JP2017536122A - 新規の昆虫抑制タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる2014年11月20日に出願された米国仮特許出願62/082,504の利益を主張する。
配列表のコンピュータで読み取りできる形態を電子申請によってここに添付して出願する。配列表は、その全体が参照によって組み入れられ、2015年11月13日に作成され、ファイル名称「MONS387WO_ST25.txt」を有し、(MS−ウインドウズの操作システムで測定すると)114kbのサイズであるファイルに含有されている。
本発明は一般に昆虫抑制タンパク質の分野に関する。作物及び種子の農業関連の害虫に対する昆虫抑制活性を示す新規のクラスのタンパク質が開示される。特に、開示されているクラスのタンパク質は、作物及び種子の農業関連の害虫、特に鱗翅目種及び鞘翅目種の害虫に対して殺虫活性がある。開示されている毒素タンパク質の1以上をコードする組換えポリヌクレオチド構築物を含有する植物、植物部位及び種子が提供される。
配列番号1は、ヌクレオチドの1〜951位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC3668タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
農業上の害虫駆除の当該技術における課題は、標的害虫に対して有効であり、標的害虫種に対して広い範囲の毒性を示し、望ましくない農業問題を生じることなく植物で発現させることができ、植物で商業的に使用されている現在の毒素と比べて代替の作用機序を提供する新しい毒素タンパク質のニーズとして特徴付けることができる。TIC3668によって例示される新規の殺虫タンパク質が本明細書で開示され、これらのニーズのそれぞれに対処し、詳しくは、広い範囲の鞘翅目及び鱗翅目の害虫、さらに詳しくはコーンルートワーム害虫種に対して対処する。
互いに比べたとき、異なる特質、たとえば、推測される毒性、プロテオームの多様性、及び形態的な変異を示す細菌株を特定し、当該技術で周知の方法を用いてゲノムの配列決定のために調製した。試験管内のバイオアッセイにて鞘翅目の昆虫に対して抑制活性を示すタンパク質TIC3668(配列番号2)はBrevibacillus laterosporus(B.laterosporous)のEG5552株から発見された。他の株もTIC3668に類似するタンパク質を含有することが見いだされた。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドのセグメントをクローニングし、組換え宿主株に挿入して発現について調べた。
この実施例は鞘翅目に対するTIC3668様タンパク質によって示される抑制活性を説明する。
−=致死性が観察されなかった
NT=調べなかった
この実施例はTIC3668タンパク質毒素クラスの範囲内でのネイティブなタンパク質のアミノ末端における膜通過ペプチドの存在及びTIC3668タンパク質毒素クラスの活性がある成熟毒素タンパク質の発見を説明する。
TIC3668タンパク質、TIC3669タンパク質、TIC3670、TIC4076、TIC4078、TIC4260タンパク質、TIC4346タンパク質、TIC4826タンパク質、TIC4861タンパク質、TIC4862タンパク質、及びTIC4863タンパク質の完全長型及び成熟型をコードするヌクレオチド配列を設計した。米国特許第5,500,365号に一般に記載されている方法に従ってTIC3668、TIC3669及びTIC3670をコードするヌクレオチド配列を合成し、ATTTA及びA/Tが豊富な植物のポリアデニル化配列のような特定の好ましくない問題の配列を回避する一方で、ネイティブのB.laterosperousのタンパク質のアミノ酸配列を保存した。これらのヌクレオチド配列は本明細書では、完全長配列については配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、及び配列番号51として、ならびに成熟配列については配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、及び配列番号49として提供されている。
配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51にて示されるような配列によって種々の植物発現カセットを設計した。そのような発現カセットは、植物のプロトプラストにおける一時的な発現または植物細胞の形質転換に有用である。典型的な発現カセットは細胞内でのタンパク質の最終的な置き換えに関して設計された。発現カセットのセットの1つはタンパク質がネイティブなN末端セグメントと共に翻訳されるような方法で設計された。発現カセットの別のセットは、N末端セグメントを伴わずに(すなわち、成熟長のタンパク質)タンパク質の発現を可能にするように設計された。発現カセットの別のセットは、インフレームで発現され、且つ成熟長の毒素タンパク質に操作可能に連結される輸送ペプチドを有して葉緑体または色素体のような細胞の小器官への標的化を可能にするように設計された。発現カセットはすべて、複数の隣接して連結されるプロモータ要素、エンハンサー要素または当業者に既知の他の発現要素で構成されて導入遺伝子の発現を増強するプロモータを伴った5’末端で開始するように設計された。プロモータ配列には普通隣接して、プロモータに対して3’での1以上のリーダー配列が続く。リーダー配列に対して3’でイントロン配列が提供されて導入遺伝子の発現を改善する。毒素または輸送ペプチドについてのコード配列及び毒素についてのコード配列は、プロモータ、リーダー及びイントロンの構成で3’に位置した。コード配列の3’に3’UTR配列が提供されて転写の終結を促し、得られた転写物のポリアデニル化に重要な配列を提供する。上述の要素のすべては、たとえば、制限エンドヌクレアーゼ部位またはライゲーションに無関係なクローニング部位のような発現カセットの構築に提供される追加であることが多い配列と隣接して配置された。
TIC3668、mTIC3668、TIC3669、mTIC3669、TIC3670、及びmTIC3670のタンパク質を発現するDNAを植物ゲノムに送達するようにagrobacteriumが介在する形質転換ベクターを構築した。発現カセットは、それらが選択可能なマーカー遺伝子と共に構築物ベクターを含有するagrobacterium宿主によって宿主植物細胞のゲノムに移されるように、agrobacteriumの境界配列間で好適なベクターにクローニングした。さらに具体的には、上記で参照したタンパク質の1つをコードする細胞質の発現カセット全体を含有する制限断片をagrobacterium植物形質転換ベクターにクローニングした。同様に、色素体を標的とする発現カセット全体を含有する制限断片をagrobacterium植物形質転換ベクターにクローニングした。TIC3668型タンパク質の発現カセット(すなわち、標的とされないカセットまたは標的とされるカセット)を含有するベクターをエレクトロポレーションまたは三親交配によってagrobacteriumに導入する。
この実施例は、植物で発現され、各害虫に餌として提供された際、鞘翅目のたとえばコーンルートワームの幼虫に対してTIC3668様タンパク質によって示される抑制活性を説明する。
この実施例は、Bt毒素Cry3Bb1への耐性を獲得しているウエスタンコーンルートワーム(WCR)の株に対するTIC3668様タンパク質によって示される殺虫活性を説明する。実施例7に記載されているような方法を用いて作出した、mTIC3668、mTIC3669及びmTIC3670を発現しているF1トランスジェニックのトウモロコシ植物に植物当たりHopkinton株の2000個のWCR卵を寄生させた。
この実施例は、米国中西部の圃場におけるWCRの自然寄生に対するTIC3668関連のタンパク質を発現しているトランスジェニックのトウモロコシ植物によって示された低下した根損傷の有効性を説明する。
この実施例は、鱗翅目に対するTIC3668様タンパク質によって示される抑制活性を説明する。TIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4076及びTIC4078の完全長のタンパク質について実施例1に記載されているようなタンパク質調製物を、タマナヤガ(BCW、Agrotis ipsilon)、ウエスタンビーンカットワーム(WBC、Striacosta albicosta)、オオタバコガ(CEW、Helicoverpa zea)、ヨーロッパアワノメイガ(ECB、Ostrinia nubilalis)、サトウキビメイガ(SCB、Diatraea saccharalis)、サウスウエスタンマツマダラメイガ(SWC、Diatraea grandiosella)、キャベツシャクトリムシ(CLW、Trichoplusia ni)、ダイズシャクトリムシ(SBL、Chrysodeixis includes)、及びツマジロクサヨトウ(FAW、Spodoptera frugiperda)に対する昆虫餌オーバーレイバイオアッセイに供した。抑制タンパク質バイオアッセイを調製し、実施するプロトコール及び方法は当該技術で既知である。
++=成長阻害及び致死性
−=致死性が観察されなかった
NT=調べなかった
この実施例は、植物で発現させ、餌として各害虫に提供された際のECB、SWC、BCW、FAW、CEW、SBLに対するTIC3668型タンパク質の抑制活性を説明する。
この実施例は、TIC3668のファミリーメンバーに基づく新規の遺伝子配列の創作を教示する。ネイティブなTIC3668型タンパク質の5つに由来するアミノ酸変異を組み合わせて、天然に存在するタンパク質と比べて異なるアミノ酸配列の多様性を示す新規のコラージュタンパク質TIC4260(配列番号12)を作り出した。図1はTIC4260との5つのネイティブなTIC3668型タンパク質の配列比較を示す。この配列比較では、配列多様性の位置を灰色の陰影付けにて強調する。TIC4260タンパク質をコードする人工のポリヌクレオチド配列を構築した(配列番号11)。成熟TIC4260タンパク質(mTIC4260、配列番号28)は配列番号43で示されるようなポリヌクレオチド配列によってコードされる。
Claims (23)
- 昆虫抑制ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド分子であって、
(a)配列番号25、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、及び配列番号31から成る群から選択されるアミノ酸配列、または
(b)配列番号25、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、及び配列番号31から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列を含む、前記組換えポリヌクレオチド分子。 - (a)配列番号37、配列番号33、配列番号35、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、及び配列番号72から成る群から選択されるヌクレオチド配列;
(b)配列番号37、配列番号33、配列番号35、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、及び配列番号72から成る群から選択されるヌクレオチド配列に対する少なくとも80%の同一性を含むヌクレオチド配列;または
(c)ストリンジェント条件下で、
(i)配列番号37、配列番号33、配列番号35、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、及び配列番号72から成る群から選択される配列の4〜885位のヌクレオチド配列の逆相補体、もしくは
(ii)配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、及び配列番号61から成る群から選択される配列の逆相補体
とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含み、
前記ストリンジェント条件が50%ホルムアミド、1MのNaCl及び1%のSDSにて37Cで4〜12時間のハイブリッド形成及び60C〜65Cでの0.1×SSCにおける洗浄を含む請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子。 - 異種プロモータに操作可能に連結される、請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子。
- 請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子によってコードされる昆虫抑制組換えポリペプチド。
- 前記昆虫抑制組換えポリペプチドが
(a)配列番号25、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、及び配列番号31から成る群から選択されるアミノ酸配列、または
(b)配列番号25、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、及び配列番号31から成る群から選択されるアミノ酸配列に対する少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチド。 - 前記昆虫抑制組換えポリペプチドが鞘翅目の昆虫種に対して抑制活性を示す請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチド。
- 鞘翅目の前記昆虫種がウエスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、メキシカンコーンルートワーム、ブラジリアンコーンルートワーム、またはDiabrotica viridulaとDiabrotica speciosaとから成るブラジリアンコーンルートワーム複合群である請求項6に記載の昆虫抑制組換えポリペプチド。
- 前記昆虫抑制組換えポリペプチドが鱗翅目の昆虫種に対して抑制活性を示す請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチド。
- 鱗翅目の前記種が、ヨーロッパアワノメイガ、サウスウエスタンアワノメイガ、タマナヤガ、ツマジロクサヨトウ、コーンイアーワーム及びダイズシャクトリムシから成る群から選択される請求項8に記載の昆虫抑制組換えポリペプチド。
- 請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が細菌宿主細胞及び植物宿主細胞から成る群から選択される、前記宿主細胞。
- 請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子を含む昆虫抑制組成物。
- さらに、前記昆虫抑制ポリペプチドとは異なる少なくとも1つの他の農薬をコードするヌクレオチド配列を含む請求項11に記載の昆虫抑制組成物。
- 前記少なくとも1つの他の農薬が、昆虫抑制タンパク質、昆虫抑制dsRNA分子及び補助タンパク質から成る群から選択される請求項12に記載の昆虫抑制組成物。
- 前記少なくとも1つの他の農薬が、鱗翅目、鞘翅目または半翅目の1以上の害虫種に対する活性を示す請求項13に記載の昆虫抑制組成物。
- 前記少なくとも1つの他の農薬が、Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry3A、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、VIP3A、及びVIP3Bタンパク質から成る群から選択される請求項14に記載の昆虫抑制組成物。
- 昆虫抑制に有効な量で請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチドを含む昆虫抑制組成物。
- 鞘翅目種の害虫の防除方法であって、前記方法が前記害虫を昆虫抑制の量での請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチドに接触させることを含む、前記防除方法。
- 請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子または請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチドを含む種子。
- 請求項10に記載の宿主細胞を含むコモディティ製品であって、前記コモディティ製品が、検出可能な量の前記組換えポリヌクレオチドまたは前記組換えポリヌクレオチドによってコードされる昆虫抑制組換えポリペプチドを含む、前記コモディティ製品。
- 請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子を含む種子の生産方法であって、前記方法が、
(a)前記組換えポリヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの種子を植え付けることと、
(b)前記種子から植物を生育させることと、
(c)前記植物から種子を収穫することとを含み、前記収穫された種子が前記組換えポリヌクレオチド分子を含む、前記生産方法。 - 請求項3に記載の組換えポリヌクレオチド分子を含む組換えベクター。
- 前記ベクターが、プラスミド、バクミド、ファージミド及びコスミドから成る群から選択される請求項21に記載の組換えベクター。
- 昆虫の寄生に耐性の植物であって、前記植物の細胞が請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子または請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチドを含む、前記植物。
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