ES2861596T3 - Nuevas proteínas inhibidoras de insectos - Google Patents

Abstract

Una molécula de polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido inhibidor de insectos que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25; o (b) una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 98 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y que comprende además la actividad inhibidora de insectos del polipéptido de (a).

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevas proteínas inhibidoras de insectos

Campo de la invención

La invención se refiere en general al campo de las proteínas inhibidoras de insectos. Se desvela una nueva clase de proteínas que presentan actividad inhibidora de insectos contra plagas de semillas y plantas de cultivo relevantes para la agricultura. En particular, la clase de proteínas desvelada es activa desde el punto de vista insecticida contra plagas de semillas y plantas de cultivo relevantes para la agricultura, en particular, especies plaga de insectos lepidópteros y coleópteros. Se proporcionan plantas, partes de plantas y semillas que contienen una construcción de polinucleótido recombinante que codifica una o más de las proteínas toxina desveladas.

Antecedentes de la invención

Mejorar el rendimiento del cultivo de plantas significativas para la agricultura que incluyen, entre otras, maíz, soja, caña de azúcar, arroz, trigo, hortalizas y algodón, se ha vuelto cada vez más importante. Además de la creciente necesidad de productos agrícolas para alimentar, vestir y proporcionar energía a una población humana en constante crecimiento, se prevé que los efectos relacionados con el clima y la presión de una población cada vez mayor para utilizar la tierra con fines diferentes de las prácticas agrícolas reducirán la cantidad de tierra cultivable disponible para la agricultura. Estos factores han conducido a pronósticos desalentadores acerca de la seguridad de los alimentos, particularmente en ausencia de mejoras importantes en biotecnología vegetal y prácticas agronómicas. A la luz de estas presiones, las mejoras sustentables desde el punto de vista medioambiental en la tecnología, las técnicas agrícolas y el manejo de plagas son herramientas fundamentales para expandir la producción de cultivos en la cantidad limitada de tierra cultivable disponible para la agricultura.

Se considera que los insectos, en particular los que están dentro del orden Lepidoptera y Coleóptera, son una de las causas principales del daño a los cultivos, disminuyendo, de esa forma, el rendimiento de los cultivos en las áreas infestadas. Las especies plaga de lepidópteros que afectan negativamente a la agricultura incluyen, pero sin limitación, Helicoverpa zea, Ostrinia nubilalis, Diatraea saccharalis, Diatraea grandiosella, Anticarsia gemmatalis, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Agrotis ipsilon, Trichoplusia ni, Chrysodeixis includens, Heliothis virescens, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Helicoverpa armigera, Elasmopalpus lignosellus, Striacosta albicosta y Phyllocnistis citrella. Las especies plaga de coleópteros que afectan negativamente a la agricultura incluyen, pero sin limitación, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma spp., particularmente cuando la plaga es Diabrotica virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz del oeste, GMO), Diabrotica barben (gusano de la raíz del maíz del norte, GMN), Diabrotica virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mejicano, GMM), Diabrotica balteata (gusano de la raíz del maíz brasileño, GMB), Diabrotica undecimpunctata howardii (gusano de la raíz del maíz del sur, GMS) y un complejo del gusano de la raíz del maíz brasileño, CMB, que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa).

Históricamente, la aplicación intensiva de insecticidas químicos sintéticos constituía el agente de control de plagas en la agricultura. Las preocupaciones por el medio ambiente y la salud humana, además de nuevos problemas de resistencias, estimularon la investigación y el desarrollo de plaguicidas biológicos. Este esfuerzo de investigación llevó al descubrimiento y uso progresivos de diversas especies microbianas entomopatógenas, entre ellas bacterias.

El paradigma del control biológico cambió cuando se descubrió y desarrolló el potencial de las bacterias entomopatógenas, especialmente las bacterias pertenecientes al género Bacillus, como agente biológico de control de plagas. Se han utilizado cepas de la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) como fuente de proteínas que presentan actividad pesticida desde que se descubrió que las cepas de Bt muestran una alta toxicidad contra insectos específicos. La principal característica de las Bt es la producción de cuerpos parasporales que contienen uno o más cristales que contienen endotoxinas insecticidas específicas (proteínas Cry) que actúan sobre la ingestión por parte de un insecto susceptible mediante un mecanismo de acción formador de poros, nocivo para el epitelio intestinal del insecto. Además de Bt, otras especies de Bacillus, tales como Bacillus sphaericus, y otras especies de bacterias que contienen genes que contribuyen a un fenotipo entomopatógeno, tales como Brevibacillus laterosporus, han mostrado potencial para el manejo de plagas.

Se han empleado proteínas toxina insecticidas en diversas aplicaciones agrícolas para preservar plantas importantes para la agricultura y aumentar el rendimiento. Las proteínas toxina insecticidas se utilizan para controlar plagas de plantas de cultivos relevantes para la agricultura a través de procedimientos mecánicos, tales como pulverización, para dispersar formulaciones microbianas que contienen diversas cepas de bacterias sobre la superficie de las plantas, y la utilización de técnicas de transformación genética para producir plantas y semillas transgénicas que expresen la proteína toxina insecticida.

El uso de plantas transgénicas que expresan proteínas toxina insecticidas se ha adaptado en todo el mundo. Por ejemplo, en 2012 se plantaron 26,1 millones de hectáreas con cultivos transgénicos que expresan toxinas de Bt (James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. Informe del ISAAA N.° 44). El uso extendido de cultivos transgénicos protegidos contra insectos y el número limitado de proteínas toxina insecticidas disponibles comercialmente está creando una presión de selección de alelos que imparten resistencia a las proteínas insecticidas utilizadas actualmente. El desarrollo de resistencia en las plagas objetivo a las proteínas toxina insecticidas disminuye la eficacia y las ventajas de esta tecnología. Tales ventajas incluyen un mayor rendimiento del cultivo, una reducción del uso de pesticidas químicos y de los costos y el trabajo asociados con el uso de estos.

El descubrimiento y desarrollo de nuevas formas de proteínas toxina insecticidas resulta central para el manejo del aumento de la resistencia de los insectos a los cultivos transgénicos que expresan proteínas toxina insecticidas. Las nuevas toxinas proteicas con eficacia mejorada y que presenten control sobre un espectro más amplio de especies de insectos susceptibles reducirán el número de insectos supervivientes que puedan desarrollar alelos de resistencia. Además, dos o más toxinas transgénicas tóxicas para la misma plaga de insectos y que presenten distintos modos de acción en una planta reducen aún más la probabilidad de resistencia en una especie de insecto objetivo.

En consecuencia, existe una imperiosa necesidad de descubrir y desarrollar proteínas de insecticidas eficaces con propiedades insecticidas mejoradas, tales como una eficacia aumentada contra un espectro más amplio de plagas de insectos objetivo y diferentes modos de acción en comparación con las proteínas conocidas en la técnica. En la presente solicitud, se desvela una nueva familia de toxinas proteicas de Brevibacillus laterosporus (B. laterosporus), junto con proteínas toxina similares, proteínas variantes y proteínas recombinantes ilustrativas que presentan actividad insecticida contra especies plaga objetivo significativas de lepidópteros y coleópteros, particularmente contra el gusano de la raíz del maíz del oeste.

Sumario de la invención

En el presente documento se desvela un nuevo grupo de moléculas de polinucleótido recombinante inhibidoras de insectos y los polipéptidos (proteínas de toxina) codificados por estas, denominadas en el presente documento proteínas de tipo TIC3668, que han demostrado presentar actividad inhibidora contra una o más plagas de plantas de cultivos. Cada proteína se puede utilizar sola o combinadas entre sí y con otras proteínas insecticidas y agentes tóxicos, en formulaciones y en la planta, proporcionando así alternativas a las proteínas insecticidas y los productos químicos insecticidas actualmente en uso en los sistemas agrícolas.

En un aspecto, la invención proporciona una molécula de polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido inhibidor de insectos, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25. En una realización, la molécula de polinucleótido recombinante codifica un polipéptido inhibidor de insectos que comprende al menos un 96 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25. En otra realización, la molécula de polinucleótido recombinante comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 37. En otra realización más, la molécula de polinucleótido recombinante comprende al menos un 80 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 37. En una realización adicional, la molécula de polinucleótido recombinante comprende una secuencia que hibrida en condiciones rigurosas con: (i) el complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la posición 4-885 de la secuencia de la SEQ ID NO: 37; o (ii) el complemento inverso de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57. En otra realización, las condiciones de hibridación son condiciones rigurosas, por ejemplo, tales condiciones rigurosas pueden comprender una hibridación de 4 a 12 horas en formamida al 50 %, NaCl 1 M y SDS al 1 % a 37 C y un lavado en SSC 0,1 X a 60 C-65 C. En una realización adicional, la molécula de polinucleótido recombinante está unida operativamente a un promotor heterólogo.

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido recombinante inhibidor de insectos codificado por la molécula de polinucleótido recombinante como se describe anteriormente.

En una realización adicional, el polipéptido recombinante inhibidor de insectos presenta actividad inhibidora contra una especie de insecto del orden Coleoptera, por ejemplo, que incluye el gusano de la raíz del maíz del oeste, el gusano de la raíz del maíz del sur, el gusano de la raíz del maíz del norte, el gusano de la raíz del maíz mejicano, el gusano de la raíz del maíz brasileño o el complejo del gusano de la raíz del maíz brasileño que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa.

En aún otro aspecto, la invención proporciona una célula hospedadora que comprende una molécula de polinucleótido recombinante de la invención, en la que la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en una célula hospedadora bacteriana y una célula hospedadora vegetal. En determinadas realizaciones, las células hospedadoras bacterianas incluyen Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus thuringiensis, Brevibacillus lacterosporus, Bacillus cereus, E. coli, Pseudomonas, Klebsiella y Erwinia. En otras realizaciones, las células vegetales incluyen una célula vegetal de alfalfa, banana, cebada, haba, brócoli, col, Brassica, zanahoria, mandioca, ricino, coliflor, apio, garbanzo, col china, cítricos, coco, café, maíz, trébol, algodón, una curcubitácea, pepino, abeto de Douglas, berenjena, eucalipto, lino, ajo, uva, lúpulo, puerro, lechuga, pino Taeda, mijo, melones, nuez, avena, oliva, cebolla, ornamental, palma, pastos, guisante, maní, pimienta, caqui, gandú, pino, granada, álamo, patata, zapallo, pino de California, rábano, colza, arroz, rizoma, centeno, cártamo, arbusto, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, maíz dulce, liquidámbar americano, boniato, pasto varilla, té, tabaco, tomate, triticale, césped, sandía y trigo.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición inhibidora de insectos que puede comprender una molécula de polinucleótido recombinante de la presente invención. En una realización, la composición inhibidora de insectos puede incluir además una secuencia de nucleótidos que codifica al menos otro agente pesticida. En determinadas realizaciones, el al menos otro agente pesticida es diferente del polipéptido inhibidor de insectos de tipo TIC3668 de la invención y se puede seleccionar del grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, una molécula de ARNbc inhibidora de insectos y una proteína auxiliar. En otras realizaciones, el otro agente plaguicida presenta actividad contra una o más especies plaga de los órdenes de Lepidoptera, Coleóptera o Hemiptera. En determinadas realizaciones, el otro agente pesticida se selecciona del grupo que consiste en una proteína Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1B, CrylC, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, CrylJ, CrylK, CrylL, Cry2A, Cry2Ab, Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cryl5, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, VIP3A y VIP3B. En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición inhibidora de insectos que comprende un polipéptido recombinante inhibidor de insectos de la presente invención, tal como un polipéptido inhibidor de insectos de tipo TIC3668, en una cantidad inhibidora de insectos eficaz.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para controlar una plaga de especies de coleópteros o lepidópteros, y para controlar una infestación de una planta por una plaga de especies de coleópteros o lepidópteros, por ejemplo, una planta de cultivo, en el que el procedimiento comprende poner en contacto la plaga con una cantidad inhibidora de insectos del polipéptido recombinante inhibidor de insectos de la invención, tal como un polipéptido inhibidor de insectos de tipo TIC3668.

En un aspecto adicional más, la invención proporciona una semilla que comprende una molécula de polinucleótido recombinante o polipéptido recombinante inhibidor de insectos, tal como un polipéptido inhibidor de insectos de tipo TIC3668 de la invención.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un vector recombinante que comprende la molécula de polinucleótido recombinante de la invención. En una realización, el vector recombinante se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un bácmido, un fagómido y un cósmido.

En otro aspecto, la invención proporciona una planta resistente a la infestación de insectos, en la que las células de dicha planta comprenden la molécula de polinucleótido recombinante o el polipéptido inhibidor de insectos recombinante de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el alineamiento de la proteína collage TIC4260 con cinco proteínas de tipo TIC3668 de ejemplo. Las posiciones de diversidad de secuencias se resaltan en gris en este alineamiento de secuencias.

La Figura 2 ilustra la actividad inhibidora del gusano de la raíz del maíz del oeste (GMO) en la planta de proteínas de tipo TIC3668 de longitud madura direccionadas y no direccionadas al cloroplasto de ejemplo.

La Figura 3 ilustra la actividad inhibidora del GMO en la planta de una proteína de tipo TIC3668 de longitud madura direccionada y no direccionada al cloroplasto de ejemplo.

Descripción breve de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína TIC3668 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótidos 1-951 y un codón de terminación de la traducción.

La SEQ ID NO: 2 es la traducción de la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora TIC3668 a partir del marco de lectura abierto como se expone en la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína TIC3669 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótidos 1-951 y un codón de terminación de la traducción.

La SEQ ID NO: 4 es la traducción de la secuencia de aminoácidos de la proteína TIC3669 a partir del marco de lectura abierto como se expone en la SEQ ID NO: 3.

La SEQ ID NO: 5 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína TIC3670 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótidos 1-951 y un codón de terminación de la traducción.

La SEQ ID NO: 6 es la traducción de la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora TIC3670 a partir del marco de lectura abierto como se expone en la SEQ ID NO: 5.

La SEQ ID NO: 7 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína TIC4076 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótidos 1-951 y un codón de terminación de la traducción.

La SEQ ID NO: 8 es la traducción de la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora TIC4076 a partir del marco de lectura abierto como se expone en la SEQ ID NO: 7.

La SEQ ID NO: 9 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína TIC4078 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótidos 1-951 y un codón de terminación de la traducción.

La SEQ ID NO: 10 es la traducción de la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora TIC4078 a partir del marco de lectura abierto como se expone en la SEQ ID NO: 9.

La SEQ ID NO: 11 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína collage TIC4260 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótido 1-951 y un codón de terminación de la traducción, creada por combinación de segmentos de ADN de cada una de las secuencias codificantes expuestas en la SEQ ID n O: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 9 en fase para incluir las variaciones de secuencia de estos cinco marcos de lectura abiertos diferentes.

La SEQ ID NO: 12 es la traducción de la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora de la proteína collage TIC4260 a partir del marco de lectura abierto, como se expone en la SEQ ID NO: 11.

La SEQ ID NO: 13 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína TIC4346 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótidos 1-951 y un codón de terminación de la traducción.

La SEQ ID NO: 14 es la traducción de la secuencia de aminoácidos a partir del marco de lectura abierto, como se expone en la SEQ ID NO: 13.

La SEQ ID NO: 15 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína TIC4826 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótidos 1-951 y un codón de terminación de la traducción.

La SEQ ID NO: 16 es la traducción de la secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto como se expone en la SEQ ID NO: 15.

La SEQ ID NO: 17 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína TIC4861 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótidos 1-918 y un codón de terminación de la traducción.

La SEQ ID NO: 18 es la traducción de la secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto como se expone en la SEQ ID NO: 17.

La SEQ ID NO: 19 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína TIC4862 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótidos 1-945 y un codón de terminación de la traducción.

La SEQ ID NO: 20 es la traducción de la secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto como se expone en la SEQ ID NO: 19.

La SEQ ID NO: 21 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína TIC4863 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótidos 1-951 y un codón de terminación de la traducción.

La SEQ ID NO: 22 es la traducción de la secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto como se expone en la SEQ ID NO: 21.

La SEQ ID NO: 23 es una secuencia de aminoácidos de una proteína TIC3668 madura, mTIC3668

La SEQ ID NO: 24 es una secuencia de aminoácidos de una proteína TIC3669 madura, mTIC3669

La SEQ ID NO: 25 es una secuencia de aminoácidos de una proteína TIC3670 madura, mTIC3670

La SEQ ID NO: 26 es una secuencia de aminoácidos de una proteína TIC4076 madura, mTIC4076

La SEQ ID NO: 27 es una secuencia de aminoácidos de una proteína TIC4078 madura, mTIC4078

La SEQ ID NO: 28 es una secuencia de aminoácidos de una proteína TIC4260 madura, mTIC4260

La SEQ ID NO: 29 es una secuencia de aminoácidos de una proteína TIC4346 madura, mTIC4346

La SEQ ID NO: 30 es una secuencia de aminoácidos de una proteína TIC4826 madura, mTIC4826.

La SEQ ID NO: 31 es una secuencia de aminoácidos de una proteína TIC4861 madura, mTIC4891.

La SEQ ID NO: 32 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC3668 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 33 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC3668 madura, mTIC3668 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 34 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC3669 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 35 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC3669 madura, mTIC3669 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 36 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC3670 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 37 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC3670 madura, mTIC3670 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 38 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4076 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 39 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4076 madura, mTIC4076 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 40 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4078 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 41 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4078 madura, mTIC4078 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 42 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4260 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 43 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4260 madura, mTIC4260 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 44 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4346 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 45 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4346 madura, mTIC4346 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 46 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4826 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 47 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4826 madura, mTIC4826 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 48 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4861 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 49 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4861 madura (mTIC4861), una proteína TIC4862 madura (mTIC4862) y una proteína TIC4863 madura (mTIC4863), diseñadas para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 50 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4682 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 51 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4863 diseñada para la expresión en plantas.

La SEQ ID NO: 52 es una secuencia de nucleótidos que representa un oligonucleótido sintético para hibridar con la cadena (-) de un ADN que codifica una proteína desvelada en la presente solicitud y correspondiente a las posiciones 1 a 36 de la Se Q ID NO: 1 (cebador directo de TIC3668).

La SEQ ID NO: 53 es una secuencia de nucleótidos que representa un oligonucleótido sintético para hibridar con la cadena (+) de un ADN que codifica una proteína desvelada en la presente solicitud y correspondiente a las posiciones 920 a 954 de la SEQ ID NO: 1 (cebador inverso de TIC3668).

La SEQ ID NO: 54 es una secuencia de nucleótidos que representa un oligonucleótido sintético para hibridar con la cadena (-) de un ADN que codifica una proteína desvelada en la presente solicitud y correspondiente a las posiciones 1 a 41 de la Se Q ID NO: 3 (cebador directo de TIC3669).

La SEQ ID NO: 55 es una secuencia de nucleótidos que representa un oligonucleótido sintético para hibridar con la cadena (+) de un ADN que codifica una proteína desvelada en la presente solicitud y correspondiente a las posiciones 920 a 954 de la SEQ ID NO: 3 (cebador inverso de TIC3669).

La SEQ ID NO: 56 es una secuencia de nucleótidos que representa un oligonucleótido sintético para hibridar con la cadena (-) de un ADN que codifica una proteína desvelada en la presente solicitud y correspondiente a las posiciones 1 a 36 de la Se Q ID NO: 5 (cebador directo de TIC3670).

La SEQ ID NO: 57 es una secuencia de nucleótidos que representa un oligonucleótido sintético para hibridar con la cadena (+) de un ADN que codifica una proteína desvelada en la presente solicitud y correspondiente a las posiciones 920 a 954 de la SEQ ID NO: 5 (cebador inverso de TIC3670).

La SEQ ID NO: 58 es una secuencia de nucleótidos que representa un oligonucleótido sintético para hibridar con la cadena (-) de un ADN que codifica una proteína desvelada en la presente solicitud y correspondiente a las posiciones 1 a 41 de la Se Q ID NO: 7 (cebador directo de TIC4076).

La SEQ ID NO: 59 es una secuencia de nucleótidos que representa un oligonucleótido sintético para hibridar con la cadena (+) de un ADN que codifica una proteína desvelada en la presente solicitud y correspondiente a las posiciones 920 a 954 de la SEQ ID NO: 7 (cebador inverso de TIC4076).

La SEQ ID NO: 60 es una secuencia de nucleótidos que representa un oligonucleótido sintético para hibridar con la cadena (-) de un ADN que codifica una proteína desvelada en la presente solicitud y correspondiente a las posiciones 1 a 36 de la SeQ ID NO: 9 (cebador directo de TIC4078).

La SEQ ID NO: 61 es una secuencia de nucleótidos que representa un oligonucleótido sintético para hibridar con la cadena (+) de un ADN que codifica una proteína desvelada en la presente solicitud y correspondiente a las posiciones 920 a 954 de la SEQ ID NO: 9 (cebador inverso de TIC4078).

La SEQ ID NO: 62 es una secuencia de polinucleótido recombinante obtenida de una especie de Brevibacillus laterosporus que codifica una proteína TIC2462 a partir de un marco de lectura abierto en la posición de nucleótidos 1-951 y un codón de terminación de la traducción.

La SEQ ID NO: 63 es la traducción de la secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto como se expone en la SEQ ID NO: 62.

La SEQ ID NO: 64 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína

madura, mTIC3668, para la expresión en bacterias.

La SEQ ID NO: 65 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC3669 madura, mTIC3669, para la expresión en bacterias.

La SEQ ID NO: 66 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC3670 madura, mTIC3670, para la expresión en bacterias.

La SEQ ID NO: 67 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4076 madura, mTIC4076, para la expresión en bacterias.

La SEQ ID NO: 68 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4078 madura, mTIC4078, para la expresión en bacterias.

La SEQ ID NO: 69 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4260 madura, mTIC4260, para la expresión en bacterias.

La SEQ ID NO: 70 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4346 madura, mTIC4346, para la expresión en bacterias.

La SEQ ID NO: 71 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína TIC4826 madura, mTIC4826, para la expresión en bacterias.

La SEQ ID NO: 72 es una secuencia sintética de nucleótidos que codifica una proteína madura TIC4861 (mTIC4861), TIC4862 (mTIC4862) y TIC4863 (mTIC4863) para la expresión en bacterias.

Descripción detallada de la invención

El problema en la técnica de control de plagas agrícolas puede caracterizarse como una necesidad de nuevas proteínas toxina que sean eficaces contra plagas objetivo, que presenten una toxicidad de amplio espectro contra especies plaga objetivo, que tangan la capacidad de expresarse en las plantas sin provocar problemas agronómicos indeseables y que proporcionen un modo alternativo de acción en comparación con las toxinas actuales que se utilizan comercialmente en las plantas. En el presente documento se desvelan proteínas insecticidas nuevas ejemplificadas por TIC3668, y se aborda cada una de estas necesidades, en particular contra un amplio espectro de plagas de insectos coleópteros y lepidópteros, y más particularmente contra las especies plaga del gusano de la raíz del maíz.

La referencia en la presente solicitud a "TIC3668", "proteína TIC3668", "toxinas proteicas TIC3668", "proteínas toxina TIC3668", "toxinas relacionadas con TIC3668", "clase o familia de toxinas proteicas relacionadas con TIC3668", "proteínas toxina relacionadas con TIC3668", "proteínas de tipo TIC3668", "proteínas similares a TIC3668", "polipéptidos de toxinas relacionados con TIC3668", "proteínas pesticidas relacionadas con TIC3668" o "polipéptido inhibidor de insectos de tipo TIC3668", y similares, se refieren a cualquier proteína inhibidora de insectos nueva que comprenda, que consista en, que sea sustancialmente homóloga a, que sea similar a, o que proceda de cualquier secuencia de polipéptido inhibidora de insectos de TIC3668 (SEQ ID NO: 2) y segmentos inhibidores de insectos de la misma, o combinaciones de los mismos, que confieran una actividad contra plagas de coleópteros y plagas de lepidópteros, incluyendo cualquier proteína que presente una actividad inhibidora de insectos si el alineamiento de tal proteína con TIC3668 (SEQ ID NO: 2), TIC3669 (SEQ ID NO: 4), TIC3670 (SEQ ID NO: 6), TIC4076 (SEQ ID NO: 8), TIC4078 (SEQ ID NO: 10), TIC4346 (SEQ ID NO: 14), TIC4826 (SEQ ID NO: 16), TIC4861 (SEQ ID N0: 18), TIC4862 (SEQ ID NO: 20) y TIC4863 (SEQ ID NO: 22), da como resultado una identidad de secuencia de aminoácidos de cualquier fracción de porcentaje de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 100 % por ciento. Las toxinas proteicas de tipo TIC3668 desveladas en la presente solicitud incluyen TIC3668, TIC3669, TIC3670. TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TTC4861, TIC4862, TIC4863, y la proteína collage TIC4260 (SEQ ID NO: 12). La clase de proteínas de tipo TIC3668 está destinada a incluir las formas precursoras, así como las formas de longitud maduras de las proteínas.

El término "segmento" o "fragmento" se utiliza en la presente solicitud para describir secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos consecutivas que son más cortas que la secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico completa que describe una proteína de tipo TIC3668. En la presente solicitud también se desvela un segmento o fragmento que presenta actividad inhibidora de insectos si el alineamiento de tal segmento o fragmento, con la sección correspondiente de la proteína de tipo TIC3668 expuesta en la SEQ ID NO: 2, da como resultado una identidad de secuencia de aminoácidos de cualquier fracción de porcentaje de aproximadamente un 35 a aproximadamente un 100 por ciento entre el segmento o fragmento y la sección correspondiente de la proteína de tipo TIC3668.

Referencia en la presente solicitud a las expresiones "activo" o "actividad", "actividad pesticida" o "actividad insecticida", "inhibidor de insectos" o "insecticida" se refieren a la eficacia de un agente tóxico, tal como una toxina proteica, en la inhibición (inhibir el crecimiento, la alimentación, la fecundidad o la viabilidad), la supresión (suprimir el crecimiento, la alimentación, la fecundidad o la viabilidad), el control (control de la infestación de plagas, el control de las actividades de alimentación de plagas en un cultivo particular que contiene una cantidad eficaz de la proteína de tipo TIC3668) o la destrucción (provocando la morbilidad, la mortalidad o la reducción de la fecundidad) de una plaga. Estos términos pretenden incluir el resultado de la proporción de una cantidad plaguicidamente eficaz de una proteína tóxica a una plaga, donde la exposición de la plaga a la proteína tóxica da como resultado la morbilidad, la mortalidad, la fecundidad reducida o atrofia. Estos términos también incluyen la repulsión de la plaga de la planta, un tejido de la planta, una parte de la planta, semilla, células vegetales o de la ubicación geográfica particular donde la planta puede estar creciendo, como resultado de proporcionar una cantidad plaguicidamente eficaz de la proteína tóxica en o sobre la planta. En general, actividad pesticida se refiere a la capacidad de una proteína tóxica para ser eficaz en la inhibición del crecimiento, desarrollo, viabilidad, comportamiento de alimentación, comportamiento de apareamiento, fecundidad o cualquier disminución medible de los efectos adversos provocados por la alimentación del insecto con esta proteína, fragmento de proteína, segmento de proteína o polinucleótido, de una plaga objetivo en particular, incluyendo, pero sin limitación, insectos del orden Lepidoptera o Coleóptera. La planta puede producir la proteína tóxica o esta puede aplicarse a la planta o al entorno dentro de la ubicación donde se encuentra la planta. Los términos "bioactividad", "eficaz", "efectivo" o variaciones de los mismos son también términos que se utilizan indistintamente en la presente solicitud para describir los efectos de las proteínas de la presente invención sobre plagas de insectos objetivo.

Una cantidad plaguicidamente eficaz de un agente tóxico, cuando se proporciona en la alimentación de una plaga objetivo, presenta actividad pesticida cuando el agente tóxico entra en contacto con la plaga. Un agente tóxico puede ser una proteína pesticida o uno o más agentes químicos conocidos en la técnica. Los agentes químicos insecticidas y los agentes proteicos insecticidas pueden utilizarse solos o en combinaciones entre sí. Los agentes químicos incluyen, pero sin limitación, moléculas de ARNbc dirigidas a genes específicos para la supresión de una plaga objetivo, organoclorados, organofosfatos, carbamatos, piretroides, neonicotinoides y rianoides. Los agentes proteicos insecticidas incluyen las toxinas proteicas expuestas en la presente solicitud, así como otros agentes tóxicos proteináceos incluyendo los que se dirigen a lepidópteros y coleópteros, así como toxinas proteicas que se utilizan para controlar otras plagas de plantas tales como las proteínas Cry disponibles en la técnica para su uso en el control de especies de hemípteros y homópteros.

Se entiende que la referencia a una plaga, particularmente una plaga de una planta de cultivo, significa plagas de insectos de plantas de cultivo, particularmente las que se controlan mediante la clase de toxinas proteicas relacionadas con TIC3668. Sin embargo, la referencia a una plaga también puede incluir plagas de plantas de insectos hemípteros y homópteros, así como nematodos y hongos cuando los agentes tóxicos dirigidos a estas plagas colocalizan o están presentes junto con una o más proteínas de la clase de toxinas proteicas relacionadas con TIC3668.

Las proteínas individuales que comprenden la clase de proteínas relacionadas con TIC3668 están relacionadas por una función común y presentan actividad insecticida hacia plagas de insectos de especies de insectos de Coleóptera y Lepidoptera, incluyendo adultos, pupas, larvas y los recién nacidos. Los insectos del orden Lepidoptera incluyen, pero sin limitación, gusanos ejército, gusanos cortadores, orugas agrimensoras, y Heliothis de la familia Noctuidae, por ejemplo, gusano cogollero (Spodoptera frugiperda), guardama de la remolacha (Spodoptera exigua), gusano soldado bertha (Mamestra configurata), gusano cortador negro (Agrotis ipsilon), oruga agrimensora del repollo (Trichoplusia ni), oruga agrimensora de la soja (Pseudoplusia includens), oruga del haba terciopelo (Anticarsia gemmatalis), verde del trébol (Hypena scabra), gusano cogollero del tabaco (Heliothis virescens), gusano cortador granulado (Agrotis subterranea), gusano cogollero (Pseudaletia unipuncta), gusano cortador occidental (Agrotis orthogonia); perforadores, orugas de vaina, palomillas, gusano de la piña, gusano de la col y polillas de la familia Pyralidae, por ejemplo, barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), gusano de ombligo naranja (Amyelois transitella), gusano telarañero de la raíz del maíz (Crambus caliginosellus), gusano telarañero de césped (Herpetogramma licarsisalis), polilla del girasol (Homoeosoma electellum), barrenador menor del tallo de maíz (Elasmopalpus lignosellus); enrolladores de hoja, gusanos de las yemas, gusanos de semillas y gusanos de la fruta de la familia Tortricidae, por ejemplo, gusano de la manzana (Cydia pomonella), polilla de la baya de la uva (Endopiza viteana), polilla oriental de la fruta (Grapholita molesta), polilla de la yema del girasol (Suleima helianthana) y muchos otros lepidópteros de importancia económica, por ejemplo, la polilla de la col (Plutella xylostella), gusano rosado (Pectinophora gossypiella) y la polilla gitana (Lymantria dispar). Otras plagas de insectos del orden de Lepidoptera incluyen, por ejemplo, Alabama argillacea (gusano de la hoja de algodón), Archips argyrospila (rodillo de la hoja del árbol de la fruta), Archips rosana (piral de los brotes) y otras especies de Archips, Chilo suppressalis (barrenador asiático de arroz o barrenador del tallo de arroz), Cnaphalocrocis medinalis (rodillos de la hoja de arroz), Crambus caliginosellus (gusano telarañero de raíz de maíz), Crambus teterrellus (gusano telarañero de pasto azul), Diatraea grandiosella (barrenador del maíz del suroeste), Diatraea saccharalis (barrenador de la caña de azúcar), Earias insulana (gusano espinoso), Earias vittella (gusano peludo), Helicoverpa armigera (gusano americano), Helicoverpa zea (gusano del maíz o gusano del algodón), Heliothis virescens (gusano del tabaco), Herpetogramma licarsisalis (gusano telarañero de césped), Lobesia botrana (polilla de la uva), Phyllocnistis citrella (minador de los cítricos), Pieris brassicae (mariposa blanca grande), Pieris rapae (oruga de la col o blanquita de la col), Plutella xylostella (polilla de la col), Spodoptera exigua (gardama de la remolacha), Spodoptera litura (rosquilla negra, gusano negro) y Tuta absoluta (minador del tomate). Los insectos del orden de Coleoptera incluyen, pero sin limitación, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma spp., particularmente cuando la plaga es Diabrotica virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz del oeste, GMO), Diabrotica barben (gusano de la raíz del maíz del norte, GMN), Diabrotica virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mejicano, GMM), Diabrotica balteata (gusano de la raíz del maíz brasilero (GMB), Diabrotica undecimpunctata howardii (gusano de la raíz del maíz sureño, GMS) y un complejo del gusano de la raíz del maíz brasilero (GMB) que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa).

La referencia en la presente solicitud a una "molécula de ADN aislada", "molécula de polinucleótido aislada", o una expresión o frase equivalente, pretende referirse a que la molécula de ADN es una que está presente sola o en combinación con otras composiciones, pero no dentro de su entorno natural. Por ejemplo, los elementos de ácidos nucleicos tales como una secuencia codificante, secuencia intrónica, secuencia líder no traducida, secuencia de promotor, secuencia de terminación de la transcripción, y similares, que se encuentran naturalmente en el ADN del genoma de un organismo, no se consideran "aisladas" siempre y cuando el elemento esté dentro del genoma del organismo y en la ubicación dentro del genoma en la que se encuentra de forma natural. Sin embargo, cada uno de estos elementos, y subpartes de estos elementos, estaría "aislado" dentro del ámbito de la presente divulgación, siempre y cuando el elemento no esté dentro del genoma del organismo y en la ubicación dentro del genoma en la que se encuentra de forma natural. Del mismo modo, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida o cualquier variante insecticida de origen natural de esa proteína sería una secuencia de nucleótidos aislada, siempre y cuando la secuencia de nucleótidos no esté dentro del ADN de la bacteria en la que se encuentra de forma natural la secuencia que codifica la proteína. Una secuencia de nucleótidos sintética que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína insecticida de origen natural sería considerada aislada para los fines de esta divulgación. Para los fines de la presente divulgación, cualquier secuencia de nucleótidos transgénica, es decir, la secuencia de nucleótidos del ADN insertado en el genoma de las células de una planta o bacteria, o presente en un vector extracromosómico, se consideraría una secuencia de nucleótidos aislada ya sea esté presente dentro del plásmido o estructura similar utilizada para transformar las células, dentro del genoma de la planta o bacteria, o presentes en cantidades detectables en los tejidos, la progenie, muestras biológicas o productos de materias primas obtenidas de la planta o bacteria.

Como se describe adicionalmente en la presente solicitud, se descubrió un marco de lectura abierto (ORF, forma siglada de open reading frame) (SEQ ID NO: 1) que codifica a TIC3668 (SEQ ID NO: 2) en el ADN obtenido a partir de Brevibacillus laterosporus cepa EG5552. A continuación, se exploraron otros genomas bacterianos en cuanto a secuencias que codifican una proteína relacionada con TIC3668. Varios otros marcos de lectura abierto se identificaron en estos otros genomas bacterianos que codifican secuencias de aminoácidos que se asemejan a la proteína TIC3668 de EG5552, incluidas las proteínas similares a TIC3668 TIC3669 que se descubrieron en el ADN obtenido de Brevibacillus laterosporus cepa EG5551 (SEQ ID NO: 3 que codifica la SEQ ID NO: 4), TIC3670 que se descubrió en el ADN obtenido a partir de Brevibacillus laterosporu cepa EG5553 (SEQ ID NO: 5 que codifica la SEQ ID NO: 6), TIC4076 que se descubrió en el ADN obtenido a partir de Brevibacillus laterosporus cepa ATCC6456 (SEQ ID NO: 7 que codifica la SEQ ID NO: 8), TIC4078 que se descubrió en el ADN obtenido a partir de Brevibacillus laterosporus cepa EG4227 (SEQ ID NO: 9 que codifica la SEQ ID NO: 10), TIC4346 que se descubrió en el ADN obtenido a partir de Brevibacillus laterosporus cepa EG5551 (SEQ ID NO: 13 que codifica la SEQ ID NO: 14), TIC4826 que se descubrió en el ADN obtenido a partir de Brevibacillus laterosporus cepa AG0021D10 (SEQ ID NO: 15 que codifica la SEQ ID NO: 16), TIC4861 (SEQ ID NO: 17 que codifica la SEQ ID NO: 18), TIC4862 (SEQ ID NO: 19 que codifica la SEQ ID NO: 20) y TIC4863 (SEQ ID NO: 21 que codifica la SEQ ID NO: 22), que se descubrieron en el ADN obtenido de Brevibacillus laterosporus cepa EG4227. Una proteína similar a TIC3668 adicional, TIC4260 (SEQ ID NO: 11 que codifica la SEQ ID NO: 12), se creó por la combinación de la variación de la secuencia de aminoácidos de origen natural de cinco proteínas nativas similares a TIC3668 diferentes para crear una proteína collage.

Las secuencias codificantes respectivas se clonaron y se expresaron en células hospedadoras microbianas para producir proteínas recombinantes para su uso en bioensayos de insectos. Como se describe adicionalmente en la presente solicitud, se demuestra que estas proteínas presentan bioactividad frente a especies de Diabrotica, incluyendo el gusano de la raíz del maíz del oeste (GMO, Diabrotica virgifera virgifera), el barrenador del maíz del oeste europeo (BMOE, Ostrinia nubialis), el barrenador del maíz del suroeste (BMSO, Diatraea grandiosella) y la oruga agrimensora de la soja (OAS, Chrysodeixis includens).

Una característica sorprendente de las proteínas de tipo TIC3668 es la presencia de un segmento de aminoácidos N-terminal correspondiente a la posición de aminoácidos 1 a 23 para TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078, TIC4260, TIC4346, TIC4826, TIC4863; 1 a 12 para TIC4861 y de 1 a 21 para TIC4862. Cada uno de estos segmentos de aminoácidos N-terminales pueden omitirse de la proteína respectiva y la secuencia de polinucleótido que codifica el segmento respectivo también puede omitirse. Cuando se expresaron en la planta, la omisión de estos segmentos respectivos sorprendentemente dio como resultado un aumento de la actividad insecticida contra las especies de gusano de la raíz del maíz en comparación con la expresión de la toxina proteica de longitud completa que contiene el segmento omitido. Los segmentos de toxina proteica que carecen de los segmentos de aminoácidos N-terminales a los que se hace referencia anteriormente se denominan en el presente documento "proteínas toxina de tipo TIC3668 maduras". En general, la referencia a la versión madura de una proteína de tipo TIC3668 se indica en el presente documento con la letra "m" que precede al nombre de la toxina, para diferenciar la referencia a la secuencia madura de la referencia a la secuencia nativa de longitud completa. Por ejemplo, la versión madura de la secuencia de aminoácidos para TIC3668 (SEQ ID NO: 2) es mTIC3668 (SEQ ID NO: 23). Las versiones maduras para TIC3669 (SEQ ID NO: 4), TIC3670 (SEQ ID NO: 6), TIC4076 (SEQ ID NO: 8), TIC4078 (SEQ ID NO: 10), TIC4260 (SEQ ID NO: 12), TIC4346 (SEQ ID NO: 14) y TIC4826 (SEQ ID NO: 16) son mTIC3669 (SEQ ID NO: 24), mTIC3670 (SEQ ID NO: 25), mTIC4076 (SEQ ID NO: 26), mTIC4078 (SEQ ID NO: 27), mTIC4260 (SEQ ID NO: 28), mTIC4346 (SEQ ID NO: 29) y mTIC4826 (SEQ ID NO: 30), respectivamente. Las proteínas de longitud completa TIC4861 (SEQ ID NO: 18), TIÓ4862 (SEQ iD NO: 20) y TIC4863 (SEQ ID NO: 22) son variantes de longitud de secuencia entre sí y sólo difieren en la longitud de su segmento de aminoácidos N-terminal. La eliminación del segmento de aminoácidos N-terminal en TIC4861, TIC4862, y TIC4863 crea una secuencia de aminoácidos madura idéntica para mTIC4861, mTIC4862 y mTIC4863. Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos para mTIC4861, mTIC4862, y mTIC4863 están codificadas por la misma secuencia de polinucleótido (mTIC4861, SEQ ID NO: 31). Las secuencias de proteínas similares a TlC3668 maduras están codificadas por la Se Q ID NO: 64 (que codifica mTIC3668), la SEQ ID NO: 65 (que codifica mTIC3669), la SEQ ID NO: 66 (que codifica mTIC3670), la Se Q ID NO: 67 (que codifica mTIC4076), la SEQ ID NO: 68 (que codifica mTIC4078), la SEq ID NO: 69 (que codifica mTIC4260), la SEQ ID NO: 70 (que codifica mTIC4346), la SEQ ID NO: 71 (que codifica mTIC4826) y la SEQ ID NO: 72 (que codifica mTIC4861, mTIC4862 y mTIC4863) para la expresión en huéspedes bacterianos.

Se pueden crear miembros adicionales de la familia de tipo TIC3668 utilizando las variaciones de aminoácidos de origen natural de algunos o todos los miembros de la familia para crear proteínas nuevas de un nivel más alto de diversidad de secuencia de aminoácidos y con propiedades nuevas. Las variantes de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 se produjeron mediante el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de miembros de la familia de tipo TIC3668 y la combinación de diferencias a nivel de la secuencia de aminoácidos en una nueva secuencia de aminoácidos, y haciendo los cambios apropiados en los polinucleótidos que codifican estas variantes. Un ejemplo de esto es TIC4260. La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de polinucleótido que codifica la proteína TIC4260 (SEQ ID NO: 12). La proteína madura (mTIC4260, SEQ ID NO: 28) está codificada por la secuencia de polinucleótido de la SEQ ID NO: 43.

Los fragmentos de las toxinas proteicas de tipo TIC3668 pueden ser formas truncadas en las que uno o más aminoácidos se delecionan del extremo N-terminal, el extremo C-terminal, del medio de la proteína, o combinaciones de las mismas con actividad inhibidora de insectos. Estos fragmentos pueden ser de origen natural o variantes sintéticas de TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 o TIC4863, pero deben conservar o mejorar la actividad inhibidora de insectos de TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 o TIC4863. Las variantes de deleción N-terminal o C-terminal truncadas incluyen, pero sin limitación, las proteínas TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 o TIC4863 que carecen de restos de aminoácido del extremo N y/o del extremo C. Por ejemplo, los restos de aminoácido N-terminales 1 a 23 de una proteína TIC3668 se pueden delecionar, dando como resultado una proteína toxina que tiene los aminoácidos 24-317 de la SEQ ID NO: 2. La eliminación de 10 o 20 aminoácidos del extremo de aminoácidos C-terminal de una proteína TIC3668 dio como resultado una pérdida de actividad insecticida, mientras que la eliminación de un solo aminoácido no afectó a la actividad.

Las proteínas de la clase proteína de tipo TIC3668, y las proteínas que se asemejan a las proteínas de la clase de proteínas de tipo TIC3668, pueden identificarse por comparación entre sí utilizando diversos algoritmos basados en ordenador conocidos en la técnica (véanse las Tablas 1 y 2). Las identidades de secuencia de aminoácidos informadas en el presente documento son el resultado de un alineamiento de Clustal W utilizando estos parámetros por defecto: Matriz de peso: blosum, penalización por apertura de hueco: 10,0, penalización por extensión de hueco: 0,05, huecos hidrófilos: aplicado, restos hidrófilos: GPSNDQERK, penalizaciones de hueco específicos para restos: Aplicado (Thompson, y col. (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). La identidad de aminoácidos porcentual se calcula adicionalmente por el producto de 100 % multiplicado por (identidades de aminoácidos/longitud de la proteína objeto). También están disponibles en la técnica otros algoritmos de alineamiento y proporcionan resultados similares a los obtenidos utilizando un alineamiento de Clustal W.

Se pretende que una proteína que presenta actividad inhibidora de insectos contra una especie de insecto lepidóptero sea un miembro de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 si la proteína se utiliza en una consulta, por ejemplo, en un alineamiento de Clustal W, y al menos una de las proteínas que se exponen como mTIC4260 se identifica como que acierta en tal alineamiento en que la proteína de consulta presenta al menos de aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos a lo largo de la longitud de la proteína de consulta, es decir el 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, o cualquier fracción de porcentaje en este intervalo; o al menos una de las proteínas que se exponen como mTIC3668 se identifica cómo que acierta en tal alineamiento en que la proteína de consulta presenta al menos de aproximadamente el 89 % a aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos a lo largo de la longitud de la proteína de consulta, es decir el 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, o cualquier fracción de porcentaje en este intervalo; o al menos una de las proteínas que se exponen como mTIC3669 y/o mTIC3670 se identifican como que acierta en tal alineamiento en que la proteína de consulta presenta al menos de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos a lo largo de la longitud de la proteína de consulta, es decir el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, o cualquier fracción de porcentaje en este intervalo; o al menos una de las proteínas que se exponen como mTIC4826 se identifica cómo que acierta en tal alineamiento en que la proteína de consulta presenta al menos de aproximadamente el 91 % a aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos a lo largo de la longitud de la proteína de consulta, es decir el 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, o cualquier fracción de porcentaje en este intervalo.

Se pretende que una proteína que presenta actividad inhibidora de insectos contra una especie de insecto coleóptero sea un miembro de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 si la proteína se utiliza en una consulta, por ejemplo, en un alineamiento de Clustal W, y al menos una de las proteínas que se exponen como mTIC3668, mTIC3669, mTIC3670, mTIC4076, mTIC4078, mTIC4260, mTIC4346, mTIC4826, mTIC4861, mTIC4862 y mTIC4863 se identifica como que acierta en tal alineamiento en que la proteína de consulta presenta al menos de aproximadamente el 35 % a aproximadamente el 100 % de identidad de aminoácidos a lo largo de la longitud de la proteína de consulta, es decir de aproximadamente el 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, o cualquier fracción de porcentaje en este intervalo.

Las proteínas de ejemplo de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 se alinearon entre sí utilizando un algoritmo Clustal W. Se creó una matriz por parejas de identidades de secuencia de aminoácidos porcentuales para cada pareja de proteínas de longitud completa, como se informa en la Tabla 1. Se creó una matriz por parejas de identidades de secuencia de aminoácidos porcentuales para cada pareja de proteínas de longitud madura. como se informa en la Tabla 2.

Descripción de la Tabla: El alineamiento de Clustal W entre (X) e (Y) se informa en una matriz por parejas. Las columnas debajo de (N) se refieren a la SEQ ID NO. La columna (M) se refiere al nombre de la proteína (n.° de TIC). Se calcula el porcentaje de identidad de aminoácidos entre todas las parejas y está representado por el primer número en cada celda. El segundo número (entre paréntesis) en cada celda representa el número de aminoácidos idénticos entre la pareja.

Tabla 2. Presentación de la matriz por parejas de proteínas maduras de ejemplo

Descripción de la Tabla: El alineamiento de Clustal W entre (X) e (Y) se informa como una matriz entre parejas. Las columnas debajo de (N) se refieren a SEQ ID NO. La columna (M) se refiere al nombre de la proteína (n.° de TlC). Se calcula la identidad de aminoácidos porcentual entre todas las parejas y se representa por el primer número en cada celda. El segundo número (entre paréntesis) en cada celda representa el número de aminoácidos idénticos entre la pareja.

Las proteínas maduras y de longitud completa de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 también pueden relacionarse por estructura primaria (motivos de aminoácidos conservados), por la longitud (aproximadamente 295 aminoácidos para las proteínas maduras y aproximadamente 317 aminoácidos para las proteínas de longitud completa) y por otras características. Las proteínas de longitud completa de la presente invención tienen una masa medida de aproximadamente 35 kDalton cuando se corren en geles de proteínas en condiciones de desnaturalización, y las proteínas maduras tienen una masa medida de aproximadamente 32 kDa. Las características de las formas maduras y de longitud completa de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 se describen en las Tablas 3 y 4.

Tabla 3 - Características de la proteína de longitud completa

Tabla 4 - Características de la proteína madura

Las proteínas de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 desveladas representan una nueva clase de proteínas insecticidas. Con referencia a la Tabla 5, todos los números por encima de la línea diagonal correspondiente al 100 % de identidad, representan el número de diferencias de aminoácidos entre las proteínas correspondientes que se comparan en la intersección de esa fila y columna en particular. Los números debajo de la línea diagonal correspondiente al 100 % de identidad representan el porcentaje de identidad de las proteínas correspondientes que se comparan en la intersección de esa fila y columna en particular. Los miembros de longitud madura de esta clase de proteínas no presentan más del 90,54 % de identidad de aminoácidos con cualquier otra proteína insecticida conocida en la técnica, como se demuestra en la alineación proporcionada en la Tabla 5. La proteína insecticida que presenta la identidad más cercana a cualquiera de las proteínas de longitud madura es la SEQ ID NO: 50 en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Número de Publicación 20110030093 (AXMI-209) con el 90,5% de identidad de secuencia con mTIC4076, mTIC4346, mTIC4826 y mTIC4863. La presente divulgación solo enseña actividad contra Lepidoptera, mientras que las proteínas de ejemplo demuestran actividad contra Coleóptera. H0UDD3_BRELA, F7TVP6_BRELA y U4WSU1_BRELA son secuencias de proteínas no anotadas predichas a partir del marco de lectura abierto en secuencias genómicas informadas como obtenidas de B. laterosporous. No se informa actividad insecticida para estas proteínas.

Tabla 5 - Alineamiento de proteínas TIC3886 de longitud madura con proteínas de la técnica anterior

Las proteínas TIC3668 desveladas en la presente solicitud presentan actividad en bioensayos de alimentación contra Coleóptera, incluyendo GMO. En algunos casos, se puede observar actividad en lepidópteros.

Como se describe adicionalmente en los Ejemplos de la presente solicitud, las secuencias de polinucleótidos que codifican las proteínas toxina TIC3668 se diseñaron para su uso en plantas. Los polinucleótidos de ejemplo que se diseñaron para la expresión en plantas y que codifican la longitud completa de las proteínas inhibidoras de insectos, TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 y TIC4863 se exponen en la SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51. Los polinucleótidos de ejemplo que se diseñaron para la expresión en plantas y que codifican una forma madura de las proteínas inhibidoras de insectos, mTIC3668, mTIC3669, mTIC3670, mTIC4260, mTIC4076, mTIC4078, mTIC4346, mTIC4826, mTIC4861, mTIC4862 y mTIC4863 se exponen en la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 49.

Los casetes de expresión y vectores que contienen estas secuencias de polinucleótido se construyeron e introdujeron en células vegetales de maíz en conformidad con procedimientos y técnicas de transformación conocidas en la técnica. Las células transformadas se regeneraron en plantas transformadas que se observó que expresaban proteínas toxina TIC3668. Para probar la actividad plaguicida, se realizaron los bioensayos en presencia de larvas de plagas de lepidópteros o coleópteros, utilizando discos foliares de plantas obtenidos a partir de las plantas transformadas.

La actividad inhibidora de insectos de miembros de ejemplo de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 se describe con más detalle en los Ejemplos. Las proteínas de ejemplo están relacionadas por una función común y presentan actividad insecticida hacia especies de insectos de Coleóptera y Lepidoptera, incluyendo adultos, larvas, pupas y recién nacidos.

Se contemplan composiciones de polinucleótidos recombinantes que codifican proteínas de tipo TIC3668. Por ejemplo, las proteínas de tipo TIC3668 pueden expresarse con construcciones de ADN recombinante en que una molécula de polinucleótido con una ORF que codifica la proteína está unida operativamente a elementos de expresión genéticos tales como un promotor y cualquier otro elemento regulador necesario para la expresión en el sistema para el cual la construcción está destinada. Los ejemplos no limitantes incluyen un promotor funcional en plantas unido operativamente a las secuencias codificantes de una proteína de tipo TIC3668 para la expresión de la proteína en plantas o un promotor funcional en Bt unido operativamente a una secuencia que codifica una proteína de tipo TIC3668 para la expresión de la proteína en una bacteria Bt u otra especie de Bacillus. Otros elementos pueden estar operativamente unidos a las secuencias codificantes de las proteínas de tipo TIC3668, incluyendo, pero sin limitación, potenciadores, intrones, líderes no traducidos, etiquetas de inmovilización de la proteína codificada (HIS-tag), péptidos de translocación (por ejemplo, péptidos de tránsito de plástidos, péptidos señal), secuencias de polipéptido para enzimas modificadoras postraduccionales, sitios de unión al ribosoma y lugares objetivo de ARNi. Las moléculas de polinucleótidos recombinantes de ejemplo proporcionadas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, un promotor heterólogo unido operativamente a un polinucleótido tal como la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21 que codifica los respectivos polipéptidos o proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos como expone en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22. Los codones de una molécula de polinucleótido recombinante que codifica las proteínas desveladas en el presente documento pueden sustituirse por codones sinónimos (conocido en la técnica como sustitución sinónima). Los ejemplos no limitantes de los polinucleótidos modificados que codifican cualquiera de las proteínas de tipo TIC3668 desveladas en la presente solicitud se exponen en la SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51 para las secuencias de proteínas de longitud completa y las SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID No : 45, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 49 para las secuencias de proteínas maduras.

Una construcción de ADN recombinante que comprende secuencias que codifican proteínas de tipo TIC3668 puede comprender además una región de ADN que codifica uno o más agentes inhibidores de insectos que se pueden configurar para expresarse o coexpresarse simultáneamente con una secuencia de ADN que codifica una proteína de tipo TIC3668, una proteína distinta de una proteína de tipo TIC3668, una molécula de ARNdc inhibidora de insectos o una proteína auxiliar. Las proteínas auxiliares incluyen, pero sin limitación, cofactores, enzimas, compañeros de unión y otros agentes que funcionan para ayudar en la eficacia de un agente inhibidor de insectos, por ejemplo, ayudando a su expresión, influyendo en su estabilidad en plantas, optimizando la energía libre para la oligomerización, incrementando su toxicidad y su espectro de actividad. Una proteína auxiliar puede facilitar la captación de uno o más agentes inhibidores de insectos, por ejemplo, o potenciar los efectos tóxicos del agente tóxico.

Puede ensamblarse una construcción de ADN recombinante de modo que todas las proteínas o moléculas de ARNbc se expresen a partir de un promotor o que cada proteína o moléculas de ARNbc esté bajo control de promotores distintos o alguna combinación de los mismos. Las proteínas pueden expresarse a partir de un sistema de expresión de múltiples genes en que una o más proteínas de las proteínas TIC3668 se expresen a partir de un segmento de nucleótidos común que también contiene otros marcos de lectura abiertos y promotores, dependiendo del tipo de sistema de expresión seleccionado. Por ejemplo, un sistema de expresión bacteriano de múltiples genes puede utilizar un solo promotor para impulsar la expresión de marcos de lectura abiertos de unidos de forma múltiple/en tándem desde dentro de un solo operón (es decir, expresión policistrónica). En otro ejemplo, un sistema de expresión en plantas de múltiples genes puede utilizar casetes de expresión no unidos de forma múltiple, expresando cada uno una proteína u otro agente distintos, tal como una o más moléculas de ARNbc

Los polinucleótidos recombinantes o construcciones de ADN recombinantes que comprenden una secuencia codificante de una proteína de tipo TIC3668 pueden suministrarse a las células hospedadoras mediante vectores, por ejemplo, un plásmido, un baculovirus, un cromosoma sintético, un virión, un cósmido, un fagómido, un fago o un vector vírico. Dichos vectores pueden utilizarse para conseguir una expresión estable o transitoria de la secuencia codificante de la proteína de tipo TIC3668 en una célula hospedadora, o la expresión posterior del polipéptido codificado. Un polinucleótido recombinante exógeno o construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia codificante de una proteína de tipo TIC3668 y que se introduce en una célula hospedadora se denomina en el presente documento "transgén".

En el presente documento se proporcionan bacterias transgénicas, células vegetales transgénicas y partes de plantas transgénicas que contienen un polinucleótido recombinante que expresa una cualquiera o más de las secuencias codificantes de proteínas de tipo TIC3668. La expresión "célula bacteriana" o "bacteria" puede incluir, pero sin limitación, una célula de Agrobacterium, una de Bacillus, una de Escherichia, una de Salmonella, una de Pseudomonas o una de Rhizobium. La expresión "célula vegetal" o "planta" puede incluir, pero sin limitación, una célula vegetal o planta monocotiledónea, dicotiledónea, de alfalfa, banana, cebada, haba, brócoli, col, Brassica, zanahoria, mandioca, ricino, coliflor, apio, garbanzo, col china, cítricos, coco, café, maíz, trébol, algodón, una curcubitácea, pepino, abeto de Douglas, berenjena, eucalipto, lino, ajo, uva, lúpulo, puerro, lechuga, pino Taeda, mijo, melones, nuez, avena, oliva, cebolla, pimienta, ornamental, palma, pastos, guisante, maní, pimienta, guandú, pino, patata, álamo, zapallo, pino de California, rábano, colza, arroz, rizoma, centeno, cártamo, arbusto, sorgo, pino de sur, soja, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, maíz dulce, liquidámbar americano, boniato, pasto varilla, té, tabaco, tomate, triticale, césped, sandía y de trigo. En determinadas realizaciones, se proporcionan plantas transgénicas y partes de plantas transgénicas regeneradas a partir de una célula vegetal transgénica. En determinadas realizaciones, las plantas transgénicas pueden obtenerse de una semilla transgénica, mediante el corte, quiebre, molienda o disociando de otra forma la parte de la planta. En determinadas realizaciones, la parte de planta puede ser una semilla, una cápsula, una hoja, una flor, un tallo, una raíz, o cualquier porción de la misma, o una porción no regenerable de una parte de planta transgénica. Como se utiliza en este contexto, una porción "no regenerable" de una parte de planta transgénica es una porción que no puede inducirse a formar una planta entera o que no puede inducirse a formar una planta entera capaz de reproducirse sexual o asexualmente. En determinadas realizaciones, una porción no regenerable de una parte de planta es una porción de una semilla, una cápsula, una hoja, una flor, un tallo o una raíz transgénica.

Se proporcionan procedimientos de fabricación de plantas transgénicas que comprenden cantidades inhibidoras de insectos, coleópteros o lepidópteros, de una proteína de tipo TIC3668. Dichas plantas pueden fabricarse mediante la introducción de un polinucleótido recombinante que codifica cualquiera de las proteínas de tipo TIC3668 proporcionadas en la presente solicitud en una célula vegetal y seleccionando una planta procedente de dicha célula vegetal que expresa una cantidad inhibidora de insecto, coleópteros o lepidópteros, de las proteínas de tipo TIC3668. Las plantas pueden obtenerse a partir de células vegetales por técnicas de transformación de regeneración, de semilla, polen o meristemo. Los procedimientos para transformar plantas se conocidos en la técnica.

Además, se desvelan en la presente solicitud productos vegetales procesados, en el que el producto procesado comprende una cantidad detectable de proteína de tipo TIC3668, un segmento inhibidor de insectos o un fragmento de la misma, o cualquier porción característica de la misma. En determinadas realizaciones, el producto procesado se selecciona del grupo que consiste en partes de plantas, biomasa vegetal, aceite, harina de maíz, azúcar, pienso, harina, copos, salvado, hebra, cáscaras, semilla procesada y semilla. En determinadas realizaciones, el producto procesado no es regenerable. El producto vegetal puede comprender materia prima u otros productos comerciales procedentes de una planta transgénica o parte de planta transgénica, en que la materia prima u otros productos pueden seguirse en su comercialización detectando segmentos de nucleótidos o ARN expresado o proteínas que codifican o comprenden porciones características de una proteína de tipo TIC3668.

Las plantas que expresan las proteínas TIC3668 pueden cruzarse mediante la mejora genética con eventos transgénicos que expresan otras proteínas toxina y/o que expresan otros rasgos transgénicos tales como genes de tolerancia a herbicidas, genes que confieren rasgos de tolerancia al estrés y de rendimiento, y similares, o tales rasgos pueden combinarse en un único vector de modo que todos los rasgos estén ligados.

Las secuencias codificantes de proteína de tipo TIC3668 y las secuencias que tienen un porcentaje de identidad sustancial con las secuencias codificantes de proteína de tipo TIC3668 pueden identificarse utilizando procedimientos conocidos para los expertos en la materia, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación térmica e hibridación. Por ejemplo, las proteínas de la clase de toxinas proteicas TIC3668 pueden utilizarse para producir anticuerpos que se unan específicamente a esta clase de proteínas, y pueden utilizarse para explorar y encontrar otros miembros de la clase.

Además, las secuencias de nucleótidos que codifican la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 (y las secuencias inversas complementarias) pueden utilizarse como sondas y cebadores para explorar e identificar otros miembros de la clase utilizando procedimientos de ampliación por ciclo térmico o isotérmica, o de hibridación. Concretamente, los oligonucleótidos que proceden de secuencias que se exponen en cualquiera de las SEQ ID NO: 52 a 61 pueden utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un transgén de tipo TIC3668 en una muestra de ácido desoxirribonucleico procedente de un producto de consumo. Dada la sensibilidad de determinados procedimientos de detección de ácidos nucleicos que emplean oligonucleótidos, se anticipa que los oligonucleótidos derivados de las secuencias que se exponen en cualquiera de las SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61 pueden utilizarse para detectar un transgén de TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078 o TIC4260 en productos de consumo obtenidos de fuentes combinadas en que sólo una fracción del producto de consumo procede de una planta transgénica que contiene cualquiera de las SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61. Además, se reconoce que tales oligonucleótidos pueden utilizarse para introducir una variación de secuencia de nucleótidos en cada una de las SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61. Dichos oligonucleótidos de "mutagénesis" son útiles para la identificación de variantes de secuencias de aminoácidos de TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078 o TIC4260 que presentan un intervalo de actividad inhibidora de insectos o expresión variada en células hospedadoras vegetales transgénicas.

Los homólogos de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, proteínas insecticidas codificadas por secuencias de nucleótidos que hibridan con cada una o cualquiera de las secuencias desveladas en la presente solicitud en condiciones rigurosas de hibridación, también son una realización de la presente invención. La invención también proporciona un procedimiento para detectar una primera secuencia de nucleótidos que hibrida a una segunda secuencia de nucleótidos, en el que la primera secuencia de nucleótidos (o su secuencia inversa complementaria) codifica una proteína insecticida o un fragmento insecticida de la misma e hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la segunda secuencia de nucleótidos. En tal caso, la segunda secuencia de nucleótidos puede ser cualquiera de las secuencias de nucleótidos desveladas en la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 en condiciones de hibridación rigurosas. Las secuencias codificantes de nucleótidos hibridan entre sí en condiciones de hibridación apropiadas y las proteínas codificadas por estas secuencias de nucleótidos reaccionan de forma cruzada con antisuero generado contra una cualquiera de las otras proteínas. Las condiciones de hibridación rigurosas son conocidas en la técnica y pueden variar de acuerdo con la aplicación y resultado deseados, y pueden abarcar una diversidad de reactivos y condiciones. Por ejemplo, los lavados a altas temperaturas constituyen condiciones más rigurosas. En determinadas realizaciones, las condiciones de hibridación de la presente invención puede comprender al menos una hibridación a 42 °C seguida por dos lavados de cinco minutos cada uno a temperatura ambiente en SSC 2X, SDS al 0,1 %, seguidos por dos lavados de treinta minutos cada uno a 65 °C en SSC 0,5 X, SDS al 0,1 %; o una hibridación a 68 oC, seguido por lavado a 68 oC, en SSC 2 X con SDS 0,1 %; o una hibridación de 4 a 12 horas en formamida al 50 %, NaCI 1 M y SDS al 1 % a 37 C, y un lavado en SSC 0,1 X a 60 C - 65 C.

Un experto en la materia reconocerá que, debido a la redundancia del código genético, muchas otras secuencias pueden codificar tales proteínas relacionadas y esas secuencias, en la medida en que funcionen para expresar proteínas insecticidas en cepas de Bacillus o en células vegetales, son realizaciones de la presente invención, naturalmente reconociendo que tales secuencias codificantes redundantes no hibridarán en estas condiciones con las secuencias nativas de Bacillus que codifican TIC3668. La presente solicitud contempla el uso de estos y otros procedimientos de identificación conocidos para los expertos en la materia, para la identificación de secuencias codificantes de proteínas de tipo TIC3668 y de secuencias con un porcentaje de identidad sustancial con las secuencias codificantes de proteínas de tipo TIC3668.

La presente divulgación también contempla el uso de procedimientos moleculares conocidos en la técnica para diseñar técnicamente y clonar proteínas comercialmente útiles que comprenden quimeras de proteínas pesticidas; por ejemplo, las quimeras pueden ensamblarse a partir de segmentos de proteínas de tipo TIC3668 para obtener realizaciones útiles incluido el ensamblaje de segmentos de proteínas de tipo TIC3668 con segmentos de diversas proteínas diferentes de TIC3668 y proteínas relacionadas. La clase de proteínas de tipo TIC3668 puede estar sujeta a alineamiento entre sí y con otras proteínas pesticidas de Bacillus (ya sea que estas estén relacionadas filogenéticamente de forma estrecha o distante), y puede identificarse que los segmentos de cada una de tales proteínas son útiles para la sustitución entre las proteínas alineadas, dando como resultado la construcción de proteínas quiméricas. Dichas proteínas quiméricas pueden someterse a análisis por bioensayo de plagas y caracterizarse en cuanto a la presencia o ausencia de bioactividad aumentada y/o de un espectro de plagas objetivo ampliado en comparación con las proteínas parentales de las que se obtuvo cada segmento de la quimera. La actividad pesticida de los polipéptidos puede diseñarse técnicamente adicionalmente en cuanto a la actividad para una plaga en particular o para un espectro más amplio de plagas, intercambiando dominios o segmentos con otras proteínas, o utilizando procedimientos de evolución dirigida conocidos en la técnica.

Los procedimientos de control de insectos, particularmente infestaciones de lepidópteros o coleópteros en plantas de cultivo, con proteínas de la clase de proteínas toxina TIC3668 también se desvelan en la presente solicitud. Dichos procedimientos pueden comprender el crecimiento de una planta que comprende una cantidad inhibidora de insectos, coleópteros o lepidópteros, de una proteína de la clase de proteínas toxina TIC3668. En determinadas realizaciones, tales procedimientos también pueden comprender uno a más de: (i) la aplicación de cualquier composición que comprende o codifica una proteína de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 a una planta o una semilla que de lugar a una planta; y (ii) la transformación de una planta o una célula vegetal que de lugar a una planta con un polinucleótido que codifica una proteína de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668. En general, se contempla que cualquier proteína de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 puede proporcionarse en una composición, proporcionarse en un microorganismo o proporcionarse en una planta transgénica, para conferir actividad inhibidora de insectos contra insectos lepidópteros o coleópteros.

En determinadas realizaciones, un polipéptido recombinante de la clase de toxinas proteicas TIC3668 es el principio activo desde el punto de vista insecticida de una composición inhibidora de insectos preparada mediante el cultivo de Bacillus recombinante o cualquier otra célula bacteriana recombinante transformada para expresar una proteína toxina de tipo TIC3668 en condiciones adecuadas para expresar y producir proteínas de la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668. Dicha composición puede prepararse mediante desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de tales células recombinantes que expresan/producen dicho polipéptido recombinante. Dicho proceso puede dar como resultado un Bacillus u otro extracto de células bacterianas entomopatógenas, suspensión celular, homogenato celular, lisado celular, sobrenadante de células, filtrado de células o sedimento celular. Mediante la obtención de los polipéptidos recombinantes producidos de ese modo, una composición que incluya los polipéptidos recombinantes puede incluir células bacterianas, esporas bacterianas y cuerpos de inclusión parasporales, y pueden formularse para diversos usos, entre ellos productos en aerosol inhibidores de insectos agrícolas o como formulaciones inhibidoras de insectos en bioensayos de alimentación.

En una realización, para disminuir la probabilidad de desarrollo de resistencia, una composición inhibidora de insectos que comprende una o más proteínas de la clase de toxinas proteicas TIC3668 además puede incluir al menos un polipéptido adicional que presenta la actividad inhibidora de insectos contra las mismas especies de insectos lepidópteros y coleópteros, pero que es diferente de la toxina proteica de tipo TIC3668. Los posibles polipéptidos adicionales para tal composición incluyen una proteína inhibidora de insectos y una molécula de ARNbc inhibidora de insectos. Un ejemplo del uso de tales secuencias de ribonucleótido para controlar plagas de insectos se describe en Baum, y col. (Publicación de Patente de EE.UU. 2006/0021087 A1). Dicho polipéptido adicional para el control de plagas de lepidópteros puede seleccionarse del grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, tal como, pero sin limitación, CryIA (Patente de EE.UU. N.° 5.880.275), CryIAb, CryIAc, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B (Publicación de Patente de EE.UU. N.° 10/525.318), Cry1C (Patente de EE.UU. N.° 6.033.874), Cry1D, Cry1Da y variantes de los mismos, quimeras de Cry1E, Cry1F, y CryIA/F (Patentes de EE.UU. N.° 7.070.982; 6.962.705 y 6.713.063), quimeras de tipo CrylG, Cry1H, Cry1I, CrylJ, Cry1K, Cry1L, Cry1 tales como, pero sin limitación, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869 y TIC1100, Cry2A, Cry2Ab (Patente de EE.UU. N.° 7.064.249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-184, AXMI-196, DIG-3, DIG-4, DIG-5, DIG-11, AfIP-1Ay derivados de los mismos (Publicación de Patente de EE.UU. 20140033361 A1), AfIP-1B y derivados del mismo (Publicación de Patente de EE.UU. 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (Publicación de Patente de EE.UU. 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (Publicación de Patente de EE.UU. 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (Publicación de Patente de EE.UU. 2014-0007292 A1), Pput_1063 (Publicación de Patente de EE.UU. 2014-0007292 A1), Pput_1064 (Publicación de Patente de EE.UU. 2014-0007292 A1), GS-135 y derivados del mismo (Publicación de Patente de EE.UU. 2012-0233726 A1), GS153 y derivados del mismo (Publicación de Patente de EE.UU. 2012-0192310 A1), GS154 y derivados del mismo (Publicación de Patente de EE.UU. 2012­ 0192310 A1), GS155 y derivados del mismo (Publicación de Patente de EE.UU 2012-0192310 A1), SEQ ID NO: 2 y derivados del mismo como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU 2012-0167259 A1, SEQ ID NO: 2 y derivados del mismo como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 2012-0047606 A1, SEQ ID NO: 2 y derivados del mismo, como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 2011-0154536 A1, SEQ ID NO: 2 y derivados del mismo como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 2011-0112013 A1, SEQ ID NO: 2 y 4 y derivados del mismo, como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 2010-0192256 A1, SEQ ID NO: 2 y derivados del mismo, como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 2010-0077507 A1, SEQ ID NO: 2 y derivados del mismo, como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 2010-0077508 A1, SEQ ID NO: 2 y derivados del mismo, como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 2009-0313721 A1, SEQ ID NO: 2 o 4 y derivados del mismo, como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 2010-0269221 A1, SEQ ID NO: 2 y derivados del mismo, como se describe en la Patente de EE.UU N.° 7.772.465 (B2), CF161_0085 y derivados del mismo, como se describe en el documento WO2014/008054 A2, proteínas tóxicas de lepidópteros y sus derivados como se describe en las Publicaciones de Patentes de EE.UU. US2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1 y US2012-0117690 A1; SEQ ID NO: 2 y derivados del mismo, como se describe en el documento US7510878(B2), SEQ ID NO: 2 y derivados del mismo, como se describe en la Patente de EE.UU. N.° 7812129(B1) y otras proteínas inhibidoras de lepidópteros conocidas para los expertos en la materia. Dicho polipéptido adicional para el control de plagas de coleópteros puede seleccionarse del grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, tal como, pero sin limitación, Cry3Bb (Patente de EE.UU. N.° 6.501.009), variantes de CryIC, variantes de Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, Axmi184, Axmi205, AxmiR1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10, eHIPs (Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2010/0017914) y otras proteínas inhibidoras de coleópteros conocidas para los expertos en la materia.

En otras realizaciones, tal composición/formulación puede además comprender al menos un polipéptido adicional que presente actividad inhibidora de insectos para un insecto que no es inhibido por otra proteína inhibidora de insectos de la presente invención, para expandir el espectro de inhibición de insectos obtenido. Por ejemplo, para el control de plagas de hemípteros, pueden utilizarse combinaciones de proteínas inhibidoras de insectos de la presente invención con proteínas activas para hemípteros tales como TIC1415 (Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2013/0097735), TIC807 (Patente de EE.UU. N.° 8609936), TIC834 (Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2013/0269060) y otras proteínas activas para hemípteros conocidas para los expertos en la materia. Se pueden encontrar polipéptidos adicionales para el control de plagas de insectos coleópteros, lepidópteros y hemípteros en el sitio de internet de nomenclatura de toxinas de Bacillus thuringiensis mantenido por Neil Crickmore (en internet en btnomenclature.info).

La posibilidad de los insectos de desarrollar resistencia a determinados insecticidas se ha documentado en la técnica. Una estrategia de manejo de resistencias de los insectos es emplear cultivos transgénicos que expresen dos agentes inhibidores de insectos distintos, que actúen a través de modos de acción distintos. Por lo tanto, cualquier insecto con resistencia a uno de los agentes inhibidores de insectos puede controlarse mediante el otro agente inhibidor de insectos. Otra estrategia de manejo de resistencias de los insectos emplea el uso de plantas que no están protegidas para las especies de plagas de coleópteros o lepidópteros objetivo para proporcionar un refugio para tales plantas desprotegidas. Un ejemplo particular se describe en la Patente de EE.UU. N.° 6.551.962.

Otras realizaciones, tales como productos químicos pesticidas aplicados por vía tópica, que están diseñados para controlar plagas que también se controlan mediante las proteínas desveladas en el presente documento, para su uso con proteínas en tratamientos de semillas, formulaciones para pulverizar, por goteo o para aplicar con un paño, se pueden aplicar directamente al suelo (empapando el suelo), aplicar a plantas en crecimiento que expresen las proteínas desveladas en el presente documento, o formular para aplicarse a semillas que contienen uno o más transgenes que codifican uno o más de las proteínas desveladas. Dichas formulaciones para su uso en tratamientos de semillas pueden aplicarse con diversos adhesivos y pegamentos conocidos en la técnica. Dichas formulaciones pueden contener plaguicidas que sean sinérgicos en su modo de acción con las proteínas desveladas, de modo que los plaguicidas de la formulación actúen a través de un modo de acción distinto para controlar las mismas plagas, o similares, que pueden controlarse mediante las proteínas desveladas, o que tales plaguicidas actúen para controlar plagas dentro de una gama más amplia de hospedadores o especies de plagas de plantas que la clase de toxinas proteicas de tipo TIC3668 no controlan de forma eficaz.

La composición/formulación mencionada anteriormente puede comprender además un vehículo agrícolamente aceptable, tal como un cebo, un polvo, polvillo, bolita, gránulo, aerosol, emulsión, una suspensión coloidal, una solución acuosa, una preparación de esporas/cristales de Bacillus, un tratamiento de semillas, un tejido/semilla/planta de célula vegetal/planta recombinante transformada para expresar una o más proteínas, o una bacteria transformada para expresar una o más proteínas. Dependiendo del nivel de inhibición de insectos o inhibición insecticida inherente al polipéptido recombinante y el nivel de formulación que se aplicará a un ensayo de alimentación o planta, la composición/formulación puede incluir diversas cantidades en peso del polipéptido recombinante, por ejemplo, del 0,0001 % al 0,001 %, al 0,01 %, al 1 %, al 99% en peso del polipéptido recombinante.

Ejemplos

Ejemplo 1

Descubrimiento de la clase de toxinas proteicas relacionada con TIC3668

Se identificaron cepas bacterianas que presentan atributos distintivos, por ejemplo, toxicidad inferida, diversidad proteómica y variaciones morfológicas al compararlas entre sí, y se prepararon para la secuenciación genómica utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Se descubrió una proteína TIC3668 (SEQ ID NO: 2) que presenta actividad inhibidora contra insectos coleópteros en bioensayos in vitro de un Brevibacillus laterosporus (B. laterosporus) cepa EG5552. También se descubrió que otras cepas contienen proteínas que se asemejan a TIC3668. Los segmentos de polinucleótido que codifican estas proteínas se clonaron y se insertaron en una cepa hospedadora recombinante para probar la expresión.

Se diseñaron cebadores para amplificación térmica para ampliar una copia de longitud completa del gen procedente del ADN genómico total de distintas cepas bacterianas de B. laterosporus, incluyendo EG5552. Se generaron productos de amplificación térmica distintos (amplicones) a partir de cada cepa, y éstos se analizaron en cuanto a la presencia de marcos de lectura abiertos que pudieran codificar proteínas relacionadas con TIC 3668. Se determinó que cada amplicón tenía un único marco de lectura abierto, que contenía un codón de inicio de la traducción, seguido en marco por un marco de lectura abierto contiguo que terminaba con un codón de terminación de la traducción en marco. Las secuencias de aminoácidos deducidas obtenidas de cada una de estas cepas bacterianas distintas adicionales se exponen respectivamente en la SEQ ID NO: 2 (TIC3668), SEQ ID NO: 4 (TIC3669), SEQ ID NO: 6 (TIC3670), SEQ ID NO: 8 (TIC4076), SEQ ID NO: 10 (TIC4078), SEQ ID NO: 14 (TIC4346), SEQ ID NO: 16 (TIC4826), SEQ ID NO: 18 (TIC4861), SEQ ID NO: 20 (TIC4862), SEQ ID NO: 22 (TIC4863). Estos amplicones se clonaron en un vector de expresión plasmídico de Bacillus thuringiensis (Bt) recombinante corriente abajo de un promotor de expresión específico de esporulación y se transformaron en una célula hospedadora de Bt acristalífera. Los amplicones también se clonaron en un sistema de expresión de E. coli. Se observó que las cepas recombinantes resultantes expresaban una proteína recombinante.

Ejemplo 2

Actividad en coleópteros de la clase de toxinas proteicas relacionadas con TIC3668

Este ejemplo ilustra la actividad inhibidora presentada por proteínas similares a TIC3668 contra coleópteros.

Las preparaciones de proteínas producidas a partir de bacterias recombinantes como se describe en el Ejemplo 1, para las proteínas de longitud completa de TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076 y TIC2462, se sometieron a bioensayos de recubrimiento de alimentación de insectos contra el escarabajo de la patata del Colorado (Leptinotarsa decemlineata, EPC) y contra al menos una especie de gusano de la raíz del maíz. Son miembros conocidos de las especies de gusanos de la raíz del maíz Diabrotica virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz del oeste, GMO) Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte, GMN), Diabrotica virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mejicano, GMM), Diabrotica balteata (gusano de la raíz del maíz brasileño (GMB), Diabrotica undecimpunctata howardii (gusano de la raíz del maíz del sur, GMS) y un complejo del gusano de la raíz del maíz brasileño (GMB), que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa).

Como se muestra en la Tabla 6, los resultados demuestran que TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260 y TIC4076 presentaron mortalidad contra el gusano de la raíz del maíz. TIC2462 (SEQ ID NO: 62 que codifica la SEQ ID NO: 63), una proteína estrechamente relacionada con la proteína AXMI-209 (en comparación con TIC2462, > 99 % idéntica a nivel de aminoácidos y que presenta solo dos diferencias de aminoácidos), no presentó mortalidad contra el gusano de la raíz del maíz, distinguiendo así la actividad de la clase de toxinas proteicas similares a TIC3668 de las proteínas que se asemejan a AXMI-209. Sorprendentemente, no se observó mortalidad contra el escarabajo de la patata del Colorado, una especie normalmente probada en bioensayos como indicador de la actividad en coleópteros, en ninguna de las proteínas probadas.

Tabla 6. Mortalidad observada contra plagas de insectos coleópteros de las proteínas de ejemplo.

continuación

Ejemplo 3

Forma madura de la toxina proteica TIC3668

Este ejemplo ilustra la presencia de un péptido de tránsito de membrana en el extremo amino de las proteínas nativas dentro de la clase de toxinas proteicas TIC3668 y el descubrimiento de proteínas toxina maduras activas de la clase de toxinas proteicas TIC3668.

El análisis bioinformático utilizando un programa SignalP (Petersen, y col (2011), Nature Methods, 8:785-786) de la traducción de la secuencia de aminoácidos a partir de la secuencia codificante de TIC3668 (SEQ ID NO: 1) predijo la presencia de un segmento de tránsito de membrana correspondiente a los primeros 23 aminoácidos N-terminales.

Se diseñaron experimentos para confirmar la presencia de un segmento de tránsito de membrana dentro de cada miembro de la clase de toxinas proteicas similares a TIC3668. TIC3668 se clonó en una célula hospedadora de Bt detrás de un promotor de Bt no específico de esporulación. Se probó la actividad insecticida de los sobrenadantes de cultivo resultantes. Se recuperaron tres formas de proteína correspondientes a TIC3668 como una mezcla a partir del sobrenadante. Se determinó posteriormente mediante espectrometría de masas y análisis de secuencia N-terminal que estos distintos fragmentos de proteína TIC3668 de longitud inferior a la completa contenían en sus respectivos extremos amino, el aminoácido 16, 19 o 24, como se expone en la SEQ ID NO: 2. Solo se detectó una pequeña cantidad de estas tres formas truncadas de TIC3668 en los medios de cultivo. Se observó que la forma más abundante de la proteína detectada tenía en su extremo amino la serina en la posición 24, como se expone en la SEQ ID NO: 2. La proteína concentrada y purificada a partir del sobrenadante de cultivo presentó bioactividad contra GMO cuando se probó en un bioensayo con alimentación artificial.

Se crearon distintas construcciones de expresión para identificar los segmentos peptídicos más pequeños para cada proteína de tipo TIC3668 que presentaba actividad insecticida. Estas construcciones se introdujeron en una cepa acristalífera de B. thuringiensis o en una cepa de E. coli. Una construcción se diseñó para la expresión de la proteína TIC3668 de longitud completa, como se expone en la SEQ ID NO: 2, desde el aminoácido 1 hasta el 317, en una cepa de acristalífera de Bt. Las construcciones se diseñaron para la expresión de la proteína TIC3668 de longitud completa y diversas formas variantes más cortas de la proteína TIC3668, en un sistema de expresión de E. coli que tiene una secuencia de etiqueta HIS (HHHHAHHH). carboxilo terminal. Las construcciones diseñadas para la expresión en E. coli consistieron en: (1) una construcción diseñada para expresar la proteína TIC3668 de longitud completa como se expone en la SEQ ID NO: 2, desde la posición de aminoácido 1 a la 317; (2) una construcción diseñada para expresar una proteína variante de TIC3668 que tenía del aminoácido 16 al 317 como se expone en la SEQ ID NO: 2; (3) una construcción diseñada para expresar una proteína variante deTIC3668 desde el aminoácido 24 al 317 como se expone en la SEQ ID NO: 2; (4) una construcción diseñada para expresar una proteína variante de TIC3668 desde el aminoácido 26 al aminoácido 317 como se expone en la SEQ ID NO: 2; (5) una construcción diseñada para expresar una proteína variante de TIC3668 del aminoácido 28 al 317 como se expone en la SEQ ID NO: 2. Adicionalmente, se obtuvo una proteína TIC3668 con una etiqueta de 10-his N-terminal y un sitio de proteasa (MHHHHHHHHHHGTETVRFQ) del VMVT (virus del moteado de las venas del tabaco) a partir de un sistema de expresión de E. coli para producir una proteína TIC3668 con un comienzo en el resto n.° 24 como se expone en la SEQ ID NO: 2.

La proteína se obtuvo a partir del sobrenadante del sistema de expresión de Bt y se sometió a espectrometría de masas y análisis de la secuencia N-terminal. El sistema de expresión de Bt produjo la toxina madura predicha TIC3668 a partir de ácido 24-317 como se expone en la SEQ ID NO: 2. La proteína no se observó en los sobrenadantes de E. coli. La proteína se obtuvo a partir de cada una de las respectivas construcciones de expresión de E. coli mediante choque osmótico para liberar las proteínas del periplasma. Las proteínas producidas a partir de las construcciones que se diseñaron para contener los aminoácidos 16 o 24 en el extremo amino de la proteína menor que la longitud completa, se confirmó que contenían estos aminoácidos en su respectivos extremos amino. La proteína producida a partir de la construcción diseñada para expresar el TIC3668 de longitud completa produjo la proteína de longitud madura, que contiene la serina en la posición 24 como se expone en la SEQ ID NO: 2, en el extremo amino. Las proteínas producidas a partir de las construcciones diseñadas para contener al aminoácido 26 o al aminoácido 28 como se expone en la SEQ ID NO: 2 como aminoácido N-terminal, cada una contenía, sorprendentemente, sólo el aminoácido 28 como aminoácido N-terminal, lo que sugiere que el procesamiento que mantiene el aminoácido número 24 como se expone en la SEQ ID NO: 2 en el extremo N puede ser importante para la estabilidad de la toxina.

Las muestras de proteína obtenidas de estos análisis de sistemas de expresión se sometieron a pruebas contra larvas del gusano de la raíz del maíz del oeste en bioensayos de recubrimiento de alimentación de insectos, como se describe en el Ejemplo 2. Se determinó que determinados truncamientos N-terminales de este estudio presentaban una bioactividad disminuida. Específicamente, se observó que la actividad insecticida se redujo significativamente cuando el aminoácido amino terminal era el 26 o el 28, como se expone en la SEQ ID NO: 2. Se puede extrapolar que otros miembros de la familia de proteínas TIC3668 que están truncados en el N-terminal para ser más cortos que la proteína madura (comenzando en el resto del aminoácido n.° 24 para TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078, TIC4260, TIC4346, TIC4826 y TIC4863 ; comenzando en el aminoácido 13 para TIC4861 y comenzando en el aminoácido 22 para TIC4862), son las versiones más cortas de las proteínas de tipo TIC3668 probadas que muestran actividad insecticida contra el GMO. Todas las variantes de TIC3668 de igual longitud o más larga que la proteína madura mostraron una alta actividad contra el GMO, incluso a concentraciones relativamente bajas. Los datos también demuestran que el procesamiento de TIC3668 por parte de E. coli varía según el diseño de construcción.

Ejemplo 4

Síntesis de genes que codifican proteínas de tipo TIC3668 para la expresión en plantas

Se diseñaron secuencias de nucleótidos que codifican las versiones de longitud completa y maduras de una proteína TIC3668, una proteína TIC3669, una TIC3670, una TIC4076, TIC4078, una proteína TIC4260, una proteína TIC4346, una proteína TIC4826, una proteína TIC4861, una proteína TIC4862 y una proteína TIC4863. Las secuencias de nucleótidos que codifican TIC3668, TIC3669 y TIC3670 se sintetizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en general en la patente de EE.UU. 5.500.365, evitando determinadas secuencias problemáticas adversas tales como las secuencias de poliadenilación de plantas ricas en ATTTA y A/T, al tiempo que se conservó la secuencia de aminoácidos de la proteína de B. laterosperous nativa. Estas secuencias de nucleótidos se proporcionan en el presente documento como la SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51 para las secuencias de longitud completa y la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, y SEQ ID NO: 49 para las secuencias maduras.

Ejemplo 5

Casetes de expresión para la expresión de proteínas de tipo TIC3668 en plantas

Se diseñaron una diversidad de casetes de expresión en plantas con las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51. Dichos casetes de expresión son útiles para la expresión transitoria en protoplastos vegetales o para la transformación de células vegetales. Se diseñaron casetes de expresión típicos con respecto al emplazamiento final de la proteína dentro de la célula. Se diseñó una serie de casetes de expresión de manera que se permitiera traducir la proteína con el segmento N-terminal nativo. Se diseñó otra serie de casetes de expresión para permitir la expresión de la proteína sin el segmento N-terminal (es decir, la proteína de longitud madura). Se diseñó otra serie de casetes de expresión para expresar un péptido de tránsito en marco y unido operativamente a la proteína toxina de longitud madura, para permitir el direccionamiento a un orgánulo de la célula tal como el cloroplasto o un plástido. Todos los casetes de expresión se diseñaron para comenzar en el extremo 5' con un promotor que puede componerse de múltiples elementos promotores unidos de forma contigua, elementos potenciadores u otros elementos de expresión conocidos por expertos en la materia para reforzar la expresión del transgén. La secuencia del promotor se siguió habitualmente de forma contigua por una o más secuencias líder a 3' con respecto al promotor. Se proporcionó una secuencia intrónica a 3' de la secuencia líder para mejorar la expresión del transgén. Una secuencia codificante de la toxina o el péptido de tránsito y la secuencia codificante de la toxina se ubicaron 3' de la configuración de promotor, líder e intrón. Se proporcionó una secuencia 3'UTR a 3' de la secuencia codificante para facilitar la terminación de la transcripción, y proporciona secuencias importantes para la poliadenilación del transcrito resultante. Todos los elementos descritos anteriormente se dispusieron de forma contigua a una secuencia adicional proporcionada a menudo para la construcción del casete de expresión, tales como sitios de endonucleasas de restricción o sitios de clonación independientes de ligamiento.

Ejemplo 6

Vectores de transformación que contienen el casete de expresión de proteínas de tipo TIC3668

Se construyeron vectores de transformación mediada por Agrobacterium para suministrar ADN al genoma de la planta que expresa las proteínas TIC3668, mTIC3668, TIC3669, mTIC3669, TIC3670 y mTIC3670. Los casetes de expresión se clonaron en vectores adecuados entre las secuencias de los extremos de Agrobacterium de modo que se transfieran al genoma de una célula vegetal hospedadora por Agrobacterium hospedadoras que contengan los vectores de construcción junto con un gen marcador de selección. Más específicamente, el fragmento de restricción que contiene el casete de expresión citosólico completo que codifica una de las proteínas mencionadas anteriormente se clonó en un vector de transformación de plantas de Agrobacterium. De manera similar, el fragmento de restricción que contiene todo el casete de expresión direccionado a plástidos se clonó en un vector de transformación de plantas de Agrobacterium. Los vectores conteniendo los casetes de expresión de proteínas de tipo TIC3668 (es decir, casetes no direccionados o casetes direccionados) se introducen en Agrobacterium mediante electroporación o por apareamiento triparental.

Casetes de expresión que contienen genes artificiales que codifican TIC4076, TIC4078, TIC4260, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 y TIC4863, cada uno con y sin secuencias que codifican los 23 aminoácidos N terminales presentes en el marco de lectura abierto de B. laterosperous nativa (aminoácidos 1-23 como se expone en la SEQ ID NO: 2), se clonan en vectores adecuados entre las secuencias de los extremos de Agrobacterium de modo que se transfieran al genoma de una célula hospedadora y se prueben en cuanto a la expresión y bioactividad de la proteína codificada.

Ejemplo 7

Actividad en coleópteros de las proteínas de tipo TIC3668 en plantas

Este ejemplo ilustra la actividad inhibidora que presentan las proteínas de tipo TIC3668 contra coleópteros, tales como larvas del gusano de la raíz del maíz, cuando se expresan en plantas y se proporcionan como alimentación a la plaga de insectos respectiva.

Se produjeron plantas de maíz transgénicas R0 que expresan las proteínas TIC3668, mTIC3668, TIC3669, mTIC3669, TIC3670 y mTIC3670 utilizando vectores que contienen los casetes de expresión descritos en el Ejemplo 5.

Se cultivaron plantas de maíz transgénicas F1 a partir de semilla producida por la polinización de mazorcas de plantas de germoplasma comercial de tipo silvestre no transformadas con polen de transformantes R0. Después de transferirse al suelo en tiestos enjaulados, las plantas F1 se infestaron de insectos gusanos de la raíz del maíz neonatos y se cultivaron durante 13 días en condiciones controladas. La clasificación del daño de la raíz (RDR, forma siglada de Root damage rating) se determinó utilizando la escala de clasificación de 0-3 de Oleson, y col., en que 0 significa que no hay lesiones y 3 significa que se recortaron tres o más nudos a dentro de 3,81 cm del tallo (J.D. Oleson, Y-L. Park, T.M. Nowatzki, J.J. Tollefson, "Node-Injury Scale to Evaluate Root Injury by Corn Rootworms", Journal of Economic Entomology, 98(1):1-8, 2005). Se evaluó la mortalidad de los insectos recontando el número de larvas de tercer estadio que quedan al final del período de crecimiento

En una primera serie de experimentos, las plantas que expresan las proteínas TIC3668, TIC3669 y TIC3670 de longitud completa se probaron contra GMO. Algunos de los eventos mostraron una reducción estadísticamente significativa en la lesión de los nudos en comparación con el control negativo, con un valor de clasificación del daño de raíz (RDR) promedio entre 2 y 2,5, pero no se observó actividad significativa desde el punto de vista comercial para las proteínas de longitud completa.

En una segunda serie de experimentos, las proteínas maduras mTIC3668 (SEQ ID NO: 23), mTIC3669 (SEQ ID NO: 24) y mTIC3670 (SEQ ID NO: 25), con o sin péptido de direccionamiento a cloroplasto, se expresaron en plantas de maíz y se probaron contra GMO. Se observó una mortalidad significativa del GMO con cada proteína madura. Cada planta expresando mTIC3668, mTIC3669 y mTIC3670, en presencia y ausencia de secuencias de direccionamiento adicionales, mostró una reducción estadísticamente significativa de la lesión de los nudos en comparación con el control negativo. La Figura 2 representa los valores promedio de RDR en varios eventos para las proteínas mTIC3668 y mTIC3669, y la Figura 3 representa el valor promedio de RDR durante varios eventos para mTIC3670 cuando se expresa en plantas de maíz F1, independientemente de si la proteína estaba direccionada al cloroplasto o no. "TS" en el nombre del evento de las Figuras 2 y 3 indica la presencia de una secuencia de direccionamiento. Se observó una actividad significativa desde el punto de vista comercial para muchos de estos eventos que expresan las proteínas maduras mTIC3668, mTIC3669 y mTIC3670.

Sorprendentemente, la eliminación del segmento de tránsito de membrana (aminoácidos 1-23 como se expone en la SEQ ID NO: 2) de las proteínas similares a TIC3668 aumentó la eficacia contra el gusano de la raíz del maíz cuando se expresan en plantas de maíz. Cuando se expresan en plantas, las proteínas similares a TIC3668 de longitud madura demostraron niveles más altos de actividad insecticida contra las plagas de coleópteros que las proteínas de longitud completa.

Ejemplo 8

Actividad insecticida de proteínas relacionadas con TIC3668, expresadas en maíz, contra GMO resistente a Cry3Bb1

Este Ejemplo ilustra la actividad insecticida presentada por las proteínas similares a TIC3668 contra una cepa de gusano de la raíz del maíz del oeste (GMO) que ha desarrollado resistencia a la toxina de Bt Cry3BbI. Plantas de maíz transgénicas F1 que expresan mTIC3668, mTIC3669 o mTIC3670, producidas utilizando procedimientos como se describe en el Ejemplo 7, se infestaron con 2000 huevos de GMO de la cepa Hopkinton por planta.

La cepa Hopkinton del gusano de la raíz del maíz del oeste (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) es una cepa sin diapausa con resistencia desarrollada en el campo a Cry3Bb1 expresada en plantas de maíz. La cepa se originó a partir de muestras de GMO adulto obtenidas de campos que se habían con maíz con Cry3Bb1 durante siete años consecutivos La población se retrocruzó tres veces con una cepa de GMO sin diapausa y se seleccionó tres veces para la resistencia a Cry3Bb1. (Gassmann, y col. (2011) Plods ONE 6(7): e22629; Gassmann, y col. (2012) GM Crops Food 3(3): 235-244. La colonia se obtuvo del laboratorio del Dr. Aaron Gassmann en la Universidad Estatal de Iowa y la mantiene el grupo de Entomología de Monsanto Biotech en Chesterfield, MO.

Después de la infestación, los huevos de la cepa Hopkinton del GMO eclosionaron al cabo de 48 horas y los neonatos comenzaron a alimentarse de las raíces. Después de 24 días, las raíces se retiraron del suelo y se evaluaron los daños en la raíz del maíz utilizando la escala de 0-3, como se describe en el Ejemplo 7. Como se muestra en la Tabla 7, las plantas que expresaban mTIC3668, mTIC3669 y mTIC3670 fueron muy eficaces para proteger las raíces del maíz del daño en presencia de neonatos de GMO de la cepa Hopkinton en comparación con las plantas de control, superando así la resistencia del GMO a la toxina Cry3Bb1.

Tabla 7. RDR promedio en plantas de maíz transgénicas infestadas con GMO resistente a Cry3Bb1

Ejemplo 9

Actividad insecticida de las proteínas relacionadas con TIC3668, expresadas en maíz, contra la infestación natural con GMO en sitios de prueba de campo

Este ejemplo ilustra la eficacia reducida de daño en las raíces presentada por plantas de maíz transgénicas que expresan proteínas similares a TIC3668 contra infestaciones naturales por GMO en campos agrícolas del medio oeste de los Estados Unidos.

Plantas de maíz transgénicas F1 que expresan mTIC3668, mTIC3669 o mTIC3670, producidas utilizando procedimientos como se describe en el Ejemplo 7, se plantaron en cinco lugares en el medio oeste de los Estados Unidos desde finales de abril hasta principios de mayo. Los experimentos en estos lugares se basaron en las infestaciones naturales existentes para la presión del gusano de la raíz del maíz. El cavado para retirar las raíces, para la evaluación del daño, se finalizó a finales de julio. El daño por gusano de la raíz se determinó de acuerdo con la escala de lesión de nudos, como se describe en el Ejemplo 7.

Los resultados de los experimentos de cavado de raíces indicaron que, en condiciones prácticas de cultivo en campo abierto, las plantas que expresan mTIC3668, mTIC3669 y mTIC3670 fueron altamente eficaces en proteger las raíces del maíz del daño en presencia de la presión natural de gusano de la raíz del maíz. La Tabla 8 muestra el número de plantas evaluadas (N), la RDR media y el error típico para las plantas de prueba cuando se combinan las ubicaciones.

Tabla 8. RDR media en plantas de maíz transgénicas probadas en campos de cultivo con infestaciones por GMO naturales

Ejemplo 10

Actividad en lepidópteros de la clase de toxinas proteicas relacionadas con TIC3668

Este Ejemplo ilustra la actividad inhibidora contra lepidópteros presentada por las proteínas similares a TIC3668. Las preparaciones de proteínas, como se describe en el Ejemplo 1, para las proteínas de longitud completa de TIC3668, TIC3669 TIC3670, TIC4076 y TIC4078, se sometieron a bioensayos de recubrimiento de alimentación de insectos contra el gusano cortador negro (GCN, Agrotis Ípsilon), el gusano cortador del haba del oeste (GCHO, Striacosta albicosta), el gusano elotero (GO, Helicoverpa zea), el piral del maíz (PM, Ostrinia nubilalis), el barrenador de la caña de azúcar (BCA, Diatraea saccharalis), el barrenador del maíz del suroeste (BMSO, Diatraea grandiosella), la oruga agrimensora del repollo (OAR, Trichoplusia ni), la oruga agrimensora de la soja (OAS, Chrysodeixis includes) y el gusano cogollero (GC, Spodoptera frugiperda). En la técnica se conocen los protocolos y procedimientos de preparación y realización de bioensayos de proteínas inhibidoras.

Se observó actividad contra determinadas plagas de insectos lepidópteros para determinadas proteínas de tipo TIC3668, como se demuestra en la Tabla 9.

Tabla 9. Atrofia observada contra plagas de insectos lepidópteros de proteínas de ejemplo.

Ejemplo 11

Actividad en lepidópteros de proteínas de tipo TIC3668 en plantas

Este ejemplo ilustra la actividad inhibidora de las proteínas de tipo TIC3668 para PM, BMSO, GCN, GC, GO y OAS, cuando se expresa en plantas y se proporciona como alimentación a las respectivas plagas de insectos.

Los bioensayos contra plagas de lepidópteros utilizando discos foliares de plantas se realizaron de manera similar a como se describe en la Patente EE.Uu .8.344.207, en plantas de maíz R0 que expresan TIC3668, TIC3669 y TIC3670. A la clasificación de daño foliar (LDR, forma siglada de leaf damage rating) se le asignó una puntuación de clasificación basada en el porcentaje del disco foliar devorado por el insecto en una escala de lo comido de 0 (0 % comido) a 11 (mayor al 50 %). Los pasos de la puntuación de clasificación aumentan de forma gradual en un 5%. Las plantas R0 que no contienen proteínas insecticidas sirvieron como controles negativos. La expresión citosólica de la proteína de tipo TIC3668 de longitud completa redujo el daño por alimentación contra GO, GC y BMSO con respecto al control no transformado. La expresión citosólica de la proteína TIC3670 redujo el daño por alimentación contra BMSO con respecto al no transformado.

Ejemplo 12

Creación de la proteína TIC4260 collage

Este Ejemplo enseña la creación de una nueva secuencia génica basada en los miembros de la familia de TIC3668. La variación de aminoácidos de cinco de las proteínas de tipo TIC3668 nativas se combinó para crear una nueva proteína collage, TIC4260 (SEQ ID NO: 12), que presenta una diversidad de secuencia de aminoácidos distinta en comparación con las proteínas de origen natural. La Figura 1 representa el alineamiento de cinco proteínas de tipo TIC3668 nativas con TIC4260. En este alineamiento de secuencias las posiciones de la diversidad de secuencia se resaltan en gris. Se construyó una secuencia de polinucleótido artificial (SEQ ID NO: 11) que codifica a la proteína TIC4260. La proteína TIC4260 madura (mTIC4260, SEQ ID NO: 28) está codificada por la secuencia de polinucleótido como se expone en la SEQ ID NO: 43.

Se pueden hacer alineamientos similares de otras proteínas de tipo TIC3668 para crear nuevas proteínas que presenten actividad tóxica contra lepidópteros y/o coleópteros. Estas nuevas proteínas se expresan, purifican y prueban contra insectos lepidópteros y coleópteros en bioensayos de alimentación. Los casetes de expresión para estas nuevas proteínas se crean y se transforman en plantas para expresar estas proteínas para el control de plagas de plantas de lepidópteros y coleópteros.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido inhibidor de insectos que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25; o

(b) una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 98 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y que comprende además la actividad inhibidora de insectos del polipéptido de (a).

2. La molécula de polinucleótido recombinante de la reivindicación 1 que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 37;

(b) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos el 80 % de identidad con una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 37; o

(c) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con:

(i) el complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la posición 4-885 de una secuencia de la SEQ ID NO: 37; o

(ii) el complemento inverso de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57;

en las que dichas condiciones rigurosas comprenden hibridación de 4 a 12 horas en formamida al 50 %, NaCl 1 M y SDS al 1 % a 37 °C, y un lavado en SSC 0,1 X a 60 °C - 65 °C.

3. Un polipéptido recombinante inhibidor de insectos codificado por la molécula de polinucleótido recombinante de la reivindicación 1.

4. El polipéptido recombinante inhibidor de insectos de la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido recombinante inhibidor de insectos presenta actividad inhibidora contra una especie de insecto del orden Coleóptera.

5. El polipéptido recombinante inhibidor de insectos de la reivindicación 4, en la que dicha especie de insecto del orden Coleóptera es el gusano de la raíz del maíz del oeste, el gusano de la raíz del maíz del sur, el gusano de la raíz del maíz del norte, el gusano de la raíz del maíz mejicano, el gusano de la raíz del maíz brasileño o el complejo del gusano de la raíz del maíz brasileño que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa.

6. Una célula hospedadora que comprende la molécula de polinucleótido recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en una célula hospedadora bacteriana y una célula hospedadora vegetal.

7. Una composición inhibidora de insectos que comprende la molécula de polinucleótido recombinante de la reivindicación 1.

8. La composición inhibidora de insectos de la reivindicación 7, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica al menos otro agente pesticida que es distinto de dicho polipéptido inhibidor de insectos, en el que dicho al menos otro agente pesticida se selecciona del grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, una molécula de ARNbc inhibidora de insectos y una proteína auxiliar.

9. La composición inhibidora de insectos de la reivindicación 8, en la que dicho al menos otro agente pesticida se selecciona del grupo que consiste en una proteína Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, CrylA.105, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, CrylK, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cryl5, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, VIP3A y VIP3B.

10. Un procedimiento de control de una plaga de especies de coleópteros, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicha plaga con una cantidad inhibidora de insectos del polipéptido recombinante inhibidor de insectos de la reivindicación 3.

11. Una semilla que comprende la molécula de polinucleótido recombinante de la reivindicación 1 o el polipéptido recombinante inhibidor de insectos de la reivindicación 3.

12. Un vector recombinante que comprende la molécula de polinucleótido recombinante de la reivindicación 1.

13. El vector recombinante de la reivindicación 12, en el que dicho vector se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un bácmido, un fagómido y un cósmido.

14. Una planta resistente a la infestación por insectos, en la que las células de dicha planta comprenden la molécula de polinucleótido recombinante de la reivindicación 1 o el polipéptido recombinante inhibidor de insectos de la reivindicación 3.