BR122020006755B1

BR122020006755B1 - Cassete de expressão, célula hospedeira bacteriana, composição inibidora de inseto, método para controlar uma praga de espécie coleoptera, e vetor recombinante

Info

Publication number: BR122020006755B1
Application number: BR122020006755-1A
Authority: BR
Inventors: Gregory J. Bean; David J. Bowen; Catherine A. Chay; Arlene R. Howe; Jason S. Milligan; Yong Yin
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2015-11-18
Publication date: 2024-01-23
Also published as: BR122020006744B1; RU2740313C2; WO2016081618A1; CL2017001298A1; AR102734A1; US20200157562A1; AR120734A2; AR120731A2; BR112017010574A2; AR120736A2; CN107109417B; US10662439B2; CA2968235C; EP3221454A1; MX2017006654A; EP3221454B1; CN112626087A; NI201700059A; MX2021007641A; RU2017121276A3

Abstract

a presente invenção refere-se a proteínas inseticidas exibindo atividade tóxica contra espécies de praga de coleoptera e lepidoptera que são divulgadas e incluem, mas não estão limitadas a, proteínas de tipo tic3668, tic3669, tic3670, tic4076, tic4078, tic4260, tic4346, tic4826, tic4861, tic4862, tic4863 e tic-3668. são fornecidas moléculas e construções de dna que contêm uma sequência de polinucleotídeo codificando uma ou mais das proteínas do tipo tic3668 divulgadas. são fornecidas plantas transgênicas, células de plantas, semente e partes de plantas resistentes a infestação de lepidoptera e coleoptera que contêm sequências de polinucleotídeos codificando as proteínas inseticidas da presente invenção. métodos para detectar a presença dos polinucleotídeos ou das proteínas da presente invenção numa amostra biológica e métodos para controlar pragas de espécies coleoptera e lepidoptera utilizando qualquer uma das proteínas inseticidas do tipo tic3668 são também divulgados.

Description

REFERÊNCIA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório N° de Série US 62/082,504, depositado em 20 de novembro de 2014, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] A forma legível por computador da Lista de Sequências está depositada em anexo apresentada por via eletrônica. A Listagem de Sequências está incorporada por referência na sua totalidade, está contida no arquivo criado em 13 de novembro de 2015, tendo o nome de arquivo "MONS387WO_ST25.txt" e que é de 114 kb de tamanho (tal como medido no sistema operacional MS-Windows).

CAMPO DE INVENÇÃO

[0003] A invenção se refere genericamente ao campo das proteínas inibidoras de insetos. Uma nova classe de proteínas que exibem atividade inibidora de insetos contra as pragas relevantes na agricultura de colheita de plantas e sementes é descrita. Em particular, a classe de proteínas é descrita é inseticidamente ativa contra as pragas relevantes na agricultura de colheita de plantas e sementes, em particular espécies de lepidópteros e coleópteros de pragas de insetos. As plantas, partes de plantas e sementes contendo uma construção polinucleotídeo recombinante que codifica uma ou mais das proteínas de toxina descritas são fornecidas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] A melhora do rendimento das culturas de plantas agricolamente significativas, incluindo, entre outros, milho, soja, cana de açúcar, arroz, trigo, legumes, algodão e, tornou-se cada vez mais importante. Além da necessidade crescente de produtos agrícolas para alimentação, vestuário e fornecimento de energia para uma população humana crescente, efeitos relacionados com o clima e pressão da crescente população usando a terra que não seja para práticas agrícolas estão previstas para reduzir a quantidade de terra arável disponível para a agricultura. Estes fatores levaram a previsões sombrias de segurança alimentar, particularmente na ausência de grandes melhorias em biotecnologia vegetal e práticas agronômicas. À luz dessas pressões, melhorias ambientalmente sustentáveis em tecnologia, técnicas agrícolas e manejo de pragas são ferramentas vitais para expandir a produção agrícola na quantidade limitada de terra arável disponível para a agricultura.

[0005] Insetos, particularmente insetos da ordem Lepidoptera e Coleoptera, são considerados uma das principais causas de danos a colheitas de campo, diminuindo assim o rendimento das culturas sobre áreas infestadas. Espécies de pragas de lepidópteros, que impactam negativamente agricultura incluem, mas não estão limitados a, Helicoverpa zea, Ostrinia nubilalis, Diatraea saccharalis, Diatraea grandiosella, Anticarsia gemmatalis, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Agrotis ipsilon, Trichoplusia ni, Chrysodeixis includens, Heliothis virescens, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Helicoverpa armigera, Elasmopalpus lignosellus, Striacosta albicosta e Phyllocnistis citrella. Espécies de pragas de Coleópteros que impactam negativamente agricultura incluem, mas não estão limitados a, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. e Trogoderma spp., particularmente quando a praga é Diabrotica virgifera virgifera (Western Corn Rootworm, WCR), Diabrotica barberi (Northern Corn Rootworm, NCR), Diabrotica virgifera zeae (Mexican Corn Rootworm, MCR), Diabrotica balteata (Brazilian Corn Rootworm (BZR), Diabrotica undecimpunctata howardii (Southern Corn Rootworm, SCR) e m complexo Brazilian Corn Rootworm (BCR) que consiste em Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa).

[0006] Historicamente, a aplicação intensiva de inseticidas químicos sintéticos foi invocada como o agente de controle de pragas na agricultura. Preocupações para o ambiente e a saúde humana, além de problemas de resistência emergentes, estimulou a pesquisa e desenvolvimento de pesticidas biológicos. Este esforço de investigação levou à descoberta progressiva e utilização de várias espécies microbianas entomopatogênicas, incluindo bactérias.

[0007] O paradigma de controle biológico mudou quando o potencial de bactérias entomopatogênicas, especialmente bactérias pertencentes ao gênero Bacillus, foi descoberta e desenvolvida como um agente de controle biológico de pragas. As cepas da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) têm sido usadas como uma fonte de proteínas que exibem atividade pesticida, uma vez que foi descoberto que as cepas de Bt mostram uma elevada toxicidade contra insetos específicos. A principal característica de Bt’s é a produção de corpos paraespóricos que contêm um ou mais cristais que contêm endotoxinas inseticidas específicos (proteínas Cry) que atuam mediante uma ingestão por um inseto susceptível por meio de um mecanismo de formação de poros de ação prejudicial para o epitélio do intestino de insetos. Além de Bt, outras espécies de Bacillus, como Bacillus sphaericus, e outras espécies de bactérias que contêm genes que contribuem para um fenótipo entomopatológico, como Brevibacillus laterosporus, demonstraram potencial para a gestão das pragas.

[0008] As proteínas toxinas de inseticidas têm sido utilizadas em diversas aplicações agrícolas para preservar plantas agricolamente importantes e aumentar os rendimentos. As proteínas toxinas de inseticidas são utilizadas para controlar as pragas relevantes na agricultura de cultura de plantas por meio de métodos mecânicos, como a pulverização para dispersar formulações microbianas contendo várias cepas de bactérias sobre as superfícies de plantas, e usando técnicas de transformação genética para produzir plantas transgênicas e sementes que expressam a proteína toxina do inseticida.

[0009] A utilização de plantas transgênicas que expressam proteínas toxinas de inseticidas tem sido globalmente adaptada. Por exemplo, em 2012, 26,1 milhões de hectares foram plantados com culturas transgênicas que expressam as toxinas Bt (James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops:2012.ISAAA Brief No.44). O uso expandido de culturas protegidas por insetos transgênicas e o número limitado de proteínas toxinas de inseticidas comercialmente disponíveis é a criação de uma pressão de seleção para alelos que conferem resistência às proteínas inseticidas atualmente utilizadas. O desenvolvimento de resistência em pragas alvo para proteínas toxinas de inseticidas não afeta a eficácia e as vantagens desta tecnologia. Tais vantagens incluem aumento de rendimentos de colheita, redução na utilização de pesticidas químicos, e redução dos custos e trabalho associados com a utilização de pesticidas químicos.

[0010] A descoberta e o desenvolvimento de novas formas de proteínas toxinas de inseticidas é central para gerir o aumento na resistência dos insetos às culturas transgênicas que expressam proteínas toxinas inseticidas. Novas proteínas toxinas com eficácia melhorada e que exibem controle ao longo de um espectro mais amplo de espécies de insetos sensíveis irá reduzir o número de insetos sobreviventes que podem desenvolver alelos de resistência. Além disso, duas ou mais toxinas transgênicas tóxicas para a mesma praga de insetos e exibindo diferentes modos de ação em uma planta reduzem ainda mais a probabilidade de resistência em uma espécie alvo de insetos.

[0011] Consequentemente, há uma necessidade crítica para descobrir e desenvolver proteínas inseticidas eficazes com propriedades inseticidas melhoradas como uma maior eficácia contra um espectro mais amplo de espécies de pragas de insetos alvo e diferentes modos de ação, em comparação com proteínas conhecidas na técnica. Uma nova família de proteína toxina a partir de Brevibacillus laterosporus (B. laterosporus) é descrita no presente pedido, juntamente com semelhantes proteínas toxinas, proteínas variantes, e as proteínas recombinantes exemplares que exibem uma atividade inseticida contra espécies de pragas alvo significativas de lepidópteros e coleópteros, particularmente contra a lagarta da raiz do milho ocidental.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] É aqui descrito um novo grupo de moléculas de polinucleotídeos de insetos inibidores recombinantes e polipeptídeos (proteínas de toxina) por elas codificadas, aqui referidas como proteínas tipo TIC3668, que demonstraram exibir atividade inibidora contra uma ou mais pragas de cultura de plantas. Cada uma das proteínas pode ser usada sozinha ou em combinação umas com as outras e com outras proteínas inseticidas e agentes tóxicos em formulações e em planta, proporcionando assim alternativas para proteínas inseticidas e inseticidas químicas atualmente em uso em sistemas agrícolas.

[0013] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo inibidor de insetos que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, e SEQ ID NO: 31. Em uma modalidade, a molécula de polinucleotídeo recombinante codifica um polipeptídeo inibidor de insetos que compreende pelo menos 35% de identidade, por exemplo, pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31. Em outra modalidade, a molécula de polinucleotídeo recombinante compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, e SEQ ID NO: 72. Em ainda outra modalidade a molécula de polinucleotídeo recombinante compreende pelo menos 35% de identidade, por exemplo, pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID N0: 71, e SEQ ID NO: 72. Em uma outra modalidade, a molécula de polinucleotídeo recombinante compreende uma sequência que hibridiza com: (i) o complemento reverso da sequência de nucleotídeos a partir da posição 4-885 de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, e SEQ ID NO: 72; ou (ii) o complemento reverso de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, e SEQ ID NO: 61. Em outra modalidade, as condições de hibridização são as condições rigorosas, por exemplo, tais condições rigorosas podem incluir hibridização a partir de 4 a 12 horas em 50% de formamida, 1 M de NaCI, e 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,1 X SSC a 60°C - 65C. Em outra modalidade, a molécula de polinucleotídeo recombinante está ligada operacionalmente a um promotor heterólogo.

[0014] Em outro aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo recombinante inibidor de inseto codificado pela molécula de polinucleotídeo recombinante aqui fornecida. Em uma modalidade, o polipeptídeo recombinante inibidor de insetos compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31. Em outra modalidade, o polipeptídeo recombinante inibidor de insetos compreende pelo menos 35% de identidade, por exemplo, pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, ou 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.

[0015] Em uma outra modalidade, o polipeptídeo recombinante inibidor de inseto exibe atividade inibidora contra uma espécie de inseto da ordem Coleoptera, por exemplo, incluindo Western Corn Rootworm, Southern Corn Rootworm, Northern Corn Rootworm, Mexican Corn Rootworm, Brazilian Corn Rootworm, ou complexo Brazilian Corn Rootworm que consiste em Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa. Em ainda uma outra modalidade, os polipeptídeos recombinantes inibidores de insetos exibem atividade inibidora contra uma espécie de inseto da ordem Lepidoptera, por exemplo, incluindo European Corn Borer, Southwestern Corn Borer, Black Cutworm, Fall Army Worm, Corn Earworm, e Soybean Looper.

[0016] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de polinucleotídeo recombinante da invenção, em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula hospedeira bacteriana e uma célula hospedeira de planta. Em certas modalidades, as células hospedeiras bacterianas incluem Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus thuringiensis, Brevibacillus lacterosporus, Bacillus cereus, E. coli, Pseudomonas, Klebsiella, e Erwinia. Em outras modalidades, as células de planta incluem uma célula da planta de alfalfa, banana, cevada, feijão, brócolos, couve, brassica, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, grão de bico, couve chinesa, cítricos, coco, café, milho, trevo, algodão, uma cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho poró, alfaces, pinho silvestre, painço, melões, noz, aveia, azeitona, cebola, ornamental, palma, pasto grama, ervilha, amendoim, pimenta, caqui, guandu, pinho, romã, álamo, batata, abóbora, pinheiro radiata, rabanete, colza, arroz, rizoma, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do Sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana, girassol, milho doce, goma doce, batata-doce, switchgrass, chá, tabaco, tomate, triticale, relvado, melancia e trigo.

[0017] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma composição inibidora de inseto, que pode compreender uma molécula de polinucleotídeo recombinante da presente invenção. Em uma modalidade, a composição inibidora de insetos pode ainda compreender uma sequência de nucleotídeos codificando pelo menos um outro agente pesticida. Em certas modalidades, o pelo menos um outro agente pesticida é diferente do polipeptídeo inibidor de insetos tipo TIC3668 da invenção e pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína inibidora de insetos, uma molécula de dsRNA inibidora de insetos, e uma proteína acessória. Em outras modalidades, o outro agente pesticida exibe atividade contra uma ou mais espécies de pragas das ordens Lepidoptera, Coleoptera, ou Hemiptera. Em certas modalidades, o outro agente pesticida é selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, VIP3A, e VIP3B. Em ainda um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição inibidora de insetos que compreende um polipeptídeo recombinante inibidor de insetos da presente invenção, como um polipeptídeo inibidor de insetos do tipo TIC3668, em uma quantidade eficaz inibidora de insetos.

[0018] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método de controlar uma praga das espécies Coleoptera ou Lepidoptera, e controlar uma infestação de pragas das espécies de Coleoptera ou Lepidoptera de uma planta, por exemplo, uma cultura de planta, em que o método compreende contatar a praga com uma quantidade inibidora de insetos do polipeptídeo recombinante inibidor de insetos da invenção, como um polipeptídeo inibidor de insetos do tipo TIC3668.

[0019] [019] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece uma semente que compreende uma molécula de polinucleotídeo recombinante ou polipeptídeo recombinante de inibidor de inseto, como um polipeptídeo inibidor de insetos do tipo TIC3668, da invenção.

[0020] Em outro aspecto, a invenção fornece um produto de commodity que compreende uma quantidade detectável da molécula de polinucleotídeo recombinante, ou o polipeptídeo inibidor de inseto, como um polipeptídeo inibidor de insetos do tipo TIC3668, da invenção. Em um outro aspecto, um produto de commodity da invenção pode compreender uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de polinucleotídeo recombinante da invenção, em que o produto de commodity compreende uma quantidade detectável da molécula de polinucleotídeo recombinante ou um polipeptídeo recombinante inibidor de inseto codificado pelo polinucleotídeo recombinante. Em certas modalidades, os produtos de commodity podem incluir milho de commodity ensacado por um manipulador de grão, flocos de milho, tortas de milho, farinha de milho, farelo de milho, xarope de milho, óleo de milho, silagem de milho, amido de milho, cereais de milho, e semelhantes, e correspondentes de soja, arroz, trigo, sorgo, ervilha de pombo, amendoim, frutas, melão e produtos de commodity vegetais, incluindo onde aplicável, sucos, concentrados, compotas, geleias, marmeladas, e outras formas comestíveis aplicáveis de tais produtos de commodity contendo uma quantidade detectável de tais polinucleotídeos e/ou polipeptídeos do presente pedido.

[0021] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método de produção de semente que compreende o polinucleotídeo recombinante da invenção, em que o método compreende: (a) plantar pelo menos uma semente compreendendo a molécula de polinucleotídeo recombinante; (b) cultivar plantas a partir da semente; e (c) a colheita de sementes a partir de plantas, em que a semente colhida compreende a molécula de polinucleotídeo recombinante.

[0022] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um vetor recombinante compreendendo a molécula de polinucleotídeo recombinante da invenção. Em uma modalidade, o vetor recombinante é selecionado a partir do grupo que consiste em um plasmídeo, um bacmídeo, um fagomídeo, e um cosmídeo.

[0023] Em outro aspecto, a invenção fornece uma planta resistente à infestação por insetos, em que as células da referida planta compreendem a molécula de polinucleotídeo recombinante ou o polipeptídeo recombinante inibidor de insetos da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] A Figura 1 ilustra o alinhamento da proteína de colagem TIC4260 a cinco proteínas de tipo TIC3668 exemplares. As posições de diversidade de sequência são destacadas em sombreado cinzento neste alinhamento de sequências.

[0025] A Figura 2 ilustra atividade inibidora na planta Western Corn Rootworm (WCR) de proteínas tipo TIC3668 de comprimento maduro direcionadas e não direcionadas para o cloroplasto.

[0026] A Figura 3 ilustra atividade inibidora na planta WCR de uma proteína tipo TIC-3668 de comprimento maduro tendo direcionada e não direcionada para o cloroplasto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0027] A SEQ ID NO: 1 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus codifica uma proteína TIC3668 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-951 e um códon de terminação da tradução.

[0028] A SEQ ID NO: 2 é a tradução da sequência de aminoácidos da proteína precursora de TIC3668 a partir do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 1.

[0029] A SEQ ID NO: 3 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus que codifica uma proteína TIC3669 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-951 e um códon de terminação da tradução.

[0030] A SEQ ID NO: 4 é a tradução da sequência de aminoácidos da proteína TIC3669 a partir do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 3.

[0031] A SEQ ID NO: 5 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus que codifica uma proteína TIC3670 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-951 e um códon de terminação da tradução.

[0032] A SEQ ID NO: 6 é a tradução da sequência de aminoácidos da proteína precursora de TIC3670 a partir do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 5.

[0033] A SEQ ID NO: 7 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus que codifica uma proteína TIC4076 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-951 e um códon de terminação da tradução.

[0034] A SEQ ID NO: 8 é a tradução da sequência de aminoácidos da proteína precursora de TIC4076 a partir do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 7.

[0035] A SEQ ID NO: 9 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus que codifica uma proteína TIC4078 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-951 e um códon de terminação da tradução.

[0036] A SEQ ID NO: 10 é a tradução da sequência de aminoácidos da proteína precursora de TIC4078 a partir do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 9.

[0037] A SEQ ID NO: 11 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus que codificam uma proteína de colagem TIC4260 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-951 e um códon de terminação da tradução, criado pela combinação de segmentos de DNA a partir de cada uma das sequências de codificação expostas em quadro de leitura de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9 para incluir as variações de sequência a partir destas cinco diferentes quadros abertos de leitura.

[0038] A SEQ ID NO: 12 é a tradução da sequência de aminoácidos da proteína precursora da proteína de colagem TIC4260 a partir do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 11.

[0039] A SEQ ID NO: 13 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus que codifica uma proteína TIC4346 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-951 e um códon de terminação da tradução.

[0040] A SEQ ID NO: 14 é a tradução da sequência de aminoácidos do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 13.

[0041] A SEQ ID NO: 15 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus que codifica uma proteína TIC4826 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-951 e um códon de terminação da tradução.

[0042] A SEQ ID NO: 16 é a tradução da sequência de aminoácidos do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 15.

[0043] A SEQ ID NO: 17 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus que codifica uma proteína TIC4861 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-918 e um códon de terminação da tradução.

[0044] A SEQ ID NO: 18 é a tradução da sequência de aminoácidos do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 17.

[0045] A SEQ ID NO: 19 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus que codifica uma proteína TIC4862 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-945 e um códon de terminação da tradução.

[0046] A SEQ ID NO: 20 é a tradução da sequência de aminoácidos do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 19.

[0047] A SEQ ID NO: 21 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus que codifica uma proteína TIC4863 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-951 e um códon de terminação da tradução.

[0048] A SEQ ID NO: 22 é a tradução da sequência de aminoácidos do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 21.

[0049] A SEQ ID NO: 23 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína madura TIC3668, mTIC3668.

[0050] A SEQ ID NO: 24 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína madura TIC3669, mTIC3669.

[0051] A SEQ ID NO: 25 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína madura TIC3670, mTIC3670.

[0052] A SEQ ID NO: 26 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína madura TIC4076, mTIC4076.

[0053] A SEQ ID NO: 27 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína madura TIC4078, mTIC4078.

[0054] A SEQ ID NO: 28 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína madura TIC4260, mTIC4260.

[0055] A SEQ ID NO: 29 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína madura TIC4346, mTIC4346.

[0056] A SEQ ID NO: 30 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína madura TIC4826, mTIC4826.

[0057] A SEQ ID NO: 31 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína madura TIC4861, mTIC4891.

[0058] A SEQ ID NO: 32 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína TIC3668 concebida para expressão em plantas.

[0059] A SEQ ID NO: 33 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC3668, mTIC3668 concebida para expressão em plantas.

[0060] A SEQ ID NO: 34 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína TIC3669 concebida para expressão em plantas.

[0061] A SEQ ID NO: 35 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC3669, mTIC3669 concebida para expressão em plantas.

[0062] A SEQ ID NO: 36 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína TIC3670 concebida para expressão em plantas.

[0063] A SEQ ID NO: 37 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC3670, mTIC3670 concebida para expressão em plantas.

[0064] A SEQ ID NO: 38 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína TIC4076 concebida para expressão em plantas.

[0065] A SEQ ID NO: 39 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4076, mTIC4076 concebida para expressão em plantas.

[0066] A SEQ ID NO: 40 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína TIC4078 concebida para expressão em plantas.

[0067] A SEQ ID NO: 41 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4078, mTIC4078 concebida para expressão em plantas.

[0068] A SEQ ID NO: 42 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína TIC4260 concebida para expressão em plantas.

[0069] A SEQ ID NO: 43 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4260, mTIC4260 concebida para expressão em plantas.

[0070] A SEQ ID NO: 44 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína TIC4346 concebida para expressão em plantas.

[0071] A SEQ ID NO: 45 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4346, mTIC4346 concebida para expressão em plantas.

[0072] A SEQ ID NO: 46 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína TIC4826 concebida para expressão em plantas.

[0073] A SEQ ID NO: 47 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4826, mTIC4826 concebida para expressão em plantas.

[0074] A SEQ ID NO: 48 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína TIC4861 concebida para expressão em plantas.

[0075] A SEQ ID NO: 49 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4861 (mTIC4861), uma proteína madura TIC4862 (mTIC4862), e uma proteína madura TIC4863 (mTIC4863) concebida para expressão em plantas.

[0076] A SEQ ID NO: 50 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína TIC4682 concebida para expressão em plantas.

[0077] A SEQ ID NO: 51 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína TIC4863 concebida para expressão em plantas.

[0078] A SEQ ID NO: 52 é uma sequência de nucleotídeos que representa um oligonucleotídeo sintético para hibridizar com a fita (-) de um DNA que codifica uma proteína descrita no presente pedido e que corresponde às posições 1 a 36 da SEQ ID NO: 1 (TIC3668 iniciador dianteiro).

[0079] A SEQ ID NO: 53 é uma sequência de nucleotídeos que representa um oligonucleotídeo sintético para hibridizar com a fita (+) de um DNA que codifica uma proteína descrita no presente pedido e que corresponde às posições 920 a 954 da SEQ ID NO: 1 (TIC3668 iniciador reverso).

[0080] A SEQ ID NO: 54 é uma sequência de nucleotídeos que representa um oligonucleotídeo sintético para hibridizar com a fita (-) de um DNA que codifica uma proteína descrita no presente pedido e que corresponde às posições 1 a 41 da SEQ ID NO: 3 (TIC3669 iniciador dianteiro).

[0081] A SEQ ID NO: 55 é uma sequência de nucleotídeos que representa um oligonucleotídeo sintético para se hibridizar com a fita (+) de um DNA que codifica uma proteína descrita no presente pedido e que corresponde às posições 920-954 da SEQ ID NO: 3 (TIC3669 iniciador reverso).

[0082] A SEQ ID NO: 56 é uma sequência de nucleotídeos que representa um oligonucleotídeo sintético para hibridizar com a fita (-) de um DNA que codifica uma proteína descrita no presente pedido e que corresponde às posições 1 a 36 da SEQ ID NO: 5 (TIC3670 iniciador dianteiro).

[0083] A SEQ ID NO: 57 é uma sequência de nucleotídeos que representa um oligonucleotídeo sintético para se hibridizar com a fita (+) de um DNA que codifica uma proteína descrita no presente pedido e que corresponde às posições 920-954 da SEQ ID NO: 5 (TIC3670 iniciador reverso).

[0084] A SEQ ID NO: 58 é uma sequência de nucleotídeos que representa um oligonucleotídeo sintético para hibridizar com a fita (-) de um DNA que codifica uma proteína descrita no presente pedido e que corresponde às posições 1 a 41 da SEQ ID NO: 7 (TIC4076 iniciador dianteiro).

[0085] A SEQ ID NO: 59 é uma sequência de nucleotídeos que representa um oligonucleotídeo sintético para se hibridizar com a fita (+) de um DNA que codifica uma proteína descrita no presente pedido e que corresponde às posições 920-954 da SEQ ID NO: 7 (TIC4076 iniciador reverso).

[0086] A SEQ ID NO: 60 é uma sequência de nucleotídeos que representa um oligonucleotídeo sintético para hibridizar com a fita (-) de um DNA que codifica uma proteína descrita no presente pedido e que corresponde às posições 1 a 36 da SEQ ID NO: 9 (TIC4078 iniciador dianteiro).

[0087] A SEQ ID NO: 61 é uma sequência de nucleotídeos que representa um oligonucleotídeo sintético para se hibridizar com a fita (+) de um DNA que codifica uma proteína descrita no presente pedido e que corresponde às posições 920-954 da SEQ ID NO: 9 (TIC4078 iniciador reverso).

[0088] A SEQ ID NO: 62 é uma sequência de polinucleotídeos recombinantes obtida a partir de uma espécie de Brevibacillus laterosporus que codifica uma proteína TIC2462 a partir de um quadro aberto de leitura na posição de nucleotídeos 1-951 e um códon de terminação da tradução.

[0089] A SEQ ID NO: 63 é a tradução da sequência de aminoácidos do quadro aberto de leitura, como estabelecido na SEQ ID NO: 62.

[0090] A SEQ ID NO: 64 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC3668, mTIC3668 para expressão em bactérias.

[0091] A SEQ ID NO: 65 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC3669, mTIC3669 para expressão em bactérias.

[0092] A SEQ ID NO: 66 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC3670, mTIC3670 para expressão em bactérias.

[0093] A SEQ ID NO: 67 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4076, mTIC4076 para expressão em bactérias.

[0094] A SEQ ID NO: 68 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4078, mTIC4078 para expressão em bactérias.

[0095] A SEQ ID NO: 69 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4260, mTIC4260 para expressão em bactérias.

[0096] A SEQ ID NO: 70 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4346, mTIC4346 para expressão em bactérias.

[0097] A SEQ ID NO: 71 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4826, mTIC4826 para expressão em bactérias.

[0098] A SEQ ID NO: 72 é uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína madura TIC4861 (mTIC4861), TIC4862 (mTIC4862), e TIC4863 (mTIC4863) para expressão em bactérias.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0099] O problema na técnica de controle de pragas agrícolas pode ser caracterizado como uma necessidade para novas proteínas toxinas que sejam eficazes contra as pragas alvo, apresentem amplo espectro de toxicidade contra espécies alvo de pragas, sejam capazes de ser expressas em plantas sem causar problemas agronômicos indesejáveis, e forneçam um modo alternativo de ação em comparação com as toxinas atuais que são usadas comercialmente nas plantas. Novas proteínas inseticidas exemplificadas por TIC3668 são aqui descritas, e direcionam cada uma destas necessidades, em especial contra um amplo espectro de pragas de insetos Coleópteros e Lepidópteros, e mais particularmente contra espécies de pragas da lagarta da raiz do milho.

[00100] A referência neste pedido a “TIC3668”, “proteína TIC3668”, “toxinas proteína TIC3668”, “toxinas proteína TIC3668”, “toxinas relacionadas a TIC3668”, “classe ou família de proteína toxina relacionada a TIC3668”, “proteínas toxinas relacionadas a TIC3668”, “proteínas tipo TIC3668”, “proteínas semelhantes a TIC3668, “polipeptídeos toxina relacionados a TIC3668”, “proteínas pesticidas relacionadas a TIC3668”, ou “polipeptídeo inibidor de inseto do tipo TIC3668” e semelhantes, se referem a qualquer nova proteína inibidora de inseto que compreende, que consiste em, que é substancialmente homólogo a, que é semelhante a, ou que é derivado de qualquer uma das sequências de polipeptídeos inibidores de insetos de TIC3668 (SEQ ID NO:2) e segmentos inibidores dos mesmos, ou combinações dos mesmos, que conferem atividade contra pragas de coleópteros e pragas de Lepidópteros, incluindo qualquer proteína que exibe atividade inibidora de inseto se o alinhamento de tal proteína com TIC3668 (SEQ ID NO:2), TIC3669 (SEQ ID NO:4), TIC3670 (SEQ ID NO:6), TIC4076 (SEQ ID NO:8), TIC4078 (SEQ ID NO:10), TIC4346 (SEQ ID NO:14), TIC4826 (SEQ ID NO:16), TIC4861 (SEQ ID NO:18), TIC4862 (SEQ ID NO:20), e TIC4863 (SEQ ID NO:22), resulta em uma identidade de sequência de aminoácidos de qualquer fração percentual de cerca de 35% a cerca de 100% percentual. As toxinas de proteína do tipo TIC3668 descritos neste pedido incluem TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862, TIC4863, e a proteína TIC4260 de colagem (SEQ ID NO:12). A classe de proteína de tipo TIC3668 destina-se a incluir as formas precursoras, bem como as formas de comprimento maduras das proteínas.

[00101] O termo "segmento" ou "fragmento" é utilizado neste pedido para descrever sequências de aminoácido ou de ácidos nucleicos consecutivos que são mais curtas do que as sequências de aminoácidos completas ou de ácido nucleico que descreve uma proteína de tipo TIC3668. Um segmento ou fragmento que exibe atividade inibidora de insetos também é descrito no presente pedido, se o alinhamento de tal segmento ou fragmento, com a seção correspondente da proteína tipo TIC3668 estabelecido na SEQ ID NO: 2, resulta em identidade de sequência de aminoácidos de qualquer fração percentual de cerca de 35 a cerca de 100 por cento entre o segmento ou fragmento e a seção correspondente da proteína de tipo TIC3668.

[00102] A referência neste pedido de patente aos termos "atividade" ou "ativo", "atividade pesticida", ou "atividade inseticida", "inibidores de insetos" ou "inseticida" referem-se a eficácia de um agente tóxico, como uma proteína toxina, na inibição (inibição de crescimento, alimentação, fecundidade, ou viabilidade), supressão (supressão do crescimento, alimentação, fecundidade, ou viabilidade), controle (controle da infestação de pragas, controle de atividades de alimentação de pragas em uma determinada cultura contendo uma quantidade eficaz da proteína do tipo TIC3668) ou matando (causando a morbidade, mortalidade, ou fecundidade reduzida) uma praga. Estes termos destinam-se a incluir o resultado do fornecimento de uma quantidade pesticidamente eficaz de uma proteína tóxica para uma praga, onde a exposição da praga às proteínas tóxicas resulta em morbidade, mortalidade, fecundidade reduzida, ou baixa estatura. Estes termos também incluem repulsão da praga da planta, um tecido da planta, uma parte de planta, semente, as células de plantas, ou a partir da localização geográfica em particular em que a planta pode estar crescendo, como resultado do fornecimento de uma quantidade pesticidamente eficaz da proteína tóxica dentro ou sobre a planta. De um modo geral, uma atividade pesticida se refere à capacidade de uma proteína tóxica para ser eficaz na inibição do crescimento, desenvolvimento, viabilidade, comportamento de alimentação, comportamento de acasalamento, fecundidade, ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados por uma alimentação de insetos nesta proteína, fragmento de proteína, segmento de proteína ou polinucleotídeo de uma determinada praga alvo, incluindo, mas não limitados a insetos da ordem Lepidoptera ou Coleoptera. A proteína tóxica pode ser produzida pela planta ou pode ser aplicada à planta ou ao ambiente dentro do local onde a planta está localizada. Os termos "bioatividade", "eficaz", "efetiva", ou variações dos mesmos são também termos indiferentemente utilizados neste pedido de patente para descrever os efeitos das proteínas da presente invenção em pragas de insetos alvo.

[00103] Uma quantidade pesticidamente eficaz de um agente tóxico, quando fornecido na dieta de uma praga alvo, exibe atividade pesticida quando o agente tóxico contata a praga. Um agente tóxico pode ser uma proteína pesticida ou um ou mais agentes químicos conhecidos na técnica. Agentes químicos inseticidas e agentes de proteína inseticida podem ser utilizados isoladamente ou em combinações uns com os outros. Os agentes químicos incluem, mas não estão limitados a genes específicos de direcionamento para moléculas de dsRNA para a supressão em uma praga alvo, organocloretos, carbamatos, organofosfatos, piretroides, neonicotinoides, e rianoides. Agentes de proteínas inseticidas incluem as proteínas toxinas previstas no presente pedido, bem como outros agentes tóxicos proteicos incluindo aqueles que têm como alvo lepidópteros e coleópteros, bem como proteínas toxinas que são usadas para controlar outras pragas de plantas, como proteínas Cry disponíveis na técnica para utilizar no controle de espécies de hemípteros e homópteros.

[00104] Pretende-se que a referência a uma praga, particularmente uma praga de uma cultura de planta, significa pragas de insetos de plantas de colheita, particularmente aquelas que são controladas pela classe de proteína toxina relacionada com TIC3668. No entanto, a referência a uma praga pode também incluir pragas de insetos de plantas hemípteros e homópteros, bem como os nematoides e fungos, quando os agentes tóxicos que têm como alvo estas pragas são concomitantemente localizadas ou presentes em conjunto com uma ou mais proteínas da classe de proteína toxina relacionada com TIC3668.

[00105] As proteínas individuais que compreendem a classe de proteínas relacionadas com a TIC3668 estão relacionadas por função comum e exibem atividade inseticida contra pragas de insetos a partir de espécies de insetos Coleoptera e Lepidoptera, incluindo adultos, larvas, pupas, e recém-nascidos. Os insetos da ordem Lepidoptera incluem, mas não estão limitados a, lagarta de cereais, minhocas, loopers, e heliotinas na família Noctuidae, por exemplo, lagarta-militar (Spodoptera frugiperda), lagarta da beterraba (Spodoptera exigua), lagarta-militar bertha (Mamestra configurata), lagarta rosca (Agrotis ipsilon), falsa-medideira-da-couve (Trichoplusia ni), falsa-medideira da soja (Pseudoplusia includens), lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis), lagarta do trevo verde (Hypena scabra), lagarta da maçã (Heliothis virescens), lagarta-rosca (Agrotis subterranea), lagarta da pastagem (Pseudaletia unipuncta), lagarta do norte (Agrotis orthogonia); brocas, traças, pírales, cone worms, lagartas de repolho e esqueletistas da família Pyralidae, por exemplo,broca do milho europeia (Ostrinia nubilalis), navel orangeworm (Amyelois transitella), verme de teias da raiz do milho(Crambus caliginosellus), verme de teia do relvado (Herpetogramma licarsisalis), traça do girassol (Homoeosoma electellum), broca do colo (Elasmopalpus lignosellus); traças, burgos, vermes de sementes, e vermes de frutos na família Tortricidae, por exemplo, traça da maçã (Cydia pomonella), traça da baga da uva (Endopiza viteana), traça da fruta oriental (Grapholita molesta), traça do broto do girassol (Suleima helianthana); e muitas outras Lepidoptera de importância econômica, por exemplo, traça de costas de diamante (Plutella xylostella), lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) e mariposa cigana (Lymantria dispar). Outras pragas de insetos da ordem de Lepidoptera incluem, por exemplo, Alabama argillacea (traça da folha do algodão), Archips argyrospila (traça da folha de árvore de fruta), Archips rosana (traça europeia) e outras espécies de Archips, Chilo suppressalis (broca do arroz asiático, ou broca do caule do arroz), Cnaphalocrocis medinalis (traça da folha do arroz), Crambus caliginosellus (verme de trama da raiz do milho), Crambus teterrellus (verme de trama de bluegrass), Diatraea grandiosella (broca do milho do sudoeste), Diatraea saccharalis (broca da cana-de-açúcar), Earias insulana (spiny bollworm), Earias vittella (spotted bollworm), Helicoverpa armigera (American bollworm), Helicoverpa zea (corn earworm ou cotton bollworm), Heliothis virescens (tobacco budworm), Herpetogramma licarsisalis (sod webworm), Lobesia botrana (European grape vine moth), Phyllocnistis citrella (citrus leafminer), Pieris brassicae (large white butterfly), Pieris rapae (imported cabbageworm, or small white butterfly), Plutella xylostella (diamondback moth), Spodoptera exigua (beet armyworm), Spodoptera litura (tobacco cutworm, cluster caterpillar), e Tuta absoluta (tomato leafminer). Os insetos da ordem de Coleoptera incluem, entre outros Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. e Trogoderma spp, particularmente quando a praga é Diabrotica virgifera virgifera (Western Corn Rootworm, WCR), Diabrotica barberi (Northern Corn Rootworm, NCR), Diabrotica virgifera zeae (Mexican Corn Rootworm, MCR), Diabrotica balteata (Brazilian Corn Rootworm (BZR), Diabrotica undecimpunctata howardii (Southern Corn Rootworm, SCR) e um complexo de Brazilian Corn Rootworm (BCR) que consiste em Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa).

[00106] A referência neste pedido a uma "molécula isolada de DNA", "molécula de polinucleotídeo isolado", ou um termo ou frase equivalente, destina-se a significar que a molécula de DNA é uma que esteja presente sozinha ou em combinação com outras composições, mas não dentro de seu ambiente natural. Por exemplo, elementos de ácidos nucleicos, como uma sequência de codificação, sequência de íntron, sequência líder não traduzida, sequência do promotor, sequência de terminação da transcrição, e outros semelhantes, que são encontradas naturalmente dentro do DNA do genoma de um organismo não são considerados como sendo "isolados" contanto que o elemento esteja dentro do genoma do organismo e no local dentro do genoma em que se encontra naturalmente. No entanto, cada um destes elementos, e subpartes destes elementos, seria "isolado" dentro do escopo desta descrição, contanto que o elemento não esteja dentro do genoma do organismo e no local dentro do genoma em que se encontra naturalmente. Da mesma forma, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína inseticida ou qualquer variante de inseticida que ocorre naturalmente daquela proteína seria uma sequência de nucleotídeos isolada, contanto que a sequência de nucleotídeos não estivesse dentro do DNA da bactéria a partir do qual a sequência que codifica a proteína é naturalmente encontrada. Uma sequência de nucleotídeo sintético que codifica a sequência de aminoácidos da proteína inseticida que ocorre naturalmente seria considerado como sendo isolada para os fins da presente descrição. Para os fins da presente descrição, qualquer sequência de nucleotídeos transgênica, ou seja, a sequência de nucleotídeos do DNA inserido no genoma das células de uma planta ou bactéria, ou presente Em um vetor extracromossômico seria considerado como sendo uma sequência de nucleotídeos isolada se esta está presente dentro do plasmídeo ou estrutura semelhante utilizada para transformar as células, dentro do genoma da planta ou bactéria, ou presente em quantidades detectáveis em tecidos, descendência, amostras biológicas ou produtos de commodity derivados da planta ou bactéria.

[00107] Como descrito ainda neste pedido, um quadro aberto de leitura (ORF) (SEQ ID NO: 1) codificando TIC3668 (SEQ ID NO: 2) foi descoberta em DNA obtido a partir de Brevibacillus laterosporus cepa EG5552.Outros genomas bacterianos foram então triados para as sequências que codificam a proteína relacionada com TIC3668. Várias outras regiões de leitura aberta foram identificadas em outros genomas bacterianos que codificam sequências de aminoácidos que se assemelham a proteína EG5552 TIC3668, incluindo as proteínas tipo TIC3668 TIC3669 que foi descoberta em DNA obtido a partir de Brevibacillus laterosporus cepa EG5551 (SEQ ID NO:3 que codifica SEQ ID NO:4), TIC3670 que foi descoberto no DNA obtido de Brevibacillus laterosporus cepa EG5553 (SEQ ID NO:5 que codifica SEQ ID NO:6), TIC4076 que foi descoberto em DNA obtido de Brevibacillus laterosporus cepa ATCC6456 (SEQ ID NO:7 que codifica SEQ ID NO:8), TIC4078 que foi descoberto em DNA obtido de Brevibacillus laterosporus cepa EG4227 (SEQ ID NO:9 que codifica SEQ ID NO:10), TIC4346 que foi descoberto em DNA obtido de Brevibacillus laterosporus cepa EG5551 (SEQ ID NO:13 que codifica SEQ ID NO:14), TIC4826 que foi descoberto em DNA obtido de Brevibacillus laterosporus cepa AG0021D10 (SEQ ID NO:15 que codifica SEQ ID NO:16), TIC4861 (SEQ ID NO:17 que codifica SEQ ID NO:18), TIC4862 (SEQ ID NO:19 que codifica SEQ ID NO:20) e TIC4863 (SEQ ID NO:21 que codifica SEQ ID NO:22) que foram descobertos em DNA obtido de Brevibacillus laterosporus cepa EG4227.Uma proteína adicional tipo TIC3668, TIC4260 (SEQ ID NO: 11 que codifica a SEQ ID NO: 12), foi criada por combinação da variação da sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente de cinco proteínas tipo TIC3668 nativas diferentes para criar uma proteína de colagem.

[00108] As sequências de codificação respectivas foram clonadas e expressas em células hospedeiras microbianas para a produção de proteínas recombinantes para utilização em bioensaios de insetos. Como descrito mais adiante neste pedido, é mostrado que estas proteínas exibem bioatividade contra espécies de Diabrotica, incluindo Western Corn Rootworm (WCR, Diabrotica virgifera virgifera), Western European Corn Borer (ECB, Ostrinia nubialis), Southwestern Corn Borer (SWC, Diatraea grandiosella), e Soybean Looper (SBL, Chrysodeixis includens).

[00109] Uma característica surpreendente das proteínas tipo TIC3668 é a presença de um segmento de aminoácidos N-terminal correspondente à posição de aminoácido 1 a 23 para TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078, TIC4260, TIC4346, TIC4826, TIC4863; 1 a 12 para TIC4861; e 1 a 21 para TIC4862.Cada um destes segmentos de aminoácidos N-terminais pode ser omitido da respectiva proteína e a sequência de polinucleotídeo que codifica para o respectivo segmento pode também ser omitido. Quando expresso na planta, a omissão desses respectivos segmentos surpreendentemente resultou Em um aumento de atividade inseticida contra espécies de vermes das raízes do milho em comparação com a expressão de proteína toxina de comprimento completo, contendo o segmento omitido. Segmentos de proteína toxina desprovidos de segmentos de aminoácidos N-terminais referidas acima são aqui referidas como “proteínas toxina tipo TIC3668 maduras”. De um modo geral, a referência à versão madura de uma proteína do tipo TIC3668 é aqui anotada com a letra "m" que precede o nome da toxina para diferenciar a referência à sequência madura a partir da sequência nativa de comprimento completo. Por exemplo, a versão madura da sequência de aminoácidos para TIC3668 (SEQ ID NO: 2) é mTIC3668 (SEQ ID NO: 23). As versões maduras para TIC3669 (SEQ ID NO:4), TIC3670 (SEQ ID NO:6), TIC4076 (SEQ ID NO:8), TIC4078 (SEQ ID NO:10), TIC4260 (SEQ ID NO:12), TIC4346 (SEQ ID NO:14) e TIC4826 (SEQ ID NO:16) são mTIC3669 (SEQ ID NO:24), mTIC3670 (SEQ ID NO:25), mTIC4076 (SEQ ID NO:26), mTIC4078 (SEQ ID NO:27), mTIC4260 (SEQ ID NO:28), mTIC4346 (SEQ ID NO:29) e mTIC4826 (SEQ ID NO:30), respectivamente. As proteínas de comprimento completo TIC4861 (SEQ ID NO: 18), TIC4862 (SEQ ID NO: 20) e TIC4863 (SEQ ID NO: 22) são variantes de comprimento de sequência de cada outra e diferem apenas no comprimento do seu segmento de aminoácido N- terminal. A remoção do segmento de aminoácidos N-terminal em TIC4861, TIC4862, e TIC4863 cria uma sequência de aminoácidos madura idêntica para mTIC4861, mTIC4862, e mTIC4863. Assim, as sequências de aminoácidos para mTIC4861, mTIC4862, e mTIC4863 são codificadas pela mesma sequência de polinucleotídeo (mTIC4861, SEQ ID NO: 31). As sequências de proteínas tipo TIC3668 maduras são codificadas por SEQ ID NO:64 (que codifica mTIC3668), SEQ ID NO:65 (que codifica mTIC3669), SEQ ID NO:66 (que codifica mTIC3670), SEQ ID NO:67 (que codifica mTIC4076), SEQ ID NO:68 (que codifica mTIC4078), SEQ ID NO:69 (que codifica mTIC4260), SEQ ID NO:70 (que codifica mTIC4346), SEQ ID NO:71 (que codifica mTIC4826), e SEQ ID NO.72 (que codifica mTIC4861, mTIC4862, e mTIC4863) para expressão em hospedeiros bacterianos.

[00110] Os membros adicionais para a família de tipo TIC3668 podem ser criados usando as variações de aminoácidos que ocorrem naturalmente a partir de alguns ou todos os membros da família para criar novas proteínas de um nível mais elevado de diversidade de sequências de aminoácidos e com novas propriedades. Variantes da classe de proteína toxina tipo TIC3668 foram produzidas através do alinhamento das sequências de aminoácidos dos membros da família tipo TIC3668 e combinando as diferenças ao nível da sequência de aminoácidos em uma nova sequência de aminoácidos e fazendo mudanças adequadas com os polinucleotídeos que codificam essas variantes. Um tal exemplo é TIC4260. SEQ ID NO: 11 é a sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína TIC4260 (SEQ ID NO: 12). A proteína madura (mTIC4260, SEQ ID NO: 28) é codificada pela sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 43.

[00111] Fragmentos das toxinas de proteína do tipo TIC3668 podem ser truncados em que um ou mais aminoácidos são eliminados da extremidade N-terminal, C-terminal, o meio da proteína, ou combinações dos mesmos com atividade inibidora de insetos. Estes fragmentos podem ser de ocorrência natural ou variantes sintéticas de TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 ou TIC4863, mas deve reter ou melhorar a atividade inibidora de inseto de TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 ou TIC4863.As variantes de deleção truncadas em N-terminal ou C- terminal incluem, mas não estão limitadas às proteínas TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 ou TIC4863 que são desprovidas de resíduos de aminoácidos de N-terminal e/ou C-terminal. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos N-terminal 1 a 23 de uma proteína TIC3668 podem ser eliminados resultando em uma proteína toxina que possui os aminoácidos 24-317 da SEQ ID NO: 2. A remoção de 10 ou 20 aminoácidos da extremidade aminoácido C-terminal de uma proteína TIC3668 resultou em uma perda de atividade inseticida, enquanto a remoção de um único aminoácido não afetou a atividade.

[00112] As proteínas da classe de proteínas do tipo TIC3668, e proteínas que se assemelham às proteínas da classe de proteínas do tipo TIC3668, podem ser identificadas por comparação umas com as outras utilizando vários algoritmos com base em computadores conhecidos na técnica (ver Tabelas 1 e 2).As identidades de sequência de aminoácidos aqui referidas são uma consequência de um alinhamento de Clustal W utilizando estes parâmetros por padrão: Peso de matriz: blosum, Penalidade de abertura de lacuna: 10,0, Penalidade de extensão de lacuna: 0.05, lacunas hidrofílicas: On, resíduos hidrofílicos: GPSNDQERK, penalidades de lacuna específicas de resíduo:On (Thompson, et al.(1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). O percentual de identidade de aminoácidos é ainda calculado pelo produto de 100% multiplicado por (identidades de aminoácidos/comprimento de proteína sujeito). Outros algoritmos de alinhamento também estão disponíveis na técnica e fornecem resultados semelhantes aos obtidos usando um alinhamento de Clustal W.

[00113] Pretende-se que uma proteína que exibe atividade inibidora de insetos contra uma espécie de inseto Lepidóptero é um membro da classe proteína toxina tipo TIC3668, se a proteína é usada em uma pergunta, por exemplo, em um alinhamento de Clustal W, e pelo menos uma das proteínas da presente invenção estabelecido como mTIC4260 e identificado como hits em tal alinhamento em que a proteína inquirida exibe pelo menos cerca de 85% a cerca de 100% identidade de sequência de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína inquirida, que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, ou qualquer fração percentual nesta faixa; ou pelo menos uma das proteínas da presente invenção como estabelecido como mTIC3668 é identificada como hits em tal alinhamento em que a proteína inquirida exibe pelo menos cerca de 89% a cerca de 100% identidade de sequência de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína inquirida, que é 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, ou qualquer fração percentual nesta faixa; ou pelo menos uma das proteínas da presente invenção como estabelecido como mTIC3669 e/ou mTIC3670 são identificadas como hits em tal alinhamento em que a proteína inquirida exibe pelo menos cerca de 90% a cerca de 100% identidade de sequência de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína inquirida, que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, ou qualquer fração percentual nesta faixa; ou pelo menos uma das proteínas das presente invenção como estabelecido como mTIC4826 é identificada como um hit em tal alinhamento em que a proteína inquirida exibe pelo menos cerca de 91% a cerca de 100% identidade de sequência de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína inquirida, que é 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, ou qualquer fração percentual nesta faixa.

[00114] Pretende-se que uma proteína que exibe atividade inibidora de insetos contra uma espécie de inseto Coleóptero seja um membro da classe de proteína toxina tipo TIC3668, se a proteína é usada em uma pergunta, por exemplo, em um alinhamento de Clustal W, e pelo menos um das proteínas da presente invenção como estabelecida como mTIC3668, mTIC3669, mTIC3670, mTIC4076, mTIC4078, mTIC4260, mTIC4346, mTIC4826, mTIC4861, mTIC4862, e mTIC4863 são identificados como hits em tal alinhamento em que proteína inquirida exibe, pelo menos, cerca de 35 % a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína inquirida que é cerca de 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99%, 100%, ou qualquer fração percentual nesta faixa.

[00115] Exemplos de proteínas da classe de proteína toxina tipo TIC3668 foram alinhadas umas com as outras utilizando um algoritmo Clustal W. Uma matriz pareada de identidades de sequência de aminoácidos percentual para cada par das proteínas de comprimento completo foi criada, como relatado na Tabela 1. Uma matriz pareada de identidades de sequência de aminoácidos percentual para cada par das proteínas de comprimento maduro foi criada, como relatado na Tabela 2. Tabela 1. Apresentação de matriz pareada de proteínas de comprimento completo exemplares Descrição da tabela: Alinhamento de Clustal W entre (X) versus (Y) são relatados em uma matriz pareada. Colunas sob (N) referem-se a SEQ ID N°. Coluna (M) se refere ao nome da proteína (TIC #). A identidade percentual de aminoácido entre todos os pares é calculada e é representada pelo primeiro número em cada caixa. O segundo número (entre parênteses) em cada caixa representa o número de aminoácidos idênticos entre o par. Tabela 2. Apresentação da matriz pareada de proteínas maduras exemplares

[00116] Descrição da tabela: Alinhamento de Clustal W entre (X) versus (Y) são relatados em uma matriz pareada. Colunas sob (N) referem-se a SEQ ID N°. Coluna (M) se refere ao nome proteína (TIC #). A identidade percentual de aminoácido entre todos os pares é calculada e é representada pelo primeiro número em cada caixa. O segundo número (entre parênteses) em cada caixa representa o número de aminoácidos idênticos entre o par.

[00117] As proteínas de comprimento completo e maduras da classe de proteína toxina tipo TIC3668 podem também estar relacionadas pela estrutura primária (motivos de aminoácidos conservados), por comprimento (cerca de 295 aminoácidos para as proteínas maduras e cerca de 317 aminoácidos para as proteínas de comprimento total) e por outras características. As proteínas de comprimento completo a partir da presente invenção têm uma massa medida de cerca de 35 k-Daltons quando corridas em géis de proteínas sob condições de desnaturação, e as proteínas maduras têm uma massa medida de cerca de 32kDa. Características das formas de comprimento completo e maduras da classe de proteína tipo TIC3668 são apresentadas nas Tabelas 3 e 4. Tabela 3 - Características da proteína de comprimento completo Tabela 4 - Características de proteína madura

[00118] As proteínas da classe de proteína toxina tipo TIC3668 descrita representam uma nova classe de proteínas inseticidas. Com referência à Tabela 5, todos os números acima da linha diagonal que correspondem a 100% de identidade, representam o número de diferenças de aminoácidos entre as proteínas correspondentes a serem comparadas na interseção da referida linha e coluna. Os números abaixo da linha diagonal que correspondem a 100% de identidade representam o percentual de identidade das proteínas correspondentes a serem comparadas na interseção da referida linha e coluna. Os membros de comprimento maduro desta classe proteína exibem não mais do que 90,54% de identidade de aminoácidos a qualquer outra proteína inseticida conhecida na técnica, como demonstrado no alinhamento apresentado na Tabela 5. A proteína inseticida que exibe a identidade mais próxima para qualquer uma das proteínas de comprimento maduro da presente invenção é a SEQ ID NO: 50 na publicação do Pedido de Patente número 20110030093 (AXMI-209) com 90,5% de identidade de sequência com mTIC4076, mTIC4346, mTIC4826, e mTIC4863. Esta descrição apenas ensina a atividade contra Lepidoptera, enquanto proteínas exemplares da presente invenção demonstram atividade contra coleópteros. H0UDD3_BRELA, F7TVP6_BRELA, e U4WSU1_BRELA são sequências de proteínas não anotadas previstas a partir do quadro aberto de leitura nas sequências de genoma relatadas como tendo sido obtidas a partir de B. laterosporous. Nenhuma atividade inseticida é relatada para estas proteínas. Tabela 5 - Alinhamento de Proteínas TIC3886 de Comprimento Maduro para proteínas da técnica anterior

[00119] As proteínas TIC3668 descritas neste pedido exibem atividade em bioensaios de dieta contra Coleoptera, incluindo WCR. Em alguns casos também é observada atividade de lepidópteros.

[00120] Como descrito adicionalmente nos Exemplos do presente pedido, as sequências de polinucleotídeos que codificam para proteínas toxinas TIC3668 foram concebidas para utilização em plantas. Polinucleotídeos exemplificativos que foram concebidos para expressão em plantas e codificam o comprimento completo das proteínas inibidoras de insetos TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862, e TIC4863 são apresentados em SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, e SEQ ID NO:51.Polinucleotídeos exemplificativos que foram concebidos para expressão em plantas e codificam uma forma madura de proteínas inibidoras de insetos mTIC3668, mTIC3669, mTIC3670, mTIC4260, mTIC4076, mTIC4078, mTIC4346, mTIC4826, mTIC4861, mTIC4862, e mTIC4863 são estabelecidos SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, e SEQ ID NO:49.

[00121] Os cassetes de expressão e vetores contendo estas sequências de polinucleotídeos foram construídos e introduzidas em células de plantas de milho de acordo com métodos e técnicas de transformação conhecidos na técnica. As células transformadas foram regeneradas em plantas transformadas que foram observadas como expressando proteínas toxinas TIC3668. Para testar a atividade pesticida, bioensaios foram realizados na presença de larvas de pragas lepidópteros ou coleópteros usando discos de folhas de plantas obtidos a partir das plantas transformadas.

[00122] A atividade inibidora de insetos de membros exemplares da classe de proteína toxina TIC3668 é descrita em mais detalhes nos Exemplos. As proteínas exemplares são relacionadas por função comum e exibem atividade inseticida contra espécies de insetos de Coleoptera e Lepidoptera, incluindo adultos, ninfas, larvas e recém- nascidos.

[00123] As composições de polinucleotídeos recombinantes que codificam proteínas tipo TIC3668 estão contempladas. Por exemplo, as proteínas tipo TIC3668 podem ser expressas com construções de DNA recombinante em que uma molécula de polinucleotídeo com uma ORF que codifica a proteína está operacionalmente ligada a elementos de expressão genética, como um promotor e qualquer outro elemento regulatório necessário para a expressão no sistema para o qual a construção se destina. Os exemplos não limitativos incluem um promotor vegetal funcional operacionalmente ligado às sequências de codificação da proteína tipo TIC3668 para a expressão da proteína em plantas ou um promotor funcional Bt ligado operacionalmente a uma sequência de codificação da proteína de tipo TIC3668 para a expressão da proteína em uma bactéria Bt ou outra espécie de Bacillus. Outros elementos podem ser operacionalmente ligados às sequências de codificação da proteína de tipo TIC3668 incluindo, mas não se limitando a potencializadores, íntrons, líderes não traduzidas, tags de imobilização de proteínas codificadas (HIS-tag), peptídeos de translocação (isto é, peptídeos de trânsito dos plastídeos, peptídeos de sinal), sequências de polipeptídeos para enzimas de modificação pós-traducionais de sítios de ligação ao ribossoma e locais alvo de iRNA. Moléculas de polinucleotídeo recombinantes exemplares aqui fornecidas incluem, mas não estão limitados a, um promotor heterólogo operacionalmente ligado a um polinucleotídeo, como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, e SEQ ID NO:21 que codifica os respectivos polipeptídeos ou proteínas tendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, e SEQ ID NO:22. Os códons de uma molécula de polinucleotídeo recombinante que codifica para proteínas aqui descritas podem ser substituídos por códons sinônimos (conhecidos na técnica como uma substituição silenciosa). Exemplos não limitativos de polinucleotídeos modificados que codificam qualquer uma das proteínas tipo TIC3668 descritas neste pedido são estabelecidos na SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, e SEQ ID NO:51 para as sequências de proteína de comprimento completo e SEQ ID NOs:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, e SEQ ID NO:49 para as sequências de proteína madura.

[00124] Uma construção de DNA recombinante compreendendo sequências de codificação de proteína tipo TIC3668 pode ainda compreender uma região de DNA que codifica para um ou mais agentes inibidores de inseto que podem ser configurados para concomitantemente expressar ou coexpressar com uma sequência de DNA que codifica uma proteína tipo TIC3668, uma proteína diferente de uma proteína do tipo TIC3668, uma molécula de dsRNA inibidora de insetos, ou uma proteína acessória. Proteínas auxiliares incluem, mas não estão limitadas a cofatores, enzimas, parceiros de ligação, ou outros agentes que funcionam para ajudar na eficácia de um agente inibidor de insetos, por exemplo, ao contribuir para a sua expressão, influenciando a sua estabilidade em plantas, otimizar a energia livre para a oligomerização, aumentar a sua toxicidade, e aumentar o seu espectro de atividade. Uma proteína acessória pode facilitar a absorção de um ou mais agentes inibidores de insetos, por exemplo, ou potencializar os efeitos tóxicos do agente tóxico.

[00125] Uma construção de DNA recombinante pode ser montado de modo que todas as proteínas ou moléculas de dsRNA são sejam expressas a partir de um promotor ou de cada proteína ou moléculas de dsRNA esteja sob o controle do promotor separado ou alguma combinação dos mesmos. As proteínas da presente invenção podem ser expressas a partir de um sistema de expressão de vários genes em que uma ou mais proteínas das proteínas tipo TIC3668 são expressas a partir de um segmento de nucleotídeo comum que também contém outras regiões de leitura aberta e os promotores, dependendo do tipo de sistema de expressão selecionado. Por exemplo, um sistema de expressão de vários genes bacteriano pode utilizar um único promotor para direcionar a expressão de quadros abertos de leitura multiplamente ligadas/em tandem dentro de um único óperon (isto é, expressão policistrônica). Em outro exemplo, um sistema de expressão de plantas de vários genes pode utilizar cassetes de expressão multiplamente ligados, cada uma expressando uma proteína diferente ou outro agente, como uma ou mais moléculas de dsRNA melancia e célula da planta de trigo ou planta. Em certas modalidades, as plantas transgênicas e partes de plantas transgênicas regeneradas a partir de uma célula de planta transgênica são fornecidas. Em certas modalidades, as plantas transgênicas podem ser obtidas a partir de uma semente transgênica por corte, o rompimento, moagem ou de outra forma dissociando a parte da planta. Em certas modalidades, a parte da planta pode ser uma semente, uma cápsula, uma folha, uma flor, um caule, uma raiz, ou qualquer parte dos mesmos, ou uma parte não regenerável de uma parte de planta transgênica. Como utilizado neste contexto, uma parte "não regenerável" de uma parte de planta transgênica é uma parte que não pode ser induzida a formar uma planta inteira ou que não pode ser induzida a formar uma planta inteira que é capaz de reprodução sexuada e/ou assexuada. Em certas modalidades, uma parte não regenerável, de uma parte da planta é uma parte de uma semente transgênica, cápsulas, folhas, flores, caule ou raiz.

[00126] Os polinucleotídeos recombinantes ou construções de DNA recombinante compreendendo uma sequência de codificação de proteína tipo TIC3668 podem ser liberados às células por vetores, por exemplo, um plasmídeo, vírus baculovírus, cromossomos sintéticos, vírions, cosmídeo, fagomídeo, fago ou vetor viral. Tais vetores podem ser utilizados para conseguir uma expressão estável ou transitória de uma sequência que codifica a proteína do tipo TIC3668 em uma célula hospedeira, ou subsequente expressão do polipeptídeo codificado. Um polinucleotídeo recombinante exógeno ou construção de DNA recombinante que compreende uma sequência que codifica a proteína tipo TIC3668 e que é introduzida em uma célula hospedeira é aqui referido como um "transgene".

[00127] As bactérias transgênicas, células de plantas transgênicas, plantas transgênicas, e partes de plantas transgênicas que contêm um polinucleotídeo recombinante que expressa qualquer uma ou mais das sequências de codificação da proteína de tipo TIC3668 são aqui fornecidas. O termo "célula bacteriana" ou "bactéria" pode incluir, mas não está limitado a uma célula de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, ou Rhizobium. O termo "célula vegetal" ou "planta" pode incluir, mas não se limita a um monocotilédone, dicotiledônio, alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, grão de bico, couve chinesa, cítricos, coco, café, milho, trevo, algodão, abóbora, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho poró, alface, pinho silvestre, painço, melões, noz, aveia, azeite, cebola, ornamental, palma, capim, ervilha, amendoim, pimenta, guandu, pinho, batata, álamo, abóbora, pinheiro radiata, rabanete, colza, arroz, rootstocks, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho de Sul, soja, espinafre, squash, morango, beterraba sacarina, cana de açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata-doce, switchgrass, chá, tabaco, tomate, triticale, relvado, melanci a e célula da planta de trigo ou planta. Em certas modalidades, as plantas transgênicas e partes de plantas transgênicas regeneradas a partir de uma célula de planta transgênica são fornecidas. Em certas modalidades, as plantas transgênicas podem ser obtidas a partir de uma semente transgênica, por corte, o rompimento, moagem ou de outra forma dissociando a parte da planta. Em certas modalidades, a parte da planta pode ser uma semente, uma cápsula, uma folha, uma flor, um caule, uma raiz, ou qualquer parte dos mesmos, ou uma parte não regenerável de uma parte da planta transgênica. Como utilizado neste contexto, uma parte "não regenerável" de uma parte planta transgênica é uma parte que não pode ser induzida a formar uma planta inteira ou que não pode ser induzida a formar uma planta inteira que é capaz de reprodução sexuada e/ou assexuada. Em certas modalidades, uma parte não regenerável, de uma parte da planta é uma parte de uma semente transgênica, cápsulas, folhas, flores, caule ou raiz.

[00128] Os métodos de produção de plantas transgênicas que compreendem inseto, quantidades inibidoras de Coleoptera ou Lepidoptera de uma proteína do tipo TIC3668 são fornecidos. Tais plantas podem ser preparadas através da introdução de um polinucleotídeo recombinante que codifica qualquer uma das proteínas de tipo TIC3668 fornecidas neste pedido em uma célula vegetal, e selecionando uma planta derivada a partir da referida célula de planta que expressa um inseto, quantidade inibidora para Coleoptera ou Lepidoptera das proteínas do tipo TIC3668. As plantas podem ser derivadas a partir das células de plantas por meio de técnicas de regeneração, semeadura, pólen, ou de transformação do meristema. Métodos para transformar plantas são conhecidos na técnica.

[00129] Os produtos vegetais transformados, em que o produto processado compreende uma quantidade detectável de uma proteína do tipo TIC3668, um segmento inibidor de inseto ou um fragmento do mesmo, ou qualquer parte distintiva dos mesmos, são também descritos no presente pedido. Em certas modalidades, o produto processado é selecionado a partir do grupo que consiste em partes de plantas, biomassa da planta, óleo, farelo, açúcar, ração animal, farinha, flocos, farelo, fiapos, cascas, sementes transformadas e sementes. Em certas modalidades, o produto processado é não regenerável. O produto vegetal pode conter commodity ou outros produtos de comércio derivados de uma planta transgênica ou parte da planta transgênica, onde a commodity ou outros produtos podem ser rastreados através do comércio através da detecção de segmentos de nucleotídeos ou RNA expresso ou proteínas que codificam ou compreendem porções distintivas de uma proteína do tipo TIC3668.

[00130] As plantas que expressam as proteínas TIC3668 podem ser cruzadas por cruzamento com eventos transgênicos que expressam outras proteínas toxinas e/ou que expressam outras características transgênicas como genes de tolerância a herbicidas, genes que conferem rendimento ou características de tolerância ao estresse, e semelhantes, ou seja, estas características podem ser combinadas Em um único vetor de modo a que as características estejam todas ligadas.

[00131] As sequências que codificam proteína tipo TIC3668 e as sequências possuindo um percentual de identidade substancial com as sequências de codificação de proteína tipo TIC3668 podem ser identificadas usando métodos conhecidos dos especialistas na técnica como a reação em cadeia da polimerase (PCR), a amplificação térmica e hibridização. Por exemplo, as proteínas da classe de proteína toxina tipo TIC3668 podem ser usadas para produzir anticorpos que se ligam especificamente a esta classe de proteínas, e podem ser utilizadas para triar e para encontrar outros membros da classe.

[00132] Além disso, as sequências de nucleotídeos que codificam para a classe de proteína toxina tipo TIC3668 (e sequências de complemento reverso) podem ser utilizadas como sondas e iniciadores para a triagem para identificar outros membros da classe utilizando métodos de amplificação e de hibridização por ciclo térmico ou isotérmico. Especificamente, os oligonucleotídeos derivados de sequências como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 52 a 61 podem ser utilizados para determinar a presença ou ausência de um transgene tipo TIC3668 em uma amostra de ácido desoxirribonucleico derivada de um produto de commodity. Dada a sensibilidade de determinados métodos de detecção de ácidos nucleicos que empregam oligonucleotídeos, prevê-se que os oligonucleotídeos derivados de sequências como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, e SEQ ID NO:61 podem ser usados para detectar um transgene TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078, ou TIC4260 em produtos de commodity derivados de fontes agrupadas em que apenas uma fração do produto de commodity seja derivada de uma planta transgênica contendo qualquer uma das SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, e SEQ ID NO:61.É ainda reconhecido que tais oligonucleotídeos podem ser utilizados para introduzir variação da sequência de nucleotídeos em cada uma das SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, e SEQ ID NO:61.Tais oligonucleotídeos "mutagênese" são úteis para a identificação de TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078, ou TIC4260, variantes de sequência de aminoácidos que exibem uma faixa de atividade inibidora de insetos ou expressão variada em células hospedeiras de plantas transgênicas.

[00133] A sequência de nucleotídeos homólogas, por exemplo, proteínas inseticidas codificadas por sequências de nucleotídeos que hibridizam com cada uma ou qualquer uma das sequências descritas neste pedido, em condições de hibridização rigorosas, são também uma modalidade da presente invenção. A invenção também fornece um método para a detecção de uma primeira sequência de nucleotídeos que hibridiza com uma segunda sequência de nucleotídeos, em que a primeira sequência de nucleotídeos (ou sua sequência de complemento reverso) codifica uma proteína inseticida ou fragmento inseticida do mesmo e hibridiza sob condições de hibridização rigorosas com a segunda sequência de nucleotídeos. Em tal caso, a segunda sequência de nucleotídeos pode ser qualquer das sequências de nucleotídeos descritas na classe de proteína toxina tipo TIC3668 sob condições de hibridização rigorosas. As sequências de codificação de nucleotídeos hibridizam com uma outra sob condições de hibridização adequadas e as proteínas codificadas por estas sequências de nucleotídeos reagem de forma cruzada com antissoro gerado contra qualquer uma das outras proteínas. As condições de hibridização rigorosas são conhecidas na técnica e podem variar de acordo com a aplicação e o resultado desejado e podem englobar uma variedade de reagentes e condições. Por exemplo, lavagens em temperaturas mais elevadas constituem condições mais rigorosas. Em certas modalidades, as condições de hibridização da presente invenção podem compreender, pelo menos, hibridização a 42°C, seguido por duas lavagens durante cinco minutos cada em temperatura ambiente com 2X SSC, 0,1% SDS, seguido de duas lavagens de trinta minutos cada, a 65°C em 0,5X SSC, 0,1% SDS; ou hibridização a 68oC, seguido de lavagem a 68oC, em 2X SSC contendo 0,1% SDS; ou hibridização a partir de 4 a 12 horas em 50% de formamida, NaCl 1 M, e SDS a 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,1 X SSC a 60°C - 65°C.

[00134] Um especialista na técnica irá reconhecer que, devido à redundância do código genético, muitas outras sequências são capazes de codificar estas proteínas relacionadas, e aquelas sequências, à medida que estas funcionam para expressar proteínas inseticidas em cepas de Bacillus ou em células de plantas, são modalidades da presente invenção, reconhecendo evidentemente que muitas destas sequências de codificação redundantes não irão hibridizar sob estas condições para as sequências de Bacillus nativas que codificam TIC3668. Este pedido contempla a utilização de estes e outros métodos de identificação conhecidos dos especialistas na técnica, para identificar as sequências de codificação das proteínas tipo TIC3668 e sequências tendo um percentual de identidade substancial com as sequências de codificação de proteína tipo TIC3668.

[00135] Esta descrição também contempla a utilização de métodos moleculares conhecidos na técnica para modificar e clonar proteínas comercialmente úteis que compreendem quimeras de proteínas de proteínas pesticidas; por exemplo, as quimeras podem ser montadas a partir de segmentos das proteínas de tipo TIC3668 para derivar modalidades adicionais úteis, incluindo a montagem de segmentos de proteínas tipo TIC3668 com segmentos de diversas proteínas diferentes a partir de TIC3668 e proteínas relacionadas. A classe de proteína de tipo TIC3668 pode ser submetida ao alinhamento a cada outra e outras proteínas pesticidas de Bacillus (se ou não estes são estreitamente ou distantemente filogeneticamente relacionados), e segmentos de cada tal proteína podem ser identificados que são úteis para a substituição entre as proteínas alinhadas, resultando na construção de proteínas quiméricas. Tais proteínas quiméricas podem ser submetidas a análise de bioensaio de pragas e caracterizadas pela presença ou ausência de aumento da bioatividade e/ou espectro de pragas alvo expandido em comparação com as proteínas parentais a partir da qual cada tal segmento na quimera foi derivado. A atividade pesticida dos polipeptídeos pode ser ainda modificada para a atividade para uma determinada praga ou a um espectro mais amplo de pragas trocando domínios ou segmentos com outras proteínas ou usando métodos de evolução direcionados conhecidas na técnica.

[00136] Métodos que controlam insetos, em particular infestações por lepidópteros ou coleópteros de cultura de plantas, com proteínas da classe de proteína toxina TIC3668 são também descritos no presente pedido. Tais métodos podem incluir o crescimento de uma planta compreendendo uma quantidade inibidora de insetos, Coleoptera ou Lepidoptera de uma proteína da classe de proteína toxina TIC3668. Em certas modalidades, tais métodos podem ainda compreender qualquer um ou mais de: (i) aplicar qualquer composição que compreende ou que codifica uma proteína da classe de proteína toxina tipo TIC3668 a uma planta ou uma semente que dá origem a uma planta; e (ii) transformar uma planta ou uma célula de planta que dá origem a uma planta com um polinucleotídeo que codifica uma proteína da classe de proteína toxina tipo TIC3668. Em geral, é contemplado que qualquer proteína na classe de proteína toxina tipo TIC3668 pode ser fornecida em uma composição, fornecida em um micro-organismo, ou fornecido em uma planta transgênica para conferir atividade inibidora contra insetos lepidópteros ou insetos coleópteros.

[00137] Em certas modalidades, um polipeptídeo recombinante da classe de proteína toxina tipo TIC3668 é o ingrediente ativo como inseticida de uma composição inibidora de insetos preparada por cultura recombinante de Bacillus ou qualquer outra célula bacteriana recombinante transformada para expressar uma proteína toxina do tipo TIC3668 sob condições adequadas para expressar e produzir as proteínas da classe de proteína toxina tipo TIC3668. Tal composição pode ser preparada por dessecação, liofilização, homogenização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação, ou concentração de uma cultura de tais células recombinantes que expressam/produzem o referido polipeptídeo recombinante. Tal processo pode resultar em um Bacillus ou outro extrato celular bacteriano entomopatológico, suspensão celular, homogenato celular, lisado celular, sobrenadante celular, filtrado celular, ou pelete celular. Pela obtenção dos polipeptídeos recombinantes assim produzidos, uma composição que inclui os polipeptídeos recombinantes pode incluir células bacterianas, esporos bacterianos, e os corpos de inclusão paraespórica e pode ser formulada para várias utilizações, incluindo como produtos de pulverização de inibidora insetos agrícolas ou como formulações inibidoras de insetos em bioensaios de dieta.

[00138] Em uma modalidade, para reduzir a probabilidade de desenvolvimento de resistência, uma composição inibidora de insetos que compreende uma ou mais proteínas da classe de proteína toxina tipo TIC3668 pode ainda compreender pelo menos um polipeptídeo adicional que exibe atividade inibidora de insetos contra a mesma espécie de insetos Lepidópteros ou coleópteros, mas que é diferente da proteína toxina do tipo TIC3668. Polipeptídeos adicionais possíveis para uma tal composição incluem uma proteína inibidora de insetos e uma molécula de dsRNA inibidora de insetos. Um exemplo para a utilização de tais sequências de ribonucleotídeos para controlar pragas de insetos é descrito em Baum, et al.(publicação do pedido de patente US 2006/0021087 A1).Tal polipeptídeo adicional para o controle de pragas de lepidópteros pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína inibidora de insetos, tais como, mas não limitados a Cry1A (US 5.880.275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B (publicação de patente US 10/525.318), Cry1C (US 6.033.874), Cry1D, Cry1Da e variantes dos mesmos, Cry1E, Cry1F, e quimeras Cry1A/F (patentes US 7.070.982; 6.962.705; e 6.713.063), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, quimeras tipo Cry1 como, entre outras, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869 e TIC1100, Cry2A, Cry2Ab (US 7.064.249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-184, AXMI-196, DIG- 3, DIG-4, DIG-5, DIG-11, AfIP-1A e derivados dos mesmos (publicação de patente US 2014-0033361 A1), AfIP-1B e derivados dos mesmos (publicação de patente US 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (publicação de Patente US 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (publicação de Patente US 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (publicação de Patente US 2014-0007292 A1), Pput_1063 (publicação de Patente US 2014-0007292 A1), Pput_1064 (US 2014-0007292 A1), GS-135 e derivados dos mesmos (publicação de Patente US 20120233726 A1), GS153 e derivados dos mesmos (publicação de Patente US 2012-0192310 A1), GS154 e derivados dos mesmos (publicação de Patente US 2012-0192310 A1), GS155 e derivados dos mesmos (publicação de Patente US 2012-0192310 A1), SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos como descrito na publicação de Patente US 2012-0167259 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos como descrito na publicação de Patente US 2012-0047606 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos como descrito na publicação de Patente US 2011-0154536 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos como descrito na publicação de Patente US 2011-0112013 A1, SEQ ID NO:2 e 4 e derivados dos mesmos como descrito na publicação de Patente US 2010-0192256 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos como descrito na publicação de Patente US 2010-0077507 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos como descrito na publicação de Patente US 2010-0077508 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos como descrito na publicação de Patente US 2009-0313721 A1, SEQ ID NO:2 ou 4 e derivados dos mesmos como descrito na publicação de Patente US 2010-0269221 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos como descrito na N°. 7.772.465 (B2), CF161_0085 e derivados do mesmo como descrito em WO2014/ 008054 A2, proteínas tóxicas de Lepidópteros e derivados dos mesmos como descrito nas publicações de patentes US US2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1, e US2012-0117690 A1; SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos como descrito em US7510878(B2), SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos como descrito na patente US 7812129(B1); e outras proteínas inibidoras de Lepidópteros conhecidas dos especialistas na técnica. Tal polipeptídeo adicional para o controle de pragas de Coleópteros pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína inibidora de insetos, tais como, mas não limitados a, Cry3Bb (Patente US 6.501.009), variantes Cry1C, variantes Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, Axmi184, Axmi205, AxmiR1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10, eHIPs (publicação de pedido de patente US 2010/0017914) e outras proteínas inibidoras de Coleópteros conhecidas dos especialistas na técnica.

[00139] Em outras modalidades, tal composição/formulação pode ainda compreender, pelo menos, um polipeptídeo adicional que exibe atividade inibidora de insetos para um inseto que não é inibido por uma proteína inibidora de inseto de outra forma da presente invenção para expandir o espectro de inibição de insetos obtido. Por exemplo, para o controle de pragas de hemípteros, as combinações de proteínas inibidoras de insetos da presente invenção podem ser utilizadas com proteínas ativas para hemípteros como TIC1415 (publicação de Pedido de Patente US N°. 2013/0097735), TIC807 (patente US 8609936), TIC834 (patente US 2013/0269060) e outras proteínas ativas para hemípteros conhecidas dos especialistas na técnica. Polipeptídeos adicionais para o controle de pragas de insetos Coleópteros, Lepidópteros, e hemípteros podem ser encontrados no website de nomenclatura da toxina de Bacillus thuringiensis mantido por Neil Crickmore (ou na rede mundial em btnomenclature.info).

[00140] A possibilidade de insetos para desenvolver resistência a certos inseticidas tem sido documentada na técnica. Uma estratégia de gestão da resistência a insetos é empregar culturas transgênicas que expressam dois agentes inibidores de insetos distintos que operam por meio de diferentes modos de ação. Portanto, quaisquer insetos com resistência a qualquer um dos agentes inibidores de inseto pode ser controlado por outro agente inibidor do inseto. Outra estratégia de gestão da resistência a insetos emprega a utilização de plantas que não são protegidas para as espécies de pragas de Coleópteros ou Lepidópteros orientadas para fornecer um refúgio para tais plantas desprotegidas. Um exemplo particular é descrito na Patente US 6.551.962, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[00141] Outras modalidades, como produtos químicos pesticidas aplicados topicamente, que são concebidos para o controle de pragas que também são controladas pelas proteínas aqui descritas para ser utilizadas com proteínas em tratamentos de sementes, pulverização, gotejamento, ou limpeza em formulações podem ser aplicadas diretamente no solo (uma rega do solo), aplicadas nas plantas em crescimento que expressam as proteínas aqui descritas, ou formuladas para serem aplicadas nas sementes contendo um ou mais transgenes codificando uma ou mais das proteínas descritas. Tais formulações para uso em tratamentos de sementes podem ser aplicadas com vários adesivos e taquificantes conhecidos na técnica. Tais formulações podem conter os pesticidas que são sinérgicos em modo de ação com as proteínas descritas, de modo a que os pesticidas da formulação atuem através de um modo de ação diferente para controlar as mesmas ou semelhantes pragas que podem ser controladas pelas proteínas descritas, ou que tais pesticidas atuam para controlar pragas dentro de uma espécie mais amplas da faixa de hospedeiro ou pragas de plantas que não são eficazmente controladas pela classe de proteína toxina tipo TIC3668.

[00142] A composição/formulação acima mencionada pode ainda compreender um carreador agricolamente aceitável, como uma isca, um pó, poeira, pelete, grânulo, pulverização, emulsão, uma suspensão coloidal, uma solução aquosa, uma preparação de esporo/cristal Bacillus, um tratamento de semente, uma célula de planta/tecido de plantas/semente/planta recombinante transformada para expressar uma ou mais das proteínas, ou bactéria transformada para expressar uma ou mais das proteínas. Dependendo do nível de inibição inseticida ou inibidor de inseto inerente ao polipeptídeo recombinante e o nível de formulação a ser aplicada a uma planta ou um ensaio de dieta, a composição/formulação pode incluir uma variedade de quantidades de peso do polipeptídeo recombinante, por exemplo, desde 0,0001% a 0,001% a 0,01% a 1% a 99% por peso do polipeptídeo recombinante.

EXEMPLOS

[00143] Tendo em vista o que precede, os especialistas na técnica devem apreciar que podem ser feitas alterações nos aspectos específicos que estão descritos e ainda obter um resultado igual ou semelhante sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Assim, os detalhes estruturais e funcionais específicos aqui descritos não devem ser interpretados como limitativos. Deve ser entendido que a descrição completa de cada referência aqui citada é incorporada dentro da descrição do presente pedido.

EXEMPLO 1 Descoberta da classe de proteína toxina relacionada a TIC3668

[00144] As cepas bacterianas que exibem atributos distintos, por exemplo, toxicidade inferida, diversidade proteômica, e variações morfológicas quando comparados com outro, foram identificados e preparados para o sequenciamento do genoma utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Uma proteína TIC3668 (SEQ ID NO: 2) que exibe atividade inibidora contra insetos coleópteros em bioensaios in vitro foi descoberta a partir de uma cepa Brevibacillus laterosporus (B. laterosporus) EG5552.Outras cepas também demonstraram conter proteínas que se assemelham a TIC3668. Segmentos de polinucleotídeos que codificam para estas proteínas foram clonados, e inseridos em uma cepa hospedeira recombinante para testar a expressão.

[00145] Os iniciadores de amplificação térmica foram concebidos para amplificar uma cópia de comprimento completo do gene a partir do DNA genômico total das diferentes cepas bacterianas B. laterosporus, incluindo EG5552. Produtos de amplificação térmica separados (amplicons) foram gerados a partir de cada cepa e estes foram analisados para a presença de regiões de leitura aberta que podem codificar proteínas relacionadas com TIC3668. Cada amplicom foi determinado como tendo uma única região de leitura aberta, contendo um códon de iniciação da tradução, seguido por um quadro aberto de leitura contígua, que foi terminada com um códon de terminação de tradução in frame. As sequências de aminoácidos deduzidas obtidas a partir de cada uma destas cepas bacterianas diferentes adicionais estão definidas respectivamente na SEQ ID NO:2 (TIC3668), SEQ ID NO:4 (TIC3669), SEQ ID NO:6 (TIC3670), SEQ ID NO:8 (TIC4076), SEQ ID NO:10 (TIC4078), SEQ ID NO:14 (TIC4346), SEQ ID NO:16 (TIC4826), SEQ ID NO:18 (TIC4861), SEQ ID NO:20 (TIC4862), SEQ ID NO:22 (TIC4863). Estes amplicons foram clonados Em um vetor de expressão de plasmídeo recombinante de Bacillus thuringiensis (Bt) a jusante de um promotor de expressão específico de esporulação e transformados em uma célula hospedeira Bt acristaliferosa. Os amplicons foram também clonados em um sistema de expressão de E. coli. As cepas recombinantes resultantes foram observadas expressando uma proteína recombinante.

EXEMPLO 2 Atividade de coleópteros de classe de proteína toxina relacionada a TIC3668

[00146] Este exemplo ilustra a atividade inibidora apresentada pelas proteínas tipo TIC3668 contra Coleoptera.

[00147] As preparações de proteína produzidas a partir de bactérias recombinantes como descrito no Exemplo 1, para as proteínas de comprimento completo de TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076 e TIC2462 foram submetidas a bioensaio de sobreposição na dieta do inseto contra Colorado Potato Beetle (Leptinotarsa decemlineata, CPB) e contra pelo menos uma espécie de verme de raiz de milho. Membros conhecidos da espécie verme de raiz de milho são Diabrotica virgifera virgifera (Western Corn Rootworm, WCR), Diabrotica barberi (Northern Corn Rootworm, NCR), Diabrotica virgifera zeae (Mexican Corn Rootworm, MCR), Diabrotica balteata (Brazilian Corn Rootworm (BZR), Diabrotica undecimpunctata howardii (Southern Corn Rootworm, SCR) e um complexo de Brazilian Corn Rootworm (BCR) que consiste em Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa).

[00148] Como demonstrado na Tabela 6, os resultados mostram que TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260 e TIC4076 apresentaram mortalidade contra o verme da raiz do milho. TIC2462 (SEQ ID NO: 62 que codifica a SEQ ID NO: 63), uma proteína estreitamente relacionada com a proteína AXMI-209 (em comparação com TIC2462, >99% idêntico ao nível dos aminoácidos, e que exibe apenas duas diferenças de aminoácidos), não apresentou mortalidade contra verme da raiz do milho, distinguindo, assim, a atividade da classe de proteína toxina tipo TIC3668 a partir de proteínas que se assemelham a AXMI- 209. Surpreendentemente, a mortalidade contra Colorado Potato Beetle, uma espécie tipicamente testada em bioensaios, como um indicador de atividade de Coleópteros, não foi observado para qualquer uma das proteínas testadas. Tabela 6. Mortalidade observada contra Pragas de insetos Coleópteros de Proteínas exemplares. + = Mortalidade observada - = Mortalidade não observada NT = Não testado

EXEMPLO 3 Forma madura da proteína toxina TIC3668

[00149] Este exemplo ilustra a presença de um peptídeo que transita na membrana no terminal amino das proteínas nativas dentro da classe proteína toxina TIC3668 e a descoberta de proteínas toxinas maduras ativas da classe de proteína toxina TIC3668.

[00150] Análise de bioinformática usando um programa SignalP (Petersen, et. al (2011), Nature Methods, 8:785-786) da tradução da sequência de aminoácidos a partir da sequência de codificação de TIC3668 (SEQ ID NO:1) previu a presença de um segmento que transita na membrana que corresponde aos primeiros 23 aminoácidos N-terminal.

[00151] Os experimentos foram desenhados para confirmar a presença de um segmento que transita na membrana dentro de cada membro da classe de proteína toxina tipo TIC3668. TIC3668 foi clonada em uma célula hospedeira Bt atrás de um promotor específico Bt de não esporulação. Os sobrenadantes de cultura resultantes foram testados quanto à atividade inseticida. Três formas de proteína correspondentes a TIC3668 foram recuperadas como uma mistura a partir do sobrenadante. Estes diferentes fragmentos de menos do que a proteína de comprimento completo TIC3668 foram depois determinados por espectrometria de massa e análise da sequência N- terminal para conter no seu respectivo amino terminal os aminoácidos 16, 19, ou 24, como estabelecido na SEQ ID NO: 2. Apenas uma pequena quantidade destas três formas truncadas de TIC3668 foi detectada no meio de cultura. A forma mais abundante da proteína detectada foi observada como tendo em seu amino terminal, a serina na posição 24, como estabelecido na SEQ ID NO: 2. A proteína concentrada e purificada a partir do sobrenadante de cultura apresentou bioatividade contra WCR quando testada em bioensaios de dieta artificial.

[00152] Diferentes construções de expressão foram criadas para identificar o menor segmento de peptídeo para cada proteína tipo TIC3668 que exibe atividade inseticida. Estas construções foram introduzidas em uma cepa de B. thuringiensis acristaliferosa ou uma cepa E. coli. Uma construção foi concebida para expressão da proteína TIC3668 de comprimento completo, como estabelecido na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido 1 a 317, em uma cepa de Bt acristaliferosa. As construções foram concebidas para expressão da proteína TIC3668 de comprimento completo, e várias formas mais curtas de variantes da proteína TIC3668, Em um sistema de expressão de E. coli tendo uma sequência HIS tag em carboxi terminal (HHHHAHHH). As construções concebidas para expressão em E. coli consistiram em: (1) uma construção concebida para expressar a proteína TIC3668 de comprimento completo como estabelecido em SEQ ID NO: 2 a partir da posição de aminoácidos 1 a 317; (2) uma construção concebida para expressar uma proteína TIC3668 variante tendo do aminoácido 16 a 317 como estabelecido na SEQ ID NO: 2; (3) uma construção concebida para expressar uma proteína TIC3668 variante a partir de amino ácido 24 a 317 como estabelecido na SEQ ID NO: 2; (4) uma construção desenhada para expressar uma proteína TIC3668 variante de aminoácido 26 até o aminoácido 317 como apresentado SEQ ID NO: 2; (5) uma construção concebida para expressar proteína TIC3668 variante de aminoácido 28 a 317 como estabelecido na SEQ ID NO: 2. Além disso, uma proteína TIC3668 com 10-his tag N-terminal e um sítio de protease TVMV (vírus do mosaico do tabaco) (MHHHHHHHHHHGTETVRFQ) foi obtida a partir do sistema de expressão em E. coli para produzir uma proteína TIC3668 com um início no resíduo no.24 como estabelecido na SEQ ID NO:2.

[00153] A proteína foi obtida a partir do sobrenadante do sistema de expressão de Bt e submetida a espectrometria de massa e análise da sequência N-terminal. O sistema de expressão de Bt produziu a prevista toxina madura TIC3668 a partir de ácido 24-317 como estabelecido na SEQ ID NO: 2. A proteína não foi observada nos sobrenadantes de E. coli. A proteína foi obtida a partir de cada um das respectivas construções de expressão de E. coli por choque osmótico para liberar as proteínas a partir do periplasma. As proteínas produzidas a partir das construções que foram concebidas para conter aminoácidos 16 ou 24, no amino terminal da proteína de menos do que o comprimento completo foram confirmadas como contendo estes aminoácidos no seu respectivo amino terminal. A proteína produzida a partir da construção concebida para expressar a TIC3668 de comprimento completo produziu a proteína madura de comprimento completo, que contém a serina na posição 24, como estabelecido na SEQ ID NO: 2, em amino terminal. As proteínas produzidas a partir de construções concebidas para conter qualquer aminoácido 26 ou aminoácido 28 como estabelecido na SEQ ID NO: 2 como o aminoácido N-terminal cada surpreendentemente continha apenas aminoácido 28 como o aminoácido N-terminal, sugerindo que o processamento que mantém o aminoácido número 24 como estabelecido na SEQ ID NO: 2 no N-terminal pode ser importante para a estabilidade da toxina.

[00154] As amostras de proteínas obtidas a partir destas análises de sistema de expressão foram submetidas a teste contra as larvas da lagarta da raiz do milho ocidental em bioensaios de sobreposição de dieta de inseto, como descrito no Exemplo 2. Certos truncamentos N- terminal deste estudo foram determinados como apresentado bioatividade reduzida. Especificamente, observou-se que a atividade inseticida foi significativamente reduzida quando o aminoácido do amino terminal foi 26 ou 28, como estabelecido na SEQ ID NO: 2. Pode ser extrapolado que outros membros da família de proteínas TIC3668 que são truncados em N-terminal como sendo mais curtos do que a proteína madura (começando no resíduo de amino ácidos no. 24 para TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078, TIC4260, TIC4346, TIC4826, e TIC4863; começando no aminoácido 13 para TIC4861; e começando no aminoácido 22 para TIC4862), são a versão mais curta das proteínas tipo TIC3668 testadas para mostrar atividade inseticida contra WCR. Todas as variantes de TIC3668 de comprimento igual ou maior do que a proteína madura mostraram alta atividade contra WCR, mesmo em concentrações relativamente baixas. Os dados também demonstram que o processamento em E. coli de TIC3668 varia por desenho da construção.

EXEMPLO 4 Síntese de genes que codificam proteínas do tipo TIC3668 para a expressão em plantas

[00155] As sequências de nucleotídeos que codificam o comprimento completo e versões maduras de uma proteína TIC3668, uma proteína TIC3669, uma TIC3670, uma TIC4076, TIC4078, uma proteína TIC4260, uma proteína TIC4346, uma proteína TIC4826, uma proteína TIC4861, uma proteína TIC4862, e uma proteína TIC4863 foram concebidas. As sequências de nucleotídeos que codificam TIC3668, TIC3669, e TIC3670 foram sintetizadas de acordo com métodos geralmente descritos na patente US 5.500.365, evitando determinadas sequências hostis problemas, como sequências ATTTA e sequência de poliadenilação de plantas ricas em A/T, enquanto preservando a sequência de aminoácidos da proteína nativa de B. laterosperous. Estas sequências de nucleotídeos são aqui fornecidas como SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, e SEQ ID NO:51 para as sequências de comprimento completo e SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, e SEQ ID NO:49 para as sequências maduras.

EXEMPLO 5 Cassetes de expressão para a expressão de proteínas tipo TIC3668 em plantas

[00156] Uma variedade de cassetes de expressão de plantas foi concebida com as sequências como estabelecido em SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, e SEQ ID NO:51.Tais cassetes de expressão são úteis para a expressão transitória em protoplastos de plantas ou transformação de células de plantas. Cassetes de expressão típicos foram concebidos no que diz respeito à eventual colocação da proteína dentro da célula. Um conjunto de cassetes de expressão foi concebido de forma a permitir que a proteína seja traduzida com o segmento N-terminal nativo. Outro conjunto de cassetes de expressão foi concebido para permitir a expressão da proteína sem o segmento N-terminal (ou seja, a proteína de comprimento maduro). Outro conjunto de cassetes de expressão foi concebido para ter um peptídeo de trânsito que expressa na estrutura e ligado operacionalmente à proteína toxina de comprimento maduro, para permitir o direcionamento para uma organela da célula como o cloroplasto ou plastídeo. Todos os cassetes de expressão foram concebidos para começar na extremidade 5' com um promotor que pode ser composto de vários elementos promotores contiguamente ligados, elementos potencializadores e outros elementos de expressão conhecidos dos especialistas na técnica para aumentar a expressão do transgene. A sequência do promotor foi geralmente seguida de forma contígua com uma ou mais sequências líder 3' para o promotor. Uma sequência de íntron foi fornecida 3' da sequência líder para melhorar a expressão do transgene. Uma sequência de codificação para a toxina ou o peptídeo de trânsito e a sequência de codificação para a toxina estava localizada 3' da configuração do promotor, líder e íntron. Uma sequência 3 'UTR foi fornecida 3' da sequência de codificação para facilitar a terminação da transcrição e fornece sequências importantes para a poliadenilação do transcrito resultante. Todos os elementos acima descritos foram dispostos de forma contígua com a sequência frequentemente adicional fornecida para a construção do cassete de expressão, como sítios de endonucleases de restrição ou sítios de clonagem de ligação independentes.

EXEMPLO 6 Vetores de transformação contendo cassete de expressão de proteínas tipo TIC3668

[00157] Vetores de transformação mediados por Agrobacterium foram construídos de modo a liberar o DNA para o genoma da planta que expressa as proteínas TIC3668, mTIC3668, TIC3669, mTIC3669, TIC3670, e mTIC3670.Os cassetes de expressão foram clonados em vetores adequados entre as sequências limítrofes de Agrobacterium tais que seriam transferidos para o genoma de uma célula de planta hospedeira por hospedeiros Agrobacterium contendo os vetores de construções junto com um gene marcador selecionável. Mais especificamente, o fragmento de restrição contendo o cassete de expressão citosólica inteiro que codifica uma das proteínas referenciadas acima, foi clonado Em um vetor de transformação de plantas por Agrobacterium. Agrobacterium. Da mesma forma, o fragmento de restrição contendo o cassete de expressão direcionado ao plastídeo inteiro foi clonado Em um vetor de transformação de plantas de Agrobacterium. Os vetores contendo os cassetes de expressão de proteína tipo TIC3668 (isto é, cassetes de direcionamento ou não direcionamento) são introduzidos em Agrobacterium por eletroporação ou por meio de cruzamentos triparentais.

[00158] Os cassetes de expressão contendo os genes artificiais que codificam TIC4076, TIC4078, TIC4260, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862, e TIC4863, cada um com e sem sequências que codificam os 23 aminoácidos N terminal presentes na região de leitura aberta de B. laterosperous nativo (aminoácidos 1-23 como determinado na SEQ ID NO:2), são clonados em vetores apropriados entre as sequências limítrofes de Agrobacterium de modo que são transferidos ao genoma de uma célula hospedeira e testados para expressão e bioatividade da proteína codificada.

EXEMPLO 7 Atividade para coleópteros de proteínas tipo TIC3668 em plantas

[00159] Este exemplo ilustra a atividade inibidora apresentada pelas proteínas tipo TIC3668 contra coleópteros, como larvas de verme da raiz do milho, quando expressas em plantas e fornecidas como uma dieta para a respectiva praga de insetos.

[00160] As plantas de milho transgênicas R0 expressando proteínas TIC3668, mTIC3668, TIC3669, mTIC3669, TIC3670, e mTIC3670 foram produzidas utilizando vetores contendo os cassetes de expressão descritos no Exemplo 5.

[00161] As plantas de milho transgênicas F1 foram cultivadas a partir de sementes produzidas por espigas de polinização de plantas de germoplasma comerciais não transformadas de tipo selvagem com pólen a partir de transformantes R0. Depois de serem transferidas para o solo em vasos engaiolados, as plantas F1 foram infestadas com insetos de vermes das raízes do milho neonatos e cultivadas durante 13 dias sob condições controladas. As classificações de danos da raiz (RDR) foram determinados usando a escala de classificação de 0-3 de Oleson, et al., em que 0 significa nenhum dano e 3 significa três ou mais nós são podados dentro de 1,5 polegadas do caule (J.D.Oleson, Y-L.Park, T.M.Nowatzki, J.J.Tollefson, “Node-Injury Scale to Evaluate Root Injury by Corn Rootworms”, Journal of Economic Entomology, 98(1):1-8, 2005).A mortalidade dos insetos foi avaliada pela contagem do número de larvas de terceiro instar remanescente no final do período de crescimento.

[00162] Em um primeiro conjunto de experimentos, as plantas que expressam as proteínas TIC3668, TIC3669, e TIC3670 de comprimento completo foram testadas contra WCR. Alguns dos eventos mostraram uma redução estatisticamente significativa na lesão de nós em comparação com o controle negativo com um valor médio de classificação de danos da raiz (RDR) entre 2 e 2,5, mas não foi observada nenhuma atividade comercialmente importante para as proteínas de comprimento completo.

[00163] Em um segundo conjunto de experimentos, as proteínas maduras mTIC3668 (SEQ ID NO: 23), mTIC3669 (SEQ ID NO: 24), e mTIC3670 (SEQ ID NO: 25), com ou sem um peptídeo direcionado ao cloroplasto foram expressas em plantas de milho e testadas contra WCR. A mortalidade de WCR significativa foi observada em cada proteína madura. Cada planta que expressa mTIC3668, mTIC3669, e mTIC3670, na presença e ausência de sequências de direcionamento adicionais mostrou uma redução estatisticamente significativa da lesão de nós em comparação com o controle negativo. A Figura 2 representa os valores médios de RDR para vários eventos para proteínas mTIC3668 e mTIC3669 e a Figura 3 representa o valor médio de RDR para vários eventos para mTIC3670 quando expressa em plantas de milho F1, independentemente se a proteína foi direcionada para o cloroplasto. "TS" no nome de evento das Figuras 2 e 3 indica a presença de uma sequência de direcionamento. Atividade comercialmente significativa foi observada para muitos desses eventos que expressam proteínas maduras mTIC3668, mTIC3669 e mTIC3670.

[00164] Surpreendentemente, a remoção do segmento de trânsito na membrana (aminoácidos 1-23 como estabelecido na SEQ ID NO: 2) a partir de proteínas tipo TIC3668 aumentou a eficácia contra o verme da raiz do milho quando expressa em plantas de milho. Quando expressas em plantas, as proteínas tipo TIC3668 de comprimento maduro demonstraram níveis elevados de atividade inseticida contra pragas de Coleópteros do que as proteínas de comprimento completo.

EXEMPLO 8 Atividade inseticida de proteínas relacionadas com TiC3668, expressas em milho, contra WCR resistente a Cry3Bb1

[00165] Este exemplo ilustra a atividade inseticida apresentada pelas proteínas tipo TIC3668 s contra uma cepa de verme da raiz do milho ocidental (WCR) que desenvolveu resistência à toxina Cry3Bb1Bt. As plantas de milho transgênicas F1 que expressam mTIC3668, mTIC3669 ou mTIC3670, produzidas utilizando métodos como descrito no Exemplo 7, foram infestadas com 2000 ovos de WCR da cepa Hopkinton por planta.

[00166] A cepa Hopkinton do verme da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) é uma cepa não diapausante com resistência desenvolvida em campo para Cry3Bb1 expressa em plantas de milho. A cepa originou-se a partir de amostras de WCR adultos obtidas a partir de campos que foram plantados com milho Cry3Bb1 durante sete anos consecutivos. A população foi novamente retrocruzada com uma cepa não diapausante de WCR três vezes e selecionada para resistência Cry3Bb1 três vezes (Gassmann, et al.(2011) PLoS ONE 6(7): e22629; Gassmann, et al.(2012) GM Crops Food 3(3):235-244). A colônia foi obtida a partir do laboratório do Dr. Aaron Gassman na Universidade Estadual de Iowa, e é mantida pelo grupo Monsanto Biotech Entomology em Chesterfield, MO.

[00167] Após a infestação, os ovos da cepa WCR-Hopkinton eclodiram dentro de 48 horas e os neonatos começaram a se alimentar das raízes. Após 24 dias, as raízes foram removidas do solo e danos da raiz do milho foram avaliados como descrito no Exemplo 7, utilizando a escala 0-3. Como mostrado na Tabela 7, as plantas que expressam mTIC3668, mTIC3669 e mTIC3670 foram altamente eficazes em proteger as raízes do milho de danos na presença de neonatos WCR da cepa Hopkinton em comparação com plantas de controle, superando, assim, a resistência de WCR à toxina Cry3Bb1. Tabela 7.RDR média em plantas de milho transgênicas infestadas com WCR resistente a Cry3Bb1 N: número de plantas avaliadas

EXEMPLO 9 Atividade inseticida de proteínas relacionadas com TIC3668, expressa em milho, contra infestação natural da WCR em locais de teste de campo

[00168] Este exemplo ilustra a eficácia reduzida aos danos da raiz apresentados por plantas de milho transgênicas que expressam proteínas tipo TIC3668 s contra infestações naturais de WCR em campos agrícolas no centro-oeste dos Estados Unidos.

[00169] As plantas de milho transgênico F1 expressando mTIC3668, mTIC3669 ou mTIC3670, produzidas utilizando métodos como descrito no Exemplo 7, foram plantadas em cinco locais no centro-oeste dos Estados Unidos durante o fim de Abril e no início de Maio. Ensaios nestes locais dependem de infestações naturais existentes para a pressão do verme lagarta da raiz do milho. Escavação de raiz, para avaliação de danos, foi concluída até o final de julho. O dano da larva da raiz foi determinado de acordo com a escala de nó-dano, como descrito no Exemplo 7.

[00170] Os resultados dos ensaios de escavação da raiz indicado que, sob condições práticas para a agricultura em campo aberto, plantas que expressam mTIC3668, mTIC3669 e mTIC3670 foram altamente eficazes em proteger as raízes do milho de danos na presença de pressão de larva da raiz de milho natural. A Tabela 8 mostra o número de plantas avaliadas (N), a RDR média e o erro padrão para plantas de teste quando as localizações são combinadas. Tabela 8. RDR média em plantas de milho transgênicas testadas em campo agrícola com Infestação natural de WCR

EXEMPLO 10 Atividade de lepidópteros de classe de proteína toxina relacionada a TIC3668

[00171] Este exemplo ilustra a atividade inibidora apresentada pelas proteínas tipo TIC3668 proteínas contra Lepidoptera. As preparações de proteína, como descrito no Exemplo 1, para as proteínas de comprimento completo de TIC3668, TIC3669 TIC3670, TIC4076, e TIC4078 foram submetidas a de dieta Black Cutworms (BCW, Agrotis ipsilon), Western Bean Cutworm (WBC, Striacosta albicosta), Corn Earworms (CEW, Helicoverpa zea), European Corn Borers (ECB, Ostrinia nubilalis), Sugarcane Borer (SCB, Diatraea saccharalis), Southwestern Corn Borer (SWC, Diatraea grandiosella), cabbage looper (CLW, Trichoplusia ni), soybean looper (SBL, Chrysodeixis includes), e Fall Armyworm (FAW, Spodoptera frugiperda).Os protocolos e métodos de preparação e realização de bioensaios de proteínas inibidoras são conhecidos na técnica.

[00172] A atividade contra certas pragas de insetos Lepidópteros foi observada para certas proteínas tipo TIC3668 como demonstrado na Tabela 9. Tabela 9. Nanismo observado contra Pragas de insetos Lepidópteros de Proteínas exemplares. + = nanismo observado ++= nanismo e mortalidade - = Mortalidade não observada NT = Não testado

EXEMPLO 11 Atividade de lepidóptero das proteínas tipo TIC3668 em plantas

[00173] Este exemplo ilustra a atividade inibidora das proteínas de tipo TIC3668 para ECB, SWC, BCW, FAW, CEW, SBL quando expressas em plantas e fornecidas como uma dieta para respectivas pragas de insetos.

[00174] Os bioensaios contra pragas de lepidópteros utilizando discos de folhas de plantas foram realizados de forma semelhante como descrito na patente US 8.344.207 em TIC3668, TIC3669, e TIC3670 expressando plantas de milho R0.A classificação de danos à folha (LDR) foi atribuída uma pontuação de classificação com base no percentual do disco da folha consumido pelo inseto em uma escala de 0 (0% consumido) a 11 (mais do que 50%) consumido. Etapas de pontuação de classificação aumentam de forma incremental em 5%. Plantas R0 que não contêm proteínas inseticidas serviram como controles negativos. A expressão citossólica da proteína do tipo TIC3668 de comprimento completo reduziu danos contra CEW, FAW e SWC em relação ao controle não transformado. A expressão citossólica da proteína TIC3670 reduziu danos de alimentação contra SWC em relação ao controle não transformado.

EXEMPLO 12 Criação da proteína de colagem TIC4260

[00175] Este exemplo descreve a criação de uma sequência de gene com base nos membros da família de TIC3668. A variação de aminoácidos de cinco das proteínas do tipo TIC3668 nativas foi combinada para criar uma nova proteína de colagem, TIC4260 (SEQ ID NO: 12), que apresenta uma diversidade de sequência de aminoácidos diferente em comparação com as proteínas que ocorrem naturalmente. A Figura 1 mostra o alinhamento de cinco proteínas de tipo TIC3668 nativas com TIC4260. As posições da diversidade de sequência são destacadas em sombreado cinzento neste alinhamento de sequências. Uma sequência de polinucleotídeo artificial foi construída (SEQ ID NO: 11) que codifica a proteína TIC4260. A proteína madura TIC4260 (mTIC4260, SEQ ID NO: 28) é codificada pela sequência de polinucleotídeos como estabelecido na SEQ ID NO: 43.

[00176] Os alinhamentos semelhantes das outras proteínas do tipo TIC3668 podem ser feitos, a fim de criar novas proteínas que exibem atividade tóxica para Lepidoptera e/ou Coleoptera. Estas novas proteínas são expressas, purificadas e testadas contra insetos lepidópteros e coleópteros em bioensaios da dieta. Os cassetes de expressão para estas novas proteínas são criados e transformados em plantas para expressar estas proteínas para controlar pragas de plantas lepidópteros e coleópteros.

[00177] Todas as composições e métodos aqui descritos e reivindicados podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente descrição. Enquanto as composições e métodos desta invenção foram descritas em termos de modalidades ilustrativas anteriores, será evidente para os especialistas na técnica que as variações, alterações, modificações, e alterações podem ser aplicadas à composição, métodos, e em nas etapas ou na sequência de etapas dos métodos aqui descritos, sem se afastar do verdadeiro conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será aparente que certos agentes que são quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes aqui descritos enquanto os mesmos ou semelhantes resultados seriam atingidos. Todos os substitutos e modificações semelhantes aparentes para os especialistas na técnica são consideradas como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações anexas.

[00178] Deve ser aparente para aqueles especialistas na técnica que estas variações de sequências diferentes melhoradas podem ser combinadas para criar variantes que estão também dentro do escopo da presente invenção.

[00179] as publicações e documentos de patente publicados citados no relatório descritivo são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente particular fosse especificamente e individualmente indicado como estando incorporado por referência.

Claims

1. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 43 operacionalmente ligada a um promotor heterólogo, sendo que a sequência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo inibidor de inseto.

2. Célula hospedeira bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende o cassete de expressão, como definido na reivindicação 1.

3. Composição inibidora de inseto, caracterizada pelo fato de que compreende o cassete de expressão, como definido na reivindicação 1.

4. Composição inibidora de inseto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo recombinante inibidor de inseto compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28.

5. Método para controlar uma praga de espécie Coleoptera, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende contatar a referida praga com uma quantidade inibidora de inseto da composição inibidora de inseto, como definida na reivindicação 3.

6. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o cassete de expressão, como definido na reivindicação 1.

7. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido vetor é selecionado do grupo consistindo em um plasmídeo, um bacmídeo, um fagomídeo e um cosmídeo.