ES2743916T3 - Proteínas tóxicas para especies de insectos hemípteros - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido inhibidor de insectos que comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 34, en el que dicho polipéptido inhibidor de insectos exhibe actividad inhibitoria contra una especie de insectos del orden Hemiptera.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas tóxicas para especies de insectos hemípteros
Campo de la invención
La presente invención se refiere de forma general al campo de las proteínas inhibidoras de insectos. En particular, la presente invención se refiere a proteínas que exhiben actividad inhibidora de insectos contra plagas agrícolamente relevantes de plantas y semillas de cultivo, particularmente especies hemípteras de plagas de insectos.
Antecedentes de la invención
Proteínas inhibidoras de insectos derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt) no son tóxicos para los humanos, vertebrados y plantas. Estas proteínas también son biodegradables, seguras y eficaces en la lucha contra insectos plaga. Algunas de estas proteínas se han usado y se están usando para luchar contra las plagas agrícolas relevantes de las plantas de cultivo rociando plantas con formulaciones que contienen estas proteínas o con microorganismos que las expresan, tratando semillas con tratamientos que contienen estas proteínas o expresando estas proteínas en plantas de cultivo y semillas de plantas de cultivo como protectores incorporados a las plantas.
Ciertas especies de Hemípteros, particularmente los bichos Amrasca, Empoasca y Lygus, son plagas de algodón y alfalfa, y típicamente solo se luchan usando productos químicos de amplio espectro, por ejemplo, endosulfan, acefato y oxamilo, que pueden persistir y son perjudiciales para el medio ambiente. Unas pocas proteínas Bt se han desarrollado en formulaciones o como rasgos transgénicos en plantas de cultivo para uso comercial de los agricultores para luchar contra las especies de plagas de coleópteros y lepidópteros, pero no se han desarrollado proteínas Bt para su uso en la lucha comercial contra especies de plagas de hemípteros.
Se han informado proteínas tóxicas específicas de hemípteros en la técnica. TIC807 es una proteína de Bacillus thuringiensis desvelada en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. US 2008-0295207 A1 y en el documento WO 2008/134072 A2 como siendo tóxica para las especies de plagas de hemípteros. También se ha desvelado una proteína Cry51Aa1 informada como tóxica para las especies de lepidópteros que se parece mucho a la secuencia de aminoácidos de TIC807 (Huang y col., (2007) J. Invertebr. Pathol. 95(3), 175-180), pero no se informó actividad específica de hemípteros. Baum y col. desvelaron TIC853, una proteína informada como tóxica para especies de plagas Lygus (Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. US 2010-0064394 A1). Se informó que una proteína denominada AXMI-171 presentaba algo de inhibición limitada de los insectos hemípteros (Publicación de solicitud de patente de EE.UU. US2010-0298207 A1, ejemplo 18), particularmente Lygus hesperus.
Todas estas proteínas exhiben un intervalo estrecho de toxicidad solo contra Lygus hesperus y exhiben efectos tóxicos contra otras especies de plagas Lygus solo a dosis altas que no se consideran alcanzables por expresión en plantas. En comparación con las proteínas tóxicas de hemípteros en la técnica anterior, existe la necesidad de proteínas de toxinas que puedan usarse sobre y en plantas que exhiban un amplio intervalo de huéspedes contra especies de plagas hemípteras y a dosis eficaces de baja concentración.
El documento US 7.524.810 desvela variantes de la proteína insecticida Cry 34 con propiedades mejoradas en comparación con las proteínas Cry34 de tipo silvestre.
Breve sumario de la invención
Las proteínas recombinantemente diseñadas por ingeniería tóxicas para hemípteros descritas en el presente documento (denominadas en el presente documento "proteínas de toxinas diseñadas por ingeniería genética", "proteínas tóxicas diseñadas por ingeniería genética", "proteínas tóxicas de hemípteros modificadas" o "proteínas de toxina de hemípteros modificadas", también se denominan en el presente documento en forma truncada "eHTP" cuando se hace referencia en grupos de dos o más de tales proteínas y "eHTP" cuando se hace referencia singularmente) son derivados de toxinas insecticidas de Bacillus thuringiensis de origen natural, TIC807 (SEQ ID NO: 2), TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO: 182), TIC853 (SEQ ID NO: 184) y AXMI-171 (SEQ ID NO: 206) se han descrito previamente que exhiben actividad de bio-lucha dirigida contra las especies de plagas de hemípteros, particularmente especies de insectos Lygus hesperus (referencias citadas en otra parte en el presente documento). Las proteínas tóxicas para insectos hemípteros recombinantes desveladas en el presente documento son particularmente tóxicas para los insectos de las especies de plagas de insectos Amrasca, Empoasca y Lygus y para otras especies de plagas de insectos que están filogenéticamente relacionadas con cada una de estas especies de plagas de insectos, y adicionalmente para las plagas de insectos que se alimentan de las plantas usando un mecanismo de perforación y succión usado por las especies de plagas Amrasca, Empoasca y Lygus del orden Hemiptera. A diferencia de las toxinas insecticidas precursoras TIC807 (SEQ ID NO: 2), TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO: 182), TIC853 (SEQ ID NO: 184) y AXMI-171 (SEQ ID NO: 206) de las que derivan, que requieren dosis moderadamente altas a altas de proteína para lograr efectos tóxicos sobre una especie de Lygus y exhiben efectos tóxicos muy bajos o prácticamente indetectables sobre una segunda especie estrechamente relacionada de Lygus, las proteínas eHTP de la presente invención exhiben sorprendentes e inesperados efectos tóxicos a bajas dosis contra plagas de insectos del orden Hemiptera, incluyendo los efectos tóxicos de la gama de huéspedes que abarcan el espectro de plagas dentro del orden.
Los eHTP de la presente invención exhiben un aumento o mayor actividad inhibitoria de Lygus y espectro de especies de plagas diana en comparación con la actividad y el espectro de especies de plagas diana de las proteínas de Bacillus thuringiensis expuestas en SEQ ID NO: 2. La presente invención proporciona de esta manera un eHTP que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, que exhibe actividad inhibitoria contra una especie de insecto del orden Hemiptera. Las especies de plagas de hemípteros diana inhibidas por los eHTP de la presente invención incluyen al menos Lygus hesperus, Lygus lineolaris, Empoasca fabae y Amrasca devastans, así como otras plagas dentro del orden Hemiptera que están filogenéticamente relacionadas entre sí o que usan un enfoque de perforación y succión para alimentarse de las plantas.
Algunos procedimientos para luchar contra una plaga de hemípteros poniendo en contacto la plaga con una cantidad inhibitoria de hemípteros de un eHTP de la presente invención, así como una composición inhibidora de insectos que contiene al menos una cantidad de lucha contra hemípteros (o cantidad inhibidora de hemípteros) de uno o más de los eHTP de la presente invención, también se proporcionan. Una composición inhibidora de insectos puede comprender cualquiera de los eHTP desvelados en el presente documento. La plaga hemípteros puede estar en un campo de algodón, un campo de soja o un campo de alfalfa. Las composiciones tóxicas de hemípteros o de lucha contra hemípteros pueden contener al menos uno o más eHTP junto con un agente suplementario que se selecciona de una proteína inhibidora de insectos, una molécula de ARNbc inhibidora de insectos y un producto químico inhibidor de insectos. Cada uno de estos agentes puede exhibir propiedades de lucha contra hemípteros, puede exhibir propiedades para luchar contra plagas no relacionadas con especies de hemípteros tales como especies de lepidópteros o especies de coleópteros, o puede exhibir propiedades de modo dual de acción en las que una o más especies de hemípteros y una o más especies de lepidópteros o coleópteros se luchan simultáneamente.
Se proporcionan polinucleótidos recombinantes que codifican los eHTP de la presente invención. También se proporcionan microbios que contienen los polinucleótidos de la presente invención y dichos polinucleótidos dentro de dichos microbios están posicionados funcionalmente dentro de casetes de expresión diseñados para expresar los eHTP de la presente invención a partir de elementos reguladores genéticos funcionales unidos operativamente. Los microbios pretenden incluir células bacterianas, así como células vegetales transgénicas. Dichas células vegetales transgénicas pueden regenerarse en plantas completas o partes de plantas que también contienen el polinucleótido recombinante. Algunos procedimientos para luchar contra una plaga de hemípteros exponiendo la plaga al microbio, ya sea una célula bacteriana o una célula vegetal transgénica, planta o parte de planta, cada uno de los cuales expresa una cantidad inhibidora de hemípteros de un eHTP también se proporcionan. El polinucleótido recombinante puede contener la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 201. El polinucleótido recombinante puede comprender además una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más agentes inhibidores de insectos que son diferentes del eHTP codificado por el polinucleótido recombinante. La parte de la planta transgénica puede ser una semilla, una cápsula, una hoja, una flor, polen, un tallo, una raíz o cualquier porción de la misma. La parte de la planta transgénica puede ser una porción no regenerable de la semilla, cápsula, hoja, flor, tallo o raíz. También se proporcionan procedimientos para luchar contra una plaga de hemípteros, que comprende exponer el microbio transgénico, bacterias, célula vegetal, planta o parte de la planta a la plaga diana, en los que el microbio, bacterias, célula vegetal, planta o parte de la planta expresa una cantidad inhibidora de hemípteros de un eHTP codificado por el polinucleótido recombinante.
Los procedimientos para hacer que una planta sea resistente a la infestación de plagas de hemípteros mediante la introducción del polinucleótido recombinante de la invención en una célula vegetal, la regeneración a partir de dicha célula vegetal de una planta transgénica que expresa una cantidad inhibidora de insectos de dicho polipéptido inhibidor de insectos; y la demostración de resistencia a la infestación de plagas de hemípteros como una propiedad de dicha planta transgénica también se proporcionan. Los procedimientos incluyen la introducción del polinucleótido recombinante que codifica los eHTP proporcionados en el presente documento en una célula vegetal; la regeneración a partir de dicha célula vegetal de una planta transgénica que expresa una cantidad inhibidora de insectos de dicho polipéptido inhibidor de insectos; y la demostración de la resistencia a la infestación de plagas de hemípteros como una propiedad de dicha planta transgénica.
Otras realizaciones, rasgos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los ejemplos y las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra la mortalidad de especies de Lygus representadas frente a la concentración de proteína eHTP. La Figura 1A ilustra la mortalidad de poblaciones de Lygus hesperus en respuesta a diversas concentraciones de cuatro eHTP diferentes en comparación con una muestra de control que contiene la proteína TIC807 natural. La Figura 1B ilustra la mortalidad de poblaciones de Lygus lineolaris en respuesta a diversas concentraciones proteicas de tres eHTP diferentes en comparación con una muestra de control que contiene la proteína TIC807 natural.
La Figura 2 ilustra un diagrama de cinta de la estructura atómica de una proteína tóxica de hemípteros de la presente invención que muestra las posiciones relativas de los resultados eficaces que aumentan los efectos tóxicos y/o amplía la especificidad del intervalo del huésped en comparación con la posición relativa de la misma posición de aminoácidos dentro de una TIC807 o proteína relacionada. Se ilustran dos parches de superficie mediante esferas que rodean posiciones particulares de residuos dentro de la estructura atómica en el diagrama de cinta: [1] una esfera tiene un radio atómico de 9,2 a 12,2 Angstroms desde el átomo de carbono beta de S95 (con respecto a la posición S95 como se establece en SEQ ID NO: 2); [2] otra esfera tiene un radio atómico de aproximadamente 9,2 a aproximadamente 12,2 Angstroms desde el átomo de carbono beta de P219 (en relación con la posición P219 como se establece en la SEC ID NO: 2). Los cambios en los aminoácidos dentro de la estructura de la cinta que caen dentro de estas esferas son eficaces provocando mayores propiedades tóxicas y efectos tóxicos de intervalo de huésped más amplios en comparación con una proteína que tiene un aminoácido natural en esa posición particular.
La Figura 3 es una vista de gráfico que ilustra la mortalidad de la población de especies de Lygus para trece eHTP diferentes en comparación entre sí y con la proteína TIC807 natural.
Descripción detallada
La presente solicitud describe eHTP (proteínas tóxicas de especies de hemípteros diseñadas por ingeniería genética). Los eHTP desvelados en el presente documento deben distinguirse de proteínas tales como TIC807, TIC853, Cry51Aa1 y AXMI-171, que se conocen en la técnica y no deben considerarse dentro del ámbito o la definición del término eHTP, ya que las proteínas de la técnica anterior no están diseñadas para exhibir propiedades tóxicas mejoradas dirigidas a una o más especies de plagas de hemípteros y no exhiben niveles de actividad inhibitoria de amplio intervalo de huéspedes. Los eHTP muestran de manera sorprendente e inesperada altos niveles de actividad tóxica contra los hemípteros y las especies de plagas relacionadas. Un rasgo adicional de estos eHTP que es aún más inesperado y sorprendente es el descubrimiento de que estas proteínas exhiben propiedades tóxicas de intervalo de huésped más amplias en comparación con las proteínas progenitoras que proporcionan la base fundamental para los eHTP desvelados en el presente documento. Las proteínas de la toxina del andamio fundacional o basal, tales como TIC807 (SEQ ID NO: 2). Cry51Aa1 (SEQ ID NO: 8), TIC853 (SEQ ID NO: 184) y AXMI-171 (SEQ ID NO: 206) no exhiben la amplitud y el ámbito de la actividad biológica anti-hemípteros o el intervalo de huésped de las proteínas eHTP desveladas en el presente documento.
Más de 2000 variantes de secuencias de aminoácidos diferentes de proteínas tóxicas de hemípteros derivadas de especies de Bacillus thuringiensis se probaron para identificar las inserciones, sustituciones o deleciones de aminoácidos específicas descritas en el presente documento que confieren un espectro inhibidor expandido del intervalo de huéspedes de especies de hemípteros y también proporcionan una actividad inhibidora de especies de hemípteros dramáticamente aumentada en comparación con el espectro y la actividad de la proteína de armazón de referencia, TIC807, TIC853 y Cry51Aa1. Los restos de aminoácidos se identifican en las proteínas del andamio de referencia que (a) pueden modificarse para producir un espectro inhibidor de hemípteros mejorado y/o mejorar la actividad inhibitoria de Lygus con respecto a una o más de las proteínas de armazón, (b) se acumulan en parches superficiales de una proteína inhibidora de insectos plegada que exhibe la estructura de pliegue de una o más de las proteínas de armazón, y/o (c) se producen en posiciones específicas de una o más de la secuencia de aminoácidos de la proteína de armazón que son eficaces disminuyendo la dosis eficaz media de las proteínas eHTP resultantes para luchar contra una especie de hemíptero y ampliar el intervalo de especies de hemípteros que están afectadas por la proteína eHTP.
Las especies de plagas hemípteros pretenden significar insectos que se alimentan de plantas y tejidos vegetales cortando o perforando la superficie exterior de la planta diana y después consumen exudados de plantas maceradas que se acumulan en la zona de corte o perforación al chupar o absorber los exudados agrupados. Tales insectos incluyen adultos y ninfas, incluyendo la siguiente lista de bichos de plantas: la Familia Miridae, cigarras de la Familia Cicadidae, saltamontes (por ejemplo, Empoasca spp., Amrasca spp.) de la Familia Cicadellidae, saltahojas de las Familias Fulgoroidea y Delphacidae, salta árboles de la Familia Membracidae, psílidos de la Familia Psyllidae, moscas blancas de la Familia Aleyrodidae, pulgones de la Familia Aphididae, filoxera de la Familia Phylloxeridae, cochinillas de la Familia Pseudococcidae, cochinillas placa de las Familias Coccidae, Diaspididae y Margarodidae, chinches de encaje de la Familia Tingidae, chinches de la Familia Pentatomidae, chinches (por ejemplo, Blissus spp.) y otros insectos de semillas de la Familia Lygaeidae, chinches de la Familia Cercopidae, chinches de la Familia Coreidae y chinches rojas y tintes de algodón de la Familia Pyrrhocoridae. Otras plagas del orden Hemiptera incluyen Acrosternum hilare (chinche verde), Anasa tristis (chinche de la calabaza), Blissus leucopterus leucopterus (insecto chinchudo), Corythuca gossypii (insecto de encaje del algodón), Cyrtopeltis modesta (chinche del tomate), Dysdercus suturellus (teñidor de algodón), Euschistus servus (chinche marrón), Euschistus variolarius (chinche de una mancha), Graptostethus spp. (complejo de chinches de semillas), Leptoglossus corculus (chinche de hoja de pino de patas de hoja), Lygus lineolaris (chinche de planta empañada), Lygus hesperus (chinche de la planta empañada del oeste), Nezara viridula (chinche verde del sur), Oebalus pugnax (chinche de arroz), Oncopeltus fasciatus (chinche del algodoncillo) y Pseudatomoscelis seriatus (pulguilla del algodón). Más específicamente, la familia Cicadellidae incluye la tribu Empoascini, por ejemplo, Amrasca biguttula, Amrasca devastans, Austroasca viridigrisea, Asymmetrasca decedens, Empoasca decipiens, Empoasca distinguenda, Empoasca dolichi, Empoasca fabae, Empoasca kerri, Empoasca kraemeri, Empoasca onukii, Empoasca sakaii, Empoasca smithi, Empoasca vitis, Jacobiasca lybica, Sonasasca Solana, la tribu Erythroneurini, por ejemplo, Empoascanara nagpurensis, Thaia assamensis, Zygnidia quyumi, la tribu Nirvaniae, por ejemplo, Sophonia rufofascia, la Familia Delphacidae, por ejemplo, Nilapoarvata lugens, Sogatella furcifera, Unkanodes sapporonus y la Familia Lophopidae, por ejemplo, Zophiuma lobulata.
Los eHTP desvelados en el presente documento contienen una o más modificaciones de la secuencia de aminoácidos en comparación con una o más de las proteínas de armazón, incluyendo sustituciones y eliminaciones, de restos de aminoácidos en setenta y dos (72) posiciones de aminoácidos diferentes. Tales modificaciones proporcionan eHTP con mayor toxicidad y/o un espectro inhibidor mejorado contra los insectos hemípteros en comparación con una o más de las proteínas de andamio que incluyen TIC807 (SEQ ID NO: 2), o proteínas relacionadas tales como TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8), Cry51Aal (SEQ ID NO: 182) y TIC853 (SEQ ID NO: 184). Los eHTP incluyen modificaciones de al menos una sustitución de aminoácidos o una eliminación de aminoácidos en cualquiera de estas setenta y dos posiciones, descrito como "X" en la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 180 pero no incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 182, o SEQ ID NO: 184. Los eHTP desvelados en el presente documento también exhiben un espectro inhibidor de hemípteros mejorado y/o una actividad inhibidora de hemípteros mejorada en comparación con el espectro y la actividad de las proteínas de base o de armazón.
Los eHTP incluyen al menos una modificación de aminoácidos de las posiciones relativas de TIC807 (SEQ ID NO: 2) como se establece anteriormente en el párrafo [0009]. Los eHTP también pueden incluir al menos dos, tres, cuatro, o más de estas sustituciones y/o deleciones de aminoácidos mencionadas anteriormente y también pueden incluir al menos dos, tres, cuatro, o más de estas sustituciones y/o deleciones de aminoácidos, así como una deleción de cualquiera de los tres aminoácidos contiguos dentro de los restos 196-201 de la SEQ ID NO: 2. Por consiguiente, los eHTP incluyen proteínas establecidas como SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO : 63, SEQ ID NO : 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO : 70, SEQ ID NO 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO : 77, SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO : 84, SEQ ID NO : 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO 91, SEQ ID NO : 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO : 98, SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 202 y SEQ ID NO: 204 y fragmentos inhibidores de insectos de las mismas.
Los eHTP descritos en este documento exhiben cualquier secuencia de aminoácidos diferente de una o más de las proteínas de armazón, incluyendo SEQ ID NO: 2 (TIC807), en al menos una posición de aminoácido donde el resto de aminoácido diferente (i) tiene una accesibilidad relativa de solvente de aminoácido de al menos el 15 % a al menos el 36 % en comparación con las mismas posiciones de restos en una cualquiera o más de las proteínas de armazón; y/o (ii) se encuentra dentro de una distancia de aproximadamente 3 restos de aminoácidos consecutivos de un aminoácido que tiene al menos del 15 % a al menos el 36 % de accesibilidad relativa al disolvente en comparación con las posiciones correspondientes de restos de aminoácidos en la secuencia primaria de aminoácidos de una o más de las proteínas de armazón, y exhibe un espectro inhibidor de hemípteros ampliado y/o una actividad inhibidora de hemípteros aumentada en comparación con la actividad correlacionada con una o más de las proteínas de armazón. Las palabras "espectro aumentado" pretenden significar, con referencia a dos proteínas diferentes que exhiben efectos tóxicos para una sola plaga particular, la proteína que exhibe un espectro aumentado exhibe efectos tóxicos para esa plaga individual en particular, así como para una o más plagas dentro del mismo orden filogenético o para una o más plagas diferentes en uno o más órdenes filogenéticos diferentes que no sean el orden en el que plaga pertenece. Las palabras "aumento de la actividad inhibidora de hemípteros" pretenden significar que una proteína particular que exhibe dicho aumento de actividad requiere, en condiciones normalizadas, una menor cantidad de esa proteína para lograr un efecto particular, tales como mortalidad, retraso en el crecimiento, morbilidad, cese de la alimentación u otro efecto fenotípico medible sobre una sola plaga particular, que una proteína de control.
Los eHTP exhiben una secuencia de aminoácidos que difiere de una o más de las proteínas del andamio, incluyendo particularmente TIC807, en al menos un resto de aminoácido ubicado dentro de al menos uno de los dos parches de superficie diferentes de una proteína inhibidora de insectos plegada (véanse la Figura 2 y los datos de la Tabla 3). Un parche de superficie se define como la inclusión de los restos de aminoácidos abarcados dentro de una esfera que tiene un radio atómico de 9,2 a 12,2 Angstroms (Figura 2, esfera [1]) con respecto al átomo de carbono beta (Cb) de Ser95 como se establece en SEQ ID NO: 2 cuando esa proteína se pliega en una estructura tridimensional en condiciones fisiológicas; que incluye los restos Thr93, Ser95, Ser97, Phe147, Gln149, Ser151, Asn180, Thr182, Val251, Gln253 y Ser255. Como se usa en el presente documento, la frase "átomo de Cb" se refiere al átomo de carbono beta en la cadena lateral del resto de aminoácido. El átomo de Cb es, por lo tanto, el primer carbono en la cadena lateral de la proteína que está presente en todos los restos de aminoácidos, con la excepción de los restos de Glicilo. Con referencia a la Figura 1, los eHTP pueden incluir una o más sustituciones conservativas o no conservativas de los restos de aminoácidos del parche de superficie [1] T93, S95, S97, F147, Q149, S151, N180, T182, V251, Q253 y S255 o los aminoácidos equivalentes dentro de una o más de las proteínas de armazón, particularmente SEQ ID NO: 2 (TIC807). Los eHTP pueden incluir una o más sustituciones de restos de aminoácidos del parche superficial [1] tales como: T93A; S95A, S95V, S95L o S95I; F147T, F147C, F147D, F147G, F147E, F147Y, F147M, F147N, F147Q, F147H, F147R, F147W, F147P, F147A, F147V, F147L o F147I; Q149A, Q149C, Q149F, Q149E o Q149D; S151A; N180D; T182A; V251E o V251A y/o Q253R. El otro o segundo parche de superficie que se ha identificado como restos de aminoácidos que son receptivos a modificaciones que son eficaces para conferir una bioactividad inhibitoria mejorada de hemípteros en forma de eHTP desveladas en el presente documento se define como la inclusión de los restos de aminoácidos incluidos dentro de una esfera que tiene un átomo atómico de 9,2 a 12,2 Angstroms (Figura 2, esfera [2]) con respecto al átomo de carbono beta de Pro219 o la posición de aminoácido equivalente en una o más de las proteínas del andamio, particularmente como se establece en SEQ ID NO: 2, cuando cualquiera de las proteínas de armazón aplicables se pliega en una estructura tridimensional en condiciones fisiológicas, que incluye los restos Val10, Ile14, Asn22, Asn23, Gly24, Ile25, Gln26, Gly27, Phe30, Gln38, Ile39, Asp40, Thr41, Ile43, Ser193, Thr194, Glu195, His196, Tyr197, Ser198, His199, Tyr200, Ser201, Gly202, Tyr203, Pro204, Ile205, Leu206, Thr207, Trp208, Ile209, Ser210, Tyr216, Ser217, Gly218, Pro219, Pro220, Met221, Ser222, Trp223, Tyr224, Phe225, Asn239 y Val244. Tales eHTP pueden incluir una o más sustituciones de restos de aminoácidos conservativas o no conservativas y/o una o más deleciones de aminoácidos dentro del parche de superficie [2] incluyendo Val10, Ile14, Asn22, Asn23, Gly24, Ile25, Gln26, Gly27, Phe30, Gln38, Ile39, Asp40, Thr41, Ile43, Ser193, Thr194, Glu195, His196, Tyr197, Ser198, His199, Tyr200, Ser201, Gly202, Tyr203, Pro204, Ile205, Leu206, Thr207, Trp208, Ile209, Ser210, Tyr216, Ser217, Gly218, Pro219, Pro220, Met221, Ser222, Trp223, Tyr224, Phe225, Asn239 y Val244 de SEQ ID NO: 2 (TIC807). Los eHTP pueden incluir una o más sustituciones y/o deleciones dentro de los restos de aminoácidos ubicados dentro del parche de superficie [2], tales como: una deleción de tres restos de aminoácidos contiguos en la secuencia His196, Tyr197, Ser198, His199, Tyr200, Ser201; Ser217Asn, Ser217Gln, Ser217Arg; y/o Pro219Arg, Pro219Asn, Pro219Gln. Los eHTP pueden incluir una o más sustituciones y/o deleciones de restos de aminoácidos dentro del parche de superficie [2], tales como: una eliminación de cualquiera de los tres restos contiguos HisTyrSer en la secuencia His196, Tyr197, Ser198, His199, Tyr200, Ser201; Ser217Asn, Ser217Gln, Ser217Arg; y/o Pro219Arg, Pro219Asn, Pro219Gln, Un eHTP puede tener al menos una modificación de aminoácidos en cada uno de los dos parches de superficie mencionados anteriormente de la proteína inhibidora de insectos plegada. El eHTP puede tener una, o una combinación de más de una modificación en los restos T93, S95, F147, Q149, S151, N180, T182, H196, Y197, S198, H199, Y200, S201, W208, S217, P219, W223, N239, V244 o V251 en relación con la SEQ ID NO: 2 (TIC807). Pueden realizarse cambios conservativos de aminoácidos sustituyendo un aminoácido ácido, básico, neutro polar o neutro de tipo no polar con otro aminoácido del mismo tipo. Se pueden hacer cambios de aminoácidos no conservativos sustituyendo un aminoácido ácido, básico, neutro polar o neutro de tipo no polar con un aminoácido de un tipo diferente. Adicionalmente, de las proteínas eHTP enumeradas en la Tabla 4B, los 267 son variantes de secuencia de aminoácidos que exhiben una toxicidad aumentada para Lygus spp. en comparación con una o más de las proteínas de andamio, incluyendo la proteína de andamio TIC807. Solo diez de estas variantes de secuencia de aminoácidos exhiben restos de aminoácidos modificados en comparación con una o más de las proteínas de armazón que se colocan fuera de los dos parches de superficie a los que se hace referencia.
La técnica anterior enseña problemas de solubilidad asociados a las proteínas de armazón. Los eHTP exhiben una solubilidad mejorada en comparación con las proteínas de armazón y generalmente exhiben una solubilidad aumentada a un pH de menos de 9,0, en contraste con el perfil de solubilidad observado de una o más de las proteínas de armazón. Este aumento de la solubilidad a un pH más fisiológico es evidente cuando el eHTP se expresa en E. coli, en una célula vegetal, en un citoplasma de célula vegetal, un apoplasto de célula vegetal o en uno dirigido para importar a un plastidio de una célula vegetal. Algunas modificaciones de aminoácidos que mejoran la solubilidad en relación con una o más de las proteínas de armazón, incluyendo la SEQ ID NO: 2 (TIC807) incluye la sustitución de un resto de aminoácido lisina en una o más de las siguientes posiciones de aminoácidos en TIC807 o el resto aplicable en cualquiera de las otras proteínas de armazón: 58, 59, 198, 199, 201 o 202; o, sustitución de un resto de aminoácido del ácido glutámico en una o más de las posiciones de aminoácidos 198, 248 o 301; o, sustitución de un resto de aminoácido arginina en una o más de las posiciones de aminoácidos 246, 250 o 253.
Las composiciones inhibidoras de insectos que comprenden los eHTP descritos anteriormente también se desvelan en el presente documento. Dichas composiciones pueden comprender además al menos un agente inhibidor de insectos adicional diferente del eHTP incluido en la composición. El agente inhibidor de insectos se selecciona de cualquier número de agentes inhibidores de insectos, incluyendo una proteína inhibidora de insectos, una molécula inhibidora de ARNbc de insectos y uno o más agentes químicos útiles para luchar contra las plagas de insectos. Algunos ejemplos de agentes inhibidores adicionales incluyen una proteína TIC1415, un ARNbc dirigido a los ortólogos hemípteros de Nilaparvata lugens V-ATPasa-E, 21E01, un ARNbc dirigido a los ortólogos hemípteros de ortólogo de actina, ADP/ATP translocasa, a-tubulina, proteína ribosómica L9 (RPL9) o subunidad V-ATPasa A, AXMI-171 (US20100298207A1), Cry3A, Cry4Aa, Cry11Aa y Cyt1Aa, DIG11, DIG5, Cry7, eCry3.1Ab, mCry3A, Cry8, Cry34/Cry35, Cry3, DiG2, Cry1, Cry1A.105, Cry2, Cry1F, VIP3, 5307 y Cry9. Los agentes químicos útiles para luchar contra las especies de hemípteros incluyen piretrinas y piretroides sintéticos; derivados de oxadizina; cloronicotinilos; derivados de nitroguanidina; triazoles; organofosfatos; pirroles; pirazoles; fenil pirazoles; diacilhidrazinas; productos biológicos/de fermentación; y carbamatos. Los plaguicidas conocidos dentro de estas categorías se enumeran en The Pesticide Manual, 11a Ed., C. D. S. Tomlin, Ed., British Crop Protection Council, Farnham, Surry, RU (1997).
Los piretroides que son útiles en la presente composición incluyen piretrinas y piretroides sintéticos. Las piretrinas que se prefieren para su uso en el presente procedimiento incluyen el éster de 2-alil-4-hidroxi-3-metil-2-ciclopenten-1-ona del ácido 2,2-dimetil-3-(2metilpropenil)-ciclopropan carboxílico y/o éster de (2-metil-1-propenil)-2-metoxi-4-oxo-3-(2 propenil)-2-ciclopenten-1-ilo y mezclas de los isómeros cis y trans de los mismos (Chemical Abstracts Service Registry Number) ("CAS RN") 8003-34-7).
Los piretroides sintéticos que se prefieren para su uso incluyen 4-cloro alfa (l-metiletil)bencenoacetato de (s)-ciano(3-fenoxifenil)metilo (fenvalerato, CAS RN 51630-58-1), (S)-4-cloro-alfa-(1-metiletil)bencenoacetato (S)-ciano(3-fenoxifenil)metilo (esfenvalerato, CAS RN 66230-04-4), (3-fenoxifenil)-metil(+)cis-trans-3-(2,2-dicoroetenil)-2,2-dimetilciclopropanocarboxilato (permetrina, CAS RN 52645-53-1), carboxilato de (±) alfa-ciano-(3-fenoxifenil)metil(+)-cis,trans-3-(2,2-dicloroetenil)-2,2-dimetil-ciclopropano (cipermetrina, CAS RN 52315-07-8), (beta-cipermetrina, CAS RN 65731-84-2), (theta cipermetrina, CAS RN 71697-59-1), carboxilato de S-ciano(3-fenoxifenil)metil (±) cis/trans 3-(2,2-dicloroetenil)2,2 dimetilciclopropano (zeta-cipermetrina, CAS RN 52315-07-8), (IR,3R)-3-(2,2-dibromovinil)-2,2-dimetil ciclopropanocarboxilato de (s)-alfa-ciano-3-fenoxibencilo (deltametrina, CAS RN 52918-63-5),ciclopropoanocarboxilato de alfa-ciano-3-fenoxibencil 2,2,3,3-tetrametilo (fenpropatrina, CAS RN 64257-84-7), (RS)-alfa-ciano-3-fenoxibencil(R)-2-[2-cloro-4-(trifluorometil)anilino]-3-metilbutanoato (tau-fluvalinato, CAS RN 102851-06-9), (2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilfenil)-metil-(1 alfa, 3 alfa)-(Z)-(±)-3-(2-cloro-3,3,3-trifluoro-1-propenil)-2,2-dimetilciclopropanocarboxilato (teflutrina, CAS RN 79538-32-2), (±)-ciano (3-fenoxifenil) metil (±)-4-(difluorometoxi)-alfa-(1-metil etil) bencenoacetato (flucitrinato, CAS RN 70124-77-5), ciano(4-fluoro-3-fenoxifenil)metil 3-[2-cloro-2-(4-clorofenil)etenil]-2,2-dimetilciclopropanocarboxilato (flumetrina, CAS RN 69770-45-2), ciano(4-fluoro-3-fenoxifenil)metil 3-(2,2-dicloroetenil)-2,2-dimetil-ciclopropanocarboxilato (ciflutrina, CAS RN 68359-37-5), (beta ciflutrina, Ca s RN 68359-37-5), (transflutrina, CAS RN 118712-89-3), carboxilato de (S)-alfa-ciano-3-fenoxibencil(Z)-(IR-cis)-2,2-dimetil-3-[2-(2,2,2-trifluoro-trifluorometil-etoxicarbonil)vinil]ciclopropano (acrinatrina, CAS RN 101007-06­ 1), par de isómeros de enantiómero (IR cis) S y (IS cis) R de carboxilato de alfa-ciano-3-fenoxibencil-3-(2,2-diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropano (alfa-cipermetrina, c AS RN 67375-30-8), ácido [IR,3S)3(1'RS)(1',2',2',2'-tetrabromoetil)]-2,2-dimetil ciclopropanocarboxílico-éster (s)alfa-ciano-3-fenoxibencílico (tralometrina, CAS RN 66841-25-6), 2,2-dicloro-1-(4-etoxifenil) ciclopropan carboxilato de ciano-(3-fenoxifenil) metilo (cicloprotrina, CAS RN 63935-38-6), [1a, 3-(2-cloro-3,3,3-trifluoro-1-propenil)-2,2-cimetilciclopropanocarboxilato de 3a(Z)]-(±)-ciano-(3-fenoxifenil)metilo (cihalotrina, CAS RN 68085-85-8), [1 alfa (s), 3 alfa(z)]-ciano(3-fenoxifenil)metil-3-(2-cloro-3,3,3-trifluoro-1-propenil)-2,2-dimetilciclopropano carboxilato (lambda cihalotrina, CAS RN 91465-08-6), 3-(2-cloro-3,3,3-trifluoro-1-propenil)-2,2-dimetilciclopropanocarboxilato de (2-metil [1,1'-bifenil]-3-il)metilo (bifentrina, CAS RN 82657-04-3), 5-1 -bencil-3-furilmetil-d-cis(1R,3S,E)2,2-dimetil-3-(2-oxo-2,2,4,5 tetrahidro tiofenilidenemetil) ciclopropan carboxilato (kadetrina, RU15525, c As RN 58769-20-3), [5-(fenil metil)-3-furanil]-3-furanil 2,2-dimetil-3-(2-metil-1-propenil) ciclopropan carboxilato (resmetrina, CAS RN 10453-86-8), (1R-trans)-[5-(fenilmetil)-3-furanil]metil 2,2-dimetil-3-(2-metil-1-propenil)ciclopropanocarboxilato (bioresmetrina, CAS RN 28434-01-7), 3,4,5,6-tetrahidro-ftalimidometil-(IRS)-cistrans-crisantemato (tetrametrina, CAS RN 7696-12-0), 3-fenoxibencil-d,l-cis,trans 2,2-dimetil-3-(2-metilpropenil)ciclopropan carboxilato (fenotrina, CAS RN 26002-80-2); (empentrina, CAS RN 54406-48-3); (cifenotrina; CAS RN 39515-40-7), (praletrina, CAS RN 23031-36-9), (imiprotrina, CAS RN 72963-72-5), (RS)-3-alil-2-metil-4-oxciclopent-2-enil-(1A,3R; 1R,3S)-2,2-dimetil-3-(2-metilprop-1-enil) ciclopropan carboxilato (aletrina, Ca s RN 584-79­ 2), (bioaletrina, CAS RN 584-79-2) y (ZXI8901, CAS r N 160791-64-0). Se cree que también pueden usarse mezclas de uno o más de los piretroides sintéticos mencionados anteriormente. Los piretroides sintéticos particularmente preferidos son teflutrina, lambda cihalotrina, bifentrina, permetrina y ciflutrina. Los piretroides sintéticos incluso más preferidos son teflutrina y lambda cihalotrina y aún más preferido es teflutrina.
Los insecticidas que son derivados de oxadiazina son útiles en la presente invención objeto. Los derivados de oxadizina que se prefieren para su uso son aquellos que se identifican en la Patente EE.UU. 5.852.012. Los derivados de oxadiazina más preferidos son 5-(2-cloropirid-5-ilmetil)-3-metil-4-nitroiminoperhidro-1,3,5-oxadiazina, 5-(2-clorotiazol-5-ilmetil)-3-metil-4-nitroiminoperhidro-1,3,5-oxadiazina, 3-metil-4-nitroimino-5-(1-oxido-3-piridinometil) perhidro-1,3,5-oxadiazina, 5-(2-cloro-1-oxido-5-piridiniometil)-3-metil-4-nitroiminoperhidro-1,3,5-oxidiazina; y 3-metil-5-(2-metilpirid-5-ilmetil)-4-nitroiminoperhidro-1,3,5-oxadiazina. Aún más preferido es el tiametoxam (CAS RN 153719­ 23-4).
Los insecticidas de cloronicotinilo también son útiles en la presente invención objeto. Los cloronicotinilos que se prefieren para su uso en la composición del sujeto se describen en la patente de EE.UU. 5.952.358 e incluyen acetamiprid ((E)-N-[(6-cloro-3-piridinil)metil]-N'-ciano-N-metilenimidamida, Ca s RN 135410-20-7), imidacloprid (1-[(6-cloro-3-piridinil)metol]-N-nitro-2-imidazolidinimina, CAS RN 138261-41-3) y nitenpiram (N-[(6-cloro-3-piridinil)metil]-N-etil-N'-metil-2-nitro-1,1-etenodiamina, CAS RN 120738-89-8).
Los insecticidas de nitroguanidina son útiles en la presente invención. Dichas nitroguanidinas pueden incluir las descritas en las Patentes de EE.UU. 5.633.375, 5.034.404 y 5.245.040.
Los pirroles, pirazoles y fenil pirazoles que son útiles en la presente invención incluyen aquellos que se describen en las Patentes de EE.UU. 5.952.358. Los pirazoles preferidos incluyen clorfenapir (4-bromo-2-(4-clorofenil)-1-etoximetil-5-trifluorometilpirrol-3-carbonitrilo, CAS RN 122453-73-0), fenpiroximato ((E)-1,1-dimetiletil-4[[[[[(1,3-dimetil-5-fenoxi1H-pirazol-4-il)metileno]amino]oxi]metil]benzoato, CAS RN 111812-58-9) y tebufenpirad (4-cloro-N[[4-1,1-dimetiletil)fenil]metil]-3-etil-1-metil-1H-pirazol-5-carboxamida, CAS RN 119168-77-3). Un fenil pirazol preferido es el fipronil (5-amino-[2,6-dicloro-4-(trifluorometil)fenil]-4-[(1R, S)-(trifluorometil)sulfinil]-1H-pirazol-3-carbonitrilo, CAS RN 120068-37-3).
Las diacilhidrazinas que son útiles en la presente invención incluyen halofenozida (4-clorobenzoato-2-benzoil-2-(1,1-dimetiletil)-hidrazida, CAS RN 112226-61-6), metoxifenozida (RH-2485; N-terc-butil-N'-(3-metoxi-o-toluoil)-3,5-xilohidrazida, CAS RN 161050-58-4) y tebufenozida (ácido 3,5-dimetilbenzoico 1-(1,1-dimetiletil)-2,(4-etilbenzoil)hidrazida, CAS RN 112410-23-8).
Los triazoles, tales como amitrol (CAS RN 61-82-5) y triazamato son útiles en el procedimiento de la presente invención. Un triazol preferido es el triazamato ([[1-[(dimetilamino)carbonil]-3-(1,1-dimetiletil)-1H-1,2,4-triazol-5-il]tio]acetato de etilo, CAS RN 112143-82-5).
Los productos biológicos/de fermentación, tales como avermectina (abamectina, CAS RN 71751-41-2) y espinosad (Xd E-105, CAS RN 131929-60-7) son útiles en la presente invención.
Los insecticidas organofosforados también son útiles como uno de los componentes de la presente invención. Los insecticidas organofofatos preferidos incluyen acefato (CAS RN 30560-19-1), clorpirifos (CAS RN 2921-88-2), clorpirifosmetilo (CAS RN 5598-13-0), diazinona (CAS RN 333-41-5), fenamifos ( CAS RN 22224-92-6) y malatión (CAS RN 121-75-5).
Además, los insecticidas de carbamato son útiles en la presente invención. Los insecticidas de carbamato preferidos son aldicarb (CAS RN 116-06-3), carbarilo (CAS RN 63-25-2), carbofurano (CAS RN 1563-66-2), oxamilo (CAS RN 23135-22-0) y tiodicarb (CAS RN 59669-26-0).
Cuando se describe en el presente documento un insecticida químico, debe entenderse que la descripción pretende incluir formas de sal del insecticida, así como cualquier forma isomérica y/o tautomérica del insecticida que exhiba la misma actividad insecticida que la forma del insecticida que se describe.
Los insecticidas químicos que son útiles en la presente invención pueden ser de cualquier grado o pureza que pase al comercio como tal insecticida. Otros materiales que acompañan a los insecticidas en preparaciones comerciales como impurezas pueden tolerarse en las composiciones, siempre que dichos otros materiales no desestabilicen la composición o reduzcan o destruyan significativamente la actividad de cualquiera de los componentes del insecticida o el evento transgénico contra la plaga o plagas diana. Un experto habitual en la materia de la producción de insecticidas puede identificar fácilmente las impurezas que se pueden tolerar y las que no.
Los eHTP están relacionados por modificaciones de aminoácidos, de modo que las proteínas modificadas exhiben un espectro inhibidor de hemípteros mejorado y/o una actividad inhibidora de hemípteros mejorada contra Lygus spp., Empoasca spp. y/o Amrasca spp. en comparación con la proteína parental, TIC807. Las expresiones "más activo", "actividad mejorada", "especificidad potenciada", "potencia tóxica aumentada", "toxicidad aumentada", "actividad inhibitoria de hemípteros mejorada", "actividad inhibidora de hemípteros potenciada", "actividad inhibitoria de Lygus, Empoasca y/o Amrasca mejorada", "actividad inhibitoria de Lygus, Empoasca y/o Amrasca mayor", "actividad inhibitoria de hemípteros mayor" y "espectro inhibitorio de Lygus, Empoasca y/o Amrasca potenciado" y "espectro inhibidor de hemípteros mejorado" se refieren a una comparación de la actividad de un eHTP y de la actividad de un TIC807 (SEQ ID NO: 2), TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO: 182), TIC853 (SEQ ID NO: 184), y/o una proteína AXMI-171 (SEQ ID NO: 206) contra un insecto hemíptero, en las que la actividad atribuida por el eHTP desvelado en el presente documento es mayor que la actividad atribuida a la proteína TIC807 (SEQ ID NO: 2), TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO: 182), TIC853 (SEQ ID NO: 184, y/o una proteína AXMI-171 (SEQ ID NO: 206). Los eHTP desvelados en el presente documento exhiben un espectro inhibidor de hemípteros mejorado y/o una actividad inhibidora de hemípteros mejorada o mayor en comparación con las proteínas de Bacillus thuringiensis de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 184, en las que las especies de plagas de hemípteros incluyen Lygus hesperus, Lygus lineolaris, Empoasca fabae y Amrasca devastans, Amrasca devastans también se llama Amrasca biguttula biguttula. Los eHTP que exhiben un espectro inhibidor de insectos mejorado y/o una actividad inhibidora de insectos mejorada en comparación con TIC807 pueden identificarse por muchos procedimientos diferentes. En general, los procedimientos ejemplares para identificar proteínas eHTP pueden comprender:
(1) administrar cantidades idénticas de una prueba eHTP y de control TIC807 (SEQ ID NO: 2), TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO: 182), TIC853 (SEQ ID NO: 184), y/o una proteína AXMI-171 (SEQ ID NO: 206) a un insecto de prueba en condiciones de ensayo controladas; y, medir y comparar la potencia de las proteínas de prueba y control; y/o,
(2) determinar las dosis de proteínas (por ejemplo, concentración de proteínas en la dieta) de un eHTP de prueba y TIC807 control (SEQ-ID NO: 2), TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8), Cry51Aal (SEQ ID NO: 182), TIC853 (SEQ ID NO: 184) y/o una proteína AXMI-171 (SEQ ID NO: 206) que provocan respuestas equivalentes de la población de insectos en condiciones de ensayo controladas (es decir, obtener una curva de respuesta a la dosis).
En el segundo enfoque, un valor de respuesta a la dosis estadísticamente robusto usado para la comparación sería la concentración letal media (CL50) requerida para matar al 50 % de una población de prueba. Sin embargo, pueden usarse otros valores, incluyendo una concentración inhibitoria mediana ("CI50") requerida para dar como resultado la inhibición del crecimiento del 50 % de una población de prueba. En este contexto, "inhibición del crecimiento" puede comprender retraso en el crecimiento y/o inhibición del desarrollo de hemípteros.
Como se usa en el presente documento, la frase "una cantidad inhibidora de insectos", se refiere a una cantidad de una composición que contiene un agente que es eficaz para lograr cualquier inhibición medible de la viabilidad del insecto, crecimiento, desarrollo del insecto, reproducción del insecto, comportamiento de alimentación del insecto, comportamiento de apareamiento del insecto y/o cualquier disminución medible en los efectos adversos causados por la alimentación del insecto en una composición que contiene el agente. De manera similar, una "cantidad inhibidora de hemípteros" se refiere a una cantidad desvelada en el presente documento sola o con otros agentes dirigidos a las especies de hemípteros aplicables para luchar, que da como resultado una inhibición medible de los insectos diana que pertenecen al orden Hemiptera relacionado con la viabilidad, crecimiento, desarrollo, reproducción, comportamiento de alimentación, comportamiento de apareamiento y/o cualquier disminución medible en los efectos adversos causados por los insectos hemípteros que se alimentan de una planta. Asimismo, "cantidad inhibitoria de Lygus, Empoasca y/o Amrasca" se refiere a una cantidad de una composición que contiene una o más proteínas desveladas en el presente documento, es decir, eHTP u otro agente que dé como resultado cualquier inhibición medible, viabilidad, crecimiento, desarrollo, reproducción, comportamiento de alimentación, comportamiento de apareamiento y/o cualquier disminución medible en los efectos adversos causados por Lygus Empoasca y/o Amrasca alimentándose de una composición que contiene ese eHTP. Como se usa en el presente documento en el contexto de un eHTP, una "actividad inhibidora de hemípteros potenciada" o "mayor actividad inhibidora de hemípteros potenciada" se refiere a cualquier aumento medible en la inhibición de la viabilidad de hemípteros, crecimiento, desarrollo, reproducción, comportamiento de alimentación, comportamiento de apareamiento y/o cualquier disminución medible en los efectos adversos causados por la alimentación de hemípteros en una composición que contiene ese eHTP en relación con la actividad inhibidora correspondiente observada con una o más de las proteínas de armazón, incluyendo TIC807, Cry51Aa1 (SEQ ID NO: 182), TIC853 (SEQ ID NO: 184) y/o proteínas AXMI-171 (SEQ ID NO: 206). Asimismo, "actividad inhibitoria de Lygus Empoasca y/o Amrasca potenciada" o "mayor actividad inhibitoria de Lygus, Empoasca y/o Amrasca potenciada" se refiere a cualquier aumento medible en la inhibición, viabilidad, crecimiento, desarrollo, reproducción, comportamiento de alimentación, comportamiento de apareamiento y/o cualquier disminución medible en los efectos adversos causados por la presencia de uno o más eHTP desvelados en el presente documento en una composición o planta proporcionada en la dieta de Lygus, Empoasca y/o Amrasca en relación con la actividad inhibidora correspondiente observada con una composición o planta equivalente que contiene solo una cantidad aplicable de una o más de las proteínas de armazón, incluyendo TIC807 (SEQ ID NO: 2), Cry51Aa1 (SEQ ID NO: 182), TIC853 (SEQ ID NO: 184) y/o proteínas AXMI-171 (SEQ ID NO: 206).
Como se usa en el presente documento en el contexto de un eHTP, un "espectro inhibitorio de Lygus Empoasca y/o Amrasca potenciado" se refiere a cualquier aumento medible en la inhibición en Lygus spp., Empoasca spp. y/o Amrasca spp. de viabilidad, crecimiento, desarrollo, reproducción, comportamiento de alimentación, comportamiento de apareamiento y/o cualquier disminución medible en los efectos adversos causados por ese Lygus spp., Empoasca spp. y/o Amrasca spp. alimentándose de una planta con respecto a la inhibición correspondiente de ese Lygus spp., Empoasca spp. y/o Amrasca spp. específico observado con la proteína TIC807. El eHTP proporcionado en el presente documento puede exhibir un espectro inhibitorio de Lygus potenciado relativo a TIC807 en que esos eHTP pueden proporcionar una mayor inhibición de Lygus lineolaris.
Un eHTP desvelado en el presente documento puede exhibir de 2 a 260 veces mayor actividad inhibitoria de Lygus, Empoasca y/o Amrasca contra una especie de plaga de Lygus, Empoasca y/o Amrasca que una proteína de s Eq ID NO: 2 (TIC807), SEQ ID NO: 8 (TIC807_M2), SEQ ID NO: 182 (Cry51Aa1), SEQ ID NO: 184 (TIC853) y SEQ ID NO: 206 (AXMI-171). Un eHTP desvelado en el presente documento puede exhibir aproximadamente 3, 4, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 27, 30, 38, 46, 50, 52, 54, 66, 91, 122, 186, 243, o 262 veces más actividad inhibitoria de Lygus, Empoasca y/o Amrasca contra una especie de plaga de Lygus, Empoasca y/o Amrasca que una proteína de SEQ ID NO: 2 (TIC807), SEQ ID NO: 8 (TIC807_M2), SEQ ID NO: 182 (Cry51Aa1), SEQ ID NO: 184 (TIC853) y SEQ ID NO: 206 (AXMI-171).
Los eHTP pueden exhibir un espectro inhibidor de plagas diana mejorado y/o una actividad inhibidora de plagas diana mejorada sobre SEQ ID NO: 2 (TIC807), SEQ ID NO: 8 (TIC807_M2), SEQ ID NO: 182 (Cry51Aa1), SEQ ID NO: 184 (TIC853) y/o SEQ ID NO: 206 (AXMI-171) al causar mortalidad:
(i) a una dosis de 0,3 pg/ml a 70 pg/ml contra una especie de insectos Lygus hesperus,
(ii) a una dosis de 0,85 pg/ml a 100 pg/ml contra una especie de insectos Lygus lineolaris,
(iii) midiendo a un valor CL50 de 0,3 a 70 pg/ml contra Lygus hesperus,
(iv) midiendo a un valor CL50 de 0,85 a 100 pg/ml contra Lygus lineolaris, o
(v) midiendo a un valor CL50 de más de dos veces menor que el valor CL50 de TIC807, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 182 (Cry51Aa1), SEQ ID NO: 184 (TIC853) y/o SEQ ID NO: 206 (AXMI-171) contra Lygus spp, Emrasca spp. y/o Amrasca spp., o
(vi) a una dosis de 0,69 pg/ml a 500 p/ml contra una especie de insecto Amrasca devastans o Empoasca fabae o (vii) medir a un valor CL50 de 3,5 a 15 pg/ml contra Amrasca devastans y/o Empoasca fabae.
Las Tablas 4A y 4B tabulan los eHTP ejemplares desvelados en el presente documento con datos de mortalidad de Amrasca y Lygus spp. Los datos de mortalidad disponibles para Lygus spp. y Amrasca spp. se informan como (a) un valor de CL50 pg/ml o como (b) un % de mortalidad a dosis de 1 a 3 pg/ml para L. hesperus o aproximadamente 100 |jg/ml de proteína para L. lineolaris y 0,69 a 500 pg/ml para Amrasca devastans. La toxicidad aumentada en comparación con TlC807 (SEQ ID NO: 2) y TIC807_ m 2 (SEQ ID NO: 8) se proporciona para ejemplos de eHTP donde se determinaron los valores de CL50.
Los eHTP desvelados en el presente documento son particularmente útiles en la lucha contra insectos del orden Hemiptera en comparación con las proteínas de armazón. Lygus lineolaris requiere altas dosis de proteína TIC807 (por ejemplo, más de 100 pg/ml) para provocar la mortalidad. La curva de respuesta a la dosis para un eHTP desvelado en el presente documento TIC807_ m 8 (SEQ ID NO: 16), un eHTP que exhibe efectos tóxicos notablemente mejorados contra ambos L. lineolaris y L. hesperus pero contra L. lineolaris El eHTP exhibe un valor calculado de CL50 de 223 pg/ml. No ha sido posible alcanzar previamente una dosis tóxica de concentración de proteína que pueda provocar una mortalidad superior al 50 % contra especies de L. lineolaris porque no ha sido posible proporcionar dosis significativamente grandes de proteína TIC807 y TIC807_M2 en exceso de 1000 pg/ml en la dieta. Por lo tanto, no se determinaron los valores de CL50 contra L. lineolaris para las proteínas TIC807 y TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8), sino más bien estimado como mayor que (>) 223 pg/ml (véanse las Tablas 1 y 3, el Ejemplo 4 y la Figura 1B).
El diseño iterativo se refiere a un enfoque semialeatorio para desarrollar y seleccionar eHTP, incluyendo una combinación de ingeniería, prueba y selección (no necesariamente en ese orden) (véanse los ejemplos 1 a 4). La palabra "ingeniería" pretende incluir la identificación de residuos relevantes para modificar, clonar y expresar eHTP descritos en el presente documento. La palabra "prueba" se refiere a comparar la actividad de hemípteros de un eHTP a la actividad de una proteína de armazón como TIC807 (SEQ ID NO: 2), T iC807_M2 (SEQ ID NO: 8), Cry51Aa1 (SEQ ID NO: 182) y/o TIC853 (SEQ ID NO: 184); o, comparar un eHTP desvelado en el presente documento con otra proteína tal como AXMI-171 (SEQ ID NO: 206). La palabra "seleccionar" pretende referirse al acto de identificar proteínas variantes mejoradas desveladas en el presente documento, es decir, eHTP y los restos de aminoácidos aplicables para "ingeniería".
El diseño iterativo incluye la elucidación de la estructura atómica de las proteínas desveladas en el presente documento (por ejemplo, como se establece en la Figura 2) y el uso de la estructura atómica para guiar y complementar los enfoques semialeatorios de "seleccionar" restos de aminoácidos para modificar para "ingeniería" y en este caso, ha incluido la identificación de restos de aminoácidos en bucles y en regiones expuestas a la superficie de una proteína de andamiaje inhibidora de insectos plegada, tal como TIC807, TIC853 y Cry51Aa1 que pueden modificarse para conferir mejoras al espectro y actividad inhibidoras de insectos. Dichos restos de aminoácidos en los bucles y en las regiones expuestas a la superficie se seleccionan para "ingeniería". En este caso, el diseño iterativo ha incluido la identificación de dos regiones diferentes dentro de la estructura tridimensional de la proteína del andamio que alberga una acumulación de restos de aminoácidos relevantes que, cuando se modifica para contener restos de aminoácidos distintos de los que aparecen en esas posiciones en la proteína del andamio natural, da como resultado una o más de las proteínas eHTP desveladas en el presente documento.
Inicialmente, se descubrió la proteína de andamio TIC807 (SEQ ID NO: 2) usada en este proceso de diseño iterativo, y 267 diferentes eHTP que exhibieron un aumento de la actividad inhibitoria de Lygus spp. en comparación con la proteína de armazón TIC807. TIC807_M8 (SEQ ID NO: 16) se descubrió en las primeras rondas del proceso de diseño. Las rondas posteriores de selección iterativa de pruebas de ingeniería condujeron al descubrimiento de otras proteínas eHTP que exhibían niveles aún mayores de toxicidad contra especies de Lygus y también exhibieron una gama más amplia de efectos tóxicos en comparación con la proteína del andamio. Siete variantes (eHTP) exhibieron niveles significativamente más altos de mayor toxicidad contra ambas especies de Lygus (L. hesperus y L. lineolaris) en comparación con TIC807. Los valores de CL50 para estos siete y otros eHTP construidos en el presente documento se determinaron contra especies Lygus hesperus y Lygus lineolaris y en comparación con los valores de CL50 para proteínas de armazón, particularmente TIC807. Los resultados se muestran en la Tabla 1, y la Figura 3 es un gráfico de barras que muestra gráficamente los resultados observados en la Tabla 1.
Tabla 1. Valores de CL50 de eHTP seleccionados en com aración con TIC807
Figure imgf000010_0001
continuación
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Con referencia a la Tabla 1, el procedimiento de diseño iterativo ha proporcionado un medio para identificar proteínas que exhiben propiedades tóxicas mejoradas, no solo para Lygus hesperus, sino también a Lygus lineolaris.
También se describen composiciones de polinucleótidos recombinantes que codifican eHTP. Los eHTP pueden expresarse con construcciones de ADN recombinante en las que una molécula de polinucleótido con el marco de lectura abierto que codifica la proteína está operativamente unida a elementos tales como un promotor y cualquier otro elemento regulador funcional para la expresión en el sistema para el que está destinada la construcción. Por ejemplo, los promotores funcionales de la planta se pueden unir operativamente a una secuencia de codificación de eHTP aplicable para permitir la expresión de la proteína en las plantas. Los promotores funcionales en bacterias también se contemplan para su uso en casetes de expresión. Los promotores funcionales en una bacteria aplicable, por ejemplo, en una especie de E. coli o en un Bacillus thuringiensis pueden estar operativamente unidas a las secuencias de codificación de eHTP para la expresión de la proteína aplicable en la cepa bacteriana aplicable. Otros elementos útiles que se pueden unir operativamente a las secuencias de codificación de eHTP incluyen potenciadores, intrones, líderes, etiquetas de inmovilización de proteínas codificadas (etiqueta HIS), péptidos de translocación subcelulares codificados (es decir, péptidos de tránsito de plástidos, péptidos señal), sitios de polipéptidos codificados para enzimas modificadoras postraduccionales, sitios de unión ribosómica y segmentos diseñados para su uso como activadores de ARNi para la supresión de uno o más genes en plantas o en una especie de plaga diana particular.
Las moléculas polinucleotídicas recombinantes ejemplares incluyen SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 201. Estas secuencias codifican las proteínas respectivas que tienen cada una la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 4 (TIC807_4), SEQ ID NO: 6 (TIC807_M1), SEQ ID NO: 8 (TIC807_M2), SEQ ID NO: 10 (TIC807_M3), SEQ ID NO: 12 (TIC807 M4), SEQ ID NO: 14 (TIC807_M5), SEQ ID NO: 16 (TIC807_M8), SEQ ID NO: 18 (TIC807_M6), SEQ ID NO: 20 (TIC807_M7), SEQ ID NO: 22 (TIC807_22), SEQ ID NO: 24 (TIC807_24), SEQ ID NO: 26 (TIC807_26), SEQ ID NO: 28 (TIC807 M9), SEQ ID NO: 30 (TIC807 _M10), SEQ ID NO: 32 (TIC807_M11), SEQ ID NO: 36 (TIC807_M12) y SEQ ID NO: 34 (TIC807_M13). Debido a la redundancia del código genético, los codones de una molécula de polinucleótido recombinante que codifica proteínas desveladas en el presente documento pueden sustituirse por codones sinónimos (también llamados una sustitución silenciosa). De este modo se obtienen polinucleótidos recombinantes que codifican cualquiera de los eHTP desvelados en el presente documento.
Una construcción de ADN recombinante que comprende secuencias de codificación de eHTP también puede comprender además una región de ADN que codifica uno o más agentes inhibidores de insectos que pueden configurarse para que se coexpresen junto con una secuencia de ADN que codifica un eHTP aplicable, una proteína diferente de un eHTP, o una molécula de ARNbc inhibidora de genes de plantas o insectos. Una construcción de ADN recombinante puede ensamblarse de modo que todos los agentes diseñados para expresarse a partir de una construcción particular se expresen a partir de un promotor o de manera que cada agente separado esté bajo un control de promotor separado, o alguna combinación de los mismos. Las proteínas desveladas en el presente documento pueden expresarse a partir de un sistema de expresión de múltiples genes en el que una o más proteínas se expresan a partir de un segmento de nucleótidos común en el que también están contenidos otros marcos de lectura abiertos y/o promotores dependiendo del tipo de sistema de expresión seleccionado.
El polinucleótido recombinante o la construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia codificante de eHTP puede administrarse a las células huésped mediante vectores, por ejemplo, un plásmido, baculovirus, cromosoma artificial, virión, cósmido, fagémido, fago o vector vírico. Tales vectores pueden usarse para lograr la expresión estable o transitoria de una secuencia que codifica eHTP en una célula huésped; y, si puede ser el caso, la expresión posterior al polipéptido. Un polinucleótido recombinante exógeno o una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia que codifica un eHTP y que se introduce en una célula huésped se denomina también "transgén" en el presente documento.
También se desvelan en el presente documento bacterias transgénicas, células de plantas transgénicas, plantas transgénicas y partes de plantas transgénicas que contienen cualquier polinucleótido recombinante (es decir, transgén) que expresa una o más secuencias de codificación de eHTP. Se pretende que "célula bacteriana" o "bacteria" pueda incluir una célula de Agrobacterium, una de Bacillus, una de Escherichia, una de Salmonella, una de Pseudomonas o una de Rhizobium. Se pretende que "célula vegetal" o "planta" incluya una célula vegetal o planta de alfalfa, almendra, plátano, cebada, judía, remolacha, brécol, repollo, Brassica, berenjena, zanahoria, mandioca, ricino, coliflor, apio, garbanzo, col china, apio, cítricos, coco, café, maíz, trébol, algodón, una cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berenjena, eucalipto, lino, ajo, uva, guar, lúpulo, puerro, legumbres, lechuga, pino Loblolly, mijos, melones, nectarina, nueces, avena, okra, aceituna, cebolla, ornamentales, palma, hierba de pasto, papaya, guisante, melocotón, cacahuete, pimiento, guandú, pino, patata, álamo, calabaza, pino Radiata, rábano, colza, arroz, portainjertos, centeno, cártamo, arbustos, sorgo, pino del sur, soja, espinacas, calabazas, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, maíz dulce, liquidámbar, batata, pasto varilla, té, tabaco, tomate, triticale, césped, sandía y trigo. En determinadas realizaciones: se proporcionan plantas transgénicas y partes de plantas transgénicas regeneradas a partir de una célula vegetal transgénica; las plantas transgénicas pueden obtenerse a partir de una semilla transgénica; las partes de plantas transgénicas pueden obtenerse cortando, por presión, molienda o cualquier otra disociación de la parte de la planta; la parte de la planta puede ser una semilla, una cápsula, una hoja, una flor, un tallo, una raíz o cualquier porción de la misma; y una parte de planta transgénica descrita en el presente documento es una porción no regenerable de una parte de planta transgénica. Tal como se usa en este contexto, una parte "no regenerable" de una parte de planta transgénica es una porción que no puede inducirse para formar una planta completa o que no puede inducirse para formar una planta completa capaz de reproducción sexual y/o asexual. Una porción no regenerable de una planta o una parte de la planta es una porción de un polen transgénico, óvulo, semilla, cápsula, hoja, flor, tallo o raíz.
También se describen en el presente documento procedimientos para hacer plantas transgénicas que contienen cantidades inhibitorias de insectos o Lygus y/o Amrasca de un eHTP. Dichas plantas pueden hacerse mediante la introducción de un polinucleótido recombinante que codifica cualquiera de las proteínas eHTP desveladas en el presente documento en una célula vegetal, y seleccionando una planta derivada de dicha célula vegetal que expresa una cantidad inhibitoria de insecto o de hemípteros de los eHTP. Las plantas pueden derivar de las células vegetales por regeneración, semilla, polen, o técnicas de transformación de meristemos.
Se describen plantas transgénicas y células huésped que expresan una cantidad inhibitoria de insecto o de hemípteros del eHTP para luchar contra una infestación de insectos o Hemípteros. Cualquiera de las especies de plantas mencionadas anteriormente puede usarse para proteger una planta de la infestación de insectos o hemípteros proporcionada en el presente documento siempre que la planta se transforme con una construcción polinucleotídica diseñada para expresar el eHTP aplicable.
Adicionalmente se desvelan en el presente documento anticuerpos, kits, procedimientos para detectar polinucleótidos que codifican eHTP o fragmentos distintivos de los mismos, o eHTP o fragmentos distintivos de los mismos, procedimientos para identificar miembros inhibidores de insectos adicionales del género de proteínas desvelado en el presente documento, formulaciones y procedimientos para luchar contra el crecimiento y/o infestación de insectos, y procedimientos para proporcionar dicha lucha a las plantas y otros huéspedes receptores. Cada composición, construcción, célula, planta, formulación, procedimiento o kit proporciona la aplicación industrial de las proteínas desveladas en el presente documento, por ejemplo, aumentando la productividad de la planta mediante el uso comercial de cualquiera de estas proteínas para inhibir insectos.
Un producto vegetal, distinto de una semilla o una fruta o verdura, está destinado a ser una mercancía u otros productos que se mueven a través del comercio y derivan de una planta transgénica o parte de una planta transgénica, en el que el producto u otros productos pueden rastrearse a través del comercio mediante la detección de segmentos de nucleótidos, ARN o proteínas que corresponden a un eHTP desvelado en el presente documento y se producen o mantienen en la planta o tejido vegetal o parte de la cual se ha obtenido el producto u otro producto. Tal mercancía u otros productos de comercio incluyen partes de plantas, biomasa, aceite, sémola, azúcar, pienso animal, harina, copos, salvado, hilazas, semillas procesadas y semillas. Las partes de la planta incluyen una semilla de planta, cápsula, hoja, flor, tallo, polen o raíz. La parte de la planta puede ser una porción no regenerable de dicha semilla, cápsula, hoja, flor, tallo, polen o raíz. Las cápsulas de plantas de algodón y lino y sus porciones no regenerables que contienen los eHTP también se desvelan en el presente documento.
También se desvelan en el presente documento productos vegetales procesados que contienen una cantidad detectable de un eHTP, un fragmento inhibidor de insectos del mismo, o cualquier porción distinguible del mismo. Sin tratar de estar limitado por la teoría, se cree que tales productos vegetales procesados que contienen una cantidad detectable de uno o más de los eHTP desvelados en el presente documento pueden exhibir reducciones en microorganismos indeseables que pueden transmitirse por Hemiptera y/o reducciones en los productos secundarios indeseables de tales microorganismos. Una porción distintiva del mismo puede comprender cualquier polipéptido de al menos 20 a 100 o más aminoácidos contiguos como se establece en SEQ ID NO: 180, en particular en el que el polipéptido no contiene un polipéptido correspondiente de aminoácidos contiguos presentes en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 182 o SEQ ID NO: 184 y en donde el polipéptido comprende al menos una sustitución, adición o deleción de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos correspondiente como se establece en la SEQ ID NO: 2. Tales sustituciones, eliminaciones o adiciones son las establecidas anteriormente en el párrafo [0009].
Los productos vegetales procesados se desvelan en el presente documento que contienen una cantidad detectable de un polinucleótido recombinante que codifica un eHTP, un eHTP o un fragmento inhibidor de insectos del mismo, o cualquier parte distintiva del mismo. El producto procesado se selecciona de biomasa vegetal, aceite, sémola, pienso animal, harina, copos, salvado, hilazas, cáscaras y semilla procesada.
Las infestaciones de Hemípteros de plantas de cultivo se luchan proporcionando en las plantas de cultivo una secuencia de polinucleótidos recombinante que codifica uno o más de los eHTP desvelados en el presente documento. Dichos cultivos transgénicos producen o son tratados para contener una cantidad inhibitoria de insectos o Hemípteros de un eHTP aplicable, y tales cultivos están imbuidos de suficiente eHTP (i) al aplicar cualquier composición que comprenda o codifique un eHTP a la planta o una semilla que da origen a la planta; y/o (ii) transformar la planta o una célula vegetal que da lugar a la semilla y, en última instancia, la planta, con un polinucleótido que codifica un eHTP. La planta puede ser una planta transgénica transformada de forma transitoria o estable que comprende un transgén que expresa una cantidad inhibitoria de insectos o Hemípteros de un eHTP. La planta puede ser una planta no transgénica a la que se ha aplicado una composición que comprende un eHTP. En dichos procedimientos, la planta es una planta dicotiledónea y más específicamente puede ser una planta de algodón, soja o alfalfa. Los insectos hemípteros incluyen adultos y ninfas, tales como la lista de bichos que se establece anteriormente en el párrafo [0020].
Preferentemente, el Lygus spp. es Lygus hesperus o Lygus lineolaris, el Empoasca spp. es Empoasca fabae y el Amrasca spp. es Amrasca devastans.
Otros rasgos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, ejemplos y reivindicaciones.
Los ejemplos no abarcados por las reivindicaciones son para fines ilustrativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Enfoque iterativo de ingeniería-prueba-selección
Este ejemplo ilustra los aspectos aleatorios y combinatorios del enfoque de selección de pruebas de ingeniería iterativo (también puede denominarse "recursivo") usado para identificar y describir proteínas inhibidoras de insectos que exhiben actividad de coleópteros y/o nematicidas o una mayor toxicidad para especies de insectos hemípteros en comparación con TIC807 (SEQ ID NO: 2). Se emplearon varios enfoques de diseño para diseñar eHTP con mayor actividad inhibitoria contra especies de Lygus; enfoques que incluían modificaciones semi-aleatorias, modificaciones dirigidas de variaciones en una alineación de TIC807 con otras proteínas Bt nativas y diseño asistido por estructura/función. Se llevaron a cabo numerosas rondas de ingeniería y pruebas (tanto consecutivas como concurrentes) para seleccionar variantes de proteína TIC807 que exhibieran una mayor toxicidad. Los enfoques de diseño se ajustaron a medida que se recopilaron los datos. Este enfoque iterativo de selección de pruebas de ingeniería también incluía etapas que incluían la clonación, expresión, purificación y prueba de bioensayo de la proteína de control TIC807 en comparación con los eHTP.
Aproximadamente se obtuvieron 267 ejemplares de eHTP que exhibieron un aumento de la toxicidad de Lygus en comparación con TIC807 de más de 2000 grupos de candidatos eHTP (es decir, proteínas de "prueba") que se ensayaron para determinar la actividad inhibidora de insectos mejorada. El número total real de eHTP candidatos probados fue mucho mayor que 2000 porque las pruebas incluyeron segmentos de nucleótidos recombinantes que codifican una cantidad de eHTP candidatos derivados de mutagénesis de biblioteca que no se secuenciaron en el procedimiento de selección.
Se prepararon reservas de proteínas de diversas cantidades y purezas dependiendo del fin de la prueba y el rendimiento de prueba deseado. Por ejemplo, se prepararon preparaciones de proteínas de menor cantidad y menor pureza para seleccionar un mayor número de variantes en el bioensayo. Se prepararon reservas de proteínas de mayor cantidad y mayor pureza para bioensayos de alta potencia. Las pruebas se orientaron hacia los bioensayos de alta potencia a medida que se aclararon las posiciones de residuos principalmente relevantes de las variantes mejoradas. Inicialmente, aproximadamente 2000 variantes se probaron en Lygus hesperus. Basado en datos de L.
hesperus se diseñaron aproximadamente 600 variantes y después se probaron en Lygus lineolaris. De estos, aproximadamente 267 variantes (Tabla 4B) demostraron una toxicidad aumentada contra Lygus hesperus y/o Lygus lineolaris en comparación con TIC807. Estas 267 variantes incluyeron veintidós (22) variantes que se confirmaron para demostrar una mayor toxicidad contra ambas especies de Lygus. La confirmación adicional y las pruebas de respuesta a la dosis redujeron la selección a siete (7) variantes que posteriormente se caracterizaron usando un bioensayo replicado de 8 dosis para determinar los valores de CL50 contra ambas especies de Lygus.
El proceso de selección incluyó actualizaciones dinámicas de datos de prueba, ajustando constantemente los enfoques de ingeniería y realizando rondas iterativas. De manera simultánea, se empleó clonación de labor intensiva, expresión de proteínas, purificación de proteínas y experimentos de bioensayo para probar los eHTP candidatos.
Ejemplo 2: Enfoques de ingeniería
Enfoques basados en alineamiento
Una alineación de secuencia múltiple de miembros de proteína de Cry51: Cry51Aa1 (SEQ ID NO: 182), TIC853 (SEQ ID NO: 184) y TIC807 (SEQ ID NO: 2) se usó para identificar regiones de variabilidad, por ejemplo, posiciones 195 a 201 y posiciones 211 a 219, relativas a la SEQ ID NO: 2 (TIC807). Estas regiones fueron objeto de mutagénesis de saturación mediante el uso de cebadores de oligonucleótidos degenerados que codifican restos de aminoácidos aleatorios en estas regiones. Se prepararon bibliotecas de construcción para la posterior expresión de proteínas en células huésped.
Una alineación de secuencia múltiple de Cry51Aal (SEQ ID NO: 182), TIC853 (SEQ ID NO: 184) y TIC807 (SEQ ID NO: 2) se usó en combinación con una matriz de sustitución BLOSUM 80 para calcular las distancias promedio por pares para cada variante de posición a TIC807. Las posiciones de los restos con distancias medias más bajas por pares se sustituyeron con restos de aminoácidos nativos alternativos usando cebadores oligonucleotídicos degenerados que codifican restos de aminoácidos alternativos. por ejemplo, G28X, G31X, F46X, E125X, F138X, F147X, S167X, Y216X, P218X, G234X, T247X, D268X y T308X. Se prepararon bibliotecas de construcción para la posterior expresión de proteínas en células huésped.
Enfoques de escaneo
Las construcciones de polinucleótidos se diseñaron para expresar una única sustitución de alanina o una doble sustitución de alanina (Alanina-<resto parental>-Alanina) en todas las posiciones posibles a lo largo de la SEQ ID NO: 2 (TIC807). Véase la Tabla 2 para un ejemplo hipotético.
Tabla 2. Un ejemplo hipotético de escaneos de Alanina sencilla y doble en una proteína de armazón que contiene la secuencia de aminoácidos XXXXAXX.
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Cuando un resto de alanina ya estaba presente en TIC807, una Serina se sustituyó en su lugar. Las variantes de proteínas que exhibieron una mayor toxicidad en comparación con TIC807 se probaron adicionalmente mediante mutagénesis de combinación y saturación en aquellos restos sustituidos con alanina que confieren una toxicidad aumentada. Los enfoques de escaneo también se realizaron en variantes de combinación mejoradas que tenían modificaciones acumuladas de rondas iterativas anteriores de selección de pruebas de ingeniería, por ejemplo, TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8) que tiene mutaciones F46S, Y54H, S167R, S217N y se diseñó adicionalmente una deleción triple contigua en el intervalo de restos 196-201 mediante una ronda adicional de sustituciones de Alanina individuales para mejorar aún más el mejorado TIC807_M2. Principalmente los restos relevantes se identificaron y se analizaron mediante mutagénesis de combinación y saturación (por ejemplo, A150X, E125X, E155X, F147X, I134X, N157X, Q149X, T133X, E135X y N137X). Las variantes diseñadas por estos enfoques combinados exhibieron mejoras adicionales para aumentar la toxicidad en comparación con TIC807 y se combinaron además con otros enfoques de diseño que aprovecharon la estructura atómica de TIC807 (SEQ ID NO: 2).
Restos expuestos a la superficie
La estructura atómica de las proteínas desveladas en el presente documento se determinó en medio del enfoque de selección de pruebas de ingeniería iterativa; y, la accesibilidad relativa al disolvente (% SA) de cada resto se determinó usando el navegador ICM-Molsoft (Molsoft L.L.C., 11199 Sorrento Valley Road, S209, San Diego, CA 92121). En la tabla 3, en las columnas (A) y (B), el % de SA real se calculó para las proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas establecidas como SEQ ID NO: 185 (TIc 807_L11M) y SEQ ID NO: 8 (TIC807_M2). El % de SA previsto para los restos de TIC807 y TIC853 se enumeran en la Tabla 3 en las columnas (A) y (C), respectivamente. En su conjunto, los valores de % de SA informados en la Tabla 3 se calculan como un porcentaje del área superficial accesible al solvente sondeada por una molécula de agua sobre el área accesible máxima al disolvente en conformación extendida convencional (Gly-XXX-Gly) para cada resto en cada posición del estructura atómica. La Tabla 3 alinea los restos de cada proteína por restos alineados en una alineación Clustal W. Puede producirse un % de SA mayor que 100 cuando el área máxima accesible para disolventes en conformación extendida convencional (Gly-XXX-Gly) para cada resto es menor que el área real accesible para disolventes sondeada por una molécula de agua. El % de SA superior a 100 se informa en la tabla como el 100 %.
Los enfoques combinados de selección de pruebas de ingeniería descritos en el presente documento dieron como resultado una cantidad de restos principalmente relevantes que se acumulan en un parche de superficie ([2] de la Figura 2) de restos que tienen un radio de 9,2 -12,2 Angstroms alrededor del átomo de Cb de P219 de SEQ ID NO: 2 (TIC807): V10, I14, N22, N23, G24, 125, Q26, G27, F30, Q38, 139, D40, T41, 143, S193, T194, E195, H196, Y197, S198, H199, Y200, S201, G202, Y203, P204, 1205, L206, T207, W208, I209, S210, Y216, S217, G218, P219, F220, M221, S222, W223, Y224, F225, N239 y V244 de SEQ ID NO: 2 (TIC807). Al menos la mitad de estos restos exhiben valores de % de SA de mayor o igual a quince (15).
Tabla 3. % De accesibilidad de disolvente relativa SA de aminoácidos de eHTP roteínas andamio.
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Unión al receptor
Un parche de superficie ([1] de la Figura 2) de restos que tienen valores de % de SA mayores del 36 % o dentro de aproximadamente 3 restos de un resto que tiene % de SA mayores del 36 % en un radio de 9,2 -12,2 Angstroms del átomo de Cb de S95 de SEQ ID NO: 2 (TIC807) se identificó como una región que comprende restos de una proteína TIC807 que puede sustituirse para proporcionar eHTP que exhiben un espectro inhibidor de Lygus mejorado y/o una actividad inhibidora de Lygus mejorada, Esta región de parche de superficie puede estar asociada a la actividad de unión al receptor de insecto diana; e, incluye los restos T93, S95, S97, F147, Q149, S151, N180, T182, V251, Q253 y S255 de SEQ ID NO: 2 (TIC807). Los eHTP pueden incluir una o más sustituciones de restos de aminoácidos del parche de superficie 1 tales como S95A, F147A, Q149E, y/o, V251A.
Los enfoques combinados de ingeniería-prueba-selección descritos en el presente documento identificaron restos ubicados en el parche de superficie 1 que pueden proporcionar eHTP cuando se sustituyen o se modifican de otra manera. Estos residuos pueden ser importantes para la unión productiva de eHTP a receptores en Lygus intestino de insecto para proporcionar un espectro inhibidor de Lygus mejorado y/o una actividad inhibidora de Lygus mejorada en comparación con TIC807. Las modificaciones de los restos de aminoácidos del parche superficial 1 que pueden proporcionar eHTP incluyen sustituciones que proporcionan grupos aromáticos y/o grupos de enlace de hidrógeno que favorecen la unión a grupos de azúcar que se encuentran en los receptores de insectos glicosilados.
Unión de membrana
Ciertos restos de aminoácidos ubicados en las regiones de la lámina beta de la proteína se identificaron a partir de la estructura atómica de TIC807 y se sustituyeron con restos aromáticos. Más específicamente, los aminoácidos L78, I123, H270, R273, I275 de las regiones plegadas de la hoja beta de TIC807 se sustituyeron con Fenilalanina, Tirosina o Triptófano. Las sustituciones de aminoácidos aromáticos de R273 y 1275 se encontraban entre aquellos restos que proporcionaban un espectro inhibitorio de Lygus potenciado y/o una actividad inhibitoria Lygus mejorada (véase la Tabla 4, datos para las SEQ ID NO: 32, 34, 68, 92 y 122). Es probable que las cadenas laterales de restos de aminoácidos en estas posiciones interactúen con la membrana de los insectos diana.
Sitios de activación proteolítica
Los restos de Glicina que generalmente se cree que están implicados en la proteólisis se sustituyeron con Serinas para alterar la dinámica de la escisión proteolítica. La presencia de un resto de glicina en una región de bucle puede impartir más flexibilidad y, por lo tanto, susceptibilidad a la proteólisis, lo que puede aumentar la actividad inhibidora de insectos o disminuir la actividad inhibidora de insectos. Los restos en las regiones de bucle estructuralmente identificadas se sustituyeron con un resto de glicina y no se observaron mejoras. Las posiciones en bucles que ya eran glicinas, por ejemplo, G18, G24, G27) se sustituyeron con una serina, un pequeño resto en un intento de reducir la susceptibilidad proteolítica, y no se observaron mejoras.
Enfoques de diseño de estructura combinada
La estructura atómica de TIC807 (SEQ ID NO: 2) se usó para identificar regiones de bucle para la mutagénesis de la biblioteca, seguido de pruebas de las variantes modificadas por ingeniería genética. Un bucle en las posiciones de aminoácidos 211-216 de SEQ ID NO: 2 (TIC807) se mutagenizó en biblioteca y se probó. Los bucles consecutivos en estrecha proximidad en las posiciones de aminoácidos 75-83, 161-167 y 267-276 de SEQ ID NO: 2 (TIC807) se mutagenizaron en la biblioteca y se ensayaron.
El análisis de la estructura atómica de TIC807 sugiere que un bucle estructural reside en los residuos 113-138 de la SEQ ID NO: 2, y se diseñaron variantes para estabilizar y desestabilizar el bucle.
En otra región que abarca dos cadenas beta conectadas por un bucle corto, las dos cadenas beta exhibieron un patrón alterno de restos de aminoácidos hidrófobos e hidrófilos en las posiciones 116 a 121 y en las posiciones 133 a 138 con respecto a la SEQ ID NO: 2, característico de los bucles formadores de poros. Se diseñó una biblioteca de expresión para modificar ambos segmentos de cadena beta reemplazando los restos V116, V118 e I120 con combinaciones respectivas 116V/Y/l/H/F/D, 118V/Y/l/H/F/D y 120I/D/F/H/l/N/V/Y para un total de 288 posibles variantes en la biblioteca. Este procedimiento se repitió para: los restos S117, S119 y P121 con sus respectivas combinaciones 117S/A/D/E/G/K/N/R/T, 119S/A/D/E/G/K/N/R/T y 121P/S/T para 243 variantes potenciales; los restos I133, A135 y F137 con las combinaciones respectivas 133I/D/F/N/V/Y, 135A/D/F/H/l/V/Y y 137F/D/H/l/V/Y para 252 posibles variantes; y los restos T134, E136 y N138 con sus respectivas combinaciones 134T/A/D/E/G/K/N/R/S, 136E/A/D/G/K/N/R/S/T y 138N/A/D/G/S/T para 486 posibles variantes. Un espectro inhibidor de Lygus mejorado y/o una actividad inhibidora de Lygus mejorada se asociaron a ciertas de estas sustituciones como se muestra en la Tabla 4.
Relación estructura-función
En su conjunto, se probaron más de 2000 clones (incluyendo los clones de bibliotecas mixtas) que expresan variantes de TIC807 para determinar el espectro inhibidor de Lygus mejorado y/o la actividad inhibidora de Lygus mejorada contra Lygus spp. en comparación con TIC807. Modificaciones semi-aleatorias, modificaciones dirigidas y modificaciones predictivas de estructura-función, incluyendo modelado de estructuras, potencial de unión al receptor, potencial de unión de metal, potencial de oligomerización, uniformidad de distribución de carga superficial, potencial de formación de poros, función de canal iónico e identificación de parches expuestos a la superficie con un objeto de identificar eHTP con un espectro inhibidor de Lygus mejorado y/o una actividad inhibidora de Lygus mejorada en comparación con TIC807. Estos clones se expresaron para pruebas de bioensayo.
Ejemplo 3: Expresión de proteínas y purificación de TIC807, incluyendo variantes y fragmentos
La proteína de control TIC807 es una proteína de 309 aminoácidos de longitud que se puede expresar en forma cristalina en Bacillus thuringiensis (Bt) o forma agregada en E. coli. Las variantes de prueba de los mismos se expresaron recombinantemente en Bt. Una expresión característica de TIC807 y variantes de TIC807 son las formas cristalinas y agregadas predominantes extraídas de las células Bt y E. coli, respectivamente. Para probar la bioactividad de Lygus, las muestras de prueba y control se hicieron adecuadas para el bioensayo de Lygus solubilizando muestras en tampón de carbonato de sodio 25 mM y eliminando materiales no solubilizados por centrifugación. La cantidad de proteína en las muestras de prueba y control se midió utilizando procedimientos de proteína total, por ejemplo, un ensayo de Bradford o un procedimiento ELISA. Se usó electroforesis en gel para determinar la pureza y la concentración de la proteína recombinante solubilizada. La proteína TIC807 etiquetada con C-terminal HIS fue diseñada para facilitar la detección, purificación y cuantificación de grandes cantidades de proteína de control TIC807. Las muestras de prueba TIC807 con etiqueta C-terminal HIS y sin etiqueta TIC807 se analizaron por separado y se confirmó que tienen una actividad equivalente contra Lygus (véanse los ejemplos 4, 5 y 6).
Se realizaron sustituciones de aminoácidos dirigidas al sitio a TIC807_M13 (SEQ ID NO: 34) para elevar la expresión de una forma soluble. Los inventores postulan que las variantes más fácilmente solubles de las proteínas descritas en este documento pueden facilitar la expresión y la purificación, por ejemplo, expresado en células huésped de E. coli; y puede aumentar la eficacia inhibidora de insectos cuando se expresa en células huésped de la planta. Las construcciones de ADN recombinante que codifican TIC807_M13 (SEQ ID NO: 34) se diseñaron de tres formas diferentes para reflejar tres variantes diferentes: Relativo a TIC807_M13, las modificaciones fueron para la Variante n.° 1: I58K y P59K, para la variante n.° 2: S198K y G199K y para la Variante n.° 3: S246R, V248E y Q250R. Relativo a TIC807 (SEQ ID NO: 2), las modificaciones pueden describirse alternativamente como sigue para la Variante n.° 1: I58K y P59k , para la variante n.° 2: S201K y G202K y para la Variante n.° 3: S249R, V251E y Q253R; esta diferencia posicional es congruente debido a una eliminación triple contigua de la SEQ ID NO: 2 (TIC807) en el intervalo de restos 196-201 que se refleja en TIC807_M13 (SEQ ID NO: 34). Las cuatro construcciones de ADN recombinante diseñadas se clonaron y se expresaron en E. coli. La fracción soluble de las cuatro preparaciones de E. coli se evaluaron mediante SDS-PAGE teñida con coomassie, que mostró que TIC807_Ml3 (SEQ ID NO: 34) no era detectable en la fracción soluble; pero, por el contrario, las variantes n.° 1, 2 y 3 fueron solubles. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos similares, ya sea individualmente o en combinación, con las proteínas desveladas en el presente documento para elevar su solubilidad en células huéspedes distintas de Bt o vegetales. Las construcciones de ADN recombinante se diseñaron para codificar y expresar la variante n.° 3 TIC807_M13 (renombrada TIC807_M14; SEQ ID NO: 203 de nucleótidos y SEQ ID NO: 204 de aminoácidos). El lisado de E. coli preparado se aclaró y la proteína recombinante se purificó y se enriqueció en una serie de columnas, incluyendo procedimientos de intercambio iónico y filtración en gel. Las fracciones de proteínas agrupadas se cuantificaron y se determinó que eran activas contra insectos Lygus (véase el Ejemplo 4, Tabla 4B).
Las proteínas desveladas en el presente documento incluyen proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos como se establece como SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ iD NO: 32 o SEQ ID NO: 36, se diseñan para elevar la expresión de una forma soluble cuando se expresa en una célula huésped, por ejemplo, se expresa en Bt, E. coli o en una célula vegetal o en un compartimento de una célula vegetal. El diseño por ingeniería incluye la sustitución de un resto de aminoácido lisina en una o más de las siguientes posiciones 58, 59, 198, 199, 201 o 202; o, un Ácido glutámico en una o más de las siguientes posiciones 198, 248 o 301; o, una Arginina en una o más de las siguientes posiciones 246, 250 o 253.
La región C-terminal sobresale del núcleo monomérico de la proteína (véase la Figura 2). Se diseñó una construcción de ADN recombinante para codificar y expresar una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202, que es un fragmento de proteína (aminoácidos 1 a 301) de TIC807_M8 (SEQ ID NO: 16); y, la proteína expresada se purificó, se cuantificó y se determinó activa contra insectos Lygus (véase el Ejemplo 4, Tabla 4B). Las construcciones de ADN recombinante se diseñaron para codificar y expresar fragmentos de TIC807 que exhiben truncamientos variables del extremo C-terminal de las proteínas desveladas en el presente documento en las respectivas posiciones de TIC807 A281, G289, S293, A301 y S304. Los fragmentos de proteínas están diseñados para codificar y expresar proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 36; y, los fragmentos de proteína expresados se usan como muestras de prueba contra insectos Lygus.
Ejemplo 4: Actividad hemíptera de proteínas de ingeniería
Este ejemplo ilustra que los eHTP tienen una actividad insecticida mejorada o una especificidad insecticida potenciada contra los insectos hemípteros cuando se proporcionan en la dieta de los insectos hemípteros, incluyendo los miembros de los Heteroptera miridae, incluyendo el género Lygus, por ejemplo, Lygus hesperus y Lygus lineolaris, y la familia Cicadellidae, incluyendo el género Amrasca, por ejemplo, Amrasca devastans y Empoasca por ejemplo, Empoasca fabae. Este ejemplo con la Tabla 4B ilustra el ensayo de alimentación utilizado para determinar el espectro inhibidor de Lygus potenciado y/o la actividad inhibidora de Lygus mejorada de proteínas recombinantes expresadas en Bt desveladas en el presente documento contra ambos Lygus hesperus y Lygus lineolaris. Las proteínas expresadas en células huésped bacterianas recombinantes se solubilizaron en tampón de carbonato y se analizaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE); y, se determinaron las concentraciones de proteína por densitometría utilizando albúmina de suero bovino (BSA) como patrón. La solución madre de proteínas (2X) preparada de esta manera se mezcló con la dieta para los ensayos de alimentación.
Los ensayos de alimentación con las especies de hemípteros Lygus hesperus y Lygus lineolaris se basaron en un formato de placa de microtitulación de 96 pocillos con dieta de Lygus encapsulada entre láminas estiradas de Parafilm® y Mylar. La dieta artificial se obtuvo de Bio-Serv® (Bio-Serv® Diet F9644B, Frenchtown, NJ). Se autoclavó, se combinó agua hirviendo (518 ml) con 156,3 g de dieta Bio-Serv® F9644B en un mezclador esterilizado en superficie. Se agregaron los contenidos de cuatro huevos de gallina esterilizados en la superficie y la mezcla se mezcló hasta que quedó suave, después se ajustó a un volumen total de un litro y se dejó enfriar a temperatura ambiente, siendo esta es la dieta 2X. Las muestras de prueba se prepararon mezclando en una proporción 1:1 de dieta 2X y muestra 2X. Una hoja de Parafilm® (Pechiney Plastic Packing, Chicago, IL) se colocó sobre un colector de vacío diseñado para el formato de 96 pocillos (Analytical Research Systems, Gainesville, FL) y se aplicó un vacío de aproximadamente -20 mm de mercurio, suficiente para provocar la extrusión del Parafilm® en los pocillos. Se añadieron veinte a cuarenta |jl de muestra de prueba a las extrusiones de Parafilm®. Una hoja de película de Mylar (Clear Lam Packaging, Inc., Elk Grove Village, IL) se colocó sobre las extrusiones de Parafilm® llenas de muestra y se selló con una plancha de pegajosidad (Bienfang Sealector II, Hunt Corporation, Filadelfia, PA), formando así bolsitas de Parafilm® llenas de dieta. Estas bolsitas de Parafilm® se colocaron sobre una placa de fondo plano de 96 pocillos que contenía huevos de Lygus suspendidos en una solución diluida de agarosa. Al nacer, las ninfas de Lygus se alimentan de la dieta perforando las bolsitas de Parafilm® llenas de dieta. Como alternativa, las ninfas de Lygus recién nacidas se infestaron manualmente en cada pocillo en lugar de huevos. Las puntuaciones de retraso en el crecimiento y mortalidad se determinaron el día 5 y se compararon con los controles. Los datos se analizaron utilizando el software estadístico JMP4. Para cada proteína a una concentración de prueba, se sometieron tres poblaciones de ocho ninfas a este bioensayo y las puntuaciones de mortalidad se informaron en la Tabla 4B.
Para las determinaciones de CL50 enumeradas en la Tabla 1 y la Tabla 4B, las proteínas se presentaron a las ninfas de Lygus recién nacidas a 8-10 concentraciones y las ninfas se dejaron alimentar durante 5 días antes de evaluar la mortalidad en el intervalo de dosis. Para cada concentración, se sometieron tres poblaciones de ocho ninfas a este bioensayo, y todas las determinaciones de CL50 en la Tabla 1 y la Tabla 4B se repitieron al menos una vez.
Para estimaciones de CL50, las proteínas se presentaron a las ninfas de Lygus recién nacidas a 4 concentraciones y las ninfas se dejaron alimentar durante 5 días antes de evaluar la mortalidad en el intervalo de dosis. Las estimaciones de CL50 de Lygus lineolaris se realizaron en TIC807 y TIC807 M2 porque no fue posible proporcionar cantidades significativamente grandes de estas proteínas en exceso de 1000 pg/ml en la dieta de Lygus para completar el alto intervalo de toxicidad dosis respuesta a Lygus lineolaris; y por lo tanto, no se determinó un valor de CL50 para TIC807 0 TIC807_M2. En cambio, se realizó una estimación de CL50 de 4 dosis en el intervalo bajo, y se informó en la Tabla 1 y la Tabla 4B. La CL50 de Lygus lineolaris estimada para TIC807_M14 es 4,4 pg/ml. Para cada concentración, tres poblaciones de ocho ninfas se sometieron a este bioensayo.
Este ejemplo con las Tablas 4A y 4B ilustra el ensayo de alimentación utilizado para determinar el espectro inhibidor potenciado y/o la actividad inhibidora mejorada de una proteína recombinante expresada en Bt desvelada en el presente documento contra Amrasca devastans. Las variantes TIC807 con actividad insecticida mejorada o especificidad insecticida potenciada contra Lygus hesperus y Lygus lineolaris exhiben actividad insecticida mejorada contra Amrasca devastans.
TIC807 y TIC807_M13 se disolvieron en tampón de carbonato de sodio 25 mM, pH 10. Los huevos de Amrasca devastans se recogieron en hojas de ocra y se incubaron en una placa Petri que contenía agar al 2 %. Al nacer, los neonatos se usaron para bioensayos utilizando la dieta de Lygus diluida (1:5). Las proteínas y la dieta se mezclaron en la misma proporción (llevando la concentración final de proteína a 500 pg/ml) y se dispensaron en el campo de prueba. El control sin tratar se preparó mezclando el tampón con la dieta. Los neonatos individuales se infestaron en la arena de prueba, los ensayos se incubaron a 25 °C, 60 % de HR. Veinte ninfas recién nacidas se probaron para cada concentración, proteína y en 2 réplicas. Se mantuvo un control con tampón de carbonato de sodio 25 mM, pH 10, en dieta de Lygus diluida 1:5. La mortalidad de los insectos se determinó al quinto día. Los valores de mortalidad se calcularon mediante la siguiente fórmula: (% de mortalidad en el tratamiento - % de mortalidad en el control)/(100 -% de mortalidad en el control) x 100. La tabla 4A tabula la actividad Amrasca para TIC807 y TIC807_M13 a 5 concentraciones diferentes.
T l 4A. P r n m r li TI 7 TI 7 M1 iri i i Amr
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Los valores de CL50 se determinaron para TIC807 y TIC807_M13 en una prueba separada. La SEQ ID NO: 2 (TIC807) exhibió un valor de CL50 de 116,79 pg/ml y LC90 de 437,27 pg/ml. La SEQ ID NO: 34 (TIC807_M13) exhibió un valor de CL50 de 7,59 pg/ml y LC90 de 239,8 pg/ml.
Un ensayo de alimentación como se describe para Amrasca devastans se usa para probar eHTP para mejorar la actividad insecticida y/o la especificidad insecticida mejorada contra Empoasca fabae. Las variantes TIC807 con actividad insecticida mejorada o especificidad insecticida potenciada contra Lygus hesperus y Lygus lineolaris exhiben actividad insecticida mejorada contra Empoasca fabae.
Los valores de CL50 de Cry51Aa1 (SEQ ID NO: 182), para TIC807 (SEQ ID NO: 2), TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8), TIC807_M10 (SEQ ID NO: 30) y T iC807_M13 (SEQ ID NO: 34) contra Lygus hesperus y Lygus lineolaris se determinaron en un conjunto de pruebas. TIC807_M2, TIC807_M10 y TIC807_M12 exhiben valores CL50 mejorados en comparación con Cry51Aa1.
Debería ser evidente para los expertos en la materia que pueden existir variaciones a este procedimiento que no deberían afectar los resultados.
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Ejemplo 5: Actividades inhibidoras de insectos de miembros proteicos desvelados en el presente documento
Las proteínas divulgadas en el presente documento, tales como TIC807_M1 (SEQ ID NO: 6), TIC807_M2 (SEQ ID NO: 8), TIC807_M3 (SEQ ID NO: 10), TIC807_M4 (SEQ ID NO: 12), TIC807_M5 (SEQ ID NO: 14), TIC807_M6 (SEQ ID NO: 18), TIC807_M7 (SEQ ID NO: 20), TIC807_M8 (SEQ ID NO: 16), TIC807_M9 (SEQ ID NO: 28), TIC807_M11 (SEQ ID NO: 32), TIC807_M13 (SEQ ID NO: 34) y TIC807_M12 (SEQ ID NO: 36), se preparan y se prueban para determinar su bioactividad contra las plagas de plantas distintas de Lygus.
Las proteínas TIC807_M10 (SEQ ID NO: 30), TIC807_M11 (SEQ ID NO: 32), TIC807_M12 (SEQ ID NO: 36) y TIC807_M13 (SEQ ID NO: 34) se prepararon y se probaron para determinar su bioactividad contra plagas del orden Lepidoptera, Coleoptera, Heteroptera y Homoptera. La proteína TIC807_M5 (SEQ ID NO: 14) se preparó y probó para determinar su bioactividad contra plagas de coleópteros. Se realizaron bioensayos para evaluar los efectos de estas proteínas en los insectos como se muestra en la Tabla 5. Los ensayos de alimentación se realizaron con una dieta artificial que contenía la proteína insecticida. La proteína insecticida se preparó como se describe en el ejemplo 3 y se aplicó tópicamente usando una dieta artificial específica para insectos, dependiendo del insecto que se esté probando. La toxina se suspendió en un tampón y se aplicó a una velocidad de 500 pg/ml de muestra por pocillo, y en el caso de TIC807_M5 de 1000 pg/ml, y después se dejó secar. Las puntuaciones medias de retraso en el crecimiento y la mortalidad de la población se determinaron en tres poblaciones de 8 insectos por especie de insecto analizada. Los resultados se expresaron como positivos (+) para reacciones de insectos como retraso del crecimiento y mortalidad que fueron estadísticamente significativas en comparación con el control no tratado. Los resultados se expresaron como negativos (-) si los insectos fueron similares al UTC, es decir, dieta de alimentación a la que solo se ha aplicado el tampón anterior.
Tabla 5. Los eHTP demuestran actividades inhibidoras adicionales de insectos contra plagas que no sean Lygus
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Las proteínas desveladas en el presente documento también se prueban para determinar su bioactividad contra una plaga del filo Nematoda.
Ejemplo 6: Las plantas que expresan proteínas desveladas en el presente documento exhiben actividad inhibidora de insectos
Este ejemplo ilustra la expresión de proteínas desveladas en el presente documento en plantas, y demuestra que las plantas de algodón que expresan estas proteínas exhiben actividad inhibidora de insectos.
Los segmentos de polinucleótidos para uso en la expresión de estas proteínas en plantas se preparan de acuerdo con los procedimientos establecidos en la Patente de EE.UU. 7.741.118. Por ejemplo, las proteínas de toxina que tienen la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 4 (TIC807_4), SEQ iD NO: 6 (TIC807_M1), SEQ ID NO: 8 (TIC807_M2), SEQ ID NO: 10 (TIC807_M3), SEQ ID NO: 12 (TIC807_M4), SEQ ID NO: 14 (TIC807_M5), SEQ ID NO: 16 (TIC807M8), SEQ ID NO: 18 (TIC807_M6), SEQ ID NO: 20 (TIC807_M7), SEQ ID NO: 22 (TIC807_22), SEQ ID NO: 24 (TIC807_24), SEQ ID NO: 26 (TIC807_26), SEQ ID NO: 28 (TIC807_M9), SEQ ID NO: 30 (TIC807_M10), SEQ ID NO: 32 (TIC807_M11) y SEQ ID NO: 34 (TIC807_M13), se expresan a partir de segmentos de polinucleótidos diseñados para su uso en plantas y que codifican estas proteínas, incluyendo las secuencias de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200 y SEQ ID NO: 201, respectivamente.
Se pretende que los segmentos polinucleotídicos (o moléculas polinucleotídicas) que codifican cada una de las proteínas variantes o fragmentos inhibidores de insectos de las mismas, puedan usarse solos o en combinación entre sí, o en combinación con otras proteínas inhibidoras de insectos o agentes inhibidores de insectos tales como moléculas de supresión génica mediadas por ARNbc. Dichas combinaciones están diseñadas para funcionar en un mecanismo sinérgico o compatible con las proteínas aquí descritas. La intención de estas combinaciones es lograr plantas y células vegetales protegidas de la infestación de plagas, particularmente de plagas de insectos. Las proteínas variantes específicas incluyen las proteínas correspondientes a las SEQ ID NO enumeradas en la Tabla 4B y descritas a lo largo de la solicitud.
Los segmentos de polinucleótidos de SEQ ID NO: 188 (codifica para TIC807_M2, SEQ ID NO: 8) y de SEQ ID NO: 192 (codifica para TIC807_M8, SEQ ID NO: 16) fueron diseñados de forma recombinante en construcciones de expresión para la transformación de algodón.
Se produjeron plantas de algodón transgénicas (plantas de algodón recombinantes) y se probó su efectividad. Se seleccionaron plantas transgénicas regeneradas (R0) que eran bajas en número de copias y altas en expresión de la proteína variante respectiva, según lo determinado por varios procedimientos cuantitativos y semicuantitativos, por ejemplo, PCR, ELISA y Westerns. Los niveles de expresión en el tejido de la hoja de algodón R0 oscilaron típicamente entre 0,5 y 500 ppm de peso fresco. Las plantas R0 que expresan altos niveles de proteína fueron transferidas al suelo y autofecundadas. Se sembraron treinta semillas de cada una de las plantas autóctonas R0 y la progenie homocigota para el transgén se cultivó hasta la floración. Se probó la eficacia de once a 18 plantas por 4 a 5 eventos por cada construcción de este ejemplo contra Lygus (Tablas 6A, 6B y 6C). El cultivar de algodón sin transformar, las plantas de la población segregada negativa agrupada (progenie que no contiene el transgén) y las plantas que expresan la proteína madre TIC807 sirvieron como controles negativos. Una rama de una planta de algodón en etapa de floración estaba encerrada en una bolsa de malla hecha de mangas de polinización de plástico transpirable (Vilutis and Co. Inc., Frankfort, IL) y múltiples sucursales establecidas de manera similar. Cada bolsa de malla se aseguró en el tallo usando una corbata. Aproximadamente 4-6 ninfas de Lygus hesperus (<24 horas después de la eclosión) se colocaron en un tubo cónico de 1,4 ml (Matrix Technologies Corp., NH). La rama dentro de una bolsa de malla estaba infestada de ninfas deslizando el tubo cónico sin tapar dentro de la bolsa de malla. Se permitió que los insectos se alimentaran durante un período de 10-11 días antes de que todos los insectos sobrevivientes en la bolsa de malla fueran recolectados en hielo seco. Los supervivientes se pesaron para obtener una masa bruta. Se calculó el porcentaje de mortalidad y la masa media de sobrevivientes. Los insectos desaparecidos se incluyeron en el cálculo del porcentaje de mortalidad. Como se muestra en las Tablas 6A, 6B y 6C, las plantas de algodón que expresan las proteínas variantes TIC807_M2 y TIC807_M8 tuvieron un impacto significativo en el crecimiento y desarrollo de las ninfas de Lygus hesperus. Según estos resultados, estas plantas semilla, construcciones de expresión fueron avanzadas para un desarrollo adicional.
Tabla 6A. % de mortalidad media determinado desde los ensayos de alimentación de Lygus en fase de floración con l n l n x r n l r ín TI 7^ v ri n TI 7 M2 TI 7 M .
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Tabla 6B. Media Instar determinada desde los ensayos de alimentación de Lygus en fase de floración con plantas l n x r n l r ín TI 7 v ri n TI M2 TI 7 M .
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continuación
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Tabla 6C. Masa de supervivencia media determinada a partir de los ensayos de alimentación de Lygus en etapa de
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Std Dev = desviación estándar
SEM = error estándar de la media
Lo 95 % = límite inferior al intervalo de confianza del 95 %
Up 95 % = límite superior al intervalo de confianza del 95 %
Agrupación T = Usando una prueba de diferencia menos significativa, Valor F = 101,1756, df = 15, 44, Pr < 0,0001
En otro ejemplo, las plantas de algodón de cinco eventos transgénicos que expresan TIC807_M11 se probaron en un ensayo de campo que tuvo presiones de infestación de Lygus naturales. Estas plantas demostraron efectividad en campo en comparación con la línea receptora no transgénica (germoplasma DP393 usado para transformación). El número promedio de insectos Lygus lineolaris en cinco plantas por evento fueron significativamente menores que el número promedio de insectos Lygus lineolaris en plantas del control no transgénico. El rendimiento del algodón de semillas de plantas de los cinco eventos fue estadísticamente comparable al rendimiento de algodón de semillas del control no transgénico, por ejemplo, retención cuadrada de toda la temporada.
En otra prueba de campo similar, las plantas de algodón de siete eventos transgénicos que expresan TIC807_M10 demostraron eficacia de campo en comparación con el control no transgénico. El número promedio de insectos Lygus lineolaris en cinco plantas por evento fueron significativamente menores que el número promedio de insectos Lygus lineolaris en plantas del control no transgénico. El rendimiento del algodón de semillas de plantas de tres de los siete eventos fue estadísticamente mayor que el rendimiento de algodón de semillas del control no transgénico.
En otro ejemplo, Las plantas de algodón de treinta y cuatro eventos transgénicos que expresaban TIC807_M13 demostraron la eficacia de la cámara de crecimiento en comparación con el control no transgénico. Se colocaron bolsas de malla alrededor de todas las plantas de algodón en la etapa de floración (en lugar de solo alrededor de las ramas individuales descritas anteriormente en este ejemplo). Se evaluaron cinco plantas por evento y el número promedio de insectos recuperados Lygus lineolaris (ninfas a adultos a Lygus de 2a generación) por planta fue significativamente menor que el número promedio de insectos Lygus lineolaris por planta no transgénica.
Se realizan experimentos similares con plantas que expresan proteínas enumeradas en la Tabla 1 y en las Tablas 4A y 4B.
Ejemplo 7: El tejido de las plantas de alfalfa que expresan proteínas desveladas en el presente documento inhibe la actividad inhibidora de insectos
Este ejemplo ilustra la expresión de proteínas desveladas en el presente documento en plantas de alfalfa y demuestra que el tejido de las plantas de alfalfa que expresan estas proteínas exhiben actividad inhibidora de insectos.
El segmento de polinucleótidos de SEQ ID NO: 192 (codifica para TIC807_M8, SEQ ID NO: 16) se diseñó de forma recombinante en tres construcciones de expresión configuradas de manera diferente para la transformación de alfalfa. Para fines de informes de datos, las tres construcciones recombinantes están codificadas [ER], [ES] y [ET].
Las plantas de alfalfa transgénicas (plantas de alfalfa recombinante) se recuperaron de los transformantes que se cruzaron y luego se autopolinizaron. Se seleccionaron plantas de alfalfa recombinantes que tenían un bajo número de copias y una alta expresión de TIC807 según lo determinado por RT-PCR y procedimientos Western semicuantitativos, respectivamente. Se agruparon tejidos de plantas de alfalfa de diez eventos separados, se liofilizaron, se molieron y se resuspendieron en el tampón de almacenamiento, NaCarb 25 mM, pH 10,5. Se preparó tejido vegetal de Alfalfa que no tiene transgén que expresa TIC807_M8 para su uso como control. Las preparaciones madre se diluyeron en serie 100, 300 y 900 veces para su incorporación a la dieta de Lygus. Usando el procedimiento de ensayo de alimentación del Ejemplo 4, las puntuaciones de mortalidad y retraso en el crecimiento se determinaron el día 5 y se compararon con los controles (véanse las Tablas 7A y 7B; los datos se analizaron utilizando el software estadístico JMP4). Para cada muestra de prueba y cada dilución, tres poblaciones de ocho ninfas se sometieron a este bioensayo. Las puntuaciones de retraso en el crecimiento corresponden a clasificaciones de masa visual donde 0 = no hay diferencia con el control negativo, 1 = aproximadamente 25 % menos de masa, 2 = aproximadamente 50 % menos de masa y 3 = aproximadamente 75 % menos de masa. Se informa el promedio de las puntuaciones de retraso en el crecimiento para cada población de ocho ninfas.
Tabla 7A. Mortalidad % media determinada a partir de ensayos de alimentación de Lygus con dieta incorporada con
Figure imgf000068_0001
Tabla 7B. Retraso en el crecimiento % medio determinado a partir de ensayos de alimentación de Lygus con dieta in r r n i l n lf lf x r n l v ri n TI 7 M l r ín TI 7.
Figure imgf000068_0002
Ejemplo 8: Plantas que coexpresan un eHTP y una segunda proteína inhibidora de insectos que exhibe actividad inhibidora de especies de Lygus
Se prepararon muestras de proteínas que contenían diversas mezclas de TIC1415 y TIC807_M13 y se analizaron en bioensayo. La proteína TIC1415 y otras proteínas inhibidoras de Lygus se describen en la Publicación de Solicitud de Patente PCT WO 2012/139004. Se alimentaron mezclas de muestra a Lygus lineolaris usando un ensayo de bioactividad. La proteína TIC1415 sola y la TIC807_M13 sola también se prepararon como controles positivos. Se usó tampón como control negativo. Las muestras de los tres tipos de preparaciones exhibieron mortalidad contra Lygus lineolaris y los supervivientes quedaron atrofiados. Las puntuaciones de mortalidad y retraso en el crecimiento fueron significativas en comparación con las puntuaciones de bioactividad de los insectos alimentados con tampón (véase la Tabla 8A). Los datos sugieren que no hay efectos antagónicos. Se realizan pruebas de bioensayo adicionales en mezclas para demostrar efectos sinérgicos y/o aditivos.
Figure imgf000069_0001
Las plantas de algodón que comprenden eventos con ADN transgénico se diseñaron para coexpresar las proteínas respectivas TIC1415 y TIC807_M13. Tales plantas se evaluaron en un ensayo de planta completa enjaulada infestada de Lygus lineolaris. Cinco plantas de cada diez eventos fueron enjauladas e infestadas con 2 pares de machos y hembras de L. lineolaris por planta. El ensayo se incubó en una cámara de crecimiento en condiciones ambientales normales para el desarrollo de la planta de algodón durante 21 días. Las plantas de control negativo DP393 se cultivaron de manera similar. Al final del periodo de 3 semanas, se contaron los Lygus de diversas etapas de desarrollo. Se calculó el número medio por planta de insectos Lygus hesperus en cada etapa del desarrollo (véase la Tabla 8B).
Tabla 8B. Datos in planta para la mezcla de proteínas: TIC1415 combinada con TIC807_M13
Construcción Evento N Media Ninfas Ninfas Media Media MEB Agrupación 3a Media 4a Media 5a vivos 2a total 2da de Tukey Instar o Instar Instar gen. gen.
< Adultos Lygus
12 021 5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 B
625 5 0,20 0,20 0,20 0,00 0,60 0,24 B 830 5 2,20 0,20 0,00 0,00 2,40 1,12 AB 890 5 4,40 0,00 0,20 0,00 4,60 2,62 AB 521 5 4,60 0,60 0,00 0,00 5,20 4,27 AB 980 5 3,40 1,20 1,20 0,00 5,80 4,86 AB

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido inhibidor de insectos que comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 34, en el que dicho polipéptido inhibidor de insectos exhibe actividad inhibitoria contra una especie de insectos del orden Hemiptera.
2. El polipéptido inhibidor de insectos de la reivindicación 1, en el que dicha especie de insectos hemípteros se selecciona de Lygus sp. un Empoasca sp. y un Amrasca sp.
3. El polipéptido inhibidor de insectos de la reivindicación 2, en el que dicha especie de insectos hemípteros se selecciona del grupo que consiste en Lygus hesperus, Lygus lineolaris, Amrasca devastans y una combinación de los mismos.
4. Un polinucleótido que codifica el polipéptido inhibidor de insectos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. El polinucleótido de la reivindicación 4, codificando dicho polinucleótido el polipéptido inhibidor de insectos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y que comprende la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 201.
6. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4, en la que la célula huésped es una célula huésped bacteriana seleccionada de Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Escherichia, Pseudomonas o Salmonela o una célula huésped vegetal.
7. La célula huésped de la reivindicación 6, en la que la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus thuringiensis o una célula de Escherichia coli.
8. Una composición inhibidora de insectos que comprende el polipéptido inhibidor de insectos de la reivindicación 1.
9. La composición inhibidora de insectos de la reivindicación 8, que comprende además al menos un agente inhibidor de insectos diferente del polipéptido inhibidor de insectos seleccionado de una proteína inhibidora de insectos, una molécula de ARNbc inhibidora de insectos y un producto químico inhibidor de insectos, en la que dicho al menos un agente inhibidor de insectos exhibe actividad contra una o más especies de plagas del orden Lepidoptera, Coleoptera o Hemiptera, en la que dicho producto químico inhibidor de insectos se selecciona del grupo que consiste en piretrinas y piretroides sintéticos, derivados de oxadizina, cloronicotinilos, derivados de nitroguanidina, triazoles, organofosfatos, pirroles, pirazoles, fenil pirazoles, diacilhidrazinas, productos biológicos/de fermentación y carbamatos.
10. Un procedimiento de lucha contra una plaga de hemípteros, comprendiendo el procedimiento presentar a dicha plaga de hemípteros una cantidad inhibidora del polipéptido inhibidor de insectos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la presentación es a través de la expresión del polipéptido inhibidor de insectos en una planta de algodón.
12. Una planta transgénica, célula vegetal o parte de la planta que comprende el polipéptido inhibidor de insectos de la reivindicación 1.
13. Un procedimiento de lucha contra una plaga de hemípteros, que comprende exponer la plaga de hemípteros a la planta transgénica, la célula vegetal o parte de planta de la reivindicación 12, en el que dicha planta, célula de la planta o parte de la planta expresa una cantidad inhibidora de hemípteros del polipéptido inhibidor de insectos, en el que dicha plaga de insectos hemípteros se selecciona del grupo que consiste en bichos de plantas de la Familia Miridae, cigarras de la Familia Cicadidae, saltahojas de las Familias Cicadellidae, Delphacidae y Lophopidae, saltahojas de las Familias Fulgoroidea y Delphacidae, salta árboles de la Familia Membracidae, psílidos de la Familia Psyllidae, moscas blancas de la Familia Aleyrodidae, pulgones de la Familia Aphididae, filoxera de la Familia Phylloxeridae, cochinillas de la Familia Pseudococcidae, cochinillas placa de las Familias Coccidae, Diaspididae y Margarodidae, chinches de encaje de la Familia Tingidae, chinches de la Familia Pentatomidae, chinches de la familia Lygaeidae, chinches de la familia Cercopidae, chinches de la familia Coreidae, chinches rojos y teñidores de algodón de la familia Pyrrhocoridae, Acrosternum hilare (chinche verde), Anasa tristis (chinche de la calabaza), Blissus leucopterus leucopterus (insecto chinchudo), Corythuca gossypii (insecto de encaje del algodón), Cyrtopeltis modesta (chinche del tomate), Dysdercus suturellus (teñidor de algodón), Euschistus servus (chinche marrón), Euschistus variolarius (chinche de una mancha), Graptostethus spp. (complejo de chinches de semillas), Leptoglossus corculus (chinche de hoja de pino de patas de hoja), Lygus lineolaris (chinche de planta empañada), Lygus hesperus (chinche de la planta empañada del oeste), Nezara viridula (chinche verde del sur), Oebalus pugnax (chinche de arroz), Oncopeltus fasciatus (chinche del algodoncillo) y Pseudatomoscelis seriatus (pulguilla del algodón).
14. Un procedimiento para hacer que una planta sea resistente a la infestación de plagas de hemípteros, que comprende las etapas de introducir un polinucleótido de la reivindicación 6 en una célula vegetal; regenerar a partir de dicha célula vegetal de una planta transgénica que expresa una cantidad inhibidora de insectos de dicho polipéptido inhibidor de insectos; y demostrar la resistencia a la infestación de plagas de hemípteros como una propiedad de dicha planta transgénica.
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8609936B2 (en) 2007-04-27 2013-12-17 Monsanto Technology Llc Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis
CN111197051B (zh) 2011-04-07 2023-10-20 孟山都技术公司 具有对抗半翅目和/或鳞翅目昆虫的活性的昆虫抑制毒素家族
US9322033B2 (en) 2012-04-06 2016-04-26 Monsanto Technology Llc Proteins toxic to hemipteran insect species
AR097292A1 (es) * 2013-08-09 2016-03-02 Monsanto Technology Llc Toxina pesticida activa contra insectos coleópteros y/o hemípteros
CN106133142B (zh) 2014-03-28 2020-10-30 孟山都技术公司 具有抗鞘翅目昆虫活性的杀虫毒素蛋白
WO2016061377A2 (en) 2014-10-16 2016-04-21 Monsanto Technology Llc Lepidopteran-active cry1da1 amino acid sequence variant proteins
US10487123B2 (en) 2014-10-16 2019-11-26 Monsanto Technology Llc Chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests
WO2016061392A1 (en) 2014-10-16 2016-04-21 Monsanto Technology Llc Proteins toxic or inhibitory to lepidopteran insects
CR20210268A (es) 2014-10-16 2021-07-14 Monsanto Technology Llc PROTEÍNAS QUIMÉRICAS INSECTICIDAS NOVEDOSAS TÓXICAS O INHIBIDORAS DE PLAGAS DE LEPIDÓPTEROS (Divisional 2017-0198)
BR122020006739B1 (pt) 2014-11-20 2024-01-23 Monsanto Technology Llc Cassete de expressão, célula hospedeira bacteriana, composição inibidora de inseto, método para controlar uma praga de espécie coleoptera, e vetor recombinante
US11130964B2 (en) 2014-11-20 2021-09-28 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory proteins
MX2017011525A (es) * 2015-03-11 2018-01-30 Pioneer Hi Bred Int Combinaciones insecticidas de pip-72 y metodos de uso.
US20180216131A1 (en) * 2015-03-27 2018-08-02 Institute Of Cotton Research, Chinese Academy Of Agricultural Sciences Artificially synthesized insect-resistant protein, biological materials associated therewith, and use thereof
US10036037B2 (en) 2015-08-18 2018-07-31 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory proteins
ES2892627T3 (es) 2015-08-27 2022-02-04 Monsanto Technology Llc Proteínas inhibidoras de insectos novedosas
PT3370527T (pt) 2015-11-02 2023-11-07 Monsanto Technology Llc Evento transgénico do algodão mon 88702 e métodos para deteção e utilizações do mesmo
CA3018384A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN106434948B (zh) * 2016-10-26 2019-10-18 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所 水稻抗褐飞虱基因Bph31(t)的分子标记及其应用
US20230235352A1 (en) 2020-07-14 2023-07-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN112410346B (zh) * 2020-11-30 2023-07-25 中国计量大学 一种提升生防真菌杀虫毒力的方法
AR124445A1 (es) 2020-12-21 2023-03-29 Monsanto Technology Llc Proteínas inhibidoras de insectos novedosas
UY39585A (es) 2020-12-23 2022-07-29 Monsanto Technology Llc Proteínas que exhiben actividad inhibidora de insectos frente a plagas con importancia agrícola de plantas de cultivo y semillas
CA3206691A1 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Monsanto Technology Llc Novel insect inhibitory proteins
WO2024046429A1 (zh) * 2022-09-01 2024-03-07 青岛清原种子科学有限公司 一种突变杀虫蛋白Vip3及其应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE960442L (en) 1988-12-27 1990-06-27 Takeda Chemical Industries Ltd Guanidine derivatives, their production and insecticides
JP3364616B2 (ja) 1989-02-24 2003-01-08 モンサント テクノロジー エルエルシー 合成植物遺伝子と調製方法
TW198724B (es) 1990-10-24 1993-01-21 Ciba Geigy Ag
US5308760A (en) 1992-01-10 1994-05-03 Washington Research Foundation Crystal proteins of Bacillus thuringiensis, genes encoding them, and host expressing them
TW240163B (en) 1992-07-22 1995-02-11 Syngenta Participations Ag Oxadiazine derivatives
US5322687A (en) 1993-07-29 1994-06-21 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects
FR2729825A1 (fr) 1995-01-30 1996-08-02 Rhone Poulenc Agrochimie Associations insecticides comprenant un insecticide de la famille des chloronicotinyls et un insecticide a groupe pyrazole,pyrrole ou phenylimidazole pour traiter les semences ou le sol
US5723440A (en) 1995-06-07 1998-03-03 Mycogen Corporation Controlling hemipteran insect pests with Bacillus thuringiensis
WO2001071042A2 (en) 2000-03-23 2001-09-27 Pe Corporation (Ny) Detection kits, such as nucleic acid arrays, for detecting the expression of 10,000 or more drosophila genes and uses thereof
CN101385467B (zh) * 2001-03-30 2014-11-05 辛根塔参与股份公司 新的杀虫毒素
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
US7524810B1 (en) * 2003-10-03 2009-04-28 Dow Agrosciences Llc Modified Cry34 proteins
AU2005244258B2 (en) 2004-04-09 2010-07-01 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for control of insect infestations in plants
US7674959B2 (en) 2005-04-01 2010-03-09 Athenix Corporation Axmi-027, axmi-036 and axmi-038, a family of delta-endotoxin genes and methods for their use
WO2006133182A2 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insect-specific protease recognition sequences
EP1920060B1 (en) 2005-08-31 2011-04-13 Monsanto Technology LLC Insecticidal compositions and methods for making insect-resistant transgenic plants
US8609936B2 (en) * 2007-04-27 2013-12-17 Monsanto Technology Llc Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis
AR073237A1 (es) * 2008-08-29 2010-10-20 Monsanto Technology Llc Proteinas de bacillus thuringiensis que son toxinas activas contra hemipteros y coleopteros
AU2010217915B2 (en) * 2009-02-27 2016-03-17 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Pesticidal proteins and methods for their use
CN111197051B (zh) 2011-04-07 2023-10-20 孟山都技术公司 具有对抗半翅目和/或鳞翅目昆虫的活性的昆虫抑制毒素家族
US9322033B2 (en) 2012-04-06 2016-04-26 Monsanto Technology Llc Proteins toxic to hemipteran insect species

Also Published As

Publication number Publication date
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WO2013152264A3 (en) 2013-11-21
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CA2868815A1 (en) 2013-10-10
CA2868815C (en) 2017-10-24
AU2013243348A1 (en) 2014-10-30

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