MÉTODO PARA IDENTIFICAR GENES NOVEDOSOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a métodos y composiciones para identificar genes novedosos que son homólogos a genes conocidos, particularmente genes Cry de Bacillus thuringiensis (Bt) . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plagas de insectos son un factor mayor en la pérdida de los cultivos de la agricultura mundial. Por ejemplo, el daño por alimentación del gusano de raíz de maíz y el daño por el gorgojo de algodón pueden ser económicamente devastadores a los productores de la agricultura. La pérdida del cultivo relacionada con plagas de insectos a partir del gusano de raíz de maíz solamente, ha alcanzado un billón de dólares al año. Tradicionalmente, los métodos primarios para impactar poblaciones de plagas de insectos, tales como poblaciones de gusano de raíz de maíz, son la rotación de cultivos y la aplicación de plaguicidas o pesticidas químicos sintéticos, de amplio espectro. Sin embargo, los consumidores y reguladores gubernamentales igualmente están llegando a estar cada vez más interesados con los peligros ambientales asociados con la producción y uso de plaguicidas químicos sintéticos. Debido a tales problemas, los reguladores han prohibido o limitado el uso de algunos de los plaguicidas más
peligrosos. Así, hay interés sustancial en desarrollar alternativas a los plaguicidas químicos tradicionales que presenten un menor riesgo de contaminación y peligros ambientales y proporcionen una especificidad objetivo más grande que es característico de los insecticidas químicos de amplio espectro, tradicionales. Ciertas especies de microorganismos del género Bacillus se conocen que poseen actividad plaguicida o pesticida contra una amplia gama de plagas de insectos que incluyen Lepidoptera , Díptera, Coleóptera , Hemiptera , y otros. Bacillus thuringiensis (Bt) y Bacillus papilliae están entre los agentes de biocontrol más exitosos descubiertos hasta la fecha. La patogenicidad de insectos se ha atribuido a cepas de: B. larvae, B. lentimorbus, B. papilliae, B. sphaericus, Bt (Har ook, ed. (1989) Bacillus (Plenum Press), p. 306) y B. cereus (Publicación Internacional No. O 96/10083) . La actividad plaguicida se presenta que se concentra en inclusiones de proteína cristalinas parasporales , aunque las proteínas plaguicidas también se han aislado de la etapa de crecimiento vegetativa de Bacillus . Varios genes que codifican estas proteínas plaguicidas se han aislado y caracterizado (ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,366,892 y 5,840,868) . Los plaguicidas microbianos, particularmente aquellos obtenidos de las cepas de Bacillus, han desempeñado
una función importante en la agricultura como alternativas para el control químico de plagas. Las proteínas plaguicidas aisladas de las cepas de Bt, conocidas como d-endotoxinas o toxinas Cry, inicialmente se producen una forma de protoxina inactiva. Estas protoxinas se convierten proteolíticamente en una toxina activa a través de la acción de proteasas en el intestino del insecto. Ver, Rukmini y colaboradores, (2000) Biochimie 82: 109-116; Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42:1-12; y Carroll y colaboradores, (1997) J. Invertebrate Pathology 70:41-49. La activación proteolítica de la toxina puede incluir la remoción de los péptidos N- y C-terminales de la proteína, así como la segmentación interna de la proteína. Una vez activada, la toxina Cry se enlaza con alta afinidad a los receptores sobre las células epiteliales en el intestino del insecto, para de esta manera crear canales de fuga en la membrana celular, lisis del intestino del insecto, y muerte subsecuente del insecto a través de la inanición y septicemia. Ver, por ejemplo, Li y colaboradores, (1991) Nature 353:815-821. Recientemente, los científicos agrícolas han desarrollado plantas de cultivo con resistencia a insectos aumentada al diseñar genéticamente plantas de cultivo con genes plaguicidas para producir proteínas plaguicidas a partir de Bacillus . Por ejemplo, las plantas de maíz y de algodón genéticamente diseñadas para producir toxina Cry
(ver, por ejemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59 (3) : 417-425; Schnepf y colaboradores, (1998) Microbiol. Mol'. Biol. Rev. 62 ( 3 ): 775-806) ahora se utilizan ampliamente en la agricultura Americana y han proporcionado al granjero con una alternativa ambientalmente favorable a los métodos de control de insectos tradicionales. Además, se han desarrollado papas genéticamente diseñadas para contener toxinas Cry plaguicidas. Estos éxitos con la ingeniería genética han conducido a los investigadores a buscar genes plaguicidas novedosos, particularmente genes Cry. Por lo tanto, nuevos métodos para identificar eficientemente genes plaguicidas novedosos, que incluyen aquellos que son homólogos a los genes Cry conocidos así como aquellos que representan familias novedosas de genes Cry, son necesarios en la técnica. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a métodos y composiciones para identificar genes novedosos. Los métodos divulgados en la presente permiten la clasificación rápida y eficiente de un número grande de secuencias de nucleótidos para identificar genes novedosos potenciales a partir de una variedad de organismos. Los presentes métodos para identificar genes novedosos permiten la identificación de genes que son homólogos a genes conocidos así como genes completamente novedosos que pueden ser miembros de las
familias de genes actualmente no identificadas de interés, incluyendo genes plaguicidas. En ciertos aspectos de la invención, los métodos permiten la identificación de genes plaguicidas novedosos que son homólogos a los genes plaguicidas conocidos, incluyendo, por ejemplo, genes de toxina Cry de Bt. Los métodos de la invención comprenden diseñar sistemáticamente cebadores de oligonucleótido que son específicos para regiones de homología (es decir, secuencias de señal) dentro de un grupo objetivo de genes conocidos de interés (por ejemplo, genes plaguicidas) y realizar una primera ronda de amplificación de PCR del material de ácido nucleico a partir de un organismo de interés. La primera ronda de PCR se propone para amplificar genes tanto conocidos como novedosos que contienen la secuencia de señal. Si los productos de PCR se detectan en la primera ronda de PCR, una segunda muestra de material de ácido nucleico del organismo se obtiene y se somete a una segunda ronda de PCR utilizando un segundo conjunto de cebadores de oligonucleótido que son específicos para la secuencias de señal dentro del grupo objetivo de genes. Los productos de PCR de la segunda ronda de PCR se separan mediante la electroforesis en gel de agarosa, y los ácidos nucleicos aislados resultantes se clonan en vectores de clonación, particularmente vectores de clonación bacterianos. Los vectores de clonación luego se
transforman en células hospederas competentes tales como células bacterianas. El material de ácido nucleico aislado de las colonias de células hospederas individuales se analizan mediante el análisis de hibridación de manchado de puntos utilizando sondas de oligonucleótido marcadas que son especificas para todos los genes conocidos en el grupo objetivo. La etapa de análisis de manchado de puntos del método de la invención se propone para identificar y eliminar genes conocidos del grupo objetivo de la consideración adicional. Los productos de PCR amplificados en la segunda ronda de PCR que no son detectados para el análisis de manchado de puntos comprenden genes novedosos putativos (por ejemplo, genes plaguicidas novedosos) , o fragmentos de los mismos. Estos ácidos nucleicos se someten al análisis de secuencia adicional para confirmar la novedad y para determinar las secuencias de nucleótidos. Los genes novedosos putativos se expresan y las proteínas recombinantes se analizan para estimar la actividad biológica, tal como la actividad plaguicida cuando los métodos de la invención se utilizan para identificar genes plaguicidas novedosos. Los métodos de la invención además son disponibles para automatización y clasificación de alto rendimiento. Las composiciones de la invención incluyen polinucleótidos aislados novedosos, y variantes y fragmentos de los mismos, que comprenden genes novedosos, que incluyen,
por ejemplo, genes plaguicidas novedosos. También se proporcionan polipéptidos codificados por los polinucleotidos de la invención. Los genes plaguicidas novedosos (por ejemplo, genes de toxina Cry de Bt) identificados por los métodos divulgados en la presente encuentran uso en la protección de plantas de las plagas, particularmente plagas de insectos, y el daño relacionado con plagas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 proporciona una representación esquemática del diseño de cebadores de oligonucleótido para el uso en la primera y segunda ronda de PCR y sondas de oligonucleótido para el análisis de manchado de puntos, como es descrito en detalle enseguida en la presente. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a métodos y composiciones para identificar genes novedosos, particularmente genes plaguicidas novedosos, más particularmente genes de toxina Cry de Bt novedosos. Los métodos de la invención permiten la clasificación rápida y eficiente de un número grande de secuencias de nucleótidos para identificar genes novedosos putativos que son homólogos a genes conocidos. Como se utiliza en la presente, el término "grupo objetivo de genes" se refiere a cualquier colección de genes conocidos de cualquier organismo de interés que comprende regiones de homología. Un "grupo objetivo" en
algunas modalidades puede comprende una colección de genes plaguicidas conocidos, más particularmente un grupo de genes de toxina Cry de Bt conocidos. En general, los métodos de la invención comprenden tres etapas distintas para identificar genes novedosos a partir de un grupo objetivo: una primera ronda de PCR, más particularmente PCR en tiempo real, una segunda ronda de PCR, y una etapa de análisis de manchado de puntos. En modalidades particulares, una primera ronda de amplificación de PCR de material de ácido nucleico a partir de un organismo de interés se realiza y se propone para amplificar genes tanto conocidos como novedosos que comprenden una secuencia de señal dirigida. Una "secuencia de señal" se propone para dar entender una región de homología que está presente dentro de todos los miembros del grupo objetivo de genes, de interés. Si los productos de PCR se detectan en la primera ronda de PCR, una segunda ronda de PCR de una segunda muestra de material de ácido nucleico del organismo se obtiene y se somete a una ronda adicional de amplificación de PCR. La segunda ronda de PCR se propone para amplificar genes tanto conocidos como novedosos que contienen secuencias de señal dirigidas particulares. Los productos de PCR ' de la segunda ronda generalmente son aislados para el análisis adicional. La tercera etapa comprende realizar el análisis de manchado de puntos de los productos de PCR individuales aislados en la segunda ronda de PCR. La etapa de
análisis de manchado de puntos se realiza con sondas de oligonucleótido que son especificas para genes conocidos en el grupo objetivo y, por lo tanto, se propone para detectar y eliminar genes conocidos de la consideración adicional. Los productos de PCR de la segunda ronda de PCR que no son detectados para el análisis de manchado de puntos comprenden genes novedosos putativos (por ejemplo, genes plaguicidas novedosos), o fragmentos de los mismos, y se someten al análisis de secuencia adicional para confirmar la novedad. Las secuencias de genes novedosos putativos se determinan, y estas moléculas de ácido nucleico y las proteínas codificadas de esta manera se utilizan en bioensayos para estimar la actividad biológica, tal como, por ejemplo, la actividad plaguicida o pesticida. Más particularmente, los métodos para identificar genes novedosos comprenden diseñar sistemáticamente cebadores de oligonucleótido a regiones de homologías (es decir, secuencias de señal) dentro del grupo objetivo de genes conocidos, tal como un grupo objetivo de genes plaguicidas de Bt, y usar estos cebadores en una primera ronda de amplificación de PCR del material de ácido nucleico de un organismo de interés. En algunos aspectos de la invención, el organismo de interés es un microorganismo, más particularmente, una cepa de Bt. Los cebadores diseñados para la primera ronda de amplificación de PCR se proponen para
amplificar genes tanto conocidos como novedosos que contienen la secuencia de señal dirigida, como es descrito en más detalle enseguida. Si los productos de PCR se detectan en la primera ronda de PCR, una segunda muestra de material de ácido nucleico del organismo se obtiene y se somete a una segunda ronda de amplificación de PCR. Los cebadores de oligonucleótido utilizados en la segunda ronda de PCR también se diseñan para amplificar genes tanto conocidos como novedosos (por ejemplo, genes plaguicidas) que contienen secuencias de señal dirigidas. Los cebadores de oligonucleótido utilizados en la segunda ronda de PCR generalmente se diseñan para generar productos de PCR de una longitud particular (por ejemplo, aproximadamente 500 pares de bases (bp) a aproximadamente 800 bp en longitud, de manera particular aproximadamente 600 bp a aproximadamente 750 bp, de manera más particular aproximadamente 650 bp a aproximadamente 700 bp) . Los productos de PCR de la longitud esperada que se generan durante la segunda de ronda de PCR se aislan mediante, por ejemplo, la electroforesis en gel de agarosa. Por lo tanto, la segunda ronda de PCR permite la amplificación de genes conocidos y novedosos o fragmentos de los mismos, que contienen secuencias de señal particulares y permite el aislamiento de estas moléculas de ácido nucleico para el análisis adicional. Los productos de PCR de la segunda ronda de
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amplificación que son de la longitud esperada generalmente comprenden fragmentos de genes conocidos o novedosos. Estos fragmentos de ácido nucleico se clonan en vectores de clonación (por ejemplo, vectores de clonación bacterianos) . Los insertos de vector de clonación (es decir, los productos de PCR de la segunda ronda de PCR) comprenden genes conocidos y potencialmente novedosos del grupo objetivo, o igualmente fragmentos de los mismos, y se utilizan para transformar células hospederas competente, particularmente células bacterianas tales como, por ejemplo, células de E. coli. En aspectos particulares de la invención, el material de ácido nucleico (por ejemplo, DNA de plásmidos) se aisla de las colonias de células hospederas individuales (por ejemplo, bacterianas) y se analizan mediante el análisis de manchado de puntos utilizando sondas de oligonucleótido marcadas especificas para todos los genes conocidos dentro del grupo objetivo. En modalidades particulares, las sondas de oligonucleótido se diseñan para ser complementarias a fragmentos de los productos de PCR generados durante la segunda ronda de amplificación, como es descrito enseguida en la presente. El análisis de manchado de puntos con sondas de oligonucleótido que son especificas para todos los genes conocidos dentro del grupo objetivo permite la identificación de moléculas de ácido nucleico que comprenden genes conocidos (por ejemplo, genes de toxina Cry de Bt conocidos de un grupo
objetivo particular) . Los ácidos nucleicos que contienen genes conocidos se eliminan de la consideración adicional. Los ácidos nucleicos que no son detectados por el análisis de manchados de puntos comprenden genes novedosos putativos o fragmentos de los mismos, y se someten al análisis de secuencia adicional y ensayos de actividad biológica. En modalidades particulares de la invención, los métodos se utilizan para identificar genes plaguicidas novedosos, particularmente genes de toxina Cry de Bt novedosos, y por consiguiente, genes plaguicidas novedosos putativos además se analizan para la actividad plaguicida. En ciertos aspectos de la invención, los productos de PCR generados en la segunda ronda de PCR que no son detectados por el análisis de manchado de puntos, como es descrito en lo anterior, son secuenciados y comparados con secuencias conocidas a partir de bases de datos públicos para estimar la novedad. Si las comparaciones de secuencias indican que el producto de PCR contiene un gen potencialmente novedoso, tal como un gen plaguicida novedoso, (por ejemplo, un gen de toxina Cry de Bt novedoso) , la secuencia de longitud completa se obtiene utilizando, por ejemplo, el Equipo Universal GenomeWalker (Becton Dickinson Bioscience, Inc.). La secuencia resultante también se compara contra secuencias en bases de datos públicas para verificar adicionalmente la novedad. En modalidades particulares, los
genes novedosos se clonan en vectores de expresión y las proteínas codificadas de esta manera se analizan para la actividad biológica, tal como la actividad plaguicida en el caso de genes plaguicidas novedosos putativos. Los métodos de la invención se dirigen a la identificación de genes novedosos, particularmente genes plaguicidas, más particularmente genes plaguicidas de toxina Cry de Bt . Aunque los métodos de la invención son descritos en la presente enseguida para identificación de genes plaguicidas, tales métodos se pueden utilizar para identificar genes novedosos que son homólogos a cualquier grupo de genes conocidos en (es decir, un grupo objetivo de interés) a partir de cualquier organismo de interés. La descripción de la identificación de genes plaguicidas novedosos se propone para ser meramente ejemplar y no es limitativa . Los métodos de la invención se puede utilizar para identificar genes novedosos que son homólogos a genes Cry conocidos mientras que también se identifican genes que comparten poca . homología con genes Cry previamente identificados y que realmente pueden representar familias novedosas de genes plaguicidas de Bt. En una modalidad de la invención el material de ácido nucleico aislado de la cepas de Bt de interés se somete a una primera sonda de PCR, generalmente PCR en tiempo real, utilizando por lo menos un
conjunto de cebadores de oligonucleótido degenerados que son específicos para una región de homología (es decir, una secuencia de señal) presente en todos los miembros de un grupo objetivo de genes plaguicidas. Como se utiliza en la presente, "grupo objetivo de genes plaguicidas" se refiere a cualquier colección de genes plaguicidas conocidos que comprenden regiones de homología. Los miembros de grupo objetivo de genes plaguicidas se alinean para diseñar cebadores de oligonucleótido. Como es indicado en lo anterior como una región de homología que está presente dentro de todos los miembros de grupo objetivo de genes plaguicidas es referida como una "secuencia de señal". Las secuencias de señal dentro de las secuencias de nucleótidos del grupo objetivo de genes plaguicidas sirven como la base para diseñar cebadores de oligonucleótido para el uso en la primera y segunda ronda de PCR, como es descrito en más detalle enseguida. En ciertos aspectos de la invención, el grupo objetivo comprende todos los genes Cry plaguicidas conocidos que son activos contra insectos del orden Coleóptera (es decir, genes Cry activos contra Coleópteros). En otras modalidades, en grupo objetivo comprende, por ejemplo, todos los genes de Bt conocidos que tienen actividad plaguicida contra insectos de los ordenes Lepidóptero y Coleóptera, excluyendo aquellos genes Cry que son activos contra insectos del orden Díptera. El grupo objetivo de genes
plaguicidas se selecciona y se define por el investigador al principio de la búsqueda para genes plaguicidas novedosos. Los cebadores de oligonucleótido específicos para el grupo objetivo de genes plaguicidas se mezclan con una primera muestra de material de ácido nucleico de un microorganismo de interés y una DNA polimerasa bajo condiciones que son adecuadas para la amplificación por PCR. Los métodos de la presente invención además comprenden realizar una primera ronda de PCR y detectar la presencia o ausencia de productos de amplificación de PCR. En modalidades particulares, la primera ronda de PCR comprende realizar la PCR en tiempo real cuantitativa utilizando un tinte Verde SYBR® para detectar la presencia de producto de PCR. Si se detectan productos de PCR en la primera ronda de PCR, una segunda muestra de ácido nucleico de microorganismo de interés se obtiene y se somete a una segunda ronda de PCR. Los cebadores de oligonucleótido utilizados en la segunda ronda de PCR también son específicos para la secuencias de señal dentro de las secuencias de nucleótidos del grupo objetivo de genes plaguicidas, como es descrito en lo anterior. En general, los cebadores de oligonucleótido inversos utilizados en la primera ronda de PCR se utilizan para general los cebadores delanteros para la segunda ronda de PCR, para de esta manera servir como un puente entre la primera y segunda ronda de PCR. Los cebadores
inversos utilizados en la segunda ronda de PCR se diseñan para dirigir una secuencia de señal diferente que es típicamente localizada 3' a la secuencia de señal utilizada para diseñar los cebadores inversos para la primera ronda de PCR. Los cebadores de oligonucleótido para la segunda ronda de PCR además se diseñan para producir productos de PCR de una longitud particular, de manera específica aproximadamente 500 bp a aproximadamente 800 bp, de manera particular aproximadamente 600 bp a aproximadamente 750 bp, de manera más particular aproximadamente 650 bp a aproximadamente 700 bp. Las reacciones de PCR de la segunda ronda de amplificación de PCR se pueden separar mediante electroforesis en gel de agarosa, y los productos de PCR resultantes que comprenden fragmentos de ácido nucleico de la longitud esperada se ligan en vectores de clonación, particularmente vectores de clonación bacterianos. Los vectores luego se transforman en células hospederas competentes, por ejemplo, células bacterianas tales como células de E. coli. Ejemplos de células hospederas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, células bacterianas, células fúngales, células de plantas (dicotiledóneas y monocotiledóneas ) , y células de animales. En modalidades particulares, las células hospederas son células bacterianas. Los vectores de clonación para el suministro de
polinucleót idos a una variedad de células hospederas son bien conocidos en la técnica. Métodos para clonar moléculas de ácido nucleico en vectores y para transformar células hospederas son bien conocidos en la técnica. Para descripciones generales de sistemas y métodos de clonación, empaquetamiento y expresión, ver Giliman y Smith (1979) Gene 8:81-97; Roberts y colaboradores, (1987) Nature 328:731-734; Berger y Kimmel (1989) Guide to Molecular Cloning Techniques , Methods in Enzymology, Vol . 152 (Academic Press, Inc., San Diego, California); Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Lahoratory Manual, Vols. 1-3 (2d ed; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York); y Ausubel y colaboradores, eds . (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols (Greene Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., New York; 1994 Supplement . El material de ácido nucleico, por ejemplo, preparaciones de plásmido, de colonias bacterianas individuales que comprende los productos de PCR de la segunda ronda de PCR se someten al análisis adicional para identificar genes plaguicidas novedosos putativos. En una modalidad particular, el DNA de plásmidos de las colonias individuales se analiza mediante el análisis de manchado de puntos utilizando sondas de oligonucleótido marcadas que se diseñan para detectar todos los genes plaguicidas conocidos
dentro del grupo objetivo. Las sondas de oligonucleótido típicamente se diseñan para ser complementarias a un fragmento de los productos de PCR generados durante la segunda ronda de amplificación de PCR. La sonda se diseñan tal que cualquier ácido nucleico que contiene un gen plaguicida conocido dentro del grupo objetivo será identificado (es decir, "positivos de manchado de puntos"). Cualquiera de los ácidos nucleicos que no son detectados por estas sondas utilizando en análisis de manchado de puntos (es decir, "negativos de manchado de puntos" contienen genes plaguicidas novedosos putativos, o probablemente fragmentos de los mismos, y además se analizan para estimar la novedad. Los fragmentos de los genes plaguicidas novedosos putativos identificados de acuerdo con los presentes métodos se secuencian y se someten a comparación de secuencia con genes plaguicidas conocidos para estimar la novedad. Tales análisis de secuencias son bien conocidos en la técnica. Las secuencias de nucleótidos novedosas además se analizan para obtener genes plaguicidas putativos. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico que comprenden genes plaguicidas novedosos putativos se clonan en vectores de expresión y los polipéptidos codificados por estos genes se analizan para la actividad pesticida utilizando ensayos estándares, tales como aquellos descritos enseguida en la presente.
Los métodos anteriores descritos para la identificación de genes plaguicidas novedosos también se pueden utilizar para identificar genes novedosos a partir de otros grupos objetivo de interés. Cuando los métodos de la invención se utilizan para identificar genes no plaguicidas, particularmente genes no de toxina Cry de Bt, el material de partida de ácido nucleico se puede obtener de un organismo de interés diferente. Las otras etapas del método, sin embargo, específicamente en diseño de cebador sistemático (descrito enseguida en la presente) , la primera ronda de PCR, la segunda ronda de PCR, y el análisis de manchado de puntos se realizan esencialmente de la misma manera, sin considerar el grupo de genes objetivos de interés. Mientras que no se propone para ser limitado a algún mecanismo, los cebadores de oligonucleótido utilizados en la primera y segunda ronda de amplificación de PCR se diseñan y probablemente permiten la amplificación de genes 1 tanto conocidos como novedosos que contienen secuencias de señal, como es definido en lo anteriormente en la presente. En contraste, las sondas de oligonucleótido utilizadas en la tercera etapa de la invención, típicamente análisis de manchado de puntos, se seleccionan para detectar específicamente solo genes conocidos. Así, los organismos, tales microorganismos, particularmente cepas de Bt, que comprenden material de ácido nucleico que es amplificado
durante la primera y segunda ronda de PCR pero no es detectado durante la etapa de análisis de manchado de puntos pueden comprender un gen novedoso. En aspectos particulares de la invención, el diseño de por lo menos un par de cebadores de oligonucleótido para el uso en la primera ronda de amplificación de PCR descrita en la presente en lo anterior comprende diseñar cebadores de oligonucleótido degenerados por la vía de un proceso de etapas múltiples. En ciertas modalidades, se prepara una alineación de secuencias de nucleótidos para un grupo de genes objetivo. Por ejemplo, un grupo objetivo de genes plaguicidas puede comprender todos los genes Cry conocidos que tienen actividad plaguicida contra insectos del orden Coleóptera (es decir, genes activos contra Coleópteras). Los genes dentro de un grupo objetivo comparten bloques de homología, referidos en la presente como secuencias de señal. La secuencia de señal sirve como el punto de partida para el diseño de cebador de oligonucleótido, como es descrito en detalle enseguida. Aunque una secuencia de señal es un bloque de nucleótidos que es conservada dentro de todos los miembros del grupo de genes objetivo, puede haber alguna divergencia en la secuencia de señal de gen a gen dentro del grupo objetivo. Como resultado, no puede ser posible diseñar un solo conjunto de cebadores de oligonucleótido que será específico para todos los genes en el grupo objetivo. Por lo
tanto, se puede utilizar una mezcla de cebadores de oligonucleotido para cubrir todas las variaciones posibles de la secuencia de señal que aparece en el grupo objetivo. La utilización de una mezcla de cebadores de oligonucleotido encuentra uso particular cuando, debido a las variaciones de secuencia de la secuencia de señal dentro del grupo de genes objetivo, es difícil o imposible desarrollar un conjunto de cebadores que es específico para una secuencia de señal dentro del grupo objetivo completo. Cuando es posible, un solo conjunto de cebadores que es específico para tantos genes dentro del grupo objetivo como sea posible es diseñado y utilizado. En ciertos aspectos de la invención para la identificación de genes de toxina Cry de Bt novedosos, los cebadores de oligonucleotido utilizados en la primera ronda de PCR se diseñan para dirigir las secuencias de señal en el "dominio 1" de un grupo objetivo de genes Cry de Bt conocidos, y aquellos utilizados en la segunda ronda de PCR son específicos para secuencias en el "dominio 2". El diseño de cebadores de oligonucleotido degenerados para el uso en la primera y segunda ronda de PCR involucra la exploración de las alineaciones de las secuencias de nucleótidos del grupo de genes objetivo para identificar varias regiones de homología que son apropiadas de puntos de partida para el diseño de cebador descrito enseguida. Estas regiones de homología son referidas como
"secuencia de señal". Se selecciona una longitud de cebador inicial, en donde la longitud de cebador inicial está entre aproximadamente 15 pares de bases (bp) y aproximadamente 30 bp, por ejemplo, 15 bp, 16 bp, 17 bp, 18 bp, 19 bp, 20 bp, 21 bp, 22 bp, 23 bp, 24 bp, 25 bp, 26 bp, 27 bp, 28 bp, 29 bp y 30 bp. Una primera ronda de clasificación para un cebador de oligonucleótido luego se realiza al visualizar una ventana inicial de nucleótidos contiguos dentro de una de las secuencias de señal. La ventana inicial comienza en el extremo 5' de la secuencia de señal seleccionada y es equivalente en longitud a la longitud de cebador inicial. La secuencia de nucleótidos dentro de la ventana inicial es revisada para determinar si posee las siguientes características de secuencia requeridas. Una secuencia de nucleótidos apropiada para un cebador para el uso en la primera o segunda ronda de PCR: 1) no tiene cuatro o más residuos de nucleótidos idénticos contiguos; 2) tiene no más de dos residuos de guanina o citosina dentro de los últimos cinco residuos del extremo 3' de la secuencia de nucleótidos; 3) tiene una temperatura de fusión entre aproximadamente 50°C y. 65°C, de manera más particular aproximadamente 54°C +/- 2°C; 4 ) no forma estructuras de horquilla o de dimero;
) está presente en por lo menos una de las secuencias de nucleótidos del grupo de genes objetivos (es decir, la alineación descrita en lo anterior) ; y, 6) no se conserva entre las secuencias de nucleótidos de los genes del grupo no objetivo. Para incrementar la diversidad de los cebadores de oligonucleotido , un residuo de nucleótido es permitido para ser n, en donde n es A, T, C o G. una secuencia de nucleótidos dentro de la ventana inicial se selecciona para el uso como un cebador de oligonucleotido si todas las características de secuencia anteriores están presentes. Si la secuencia de nucleótidos dentro de la ventana inicial no posee todas estas características de secuencia, una ventana adyacente de nucleótidos contiguos se selecciona al mover la ventana inicial por un par de base hacia el extremo 3' de la secuencia de señal. La secuencia de nucleótidos dentro de la ventana adyacente es revisada como es descrita en los anterior y seleccionada para el uso como un cebador de oligonucleótido y todas las características de secuencia están presentes. Rondas de clasificación adicionales se realizan como sea necesario para identificar una secuencia de nucleótidos que satisface los requerimientos anteriores. Un oligonucleótido dentro de la secuencia de señal que tiene las características requeridas se selecciona y se utiliza como un cebador de oligonucleótido en la primera o segunda ronda de
PCR. Ambos cebadores delantero y trasero se diseñan como es descrito en lo anterior. Además, los cebadores delantero y trasero utilizados en la primera ronda de PCR se diseñan tal que son complementarios a las secuencias de nucleótidos dentro de los genes en el grupo objetivo que son de aproximadamente 50 bp a aproximadamente 150 bp aparte. Los cebadores delantero y trasero de la segunda ronda de amplificación de PCR generalmente se diseñan tal que son complementarios a la secuencias de nucleótidos dentro de los genes del grupo objetivo que son de aproximadamente 500 bp a aproximadamente 800 bp aparte. Como se utiliza en la presente en lo anterior, una secuencia de nucleótidos está "presente" en por lo menos una de las secuencias de nucleótidos del grupo de genes objetivo si la secuencia de nucleótidos idéntica se encuentra la secuencia de nucleótidos de por lo menos un miembro del grupo objetivo, con la advertencia de que un residuo de oligonucleótido se permite para ser cualquier nucleótido (es decir, n = A, T, C o G) . El término "grupo no objetivo de genes plaguicidas" se refiere a todos los genes plaguicidas dentro de una familia particular de genes plaguicidas, excluyendo aquellos genes plaguicidas que se han seleccionado como el grupo objetivo. Por ejemplo, si el grupo objetivo comprende todos los genes Cry de Bt que son activos contra Coleópteros, el grupo no objetivo correspondiente de genes
plaguicidas comprende todos los genes de Bt excepto aquellos que son activos contra insectos del orden Coleóptera. De manera similar, un "gen objetivo" o "grupo de genes no objetivos" se refiere a todos los genes dentro de una familia particular de genes plaguicidas, excluyendo aquellos genes que se han seleccionado como el grupo objetivo. Una secuencia de nucleótidos es "no conservada entre secuencias de nucleótidos de los grupos de genes no objetivo" si difiere de todas las secuencias de nucleótidos dentro del grupo no objetivo por al menos dos residuos de nucleótido. En ciertos aspectos de la invención, la determinación de si una secuencia de nucleótidos dentro de una ventana particular de nucleótidos contiguos no es conservada entre los genes del grupo no objetivo comprende la búsqueda de la secuencia de longitud completa de cada gen a partir del grupo de genes no objetivo. En algunas modalidades, la secuencia de longitud completa de cada gen del grupo de genes no objetivo es buscar exhaustivamente utilizando la secuencia de nucleótido dentro de la ventana como un término de búsqueda de cadena. Esto es, si una secuencia de nucleótido dentro de una ventana aparece en otra parte en un gen de grupo no objetivo, o si una secuencia de nucleótidos con menos de 2 diferencias de residuos de nucleótidos aparece otra parte en un gen de grupo no objetivo, entonces esa secuencia de nucleótidos particular dentro de la ventana no será seleccionada como un cebador de
oligonucleót ido . Como es indicado en lo anterior, los cebadores traseros utilizados en la primera ronda de PCR típicamente se utilizan para general los cebadores delanteros para la segunda ronda de PCR. Los cebadores traseros para la segunda ronda de PCR se diseñan de acuerdo con los métodos descritos en lo anterior utilizando una secuencia de señal diferente como el punto de partida para el diseño de cebador, específicamente una que está 3' a la secuencia de señal utilizada para diseñar los cebadores de oligonucleót ido para la primera ronda de PCR. Una vista esquemática del diseño de cebador ejemplar para la primera y segunda ronda de PCR se presenta en la Figura 1. Debido a que las secuencias de señal dentro del grupo de genes objetivo típicamente no serán idénticas entre todos los miembros, una mezcla de cebadores de oligonucleótido generalmente será utilizada en tanto la primera como la segunda ronda de PCR para tener en cuenta estas variaciones de secuencia. Cuando mezclas de cebadores de oligonucleót idos se utilizan en la reacciones de PCR de la invención, los cebadores además se diseñan tal que todos los cebadores tienen temperaturas de fusión idénticas o casi idénticas. En algunas modalidades, la temperatura de fusión para los cebadores de oligonucleótido utilizados en la primera y segunda ronda de PCR serán de aproximadamente
54°C + 2°C. "Gen plaguicida" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que exhibe actividad plaguicida. Como se utiliza en la presente, el término "actividad plaguicidas" se refiere a la habilidad de una sustancia, tal como un polipéptido, para inhibir el crecimiento, alimentación o reproducción de una plaga de insectos y/o para exterminar la plaga de insectos. Un "polipéptido plaguicidas" o "toxina de insecto" se propone para dar entender una proteina que tiene actividad plaguicida. La actividad plaguicida se puede medir mediante ensayos de rutina conocidos en la técnica. Tales ensayos incluyen, pero no están limitados a, mortalidad de la plaga, pérdida de peso de la plaga, repelencia de la plaga, tracción de la plaga y otros cambios de comportamiento y físicos de una plaga después de la alimentación y la exposición a la sustancia por un período de tiempo apropiado. Procedimientos generales incluyen la adición del compuesto u organismo experimental a la fuente de dieta en un recipiente encerrado. Los ensayos para estimar la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes Norteamericanas Nos. 6,570,005 y 6,339,144; incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. La etapa de desarrollo preferida para la prueba para la actividad plaguicida es en larvas o en formas
inmaduras de un insecto de interés. Los insectos pueden ser criados en la oscuridad total en aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C y de aproximadamente 30% a aproximadamente 70% de humedad relativa. Los bioensayos se pueden realizar como es descrito en Czapla y Lang (199°) J. Econ. Entomol. 83 ( 6) : 2480-2485. Métodos para crear larvas de insectos y realizar bioensayos son bien conocidos para uno de habilidad ordinario en la técnica. En algunas modalidades de la invención, el grupo objetivo de interés es genes plaguicidas que comprende genes de toxina Cry de Bt o un subconjunto especifico de genes Bt , tales como, por ejemplo, genes Cry de Bt activos contra Coleópteros. Gen "Bt" o "Bacillus thuringiensis" se propone para dar entender la clase más amplia de genes encontrados en varias cepas de Bt que codifican toxinas de Bt, que incluyen tales toxinas como, por ejemplo, toxina Cry (cristal) (es decir, d-endotoxinas) y toxinas Cyt (citotóxicas) . "toxina Cry" y "toxinas Cyt" incluyen polipéptidos plaguicidas que son homólogos a las proteínas Cry o Cyt conocidas respectivamente. Los genes Cry incluyen secuencias de nucleótidos que codifican cualquier polipéptido clasificado como una toxina Cry, por ejemplo, Cryl, Cry2, Cry3, Cry7, Cry8 y Cry9. Ver, Crickmore y colaboradores, (1998) Microbiol. Molec. Biol . Rev. 62:807-813 y Crickmore y colaboradores, (2004) Bacillus Thuringiensis Toxin
Nomenclature at lifesci . sussex . ac . uk/Home/Neil_Crickmore/B . thuringiensis, ambas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Las toxinas Bt son una familia de proteínas plaguicidas que se sintetizan como protoxinas y cristalizan como inclusiones parasporales . Cuando son ingeridas por una plaga de insectos, la estructura de microcristal es disuelta por el pH alcalino del intestino medio del insecto, y la protoxina es segmentada por las proteasas del intestino del insecto para generar la toxina activa. La toxina Bt activada se enlaza a los receptores en el epitelio intestinal del insecto, causando lesiones de la membrana e hinchamiento y lisis asociados del intestino del insecto. La muerte del insecto resulta de la inanición y septicemia. Ver, por ejemplo, Li y colaboradores (1991) Nature 353: 815-821. La forma de protoxina de la toxina Cry contiene un segmento de formación cristalino. Una comparación de las secuencias de aminoácidos de la toxina Cry activa de diferentes especificidades además revela cinco bloques de secuencia altamente conservados. Estructuralmente, la toxina Cry comprenden tres dominios distintos, que son, del N- a C- terminal: una agrupación de siete alfa-hélices implicadas en la formación de poros (referida como "dominio 1"), tres láminas beta anti-paralelas implicadas en el enlace celular (referidas como "dominio 2"), y una beta intercalación
(referida como "dominio 3") . La ubicación y las propiedades de estos dominios son conocidas para aquellos de habilidad en la técnica. Ver, por ejemplo, Li y colaboradores, (1991) supra y Morse y colaboradores, (2001) Structure 9:409-417. El sistema de nomenclatura de toxina Bt original clasificó las toxinas sobre las bases de los perfiles de actividad plaguicida. Este sistema se ha reemplazado una nueva nomenclatura que está basada solamente sobre la identidad de secuencia de aminoácidos. Bajo este sistema, las toxinas Cry y Cyt se han agrupado en clases o familias basadas en la identidad de secuencia de aminoácidos, y el nombre de la toxina proporciona información que considera su homología a otras secuencias. Así, por ejemplo, las toxinas Cry2Aa, Cry2Ab, y Cry2Ac, que son miembros de la familia Cry2, comparten aproximadamente 80% de identidades de secuencia de aminoácidos. De manera similar, las toxinas de la familia Cry8, CrySAa y Cry8Ba comparten aproximadamente 65% de identidad de secuencia de aminoácidos. Ver Crickmore y colaboradores. (1998), supra. Los cebadores de oligonucleótido específicos para secuencias de señal dentro de un grupo de interés objetivo, tal como un grupo objetivo de genes plaguicidas, utilizado en ambas de las primera y la segunda ronda de PCR y diseñados de acuerdo con los métodos en la presente, generalmente se diseñan para tener un punto de fusión térmico (Tm) o
temperatura de entre aproximadamente 50°C y 65°C. En modalidades particulares, los cebadores de oligonucleótido tienen una Tm de entre aproximadamente 52°C y 56°C, de manera más particular aproximadamente 54 °C. Un número de fórmulas se han utilizado para determinar la Tm. Cualquier fórmula para calcular Tm se puede utilizar para practicar los presentes métodos. Por ejemplo, un algoritmo clásico para la determinación de Tm basado en la termodinámica de vecino más cercano es como sigue: Tm = EH°/(ES° + (R x In (Ct)) - 273.15 + 16.6 log[X] donde EH° y ES° son la entalpia y entropía para formación de hélice respectivamente; R es la constante de gases molar (1.987 (cal) (K"x) (mol-1) ) ; Ct es la concentración de hebra (cebador) total; y X es la concentración de sal. Rychlik y colaboradores, (1990) Nucleic Acid Res. 18 (21) : 6409-6412. Por otra parte, en algunas modalidades, la Tm de un cebador de oligonucleótido se calcula utilizando la siguiente fórmula: Tm = (EH° / [ES° + (R x In (Ct) ) ] - 273.15 + 16.6 log ( [X] ) ) x 1.1144-14.964 donde EH° (entalpia) = ? ??; ES° (entropía) = ? AS + 0.368 x 19 x 1.585; R (constante de gases molar) = 1.987; Ct (concentración de cebador total) = log (0.00000005/4) x 1000; y X (concentración de sal [K+] ) = 0.05. Una persona experta en la técnica reconocerá que los cebadores de oligonucleótido utilizados para practicar
los métodos de la invención son cebadores de oligonucleotido empare ados tal que hay dos cebadores individuales por par (es decir, un cebador delantero y un cebador trasero) . Uno de los cebadores en cada par es complementario (es decir, capaz de hibridar) a una porción de la hebra 5' de una secuencia de señal del grupo de genes objetivos (cebador delantero) mientras que el otro es complementar a una porción de la hebra 3' de una secuencia de señal, (cebador trasero) . Los cebadores de oligonucleótidos se diseñan tal que una polimerasa adecuada copiará la secuencia de cada hebra 3' a cada cebador para producir copias amplificadas (es decir, el "producto de amplificación de PCR" o "producto de PCR") . El presente método utiliza por lo menos un par de cebadores de oligonucleotido para la amplificación de PCR. En ciertos aspectos de la invención, se utiliza una mezcla de pares de cebadores de oligonucleotido que comprenden 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 o más pares de cebadores. Métodos para diseñar cebadores de oligonucleotido, incluyendo cebadores de oligonucleotido degenerados, específicos para una secuencia de nucleótidos particular de interés (por ejemplo, secuencias de señal) son bien conocidos en la técnica. Los cebadores de oligonucleotido de la presente invención serán de una longitud adecuada para permitir la amplificación de genes novedosos, tales como genes plaguicidas novedosos. Los cebadores individuales de cada par
típicamente comprenderán entre aproximadamente 15 bp y aproximadamente 30 bp, más particularmente entre aproximadamente 20 bp y aproximadamente 25 bp . La distancia entre los cebadores individuales en un par de cebadores de oligonucleótido también será suficiente para producir productos de PCR de de una longitud detectable. Así, la primera ronda de PCR, los cebadores delantero y trasero se seleccionan tal que son complementarios a secuencias de nucleótidos dentro de la secuencias de nucleótidos para miembros del grupo de genes objetivos que están típicamente entre aproximadamente 50 bp a aproximadamente 150 bp aparte, más particularmente aproximadamente 100 bp aparte. La segunda ronda de PCR, los cebadores delantero y trasero generalmente serán complementarios a la secuencias de nucleótidos dentro del grupo objetivo que están entre aproximadamente 500 bp a aproximadamente 800 bp aparte, de manera particular aproximadamente 600 bp a aproximadamente 750 bp aparte, de manera más particular aproximadamente 600 a aproximadamente 650 bp aparte. El material de ácido nucleico para el uso en los presentes métodos se puede obtener mediante cualquier método de cualquier organismo de interés. Los organismos de interés incluyen, por ejemplo, microorganismos (más particularmente cepas de Bt) , plantas, animales, hongos, bacterias, e insectos. El material de ácido nucleico puede comprender, por
ejemplo, DNA de plásmido preparado de un organismo de interés, tal como una cepa de Bt . En algunas modalidades, la obtención del material de ácido nucleico comprende aislar DNA de un organismo de interés, particularmente un microorganismo de interés. El material de ácido nucleico puede comprender, por ejemplo, DNA geonómico. En aspectos particulares de la invención, el material de ácido nucleico comprende una librería de plásmidos generada de cepas de Bt. Cuando se realizan múltiples rondas de amplificación de PCR, una nueva muestra de material de ácido nucleico del organismo se puede obtener y utilizar para cada ronda de PCR. Así, por ejemplo, una nueva preparación de plásmidos de DNA se puede preparar a partir de una cepa de Bt para el uso en cada ronda de PCR. La amplificación de ácido nucleico mediante PCR es una técnica de biología molecular fundamental. Los métodos para realizar PCR son bien conocidos en la técnica y se pueden realizar sobre la instrumentación que es comercialmente disponible. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Lahoratory Manual
(2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York); Innis y colaboradores, eds . (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods y Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); y Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual
(Academic Press, New York), todas las cuales son incorporadas
en la presente por referencia. Brevemente, PCR permite la amplificación rápida y eficiente del material de ácido nucleico (por ejemplo, DNA de un gen de interés) que comprende una secuencia objetivo de interés. El material de ácido nucleico a ser amplificado, los cebadores del oligonucleotido, y una DNA polimerasa termoestable (por ejemplo, Taq polimerasa) se mezclan bajo condiciones adecuadas para la amplificación de PCR. Las mezclas de reacción de PCR además comprenden cantidades suficientes de los cuatro trifosfatos deoxinucleosido y cloruro de magnesio. Los componentes de reacción individuales para PCR son comercialmente disponibles y son ofrecidos por un número de compañías (por ejemplo, Roche Diagnostics, Qiagen, Promega, Stratagene, etc.). Las mezclas de reacción previamente preparadas o "mezclas maestras" a las cuales solamente el material de ácido nucleico y los cebadores de oligonucleotido tienen que ser adicionados también son disponibles. La PCR se realiza por al menos un tiempo suficiente para permitir la producción de copias de secuencias de ácido nucleico entre cebadores de oligonucleotido en una cantidad detectable. En modalidades particulares, los métodos de la invención comprenden realizar una primera ronda de PCR, particularmente PCR en tiempo real, más particularmente, PCR en tiempo real cuantitativa. La PCR en tiempo real permite. la detección de productos de PCR en etapas más tempranas de la
reacción de amplificación. Específicamente, en la PCR en tiempo real la cuantificación de productos de PCR depende de cuantos ciclos donde la cantidad de material de ácido nucleico amplifica el logarítmicamente hasta que alcanza una meseta. Durante la fase exponencial, la cantidad de material de ácido nucleico objetivo debe estar duplicando cada ciclo, y no hay desviación a los reactivos limitantes. Los métodos sin instrumentación para realizar la PCR en tiempo real son bien conocidos en · la técnica. Ver, por ejemplo, Bustin (2000) J. Molec. Endocrino!. 25:169-193; Freeman y colaboradores, (1999) Biotechniques 112:124-125; Halford (1999) Wat. Biotechnol. 17:835; y Heid y colaboradores, (1996) Genome Res. 6 ( 10 ) : 986-99 , todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. En ciertos aspectos de la invención, la primera ronda de amplificación de PCR comprende realizar la PCR en tiempo real. Como se utiliza en la presente, "detección" de productos de amplificación de PCR comprende cualquier método para detectar la presencia, o ausencia o cantidad de ácidos nucleicos amplificados por las etapas de PCR de la presente invención. Los métodos de detección pueden proporcionar información cualitativa o cuantitativa considerando el nivel de amplificación. Tales métodos para detectar los productos de amplificación de PCR son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la electroforesis en gel de azarosa
manchada con bromuro de etidio, la hibridación de manchado/sonda de Southern y ensayos de fluorescencia. Muchos diferentes tintes y sondas están disponibles para monitorear la PCR y detectar productos de PCR. Por ejemplo, los productos de PCR generados mediante la amplificación de PCR en tiempo real se pueden detectar utilizando una variedad de tintes fluorescentes y sondas de oligonucleótido covalentemente marcadas con moléculas fluorescentes. Tales entidades fluorescentes son capaces de indicar la presencia de productos de PCR y proporcionar una señal relacionada con la cantidad de productos de PCR. Por otra parte, al utilizar el monitoreo de fluorescencia continua de los productos de PCR, el punto en el cual la señal se detecta arriba del antecedente (Ct; umbral del ciclo) y está en la fase exponencial puede ser determinado. Entre más abundante es la secuencia de ácido nucleico de plantilla más antes se alcanza el Ct. Los tintes específicos de DNA de doble hebra se pueden utilizar para detectar la formación de producto de PCR en cualquier amplificación de PCR sin la necesidad de sintetizar sondas específicas de secuencia. Tales tintes enlazan específicamente al DNA de doble hebra (dsDNA) e incluyen pero no está limitados a SYBR® Green, SYBR Gold®, y bromuro de etidio. "SYBR® Creen" se refiere al cualquiera de los tintes fluorescentes SYBR® Green comercialmente
disponibles, incluyendo SYBR® Green I y SYBR® Green II. Con tintes de dsDNA, la especificidad del producto se puede incrementar mediante el análisis de las curvas de fusión o al adquirir la fluorescencia en una alta temperatura donde han fundido productos no específicos. Ver Ririe y colaboradores,
(1997) Anal. Biochem. 245:154-160; Morrison y colaboradores,
(1998) Bio Techniques 24:954-962. Las sondas de oligonucleótido también se pueden marcar covalentemente con moléculas fluorescentes y utilizar para detectar productos de PCR. Los cebadores de horquilla (cebadores Sunrise®) , sondas de horquilla (Molecular Beacons®) , y sondas de exonucleasa (sondas TaqMan®) son oligonucleótidos fluorescentes de marca doble que pueden ser monitoreados durante la PCR. Estas sondas dependen del enfriamiento de fluorescencia de un fluoroforo mediante un apagador sobre el mismo oligonucleótido. La fluorescencia incrementa cuando la hibridación o hidrólisis de exonucleasa ocurre . Los productos de PCR también se pueden detectar utilizando dos oligonucleótidos , cada uno marcado con una sonda fluorescente. La hibridación de estos oligonucleótidos a un ácido nucleico objetivo lleva las dos sondas fluorescentes cercanas conjuntamente para permitir que ocurra la transferencia de energía de resonancia. Ver, por ejemplo, Wittwer y colaboradores, (1997) BioTechniques 22:130-138. Los
pares de fluoroforo aceptables para el uso como pares de transferencia de energía de resonancia fluorescente son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica e incluye, pero no están limitados a, fluoresceína/rodamina, ficoeritrina/Cy7 , fluoresceína/Cy5 , fluoresceína/Cy5.5 , fluoresceína/LC Red 640, y fluoresceína/LC Red 705. En ciertos aspectos de la invención, un tinte fluorescente SYBR® Green se utiliza para detectar productos de PCR, más particularmente productos de PCR en tiempo real generados durante la primera ronda de PCR. Como es descrito en lo anterior, SYBR® Green es un tinte fluorescente que enlaza la hendidura menor de dsDNA. Cuando el tinte SYBR® Green enlaza a dsDNA, se incrementa la intensidad de la emisión fluorescente. Así, a medida que se producen más productos de PCR de doble hebra, también se incrementa la señal fluorescente de SYBR® Green. En otros aspectos de la invención, un ensayo de 5' nucleasa se utiliza para monitorear PCR, particularmente PCR en tiempo real, y para detectar productos de amplificación de PCR. En el ensayo de nucleasa 5' , una sonda de oligonucleótido llamado una sonda TaqMan® se adiciona a la mezcla de reactivos de PCR. La sonda TaqMan® comprende un tinte reportador de fluorescente de alta energía en el extremo 5' (por ejemplo, FAM) y un tinte apagador de baja energía en el extremo 3' y (por ejemplo, TA RA) . Cuando la sonda está intacta, la emisión fluorescente
del tinte reportador se suprime por la estrecha proximidad del apagador. La sonda TaqMan® además se diseña para recoser a una secuencia especifica de la plantilla entre los cebadores delantero y trasero, y por lo tanto, la sonda enlaza al material de ácido nucleico de plantilla en la ruta de la polimerasa. La amplificación de PCR da por resultado la segmentación y liberación del tinte reportador de la sonda que contiene el apagador mediante la actividad de nucleasa de la polimerasa. Asi, la señal de fluorescencia generada del tinte reportador liberado es proporcional a la cantidad del producto de PCR. Métodos e instrumentación (por ejemplo, Detector ABI Prism 7700; Perkin Elmer/Applied Biosytems División) para realizar la PCR en tiempo real utilizando las sondas SYBR® Green o TaqMan® son bien conocidos en la técnica. En modalidades particulares, los productos de PCR de la primera ronda de amplificación de PCR se detectan utilizando SYBR® Green. Como es indicado en lo anterior, los productos de PCR generados durante la segunda ronda de PCR generalmente son separados mediante la electroforesis en gel de agarosa. Las moléculas de ácido nucleico de la longitud esperada se aislan y se someten al análisis de manchado de puntos para eliminar los genes conocidos en el grupo objetivo de la consideración adicional. "Análisis de manchado de puntos" o "hibridación de
manchado de puntos" es un método estándar en el campo de la biología molecular. En general, la hibridación de manchado de puntos comprende inmovilizar en el material de ácido nucleico sobre, por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o de nylon. El material de ácido nucleico inmovilizado se expone a una sonda de oligonucleótido marcada bajo condiciones adecuadas para la hibridación, y la presencia o ausencia de sonda enlazada es detectada. Las sondas de oligonucleótido de la invención se pueden marcar con una marca radioactiva o no radioactiva para facilitar la detección del enlace de sonda. Varias marcas radioactiva y no radioactiva están disponibles en la técnica. Tales marcas incluyen, por ejemplo, digoxigenina (DIG), biotina, moléculas fluorescentes, y tritio (3H) . Métodos para producir sondas de oligonucleótido marcadas para el uso en el análisis de manchados de puntos son bien conocidos en la técnica . Las sondas de oligonucleótido utilizadas para el análisis de manchados de puntos en los métodos de la invención son específicas para todos los genes conocidos (por ejemplo, genes plaguicidas o plaguicidas) dentro del grupo objetivo. Las sondas se diseñan para ser complementarias a los fragmentos de los productos de PCR generados durante la segunda ronda de PCR. Una vista esquemática del diseño de sonda de oligonucleótido para la etapa de análisis de manchado de puntos de la presente invención se proporciona en
la Figura 1. En modalidades particulares, una mezcla de sondas de oligonucleotido que son especificas para todos los genes conocidos en el grupo objetivo son utilizados. El diseño de una mezcla de sondas de oligonucleotido, en donde cada sonda es especifica para un gen dentro del grupo objetivo, encuentra uso particular cuando, debido a las deferencias de secuencia como es difícil desarrollar una sonda individual que es específica para un grupo objetivo completo. Cuando es posible, un solo conjunto de sondas que es específico para tantos genes (por ejemplo, genes plaguicidas) dentro del grupo objetivo cómo es posible es diseñado y utilizado. Además, cuando más de una sonda de oligonucleotido es utilizada, las sondas pueden ser incubadas con una sola membrana de manchado de puntos como una mezcla de sondas, alternativamente, múltiples membranas se pueden preparar e incubar por separado con las sondas individuales. Las sondas de oligonucleotido de manchado de puntos típicamente será de aproximadamente 20 bp a aproximadamente 40 bp en longitud, de manera más particular aproximadamente 25 bp a aproximadamente 35 bp, de manera más particular aproximadamente 30 bp a aproximadamente 35 bp . Por otra parte, las sondas de oligonucleotido utilizadas para el análisis de manchado de puntos típicamente serán diseñadas para tener una Tm de por lo menos aproximadamente 70°C, de manera particular por lo menos aproximadamente 75°C, más
particularmente por lo menos aproximadamente 80°C. Cuando se utiliza una mezcla de sondas de oligonucleótido , cada sonda será diseñada para tener aproximadamente la misma Tm. Uno de habilidad en la técnica apreciará que los métodos o cualquiera de las etapas en los mismos, para identificar genes novedosos, incluyendo genes plaguicidas novedosos, más particularmente genes de toxina Cry de 23fc novedosos, se pueden implementar en una manera automatizada, semi-automatizada o manual. Los métodos divulgados en la presente se pueden utilizar en ensayos de clasificación de alto rendimiento. Las composiciones de la invención incluyen polinucleótidos aislados y variantes y fragmentos de los mismos, que comprenden genes novedosos. Tales genes novedosos se identifican utilizando los métodos de la presente invención. Las secuencias de aminoácidos que comprende polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico de la invención además son proporcionadas. Las moléculas de ácido nucleico novedosas y polipéptidos plaguicidas identificados por lo métodos proporcionados en la presente, encuentran uso, por ejemplo, en la protección de plantas de del daño relacionado con plagas. La invención abarca composiciones de polinucleótido o de proteína aislado o sustancialmente purificada. Un polinucleótido o proteína "aislada" o "purificada" o porción
biológicamente activa de los mismos, está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el polinucleótido o proteina como se encuentra en su medio ambiente en que ocurre naturalmente. Asi, un polinucleótido o proteina aislada o purificada está sustancialmente libre de otro material o celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes , o sustancialmente libre de precursores químicos y otras sustancias químicas cuando se sintetizan químicamente. Óptimamente, un polinucleótido "aislados" está libre de secuencia (secuencias que codifican proteína óptimamente) que naturalmente flanquean el polinucleótido (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del polinucleótido) en el DNA genómico del organismo del cual se deriva el polinucleótido. Por ejemplo, en varias modalidades, el polinucleótido aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, o 0.1 kb de secuencia de nucleótidos que naturalmente flanquea el polinucleótido en el DNA genómico de la célula de la cual se deriva en polinucleótido. Una proteína que esta sustancialmente libre de material celular incluye preparación de proteína en términos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, o 1% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención o porción de biológicamente activa de la misma se produce recombinantemente, en medio
óptimamente de cultivo representa menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, o 1% (en peso seco) de precursores químicos o sustancias químicas no de proteína de interés. Como se utiliza en la presente, "ácido nucleico" incluye en la referencia a un polímero de deoxiribonucleótido o ribonucleótido en forma ya sea de una sola o de doble hebra, y a menos que se limite de otra manera, abarca análogos conocidos (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptidos) que tiene la naturaleza su esencial de nucleótidos naturales en que hibridan a ácidos nucleicos de una sola hebra de una manera similar a los nucleótidos que ocurren naturalmente . El uso del término "oligonucleótido" o "polinucleótido" no se propone para limitar la presente invención a polinucleótidos que comprenden DNA. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica reconocerán que los oligonucleótidos y polinucleótidos, pueden comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y deoxiribonucleótidos . Tales deoxiribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen moléculas que ocurren naturalmente y análogos sintéticos. Los oligonucleótidos y polinucleótidos de la invención también abarca en todas las formas de secuencias que incluyen, pero no limitadas a, formas de una sola hebra, formas de doble hebra y los similares. Los términos "polipéptido" , "péptido", y "proteína"
se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácido es un análogo químico artificial de un aminoácido que ocurre naturalmente correspondiente, así como polímeros de aminoácidos que ocurren naturalmente. Como se utiliza en la presente, "secuencia de longitud completa" en referencia a un polinucleótido especificado o su proteína codificada significa que tiene la secuencia de ácido nucleico completa o la secuencia de aminoácidos completa de una secuencia nativa. "Secuencia nativa" se propone para dar entender una secuencia endógena como es decir, una secuencia no diseñada encontrada en el genoma de un organismo. Un polinucleótido de longitud completa codifica la forma de longitud completa de la proteína especificada. Como se utiliza en la presente, los términos "codificación" o "codificado" cuando se utiliza en el contexto de un ácido nucleico especificado significa el ácido nucleico comprende la información necesaria para dirigir la producción de la secuencia de nucleótidos en una proteína especificada. La información mediante la cual una proteína es codificada especificada por el uso de codones. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de la
región traducidas de la molécula de ácido nucleico o puede carecer de tales secuencias no traducidas de intervención (por ejemplo, como en cDNA) . Los fragmentos y variantes de los polinucleótidos divulgados y proteínas codificadas de esta manera también están abarcados por la presente invención. "Fragmentos" se propone para dar entender una porción del polinucleótido o una porción de la secuencia de aminoácidos y por consiguiente la proteína codificada de esta manera. Los fragmentos de un polinucleótido pueden codificar fragmentos de proteína que retiene la actividad biológica de la proteína nativa y por consiguiente poseen, por ejemplo, actividad plaguicida. Alternativamente, los fragmentos de un polinucleótido que son útiles como sondas de hibridación generalmente cuando no codifican proteínas de fragmento que retienen la actividad biológica. Así, los fragmentos de un polinucleótido pueden variar de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta el polinucleótido de longitud completa que codifica las proteínas de la invención. Un fragmento de un polinucleótido de la invención que codifica una' porción biológicamente activa de una proteína codificará por lo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 20, o 250 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína de longitud completa de
la invención, tal como una proteina plaguicida. Los fragmentos de un polinucleótido que son útiles cómo sondas de hibridación o cebadores de PCR generalmente no necesitan codificar una porción biológicamente activa de la proteina. Asi, un fragmento de un polinucleótido puede codificar una porción biológicamente activa de una proteina, o puede ser un fragmento que puede ser utilizado como una sonda de hibridación o cebador de PCR utilizando métodos divulgados enseguida. Una porción biológicamente activa de una proteina se puede preparar al aislar una porción de uno de los polinucleótidos de la invención, al expresar la porción codificada de la proteina (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) , y al estimar la actividad biológica de la porción codificada de la proteina. Los polinucleótidos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos identificados por los métodos en la presente comprenden por lo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, o 1,400 nucleótidos contiguos, hasta el número de nucleótidos presentes en un polinucleótido de longitud completa divulgada en la presente. Las "variantes" se proponen para dar entender secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos, una variante comprende una supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro del
polinucleótido nativo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Como se utiliza en la presente, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos que ocurren naturalmente o secuencia de aminoácidos, respectivamente. Para polinucleótidos , las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifica la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de la invención. Las variantes alélicas que ocurren naturalmente tales como estas pueden ser identificadas con el uso de técnica de biología molecular bien conocida, como, por ejemplo, con técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como es resumido enseguida . Los polinucleótidos variantes también incluyen polinucleótidos, sintéticamente derivados, tales como aquellos generados, por ejemplo, al utilizar la mutagénesis dirigida al sitio pero que todavía codifican una proteína biológicamente activa de la invención (por ejemplo, como una proteína plaguicidas) . Generalmente, las variantes de un polinucleótido particular de la invención tendrán por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a ese polinucleótido particular como es determinado por los programas y parámetros de alineación de secuencias descritos
en otra parte en la presente. Las variantes de un polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) también se pueden evaluar mediante la comparación del por ciento de identidad de secuencia entre polipéptido codificado por un polinucleótido variante y el polipéptido codificado por el polinucleótidos de referencia. Asi, por ejemplo, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con un por ciento de identidad de secuencia dado a un polipéptido de la invención es divulgado. El por ciento de identidad de secuencia entre cualquiera de los dos polipéptidos se puede calcular utilizando programas de alineación se secuencia y parámetros descritos en otra parte en la presente. Donde cualquier par dado de polinucleótidos de la invención se evalúa mediante la comparación del por ciento de identidad se secuencia compartido por los dos polipéptidos que ellos codifican, el por ciento de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia . Proteina "variante" se propone para dar entender una proteina derivada de la proteina nativa mediante su presión o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteina nativa y/o sustitución de uno
o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteina nativa. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, esto es continúan presentando la actividad biológica deseada de la proteína nativa, por ejemplo, actividad plaguicida como es descrito en la presente. Tales variante pueden resultar de, por ejemplo, polimorfismo genético de la manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína nativa de la invención tendrán por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos para la proteína nativa como es determinado por los programas de alineación de secuencia y parámetros descritos en otra parte en la presente. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención fue diferente esa proteína por tampoco como 1-15 residuos de aminoácido, tan pocos como 1-10, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o aun 1 residuo de aminoácido . Las proteínas de la invención se pueden alterar de varias maneras incluyendo sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos y fragmentos de proteínas plaguicidas u otras
proteínas se pueden preparar mediante mutaciones en el DNA. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 82:488-492; Kunkel y colaboradores, (1987) Methods in Enzymol 154:367-382; la patente Norteamericana No. 4,873,192; Walker y Gaastra, eds . (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias citadas en las mismas. La guía en cuanto a las substituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se puede encontrar en el modelo de Dayhoff y colaboradores, (1978) Atlas oí Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D. C) , incorporada en la presente por referencia. La substituciones conservativas, tal como el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser óptimas. Así, los polinucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias que ocurren naturalmente así como las formas mutantes. Del mismo modo, las proteínas de la invención abarcan tanto proteínas que ocurren naturalmente así como variaciones y formas modificadas de las mismas. Tales variantes continúan presentando la actividad biológica deseada, por ejemplo, actividad plaguicida. Obviamente, las mutaciones que serán hechas en el DNA que codifica la
variante no devén colocar la secuencia fuera de la estructura de lectura y óptimamente no crearán regiones complementarias que podrían producir estructura de mRNA secundaria. Ver, la Publicación de Solicitud de Patente EP No. 75,444. Las supresiones, inserciones y substituciones de las secuencias de proteína abarcadas en la presente no se esperan que produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la substitución, supresión e inserción por adelantado para hacerlo así, un experto en la técnica apreciará que el efecto será evaluado mediante ensayos de clasificación de rutina. Por ejemplo, la actividad de variantes de proteínas plaguicidas novedosas se puede evaluar al analizar para la actividad plaguicida. Ver, por ejemplo, las patentes Norteamericanas Nos. 6,570,005 y 6,339,144, incorporadas en al presente por referencia. Los polinucleótidos variantes y proteínas también abarcar secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como él entre mezclado de DNA. Con tal procedimiento, una o más secuencias de codificación de proteína diferentes se pueden manipular para crear un nuevo polipéptido que posee las propiedades deseadas, tal como actividad plaguicida. De esta manera, librerías de polinucleótido recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionados
que comprenden regiones de secuencia que tiene identidad de secuencia sustancial y pueden ser homólogamente recombinados in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando este procedimiento, las porciones de secuencia que codifican un dominio de interés pueden ser entre mezcladas entre el gen de la invención (por ejemplo, un gen de toxina Cry de Bt novedoso) y otros genes relacionados conocidos para obtener un nuevo gen que codifica para una proteina con una propiedad de interés mejorada, tal como actividad plaguicida incrementada. Las estrategias para tal entre mezclado de DNA son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri y colaboradores, (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Mopre y colaboradores, (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang y colaboradores, {1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri y colaboradores, (1998) Nature 391:288-291; y las Patentes Norteamericanas Nos. 5, 605, 793 y 5, 837, 458. Los polinucleótidos de la invención se pueden utilizar para aislar secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otros microorganismos. De esta manera, métodos tales como PCR, hibridación o los similares se pueden utilizar para identificar tales secuencias basados en su homología se secuencia con las secuencias expuestas en la presente. Las secuencias aisladas basadas en su identidad
de secuencia a las secuencias completas expuestas en la presente o variantes y fragmentos de las mismas están abarcadas por la presente invención. Tales secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias divulgadas. "Ortólogos" se propone para dar entender genes derivados un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como un resultado de la diferencia siendo especies. Los genes encontrados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o secuencias de proteína codificadas comparten por lo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más grande identidad de secuencia. Las funciones de los ortólogos son de manera frecuente altamente conservadas entre las especies. Así, los polinucleótidos aislados que codifican para un polipéptido con una actividad biológica de interés y que hibridan bajo condiciones severas a una secuencia divulgada en la presente, o variantes o fragmentos de los mismos, están abarcados por la presente invención . En un procedimiento de PCR, los cebadores de oligonucleótido pueden ser diseñados para el uso en reacciones de PCR para amplificar secuencias DNA correspondientes a partir del cDNA o DNA genómico extraído de cualquier organismo de interés. Métodos para diseñar cebadores de PCR y la clonación de PCR son generalmente
conocidos en la técnica y son divulgados en Sambrook y colaboradores, (1989) Molécula r Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring I-Iarbor Laboratory Press, Plainview, New York). Ver también Innis y colaboradores, eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods y Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); y Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York) . Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no están limitados a, métodos que utilizan cebadores emparejados, cebadores empalmados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores parcialmente desigualados y los similares. En las técnicas de hibridación, todo o parte de un polinucleótido conocido se utiliza como una sonda que selectivamente híbrida a otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de DNA genómicos clonados o fragmentos de cDNA (es decir, librerías genómicas o cDNA) a partir de un organismo elegido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de DNA genómico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, u otros oligonucleótidos, pueden ser marcados por un grupo detectable tal como P, o cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo, las sondas para hibridación se pueden hacer al marcar oligonucleótidos sintéticos basados en los
polinucleótidos plaguicidas de la invención. .Los métodos para preparación de sondas para hibridación para la construcción de cDNA y librerías genómicas son generalmente conocidos en la técnica y son divulgados en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Mientras que la presente invención proporciona métodos más eficientes para identificar genes novedosos que comparten regiones homologas (es decir, secuencias de señal) con cualquier grupo objetivo de genes conocidos de interés, particularmente genes plaguicidas novedosos, más particularmente genes de toxina Cry de Bt novedosos, uno de habilidad en la técnica reconocerá que métodos estándares conocidos en la técnica también se pueden utilizar para identificar secuencias que son homologas a los polinucleótidos divulgados en la presente. Por ejemplo, un polinucleótido completo divulgado en la presente uno o más porciones de los mismos, se puede utilizar como una sonda capaz de hibridar específicamente a polinucleótidos correspondientes y NAs mensajeros. Para lograr la hibridación específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de polinucleótido y son óptimamente de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos en longitud, y mucho más óptimamente por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos en
longitud. Tales sondas se pueden utilizar para amplificar polinucleótidos correspondientes (por ejemplo, polinucleótidos plaguicidas) a partir de un organismo elegido mediante PCR. Esta técnica se puede utilizar para aislar secuencias de codificación adicionales a partir de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en un organismo. La técnicas de hibridación incluyen la clasificación de hibridación de librerías de DNA colocadas en placas (ya sean placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) . La hibridación de tales secuencias se puede llevar bajo condiciones severas. "Condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" se propone para dar a entender condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo a un grado detectablemente más grande que a otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2-veces arriba del antecedente) . Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, las secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda pueden ser identificadas (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad se
pueden ajustar para permitir alguna desigualación en las secuencias de modo que menores grados de similitud son detectados (sondeo heterólogo) . Generalmente, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud, óptimamente menor que 500 nucleótidos en longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 de ion Na, de manera típica de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion Na (u otras sales) en pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación con una solución reguladora de formamida al 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37°C y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) a 50 a 55°C. Las condiciones de moderada severidad ejemplar incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl 1.0 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado final de 0.1 X SSC a 60 a 65°C durante
por lo menos aproximadamente 20 minutos. Opcionalmente, las soluciones reguladoras de lavado pueden comprender aproximadamente SDS al 0.1% a aproximadamente 1%. La duración de la hibridación es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, de manea usual aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será de por lo menos una duración de tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio . La especificidad es típicamente la función de los lavados de post-hibridación, los factores críticos que son la intensidad iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de DNA-DNA, la Tm se puede aproximar de la ecuación de Meinkoth y Wah'l (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5 °C + 16.6 (log M) -i- 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el DNA, "% form" es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo intensidad iónica y pl-l definidos) en la cual 60% de una secuencia objetivo complementaria híbrida a una sonda perfectamente igualada. La Tm se reduce por aproximadamente 1°C por cada 1% de desigualación ; así, la Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si la
secuencia con =90% de identidad son buscadas, la Tm puede ser disminuida a 10°C. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menor que la Tm para la secuencia especifica y su complemento en una intensidad iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 1, 2, 3 o A°C menor que la Tm; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación/lavado en 6, 7, 8, 9 o 10 °C menor que la Tm; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C menor que la Tm. Utilizando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y la Tm deseada aquellos de habilidad ordinaria entenderán que las variaciones en la severidad de la hibridación y/o las soluciones de lavado son inherentemente descritas. Si el grado deseado de desigualación dan por resultado una Tm de menos que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) , es óptimo incrementar la concentración SSC de modo que se puede utilizar una temperatura más alta. Una guia extensiva a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry y Molecular Biology — Hybridiza Lion with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capitulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel y colaboradores,, eds . (1995) Current Protocole in Molecular Biology, Capitulo 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience ,
New York) . Ver, Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: ñ Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos : (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia" y (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de una secuencia de cDNA o de gen de longitud completa, o la secuencia de cDNA o de gen completa . (b) Como se utiliza en la presente "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o más larga.
Aquellos de habilidad en la técnica entienden que para evitar una alta similitud de una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótido una sanción de espacio es típicamente introducida y es sustraída del número de igualaciones. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Así, la determinación del por ciento de identidad de secuencia entre cualquiera de dos secuencias se puede realizar utilizando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitativos de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineación local de Smith y colaboradores, (1981) Adv . Appl . Math. 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda para alineación local de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, como es modificada en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873- 5877. Las implementaciones en computadora de estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no están limitadas a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de
Intelligenetics , Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BEST FIT, BLAST , FASTA, y ' TFASTA en el Paquete de Software de Genética de isconsin GCG, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA). Las alineaciones utilizando estos programas se puede realizar utilizando los parámetros de error. El programa CLU STAL es bien descrito Higgins y colaboradores, (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins y colaboradores, (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet y colaboradores, (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang y colaboradores, (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson y colaboradores, (1994) Meth . Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN está basado sobre el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Una tabla de residuos ponderados PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12, y una sanción de espacio de 4 se puede utilizar como el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215:403 están basados en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se puede realizar con el programa BLASTN, registro = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de las modalidades. Las búsquedas de proteina BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, registro = 50, longitud de
palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones espaciadas para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como es descrito en Altschul y colaboradores, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (en BLAST 2.0) se puede utilizar para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre las moléculas. Ver Altschul y colaboradores, (1997) supra . Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, los parámetros de error de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas) pueden ser utilizados. Ver el sitio de la red de Información de National Center for Biotechnology sobre la red mundial en www . ncbi . hlm. nih . gov . La alineación también se puede realizar manualmente por inspección . A menos que se establezca de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 utilizando Jos siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando Ponderación de GAP de 50 y Ponderación de Longitud de 3, y la matriz de registro nwsgapdna . cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y Ponderación de Longitud de 2, y la
matriz de registro BLOSUM62; o cualquier programa equivalente del mismo. "Programa equivalente" se propone para dar a entender cualquier programa de comparación de secuencia que, para cualquiera de dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene igualaciones de residuos de nucleótidos o de aminoácidos idénticos y un por ciento idéntico de identidad de secuencia cuando se compara con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones posibles y posiciones de espacio y crea la alineación con el número más grande de bases igualadas y los menos espacios. Esto permite la provisión de una sanción de creación de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de bases igualadas. GAP debe hacer un aprovechamiento del número de sanción de creación de espacio de igualaciones para cada espacio que este inserta. Si se elige una sanción de extensión de espacio mayor que cero, GAP debe, además, hacer un aprovechamiento para cada espacio insertado de la longitud de los tiempos de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio de error y los valores de sanción de extensión de espacio en la Versión 10 del Paquete de Software
de Genética de isconsin GCG para secuencias de proteina son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos la sanción de creación de espacio de error es 50 mientras que la sanción de extensión de espacio de error es 3. Las sanciones de creación de espacio y de extensión de espacio se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consisten de 0 a 200. Asi, por ejemplo, las sanciones de creación de espacio y de extensión de espacio pueden ser 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más grande. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP exhibe cuatro cifras de mérito pa a las alineaciones: calidad, relación, identidad y similitud. La calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. Relación es la calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. Por ciento de identidad es el por ciento de los símbolos que realmente se igualan. Por ciento de similitud es el por ciento de los símbolos que son similares. Los símbolos que están a través de los espacios son ignorados. Una similitud se' registra cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similitud. La matriz de registro utilizada en la Versión 10 del Paquete de Software de Genética de Wisconsin
GCG es BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89:10915) . (c) Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de polinucleótido o de polipéptido hace referencia a los residuos de las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas frecuentemente difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde los residuos de aminoácidos, están sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia se puede ajusfar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias que difieren por tales sustituciones conservativas se dicen que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellos de habilidad en la técnica. Típicamente esto involucra registrar una sustitución conservativa como una desigualación parcial antes que completa, para de esta manera incrementar el porcentaje
de identidad de secuencia. Asi, por ejemplo, donde se le da a un aminoácido idéntico un registro de 1 y una sustitución no conservativa se le da un registro de cero, una sustitución conservativa se le da un registro entre cero y 1. El registro de sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, como es implementado en el programa PC/GENE ( Intelligenet ics , Mountain View, California) . (d) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia . Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para identificar genes novedosos que comparten
regiones de homología dentro de cualquier grupo objetivo de genes conocidos. En una modalidad, los presentes métodos se utilizan para identificar genes plaguicidas novedosos que son efectivos contra una variedad de plagas. Para propósitos de la presente invención, las plagas incluyen, pero no están limitadas a, insectos, hongos, bacterias, nemátodos, acárides, patógenos protozoarios , lenguados del hígado parasíticos de animales y los similares. Plagas de interés particular son plagas de insectos, particularmente plagas de insectos que causan daño significante a las plantas agrícolas. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera , Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera , Trichoptera, etc., particularmente Coleóptera y Lepidoptera. Las plagas de insectos de la invención para los cultivos mayores incluyen, pero no están limitados a: Maíz : Ostrinia nubilalis , barrenillo de maíz Europeo; Agrotis ípsilon, oruga cortadora negra; Helicoverpa zea, gusano de masorca de maíz; Spodoptera frugiperda , gusano devastador de otoño; Diatraea grandiosella , barrenillo de maíz del sudoeste; Ela smopaIpus lignosellus , barrenillo del tallo de maíz menor; Diatraea saccharal is , barrenillo de caña de azúcar; Diabrotica vir.gif. ra virgifera , gusano de raíz de maíz del oeste; Diabrotica longicornis barberi, gusano de
raíz de maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi , gusano de raíz de maíz del sur; Mclanotus spp., ciempiés; Cyclocephala borealis , abejorro enmascarado del norte (larva blanca); Cyclocephala immaculata, abejorro enmascarado del sur (larva blanca); Popillia japónica, escarabajo Japonés; Chaetocnema pulicaria , escaraba j uelo de maíz; Sphenophorus maidis, bicho picudo de maíz; Rhopalosiphum maidis, áfido de hoja de maíz; Anuraphis maidiradicis , áfido de raíz de maíz; Blissus leucopterus leucopterus , bicho chinche; Melanoplus femurrubrum , langosta de patas rojas; Melanoplus sanguinipes , langosta migratoria;. Hylemya platura, gusano de maíz; Agromyza parvicornis , minador manchado de maíz; Anaphothrips obscrurus, trips de hierba; Solenopsis milesta, hormiga hurtadora; Tetranychus urtícae, ácaro rojo de dos manchas; Sorgo : Chilo partellus , barrenillo de sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano devastador de otoño; Helícoverpa zea, gusano de mazorca de maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenillo de tallo de maíz menor; ITeltia subterránea, gusano cortador granulado; Phyllophaga crinita, larva blanca; Eleodes, Conoderus y Aeolus spp., ciempiés; Oulema melanopus, escarabajo de hoja de cereal; Chaetocnema pulicaria , escarabaj uelo de maíz; Sphenophorus maidis, bicho picudo de maíz; Rhopalosiphum maidis; áfido de hoja de maíz; Sipha flava, áfido de caña de azúcar amarillo; Blissus leucopterus leucopterus , bicho chinche; Contarinia sorghicola , jején de
sorgo; Tetra nychus cinnabarinus , acaro rojo carmín; Tetranychus urticae, ácaro rojo de dos manchas; Trigo : Pseudaletia unipunctata , gusano devastador; Spodoptera frugiperda, gusano devastador de otoño; Elasmopalpus lignosellus , barrenillo de tallo de maíz menor; Agrotis orthogonia, gusano cortador del oeste; Elasmopalpus lignosellus , barrenillo de tallo de maíz menor; Oulema melanopus, escarabajo de hoja de cereal; Hypera punctata , gorgojo de hoja de trébol; Diabrotica undecimpuctata howardi, gusano de raíz de maíz del sur; áfido de trigo Ruso; Schizaphis graminum , bicho verde; Macrosiphum avenae, áfido de grano Inglés; Melanoplus femurrubru , langosta de patas rojas; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Melanoplus sanguinipes , langosta migratoria; Mayetiola destructor, Mosca de Hesse; Sítodiplosis mosellana , jején de trigo; Meromyza americana , gusano de tallo de trigo; Hylemya coarctata , mosca de bulbo de trigo; Frankliella fusca, trips de tabaco; Cephus cinctus, mosca de sierra de tallo de trigo; Acería tulipae, ácaro ondeado de trigo; Girasol : Suleima helianthana , polilla de brote de girasol; Homoeosoma electellum , polilla de girasol; zygogramma exclamationis , escarabajo de girasol; Bothyrus gibbosus , escarabajo de zanahoria; Neola sioptera murtfeldtíana , jején de semilla de girasol; Algodón : fíeliothis virescens , gusano de algodón; Helicovelpa zea, gorgojo de algodón; Spodoptera exigua,
gusano devastador de betabel; Pectinophora gossypiella, gorgojo rosa; ñnthonomus granáis, gorgojo de algodón; Aphis gossypii, áfido de algodón; Pseuda tomoscelis seriatus, langosta pequeña de algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca con franjas; Lygus lineolaris, bicho de planta descolorido; Mela 1 I oplus fémur ubru , langosta de patas rojas; Melanoplus diflerentialís, langosta diferencial; Thrips tabaci, trips de cebolla; Franklinkiella filsca, trips de tabaco; Tetranychus cinnabarinus , ácaro rojo carmín; Tetranychus urticae, ácaro rojo de dos manchas; Arroz : Diatraea saccharalis , barrenillo de caña de azúcar; Spodoptera frugiperda , gusano devastador de otoño; Helicoverpa zea, gusano de mazorca de maíz; Colaseis brunnea, colaspis de uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo de agua de arroz; Sitoph ilus oryzae, gorgojo de arroz; Nephotettix nigropictus , saltamontes de arroz; Blissus leucopterus leucopterus , bicho chinche; ñeros ternum hilare, bicho verde; Soya : Pseudoplusia includens , oruga medidora de soya; Anticarsia gemmatalis , oruga de heno; Plathypena scabra, gusano de trébol verde; Ostrinia nubilalís , barrenillo de maíz Europeo; Agrotis ípsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, gusano devastador de betabel; Heliothís virescens, gorgojo de algodón; Helicoverpa zea, gorgojo de algodón; Epilachna vari vestís, escarabajo de frijol Mexicano; Myzus persicae , áfido de durazno verde; Ernpoasca fabae,
saltamontes de papa; ñcrosternum hilare, chinche del bosque verde; Melanoplus femurrubrum , saltamontes de patas rojas; Alelanoplus differentialis, saltamontes de diferencial; Hylemya pía tura , larva de semilla de maíz; Sericothrips variabilis, trips de soya; Thrips tabaci, trips de cebolla; Tetranychus turkestani, ácaro rojo de fresa; Tetranychus urticae, ácaro rojo de dos manchas; Cebada : Ostrinia nubilalis , barrenillo de maíz Europeo; Agrotis Ípsilon, oruga o gusano cortador negro; Schizaphis graminuw , bicho verde; Blissus leucopterus leucoplze cus , bicho chinche/ Acrosternum hilare, chinche del bosque verde; Euschistus servus, chinche café; Jylemya platura, larva de semilla de maíz; Mayetiola destructor, Mosca de Hese; Petrobia latens, ácaro de trigo café; Colza de Aceite: Brevicoryne brassicae , áfido de col; Phyllotreta cruciferas , escarabajo crucifero; Mamestra configurata, gusano devastador Bertha; Plutella xylostella, polilla de espalda de diamante; Delia ssp., larvas de raíz. Los nemátodos incluyen nemátodos parasíticos tales como nemátodos de nudo de raíz, de quiste y de lesión, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp., y Globodera spp.; particularmente miembros de los nemátodos de quiste, que incluyen, pero no limitados a, Heterodera glycines (nemátodo de quiste de soya); Heterodera. schachtii (nemátodo de quiste de betabel); y Heterodera avenae (nemátodo de quiste de cereal) ; y Globodera rostochiensis y Globodera
pailida (nemátodos de quiste de papa) . Nemátodos de lesión incluyen Pra tylenchus spp. Como se utiliza en la presente, el término planta incluye células de plantas, protoplastos de plantas, cultivos de tejidos de células de plantas de los cuales una planta puede ser regenerada, callos de plantas, agrupaciones de plantas y células de plantas que están intactas en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, núcleos, mazorcas, elotes, farfollas, tallos, raices, puntas de raices, anteras y los similares. El grano se propone para dar a entender la semilla madura producida por cultivadores comerciales para propósitos diferentes del cultivo o reproducción de las especies. La progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas también se incluyen dentro del alcance de la invención, con la condición de que estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos. Aunque los presentes métodos se pueden utilizar para identificar genes novedosos que son homólogos a cualquier grupo objetivo de genes conocidos, la presente invención, por ejemplo, puede ser utilizada para identificar genes plaguicidas novedosos que codifican polipéptidos que protegen cualquier especie de planta del daño relacionado con plagas, incluyendo, pero no limitadas a monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de especies de plantas de interés
incluyen, pero no están limitadas a, maíz {Zea mays) , Brassica sp. (por ejemplo, B. napus , B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semilla, alfalfa {Medicago sativa), arroz {Oryza sativa), centeno {Sécale cereale,) sorgo {Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perlado {Pennisetum glaucum) , mijo proso {Panicum miliaceum) , mijo de cola de zorra {Setaria itálica) , mijo extendido {Eleusine coracana)), girasol {Helianthus annuus) , cártamo {Carthamus tinctorius) , trigo {Triticum aestivum) , soya {Glycine max) , tabaco {Nicotiana tabacum) , papa {Solanum tuberosum) , cacahuates {Arachis hipogaea) , algodón {Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , camote {Ipomoea batatus) , casava {Manihot esculenta) , café {Coffea spp.), coco {Cocos nucífera) , piña {Ananas comosus) , árboles cítricos {Citrus spp.), cacao {Theobro a cacaco) , te {Camellia sinensis) , plátano {Musa spp.), aguacate {Persea americana) , higo {Ficus casica) , guayaba {Psídiu guajava) , mango {Mangifera indica), olivo (Olea europaea) , papaya {Carica papaya), anacardo {Anacardium occidentale) , macadamia {Macadamia integrifolia) , almendra {Prunus amygdalus) , betabeles (Beta vulgaris) , caña de azúcar {Saccharum spp.), avenas, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coniferas. Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentu ) , lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa),
habichuelas verdes (Phaseolus vulgaris) , habas (Phaseolus limensis) , guisantes {Lathyrus spp. ) , y miembros del género Cucumis tal como pepino (C. sativus) , cantalupo (C. cantalupensis) , y melón (C. meló). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hidrángea (Macrophylia hydrangea) , hibisco (Hibiscus rosasanensis) , rosas {Rosa spp.), tulipanes {Tulipa spp.), narcisos {Narcissus spp.), petunias {Petunia hybrida) , clavel {Dianthus caryophyllus) , pastora roja {Euphorbia pu lche rima) , y crisantemo. Las coniferas que pueden ser empleadas en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tal como el pino del incienso {Pinus taeda) , pino de tala {Pinus elliotii) , pino ponderosa {Pinus ponderosa), pino lodgepole {Pinus contorta) , y pino Monterrey {Pinus radiata) ; abeto de Douglas {Pseudotsuga enziesil) ; pinabete del occidente (Tsuga canadensis) ; abeto Sitka {Picea glauca); madera roja {Sequoia sempervirens) ; abetos típicos tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto de bálsamo {Abies balsamea) ; y cedros tales como cedro rojo del occidente {Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska {Chamaecyparis nootkatensis) . En modalidades específicas, las plantas de la presente invención incluyen plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soya, algodón, cártamo, cacahuate, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). En otras modalidades, las plantas de maíz y de soya son óptimas, y en
todavía otras modalidades las plantas de maíz son óptimas. Otras plantas de interés incluyen plantas de grano que proporcionan semillas de interés, plantas de semilla de aceite y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de grano, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, mijo, etc. Las plantas de semilla de aceite incluyen algodón, soya, cártamo, girasol, Brassica , maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen frijoles y guisantes. Los frijoles incluyen guar, algarroba, fenegreco, soya, frijoles de jardín, caupí, mungo, haba, fava bean, lentejas, garbanzo, etc. El artículo "un" y "uno" se utilizan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. Los siguientes ejemplos se proporcionan a manera de ilustración, no a manera de limitación. EXPERIMENTAL Ejemplo 1: Identificación de Genes plaguicidas Novedosos Aislamiento de DNA de Plásmido de Bt Extractos de glicerol de varias cepas de Bt se depositaron en rayas sobre placas de agar LB. Al siguiente día, una sola colonia de cada cepa se inoculó en 2 mL de medio TB por cavidad de una placa de 48 cavidades. Las placas se incubaron durante la noche a 28°C y 250 rpm. Las células
se recolectaron por centrifugación a 6, 000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las pelotillas de células se resuspendieron al girar en vórtice en solución reguladora de suspensión Pl (Qiagen) . Las células se Usaron y se neutralizaron con soluciones reguladoras P2 y P3, respectivamente, y los Usados se transfirieron a TurboFilters (Qiagen) con vacio aplicado. Los filtrados se unieron a placas QIAprep y se lavaron con soluciones reguladoras de PB y PE (Qiagen) . Las preparaciones de plásmido se eluyeron con solución reguladora de EB y se recolectaron en placas de 96 cavidades. Diseño del Cebador de Oligonucleótido Degenerado para la Primera Ronda de PCR Con el fin de identificar genes Bt novedosos, ambos de esos que son homólogos a genes Cry conocidos asi como genes plaguicidas que representan familias del gen Cry novedoso, se diseñaron cebadores de oligonucleótido a regiones de alta homología dentro de un grupo objetivo de genes Bt conocidos de interés. En el presente ejemplo, el grupo objetivo comprendió genes Cry conocidos que tienen actividad plaguicida contra insectos de los órdenes Lepidóptera y Coleóptera pero no aquellos genes Cry que son activos de Díptera. Específicamente, las secuencias de nucleótidos para todos los genes Cry de Bt conocidos del grupo objetivo se recolectaron de la base de datos pública, y
una alineación de estas secuencias se generó. Varias regiones de DNA a lo largo de las secuencias de nucleótidos que fueron apropiadas para los requerimientos estrictos de diseño de cebador se ubicaron en todos los genes Bt elegidos. Esas regiones se nombraron "secuencia de señal" para genes Bt insecticidas ya que unas cuantas secuencias de DNA (17 a 24 nucleótidos continuos) estuvieron presentes en todos los genes Bt insecticidas conocidos. Una longitud de cebador inicial se seleccionó para dar una Tm de 54 °C, y una ventana de nucleótidos contiguos que comienzan en el extremo 5' de la secuencia de señal seleccionada se visualizó. Específicamente, la secuencia de nucleótidos dentro de la ventana se revisó para determinar si las siguientes características de secuencias estuvieron presentes : 1) no tiene cuatro o más residuos de nucleótido idénticos contiguos; 2) no tiene más de dos residuos de guanina o citosina dentro de los últimos cinco residuos del extremo 3' de la secuencia de nucleótido; 3) tiene una temperatura de fusión Tm fijada en
54°C ± 2°C 4) no forma estructuras de horquilla o de dimero; 5) está presente en por lo menos una de las secuencias de nucleótidos del grupo objetivo de genes
plaguicidas (es decir, la alineación) ; y, 6) no se conserva entre las secuencias de nucleótidos de los genes plaguicidas del grupo no objetivo. Para incremen La r: la diversidad dentro del cebador, un par de bases se dejó para ser n, en donde n se seleccionó del grupo que consiste de adenina, timina, citosina, y guanina . Si todas las características de secuencia estuvieron presentes, la secuencia de nucleótidos dentro de la ventana de nucleótidos se seleccionó para el uso como un cebador de oligonucleótido pa a la primera ronda de PCR. Si la secuencia de nucleótidos dentro de la ventana no presentó las características de secuencia requeridas, entonces una ventana adyacente de nucleótidos contiguos se seleccionó al mover 1 bp más cercano al extremo 3' de la señal, y el proceso se repitió. Tanto un cebador de oligonucleótido delantero como trasero se diseñaron de acuerdo con los presentes métodos. Además, los cebadores delantero y trasero se diseñaron tal que fueron complementarios a las secuencias de nucleótidos en los genes plaguicidas de interés que están aproximadamente 50 bp a aproximadamen e 150 bp aparte. Una vista esquemática de la metodología de diseño de cebador general para la primera ronda de PCR se proporciona en la Figura 1. Primera Ronda de Amplificación de PCR: Etapa con SYBR® Green
Una primera ronda de amplificación de PCR de una primera muestra de material de ácido nucleico aislado de una cepa de Sfc se realizó utilizando los cebadores de oligonucleót ido diseñados como es descrito en lo anterior. Específicamente, las preparaciones de plásmido de Bt en placas de 96 cavidades se amplificaron mediante PCR bajo las siguientes condiciones de reacción: Cantidad de DNA de plantilla: 100 ng Cantidad de Cebador: 7.5 nmol (5 µ? x 1.5 µ?,) Volumen de la mezcla de reacción: 25 \J'L Activación de DNA polimerasa de AmpliTag® Gold: 95°C durante 10 minutos Ciclo de PCR (40 ciclos) : 95°C durante 15 seg; 60°C 1 min Los productos de PCR de la primera ronda de amplificación se detectaron utilizando un tinte fluorescente SYBR® Creen y el Sistema de Detección de Secuencias 7700 ABI Prism de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Una preparación de plásmido de la cepa 1218-1 de DP que comprende el gen Cry8Bbl se utilizó como un control positivo. De la solicitud de patente Norteamericana pendiente No. 10/032,717, intitulada "Genes Encoding Novel Proteins with Pesticidal Activity Against Col eopterans" , presentada el 23 de octubre del 2001, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Utilizando las condiciones de PCR descritas en lo anterior, la preparación de plásmido 1218-1 produjo una
curva estándar para la amplificación de PCR en el Sistema de Detección de Secuencia 7700 ABI Prism, y un valor Ct de aproximadamente 13 se obtuvo para el control positivo. Un control negativo que comprende solamente la mezcla de reacción de PCR sin el DNA de plantilla se probó y generó un valor Ct de aproximadamente 35. Las p eparaciones de plásmido Bt que produjeron un valor Ct por debajo de 16 se seleccionó para el análisis adicional y se designaron como positivos de SYBR® Green . Segunda Ronda de PCR Todos los cebadores traseros del conjunto de cebadores de SYBR® Green (es decir, cebadores de oligonucleótido trasero utilizaron la primera ronda de PCR) se utilizaron para generar los cebadores delanteros para la segunda ronda de PCR (es decir, la plantilla trasera de los cebadores de primera ronda) . E',stos cebadores funcionaron como el puente entre la etapa de SYBR® Green (es decir, primera ronda de PCR) y J segunda ronda de PCR. Los cebadores traseros para el uso de la segunda ronda de PCR se diseñaron esencialmente como es descrito en lo anterior para los cebadores de oligonucleótido de primera ronda. La Tm del cebador de PCR se conservó en 54 °C ± 2°C y se diseñó para generar un fragmento de aproximadamente 650 bp a aproximadamente 700 bp. Una vista esquemática de la metodología de diseño del cebador general para la segunda
ronda de PCR se proporciona en la Figura 1. El DNA de plásmidos se aisló de las cepas Bt identificadas corno positivas de SYBR® Green en la primera ronda de PCR y luego se sometieron a una segunda ronda de PCR. Las condiciones de PCR para la segunda ronda fueron como sigue, utilizando el equipo de PCR Qiagen Múltiplex y las preparaciones de plásmido .Bt descritos en lo anterior: DNA 0.5 pg Programa : 95°C 15 rnin 94°C 30 seg 54 °C 1.5 min 72°C 1.5 min 35X de la etapa 2 a la etapa 4 72 °C 10 min 4°C inde inidamente Las reacciones de PCR de la segunda ronda se analizaron con electroforesis en gel de agarosa al 1.0%, y los fragmentos esperados de 650 bp a 700 bp luego se clonaron en vectores de clonación bacterianos utilizando el equipo blunt Vector ( Invl trogen) . Después de la ligación, los productos se transformaron en células competentes de E. coli Top 10 (Invitrogen) . El DNA de plásmido de colonias bacterianas individuales se preparó y se analizó mediante el análisis de manchado de puntos, como es descrito enseguida.
Análisis de Manchado de Puntos Con el fin de eliminar los genes Bt conocidos del análisis y para identificar genes plaguicidas novedosos que comprenden las secuencias de señal utilizadas en la primera y la segunda ronda de PC , se realizó el análisis de manchado de puntos. Específicamente, el DNA de plásmido del aislado de las colonias bacterianas individuales se manchó sobre membrana posi ivamente cargada de nylon (Roche) . La sonda especifica para todos i'os genes pesticidas dentro del grupo objetivo se diseñaron para estar dentro del fragmento de secuencia esperada de DNA generado durante la segunda ronda de PCR. Una vista esquemática de la metodología de diseño de sonda general para la etapa de manchado de puntos se proporciona en la Figura 1. Todas los sondas se diseñaron para tener una Tm de aproximadamente 74 °C ± 2°C. En todas las tres etapas (es decir, la primera ronda de PCR, la segunda ronda de PCR, y el análisis de manchado de puntos) , la Tm de los cebadores/sondas de oligonucleótidos se fijo de modo que una mezcla de cebadores/sondas podría ser utilizada en cada etapa. La sondas de oligonucleótido se marcaron utilizando el equipo de marcación de extremo 3' de oligonucleótido DIG (Roche) y se utilizaron para clasificar el manchado de puntos para genes Bt conocidos. Cada sonda se probó individualmente en una mezcla de sondas para asegurar la especificidad y validez de cada sonda.
Todas las preparaciones de plásmido caracterizadas como positivas para los genes Bt conocidos mediante el análisis de manchado de punios se eliminaron para el análisis adicional. Las preparaciones de plásmidos que fueron negativos cuando se analizaron mediante el manchado de puntos se sometieron al análisis de secuencia adicional, como es descrito enseguida, para estimar la novedad. Análisis de Secuencia Ácidos nucleicos generados durante la segunda ronda de PCR (es decir, fragmentos de 650 bp a 700 bp) y caracterizados como "negativo" mediante el análisis de manchado de puntos se secuenciaron . Los resultados de secuencia de estos ácidos nucleicos se compararon contra secuencias de nucleótidos disponibles en bases de datos públicas utilizando BLAST . Si el análisis de secuencia indicó un gen Bt potencialmente novedoso, la secuencia de nucleótidos para el gen de longitud completa se obtuvo utilizando el equipo Universal GenomeWalker (Becton Dickinson Bioscience) . La secuencia de nucleótidos del gen plaguicida novedoso putativo de longitud completa además se analizó como es descrito en lo anterior para confirmar la novedad. Genes plaguicidas novedosos, tales como expuestos en la SEQ ID NOs : 1, 3, y 5 (y los polipéptidos codificados de esta manera expuestos en SEQ 113 NOs: 2, 4, y 6, respectivamente) se identificaron por los presentes métodos. Los genes
plaguicidas novedosos se probaron para la actividad plaguicida, como es descrito enseguida. Bioensayos Genes plaguicidas novedosos se clonaron en vectores de expresión y se analizaron para la actividad plaguicida contra plagas de insectos de maíz. Tales métodos son generalmente conocidos en la técnica. Los métodos para analizar la actividad plaguicida contra Coleópteros son conocidos en la técnica y descritos en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2002/0151709. Los ensayos para actividad pesticida contra Lepidópteros se divulgan en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2005/0138684. Resultados Los resultados de los bioensayos se presentan en la Tabla 1 y 2. Genes plaguicidas novedosos con actividad
GS001 (SEQ ID NO:3) GS021 (SEQ ID N0:1)
Ostrinia nubilal is (ECB) + + Helicoverpa zea (CEW) + + Agrotis ípsilon (BCW) + + Spodoptera frugiperda (FAW) - -
Tabla 2: Gen plaguicida novedoso con actividad Coleóptera
Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en Ja técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes son incorporadas en la presente por referencia al mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada por referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún deta.l le a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de ciar ¡.dad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.