BR112014024861B1

BR112014024861B1 - Polipeptídeo inibidor de inseto, polinucleotídeo codificando o mesmo, célula hospedeira bacteriana, composição inibidora de inseto, mercadoria e métodos de controle de uma peste hemíptera e de produzir uma mercadoria

Info

Publication number: BR112014024861B1
Application number: BR112014024861-3A
Authority: BR
Inventors: James A. Baum; Artem G. Evdokimov; Farhad Moshiri; Timothy J. Rydel; Eric J. Sturman; Moritz von Rechenberg; Halong Vu; Andrew M. Wollacott; Meiying Zheng
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2013-04-05
Publication date: 2021-11-16
Also published as: ES2743916T3; US20220356215A1; US11459359B2; AR118723A2; US20170318818A1; CR20140507A; US20200022376A1; US9322033B2; WO2013152264A2; CN104271595B; US10897910B2; CN104271595A; CA2868815C; US20210100249A1; AR090622A1; US20130269060A1; EP3495379A1; US9713334B2; EP2834266A2; JP6106263B2

Abstract

proteínas tóxicas para insetos da espécie hemiptera. a presente invenção divulga proteínas inibidoras de insetos da espécie hemiptera, métodos de uso dessas proteínas, sequências de nucleotídeos que codificam essas proteínas, métodos de detectar e isolar essas proteínas e sua utilização em sistemas agrícolas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido de patente provisório U.S. No de série 61/621,436, depositado em 6 de abril de 2012, que está incorporado neste documento como referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] A Listagem de Sequência contida no artigo nomeado"38_21_56191_APCT_Sequence Listing_ST25.txt", que tem 529,794 bytes de tamanho (medido no sistema operacional MS-WINDOWS) e foi criada em 4 de abril de 2013, é contemporaneamente depositada por submissão eletrônica (usando o sistema de preenchimento EFS- Web do Escritório de Patentes dos Estados Unidos) e é incorporada neste documento como referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção trata geralmente do campo de proteínas inibidoras de insetos. Em particular, a presente invenção trata de proteínas que exibem atividade inibidora de insetos contra pragas agriculturalmente relevantes de plantas de cultivo e sementes, particularmente pragas de insetos da espécie hemiptera.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Proteínas inibidoras de insetos derivadas de Bacillus thu-ringiensis (Bt) são atóxicas a humanos, vertebrados e plantas. Essas proteínas são também biodegradáveis, seguras e eficazes no controle de pragas de insetos. Algumas dessas proteínas foram e estão sendo usadas para controlar pragas agriculturalmente relevantes de plantas de cultivo espargindo-se as plantas com formulações contendo essas proteínas ou com microorganismos que as expressam, tratando-se sementes com tratamentos contendo essas proteínas ou expressando essas proteínas em plantas de cultivo e sementes de plantas de cultivo como protetores incorporados à planta.

[005] Determinadas espécies de Hemiptera, particularmente insetos Amrasca, Empoasca e Lygus, são pragas de algodão e alfafa, e tipicamente são controladas apenas usando-se químicos de amplo espectro, por exemplo, endossulfano, acefato e oxamil, os quais podem persistir no e são nocivos ao meio ambiente. Algumas proteínas Bt foram desenvolvidas em formulações ou como traços transgênicos em plantas de cultivo para uso comercial por fazendeiros a fim de controlarespécies de pragas Coleoptera e Lepidóptera, mas nenhuma proteína Bt foi desenvolvida para uso em controle comercial da espécie de praga Hemiptera.

[006] Proteínas tóxicas específicas para Hemiptera foram relatadas na técnica. TIC807 é uma proteína de Bacillus thuringiensisdivulgada na Publicação de Pedido de Patente No. US 2008-0295207 A1 como sendo tóxica a espécies de praga Hemiptera. Uma proteína Cry51Aa1 relatada como tóxica à espécie Lepidóptera que se assemelhaà sequência de aminoácido de TIC807 também foi divulgada (Huang et al., (2007) J. Invertebr. Pathol. 95(3), 175-180), mas nenhuma atividadeespecífica de Hemiptera foi relatada. Baum et al. divulgaram TIC853, uma proteína relatada como tóxica à espécie de praga Lygus (Publicação de Pedido de Patente No. US 2010-0064394 A1). Uma proteína referida como AXMI-171 foi relatada por exibir alguma inibição li-mitada de insetos Hemiptera (Publicação de Pedido de Patente No. US 2010-0298207 A1, exemplo 18), particularmente Lygus hesperus.

[007] Todas essas proteínas exibem um estreito alcance de toxicidade apenas contra Lygus hesperus e exibem efeitos tóxicos contra outras espécies de praga Lygus apenas em doses altas, não conside-radasobteníveis por expressão em plantas. Comparadas às proteínas tóxicas Hemiptera da técnica anterior, há uma necessidade de proteínas de toxina que possam ser usadas em e dentro de plantas que exibem um amplo alcance de hospedagem contra espécies de praga Hemiptera e a doses eficazes de baixa concentração.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] As proteínas tóxicas recombinantemente manipuladas descritas neste documento (referidas neste documento como "proteínas de toxinas manipuladas", "proteínas tóxicas a Hemiptera manipuladas" ou "proteínas de toxinas a Hemiptera manipuladas"também são descritas neste documento, de forma truncada, como "eHTPs" quando referidas em grupos de duas ou mais tais proteínas e "eHTP" quando referidas singularmente) são derivados de toxinas inseticidas naturalmente ocorrentes de Bacillus thuringiensis, TIC807 (SEQ ID NO:2), TIC807_M2 (SEQ ID NO:8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO:182), TIC853(SEQ ID NO:184) e AXMI-171(SEQ ID NO:206), previamente descritas como possuidoras de atividade de biocontrole dirigida à espécie de praga Hemiptera, particularmente a espécie de insetos Lygus hesperus(referências citadas alhures neste documento). As proteínas tóxicas a He- miptera recombinantes da presente invenção são particularmente tóxi-cas a insetos das espécies Amrasca, Empoasca e Lygus e a outras espécies de praga de insetos filogeneticamente relacionadas a cada uma dessas espécies de praga de insetos, e adicionalmente a pragas de insetos que se alimentam de plantas usando um mecanismo de rasgo e sugamento usado pelas espécies de praga Amrasca, Empo- asca e Lygus da ordem Hemiptera. Diferentemente das toxinas inseticidas precursoras TIC807 (SEQ ID NO:2), TIC807_M2 (SEQ ID NO:8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO:182), TIC853 (SEQ IDNO:184) e AXMI-171 (SEQ ID NO:206) das quais são derivadas, as quais necessitam cada uma de doses moderadamente altas a altas de proteína para alcançar efeitos tóxicos sobre uma espécie de Lygus e exibem efeitos tóxicos muito baixos ou nenhum efeito tóxico sobre uma segunda espécie de Lygus fortemente assemelhada, as proteínas eHTPs da presente invenção exibem efeitos tóxicos de baixa dosagem interessantes contra pragas de insetos da ordem Hemiptera, incluindo efeitos tóxicos do alcance de hospedagem que abarcam o espectro de pragas no interior da ordem.

[009] As eHTPs da presente invenção contêm cada uma pelomenos uma substituição de aminoácido, uma adição de aminoácido ou uma deleção de aminoácido comparadas às sequências primárias de aminoácidos de uma ou mais das proteínas de toxina estabelecidas em qualquer uma dentre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ IDNO:182 ou SEQ ID NO:184. Em determinadas modalidades, provê-se uma eHTP que contém pelo menos de cerca de 2 a cerca de 260 vezes mais atividade inibidora contra uma espécie de praga de Lygus que qualquer uma ou mais das proteínas estabelecidas em qualquer uma dentre SEQ ID NO:2 (TIC807), SEQ ID NO:8 (TIC807_M2), SEQ ID NO:182 (Cry51Aa1), SEQ ID NO:184 (TIC853) e/ou SEQ ID NO:206 (AXMI-171). Opcionalmente, a eHTP exibe pelo menos cerca de 95% de identificação de sequência de aminoácidos em relação à toxina de proteína escolhida do grupo consistente de SEQ ID NO:2 (TIC807) e SEQ ID NO:182 (Cry51Aa1). Em determinadas modalidades, é provido uma eHTP contendo pelo menos uma substituição de aminoácido, pelo menos uma adição de aminoácido ou pelo menos uma deleção de aminoácido quando à sequência de aminoácido de qualquer um dentre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:182 ou SEQ ID NO:184. A eHTP exibe uma atividade inibidora de Lygus aumentada ou maior e alveja um espectro de espécies de praga comparado ao espectro de atividade e alvejamento das espécies de praga das proteínas do Baci llus thuringiensis estabelecidas em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:182 e SEQ ID NO:184. Cada uma das eHTPs supramencionadascontém pelo menos, coletiva ou alternativamente: (i) a substituição, adição ou deleção de um aminoácido em um resíduo de aminoá- cido acessível a solvente de SEQ ID NO:2; (ii) a substituição, adição ou deleção de um aminoácido dentro de 3 resíduos consecutivos de um solvente de um resíduo de aminoácido acessível a solvente de SEQ ID NO:2; ou (iii), uma sequência de aminoácido conforme estabelecida em SEQ ID NO:180. As eHTPs supramencionadas conterão cada uma, pelo menos, em referência às posições da sequência de ami- noácidos conforme numeradas de acordo com as posições de amino- ácido de TIC807, uma substituição ou deleção selecionada do grupo consistente de asparagina na posição 12 substituída por ácido aspárti- co, fenilanina na posição 46 substituída por serina, isoleucina na posição 52 substituída por metionina, tirosina na posição 54 substituída por histidina, treonina na posição 68 substituída por alanina, glutamina na posição 70 substituída por alanina, alanina na posição 87 substituída por serina, treonina na posição 93 substituída por alanina, serina na posição 95 substituída por alanina, glicinas na posição 105 substituídas por alanina, serina na posição 117 substituídas por alanina, serina na posição 119 substituída por alanina, glutamato na posição 125 substituído por cisteína, histidina, arginina, fenilanina, serina, glutami- na, lisina, treonina, asparagina, alanina, leucina, valina, metionina, ácidoaspártico ou tirosina, glicinas na posição 128 substituídas por alani- na, treonina na posição 133 substituída por ácido glutâmico, tirosina ou triptofano, isoleucina na posição 134 substituída por alanina, valina, leucina, fenilanina, lisina, cisteína ou metionina, glutamato na posição 135 substituído por serina, alanina, valina, triptofano ou treonina, aspa- ragina na posição 137 substituída por histidina, tirosina, treonina, ácido glutâmico, serina, alanina, glutamina, glicina, isoleucina, triptofano, li sina, cisteína, metionina, ácido aspártico, fenilanina ou arginina, fenila- nina na posição 138 substituída por valina, Ala139 substituída por serina, Thr145 substituída por alanina, Phe147 substituída por serina, valina, treonina,cisteína, ácido aspártico, alanina, glicina, ácido glutâ- mico, isoleucina, tirosina, metionina, asparagina, glutamina, histidina, alanina, arginina, triptofano ou prolina, glutamina na posição 148 substituída por alanina, glutamina na posição 149 substituída por ácido as- pártico, ácido glutâmico, cisteína, alanina ou fenilanina, alanina na posição 150 substituída por serina, leucina, valina, glicina, ácido aspárti- co, triptofano, ácido glutâmico, asparagina, tirosina, fenilanina, prolina, lisina, treonina, glutamina ou arginina, seroína na posição 151 substituída por alanina, aspartato na posição 153 substituído por alanina, glu- tamato na posição 155 substituído por cisteína, isoleucina, lisina, ácido aspártico, histidina, tirosina, glutamina, lisina, asparagina, treonina, alanina, fenilanina, arginina, metionina, prolina, triptofano, serina ou valina, asparagina na posição 157 substituída por cisteína, ácido aspá- rtico, triptofano, tirosina, metionina, alanina, fenilanina, valina, leucina, prolina, ácido glutâmico, treonina, glicina, isoleucina ou arginina, iso- leucina na posição 158 substituída por alanina, serina na posição 159 substituída por alanina ou treonina, serina na posição 167 substituída por arginina ou alanina, valina na posição 175 substituída por alanina, metionina na posição 177 substituída por alanina, asparagina na posição 180 substituída por ácido aspártico, treonina na posição 182 substituída por alanina, leucina na posição 187 substituída por alanina, his- tidina na posição 196 deletada, tirosina na posição 197 deletada, serina na posição 198 deletada, histidina na posição 199 deletada, tirosina na posição 200 substituída por alanina, tirosina na posição 200 deleta- da, Ser201 substituída por alanina, deleção da serina na posição 201, triptofano na posição 208 substituído por alanina, serina na posição 217 substituída por asparagina, prolina na posição 219 substituída por arginina, triptofano na posição 223 substituído por tirosina, fenilanina na posição 235 substituída por alanina, asparagina na posição 239 substituída por alanina, aspartato na posição 241 substituído por ala- nina, treonina na posição 243 substituído por alanina, valina na posição 244 substituída por isoleucina, treonina na posição 245 substituída por alanina, tirosina na posição 246 substituída por fenilanina, treonina na posição 247 substituída por alanina ou lisina, serina na posição 249 substituída por alanina ou arginina, valina na posição 250 substituída por alanina, valina na posição 251 substituída por alanina, serina na posição 252 substituída por alanina, arginina na posição 273 substituída por triptofano, treonina na posição 274 substituída por alanina, iso- leucina na posição 275 substituída por alanina, arginina na posição 282 substituída por alanina, histidina na posição 287 substituída por alanina ou fenilanina, serina na posição 293 substituída por alanina, asparagina na posição 295 substituída por alanina, glutamato na posição 299 substituído por alanina, metionina na posição 300 substituída por alanina, treonina na posição 303 substituída por alanina, prolina na posição 305 substituída por alanina, isoleucina na posição 306 substituída por alanina e treonina na posição 308 substituída por alanina, ou em que a proteína compreende qualquer combinação das substituições e/ou deleções referidas. eHTPs contêm pelo menos uma substituição de aminoácido, uma adição de aminoácido ou uma deleção de aminoácido em um resíduo de aminoácido da SEQ ID NO:2, ou a posição de aminoácido correspondente de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:182 ou SEQ ID NO:184, escolhido do grupo consistente de (i) um resíduo de aminoácido possuidor de uma acessibilidade de solvente relativa de cerca de 15% a cerca de 36%; e (ii) um resíduo de aminoá- cido localizado dentro de uma distância de cerca de 3 resíduos consecutivos de um aminoácido possuidor de pelo menos 15% a pelo menos 36% de acessibilidade de solvente relativa. Uma eHTP da presente invenção contém pelo menos uma substituição, adição ou deleção de um resíduo de aminoácido escolhido do grupo consistente de Thr93, Ser95, Ser97, Phe147, Gln149, Ser151, Asn180, Thr182, Val251,Gln253 e Ser255 da SEQ ID NO:2. Qualquer uma das eHTPs supra-mencionadas pode conter pelo menos uma substituição, adição ou de- leção adicional em um resíduo de aminoácido escolhido do grupo consistente de Val10, Ile14, Asn22, Asn23, Gly24, Ile25, Gln26, Gly27, Phe30, Gln38, Ile39, Asp40, Thr41, Ile43, Ser193, Thr194, Glu195, His196, Tyr197, Ser198, His199, Tyr200, Ser201, Gly202, Tyr203,Pro204, Ile205, Leu206, Thr207, Trp208, Ile209, Ser210, Tyr216,Ser217, Gly218, Pro219, Pro220, Met221, Ser222, Trp223, Tyr224,Phe225, Asn239 e Val244 da SEQ ID NO: 2 ou a posição correspondente do resíduo de aminoácido de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:182 ou SEQ ID NO:184. Qualquer uma das eHTPs supramencionadas pode conter uma ou mais modificações escolhidas do grupo consistente de S95A, F147A, Q149E, V251A, P219R e uma deleção de quaisquer três aminoácidos consecutivos dos resíduos de aminoácido 196-201 conforme estabelecidos na SEQ ID NO:2. Qualquer uma das eHTPs da presente invenção pode ser adicionalmente modificada para exibir solubilidade aumentada comparada à proteína de ocorrência natural de Bacillus thuringiensis conforme estabelecido em qualquer uma dentre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:182 ou SEQ ID NO:184 em que a eHTP contenha pelo menos uma ou mais modificações de sequência de aminoácido relativas à sequência de aminoácido conforme estabelecido na SEQ ID NO:2. A(s) modificação(ões) contêm pelo menos uma substituição de lisina em uma ou mais das posições de aminoácido definidas como 58, 59, 198, 199, 201 ou 202 na SEQ ID NO:2; uma substituição de resíduo de ácido glutâmico em uma ou mais das posições de aminoácido definidas como 198, 248 ou 301 na SEQ ID NO:2; ou uma substituição de resíduo de arginina em uma ou mais das posições de aminoácido definidas como 246, 250 ou 253 na SEQ ID NO:2. Uma eHTP possuidora de uma sequência de aminoáci- do escolhida do grupo consistente de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:171, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:202, e SEQ ID NO:204 ou um fragmento inibidor do inseto da mesma é uma modalidade preferencial da presente invenção. A espécie de praga Hemiptera alvejada inibida pelas eHTPs da presente invenção incluem pelo menos Lygus hesperus, Lygus lineolaris, Empoasca fabae e Amrasca devastans, bem como outras pragas dentro da ordem Hemiptera que sejam filogenetica- mente relacionadas umas às outras ou que usem uma abordagem de rasgo e sugamento em sua alimentação de plantas.

[0010] Proveem-se também métodos de controle de uma pragaHemiptera colocando-se a praga em contato com uma quantia inibido- ra de Hemiptera de uma eHTP da presente invenção, bem como uma composição inibidora do inseto que contenha pelo menos uma quantidade controladora de Hemiptera (ou quantidade inibidora de Hemipte- ra) de uma ou mais das eHTPs da presente invenção. Em determinadas modalidades, uma composição inibidora de insetos compreendendo qualquer uma das eHTPs divulgadas neste documento é provida. Em determinadas modalidades desses métodos, a praga Hemiptera se dá em um campo de algodões, soja ou alfafa. Composições tóxicas ou controladoras de Hemiptera podem conter pelo menos um ou mais eHTP junto a um agente suplementar que é escolhido do grupo consistente de uma proteína inibidora de insetos, uma molécula dsRNA inibi- dora de insetos e um químico inibidor de insetos. Cada um desses agentes pode exibir propriedades controladoras de Hemiptera, pode exibir propriedades controladoras de pragas não relacionadas a espécies Hemiptera, tais como espécies Lepidóptera ou Coleóptera, ou pode exibir modo dual de propriedades de ação em que uma ou mais espécies Hemiptera e uma ou mais espécies Lepidóptera ou Coleóptera são simultaneamente controladas.

[0011] Proveem-se polinucleotídeos recombinantes que codificamas eHTPs da presente invenção. Proveem-se também micróbios que contêm os polinucleotídeos da presente invenção, e tais polinucleotí- deos no interior de tais micróbios são funcionalmente posicionados no interior de cassetes de expressão projetados para expressar as eHTPs da presente invenção a partir de elementos regulatórios genéticos funcionais operavelmente ligados. Os micróbios são destinados a incluir células bacterianas, bem como células de plantas transgênicas. Tais células de plantas transgênicas podem ser regeneradas em plantas inteiras ou partes de plantas que também contêm o polinucleotídeo re- combinante. Proveem-se também métodos de controle de uma praga Hemiptera por exposição da praga ao micróbio, quer se trate de uma célula bacteriana ou célula de planta transgênica, planta ou parte de planta, cada qual expressando uma quantidade inibidora de Hemiptera de uma eHTP. O polinucleotídeo recombinante pode conter uma sequência de nucleotídeos escolhida do grupo consistente de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ IDNO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ IDNO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201 e SEQ IDNO:203 ou outras sequências que podem ser montadas para codificar uma ou mais das proteínas da presente invenção. Em determinadas modalidades, o polinucleotídeo recombinante pode compreender ademais uma sequência de nucleotídeos que codifica um ou mais agentes inibidors de inseto que são diferentes da eHTP codificada pelo polinu- cleotídeo recombinante. A parte transgênica da planta é uma semente, cápsula, folha, flor, caule, raiz ou qualquer parte dela. A parte transgêni- ca da planta pode ser uma parte não regenerável dessa semente, cápsula, folha, flor, caule ou raiz. Proveem-se também métodos de controle de uma praga de Hemiptera, compreendendo expor o micróbio, a bactéria, a célula da planta, planta ou parte da planta à praga alvejada, em que o micróbio, a bactéria, a célula da planta, planta ou parte da planta expressa uma quantidade inibidora de Hemiptera de uma eHTP codificada pelo polinucleotídeo recombinante.

[0012] Proveem-se também produtos de planta processados quecontêm uma quantidade detectável de um polinucleotídeo recombinan- te que codifica uma eHTP ou qualquer parte controladora de Hemipte- ra da mesma. Tais produtos processados incluem, mas não se limitam a biomassa de planta, óleo, refeição, ração animal, farinha, flocos, farelo, fibras, cascas e sementes processadas. O produto processado pode ser não regenerável.

[0013] Proveem-se também métodos para fazer uma planta trans-gênica introduzindo-se o polinucleotídeo recombinante em uma célula de planta e escolhendo-se uma planta transgênica que expresse uma quantidade inibidora de insetos de uma eHTP codificada por um poli- nucleotídeo. Os métodos incluem introduzir o polinucleotídeo recombi- nante que codifica qualquer uma das eHTPs providas neste documen- to em uma célula de planta e escolher uma planta transgênica que expresse uma quantidade inibidora de insetos da eHTP codificada pelo polinucleotídeo recombinante.

[0014] Outras modalidades, características e vantagens da invenção se tornarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, dos exemplos e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0015] A Figura 1 ilustra a mortalidade da espécie Lygus registradaem função da concentração de proteína eHTP. A Figura 1A ilustra a mortalidade de populações de Lygus hesperus em resposta a diversas concentrações de quatro diferentes eHTPs comparado a amostras de controle contendo a proteína naturalmente ocorrente TIC807. A Figura 1B ilustra a mortalidade de populações Lygus lineolaris em resposta a diversas concentrações de proteína de três diferentes eHTPs comparado a uma amostra de controle que contém a proteína naturalmente ocorrente TIC807.

[0016] A Figura 2 ilustra um diagrama de fita da estrutura atômicade uma proteína tóxica de Hemiptera da presente invenção mostrando as posições relativas das mudanças efetivas do resultado aumentando os efeitos tóxicos e/ou aumentando a especificidade do alcance comparadoà posição relativa da mesma posição de aminoácido no interior de uma proteína TIC807 ou relacionada. Dois emplastros de superfície são ilustrados por esferas circundantes de posições residuais particulares no interior da estrutura atômica no diagrama de fita: [1] uma esfera tem um raio atômico de cerca de 9,2 a cerca de 12,2 Anstroms do átomo de carbono beta de S95 (em relação à posição S95, conforme estabelecido na SEQ ID NO:2); [2] outra esfera tem um raio atômico de cerca de 9,2 a cerca de 12,2 Angstroms do átomo de carbono beta de P219 (em relação à posição P219, conforme estabelecido na SEQ ID NO:2). Mudanças dos aminoácidos com a estrutura de fita que ca- em dentro dessas esferas se resultam eficazes em causar proprieda-destóxicas aumentadas e efeitos tóxicos de alcance de hospedagem mais amplos comparado a uma proteína possuidora de um aminoácido naturalmente ocorrente naquela posição específica.

[0017] A Figura 3 é uma vista em gráfico ilustrando a mortalidadeda população da espécie Lygus de treze eHTPs diferentes comparadas umas às outras e à proteína naturalmente ocorrente TIC807.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0018] Este pedido descreve eHTPs (proteínas tóxicas da espécieHemiptera manipuladas). As eHTPs da presente invenção devem ser diferenciadas de proteínas tais como TIC807, TIC853, Cry51Aa1 e AXMI-171, que são conhecidas na técnica e não devem ser consideradas como dentro do escopo da invenção do termo eHTP, uma vez que as proteínas da técnica anterior não são manipuladas para exibir propriedades tóxicas melhoradas dirigidas a uma ou mais espécies de praga Hemiptera e não exibem amplos níveis de alcance de hospedagem de atividade inibidora. eHTPs exibem, curiosamente, níveis mais altos de atividade tóxica contra espécies de praga Hemiptera e relacionadas. Uma característica adicional dessas eHTPs que á ainda mais curiosa é a descoberta de que essas proteínas exibem propriedades tóxicas de alcance de hospedagem mas amplas comparadas a proteínas progenitoras que proveem a base fundacional dos eHTPs da pre-sente invenção. As proteínas de toxina fundacionais ou de andaime de linha de base, tais como TIC807 (SEQ ID NO:2), Cry51Aa1 (SEQ ID NO:8), TIC853 (SEQ ID NO:184), e AXMI-171 (SEQ ID NO:206) não exibem a amplitude e o escopo da atividade anti-Hemiptera biológica ou o alcance de hospedagem das proteínas eHTP da presente invenção.

[0019] Mais de 2000 variantes diferentes de sequências de amino-ácidos derivadas de proteínas tóxicas de Hemiptera derivadas da es- pécie Bacillus thuringiensis foram testadas para identificar as inserções, substituições ou deleções de aminoácidos específicas descritas neste documento que conferem espectro inibidor expandido ao alcance de hospedagem da espécie Hemiptera e também proveem atividade inibidora dramaticamente aumentada da espécie Hemiptera comparada ao espectro e à atividade da proteína de andaime de linha de base, TIC807, TIC853 e Cry51Aa1. Resíduos de aminoácido são identifi-cados nas proteínas de andaime de linha de base que (a) podem ser modificadas para render um espectro inibidor de Hemiptera melhorado e/ou alcance de atividade inibidora de Lygus melhorada em relação a uma ou mais proteínas de andaime, (b) se acumulam em emplastros de superfície de uma proteína inibidora de inseto dobrada exibindo a estrutura de dobras de uma ou mais proteínas de andaime e/ou (c) ocorrem em posições específicas de uma ou mais das sequências de aminoácido das proteínas de andaime que resultam eficazes na redução da dose eficaz média de proteínas eHTP para controle de uma espécie Hemiptera e aumento da faixa de espécies Hemiptera que são afetadas pela proteína eHTP.

[0020] As espécies de praga Hemiptera são destinadas a significarinsetos que se alimentam de plantas e tecidos de plantas cortando ou rasgando a superfície externa da planta alvejada, e então consumindo exsudatos de planta macerada que se acumulam no local de corte ou rasgo sugando ou absorvendo os exsudatos acumulados. Tais insetos incluem adultos e crisálidas, incluindo, sem limitação, a seguinte listagem de insetos de plantas: a família Miridae, cigarras da Família Cica- didae, gafanhotos (por exemplo, Empoasca spp., Amrasca spp.) da Família Cicadellidae, pulgões da Família Fulgoroidea e Delphacidea, pulgões da Família dos Membracídeos, psilídeos da Família Psylidae, moscas brancas da família Aleyrodidae, afídeos da Família Aphididae, filoxera da Família Phylloxeridae, cochonilhas da Família Pseudococ- cidae, escalas da família Coccidae, Diaspididae e Margarodidae, percevejos da Família Tingidae, percevejos da Família Pentatomidae, percevejos (por exemplo, Blissus spp.) e outros insetos de sementes da Família Lygaeidae, cigarrinhas da família Cercopidae, pulgões da Família Coreidae e insetos vermelhos e pulgões de algodoeiro da Família Pyrrhocoridae. Outras pragas da ordem Hemiptera incluem Acrosternum hilare (percevejo verde), Anasa tristis, Blissus leucopte- rus leucopterus, Corythuca gossypii (percevejo do algodão), Cyrtopel- tis modesta(pulgão do tomate), Dysdercus suturellus(pulgão de algodoeiro),Euschistus servus (fedorento), Euschistus variolarious(fedorento pintado), Graptostethus spp. (complexo de percevejos), Lepto- glossus corculus (percevejo da semente do pinho), Lygus lineolaris (percevejo manchador), Lygus hesperus (percevejo manchador oci-dental),Maria viridulum (percevejo verde do sul), Oebalus pugnax (percevejo do arroz), Oncopeltus fasciatus (percevejo grande) e Pseu- datomoscelis seriatus(pulgão do algodoeiro). Mais especificamente, a família Cicadellidae inclui, sem se limitar à tribo Empoascini, e.g. Am- rasca biguttula, Amrasca devastans, Austroasca viridigrisea, Asymme- trasca decedens, Empoasca decipiens, Empoasca distinguenda, Em- poasca dolichi, Empoasca fabae, Empoasca kerri, Empoasca kraeme- ri, Empoasca onukii, Empoasca sakaii, Empoasca smithi, Empoasca vitis, Jacobiasca lybica, Sonasasca Solana, tribo Erythroneurini, por exemplo Empoasca nara nagpurensis, Thaiaassamensis, Zygnidia quyumi, tribo Nirvaniae, por exemplo Sophonia rufofascia, Família Del- phacidae, por exemplo Nilapoarvata lugens, Sogatella furcifera, Unka- nodes sapporonus, e Família Lophopidae, por exemplo Zophiuma lo- bulata.

[0021] eHTPs da presente invenção contêm uma ou mais modificações de sequência de aminoácido comparadas a uma ou mais das proteínas de andaime, incluindo substituições e deleções, de resíduos de aminoácido em setenta e duas (72) posições diferentes de aminoá- cido. Tais modificações proveem eHTPs com toxicidade aumentada e/ou espectro inibidor melhorado contra insetos Hemiptera quando comparadas a uma ou mais das proteínas de andaime que incluem mas não se limitam a TIC807 (SEQ ID NO:2) ou proteínas relacionadas tais como TIC807_M2 (SEQ ID NO:8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO:182) e TIC853 (SEQ ID NO:184). eHTPs incluem, sem se limitar a modificações de pelo menos uma substituição de aminoácido ou dele- ção de um aminoácido em qualquer uma dessas setenta e duas posições, descritas como "X" na sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:180, mas não incluem as sequências de aminoácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:182 ou SEQ ID NO:184. eHTPs da presente invenção exibem também espectro inibidor de Hemiptera melhorado e/ou atividade inibidora de Hemiptera melhorada quando comparadas ao espectro e à atividade das proteínas de linha de base ou andaime.

[0022] eHTPs incluem pelo menos uma modificação de aminoáci- do das posições relativas de TIC807 (SEQ ID NO:2) conforme estabelecido acima no parágrafo [0009]. eHTPs também podem incluir pelo menos duas, três ou mais dessas substituições e/ou deleções de ami- noácidos supramencionadas e também podem incluir pelo menos du- as, três, quatro ou mais dessas substituições e/ou deleções de amino- ácidos, bem como uma deleção de pelo menos três aminoácidos contíguos no interior dos resíduos 196-201 da SEQ ID NO:2. Conforme- NO:14, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:42, SEQ ID ID NO:20, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:171, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:204 e fragmentos inibidores de insetos das mes-mas.

[0023] eHTPs da presente invenção exibem qualquer sequênciade aminoácidos diferente de qualquer uma ou mais das proteínas de andaime, incluindo SEQ ID NO:2 (TIC807), em pelo menos uma posição de aminoácido em que o resíduo de aminoácido diferente ou (i) tem uma acessibilidade de solvente de aminoácido de pelo menos 15% a pelo menos 36% comparada às mesmas posições de resíduo em qualquer uma ou mais das proteínas de andaime; e/ou (ii) se localiza dentro de uma distância de pelo menos 3 resíduos de aminoácido consecutivos de um aminoácido possuidor de pelo menos cerca de 15% a cerca de 36% de acessibilidade de solvente relativa comparada às posições de aminoácido correspondentes na sequência primária de aminoácidos de uma ou mais das proteínas de andaime, e exibe espectro inibidor de Hemiptera expandido e/ou atividade inibidora de Hemiptera expandida quando compararas às atividades correlatas com uma ou mais das proteínas de andaime. As palavras "espectro expandido" querem significar, em referência a duas proteínas diferentes que exibem efeitos tóxicos a uma praga única em particular, que a proteína que exibe espectro expandido exibe efeitos tóxicos para aquela única praga em particular, bem como para uma ou mais de outras pragas dentro da mesma ordem filogenética ou para uma ou mais de outras pragas em uma ou mais ordens filogenéticas diferentes daquela ordem à qual a praga em particular pertence. As palavras "atividade inibidora de Hemiptera aumentada" querem significar que uma proteína em particular que exibe tal atividade aumentada requer, sob condições padronizadas, uma quantidade menor daquela proteína para alcançar um efeito em particular, tal como mortalidade, atrofiamen- to, morbidez, cessação ou alimentação, ou qualquer outro efeito feno- tipicamente mensurável sobre uma única praga em particular, do que uma proteína de controle.

[0024] eHTPs exibem uma sequência de aminoácido que difere dade uma ou mais das proteínas de andaime, incluindo, particularmente, TIC807, em pelo menos um resíduo de aminoácido localizado no interior de um ou mais emplastros de superfície de uma proteína inibidora de insetos dobrada (vide os dados da Figura 2 e da Tabela 3). Um emplastro de superfície é definido como includente dos resíduos de aminoácido abarcados no interior de uma esfera possuidores de um raio de átomo de cerca de 9,2 a cerca de 12,2 Angstroms (Figura 2, esfera [1]) relativos ao átomo de beta-carbono (Cb) de Ser95, conforme estabelecido na SEQ ID NO:2 quando aquela proteína é dobrada em uma estrutura tridimensional sob condições fisiológicas; o que inclui os resíduos Thr93, Ser95, Ser97, Phe147, Gin149, Ser151,Asn180, Thr182, Val251, Gln253 e Ser255. Conforme usada neste do-cumento, a frase "átomo de Cb" se refere ao átomo de beta-carbono na cadeia lateral de resíduo de aminoácido. O átomo de Cb é, portanto, o primeiro carbono na cadeia lateral de proteína que está presente em todos os resíduos de aminoácido, com exceção dos resíduos de Glicil. Em referência à Figura 1, eHTPs podem incluir, mas não se limitam a uma ou mais substituições conservantes ou não conservantes de emplastros de superfície de [1] resíduos de aminoácido T93, S95, S97, F147, Q149, S151, N180, T182, V251, Q253 e S255 ou os ami- noácidos equivalentes dentro de uma ou mais das proteínas de andaime, em particular SEQ ID NO:2 (TIC807). eHTPs podem incluir, mas não se limitam a uma ou mais substituições de emplastros de superfície de [1] resíduos de aminoácido tais como: T93A; S95A, S95V, S95L, ou S95I; F147T, F147C, F147D, F147G, F147E, F147Y, F147M, F147N, F147Q, F147H, F147R, F147W, F147P, F147A, F147V,F147L, ou F147I; Q149A, Q149C, Q149F, Q149E ou Q149D; S15 N18 T182A; V251E ou V251A e/ou Q253R. O outro ou segundo emplastro de superfície que foi identificado como resíduos de aminoácido que são receptivos a modificações que resultam eficazes na conferência de bioatividade inibidora de Hemiptera na forma de eHTPs da presente invenção é definido como includente dos resíduos de aminoácido abarcados no interior de uma esfera possuidora de um raio atômico de cerca de 9,2 a cerca de 12,2 Angstroms (Figura 2, esfera [2]) em relação ao átomo de beta-carbono de Pro219 ou à posição de aminoácido equivalente em uma ou mais das proteínas de andaime, particularmente conforme estabelecido na SEQ ID NO:2, quando qualquer das proteínas de andaime aplicáveis é dobrada em uma estrutura tridimensional sob condições fisiológicas, as quais incluem resíduos Val10, Ile14, Asn22, Asn23, Gly24, Ile25, Gln26, Gly27, Phe30, Gln38, Ile39, Asp40, Thr41, Ile43, Ser193, Thr194, Glu195, His196, Tyr197, Ser198,His199, Tyr200, Ser201, Gly202, Tyr203, Pro204, Ile205, Leu206, Thr207,Trp208, Ile209, Ser210, Tyr216, Ser217, Gly218, Pro219,Pro220,Met221, Ser222, Trp223, Tyr224, Phe225, Asn239 e Val244. Tais eHTPs podem incluir, mas não se limitam a uma ou mais substituições de resíduos conservantes ou não conservantes de aminoáci- dos e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos no interior da superfície de emplastro [2] incluindo Val10, Ile14, Asn22, Asn23, Gly24, Ile25, Gln26, Gly27, Phe30, Gln38, Ile39, Asp40,Thr41, Ile43, Ser193, Thr194, Glu195, His196, Tyr197, Ser198, His199, Tyr200, Ser201, Gly202, Tyr203, Pro204, Ile205, Leu206, Thr207,Trp208, Ile209,Ser210, Tyr216, Ser217, Gly218, Pro219, Pro220, Met221, Ser222, Trp223, Tyr224, Phe225, Asn239 e Val244, da SEQ ID NO:2 (TIC807). eHTPs podem incluir, mas não se limitam a uma ou mais substituições e/ou deleções com os resíduos de aminoácido localizados no interior do emplastro de superfície [2], tais como: uma deleção de quaisquer três resíduos de aminoácidos contíguos na sequência His196, Tyr197, Ser198, His199, Tyr200,Ser201; Ser217Asn, Ser217Gln, Ser217Arg; e/ou Pro219Arg, Pro219Asn, Pro219Gln. eHTPs podem incluir, mas não se limitam a uma ou mais substituições e/ou deleções de aminoá- cidos no interior do emplastro de superfície [2], tais como: uma dele- ção de quaisquer três resíduos HisTyrSer contíguos na sequência His196, Tyr197, Ser198, His199, Tyr200, Ser201; Ser217Asn,Ser217Gln, Ser217Arg; e/ou Pro219Arg, Pro219Asn, Pro219Gln. Um eHTP pode ter pelo menos uma modificação de aminoácido em cada um dos dois emplastros de superfície supramencionados da proteína inibidora de insetos dobrada. eHTP pode ter uma ou uma combinação de mais que uma modificação nos resíduos T93, S95, F147, Q149, S151, N180, T182, H196, Y197, S198,H199, Y200, S201, W208, S217, P219, W223, N239, V244 ou V251 em relação à SEQ ID NO:2 (TIC807). Mudanças conservadoras de aminoácido podem ser feitas substituindo-se um aminoácido do tipo acídico, básico, polar neutro ou não polar neutro por outro aminoácido do mesmo tipo. Mudanças não conservadoras de aminoácido podem ser feitas substituindo-se um aminoácido do tipo acídico, básico, polar neutro ou não polar neutro por outro aminoácido do mesmo tipo. Além disso, das proteínas eHTP listadas na Tabela 4B, todas as 267 são variantes de sequência de aminoácido que exibem toxicidade a Lygus spp. aumentada quando comparadas a uma ou mais das proteínas de andaime, incluindo a pro-teína de andaime TIC807. Apenas dez dessas sequências variantes de aminoácido exibem resíduos de aminoácido modificados em comparação a uma ou mais das proteínas de andaime que são posicionadas fora dos dois emplastros de superfície referenciados.

[0025] A técnica anterior ensina problemas de solubilidade associ- ados com as proteínas de andaime. eHTPs exibem solubilidade me-lhorada comparadas às proteínas de andaime, e exibem geralmente solubilidade aumentada a um pH de menos que 9.0, em contraste com o perfil de solubilidade de uma ou mais das proteínas de andaime. Esta solubilidade aumentada em pH mais fisiológico é evidente quando o eHTP é expresso em E.coli, em uma célula de planta, no citoplasma de uma célula de planta, no apoplasto de uma célula de planta ou em ou alvejada para importação ao plastídeo de uma célula de planta. Modificações de aminoácido que aumentam a solubilidade em relação a uma ou mais proteínas de emplastro, incluindo a SEQ ID NO:2 (TIC807) incluem, sem se limitar à substituição de um resíduo de ami- noácido de lisina e uma ou mais das seguintes posições de aminoáci- do em TIC807 ou o resíduo aplicável em qualquer uma das outras proteínas de andaime: 58, 59, 198, 199, 201 ou 202; ou substituição de um resíduo de aminoácido de ácido glutâmico em uma ou mais das posições de aminoácidos 198, 248 ou 301; ou substituição de um resíduo de aminoácido de arginina em uma ou mais posições de aminoá- cidos 246, 250 ou 253.

[0026] Composições inibidoras de insetos compreendendo aseHTPs descritas acima também são providas. Tais composições podem compreender ademais pelo menos um agente inibidor de insetos adicional do eHTP incluído na composição. O agente inibidor de insetos é escolhido de qualquer variedade de agentes inibidores de insetos, incluindo uma proteína inibidora de insetos, uma molécula de dsRNA inibidora de insetos e um ou mais agentes químicos úteis no controle de pragas de insetos. Exemplos de agentes inibidores adicionais incluem, mas não se limitam a proteína TIC1415, um dsRNA dirigido para ortólogos Hemiptera de Nilaparvata lugens V-ATPase-E, 21E01, um dSRNA dirigido para ortólogos de Hemiptera de ortólogo de actina, ADP/ATP translocase, α-tubulina, proteína ribossômica L9 (RPL9) ou subunidade V-ATPase A, AXMI-171 (US20100298207A1), Cry3A, Cry4Aa, Cry11Aa, e Cyt1Aa, DIG11, DIG5, Cry7,eCry3,1Ab, mCry3A, Cry8, Cry34/Cry35, Cry3, DIG2, Cry1, Cry1A,105, Cry2, Cry1F, VIP3, 5307 e Cry9. Agentes químicos úteis no controle de espécies Hemiptera incluem, mas não se limitam a piretrinas e piretroi- des sintéticos; derivados de oxadizina; cloronicotinilas; derivados de nitroguanidina; triazolas; organofosfatos; pirróis; pirazóis; fenil pirazóis; diacilhidrazinas; produtos de fermentação biológica; e carbamatos. Pesticidas conhecidos dentro dessas categorias são listados em The Pesticide Manual, 11th Ed., C. D. S. Tomlin, Ed., British Crop Protection Council,Farnham, Surry, UK (1997).

[0027] Piretroides que são úteis na presente composição incluempiretrinas e piretroides sintéticos. As piretrinas que são preferenciais para uso no presente método incluem, sem limitação, 2-alquil-4- hidróxi-3-metil-2-ciclopenten-1-ona éster de ácido 2,2-dimetil-3-(2metil propenil)-ciclopropano carboxílico, e/ou (2-metil-1-propenil)-2-metóxi-4- oxo-3-(2 propenil)-2-ciclopenten-1-il éster e misturas de isômeros cis e trans dos mesmos (Chemical Abstracts Service Registry Number - Número de Registro do Serviço de Resumos Químicos ("CAS RN") 8003-34-7).

[0028] Piretroides sintéticos preferenciais para a utilização na presente invenção incluem (s)-ciano (3-fenoxifenil)metil-4-cloro alfa (L- metiletil)benzenoacetato (fenvalerato, CAS RN 51630-58-1), (S)-ciano (3- fenoxifenil) metil (S)-4-cloro-alfa (1-metiletil) benzenoacetato esfenvalera- to, CAS RN 66230-04-4), (+) cis-trans-3 (2,2-dicloroetenil)-2,2- dimetilciclopropanocarboxilato de (3-fenoxifenil) metila (permetrina, CAS RN 52645-53-1), (±)-alfa-ciano (3-fenoxifenil)metil(+)-cis, trans-3-(2 , 2- dicloroetenil) -2,2-dimetil-ciclopropano carboxilato de metila (cipermetrina, CAS RN 52315-07-8), (beta-cipermetrina, CAS RN 65731-84-2), (teta cipermetrina, CAS RN 71697-59- 1), s-ciano (3-fenoxifenil) metil (±) cis / 3 (2,2-dicloroetenil) 2,2 dimetilciclopropano carboxilato de trans(zeta- cipermetrina, CAS RN 52315-07-8), (s)-alfa-ciano-3-fenoxibenzil (IR, 3R)- 3 (2,2-dibromovinil)-2,2-dimetil-ciclopropanocarboxilato(deltametrina,CAS RN 52918-63-5), alfa-ciano-3-fenoxibenzil 2, 2,3,3,-tetrametil ciclo- propanocarboxilato (fenpropatrina, CAS RN 64257-84-7), (RS)-alfa-ciano- 3-fenoxibenzil (R) -2 [2-cloro-4-(trifluorometil) anilino] -3-metilbutanoato (tau-fluvalinato, CAS RN 102851-06-9), (2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilfenil)- metil-(1 alfa, 3 alfa)-(Z)-(± )-3 (2-cloro-3,3,3-trifluoro-1-propenil)-2,2-dimetilciclopropanocarboxilato (teflutrina, CAS RN 79538-32-2), (±)-ciano (3-fenoxifenil) metil (±)-4(difluorometoxi)-alfa-(1-metil-etil) benzenoacetato de (flucitrinato, CAS RN 70124-77-5), ciano (4-fluoro-3-fenoxifenil) metil 3 [2-cloro-2 - (4-clorofenil) etenil]-2,2-dimetilciclopropano (flumetrina, CAS RN 69770-45-2), ciano (4-fluoro-3-fenoxifenil) metil 3(2,2-dicloroetenil)- 2,2-dimetil-ciclopropanocarboxilato (ciflutrina, CAS RN 68359-37-5), (beta ciflutrina, CAS RN 68359-37-5), (transflutrina, CAS RN 118712-89-3), (S)- alfa-ciano-3-fenoxibenzil(Z)-(IR-cis)-2,2-dimetil-3-[2-(2,2,2-trifluoro- triflorometil-etoxicarbonil)vinil]ciclopropano carboxilato (acrinatrina, CAS RN 101007-06-1), par de isômeros enantiômeros (IR cis) S e (IS cis) R de alfa-ciano-3-fenoxibenzil-3-(2,2diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropano (al- fa-cipermetrina, CAS RN 67375-30-8), [IR, 3S) 3 (1'RS) (1',2',2',2'-tetrabromoetil)]-ciclopropano carboxílico 2,2-dimetil (s)-alfa-ciano-3- fenoxibenzil éster(tralometrina, CAS RN 66841-25-6), ciano(3-fenoxifenil)metil 2,2-dicloro-1(4-etoxifenil)ciclopropano (cicloprotrina, CAS RN 63935-38-6), [1α,3α(Z)]-(±)-ciano (3-fenoxifenil) metil 3 (2-cloro-3,3,3-trifloro 1-propenil)-2,2-cimetilciclopropanocarboxilato (cialotrina,CAS RN 68085-85-8), [1 alfa (s), 3 alfa (Z)]-ciano (3-fenoxifenil) metil-3- (2-cloro -3,3,3-trifluoro-1-propenil) -2,2-dimetilciclopropanocarboxilato (lambda ci-halotrina, CAS RN 91465-08-6), (2-metil [1,1 '-bifenil] -3-il) me- til 3 (2-cloro-3,3,3-trifluoro-1-propenil) -2,2-dimetil-ciclopropanocarboxilato de (bifentrina, CAS RN 82657-04-3), 5-1-benzil-3-furilmetil-d-cis (1R, 3S, E) 2,2-dimetil-3-(2-oxo, -2,2,4,5 tetra tiofenilidenometil) ciclopropano car- boxilato (cadetrina, RU15525, CAS RN 58769-20-3), [5 (metil-fenil) -3- furanil] -3-furanil 2,2-dimetil-3-(2-metil-1-propenil) ciclopropano (resmetri- na, CAS RN 10453-86-8), (1R trans) - [5 (fenilmetil)-3-furanil] metil 2,2- dimetil-3-(2-metil-1-propenil) ciclopropanocarboxilato de (bioresmetrina, CAS RN 28434-01-7), 3,4,5 , 6-tetra-hidro-ftalimidometil-(IRS)-cis-trans- crisantemato (tetrametrina, CAS RN 7696-12-0), 3-fenoxibenzil-d, L-cis, trans 2,2-dimetil-3-(2 -metilpropenil) ciclopropanocarboxilato (fenotrina, CAS RN 26002-80-2); (empentrina, CAS RN 54406-48-3); (cifenotrina; CAS RN 39515-40-7), (praletrina, CAS RN 23031-36-9), (imiprotrina, CAS RN 72963-72-5), (RS) -3-alil-2-metil-4 oxiciclopent-2-enil- (1A, 3R; 1R, 3S) -2,2-dimetil-3-(2-metil-prop-1-enil) ciclopropanocarboxilato (aletri- na, CAS RN 584-79-2), (bioaletrina, CAS RN 584-79-2) e (ZXI8901, CAS RN 160791-64-0). Acredita-se que misturas de um ou mais dos piretroi- des sintéticos supramencionados também podem ser usadas na presente invenção. Piretroides sintéticos particularmente preferenciais são teflu- trina, lambda cihalotrina, bifentrina, permetrina e ciflutrina. Piretroides sintéticos ainda mais preferenciais são teflutrina e lambda cihalotrina, e ainda mais preferencial é teflutrina.

[0029] Inseticidas que são derivados de oxadiazina são úteis nainvenção do objeto. Os derivados de oxadizina que são preferenciais para uso na presente invenção são aqueles identificados da Patente US No. 5,852,012. Mais derivados de oxadiazina preferenciais são 5- (2-cloropirid-5-ilmetil)-3-metil-4-nitroiminoperhidro-1,3,5-oxadiazina, 5-(2-clorotiazol-5-ilmetil)-3-metil-4-nitroiminoperhidro-1,3,5-oxadiazina, 3- metil-4-nitroimino-5-(1-oxido-3-piridinometil) perhidro-1,3,5-oxidiazina,5-(2-cloro-1-óxido-5-piridiniometil)-3-metil-4-nitroiminoperhidro-1,3,5- oxidiazina; e 3-metil-5-(2-metilpirid-5-ilmetil)-4-nitroiminoperhidro-1,3,5- oxadiazina. Ainda mais preferencial é tiametoxama (CAS RN 15371923-4).

[0030] Inseticidas de Cloronicotinil também são úteis no objeto dainvenção. Cloronicotinilas preferenciais para uso na composição que se tem por objeto são descritos na Patente US No. 5,952,358 e incluem ace- tamiprida ((E)-N-[(6-cloro-3-piridinil)metil]-N'-ciano-N-metilenoimidamida, CAS RN 135410-20-7), imidacloprida (1-[(6-cloro-3-piridinil)metol]-N-nitro- 2-imidazolidinimima, CAS RN 138261-41-3) e nitenpiram (N-[(6-cloro-3- piridinil)metil]-N-etil-N'-metil-2-nitro-1,1-etenodiamina, CAS RN120738- 89-8).

[0031] Inseticidas Nitroguanidina são úteis na presente invenção.Tais nitroguanidinas podem incluir aquelas descritas nas Patentes US Nos. 5,633,375, 5,034,404 e 5,245,040.

[0032] Pirróis, pirazóis e fenil pirazóis úteis na presente invençãoincluem aqueles descritos na Patente US No. 5,952,358. Pirazóis pre-ferenciais incluem clorofenapir (4-bromo-2-(4-clorofenil)-1-etoximetil-5- triflorometilpirrol-3-carbonitrila, CAS RN 122453-73-0), fenpiroximato ((E)-1,1-dimetiletil-4[[[[(1,3-dimetil-5-fenóxi-1H-pirazol-4-il)metileno]ami no]oxi]metil]benzoato, CAS RN 111812-58-9) e tebufenpirade (4-cloro- N[[4-1,1-dimetiletil)fenil]metil]-3-etil-1-metil-1H-pirazol-5-carboxamida, CAS RN 119168-77-3). Um fenil pirazol preferencial é o fipronil (5- amino-[2,6-dicloro-4-(triflorometil)fenil]-4-[1R,S)-triflorometil)sulfinil]-1H- pirazol-3-carbonitrilo, CAS RN 120068-37-3).

[0033] Diacilhidrazinas úteis na presente invenção incluem halofe-nozida (4-clorobenzoato-2-benzoil-2-(1,1-dimetiletil)-hidrazida, CASRN 112226-61-6), metoxifenozida (RH-2485; N-terc-butil-N'-(3-metóxi-o- toluoil)-3,5-xilohidrazida, CAS RN 161050-58-4) e tebufenozida(3,5- ácido dimetilbenzoico 1-(1,1-dimetiletil)-2,(4-etilbenzoil)hidrazida, CAS RN 112410-23-8).

[0034] Triazóis, tais como o amitrol (CAS RN 61-82-5) e o triazamato são úteis no método da presente invenção. Um triazol preferencialé o triazamato (etil [[1-[(dimetilamino)carbonil]-3-(1,1-dimetiletil)- 1H-1,2,4-triazol-5-il]tio]acetato, CAS RN 112143-82-5).

[0035] Produtos biológicos/de fermentação, tais como avermectina(abamectina, CAS RN 71751-41-2) e spinosad (XDE-105, CAS RN 131929-60-7) são úteis na presente invenção.

[0036] Inseticidas de organofosfato também são úteis como umdos componentes da presente invenção. Inseticidas de organofosfato preferenciais incluem acefato (CAS RN 30560-19-1), clorpirifós (CAS RN 2921-88-2), clorpirifós-metil (CAS RN 5598-13-0), diazinona (CAS RN 333-41-5), fenamifos (CAS RN 22224-92-6) e malationa (CAS RN 121-75-5).

[0037] Adicionalmente, inseticidas de carbamato são úteis no objeto da invenção. Os inseticidas preferenciais de carbamato são aldicarb (CAS RN 116-06-3), carbaril (CAS RN 63-25-2), carbofurano (CAS RN 1563-66-2), oxamil (CAS RN 23135-22-0) e tiodicarb (CAS RN 5966926-0).

[0038] Quando um inseticida químico é descrito neste documento,deve-se entender que a descrição se destina a incluir formas de sal do inseticida, bem como qualquer forma isomérica e/ou tautométrica de inseticida que exiba a mesma atividade de inseticida que a forma do inseticida que é descrita.

[0039] Os inseticidas químicos que são úteis na presente invençãopodem ser de qualquer grau de pureza que passe no ofício como tal in-seticida. Outros materiais que acompanham os inseticidas em prepara-ções comerciais como impurezas podem ser tolerados na invenção e na composição do objeto, contanto que outros tais materiais não desestabi- lizem a composição ou reduzam significativamente ou destruam a ativi-dade de qualquer um dos componentes do inseticida ou o evento trans- gênico contra as pragas alvejadas. Alguém ordinariamente versado na técnica de produção de inseticidas poderá identificar prontamente aque-las impurezas que podem ser toleradas e aquelas que não podem.

[0040] eHTPs são relacionadas por modificações de aminoácidode modo que as proteínas modificadas exibam espectro inibidor de Hemiptera melhorado e/ou atividade inibidora de Hemiptera melhorada contra Lygus spp., Empoasca spp. e/ou Amrasca spp. comparadas à proteína parental, TIC807. As frases "mais ativo", "atividade melhora-da","especificidade aumentada", potência tóxica aumentada", "toxicidade aumentada", "atividade inibidora de Hemiptera melhorada", 'atividade inibidora de Hemiptera aumentada", "atividade inibidora de Lygus, Empoasca e/ou Amrasca", "maior atividade inibidora de Lygus, Empoasca e/ou Amrasca", "maior atividade inibidora de Hemiptera" e "espectro inibidor de Hemiptera aumentado" referem-se a uma comparação da atividade de uma eHTP e da atividade de uma proteína TIC807 (SEQ ID NO:2), TIC807_M2 (SEQ ID NO:8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO:182), TIC853 (SEQ ID NO:184), e/ou uma AXMI-171(SEQ ID NO:206) contra um inseto Hemiptera, em que a atividade atribuída pela eHTP da presente invenção é maior que a atividade atribuída à proteína TIC807 (SEQ ID NO:2), TIC807_M2 (SEQ ID NO:8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO:182), TIC853 (SEQ ID NO:184 e/ou uma proteína AXMI- 171 (SEQ ID NO:206). ehTPs providas neste documento exibem espectro inibidor de Hemiptera melhorado e/ou atividade inibidora de Hemiptera aumentada ou maior quando comparadas às proteínas do Bacillus thuringiensis de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:182 e SEQ ID NO:184, em que a espécie de praga Hemiptera inclui Lygus hesperus, Lygus lineolaris, Empoasca fabae e Amrasca devastans. Amrasca devastanstambém é chamada Amrasca biguttula biguttula. eHTPs exibindo espectro inibidor de insetos aumentado e/ou atividade inibidora de insetos aumentada comparadas a TIC807 podem ser identificadas por diversos métodos diferentes. Em geral, métodos exemplaresnão limitadores para identificação das proteínas eHTP podem compreender: (1) administrar quantidades idênticas de uma eHTP de teste e de proteína TIC807 de controle (SEQ ID NO:2), TIC807_M2 (SEQ ID NO:8), Cry51Aa1 (SEQ IDNO:182), TIC853 (SEQ ID NO:184) e/ou uma proteína AXMI-171 (SEQ ID NO:206) para um inseto de teste sob condições de ensaio controlado; e medir e comparar a potência do teste e a das proteínas de controle; e/ou(2) Determinar as doses de proteína (por exemplo, a con-centração da proteína em dieta) de uma eHTP de teste e de uma proteína de controle TIC807 (SEQ-ID NO:2), TIC807_M2 (SEQ IDNO:8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO:182), TIC853 (SEQ ID NO:184) e/ou uma proteína AXMI-171 (SEQ ID NO:206) que provocam respostas de população de insetos equivalentes sob condições de ensaio controladas (isto é, obtendo-se uma curva de resposta à dosagem).

[0041] Na segunda abordagem, um valor de resposta à dosagemestatisticamente robusto usado para comparação seria uma concentração letal mediana (LC50) necessária para matar 50% de uma população de teste. Entretanto, em determinadas modalidades, outros valores, incluindo, mas não limitados a uma concentração inibidora média ("IC50") necessária para resultar em 50% de inibição de crescimento de uma população de teste podem ser utilizados. Neste contexto, "inibição do crescimento" pode compreender o atrofiamento e/ou a inibição do desenvolvimento de Hemiptera.

[0042] Conforme usado neste documento, a frase "uma quantidade inibidora de inseto" refere-se a uma quantidade de uma composição contendo um agente que é eficaz em alcançar qualquer inibição mensurável de viabilidade, crescimento, desenvolvimento, comporta-mento de alimentação, de acasalamento e/ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados pelo alimentação do inseto de uma composição contendo o agente. Semelhantemente, uma "quantidade inibidora de Hemiptera" refere-se a uma quantidade de uma proteína da presente invenção sozinha ou com outros agentes alvejando a espécie de Hemiptera aplicável para controle que resulte em qualquer inibição mensurável de insetos alvejados pertencentes á ordem Hemiptera relacionada a viabilidade, crescimento, desenvolvi-mento,reprodução, comportamento de alimentação, de acasalamento e ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados pelos insetos Hemiptera que se alimentam de uma planta. Do mesmo modo, "quantidade inibidora de Lygus, Empoasca e/ou Amrasca"refere-se a uma quantidade de uma composição que contenha uma ou mais proteínas da presente invenção, isto é, eHTPs, ou outro agente que resulte em qualquer inibição mensurável, viabilidade, crescimento, desenvolvimento, reprodução, comportamento de alimentação, de acasalamento e/ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados por Lygus, Empoasca e/ou Amrasca que se alimentam de uma composição contendo aquela eHTP. Conforme usado neste documento, no contexto de uma eHTP, uma "atividade inibidora de Hemiptera aumentada" ou "atividade inibidora de Hemiptera ainda maior" refere-se a qualquer aumento mensurável na inibição da viabilidade, do crescimento, do desenvolvimento, da reprodução, do comportamento de alimentação, do comportamento de acasalamento e/ou de qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados pela alimentação de Hemiptera de uma composição contendo aquela eHTP relativa à atividade inibidora correspondente observada com qualquer uma ou mais das proteínas de andaime, incluindo as proteínas TIC807, Cry51Aa1(SEQ ID NO:182), TIC853(SEQ ID NO:184), e/ou proteínas AXMI-171 (SEQ ID NO:206). Da mesma forma, "atividade inibidora aumentada de Lygus, Empoasca e/ou Amrasca" ou "maior atividade de Lygus, Empoasca e/ou Amrasca" refere-se a qualquer aumento mensurável na inibição, viabilidade, no crescimento, desenvolvimento, na reprodução, no comportamento de alimentação, no comportamento de acasalamento e/ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados pela presença de uma ou mais eHTPs da presente invenção em uma composição ou planta providas na dieta de Lygus, Empoasca e/ou Amrasca em relação à atividade inibidora correspondente observada com uma composição equivalente ou planta contendo apenas uma quantidade aplicável de uma ou mais das proteínas de andaime, incluindo, mas não limitado a proteínas TIC807 (SEQ ID NO:2),Cry51Aa1(SEQ ID NO:182), TIC853 (SEQ ID NO:184) e/ou proteínas AXMI-171 (SEQ ID NO:206).

[0043] Conforme usado neste documento no contexto de umaeHTP, um "espectro inibidor de Hemiptera aumentado" refere-se a qualquer aumento mensurável na inibição da viabilidade, do crescimento, desenvolvimento, da reprodução, do comportamento de alimentação, comportamento de de acasalamento e/ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados por um Lygus spp., Empoasca spp. e/ou Amrasca spp. que se alimenta de uma planta em relação à inibição correspondente daquele Lygus spp., Empoasca spp. e/ou Amrasca spp.específico observado com a proteína TIC807. Em determinadas modalidades, a eHTP provida neste documento exibe um espectro inibidor de Lygus melhorado em relação a TIC807 em que aqueles eHTPs podem prover inibição aumentada de Lygus lineolaris.

[0044] Uma eHTP provida neste documento pode exibir de cercade 2 a cerca de 260 vezes mais atividade inibidora de Lygus, Empoas- ca e/ou Amrasca contra uma espécie de praga Lygus, Empoasca e/ou Amrasca do que uma proteína de SEQ ID NO:2 (TIC807), SEQ ID NO:8 (TIC807_M2), SEQ ID NO:182(Cry51Aa1), SEQ ID NO:184 (TIC853) e SEQ ID NO:206 (AXMI-171). Uma eHTP provida neste documento pode exibir de cerca de 3 a 4, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 27, 30, 38, 46, 50, 52, 54, 66, 91, 122, 186, 243 ou 262 vezes mais atividade inibidora de Lygus, Empoasca e/ou Amrasca contra uma espécie de praga Lygus, Empoasca e/ou Amrasca do que uma proteína de SEQ ID NO:2 (TIC807), SEQ ID NO:8 (TIC807_M2), SEQ ID NO:182(Cry51Aa1), SEQ ID NO:184 (TIC853) e SEQ ID NO:206 (AX- MI-171).

[0045] eHTPs podem exibir um espectro inibidor de praga alvejadae/ou atividade inibidora de praga alvejada em relação a SEQ ID NO:2 (TIC807), SEQ ID NO:8 (TIC807_M2), SEQ ID NO:182(Cry51Aa1), SEQ ID NO:184 (TIC853) e/ou SEQ ID NO:206 (AXMI-171), causando mortalidade:(i) a uma dose de cerca de 0,3 μg/mL a cerca de 70 μg/mL contra uma espécie de inseto Lygus hesperus,(ii) a uma dose de cerca de 0,85 μg/mL a cerca de 100 μg/mL contra uma espécie de inseto Lygus lineolaris,(iii) medindo a um valor LC50 de cerca de 0,3 μg/mL a cerca de 70 μg/mL contra uma espécie deinseto Lygus hesperus,(iv) medindo a um valor LC50 de cerca de 0,85 μg/mL a cerca de 100 μg/mL contra uma espécie de inseto Lygus lineolaris,(v) medindo a um valor LC50 de mais que duas vezes mais baixo do que o valor LC50 de TIC807, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:182 (Cry51Aa1), SEQ IDNO:184 (TIC853) e/ou uma SEQ ID NO:206 (AX- MI-171) contra Lygus spp, Emrasca spp. e/ou Amrasca spp., ou(vi) a uma dose de cerca de 0,69 μg/mL a cerca de 500 μ/mL contra uma espécie de inseto Amrasca devastans ou Empoasca fabae, ou(vii) medindo a um valor LC50 de cerca de 3,5 a cerca de 15 μg/mL contra Amrasca devastans e/ou Empoasca fabae.

[0046] As tabelas 4A e 4B tabulam as eHTPs exemplares da presente invenção com dados de mortalidade de Amrasca e Lygus spp. Dados da mortalidade disponíveis para Lygus spp. e Amrasca spp.são relatados ou como (a) um valor de μg/mL LC50, ou como (b) uma % de mortalidade a doses de cerca de 1 a cerca de 3 μg/mL para L. hes-perus ou cerca de 100 μg/mL de proteína para L. lineolaris, e cerca de 0,69 a cerca de 500 μg/mL para Amrasca devastans. A dobragem au-mentou a toxicidade comparado a TIC807 (SEQ ID NO:2) e TIC807_M2 (SEQ ID NO:8) providos para eHTPs exemplares, em que valores de LC50 são determinados.

[0047] As eHTPs da presente invenção são particularmente úteisno controle de insetos da ordem Hemiptera comparadas às proteínas de andaime. Lygus lineolaris necessitou de altas doses de proteína TIC807 (por exemplo, excedente a 100 μg/mL) para provocar mortalidade. A curva de resposta à dosagem para uma eHTP da presente invenção TIC807_M8 (SEQ ID NO:16), uma eHTP que exibe efeitos tóxicos notoriamente melhorados tanto contra L. lineolaris quanto contra L. hesperus, mas contra L. lineolaris a eHTP exibe um valor de LC50 calculado em 223 μg/ml. Não foi possível, anteriormente, alcançar uma dosagem tóxica de concentração da proteína de possa provocar mais que 50% de mortalidade contra espécies L. lineolaris, porque prover dosagens significativamente grandes de proteínas TIC807 e TIC807_M2 excedentes a 1000 μg/mL na dieta não foi possível. Consequentemente, valores LC50 contra L. lineolaris para proteínas TIC807 e TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8) não foram determinados, mas antes estimados como maiores que (>) 223 μg/mL (Vide Tabelas 1 e 3, Exemplo 4, e Figura 1B).

[0048] Projeto iterativo refere-se a uma abordagem semi-aleatóriapara o desenvolvimento e a escolha de eHTPs, incluindo uma combi-nação de manipulação, testagem e escolha (não necessariamente nessa ordem) (vide Exemplos 1 a 4). A palavra "manipulação"destina- se a incluir a identificação de resíduos relevantes para modificar, clo- nar e expressar as eHTPs descritas neste documento. A palavra "testagem"é destinada a se referir à comparação de atividade de Hemip- tera de uma eHTP à atividade de uma proteína de andaime tal qual TIC807 (SEQID NO:2), TIC807_M2 (SEQ ID NO:8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO:182) e/ou TIC853 (SEQ ID NO:184); ou comparar uma eHTP da presente invenção contra outra proteína, tal qual AXMI-171 (SEQ ID NO:206). A palavra "escolha"é destinada a se referir ao ato de identificar variantes de proteínas de planta melhoradas da presente invenção, isto é, eHTPs, e os resíduos de aminoácido aplicáveis para "manipulação".

[0049] Projeto iterativo inclui a elucidação da estrutura atômica deproteínas da presente invenção (por exemplo, conforme estabelecido na Figura 2) e o uso da estrutura atômica para guiar e complementar abordagens semi-aleatórias de "escolha" de resíduos de aminoácido para modificar para "manipulação", e, nesse caso, incluiu a identificação de resíduos de aminoácido em laços e em regiões de superfície exposta de uma proteína de andaime inibidora de atividade de inseto dobrada, tal como TIC807, TIC853 e Cry51Aa1, que pode ser modificada para conferir melhorias ao espectro e à atividade inibidora de insetos. Tais resíduos de aminoácido em laços e em regiões de superfície exposta são escolhidos para "manipulação". Neste caso, projeto iterativo incluiu a identificação de duas regiões diferentes no interior da estrutura tridimensional da proteína de andaime que abriga uma acumulação de resíduos de aminoácido relevantes que, quando modificados para conter resíduos de aminoácido além daqueles que aparecem naquelas posições na proteína de andaime naturalmente ocorrente, resultam em uma ou mais das proteínas eHTP da presente invenção.

[0050] Inicialmente, a proteína de andaime TIC807 (SEQ ID NO: 2)usada neste processo de projeto iterativo, bem como 267 eHTPs dife-rentes exibindo atividade inibidora de Lygus spp. aumentada compa-radasà proteína de andaime TIC807 foram descobertas. TIC807_M8 (SEQ ID NO:16) foi descoberta em estágios iniciais do processo do projeto. Estágios subsequentes de manipulação-testagem-escolha ite-rativa levaram à descoberta de outras proteínas eHTP que exibiram níveis de toxicidade contra espécies Lygus ainda maiores e também exibiram um alcance de hospedagem de efeitos tóxicos mais amplo comparadas à proteína de andaime. Sete variantes (eHTPs) exibiram níveis de toxicidade significativamente aumentados tanto contra am-basespécies Lygus (L. hesperus e L. lineolaris) quando comparadas a TIC807. Valores LC50 para estas sete, bem como outras eHTPs cons-truídas neste documento foram determinadas contra espécies Lygus hesperus e Lygus lineolaris e comparadas a valores LC50 para proteínas de andaime, particularmente TIC807. Os resultados são mostrados na Tabela 1, e a Figura 3 é um gráfico de barras que mostra graficamente os resultados observados como tabulados na Tabela 1.Tabela 1. Valores LC50 de eHTPs escolhidas comparados a TIC807

ND = Não Determinado. Valores LC50 são determinados apresentando-se 810 concentrações de proteínas diferentes a uma população de crisálidas de Lygus recentemente eclodidas, possibilitando às crisálidas alimentarem-se por 5 dias e então medindo-se a mortalidade sobre o alcance da dosagem provido.* Toxicidade, mostrada em termos de uma multiplicidade de atividade au-mentada comparada ao nível observado contra Lygus hesperus usando-se os o LD50 observado para TIC807 como o valor de linha de base para 1. Quantidades significativamente grandes de proteína excedentes a 1000 μg/mL não foram possíveis de se prover à dieta de Lygus a fim de se completar o alto alcance de resposta da dosagem de toxicidade a Lygus lineola- ris. Consequentemente, um valor LC50 não foi determinado para TIC807 ou TIC807_M2. Em vez disso, uma estimativa de 4 dosagens de LC50 em baixo alcance foi executada, verificando-se que os valores esperados de LC50 para TIC807 e TIC807_M2 são maiores que 223 μg/ml.

[0051] Em referência à Tabela 1, o processo de projeto iterativoproveu um meio para identificar proteínas que exibem propriedades tóxicas melhoradas, não apenas para Lygus hesperus, mas também para Lygus lineolaris.

[0052] Composições de polinucleotídeos recombinantes que codificam eHTPs também são providas. Em determinadas modalidades, eHTPs podem ser expressas com construtos de DNA recombinante em que uma molécula de polinucleotídeo com a estrutura de leitura aberta codificando a proteína é operavelmente ligada a elementos tais como um promovedor e qualquer outro elemento regulatório funcional para expressão no sistema para o qual o construto é destinado. Por exemplo, promovedores funcionais em plantas podem ser operavel- mente ligados a uma sequência codificadora de eHTP aplicável para possibilitar a expressão da proteína em plantas. Promovedores funcionais em bactérias também são contemplados para uso em cassetes de expressão. Promovedores funcionais em uma bactéria aplicável, por exemplo, em uma espécie E.coli ou Bacillus thuringiensis, podem ser operavelmente ligados às sequências codificadoras de eHTP para ex-pressão da proteína aplicável na cepa bacteriana aplicável. Outros elementos úteis que podem ser operavelmente ligados às sequências de codificação incluem, mas não se limitam a incrementadores, in- trões, líderes, marcadores de imobilização de proteína codificada (HIS- tag), peptídeos de translocação subcelular codificados (isto é, peptí- deos de trânsito de plastídeos, peptídeos de sinal), locais de peptídeos codificados para enzimas modificadoras pós-translacionais, locais de vinculação ribossômica e segmentos designados para uso como gatilhos RNAi para supressão de um ou mais genes, seja em plantas, seja em uma espécie de praga alvejada em particular.

[0053] Moléculas exemplares de polipeptídeos recombinantes providas neste documento incluem, mas não se limitam a SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:201. Essas sequências codificam as proteínas respectivas, cada uma possuidora de uma sequência de aminoácido conforme estabelecido em SEQ ID NO:4 (TIC807_4), SEQ ID NO:6 (TIC807_M1), SEQ ID NO:8 (TIC807_M2), SEQ ID NO:10 (TIC807_M3), SEQ ID NO:12 (TIC807_M4), SEQ ID NO:14 (TIC807_M5), SEQ ID NO:16 (TIC807_M8), SEQ ID NO:18 (TIC807_M6), SEQ ID NO:20 (TIC807_M7), SEQ ID NO:22 (TIC807_22), SEQ ID NO:24 (TIC807_24), SEQ ID NO:26 (TIC807_26), SEQ ID NO:28 (TIC807_M9), SEQ ID NO:30 (TIC807_M10), SEQ ID NO:32 (TIC807_M11), SEQ ID NO:36 (TIC807_M12) e SEQ ID NO:34 (TIC807_M13). Por causa da redundância do código genético, os có- dons de uma molécula de polipeptídeo recombinante codificadores de proteínas da presente invenção podem ser substituídos por códons sinônimos (também chamado uma substituição silenciosa); e estão dentro do escopo da presente invenção. Polinucleotídeos recombinan- tes que codificam qualquer uma das eHTPs divulgadas neste documentosão assim providos.

[0054] Um construto recombinante de DNA que compreende sequências de codificação eHTP podem compreender também uma região de DNA que codifica um ou mais agentes inibidores de insetos que podem ser configurados para serem co-expressos junto a uma sequência de DNA que codifique um eHTP aplicável, uma proteína diferente de uma eHTP ou uma molécula de dsRNA inibidora de gene de inseto ou planta. Um construto de DNA recombinante pode ser montado de modo que todos os agentes projetados para serem expressos a partir de um construto em particular sejam expressos a partir de um promovedor ou de modo que agentes separados estejam cada um sob controle de promovedor separado ou uma combinação dos mesmos. As proteínas desta invenção podem ser expressas a partir de um sistema de expressão multigenética em que uma ou mais proteínassão expressas a partir de um segmento de nucleotídeos comum em que também são contidos outras estruturas e/ou outros promovedores de leitura aberta, dependendo do tipo de sistema de expressão escolhido.

[0055] Polinucleotídeo recombinante ou construto de DNA recom-binante compreendendo uma sequência de codificação de eHTP pode ser entregue a células hospedeiras a partir de vetores, por exemplo, um plasmídeo, baculovírus, cromossomo artificial, cosmídeo, fagemí- deo, fago ou vetor viral. Tais vetores podem ser usados para alcançar expressão estável ou transitória de uma sequência codificadora de eHTP em uma célula hospedeira; e, se for este o caso, subsequente expressão para polipeptídeo. Um polinucleotídeo recombinante exógeno ou construto de DNA recombinante que compreende uma sequência de codificação de eHTP e que é introduzido em uma célula hospedeira também é referido, neste documento, como um "transgene".

[0056] Proveem-se também, por meio deste documento, bactérias,células de plantas transgênicas, plantas transgênicas e partes de plantas transgênicas que contenham, qualquer uma, um polinucleotídeo recombinante (isto é, transgene) que expresse qualquer uma ou mais sequências codificadoras de eHTP. Pretende-se que "célula bacteria- na" ou "bactéria"possam incluir, sem se limitar, a uma célula de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonela, Pseudomonas ou Rhizobium. Pretende-se que "célula de planta" ou "planta" inclua uma alfafa, amêndoa, banana, cevada, feijão, beterraba, brócolis, repolho, brassica, berinjela, cenoura, mandioca, rícino, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, aipo, citros, coco, café, milho, trevo, algodão, cu- curbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, guar, lúpulo, alho-poró, leguminosas, alface, Pinus taeda, painço, melões, nectarina, noz, aveia, quiabo, azeite, cebola, ornamental, pal-meira, grama de pasto, mamão papaia, ervilha, pêssego, amendoim, pimenta, Guandu, pinho, batata, poplar, abóbora, Pinus Radiata, rabanete, colza, arroz, porta-enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do Sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba, cana de açúcar, girassol, milho doce, árvore do âmbar, batata doce, panicum, chá, tabaco, tomate, triticale, relvado, melancia e célula da planta de trigo ou planta. Em determinadas modalidades, plantas e partes de plantas transgênicas regeneradas a partir de uma célula de planta transgênica são providas; plantas transgênicas podem ser obtidas a partir de uma semente transgênica; partes de plantas transgênicas po-dem ser obtidas cortando-se, quebrando-se, moendo-se ou dissociando-se de outro modo a parte da planta; a parte da planta pode ser uma semente, um casulo, uma folha, um caule, uma flor, uma raiz ou qual-querporção das mesmas; e uma parte de planta transgênica provida neste documento é uma porção não regenerável de uma parte de planta transgênica. Conforme usado neste contexto, uma porção "não regenerável"de uma parte de planta transgênica é uma porção que não pode ser induzida a formar uma planta inteira ou que não pode ser induzida a formar uma planta inteira capaz de reprodução sexual ou assexual. Uma porção não regenerável de uma parte de planta é uma porção de um pólen, óvulo, de uma semente, de um casulo, de uma folha, flor, de um caule ou de uma raiz transgênica.

[0057] Proveem-se também, neste documento, métodos para afeitura de plantas transgênicas que contenham insetos ou quantidades inibidoras de Lygus e/ou Amrasca de uma eHTP. Tais plantas podem ser feitas introduzindo-se um polinucleotídeo recombinante que codifique qualquer uma das proteínas eHTP providas neste documento em uma célula de planta e escolhendo-se uma planta derivada de dita célula de planta que expresse uma quantidade inibidora de inseto ou Hemiptera das eHTPs. Plantas podem ser derivadas a partir de células de plantas por regeneração, sementes, pólen ou técnicas de transformação de meristema.

[0058] São providas plantas transgênicas e células hospedeirasque expressam uma quantidade inibidora de inseto ou Hemiptera da eHTP para controlar uma infestação de insetos ou Hemiptera. Qualquer uma das espécies de plantas supramencionadas pode ser usada para proteger uma planta da infestação de insetos e Hemiptera providas neste documento contanto que a planta seja transformada com um construto polinucleotídeo projetado para expressar o eHTP aplicável.

[0059] Aspectos adicionais da invenção incluem anticorpos, kits,métodos para a detecção de polinucleotídeos que codificam as eHTPs ou distinguem seus fragmentos, ou eHTPs ou fragmentos distintivos das mesmas, métodos para a identificação de membros inibidores de insetos adicionais do gênero da proteína da presente invenção, formulações e métodos para o controle do crescimento e/ou da infestação de insetos e métodos para prover tal controle a plantas e outros hospedeiros recipientes. Cada composição, construto, célula, planta, formulação, método ou kit provê à aplicação industrial das proteínas da presente invenção, por exemplo, aumentando a produtividade da planta por meio do uso comercial de qualquer uma dessas proteínas para inibir insetos.

[0060] Um produto de planta, que não seja uma semente, uma fruta ou um vegetal, é destinado a ser uma mercadoria ou outros produtos que se movimentam pelo comércio e são derivados de uma planta transgênica ou de uma parte de planta transgênica, em que a mercadoria ou outros produtos podem ser rastreados pelo comércio detectando-se segmentos de nucleotídeo, RNA ou proteínas correspondentes a um eHTP da presente invenção, e são produzidos em ou mantidos na planta ou no tecido da planta ou parte da qual a mercadoria ou outro produto foi obtida. Tais mercadorias ou outros produtos de comércio incluem, mas não se limitam a partes de planta, biomassa, óleo, refeição, açúcar, ração animal, farinha, flocos, farelo, fibras, cascas e sementes processadas. Partes de planta incluem, mas não estão limitadas a semente, casulo, folha, flor, caule, pólen ou raiz de planta. Em determinadas modalidades, a parte da planta é uma parte não regenerável dessa semente, cápsula, folha, flor, caule, pólen ou raiz. Casulos de linho e de algodão e partes não regeneráveis dos mesmos que contêm as eHTPs também são providos.

[0061] Também são providos neste documento produtos de plantaprocessada que contenham uma quantidade detectável de uma eHTP, um fragmento inibidor de insetos da mesma ou qualquer porção distintiva da mesma. Sem procurar limitação pela teoria, acredita-se que tais produtos de plantas processadas contendo uma quantidade detectável de uma ou mais das eHTPs providas neste documento podem, em determinadas modalidades, exibir reduções em microorganismos indese- jados que podem ser transmiditos por Hemiptera e/ou reduções nos produtos colaterais indesejados de tais microorganismos. Em determinadas modalidades, uma parte distintiva da mesma pode compreender qualquer polipeptídeo de pelo menos cerca de 20 a cerca de 100 ou mais aminoácidos contíguos conforme estabelecido na SEQ ID NO:180, em particular em que o polipeptídeo não contém um polipeptídeo cor-respondente de aminoácidos contíguos presente nas SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:182 ou SEQ ID NO:184, e em que o polipep- tídeo compreende pelo menos uma substituição, adição ou deleção de aminoácido na sequência de aminoácido correspondente, conforme es-tabelecido na SEQ ID NO:2. Tais substituições, deleções ou adições são aquelas conforme estabelecido acima no parágrafo [0009].

[0062] São providos produtos de planta processada que contêmuma quantidade detectável de uma eHTP, um polipeptídeo recombi- nante codificando uma eHTP ou um fragmento inibidor de insetos da mesma ou qualquer porção distintiva da mesma. O produto processadoé escolhido do grupo consistente de biomassa de planta, óleo, refeição, ração animal, farinha, flocos, farelos, fibras, cascas e sementes processadas.

[0063] Infestações de plantas de cultivo por Hemiptera são controladas provendo-se, nas plantas de cultivo, uma sequência de polinu- cleotídeos recombinantes que codifica uma ou mais eHTPs da presente invenção. Tais colheitas transgênicas produzem ou são tratadas para conter uma quantidade inibidora de insetos ou Hemiptera de um eHTP aplicável, e tais colheitas são imbuídas de eHTP suficiente (i) aplicando-se qualquer composição compreendendo ou codificando uma eHTP para a planta ou uma semente que gere a planta; e;ou (ii) transformando-se a planta ou a célula de planta que gera a planta e, ulteriormente, a planta, com um polinucleotídeo que codifica uma eHTP. A planta pode ser uma planta transgênica transitória ou esta- velmente transformada compreendendo um transgene que expressa uma quantidade inibidora de insetos ou Hemiptera de uma eHTP. A planta pode ser uma planta não transgênica para qual uma composição compreendendo uma eHTP foi aplicada. Em tais métodos, a planta é uma planta dicotiledônea, e, mais especificamente, pode ser uma planta de algodoeiro, soja ou alfafa. Os insetos Hemiptera incluem adultos e crisálidas, tais como, mas não limitados à listagem de insetos estabelecida acima, no parágrafo [0020].

[0064] Preferencialmente, o Lygus spp.é Lygus hesperus ouLygus lineolaris, a Empoasca spp.é Empoasca fabae e a Amrasca spp.é Amrasca devastans.

[0065] Outros recursos e vantagens da invenção estarão evidentesa partir da seguinte descrição detalhada, dos exemplos e das reivindi-cações.

EXEMPLOS

[0066] Em vista do supracitado, aqueles versados na técnica devem,à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nos aspectos específicos que são divulgados e ainda obter-se um resultado parecido ou semelhante, sem se desviar do espírito e do escopo da invenção. Assim, detalhes específicos divulgados neste documento não devem ser interpretados como limitadores. O Número de Série de Pedido Provisório US 61/621,436, sobre o qual esta aplicação reivindica o benefício da prioridade, a Listagem de Sequência referenciada no parágrafo [0002], bem como todos os materiais de referência às invenções divulgadas e reivindicadas, particular-mentereferências e pedidos de patente publicados citados nesta apli-cação, são incorporados neste documento por referência em sua tota-lidade.

Exemplo 1: Abordagem de Manipulação-Testagem-Escolha Iterativa

[0067] Este exemplo ilustra os aspectos aleatórios, combinatóriose inventivos da abordagem iterativa (também pode ser aqui referida como "recursiva") manipulação-testagem-escolha usada para identificar e descrever proteínas inibidoras de insetos exibindo Coleóptera e/ou atividade nematicida ou toxicidade aumentada a espécies de insetos Hemiptera comparadas a TIC807 (SEQ ID NO:2). Diversas abordagens de projeto foram empregadas para manipular as eHTPs com atividade inibidora aumentada contra espécies Lygus; abordagens incluindo, mas não limitadas a modificações semi-aleatórias, modificações dirigidas de variantes em alinhamento de TIC807 com outras proteínas Bt e projeto assistido de estrutura/função. Vários estágios de manipulação e testagem foram conduzidos (tanto consecutiva como concorrentemente) para escolher variantes de proteína TIC807 exibindo toxicidade aumentada. Abordagens de projeto foram ajustadas conforme dados eram coletados. Essa abordagem iterativa de manipula- ção-testagem-escolha também incluiu, sem se limitar a etapas incluindo clonagem, expressão, purificação e testagem de bioensaio da proteína de controle TIC807 comparada às eHTPs.

[0068] Cerca de 267 eHTPs exemplares possuidoras de toxicidade de Lygus aumentada comparadas a TIC807 foram obtidas de mais que 2000 grupos de eHTPs candidatas (isto é, proteínas de "teste") que foram ensaiados quanto a atividade inibidora de insetos aumentada. O número real total de eHTPs candidatas testado foi muito maior que 2000, uma vez que a testagem incluiu segmentos de nucleotídeo recombinantes codificando diversas eHTPs candidatas derivadas de mutagêneses de biblioteca que não foram sequenciadas no processo seletivo.

[0069] Estoques de proteína de diversas quantidades e purezasforam preparados dependendo do propósito do teste e da vazão de testagem desejada. Por exemplo, preparações de proteína em menor quantidade e menor pureza foram preparadas para triagem de maior número de variantes em bioensaio. Estoques de proteína em maior quantidade e maior pureza foram preparados para bioensaios de maior potência. A testagem tendeu na direção de bioensaios de alta potência conforme posições residuais principalmente relevantes das variantes eram elucidadas. Inicialmente, cerca de 2000 variantes foram testadas em Lygus hesperus. Baseado em dados de L. hesperus, aproximada-mente 600 variantes foram projetadas e então adicionalmente testadas em Lygus lineolaris. Destas, cerca de 267 variantes (Tabela 4B) de-monstraram toxicidade aumentada contra Lygus hesperus e/ou Lygus lineolaris quando comparadas a TIC807. Essas 267 variantes incuíam vinte e duas (22) variantes que confirmaram demonstrar toxicidade aumentada contra ambas as espécies de Lygus. Confirmação e testagem de resposta da dosagem adicionais estreitaram a seleção para sete (7) variantes que foram subsequentemente caracterizadas usando-se um bioensaio replicado de 9 dosagens para determinar os valores LC50 contra ambas as espécies de Lygus.

[0070] O processo de seleção incluiu atualizações dinâmicas dedados de testagem, constantemente ajustando abordagens de mani-pulação e executando estágios iterativos. Concorrentemente, clonagem de trabalho intensivo, expressão de proteínas, purificação de pro- teínas e experimentos de bioensaio foram empregados para testar as eHTPs candidatas.

Exemplo 2: Abordagens de Manipulação Abordagens baseadas em alinhamento

[0071] Uma sequência múltipla de alinhamento de membros deproteína de Cry51: Cry51Aa1 (SEQ ID NO:182), TIC853 (SEQ ID NO:184), e TIC807 (SEQ ID NO:2) foi usada para identificar regiões de variação, por exemplo, posições 195 a 201 e posições 211 a 219, em relação à SEQ ID NO:2 (TIC807). Essas regiões foram alvejadas para mutagênese de saturação por meio do uso de iniciadores de oligonu- cleotídeos degenerados que codificam resíduos de aminoácido aleatórios nessas regiões. Bibliotecas de construtos foram preparadas para expressão de proteína subsequente em células hospedeiras.

[0072] Um alinhamento de sequência múltipla de Cry51Aa1 (SEQID NO:182), TIC853 (SEQ ID NO:184) e TIC807 (SEQ ID NO:2) foi usado em combinação com uma matriz de substituição BLOSUM 80 para calcular distâncias médias de pares para cada variante de posição quanto a TIC807. As posições de resíduo com distâncias de pares menores foram substituídas por resíduos de aminoácidos alternativos usando-se iniciadores de oligonucleotídeos degenerados que codifi-camresíduos de aminoácidos alternativos, por exemplo, G28X, G31X, F46X, E125X, F138X, F147X, S167X, Y216X, P218X, G234X,T247X,D268X e T308X. Bibliotecas de construtos foram preparadas para expressão subsequente de proteínas em células hospedeiras.

Abordagens de varredura

[0073] Construtos de polinucleotídeos foram manipulados para expressar uma única substituição de Alanina ou uma substituição dupla de Alanina (Alanina-<resíduo parental>-alanina) em todas as posições possíveis ao longo de toda a extensão da SEQ ID NO:2 (TIC807). Vide a Tabela 2 para um exemplo hipotético. Tabela 2 Um exemplo hipotético de varreduras únicas e duplas de Alanina em uma proteína de andaime contendo a sequência de ami- noácido XXXXAXX.

X = resíduo parentala = resíduo parental em um resíduo de AlaninaA = Modificado para um resíduo de AlaninaS = Modificado para um resíduo de Serina

[0074] Onde um resíduo de Alanina já estava presente em TIC807,uma Serina foi substituída no lugar. Variantes de proteína que exibiram toxicidade diminuída comparado a TIC807 foram testados, além disso, por mutagênese de combinação e saturação naqueles resíduos de Alanina substituída que conferiram toxicidade aumentada. Aproximações de varredura também foram executadas em variantes de combinação melhoradas possuidoras de modificações acumuladas de estágios iterativos anteriores de manipulação-testagem-seleção, por exemplo, TIC807_M2 (SEQ ID NO:8), possuindo mutações F46S, Y54H, S167R, S217N e uma deleção tripla contígua na escala de resíduo 196-201 foi adicionalmente manipulada por um estágio adicional de substituições únicas de Alanina para melhorar ademais o TIC807_M2 melhorado. Resíduos principalmente relevantes foram identificados e adicionalmente testados por mutagênese de combinação e saturação (por exemplo, A150X, A125X, E155X, F147X, I134X, N157X, Q149X, T133X, E135X e N137X). As variantes manipuladas por essas abordagens combinadas exibiram melhorias adicionais à toxicidade aumentada comparadas a TIC807 e foram adicionalmente combinadas com outras abordagens de projeto que tiravam vantagem da estrutura atômica de TIC807 (SEQ ID NO:2).

Resíduos de superfície exposta

[0075] A estrutura atômica de proteínas da presente invenção foideterminada em meio à abordagem de Manipulação-Testagem- Escolha; e a acessibilidade de solvente relativa (%SA) de cada resíduo foi determinada usando-se o Browser ICM da Molsoft (Molsoft L.L.C., 11199 Sorrento ValleyRoad, S209, San Diego, CA 92121). Mostrado na Tabela 3 nas colunas (A) e (B), a %SA real foi calculada para proteínas possuidoras das respectivas sequências de aminoácido estabelecidas como SEQ ID NO:185 (TIC807_L11M) e SEQ ID NO:8(TIC807_M2). A % de SA prevista para resíduos de TIC807 e TIC853 são listadas na Tabela 3 nas colunas (A) e (C), respectivamente. Tudo somado, os valores de %SA relatados na Tabela 3 são calculados como uma porcentagem da área de superfície acessível por solvente sondada por uma molécula de água sobre a área máxima acessível de solvente em conformação estendida padrão (Gly-XXX-Gly) para cada resíduo em cada posição da estrutura atômica. A Tabela 3 alinha os resíduos de cada proteína por resíduos alinhados em um alinhamento de Clustal W. %SA maior que 100 pode ocorrer quando a área acessível por solvente máxima em conformação estendida padrão (Gly-XXX- Gly) para cada resíduo é menor que a área total acessível por solvente soldada por uma molécula de água. %Sa maiores que 100 são relatadas na tabela como 100%.

[0076] Abordagens combinadas de manipulação-testagem-escolhadescritas neste documento resultaram em uma diversidade de resíduos principalmente relevantes que se acumulam em um emplastro de superfície ([2] da Figura 2) de resíduos possuidores de um raio de cerca de 9,2-12,2 Angstroms em torno do átomo Cb de P219 da SEQ ID NO:2 (TIC807): V10, I14, N22, N23, G24, I25, Q26, G27, F30, Q38, I39, D40, T41, I43, S193, T194, E195, H196, Y197, S198, H199, Y200, S201, G202, Y203, P204, I205, L206, T207, W208, I209, S210, Y216, S217, G218, P219, F220, M221, S222, W223, Y224, F225, N239, e V244 of SEQ ID NO:2 (TIC807). Pelo menos um desses resíduos exibe valores de %SA maiores que ou iguais a quinze (15).Tabela 3. % de Acessibilidade do Solvente (SA) de Aminoácidos de eHTPs &Proteínas de Andaime.

P1 designa um aminoácido no emplastro de superfície [1] da Figura 2. P2 designa um aminoácido no emplastro de superfície [2] da Figura 2. * designa um dos 72 principais aminoácidos relevantes descritos neste documento (vide Figura 2).São mostrados resíduos de TIC807_L11M, TIC807_M2 e TIC853 ali-nhados por Clustal W.Números marcados com # representam a %SA de pelo menos cerca de 36%.

Vinculação do Receptor

[0077] Um emplastro de superfície ([1] da Figura 2) de resíduospossuidor de valores de %SA maiores que 36% ou dentro de cerca de 3 resíduos de um resíduo possuidor de %SA maior que 36% em um raio de cerca de 9,2 - 12,2 Angstroms do átomo de Cb de S95 da SEQ ID NO:2 (TIC807) foi identificado como uma região compreendendo os resíduos de uma proteína TIC807 que pode ser substituída para prover para eHTPs que exibem espectro inibidor de Lygusavançado e/ou atividade inibidora de Lygus melhorada. Essa região de emplastro de superfície pode ser associada com a atividade vinculante de receptor de inseto alvejada; e inclui os resíduos T93, S95, S97, F147, Q149, S151, N180, T182, V251, Q253 e S255 da SEQ ID NO:2 (TIC807). eHTPs podem incluir, mas não se limitam a uma ou mais substituições do re- síduo de aminoácido de emplastro de superfície 1 tal como S95A, F147A, Q149E e/ou V251A.

[0078] As abordagens de manipulação-testagem-escolha combinadas descritas neste documento identificaram resíduos localizados no emplastro de superfície 1 que pode prover eHTPs quando substituído ou modificado de outra forma. Estes resíduos podem ser importantes para a vinculação produtiva dos eHTPs para receptores nas vísceras do inseto para espectro inibidor de Lygus aumentado e/ou atividade inibidora de Lygus melhorada quando comparados a TIC807. Modificações dos resíduos de aminoácido do emplastro de superfície 1 que podem prover eHTPs incluem substituições que proveem grupos aromáticos e/ou grupos vinculantes de hidrogênio que favorecem a vincu- lação a grupos de açúcar encontrados em receptores glicosilados de insetos.

Vinculação da Membrana

[0079] Determinados resíduos de aminoácido localizados em regiões folha-beta da proteína foram identificados a partir da estrutura atômica de TIC807 e foram substituídos por resíduos aromáticos. Mais especificamente, os aminoácidos L78, I123, H270, R273, I275 das re-giões dobradas de TIC807 foram substituídos por Fenilalanina, Tirosi- na ou Triptofano. Substituições de aminoácido aromático de R273 e I275 estavam entre esses resíduos que proveram espectro inibidor de Lygus melhorado e/ou atividade inibidora de Lygus melhorada (Vide Tabela 4, dados para as SEQ ID NOs:32, 34, 68, 92 e 122). Cadeias laterais de resíduos nessas posições podem ser capazes de interagir com as membranas de insetos alvejados.

Locais proteolíticos de ativação

[0080] Resíduos de glicina geralmente pensados para serem envolvidos em proteólise foram substituídos por Serinas para alterar di-nâmicas de clivagem proteolíticas. A presença de um resíduo de glici- na em uma região de laço pode conferir mais flexibilidade e, portanto, suscetibilidade a proteólise, o que pode ou aumentar a atividade inibi- dora de insetos ou diminuir a atividade inibidora de insetos. Resíduos em regiões de laço estruturalmente identificadas foram substituídos por um resíduo de glicina, e nenhuma melhoria foi observada. Posições em laços que já eram glicinas, (por exemplo, G18, G24, G27) foramsubstituídas por uma serina, um resíduo pequeno em uma tentativa de reduzir a suscetibilidade proteolítica, e nenhuma melhoria foi observada.

Abordagens de projetos de Estrutura Combinada

[0081] A estrutura atômica de TIC807 (SEQ ID NO:2) foi usadapara identificar regiões de laço para mutagêneses da biblioteca seguidas de testagem das variantes manipuladas. um laço em posições de aminoácido 211-216 da SEQ ID NO:2 (TIC807) teve a biblioteca muta- genizada e testada. Laços consecutivos em estreita proximidade a po-sições de aminoácido 75-83, 161-167 e 267-276 da SEQ ID NO:2 (TIC807) tiveram a biblioteca mutagenizada e testada.

[0082] A análise da estrutura atômica de TIC807 sugere que umlaço estrutural reside nos resíduos 113-138 da SEQ ID NO:2, e variantes foram manipuladas para estabilizar e desestabilizar o laço.

[0083] Em outra região compreendendo duas cadeias beta conectadas por um laço curto, as duas cadeias beta exibiram um padrão alterna-do de resíduos de aminoácido hidrofóbicos e hidrofílicos nas posições 116 a 121 e nas posições 133 a 138 em relação à SEQ ID NO:2, caracte-rísticas de laços formadores de poros. Uma biblioteca de expressão foi manipulada para modificar ambos os segmentos de cadeias beta que substituem os resíduos V116, V118 e I120, com combinações respecti-vas 116V/Y/L/H/F/D, 118V/Y/L/H/F/D e 120I/D/F/H/L/N/V/Y para um total de 288 variantes possíveis na biblioteca. Este procedimento foi repetido para: resíduos S117, S119 e P121 com combinações respectivas 117S/A/D/E/G/K/N/R/T, 119S/A/D/E/G/K/N/R/T e 121P/S/T para 243 va-riantes potenciais; resíduos I133, A135, e F137 com combinações res-pectivas 133I/D/F/N/V/Y, 135A/D/F/H/L/V/Y,e 137F/D/H/L/V/Y para 252 variantes possíveis; e resíduos T134, E136, e N138 com combinações respectivas 134T/A/D/E/G/K/N/R/S, 136E/A/D/G/K/N/R/S/T e 138N/A/D/ G/S/T para 486 possíveis variantes. Um espectro inibidor de Lygusme-lhorado e/ou atividade inibidora de Lygus melhorada foi associada a de-terminadas dessas substituições, conforme mostrado na Tabela 4.

Relacionamento Estrutura-Função

[0084] Tudo somado, mais de 2000 clones (incluindo clones debiblioteca misturada) expressando variantes de TIC807 foram testados quanto a espectro inibidor de Lygus e/ou atividade inibidora de Lygus aumentada contra Lygus spp. comparados a TIC807. Modificações semi-aleatórias, modificações dirigidas e modificações de estrutura- função, incluindo moldagem de estrutura, potencial de vinculação de receptor, potencial de vinculação de metal, potencial de oligomeriza- ção, uniformidade de distribuição de carga de superfície, potencial de formação de poros, função de canal de íons e identificação de emplastros de superfície exposta são providos com um objetivo de identificar eHTPs com um espectro inibidor de Lygus melhorado e/ou atividade inibidora de Lygus melhorada comparado a TIC807. Esses clones foram expressos para testagem de bioensaio.

Exemplo 3: Expressão da proteína e purificação de TIC807, incluindo variantes e fragmentos

[0085] A proteína de controle TIC807 é uma proteína de 309 ami-noácidos de extensão que pode ser expressa de forma cristalina em Bacillus thuringiensis (Bt) ou forma agregada em E.coli. As variantes de testagem da mesma foram expressas de modo recombinatório em Bt. Uma característica de expressão de TIC807 e variantes de TIC807 é a forma predominante cristalina e agregada extraída de células Bt e E.coli, respectivamente. Para fazer o teste quanto à bioatividade de Lygus, amostras de teste e controle foram apropriadas para o bioensaio de Lygus solubilizando-se amostras em 25 mM de tampão de Carbonato de Sódio e removendo-se materiais insolubilizados por centrifugação. A quantidade de proteína em amostras de teste e controle foram medidas usando-se métodos de proteína total, por exemplo, um ensaio Bradford, um método ELISA ou semelhantes. A eletroforese de gel foi usada para determinar a pureza e concentração de estoque da proteína re- combinante solubilizada. A proteína de término C marcada com HIS TIC807 foi manipulada para facilitar a detecção, a purificação e a quan-tificação de grandes quantidades da proteína de controle TIC807. As amostras de teste de término C TIC807 marcadas com HIS e TIC807 não marcadas foram ensaiadas separadamente e confirmaram possuir atividade equivalente contra Lygus (vide Exemplos 4, 5 e 6).

[0086] Substituições de aminoácidos dirigidas por local foram feitasa TIC807_M13 (SEQ ID NO:34) para elevar a expressão de uma forma solúveI.Os inventores postulam que variantes mais prontamente solúveis das proteínas da presente invenção podem facilitar a expressão e a puri-ficação, por exemplo, expressas em células hospedeiras E.coli; e podem aumentar a eficácia inibidora de inseto quando expressas em células hospedeiras de plantas. Construtos recombinatórios de DNA codificando TIC807_M13 (SEQ ID NO:34) foram manipulados de três maneiras dife-rentes para refletir três variantes diferentes: Em relação a TIC807_M13, as modificações foram, para a Variante#1: I58K e P59K, para a Variante #2: S198K e G199K, e para a Variante #3: S246R, V248E e Q250R. Em relação a TIC807 (SEQ ID NO:2), as modificações podem ser alternati-vamente descritas conforme o seguinte para a Variante #1: I58K e P59K, para a Variante #2: S201K e G202K, e para a Variante #3: S249R, V251E e Q253R; esta diferença posicional é congruente devido a uma deleção tripla contígua de SEQ ID NO:2 (TIC807) no alcance de resíduos 196-201 que é refletido em TIC807_M13 (SEQ ID NO:34). Os quatro construtos manipulados de DNA recombinante foram, cada um, clonados e expressos em E.coli. A fração solúvel das quatro preparações de E.coli foram avaliadas por SDS-PAGE tingidos com comassie, o que mostrou que TIC807_M13 (SEQ ID NO:34) não era detectável na fração solúvel; mas, pelo contrário, as variantes #s 1, 2 e 3 eram solúveis. Substituições de aminoácidos semelhantes, separadas ou em combinação, são feitas a proteínas da presente invenção a fim de elevar sua solubilidade em célu-las hospedeiras não Bt ou de planta. Construtos de DNA recombinante foram manipulados para codificar e expressar a variante#3 TIC807_M13 (renomeada TIC807_M14; SEQ ID de nucleotídeo NO: 203 e SEQ ID de aminoácido NO:204). Lisado de E.coli preparado foi clarificado, e a prote-ína recombinante foi purificada e enriquecida em uma série de colunas, incluindo métodos de troca de íons e filtragem de gel. Frações de proteí-nas agrupadas foram quantificadas e determinadas como ativas contra insetos Lygus (Vide Exemplo 4, Tabela 4B).

[0087] Proteínas da presente invenção, incluindo, sem limitação,proteínas possuidoras da sequência de aminoácido conforme estabe-lecida em SEQ ID NO:28, SEQ IDNO:30, SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:36 são manipuladas para elevar a expressão de uma forma solúvel quando expressas em uma célula hospedeira, por exemplo, expressas em Bt, E.coli ou uma célula de planta ou em um compartimento de uma célula de planta. Manipulação inclui a substituição de um resíduo de aminoácido de lisina em uma ou mais das seguintes posições 58, 59, 198, 199, 201 ou 202; ou um ácido glutâmico em uma ou mais das seguintes posições 198, 248 ou 301; ou uma Arginina em uma ou mais das seguintes posições 246, 250 ou 253.

[0088] A região do término C é protuberante no sentido contrárioao núcleo monomérico da proteína (Vide Figura 2). Um construto de DNA recombinante foi manipulado para codificar e expressar uma pro- teína possuidora de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:202, que é um fragmento de proteína (aminoácidos 1 a 301) de TIC807_M8 (SEQ ID NO:16); e a proteína expressa foi purificada, quantificada e determinada ativa contra insetos Lygus (Vide Exemplo 4, Tabela 4B). Construtos de DNA recombinante foram projetados para codificar e expressar fragmentos TIC807 que exibem truncações variadasextraídas da extremidade de término C das proteínas da presente invenção nas posições respectivas A281, G289, S293, A301 e S304. Fragmentos de proteína são manipulados para codificar e expressarproteínas possuidoras das sequências de aminoácido estabelecidas como SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:36; e os fragmentos de proteína expressos são usados como amostras de teste contra insetos Lygus.

Exemplo 4: Atividade Hemiptera de proteínas Manipuladas

[0089] Este exemplo ilustra eHTPs possuidoras de atividade inseticida melhorada ou especificidade inseticida aumentada contra insetos Hemiptera quando providas na dieta de insetos Hemiptera, incluindo, mas não limitado a membros da Heteroptera miridae, incluindo o gêneroLygus, por exemplo, Lygus hesperus e Lygus lineolaris, e a família das Cicadellidae, incluindo o gênero Amrasca, por exemplo, Amrasca devastans, e Empoasca, por exemplo, Empoasca fabae. Este exemplo, com a Tabela 4B, ilustra o ensaio de alimentação usado para determinar o espectro inibidor de Lygus aumentado e/ou a atividade ini- bidora de Lygus melhorada de proteínas Bt expressas de modo re- combinante da presente invenção tanto contra Lygus hesperus como contra Lygus lineolaris. As proteínas expressas em células hospedeiras bacterianas recombinantes foram solubilizadas em tampão de carbonato e analisadas por gel de SDS poliacrilamida (SDS-PAGE); e concentrações de proteína foram determinadas por densitometria usando-se albumina de soro bovino (BSA) como padrão. O estoque de proteína (2X) preparado deste modo foi misturado com dieta para ensaios de alimentação.

[0090] Ensaios de alimentação com as espécies de HemipteraLygus hesperus e Lygus lineolaris foram baseados em um formato de placa de microtítulos de 96 poços com dieta de Lygus encapsulado entre folhas de Parafilm® e Mylar estendidas. A dieta artificial foi obtida de Bio-Serv ® (Bio-Serv ® Diet F9644B, Frenchtown, NJ). Água fervida esterilizada (518 mL) foi combinada com 156,3 gramas de dieta Bio-Serv ® F9644B em um misturador de superfície esterilizada. Os conteúdos de quatro ovos de galinha de superfície esterilizada foram adicionados e a mistura foi misturada até ficar regular e então ajustada a um volume total de um litro e deixada para resfriar à temperatura ambiente, esta sendo a dieta 2X. As amostras foram preparadas misturando-se em uma razão 1:1 de 2X de dieta de 2X de amostra. Uma folha de Parafilm® (Pechiney Plastic Packing, Chicago, IL) foi colocada sobre um coletor a vácuo projetado para o formato de 96 poços (Analytical Research Systems, Gainesville, FL) e um vácuo de aproximadamente -20 milímetros de mercúrio foi aplicado, suficiente para causar extrusão do Parafilm® nos poços. Vinte a quarenta microlitros de amostra de teste foram adicionados às extrusões de Parafilm®. Uma folha de película Mylar (Clear Lam Packaging, Inc., Elk Grove Village, IL) foi colocada sobre as extrusões de amostra preenchidas de Parafilm® e selada com um ferro de alinhamento (Bienfang Sealector II, Hunt Corporation, Philadelphia, PA), formando assim sachês de dieta preenchidos de Parafilm®. Estes sachês de Parafilm® foram posicionados sobre uma placa de fundo plano 96 que contém os ovos de Lygus suspensos em uma solução diluída de agarose. À eclosão, crisálidas de Lygus se alimentam da dieta rasgando os sachês de dieta preenchidos de Parafilm®. Alternativamente, crisálidas de Lygusrecentemente eclodidas foram manualmente infestadas em cada célula. Pontuações de atrofiamento e mortalidade foram determinados no dia 5 e comparados aos controles. Os dados foram analisados usando-se software estatístico de JMP4. Para cada proteína em uma concentração de teste três populações de oito crisálidas foram sujeitas a este bioensaio, e pontuações de mortalidade relatados na Tabela 4B.

[0091] Para determinações LC50 listadas na Tabela 1 e Tabela4B, as proteínas foram apresentadas a crisálidas de Lygusrecentemente eclodidas a concentrações de 8-10 e às crisálidas foi permitido se alimentarem por 5 dias antes de pontuar quanto à mortalidade sobre o alcance da dosagem. Para cada concentração, três populações de oito crisálidas foram sujeitas a este bioensaio, e todas as determinações de LC50 na Tabela 1 e na Tabela 4B foram repetidos pelo menos uma vez.

[0092] Para estimativas de LC50, proteínas foram apresentadas acrisálidas recentemente eclodidas de Lygus lineolaris a 4 concentrações e às crisálidas foi permitido se alimentarem por 5 dias antes de pontuar quanto à mortalidade sobre o alcance da dosagem. Estimativas de Lygus lineolaris LC50 foram executadas em TIC807 e TIC807_M2 porque quantidades significativamente grandes dessas proteínas excedentes a 1000 μg/mL não puderam prover à dieta de Lygus a fim de completar o alto alcance de resposta de dosagem de toxicidade a Lygus lineolaris; e assim um valor LC50 não foi determinado para TIC807 ou TIC807_M2. Em vez disso, uma estimativa de 4 dosagens de estimativa de LC50 no baixo alcance foi executada e relatada na Tabela 1 e na Tabela 4B. O Lygus lineolaris LC50 estimado para TIC807_M14 é 4,4 μg/ml. Para cada concentração, três populações de oito crisálidas foram sujeitas a este bioensaio.

[0093] Este exemplo, com as Tabelas 4A e 4B, ilustra o ensaio dealimentação usado para determinar o espectro inibidor de Lygusau-mentado e/ou a atividade inibidora de uma proteína Bt recombinante expressa divulgada neste documento contra Amrasca devastans. As variantes TIC807 com atividade inseticida melhorada ou especificidade inseticida melhorada contra Lygus Hesperus e Lygus lineolaris exibem atividade inseticida melhorada contra Amrasca devastans.

[0094] TIC807 e TIC807_M13 foram dissolvidos em 25mM detampão de carbonato de sódio, pH 10. Ovos de Amrasca devastans foram coletados em folha de quiabo em uma placa de Petri contendo 2% de agar. À eclosão, os neonatos foram usados para bioensaios usando-se a dieta de Lygusdiluído (1:5). As proteínas e a dieta foram misturadas em proporção igual (trazendo a concentração final de proteína a 500 μg/mL) e dispensadas à arena de testes. O controle intra- tado foi preparado misturando-se o tampão com a dieta. Neonatos individuais foram infestados na arena de testes, e os ensaios foram incubados a 25°C, 60% RH. Vinte crisálidas neonatas foram testadas para cada concentração, proteína e em 2 réplicas. Um controle foi mantido com 25mM de tampão de Carbonato de Sódio, pH 10, em dieta de Lygusdiluída a 1:5. A mortalidade dos insetos foi determinada no quinto dia. Valores de mortalidade foram calculados por meio da seguinte fórmula: (% mortalidade no tratamento - % mortalidade no controle)/(100 - % mortalidade no controle) x 100. A Tabela 4A tabula a atividade de Amrasca para TIC80 e TIC807_M13 em 5 concentrações diferentes. Tabela 4A. TIC807 e TIC807_M13 Porcentagem de Mortalidade Dirigida a Espécies de Amrasca.

[0095] Valores LC50 foram determinados para T C807 eTIC807_M13 em um teste separado. SEQ ID NO:2 (TIC8007) exibiu um valor LC50 de 116,79 μg/mL e LC90 de 437,27 μg/ml. SEQ ID NO:34 (TIC8007_M13) exibiu um valor LC50 de 7,59 μg/mL e LC90 de 239,8 μg/ml.

[0096] Um ensaio de alimentação conforme descrito para Amrascadevastansé usado para testagem de eHTPs quanto a atividade inseticida melhorada e/ou especificidade inseticida aumentada contra Em- poasca fabae. As variantes TIC807 com atividade inseticida melhorada ou especificidade inseticida melhorada contra Lygus Hesperus e Lygus lineolaris exibem atividade inseticida melhorada contra Empoasca fa- bae.

[0097] Os valores LC50 de Cry51Aa1 (SEQ ID NO:182) paraTIC807 (SEQ ID NO:2), TIC807_M2 (SEQ ID NO:8), TIC807_M10 (SEQ ID NO:30) e TIC807_M13 (SEQ ID NO:34) contra Lygus hesperus e Lygus lineolaris foram determinados em um conjunto de teste. TIC807_M2, TIC807_M10 e TIC807_M12 exibiram valores LC50 me-lhorados comparado a Cry51Aa1.

[0098] Deve ser evidente àqueles versados na técnica que variações desse procedimento podem existir sem que isso afete os resulta-dos. Tabela 4B. Manipulação-testagem-escolha iterativa de eHTPs contra Lygus spp. resultou em 267 proteínas com espectro inibidor de Lygus melhorado e/ou atividade inibidora de Lygus melhorada contra Lygus spp. comparado a TIC807. Tabela 4B. Manipulação-testagem-escolha iterativa de eHTPs contra Lygus spp. resultou em 267 proteínas com espectro inibidor de Lygus melhorado e/ou atividade inibidora de Lygus melhorada contra Lygus spp. comparado a

Exemplo 5: Atividades inibidoras de inseto de membros de proteína da presente invenção

[0099] Proteínas da presente invenção, tais como, mas não limitadas a TIC807_M1 (SEQ ID NO:6), TIC807_M2 (SEQ ID NO:8),TIC807_M3 (SEQ ID NO:10),TIC807_M4 (SEQ ID NO:12), TIC807_M5 (SEQ ID NO:14), TIC807_M6 (SEQ ID NO:18), TIC807_M7 (SEQ ID NO:20), TIC807_M8 (SEQ IDNO:16), TIC807_M9 (SEQ ID NO:28), TIC807_M11 (SEQ ID NO:32), TIC807_M13 (SEQ ID NO:34), eTIC807_M12 (SEQ ID NO:36) são preparadas e testadas quanto à bi- oatividade contra pragas de plantas diferentes de Lygus.

[00100] As proteínas TIC807_M10 (SEQ ID NO:30), TIC807_M11 (SEQ ID NO:32), TIC807_M12 (SEQ ID NO:36) e TIC807_M13 (SEQ ID NO:34) foram preparadas e testadas quanto à bioatividade contra pragas das ordens Lepidoptera, Coleoptera, Heteroptera e Homoptera. Proteína TIC807_M5 (SEQ ID NO:14) foi preparada e testada quanto à bioatividade contra pragas de Coleóptera. Bioensaios foram conduzidos a fim de avaliar os efeitos dessas proteínas em insetos, conforme mostrado na Tabela 5. Ensaios de alimentação foram conduzidos em uma dieta artificial contendo a proteína inseticida. A proteína inseticida foi preparada conforme descrito no exemplo 3 e topicamente aplicada usando-se uma dieta artificial específica para insetos, dependendo do inseto sendo testado. A toxina foi suspensa em um tampão e aplicada a uma taxa de 500 μg/mL de amostra por poço, e, no caso de TIC807_M5, de 1000 μg/mL, e então deixada para secar. Pontuações e mortalidades de populações médias foram determinadas em três populações de 8 insetos por espécie testada. Os resultados foram expressos como positivos (+) para reações de insetos tais como atrofia- mento e mortalidade que foram estatisticamente significativos comparado ao controle não tratado. Os resultados foram expressos como negativos (-) se os insetos eram semelhantes ao UTC, isto é, dieta de alimentação à qual apenas o tampão foi aplicado. Tabela 5. eHTPs demonstram atividades inibidoras de inseto adicionais contra pragas diferentes de Lygus spp.

UTC = Nontrole Não Tratado; ND Não DeterminadoCPB = Besouro da batata (Leptinotarsa decemlineata); WCR = verme da raiz do milho ocidental Diabrotica virgifera); ECB = broca do milho europeia (Ostrinia nubilalis); broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella); CEW = lagarta da espiga (Helicoverpa zea); FAW = La-garta do cartucho (Spodoptera frugiperda); SGSB = percevejo verde (Nezara virudula); NBSB = percevejo-marrom (Euschistus heros); GPA = Pulgão (Myzus persicae).

[00101] As proteínas da presente invenção também são testadas quanto à bioatividade contra uma forma de praga do filo Nematoda.

Exemplo 6: Plantas que expressam proteínas da presente invenção exibem atividade inibidora de insetos

[00102] Este exemplo ilustra a expressão de proteínas da presente invenção em plantas e demonstra que plantas de algodoeiro expres-sandoproteínas da presente invenção exibem atividade inibidora de insetos.

[00103] Segmentos de polinucleotídeos para uso na expressão das proteínas da presente invenção em plantas são feitos de acordo com os métodos estabelecidos na Patente US No. 7,741,118. Por exemplo, proteínas de toxina possuidoras da sequência de aminoácido conforme estabelecido em SEQ ID NO:4 (TIC807_4), SEQ ID NO:6 (TIC807_M1), SEQ ID NO:8 (TIC807_M2), SEQ ID NO:10 (TIC807_M3), SEQ ID NO:12 (TIC807_M4), SEQ ID NO:14 (TIC807_M5), SEQ ID NO:16 (TIC807_M8), SEQ ID NO:18 (TIC807_M6), SEQ ID NO:20 (TIC807_M7), SEQ ID NO:22 (TIC807_22), SEQ ID NO:24 (TIC807_24), SEQ ID NO:26 (TIC807_26), SEQ ID NO:28 (TIC807_M9), SEQ ID NO:30 (TIC807_M10), SEQ ID NO:32 (TIC807_M11) e SEQ ID NO:34 (TIC807_M13), são expressas a partir de segmentos de polinucleotí- deos designados para uso em plantas e na codificação de proteínas da presente invenção, incluindo a sequência de polinucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200 e SEQ ID NO:201, respectivamente.

[00104] Pretende-se que os segmentos de polinucleotídeo (ou moléculas de polinucleotídeo) que codificam cada uma das variantes de proteínas ou fragmentos inibidores de insetos das mesmas sejam usados sozinhos ou em combinação uns com os outros ou em combinação com outras proteínas inibidoras de inseto ou agentes inibidores de inseto tais como moléculas de supressão de genes mediadas por dsRNA. Tais combinações projetadas para funcionar em mecanismo sinergístico ou compatível com as proteínas da presente invenção. A intenção dessas combinações é alcançar plantas e células de plantas protegidas de infestações de pragas, em particular pragas de insetos. As proteínas variantes específicas dentro do escopo da invenção incluem as proteínas correspondentes aos SEQ ID NOs listados na Tabela 4B e descritos ao longo da aplicação como depositados.

[00105] Segmentos de polinucleotídeo da SEQ ID NO:188 (codifica TIC807_M2, SEQ ID NO:8) e de SEQ ID NO:192 (codifica TIC807_M8, SEQ ID NO:16) foram cada uma recombinantemente manipuladas em construtos de expressão para transformação de algodoeiros.

[00106] Plantas de algodoeiro transgênicas (plantas de algodoeiro recombinante) foras produzidas e testadas quanto à eficácia. Plantas transgênicas regeneradas (R0) baixas em número de cópia e altas em expressão da respectiva variante de proteína foram escolhidas, conforme determinado por diversos métodos quantitativos e semiquantitativos, por exemplo, PCR, ELISAs e Westerns. Níveis de expressão em tecido de folha de algodoeiro R0 ficaram tipicamente na faixa de 0,5 a 500 ppm em massa fresca. Plantas R0 que expressam altos níveis de proteína foram transferidas para o solo e autofecundadas. Trinta sementes de cada uma das plantas R0 auto- fecundadas foram plantadas e progênies homozigóticas cultivadas até o florescimento. De onze a 18 plantas a cada 4 ou 5 eventos por construto deste exemplo foram testados quanto à eficácia contra Lygus (Tabelas 6A, 6B e 6C). O cultivo de algodoeiros não transformados, plantas do agrupamento de população segregada negativa (progenia não contando o transgene) e plantas que expressam a proteína parental TIC807 serviram como controles negativos. Um ramo de uma planta de algodoeiro em estágio de florescimento foi fechado em um saco de malha feito de folhas de "polinização"de plástico respiráveis (Vilutis and Co. Inc.,Frankfort, IL), e diversos ramos foram arranjados de maneira semelhante. Cada saco de malhas foi preso pelo cabo usando um laço de torção. Aproximadamente 4-6 crisálidas de Lygus hesperus (<24 horas após a eclosão) foram colocadas em um tubo cônico de 1,4 ml (Matrix Technologies Corp., NH). Um ramo no interior de um saco de malha foi infestado com crisálidas deslizando-se o tubo cônico destampado para o interior do saco de malha. Permitiu-se aos insetos que se alimentassem por um período de 10-11 dias antes que todos os insetos sobreviventes no saco de malha fossem coletados em gelo seco. Os sobreviventes foram pesados para obter uma massa bruta. A percentagem de mortalidade e a média de massa dos sobreviventes foi calculada. Os insetos faltantes foram incluídos no cálculo do percentual de mortalidade. Conforme mostrado nas Tabelas 6A, 6B e 6C, plantas de algodoeiro que expressavam as variantes de proteínas TIC807_M2 e TIC807_M8 impactaram significativamente o crescimento e o desenvolvimento de crisálidas de Lygus hesperus. Baseado nesses resultados, essas plantas, sementes, construtos de expressão foram avançados para desenvolvimento adicional.Tabela 6A. % média de mortalidade determinada de ensaios de ali-mentação de Lygus em estágio de florescimento com plantas de algo-doeiro expressando as variantes de proteína TIC807: TIC807_M2 e TIC807_M8.

Tabela 6B. Ínstar médio determinado a partir de de ensaios de alimen-tação de Lygus em estágio de florescimento com plantas de algodoeiro expressando as variantes de proteína TIC807: TIC807_M2 e TIC807_M8.

Tabela 6C. Média de Massas de Sobrevivência determinadas a partir de de ensaios de alimentação de Lygus em estágio de florescimento com plantas de algodoeiro expressando as variantes de proteína TIC807: TIC807_M2 e TIC807_M8.

Desv Pad = desvio padrãoSEM = Erro padrão no meioMais baixo que 95% = Limite mais baixo a um intervalo de confiança de 95%Acima de 95% = limite mais alto a um intervalo da confiança de 95% Agrupamento de T = Usando um teste de diferenciação menos signifi- cante diferente, valor de F = 101,1756, df = 15, 44, Pr < 0,0001

[00107] Em outro exemplo, plantas de algodoeiro de cinco eventos transgênicos expressando TIC807_M11 foram testadas em uma triagem de campo tendo pressões naturais de infestações de Lygus. Essas plantas demonstram eficácia de campo comparadas à linha não recipiente (germoplasma DP393 usado para transformação). O núme-romédio de insetos Lygus lineolaris em cinco plantas por evento foi significativamente mais baixo que o número médio de insetos Lygus lineolaris em plantas do controle não transgênico. O rendimento de semente de algodoeiro de cinco plantas dos cinco eventos foi estatisti-camentecomparável ao rendimento de semente do controle não transgênico, por exemplo, retenção de quadrados de algodão ao longo da estação.

[00108] Em outra triagem de campo semelhante, plantas de algodoeiro de sete eventos transgênicos expressando TIC807_M10 de-monstrarameficácia de campo comparadas ao controle não transgêni- co. O número médio de insetos Lygus lineolaris em cinco plantas por evento foi significativamente mais baixo que o número médio de insetos Lygus lineolaris em plantas do controle não transgênico. O rendimento de sementes de algodoeiro de três das sete plantas foi estatisticamente mais alto que o rendimento de sementes de algodoeiro no controle não transgênico.

[00109] Em um outro exemplo, plantas de algodoeiro de trinta e quatro eventos transgênicos expressando TIC807_M13 demonstraram eficácia de crescimento de câmara comparadas ao controle não trans- gênico. Sacos de malha foram colocados ao redor das plantas de algodoeiro inteiras no estágio de florescimento (em vez de apenas em torno de ramos únicos descritos anteriormente neste exemplo). Cinco plantas por evento foram avaliadas e o número médio de insetos Lygus lineolaris recolhido (crisálidas a adultos a Lygus de 2a geração) por planta foi significativamente mais baixo que o número médio de insetos Lygus lineolaris por planta não transgênica.

[00110] Experimentos semelhantes são executados com plantas expressando proteínas listadas na Tabela 1 e nas Tabelas 4A e 4B.

Exemplo 7: Tecidos de plantas de alfafa que expressam proteínas da presente invenção exibem atividade inibidora de insetos

[00111] Este exemplo ilustra a expressão de proteínas da presente invenção em plantas de alfafa e demonstra que tecidos de plantas de alfafa expressando proteínas da presente invenção exibem atividade inibidora de insetos.

[00112] O segmento de polinucleotídeo da SEQ ID NO:192 (que codifica TIC807_M8, SEQ ID NO:16) foi recombinantemente manipulado em três construtos de expressão diferentemente configurada para a transformação de alfafa. Para fins de relação de dados, os três cons- trutos recombinantes são codificados [ER], [ES] e [ET].

[00113] Plantas de alfafa transgênicas (plantas de alfafa recombinan- tes) foram recuperadas de transformantes que sofreram cruzamento hí-brido e foram então autofecundadas. Foram escolhidas plantas de alfafa recombinantes baixas em número de cópias e altas em expressão de TIC807, conforme determinado pelos métodos RT-PCR e semiquantitati- vo Ocidental, respectivamente. O tecido de planta de alfafa de dez even-tos separados foi agrupado, liofilizado, moído e ressuspenso em tampão de estoque, 25 mM de NaCarb, pH10,5. Tecido de planta de alfafa sem nenhum transgene de expressão TIC807_M8 foi preparado para uso como controle. Preparações de estoque foram diluídas serialmente 100, 300 e 900 vezes para incorporação à dieta de Lygus. Usando-se o méto-do de ensaio de alimentação do Exemplo 4, pontuações de mortalidade e atrofiamento foram determinadas no dia 5 e comparadas a controles (Vi-de Tabelas 7A e 7B; dados foram analizados usando-se softwares esta-tísticos JMP4). Para cada amostra de teste e cada diluição, três popula-ções de oito crisálidas foram submetidas a este bioensaio. Pontuações de atrofiamento correspondem a estimativas de massa visuais em que 0 = sem diferença em relação ao controle negativo, 1 = cerca de 25% me-nos massa, 2 = cerca de 50% menos massa e 3 = cerca de 75% menos massa. A média das pontuações de atrofiamento para cada população de oito crisálidas é relatada. Tabela 7A. Média de % de mortalidade determinada a partir de ensaios de alimentação de Lygus com dieta incorporada com tecido de plantas de alfafa expressando a proteína variante de TIC807:TIC807_M8.

Tabela 7B. Média de atrofiamento determinada a partir de ensaios de alimentação de Lygus com dieta incorporada com tecido de plantas de alfafa expressando a proteína variante de TIC807:TIC807_M8.

Exemplo 8: Plantas co-expressando uma eHTP e uma segundaproteína inibidora de insetos exibindo atividade inibidora de es-pécies Lygus

[00114] Prepararam-se amostras de proteínas contendo diversas mis-turas de TIC1415 e TIC807_M13 e testadas em bioensaio. A proteína TIC1415 e outras proteínas inibidoras de Lygussão descritas na Publica-ção de Pedido de Patente No. WO 2012/139004. Misturas de amostras foram alimentadas a Lygus lineolaris usando-se ensaio de bioatividade. A proteína TIC1415 sozinha e TIC807_M13 também foram preparadas como controles positivos. O tampão foi usado como controle negativo. Amostras de todos os três tipos de preparações exibiram mortalidade contra Lygus lineolaris, e os sobreviventes tiveram seu desenvolvimento atrofiado. Pontuações de mortalidade e atrofiamento foram significativas comparadas a pontuações de bioatividade de insetos alimentados com o tampão (vide Tabela 8A). Os dados sugerem que não há efeitos antagô-nicos. Testagens adicionais de bioensaios são realizados em misturas para demonstrar efeitos sinergísticos e/ou aditivos. Tabela 8A. Dados de bioensaio para mistura de proteínas. TIC1415 combinada a TIC807_M13

fMédia (mediana) de 5 populações de 8 crisálidas por população.t Pontuações de atrofiamento correspondem a estimativas de massa visuais em que 0 = sem diferença em relação ao controle negativo, 1 = cerca de 25% menos massa, 2 = cerca de 50% menos massa e 3 = cerca de 75% menos massa. A média das pontuações de atrofiamento para cada população de oito crisálidas é relatada.* Num intervalo de confiança de 95%.

[00115] Plantas de algodoeiro compreendendo eventos com DNA transgênico foram designadas para co-expressar proteínas respectivas TIC1415 e TIC807_M13. Tais plantas foram avaliadas em um ensaio de planta engaiolada inteira infestada com Lygus lineolaris. Cinco plantas cada, de dez eventos, foram engaioladas e infestadas com 2 pares de macho e fêmea L. lineolaris por planta. O ensaio foi incubado em uma câmara de crescimento sob condições ambientais normais para o desen-volvimento de planta de algodoeiro por 21 dias. Plantas de controle nega-tivo DP393 foram crescidas de modo semelhante. Ao final do período de 3 semanas, Lygus de diversos estágios de desenvolvimento foram con-tados. O número médio por planta de insetos Lygus hesperus em cada estágio em desenvolvimento foram calculados (vide Tabela 8B). Tabela 8B. Dados in-planta para a mistura de proteínas: TIC1415 combinado com TIC807_M13

Claims

1. Polipeptídeo inibidor de inseto, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

2. Polipeptídeo inibidor de inseto de acordo com a reivindi-cação 1, caracterizado pelo fato de que exibe atividade inibitória contra uma espécie de inseto da ordem Hemiptera.

3. Polipeptídeo inibidor de inseto de acordo com a reivindi-cação 2, caracterizado pelo fato de que o inseto hemíptero é selecionado a partir do grupo consistindo em Lygus sp., Empoasca sp., e Am- rasca sp..

4. Polipeptídeo inibidor de inseto de acordo com a reivindi-cação 2, caracterizado pelo fato de que o inseto hemíptero é selecionado a partir do grupo consistindo em Lygus hesperus, Lygus lineola- ris, Amrasca devastans, e uma combinação dos mesmos.

5. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo inibidor de inseto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 5, carac-terizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 201.

7. Célula hospedeira bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 4 ou 5.

8. Célula hospedeira bacteriana de acordo com a reivindi-cação 7, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo consistindo em Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Escherichia, Pseudomonas, e Salmonella.

9. Célula hospedeira bacteriana de acordo com a reivindi-cação 7, caracterizada pelo fato de que é Bacillus thuringiensis ou Es-cherichia coli.

10. Composição inibidora de inseto, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo inibidor de inseto como definido na reivindicação 1.

11. Composição inibidora de inseto de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que é preparada por liofilização, extração, filtração ou centrifugação.

12. Composição inibidora de inseto de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um agente inibidor de inseto diferente do polipeptídeo inibidor de inseto, em que pelo menos um agente inibidor de inseto é selecionado a partir do grupo consistindo em uma proteína inibidora de inseto, uma molécula de dsRNA inibidora de inseto e um químico inibidor de inseto.

13. Composição inibidora de inseto de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um agente inibidor de inseto apresenta atividade contra uma ou mais espécies de pestes da ordem Lepidóptera, Coleóptera, Hemíptera, ou Homóptera.

14. Método de controle de uma peste hemíptera, caracterizado pelo fato de que compreende apresentar à peste hemíptera uma quantidade inibidora do polipeptídeo inibidor de inseto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

15. Mercadoria, caracterizada pelo fato de que o produto de commodity é uma composição definida pela quantidade detectável do polipeptídeo inibidor de inseto como definido na reivindicação 1.