KR20190059961A - 신규한 곤충 저해 단백질 - Google Patents

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데이비드 제이. 보웬
캐서린 에이. 차이
알린 알. 하우이
우마 케사나팔리
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몬산토 테크놀로지 엘엘씨
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Abstract

나비목 해충 종에 대해 독성 활성을 나타내는 살충 단백질이 개시되어 있되, 상기 살충 단백질은 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 개시된 살충 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 재조합 핵산 서열을 함유하는 DNA 작제물이 제공된다. 본 발명의 살충 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 서열을 함유하는, 나비목 침입에 내성인 형질전환 식물, 식물 세포, 종자 및 식물 부분이 제공된다. 생물학적 샘플에서 본 발명의 재조합 핵산 서열 또는 단백질의 존재를 검출하는 방법 및 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 살충 단백질 중 어느 하나를 사용하여 나비목 종 해충을 방제하는 방법이 또한 제공된다.

Description

신규한 곤충 저해 단백질
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2016년 10월 10일자로 출원된 미국 가출원 제62/406,082호(본 명세서에서 참고로 그 전문이 포함됨)의 이익을 주장한다.
서열 목록의 포함
서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형태를 함유하는 파일명 "MONS426WO_ST25.txt"는 2017년 10월 8일자에 생성되었다. 이 파일은 (MS-Windows(등록상표)에서 측정된) 77,030바이트이다(전자 제출(미국 특허청 EFS-Web 제출 시스템 사용)에 의해 동시에 제출되고, 본 명세서에서 참고로 그 전문이 포함됨).
기술 분야
본 발명은 일반적으로 곤충 저해 단백질의 분야에 관한 것이다. 농작물 및 종자의 농업적으로 관련된 해충에 대해 곤충 저해 활성을 나타내는 단백질의 신규한 종류가 개시되어 있다. 특히, 단백질의 개시된 종류는 농작물 및 종자의 농업적으로 관련된 해충, 특히 곤충 해충의 나비목 종에 대해 살충 활성이다. 하나 이상의 개시된 독소 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물을 함유하는 식물, 식물 부분 및 종자가 제공된다.
무엇보다도 옥수수, 대두, 사탕수수, 쌀, 밀, 야채 및 면을 포함하는 농업적으로 유의미한 식물로부터 작물 수율의 개선은 점점 더 중요해진다. 먹히고 입히고 성장하는 인간 집단에 대한 에너지를 공급하기 위한 농업 제품에 대한 증가하는 수요 이외에, 기후 관련된 효과 및 영농에 대한 것 이외에 토지를 사용하려는 성장하는 집단으로부터의 압박은 농사에 이용 가능한 경작 가능한 토지의 양을 감소시키는 것으로 예측된다. 이 인자는 특히 식물 바이오기술 및 농경 실행에서 주요 개선의 부재 하에 식량 안보의 암울한 예측을 발생시켰다. 이 압박의 견지에서, 기술, 농업 기법 및 해충 관리에서의 환경적으로 지속 가능한 개선은 농사에 이용 가능한 경작 가능한 토지의 제한된 양에서 작물 생산을 확장시키는 필수적인 도구이다.
곤충, 특히 나비목 및 딱정벌레목의 목 내의 곤충은 밭 작물에 대한 손상의 주요 원인으로 생각되어서, 침입된 면적에 걸쳐 작물 수율을 감소시킨다. 농업에 부정적으로 영향을 미치는 나비목 해충 종은 근대 거염벌레(스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua)), 옥수수 귀벌레(헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 면 잎 벌레(알라바마 아르길라세아(Alabama argillacea)), 유럽 옥수수 나무좀(오스트리니아 누빌랄리스(Ostrinia nubilalis)), 밤나방유충(스포돕테라 푸리기페르다)(Spodoptera frugiperda), 올드 월드 솜벌레(헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera)), 오리엔탈 잎 벌레(스포돕테라 리투라(Spodoptera litura)), 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라(Pectinophora gossypiella)), Cry1Ac 내성 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라), 대두 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens)), 써던 거염벌레(스포돕테라 에리다니아(Spodoptera eridania)), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(디아트라에아 그라디오셀라(Diatraea grandiosella)), 점무늬 솜벌레(에아리아스 비텔라(Earias vittella)), 사탕수수 나무좀(디아트라에아 사카랄리스(Diatraea saccharalis)), 회색담배나방(헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens)) 및 벨벳콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis))를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
역사적으로, 합성 화학 살충제의 강력한 적용은 농업에서 해충 방제 물질로서 의존되다. 출현하는 내성 문제 이외에 환경 및 인간 건강에 대한 우려는 생물학적 농약의 조사 및 개발을 자극하였다. 이 조사 노력은 박테리아를 포함하는 다양한 곤충 병원성 미생물 종의 진보적인 발견 및 사용을 발생시켰다.
곤충 병원성 박테리아, 특히 바실러스 속에 속하는 박테리아의 가능성이 생물학적 해충 방제 물질로서 발견되고 개발되었을 때 생물학적 방제 패러다임이 바꿨다. Bt 균주가 특정한 곤충에 대해 높은 독성을 나타낸다는 것이 발견된 이후로, 박테리아 바실러스 튜링겐시스(Bt)의 균주는 살충 단백질에 대한 소스로서 사용되었다. Bt 균주는 포자형성의 시작 시 및 정지상 증식기(예를 들어, Cry 단백질) 동안 부아포 결정질 봉입체 내에 국재화된 델타-내독소를 생성시키는 것으로 공지되어 있고, 분비된 살충 단백질을 생산하는 것으로 또한 공지되어 있다. 감수성인 곤충에 의한 침입 시, 델타-내독소, 및 분비된 독소는 중장 상피의 표면에서 이의 효과를 발휘하여서, 세포막을 파괴하여서, 세포 파괴 및 사멸을 발생시킨다.
살충 단백질을 코딩하는 유전자는 Bt 이외의 박테리아 종, 예를 들어 다른 바실러스 및 다양한 추가적인 박테리아 종, 예컨대 브레비바실러스 라테로스포루스, 라이시니바실러스 스파에리쿠스(이전에 바실러스 스파에리쿠스로 공지된 "Ls") 및 파에니바실러스 포필리아에에서 또한 확인되었다.
결정질 및 분비된 가용성 살충 독소는 이의 숙주에 고도로 특이적이고, 화학 살충제에 대한 세계적인 동의를 얻었다. 예를 들어, 살충 독소 단백질은 곤충 침입으로부터 농업적으로 중요한 식물을 보호하고, 화학 농약 분야에 대한 수요를 감소시키고, 수율을 증가시키기 위해 다양한 농업 분야에서 사용된다. 살충 독소 단백질은 기계적 방법, 예컨대 식물 표면에 대한 다양한 박테리아 균주를 함유하는 미생물 제제를 산재시키기 위한 살포에 의해, 그리고 살충 독소 단백질을 발현하는 형질전환 식물 및 종자를 생성하기 위한 유전자 형질전환 기법을 이용함으로써 농작물의 농업적으로 관련된 해충을 방제하기 위해 사용된다.
살충 독소 단백질을 발현하는 형질전환 식물의 사용은 세계적으로 채택되었다. 예를 들어, 2012년에, 2610만개 헥타르가 Bt 독소를 발현하는 형질전환 작물에 의해 식목되었다(James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAA Brief No. 44). 형질전환 곤충 보호된 작물의 세계적인 사용 및 이 작물에서 사용된 살충 독소 단백질의 제한된 수는 현재 사용되는 살충 단백질에 내성을 부여하는 기존의 곤충 대립유전자에 대한 선택 압박을 생성하였다.
표적 해충에서의 살충 독소 단백질에 대한 내성의 발생은 살충 독소 단백질을 발현하는 형질전환 작물에 대한 곤충 내성의 증가를 관리하는 데 유용한 살충 독소 단백질의 새로운 형태의 발견 및 개발에 대한 계속적인 수요를 생성한다. 개선된 효율을 갖고 감수성인 더 광범위한 스펙트럼의 곤충 종에 대한 방제를 나타내는 새로운 단백질 독소는 내성 대립유전자를 발생시킬 수 있는 생존한 곤충의 수를 감소시킬 것이다. 또한, 동일한 곤충 해충에 대해 독성이고 상이한 작용 방식을 나타내는 2개 이상의 형질전환 살충 독소 단백질의 하나의 식물에서의 사용은 임의의 단일 표적 곤충 종에서의 내성의 확률을 감소시킨다.
따라서, 본 발명자들은 유사한 독소 단백질, 변이체 단백질, 및 표적 나비목 종, 특히 근대 거염벌레(스포돕테라 엑시구아), 옥수수 귀벌레(헬리코베르파 제아), 면 잎 벌레(알라바마 아르길라세아), 유럽 옥수수 나무좀(오스트리니아 누빌랄리스), 밤나방유충(스포돕테라 푸리기페르다), 올드 월드 솜벌레(헬리코베르파 아르미게라), 오리엔탈 잎 벌레(스포돕테라 리투라), 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라), Cry1Ac 내성 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라), 대두 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스), 써던 거염벌레(스포돕테라 에리다니아), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(디아트라에아 그라디오셀라), 점무늬 솜벌레(에아리아스 비텔라), 사탕수수 나무좀(디아트라에아 사카랄리스), 회색담배나방(헬리오티스 비레센스) 및 벨벳콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스)에 대한 살충 활성을 나타내는 예시적인 재조합 단백질과 함께 바실러스 튜링겐시스로부터의 신규한 단백질 독소 과를 본 명세서에 개시한다.
농작물의 하나 이상의 해충에 대해 저해 활성을 나타내는 것으로 밝혀진 TIC4472 단백질 독소 종류에 속하는 TIC4472, TIC1425 및 TIC2613으로서 본 명세서에서 언급된, 곤충 저해 활성을 갖는 살충 단백질(독소 단백질)의 신규한 그룹이 본 명세서에 개시되어 있다. TIC4472 단백질 및 TIC4472 단백질 독소 종류에서의 단백질은 단독으로 제제 및 식물계에서 다른 살충 단백질 및 독성 물질과 조합되어 사용될 수 있어서, 현재 농업 시스템에서의 사용에 대해 살충 단백질 및 살충제 화학물질에 대한 대안을 제공한다.
일 실시형태에서, 살충 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절에 작동 가능하게 연결된 이종성 촉진자 단편을 포함하는 재조합 핵산 분자가 본 출원에 개시되어 있고, 여기서 (a) 상기 살충 단백질은 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) 상기 살충 단백질은 (i) 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 93% 또는 95% 또는 98% 또는 99% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성; 또는 (ii) 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 적어도 73% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; (c) 상기 폴리뉴클레오타이드 분절은 서열 번호 3, 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 7 또는 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되거나; (d) 살충 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 분절은 서열 번호 3, 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 7 또는 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 65% 또는 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 98% 또는 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; (e) 상기 재조합 핵산 분자는 벡터와 작동 가능하게 연결되고, 상기 벡터는 플라스미드, 파지미드, 박미드(bacmid), 코스미드 및 박테리아 또는 효모 인공 염색체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 재조합 핵산 분자는 식물에서 살충 단백질을 발현하도록 작용하는 서열을 포함하거나; 식물 세포에서 살충 단백질의 살충 유효량을 생성하도록 발현된다.
본 출원의 또 다른 실시형태에서, 본 출원의 재조합 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 제공되고, 여기서 숙주 세포는 박테리아 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 고안된 박테리아 숙주 세포는 아그로박테륨(Agrobacterium), 리조븀(Rhizobium), 바실러스(Bacillus), 브레비바실러스(Brevibacillus), 에스체리치아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea) 및 에르위니아(Erwinia)를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 상기 바실러스 종은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis)이고, 상기 브레비바실러스는 브레비바실러스 라테로스페로우스(Brevibacillus laterosperous)이고, 또는 에스체리치아는 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli)이다. 고안된 식물 숙주 세포는 쌍떡잎식물 식물 세포 및 외떡잎식물 식물 세포를 포함한다. 고안된 식물 세포는 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 배추속, 당근, 카사바, 피마자, 꽃양배추, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 면(고시퓸 종), 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 상추, 테에다 소나무(Loblolly pine), 수수, 멜론, 견과, 귀리, 올리브, 양파, 관상품, 팜, 목초, 완두콩, 땅콩, 후추, 나무콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디아타 소나무(Radiata pine), 무, 유채, 쌀, 근경, 호밀, 잇꽃, 관목, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕 옥수수, 스위트 검, 고구마, 스위치그래스, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디, 수박 및 밀 식물 세포를 추가로 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 살충 단백질은 근대 거염벌레(스포돕테라 엑시구아), 옥수수 귀벌레(헬리코베르파 제아), 면 잎 벌레(알라바마 아르길라세아), 유럽 옥수수 나무좀(오스트리니아 누빌랄리스), 밤나방유충(스포돕테라 푸리기페르다), 올드 월드 솜벌레(헬리코베르파 아르미게라), 오리엔탈 잎 벌레(스포돕테라 리투라), 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라), Cry1Ac 내성 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라), 대두 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스), 써던 거염벌레(스포돕테라 에리다니아), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(디아트라에아 그라디오셀라), 점무늬 솜벌레(에아리아스 비텔라), 사탕수수 나무좀(디아트라에아 사카랄리스), 회색담배나방(헬리오티스 비레센스) 및 벨벳콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스)를 포함하는 나비목 곤충에 대해 활성을 나타낸다.
살충 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절에 작동 가능하게 연결된 이종성 촉진자 단편을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물이 본 출원에 또한 고안되고, 여기서 (a) 상기 살충 단백질은 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) 상기 살충 단백질은 (i) 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 93% 또는 95% 또는 98% 또는 99% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성; 또는 (ii) 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 적어도 73% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; (c) 상기 폴리뉴클레오타이드 분절은 엄격한 혼성화 조건 하에 서열 번호 3 또는 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열의 보체에 혼성화되거나; (d) 상기 식물은 상기 살충 단백질의 검출 가능한 양을 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 살충 단백질은 서열 번호 4, 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10을 포함한다. 일 실시형태에서, 식물은 쌍떡잎식물 식물 또는 외떡잎식물 식물 중 어느 하나이다. 또 다른 실시형태에서, 식물은 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 배추속, 당근, 카사바, 피마자, 꽃양배추, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 면, 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 상추, 테에다 소나무, 수수, 멜론, 견과, 귀리, 올리브, 양파, 관상품, 팜, 목초, 완두콩, 땅콩, 후추, 나무콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디아타 소나무, 무, 유채, 쌀, 근경, 호밀, 잇꽃, 관목, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕 옥수수, 스위트 검, 고구마, 스위치그래스, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디, 수박 및 밀로 이루어진 군으로부터 추가로 선택된다.
추가의 실시형태에서, 재조합 핵산 분자를 포함하는 종자가 개시된다.
또 다른 실시형태에서, 본 출원에 개시된 재조합 핵산 분자를 포함하는 곤충 저해 조성물이 고안된다. 곤충 저해 조성물은 상기 살충 단백질과 다른 적어도 하나의 다른 살충제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 적어도 하나의 다른 살충제는 곤충 저해 단백질, 곤충 저해 dsRNA 분자 및 보조 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 곤충 저해 조성물 내의 적어도 하나의 다른 살충제가 나비목, 딱정벌레목 또는 반시목의 목의 하나 이상의 해충 종에 대해 활성을 나타낸다는 것이 또한 고안된다. 곤충 저해 조성물 내의 적어도 하나의 다른 살충제는 일 실시형태에서 Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, Cry1C 변이체, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1A/F 키메라, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, Cry3A 변이체, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113, 및 AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z 및 AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1 및 이의 변이체, IP3 및 이의 변이체, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 및 DIG-11 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 출원에 개시된 재조합 핵산 분자의 검출 가능한 양을 포함하는 소비재(commodity product)가 또한 고안된다. 이러한 소비재는 곡물 취급자가 담은 소비재 옥수수, 옥수수 플레이크, 옥수수 케이크, 옥수수 밀가루, 옥수수 가루, 옥수수 시럽, 옥수수 오일, 옥수수 사일리지, 옥수수 전분, 옥수수 시리얼 등, 및 상응하는 대두, 쌀, 밀, 수수, 나무콩, 땅콩, 과일, 멜론, 및 식물성 소비재, 예를 들어, 적용 가능한 경우, 주스, 농축물, 잼, 젤리, 마멀레이드 및 검출 가능한 양의 본 출원의 이러한 폴리뉴클레오타이드 및 또는 폴리펩타이드를 함유하는 이러한 소비재의 다른 식용 가능한 형태, 전체 또는 처리된 면 종자, 면 오일, 린트, 먹이 또는 사료에 대해 처리된 종자 및 식물 일부, 섬유, 제지, 바이오매스, 및 연료 생성물, 예컨대 면 오일로부터 유래된 연료 또는 조면기 폐기물로부터 유래된 펠릿, 전체 또는 처리된 대두 종자, 대두유, 대두 단백질, 대두 가루, 대두 밀가루, 대두 플레이크, 대두 겨, 대두 밀크, 대두 치즈, 대두 와인, 대두를 포함하는 동물 사료, 대두를 포함하는 제지, 대두를 포함하는 크림, 대두 바이오매스, 및 대두 식물 및 대두 식물 일부를 사용하여 제조된 연료 생성물을 포함한다.
본 출원에 개시된 재조합 핵산 분자를 포함하는 종자를 제조하는 방법이 본 출원에서 또한 고안된다. 상기 방법은 본 출원에 개시된 재조합 핵산 분자를 포함하는 종자 중 적어도 하나를 식목하는 단계; 종자로부터 식물을 성장시키는 단계; 및 식물로부터 종자를 수확하는 단계를 포함하고, 여기서 수확된 종자는 본 출원에서 재조합 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 곤충 침입에 대한 식물 내성이 제공되고, 여기서 상기 식물의 세포는 (a) 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6에 기재된 바와 같은 살충 단백질의 살충 유효량을 코딩하는 재조합 핵산 분자; 또는 (b) (i) 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 93% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성; 또는 (ii) 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 적어도 73% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 살충 유효량을 포함한다.
나비목 종 해충을 방제하고, 식물, 특히 농작물의 나비목 종 해충 침입을 방제하는 방법이 본 출원에 또한 개시되어 있다. 상기 방법은, 일 실시형태에서, (a) 해충을 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6에 기재된 바와 같은 살충 단백질의 살충 유효량과 접촉시키는 단계; 또는 (b) 해충을 (i) 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 93% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성; 또는 (ii) 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 적어도 73% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 살충 단백질의 살충 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다.
살충 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절을 포함하는 재조합 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법이 본 명세서에 추가로 제공되고, 여기서 (a) 상기 살충 단백질은 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) 상기 살충 단백질은 (i) 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 93% 또는 95% 또는 98% 또는 99% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성; 또는 (ii) 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 적어도 73% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; (c) 상기 폴리뉴클레오타이드 분절은 서열 번호 4, 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 방법은 엄격한 혼성화 조건 하에 본 명세서에 제공된 살충 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절을 포함하는 식물로부터의 게놈 DNA과 혼성화되고, 이러한 혼성화 조건 하에 그 분절을 포함하지 않는 달리 동질유전자 식물로부터의 게놈 DNA와 혼성화되지 않는 핵산 프로브(여기서, 프로브는 서열 번호 3 또는 서열 번호 9와 상동성 또는 상보성임), 또는 (a) 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 93% 또는 95% 또는 98% 또는 99% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성; 또는 (b) 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 적어도 73% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질을 코딩하는 서열과 핵산의 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 (a) 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건으로 처리하는 단계; 및 (b) 프로브의 샘플의 DNA와의 혼성화를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
단백질을 포함하는 샘플에서 살충 단백질 또는 이의 단편의 존재를 검출하는 방법이 본 발명에 의해 또한 제공되고, 여기서 상기 살충 단백질은 서열 번호 4, 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 살충 단백질은 (a) 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 93% 또는 95% 또는 98% 또는 99% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성; 또는 (b) 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 적어도 73% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 샘플을 면역반응성 항체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 검출하는 단계는 ELISA 또는 웨스턴 블롯을 포함한다.
[서열의 간단한 설명]
서열 번호 1은 바실러스 튜링겐시스 종 EG10742로부터 얻은 TIC4472 살충 단백질을 코딩하는 핵산 서열이다.
서열 번호 2는 TIC4472 살충 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 3은 추가적인 알라닌 코돈이 시작 메티오닌 코돈 직후에 삽입된 식물 세포에서의 발현을 위해 설계된 TIC4472PL 살충 단백질을 코딩하는 합성 코딩 서열이다.
서열 번호 4는 식물 세포에서의 발현을 위해 설계되고, 추가적인 알라닌 아미노산이 시작 메티오닌 직후에 삽입된, 합성 코딩 서열에 의해 코딩된 TIC4472PL의 아미노산 서열(서열 번호 3)이다.
서열 번호 5는 바실러스 튜링겐시스 종 EG10731로부터 얻은 TIC1425 살충 단백질을 코딩하는 핵산 서열이다.
서열 번호 6은 TIC1425 살충 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 7은 바실러스 튜링겐시스 종 EG5408로부터 얻은 TIC2613 살충 단백질을 코딩하는 핵산 서열이다.
서열 번호 8은 TIC2613 살충 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 9는 추가적인 알라닌 코돈이 시작 메티오닌 코돈 직후에 삽입된 식물 세포에서의 발현을 위해 설계된 TIC2613PL 살충 단백질을 코딩하는 합성 코딩 서열이다.
서열 번호 10은 식물 세포에서의 발현을 위해 설계되고, 추가적인 알라닌 아미노산이 시작 메티오닌 직후에 삽입된, 합성 코딩 서열에 의해 코딩된 TIC2613PL의 아미노산 서열(서열 번호 9)이다.
농업적 해충 방제의 당해 분야에서의 문제는 표적 해충에 대해 효율적이고, 표적 해충 종에 대해 광범위한 스펙트럼 독성을 나타내고, 바람직하지 않은 농경 문제를 야기하지 않으면서 식물에서 발현될 수 있고, 식물에서 상업적으로 사용되는 현재의 독소와 비교하여 대안적인 작용 방식을 제공하는 새로운 독소 단백질의 수요를 특징으로 할 수 있다.
TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL에 의해 예시되는 신규한 살충 단백질은 본 명세서에 개시되어 있고, 특히 나비목 곤충 해충의 광범위한 스펙트럼, 더 특히 근대 거염벌레(스포돕테라 엑시구아), 옥수수 귀벌레(헬리코베르파 제아), 면 잎 벌레(알라바마 아르길라세아), 유럽 옥수수 나무좀(오스트리니아 누빌랄리스), 밤나방유충(스포돕테라 푸리기페르다), 올드 월드 솜벌레(헬리코베르파 아르미게라), 오리엔탈 잎 벌레(스포돕테라 리투라), 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라), Cry1Ac 내성 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라), 대두 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스), 써던 거염벌레(스포돕테라 에리다니아), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(디아트라에아 그라디오셀라), 점무늬 솜벌레(에아리아스 비텔라), 사탕수수 나무좀(디아트라에아 사카랄리스), 회색담배나방(헬리오티스 비레센스) 및 벨벳콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스)에 대한 이들 수요 각각을 해소한다.
본 출원에서 TIC4472, "TIC4472 단백질", "TIC4472 단백질 독소", "TIC4472 독소 단백질", "TIC4472 살충 단백질", "TIC4472 관련된 독소", "TIC4472 관련된 독소 단백질", TIC4472PL, "TIC4472PL 단백질", "TIC4472PL 단백질 독소", "TIC4472PL 독소 단백질", "TIC4472PL 살충 단백질", "TIC4472PL 관련된 독소", "TIC4472PL 관련된 독소 단백질", TIC1425, "TIC1425 단백질", "TIC1425 단백질 독소", "TIC1425 독소 단백질" "TIC1425 살충 단백질", "TIC1425 관련된 독소", "TIC1425 관련된 독소 단백질", TIC2613, "TIC2613단백질, "TIC2613단백질 독소", "TIC2613독소 단백질", "TIC2613살충 단백질", "TIC2613 관련된 독소", "TIC2613 관련된 독소 단백질", TIC2613PL, "TIC2613PL 단백질", "TIC2613PL 단백질 독소", "TIC2613PL 독소 단백질", "TIC2613PL 살충 단백질", "TIC2613PL 관련된 독소", "TIC2613PL 관련된 독소 단백질" 등의 언급은, 이러한 단백질의 TIC4472, TIC4472PL 또는 TIC1425와의 정렬이 약 93% 내지 약 100%의 임의의 분수 백분율의 아미노산 서열 동일성을 발생시키는 경우; 또는 이러한 단백질의 TIC2613 또는 TIC2613PL과의 정렬이 약 73% 내지 약 100%의 임의의 분수 백분율의 아미노산 서열 동일성을 발생시키는 경우, 살충 또는 곤충 저해 활성을 나타내는 임의의 단백질을 포함하는 나비목 해충에 대해 활성을 부여하는, TIC4472(서열 번호 2), TIC4472PL(서열 번호 4), TIC1425(서열 번호 6), TIC2613(서열 번호 8) 또는 TIC2613PL(서열 번호 10)의 임의의 살충 단백질 또는 곤충 저해 단백질 서열 및 이의 살충 또는 곤충 저해 분절, 또는 이의 조합을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 이들과 실질적으로 상동성이거나, 이들과 유사하거나 이들로부터 유래된 임의의 신규한 살충 단백질 또는 곤충 저해 단백질을 의미한다. TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질은 단백질로부터 색소체 표적된 및 색소체 비표적화된 형태 둘 다를 포함한다.
용어 "분절" 또는 "단편"은 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질을 기재하는 완전한 아미노산 또는 핵산 서열보다 짧은 구성적 아미노산 또는 핵산 서열을 기재하도록 본 출원에서 사용된다. 곤충 저해 활성을 나타내는 분절 또는 단편은 이러한 분절 또는 단편과 서열 번호 2에 기재된 TIC4472 단백질, 서열 번호 4에 기재된 TIC4472PL 단백질, 서열 번호 6에 기재된 TIC1425 단백질의 상응하는 섹션과의 정렬이 분절 또는 단편과 TIC4472, TIC4472PL 또는 TIC1425 단백질의 상응하는 섹션 사이의 약 93% 내지 약 100%의 임의의 분수 백분율의 아미노산 서열 동일성을 발생시키는 경우; 또는 이러한 분절 또는 단편과 서열 번호 8에 기재된 TIC2613 또는 서열 번호 10에 기재된 TIC2613PL 단백질의 상응하는 섹션과의 정렬이 분절 또는 단편과 TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질의 상응하는 섹션 사이의 약 73% 내지 약 100%의 임의의 분수 백분율의 아미노산 서열 동일성을 발생시키는 경우 본 출원에 또한 개시되어 있다.
훨씬 추가의 구체적인 실시형태에서, TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질의 단편은 이것이 유래된 시작 단백질 분자가 보유하는 살충 활성을 나타내는 것으로서 정의될 수 있다. TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 단편은 이것이 유래된 시작 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질 분자가 보유하는 살충 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 것으로서 정의될 수 있다. 본 명세서에 기재된 단편 또는 변이체는 단백질의 살충 활성을 담당하는 본 명세서에서 확인된 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 살충 활성을 갖는 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질의 적어도 약 50개, 적어도 약 75개, 적어도 약 95개, 적어도 약 100개, 적어도 약 125개, 적어도 약 150개, 적어도 약 175개, 적어도 약 200개, 적어도 약 225개, 적어도 약 250개, 적어도 약 275개, 적어도 약 300개, 적어도 약 500개, 적어도 약 600개, 적어도 약 700개, 적어도 약 750개, 적어도 약 800개, 적어도 약 900개, 적어도 약 1000개, 적어도 약 1100개, 적어도 약 1150개 또는 적어도 약 1175개, 또는 이것 초과의 인접한 아미노산을 포함하는, TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질의 단편이 제공된다. 소정의 실시형태에서, 본 발명은 전장 서열의 활성을 갖는 서열 번호 2, 4, 6, 8 또는 10 중 어느 하나의 단편을 제공한다. 출발 분자로부터 이러한 단편을 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 출원에서 용어 "활성인" 또는 "활성, "살충 활성" 또는 "살충성" 또는 "곤충사멸 활성", "곤충 저해" 또는 "곤충사멸성"의 언급은 해충을 저해(성장, 먹이공급, 생식력, 또는 생존능력의 저해), 억제(성장, 먹이공급, 생식력 또는 생존능력의 억제), 방제(해충 침입의 방제, 유효량의 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질을 함유하는 특정한 작물에 대한 해충 먹이공급 활성의 방제) 또는 사멸(이환율, 사망률 또는 생식력의 감소를 발생시킴)하게 하는 데 있어서 독성 물질, 예컨대 단백질 독소의 효율을 의미한다. 이들 용어는 독성 단백질에 대한 해충의 노출이 이환율, 사망률, 생식력의 감소 또는 영양실조를 발생시키는 해충에 대한 독성 단백질의 살충 유효량을 제공하는 것의 결과를 포함하도록 의도된다. 이들 용어는 또한 식물에서의 또는 식물 상의 독성 단백질의 살충 유효량을 제공하는 것의 결과로서 식물, 식물의 조직, 식물 부분, 종자, 식물 세포 또는 식물이 성장할 수 있는 특정한 지정학적 위치로부터의 해충의 혐오감을 포함한다. 일반적으로, 살충 활성은 나비목 목의 곤충(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 특정한 표적 해충의 성장, 발육, 생존능력, 먹이공급 행동, 짝짓기 행동, 생식력을 저해하는 데 있어서 효과적인 독성 단백질의 능력 또는 이 단백질, 단백질 단편, 단백질 분절 또는 폴리뉴클레오타이드에 대한 곤충 먹이공급에 의해 생긴 부작용의 임의의 측정 가능한 감소를 의미한다. 독성 단백질은 식물에 의해 생산될 수 있거나, 식물 또는 식물이 배치된 위치 내의 환경에 시비될 수 있다. 용어 "생물활성", "효과적", "효율적" 또는 이의 변형어는 또한 표적 곤충 해충에 대한 본 발명의 단백질의 효과를 기재하기 위해 본 출원에서 상호 교환되어 사용되는 용어이다.
독성 물질의 살충 유효량은, 표적 해충의 식이에 제공될 때, 독성 물질이 해충과 접촉할 때 살충 활성을 나타낸다. 독성 물질은 당해 분야에 공지된 살충 단백질 또는 하나 이상의 화학 물질일 수 있다. 살충 또는 살충 화학 물질 및 살충 또는 살충 단백질 물질은 단독으로 또는 서로와 조합되어 사용될 수 있다. 화학 물질은 표적 해충, 유기 클로라이드, 유기 포스페이트, 카바메이트, 피레스린, 네오니코티노이드 및 리아노이드에서의 억제를 위한 특정한 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 살충 또는 살충 단백질 물질은 본 출원에 기재된 단백질 독소, 및 나비목을 표적화하는 것을 포함하는 다른 단백질성 독성 물질, 및 다른 식물 해충을 방제하기 위해 사용된 단백질 독소, 예컨대 나비목, 딱정벌레목 또는 반시목 종을 방제하는 데 사용하기 위해 당해 분야에서 이용 가능한 Cry 및 Cyt 단백질을 포함한다.
해충, 특히 농작물의 해충의 언급은 농작물의 곤충 해충, 특히 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질 독소 종류에 의해 방제되는 나비목 곤충 해충을 의미하는 것으로 의도된다. 그러나, 해충의 언급은 또한 식물의 나비목, 딱정벌레목 또는 반시목 곤충 해충, 및 이들 해충을 표적화하는 독성 물질이 TIC4472, TIC4472PL 또는 TIC1425 단백질 또는 TIC4472, TIC4472PL 또는 TIC1425와 93% 내지 약 100% 동일한 단백질; 또는 TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질 또는 TIC2613 또는 TIC2613PL과 73% 내지 약 100% 동일한 단백질과 함께 동시국재화 또는 존재할 때 선충 및 진균을 포함할 수 있다.
TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질은 일반 기능에 의해 관련되고, 성체, 번데기, 애벌레 및 유충(neonate)을 포함하는 나비목 곤충 종으로부터의 곤충 해충에 대해 살충 활성을 나타낸다.
나비목 목의 곤충은 밤나방과 과(Family Noctuidae)에서의 거염벌레(armyworm), 야도충(cutworm), 자벌레(looper) 및 헬리오티네스(heliothine), 예를 들어 밤나방유충(스포돕테라 푸리기페르다), 근대 거염벌레(스포돕테라 엑시구아), 블랙 거염벌레(스포돕테라 엑셈프타), 써던 거염벌레(스포돕테라 에리다니아), 베르타 거염벌레(마메스트라 컨피구라타), 블랙 야도충(아그로티스 입실론), 양배추 자벌레(트라이쵸플루시아 니), 대두 자벌레(푸슈도풀시아 인클루덴스), 벨벳빈 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스), 그린 클로버웜(하이페나 스카브라), 회색담배나방(헬리오티스 비레센스), 그라눌라테 야도충(아그로티스 수브테라네아), 거염벌레(슈달레티아 유니펀크타), 웨스턴 야도충(아그로티스 오르토고니아); 명나방과 과로부터의 나무좀, 고치 애벌레(casebearer), 흰불나방(webworm), 뿔벌레(coneworm), 양배추벌레 및 알락나방(skeletonizer), 예를 들어 유럽 옥수수 나무좀(오스트리니아 누빌랄리스), 네이블 오렌지 벌레(아멜로이스 트란시텔라(Amyelois transitella)), 옥수수 뿌리 흰불나방(크람부스 칼리지노셀루스(Crambus caliginosellus)), 잔디 흰불나방(헤르페토그람마 리카르시살리스(암엘로이스)), 해바라기 나방(호모에오소마 엘렉텔룸), 명충나방 유충(lesser cornstalk borer)(엘라스모팔푸스 리그노셀루스(Elasmopalpus lignosellus)); 잎말이나방과 과에서의 리프롤러(leafroller), 버드웜(budworm), 종자 벌레 및 과일 벌레, 예를 들어 코드링 나방(Cydia pomonella), 포도 열매 나방(엔도피자 비테아나(Endopiza viteana)), 오리엔탈 과일 나방(그라폴리타 몰레스타(Grapholita molesta)), 해바라기 순나방(술레이마 헬리안타나(Suleima helianthana)); 및 많은 다른 경제적으로 중요한 나비목, 예를 들어 배추좀나방(플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella)), 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라) 및 매미 나방(라이만트리아 디스파(Lymantria dispar))를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 나비목 목의 다른 곤충 해충은 예를 들어 면 잎 벌레(알라바마 아르길라세아), 과일 나무 잎말이 나방(아르칩스 아르기노스필라(Archips argyrospila)), 유럽 잎말이 나방(아르칩스 로사나(Archips rosana)) 및 다른 아르칩스 종(칠로 수프레살리스(Chilo suppressalis), 아시아 쌀 나무좀 또는 쌀 줄기 나무좀), 쌀 잎말이 나방(크나팔로크로시스 메디날리스(Cnaphalocrocis medinalis)), 옥수수 뿌리 흰불나방(크람부스 칼리지노셀루스), 잔디포충나방(bluegrass webworm)(크람부스 테테렐루스), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(디아트라에아 그라디오셀라), 사탕수수 나무좀(디아트라에아 사카랄리스), 가시 솜벌레(spiny bollworm)(에아리아스 인술라나), 점무늬 솜벌레(에아리아스 비텔라), 아메리칸 솜벌레(헬리코베르파 아르미게라), 옥수수 귀벌레(헬리코베르파 제아, 대두 꼬투리벌레 및 면 솜벌레로도 공지됨), 회색담배나방(헬리오티스 비레센스), 잔디 흰불나방(헤르페토그람마 리카르시살리스), 웨스턴 콩 야도충(스티리아코스타 알비코스타), 유럽 포도 나무 나방(로베시아 보트라나), 감귤류 잎나방벌레(필로크니스티스 시트렐라), 큰 하얀 나방(피에리스 브라시카에), 작은 하얀 나방(피에리스 라파에, 수입된 양배추벌레로도 공지됨), 근대 거염벌레(스포돕테라 엑시구아), 담배 야도충(클러스터 애벌레로도 공지된 스포돕테라 리투라) 및 토마토 잎나방벌레(투타 압솔루타)를 포함한다.
본 출원에서 "단리된 DNA 분자" 또는 동등한 용어 또는 구절의 언급은 DNA 분자가 이의 천연 환경 내가 아니라 단독으로 또는 다른 조성물과 조합되어 존재하는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 유기체의 게놈의 DNA 내에 자연에서 발견되는, 핵산 요소, 예컨대 코딩 서열, 인트론 서열, 비번역된 리더 서열, 촉진자 서열, 전사 종결 서열 등은, 이 요소가 유기체의 게놈 내에 및 이것이 자연에서 발견된 게놈 내의 위치에서 있는 한, "단리"된 것으로 고려되지 않는다. 그러나, 이들 요소의 각각, 및 이들 요소의 하위부분은, 이 요소가 유기체의 게놈 내에 및 이것이 자연에서 발견된 게놈 내의 위치에서 있지 않은 한, 본 개시내용의 범위 내에 "단리"될 것이다. 유사하게, 살충 단백질 또는 그 단백질의 임의의 천연 발생 살충 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 뉴클레오타이드 서열이 단백질을 코딩하는 서열이 자연에서 발견되는 박테리아의 DNA 내에 있지 않은 한, 단리된 뉴클레오타이드 서열일 것이다. 천연 발생 살충 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 합성 뉴클레오타이드 서열은 본 개시내용의 목적을 위해 단리된 것으로 고려될 것이다. 본 개시내용의 목적을 위해, 임의의 형질전환 뉴클레오타이드 서열, 즉 식물 또는 박테리아의 세포의 게놈으로 삽입되거나 염색체외 벡터에 존재하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열은, 이것이 세포를 형질전환시키기 위해 사용된 플라스미드 또는 유사한 구조 내에, 식물 또는 박테리아의 게놈 내에 존재하든, 또는 조직, 자손, 생물학적 샘플 또는 식물 또는 박테리아로부터 유래된 소비재에서 검출 가능한 양으로 존재하든 단리된 뉴클레오타이드 서열인 것으로 생각될 것이다.
본 출원에 추가로 기재된 바대로, TIC4747(서열 번호 1)을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)은 바실러스 튜링겐시스 균주 EG10742로부터 얻은 DNA에서 발견되었다. 코딩 서열은 생물검정에서 사용된 재조합 단백질을 생성하기 위해 미생물 숙주 세포에서 클로닝되고 발현된다. TIC1425(서열 번호 5)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)은 바실러스 튜링겐시스 균주 EG10731로부터 얻은 DNA에서 발견되었다. TIC2613(서열 번호 7)을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)은 바실러스 튜링겐시스 균주 EG5408로부터 얻은 DNA에서 발견되었다. TIC4472의 미생물 숙주 세포 유래된 단백질을 이용한 생물검정은 나비목 종 근대 거염벌레(스포돕테라 엑시구아), 옥수수 귀벌레(헬리코베르파 제아), 면 잎 벌레(알라바마 아르길라세아), 유럽 옥수수 나무좀(오스트리니아 누빌랄리스), 밤나방유충(스포돕테라 푸리기페르다), 올드 월드 솜벌레(헬리코베르파 아르미게라), 오리엔탈 잎 벌레(스포돕테라 리투라), 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라), Cry1Ac 내성 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라), 대두 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스), 써던 거염벌레(스포돕테라 에리다니아), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(디아트라에아 그라디오셀라), 점무늬 솜벌레(에아리아스 비텔라), 사탕수수 나무좀(디아트라에아 사카랄리스), 회색담배나방(헬리오티스 비레센스) 및 벨벳콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스)에 대한 활성을 입증하였다. 또한, 활성은 황열 모기(아에데스 아에깁티)에 대해 또한 관찰되었다. TIC1425의 미생물 숙주 세포 유래된 단백질을 이용한 생물검정은 나비목 종 면 잎 벌레(알라바마 아르길라세아), 유럽 옥수수 나무좀(오스트리니아 누빌랄리스), 밤나방유충(스포돕테라 푸리기페르다), 사탕수수 나무좀(디아트라에아 사카랄리스) 및 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(디아트라에아 그라디오셀라에 대해 활성을 입증하였다. TIC2613의 미생물 숙주 세포 유래된 단백질을 사용한 생물검정은 나비목 종 옥수수 귀벌레(헬리코베르파 제아), 면 잎 벌레(알라바마 아르길라세아), 유럽 옥수수 나무좀(오스트리니아 누빌랄리스), 밤나방유충(스포돕테라 푸리기페르다), 대두 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(디아트라에아 그라디오셀라) 및 회색담배나방(헬리오티스 비레센스)에 대해 활성을 입증하였다.
식물 세포에서의 발현을 위해, TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질은 식물 세포의 사이토졸에 있도록 발현되거나 다양한 세포소기관에 표적화될 수 있다. 예를 들어, 엽록체에 대한 단백질의 표적화는 오프-표현형이 생기는 것을 방지하면서 형질전환 식물에서 발현된 단백질의 증가된 수준을 발생시킬 수 있다. 표적화는 형질전환 사건에서 해충 내성 효율의 증가를 또한 발생시킬 수 있다. 표적 펩타이드 또는 통과 펩타이드는 핵, 미토콘드리아, 소포체(ER), 엽록체, 아포플라스트, 퍼옥시좀 및 혈장 막을 포함하는 세포에서 특정한 영역으로 단백질의 운송을 지시하는 짧은(3개 내지 70개의 아미노산 길이) 펩타이드 사슬이다. 몇몇 표적 펩타이드는 단백질이 운송된 후 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다. 엽록체에 대한 표적화를 위해, 단백질은 대략 40개 내지 50개의 아미노산인 통과 펩타이드를 함유한다. 엽록체 통과 펩타이드의 사용의 설명을 위해, 미국 특허 제5,188,642호 및 제5,728,925호를 참조한다. 많은 엽록체 국소화된 단백질은 전구체로서 핵 유전자로부터 발현되고, 엽록체 통과 펩타이드(CTP)에 의해 엽록체로 표적화된다. 이러한 단리된 엽록체 단백질의 예는 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제의 작은 아단위(SSU)와 연관된 것, 페레독신, 페레독신 옥시도리덕타제, 광 수확 복합 단백질 I 및 단백질 II, 티오레독신 F, 엔올피루빌 쉬키메이트 포스페이트 신타아제(EPSPS) 및 미국 특허 제7,193,133호에 기재된 통과 펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비엽록체 단백질이 이종성 CTP와의 단백질 융합의 사용에 의해 엽록체로 표적화될 수 있고, CTP가 엽록체로 단백질을 표적화하기에 충분하다는 것이 생체내 및 시험관내 입증되었다. 적합한 엽록체 통과 펩타이드, 예컨대 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS CTP(CTP2)(문헌[Klee et al., Mol . Gen. Genet. 210:437-442, 1987] 참조) 또는 페투니아 하이브리다 EPSPS CTP(CTP4)(문헌[della-Cioppa et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 83:6873-6877, 1986] 참조)의 혼입은 형질전환 식물에서 엽록체로 이종성 EPSPS 단백질 서열을 표적화하는 것으로 나타났다(미국 특허 제5,627,061호; 제5,633,435호호; 및 제5,312,910호; 및 EP 제0218571호; EP 제189707호; EP 제508909호; 및 EP 제924299호를 참조한다). 엽록체에 대한 TIC6757 또는 TIC6757PL 독소 단백질의 표적화를 위해, 엽록체 통과 펩타이드를 코딩하는 서열은 식물 세포에서 최적 발현을 위해 설계된 TIC6757 또는 TIC6757PL 독소 단백질을 코딩하는 합성 코딩 서열에 작동 가능한 연결로 및 인 프레임으로 5'에 배치된다.
TIC4472, TIC1425 또는 TIC2613과 관련된 추가적인 독소 단백질 서열이 신규한 특성을 갖는 신규한 단백질을 생성하도록 TIC4472, TIC1425 또는 TIC2613의 아미노산 서열을 사용함으로써 이것은 고안된다. TIC4472, TIC1425 또는 TIC2613 독소 단백질은 아미노산 서열 수준에서 신규한 아미노산 서열 변이체로 차이를 조합하고 변이체를 코딩하는 재조합 핵산 서열에 적절한 변화를 만들도록 정렬될 수 있다.
본 개시내용은 추가로 TIC4472 단백질 독소 종류의 개선된 변이체가 당해 분야에 공지된 다양한 유전자 편집 방법을 이용함으로써 식물계에서 조작될 수 있다는 것을 고려한다. 게놈 편집에 사용된 이러한 기술은 ZFN(아연-핑거 뉴클레아제), 메가뉴클레아제, TALEN(전사 활성자 유사 효과기 뉴클레아제) 및 CRISPR(일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열)/Cas(CRISPR 연관된) 시스템을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 게놈 편집 방법은 상이한 독소 코딩 서열에 대한 식물 세포 내에 형질전환된 독소 단백질 코딩 서열을 변경하도록 사용될 수 있다. 구체적으로, 이들 방법을 통해, 독소 코딩 서열 내의 하나 이상의 코돈은 새로운 단백질 아미노산 서열을 조작하도록 변경된다. 대안적으로, 코딩 서열 내의 단편은 대체되거나 결실되거나, 추가적인 DNA 단편은 새로운 독소 코딩 서열을 조작하도록 코딩 서열로 삽입된다. 새로운 코딩 서열은 곤충 해충에 대해 새로운 특성, 예컨대 증가된 활성 또는 스펙트럼을 갖는 독소 단백질을 코딩하면서, 원래의 곤충 독소 단백질에 대해 내성을 발생시킨 곤충 해충 종에 대해 활성을 제공할 수 있다. 유전자 편집된 독소 코딩 서열을 포함하는 식물 세포는 새로운 독소 단백질을 발현하는 전체 식물을 생산하도록 당해 분야에 공지된 방법에 의해 사용될 수 있다.
TIC4472, TIC1425 또는 TIC2613의 단편 또는 이의 단백질 변이체가 절두된 형태일 수 있는 것으로 또한 고안되고, 여기서 하나 이상의 아미노산은 N 말단 끝, C 말단 끝, 단백질의 중간, 또는 이의 조합으로부터 결실되고, 여기서 단편 및 변이체는 곤충 저해 활성을 보유한다. 이 단편은 TIC4472, TIC1425 또는 TIC2613의 천연 발생 또는 합성 변이체 또는 유래된 단백질 변이체일 수 있지만, 적어도 TIC4472, TIC1425 또는 TIC2613의 곤충 저해 활성을 보유해야 한다. 본 명세서에 기재된 단편 또는 변이체는 단백질의 살충 활성을 담당하는 본 명세서에서 확인된 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 단백질을 닮은 단백질은 당해 분야에 공지된 다양한 컴퓨터 기반 알고리즘을 이용하여 확인되고 서로에 비교될 수 있다(표 1 및 표 2 참조). 본 출원에 보고된 아미노산 서열 동일성은 이 디폴트 매개변수를 이용한 Clustal W 정렬의 결과이다: 가중 매트릭스: blosum, 갭 오프닝 패널티: 10.0, 갭 연장 패널티: 0.05, 친수성 갭: On, 친수성 잔기: GPSNDQERK, 잔기 특정 갭 패널티: On(Thompson, et al (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). 퍼센트 아미노산 동일성은 100% x (아미노산 동일성/해당 단백질의 길이)의 곱에 의해 추가로 계산된다. 다른 정렬 알고리즘은 또한 당해 분야에서 이용 가능하고, Clustal W 정렬을 이용하여 얻은 것과 유사한 결과를 제공하고, 본 명세서에서 고안된다.
나비목 곤충 종에 대해 곤충 저해 활성을 나타내는 단백질은 단백질이 예를 들어 Clustal W 정렬에서 쿼리에서 사용되는 경우 TIC4472, TIC4472PL 또는 TIC1425와 관련되고, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 바와 같은 본 발명의 단백질은 쿼리 단백질이 이 범위에서 약 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 임의의 분수 백분율인 쿼리 단백질의 길이를 따라 적어도 93% 내지 약 100%의 아미노산 동일성을 나타내는 이러한 정렬에서 히트로서 확인되는 것으로 의도된다. 나비목 곤충 종에 대해 곤충 저해 활성을 나타내는 단백질은 단백질이 예를 들어 Clustal W 정렬에서 쿼리에서 사용되는 경우 TIC2613 또는 TIC2613PL과 관련되고, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10에 기재된 바와 같은 본 발명의 단백질은 쿼리 단백질이 이 범위에서 약 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 임의의 분수 백분율인 쿼리 단백질의 길이를 따라 적어도 73% 내지 약 100%의 아미노산 동일성을 나타내는 이러한 정렬에서 히트로서 확인되는 것으로 또한 의도된다.
예시적인 단백질 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL을 Clustal W 알고리즘을 이용하여 서로에 정렬하였다. 각각의 전장 단백질에 대한 퍼센트 아미노산 서열 동일성의 쌍별 매트릭스는 표 1에 보고된 바대로 생성되었다.
Figure pct00001
퍼센트 동일성 이외에, TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 및 관련된 단백질은 1차 구조(보존된 아미노산 모티프), 길이(약 1187개의 아미노산) 및 다른 특징에 의해 또한 관련될 수 있다. TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 단백질 독소의 특징은 표 2에 기록되어 있다.
Figure pct00002
본 출원의 예에 추가로 예시된 바대로, TIC4472, TIC4472PL의 변이체 및 TIC2613, TIC2613PL의 변이체를 코딩하는 합성 핵산 분자 서열을 식물에서 사용하도록 설계하였다. TIC4472PL 단백질을 코딩하는 식물에서 사용하도록 설계된 예시적인 재조합 핵산 분자 서열은 서열 번호 3으로서 제시된다. TIC2613PL 단백질을 코딩하는 식물에서 사용하도록 설계된 예시적인 재조합 핵산 분자 서열은 서열 번호 9로서 제시된다. TIC4472PL 및 TIC2613PL 단백질은 각각 TIC4472 및 TIC2613 단백질에 대해 출발 메티오닌 바로 뒤에 추가적인 알라닌 아미노산을 갖는다. TIC4472 및 TIC2613 아미노산 서열로 삽입된 추가적인 알라닌 잔기는 식물계에서 단백질의 발현을 개선하는 것으로 생각된다. 마찬가지로, TIC1425의 변이체를 코딩하는 합성 핵산 분자 서열은 식물에서 사용하도록 설계될 수 있다.
TIC4472PL 단백질을 발현하는 R0 면 잎 조직을 사용한 잎 디스크 검정은 대두 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스) 및 회색담배나방(헬리오티스 비레센스)에 대해 높은 활성 및 면 솜벌레(헬리코베르파 제아) 및 밤나방유충(스포돕테라 푸리기페르다)에 대해 낮은 활성을 입증하였다. TIC4472PL 단백질을 발현하는 R0 대두 잎 조직을 사용한 잎 디스크 검정은 써던 거염벌레(스포돕테라 에리다니아) 및 대두 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스)에 대해 활성을 입증하였다.
TIC4472PL 및 TIC2613PL 단백질을 발현하는 R0 대두 식물로부터의 잎 샘플은 써던 거염벌레(스포돕테라 에리다니아) 및 대두 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스)에 대해 활성을 입증하였다.
재조합 핵산 분자 서열을 함유하는 발현 카세트 및 벡터는 당해 분야에 공지된 형질전환 방법 및 기법에 따라 작제되고 옥수수, 대두, 면 또는 다른 식물 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 아그로박테륨 매개된 형질전환은 미국 특허 출원 공보 제2009/0138985A1호(대두), 2008/0280361A1호(대두), 2009/0142837A1호(옥수수), 2008/0282432호(면), 2008/0256667호(면), 2003/0110531호(밀), 2001/0042257 A1호(사탕무), 미국 특허 제5,750,871호(카놀라), 7,026,528호(밀) 및 6,365,807호(쌀) 및 문헌[Arencibia et al. (1998) Transgenic Res. 7:213-222 (sugarcane)](이들 모두 본 명세서에서 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 형질전환된 세포는 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 단백질을 발현하고 형질전환된 식물로부터 얻은 식물 잎 디스크를 사용하여 나비목 해충 애벌레의 존재 하에 수행된 생물검정을 이용하여 살충 활성을 나타낸 형질전환된 식물로 재생될 수 있다. 식물은 재생, 종자, 화분 또는 분열조직 형질전환 기법에 의해 식물 세포로부터 유래될 수 있다. 식물을 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
전통적인 형질전환 방법에 대한 대안으로서, DNA 서열, 예컨대 전이유전자, 발현 카세트(들) 등은 부위 지시된 통합을 통해 식물 또는 식물 세포의 게놈 내의 특정한 부위 또는 유전좌위로 삽입되거나 통합될 수 있다. 본 개시내용의 재조합 DNA 작제물(들) 및 분자(들)는 이에 따라 적어도 하나의 전이유전자를 포함하는 도너 주형 서열, 발현 카세트, 또는 식물 또는 식물 세포의 게놈으로의 삽입을 위해 다른 DNA 서열을 포함할 수 있다. 부위 지시된 통합을 위한 이러한 도너 주형은 삽입 서열을 플랭킹하는 1개 또는 2개의 상동성 아암(즉, 식물 게놈으로 삽입되는 서열, 전이유전자, 카세트 등)을 추가로 포함할 수 있다. 본 개시내용의 재조합 DNA 작제물(들)은 부위 지시된 통합을 수행하도록 부위 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 발현 카세트(들) 및/또는 임의의 연관된 단백질(들)을 추가로 포함할 수 있다. 카세트(들)를 발현하는 이 뉴클레아제는 도너 주형(시스로)으로서 동일한 분자 또는 벡터에서 또는 별개의 분자 또는 벡터(트랜스로)에 존재할 수 있다. 부위 지시된 통합을 위한 몇몇 방법은 원하는 게놈 부위 또는 유전좌위에서 이중 가닥 파괴(double strand break: DSB) 또는 닉(nick)을 생성하도록 게놈 DNA를 절단시키는 상이한 단백질(또는 단백질 및/또는 가이드 RNA의 복합체)을 수반하는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 간단히 당해 분야에서 이해되는 것처럼, 뉴클레아제 효소에 의해 도입된 DSB 또는 닉을 보수하는 과정 동안에, 도너 주형 DNA는 DSB 또는 닉의 부위에서 게놈으로 통합될 수 있다. 도너 주형에서의 상동성 아암(들)의 존재는 상동성 재조합을 통해 보수 과정 동안 식물 게놈으로의 삽입 서열의 입양 및 표적화를 촉진할 수 있지만, 삽입 사건은 비상동성 말단 연결(non-homologous end joining: NHEJ)을 통해 생길 수 있다. 사용될 수 있는 부위 특이적 뉴클레아제의 예는 아연-핑거 뉴클레아제, 조작된 또는 네이티브 메가뉴클레아제, TALE-엔도뉴클레아제 및 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)를 포함한다. RNA 가이드된 부위 특이적 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)를 사용한 방법을 위해, 재조합 DNA 작제물(들)은 식물 게놈 내에 원하는 부위로 뉴클레아제를 지시하도록 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 서열을 또한 포함할 것이다.
본 명세서에 사용된 바대로, "재조합 DNA 분자"는 인간 중재 없이 함께 천연에서 생기지 않는 DNA 분자의 조합을 포함하는 DNA 분자이다. 예를 들어, 재조합 DNA 분자는 서로에 대해 적어도 2개의 DNA 분자 이종성으로 이루어진 DNA 분자, 자연에 존재하는 DNA 서열로부터 벗어난 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 유전자 형질전환 또는 유전자 편집에 의해 숙주 세포의 DNA로 도입된 DNA 분자일 수 있다. 유사하게, "재조합 단백질 분자"는 인간 중재 없이 함께 천연에서 생기지 않는 아미노산의 조합을 포함하는 단백질 분자이다. 예를 들어, 재조합 단백질 분자는 서로에 대해 적어도 2개의 아미노산 분자 이종성으로 이루어진 단백질 분자, 천연에 존재하는 아미노산 서열로부터 벗어난 아미노산 서열을 포함하는 단백질 분자 또는 숙주 세포의 유전자 형질전환의 결과로서 또는 숙주 세포 게놈의 유전자 편집에 의해 숙주 세포에서 발현된 단백질 분자일 수 있다.
TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL을 코딩하는 재조합 핵산 분자 조성물이 고안된다. 예를 들어, TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 단백질은 단백질을 코딩하는 ORF를 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자가 유전자 발현 요소, 예컨대 촉진자 및 작제물이 의도되는 시스템에서 발현에 필요한 임의의 다른 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 재조합 DNA 작제물과 발현될 수 있다. 비제한적인 예는 식물에서 단백질의 발현을 위한 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 식물 작용성 촉진자 또는 Bt 박테리아 또는 다른 바실러스 종에서의 단백질의 발현을 위한 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 Bt-작용성 촉진자를 포함한다. 다른 요소는 인핸서, 인트론, 비번역된 리더, 코딩된 단백질 부동화 태그(HIS-태그), 전위 펩타이드(즉, 색소체 통과 펩타이드, 신호 펩타이드), 번역 후 변형 효소에 대한 폴리펩타이드 서열, 리보솜 결합 부위 및 RNAi 표적 부위(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서와 제공된 예시적인 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열 번호 4, 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 8 및 서열 번호 10에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 각각의 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 서열 번호 3, 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 7 및 서열 번호 9에 작동 가능하게 연결된 이종성 촉진자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이종성 촉진자는 또한 색소체 표적화된 TIC4472PL 또는 TIC2613PL; 또는 비표적화된 TIC4472PL 또는 TIC2613PL을 코딩하는 합성 DNA 코딩 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에 개시된 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 코돈은 동의 코돈에 의해 치환될 수 있다(당해 분야에서 침묵 치환으로 공지됨).
TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질 코딩 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물은 또한 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질, TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질과 다른 단백질, 곤충 저해 dsRNA 분자 또는 보조 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 동반 발현하거나 동시 발현하도록 구성될 수 있는 하나 이상의 곤충 저해 물질을 코딩하는 DNA의 영역을 포함한다. 보조 단백질은 보인자, 효소, 결합-파트너 또는 예를 들어 이의 발현을 보조하고, 식물에서 이의 안정성에 영향을 미치고, 올리고머화에 대해 자유 에너지를 최적화하고, 이의 독성을 증대시키고, 활성에 대한 이의 스펙트럼을 증가시킴으로써 곤충 저해 물질의 유효성을 보조하도록 기능하는 다른 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 보조 단백질은 예를 들어 하나 이상의 곤충 저해 물질의 흡수를 촉진하거나 독성 물질의 독성 효과를 강화시킬 수 있다.
재조합 DNA 작제물은 조립될 수 있어서, 모든 단백질 또는 dsRNA 분자는 하나의 촉진자로부터 발현되거나, 각각의 단백질 또는 dsRNA 분자는 별개의 촉진자 제어 또는 이의 몇몇 조합 하에 있다. 본 발명의 단백질은 선택된 발현 시스템의 유형에 따라 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL의 하나 이상의 단백질이 다른 오픈 리딩 프레임 및 촉진자를 또한 함유하는 일반 뉴클레오타이드 분절로부터 발현된 멀티-유전자 발현 시스템으로부터 발현될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 멀티-유전자 발현 시스템은 단일 오페론 내로부터 다중 연결된/탠덤 오픈 리딩 프레임의 발현(즉, 폴리시스트론성 발현)을 추진시키도록 단일 촉진자를 이용할 수 있다. 또 다른 예에서, 식물 멀티-유전자 발현 시스템은 다중 비연결된 또는 연결된 발현 카세트를 이용할 수 있고, 각각의 카세트는 상이한 단백질 또는 다른 물질, 예컨대 하나 이상의 dsRNA 분자를 발현한다.
TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질 코딩 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 DNA 작제물은 벡터, 예를 들어 플라스미드, 바큘로바이러스, 합성 염색체, 비리온, 코스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 이러한 벡터는 숙주 세포에서 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질 코딩 서열의 안정한 또는 일시적인 발현, 또는 코딩된 폴리펩타이드의 후속하는 발현을 달성하도록 사용될 수 있다. 숙주 세포로 도입된 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질 코딩 서열을 포함하는 외인성 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 DNA 작제물은 본 출원에서 "전이유전자"라 칭해진다.
TIC4472의 임의의 하나 이상을 발현하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 관련된 과 독소 단백질 코딩 서열을 함유하는 형질전환 박테리아, 형질전환 식물 세포, 형질전환 식물 및 형질전환 식물 부분은 본 명세서에 제공된다. 용어 "박테리아 세포" 또는 "박테리아"는 아그로박테륨, 바실러스, 에스체리치아, 살모넬라, 슈도모나스, 브레비바실러스, 클레브시엘라, 에르위니아 또는 리조븀 세포를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 용어 "식물 세포" 또는 "식물"은 쌍떡잎식물 또는 외떡잎식물 식물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 용어 "식물 세포" 또는 "식물"은 또한 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 배추속, 당근, 카사바, 피마자, 꽃양배추, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 면, 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 상추, 테에다 소나무, 수수, 멜론, 견과, 귀리, 올리브, 양파, 관상품, 팜, 목초, 완두콩, 땅콩, 후추, 나무콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디아타 소나무, 무, 유채, 쌀, 근경, 호밀, 잇꽃, 관목, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕 옥수수, 스위트 검, 고구마, 스위치그래스, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디, 수박 및 밀 식물 세포 또는 식물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 실시형태에서, 형질전환 식물 및 형질전환 식물 세포로부터 재생된 형질전환 식물 부분이 제공된다. 소정의 실시형태에서, 형질전환 식물은 식물로부터의 부분을 절단, 스내핑, 분쇄 또는 달리 분리함으로써 형질전환 종자로부터 얻을 수 있다. 소정의 실시형태에서, 식물 부분은 종자, 꼬투리, 잎, 꽃, 줄기, 뿌리 또는 임의의 이의 일부, 또는 형질전환 식물 부분의 생식 불가 부분일 수 있다. 이 문맥에서 사용된 바대로, 형질전환 식물 부분의 "생식 불가" 부분은 전체 식물을 형성하도록 유도될 수 없거나, 유성 및/또는 무성 생식을 할 수 있는 전체 식물을 형성하도록 유도될 수 없는 부분이다. 소정의 실시형태에서, 식물 부분의 생식 불가 부분은 형질전환 종자, 꼬투리, 잎, 꽃, 줄기 또는 뿌리의 부분이다.
TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질의 곤충, 나비목 저해 양을 포함하는 형질전환 식물을 제조하는 방법이 제공된다. 이러한 식물은 본 출원에서 제공된 임의의 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 도입하고, 단백질의 곤충, 나비목 저해 양을 발현하는 상기 식물 세포로부터 유래된 식물을 선택함으로써 제조될 수 있다. 식물은 재생, 종자, 화분 또는 분열조직 형질전환 기법에 의해 식물 세포로부터 유래될 수 있다. 식물을 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
처리된 식물 생성물(여기서, 처리된 생성물은 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질의 검출 가능한 양을 포함하고, 곤충 저해 분절 또는 이의 단편, 또는 이의 임의의 구별 부분은 또한 본 명세서에 개시된다. 소정의 실시형태에서, 처리된 생성물은 식물 부분, 식물 바이오매스, 오일, 가루, 당, 동물 공급물, 밀가루, 플레이크, 겨, 린트, 껍질, 처리된 종자 및 종자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 처리된 생성물은 생식 불가이다. 식물 생성물은 형질전환 식물 또는 형질전환 식물 부분으로부터 유래된 상업의 원자재 또는 다른 생성물을 포함할 수 있고, 원자재 또는 다른 생성물은 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질의 구별 부분을 코딩하거나 포함하는 뉴클레오타이드 분절 또는 발현된 RNA 또는 단백질을 검출함으로써 상업품을 통해 추적될 수 있다.
TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질을 발현하는 식물은 다른 독소 단백질을 발현하고/하거나 다른 형질전환 특징, 예컨대 제초제 관용성 유전자, 수율 또는 스트레스 관용성 특질 등을 부여하는 유전자를 발현하는 형질전환과 육종에 의해 교배될 수 있거나, 이러한 특질은 단일 벡터에서 조합될 수 있어서 특질은 모두 연결된다.
본 출원에서 "단리된" DNA 분자 또는 아미노산 분자, 또는 동등한 용어 또는 구절의 언급은 DNA 분자 또는 아미노산 분자가 이의 천연 환경 내에서가 아니라 단독으로 또는 다른 조성물과 조합되어 존재한다는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, DNA 분자 또는 아미노산 분자는, 그 요소가 유기체의 게놈 내에 및 이것이 자연에서 발견된 게놈 내의 위치에서 있지 않은 한, 본 개시내용의 범위 내에 "단리"될 것이다. 본 개시내용의 목적을 위해, 임의의 형질전환 뉴클레오타이드 서열, 즉 식물 또는 박테리아의 세포의 게놈으로 삽입된, 또는 염색체외 벡터 내에 존재하는, DNA의 뉴클레오타이드 서열은, 세포를 형질전환시키기 위해 사용된 플라스미드 또는 유사한 구조 내에, 식물 또는 박테리아의 게놈 내에 존재하거나, 조직, 자손, 생물학적 샘플 또는 식물 또는 박테리아로부터 유래된 소비재에서 검출 가능한 양으로 존재하든지, 단리된 뉴클레오타이드 서열인 것으로 간주될 것이다.
실시예에 추가로 기재된 바대로, TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL 단백질 코딩 서열 및 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL과 실질적인 백분율 동일성을 갖는 서열은 당업자에게 공지된 방법, 예컨대 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 열 증폭 및 혼성화를 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 단백질 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL은 관련된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하도록 사용될 수 있고, 밀접하게 관련된 다른 단백질 구성원을 스크리닝하고 발견하기 위해 사용될 수 있다.
게다가, TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 독소 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 스크리닝이 열 사이클 또는 등온 증폭 및 혼성화 방법을 이용하여 종류의 다른 구성원을 확인하기 위한 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 3에 기재된 바와 같은 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드는 소비재로부터 유래된 데옥시리보핵산 샘플에서 TIC4472PL 전이유전자의 존재 또는 부재를 결정하도록 사용될 수 있다. 서열 번호 7에 기재된 바와 같은 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드는 소비재로부터 유래된 데옥시리보핵산 샘플에서 TIC2613PL 전이유전자의 존재 또는 부재를 결정하도록 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 소정의 핵산 검출 방법의 감수성을 고려하면, 서열 번호 3 또는 서열 번호 9에 기재된 바와 같은 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드가 오직 소비재의 분획이 임의의 전이유전자를 함유하는 형질전환 식물로부터 유래된 혼주된 소스로부터 유래된 소비재에서 TIC4472PL 또는 TIC2613PL 전이유전자를 검출하도록 사용될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드가 서열 번호 3 및 서열 번호 9의 각각에서 뉴클레오타이드 서열 변이를 도입하도록 사용될 수 있다는 것이 추가로 인식된다. 이러한 "돌연변이유발" 올리고뉴클레오타이드는 형질전환 식물 숙주 세포에서 곤충 저해 활성 또는 변하는 발현의 범위를 나타내는 TIC4472PL 및 TIC2613PL 아미노산 서열 변이체의 확인에 유용하다.
뉴클레오타이드 서열 동족체, 예를 들어 엄격한 혼성화 조건 하게 본 출원에 개시된 각각의 또는 임의의 서열에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 살충 단백질은 또한 본 발명의 실시형태이다. 본 발명은 또한 제2 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 제1 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 방법을 제공하고, 여기서 제1 뉴클레오타이드 서열(또는 이의 역 보체 서열)은 살충 단백질 또는 이의 살충 단편을 코딩하고, 제2 뉴클레오타이드 서열에 혼성화된다. 이러한 경우에, 제2 뉴클레오타이드 서열은 엄격한 혼성화 조건 하에 서열 번호 3, 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 7 또는 서열 번호 9로서 제시된 임의의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 뉴클레오타이드 코딩 서열은 적절한 혼성화 조건, 예컨대 엄격한 혼성화 조건 하에 서로에 혼성화되고, 이들 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 단백질은 다른 단백질 중 어느 하나에 대해 키워진 항혈청과 상호작용한다. 본 명세서에 정의된 바와 같은, 엄격한 혼성화 조건은 적어도 42℃에서의 혼성화, 이어서 2X SSC, 0.1% SDS에 의해 실온에서의 각각 5분 동안 2회의 세척, 이어서 0.5X SSC, 0.1% SDS 중의 65℃에서의 각각 30분 동안 2회의 세척을 포함한다. 훨씬 더 높은 온도에서의 세척은 훨씬 더 엄격한 조건, 예를 들어 68℃의 혼성화 조건, 이어서 0.1% SDS를 함유하는 2xSSC 중의 68℃에서의 세척을 구성한다.
당업자는, 유전자 코드의 중복으로 인해, 많은 다른 서열이 이러한 관련된 단백질을 코딩할 수 있고, 이들 서열이 바실러스 균주 또는 식물 세포에서 살충 단백질을 발현하도록 작용하는 정도로 본 발명의 실시형태라는 것을 인식할 것이어서, 물론 많은 이러한 중복 코딩 서열이 이들 조건 하에 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL을 코딩하는 네이티브 바실러스 서열에 혼성화되지 않는다는 것을 인식한다. 본 출원은 TIC4472, TIC1425 및 TIC2613 단백질 코딩 서열 및 TIC4472, TIC1425 및 TIC2613 단백질 코딩 서열에 실질적인 백분율 동일성을 갖는 서열을 확인하기 위해 당업자에게 공지된 이들 및 다른 확인 방법의 사용을 고려한다.
본 개시내용은 또한 살충 단백질로부터의 단백질의 키메라를 포함하는 상업적으로 유용한 단백질을 조작하고 클로닝하기 위한 당해 분야에 공지된 분자 방법의 용도를 고려하고; 예를 들어, 키메라는 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 단백질의 분절과 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 및 관련된 단백질과 다른 다양한 단백질의 분절과의 어셈블리를 포함하는 추가적인 유용한 실시형태를 유도화하기 위한 단백질인 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 또는 TIC2613PL의 분절로부터 어셈블링될 수 있다. TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 단백질은 서로에 및 다른 바실러스 튜링겐시스 또는 다른 살충 단백질(이들이 밀접하게 또는 멀리 계통발생적으로 관련되든 또는 아니든)에 정렬하도록 처리될 수 있고, 정렬된 단백질 사이에서 치환에 유용한 각각의 이러한 단백질의 분절이 확인될 수 있어서, 키메라 단백질의 작제를 발생시킨다. 이러한 키메라 단백질은 해충 생물검정 분석으로 처리되고, 키메라에서의 각각의 이러한 분절이 유래된 모 단백질과 비교하여, 증가한 생물활성 또는 확대된 표적 해충 스펙트럼의 존재 또는 부재에 대해 규명될 수 있다. 폴리펩타이드의 살충 활성은 도메인 또는 분절을 다른 단백질과 스와핑함으로써 또는 당해 분야에 공지된 지향된 진화 방법을 이용함으로써 특정한 해충 또는 더 넓은 스펙트럼의 해충에 대한 활성에 대해 추가로 조작될 수 있다.
TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 단백질에 의해 곤충, 특히 농작물의 나비목 침입을 방제하는 방법이 본 출원에 또한 개시되어 있다. 이러한 방법은 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 독소 단백질의 곤충 또는 나비목 저해 양을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 이러한 방법은 (i) 식물을 생성시키는 식물 또는 종자에 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 독소 단백질을 포함하거나 이들을 코딩하는 임의의 조성물을 시비하는 단계; 및 (ii) TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 독소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 식물 또는 식물을 생산하는 식물 세포를 형질전환시키는 단계 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 독소 단백질이 조성물에서 제공되거나, 미생물에서 제공되거나, 형진전환 식물에서 제공될 수 있어서, 나비목 곤충에 대해 곤충 저해 활성을 부여한다는 것이 고안된다.
소정의 실시형태에서, TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 독소 단백질의 재조합 핵산 분자는 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 독소 단백질을 발현시키기에 적합한 조건 하에 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 독소 단백질을 발현시키도록 형질전환된 재조합 바실러스 또는 임의의 다른 재조합 박테리아 세포를 배양함으로써 제조된 곤충 저해 조성물의 살충 활성 성분이다. 이러한 조성물은 상기 재조합 폴리펩타이드를 발현/생산하는 이러한 재조합 세포의 배양물의 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강 또는 농축에 의해 제조될 수 있다. 이러한 공정은 바실러스 또는 다른 곤충 병원성 박테리아 세포 추출물, 세포 현탁액, 세포 균질액, 세포 용해물, 세포 상청액, 세포 여과액 또는 세포 펠릿을 생성시킬 수 있다. 이렇게 생산된 재조합 폴리펩타이드를 얻음으로써, 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 박테리아 세포, 박테리아 포자 및 부아포 봉입체를 포함할 수 있고, 농업적 곤충 저해 스프레이 생성물로서 또는 식이 생물검정에서의 곤충 저해 제제로서를 포함하여 다양한 용도에 대해 제제화될 수 있다.
일 실시형태에서, 내성 발생의 가능성을 감소시키기 위해, TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL을 포함하는 곤충 저해 조성물은 동일한 나비목 곤충 종에 대해 곤충 저해 활성을 나타내지만 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 독소 단백질과 다른 적어도 하나의 추가적인 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조성물에 가능한 추가적인 폴리펩타이드는 곤충 저해 단백질 및 곤충 저해 dsRNA 분자를 포함한다. 곤충 해충을 방제하기 위한 이러한 리보뉴클레오타이드 서열의 사용을 위한 하나의 예는 Baum 등에 기재되어 있다(미국 특허 공보 제2006/0021087호 A1). 나비목 해충의 방제를 위한 이러한 추가적인 폴리펩타이드는 곤충 저해 단백질, 예컨대 Cry1A(미국 특허 제5,880,275호), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B(미국 특허 공보 제10/525,318호), Cry1C(미국 특허 제6,033,874), Cry1D, Cry1Da 및 이들의 변이체(이들로 제한되지는 않음), Cry1E, Cry1F 및 Cry1A/F 키메라(미국 특허 제7,070,982호; 제6,962,705호; 및 제6,713,063호), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry1-type 키메라, 예컨대 TIC836, TIC860, TIC867, TIC869 및 TIC1100(국제 출원 공보 WO 제2016/061391호(A2)), TIC2160(국제 출원 공보 WO 제2016/061392호(A2)), Cry2A, Cry2Ab(미국 특허 제7,064,249호), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400,, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 및 AXMI-045(미국 특허 공보 제2013-0117884호 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100(미국 특허 공보 제2013-0310543호 A1), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005(미국 특허 공보 제2013-0104259호 A1), AXMI-134(미국 특허 공보 제2013-0167264호 A1), AXMI-150(미국 특허 공보 제2010-0160231호 A1), AXMI-184(미국 특허 공보 제2010-0004176호 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, axmi209(미국 특허 공보 제2011-0030096호 A1), AXMI-218, AXMI-220(미국 특허 공보 제2014-0245491호 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z(미국 특허 공보 제2014-0196175호 A1), AXMI-238(미국 특허 공보 제2014-0033363호 A1), AXMI-270(미국 특허 공보 제2014-0223598호 A1), AXMI-345(미국 특허 공보 제2014-0373195호 A1), AXMI-335(국제 출원 공보 WO 제2013/134523호(A2)), DIG-3(미국 특허 공보 제2013-0219570호 A1), DIG-5(미국 특허 공보 제2010-0317569호 A1), DIG-11(미국 특허 공보 제2010-0319093호 A1), AfIP-1A 및 이의 유도체(미국 특허 공보 제2014-0033361호 A1), AfIP-1B 및 이의 유도체(미국 특허 공보 제2014-0033361호 A1), PIP-1APIP-1B(미국 특허 공보 제2014-0007292호 A1), PSEEN3174(미국 특허 공보 제2014-0007292호 A1), AECFG-592740(미국 특허 공보 제2014-0007292호 A1), Pput_1063(미국 특허 공보 제2014-0007292호 A1), DIG-657(국제 출원 공보 WO 제2015/195594호(A2)), Pput_1064(미국 특허 공보 제2014-0007292호 A1), GS-135 및 이의 유도체(미국 특허 공보 제2012-0233726호 A1), GS153 및 이의 유도체(미국 특허 공보 제2012-0192310호 A1), GS154 및 이의 유도체(미국 특허 공보 제2012-0192310호 A1), GS155 및 이의 유도체(미국 특허 공보 제2012-0192310호 A1), 미국 특허 공보 제2012-0167259호 A1에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 및 이의 유도체, 미국 특허 공보 제2012-0047606호 A1에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 및 이의 유도체, 미국 특허 공보 제2011-0154536호 A1에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 및 이의 유도체, 미국 특허 공보 제2011-0112013호 A1에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 및 이의 유도체, 미국 특허 공보 제2010-0192256호 A1에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 및 4 및 이의 유도체, 미국 특허 공보 제2010-0077507호 A1에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 및 이의 유도체, 미국 특허 공보 제2010-0077508호 A1에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 및 이의 유도체, 미국 특허 공보 제2009-0313721호 A1에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 및 이의 유도체, 미국 특허 공보 제2010-0269221호 A1에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 또는 4 및 이의 유도체, 미국 특허 제7,772,465호(B2)에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 및 이의 유도체, WO 제2014/008054호 A2에 기재된 바와 같은 CF161_0085 및 이의 유도체, US 특허 공보 US 제2008-0172762호 A1, US 제2011-0055968호 A1 및 US 제2012-0117690호 A1에 기재된 바와 같은 나비목 독성 단백질 및 이의 유도체; US 제7510878호(B2)에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 및 이의 유도체, 미국 특허 제7812129호(B1)에 기재된 바와 같은 서열 번호 2 및 이의 유도체; 등(이들로 제한되지는 않음)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 실시형태에서, 이러한 조성물/제제는 얻은 곤충 저해의 스펙트럼을 확장시키도록 달리 본 발명의 곤충 저해 단백질에 의해 저해되지 않는 곤충에 대한 곤충 저해 활성을 나타내는 적어도 하나의 추가적인 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 반시목 해충의 방제를 위해, 본 발명의 곤충 저해 단백질의 조합은 반시목 활성 단백질, 예컨대 TIC1415(US 특허 공보 제2013-0097735호 A1), TIC807(미국 특허 제8609936호), TIC834(미국 특허 공보 제2013-0269060호 A1), AXMI-036(미국 특허 공보 제2010-0137216호 A1) 및 AXMI-171(미국 특허 공보 제2013-0055469호 A1)와 사용될 수 있다. 딱정벌레목 해충의 방제를 위한 추가의 폴리펩타이드는 곤충 저해 단백질, 예컨대 Cry3Bb(미국 특허 제6,501,009호), Cry1C 변이체, Cry3A 변이체, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134(미국 특허 공보 제2013-0167264호 A1) AXMI-184(미국 특허 공보 제2010-0004176호 A1), AXMI-205(미국 특허 공보 제2014-0298538호 A1), axmi207(미국 특허 공보 제2013-0303440호 A1), AXMI-218, AXMI-220(미국 특허 공보 제20140245491호 A1), AXMI-221z, AXMI-223z(미국 특허 공보 제2014-0196175호 A1), AXMI-279(미국 특허 공보 제2014-0223599호 A1), AXMI-R1 및 이의 변이체(미국 특허 공보 제2010-0197592호 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10(미국 특허 공보 제2010-0319092호 A1), eHIP(미국 특허 출원 공보 제2010/0017914호), IP3 및 이의 변이체(미국 특허 공보 제2012-0210462호 A1) 및 ω-헥사톡신-Hv1a(미국 특허 출원 공보 제2014-0366227호 A1)(이들로 제한되지는 않음)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
딱정벌레목, 나비목 및 반시목 곤충 해충의 방제를 위한 추가적인 폴리펩타이드는 Neil Crickmore에 의해 유지되는 바실러스 튜링겐시스 독소 명명법 웹사이트(btnomenclature.info에서의 world wide web에서)에서 발견될 수 있다.
곤충이 소정의 살충제에 대해 내성을 발생시킬 가능성은 당해 분야에 문서기록되어 있다. 하나의 곤충 내성 관리 전략은 상이한 작용 방식을 통해 작동하는 2개의 구별되는 곤충 저해 물질을 발현하는 형진전환 작물을 사용하는 것이다. 따라서, 곤충 저해 물질 중 어느 하나에 내성을 갖는 임의의 곤충은 다른 곤충 저해 물질에 의해 방제될 수 있다. 또 다른 곤충 내성 관리 전략은 이러한 비보호된 식물에 대한 은신처를 제공하도록 표적화된 나비목 해충 종에 보호되지 않는 식물의 사용을 이용한다. 하나의 특정한 예는 미국 특허 제6,551,962호(참고로 그 전문이 포함됨)에 기재되어 있다.
종자 처리에서 단백질과 사용되는 본 명세서에 개시된 단백질, 스프레이 온, 드립 온 또는 와이프 온 제제에 의해 또한 방제되는 해충을 방제하도록 설계된 다른 실시형태, 예컨대 국소로 시비된 살충 화학물질은 토양에 직접 시비되거나(토양 관주), 본 명세서에 개시된 단백질을 발현하는 성장하는 식물에 시비되거나, 개시된 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 전이유전자를 함유하는 종자에 시비되도록 제제화될 수 있다. 종자 처리에서 사용하기 위한 이러한 제제는 당해 분야에 공지된 다양한 스티커(sticker) 및 점착제와 시비될 수 있다. 이러한 제제는 개시된 단백질과 작용 방식에서 상승적인 농약을 함유할 수 있어서, 제제 농약은 개시된 단백질에 의해 방제될 수 있는 동일한 또는 유사한 해충을 방제하도록 상이한 작용 방식을 통해 작용하고, 이러한 농약은 더 광범위한 숙주 범위 내의 해충 또는 TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 및 TIC2613PL 살충 단백질에 의해 효과적으로 제어되지 않는 식물 해충 종을 방제하도록 작용한다.
상기 언급된 조성물/제제는 농업적으로 허용 가능한 캐리어, 예컨대 미끼, 분말, 먼지, 펠릿, 과립, 스프레이, 에멀션, 콜로이드성 현탁액, 수성 용액, 바실러스 포자/결정 제제, 종자 처리, 단백질 중 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 재조합 식물 세포/식물 조직/종자/식물, 또는 단백질 중 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 박테리아를 추가로 포함할 수 있다. 재조합 폴리펩타이드에서 고유한 곤충 저해 또는 살충 저해의 수준 및 식물 또는 식이 검정에 시비되는 제제의 수준에 따라, 조성물/제제는 재조합 폴리펩타이드의 다양한 중량 기준 양, 예를 들어 재조합 폴리펩타이드의 0.0001% 내지 0.001% 내지 0.01% 내지 1% 내지 99중량%를 포함할 수 있다.
상기의 검토에서, 당업자는 개시된 구체적인 양태에서 변화는 이루어질 수 있고 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 구체적인 구조 및 기능적 상세내용은 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 본 명세서에 인용된 각각의 참고문헌의 전체 개시내용은 본 출원의 개시내용 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1
TIC4472, TIC1425 및 TIC2613의 발견, 클로닝 및 발현
3개의 신규한 바실러스 튜링겐시스 살충 단백질을 코딩하는 서열을 곤충 생물검정에서 동정하고, 클로닝하고, 서열 확인하고, 시험하였다. 각각 바실러스 튜링겐시스 균주 EG10742, EG10731 및 EG5408로부터 단리된 TIC4472, TIC1425 및 TIC2613인 살충 단백질은 신규한 Cry1Ca-유사 단백질을 나타낸다.
중합효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머는 각각 EG10742, EG10731 및 EG5408인 바실러스 튜링겐시스 균주로부터 단리된 전체 게놈 DNA로부터 TIC4472, TIC1425 및 TIC2613에 대한 코딩 영역의 전장 카피를 증폭시키도록 설계되었다. PCR 앰플리콘은 각각의 코딩 서열의 번역 개시 및 종결 코돈을 또한 포함하였다.
각각의 앰플리콘을 Bt 발현 가능한 촉진자와 작동 가능한 연결에 있는 Bt(바실러스 튜링겐시스) 발현 벡터로 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 클로닝하였다.
실시예 2
TIC4472, TIC1425 및 TIC2613은 곤충 생물검정에서 나비목 활성을 입증한다
Bt 발현 숙주에서 단백질을 제조함으로써 살충 단백질 TIC4472, TIC1425 및 TIC2613의 생물활성을 평가하였다. TIC4472, TIC1425 및 TIC2613을 발현하는 Bt 균주를 이십사(24) 시간 동안 성장시키고, 이후 포자 결정 제제 또는 가용화된 단백질 제제 중 어느 하나를 곤충 먹이에 첨가하였다. TIC4472, TIC1425 및 TIC2613을 발현하는 Bt 균주로부터의 배양물을 갖는 먹이에서의 곤충의 성장 및 발생을 비처리된 대조군 배양물을 갖는 먹이에서의 곤충과 비교함으로써 사망률 및 영양실조를 평가하였다.
TIC4472의 제제는 나비목 종 옥수수 귀벌레(2개의 콜로니(CEW 및 CEWUC), 헬리코베르파 제아, 본 명세서에서 면 솜벌레 및 대두 꼬투리 벌레라고도 함), 면 잎 벌레(CLW, 알라바마 아르길라세아), 유럽 옥수수 나무좀(ECB, 오스트리니아 누빌랄리스), 밤나방유충(FAW, 스포돕테라 푸리기페르다), 대두 자벌레(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스), 써던 거염벌레(SAW, 스포돕테라 에리다니아), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(SWCB, 디아트라에아 그라디오셀라), 사탕수수 나무좀(SCB, 디아트라에아 사카랄리스), 사탕수수 나무좀의 Cry2Ab 내성 콜로니(SCB2R), 회색담배나방(TBW, 헬리오티스 비레센스) 및 벨벳콩 애벌레(VBW, 안티카르시아 겜마탈리스); 딱정벌레목 종 콜로라도 감자 딱정벌레(CPB, 렙티노타르사 데셈리네아타) 및 웨스턴 옥수수 뿌리벌레(WCB, 디아브로티카 비르기페라 비르기페라); 반시목 종 타니시드 식물 벌레(TPB, 리구스 리네올라리스), 웨스턴 타니시드 식물 벌레(WTP, 리구스 헤스페루스); 및 쌍시류 종 황열 모기(아에데스 아에깁티)에 대해 평가되었다. TIC1425의 제제는 나비목 종 블랙 야도충(BCW, 아그로티스 입실론), 면 잎 벌레(CLW, 알라바마 아르길라세아), 유럽 옥수수 나무좀(ECB, 오스트리니아 누빌랄리스), 밤나방유충(FAW, 스포돕테라 푸리기페르다), 블랙 야도충(BCW, 아그로티스 입실론), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(SWCB, 디아트라에아 그라디오셀라) 및 사탕수수 나무좀(SCB, 디아트라에아 사카랄리스); 및 딱정벌레목 종 웨스턴 옥수수 뿌리벌레(WCB, 디아브로티카 비르기페라 비르기페라) 및 써던 옥수수 뿌리벌레(디아브로티카 운데심푼크타타 호와디)에 대해 평가되었다. TIC2613의 제제는 나비목 종 옥수수 귀벌레(2개의 콜로니(CEW 및 CEWUC), 헬리코베르파 제아, 본 명세서에서 면 솜벌레 및 대두 꼬투리 벌레라고도 함), 면 잎 벌레(CLW, 알라바마 아르길라세아), 유럽 옥수수 나무좀(ECB, 오스트리니아 누빌랄리스), 밤나방유충(FAW, 스포돕테라 푸리기페르다), 대두 자벌레(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스), 써던 거염벌레(SAW, 스포돕테라 에리다니아), 블랙 야도충(BCW, 아그로티스 입실론), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(SWCB, 디아트라에아 그라디오셀라), 회색담배나방(TBW, 헬리오티스 비레센스) 및 벨벳콩 애벌레(VBW, 안티카르시아 겜마탈리스); 딱정벌레목 종 콜로라도 감자 딱정벌레(CPB, 렙티노타르사 데셈리네아타); 웨스턴 옥수수 뿌리벌레(WCB, 디아브로티카 비르기페라 비르기페라) 및 써던 옥수수 뿌리벌레(디아브로티카 운데심푼크타타 호와디); 및 반시목 종 타니시드 식물 벌레(TPB, 리구스 리네올라리스), 웨스턴 타니시드 식물 벌레(WTP, 리구스 헤스페루스)에 대해 평가되었다.
Bt 숙주에서 성장한 각각의 단백질에 대해 관찰된 생물검정 활성은 하기 표 3 및 표 4에 제시되고, 여기서 "+"는 활성을 나타내고, "NT"는 독소가 그 특이적 곤충 해충에 대해 평가되지 않았다는 것을 나타내고, "S"는 영양실조를 나타내고, "M"은 사망률을 나타낸다. TIC4472, TIC1425 및 TIC2613의 제제는 각각의 단백질에 대해 평가된 딱정벌레목 또는 반시목 곤충 해충에 대한 활성을 입증하지 않는다. TIC4472는 또한 황열 모기(아에데스 아에깁티)에 대한 활성을 입증하였다. 모든 3개의 독소는 표 3 및 표 4에 기재된 바대로 다수의 나비목 곤충 해충에 대한 내성을 입증하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
상기 표 3 및 표 4에서 볼 수 있는 것처럼, 곤충 독소 TIC4472는 평가되는 모든 나비목 곤충 해충(CEW, CEWUC, CLW, ECB, FAW, SBL, SAW, SCB, SCB2R, SWCB, TBW 및 VBC); 및 YFM에 대한 활성을 입증하였다. 곤충 독소 TIC1425는 CLW, ECB, FAW, SCB 및 SWCB에 대한 활성을 입증하였다. 곤충 독소 TIC2613은 CEW, CLW, ECB, FAW, SBL, SAW, SCB, SWCB, TBW 및 VBC에 대한 활성을 입증하였다. BCW에 대해 평가될 때 TIC1425 및 TIC2613에 대해 활성이 관찰되지 않았다.
실험의 별개의 시리즈에서, TIC4472의 단백질 제제는 나비목 곤충 해충 근대 거염벌레(BAW, 스포돕테라 엑시구아), 분홍 솜벌레(PBW, 펙티노포라 고시피엘라), Cry1Ac 내성 분홍 솜벌레(PBW_Cry1Acr, 펙티노포라 고시피엘라), 올드 월드 솜벌레(OWB, 헬리코베르파 아르미게라), 오리엔탈 잎 벌레(OLW, 스포돕테라 리투라) 및 점무늬 솜벌레(SBW, 에아리아스 비텔라)에 대해 먹이 오버레이 검정을 이용하여 평가되었다. 표 5는 먹이 오버레이 생물검정에서 평가된 이들 나비목 곤충 해충의 각각에 대해 관찰된 활성으르 보여주고, 여기서 "+"는 활성을 나타낸다.
Figure pct00005
상기 표 5에서 볼 수 있는 것처럼, TIC4472는 분홍 솜벌레의 Cry1Ac 내성 콜로니를 포함하여 먹이 오버레이 생물검정에서 모든 나비목 곤충 해충에 대한 활성을 입증하였다.
표 3 내지 표 5에서 입증된 바대로, TIC4472, TIC1425 및 TIC2613은 광범위한 나비목 곤충 해충 종에 걸쳐 활성을 입증하였다.
실시예 3
식물 세포에서의 발현을 위한 TIC4472PL 및 TIC2613PL을 코딩하는 합성 코딩 서열의 설계
합성 코딩 서열을 식물에서 코딩된 단백질의 발현에서 사용하도록 작제하고, 2원 식물 형질전환 벡터로 클로닝하고, 사용하여 식물 세포를 형질전환시켰다. 합성 서열을 일반적으로 미국 특허 5,500,365호에 기재된 방법에 따라 합성하여, 소정의 해로운 문제 서열, 예컨대 ATTTA 및 A/T 농후 식물 폴리아덴일화 서열을 피했다. 합성 코딩 서열은 각각 TIC4472 및 TIC2613 단백질에 대해 개시 메티오닌 바로 뒤에 추가적인 알라닌 잔기를 포함하는 TIC4472PL 및 TIC2613PL 단백질을 코딩한다. 추가적인 알라닌 잔기는 곤충 독소 단백질의 발현을 개선하도록 합성 코딩 서열로 도입되었다.
TIC4472PL을 코딩하는 합성 코딩 서열(서열 번호 4)은 서열 번호 3으로서 본 명세서에서 제시된다. TIC2613PL을 코딩하는 합성 코딩 서열(서열 번호 10)은 서열 번호 9로서 제시된다. 2원 식물 형질전환 벡터에서 합성 코딩 서열을 사용하여 TIC4472PL 및 TIC2613PL 단백질을 발현하는 형질전환 식물을 생성하고, 나비목 곤충 해충에 대해 활성에 대해 평가하였다.
실시예 4
안정하게 형질전환된 면 식물에서의 나비목 해충에 대한 TIC4472PL 활성의 검정
당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 비표적화된 TIC4472PL 살충 단백질을 발현하도록 설계된 전이유전자 카세트를 포함하는 2원 식물 형질전환 벡터를 클로닝하였다. 생성된 벡터를 사용하여 면 식물을 안정하게 형질전환시켰다. 조직을 형질전환체로부터 수확하고, 다양한 나비목 곤충 해충에 대해 곤충 생물검정에서 사용하였다.
합성 코딩 서열을 식물에서 코딩된 단백질의 발현에서 사용하기 위해 작제하고, 2원 식물 형질전환 벡터로 클로닝하고, 사용하여 면 식물 세포를 형질전환시켰다. 생성된 식물 형질전환 벡터는 리더에 작동 가능하게 5' 연결되고, 비표적화된 TIC4472PL 단백질을 코딩하는 합성 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결되어, 결국 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된, 구성적 촉진자로 구성된 TIC4472PL 살충 단백질의 발현을 위한 제1 전이유전자 카세트; 및 스펙티노마이신 선택을 이용하여 형질전환된 식물 세포의 선택을 위한 제2 전이유전자 카세트로 구성된다.
3개의 2원 식물 형질전환 벡터 작제물을 상기 기재된 바대로 작제하고, 상이한 구성적 촉진자를 구성하였다. 2개의 작제물, 작제물 1 및 작제물 3은 또한 리더에 3' 및 비표적화된 TIC4472PL 단백질을 발현하는 합성 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 인트론 서열로 구성되었다. 작제물 2는 인트론 무였다. 면 식물을 아그로박테륨 매개된 형질전환 방법을 이용하여 3개의 상이한 2원 형질전환 벡터에 의해 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 당해 분야에 공지된 방법에 의해 식물을 형성하도록 유도하였다. 식물 잎 디스크를 사용한 생물검정은 미국 특허 제8,344,207호에 기재된 것과 유사하게 수행되었다. 1일 미만의 단일의 새로 부화된 신생아 애벌레는 각각의 잎 디스크 샘플에 위치하고, 대략 4일 동안 먹이공급에 허용되었다. 비형질전환된 면 식물을 이용하여 음성 대조군으로서 사용되는 조직을 얻었다. 각각의 2원 벡터로부터의 다수의 형질전환 R0 단일-카피 삽입 사건은 면 솜벌레(CBW, 헬리코베르파 제아), 밤나방유충(FAW, 스포돕테라 푸리기페르다), 대두 자벌레(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스) 및 회색담배나방(TBW, 헬리오티스 비레센스)에 대해 평가되었다. 일(1) 내지 사(4)의 범위의 잎 손상 순위(Leaf Damage Rating: LDR) 점수는 사건에 적용되었다. LDR 점수는 각각의 잎 디스크에 관찰된 손상의 백분율에 기초한다. 하기 표 6은 LDR 점수 및 각각의 점수와 연관된 퍼센트 손상의 상응하는 범위를 보여준다. 일(1)의 LDR 점수에 대해, 특성의 침투를 또한 평가하였다. ("H"로 표시된 바와 같은) 높은 침투는 십(10) 퍼센트 이하의 입 손상을 갖는 각각의 작제물에 대한 평가된 사건의 오십(50) 퍼센트 초과로서 정의된다. ("L"로 표시된 바와 같은) 높은 침투는 십(10) 퍼센트 이하의 입 손상을 갖는 각각의 작제물에 대한 평가된 사건의 오십(50) 퍼센트 이하로서 정의된다. 침투는 일(1) 초과의 LDR 점수에 적용되지 않는다.
Figure pct00006
TIC4472PL을 발현하는 형질전환된 R0 면 식물에 대한 잎 손상 순위 점수는 하기 표 7에 제시되어 있다. 평가된 전체 수 사건 중에서 LDR 점수를 입증하는 사건의 수는 괄호 내에, 이어서 하나(1)의 LDR 점수에 대한 침투로 표시된다.
Figure pct00007
TIC4472PL을 발현하는 형질전환된 R0 면 식물은 표 7에 기재된 바대로 SBL 및 TBW에 대해 고도로 효율적이다(퍼센트 잎 손상보다 적거나 이와 동일한 것으로 정의됨). CBW 및 FAW에 대한 활성은 또한 몇몇 사건에서 관찰되었다.
R1 면 사건은 상기 평가된 형질전환된 R0 면 식물로부터 선택되고, FAW, SBL 및 TBW에 대해 디스크 검정에서 사용되었다. 표 8은 TIC4472PL을 발현하는 형질전환된 R1 면 식물에 대한 잎 손상 순위 점수를 보여준다.
Figure pct00008
상기 표 8에서 볼 수 있는 것처럼, 선택된 사건은 FAW, SBL 및 TBW에 대해 높은 효율을 보여주었다. 침투는 모든 3개의 곤충 해충 종에 대해 작제물 1 형질전환된 사건에 대해 높았다. 작제물 2 형질전환된 사건과 관련하여, 침투는 SBL에 대해 높았다.
상기는 TIC4472PL 단백질을 발현하는 형질전환된 면 식물이 밤나방유충(FAW, 스포돕테라 푸리기페르다), 대두 자벌레(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스) 및 회색담배나방(TBW, 헬리오티스 비레센스)에 내성을 제공한다는 것을 입증한다.
실시예 5
안정하게 형질전환된 대두 식물에서 나비목 해충에 대한 TIC4472PL 및 TIC2613PL 활성의 검정
당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 색소체 표적화된 TIC4472PL 또는 TIC2613PL 비표적화된 살충 단백질을 발현하도록 설계된 전이유전자 카세트를 포함하는 2원 식물 형질전환 벡터를 클로닝하였다. 생성된 벡터를 사용하여 대두 식물을 안정하게 형질전환시켰다. 조직을 형질전환체로부터 수확하고, 다양한 나비목 곤충 해충에 대해 곤충 생물검정에서 사용하였다.
실시예 3에 기재된 식물 발현에 대해 설계된 합성 코딩 서열을 2원 식물 형질전환 벡터 작제물로 클로닝하고, 대두 식물 세포를 형질전환시키도록 사용하였다. 색소체 표적화된 및 비표적화된 TIC4472PL을 발현하는 것으로 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 3개의 2원 벡터 작제물을 작제하였다. 작제물 4는 리더에 5' 작동 가능하게 연결되고, 비표적화된 TIC4472PL 단백질을 코딩하는 합성 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결되어, 결국 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 구성적 촉진자로 구성된 비표적화된 TIC4472PL의 발현을 위한 제1 전이유전자 카세트 및; 스펙티노마이신 선택을 이용하여 형질전환된 식물 세포의 선택에 대한 제2 전이유전자 카세트로 구성된다. 작제물 5는 리더에 5' 작동 가능하게 연결되고, 인트론에 5' 작동 가능하게 연결되고, 색소체 표적화된 TIC4472PL 단백질을 코딩하는 합성 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결되어, 결국 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 구성적 촉진자로 구성된 비표적화된 TIC4472PL의 발현을 위한 제1 전이유전자 카세트 및; 스펙티노마이신 선택을 이용하여 형질전환된 식물 세포의 선택에 대한 제2 전이유전자 카세트로 구성된다. 작제물 6은 리더에 5' 작동 가능하게 연결되고, 인트론에 5' 작동 가능하게 연결되고, 비표적화된 TIC4472PL 단백질을 코딩하는 합성 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결되어, 결국 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 구성적 촉진자로 구성된 비표적화된 TIC4472PL의 발현을 위한 제1 전이유전자 카세트 및; 스펙티노마이신 선택을 이용하여 형질전환된 식물 세포의 선택에 대한 제2 전이유전자 카세트로 구성된다.
비표적화된 TIC2613PL을 발현하는 것으로 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 2개의 2원 벡터 작제물을 작제하였다. 작제물 7은 리더에 5' 작동 가능하게 연결되고, 비표적화된 TIC2613PL 단백질을 코딩하는 합성 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결되어, 결국 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 구성적 촉진자로 구성된 비표적화된 TIC2613PL의 발현을 위한 제1 전이유전자 카세트 및; 스펙티노마이신 선택을 이용하여 형질전환된 식물 세포의 선택에 대한 제2 전이유전자 카세트로 구성된다. 작제물 8은 리더에 5' 작동 가능하게 연결되고, 인트론에 5' 작동 가능하게 연결되고, 비표적화된 TIC2613PL 단백질을 코딩하는 합성 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결되어, 결국 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 구성적 촉진자로 구성된 비표적화된 TIC2613PL의 발현을 위한 제1 전이유전자 카세트 및; 스펙티노마이신 선택을 이용하여 형질전환된 식물 세포의 선택에 대한 제2 전이유전자 카세트로 구성된다.
생성된 2원 형질전환 벡터 작제물을 이용하여 아그로박테륨 매개된 형질전환 방법을 사용하여 대두 세포를 형질전환시켰다. 형질전환된 대두 세포를 유도하여 당해 분야에 공지된 방법에 의해 식물을 형성하였다. 식물 잎 디스크를 사용한 생물검정은 미국 특허 제8,344,207호에 기재된 것과 유사하게 수행되었다. 비형질전환된 대두 식물을 사용하여 음성 대조군으로서 사용되는 조직을 얻었다. 2원 벡터로부터 유래된 다수의 R0 대두 형질전환 사건은 써던 거염벌레(SAW, 스포돕테라 에리다니아), 대두 자벌레(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스) 및 대두 꼬투리벌레(SPW, 헬리코베르파 제아)에 대해 평가되었다. 잎 손상 순위(LDR) 점수는 면에 대해서 그것과 유사하지만, 점수를 결정하기 위해 사용된 백분율 손상의 범위에서 다르다. 잎 손상 순위 점수 및 이의 상응하는 퍼센트 잎 손상 순위 범위는 하기 표 9에 제시된다.
Figure pct00009
TIC4472PL 및 TIC2613PL을 발현하는 형질전환된 R0 면 식물에 대한 잎 손상 순위 점수는 하기 표 10에 제시되어 있다. 평가된 전체 수 사건 중에서 LDR 점수를 입증하는 다수의 사건은 괄호 내에 표시된다.
Figure pct00010
상기 표 10에서 볼 수 있는 것처럼, TIC4472PL 및 TIC2613PL 둘 다의 발현 둘 다는 SAW 및 SBL에 대해 높은 효율을 입증하였다. 활성은 SPW에 대해 단백질 둘 다에 대해 더 낮았다.
R1 대두 사건은 상기 평가된 TIC4472PL 및 TIC2613PL을 발현하는 형질전환된 R0 대두 식물로부터 선택되고, SAW, SBL 및 SPW에 대해 잎 디스크 검정에서 사용되었다. TIC4472PL을 발현하는 R1 대두 사건은 벨벳콩 애벌레(VBW, 안티카르시아 겜마탈리스)에 대해 또한 평가되었다. 표 11은 TIC4472PL 및 TIC2613PL을 발현하는 형질전환된 R1 대두 식물에 대한 잎 손상 순위 점수를 보여준다.
Figure pct00011
표 11에서 볼 수 있는 것처럼, TIC4472PL에 의해 형질전환된 다수의 R1 대두 사건은 SAW 및 SBL에 대한 높은 효율을 입증하였다. 또한, 작제물 6을 사용하여 형질전환된 몇몇 R1 대두 사건은 VBC에 대한 높은 효율을 입증하였다. TIC2613PL에 의해 형질전환된 R1 대두 사건은 SBL에 대해 높은 효율을 입증하였다.
상기는 TIC4472PL 또는 TIC2613PL을 발현하는 형질전환된 대두 식물이 나비목 곤충, 특히 써던 거염벌레(스포돕테라 에리다니아) 및 대두 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스) 및 벨벳콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스)에 내성을 제공한다는 것을 입증한다.
실시예 6
안정하게 형질전환된 옥수수 식물에서 나비목 해충에 대한 TIC4472PL 및 TIC2613PL 활성의 검정
색소체 표적화된 및 비표적화된 TIC4472PL 또는 TIC2613PL 살충 단백질 둘 다를 발현하도록 설계된 전이유전자 카세트를 포함하는 2원 식물 형질전환 벡터를 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 클로닝하였다. 생성된 벡터를 사용하여 옥수수 식물을 안정하게 형질전환시켰다. 조직은 형질전환체로부터 수확되고, 다양한 나비목 곤충 해충에 대해 곤충 생물검정에서 사용되었다.
TIC4472PL(서열 번호 3) 또는 TIC2613(서열 번호 9) 단백질을 코딩하는 합성 코딩 서열을 2원 형질전환 벡터로 클로닝하였다. 색소체 표적화된 단백질에 대해, 합성 TIC4472PL 또는 TIC2613PL 살충 단백질 코딩 서열을 엽록체 표적화 신호 펩타이드 코딩 서열과 인프레임으로 작동 가능하게 연결하였다. 생성된 식물 형질전환 벡터는 리더에 5' 작동 가능하게 연결되고, 인트론에 5' 작동 가능하게 연결되고, 색소체 표적화된 또는 비표적화된 TIC4472PL 또는 TIC2613PL 단백질을 코딩하는 합성 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결되어, 결국 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 구성적 촉진자를 포함하는 TIC4472PL 또는 TIC2613PL 살충 단백질의 발현을 위한 제1 전이유전자 카세트; 및 글라이포세이트 선택을 이용하여 형질전환된 식물 세포의 선택을 위한 제2 전이유전자 카세트를 포함한다.
옥수수 식물은 아그로박테륨 매개된 형질전환 방법을 이용하여 상기 기재된 2원 형질전환 벡터에 의해 형질전환된다. 형질전환된 세포는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 식물을 형성하도록 유도된다. 식물 잎 디스크를 이용한 생물검정은 미국 특허 제8,344,207호에 기재된 것과 유사하게 수행된다. 비형질전환된 옥수수 식물은 음성 대조군으로서 사용되는 조직을 얻도록 사용되었다. 각각의 2원 벡터로부터의 다수의 형질전환 사건은 근대 거염벌레(BAW, 스포돕테라 엑시구아), 블랙 야도충(BCW, 아그로티스 입실론), 옥수수 귀벌레(CEW, 헬리코베르파 제아), 면 잎 벌레(CLW, 알라바마 아르길라세아), 유럽 옥수수 나무좀(ECB, 오스트리니아 누빌랄리스), 밤나방유충(FAW, 스포돕테라 푸리기페르다), 올드 월드 솜벌레(OWB, 헬리코베르파 아르미게라), 오리엔탈 잎 벌레(OLW, 스포돕테라 리투라), 분홍 솜벌레(PBW, 펙티노포라 고시피엘라), 대두 자벌레(SBL, 크리소데익시스 인클루덴스), 점무늬 솜벌레(SBW, 에아리아스 비텔라), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(SWCB, 디아트라에아 그라디오셀라), 사탕수수 나무좀(SCB, 디아트라에아 사카랄리스), 회색담배나방(TBW, 헬리오티스 비레센스) 및 벨벳콩 애벌레(VBW, 안티카르시아 겜마탈리스), 및 다른 나비목 곤충 해충에 대해 평가되었다.
곤충 해충은 TIC4472PL 또는 TIC2613PL을 발현하는 제시된 잎 디스크의 침입에 의해 생긴 사망률 및 영양실조에 대해 관찰되고, 비형질전환된 옥수수 식물로부터 유래된 잎 디스크와 비교되었다.
본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물은 본 개시내용의 견지에서 부당한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물이 상기 예시적인 실시형태의 면에서 기재되어 있지만, 본 발명의 진정한 개념, 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기재된 조성물에 변동, 변화, 변형 및 변경이 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 더 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 둘 다와 관련된 소정의 물질이 본 명세서에 기재된 물질에 대해 치환될 수 있지만, 동일한 또는 유사한 결과가 성취될 것이라는 것이 이해될 것이다. 당업자에게 명확한 모든 이러한 유사한 치환물 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바대로 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 있는 것을 간주된다는 것이 명확하다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 공개 특허 문헌은, 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Monsanto Technology LLC <120> NOVEL INSECT INHIBITORY PROTEINS <130> WO2018/071324 <140> PCT/US2017/055731 <141> 2017-09-19 <150> US 62/406082 <151> 2016-10-10 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3564 <212> DNA <213> Bacillus thuringienses <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3564) <223> Nucleic acid sequence encoding a TIC4472 pesticidal protein obtained from Bacillus thuringiensis species EG10742. <400> 1 atgaataata atattgaaaa ccaatgcgta ccttacaatt gtttaagtaa tcctgaagaa 60 gtaattttgg atggagaacg gatatcaact ggtaattcat caattgatat ttctctgtca 120 cttgttcaac ttctggtatc taactttgta ccaggcggag gatttttagt agggttaata 180 gattttgtat ggggaatagt aggcccttct ccatgggatg catttctagt gcaaattgaa 240 caattaattc agcaaagaat agaagcatat gctagggctg cagcaatttc taatttagaa 300 ggaataggaa acaatttcaa tatatatgtg gaagcatttc aagaatggga agaagatcct 360 aataatccag caaccaggaa tagagtagtt gatcgctttc gtatacttga tgggctactt 420 gaaagggaca ttccttcgtt tcgaatttct ggatttgaag tccccctttt 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ccatttttaa caacgggtgt agtattttct tggacgcatc gcagtgcaac tcttacaaat 1380 acaattgatc cagacaaaat tactcagata cctttagtga aaggatttag agtttggagt 1440 ggcgcctctg tcgttacagg accaggtttt acaggagggg atatccttcg aagaactaac 1500 tttggggatt ttgtatctat gcaagttaat attaattcac caataacaca aagataccgt 1560 ttaagatttc gttatgcttc cagtagagat gcacgactta cagtagcgac aggagcagca 1620 aacacaggag ttggagggca aattagtgtg gacatggctc ttcagaaaac tatggaaatt 1680 ggagagagct taacatctag aacatttaga tataccgatt ttagtaatcc tttttcattt 1740 agagctaatc cagatataat tcgtataaat gaacaaccac tattcggtgc aggctctatt 1800 agtagtggtg aactttatat agataaaatt gaaattattc tagcagatgc aacatttgaa 1860 gcagaatatg atttggaaag agcacagaag gcggtgaatg cgctgtttac ttctacaaac 1920 caaagaggat taaaaacaga tgtgacggat tatcatattg atcaagtatc caatttagtt 1980 gagtgtttat cggatgaatt ttgtctggat gaaaaacgag aattgtccga gaaagtcaaa 2040 catgcgaagc gactcagtga tgagcgaaat ttactccagg atcgaaattt cacatccatt 2100 aatgggcaac tagaccgtgg ctggagagga agtacggata ttaccatcca aggaggagat 2160 gacgtattca aagagaatta cgtcacacta ctgggtacct ttgatgagtg ctatccaacg 2220 tatttatatc aaaaaataga tgagtcgaaa ttaaaagcct atacccgcta tgaattaaga 2280 gggtatatcg aggatagtca agacttagaa atctatttaa ttcgctacaa tgcaaaacac 2340 gaaacagtaa atgtgccagg tacaggttcc ttatggccgc tttcagtcga aagtccaatc 2400 ggaaagtgtg gagaaccgaa tcgatgcaca ccacaccttg aatggaatcc taatctagat 2460 tgttcctgca gagacgggaa aacatgtgca catcattctc atcatttctc cttggacatt 2520 gatgttggat gtacagactt aaatgaagat ctaggtgtat gggtgatatt caagattaag 2580 acgcaagatg gtcatgcaag actaggaaat ctagagtttc tcgaagagaa accattagta 2640 ggagaagcgt tagctcgtgt gaaaagagcg gagaaaaaat ggagagacaa acgcgaaaaa 2700 ttgcaattag aaacaaatat cgtttacaaa gaggcaaaag aagctgtgga tgctttattt 2760 gtaaactctc aatatgatag attacaagtg gatacgaaca ttgccatgat tcatgcggca 2820 gataaacgcg ttcatagaat ccgagaagcg tatcttccag agttatctgt gattccgggt 2880 gtcaatgcgg ctattttcga agaattagaa gggtgtgttt tcactgcatt ctccctatat 2940 gatgcgagaa atgtcattaa aaatggcgat tttaataatg gcttatcatg ctggaacgtg 3000 aaagggcatg tagaagaaca aaacgaccat cgttcggtcc ttgttgtccc ggaatgggaa 3060 gcagaagtgt cacaagaggt tcgtgtctgt ccaggtcgtg gctatatcct tcgtgttaca 3120 gcatacaaag agggatatgg agaaggctgt gtaaccattc atgggatcga gaacaataca 3180 gacgaactga agtttagcaa ctgcgtagaa gaggaagtct atccaaacaa cacggtaacg 3240 tgtaatgatt atcctgcaaa tcaagaagaa tacgggggtg cgtacacttc tcgtaatcgt 3300 ggatatgacg aaacttatgg aagcaattct tccgtatcag ctgattatgc gtcagtttat 3360 gaagaaaaag cgtatacaga tggacgaaga gacaatccat gtgaatttaa cagagggtat 3420 ggggattata cgccactacc agctggctat gtaacaaaag aattagaata cttcccagaa 3480 accgataagg tatggattga gattggagaa acggaaggaa cattcatcgt ggacagtgtg 3540 gaattactcc ttatggagga atag 3564 <210> 2 <211> 1187 <212> PRT <213> Bacillus thuringienses <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1187) <223> The amino acid sequence of the TIC4472 pesticidal protein. <400> 2 Met Asn Asn Asn Ile Glu Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Glu Glu Val Ile Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly Asn 20 25 30 Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Leu Leu Val Ser Asn 35 40 45 Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val Trp 50 55 60 Gly Ile Val Gly Pro Ser Pro Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu 65 70 75 80 Gln Leu Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Ile 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Gly Ile Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu Ala 100 105 110 Phe Gln Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Thr Arg Asn Arg 115 120 125 Val Val Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp Ile 130 135 140 Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr 145 150 155 160 Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val Ile 165 170 175 Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Thr Asn Val Asn Glu Asn Tyr 180 185 190 Asn Arg Gln Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala Asn 195 200 205 Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln Asp 210 215 220 Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu 225 230 235 240 Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro Ile 245 250 255 Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Ile 260 265 270 Thr Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe Asn 275 280 285 Val Met Glu Ser Asn Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile Leu 290 295 300 Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn Phe 305 310 315 320 Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Thr Ser Asn Tyr Ile Gly Gly Gly Asn 325 330 335 Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro Arg 340 345 350 Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro Thr 355 360 365 Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu Arg 370 375 380 Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr Tyr 385 390 395 400 Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Asp 405 410 415 Asn Ser Val Leu Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala 420 425 430 Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val Val 435 440 445 Phe Ser Trp Thr His Arg 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Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys 660 665 670 Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu 675 680 685 Arg Asn Leu Leu Gln Asp Arg Asn Phe Thr Ser Ile Asn Gly Gln Leu 690 695 700 Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp 705 710 715 720 Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Leu Gly Thr Phe Asp Glu 725 730 735 Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys 740 745 750 Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp 755 760 765 Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn 770 775 780 Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Val Glu Ser Pro Ile 785 790 795 800 Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Thr Pro His Leu Glu Trp Asn 805 810 815 Pro Asn Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Lys Thr Cys Ala His His 820 825 830 Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn 835 840 845 Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly 850 855 860 His Ala Arg Leu Gly Asn Leu 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agcttctagt cagtaacttc gttccgggcg gagggtttct cgtgggcctt 180 attgacttcg tttggggcat cgtgggccca tctccttggg acgcattcct cgtgcagatc 240 gagcaactga tccagcagcg tatcgaggcg tacgctaggg ctgccgctat ctccaacctg 300 gagggcatcg gcaacaactt caacatctac gttgaagcct tccaagaatg ggaggaagat 360 cctaataacc cagctacgcg gaacagagtg gtggatcgct ttagaatcct cgacggcctc 420 ctggaaaggg acatcccgag cttccgtatt tccggcttcg aggtgccgct gctgagcgtg 480 tacgcgcaag cggccaatct gcacctggcg attctccggg actctgtgat cttcggcgag 540 cggtggggcc tcaccaccac taacgtgaac gagaactaca accgccagat ccgccacatc 600 gacgagtacg cggaccactg cgccaacaca tacaatcgcg ggctgaacaa cctccctaag 660 agcacttacc aagattggat cacctacaac aggctccgcc gggaactcac tctcacagtc 720 ctcgacatcg ctgccttctt cccgaactac gacaaccgcc gctacccgat tcagccagtc 780 ggccagctca cccgtgaggt gtacaccgat ccactgataa ctttcaatcc gcagctccag 840 tctgtcgcac agttgcccac cttcaacgtc atggaaagca acgccatcag gaacccacac 900 ttgttcgaca tccttaacaa cctgactatc ttcaccgact ggttcagcgt cggacggaac 960 ttctactggg gcggacaccg cgtcacctca aactacatcg gcggcggcaa cattacttcg 1020 cccatctacg gccgggaggc gaatcaggag ccgccacgca gctttacatt caacggtcct 1080 gtgtttcgca cgttatcgaa cccgacactc aggctgctcc agcagccctg gcctgcgccg 1140 ccgtttaatt tgcgcggcgt cgaaggcgtc gagttcagta cgccgaccaa cagcttcacc 1200 tatcgcggac gcgggactgt tgactccctg acagagctgc cgccggagga caactcggtt 1260 ctgccgcgtg agggctacag ccataggctt tgtcacgcga cctttgtgca gcgatccggg 1320 acaccgttcc ttacaaccgg cgtggtgttc tcctggacac accgcagtgc aactctgacg 1380 aacacgattg acccagacaa gatcacgcag atcccgttag tgaagggctt ccgggtttgg 1440 tctggtgcct ctgtagtcac tgggcctggc tttacgggtg gcgacatcct ccgtcgcacg 1500 aactttggcg acttcgtgtc catgcaagtg aacattaaca gccctattac gcaacgctac 1560 cggctgaggt tcagatacgc ttcctcgcgg gacgcccgtc ttacggtggc gacgggcgca 1620 gcgaacactg gagttggcgg ccaaatctcc gtggacatgg ctttgcagaa gactatggag 1680 atcggtgagt ctctcacatc tcgcacgttc cgctacacgg atttctccaa ccctttctcc 1740 ttccgcgcca atccggacat cattcggatc aacgaacagc cgctcttcgg cgcgggctcc 1800 atctcatccg gtgagcttta cattgataag attgagataa ttctggccga cgcgaccttt 1860 gaggcagagt atgatctgga gcgcgcacag aaggccgtga acgcgctgtt tacgtccacg 1920 aaccagcgcg ggctcaagac agacgtcaca gactaccaca tcgaccaagt ctccaacctt 1980 gtcgagtgtc tctccgacga gttctgcctg gacgagaagc gggagcttag tgagaaggtg 2040 aagcacgcaa agcgcctgtc tgacgagcgg aaccttctac aagaccgtaa cttcacctcc 2100 attaacgggc agctagaccg tggctggcgc gggtccaccg acatcactat ccaaggtggc 2160 gacgacgtct tcaaggagaa ctacgtgacg ctgctcggca cctttgacga gtgctacccg 2220 acatacctct atcagaagat tgacgagtct aagctcaagg cttacacccg ttacgagctg 2280 cgtggctaca tcgaggactc ccaggatctg gaaatctatc tcatcagata caacgcgaag 2340 cacgagacag tcaacgtacc tgggacaggc tctctctggc ctctgtctgt ggagagtccc 2400 atcggcaaat gtggcgagcc gaacagatgt actccgcacc tggagtggaa tcccaacttg 2460 gactgtagtt gccgcgacgg caagacctgc gcgcaccact cccaccactt ctccctggac 2520 attgacgtcg gctgcacgga tctcaacgag gatctgggcg tttgggtcat cttcaagata 2580 aagacccagg acggacacgc cagactggga aacctagagt tccttgagga gaagccgctg 2640 gtcggcgaag cactggcgcg ggtcaagagg gccgagaaga agtggcggga caaacgggag 2700 aaacttcaac tcgaaacgaa catcgtttac aaggaggcaa aggaggccgt ggacgcactg 2760 ttcgtgaact cgcagtacga ccgcctccaa gtggacacca acatcgccat gatccatgca 2820 gcggacaagc gcgtgcaccg aatcagggaa gcgtacttgc ccgagttgtc cgttatccct 2880 ggcgtgaacg ctgccatctt cgaggaactg gagggctgcg tgttcaccgc attctccctg 2940 tacgacgcac gaaacgtcat caagaatggc gacttcaaca acggcctgag ctgctggaac 3000 gtgaagggcc acgtggagga gcagaacgac caccgctccg tgttagtggt cccggaatgg 3060 gaagccgaag tgagccagga ggtcagggtg tgtcccggtc gcggttacat cctccgcgtg 3120 accgcctaca aggagggcta tggcgagggc tgcgtgacga tacacggtat cgagaacaac 3180 accgatgagc ttaagttctc gaactgcgtg gaggaggagg tgtacccgaa taacacagtg 3240 acgtgcaatg actacccggc caaccaggag gagtacggcg gtgcctacac gagccgaaac 3300 cgtggctatg acgaaactta cggctcgaac agcagcgtgt ctgcggatta tgccagtgtg 3360 tacgaggaga aggcgtacac ggacgggcgg cgcgacaacc cttgcgagtt caatagaggc 3420 tatggcgact acacgccgct gcccgccggt tatgtgacga aggagttgga atacttccca 3480 gagacggaca aggtgtggat cgagattggc gagaccgagg gcacgttcat tgtggacagc 3540 gttgagctgc tactgatgga ggagtga 3567 <210> 4 <211> 1188 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of TIC4472PL encoded by a synthetic coding sequence designed for expression in a plant cell (SEQ ID NO:3), and wherein an additional alanine amino acid is inserted immediately following the initiating methionine. <400> 4 Met Ala Asn Asn Asn Ile Glu Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Glu Val Ile Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly 20 25 30 Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Leu Leu Val Ser 35 40 45 Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val 50 55 60 Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Pro Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Ala Ala 85 90 95 Ile Ser Asn Leu Glu Gly Ile Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu 100 105 110 Ala Phe Gln Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Thr Arg Asn 115 120 125 Arg Val Val Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp 130 135 140 Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val 165 170 175 Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Thr Asn Val Asn Glu Asn 180 185 190 Tyr Asn Arg Gln Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala 195 200 205 Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln 210 215 220 Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu 260 265 270 Ile Thr Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe 275 280 285 Asn Val Met Glu Ser Asn Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile 290 295 300 Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn 305 310 315 320 Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Thr Ser Asn Tyr Ile Gly Gly Gly 325 330 335 Asn Ile Thr Ser Pro 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Gly Glu Thr Glu 1160 1165 1170 Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu 1175 1180 1185 <210> 5 <211> 3564 <212> DNA <213> Bacillus thuringienses <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3564) <223> Nucleic acid sequence encoding a TIC1425 pesticidal protein obtained from Bacillus thuringiensis species EG10731. <400> 5 atgaataata atattgaaaa ccaatgcgta ccttacaatt gtttaagtaa tcctgaagaa 60 gtaattttgg atggagaacg gatatcaact ggtaattcat caattgatat ttctctgtca 120 cttgttcaac ttctggtatc taactttgta ccaggcggag gatttttagt agggttaata 180 gattttgtat ggggaatagt aggcccttct ccatgggatg catttctagt gcaaattgaa 240 caattaattc agcaaagaat agaagcatat gctagggctg cagcaatttc taatttagaa 300 ggaataggaa acaatttcaa tatatatgtg gaagcatttc aagaatggga agaagatcct 360 aataatccag caaccaggaa tagagtagtt gatcgctttc gtatacttga tgggctactt 420 gaaagggaca ttccttcgtt tcgaatttct ggatttgaag tccccctttt atccgtttat 480 gctcaagcgg ccaatctgca tctagctata ttaagagatt ctgtaatttt tggagaaaga 540 tggggattga caacaacaaa tgtcaatgaa aactataata gacaaatcag gcatattgat 600 gaatatgctg atcactgtgc aaatacgtat aatcggggat taaataattt accgaaatct 660 acgtatcaag attggataac atataatcga ttacggagag aattaacatt gactgtatta 720 gatatcgctg ctttctttcc aaactatgac aataggcggt atccaattca gccagttggt 780 caactaacaa gggaagttta tacggaccca ttaattactt ttaatcccca gttacagtct 840 gtagctcaat tacctacttt taacgttatg gaaagcaacg caattagaaa tcctcatttg 900 tttgatatat tgaataatct tacaattttt acggattggt ttagtgttgg acgcaacttt 960 tattggggag gacatcgagt aacttctaac tatataggag gaggcaacat aacatctcct 1020 atatatggaa gagaggcgaa ccaggagcct ccaagatctt ttacttttaa tggacctgtt 1080 tttaggactt tatcaaatcc tactttacga ttattacagc aaccttggcc agcaccacca 1140 tttaatttac gtggtgttga aggagtagaa ttttctacac ctacaaatag ctttacgtat 1200 cgaggaagag gtacagttga ttctttaacc gaattaccgc ctgaggataa tagtgtgcta 1260 cctcgcgagg gatatagtca tcgtttatgt catgcaactt ttgttcaaag atctggaaca 1320 ccatttttaa caacgggtgt agtattttct tggacgcatc gcagtgcaac tcttacaaat 1380 acaattgatc cagacaaaat tactcagata cctttagtga aaggatttag agtttggagt 1440 ggcgcctctg tcgttacagg accaggtttt acaggagggg atatccttcg aagaactaac 1500 tttggggatt ttgtatctat gcaagttaat attaattcac caataacaca aagataccgt 1560 ttaagatttc gttatgcttc cagtagagat gcacgactta cagtagcgac aggagcagca 1620 aacacaggag ttggagggca aattagtgtg gacatggctc ttcagaaaac tatggaaatt 1680 ggagagagct taacatctag aacatttaga tataccgatt ttagtaatcc tttttcattt 1740 agagctaatc cagatataat tcgtataaat gaacaaccac tattcggtgc aggctctatt 1800 agtagtggtg aactttatat agataaaatt gaaattattc tagcagatgc aacatttgaa 1860 gcagaatatg atttggaaag agcacagaag gcggtgaatg cgctgtttac ttctacaaac 1920 caaagaggat taaaaacaga tgtgacggat tatcatattg atcaagtatc caatttagtt 1980 gagtgtttat cggatgaatt ttgtctggat gaaaaacgag aattgtccga gaaagtcaaa 2040 catgcgaagc gactcagtga tgagcgaaat ttactccagg atcgaaattt cacatccatt 2100 aatgggcaac tagaccgtgg ctggagagga agtacggata ttaccatcca aggaggagat 2160 gacgtattca aagagaatta cgtcacacta ctgggtacct ttgatgagtg ctatccaacg 2220 tatttatatc aaaaaataga tgagtcgaaa ttaaaagcct atacccgcta tgaattaaga 2280 gggtatatcg aggatagtca agacttagaa atctatttaa ttcgctacaa tgcaaaacac 2340 gaaacagtaa atgtgccagg tacaggttcc ttatggccgc tttcagtcga aagtccaatc 2400 ggaaagtgtg gagaaccgaa tcgatgcaca ccacaccttg aatggaatcc taatctagat 2460 tgttcctgca gagacgggaa aacatgtgca catcattctc atcatttctc cttggacatt 2520 gatgttggat gtacagactt aaatgaagat ctaggtgtat gggtgatatt caagattaag 2580 acgcaagatg gtcatgcaag actaggaaat ctagagtttc tcgaagagaa accattagta 2640 ggagaagcgt tagctcgtgt gaaaagagcg gagaaaaaat ggagagacaa acgcgaaaaa 2700 ttgcaattag aaacaaatat cgtttacaaa gaggcaaaag aagctgtgga tgctttattt 2760 gtaaactctc aatatgatag attacaagtg gatacgaaca ttgccatgat tcatgcggca 2820 gataaacgcg ttcatagaat ccgagaagcg tatcttccag agttatctgt gattccgggt 2880 gtcaatgcgg ctattttcga agaattagaa gggtgtattt tcactgcatt ctccctatat 2940 gatgcgagaa atgtcattaa aaatggcgat tttaataatg gcttatcatg ctggaacgtg 3000 aaagggcatg tagaagaaca aaacgaccat cgttcggtcc ttgttgtccc ggaatgggaa 3060 gcagaagtgt cacaagaggt tcgtgtctgt ccaggtcgtg gctatatcct tcgtgttaca 3120 gcatacaaag agggatatgg agaaggctgt gtaaccattc atgggatcga gaacaataca 3180 gacgaactga agtttagcaa ctgcgtagaa gaggaagtct atccaaacaa cacggtaacg 3240 tgtaatgatt atcctgcaaa tcaagaagaa tacgggggtg cgtacacttc tcgtaatcgt 3300 ggatatgacg aaacttatgg aagcaattct tccgtatcag ctgattatgc gtcagtttat 3360 gaagaaaaag cgtatacaga tggacgaaga gacaatccat gtgaatttaa cagagggtat 3420 ggggattata cgccactacc agctggctat gtaacaaaag aattagaata cttcccagaa 3480 accgataagg tatggattga gattggagaa acggaaggaa cattcatcgt ggacagtgtg 3540 gaattactcc ttatggagga ataa 3564 <210> 6 <211> 1187 <212> PRT <213> Bacillus thuringienses <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1187) <223> The amino acid sequence of the TIC1425 pesticidal protein. <400> 6 Met Asn Asn Asn Ile Glu Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Glu Glu Val Ile Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly Asn 20 25 30 Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Leu Leu Val Ser Asn 35 40 45 Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val Trp 50 55 60 Gly Ile Val Gly Pro Ser Pro Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu 65 70 75 80 Gln Leu Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Ile 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Gly Ile Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu Ala 100 105 110 Phe Gln Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Thr Arg Asn Arg 115 120 125 Val Val Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp Ile 130 135 140 Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr 145 150 155 160 Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val Ile 165 170 175 Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Thr Asn Val Asn Glu Asn Tyr 180 185 190 Asn Arg Gln Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala Asn 195 200 205 Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln Asp 210 215 220 Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu 225 230 235 240 Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro Ile 245 250 255 Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro 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1095 Asn Arg Gly Tyr Asp Glu Thr Tyr Gly Ser Asn Ser Ser Val Ser 1100 1105 1110 Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys Ala Tyr Thr Asp Gly 1115 1120 1125 Arg Arg Asp Asn Pro Cys Glu Phe Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr 1130 1135 1140 Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe 1145 1150 1155 Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly 1160 1165 1170 Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu 1175 1180 1185 <210> 7 <211> 3537 <212> DNA <213> Bacillus thuringienses <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3537) <223> Nucleic acid sequence encoding a TIC2613 pesticidal protein obtained from Bacillus thuringiensis species EG5408. <400> 7 atggataaca atatcaagaa ccaatgcatt ccttacaatt gtttaaatga tcctgaggta 60 gaaatattag gtgaagaggg gataactact agtaatgaaa atctcgaatt tttcttatcg 120 ctaacgaaat ttgtcttgaa taggtttgtc cctggtggag catatgtagc tggcctattt 180 gatgtattct ggggatggtt aaaaccttct gattggtctg caatccttga acaaattgaa 240 gaattaatta accaaaaaat tgagacgttt gctagaaatc aagcaattag tagattggaa 300 gggttaagca acctttatga aatttacgca gatactttta aagaatggga aaaagatccg 360 actaatccag cattaagaga agaaatgcgt acacaattta atgacatgaa cagctctttt 420 gtaacagcta tgcctctttt ttcagttcaa aattttgaag ttcctctttt agcagtatac 480 gctcaagctg caaatttaca tctatcagtt ttaagggatg tctcagtttt tggtcaaaat 540 tggggatttg attcagccac tgtcaatagt cgttataatg atttagtaag aaatattcgt 600 acctatacaa attatgtcgt acgttggtat aacacaggat tagcaaggtt acgaggtact 660 acgtaccaag attggttaaa ttatcatcgc tttagaagag aattaacaat aactgcattg 720 gatatcatta ccatattccc acactacgat aataaaatgt atccaattca accccatttt 780 caattaacaa gagagattta tacggatcca ctaattaatt tcaatccggc gttacagtct 840 gtagcacaat tacctctatt taatgagatg gaaaatagta caattagaag ccctcattta 900 gttgattttt taaataggct tacaatttat acagattggt atagtctcgg aagacactat 960 tattggggag gacatcaaat agtctctaga caaacaggat caacttccac tattacattc 1020 cctatatatg gaagagaggc gaatcaagag gcccctagaa catataattt tagtcaacct 1080 gtctttagaa cactgtcaaa tcctacttta acacgtttaa tgcaaccttg gccagcccca 1140 gcatttcagt tgcgtcgtct tgagggagtt gaatttcaaa caactacagg taattttacg 1200 tatcgaggaa gaggtacggt agattccttt gatgaattac caccagatga tacaagcgta 1260 ccagcgcgtg aaggatatag tcatcgttta tgtcatgcaa catttatcag aaaatctggg 1320 acgccgtatt taacaacggg tgtaacacta tcttggacac acaatagcaa tacacctacg 1380 aatataattt atcctgataa aatcactcaa gtaccattgg tgaaagcatc taaccttcat 1440 tctagtgctt tcgttttaaa aggaccagga tttacaggag gggacatact tggaagaact 1500 agtgtgggca acatagcaga tatccaaatg aatattactg caccgttatc acaaagatat 1560 cgcgtacgaa ttcggtatgc ctctactaca aacttacaat ttcatacgac aattaacggc 1620 agggccgtaa atcaggctaa tttcccagca actatgaata gagtagaaga cttagaatat 1680 aattccttta gaacgataag tttcggtact ccttttaact ttttagatgc tcaaagtacc 1740 ttcaggttag gtgtatggag cttttcttca ggtaccgttt taatagatag aattgaagtt 1800 gtaccaatgg aagtaacatt tgaagcagaa tctgatttag aaagagcaca aaaggcggtg 1860 aacgctctgt ttacttctat aaatcaaaaa ggactaaaaa cagatgtaac agattatcac 1920 attgatcaag tatccaattt ggtcgaatgt ctatccgatg aattttgtct agatgaaaag 1980 agagaactat ttgagaaagt caaatatgcg aaacgactca gtgacgaacg gaatttactt 2040 gcagatccaa atttcacatc tattaatggg caactagatc gtggatggag aggaagtacg 2100 gatattacca ttcaaggggg cgatgacgta ttcaaagaaa actacgtcac actatcaggt 2160 acccttgatg agtgttatcc aacctattta tatcaaaaaa tagacgaatc gaaattaaaa 2220 gcgtataccc gttacgagtt acgaggatat atcgaagata gtcaagattt agaagtatac 2280 ttgattcgtt acaataccaa acatgaaaca ttgaatgtac caggtacagg gggcctatgg 2340 ccgcttgcag tagaaagttc aatcggaggg tgtggcgaac caaaccgatg cgcaccacaa 2400 atggaatggg atccaaatct agaatgttct tgtagcgacg aggagaaatg tgcgcatcat 2460 tcccatcatt tctctctcga tattgatgtt ggatgtactg atttaaatga aaatctaggt 2520 atatgggtta tatttaaaat taaaacgcag aacggttatg caaaattagg aaatttagag 2580 tttctcgaag agaaaccatt aataggggaa gcgttagctc gtgttaagcg agtggagaaa 2640 aaatggaaag acaaacgtga aaaattagaa tttgaaacga atatagtcta caacgaggca 2700 aaagaagctg tggatgcact attcgtaaat tcacaatatg atagattgca agctgataca 2760 aatatcgcaa tgattcatgc ggcggataac aaagttcata aaattcgcga ggcgtacctc 2820 ccagagttat ctgtgatacc aggtgtaaat gcgaccgttt ttgaagaatt agaagagcgt 2880 atttttacag cattctccct ttacgatgca agaaatgtga taaaaaatgg ggatttcaat 2940 aatggattat cttgttggaa tgtgaagggc caagtagatg tagaccaaaa tgaccatcgt 3000 tctgtccttg ttattccagg atgggaatcg gaagtatcac aagaagttca tgtatgtcca 3060 gatcgtggat acattcttcg tgttacggcg tacaaagaag gatatggaga aggctgcgta 3120 acaatccatg agattgataa tcatacagac gaactgaaat ttaaaaactg ctttgaagag 3180 gaagtatctc taaataatgc ggtgacatgt gatgagtata ctacaaatca agaagtagga 3240 gggtatgcgg atgtacgtca atccaataat cgtggatcta atgaggccta tgtaaatcct 3300 acttccacat caactgatta tgcatcgctc tacgaggaag agtcgtatac gaatgaacag 3360 acatataatt cttgtgaatc taacagaggg tatggtaatc aaatgccatt accgtctggc 3420 tatgtgacaa aagaattaga atattttcca gagacagata aagtatggat tgagattgga 3480 gaaacagaag gaacattcat cgtagacagt gtggaattac tccttatgga ggaataa 3537 <210> 8 <211> 1178 <212> PRT <213> Bacillus thuringienses <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1178) <223> The amino acid sequence of the TIC2613 pesticidal protein. <400> 8 Met Asp Asn Asn Ile Lys Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Asn 1 5 10 15 Asp Pro Glu Val Glu Ile Leu Gly Glu Glu Gly Ile Thr Thr Ser Asn 20 25 30 Glu Asn Leu Glu Phe Phe Leu Ser Leu Thr Lys Phe Val Leu Asn Arg 35 40 45 Phe Val Pro Gly Gly Ala Tyr Val Ala Gly Leu Phe Asp Val Phe Trp 50 55 60 Gly Trp Leu Lys Pro Ser Asp Trp Ser Ala Ile Leu Glu Gln Ile Glu 65 70 75 80 Glu Leu Ile Asn Gln Lys Ile Glu Thr Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Ile Tyr Ala Asp Thr 100 105 110 Phe Lys Glu Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu 115 120 125 Met Arg Thr Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ser Phe Val Thr Ala Met 130 135 140 Pro Leu Phe Ser Val Gln Asn Phe Glu Val Pro Leu Leu Ala Val Tyr 145 150 155 160 Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val 165 170 175 Phe Gly Gln Asn Trp Gly Phe Asp Ser Ala Thr Val Asn Ser Arg Tyr 180 185 190 Asn Asp Leu Val Arg Asn Ile Arg Thr Tyr Thr Asn Tyr Val Val Arg 195 200 205 Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Ala Arg Leu Arg Gly Thr Thr Tyr Gln Asp 210 215 220 Trp Leu Asn Tyr His Arg Phe Arg Arg Glu Leu Thr Ile Thr Ala Leu 225 230 235 240 Asp Ile Ile Thr Ile Phe Pro His Tyr Asp Asn Lys Met Tyr Pro Ile 245 250 255 Gln Pro His Phe Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Leu Ile 260 265 270 Asn Phe Asn Pro Ala Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Leu Phe Asn 275 280 285 Glu Met Glu Asn Ser Thr Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu 290 295 300 Asn Arg Leu Thr Ile Tyr Thr Asp Trp Tyr Ser Leu Gly Arg His Tyr 305 310 315 320 Tyr Trp Gly Gly His Gln Ile Val Ser Arg Gln Thr Gly Ser Thr Ser 325 330 335 Thr Ile Thr Phe Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Ala Pro 340 345 350 Arg Thr Tyr Asn Phe Ser Gln Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro 355 360 365 Thr Leu Thr Arg Leu Met Gln Pro Trp Pro Ala Pro Ala Phe Gln Leu 370 375 380 Arg Arg Leu Glu Gly Val Glu Phe Gln Thr Thr Thr Gly Asn Phe Thr 385 390 395 400 Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Phe Asp Glu Leu Pro Pro Asp 405 410 415 Asp Thr Ser Val Pro Ala Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His 420 425 430 Ala Thr Phe Ile Arg Lys Ser Gly Thr Pro Tyr Leu Thr Thr Gly Val 435 440 445 Thr Leu Ser Trp Thr His Asn Ser Asn Thr Pro Thr Asn Ile Ile Tyr 450 455 460 Pro Asp Lys Ile Thr Gln Val Pro Leu Val Lys Ala Ser Asn Leu His 465 470 475 480 Ser Ser Ala Phe Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile 485 490 495 Leu Gly Arg Thr Ser Val Gly Asn Ile Ala Asp Ile Gln Met Asn Ile 500 505 510 Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg Tyr Ala Ser 515 520 525 Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Thr Ile Asn Gly Arg Ala Val Asn 530 535 540 Gln Ala Asn Phe Pro Ala Thr Met Asn Arg Val Glu Asp Leu Glu Tyr 545 550 555 560 Asn Ser Phe Arg Thr Ile Ser Phe Gly Thr Pro Phe Asn Phe Leu Asp 565 570 575 Ala Gln Ser Thr Phe Arg Leu Gly Val Trp Ser Phe Ser Ser Gly Thr 580 585 590 Val Leu Ile Asp Arg Ile Glu Val Val Pro Met Glu Val Thr Phe Glu 595 600 605 Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe 610 615 620 Thr Ser Ile Asn Gln Lys Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His 625 630 635 640 Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys 645 650 655 Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Phe Glu Lys Val Lys Tyr Ala Lys Arg 660 665 670 Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Ala Asp Pro Asn Phe Thr Ser Ile 675 680 685 Asn Gly Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile 690 695 700 Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Ser Gly 705 710 715 720 Thr Leu Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu 725 730 735 Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu 740 745 750 Asp Ser Gln Asp Leu Glu Val Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Thr Lys His 755 760 765 Glu Thr Leu Asn Val Pro Gly Thr Gly Gly Leu Trp Pro Leu Ala Val 770 775 780 Glu Ser Ser Ile Gly Gly Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro Gln 785 790 795 800 Met Glu Trp Asp Pro Asn Leu Glu Cys Ser Cys Ser Asp Glu Glu Lys 805 810 815 Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys 820 825 830 Thr Asp Leu Asn Glu Asn Leu Gly Ile Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys 835 840 845 Thr Gln Asn Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu 850 855 860 Lys Pro Leu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Val Glu Lys 865 870 875 880 Lys Trp Lys Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Phe Glu Thr Asn Ile Val 885 890 895 Tyr Asn Glu Ala Lys Glu Ala Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln 900 905 910 Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala 915 920 925 Asp Asn Lys Val His Lys Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser 930 935 940 Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Thr Val Phe Glu Glu Leu Glu Glu Arg 945 950 955 960 Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn 965 970 975 Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly Gln Val 980 985 990 Asp Val Asp Gln Asn Asp His Arg Ser Val Leu Val Ile Pro Gly Trp 995 1000 1005 Glu Ser Glu Val Ser Gln Glu Val His Val Cys Pro Asp Arg Gly 1010 1015 1020 Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly 1025 1030 1035 Cys Val Thr Ile His Glu Ile Asp Asn His Thr Asp Glu Leu Lys 1040 1045 1050 Phe Lys Asn Cys Phe Glu Glu Glu Val Ser Leu Asn Asn Ala Val 1055 1060 1065 Thr Cys Asp Glu Tyr Thr Thr Asn Gln Glu Val Gly Gly Tyr Ala 1070 1075 1080 Asp Val Arg Gln Ser Asn Asn Arg Gly Ser Asn Glu Ala Tyr Val 1085 1090 1095 Asn Pro Thr Ser Thr Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Leu Tyr Glu Glu 1100 1105 1110 Glu Ser Tyr Thr Asn Glu Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Glu Ser Asn 1115 1120 1125 Arg Gly Tyr Gly Asn Gln Met Pro Leu Pro Ser Gly Tyr Val Thr 1130 1135 1140 Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu 1145 1150 1155 Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu 1160 1165 1170 Leu Leu Met Glu Glu 1175 <210> 9 <211> 3540 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> A synthetic coding sequence encoding a TIC2613PL pesticidal protein designed for expression in a plant cell wherein an additional alanine codon is inserted immediately following the initiating methionine codon. <400> 9 atggctgaca acaacatcaa gaaccagtgc atcccgtaca actgcctcaa cgacccggag 60 gtcgagatcc tcggcgagga gggcataacg acgagcaacg agaaccttga gttcttcctc 120 agcctcacga agttcgtcct gaaccgcttc gtgccgggcg gagcctacgt ggctggcctg 180 ttcgatgtgt tctggggatg gctcaagcca agcgactggt ccgcgattct ggagcagatc 240 gaggaactca tcaaccagaa gatcgagaca ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300 gagggcctct cgaacctcta cgaaatctac gccgatacgt tcaaggagtg ggagaaggat 360 ccgacgaacc cggccttgcg cgaggagatg aggacgcaat tcaacgacat gaactccagc 420 ttcgtcaccg ccatgccgct gttctccgtc cagaacttcg aggtgccctt gctcgccgtg 480 tacgcgcaag ctgcgaactt acatcttagc gtcctccgcg acgtcagcgt cttcggccag 540 aactggggat tcgattccgc gacggtgaac tcacggtaca atgatctcgt gcggaacatc 600 cggacctaca ccaattacgt cgtgcgctgg tacaacacgg gattggcgcg tctgcgcggc 660 actacctacc aggactggct caactaccac cggttccgcc gcgaactcac aatcacagcg 720 ctggacatca ttaccatctt cccgcactac gacaacaaga tgtacccaat ccagcctcac 780 ttccagctta cccgtgagat ctacacggac ccgctcatca acttcaatcc cgcactgcaa 840 tcagtagccc aattgccact cttcaacgag atggagaact cgacaatccg aagccctcac 900 ctcgtggact tcctcaaccg cctgaccatc tacacggatt ggtactctct tggtcggcac 960 tactattggg gcgggcacca aatcgtgtcc aggcagaccg gctctacctc taccataacc 1020 ttcccgatct atggccggga ggccaaccag gaggctccga ggacttacaa cttcagtcag 1080 ccagtgttcc gcacactctc caacccgact ctcactcgtt tgatgcagcc ctggcccgct 1140 cccgcgtttc agctcagaag attggagggc gtggagttcc aaacaacgac gggcaacttc 1200 acctaccgtg gccgtgggac ggtggacagt ttcgacgagt tgcctccgga cgacaccagc 1260 gtgcctgcaa gggaaggcta ctcgcacagg ctgtgccacg cgacgttcat ccgcaagtct 1320 gggacaccct acctgacaac cggcgtcact ctctcctgga cccacaacag caacacaccc 1380 accaacataa tctaccctga caagataaca caagtgccgc tggtgaaggc ttcgaacctc 1440 cattcctccg ccttcgtcct caagggtccg ggcttcaccg gcggcgacat cctgggtcgc 1500 acgtcggtcg gcaacatcgc ggacattcag atgaacatta ccgcacctct gtcccagcgc 1560 tacagagtgc gtatccgcta cgcgagtacg accaacctcc aattccacac tacgatcaat 1620 gggagggcgg ttaatcaggc caacttcccg gccacgatga accgggtcga agacctggag 1680 tacaactcgt ttcggaccat ctctttcggc acgccgttca acttcctaga cgcccagtca 1740 acctttcggc tgggagtttg gagcttcagc agcggcacag tcctcatcga ccgaatagag 1800 gtggttccga tggaggtcac gttcgaggcg gagtcggacc tggagcgagc gcagaaggct 1860 gtaaatgcgt tgttcacgag cattaaccag aagggcctca agaccgatgt cacagactac 1920 cacatcgacc aagtgtcgaa cctggtggag tgtctgtcgg atgagttctg tcttgacgag 1980 aagcgggagc tgttcgagaa ggtgaagtat gctaagcggc tgagcgacga gcggaacttg 2040 ttggctgacc cgaacttcac cagcatcaac ggacagctcg accgtgggtg gcgaggttcc 2100 accgacatca cgatacaggg cggagacgat gtgttcaagg agaactatgt gaccctctca 2160 ggaacactgg atgagtgcta cccgacctat ctctaccaga agatcgacga gagcaagctc 2220 aaggcttaca cgcgctacga actccgtggc tacatcgaag actcccagga tcttgaggtg 2280 tacctcatac gctacaacac aaagcacgag acgctcaacg ttcctggcac cggtggtctt 2340 tggcccttgg ccgtggagag tagcatcggc gggtgcggtg agccaaaccg atgcgcgcca 2400 cagatggaat gggatccgaa cctagagtgc tcctgctcag acgaggagaa gtgcgcccac 2460 cactcccacc acttctcgct cgacattgac gttggctgca cggatctcaa cgagaaccta 2520 ggaatctggg tgatcttcaa gattaagacc cagaacggct acgccaagct cgggaatctg 2580 gagtttcttg aggagaagcc gctgatcggc gaggccctcg cgcgcgtgaa gcgagtcgag 2640 aagaagtgga aagacaagcg ggagaagcta gagtttgaaa cgaacattgt ttacaacgag 2700 gcaaaggaag ccgtggacgc tctgttcgta aacagtcagt acgaccgtct ccaggccgac 2760 acgaacatcg caatgataca cgcggcggat aacaaggtgc acaagattcg ggaggcttac 2820 ctgcccgagc tgtcggtcat cccaggcgta aacgctaccg tgttcgagga gctggaggaa 2880 cggatcttca ccgcgttctc cctctatgac gcaaggaacg tcatcaagaa cggcgacttc 2940 aacaacggcc tgagctgctg gaacgtgaag ggccaagtgg acgtcgatca gaacgatcac 3000 cgctccgttc tggtcattcc agggtgggag tccgaggtga gccaagaggt ccatgtgtgc 3060 ccggaccgtg gctacatcct tcgggtgacc gcgtacaagg agggctacgg cgaaggctgc 3120 gtgaccatac acgagatcga caaccacacc gacgagctta agttcaagaa ctgcttcgag 3180 gaggaggtgt cactgaacaa cgccgtgacc tgcgacgagt acacgaccaa tcaggaggtc 3240 ggcggctacg ccgacgtccg ccagtcgaac aatcgaggca gcaacgaggc gtacgtgaac 3300 ccaacctcca cctcgacgga ctacgccagc ctctacgagg aggagtccta cacaaacgag 3360 cagacctaca actcgtgcga gagcaaccga ggttacggga accagatgcc gctaccgtcc 3420 gggtacgtga cgaaggagct ggagtatttc ccagagaccg acaaggtgtg gatcgagatc 3480 ggcgagacag agggcacgtt catcgtggac agcgtcgagc tgctgttgat ggaggagtga 3540 <210> 10 <211> 1179 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of TIC2613PL encoded by a synthetic coding sequence designed for expression in a plant cell (SEQ ID NO:9), and wherein an additional alanine amino acid is inserted immediately following the initiating methionine. <400> 10 Met Ala Asp Asn Asn Ile Lys Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Asn Asp Pro Glu Val Glu Ile Leu Gly Glu Glu Gly Ile Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Glu Asn Leu Glu Phe Phe Leu Ser Leu Thr Lys Phe Val Leu Asn 35 40 45 Arg Phe Val Pro Gly Gly Ala Tyr Val Ala Gly Leu Phe Asp Val Phe 50 55 60 Trp Gly Trp Leu Lys Pro Ser Asp Trp Ser Ala Ile Leu Glu Gln Ile 65 70 75 80 Glu Glu Leu Ile Asn Gln Lys Ile Glu Thr Phe Ala Arg Asn Gln Ala 85 90 95 Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Ile Tyr Ala Asp 100 105 110 Thr Phe Lys Glu Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu 115 120 125 Glu Met Arg Thr Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ser Phe Val Thr Ala 130 135 140 Met Pro Leu Phe Ser Val Gln Asn Phe Glu Val Pro Leu Leu Ala Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser 165 170 175 Val Phe Gly Gln Asn Trp Gly Phe Asp Ser Ala Thr Val Asn Ser Arg 180 185 190 Tyr Asn Asp Leu Val Arg Asn Ile Arg Thr Tyr Thr Asn Tyr Val Val 195 200 205 Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Ala Arg Leu Arg Gly Thr Thr Tyr Gln 210 215 220 Asp Trp Leu Asn Tyr His Arg Phe Arg Arg Glu Leu Thr Ile Thr Ala 225 230 235 240 Leu Asp Ile Ile Thr Ile Phe Pro His Tyr Asp Asn Lys Met Tyr Pro 245 250 255 Ile Gln Pro His Phe Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Leu 260 265 270 Ile Asn Phe Asn Pro Ala Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Leu Phe 275 280 285 Asn Glu Met Glu Asn Ser Thr Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe 290 295 300 Leu Asn Arg Leu Thr Ile Tyr Thr Asp Trp Tyr Ser Leu Gly Arg His 305 310 315 320 Tyr Tyr Trp Gly Gly His Gln Ile Val Ser Arg Gln Thr Gly Ser Thr 325 330 335 Ser Thr Ile Thr Phe Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Ala 340 345 350 Pro Arg Thr Tyr Asn Phe Ser Gln Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn 355 360 365 Pro Thr Leu Thr Arg Leu Met Gln Pro Trp Pro Ala Pro Ala Phe Gln 370 375 380 Leu Arg Arg Leu Glu Gly Val Glu Phe Gln Thr Thr Thr Gly Asn Phe 385 390 395 400 Thr Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Phe Asp Glu Leu Pro Pro 405 410 415 Asp Asp Thr Ser Val Pro Ala Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys 420 425 430 His Ala Thr Phe Ile Arg Lys Ser Gly Thr Pro Tyr Leu Thr Thr Gly 435 440 445 Val Thr Leu Ser Trp Thr His Asn Ser Asn Thr Pro Thr Asn Ile Ile 450 455 460 Tyr Pro Asp Lys Ile Thr Gln Val Pro Leu Val Lys Ala Ser Asn Leu 465 470 475 480 His Ser Ser Ala Phe Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp 485 490 495 Ile Leu Gly Arg Thr Ser Val Gly Asn Ile Ala Asp Ile Gln Met Asn 500 505 510 Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg Tyr Ala 515 520 525 Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Thr Ile Asn Gly Arg Ala Val 530 535 540 Asn Gln Ala Asn Phe Pro Ala Thr Met Asn Arg Val Glu Asp Leu Glu 545 550 555 560 Tyr Asn Ser Phe Arg Thr Ile Ser Phe Gly Thr Pro Phe Asn Phe Leu 565 570 575 Asp Ala Gln Ser Thr Phe Arg Leu Gly Val Trp Ser Phe Ser Ser Gly 580 585 590 Thr Val Leu Ile Asp Arg Ile Glu Val Val Pro Met Glu Val Thr Phe 595 600 605 Glu Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu 610 615 620 Phe Thr Ser Ile Asn Gln Lys Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr 625 630 635 640 His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe 645 650 655 Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Phe Glu Lys Val Lys Tyr Ala Lys 660 665 670 Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Ala Asp Pro Asn Phe Thr Ser 675 680 685 Ile Asn Gly Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr 690 695 700 Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Ser 705 710 715 720 Gly Thr Leu Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp 725 730 735 Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile 740 745 750 Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Val Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Thr Lys 755 760 765 His Glu Thr Leu Asn Val Pro Gly Thr Gly Gly Leu Trp Pro Leu Ala 770 775 780 Val Glu Ser Ser Ile Gly Gly Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro 785 790 795 800 Gln Met Glu Trp Asp Pro Asn Leu Glu Cys Ser Cys Ser Asp Glu Glu 805 810 815 Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly 820 825 830 Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asn Leu Gly Ile Trp Val Ile Phe Lys Ile 835 840 845 Lys Thr Gln Asn Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu 850 855 860 Glu Lys Pro Leu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Val Glu 865 870 875 880 Lys Lys Trp Lys Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Phe Glu Thr Asn Ile 885 890 895 Val Tyr Asn Glu Ala Lys Glu Ala Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser 900 905 910 Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala 915 920 925 Ala Asp Asn Lys Val His Lys Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu 930 935 940 Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Thr Val Phe Glu Glu Leu Glu Glu 945 950 955 960 Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys 965 970 975 Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly Gln 980 985 990 Val Asp Val Asp Gln Asn Asp His Arg Ser Val Leu Val Ile Pro Gly 995 1000 1005 Trp Glu Ser Glu Val Ser Gln Glu Val His Val Cys Pro Asp Arg 1010 1015 1020 Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu 1025 1030 1035 Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Asp Asn His Thr Asp Glu Leu 1040 1045 1050 Lys Phe Lys Asn Cys Phe Glu Glu Glu Val Ser Leu Asn Asn Ala 1055 1060 1065 Val Thr Cys Asp Glu Tyr Thr Thr Asn Gln Glu Val Gly Gly Tyr 1070 1075 1080 Ala Asp Val Arg Gln Ser Asn Asn Arg Gly Ser Asn Glu Ala Tyr 1085 1090 1095 Val Asn Pro Thr Ser Thr Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Leu Tyr Glu 1100 1105 1110 Glu Glu Ser Tyr Thr Asn Glu Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Glu Ser 1115 1120 1125 Asn Arg Gly Tyr Gly Asn Gln Met Pro Leu Pro Ser Gly Tyr Val 1130 1135 1140 Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile 1145 1150 1155 Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu 1160 1165 1170 Leu Leu Leu Met Glu Glu 1175

Claims (27)

  1. 살충 단백질 또는 이의 살충 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절에 작동 가능하게 연결된 이종성 촉진자를 포함하는 재조합 핵산 분자로서,
    a. 상기 살충 단백질은 서열 번호 4, 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b. 상기 살충 단백질은,
    ⅰ. 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 93% 또는 95% 또는 98% 또는 99% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성; 또는
    ⅱ. 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 적어도 73% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성
    을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    c. 상기 폴리뉴클레오타이드 분절은 엄격한 혼성화 조건 하에 서열 번호 3, 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 7 또는 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는, 재조합 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 상기 재조합 핵산 분자는 식물에서 상기 살충 단백질을 발현하도록 작용하는 서열을 포함하거나;
    b. 상기 재조합 핵산 분자는 상기 살충 유효량의 살충 단백질을 생산하도록 식물 세포에서 발현되거나; 또는
    c. 상기 재조합 핵산 분자는 벡터와 작동 가능한 연결에 있고, 상기 벡터는 플라스미드, 파지미드, 박미드(bacmid), 코스미드, 및 박테리아 또는 효모 인공 염색체로 이루어진 군으로부터 선택된, 재조합 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 숙주 세포 내에 존재하는 것으로 정의되고, 상기 숙주 세포는 박테리아 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된, 재조합 핵산 분자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 박테리아 숙주 세포는 아그로박테륨(Agrobacterium), 리조븀(Rhizobium), 바실러스(Bacillus), 브레비바실러스(Brevibacillus), 에스체리치아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea) 및 에르위니아(Erwinia)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아의 속 유래인, 재조합 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 바실러스 종은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis)이고, 상기 브레비바실러스는 브레비바실러스 라테로스페로우스(Brevibacillus laterosperous)이고, 상기 에스체리치아는 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli)인, 재조합 핵산 분자.
  6. 제3항에 있어서, 상기 식물 세포는 쌍떡잎식물 또는 외떡잎식물 식물 세포인, 재조합 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물 숙주 세포는 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 배추속, 당근, 카사바, 피마자, 꽃양배추, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 면, 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 상추, 테에다 소나무(Loblolly pine), 수수, 멜론, 견과, 귀리, 올리브, 양파, 관상품, 팜, 목초, 완두콩, 땅콩, 후추, 나무콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디아타 소나무(Radiata pine), 무, 유채, 쌀, 근경, 호밀, 잇꽃, 관목, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕 옥수수, 스위트 검, 고구마, 스위치그래스, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디, 수박 및 밀 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된, 재조합 핵산 분자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 나비목 곤충에 대한 활성을 나타내는, 재조합 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 곤충은 근대 거염벌레(스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua)), 옥수수 귀벌레(헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)), 면 잎 벌레(알라바마 아르길라세아(Alabama argillacea)), 유럽 옥수수 나무좀(오스트리니아 누빌랄리스(Ostrinia nubilalis)), 밤나방유충(스포돕테라 푸리기페르다)(Spodoptera frugiperda), 올드 월드 솜벌레(헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera)), 오리엔탈 잎 벌레(스포돕테라 리투라(Spodoptera litura)), 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라(Pectinophora gossypiella)), Cry1Ac 내성 분홍 솜벌레(펙티노포라 고시피엘라), 대두 자벌레(크리소데익시스 인클루덴스(Chrysodeixis includens)), 써던 거염벌레(스포돕테라 에리다니아(Spodoptera eridania)), 사우쓰웨스턴 옥수수 나무좀(디아트라에아 그라디오셀라(Diatraea grandiosella)), 점무늬 솜벌레(에아리아스 비텔라(Earias vittella)), 사탕수수 나무좀(디아트라에아 사카랄리스(Diatraea saccharalis)), 회색담배나방(헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens)) 및 벨벳콩 애벌레(안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis))로 이루어진 군으로부터 선택된, 재조합 핵산 분자.
  10. 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는, 식물 또는 이의 일부.
  11. 제10항에 있어서, 상기 식물은 외떡잎식물 식물 또는 쌍떡잎식물 식물인, 식물 또는 이의 일부.
  12. 제10항에 있어서, 상기 식물은 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 배추속, 당근, 카사바, 피마자, 꽃양배추, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 면, 조롱박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 상추, 테에다 소나무, 수수, 멜론, 견과, 귀리, 올리브, 양파, 관상품, 팜, 목초, 완두콩, 땅콩, 후추, 나무콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디아타 소나무, 무, 유채, 쌀, 근경, 호밀, 잇꽃, 관목, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕 옥수수, 스위트 검, 고구마, 스위치그래스, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디, 수박 및 밀로 이루어진 군으로부터 선택된, 식물 또는 이의 일부.
  13. 제10항의 식물의 종자로서, 상기 종자는 상기 재조합 핵산 분자를 포함하는, 식물의 종자.
  14. 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는, 곤충 저해 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 살충 단백질과 다른 적어도 하나의 다른 살충제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 곤충 저해 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다른 살충제는 곤충 저해 단백질, 곤충 저해 dsRNA 분자 및 보조 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된, 곤충 저해 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다른 살충제는 나비목(Lepidoptera), 딱정벌레목(Coleoptera) 또는 반시목(Hemiptera) 목의 하나 이상의 해충 종에 대해 활성을 나타내는, 곤충 저해 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다른 살충 단백질은 Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, Cry1C 변이체, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1A/F 키메라, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, Cry3A 변이체, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113, 및 AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z 및 AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1 및 이의 변이체, IP3 및 이의 변이체, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 및 DIG-11 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된, 곤충 저해 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 상기 재조합 핵산 분자를 발현하는 식물 세포를 포함하는 것으로 정의된, 곤충 저해 조성물.
  20. 제10항의 식물 또는 이의 일부로부터 생성된 소비재(commodity product)로서, 검출 가능한 양의 상기 재조합 핵산 분자 또는 살충 단백질을 포함하는, 소비재.
  21. 제20항에 있어서, 곡물 취급자가 담은 소비재 옥수수, 옥수수 플레이크, 옥수수 케이크, 옥수수 밀가루, 옥수수 가루, 옥수수 시럽, 옥수수 오일, 옥수수 사일리지, 옥수수 전분, 옥수수 시리얼 등, 및 상응하는 대두, 쌀, 밀, 수수, 나무콩, 땅콩, 과일, 멜론, 및 식물성 소비재, 예를 들어, 적용 가능한 경우, 주스, 농축물, 잼, 젤리, 마멀레이드 및 검출 가능한 양의 본 출원의 이러한 폴리뉴클레오타이드 및 또는 폴리펩타이드를 함유하는 이러한 소비재의 다른 식용 가능한 형태, 전체 또는 처리된 면 종자, 면 오일, 린트, 먹이 또는 사료에 대해 처리된 종자 및 식물 일부, 섬유, 제지, 바이오매스, 및 연료 생성물, 예컨대 면 오일로부터 유래된 연료 또는 조면기 폐기물로부터 유래된 펠릿, 전체 또는 처리된 대두 종자, 대두유, 대두 단백질, 대두 가루, 대두 밀가루, 대두 플레이크, 대두 겨, 대두 밀크, 대두 치즈, 대두 와인, 대두를 포함하는 동물 사료, 대두를 포함하는 제지, 대두를 포함하는 크림, 대두 바이오매스, 및 대두 식물 및 대두 식물 일부를 사용하여 제조된 연료 생성물로 이루어진 군으로부터 선택된, 소비재.
  22. 종자를 생산하는 방법으로서,
    a. 제13항에 따른 제1 종자를 식목하는 단계;
    b. 상기 종자로부터 식물을 성장시키는 단계; 및
    c. 상기 식물로부터 종자를 수확하는 단계로서, 수확된 상기 종자는 상기 재조합 핵산 분자를 포함하는, 종자를 생산하는 방법.
  23. 곤충 침입에 내성인 식물로서, 상기 식물의 세포는 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는, 식물.
  24. 나비목 종 해충 또는 해충 침입을 방제하는 방법으로서,
    a. 상기 해충을 서열 번호 4, 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10에 기재된 살충 단백질의 살충 유효량과 접촉시키는 단계; 또는
    b. 상기 해충을,
    i. 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 93% 또는 95% 또는 98% 또는 99% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성; 또는
    ii. 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 적어도 73% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성
    을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 살충 단백질의 살충 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 나비목 종 해충 또는 해충 침입을 방제하는 방법.
  25. 식물 게놈 DNA를 포함하는 샘플에서 제1항의 재조합 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법으로서,
    a. 엄격한 혼성화 조건 하에 제1항의 DNA 분자를 포함하는 식물로부터 게놈 DNA와 혼성화되고, 이러한 혼성화 조건 하에 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하지 않는 달리 동질유전자 식물로부터 게놈 DNA와 혼성화되지 않는 핵산 프로브, 또는
    i. 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 93% 또는 95% 또는 98% 또는 99% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성; 또는
    ii. 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 적어도 73% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성
    을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 살충 단백질을 코딩하는 서열과 상기 샘플을 접촉시키는 단계로서, 상기 프로브는 서열 번호 3 또는 서열 번호 9와 상동성 또는 상보성인, 상기 접촉시키는 단계;
    b. 상기 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건으로 처리하는 단계; 및
    c. 상기 프로브의 상기 샘플의 DNA와의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는, 식물 게놈 DNA를 포함하는 샘플에서 재조합 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법.
  26. 단백질을 포함하는 샘플에서 살충 단백질 또는 이의 단편의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 살충 단백질은 서열 번호 4, 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 살충 단백질은,
    a. 서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6과 적어도 93% 또는 95% 또는 98% 또는 99% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성; 또는
    b. 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 적어도 73% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 약 100%의 아미노산 서열 동일성
    을 갖는 아미노산 서열을 포함하되;
    c. 상기 샘플을 면역반응성 항체와 접촉시키는 단계; 및
    d. 상기 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 단백질을 포함하는 샘플에서 살충 단백질 또는 이의 단편의 존재를 검출하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 ELISA 또는 웨스턴 블롯을 포함하는, 단백질을 포함하는 샘플에서 살충 단백질 또는 이의 단편의 존재를 검출하는 방법.
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