CN118271409A - 一种Cry51Aa1蛋白及其在控制害虫上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种Cry51Aa1蛋白及其在控制害虫特别是绿盲蝽或蓟马上的应用。所述Cry51Aa1蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2‑10，其产生了优异的抗虫特性，尤其是可对植物进行全生育期、全植株的保护以防治蓟马、绿盲蝽害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定、彻底，简单、方便、经济。

Description

一种Cry51Aa1蛋白及其在控制害虫上的应用
技术领域
本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种Cry51Aa1蛋白及其在控制害虫特别是绿盲蝽或蓟马上的应用。
背景技术
玉米/棉花分别是中国重要的粮食作物/纤维作物，每年因害虫特别是蓟马/绿盲蝽造成的粮食损失/经济损失巨大，更甚者影响到当地人口的生存状况。为了防治害虫，人们通常采用的主要防治方法有：农业防治、化学防治、物理防治和生物防治。然而，为了解决上述防治方法在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。例如，转基因表达苏云金芽孢杆菌(Bt)抗虫蛋白Cry1Ac、Cry2Ab的棉花有效地控制了鳞翅目害虫如棉铃虫、棉红铃虫等；利用Cry1Ab开发了对玉米螟具有抗性的玉米。
发明内容
本发明的目的是提供一种Cry51Aa1蛋白及其在控制害虫特别是绿盲蝽或蓟马上的应用。
本发明提供一种Cry51Aa1蛋白，包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:2-10。
本发明还提供一种控制害虫的方法，其包括将害虫至少与所述Cry51Aa1蛋白接触。
在一个具体实施方式中，所述Cry51Aa1蛋白存在于至少产生所述Cry51Aa1蛋白的宿主细胞中，所述害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述Cry51Aa1蛋白接触。
在另一个具体实施方式中，所述Cry51Aa1蛋白存在于至少产生所述Cry51Aa1蛋白的细菌或转基因植物中，所述害虫通过摄食所述细菌或所述转基因植物的组织至少与所述Cry51Aa1蛋白接触，接触后所述害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对其危害植物的控制。
在一个具体实施方式中，所述转基因植物为玉米、大豆、棉花或油菜；或所述害虫为绿盲蝽害虫或蓟马害虫。
在一个具体实施方式中，所述Cry51Aa1蛋白在大肠杆菌中的核苷酸序列具有SEQID NO:12-20所示的核苷酸序列；所述Cry51Aa1蛋白在转基因拟南芥中的核苷酸序列具有SEQ ID NO:22-30所示的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，所述转基因植物还包括至少一种不同于编码所述Cry51Aa1蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
在另一个具体实施方式中，所述第二种核苷酸编码其他Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶；或者所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
本发明还提供一种所述Cry51Aa1蛋白在控制害虫上的用途。
本发明还提供一种产生控制害虫的植物的方法，其包括向所述植物的基因组中引入编码所述Cry51Aa1蛋白的核苷酸序列。
本发明还提供一种产生控制害虫的植物种子的方法，其包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码所述Cry51Aa1蛋白的核苷酸序列的种子。
本发明还提供一种培养控制害虫的植物的方法，其包括：种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括编码所述Cry51Aa1蛋白的核苷酸序列；
使所述植物种子长成植株；
使所述植株在人工接种害虫和/或害虫自然发生危害的条件下生长，收获与其他不具有编码所述Cry51Aa1蛋白的核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量的植株。
术语“转基因”植物是指包含异源多核苷酸的植物。优选地，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得多核苷酸传递至连续世代。异源多核苷酸可以单独整合到基因组中或作为重组表达盒的一部分整合。“转基因”在本文中用于指任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型由于异源核酸的存在而被改变，包括那些最初被改变的转基因生物体或细胞，以及从初始转基因生物体或细胞杂交或无性繁殖所产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不旨在包括通过常规植物育种方法(例如，杂交)或通过天然发生的事件(如，自体受精、随机杂交受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)改变基因组(染色体或染色体外)。所述转基因植物可以处于任意生育期。
所述对害虫危害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
术语“野生型”指的是可以在自然界中被发现存在的核酸分子或蛋白质。
在本发明中，“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，特别是单子叶或双子叶植物。在一个具体实施方式中，所述植物为棉花、玉米、大豆或油菜。
在本发明中，术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。
在本发明中，“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。
在本发明中，“宿主生物”应理解为可以引入突变型蛋白编码核酸的任何单细胞或多细胞生物，包括例如细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。
所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述Cry51Aa1蛋白的多核苷酸的植物。
本发明中所述的“接触”，是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或具有产生杀虫蛋白的微生物。
本发明术语“控制”和/或“防治”是指害虫至少与Cry51Aa1蛋白接触，接触后害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地，害虫通过摄食植物组织至少与Cry51Aa1蛋白接触，接触后全部或部分害虫生长受到抑制和/或导致死亡。抑制是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种效应，如生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，含有编码Cry51Aa1蛋白的多核苷酸序列的控制害虫的植物和/或植物种子，在人工接种害虫和/或害虫自然发生危害的条件下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不限于改善的茎秆抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。Cry51Aa1蛋白对害虫的“控制”和/或“防治”作用是可以独立存在的，不因其它可“控制”和/或“防治”害虫的物质的存在而减弱和/或消失。具体地，转基因植物(含有编码Cry51Aa1蛋白的多核苷酸序列)的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生，Cry51Aa1蛋白和/或可控制害虫的另一种物质，则所述另一种物质的存在既不影响Cry51Aa1蛋白对害虫的“控制”和/或“防治”作用，也不能导致所述“控制”和/或“防治”作用完全和/或部分由所述另一种物质实现，而与Cry51Aa1蛋白无关。通常情况下，在大田，害虫摄食植物组织的过程短暂且很难用肉眼观察到，因此，在人工接种害虫和/或害虫自然发生危害的条件下，如转基因植物(含有编码Cry51Aa1蛋白的多核苷酸序列)的任何组织存在死亡的害虫、和/或在其上停留生长受到抑制的害虫、和/或与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，即为实现了本发明的方法和/或用途，即通过害虫至少与Cry51Aa1蛋白接触以实现控制害虫的方法和/或用途。
在本发明中，Cry51Aa1蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第1亲本)可以通过遗传工程操作表达Cry51Aa1蛋白质，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。因此在本发明中可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达。
本发明所述的绿盲蝽(Apolygus lucorum)，为半翅目盲蝽科渐变态昆虫。成虫体长5mm，宽2.2mm，绿色，密被短毛。头部三角形，黄绿色，复眼黑色突出，无单眼，触角4节丝状，较短，约为体长2/3，第2节长等于3、4节之和，向端部颜色渐深，1节黄绿色，4节黑褐色。前胸背板深绿色，布许多小黑点，前缘宽。小盾片三角形微突，黄绿色，中央具1浅纵纹。前翅膜片半透明暗灰色，余绿色。足黄绿色，肠节末端、财节色较深，后足腿节末端具褐色环斑，雌虫后足腿节较雄虫短，不超腹部末端，跗节3节，末端黑色。卵长1mm，黄绿色，长口袋形，卵盖奶黄色，中央凹陷，两端突起，边缘无附属物。若虫5龄，与成虫相似。初孵时绿色，复眼桃红色。2龄黄褐色，3龄出现翅芽，4龄超过第1腹节，2、3、4龄触角端和足端黑褐色，5龄后全体鲜绿色，密被黑细毛；触角淡黄色，端部色渐深；眼灰色。
本发明所述的西花蓟马，Frankliniella occidentalis(Pergande)，属于缨翅目蓟马科花蓟马属。卵，肾形，白色，0.25mm长，田间条件下卵期5～15天，而在25℃下平均2.6天。若虫：有4个龄期。若虫孵化后即开始取食，初孵若虫体白色，蜕皮前变为黄色，2龄若虫蜡黄色，非常活跃，取食量为1龄若虫的3倍，接近成熟时表现负趋光性，离开植物入土蜕皮成为3龄若虫(前蛹)，再蜕一次皮即为4龄若虫(伪蛹)。若虫的发育起点温度为9.4℃，田间若虫的发育历期为9～12天，到冬季可延长至60天，而在恒温25℃条件下1龄和2龄若虫发育仅需2.3和3.7天，若虫和成虫常小群集取食。成虫细小，平均体长1.5mm。翅窄，翅前缘缨毛显著短于后缘缨毛。能飞、善跳，能借助气流作短距离迁移。成虫体色从淡黄色至褐色，触角8节。雌虫经常将卵产在叶肉组织、花序或幼果内。
西花蓟马食性杂，已知寄主植物多达500余种，包括重要的菊科、葫芦科、豆科、十字花科等作物，主要有李、桃、苹果、葡萄、草莓、茄、辣椒、生菜、番茄、豆、兰花、菊花等，随着西花蓟马的不断扩散蔓延，其寄主种类一直在持续增加。对于不同种类的寄主植物，西花蓟马虽有喜好程度的差别，但均能生存且具有相当的繁殖能力。西花蓟马以特殊的口器锉吸寄主植物的叶、芽、花或茄果汁液，被害叶片初呈白色斑点后连成片，叶片正面似斑点病害，叶背则有黑色虫粪，严重危害时叶片变小、皱缩，甚至黄花、干枯、调萎，花器受害呈白斑点或呈褐色，果实受害多留下创痕，甚至造成疮疤，花卉作物受害后表现为叶片和花瓣褪色并留下食痕，影响花卉的外观和商品价值，受侵染的花蕾花朵畸形，严重者造成花不能正常开放。西花蓟马远距离扩散主要依靠人为因素。种苗、花卉及其它农产品的调运，尤其是切花运输及人工携带是其远距离传播的主要方式。其生存能力强，经过辗转运销到外埠后西花蓟马仍能存活。另外，该害虫与很容易随风飘散，易随衣服、运输工具等携带传播。西花蓟马容易传播病毒病，我国已经将其列为检疫对象。
本发明中所述的Cry51Aa1蛋白是一类β-开孔蛋白，而昆虫肠道内的酶切活化、与昆虫肠道上的受体结合以及肠道内的理化环境是β-开孔蛋白起作用的关键点，只有能够将β-开孔蛋白进行酶切成活性片段后，并与昆虫肠道上皮细胞膜上的受体结合，才有可能使得某个β-开孔蛋白对该害虫具有抗虫效果。受体结合过程需要精确匹配，往往开孔蛋白或受体蛋白上的一个氨基酸差异就能造成与同一受体的结合发生改变。例如同属于β-开孔蛋白的气溶素蛋白(aerolysin)在R336A突变后，对CTLL-2细胞系的毒力产生了质的变化(Osusky,Teschk等，2008)。同样由于受体发生了变化也可导致同一个β-开孔蛋白的毒力发生变化。例如采用dsRNA将MDCK细胞系上的HAVCR1基因进行抑制，导致了ε-毒蛋白(epsilon-toxin)对细胞的毒力产生了百倍差异(Ivie,Fennessey等，2011)。这充分说明了β-开孔蛋白与昆虫体内酶和受体的相互作用方式是复杂且难以预料的。
本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核、质体和线粒体基因组。
本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。
本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了DNA的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子(密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(ORF)阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA。
本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明Cry51Aa1基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明Cry51Aa1基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6×SSC、0.5％SDS溶液中，在65℃下发生特异性杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。
因此，具有抗虫活性并在严格条件下与本发明SEQ ID NO:12-20或22-30杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40％-50％同源，大约60％、65％或70％同源，甚至至少大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性。
本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的杀虫活性特征的部分和/或片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有杀虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗害虫的生物活性的蛋白。
本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)蛋白质为昆虫毒素。
使用标准技术可以修饰基因和容易的构建基因变异体。例如，本领域熟知制造点突变的技术。又例如美国专利号5605793描述了在随机断裂后使用DNA重装配产生其它分子多样性的方法。可以使用商业化核酸内切酶制造全长基因的片段，并且可以按照标准程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶诸如Bal31或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。还可以使用多种限制性内切酶获取编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接获得这些毒素的活性片段。
本发明可以从β-开孔蛋白分离物和/或DNA文库衍生出等价蛋白和/或编码这些等价蛋白的基因。有多种方法获取本发明的杀虫蛋白。例如，可以使用本发明公开和要求保护的杀虫蛋白的抗体从蛋白质混合物鉴定和分离其它蛋白。特别地，抗体可能是由蛋白最恒定和与其它β-开孔蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)或western印迹方法使用这些抗体专一地鉴定有特征活性的等价蛋白。可使用本领域标准程序容易的制备本发明中公开的蛋白或等价蛋白或这类蛋白的片段的抗体。然后可以从微生物中获得编码这些蛋白的基因。
由于遗传密码子的丰余性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本上相同的蛋白的可替代DNA序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的DNA序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响杀虫活性的序列，亦包括保留杀虫活性的片段。
本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为：小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。
保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年纽约学术出版社(Academic Press)出版的《Protein》中进行了描述。最常见的互换有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thu/Ser，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly，以及它们相反的互换。
对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(如参见，Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的抗虫活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定(参见，如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol 224:899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLetters 309：59-64)。
在本发明中，Cry51Aa1蛋白包括但不限于SEQ ID NO:2-10，与SEQ ID NO:2-10所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于78％，优选的大于85％，更优选的大于90％，甚至更优选的大于95％，并且可以大于99％。也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性和/或类似性。
本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子、增强子、前导序列、内含子以及其它可操作地连接到所述Cry51Aa1蛋白的调节序列。
所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、玉米Ubi启动子、水稻GOS2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(pinⅠ和pinⅡ)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。
所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV(玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP)；苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列(AMVRNA4)；烟草花叶病毒(TMV)前导序列。
所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)增强子、玄参花叶病毒(FMV)增强子、康乃馨风化环病毒(CERV)增强子、木薯脉花叶病毒(CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病毒(MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒(PCLSV)增强子。
对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Act1内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子。
所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂Ⅱ(pinⅡ)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。
本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。
本发明中所述的“杀虫”或“抗虫”是指对农作物害虫是有毒的，从而实现“控制”和/或“防治”农作物害虫。优选地，所述“杀虫”或“抗虫”是指杀死农作物害虫。更具体地，目标昆虫是绿盲蝽害虫或蓟马害虫(如玉米黄呆蓟马、禾蓟马、稻蓟马或西花蓟马)。
本发明中Cry51Aa1蛋白对害虫具有毒性。本发明中的植物，特别是玉米、大豆和棉花，在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含编码Cry51Aa1蛋白的核苷酸序列，害虫通过摄食植物组织与该蛋白接触，接触后害虫生长受到抑制和/或导致死亡。抑制是指致死或亚致死。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，该植物可基本消除对化学或生物杀虫剂的需要(所述化学或生物杀虫剂为针对Cry51Aa1蛋白所靶向的害虫的杀虫剂)。
植物材料中杀虫蛋白(β-开孔蛋白)的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的mRNA进行定量，或直接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量。
可以应用不同的试验测定植物中β-开孔蛋白的杀虫效果。本发明中目标昆虫主要为绿盲蝽害虫或蓟马害虫。
本发明中，所述Cry51Aa1蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO:2-10所示的氨基酸序列。除了包含Cry51Aa1蛋白的编码区外，也可包含其他元件，例如编码选择性标记的蛋白质。
此外，包含编码本发明Cry51Aa1蛋白的核苷酸序列的表达盒在植物中还可以与至少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敌草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗性基因、对氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂(如PPT)的抗性基因，从而获得既具有高杀虫活性、又具有除草剂抗性的转基因植物。
本发明中，将外源DNA导入植物，如将编码所述Cry51Aa1蛋白的基因或表达盒或重组载体导入植物细胞，常规的转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。
本发明的有益效果为：所述Cry51Aa1蛋白产生了优异的抗虫特性，尤其是可对植物进行全生育期、全植株的保护以防治蓟马和绿盲蝽害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定、彻底，简单、方便、经济。
附图说明
图1为本发明具有杀虫蛋白用途的含有Cry51Aa1核苷酸序列的重组表达载体pET15b-Cry51Aa1-V1构建图谱。
图2为本发明具有杀虫蛋白用途的Cry51Aa1-V1蛋白纯化SDS-PAGE胶图。Lane 1:诱导之前菌液；Lane 2:诱导之后菌液；Lane 3:细胞裂解沉淀；Lane 4:细胞裂解上清；Lane5:Ni柱纯化流穿；Lane 6:50mM咪唑洗杂；Lane 7:目的蛋白洗脱。
图3为同一浓度的不同Cry51Aa1蛋白对绿盲蝽的毒力比较。
图4为西花蓟马对转基因拟南芥T1代(实验材料编号为3712)与非转基因拟南芥(COL)的取食对比图。
图5为西花蓟马对转基因拟南芥T2代(3712)与非转基因拟南芥(COL)的取食对比图。
图6为西花蓟马对转基因拟南芥T2代(3715)与非转基因拟南芥(COL)的取食对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明杀虫蛋白的用途的技术方案。
实施例一、基因的获得和合成
由南京金斯瑞生物科技有限公司合成在大肠杆菌和拟南芥中优化的Cry51Aa1野生型及其突变体核苷酸序列(SEQ ID NO:11-30)。
实施例二、重组表达载体的构建和重组表达载体转化大肠杆菌获得Cry51Aa1蛋白
1、构建含有Cry51Aa1基因的重组表达载体
以Cry51Aa1-V1为例，将合成的大肠杆菌密码子优化Cry51Aa1-V1核苷酸序列(如SEQ ID NO:12所示)连到蛋白表达载体pET15b(Novagen，USA)上，基因插入位点为NdeI和BamHI，得到重组表达载体pET15b-Cry51Aa1-V1，如图1所示。
按照上述构建重组表达载体pET15b-Cry51Aa1-V1的方法，分别构建载体pET15b-Cry51Aa1-WT、pET15b-Cry51Aa1-V2、pET15b-Cry51Aa1-V3、pET15b-Cry51Aa1-V4、pET15b-Cry51Aa1-V5、pET15b-Cry51Aa1-V6、pET15b-Cry51Aa1-V7、pET15b-Cry51Aa1-V8、pET15b-Cry51Aa1-V9。
2、重组表达载体转化大肠杆菌获得Cry51Aa1蛋白
将步骤1构建的重组表达载体pET15b-Cry51Aa1-V1用热激方法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Transgen，China，CAT：CD501)，挑取阳性克隆于LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、氨苄青霉素100mg/L)中于温度37℃，转速200r/min条件下培养16h。再将培养液按照1:20的比例转接到LB培养基中，置于温度37℃，转速200r/min条件下培养。当培养液的OD＝600值达到0.6-0.8时，降温到25℃，0.5mM IPTG诱导表达过夜，5000xg离心收菌。将收集好的菌体利用Ni-buffer A：50mM Na2CO3/NaHCO3 pH 10,150mM NaCl,20mM imidazole重悬，加入终浓度为1mM的PMSF和250ul protease inhibitorCocktail，混匀。高压匀浆破碎仪破碎后，43000xg，4℃离心30min，取上清过Ni柱。Ni-NTA柱纯化，将裂解液上清与resin结合20min后，用含有50mM imidazole的buffer A洗杂，最后用含400mM imidazole的buffer A洗脱缓冲液洗脱。SDS-PAGE检测蛋白纯化效果，透析换buffer至25mM Na2CO3/NaHCO3 pH 10。最终样品SDS-PAGE检测蛋白纯化效果，超滤浓缩后，冻存于-80℃备用。最终纯化效果如图2所示，目的蛋白Cry51Aa1-V1纯度达90％以上。
其余突变体纯化步骤如上所述，此处不再赘述。
实施例三、饲喂Cry51Aa1蛋白鉴定对绿盲蝽的抗虫效果
1、半固体人工饲料的配制
按照CN104351503A专利中方法进行配制。所有容器高温灭菌(121℃，30min)，配制后的母液经过抽滤器分装至10mL已灭菌的离心管中，放置在4℃/-20℃冰箱保存。加入100g/mL氨苄西林，防止细菌生长。
2、不同Cry51Aa蛋白对绿盲蝽的毒力测试
首先，按照中国农业科学院硕士论文(Ei Thinzar Soe,Bt蛋白Cry51Aa1和Cry51Aa2对绿盲蝽的毒性和结合特性分析，2021)中测试的Cry51Aa蛋白对绿盲蝽二龄若虫的LC50(61.34μg/mL)配制含有不同BT蛋白的人工饲料溶液(以下简称BT饲料)，选取健康一致的二龄若虫10头，用尖毛笔转移至塑料瓶内，以人工饲料与人工饲料+BSA处理作为对照组，每个处理分别设置6个重复，置于光照培养箱(L:D＝16h:8h，T＝25±1℃，RH＝60±5％)，第6天调查不同处理的死亡情况。
结果如图3所示：Cry51Aa1-V1、Cry51Aa1-V2、Cry51Aa1-V4、Cry51Aa1-V6、Cry51Aa1-V7蛋白都显示出对绿盲蝽的抗性活性，且高于Cry51Aa1-WT，这种活性足以对绿盲蝽的生长产生不良效应从而使其在田间得以控制。
实施例四、转基因拟南芥对西花蓟马二龄若虫的抗性检测试验
1、构建拟南芥转基因表达载体并转化
以pHEE401载体为基础，按照常规方法构建包含At-Cry51Aa1-WT、V1-V9(SEQ IDNO:21-30)的转基因载体pQY3709、pQY3711-pQY3719，并成功转化拟南芥。
2、准备转基因拟南芥
将单株转基因拟南芥pQY3709、pQY3711-pQY3719分别移栽至生测装置中，15天后，将生长一致的转基因拟南芥进行抗虫测试。
3、T1代转基因拟南芥的抗虫检测
每株拟南芥接入50头健康一致的西花蓟马二龄若虫，观察至第15天，调查记录存活的成虫数量并拍照记录叶片取食情况。以非转基因拟南芥(COL)和转基因拟南芥pQY3709(At-Cry51Aa1-WT)作为对照组，利用单因素分析比较不同处理间存活率的差异。其中，转基因拟南芥上西花蓟马的存活情况见表1(每载体挑选3个代表性单株)，西花蓟马对转基因拟南芥(pQY3712)与非转基因拟南芥(COL)的取食对比情况如图4所示。
表1T1代转基因拟南芥上西花蓟马的存活情况
4、T1代转基因拟南芥抗性植株占比统计
按照表2中转基因拟南芥对西花蓟马二龄若虫的抗性评定标准对存活的转基因拟南芥进行评定，将抗性等级为“抗”的转基因拟南芥植株计为抗性植株，最终统计抗性植株占总植株数的比例(表3)。
表2转基因拟南芥对西花蓟马二龄若虫的抗性评定标准
表3转基因拟南芥抗性植株占比统计
结果显示西花蓟马对转基因拟南芥的取食量显著低于对照组(如图4所示)，且取食转基因拟南芥的西花蓟马的成虫存活率均显著低于对照组(如表1所示)，这说明转入At-Cry51Aa1-V1-V9(SEQ ID NO:22-30)赋予了拟南芥植物更优异的抗西花蓟马特性。另如表3所示，转入At-Cry51Aa1-V1-V9的转基因拟南芥的抗性植株的比例也明显高于转入At-Cry51Aa1-WT。
5、T2代转基因拟南芥对西花蓟马二龄若虫的抗性检测
选取典型代表pQY3712和pQY3715的T2代拟南芥转化体进行抗西花蓟马测试，每株拟南芥接入50头健康一致的西花蓟马二龄若虫，观察至第15天，调查记录存活的成虫数量并拍照记录叶片取食情况。以非转基因拟南芥(COL)作为对照组，调查根据表2所示抗性评价标准确定抗性级别。
表4 T2代转基因拟南芥对西花蓟马抗性比例
结果显示转入At-Cry51Aa1-V2和At-Cry51Aa1-V5的T2代拟南芥植物表现出显著的抗西花蓟马特性(见表4、图5和图6)。
实施例五、转基因棉花对西花蓟马二龄若虫的抗性检测试验
1、构建棉花转基因表达载体并转化
以pHEE401载体为基础，按照常规方法构建包含Cry51Aa1-WT(SEQ ID NO:1)、Cry51Aa1-V2(SEQ ID NO:3)的转基因载体pQY4340、pQY5112，并成功转化棉花。
2、准备转基因棉花
将单株转基因棉花pQY4340、pQY5112分别定植至营养土中，30天后，将生长一致的转基因棉花进行抗虫测试。
3、T1代转基因棉花的抗虫检测
剪裁脱脂棉、滤纸依次放入生测盒底部，浸润至表面无水。挑选长势良好、无病虫害叶片，每株取3片带叶柄一起剪下，单独用浸湿脱脂棉包裹，外侧用封口膜缠绕严密，放入盒内备用。挑选长势一致、健康西花蓟马二龄若虫，每个盒内100头。7天后调查成虫存活情况。
以非转基因棉花(TM-1)和转基因棉花pQY4340(Cry51Aa1-WT)作为对照组，利用单因素分析比较不同处理间存活率的差异。其中，转基因棉花上西花蓟马的存活情况见表5(每载体挑选3个代表性单株)。
表5 T1代转基因棉花上西花蓟马的存活情况
4、T1代转基因棉花抗性植株占比统计
表6转基因棉花抗性植株占比统计
载体名称 基因 世代 总植株数 抗性植株数 抗性植株比例/％
pQY4340 Cry51Aa1-WT T1 65 5 7.7
pQY5112 Cry51Aa1-V2 T1 72 23 31.9
结果显示取食转基因棉花的西花蓟马的成虫存活率均显著低于对照组，抗性植株占比远高于对照组，这说明转入Cry51Aa1-V2(SEQ ID NO:3)赋予了棉花植物更优异的抗西花蓟马特性。
5、T2代转基因棉花对西花蓟马二龄若虫的抗性检测
选取典型代表pQY5112的T2代棉花转化体进行抗西花蓟马测试，每株棉花取离体叶片接入100头健康一致的西花蓟马二龄若虫，观察至第7天，调查记录存活的成虫数量。统计棉花植株抗性占比。
表7 T2代转基因棉花对西花蓟马抗性比例
结果显示转入Cry51Aa1-V2的T2代棉花植物表现出显著的抗西花蓟马特性。
同时经过很多测试发现，将本发明所述基因导入其他植物中，都产生了优异的抗虫特性，具有良好的产业价值。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种Cry51Aa1蛋白，包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2-10。
2.一种控制害虫的方法，其特征在于，包括将害虫至少与如权利要求1所述Cry51Aa1蛋白接触；
优选地，所述Cry51Aa1蛋白存在于至少产生所述Cry51Aa1蛋白的宿主细胞中，所述害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述Cry51Aa1蛋白接触；
更优选地，所述Cry51Aa1蛋白存在于至少产生所述Cry51Aa1蛋白的细菌或转基因植物中，所述害虫通过摄食所述细菌或所述转基因植物的组织至少与所述Cry51Aa1蛋白接触，接触后所述害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对其危害植物的控制。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转基因植物优选为玉米、大豆、棉花或油菜；或所述害虫优选为绿盲蝽害虫或蓟马害虫。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述Cry51Aa1蛋白在大肠杆菌中的核苷酸序列具有SEQ ID NO:12-20所示的核苷酸序列；所述Cry51Aa1蛋白在转基因拟南芥中的核苷酸序列具有SEQ ID NO:22-30所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述转基因植物还包括至少一种不同于编码如权利要求1所述Cry51Aa1蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸编码其他Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶；或者所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
7.一种如权利要求1所述Cry51Aa1蛋白在控制害虫上的用途。
8.一种产生控制害虫的植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因组中引入编码如权利要求1所述Cry51Aa1蛋白的核苷酸序列。
9.一种产生控制害虫的植物种子的方法，其特征在于，包括将由权利要求8所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码如权利要求1所述Cry51Aa1蛋白的核苷酸序列的种子。
10.一种培养控制害虫的植物的方法，其特征在于，包括：种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括编码如权利要求1所述Cry51Aa1蛋白的核苷酸序列；
使所述植物种子长成植株；
使所述植株在人工接种害虫和/或害虫自然发生危害的条件下生长，收获与其他不具有编码如权利要求1所述Cry51Aa1蛋白的核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量的植株。
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