JP6106263B2 - 半翅目昆虫種に対して毒性のタンパク質 - Google Patents
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Description
本出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、2012年4月6日に出願された米国仮出願第61/621,436号への優先権を主張する。
サイズが529,794バイトであり(オペレーティングシステムMS−Windowsにおいて測定)、2013年4月4日に作成された、「38_21_56191_APCT_Sequence Listing_ST25.txt」という名称のファイルに含有される配列表は、電子提出(米国特許庁EFS−Web出願システムを使用)によって同時に出願され、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号13、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、配列番号202、および配列番号204、またはこれらの昆虫阻害断片から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するeHTPが、本発明の好ましい実施形態である。本発明のeHTPによって阻害される標的の半翅目有害生物種としては、少なくとも、リグス・ヘスペルス、リグス・リネオラリス(Lygus lineolaris)、エムポアスカ・ファバエ(Empoasca fabae)、およびアムラスカ・デバスタンス(Amrasca devastans)、ならびに互いに系統発生学的に関連する、または植物を摂食するために突刺および吸汁手法を使用する、半翅目内の他の有害生物が挙げられる。
(1)制御されたアッセイ条件下で、試験昆虫に、同一量の試験eHTPならびに対照TIC807(配列番号2)、TIC807_M2(配列番号8)、Cry51Aa1(配列番号182)、TIC853(配列番号184)、および/もしくはAXMI−171(配列番号206)タンパク質を投与し、試験および対照タンパク質の効力を測定および比較すること、ならびに/または
(2)制御されたアッセイ条件下で同等の昆虫個体群応答を引き起こす、試験eHTP、ならびに対照TIC807(配列番号2)、TIC807_M2(配列番号8)、Cry51Aa1(配列番号182)、TIC853(配列番号184)、および/もしくはAXMI−171(配列番号206)タンパク質のタンパク質用量(例えば、食餌中のタンパク質濃度)を判定する(即ち、用量応答曲線を得る)ことを含むことができる。
第2の手法において、比較のために使用される統計的に堅牢な用量応答値は、試験個体群の50%を殺滅するために必要とされる中央致死濃度(LC50)であろう。しかしながら、ある実施形態において、試験個体群の50%成長阻害をもたらすために必要とされる中央阻害濃度(「IC50」)を含むが、これに限定されない、他の値を使用することができる。この文脈において、「成長阻害」は、半翅目の生育の発育阻止および/または阻害を含むことができる。
(i)リグス・ヘスペルス昆虫種に対して、約0.3μg/mL〜約70μg/mLの用量で、
(ii)リグス・リネオラリス昆虫種に対して、約0.85μg/mL〜約100μg/mLの用量で、
(iii)リグス・ヘスペルスに対して、約0.3〜約70μg/mLのLC50値で測定、
(iv)リグス・リネオラリスに対して、約0.85〜約100μg/mLのLC50値で測定、または
(v)リグス種、エムラスカ(Emrasca)種、および/もしくはアムラスカ種に対して、TIC807、配列番号8、配列番号182(Cry51Aa1)、配列番号184(TIC853)、および/もしくは配列番号206(AXMI−171)のLC50値よりも2倍超低いLC50値で測定、または
(vi)アムラスカ・デバスタンスもしくはエムポアスカ・ファバエ(Empoasca fabae)昆虫種に対して、約0.69μg/mL〜約500μ/mLの用量で、または
(vii)アムラスカ・デバスタンスおよび/もしくはエムポアスカ・ファバエ(Empoasca fabae)に対して、約3.5〜約15μg/mLのLC50値で測定。
ND=判定されず。LC50値は、8〜10の異なるタンパク質濃度を新たに孵化したリグス幼虫の個体群に提示し、幼虫に5日間摂食させ、次いで、提供される用量範囲にわたる致死率に関して採点することによって、判定される。
*毒性、1のベースライン値として、TIC807に関して観察されたLD50を使用して、リグス・ヘスペルスに対して観察されるレベルと比較した、増加した活性の倍数に関して表示される。1000μg/mLを超過する著しく大きい量のタンパク質は、リグス・リネオラリスへの高い範囲の毒性用量応答を完了させるために、リグスの食餌中に提供することは不可能であった。したがって、LC50値は、TIC807またはTIC807_M2に関しては、判定されなかった。代わりに、低範囲における4つの用量のLC50推定が実施され、TIC807およびTIC807_M2に関して予想されたLC50値が、223μg/mL超であることを立証した。
上述を考慮して、当業者は、変更は、開示される特定の態様において行うことができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様もしくは類似の結果を依然として得ることができることを理解するべきである。このため、本明細書において開示される特定の詳細は、制限として解釈されないものとする。本出願が優先権の利益を主張する米国仮特許出願第61/621,436号、段落[0002]で言及される配列表、ならびに開示および特許請求される本発明への参考資料、特に、本出願で引用される参考文献および公開特許出願は、それらの全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
本実施例は、TIC807(配列番号2)と比較して、鞘翅目および/もしくは殺線虫活性、または半翅目昆虫種に対する増加した毒性を呈する、昆虫阻害タンパク質を識別および説明するために使用される、反復的(「再帰的」とも称され得る)操作・試験・選択手法のランダムな、組み合わせの、および発明的な態様を例解する。いくつかの設計手法が、リグス種に対するより大きい阻害活性を有するeHTPを操作するために採用され、手法としては、半ランダムな修飾、他の天然Btタンパク質とのTIC807のアライメントにおける差異の特異的修飾、および構造/機能支援設計を含んだが、これらに限定されなかった。多数の段階の操作および試験を実行して(連続して、および同時にの両方)、増加した毒性を呈するTIC807タンパク質変異体を選択した。データが収集された際、設計手法は調節された。この反復的操作・試験・選択手法はまた、eHTPと比較されるTIC807対照タンパク質のクローン作成、発現、精製、およびバイオアッセイ試験を含むステップを含んだが、これに限定されなかった。
アライメントに基づく手法
Cry51:Cry51Aa1(配列番号182)、TIC853(配列番号184)、およびTIC807(配列番号2)のタンパク質メンバの多重配列アライメントを使用して、配列番号2(TIC807)に対する、変動の領域、例えば、195〜201位および211〜219位を識別した。これらの領域は、これらの領域におけるランダムなアミノ酸残基をコードする、縮重したオリゴヌクレオチドプライマーの使用を通じた飽和突然変異に対して標的化された。構築物ライブラリは、宿主細胞におけるその後のタンパク質発現のために調製された。
ポリヌクレオチド構築物は、配列番号2(TIC807)の全長にわたる全ての可能な位置において、単一アラニン置換または二重アラニン置換(アラニン−<親残基>−アラニン)を発現するように操作された。仮説実施例に関しては、表2を参照されたい。
a=親残基はアラニン残基
A=アラニン残基に修飾
S=セリン残基に修飾
本発明のタンパク質の原子構造は、反復的操作・試験・選択手法の最中に判定され、各残基の相対的溶媒露出度(SA%)は、MolsoftのICM−Browser(Molsoft L.L.C.,11199 Sorrento Valley Road,S209,San Diego,CA92121)を使用して判定された。表3中、(A)および(B)の列に示される、実際のSA%は、配列番号185(TIC807_L11M)および配列番号8(TIC807_M2)として記載されるそれぞれのアミノ酸配列を有するタンパク質に関して計算された。TIC807およびTIC853の残基に関して予想されたSA%は、表3中、(A)および(C)の列にそれぞれ列記される。ともに、表3に報告される%SA値は、原子構造の各位置における各残基に関して標準的な伸長配座(Gly−XXX−Gly)における最大溶媒露出面積に対する、水分子によってプローブされる溶媒露出表面積のパーセンテージ(%)として計算される。表3は、Clustal Wアライメントにおいて並べられた残基ごとに、各タンパク質の残基を並べる。100超のSA%は、各残基に対する標準的な伸長配座(Gly−XXX−Gly)における最大溶媒露出面積が、水分子によってプローブされる実際の溶媒露出面積未満である時に、生じ得る。100超のSA%は、100%として表中に報告される。
P2は、図2の表面パッチ[2]におけるアミノ酸を示す。
*は、本明細書において説明される72の主に関連するアミノ酸のうちの1つを示す(図2を参照されたい)。
Clustal Wによって並べられるTIC807_L11M、TIC807_M2、およびTIC853の残基が示される。
#で印される数は、少なくとも約36%のSA%を表す。
36%超のSA%値を有する残基、または配列番号2(TIC807)のS95のCb原子からの約9.2〜12.2オングストロームの半径における、36%超のSA%を有する残基の約3つの残基内の表面パッチ(図2の[1])は、増強されたリグス阻害スペクトルおよび/または改善されたリグス阻害活性を呈するeHTPを提供するように置換することができる、TIC807タンパク質の残基を含む領域として識別された。この表面パッチ領域は、標的昆虫受容体結合活性と関連付けられ得、配列番号2(TIC807)の残基T93、S95、S97、F147、Q149、S151、N180、T182、V251、Q253、およびS255を含む。eHTPは、S95A、F147A、Q149E、および/またはV251Aといった、表面パッチ1のアミノ酸残基の1つ以上の置換を含むことができるが、これらに限定されない。
タンパク質のベータシート領域に位置するあるアミノ酸残基がTIC807の原子構造から識別され、芳香族残基で置換された。より具体的には、折り畳まれたTIC807ベータシート領域のアミノ酸L78、I123、H270、R273、I275が、フェニル(Pheny)アラニン、チロシン、またはトリプトファンで置換された。R273およびI275の芳香族アミノ酸置換が、増強されたリグス阻害スペクトルおよび/または改善されたリグス阻害活性を提供した、それらの残基間で行われた(表4、配列番号32、34、68、92、および122に関するデータを参照されたい)。これらの位置における残基のアミノ酸側鎖は、標的昆虫の膜と相互作用する可能性が高くあり得る。
概して、タンパク質分解に関与すると考えられるグリシン残基は、タンパク質分解開裂動力学を改変するように、セリンで置換された。ループ領域におけるグリシン残基の存在は、より多くの柔軟性、および、したがってタンパク質分解への感受性を付与することができ、これは、昆虫阻害活性を増加させ得るか、または昆虫阻害活性を減少させ得る。構造的に識別されたループ領域における残基は、グリシン残基で置換され、改善は全く観察されなかった。既にグリシンであるループ内の位置(例えば、G18、G24、G27)は、タンパク質分解感受性を低減するための小さい残基であるセリンで置換され、改善は全く観察されなかった。
TIC807(配列番号2)の原子構造は、ライブラリ突然変異のためのループ領域を識別し、続いて、操作された変異体を試験するために使用された。配列番号2(TIC807)のアミノ酸位置211〜216で、ループは、ライブラリ突然変異され、試験された。配列番号2(TIC807)のアミノ酸位置75〜83、161〜167、および267〜276で、近接して連続したループは、ライブラリ突然変異され、試験された。
TIC807の変異体を発現する、総計で2000超のクローン(混合ライブラリクローンを含む)が、TIC807と比較して、リグス種に対して増強されたリグス阻害スペクトルおよび/または改善されたリグス阻害活性について試験された。半ランダムな修飾、特異的修飾、および予測構造関数修飾は、構造モデリング、受容体結合能、金属結合能、オリゴマー形成能、表面電荷分布の均一性、孔形成能、イオンチャネル機能、ならびにTIC807と比較して増強されたリグス阻害スペクトルおよび/または改善されたリグス阻害活性を有するeHTPを識別することを目的とする表面露出パッチの識別を含む。これらのクローンは、バイオアッセイ試験のために発現された。
対照タンパク質TIC807は、バチルス・チューリンゲンシス(Bt)において結晶形態または大腸菌において凝集形態で発現され得る309アミノ酸長さのタンパク質である。その試験変異体は、Btにおいて組み換え発現された。TIC807およびTIC807の変異体の発現特性は、Bt細胞および大腸菌細胞からそれぞれ抽出された優勢な結晶形態および凝集形態である。リグス生物活性について試験するために、試験試料および対照試料は、25mM炭酸ナトリウム緩衝液中に試料を可溶化し、遠心分離によって不溶化材料を除去することによって、リグスバイオアッセイに適合させた。試験試料および対照試料中のタンパク質の量は、総タンパク質法、例えば、ブラッドフォードアッセイ、ELISA法、または同等のものを使用して測定された。ゲル電気泳動は、可溶化組み換えタンパク質の純度およびストック濃度を決定するために使用された。C末端HISタグTIC807タンパク質は、大量のTIC807対照タンパク質の検出、精製、および定量化を容易にするために操作された。C末端HISタグTIC807および非タグTIC807試験試料は、別々にアッセイされ、リグスに対して同等の活性を有することが確認された(実施例4、5、および6を参照されたい)。
本実施例は、リグス属、例えば、リグス・ヘスペルスおよびリグス・リネオラリスを含む異翅目カスミカメムシ科、アムラスカ属、例えば、アムラスカ・デバスタンス、およびエムポアスカ、例えば、エムポアスカ・ファバエ(Empoasca fabae)を含むオオヨコバイ科のメンバが含まれるが、これらに限定されない、半翅目の昆虫の食餌中に提供される時、半翅目の昆虫に対して改善された殺虫活性または増強された殺虫特異性を有するeHTPを例解する。表4Bを含む本実施例は、リグス・ヘスペルスおよびリグス・リネオラリスの両方に対して本発明のBt発現組み換えタンパク質の増強されたリグス阻害スペクトルおよび/または改善されたリグス阻害活性を決定するために使用された摂食アッセイを例解する。組み換え細菌宿主細胞において発現されるタンパク質は、炭酸塩緩衝液中に可溶化され、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分析され、タンパク質濃度は、基準としてウシ血清アルブミン(BSA)を使用してデンシトメトリーによって決定された。この方法で調製されたタンパク質ストック(2X)は、摂食アッセイのための食餌と混合された。
TIC807_M1(配列番号6)、TIC807_M2(配列番号8)、TIC807_M3(配列番号10)、TIC807_M4(配列番号12)、TIC807_M5(配列番号14)、TIC807_M6(配列番号18)、TIC807_M7(配列番号20)、TIC807_M8(配列番号16)、TIC807_M9(配列番号28)、TIC807_M11(配列番号32)、TIC807_M13(配列番号34)、およびTIC807_M12(配列番号36)等であるが、これらに限定されない、本発明のタンパク質が調製され、リグス以外の植物の有害生物に対する生物活性について試験された。
CPB=コロラドハムシ(Leptinotarsa decemlineata);WCR=西洋トウモロコシ根虫(Diabrotica virgifera);ECB=欧州アワノメイガ(Ostrinia nubilalis);南西アワノメイガ(Diatraea grandiosella);CEW=アメリカタバコガ(Helicoverpa zea);FAW=ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda);SGSB=ミナミアオカメムシ(Nezara virudula);NBSB=亜熱帯ブラウンスティンクバグ(brown stink bug)(Euschistus heros);GPA=モモアカアブラムシ(Myzus persicae)。
本実施例は、植物における本発明のタンパク質の発現を例解し、本発明のタンパク質を発現する綿植物が昆虫阻害活性を呈することを実証する。
SEM=標準誤差
Lo 95%=95%信頼区間の下限
Up 95%=95%信頼区間の上限
T分類=最小有意差検定を用いた、F値=101.1756、df=15,44、Pr<0.0001
本実施例は、アルファルファ植物における本発明のタンパク質の発現を説明し、本発明のタンパク質を発現するアルファルファ植物由来の組織が昆虫阻害活性を呈することを実証する。
TIC1415およびTIC807_M13の種々の混合物を含むタンパク質試料が、調製され、バイオアッセイにおいて試験された。TIC1415タンパク質および他のリグス阻害タンパク質は、PCT特許出願公開国際公開第2012/139004号に記載される。試料混合物が、リグス・リネオラリスに与えられ、生物活性アッセイを使用した。また、TIC1415タンパク質のみおよびTIC807_M13のみを、陽性対照として調製した。緩衝液は、陰性対照として使用した。3つすべてのタイプの調製物からの試料は、リグス・リネオラリスに対して致死率を呈し、生存したものの発育を阻止した。致死率および発育阻止スコアは、緩衝液を与えられる昆虫の生物活性スコアと比較して有意であった(表8Aを参照されたい)。データは、拮抗作用がないことを示唆している。追加のバイオアッセイ試験が、相乗および/または相加効果を実証するために、混合物に対して行われる。
‡発育阻止スコアは、0=陰性対照に対する差がない、1=約25%少ない質量、2=約50%少ない質量、および3=約75%少ない質量である、視覚的な質量評価に相当する。8匹の幼虫から成る各々の個体群に関して発育阻止スコアの平均が報告される。
*95%信頼区間で。
Claims (20)
- 配列番号34に記載されるアミノ酸配列を含む昆虫阻害ポリペプチドであって、前記昆虫阻害ポリペプチドは半翅目昆虫種に対する阻害活性を呈する、昆虫阻害ポリペプチド。
- 前記半翅目昆虫種は、リグス(Lygus)種、エムポアスカ(Empoasca)種、およびアムラスカ(Amrasca)種から成る群から選択される、請求項1に記載の昆虫阻害ポリペプチド。
- 前記半翅目昆虫種は、リグス・ヘスペルス(Lygus hesperus)、リグス・リネオラリス(Lygus lineolaris)、アムラスカ・デバスタンス(Amrasca devastans)、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項2に記載の昆虫阻害ポリペプチド。
- 配列番号201に記載される配列と99%同一性であるヌクレオチド配列を含む、請求項1から3のいずれかに記載の昆虫阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは、配列番号201に記載される配列と100%同一性である、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- アグロバクテリウム、リゾビウム、バチルス、エシェリキア、シュードモナス、およびサルモネラから成る群から選択される細菌宿主細胞、または植物宿主細胞である、請求項4または5に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞は、バチルス・チューリンゲンシスまたは大腸菌である、請求項6に記載の宿主細胞。
- 配列番号34に記載されるアミノ酸配列を含む昆虫阻害ポリペプチドをコードする配列番号201に記載される配列と99%同一性であるポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック植物またはその部分。
- 前記ポリヌクレオチドは、配列番号201に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項8に記載のトランスジェニック植物またはその部分。
- 前記トランスジェニック植物は、アルファルファ、アーモンド、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ブロッコリ、キャベツ、アブラナ属、ナス(brinjal)、ニンジン、キャッサバ、ヒマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、セロリ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、綿、ウリ、キュウリ、ダグラスファー、ナス(eggplant)、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、グアー、ホップ、リーキ、マメ類、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ネクタリン、ナッツ、オートムギ、オクラ、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、パパイヤ、エンドウ、モモ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、コメ、台木、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、大豆、ホウレンソウ、スクオッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、およびコムギから成る群から選択される、請求項8に記載のトランスジェニック植物またはその部分。
- 前記トランスジェニック植物またはその部分は綿植物である、請求項10に記載のトランスジェニック植物またはその部分。
- 前記部分は、花粉、胚珠、種子、実、葉、花、茎、根、および細胞から成る群から選択される、請求項8に記載のトランスジェニック植物またはその部分。
- 請求項1に記載の昆虫阻害ポリペプチドまたは前記昆虫阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、昆虫阻害組成物。
- 前記昆虫阻害ポリペプチドとは異なり、鱗翅目、鞘翅目、異翅目、または同翅目の1つ以上の有害生物種に対する活性を呈する少なくとも1つの昆虫阻害剤をさらに含む請求項13に記載の昆虫阻害組成物であって、前記少なくとも1つの昆虫阻害剤は、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害dsRNA分子、および昆虫阻害化学物質から成る群から選択される、昆虫阻害組成物。
- 半翅目の有害生物を制御する方法であって、前記半翅目の有害生物に阻害量の請求項1から3のいずれかに記載の昆虫阻害ポリペプチドを与えることを含む、方法。
- 前記与えることは、綿植物において前記昆虫阻害ポリペプチドを発現させることによる、請求項15に記載の方法。
- 半翅目の有害生物を制御する方法であって、前記半翅目の有害生物を請求項8に記載のトランスジェニック植物またはその部分に曝露することを含み、前記トランスジェニック植物またはその部分は、半翅目阻害量の前記昆虫阻害ポリペプチドを発現する、方法。
- 請求項8に記載のトランスジェニック植物またはその部分から得られる商品産物であって、前記商品産物は、植物バイオマス、油、食物、動物飼料、粉、フレーク、ふすま、リント、および外皮から成る群から選択され、検出可能な量の前記昆虫阻害ポリペプチドを含む、商品産物。
- 植物を半翅目の有害生物の侵入に対して抵抗性にする方法であって、操作された半翅目の毒素タンパク質(eHTP)をコードする配列番号201に記載されるヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入するステップと、前記植物細胞から、昆虫阻害量のeHTPを発現するトランスジェニック植物を再生するステップと、半翅目の有害生物の侵入抵抗を前記トランスジェニック植物の特性として実証するステップと、を含み、
前記植物は、任意に、
a.双子葉植物および単子葉植物から成る群から選択されるか、
b.アルファルファ、アーモンド、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ブロッコリ、キャベツ、アブラナ属、ナス(brinjal)、ニンジン、キャッサバ、ヒマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、セロリ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、綿、ウリ、キュウリ、ダグラスファー、ナス(eggplant)、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、グアー、ホップ、リーキ、マメ類、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ネクタリン、ナッツ、オートムギ、オクラ、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、パパイヤ、エンドウ、モモ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、コメ、台木、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、大豆、ホウレンソウ、スクオッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、およびコムギから成る群から選択されるか、または
c.前記eHTPとは異なる昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害dsRNA分子、および昆虫阻害化学物質から成る群から選択される補助的薬剤を含み、
前記eHTPとは異なる前記昆虫阻害タンパク質は、Cry1毒素、Cry2毒素、Cry5毒素、Cry7毒素、Cry9毒素、およびVIP3毒素から成る群から選択され、
前記昆虫阻害化学物質は、ピレトリンおよび合成ピレスロイド;オキサジアジン(oxadizine)誘導体;クロロニコチニル;ニトログアニジン誘導体;トリアゾール;有機リン酸;ピロール;ピラゾール;フェニルピラゾール;ジアシルヒドラジン;生物学的/発酵産物;およびカルバメートから成る群から選択される、方法。 - 請求項19に記載の方法であって、前記半翅目昆虫有害生物は、植物虫(カスミカメムシ科を含む)、セミ科からのセミ、ヨコバイ(例えば、エンポアスシニ(Empoascini)族を含むオオヨコバイ科からのエムポアスカ(Empoasca)種、アムラスカ(Amrasca)種、例えば、アムラスカ・ビグッチュラ(Amrasca biguttula)、アムラスカ・デバスタンス、アウストロアスカ・ヴィリジグリセア(Austroasca viridigrisea)、アシンメトラスカ・デセデンス(Asymmetrasca decedens)、エムポアスカ・デシピエンス(Empoasca decipiens)、エムポアスカ・ディスティングエンダ(Empoasca distinguenda)、エムポアスカ・ドリチ(Empoasca dolichi)、エムポアスカ・ファバエ(Empoasca fabae)、エムポアスカ・ケリ(Empoasca kerri)、エムポアスカ・クラエメリ(Empoasca kraemeri)、エムポアスカ・オヌキイ(Empoasca onukii)、エムポアスカ・サカイイ(Empoasca sakaii)、エムポアスカ・スミチ(Empoasca smithi)、エムポアスカ・ビティス(Empoasca vitis)、ヤコビアスカ・リビカ(Jacobiasca lybica)、ソナサスカ・ソラナ(Sonasasca Solana)、エリスロニューリニ(Erythroneurini)族、例えば、エムポアスカナラ・ナグプレンシス(Empoascanara nagpurensis)、タイアアサメンシス(Thaiaassamensis)、ジグニディア・クユミ(Zygnidia quyumi)、ニルバニアエ(Nirvaniae)族、ソフォニア・ルフォファスシア(Sophonia rufofascia)、ウンカ科、例えば、ニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilapoarvata lugens)、ソガテラ・フルシフェラ(Sogatella furcifera)、サッポロトビウンカ(Unkanodes sapporonus)、およびアシブトウンカ科、例えば、ゾフィウマ・ロブラタ(Zophiuma lobulata))、ウンカ(ビワハゴロモ上科およびウンカ科から)、ツノゼミ(ツノゼミ科から)、キジラミ(キジラミ科から)、コナジラミ(コナジラミ科から)、アブラムシ(アブラムシ科から)、ネアブラムシ(ネアブラムシ科から)、コナカイガラムシ(コナカイガラムシ科から)、カイガラムシ(カタカイガラムシ科、マルカイガラムシ科、およびワタフキカイガラムシ科から)、グンバイムシ(グンバイムシ科から)、カメムシ(カメムシ科から)、ナガカメムシ(例えば、ブリッサス(Blissus)種、およびナガカメムシ科からの他の種子虫)、アワフキムシ(アワフキムシ科から)、ヘリカメムシ(ヘリカメムシ科から)、ツツガムシおよびアカホシカメムシ(ホシカメムシ科から)、アクロステルヌム・ヒラレ(Acrosternum hilare)(アオカメムシ)、アナサ・トリスティス(Anasa tristis)(ヘリカメムシ)、ブリッサス・ロイコプテルス・ロイコプテルス(Blissus leucopterus leucopterus)(ヒメコバネナガカメムシ)、コリスカ・ゴシピイ(Corythuca gossypii)(コットンレースバグ(cotton lace bug))、シルトペルティス・モデスタ(Cyrtopeltis modesta)(トマトバグ(tomato bug)、ディスデルクス・スツレルス(Dysdercus suturellus)(アカホシカメムシ)、ユースキスツス・セルバス(Euschistus servus)(ブラウンスティンクバグ(brown stink bug))、ユースキスツス・バリオラリウス(Euschistus variolarius)(ワンスポッテッドスティンクバグ(one−spotted stink bug))、グラプトステツス(Graptostethus)種(種子虫の複合)、レプトグロッスス・コルクルス(Leptoglossus corculus(リーフ・フッテッドパインシードバグ(leaf−footed pine seed bug))、リグス・リネオラリス(ミドリメクラガメ)、リグス・ヘスペルス(ウエスタンターニッシュプラントバグ(western tarnish plant bug))、ネザラ・ビリヅラ(Nezara viridula)(ミナミアオカメムシ)、オエバルス・プグナクス(Oebalus pugnax)(イネカメムシ)、オンコペルツス・ファスシアツス(Oncopeltus fasciatus)(ラージミルクウィードバグ(large milkweed bug))、およびシューダトモスセリス・セリアツス(Pseudatomoscelis seriatus)(ワタノミハムシ)から成る群から選択される、方法。
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