utilizarse para recombinar la longitud total y los cartuchos modificados de expresión de planta génica en un plásmido de transformación de planta binario si se utiliza la tecnología de Gateway®. Es conveniente emplear un vector de transformación de planta binario que alberga un gen bacteriano que confiere resistencia al antibiótico espectinomicina cuando el plásmido está presente en las células de E. coli y Agrobacterium. También es conveniente emplear un plásmido de vector binario que contiene un gen marcador seleccionare expresable en planta que es funcional en las plantas hospederas deseadas. Ejemplos de genes marcadores seleccionares expresables en planta incluyen pero no están limitados al gen de fosfotransferasa aminoglucósido (aphll) del transposón Tn5, que codifica la resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina y G418, así como los genes que codifican la resistencia o tolerancia a herbicidas de glifosato; higromicina; metotrexato; fosfinotricina (bialafos), imidazolinonas, sulfonilureas y de triazolopirimidina, tal como clorosulfuron, bromoxinil, dalapon y similares.

Las células electro-competentes de cepa Agrobacterium tumefaciens Z707S (un derivado resistente a la estreptomicina de Z707; Hepburn et al., 1985) se preparan y transforman utilizando electroporación (Weigel y Glazebrook, 2002). Después de la electroporación, 1 mi de caldo de YEP (gm/l: extracto de levadura, 10; peptona, 10; NaCI, 5) se agregan a la cubeta y la suspensión célula-YEP es transferido a un tubo de cultivo de 15 mi para incubación a 28° en un baño de agua con agitación constante durante 4 horas. Las células se ponen en placas en YEP más agar (25 gm/L) con espectinomicina (200 pg/mL) y estreptomicina (250 pg/mL) y las placas se incubaron durante 2-4 días a 28°. Colonias única bien separadas son seleccionadas y rayadas en YEP + placas de agar frescas con espectinomicina y estreptomicina como antes y se incuban a 28° durante 1 -3 días.

La presencia del inserto de genes de toxinas de insectos DIG-1 1 en el vector de transformación de planta binario se realizó mediante análisis PCR utilizando los iniciadores específicos de vector con ADN de plásmido de plantilla preparado a partir de las colonias de Agrobacterium . La pella celular de una alícuota de 4 mi de un cultivo durante la noche 15 mi crece en YEP con espectinomicina y estreptomicina como antes se mencionó se extrae mediante Qiagen Spin® Mini Preps, realizada por instrucciones del fabricante. El ADN de plásmido del vector binario utilizado en la transformación de electroporación de Agrobacterium está incluido como un control. La reacción PCR se completa con Taq ADN polimerasa de Invitrogen por instrucciones del fabricante en concentraciones de 0.5 X. Reacciones PCR se llevan a cabo en un ciclador térmico MJ Research Peltier programado con las siguientes condiciones: etapa 1) 94° durante 3 minutos; etapa 2) 94° durante 45 segundos; etapa 3) 55° durante 30 segundos; etapa 4) 72° durante 1 minuto por kb de longitud de producto esperado; etapa 5) 29 veces a la etapa 2; etapa 6) 72° durante 10 minutos. La reacción se mantiene a 4° después de ciclado. Los productos de amplificación son analizados por electroforesis en gel de agarosa (por ejemplo, agarosa de 0.7 % a 1 % p/v) y visualizados por la tinción de bromuro de etidio. Una colonia es seleccionada cuyo producto de PCR es idéntico al control plásmido.

Alternativamente, la estructura de plásmido del vector de transformación de planta binario que contiene el inserto de genes DIG-1 1 se realiza mediante la asignación de huella digital de digestión de restricción del plásmido ADN preparado de aislados candidatos deAgrobacterium mediante los métodos de biología molecular estándar conocidos en la técnica de manipulación de Agrobacterium.

Aquellos expertos en la técnica para obtener plantas transformadas a través de métodos de transformación mediada por /4grobacteritvA77Comprenderán que otras cepas Agrobacterium además de Z707S pueden ser utilizadas por conveniencia, y la elección de la cepa puede depender de la identidad de las especies de plantas hospederas a transformarse.

EJEMPLO 7 Producción de toxinas de insectos DIG-11 y variantes en plantas dicotiledóneas Transformación de Arabidopsis Arabidopsis thaliana Col-01 se transforma usando el método de inmersión floral (Weigel and Glazebrook, 2002). La colonia de Agrobacterium seleccionada se utiliza apra inocular cultivos de 1 mL a 15 mL de caldo de YEP que contien los antibióticos adecuados para la selección. El cultivo es incubado durante la noche a 28° con agitación constante a 220 rpm. Cada cultivo es utilizado para inocular dos cultivos de 500 mi de caldo YEP que contienen antibióticos adecuados para la selección y nuevos cultivos se incuban durante la noche a 28° con agitación constante. Las células se granulan en aproximadamente 8700 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se descarta el sobrenadante resultante. La pella celular es resuspendida suavemente en 500 mi de medio de infiltración que contiene: 1/2 x sales Murashige y Skoog (S¡gma-Aldrich)/vitam¡nas B5 de Gamborg (Gold BioTechnology, St.Louis, MO), sacarosa 10% (p/v), 0.044 µ? bencilaminopurina (10 µ?/litro de 1 mg/ml solución madre en DMSO) y 300 µ?/litro Silwet L-77. Plantas aproximadamente de 1 mes de edad se sumergen en el medio durante 15 segundos, con cuidado para asegurar la inmersión de la inflorescencia más reciente. Las plantas luego se tienden a sus lados y se cubren (transparente u opaco) durante 24 horas, se lavan con agua y colocan en posición vertical. Las plantas se cultivan a 22°, con un fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. Aproximadamente 4 semanas después de la inmersión, se cosechan las semillas.

Crecimiento y selección de Arabidopsis La semilla T1 recientemente cosechada se dejó secar durante al menos 7 días a temperatura ambiente en la presencia de un desecante. La semilla es suspendida en una solución de agar/agua (Sigma - Aldrich) 0.1 % y luego se estratifica a 4o durante 2 días. Para preparar la siembra, Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) en bandejas de germinación de 26.67 cm x 53.34 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN) es cubierto con vermiculita fina, sub-irrigada con solución de Hoagland (Hoagland y Arnon, 1950) hasta que esté húmeda y se permite escurrir durante 24 horas. Semilla estratificada es sembrada en la vermiculita y se cubre con cúpulas de humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canadá) durante 7 días. Se germinaron las semillas ylas plantas se cultivaron en un Conviron (Modelos CMP4030 o CMP3244; Controlled Enviroments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) bajo condiciones a lo largo del día (16 horas de luz/8 horas de oscuridad) a una intensidad luminosa de 120-150 pmol/m2seg bajo temperatura (22°) y humedad (40-50%) constante. Plantas inicialmente son regadas con solución de Hoagland y posteriormente con agua desionizada para mantener el suelo húmedo pero no mojado.

Se quitan las cúpulas 5-6 días después de la siembra y las plantas se rocían con un agente químico de selección para matar plantas germinadas de semillas no transformadas. Por ejemplo, si el gen marcador expresable seleccionare de planta proporcionado por el vector de transformación de planta binario es un gen pat o bar (Wehrmann et al., 1996), plantas transformadas pueden seleccionarse mediante rociado con una solución 1000X de Finale (5.78% glufosinato amónico, Farnam Companies Inc., Phoenix, AZ). Dos rociados subsiguientes se realizan en intervalos de 5-7 días. Supervivientes (plantas creciendo activamente) se identifican 7-10 días después del último rociado y trasplantarse en macetas preparadas con Sunshine Mix LP5. Plantas trasplantadas son cubiertas con una cúpula de humedad durante 3-4 días y colocadas en un Conviron en las condiciones de crecimiento antes mencionadas.

Los expertos en la técnica de la transformación de plantas dicotiledóneas comprenderán que otros métodos de selección de vegetales transformadas están disponibles cuando otros genes marcadores expresables seleccionable (por ejemplo, genes de tolerancia de herbicidas) se usan.

Bioensayos de insectos de Arabidopsis transgénica Las líneas de Arabidopsis transgéncia que expresan proteínas Cry modificada demostraron ser activas contra las especies de insectos sensibles en los ensayos de recubrimiento de dieta artificial. La proteína extraída de líneas transgénicas y no transgénicas de Arabidopsis se cuantifican mediante métodos adecuados y los volúmenes de muestra se ajustan para normalizar la concentración de proteínas. Bioensayos se llevan a cabo en dieta artificial como se describió anteriormente. La Arabidopsis no transgénica y/o el regulador de pH y agua se incluyen en ensayos como tratamientos de verificación de fondo.

EJEMPLO 8 Transformación de Aprobacteríum para generación de los vectores binarios El sistema súper-binario Agrobacterium convenientemente se utiliza para la transformación de los hospederos de la planta monocotiledónea. Las metodologías para construir y validar los vectores súperbinarios están bien establecidas. Véase, por ejemplo, la patente europea No. EP604662B1 y la patente de E.U.A. No. 7060876. Métodos biológicos y microbiológicos moleculares estándar se utilizan para generar plásmidos super-binarios. La verificación/validación de la estructura del plásmido super-binarios se realiza utilizando metodologías como se describe anteriormente.

EJEMPLO 9 Producción de toxinas de insectos DIG-11 y variantes en plantas monocotiledóneas Transformación mediada por A robacteriumóe maíz Las semillas de un cruce High II Fi (Armstrong et ai, 1991 ) se plantan en macetas de 5 galones que contienen una mezcla de 95% del medio de crecimiento sin tierra Metro-Mix 360 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) y 5% de tierra arcilloso/limosa. Las plantas son cultivadas en invernadero mediante una combinación de sodio de alta presión y lámparas de haluro metálico con un fotoperíodo de 16:8 horas de luz:oscuridad. Para la obtención de embriones inmaduros F2 para la transformación, se realizan sib-polinizaciones controladas. Embriones inmaduros están aislados en 8 a 10 días después de la polinización, cuando los embriones son aproximadamente de 1.0 a 2.0 mm de tamaño.

Oídos de maíz son esterilizados en la superficie por lavado con jabón líquido, sumergiendo en etanol 70% por 2 minutos y luego se sumergen en 20% de blanqueador comercial (hipoclorito de sodio 0.1 %) durante 30 minutos antes de enjuagarse con agua estéril. Las células de Agrobacterium de suspensión que contienen un vector súper-binario mediante la transferencia de 1-2 bucles de bacterias cultivadas en medio sólido YEP que contiene espectinomicina 100 mg/l, tetraciclina 10 mg/l y estreptomicina 250 mg/l en 28° durante 2-3 días en 5 mi de medio líquido de infección (Medio Basal LS (Linsmaier y Skoog, 1965), vitaminas N6 (Chu et al., 1975), ácido 2,4-diclorofenoxiacético 1.5 mg/l (2,4-D), sacarosa 68.5 mg/l, glucosa 36.0 mg/l, 6 mM L-prolina, pH 5.2) que contiene 100 µ? de acetosiringona. La solución fue agitada con vórtice hasta que se logró una suspensión uniforme y la concentración se ajusta a una densidad final de aproximadamente 200 unidades Klett, utilizando un colorímetro Klett Summerson con un filtro de color púrpura. Embriones inmaduros se aislan directamente en un tubo de micro-centrífuga que contiene 2 mi del medio de infección. El medio es eliminado y reemplazado con 1 mi de la solución de Agrobacterium con una densidad de 200 unidades Klett, y el Agrobacterium y la solución de embrión se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se transfieren a medio de cultivación (Medio Basal LS, vitaminas N6, 1.5 mg/L 2,4-D, sacarosa 30.0 mm/l, 6 mM L-prolina, AgNÜ3 0.85 mg/l, 100 M acetosiringona, goma de Gelano 3.0 mg/l (PhytoTechnology Laboratories., Lenexa, KS), pH 5,8) durante 5 días a 25°C en condiciones de oscuridad.

Después de la co-cultivación, los embriones son transferidos al medio selectivo tras lo cual se obtienen aislados transformados a lo largo de aproximadamente 8 semanas. Para la selección de tejidos de maíz transformados con un plásmido súper-binario que contiene un gen marcador seleccionable de planta expresable pat o barra, un medio basado en LS (medio basal de LS, vitaminas N6, 1.5 mg/l 2,4-D, MES 0.5 mg/L (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico monohidratado; PhytoTechnologies Labr.), sacarosa 30.0 mm/L, L-prolina 6 mM, 1.0 mg/l AgN03, cefotaxima 250 mg/l, 2.5 mg/l goma de gelano, pH 5.7) se utiliza con Bialaphos (Gold BioTechnology). Los embriones se transfieren a los medios de selección que contienen 3 mg/l Bialafos hasta que se obtuvieron aislados embriogénicos. Aislados recuperados son agrupados al transferir a medio de selección fresco a intervalos de dos semanas para la regeneración y análisis posterior.

Aquellos expertos en la técnica de la transformación del maíz entenderán que otros métodos de selección de vegetales transformados están disponibles cuando se utilizan otros genes expresables marcadores seleccionable de planta (por ejemplo, genes de tolerancia a herbicidas).

Regeneración y producción de semillas.

Para la regeneración, los cultivos se transfieren a medio de inducción "28" (Sales y vitaminas MS, sacarosa de 30 mg/l, bencilaminopurina 5 mg/l, 2,4-D 0.25 mg/l, Bialaphos 3 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, goma gelano 2.5 mg/L, pH 5.7) 1 semana en condiciones de poca luz (14 pEm-2s'2) luego 1 semana en condiciones de iluminación alta (aproximadamente 89 pEm-2s"2). Tejidos son transferidos posteriormente a "36" medio de regeneración (igual que el medio de inducción excepto que carecen de reguladores del crecimiento de plantas). Cuando plántulas crecen a 3-5 cm de longitud, fueron trasladadas a tubos de cultivo de vidrio que contienen medio SHGA (sales Schenk y Hildebrandt y vitaminas (1972); PhytoTechnologies Labr.), 1.0 mg/L myo-inositol, sacarosa 10 mg/L y gomagelano 2.0 gm/l, pH 5.8) para permitir el crecimiento y desarrollo adicional del tallo y raíces. Las plantas son trasplantadas a la misma mezcla de suelo como se describió anteriormente en este documento y crecidas a flores en el invernadero. Se llevan a cabo polinizaciones controladas para la producción de semillas.

EJEMPLO 10 Bioensayo de maíz transqénico La bioactividad de la toxina DIG-11 de insecto y las variantes producidas en células vegetales se demuestra mediante los métodos convencionales de bioensayo (véase, por ejemplo Huang et al., 2006). Uno es capaz de demostrar la eficacia, por ejemplo, al alimentar varios tejidos vegetales o trozos de tejido derivados de una planta que produce una toxina DIG-1 1 de insecto a los insectos objetivo en un entorno controlado de alimentación. Alternativamente, los extractos de proteína pueden prepararse a partir de varios tejidos vegetales derivados de una planta que produce la toxina DIG-1 1 de insecto e incorporan las proteínas extraídas en un bioensayo de dieta artificial como se describe anteriormente en la presente. Es de entenderse que los resultados de estos ensayos de alimentación son para compararse con bioensayos conducidos similarmente que emplean tejidos de control apropiados de plantas hospederas que no producen la proteína DIG-1 1 de insecto o las vanantes, u otras muestras de control.

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Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un polipéptido aislado que comprende un segmento de toxina de núcleo seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 142 a 664 de SEQ ID NO:2; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de los residuos 142 a 664 de SEQ ID NO:2; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de residuos 142 a 664 de SEQ ID NO:2 con hasta 20 sustituciones, supresiones o modificaciones de aminoácidos, que no afectan adversamente la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2; o un fragmento insecticídicamente activo del mismo.

2.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un segmento de toxina de núcleo seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 664 de SEQ ID NO:2; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 664 de SEQ ID N0.2; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 664 de SEQ ID NO:2 con hasta 20 sustituciones, supresiones o modificaciones de aminoácidos, que no afectan adversamente la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2; o un fragmento insecticídicamente activo del mismo.

3.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un segmento de toxina de núcleo seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 142 a 1 164 de SEQ ID NO:2; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de los residuos 142 a 1 164 de SEQ ID NO:2; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de residuos 142 a 1 164 de SEQ ID NO:2 con hasta 20 sustituciones, supresiones o modificaciones de aminoácidos, que no afectan adversamente la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2; o un fragmento insecticídicamente activo del mismo.

4.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un segmento de toxina de núcleo seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 1 164 de SEQ ID NO:2; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 1 164 de SEQ ID NO:2; (c) un poiipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 1164 de SEQ ID NO:2 con hasta 20 sustituciones, supresiones o modificaciones de aminoácidos, que no afectan adversamente la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2; o un fragmento insecticídicamente activo del mismo.

5. - Una planta que comprende el poiipéptido de la reivindicación 1.

6. - Una planta que comprende el poiipéptido de la reivindicación 2.

7.- Una planta que comprende el poiipéptido de la reivindicación 3.

8. - Una planta que comprende el poiipéptido de la reivindicación 4.

9. - Un método para controlar una población de plaga que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad pesticidamente efectiva del poiipéptido de conformidad con la reivindicación .

10. - Un ácido nucleico aislado que codifica un poiipéptido de la reivindicación 1.

1 1. - Un ácido nucleico aislado que codifica un poiipéptido de la reivindicación 2.

12. - Un ácido nucleico aislado que codifica un poiipéptido de la reivindicación 3.

13. - Un ácido nucleico aislado que codifica un poiipéptido de la reivindicación 4.

14.- El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

15.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 5.

16. - Una construcción de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de la reivindicación 10 unida de manera operable a un promotor que no se deriva de Bacillus thuringiensis y es capaz de activar la expresión en una planta.

17. - Una planta transgénica que comprende la construcción de ADN de la reivindicación 16 incorporada establemente en su genoma.

18. - Un método para proteger una planta de una plaga que comprende introducir en dicha planta la construcción de la reivindicación 16.

19. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 3 ó 4, caracterizado además porque tiene actividad contra el gusano de tierra del maíz.