CN109475124A - 新型昆虫抑制蛋白 - Google Patents

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Abstract

公开了对鳞翅类害虫的种表现出毒性活性的杀虫蛋白，并且包括但不限于TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473和TIC7473PL。提供了含有编码一种或多种公开的杀虫蛋白的重组核酸序列的DNA构建体。提供了抗鳞翅类侵袭的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，其含有编码本发明的所述杀虫蛋白的重组核酸序列。还提供了用于检测生物样品中本发明的重组核酸序列或蛋白质的存在的方法，以及使用TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473和TIC7473PL杀虫蛋白中的任一种来防治鳞翅类种的害虫的方法。

Description

新型昆虫抑制蛋白
相关申请的引用
本申请要求2015年8月27日提交的美国临时申请No.62/210,737 的权益，其全部内容通过引用并入本文。
序列表的引入
包含序计算机可读形式的序列表的名为“38-21_61627US0001SEQLISTING_ST25.txt”的文件创建于2016年8 月3日。该文件为94,508字节(在MS-中测量)，通过电子提交同时提交(使用美国专利局EFS-Web提交系统(United States PatentOffice EFS-Web filing system))，并且通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明一般涉及昆虫抑制蛋白的领域。公开了一类新型的对作物植物和种子的农业相关害虫表现出昆虫抑制活性的蛋白质。特别地，所公开的一类蛋白质对作物植物和种子的农业相关害虫，特别是对鳞翅类种的害虫具有杀虫活性。提供了含有编码一种或多种公开的毒素蛋白的重组多核苷酸构建体的植物、植物部分和种子。
发明背景
提高包括玉米、大豆、甘蔗、稻、小麦、蔬菜和棉花等在内的农业重要植物的作物产量已变得越来越重要。除了需要越来越多的农产品来为增长的人口提供食物、衣物和能量以外，预期气候相关影响和来自增长的人口使用农业实践以外的土地的压力也会减少农业可用耕地的量。这些因素导致对粮食安全的严峻预测，特别是在植物生物技术和农艺实践缺乏重大改进的情况下。鉴于这些压力，技术、农业技术和害虫管理方面的环境可持续的改进是在有限的耕地面积上扩大作物生产的重要工具。
昆虫，特别是鳞翅目和鞘翅目的昆虫被认为是大田作物受损的主要原因，从而降低了侵袭地区的作物产量。对农业有不利影响的鳞翅类害虫的种包括但不限于莎草粘虫(Black armyworm)(Spodoptera exempta)、秋菜夜蛾(Black cutworm)(Agrotisipsilon)、玉米穗虫(Corn earworm)(Helicoverpa zea)、棉叶波纹夜蛾(Cotton leafworm) (Alabama argillacea)、菱纹背蛾(Diamondback moth)(Plutella xylostella)、欧洲玉米螟(European corn borer)(Ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾(Fall armyworm)(Spodoptera frugiperda)、Cry1Fa1抗性草地贪夜蛾(Cry1Fa1resistant Fall armyworm)(Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫(Old World bollworm)(OWB,Helicoverpaarmigera)、南部夜蛾(Southern armyworm)(Spodoptera eridania)、大豆尺夜蛾(Soybeanlooper)(Chrysodeixis includens)、斑纹钻夜蛾 (Spotted bollworm)(Eariasvittella)、西南玉米螟(Southwestern Corn Borer)(Diatraea grandiosella)、烟芽夜蛾(Tobacco budworm) (Heliothis virescens)、烟斜纹夜蛾(Tobacco cutworm)(Spodoptera litura，也称为群毛虫(cluster caterpillar))、西方豆夜蛾(Western beancutworm)(Striacosta albicosta)和绒毛豆夜蛾(Velvetbean caterpillar)(Anticarsia gemmatalis)。
历史上，依赖于合成化学杀虫剂的广泛应用来作为农业中的害虫防治剂。除了出现的抗性问题外，对环境和人类健康的担忧激发了生物杀虫剂的研发。这项研究工作导致逐渐发现和使用各种昆虫病原性微生物物种，包括细菌。
当昆虫病原性细菌，特别是属于芽孢杆菌属的细菌的潜力被发现并开发为生物害虫防治剂时，生物防治范例发生了转移。细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的菌株已被用作杀虫蛋白的来源，这是因为发现Bt菌株对特定昆虫具有高毒性。已知Bt菌株产生δ-内毒素，其在孢子形成开始时和静止生长期期间位于伴孢结晶包涵体内(例如Cry蛋白质)，并且也已知其产生分泌的杀虫蛋白。在被易感昆虫摄食后，δ-内毒素以及分泌毒素在中肠上皮表面发挥其作用，破坏细胞膜，导致细胞破裂和死亡。编码杀虫蛋白的基因也在除 Bt以外的细菌物种中被鉴定出来，包括其他芽孢杆菌属和多种其他细菌物种，例如侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus，“Ls”，以前称为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus))和日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。
结晶和分泌的可溶性杀虫毒素对它们的宿主是高度特异性的并且作为化学杀虫剂的替代物已经获得全世界的认可。例如，杀虫毒素蛋白已被用于各种农业应用中，以保护农业上重要的植物免受昆虫侵袭，减少对化学杀虫剂应用的需求并提高产量。通过机械方法，例如喷洒以将含有各种细菌菌株的微生物制剂分散到植物表面上，以及通过使用遗传转化技术产生表达杀虫毒素蛋白的转基因植物和种子，杀虫毒素蛋白被用于防治作物植物的农业相关害虫。
表达杀虫毒素蛋白的转基因植物的使用已经在全球范围内适用。例如，2012年，有2610万公顷种植了表达Bt毒素的转基因作物(James, C.,Global Status ofCommercialized Biotech/GM Crops:2012.ISAAA Brief No.44)。转基因防虫作物的全球使用和这些作物中使用的有限数目的杀虫毒素蛋白为赋予对目前使用的杀虫蛋白的抗性的现有昆虫等位基因产生了选择压力。
目标害虫对杀虫毒素蛋白的抗性的发展产生了对发现和开发新形式的杀虫毒素蛋白的持续需求，所述新型杀虫毒素蛋白可用于管理对表达杀虫毒素蛋白的转基因作物的昆虫抗性的增加。新的蛋白毒素具有改善的效力并且对更广泛的易感昆虫种类表现出防治，这将减少可发展抗性等位基因的存活昆虫的数量。另外，在一个植物中使用两种或更多种对相同害虫有毒性并显示不同作用方式的转基因杀虫毒素蛋白，降低了在任何单个目标昆虫物种中的抗性的可能性。
因此，发明人在本文中公开了对以下物种表现出杀虫活性的来自日本甲虫类芽孢杆菌的新型蛋白毒素家族，以及类似毒素蛋白、变体蛋白和示例性重组蛋白：鳞翅类的种，特别是莎草粘虫(Spodoptera exempta)、秋菜夜蛾(Agrotis ipsilon)、玉米穗虫((Helicoverpa zea)、棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea)、菱纹背蛾(Plutellaxylostella)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、Cry1Fa1抗性草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫 (OWB,Helicoverpaarmigera)、南部夜蛾(Spodoptera eridania)、大豆尺夜蛾(Chrysodeixis includens)、斑纹钻夜蛾(Earias vittella)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、烟斜纹夜蛾(Spodoptera litura，也称为群毛虫)、西方豆夜蛾(Striacosta albicosta)和绒毛豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)。
发明内容
本文公开了一组新型的具有昆虫抑制活性的杀虫蛋白(毒素蛋白)，在本文称为TIC6757、TIC7472和TIC7473，属于TIC6757蛋白毒素类别，其对作物植物的一种或多种害虫表现出抑制活性。 TIC6757蛋白和TIC6757蛋白毒素类别中的蛋白质可以在制剂中和在植物中(in planta)单独使用或与其他杀虫蛋白和毒性剂组合使用，从而提供了目前农业系统中使用的杀虫蛋白和杀虫剂化学物的替代品。
在一个实施方案中，本申请公开了重组核酸分子，其包含与编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子片段，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、 SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或 SEQ ID NO:18具有至少85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(c)所述多核苷酸区段与具有SEQ ID NO:3、SEQID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的多核苷酸杂交；或(d)编码杀虫蛋白或其片段的所述多核苷酸区段包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的核苷酸序列具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％序列同一性的多核苷酸序列；或(e)所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒和细菌或酵母人工染色体。重组核酸分子可以包含用于在植物中表达杀虫蛋白的序列；或在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的杀虫蛋白。
本申请的另一个实施方案中是包含本申请的重组核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞和植物细胞。考虑的细菌宿主细胞包括土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、埃希氏菌属 (Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)和欧文氏菌属(Erwinia)。在某些实施方案中，所述芽孢杆菌属的种是蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，所述短芽孢杆菌属是侧孢短芽孢杆菌，或者埃希氏菌属是大肠杆菌(Escherichia coli)。考虑的植物宿主细胞包括双子叶植物细胞和单子叶植物细胞。考虑的植物细胞还包括苜蓿 (alfalfa)、香蕉(banana)、大麦(barley)、豆类(bean)、西兰花(broccoli)、卷心菜(cabbage)、芸苔(brassica)、胡萝卜(carrot)、木薯(cassava)、蓖麻(castor)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、鹰嘴豆(chickpea)、白菜(Chinesecabbage)、柑橘(citrus)、椰子 (coconut)、咖啡(coffee)、玉米(corn)、三叶草(clover)、棉花(cotton) (棉属的种)、葫芦(cucurbit)、黄瓜(cucumber)、花旗松(Douglas fir)、茄子(eggplant)、桉树(eucalyptus)、亚麻(flax)、蒜(garlic)、葡萄(grape)、啤酒花(hops)、韭菜(leek)、莴苣(lettuce)、火炬松(Loblolly pine)、粟(millets)、瓜类(melons)、坚果(nut)、燕麦(oat)、橄榄(olive)、洋葱(onion)、观赏植物(ornamental)、棕榈(palm)、牧草(pasture grass)、豌豆(pea)、花生(peanut)、胡椒(pepper)、木豆(pigeonpea)、松树(pine)、马铃薯(potato)、杨树(poplar)、南瓜(pumpkin)、辐射松(Radiata pine)、萝卜(radish)、油菜籽(rapeseed)、稻(rice)、根茎(rootstocks)、黑麦(rye)、红花(safflower)、灌木(shrub)、高粱(sorghum)、南方松(Southern pine)、大豆(soybean)、菠菜(spinach)、倭瓜(squash)、草莓(strawberry)、甜菜(sugar beet)、甘蔗(sugarcane)、向日葵(sunflower)、甜玉米 (sweet corn)、枫香(sweet gum)、甘薯(sweet potato)、柳枝稷(switchgrass)、茶(tea)、烟草(tobacco)、番茄(tomato)、小黑麦 (triticale)、草坪草(turf grass)、西瓜(watermelon)和小麦(wheat) 植物细胞。
在另一个实施方案中，杀虫蛋白表现出针对鳞翅类昆虫的活性，所述鳞翅类昆虫包括绒毛豆夜蛾、甘蔗螟虫(Sugarcane borer)、小玉米茎蛀虫(Lesser cornstalkborer)、玉米穗虫、烟芽夜蛾、大豆尺夜蛾、莎草粘虫、南方夜蛾、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾(Beet armyworm)、旧世界棉铃虫、东方叶虫(Oriental leafworm)、棉红铃虫(Pinkbollworm)、秋菜夜蛾、西南玉米螟、棉叶波纹夜蛾、菱纹背蛾、斑纹钻夜蛾(Spotted bowlworm)、烟斜纹夜蛾、西方豆夜蛾和欧洲玉米螟。
本申请还考虑了包含重组核酸分子的植物，所述重组核酸分子包含与编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子片段，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:8、SEQID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18具有至少85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(c)所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的核苷酸序列的互补序列杂交；或(d)所述植物表现出可检测量的所述杀虫蛋白。在某些实施方案中，杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18。在一个实施方案中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物。在另一个实施方案中，所述植物进一步选自苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦。
在另一些实施方案中，公开了包含重组核酸分子的种子。
在另一个实施方案中，预期了包含本申请中公开的重组核酸分子的昆虫抑制组合物。所述昆虫抑制组合物可以进一步包含编码至少一种不同于所述杀虫蛋白的其他杀虫剂的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述至少一种其他杀虫剂选自昆虫抑制蛋白、昆虫抑制性dsRNA 分子和辅助蛋白。还预期了昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫种的活性。在一个实施方案中，昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂选自 Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、 Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、 Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、 Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、 ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、 TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、 TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-AXMI-、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、 AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113、和 AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、 AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和 AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、 AXMI-335、AXMI-R1及其变体、IP3及其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、 DIG-657和DIG-11蛋白。
还预期了包含可检测量的本申请中公开的重组核酸分子的商品。这样的商品包括由谷物处理者装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米谷物等；以及相应的大豆、稻、小麦、高粱、木豆、花生、水果、瓜类和蔬菜商品，适当时包括含有可检测量的本申请的这些多核苷酸和/或多肽的这些商品的汁、浓缩物、果酱、果冻、酱和其他可食用形式；完整或经处理的棉籽、棉籽油、棉绒；经处理用于饲料或食物的种子和植物部分；纤维、纸、生物质；以及燃料产品，例如来自棉籽油或来自轧棉机废物的丸粒的燃料；完整或经处理的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粉、大豆面、大豆片，大豆麸皮、大豆浆、大豆干酪、大豆酒，包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的奶油、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。
本申请还涵盖了生产包含本申请中公开的重组核酸分子的种子的方法。该方法包括种植至少一个包含本申请中公开的重组核酸分子的种子；由所述种子生长出植物；以及从所述植物收获种子，其中所述收获的种子包含本申请中的重组核酸分子。
在另一个说明性实施方案中，提供了抗昆虫侵袭的植物，其中所述植物的细胞包含：(a)重组核酸分子，其编码杀虫有效量的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQID NO:12、SEQ ID NO:16 或SEQ ID NO:18所示的杀虫蛋白；或(b)杀虫有效量的蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18具有至少85％、或90％、或 95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在本申请中还公开了用于防治鳞翅类种害虫和防治植物，特别是作物植物的鳞翅类种虫害的方法。在一个实施方案中，该方法包括(a) 使所述害虫与杀虫有效量的SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18所示的杀虫蛋白接触；或(b)使所述害虫与杀虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18具有至少85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本文还提供了检测包含编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的重组核酸分子的存在的方法，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、 SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18具有至少65％、或70％、或 75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约 100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(c)所述多核苷酸区段与具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的多核苷酸杂交。在本发明的一个实施方案中，该方法包括使核酸样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与来自包含编码本文提供的杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的植物的基因组DNA杂交，并且在这样的杂交条件下不与来自不包含所述区段的其他同基因植物的基因组DNA杂交，其中所述探针与 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17 或编码杀虫蛋白的序列同源或互补，所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、 SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。该方法可还包括(a)使所述样品和所述探针经受严格杂交条件；以及(b) 检测所述探针与所述样品的DNA的杂交。
本发明还提供了检测包含蛋白质的样品中杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；或所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQID NO:2、SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQID NO:16或SEQ ID NO:18具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该方法包括：(a)使所述样品与免疫反应性抗体接触；以及(b)检测蛋白质的存在。在一些实施方案中，检测步骤包括ELISA或Western印迹。
序列简述
SEQ ID NO:1是获自日本甲虫类芽孢杆菌种DSC004343的编码 TIC6757杀虫蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:2是TIC6757杀虫蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是设计用于在植物细胞中表达的编码TIC6757PL 杀虫蛋白的合成编码序列，其中紧接起始甲硫氨酸密码子插入额外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO:4是由设计用于在植物细胞中表达的合成编码序列 (SEQ ID NO:3)编码的TIC6757PL的氨基酸序列，并且其中紧接起始甲硫氨酸插入额外的丙氨酸。
SEQ ID NO:5是编码TIC6757_His杀虫蛋白的核酸序列，其中编码组氨酸标签的核酸序列可操作地连接至TIC6757编码序列的5’并且与其同框。
SEQ ID NO:6是TIC6757_His杀虫蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是获自日本甲虫类芽孢杆菌种DSC007648的编码 TIC7472杀虫蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:8是TIC7242杀虫蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是编码TIC7472_His杀虫蛋白的核酸序列，其中编码组氨酸标签的核酸序列可操作地连接至TIC7472编码序列的3’并且与其同框。
SEQ ID NO:10是TIC7472_His杀虫蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是从核苷酸位置1-2391的开放阅读框和翻译终止密码子的编码TIC7473杀虫蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:12是获自日本甲虫类芽孢杆菌种DSC008493的 TIC7243杀虫蛋白的氨基酸序列翻译。
SEQ ID NO:13是编码TIC7473_His杀虫蛋白的重组核酸序列，其中编码组氨酸标签的核酸序列可操作地连接至TIC7472编码序列的3’并且与其同框。
SEQ ID NO:14是TIC7473_His杀虫蛋白的氨基酸序列翻译。
SEQ ID NO:15是设计用于在植物细胞中表达的编码TIC7472PL 杀虫蛋白的合成编码序列，其中紧接起始甲硫氨酸密码子插入额外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO:16是由设计用于在植物细胞中表达的合成编码序列 (SEQ ID NO:15)编码的TIC7472PL的氨基酸序列，并且其中紧接起始甲硫氨酸插入额外的丙氨酸。
SEQ ID NO:17是设计用于在植物细胞中表达的编码TIC7473PL 杀虫蛋白的合成编码序列，其中紧接起始甲硫氨酸密码子插入额外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO:18是由设计用于在植物细胞中表达的合成编码序列 (SEQ ID NO:17)编码的TIC7473PL的氨基酸序列，并且其中紧接起始甲硫氨酸插入额外的丙氨酸。
发明详述
农业害虫防治领域中的问题可以表征为需要新的毒素蛋白，所述新的毒素蛋白对目标害虫有效，对目标目标害虫物种表现出广谱毒性，能够在植物中表达而不导致不希望的农业问题，并且与目前植物中商业使用的毒素相比提供替代作用方式。
本文公开了由TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、 TIC7473和TIC7473PL示例的新型杀虫蛋白，解决了这些需求中的每一个，特别是针对宽范围的鳞翅类害虫，特别是针对莎草粘虫 (Spodoptera exempta)、秋菜夜蛾(Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea)、菱纹背蛾 (Plutellaxylostella)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾 (Spodopterafrugiperda)、Cry1Fa1抗性草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫(OWB,Helicoverpa armigera)、南部夜蛾 (Spodoptera eridania)、大豆尺夜蛾(Chrysodeixisincludens)、斑纹钻夜蛾(Earias vittella)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、烟斜纹夜蛾(Spodoptera litura，也称为群毛虫)、西方豆夜蛾(Striacosta albicosta)和绒毛豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)。
本申请提及的TIC6757、“TIC6757蛋白”、“TIC6757蛋白毒素”、“TIC6757毒素蛋白”、“TIC6757杀虫蛋白”、“TIC6757相关毒素”、“TIC6757相关毒素蛋白”、TIC6757PL、“TIC6757PL蛋白”、“TIC6757PL蛋白毒素”、“TIC6757PL毒素蛋白”、“TIC6757PL杀虫蛋白”、“TIC6757PL相关毒素”、“TIC6757PL相关毒素蛋白”、TIC7472、“TIC7472蛋白”、“TIC7472蛋白毒素”、“TIC7472毒素蛋白”、“TIC7472 杀虫蛋白”、“TIC7472相关毒素”、“TIC7472相关毒素蛋白”、 TIC7472PL、“TIC7472PL蛋白”、“TIC7472PL蛋白毒素”、“TIC7472PL 毒素蛋白”、“TIC7472PL杀虫蛋白”、“TIC7472PL相关毒素”、“TIC7472PL相关毒素蛋白”、TIC7473、“TIC7473蛋白”、“TIC7473 蛋白毒素”、“TIC7473毒素蛋白”、“TIC7473杀虫蛋白”、“TIC7473相关毒素”、“TIC7473相关毒素蛋白”、TIC7473PL、“TIC7473PL蛋白”、“TIC7473PL蛋白毒素”、“TIC7473PL毒素蛋白”、“TIC7473PL 杀虫蛋白”、“TIC7473PL相关毒素”、“TIC7473PL相关毒素蛋白”等是指包含以下、由以下组成、与以下基本上同源、类似于以下、或衍生自以下的任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白：TIC6757(SEQ ID NO:2)、TIC6757PL(SEQ ID NO:4)、TIC7472(SEQ ID NO:8)、 TIC7472PL(SEQ ID NO:16)、TIC7473(SEQ ID NO:12)或TIC7473PL (SEQ ID NO:18)和赋予针对鳞翅类昆虫的活性的其杀虫或昆虫抑制片段，或者其组合，包括表现出杀虫或昆虫抑制活性的任何蛋白，如果此类蛋白与TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473 或TIC7473PL的比对导致从约85％到100％百分比的任何百分比分数的氨基酸序列同一性。TIC6757和TIC6757PL蛋白质包括蛋白质的质体靶向和非质体靶向形式。
在本申请中使用的术语“区段”或“片段”来描述比描述TIC6757、 TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL蛋白的完整氨基酸或核酸序列短的连续氨基酸或核酸序列。在以下情况下，表现出昆虫抑制活性的区段或片段也由本申请公开：如果这样的区段或片段与SEQ ID NO:2所示的TIC6757蛋白、SEQ ID NO:4所示的 TIC6757PL蛋白、SEQ ID NO:8所示的TIC7472蛋白、SEQ ID NO:16 所示的TIC7472PL蛋白、SEQ ID NO:12所示的TIC7473蛋白、或SEQ ID NO:18所示的TIC7473PL蛋白的相应部分的比对导致所述区段或片段与TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或 TIC7473PL蛋白的相应部分之间从约85％到约100％的任何百分比分数的氨基酸序列同一性。
在本申请中，提及的术语“活力”或“活性”、“杀虫活性”或“杀虫”或“杀昆虫活性”、“昆虫抑制”或“杀虫”是指毒性剂如蛋白毒素抑制(抑制生长、摄食、生殖力或生存能力)、遏制(遏制生长、摄食、生殖力或生存能力)、防治(在包含有效量的TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL蛋白的特定作物上防治虫害、控制害虫摄食活动)或杀死(引起发病、死亡或降低繁殖力) 害虫的效力。这些术语旨在包括向害虫提供杀虫有效量的毒性蛋白的结果，其中害虫暴露于毒性蛋白导致发病、死亡、降低繁殖力或发育迟缓。这些术语还包括由于在植物中或植物上提供了杀虫有效量的毒性蛋白，所以从植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞或植物可能生长的特定地理位置驱除害虫。一般而言，杀虫活性是指毒性蛋白有效抑制特定目标昆虫(包括但不限于鳞翅目的昆虫)的生长、发育、存活力、摄食行为、交配行为、生殖力的能力，或者由摄食该蛋白质、蛋白质片段、蛋白质区段或多核苷酸的昆虫造成的不利影响的任何可测量降低。毒性蛋白可以由植物产生，或者可以施用于植物或施用于植物所在位置中的环境。术语“生物活性”、“有效”、“效力”或其变体也是本申请中可交换使用的术语，用于描述本发明的蛋白质对目标害虫的影响。
当在目标害虫的饮食中提供时，杀虫有效量的毒性剂在毒性剂接触害虫时表现出杀虫活性。毒性剂可以是本领域已知的杀虫蛋白或一种或多种化学试剂。杀虫或杀昆虫化学试剂和杀虫或杀昆虫蛋白试剂可以单独使用或彼此组合使用。化学试剂包括但不限于靶向特定基因以遏制目标害虫的dsRNA分子、有机氯化物、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱类和ryanoids。杀虫或杀昆虫蛋白试剂包括本申请所述的蛋白质毒素，以及其他蛋白质毒性剂，包括靶向鳞翅类昆虫的毒性剂，以及用于防治其他植物害虫的蛋白质毒素，例如用于防治鞘翅类、半翅类和同翅类的种的本领域可获得的Cry和Cyt蛋白。
意图是提及害虫，特别是作物植物的害虫时是指作物植物的被 TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL 蛋白毒素类别防治的的害虫，特别是那些鳞翅目害虫。然而，在以下情况下提及害虫也可包括植物的鞘翅类、半翅类和同翅类害虫，以及线虫和真菌：当靶向这些害虫的毒性剂与TIC6757、TIC6757PL、 TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL蛋白或者与TIC6757、 TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL蛋白具有85％至约100％同一性的蛋白质共定位或一起存在时。
TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473和 TIC7473PL蛋白通过共同功能相关并且对来自鳞翅目昆虫种的害虫 (包括成虫、蛹、幼虫和新生虫)表现出杀虫活性。
鳞翅目的昆虫包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的粘虫 (armyworm)、切根虫(cutworm)、尺夜蛾(looper)和heliothine，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、莎草粘虫(Spodoptera exempta)、南部夜蛾(Spodopteraeridania)、蓓带夜蛾(bertha armyworm)(Mamestra configurata)、秋菜夜蛾(Agrotisipsilon)、粉纹夜蛾(cabbage looper)(Trichoplusia ni)、大豆尺夜蛾(Pseudoplusiaincludens)、绒毛豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、绿夜蛾(green cloverworm)(Hypenascabra)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、granulate cutworm(Agrotis subterranea)、粘虫(Pseudaletia unipuncta)、西方夜蛾(western cutworm)(Agrotis orthogonia)；螟蛾科的蛀虫(borer)、潜蛾(casebearer)、结网虫 (webworm)、coneworm、菜青虫(cabbageworm)；和螟蛾科(Pyralidae)的食叶虫(skeletonizer)，例如欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、脐橙螟(navel orangeworm)(Amyelois transitella)、玉米根螟(corn root webworm) (Crambus caliginosellus)、草地螟(sod webworm)(Herpetogramma licarsisalis)、向日葵螟(sunflower moth)(Homoeosoma electellum)、小玉米茎蛀虫(Elasmopalpus lignosellus)；卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫(Leafroller)、蚜虫(budworm)、种子蠕虫(seed worms)和果实蠕虫(fruit worm)，例如苹果蠹蛾(codling moth)(Cydia pomonella)、葡萄卷夜蛾(grape berry moth)(Endopizaviteana)、东方果蛾(oriental fruit moth)(Grapholita molesta)、向日葵芽蛾(sunflower bud moth) (Suleima helianthana)；以及许多其他在经济上重要的鳞翅目，例如菱纹背蛾(Plutella xylostella)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella) 和舞毒蛾(gypsy moth)(Lymantria dispar)。鳞翅目的其他害虫包括例如棉叶波纹夜蛾(Alabamaargillacea)、果树卷夜蛾(fruit tree leaf roller)(Archips argyrospila)、欧洲卷叶虫(European leafroller)(Archips rosana)和其他卷蛾属的种(二化螟(Chilosuppressalis)、亚洲稻螟 (Asiatic rice borer)或稻螟(rice stem borer))、稻纵卷叶螟(rice leaf roller)(Cnaphalocrocis medinalis)、玉米根螟(corn root webworm)(Crambus caliginosellus)、兰草结网虫(bluegrass webworm)(Crambus teterrellus)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、甘蔗螟虫(Diatraea saccharalis)、埃及钻夜蛾(spiny bollworm)(Earias insulana)、斑纹钻夜蛾(Earias vittella)、美国棉铃虫(American bollworm) (Helicoverpa armigera)、玉米穗虫(Helicoverpa zea，也称为大豆豆荚虫(soybean podworm)和棉铃虫)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、草地螟(Herpetogramma licarsisalis)、西方豆夜蛾(Striacosta albicosta)、葡萄蛾(Europeangrape vine moth)(Lobesia botrana)、柑橘潜叶蛾(citrus leafminer)(Phyllocnistiscitrella)、大菜粉蝶(large white butterfly)(Pieris brassicae)、菜粉蝶(smallwhite butterfly)(Pieris rapae，也称为进口菜青虫(imported cabbageworm))、甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua)、烟斜纹夜蛾(Spodoptera litura，也称为群毛虫) 以及番茄斑潜蝇(tomato leafminer)(Tuta absoluta)。
本申请中提及的“分离的DNA分子”或等同的术语或短语旨在表示DNA分子是单独存在的或与其他组合物组合存在，但不存在于其天然环境中的分子。例如，对于生物体基因组的DNA中天然发现的核酸元件，例如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等，只要元件在生物体的基因组中并且在基因组中其天然存在的位置处，就不认为其是“分离的”。然而，只要元件不在生物体的基因组中以及基因组中其天然存在的位置处，就认为这些元件中的每个以及这些元件的子元件在本公开内容的范围内是“分离的”。类似地，编码杀虫蛋白或该蛋白质的任何天然存在的杀虫变体的核苷酸序列可以是分离的核苷酸序列，只要该核苷酸序列不在天然发现编码该蛋白质的序列的细菌的DNA内。对于本公开内容的目的，编码天然存在的杀虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。对于本公开内容的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入到植物或细菌细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列将被认为是分离的核苷酸序列，无论其存在于用于转化细胞的质粒或类似结构中，植物或细菌的基因组中，还是以可检测量存在于来自植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品中。
如本申请中进一步描述的，编码TIC6757(SEQ ID NO:19)的开放阅读框(ORF)发现于获自日本甲虫类芽孢杆菌菌株DSC004343 的DNA中。将编码序列在微生物宿主细胞中克隆并表达以产生用于生物测定的重组蛋白。使用高通量筛选和生物信息学技术筛选微生物序列的编码表现出与TIC6757的相似性的蛋白质的基因。编码 TIC7472(SEQ ID NO:7)的开放阅读框(ORF)发现于获自日本甲虫类芽孢杆菌菌株DSC007648的DNA中。编码TIC7473(SEQID NO:11)的开放阅读框(ORF)发现于获自日本甲虫类芽孢杆菌菌株 DSC008493的DNA中。使用来自微生物宿主细胞的蛋白质TIC6757 的生物测定证明了针对以下鳞翅类的种的活性：甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、秋菜夜蛾(Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(Helicoverpazea)、棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea)、菱纹背蛾(Plutella xylostella)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、 Cry1Fa1抗性草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫 (OWB,Helicoverpa armigera)、南部夜蛾(Spodoptera eridania)、大豆尺夜蛾(Chrysodeixis includens)、斑纹钻夜蛾(Eariasvittella)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、烟斜纹夜蛾(Spodoptera litura，也称为群毛虫)和绒毛豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)。使用来自微生物宿主细胞的蛋白质TIC7472和TIC7473 证明了针对以下鳞翅类的种的活性：玉米穗虫(Helicoverpa zea)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、南部夜蛾(Spodoptera eridania)、大豆尺夜蛾(Chrysodeixis includens)和西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)。
对于在植物细胞中的表达，TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、 TIC7472PL、TIC7473和TIC7473PL蛋白可被表达以存在于胞质溶胶中或靶向植物细胞的各种细胞器。例如，将蛋白质靶向叶绿体可导致转基因植物中表达的蛋白质的水平增加，同时防止脱表型 (off-phenotype)的发生。靶向也可导致转基因事件中害虫抗性效力的增加。靶肽或转运肽是指导将蛋白质运输至细胞中的特定区域的短 (3-70个氨基酸长)肽链，所述区域包括细胞核、线粒体、内质网 (ER)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体和质膜。在蛋白质被运输后，一些靶肽通过信号肽酶从蛋白质上裂解。为了靶向叶绿体，蛋白质含有为约40-50个氨基酸的转运肽。关于使用叶绿体转运肽的描述，参见美国专利No.5,188,642和5,728,925。许多叶绿体定位蛋白从核基因表达为前体，并通过叶绿体转运肽(CTP)被靶向叶绿体。此类分离的叶绿体蛋白的实例包括但不限于与核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、捕光复合蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、烯醇丙酮莽草酸磷酸合酶(EPSPS) 结合的那些，以及美国专利No.7,193,133中描述的转运肽。已经在体内和体外证明了非叶绿体蛋白质可以通过使用与异源CTP的蛋白融合被靶向叶绿体，并且CTP足以将蛋白质靶向叶绿体。已经表明引入合适的叶绿体转运肽如拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS CTP (CTP2)(参见Klee等,Mol.Gen.Genet.210:437-442,1987)或矮牵牛(Petuniahybrida)EPSPS CTP(CTP4)(参见，della-Cioppa等,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 83:6873-6877,1986)在转基因植物中将异源 EPSPS蛋白质序列靶向叶绿体(参见美国专利No.5,627,061； 5,633,435；和5,312,910；以及EP 0218571；EP 189707；EP 508909；和EP924299)。为了将TIC6757或TIC6757PL毒素蛋白靶向叶绿体，将编码叶绿体转运肽的序列置于与已设计用于在植物细胞中最佳表达的编码TIC6757或TIC6757PL毒素蛋白的合成编码序列的5'端可操作连接并且同框。
预期通过使用TIC6757、TIC7472或TIC7473的氨基酸序列可以产生与TIC6757、TIC7472和TIC7473相关的另外的毒素蛋白序列，以产生具有新型特性的新型蛋白质。可以将TIC6757、TIC7472和 TIC7473毒素蛋白进行比对，以将氨基酸序列水平的差异组合到新的氨基酸序列变体中，并对编码变体的重组核酸序列进行适当的改变。
本发明进一步预期可通过使用多种本领域已知的基因编辑方法在植物中工程改造TIC6757蛋白毒素类别的改良变体。用于基因组编辑的此类技术包括但不限于ZFN(锌指核酸酶)、大范围核酸酶、 TALEN(转录活化因子样效应子核酸酶)和CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)系统。这些基因组编辑方法可用于将在植物细胞内转化的毒素蛋白质编码序列改变为不同的毒素编码序列。特别地，通过这些方法，改变毒素编码序列内的一个或多个密码子以设计新的蛋白质氨基酸序列。或者，将编码序列内的片段替换或缺失，或将额外的DNA片段插入编码序列中，以设计新的毒素编码序列。新的编码序列可以编码具有新特性的毒素蛋白，所述新特性例如针对害虫的增强的活性或谱，以及提供针对其中已对原始昆虫毒素蛋白产生抗性的害虫物种的活性。包含基因编辑的毒素编码序列的植物细胞可以通过本领域已知的方法使用以产生表达新的毒素蛋白的完整植物。
还预期TIC6757、TIC7472和TIC7473的片段或其蛋白变体可以是截短的形式，其中一个或多个氨基酸从蛋白质的N端、C端、中间或其组合缺失，其中所述片段和变体保留了昆虫抑制活性。这些片段可以是TIC6757、TIC7472和TIC7473的天然存在的或合成的变体，或者衍生的蛋白质变体，但应保留至少TIC6757、TIC7472或TIC7473 的昆虫抑制活性。
类似于TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473 和TIC7473PL蛋白的蛋白质可以使用本领域已知的各种基于计算机的算法来鉴定并相互比较(参见表1和2)。本申请中报道的氨基酸序列同一性是使用以下这些默认参数的Clustal W比对的结果：权重矩阵：blosum，空位开放罚分：10.0，空位延伸罚分：0.05，亲水间隙：开，亲水残基：GPSNDQERK，残基特异性空位罚分：开(Thompson 等(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680)。进一步通过100％乘以(氨基酸同一性/目标蛋白质的长度)的乘积来计算氨基酸同一性百分比。其他比对算法在本领域中也是可用的并且提供与使用 Clustal W比对获得的那些相似的结果，并且在本文中被考虑。
意图是表现出对鳞翅类昆虫种的昆虫抑制活性的蛋白质在以下情况下与TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或 TIC7473PL相关：如果在例如ClustalW比对中的查询中使用该蛋白质，并且本发明如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:18所示的蛋白质在这样的比对中鉴定为命中，其中查询蛋白沿着查询蛋白的长度表现出至少85％至约100％氨基酸同一性，即约85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或者该范围内的任何百分比分数。
使用Clustal W算法将示例性蛋白TIC6757、TIC6757PL、 TIC7472、TIC7472PL、TIC7473和TIC7473PL相互比对。产生了每个全长蛋白质的氨基酸序列同一性百分比的成对矩阵，如表1所报告的。
表1.示例性蛋白质TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、 TIC7472PL、TIC7473和TIC7473PL的成对矩阵显示。
表格说明：在成对矩阵中报告了(X)和(Y)之间的Clustal W 比对。计算所有对之间的氨基酸同一性百分比，并由每个框中的第一个数字表示。每个框中的第二个数字(括号内)表示对之间相同氨基酸的数目。
除了同一性百分比之外，TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、 TIC7472PL、TIC7473、TIC7473PL和相关蛋白还可以通过一级结构 (保守氨基酸基序)、长度(约797个氨基酸)和其他特征来关联。表2中报道了TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473 和TIC7473PL蛋白毒素的特征。
表2.TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473 和TIC7473PL蛋白的选择的特征。
如本申请的实施例中进一步描述的，设计编码TIC6757、 TIC6757PL的变体的合成核酸分子序列以用于在植物中使用。设计用于在植物中使用的编码TIC6757PL蛋白的示例性重组核酸分子序列如SEQ ID NO:3所示。相对于TIC6757蛋白，TIC6757PL蛋白具有紧接起始甲硫氨酸之后的额外的丙氨酸氨基酸。认为插入到TIC6757 氨基酸序列中的额外的丙氨酸残基提高了植物中蛋白质的表达。同样，编码TIC7472和TIC7473的变体的合成核酸分子序列在本文中分别称为TIC7472PL和TIC7473PL，并且被设计用于在植物中使用。设计用于在植物中使用的编码TIC7472PL和TIC7473PL的示例性合成核酸分子序列分别如SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:17所示。相对于TIC7472和TIC7473蛋白，TIC7472PL和TIC7473PL蛋白具有紧接起始甲硫氨酸之后的额外的丙氨酸氨基酸。
可以构建包含重组核酸分子序列的表达盒和载体并根据本领域已知的转化方法和技术将其导入玉米、大豆或棉花植物细胞中。例如，土壤杆菌介导的转化描述在以下文献中：美国专利申请公开 2009/0138985A1(大豆)、2008/0280361A1(大豆)、2009/0142837A1(玉米)、2008/0282432(棉花)、2008/0256667(棉花)、2003/0110531 (小麦)、2001/0042257A1(糖用甜菜)，美国专利No.5,750,871(油菜)、7,026,528(小麦)和6,365,807(稻)，以及Arencibia等.(1998) Transgenic Res.7:213-222(甘蔗)，所述文献全部内容通过引用整体并入本文。转化的细胞可以再生成表达TIC6757PL、TIC7472和 TIC7473蛋白的转化植物，并且通过使用从转化植物获得的植物叶片在鳞翅类害虫幼虫的存在下进行生物测定来证明了杀虫活性。植物可以来自植物细胞(通过再生)、种子、花粉或分生组织转化技术。用于转化植物的方法是本领域已知的。
作为传统转化方法的替代方法，可以通过定点整合将DNA序列 (例如转基因、表达盒等)插入或整合到植物或植物细胞基因组内的特定位点或基因座中。因此，本公开内容的重组DNA构建体和分子可包含供体模板序列，所述供体模板序列包含至少一个转基因、表达盒或用于插入植物或植物细胞基因组中的其他DNA序列。用于定点整合的此类供体模板可进一步包含在插入序列(例如，待插入植物基因组中的序列、转基因、盒等)的侧翼的一个或两个同源臂。本公开内容的重组DNA构建体可进一步包含编码位点特异性核酸酶和/或进行定点整合的任何任何相关蛋白的表达盒。这些核酸酶表达盒可以与供体模板存在于相同的分子或载体中(顺式)或存在于分开的分子或载体上(反式)。用于定点整合的多种方法是本领域已知的，涉及切割基因组DNA以在期望的基因组位点或基因座处产生双链断裂 (DSB)或缺口的不同蛋白质(或蛋白质和/或引导RNA的复合物)。简而言之，如本领域所理解的那样，在修复由核酸酶引入的DSB或切口的过程中，供体模板DNA可以在DSB或切口的位点整合到基因组中。供体模板中的同源臂的存在可以促进在修复过程中通过同源重组采用插入序列并靶向到植物基因组中，尽管插入事件可以通过非同源端连接(NHEJ)发生。可以使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程或天然大范围核酸酶、TALE核酸内切酶和RNA 引导的核酸内切酶(例如Cas9或Cpf1)。对于使用RNA引导的位点特异性核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)的方法，重组DNA构建体还将包含编码一个或多个引导RNA的序列，以将核酸酶引导至植物基因组中的期望位点。
考虑了编码TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473 和TIC7473PL的重组核酸分子组合物。例如，TIC6757、TIC6757PL、 TIC7472、TIC7472PL、TIC7473和TIC7473PL蛋白可以用重组DNA 构建体表达，在所述重组DNA构建体中具有编码该蛋白质的ORF 的多核苷酸分子可操作地连接至基因表达元件，例如启动子以及用于构建体所针对的系统中表达所需的任何其他调控元件。非限制性实例包括与用于在植物中表达蛋白质的TIC6757PL、TIC7472PL或 TIC7473PL蛋白质编码序列可操作地连接的植物功能性启动子，或与用于在Bt细菌或其他芽孢杆菌属种中表达蛋白质的TIC6757、 TIC7472或TIC7473蛋白质编码序列可操作地连接的Bt功能性启动子。其他元件可以与TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、 TIC7473或TIC7473PLL蛋白质编码序列可操作地连接，包括但不限于增强子、内含子、非翻译前导序列、编码的蛋白质固定标签(HIS 标签)、易位肽(即，质体转运肽、信号肽)、用于翻译后修饰酶的多肽序列、核糖体结合位点和RNAi靶位点。本文提供的示例性重组多核苷酸分子包含但不限于与诸如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SIQ ID NO:7、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:15何SEQ ID NO:17的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16和SEQID NO:18所示的氨基酸序列的相应多肽或蛋白质。异源启动子还可以与编码质体靶向的TIC6757PL、TIC7472PL或TIC7473PL或非靶向的TIC6757PL、TIC7472PL或TIC7473PL的合成DNA编码序列可操作地连接。编码本文公开的蛋白质的重组核酸分子的密码子可以用同义密码子替换(本领域已知为沉默替换)。
包含TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或 TIC7473PL蛋白质编码序列的重组DNA构建体可进一步包含编码以下的DNA区域：一种或多种昆虫抑制剂，其可被配置与编码TIC6757、 TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL蛋白的 DNA序列同时表达或共表达；不同于TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、 TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL蛋白的蛋白质；昆虫抑制性dsRNA 分子；或辅助蛋白。辅助蛋白包括但不限于辅助因子、酶、结合伴侣或其他试剂，所述其他试剂用于辅助昆虫抑制剂的效力，例如通过辅助其表达，影响其在植物中的稳定性，优化用于低聚反应的自由能，增强其毒性，以及提高其活性的范围来实现。辅助蛋白可以例如促进一种或多种昆虫抑制剂的摄取，或增强毒性剂的毒性作用。
可以组装重组DNA构建体，使得所有蛋白质或dsRNA分子从一个启动子表达，或者每个蛋白质或dsRNA分子处于单独的启动子控制下，或其一些组合。本发明的蛋白质可以从多基因表达系统中表达，其中TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL中的一种或多种蛋白质从共同核苷酸区段表达，根据选择的表达系统的类型，所述区段还包含其他开放阅读框和启动子。例如，细菌多基因表达系统可以利用单个启动子驱动单个操纵子内的多连接/串联开放阅读框的表达(即多顺反子表达)。在另一个实例中，植物多基因表达系统可利用多个-未连接或连接的表达盒，每个表达盒表达不同的蛋白质或其他试剂，例如一种或多种dsRNA分子。
可以通过载体例如质粒、杆状病毒、合成染色体、病毒粒子、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体将包含TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、 TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL蛋白质编码序列的重组多核苷酸或重组DNA构建体可以递送到宿主细胞中。此类载体可用于实现TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL 蛋白质编码序列在宿主细胞中的稳定或瞬时表达，或随后编码的多肽的表达。包含TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473 或TIC7473PL蛋白质编码序列并且被引入宿主细胞的外源重组多核苷酸或重组DNA构建体在本申请中被称为“转基因”。
本文提供了转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物和转基因植物部分，其包含表达TIC6757或相关家族毒素蛋白编码序列中的任何一种或多种的重组多核苷酸。术语“细菌细胞”或“细菌”可以包括但不限于土壤杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属、短芽孢杆菌属、克雷伯菌属、欧文氏菌属或根瘤菌属细胞。术语“植物细胞”或“植物”可以包括但不限于双子叶植物或单子叶植物。术语“植物细胞”或“植物”还可以包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞或植物。在某些实施方案中，提供了从转基因植物细胞再生的转基因植物和转基因植物部分。在某些实施方案中，转基因植物可以从转基因种子获得，通过切割、弯折、研磨或以其他方式使部分与植物分离获得。在某些实施方案中，植物部分可以是种子、荚、叶、花、茎、根或其任何部分，或转基因植物部分的不可再生部分。如本文所用，转基因植物部分的“不可再生”部分是不能诱导形成完整植物或不能诱导形成能够进行有性和/或无性繁殖的完整植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的不可再生部分是转基因种子、荚、叶、花、茎或根的一部分。
提供了制备包含鳞翅目昆虫抑制量的TIC6757、TIC6757PL、 TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL蛋白的转基因植物的方法。可以通过将编码本申请中提供的任何蛋白质的重组多核苷酸引入植物细胞并选择由表达鳞翅目昆虫抑制量的蛋白质的所述植物细胞衍生的植物来制备这样的植物。植物可以通过再生从植物细胞、从种子、花粉或分生组织转化技术获得。用于转化植物的方法是本领域已知的。
本文还公开了经加工植物产品，其中经加工产品包含可检测量的 TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL 蛋白，其昆虫抑制区段或片段，或其任何区别部分。在某些实施方案中，加工的产品选自植物部分、植物生物质、油、粕、糖、动物饲料、粉、薄片、麸皮、绒、外壳、经加工种子和种子。在某些实施方案中，经加工产品是不可再生的。植物产品可以包括来自自转基因植物或转基因植物部分的商品或其他商业产品，其中所述商品或其他产品可以通过检测编码或包含TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、 TIC7473或TIC7473PL蛋白的区别部分的核酸片段或表达的RNA或蛋白质通过商业追踪。
表达TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或 TIC7473PL蛋白的植物可通过育种与表达其他毒素蛋白和/或表达其他转基因性状(如抗除草剂基因、赋予产量或抗逆性形状的基因等) 的转基因事件交杂交，或者这样的性状可在单一载体中组合以使得所有性状都联系起来。
如实施例中进一步描述的，TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、 TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL蛋白编码序列以及与TIC6757、 TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL具有较大的同一性百分比的序列可使用本领域普通技术人员已知的方法如聚合酶链式反应(PCR)、热扩增和杂交来鉴定。例如，蛋白质TIC6757、 TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL可用于产生与相关蛋白质特异性结合的抗体，并且可用于筛选和发现其他密切相关的蛋白质成员。
此外，编码TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473 和TIC7473PL毒素蛋白的核苷酸序列可以用作探针和引物用于筛选以使用热循环或等温扩增和杂交方法鉴定该类别的其他成员。例如，衍生自如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17所示序列的寡核苷酸可用于确定来自商品的脱氧核糖核酸样品中TIC6757PL、 TIC7472PL或TIC7473PL转基因的存在或不存在。考虑到使用寡核苷酸的某些核酸检测方法的灵敏度，预期衍生自如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17所示序列的寡核苷酸可用于检测来自合并来源的商品中的TIC6757PL、TIC7472PL和TIC7473PL转基因，在所述合并来源中，仅一部分商品来自包含任何转基因的转基因植物。进一步认识到，这样的寡核苷酸可用于在SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17中的每一个中引入核苷酸序列变异。这种“诱变”寡核苷酸可用于鉴定在转基因植物宿主细胞中显示一定范围的昆虫抑制活性或不同表达的TIC6757PL、TIC7472PL和TIC7473PL氨基酸序列变体。
核苷酸序列同源物，例如由在严格杂交条件下与本申请中公开的每个或任何序列杂交的核苷酸序列编码的杀虫蛋白也是本发明的实施方案。本发明还提供了检测与第二核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列的方法，其中第一核苷酸序列(或其反向互补序列)编码杀虫蛋白或其杀虫片段并与第二核苷酸序列杂交。在这种情况下，第二核苷酸序列可以是在严格杂交条件下由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SIQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17所示的任何核苷酸序列。核苷酸编码序列在适当的杂交条件(如严格杂交条件) 下彼此杂交，并且由这些核苷酸序列编码的蛋白质与针对任一种其他蛋白质产生的抗血清发生交叉反应。如本文所定义，严格杂交条件包括：至少在42℃下杂交，然后在室温下洗涤两次，每次用2X SSC、 0.1％SDS洗涤5分钟，然后在65℃下洗涤两次，每次用0.5XSSC、 0.1％SDS洗涤30分钟。在甚至更高的温度下洗涤构成甚至更严格的条件，例如68℃的杂交条件，接着在68℃下在含有0.1％SDS的2xSSC 中洗涤。
本领域技术人员将认识到，由于遗传密码的冗余性，许多其他序列能够编码此类相关蛋白，并且在其用于在芽孢杆菌属菌株或植物细胞中表达杀虫蛋白的程度上的那些序列是本发明的实施方案，当然也认识到许多这样的冗余编码序列在这些条件下不与编码TIC6757、 TIC7472和TIC7473的天然芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属(Paenibacillus) 序列杂交。本申请考虑了使用这些以及本领域普通技术人员已知的其他鉴定方法来鉴定TIC6757、TIC7472和TIC7473蛋白质编码序列以及与TIC6757、TIC7472和TIC7473蛋白质编码序列具有较大的同一性百分比的序列。
本公开还考虑使用本领域已知的分子方法来工程改造和克隆包含来自杀虫蛋白的蛋白质嵌合体的商业上有用的蛋白质；例如，嵌合体可以由TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或 TIC7473PL蛋白的片段组装，以得到额外有用的实施方案，包括 TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL 蛋白的片段以及不同于TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、 TIC7473或TIC7473PL和相关蛋白的不同蛋白质的片段的组装体。 TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL 蛋白可彼此比对并且与其他芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属其他杀虫蛋白 (无论其在系统发生上是密切还是远缘相关)进行比对，并且可以鉴定可用于在比对的蛋白质之间进行替换的每种这样的蛋白的区段，导致嵌合蛋白质的构建。可对这样的嵌合蛋白质进行害虫生物测定分析，并且表征与嵌合体中每个这样的片段所来源的亲本蛋白质相比增强的生物活性或扩大的目标害虫谱的存在或不存在。可通过与其他蛋白质交换结构域或区段或通过使用本领域已知的定向进化方法对多肽的杀虫活性可进一步工程改造，已得到针对特定害虫或更广谱害虫的活性。
本申请中还公开了用TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、 TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL蛋白质防治作物植物的昆虫(特别是鳞翅目)侵袭的方法。这样的方法可包括培育包含昆虫或鳞翅目抑制量的TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL毒素蛋白的植物。在某些实施方案中，这样的方法可以进一步包括以下任何一项或多项：(i)将包含或编码TIC6757、 TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL毒素蛋白的任何组合物施用于植物或产生植物的种子；以及(ii)用编码 TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL 毒素蛋白的多核苷酸转化植物或产生植物的植物细胞。一般而言，预期可以在组合物中、在微生物中或在转基因植物中提供TIC6757、 TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL毒素蛋白，以赋予针对鳞翅类昆虫的昆虫抑制活性。
在某些实施方案中，TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、 TIC7473或TIC7473PL毒素蛋白的重组核酸分子是昆虫抑制组合物的杀虫活性成分，所述组合物通过以下方式来制备：在适于表达 TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL 毒素蛋白的条件下培养被转化来表达TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL毒素蛋白的重组芽孢杆菌或任何其他重组细菌细胞。这样的组合物可以通过干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩表达/产生所述重组多肽的此类重组细胞的培养物来制备。这样的过程可以得到芽孢杆菌或其他昆虫病原性细菌细胞提取物、细胞悬液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或细胞沉淀。通过获得如此产生的重组多肽，包含重组多肽的组合物可以包括细菌细胞、细菌孢子和伴孢包涵体，并且可以配制用于各种用途，包括作为农业昆虫抑制喷雾产品或作为饮食生物测定中的昆虫抑制制剂。
在一个实施方案中，为了降低出现抗性的可能性，包含TIC6757、 TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL的昆虫抑制组合物还包含表现出对相同鳞翅类昆虫种的昆虫抑制活性，但不同于TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或TIC7473PL毒素蛋白的至少一种额外的多肽。用于这种组合物的可能的额外多肽包括昆虫抑制蛋白和昆虫抑制dsRNA分子。Baum等描述了使用这种核糖核苷酸序列来防治害虫的一个实例(美国专利公开 2006/0021087A1)。用于防治害虫鳞翅类害虫的此类额外多肽可选自昆虫抑制蛋白，例如但不限于：Cry1A(美国专利No.5,880,275)、 Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美国专利公开No. 10/525,318)、Cry1C(美国专利No.6,033,874)、Cry1D、Cry1Da及其变体、Cry1E、Cry1F和Cry1A/F嵌合体(美国专利No.7,070,982； 6,962,705；和6,713,063)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、 Cry1L、Cry1-型嵌合体，例如但不限于TIC836、TIC860、TIC867、 TIC869和TIC1100(国际申请公开WO2016/061391(A2))、TIC2160 (国际申请公开WO2016/061392(A2))、Cry2A、Cry2Ab(美国专利No.7,064,249)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、 Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、 TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、 AXMI-035、和AXMI-045(美国专利公开2013-0117884 A1)、 AXMI-52、AXMI-58、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、 AXMI-117、AXMI-100(美国专利公开2013-0310543 A1)、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005(美国专利公开2013-0104259 A1)、AXMI-134 (美国专利公开2013-0167264 A1)、AXMI-150(美国专利公开 2010-0160231 A1)、AXMI-184(美国专利公开2010-0004176 A1)、 AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209(美国专利公开 2011-0030096A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公开 2014-0245491A1)、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、 AXMI-224z、AXMI-225z(美国专利公开2014-0196175A1)、 AXMI-238(美国专利公开2014-0033363 A1)、AXMI-270(美国专利公开2014-0223598 A1)、AXMI-345(美国专利公开2014-0373195 A1)、AXMI-335(国际申请公开WO2013/134523(A2))、DIG-3(美国专利公开2013-0219570 A1)、DIG-5(美国专利公开2010-0317569 A1)、DIG-11(美国专利公开2010-0319093 A1)、AfIP-1A及其衍生物(美国专利公开2014-0033361 A1)、AfIP-1B及其衍生物(美国专利公开2014-0033361 A1)、PIP-1APIP-1B(美国专利公开 2014-0007292A1)、PSEEN3174(美国专利公开2014-0007292 A1)、 AECFG-592740(美国专利公开2014-0007292 A1)、Pput_1063(美国专利公开2014-0007292 A1)、DIG-657(国际申请公开WO2015/195594 A2)、Pput_1064(美国专利公开2014-0007292 A1)、GS-135及其衍生物(美国专利公开2012-0233726 A1)、GS153及其衍生物(美国专利公开2012-0192310 A1)、GS154及其衍生物(美国专利公开 2012-0192310 A1)、GS155及其衍生物(美国专利公开2012-0192310 A1)、美国专利公开2012-0167259 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、美国专利公开2012-0047606 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、美国专利公开2011-0154536 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、美国专利公开2011-0112013 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、美国专利公开2010-0192256 A1中所述的SEQ ID NO:2和4及其衍生物、美国专利公开2010-0077507 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、美国专利公开2010-0077508A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、美国专利公开2009-0313721 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、美国专利公开2010-0269221 A1中所述的SEQ ID NO:2或 4及其衍生物、美国专利No.7,772,465(B2)中所述的SEQ ID NO:2 及其衍生物、WO2014/008054 A2中所述的CF161_0085及其衍生物、美国专利公开US2008-0172762 A1、US2011-0055968 A1和US2012-0117690 A1中所述的鳞翅类毒素蛋白及其衍生物； US7510878(B2)中所述的SEQID NO:2及其衍生物、美国专利No. 7812129(B1)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物；等。
在另一些实施方案中，这样的组合物/制剂可以进一步包含对不被本发明的其他昆虫抑制蛋白抑制的昆虫具有昆虫抑制活性的至少一种额外的多肽，以扩大所获得的昆虫抑制谱。例如，为了防治半翅类害虫，本发明的昆虫抑制蛋白的组合可以与半翅类活性蛋白例如 TIC1415(美国专利公开2013-0097735 A1)、TIC807(美国专利No. 8609936)、TIC834(美国专利公开2013-0269060 A1)、AXMI-036(美国专利公开2010-0137216 A1)和AXMI-171(美国专利公开 2013-0055469 A1)一起使用。另外，用于防治鞘翅类害虫的多肽可以选自例如但不限于以下的昆虫抑制蛋白：Cry3Bb(美国专利No. 6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、 AXMI134(美国专利公开2013-0167264 A1)、AXMI-184(美国专利公开2010-0004176 A1)、AXMI-205(美国专利公开2014-0298538 A1)、AXMI-207(美国专利公开2013-0303440A1)、AXMI-218、 AXMI-220(美国专利公开20140245491A1)、AXMI-221z、AXMI-223z (美国专利公开2014-0196175 A1)、AXMI-279(美国专利公开 2014-0223599 A1)、AXMI-R1及其变体(美国专利公开2010-0197592 A1、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、 TIC3131、DIG-10(美国专利公开2010-0319092 A1)、eHIPs(美国专利申请公开No.2010/0017914)、IP3及其变体(美国专利公开 2012-0210462A1)，以及(美国专利申请公开 US2014-0366227 A1)。
用于防治鞘翅类、鳞翅类和半翅类害虫的其他多肽可以在由Neil Crickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名网站(在万维网 btnomenclature.info)上找到。
本领域已经记录了昆虫对某些杀虫剂产生抗性的可能性。一种昆虫抗性管理策略是采用表达通过不同的作用方式发挥作用的两种不同昆虫抑制剂的转基因作物。因此，对任一种昆虫抑制剂具有抗性的任何昆虫都可以通过另一种昆虫抑制剂来防治。另一种昆虫抗性管理策略使用没有对目标鳞翅类害虫物种提供保护的植物，以为这些未受保护的植物提供庇护。一个具体事例描述在美国专利No.6,551,962 中，所述美国专利的全部内容通过引用并入本文。
其他实施方案，例如设计用于防治也由本文公开的蛋白质防治的害虫的待与蛋白质一起用于种子处理、在制剂上喷雾、滴落或擦拭的局部施用杀虫化学剂可直接施用于土壤(土壤浇灌)，或施用于表达本文公开的蛋白质的生长中的植物，或配制为施用于包含编码一种或多种公开的蛋白质的一种或多种转基因的种子。用于种子处理的此类制剂可以与本领域已知的各种粘着剂和增粘剂一起施用。这样的制剂可包含在作用方式上与所公开的蛋白质协同作用的杀虫剂，使得制剂杀虫剂通过不同的作用方式起作用以防治可由所公开的蛋白质防治的相同或类似害虫，或这样的杀虫剂用于防治更宽宿主范围内的害虫或无法由TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473或 TIC7473PL杀虫蛋白有效防治的植物害虫物种。
前述组合物/制剂可以进一步包含农业上可接受的载体(例如饵剂)、粉剂、粉尘、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体悬浮剂、水溶液、芽孢杆菌孢子/晶体制剂、种子处理剂、转化以表达一种或多种蛋白质的重组植物细胞/植物组织/种子/植物，或转化以表达一种或多种蛋白质的细菌。取决于重组多肽中固有的昆虫抑制或杀虫抑制水平和待施用于植物或饮食测定的制剂水平，组合物/制剂可包含各种重量的重组多肽，例如0.0001重量％至0.001重量％至0.01重量％至 1重量％至99重量％的重组多肽。
鉴于前述内容，本领域技术人员应该理解，可以对所公开的特定方面进行改变，并且仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。因此，本文公开的特定结构和功能细节不应解释为限制。应该理解的是，本文引用的每篇参考文献的全部公开内容并入本申请的公开内容内。
实施例
实施例1
TIC6757的发现、克隆和表达
对编码三种新型日本甲虫类芽孢杆菌杀虫蛋白的序列进行了鉴定、克隆、序列确证，并在昆虫生物测定中测试。分别从日本甲虫类芽孢杆菌菌株DSC004343、DSC007648和DSC008493分离的杀虫蛋白TIC6757、TIC7472和TIC7473代表了新的Vip3C样蛋白。与TIC6757、TIC7472和TIC7473远缘相关的序列是Vip3Ca2(83.7％同一性，最接近的已知亲缘关系)、Vip3Aa1(66.75％同一性)和Vip3B 样蛋白(60.93％同一性)。TIC6757、TIC7472和TIC7473的与众不同的独特品质表明这些杀虫蛋白可能具有新的作用方式(MOA)。
设计聚合酶链式反应(PCR)引物以从分别分离自日本甲虫类芽孢杆菌菌株DSC004343、DSC007648和DSC008493的总基因组DNA 扩增TIC6757、TIC7472和TIC7473的编码区的全长拷贝。PCR扩增子也包含每个编码序列的翻译起始密码子和终止密码子。
使用本领域已知的方法将每个扩增子克隆到与Bt可表达启动子可操作地连接的两个不同的Bt表达载体中。一个Bt表达载体包含在芽孢杆菌孢子形成期间开启的启动子。另一种表达载体包含非孢子形成启动子。另外，将每个扩增子克隆到用于大肠杆菌(E.coli)中进行蛋白质表达的载体中。为了分离大肠杆菌表达的蛋白质，将组氨酸标签与表达的编码序列可操作地连接以促进蛋白质的柱纯化。以下表 3列出了用于细菌表达的编码序列及其各自的蛋白质序列。
表3.用于在Bt和大肠杆菌中表达的毒素编码序列和相应的蛋白质序列。
实施例2
TIC6757、TIC7472和TIC7473在昆虫生物测定中证实了对鳞翅类的活性
使杀虫蛋白TIC6757、TIC7472和TIC7473在Bt和大肠杆菌中表达并测定其对鳞翅目、鞘翅目和半翅目各个种的毒性。针对下物种测定来自Bt的每种毒素的制备物：鳞翅类的种甜菜夜蛾(BAW, Spodoptera exigua)、秋菜夜蛾(BCW,Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(CEW, Helicoverpa zea)、棉叶波纹夜蛾(CLW,Alabama argillacea)、菱纹背蛾(DBM,Plutella xylostella)、欧洲玉米螟(ECB,Ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾(FAW,Spodoptera frugiperda)、Cry1Fa1抗性草地贪夜蛾 (FAWR1,Spodoptera frugiperda)、美国棉铃虫(AWB,Helicoverpa armigera)、棉红铃虫(PBW,Pectinophora gossypiella)、南部夜蛾(SAW, Spodoptera eridania)、大豆尺夜蛾(SBL,Chrysodeixis includens)、斑纹钻夜蛾(SBW,Earias vittella)、西南玉米螟(SWCB,Diatraea grandiosella)、烟芽夜蛾(TBW,Heliothis virescens)、烟斜纹夜蛾(TCW, Spodoptera litura,也称为群毛虫)和绒毛豆夜蛾(VBW,Anticarsia gemmatalis)；鞘翅类的种马铃薯甲虫(Colorado potatobeetle(CPB, Leptinotarsa decemlineata))、西部玉米根虫(Western Corn Rootworm)(WCB,Diabrotica virgifera virgifera)；以及半翅类的种牧草盲蝽 (Tarnished plantbug)(TPB,Lygus lineolaris)、西部牧草盲蝽(Western tarnished plant bug)(WTP,Lygus hesperus)、新热带褐蝽(Neotropical Brown Stink Bug)(NBSB,Euschistusheros)和绿蝽(Green Stink Bug) (GSB,Nezara viridula)。
通过在大肠杆菌或Bt表达宿主中产生蛋白质来评估杀虫蛋白 TIC6757、TIC7472和TIC7473的生物活性。在Bt宿主的情况下，使表达TIC6757、TIC7472或TIC7473的Bt菌株生长二十四(24)小时，然后将培养物添加到昆虫饮食中。通过将食用具有来自表达 TIC6757、TIC7472或TIC7473的Bt菌株的培养物的饮食的昆虫的生长和发育与食用具有未处理对照培养物的饮食的昆虫进行比较来评估死亡率和发育迟缓。以类似的方式处理表达TIC6757、TIC7472或 TIC7473的大肠杆菌菌株并且也提供在昆虫饮食中。对于来自Bt或大肠杆菌制备物或两种制备物的每种蛋白质观察的生物测定活性列于下表4和5中，其中“+”表示活性，“NT”表示未针对该特定害虫测定毒素。
表4.TIC6757、TIC7472或TIC7473针对害虫的生物测定活性
毒素 BAW BCW CEW CLW DBM ECB FAW FAWR1 AWB PBW SAW SBL
TIC6757 + + + + + + + + + + +
TIC7472 NT NT + NT NT NT + NT NT N T + +
TIC7473 NT NT + NT NT NT + NT NT NT + +
表5.TIC6757、TIC7472或TIC7473针对害虫的生物测定活性
毒素 SBW SWCB TBW TCW VBC CPB WCR TPB WTP NBSB SGB
TIC6757 + + + + +
TIC7472 NT + NT NT NT NT NT
TIC7473 NT + NT NT NT NT NT
从上表4和5中可以看出，昆虫毒素TIC6757显示出对许多鳞翅类害虫(BAW、BCW、CEW、CLW、DBM、ECB、FAW、FAWR1、 AWB、SAW、SBL、SBW、SWCB、TBW、TCW和VBC)的活性。观察到了TIC7472和TIC7473对于大多数测定的害虫(CEW、FAW、 SAW、SBL、SWCB)的活性。
实施例3
在稳定转化的玉米植物中测定TIC6757PL对鳞翅类害虫的活性
使用本领域已知的方法克隆二元植物转化载体，所述二元植物转化载体包含设计为表达质体靶向的和非靶向的TIC6757PL杀虫蛋白二者的转基因盒。将所得载体用于稳定转化玉米植物。从转化体收获组织并用于针对多种鳞翅类害虫的昆虫生物测定。
构建用于在植物中表达编码的蛋白质的合成编码序列，将其克隆到二元植物转化载体中并用于转化玉米植物细胞。根据美国专利 5,500,365中一般描述的方法来合成合成序列，以避免某些不合理的问题序列，例如富含ATTTA和A/T的植物聚腺苷酸化序列，同时保留天然类芽孢杆菌属蛋白的氨基酸序列。合成编码序列编码 TIC6757PL蛋白质，其相对于TIC6757蛋白质在紧接起始甲硫氨酸之后包含额外的丙氨酸残基。对于质体靶向的蛋白质，将合成 TIC6757PL杀虫蛋白质编码序列在框内与叶绿体靶向信号肽编码序列可操作地连接。所得的植物转化载体包含用于表达TIC6757PL杀虫蛋白的第一转基因盒，所述第一转基因盒包含组成型启动子，所述组成型启动子的5'与前导序列可操作地连接，前导序列的5'与内含子可操作地连接，内含子的5'与编码质体靶向的或未靶向的TIC6757PL 蛋白的合成编码序列可操作地连接，合成编码序列的5'又与3'UTR可操作地连接；以及用于使用草甘膦选择来选择转化的植物细胞的第二转基因盒。TIC6757PL杀虫蛋白的合成编码序列如SEQID NO:3所示，并编码SEQ ID NO:4所示的蛋白质。
使用土壤杆菌介导的转化方法，用如上所述的四种不同的二元转化载体转化玉米植物。二元植物转化载体构建体1和3包含编码质体靶向的TIC6757PL蛋白的编码序列，而构建体2和4包含编码非靶向的TIC6757PL蛋白的编码序列。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞形成植物。类似于美国专利No.8,344,207中所述的那些，使用植物叶盘进行生物测定。每个叶盘样品上放置一只新孵化的不到一天龄的新生幼虫，并使其进食约4天。使用未转化的玉米植物来获得用作阴性对照的组织。针对秋菜夜蛾(BCW,Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(CEW,Helicoverpa zea)、草地贪夜蛾(FAW,Spodoptera frugiperda) 和西南玉米螟(SWCB,Diatraea grandiosella)，评估来自每个二元载体的多重转化R0单拷贝插入事件。
如表6所示，表达TIC6757PL的转化的R0植物对于所有四种害虫高度有效(定义为具有小于或等于百分之十七点五的叶损伤和百分之百的死亡率)。高外显率(由“(H)”指示)定义为每种构建体的超过百分之五十的测定事件具有小于或等于百分之十七点五的叶损伤和百分之百的死亡率。低外显率(由“(L)”指示)定义为每种构建体的小于或等于百分之五十的测定事件具有小于或等于百分之十七点五的叶损伤和百分之百的死亡率。
表6.具有≤17.5％的叶损伤和百分之百的死亡率和外显率的表达 TIC6757的事件的数目
使来自R0构建体1(质体靶向的)和构建体2(质体未靶向的) 的所选R0事件自花授粉，产生F1子代。选择来自每个R0事件的多个杂合F1子代植物用于叶盘生物测定，并针对秋菜夜蛾(BCW,Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(CEW,Helicoverpa zea)、草地贪夜蛾(FAW,Spodoptera frugiperda)和西南玉米螟(SWCB,Diatraea grandiosella) 进行测定。下表7示出了来自每个构建体/事件的每种植物的平均叶损伤百分比和平均死亡率。F1子代植物相对于R0事件来提及。例如，“事件-1_1”是来自事件-1的第一个杂合子F1子代植物，“事件-1_2”是来自事件-1的第一个杂合子F1子代植物。“N”代表测定中使用的来自每个植物的样品数。从表7和表8可以看出，来自每个R0事件的大多数植物表现出不大于百分之五的叶片损伤和对于BCW、CEW和 FAW的百分之百的死亡率。关于SWCB，来自每个R0事件的多个植物在测定中表现出小于10％的叶损害和大于50％的死亡率。
表7.来自表达TIC6757PL的所选R0事件的F1子代的平均叶损伤百分比和死亡率。
表8.来自表达TIC6757PL的所选R0事件的F1子代的平均叶损伤百分比和死亡率。
使来自构建体3(质体靶向的)和构建体4(质体未靶向的)的所选R0事件自花授粉，产生F1子代。选择来自每个R0事件的杂合 F1子代植物用于叶盘生物测定，并针对西部豆夜蛾(WBC,Striacosta albicosta)进行测定。表9示出了来自每个R0事件和阴性对照的F1子代植物的平均叶损伤百分比和平均百分比死亡率。“N”代表测定中使用的来自每个植物的样品数。
表9.来自表达TIC6757PL的所选R0事件的F1子代的平均叶损伤百分比和死亡率。
从上表9中可以看出，来自针对WBC进行测定的每个R0事件的所有F1子代植物(除了一个以外)表现出不超过百分之五的叶损害和百分之百的死亡率。
测定来自用构建体3(质体靶向的)和构建体4(未靶向的)转化的所选杂合子F1子代植物的幼苗对秋菜夜蛾(BCW,Agrotis ipsilon) 的抗性。将F1子代种子以及未转化的种子(阴性对照)种植在盆中。 8天后，当幼苗从土壤中出苗时，每株植物用3只三龄BCW侵袭。在侵袭14天后，检查植物以对被BCW切咬的植物的数量进行计数。在测定中使用用构建体3转化的10个不同R0事件得到的68个F1子代植物和用构建体4转化的4个不同R0事件得到的10个F1子代植物。测定中还使用了15个阴性对照植物。观察植物后，观察到百分之八十的阴性对照被BCW切咬，而百分之零的用构建体3和构建体 4转化的F1子代植物表现出切咬。
前文表明表达TIC6757PL的转化的玉米植物提供了对鳞翅类害虫的优异抗性，所述鳞翅类害虫特别是秋菜夜蛾(Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)和西部豆西部豆夜蛾(Striacosta albicosta)。
实施例4
在稳定转化的大豆植物中测定TIC6757PL针对鳞翅类害虫的活性
使用本领域已知的方法克隆包含设计为表达质体靶向的和非靶向的TIC6757PL杀虫蛋白二者的转基因盒的二元植物转化载体。将所得载体用于稳定转化大豆植物。从转化体收获组织并用于针对多种鳞翅类害虫的昆虫生物测定。
将如上文实施例3中所述设计用于植物表达的合成编码序列克隆到二元植物转化载体中，并用于转化大豆植物细胞。使用本领域已知的方法构建包含质体靶向的和非靶向的TIC6757PL编码序列的二元载体。所得的植物转化载体包含用于表达TIC6757PL杀虫蛋白的第一转基因盒，所述第一转基因盒包含组成型启动子，组成型启动子的5'与前导序列可操作地连接，前导序列的5'与编码质体靶向的或未靶向的TIC6757PL蛋白的合成编码序列可操作地连接，合成编码序列的5'又与3'UTR可操作地连接；以及用于使用壮观霉素选择来选择转化的植物细胞的第二转基因盒。构建体1、3和5包含编码非靶向TIC6757PL杀虫蛋白的编码序列。构建体2、4和6包含编码质体靶向的TIC6757PL蛋白质的编码序列。
通过本领域已知的方法诱导转化的大豆细胞形成植物。类似于美国专利No.8,344,207中所述的那些，使用植物叶盘进行生物测定。使用未转化的大豆植物来获得待用作阴性对照的组织。针对南部夜蛾 (SAW,Spodoptera eridania)、大豆尺夜蛾(SBL,Chrysodeixis includens)和大豆豆荚虫(SPW,Helicoverpa zea)评估来自每个二元载体的多重转化事件。
如表10所示，表达TIC6757PL的转化的R0大豆植物对SAW、 SBL和SPW高度有效(定义为具有小于或等于百分之二十的叶损伤)。高外显率(由“(H)”指示)定义为每种构建体的超过百分之五十的测定事件具有小于或等于百分之二十的叶损伤。低外显率(由“(L)”指示)定义为每种构建体的小于或等于百分之五十的测定事件具有小于或等于百分之二十的叶损伤。
表10.具有≤20％的叶损伤和外显率的表达TIC6757PL的事件的数目
使来自构建体3、4、5和6的转化的表达TIC6757PL蛋白毒素的选择的R0转基因大豆植物自花授粉，并产生R1种子。使R1种子萌发产生R1植物。选择TIC6757PL表达盒纯合的R1植物用于针对南部夜蛾(SAW,Spodoptera eridania)、大豆尺夜蛾(SBL,Chrysodeixisincludens)、大豆豆荚虫(SPW,Helicoverpa zea)和绒毛豆夜蛾(VBW, Anticarsiagemmatalis)的叶盘生物测定。表11和12示出了每个R1子代植物和阴性对照品种A3555的通过每种昆虫显示的平均叶损伤百分比。表11和12还示出了相对于阴性对照，每个测定的事件的通过每种昆虫显示的标准误差平均值(SEM)叶损伤百分比。“N”代表测定中使用的来自每个植物的样品数。“SEM”表示平均损伤百分比的标准误差。
表11.表达TIC6757PL的R1大豆植物的平均叶损伤百分比
表12.表达TIC6757PL的R1大豆植物的平均叶损伤百分比
如表11和12中可见，表达TIC6757PL毒素蛋白的R1大豆植物对SAW、SBL、SPW和VBC提供了优异的抗性。对于SAW，所有四个事件表现出小于百分之一(1％)的叶损害，而阴性对照则具有约百分之八十八(88％)的叶损害。对于SBL，所有四(4)个事件表现出小于百分之二(2)的叶损害，而对照具有约百分之八十(80) 的叶损害。对于SPW，四个事件中的三个表现出小于百分之四(4) 的叶损害，而对照具有约百分之九十七(97)的叶损害。对于VBC，三个事件表现出小于百分之一(1)的叶损伤，一个事件表现出小于百分之二(2)的叶损伤，而阴性对照具有接近百分之八十九(89) 的叶损害。
前文表明表达TIC6757PL的转化的大豆植物提供了对鳞翅类害虫的优异抗性，特别是对南部夜蛾(Spodoptera eridania)、大豆尺夜蛾(Chrysodeixis includens)、大豆豆荚虫(Helicoverpa zea)和绒毛豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)。
实施例5
在稳定转化的棉花植物中测定针对鳞翅类害虫的TIC6757PL活性
使用本领域已知的方法克隆包含设计为表达质体靶向的和非靶向的TIC6757PL杀虫蛋白二者的转基因盒的二元植物转化载体。将所得载体用于稳定转化棉花植物。从转化体收获组织并用于针对多种鳞翅类害虫的昆虫生物测定。
将如上文实施例3中所述设计用于植物表达的合成编码序列克隆到二元植物转化载体中，并用于转化棉花植物细胞。使用本领域已知的方法构建包含质体靶向的和非靶向的TIC6757PL编码序列的二元载体。所得的植物转化载体包含用于表达TIC6757PL杀虫蛋白的第一转基因盒，所述第一转基因盒包含组成型启动子，组成型启动子的5'与前导序列可操作地连接，前导序列的5'与编码质体靶向的或未靶向的TIC6757PL蛋白的合成编码序列可操作地连接，合成编码序列的5'又与3'UTR可操作地连接；以及用于使用壮观霉素选择来选择转化的植物细胞的第二转基因盒。
通过本领域已知的方法诱导转化的棉花细胞形成植物。类似于美国专利No.8,344,207中所述的那些，使用植物叶盘进行生物测定。使用未转化的棉花植物来获得待用作阴性对照的组织。针对棉铃虫 (Southern armyworm Cotton bollworm)(CBW,Helicoverpazea)、草地贪夜蛾(FAW,Spodoptera frugiperda)、大豆尺夜蛾(SBL, Chrysodeixisincludens)和烟芽夜蛾(TBW,Heliothis virescens)评估来自每个二元载体的多重转化事件。
如表13所示，表达TIC6757PL的转化的R0棉花植物对CBW、 FAW、SBL和TBW高度有效(定义为具有小于或等于百分之十的叶损伤)。高外显率(由“(H)”指示)定义为每种构建体的超过百分之五十的测定事件具有小于或等于百分之十的叶损伤。低外显率(由“(L)”指示)定义为每种构建体的小于或等于百分之五十的测定事件具有小于或等于百分之十的叶损伤。
表13具有≤10％的叶损伤和外显率的表达TIC6757PL的事件的数目
实施例6
在稳定转化的玉米植物中测定针对鳞翅类害虫的TIC7472PL和 TIC7473PL活性
使用本领域已知的方法克隆包含设计为表达质体靶向的和非靶向的TIC7472PL或TIC7473PL杀虫蛋白二者的转基因盒的二元植物转化载体。将所得载体用于稳定转化玉米植物。从转化体收获组织并用于针对多种鳞翅类害虫的昆虫生物测定。
构建合成编码序列用于在植物中表达编码的蛋白质，将其克隆到二元植物转化载体中并用于转化玉米植物细胞。按照美国专利 5,500,365中一般描述的方法来合成合成序列，以避免某些不合理的问题序列，例如富含ATTTA和A/T的植物聚腺苷酸化序列，同时保留天然类芽孢杆菌属蛋白的氨基酸序列。合成编码序列编码 TIC7472PL和TIC7473PL蛋白质，其相对于TIC7472和TIC7473蛋白质在紧接甲硫氨酸之后包含额外的丙氨酸残基。对于质体靶向的蛋白质，合成TIC7472PL或TIC7473PL杀虫蛋白质编码序列在框内与叶绿体靶向信号肽编码序列可操作地连接。所得的植物转化载体包含用于表达TIC7472PL或TIC7473PL杀虫蛋白的第一转基因盒，所述第一转基因盒包含组成型启动子，组成型启动子的5'与前导序列可操作地连接，前导序列的5'与内含子可操作地连接，内含子的5'与编码质体靶向的或未靶向的TIC7472PL或TIC7473PL蛋白的合成编码序列可操作地连接，合成编码序列的5'又与3'UTR可操作地连接；以及用于使用草甘膦选择来选择转化的植物细胞的第二转基因盒。TIC7472PL杀虫蛋白的合成编码序列如SEQ ID NO:15所示，并编码 SEQ ID NO:16所示的蛋白质。TIC7473PL杀虫蛋白的合成编码序列如SEQ ID NO:17所示，并编码SEQ ID NO:18所示的蛋白质。
使用土壤杆菌介导的转化方法，用上述二元转化载体转化玉米植物。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞形成植物。类似于美国专利No.8,344,207中所述的那些，使用植物叶盘进行生物测定。使用未转化的玉米植物来获得待用作阴性对照的组织。针对秋菜夜蛾 (BCW,Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(CEW,Helicoverpa zea)、草地贪夜蛾(FAW,Spodoptera frugiperda)和西南玉米螟(SWCB,Diatraea grandiosella)以及其他鳞翅类害虫，评估来自每个二元载体的多重转化事件。
观察害虫的由摄取表达TIC7472PL或TIC7473PL的本发明叶盘造成的死亡和发育迟缓，并与来自未转化的玉米植物的叶盘进行比较。
实施例7
在稳定转化的大豆和棉花植物中测定针对鳞翅类害虫的TIC6757PL 活性
使用本领域已知的方法克隆包含设计为表达质体靶向的和非靶向的TIC7472PL或TIC7473PL杀虫蛋白二者的转基因盒的二元植物转化载体。将所得载体用于稳定转化大豆和棉花植物。从转化体收获组织并用于针对多种鳞翅类害虫的昆虫生物测定。
将如上文实施例6中所述设计用于植物表达的合成编码序列克隆到二元植物转化载体中，并用于转化大豆或棉花植物细胞。使用本领域已知的方法构建包含质体靶向的和非靶向的TIC7472PL或 TIC7473PL编码序列的二元载体。所得的植物转化载体包含用于表达 TIC7472PL或TIC7473PL杀虫蛋白的第一转基因盒，所述第一转基因盒包含组成型启动子，所述组成型启动子的5'与前导序列可操作地连接，所述前导序列的5'与编码质体靶向的或未靶向的TIC7472PL 或TIC7473PL蛋白的合成编码序列可操作地连接，所述合成编码序列的5'又与3'UTR可操作地连接；以及用于使用壮观霉素选择来选择转化的植物细胞的第二转基因盒。构建体1、2和7包含编码非靶向TIC6757PL杀虫蛋白的编码序列。构建体3、4、5和6包含编码靶向的TIC6757PL杀虫蛋白的编码序列。
通过本领域已知的方法诱导转化的大豆或棉花细胞形成植物。类似于美国专利No.8,344,207中所述的那些，使用植物叶盘进行生物测定。使用未转化的大豆或棉花植物来获得用作阴性对照的组织。针对南部夜蛾(SAW,Spodoptera eridania)、大豆尺夜蛾(SBL, Chrysodeixis includens)、大豆豆荚虫(SPW,Helicoverpa zea)、草地贪夜蛾(FAW,Spodoptera frugiperda)、大豆尺夜蛾(SBL,Chrysodeixis includens)、烟芽夜蛾(TBW,Heliothis virescens)、棉铃虫(Cotton bollworm)(CBW,Helicoverpa zea)和绒毛豆夜蛾(VBW,Anticarsia gemmatalis)以及其他鳞翅类害虫评估来自每个二元载体的多重转化事件。观察害虫的由摄取表达TIC7472PL或TIC7473PL的本发明叶盘造成的死亡和发育迟缓，并与来自未转化的大豆或棉花植物的叶盘进行比较。
根据本公开内容，本文公开和要求保护的所有组合物可以在不需过度实验的情况下制备和实施。尽管已经根据前述说明性实施方案了描述本发明的组合物，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以对本文所述的组合物的进行变化、改变、修改和变更，而不脱离本发明的真实的观念、精神和范围。更具体地说，显而易见的是，化学和生理学上相关的某些试剂可以替代本文所述的试剂，而获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和观念内。
在说明书中引用的所有出版物和公开的专利文件通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示通过引用并入。

Claims (28)

1.一种重组核酸分子，其包含与编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子，其中：
a.所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的氨基酸序列；或
b.所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18具有至少85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或
c.所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:17的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中：
a.所述重组核酸分子包含用于在植物中表达所述杀虫蛋白的序列；或
b.所述重组核酸分子在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的所述杀虫蛋白或杀虫片段；或
c.所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒和细菌或酵母人工染色体。
3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其限定为存在于宿主细胞内，其中所述宿主细胞选自细菌细胞和植物细胞。
4.如权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述细菌宿主细胞来自选自以下的细菌属：土壤杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、克雷伯菌属、泛菌属和欧文氏菌属。
5.如权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述芽孢杆菌属的种是蜡样芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属是侧孢短芽孢杆菌，并且所述埃希氏菌属是大肠杆菌。
6.如权利要求2所述的重组核酸，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。
7.如权利要求6所述的重组核酸，其中所述植物宿主细胞选自苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。
8.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述蛋白质表现出针对鳞翅类昆虫的活性。
9.如权利要求8所述的重组核酸分子，其中所述鳞翅类昆虫选自：绒毛豆夜蛾、甘蔗螟虫、小玉米茎蛀虫、玉米穗虫、烟芽夜蛾、大豆尺夜蛾、莎草粘虫、南部夜蛾、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、美国棉铃虫、东方叶虫、棉红铃虫、秋菜夜蛾、西南玉米螟、棉叶波纹夜蛾、菱纹背蛾、斑纹钻夜蛾、烟斜纹夜蛾、西方豆夜蛾和欧洲玉米螟。
10.一种植物或其部分，其包含如权利要求1所述的重组核酸分子。
11.如权利要求10所述的植物或其部分，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
12.如权利要求10所述的植物，其中所述植物选自苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦。
13.如权利要求10所述的植物的种子，其中所述种子包含所述重组核酸分子。
14.一种昆虫抑制组合物，其包含如权利要求1所述的重组核酸分子。
15.如权利要求14所述的昆虫抑制组合物，其还包含编码至少一种不同于所述杀虫蛋白的其他杀虫剂的核苷酸序列。
16.如权利要求15所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂选自昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子和辅助蛋白。
17.如权利要求15所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫种的活性。
18.如权利要求15所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫蛋白选自Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-AXMI-、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113、和AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、AXMI-335、AXMI-R1及其变体、IP3及其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-657和DIG-11蛋白。
19.如权利要求14所述的昆虫抑制组合物，其限定为包含表达如权利要求1所述的重组核酸分子的植物细胞。
20.一种由如权利要求10所述的植物或其部分产生的商品，其中所述商品包含可检测量的所述重组核酸分子或杀虫蛋白。
21.如权利要求20所述的商品，其选自由谷物处理者装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米谷物等；以及相应的大豆、稻、小麦、高粱、木豆、花生、水果、瓜类和蔬菜商品，适当时包括含有可检测量的本申请的这些多核苷酸和/或多肽的这些商品的汁、浓缩物、果酱、果冻、酱和其他可食用形式；完整或经处理的棉籽、棉籽油、棉绒；经处理用于饲料或食物的种子和植物部分、纤维、纸、生物质；以及燃料产品，例如来自棉籽油或来自轧棉机废物的丸粒的燃料；完整或经处理的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粉、大豆面、大豆片，大豆麸皮、大豆浆、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的奶油、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。
22.一种生产种子的方法，其包括：
a.种植根据权利要求13所述的第一种子；
b.由所述种子生长出植物；以及
c.从所述植物收获种子，其中所述收获的种子包含所述重组核酸分子。
23.一种抗昆虫侵袭的植物，其中所述植物的细胞包含如权利要求1所述的重组核酸分子。
24.一种用于防治鳞翅类害虫或虫害的方法，所述方法包括：
a.使所述害虫与杀虫有效量的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18所示的杀虫蛋白接触；或
b.使所述害虫与杀虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，所述杀虫蛋白包含与SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18具有至少85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
25.一种检测包含植物基因组DNA的样品中如权利要求1所述的重组核酸分子的存在的方法，其包括：
a.使所述样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与来自包含如权利要求1所述的重组核酸分子的植物的基因组DNA杂交，并且在这样的杂交条件下不与来自不包含如权利要求1所述的重组核酸分子的其他同基因植物的基因组DNA杂交，其中所述探针与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17同源或互补，或者是编码杀虫蛋白的序列，所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
b.使所述样品和所述探针经受严格杂交条件；以及
c.检测所述核酸探针与所述样品的所述植物基因组DNA的杂交。
26.一种检测包含蛋白质的样品中杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:18的氨基酸序列；或者所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；所述方法包括：
a.使所述样品与免疫反应性抗体接触；以及
b.检测所述杀虫蛋白或其片段的存在。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述检测步骤包括ELISA或Western印迹。
28.如权利要求14所述的昆虫抑制组合物，其还包含如权利要求1所述的杀虫蛋白或杀虫片段。
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