BR112013018151B1

BR112013018151B1 - Molécula de ácido nucleico isolada, construto de dna, método para obtenção de uma célula hospedeira transgênica, célula bacteriana, método para obtenção de uma planta transgênica, polipeptídeo isolado com atividade pesticida, composição e método para proteger uma planta contra uma praga da broca europeia do milho (ostrinia nubilalis)

Info

Publication number: BR112013018151B1
Application number: BR112013018151-6A
Authority: BR
Inventors: Andre R. Abad; Hua Dong; Sue B. Lo; Xiaomei Shi; Thomas C. Wolfe
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2012-01-23
Publication date: 2021-03-23
Also published as: CA2825049A1; US20180258444A1; MX2013008392A; US20150197770A1; US9000261B2; CN103328637A; WO2012102999A1; CN103328637B; US20120192310A1; US10000769B2; BR112013018151A2

Abstract

molécula de ácido nucleico isolada, construto de dna, método para obtenção de uma célula hospedeira, célula bacteriana, método para obtenção de planta transgênica, polipeptídeo, composição, método para controlar uma população de praga de lepidóptero, método para matar uma praga, método para produzir um polipeptídeo, método para proteger uma planta. a presente invenção refere-se a ácidos nucleicos, variantes e fragmentos dos mesmos, obtidos a partir de cepas de bacillus thuringiensis que codificam polipeptídeos que têm atividade pesticida contra pragas de insetos, incluindo lepidoptera. as modalidades particulares da invenção fornecem ácidos nucleicos isolados que codificam proteínas pesticidas, composições pesticidas, construtos de dna, micro-organismos e plantas transformadoas que compreendem um ácido nucleico das modalidades. essas composições encontram uso nos métodos para controle de pragas, especialmente pragas de plantas.

Description

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, CONSTRUTO DE DNA, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSGÊNICA, CÉLULA BACTERIANA, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, POLIPEPTÍDEO ISOLADO COM ATIVIDADE PESTICIDA, COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA PROTEGER UMA PLANTA CONTRA UMA PRAGA DA BROCA EUROPEIA DO MILHO (OSTRINIA NUBILALIS)

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se a ácidos nucleicos de ocorrência natural e recombinantes obtidos a partir de genes inovadores de Bacillus thuringiensis que codificam polipeptídeos pesticidas caracterizados pela atividade pesticida contra insetos-praga. As composições e métodos da invenção utilizam os ácidos nucleicos apresentados, e seus polipeptídeos pesticidas codificados, para controlar pragas de plantas.

Antecedentes da Invenção

[0002] Os insetos-pragas são um fator principal na perda das culturas agrícolas em todo o mundo. Por exemplo, a alimentação da lagarta-do-cartucho, os danos causados pela lagarta-rosca, ou os danos pela broca européia do milho podem ser economicamente devastadores para os produtores agrícolas. A perda de culturas relacionadas a pragas de insetos causada somente pela broca européia do milho no campo e no milho doce sozinha cerca de bilhões de dólares por ano em gastos relacionados a danos e controle de pragas.

[0003] Tradicionalmente, o método principal para causar impacto sobre populações de insetos-pragas é a aplicação de inseticidas químicos de amplo espectro. Entretanto, os consumidores e os reguladores governamentais têm se tornado crescentemente preocupados com os riscos ambientais associados à produção e uso de pesticidas químicos sintéticos. Por causa dessa preocupação, os reguladores têm banido ou limitado o uso de alguns dos pesticidas que apresentam mais riscos. Portanto, há um interesse substancial no desenvolvimento de pesticidas alternativos.

[0004] O controle biológico de pragas de insetos de importância agrícola com o uso de um agente microbiano, como fungos, bactérias, ou outras espécies de insetos consiste em uma alternativa ambientalmente amigável e comercialmente atrativa aos pesticidas químicos sintéticos. Geralmente falando, o uso de biopesticidas apresenta um risco mais baixo de poluição e riscos ambientais, e ainda fornecem uma especificidade ao alvo maior que aquela que é característica de inseticidas químicos de amplo espectro tradicionais. Além disso, os biopesticidas custam frequentemente menos para serem produzidos e portanto otimizam a produtividade econômica para uma ampla variedade de culturas.

[0005] Certas espécies de micro-organismos do gênero Bacillus são conhecidas por apresentarem atividade pesticida contra uma ampla gama de pragas de insetos incluindo Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e outros. O Bacillus thuringiensis (Bt) e o Bacillus papilliae estão entre os agentes de biocontrole mais bem sucedidos descobertos até o momento. A patogenicidade de insetos também tem sido atribuída a cepas de B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus (Harwook, ed., ((1989) Bacillus (Plenum Press), 306) e B. cereus (WO 96/10083). A atividade pesticida parece estar concentrada em inclusões proteicas cristalinas paraesporais, embora proteínas pesticidas também tenham sido isoladas a partir do estágio de crescimento vegetativo de Bacillus. Vários genes que codificam essas proteínas pesticidas têm sido isolados e caracterizados (consulte, por exemplo, as patentes US n°s 5.366.892 e 5.840.868).

[0006] Os inseticidas microbianos, particularmente aqueles obtidos a partir de cepas de Bacillus, desempenharam um papel importante na agricultura como alternativas ao controle químico de pragas. Recentemente, cientistas agrícolas desenvolveram plantas para culturas comerciais com resistência otimizada a insetos, mediante engenharia genética em plantas cultivadas para a produção de proteínas pesticidas de Bacillus. Por exemplo, as plantas de milho e algodão foram geneticamente modificadas para produzir proteínas pesticidas isoladas a partir de cepas de Bt (consulte, por exemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3):417-425; Schnepf et al. (1998) Microbiol Mol Biol Rev. 62(3):775-806. Essas culturas geneticamente modificadas são atualmente usadas amplamente na agricultura americana e têm fornecido aos agricultores uma alternativa ambientalmente amigável aos métodos de controle de insetos tradicionais. Além disso, batatas geneticamente modificadas para conter toxinas Cry pesticidas têm sido vendidas aos agricultores americanos. Embora elas tenham provado ser muito bem sucedidas comercialmente, essas plantas de cultura geneticamente modificadas para a resistência a insetos fornecem resistência apenas para uma faixa estreita de pragas de insetos importantes economicamente.

[0007] Consequentemente, permanece a necessidade de novas toxinas de Bt com uma faixa mais ampla de atividade inseticida contra pragas de insetos, por exemplo, toxinas que são ativas contra uma variedade maior de insetos da ordem Lepidoptera. Além disso, permanece a necessidade de biopesticidas que tenham atividade contra uma variedade de insetos-pragas e de biopesticidas que tenham atividade inseticida aprimorada.

Sumário da Invenção

[0008] Composições e métodos são fornecidos para causar impacto sobre insetos-praga. Mais especificamente, as modalidades da presente invenção referem-se a métodos que causam impacto sobre insetos que utilizam sequências de nucleotídeos que codificam peptídeos para produzir plantas e microrganismos transformados que expressam um polipeptídeo inseticida das modalidades apresentadas. Em algumas modalidades, as sequências de nucleotídeos codificam polipeptídeos que são pesticidas para pelo menos um inseto pertencente à ordem Lepidoptera.

[0009] As modalidades fornecem um ácido nucleico, e seus fragmentos e variantes que codificam polipeptídeos que possuem atividade pesticida contra insetos (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5 que codificam SEQ ID NOs: 2, 4 ou 6, respectivamente). A sequência de nucleotídeos de tipo selvagem (por exemplo, de ocorrência natural) das modalidades que foi obtida a partir de Bt, codifica um peptídeo inseticida inovador. As modalidades fornecem adicionalmente fragmentos e variantes da sequência de nucleotídeos apresentada que codificam polipeptídeos biologicamente ativos (por exemplo, inseticidas).

[0010] As modalidades fornecem adicionalmente polipeptídeos pesticidas isolados (por exemplo, inseticidas) codificados por um ácido nucleico de ocorrência natural, ou modificado (por exemplo, mutagenizado ou manipulado) das modalidades. Em exemplos particulares, as proteínas das modalidades incluem fragmentos de proteínas de comprimento inteiro e polipeptídeos que são produzidos a partir da ácidos nucleicos mutagenizados projetados para introduzir sequências de aminoácidos particulares nos polipeptídeos das modalidades. Em modalidades particulares, os polipeptídeos aprimoraram a atividade pesticida em relação à atividade do polipeptídeo de ocorrência natural do qual eles foram derivados.

[0011] Os ácidos nucleicos das modalidades podem também ser usados para produzir plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas transgênicas (por exemplo, transformadas) que são caracterizadas por genomas que compreendem pelo menos um construto de nucleotídeo incorporado de maneira estável que compreende uma sequência codificadora das modalidades ligada a modo operacional a um promotor que dirige a expressão do polipeptídeo pesticida codificado. Consequentemente, células de plantas, tecidos de plantas, plantas, e sementes transformadas das mesmas também são fornecidas.

[0012] Em uma modalidade particular, uma planta transformada pode ser produzida com o uso de um ácido nucleico que foi otimizado para expressão aumentada em uma planta hospedeira. Por exemplo, um dos polipeptídeos pesticidas das modalidades pode ser retrotraduzido para produzir um ácido que compreende códons otimizados para expressão em um hospedeiro particular, por exemplo, uma planta cultivada como uma planta de milho (Zea mays). A expressão de uma sequência codificada por essa planta transformada (por exemplo, dicotiledônea ou monocotiledônea) resultará na produção de um polipeptídeo pesticida e confere à planta o aumento da resistência a insetos. Algumas modalidades fornecem plantas transgênicas que expressam polipeptídeos pesticidas que encontram uso em métodos para causar impacto sobre vários insetos-pragas.

[0013] As modalidades incluem adicionalmente composições pesticidas ou inseticidas que contêm os polipeptídeos inseticidas das modalidades, e podem compreender adicionalmente peptídeos inseticidas. As modalidades abrangem a aplicação dessas composições ao ambiente de insetos-pragas para causar impacto sobre os insetos-pragas.

Descrição Detalhada da Invenção

[0014] As modalidades da invenção são desenhadas a composições e métodos para causar impacto a insetos-pragas, particularmente pragas de plantas. Mais especificamente, o ácido nucleico isolado das modalidades e fragmentos e variantes do mesmo compreendem sequências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos pesticidas (por exemplo, proteínas). As proteínas pesticidas apresentadas são biologicamente ativas (por exemplo, pesticidas) contra insetos-pragas tais como, mas não se limitando a, insetos-pragas da ordem Lepidoptera. Insetos-praga de interesse incluem, mas não se limitam a, Ostrinia nubilalis (broca européia do milho).

[0015] As composições das modalidades compreendem ácidos nucleicos isolados, e fragmentos e variantes dos mesmos, que codificam polipeptídeos pesticidas, cassetes de expressão que compreendem sequências de nucleotídeos das modalidades, proteínas pesticidas isoladas, e composições pesticidas. Algumas modalidades fornecem polipeptídeos pesticidas modificados caracterizados por uma atividade inseticida aprimorada contra Lepidópteros em relação à atividade pesticida da proteína de ocorrência natural correspondente. As modalidades fornecem adicionalmente plantas e microrganismos transformados com esses ácidos nucleicos inovadores, e métodos que envolvem o uso desses ácidos nucleicos, composições pesticidas, organismos transformados, e produtos dos mesmos para causar impacto sobre insetos-pragas.

[0016] Os ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeos das modalidades podem ser usados para transformar qualquer organismo para produzir as proteínas pesticidas codificadas. São fornecidos métodos que envolvem o uso desses organismos transformados para causar impacto ou controlar pragas de plantas. Os ácidos nucleicos e as sequências de nucleotídeos das modalidades podem também ser usadas para transformar organelas como cloroplastos (McBride et al. (1995) Biotechnology 13: 362-365; e Kota et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1840-1845).

[0017] As modalidades relacionam-se adicionalmente à identificação de fragmentos e variantes da sequência de codificação de ocorrência natural que codifica proteínas pesticidas biologicamente ativas. As sequências de nucleotídeos das modalidades encontram uso direto em métodos para causar impacto sobre pragas, particularmente insetos-pragas da ordem Lepidoptera. Consequentemente, as modalidades fornecem novas abordagens para causar impacto sobre insetos-pragas que não dependem do uso dos tradicionais inseticidas químicos sintéticos. As modalidades envolvem a descoberta de pesticidas biodegradáveis de ocorrência natural e os genes que os codificam.

[0018] As modalidades fornecem adicionalmente fragmentos e variantes da sequência codificadora de ocorrência natural que também codificam polipeptídeos biologicamente ativos (por exemplo, pesticidas). Os ácidos nucleicos da presente invenção abrangem ácidos nucleicos ou sequências de nucleotídeos que foram otimizadas para expressão pelas células de um organismo particular, por exemplo sequências de ácido nucleico que passaram por retrotradução (isto é, traduzidas de modo inverso) com o uso de códons preferenciais de plantas com base na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo com atividade pesticida aprimorada. As modalidades fornecem adicionalmente mutações que conferem propriedades acentuadas ou alteradas sobre os polipeptídeos das modalidades. Consulte, por exemplo, a patente US 7.462.760.

[0019] Na descrição mostrada a seguir, vários termos são usados extensivamente. As seguintes definições são fornecidas para facilitar o entendimento das modalidades.

[0020] Unidades, prefixos e símbolos podem ser denotados em sua forma aceita de SI. Exceto onde indicado em contrário, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para direita em uma orientação 5' a 3'; As sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino a carbóxi, respectivamente. Os intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. Os aminoácidos podem ser referidos na presente invenção por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, de modo semelhante, podem ser designados por seus códigos de uma letra comumente aceitos. Os termos definidos acima são mais completamente definidos por referência ao relatório descritivo como um todo.

[0021] Para uso na presente invenção, ácido nucleico inclui a referência a um polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo em forma de filamento único ou duplo e, exceto onde limitado de outro modo, abrange análogos conhecidos (por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos) tendo a natureza essencial de nucleotídeos naturais, visto que eles hibridizam com ácidos nucleicos de filamento único de maneira similar ao nucleotídeos de ocorrência natural.

[0022] Para uso na presente invenção, os termos “codificação” ou “codificado” quando usados no contexto de um ácido nucleico especificado compreende a informação requerida para direcionar a tradução da sequência de nucleotídeos em uma proteína especificada. As informações segundo as quais uma proteína é codificada são especificadas pelo uso de códons. Um ácido nucleico codificador de uma proteína pode compreender sequências não traduzidas (por exemplo, íntrons) dentro de regiões traduzidas do ácido nucleico ou pode não conter tais sequências não traduzidas intervenientes (por exemplo, como em cDNA).

[0023] Para uso da presente invenção, “sequência de comprimento inteiro” em referência a um polinucleotídeo especificado ou sua proteína codificada significa ter a sequência de ácido nucleico inteira ou a sequência de ácidos nucleicos inteira de uma sequência endógena nativa (não sintética). Um polinucleotídeo de comprimento inteiro codifica a forma de comprimento inteiro cataliticamente ativa da proteína especificada.

[0024] Para uso na presente invenção, o termo “antissenso” usado no contexto de orientação de uma sequência de nucleotídeos refere-se a uma sequência de polinucleotídeos bidirecional que está ligada de maneira funcional a um promotor em uma orientação na qual o filamento antissenso é transcrito. O filamento antissenso é suficientemente complementar a um produto de transcrição endógeno de modo que a tradução do produto de transcrição endógeno é com frequência inibido. Portanto, onde o termo “antissenso” é usado no contexto de uma sequência de nucleotídeos particular, o termo refere-se ao filamento complementar do produto de transcrição de referência.

[0025] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são aqui usados de maneira intercambiável para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduos de aminoácido é um análogo químico artificial de um aminoácido correspondente de ocorrência natural, bem como de polímeros de aminoácido de ocorrência natural.

[0026] Os termos “resíduo” ou “resíduo de aminoácido” ou “aminoácido” são usados de maneira intercambiável na presente invenção referindo-se a um aminoácido que é incorporado em uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo (coletivamente chamados de “proteína”). O aminoácido pode ser um aminoácido de ocorrência natural e, a menos que limitado de outro modo, pode abranger análogos conhecidos de aminoácidos naturais que podem funcionar de maneira similar como aminoácidos de ocorrência natural.

[0027] Os polipeptídeos das modalidades podem ser produzidos a partir de um ácido nucleico apresentado na presente invenção, ou com o uso de técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, uma proteína das modalidades pode ser produzida pela expressão de um ácido nucleico recombinante das modalidades em uma célula hospedeira adequada, ou alternativamente por uma combinação de procedimentos ex vivo.

[0028] Para uso da presente invenção, os termos “isolado” e “purificado” são usados intercambiavelmente para se referir a ácidos nucleicos ou polipeptídeos ou porções biologicamente ativas dos mesmos que são substancialmente ou essencialmente isentos de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o ácido nucleico ou polipeptídeo conforme é encontrado no ambiente em que ocorre naturalmente. Portanto, um ácido nucleico ou polipeptídeo isolado ou purificado é substancialmente isento de outro material celular ou meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes ou substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizado quimicamente.

[0029] Um ácido nucleico “isolado” é em geral isento de sequências (tais como, por exemplo, sequências de codificação de proteínas) que naturalmente ladeiam o ácido nucleico isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Por exemplo, em várias modalidades, os ácidos nucleicos isolados podem conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de sequências de nucleotídeos que naturalmente ladeiam os ácidos nucleicos no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado.

[0030] Para uso na presente invenção, o termo “isolado” ou “purificado”, como é usado para se referir a um polipeptídeo das modalidades, significa que a proteína isolada é substancialmente isenta de material celular e inclui preparações de proteína que têm menos que cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (em peso seco) da proteína contaminante. Quando a proteína das modalidades ou uma porção biologicamente ativa da mesma é produzida de forma recombinante, o meio de cultura representa menos que cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (em peso seco) dos precursores químicos ou produtos químicos que não consistem na proteína de interesse.

[0031] Ao longo do pedido, a palavra “que compreende” ou variações como “compreende” ou “compreendem” deverão ser compreendidas como implicando a inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa indicada, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outros elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

[0032] Para uso na presente, o termo “causar impacto sobre insetos-praga” refere-se à realizar alterações na alimentação do inseto, crescimento e/ou comportamento em qualquer estágio de desenvolvimento, incluindo, mas não se limitando ao: extermínio do inseto; retardamento do crescimento; prevenção da capacidade reprodutora; atividade antialimentar; e similares.

[0033] Para uso na presente invenção, os termos “atividade pesticida” e “atividade inseticida” são usados como sinônimos para referir-se à atividade de um organismo ou uma substância (como, por exemplo, uma proteína) que pode ser medida, a título de exemplo não limitador, pela mortalidade da praga, perda de peso da praga, repelência da praga, e outras alterações físicas e comportamentais de uma praga após alimentação e exposição durante um período de tempo apropriado. Portanto, um organismo ou substância que tem atividade pesticida causa impacto de modo adverso pelo menos sobre um parâmetro mensurável da aptidão da praga. Por exemplo, “proteínas pesticidas” são proteínas que exibem atividade pesticida por si mesmas ou em combinação com outras proteínas.

[0034] Para uso na presente invenção, o termo “quantidade eficaz para ação pesticida” significa uma quantidade de uma substância ou organismo que tem atividade pesticida quando presente no ambiente de uma praga. Para cada substância ou organismo, a quantidade eficaz de pesticida é determinada empiricamente para cada praga afetada em um ambiente específico. De modo similar “quantidade eficaz para ação inseticida” pode ser usado para referir-se a uma “quantidade eficaz para ação pesticida” quando a praga é uma praga de inseto.

[0035] Para uso na presente invenção, o termo “modificado de modo recombinante” ou “modificado” significa a utilização da tecnologia de DNA recombinante para introduzir (por exemplo, modificar) uma alteração na estrutura da proteína com base em um entendimento do mecanismo de ação da proteína e uma consideração dos aminoácidos que estão sendo introduzidos, deletados, ou substituídos.

[0036] Para uso na presente invenção, o termo “sequência de nucleotídeos mutante” ou “mutação” ou “sequência de nucleotídeos mutagenizada” significa um nucleotídeo que foi mutagenizado ou alterado para conter um ou mais resíduos de nucleotídeo (por exemplo, par de base) que não está presente na sequência de ocorrência natural correspondente. Essa mutagênese ou alteração consiste em uma ou mais adições, deleções, ou substituições ou recolocações de resíduos de ácido nucleico. Quando as mutações são realizadas por adição, remoção, ou substituição de um aminoácido de um sítio proteolítico, essa adição, remoção, ou substituição pode estar dentro ou adjacente ao motivo, desde que o objeto da mutação seja executado (isto é, desde que a proteólise no sítio seja alterada).

[0037] Uma sequência de nucleotídeos mutante pode codificar uma toxina inseticida mutante mostrando atividade inseticida aprimorada ou reduzida, ou uma sequência de aminoácidos que confere atividade inseticida aprimorada ou reduzida sobre um polipeptídeo que contém tal sequência. Para uso na presente invenção, o termo “mutante” ou “mutação” dentro do contexto de uma sequência de proteínas, polipeptídeos ou aminoácidos referese a uma sequência que foi mutagenizada ou alterada para conter um ou mais resíduos de aminoácido que não estão presentes na sequência de ocorrência natural correspondente. Essa mutagênese ou alteração consiste em uma ou mais adições, deleções, ou substituições ou recolocações de resíduos de aminoácidos. Um polipeptídeo mutante mostra atividade inseticida aprimorada ou reduzida, ou representa uma sequência de aminoácidos que confere atividade inseticida aprimorada sobre um polipeptídeo que contém essa sequência. Portanto, o termo “mutante” ou “mutação” referese a uma ou ambas as sequências de nucleotídeos mutantes e os aminoácido codificados. Os mutantes podem ser usados sozinhos ou em qualquer combinação compatível com outros mutantes das modalidades ou com outros mutantes. Um “polipeptídeo mutante” pode mostrar, inversamente, uma diminuição na atividade inseticida. Onde mais de uma mutação é adicionada a um ácido nucleico ou proteína específicos, as mutações podem ser adicionadas ao mesmo tempo ou sequencialmente; e sequencialmente, as mutações podem ser adicionadas em qualquer ordem adequada.

[0038] Para uso na presente invenção, o termo “atividade inseticida aprimorada” ou “atividade pesticida aprimorada” refere-se a um polipeptídeo inseticida das modalidades que tem uma atividade inseticida aumentada em relação à atividade de sua proteína de ocorrência natural correspondente, e/ou um polipeptídeo inseticida que é eficaz contra uma faixa mais ampla de insetos, e/ou um polipeptídeo inseticida que tem especificidade para um inseto que não é susceptível à toxicidade da proteína de ocorrência natural. Uma constatação da atividade pesticida aprimorada ou aumentada exige uma demonstração de um aumento da atividade pesticida de pelo menos 10%, contra o inseto-alvo, ou pelo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 100%, 150%, 200%, ou 300% ou um aumento maior de atividade pesticida em relação à atividade pesticida do polipeptídeo inseticida de ocorrência natural determinado contra o mesmo inseto.

[0039] Por exemplo, uma atividade pesticida ou inseticida aprimorada é fornecida quando uma faixa mais ampla ou mais estreita de insetos é impactada pelo polipeptídeo em relação à faixa de insetos que é afetada por uma toxina Bt de tipo selvagem. Uma faixa mais ampla de impacto pode ser desejável quando é desejada versatilidade, enquanto que uma faixa mais estreita de impacto pode ser desejável quando, por exemplo, insetos benéficos poderiam ser de outro modo impactados pelo uso ou presença da toxina. Embora as modalidades não sejam limitadas a nenhum mecânismo de ação específico, uma atividade pesticida aprimorada pode ser fornecida alterando-se um ou mais características de um polipeptídeo; por exemplo, a estabilidade ou longevidade de um polipeptídeo no trato intestinal de um inseto pode aumentar em relação à estabilidade ou longevidade uma proteína de tipo selvagem correspondente.

[0040] O termo “toxina” para uso na presente invenção referese a um polipeptídeo que mostra atividade pesticida ou atividade inseticida ou atividade pesticida aprimorada ou atividade inseticida aprimorada. A toxina “Bt” ou de “Bacillus thuringiensis” destina-se a incluir uma classe mais ampla de toxinas Cry encontradas em várias cepas de Bt que incluem essas toxinas como, por exemplo, Cry1s, Cry2s ou Cry3s.

[0041] Os termos “sítio proteolítico” ou “sítio de clivagem” refere-se a uma sequência de aminoácidos que confere sensibilidade a uma classe de proteases ou uma protease particular de modo que um polipeptídeo que contém a sequência de aminoácidos é digerido pela classe de proteases ou protease particular. Um sítio proteolítico é dito como “sensível” à(s) protease(s) que reconhecem aquele sítio. Entende-se na técnica que a eficiência de digestão variará, e que uma diminuição na eficiência da digestão pode levar a um aumento na estabilidade ou longevidade do polipeptídeo em um intestino de inseto. Portanto, um sítio proteolítico pode conferir sensibilidade a mais de uma protease ou classe de proteases, mas a eficiência de digestão naquele sítio por várias proteases pode variar. Os sítios proteolíticos incluem, por exemplo, sítios de tripsina, sítios de quimotripsina, e sítios de elastase.

[0042] As pesquisas têm mostrado que as proteases do intestino de insetos Lepidópteros incluem tripsinas, quimotripsinas, e elastases. Consulte, por exemplo, Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212; e Hedegus et al. (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53: 30-47. Por exemplo, cerca de 18 tipos de tripsinas diferentes foram encontrados no intestino médio de larvas de Helicoverpa armigera (consulte Gatehouse et al. (1997) Insect Biochem. Mol. Biol. 27: 929-944). Os sítios de substrato proteolítico preferenciais dessas proteases foram investigados. Consulte, por exemplo, Peterson et al. (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25: 765-774.

[0043] Esforços têm sido feitos para compreender o mecanismo de ação das toxinas Bt e para modificar toxinas com propriedades aprimoradas. Tem sido mostrado que as proteases do intestino de inseto podem afetar o impacto da proteína Cry de Bt sobre o inseto. Algumas proteases ativam as proteínas Cry processando-as uma forma de “protoxina” para uma forma tóxica, ou “oxina.” Consulte, Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42: 1-12; e Carroll et al. (1997) J. Invertebrate Pathology 70: 41-49. Essa ativação da toxina pode incluir o remoção dos peptídeos N- e Cterminal da proteína e pode também incluir a clivagem interna da proteína. Outras proteases podem degradar as proteínas Cry. Consulte Oppert, ibid.

[0044] Uma comparação das sequências de aminoácidos de toxinas Cry de diferentes especificidades revela cinco blocos de sequência altamente conservados. Estruturalmente, as toxinas compreendem três domínios distintos que são, a partir dos terminais N- a C-: um agrupamento de sete hélices alfaimplicadas em formação de poro (chamada de “domínio 1”), três lâminas beta antiparalelas implicadas em ligação de célula (chamadas de “domínio 2”), e um sanduíche beta (chamado de “domínio 3”). O local e propriedades desses domínios são conhecidos pelos versados na técnica. Consulte, por exemplo, Li et al. (1991) Nature, 05:815-821 e Morse et al. (2001) Structure, 9:409-417. Quando é feita referência a um domínio particular, como o domínio 1, entende-se que os pontos finais de avaliação exatos do domínio em relação a uma sequência particular não são críticos desde que a sequência ou porção da mesma inclua a sequência que fornece pelo menos alguma função atribuída ao domínio particular. Portanto, por exemplo, quando refere-se ao “domínio 1,” pretende-se que uma sequência particular inclui um agrupamento de sete alfa-hélices, mas os pontos finais de avaliação exatos da sequência usada ou referida em relação àquele agrupamento não são críticos. O elemento versado na técnica está familiarizado com a determinação desses pontos finais e a avaliação dessas funções.

[0045] Em um esforço para caracterizar e aprimorar melhor as toxinas Bt, cepas da bactéria Bt foram estudadas. Descobriu-se que preparações de cristal preparadas a partir de cultura de cepas de Bt têm atividade pesticida contra numerosas pragas de Lepidópteros (consulte, por exemplo, Exemplo Experimental 1). Um esforço foi feito para identificar as sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas cristal a partir da cepas selecionadas, e os ácidos nucleicos de tipo selvagem (isto é, que ocorrem naturalmente) das modalidades foram isolados a partir dessas cepas de bactérias, clonados em um vetor de expressão, e transformados em E coli. Dependendo das características de uma determinada preparação, foi reconhecido que a demonstração de atividade pesticida algumas vezes exigiu um pré-tratamento com tripsina para ativar as proteínas pesticidas. Portanto, entende-se que algumas proteínas pesticidas exigem a digestão de protease (por exemplo, por tripsina, quimotripsina, e similares) para ativação, enquanto outras proteínas são biologicamente ativas (por exemplo, pesticidas) na ausência de ativação.

[0046] Tais moléculas podem ser alteradas por meios descritos, por exemplo, na patente US 7.462.760. Além disso, as sequências de ácido nucleico podem ser modificadas para codificar polipeptídeos que contêm mutações adicionais que conferem atividade pesticida aprimorada ou alterada em relação à atividade pesticida do polipeptídeo de ocorrência natural. As sequências de nucleotídeos desses ácidos nucleicos modificados compreendem mutações não encontradas nas sequências de ocorrência natural.

[0047] Os polipeptídeos mutantes das modalidades são preparados em geral por um processo que envolve as etapas de: obter uma sequência de ácido nucleico que codifica uma família de polipeptídeo Cry; analisar a estrutura do polipeptídeo para identificar sítios “alvo” específicos para mutagênese da sequência de genes subjacente com base em uma consideração da função proposta do domínio alvo no modo de ação da toxina; introduzir uma ou mais mutações na sequência de ácido nucleico para produzir uma alteração desejada em um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de polipeptídeo codificado; e analisar o polipeptídeo produzido para atividade pesticida.

[0048] Muitas das toxinas inseticidas de Bt são relacionadas a vários graus de similaridades em suas sequências de aminoácidos e estrutura terciária e meios para obter as estruturas cristalinas de toxinas Bt são bem conhecidos. A solução de estrutura cristalina de alta-resolução exemplificadora tanto de polipeptídeos Cry3A quanto Cry3B está disponível na literatura. A estrutura resolvida do gene Cry3A (Li et al. (1991) Nature 353:815-821) fornece uma compreensão acerca do relacionamento entre a estrutura e a função da toxina. Uma consideração combinada das análises estruturais publicadas referentes a toxinas Bt e a função relatada associada a estruturas particulares, motivos, e similares indica que regiões específicas da toxina estão correlacionadas com funções particulares e etapas discretas do modo de ação da proteína. Por exemplo, muitas toxinas isoladas do Bt são descritas em geral como compreendendo três domínios: um feixe de sete hélices que é envolvido na formação de poro, um domínio de três lâminas que foi implicado em ligação de receptor e um motivo de sanduíche beta (Li et al. a (1991) Nature 305: 815-821).

[0049] Conforme relatado nas patentes US n°s 7.105.332 e 7.462.760, a toxicidade de proteínas Cry pode ser aprimorada pelo direcionamento à região localizada entre hélices alfa 3 e 4 de domínio 1 da toxina. Esta teoria foi argumentada em um corpo de conhecimento relacionado com inseticidas, incluindo 1) que hélices alfa 4 e 5 de domínio 1 de toxinas Cry3A foram relatadas para inserção nas bicamadas lipídicas de células que revestem o intestino médio de insetos susceptíveis (Gazit et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12289-12294); 2) o conhecimento do inventor da localização de sítios de clivagem de tripsina e quimotripsina dentro da sequência de aminoácidos da proteína de origem natural; 3) a observação de que a proteína de origem natural foi mais ativa contra certos insetos que seguem ativação in vitro pelo tratamento de tripsina ou quimotripsina; e 4) relatos de que a digestão de toxinas da extremidade 3' resultou em toxicidade diminuída para insetos.

[0050] Uma série de mutações pode ser criada e colocada em uma variedade de sequências antecedentes para criar polipeptídeos inovadores que têm atividade pesticida aumentada ou alterada. Consulte, por exemplo, patente US 7.462.760. Esses mutantes incluem, mas não se limitam à adição de ao menos um sítio mais sensível à protease (por exemplo, sítio de clivagem de tripsina) na região localizada entre hélices 3 e 4 do domínio 1; a substituição de um sítio sensível à protease original na sequência de origem natural com um sítio sensível à protease diferente; a adição de múltiplos sítios sensíveis a protease em uma localização específica; a adição de resíduos de aminoácidos próximo ao(s) sítio(s) sensível(is) a protease para alterar flexão do polipeptídeo e, dessa forma, melhorar digestão do polipeptídeo no(s) sítio(s) sensível(is) à protease; e a adição de mutações para proteger o polipeptídeo da digestão degradativa que reduz toxicidade (por exemplo, fazer uma série de mutações em que o aminoácido de origem natural é substituído por valina para proteger o polipeptídeo da digestão). As mutações podem ser usadas isoladamente ou em qualquer combinação para fornecer os polipeptídeos das modalidades.

[0051] Dessa maneira, as modalidades fornecem sequências que compreendem uma variedade de mutações, como, por exemplo, uma mutação que compreende um sítio sensível a protease adicional, ou um sítio alternativo, localizado entre as alfa-hélices 3 e 4 do domínio 1 do polipeptídeo codificado. Uma mutação que consiste em um sítio sensível a protease adicional ou alternativo pode ser sensível a várias classes de proteases como as proteases de serina, que incluem tripsina e quimotripsina, ou enzimas como a elastase. Portanto, uma mutação que consiste em um sítio sensível a protease adicional ou alternativo pode ser planejada de modo que o sítio é prontamente reconhecido e/ou clivado por uma categoria de proteases, como as proteases de mamíferos ou proteases de insetos. Um sítio sensível a protease pode também ser concebido para ser clivado por uma classe particular de enzimas ou uma enzima particular conhecida para ser produzida em um organismo, como, por exemplo, uma quimotripsina produzida pela lagarta-da-espiga do milho Heliothis zea (Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212). Mutações podem também conferir resistência a digestão proteolítica, por exemplo, para digerir por quimotripsina no C-terminal do peptídeo.

[0052] A presença de uma sítio sensível a protease adicional e/ou alternativo na sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado pode aprimorar a atividade pesticida e/ou especificidade do polipeptídeo codificado pelos ácidos nucleicos das modalidades. Consequentemente, as sequências de nucleotídeo das modalidades podem ser modificadas de maneira recombinante ou manipuladas para produzir polipeptídeos que têm atividade inseticida aprimorada ou alterada e/ou especificidade comparada àquela de uma toxina de ocorrência natural não-modificada. Além disso, as mutações apresentadas na presente invenção podem ser colocadas ou usadas em conjunto com outras sequências de nucleotídeos para fornecer propriedades aprimoradas. Por exemplo, um sítio sensível a protease que é prontamente clivado por quimotripsina de inseto, por exemplo, uma quimotripsina encontrada na lagarta-do-cartucho bertha ou lagarta-da-espiga do milho (Hegedus et al. (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53: 30-47; e Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212), pode ser colocada em um sequência de valores antecedentes Cry para fornecer uma toxicidade aprimorada para aquela sequência. Dessa maneira, as modalidades fornecem polipeptídeos tóxicos com propriedades aprimoradas.

[0053] Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos Cry mutagenizada pode compreender mutantes adicionais que compreendem códons adicionais que introduzem uma segunda sequência de aminoácidos sensível à tripsina (em adição ao sítio de tripsina de ocorrência natural) dentro do polipeptídeo codificado. Um mutante de adição alternativo das modalidades compreende códons adicionais planejados para introduzir pelo menos um sítio sensível a protease adicional diferente no polipeptídeo, por exemplo, um sítio sensível a quimotripsina localizado imediatamente em 5' ou 3' do sítio de tripsina de ocorrência natural. Alternativamente, mutantes de substituição podem ser criados nos quais pelo menos um códon do ácido nucleico que codifica o sítio sensível à protease de ocorrência natural é destruído, e códons alternativos são introduzidos na sequência de ácidos nucleicos para fornecer um sítio sensível à protease (por exemplo, substituto) diferente. Um mutante de substituição pode também ser adicionado a uma sequência Cry na qual o sítio de clivagem da tripsina de ocorrência natural presente no polipeptídeo codificado é destruído e um sítio de clivagem de quimotripsina ou elastase é introduzido em seu lugar.

[0054] É reconhecido que qualquer sequência de nucleotídeos que codifica as sequências de aminoácidos que constituem sítios proteolíticos ou sítios proteolíticos putativos (por exemplo, sequência como NGSR, RR, ou LKM) pode ser usada e que a identidade exata dos códons usados para introduzir qualquer um desses sítios de clivagem dentro de um polipeptídeo variante pode variar dependendo do uso, isto é, expressão em uma espécie de planta particular. Também é reconhecido que qualquer uma das mutações apresentadas pode ser introduzida em qualquer sequência de polinucleotídeos das modalidades, que compreende os códons para resíduos de aminoácidos que fornecem um sítio de clivagem de tripsina nativa que é alvo da modificação. Consequentemente, as variantes tanto das toxinas de comprimento inteiro como de fragmentos das mesmas podem ser modificados para conter sítios de clivagem adicionais ou alternativos, e essas modalidades são destinadas a serem abrangidas pelo escopo das modalidades apresentada na presente invenção.

[0055] Será entendido pelos versados na técnica que qualquer mutação útil pode ser adicionada às sequências das modalidades desde que os polipeptídeos codificados mantenham a atividade pesticida. Portanto, as sequências podem também ser mutadas de modo que os polipeptídeos codificados sejam resistentes à digestão proteolítica por quimotripsina. Mais de um sítio de reconhecimento pode ser adicionado em um local particular em qualquer combinação, e sítios de reconhecimento múltiplos podem ser adicionados ou removidos da toxina. Portanto, mutações adicionais podem compreender três, quatro, ou mais sítios de reconhecimento. Deve-se reconhecer que múltiplas mutações podem ser fabricadas em qualquer sequência de polinucleotídeos adequada; Consequentemente, sequências de comprimento total ou fragmentos das mesmas podem ser modificados para conter sítios de clivagem adicionais ou alternativos, assim como serem resistentes a digestão proteolítica. Dessa maneira, as modalidades fornecem toxinas Cry contendo mutações que aprimoram a atividade pesticida, bem como composições e métodos aprimorados para causar impacto sobre pragas com o uso de outras toxinas Bt.

[0056] As mutações podem proteger o polipeptídeo da degradação de protease, por exemplo, pela remoção de sítios proteolíticos putativos como os sítios de serina protease putativa e sítios de reconhecimento de elastase de diferentes áreas. Alguns desses sítios putativos podem ser removidos ou alterados de modo que a proteólise no local do sítio original é diminuída. Alterações na proteólise podem ser avaliadas por comparação de um polipeptídeo mutante com toxinas de ocorrência natural ou por comparação de toxinas mutantes que diferem em sua sequência de aminoácidos. Sítios proteolíticos putativos e sítios proteolíticos incluem, mas não se limitam às seguintes sequências: RR, um sítio de clivagem com tripsina; LKM, um sítio de quimotripsina; e NGSR, um sítio de tripsina. Esses sítios podem ser alterados pela adição ou deleção de qualquer número e tipo de resíduos de aminoácidos, desde que a atividade pesticida do polipeptídeo seja aumentada. Portanto, os polipeptídeos codificados pelas sequências de nucleotídeos compreendem mutações que compreendem pelo menos uma alteração ou adição de aminoácido em relação à sequência nativa ou antecedente, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, ou 280 ou mais alterações ou adições de aminoácido. A atividade pesticida de um polipeptídeo pode também ser aprimorada pelo truncamento da sequência nativa ou de comprimento inteiro, como é conhecido na técnica.

[0057] As composições das modalidades incluem ácidos nucleicos, e fragmentos e variantes do mesmo, que codificam os polipeptídeos pesticidas. Em particular, as modalidades fornecem moléculas de ácido nucleico isoladas que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 2, 4, e 6, ou as sequências de nucleotídeos que codificam as ditas sequências de aminoácidos, por exemplo as sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 3, e 5, e fragmentos e variantes das mesmas.

[0058] Também são de interesse sequências de nucleotídeos otimizadas que codificam as proteínas pesticidas das modalidades. Para uso na presente invenção, a expressão “sequências de nucleotídeos otimizadas” refere-se a ácidos nucleicos que são otimizados para expressão em um organismo particular, por exemplo, uma planta. As sequências de nucleotídeos otimizadas podem ser preparadas para qualquer organismo de interesse com o uso de métodos conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, a patente US n° 7.462.760 que descreve uma sequência de nucleotídeos otimizada que codifica uma proteína pesticida revelada. Neste exemplo, a sequência de nucleotídeos foi preparada utilizando a tradução reversa da sequência de aminoácidos da proteína e alterando a sequência de nucleotídeos, de modo que ela compreenda códons preferenciais de milho, enquanto ainda codifica a mesma sequência de aminoácidos. Esse procedimento é descrito em mais detalhes por Murray et al. (1989) ácidos nucleicos Res. 17:477-498. As sequências de nucleotídeos otimizadas encontram uso na expressão crescente de uma proteína pesticida em uma planta, por exemplo, plantas monocotiledôneas da família da Gramineae (Poaceae) como por exemplo, uma planta de milho ou maíz.

[0059] As modalidades fornecem adicionalmente polipeptídeos pesticidas isolados (por exemplo, inseticidas) codificados por um ácido nucleico de ocorrência natural ou modificado das modalidades. Mais especificamente, as modalidades fornecem polipeptídeos que compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 2, 4, ou 6, e os polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos aqui descritos, por exemplo aqueles apresentados nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e fragmentos e variantes dos mesmos.

[0060] Em modalidades particulares, as proteínas pesticidas das modalidades fornecem polipeptídeos inseticidas de comprimento inteiro, fragmentos de polipeptídeos inseticidas de comprimento inteiro, e polipeptídeos variantes que são produzidos a partir de ácidos nucleicos mutagenizados planejados para introduzir sequências de aminoácido particulares em polipeptídeos das modalidades. Em modalidades particulares, as sequências de aminoácidos que são introduzidas nos polipeptídeos compreendem uma sequência que fornece um sítio de clivagem para uma enzima, como uma protease.

[0061] É conhecido na técnica que a atividade pesticida de toxinas Bt é ativada tipicamente pela clivagem do peptídeo no intestino do inseto por várias proteases. Devido ao fato de que os peptídeos não podem sempre ser clivados com completa eficiência no intestino do inseto, fragmentos de uma toxina de comprimento inteiro podem ter atividade pesticida aumentada em comparação à toxina de comprimento inteiro em si. Portanto, alguns dos peptídeos das modalidades incluem fragmento de uma polipeptídeo inseticida de comprimento inteiro e alguns dos fragmentos, variantes e mutações dos polipeptídeos terão atividade pesticida aumentada em relação à atividade do polipeptídeo inseticida de ocorrência natural a partir do qual eles foram derivados, particularmente, se o polipeptídeo inseticida de ocorrência natural não é ativado in vitro com uma protease antes da triagem para a atividade. Portanto, o presente pedido abrange versões truncadas ou fragmentos das sequências.

[0062] As mutações podem ser localizadas em qualquer sequência antecedente, incluindo tais polipeptídeos truncados, desde que o polipeptídeo mantenha a atividade pesticida. O versado na técnica pode comparar prontamente duas ou mais proteínas no que diz respeito à atividade pesticida com o uso de ensaios conhecidos na técnica ou descritos em outras partes na presente invenção. Deve-se compreender que os polipeptídeos das modalidades podem ser produzidos pela expressão de um ácido nucleico apresentado na presente invenção, ou pelo uso de técnicas de biologia molecular padrão.

[0063] É reconhecido que as proteínas pesticidas podem ser oligoméricas e variarão em peso molecular, número de resíduos, peptídeos componentes, atividade contra pragas particulares, e outras características. Entretanto, pelos métodos apresentados na presente invenção, as proteínas ativas contra uma variedade de pragas podem ser isoladas e caracterizadas. As proteínas pesticidas das modalidades podem ser usadas em combinação com outras toxinas Bt ou outras proteínas inseticidas para aumentar a faixa-alvo de insetos. Além do mais, o uso de proteínas pesticidas das modalidades em combinação com outras toxinas Bt ou outros princípios pesticidas de uma natureza distinta tem utilidade particular para a prevenção e/ou gerenciamento de resistência de insetos. Outros agentes inseticidas incluem inibidores da protease (tanto os tipos serina como cisteína), αamilase, e peroxidase.

[0064] Os fragmentos e variantes das sequências de nucleotídeos e aminoácidos e os polipeptídeos assim codificados são, também, abrangidos pelas modalidades. Para uso na presente invenção, o termo “fragmento” refere-se a uma porção de uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo ou uma porção de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo das modalidades. Os fragmentos de uma sequência de nucleotídeos podem codificar fragmentos de proteína que mantêm a atividade biológica da proteína nativa ou de comprimento inteiro correspondente e, consequentemente, possui atividade pesticida. Portanto, é reconhecido que algumas das sequências de polinucleotídeos e aminoácidos das modalidades podem ser corretamente referidas tanto como fragmentos como mutantes.

[0065] Deve-se reconhecer que o termo “fragmento”, conforme é usado para referir-se a sequências de ácidos nucleicos das modalidades, também abrangem sequências que são úteis como sondas de hibridização. Essa classe de sequências de nucleotídeos em geral não codifica fragmentos de proteínas que mantêm atividade biológica. Desta forma, os fragmentos de uma sequência de nucleotídeos podem estar na faixa de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos e até a sequência de nucleotídeos de comprimento inteiro que codifica as proteínas da invenção.

[0066] Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos das modalidades que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida das modalidades codificará pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 650 ou 700 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma polipeptídeo pesticida das modalidades (por exemplo, 705 aminoácidos para a SEQ ID NO: 2.693 aminoácidos para a SEQ ID NO: 4, e 719 aminoácidos para a SEQ ID NO: 6). Dessa forma, é entendido que as modalidades também abrangem polipeptídeos que são fragmentos das proteínas pesticidas exemplificadoras das modalidades e que têm comprimentos de pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 ou, 700 aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo pesticida das modalidades (por exemplo, 705 aminoácidos para a SEQ ID NO: 2). Os fragmentos de uma sequência de nucleotídeos das modalidades que são úteis como sondas de hibridização ou iniciadores de PCR, em geral, não precisam codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida. Portanto, um fragmento de um ácido nucleico das modalidades pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida, ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR com o uso dos métodos apresentados na presente invenção. Uma porção biologicamente ativa de um pesticida pode ser preparada pelo isolamento de uma porção de uma das sequências de nucleotídeos das modalidades, expressando a porção codificada da proteína pesticida (por exemplo, por expressão recombinante in vitro) e avaliação da atividade da porção codificada da pesticida proteína.

[0067] Ácidos nucleicos que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos das modalidades compreendem ao menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 1.000, 1.200, 1.400, 1.600, 1.800, 1.900, 2.000 ou 2.100 nucleotídeos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos apresentada aqui (por exemplo, 2118 nucleotídeos para a SEQ ID NO: 1; 2118 nucleotídeos para a SEQ ID NO: 3; e 2160 nucleotídeos para a SEQ ID NO: 5). As modalidades particulares consideram fragmentos derivados de (por exemplo, produzidos a partir de) um primeiro ácido nucleico das modalidades, sendo que o fragmento codifica uma toxina truncada caracterizada pela atividade pesticida. Os polipeptídeos truncados codificados pelos fragmentos de polinucleotídeo das modalidades são caracterizados pela atividade pesticida que é equivalente a, ou aprimorada, em relação à atividade do polipeptídeo de comprimento inteiro correspondente codificado pelo primeiro ácido nucleico do qual o fragmento é derivado. Considera-se que esses fragmentos de ácidos nucleicos das modalidades podem ser truncados na extremidade 3' da sequência codificadora nativa ou de comprimento inteiro correspondente. Os fragmentos de ácido nucleico podem também ser truncados tanto na extremidade 5′ como 3′ da sequência codificadora de comprimento inteiro correspondente.

[0068] O termo “variantes” é usado na presente invenção para referir-se a sequências substancialmente similares. Para sequências de nucleotídeos, as variantes conservadoras incluem aquelas sequências que, devido à degeneração do código genético, codificam a sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos pesticidas das modalidades. Variantes alélicas de ocorrência natural como estas podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas como, por exemplo, reação em cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, conforme descrito na presente invenção.

[0069] As sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos derivadas sinteticamente como aquelas geradas, por exemplo, pelo uso de mutagênese sítio-dirigida, mas que codificam ainda uma proteína pesticida das modalidades, como uma toxina mutante. De modo geral, as variantes de uma sequência de nucleotídeos específica das modalidades terão pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com aquela sequência de nucleotídeos específica, conforme determinado por programas para alinhamento de sequência descritos em outra parte do presente documento, com o uso de parâmetros-padrão. Uma variante de uma sequência de nucleotídeos das modalidades pode diferir daquela sequência por somente 1 a 15 nucleotídeos, somente 1 a 10, como 6 a 10, somente 5, somente 4, 3, 2 ou mesmo 1 nucleotídeo.

[0070] As variantes de uma sequência de nucleotídeos particular das modalidades (isto é, uma sequência de nucleotídeos exemplificadora) podem também ser avaliadas por comparação do percentual de identidade de sequência entre o polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos variante e o polipeptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de referência. Portanto, por exemplo, ácidos nucleicos isolados que codificam um polipeptídeo com um determinado percentual de identidade de sequência ao polipeptídeo das SEQ ID NOs: 2, 4, e 6 são apresentados. O percentual de identidade de sequência entre quaisquer dois polipeptídeos pode ser calculado com o uso dos programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em outras partes no presente documento com o uso de parâmetros padrão. Quando qualquer par de polinucleotídeos da invenção é avaliado por comparação do percentual de identidade de sequência compartilhado pelos dois polipeptídeos que eles codificam, o percentual de identidade de sequência entre os dois polipeptídeos codificados é de pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, em geral pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, ou pelo menos cerca de 98%, 99% ou mais de identidade de sequência.

[0071] Como usado aqui, o termo “proteína variante” abrange polipeptídeos que são derivados de uma proteína nativa por: deleção (denominado truncamento) ou adição de um ou mais aminoácidos à extremidade de N-terminal e/ou C-terminal da proteína nativa; deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa; ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa. Consequentemente, o termo “proteína variante” abrange fragmentos biologicamente ativos de uma proteína nativa que compreendem um número suficiente de resíduos de aminoácidos contíguos para manter a atividade biológica da proteína nativa, isto é, para ter atividade pesticida. Essa atividade pesticida pode ser diferente ou aprimorada em relação à proteína nativa ou pode ser inalterada, desde que a atividade pesticida seja mantida.

[0072] As proteínas variantes abrangidas pelas modalidades são biologicamente ativas, isto é, elas continuam a ter a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, a atividade pesticida, conforme descrito na presente invenção. Tais variantes podem resultar, por exemplo, de polimorfismo genético ou de manipulação humana. As variantes biologicamente ativas de uma proteína pesticida nativa das modalidades terão pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos conforme determinado por programas de alinhamento de sequência descritos em outra parte na presente invenção com o uso de parâmetros padrão. Uma variante biologicamente ativa de uma proteína das modalidades pode ser diferente desta proteína por somente 1 a 15 resíduos de aminoácido, somente 1 a 10, como 6 a 10, somente 5, somente 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.

[0073] As modalidades abrangem adicionalmente um microrganismo que é transformado com pelo menos um ácido nucleico das modalidades, com um cassete de expressão que compreende o ácido nucleico, ou com um vetor que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o microorganismo é capaz de se multiplicar em plantas. Uma modalidade da invenção refere-se a uma proteína pesticida encapsulada que compreende um microrganismo transformado capaz de expressar pelo menos uma proteína pesticida das modalidades.

[0074] As modalidades fornecem composições pesticidas que compreendem um microrganismo transformado das modalidades. Nessas modalidades, o microrganismo transformado em geral está presente na composição pesticida em uma quantidade eficaz de pesticida, juntamente com um veículo adequado. As modalidades também abrangem composições pesticidas que compreendem uma proteína isolada das modalidades, sozinha ou em combinação com um organismo transformado das modalidades e/ou uma proteína pesticida encapsulada das modalidades, em uma quantidade eficaz de pesticida, juntamente com um veículo adequado.

[0075] As modalidades fornecem adicionalmente um método para aumentar a faixa alvo de inseto pelo uso de uma proteína pesticida das modalidades em combinação com pelo menos uma outra ou “segunda” proteína pesticida. Qualquer proteína pesticida conhecida na técnica pode ser empregada nos métodos das modalidades. Essas proteínas pesticidas incluem, mas não se limitam a, toxinas Bt, inibidores de protease, α-amilases e peroxidases.

[0076] As modalidades também abrangem plantas transformadas ou transgênicas que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeos das modalidades. Em algumas modalidades, a planta é transformada de maneira estável com um construto de nucleotídeo que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos das modalidades ligado de maneira funcional a um promotor que dirige a expressão em uma célula vegetal. Para uso na presente invenção, os termos “planta transformada” e “planta transgênica” se referem a uma planta que compreende em seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Em geral, o polinucleotídeo heterólogo está integrado de maneira estável ao genoma de uma planta transgênica ou transformada, de modo que o polinucleotídeo seja transmitido para sucessivas gerações. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de um cassete de expressão recombinante.

[0077] Deve-se compreender que, para uso na presente invenção, o termo “transgênico” inclui qualquer célula, linhagem de células, calo, tecido, parte de planta ou planta cujo genótipo foi alterado pela presença de ácido nucléico heterólogo, inclusive aqueles transgênicos inicialmente assim alterados, bem como aqueles criados por meio de cruzamentos sexuados ou propagação assexuada a partir do transgênico inicial. O termo “transgênico”, conforme usado neste documento, não abrange a alteração do genoma (cromossômica ou extracromossômica) por métodos convencionais de reprodução de plantas ou por eventos que ocorrem naturalmente como a fecundação cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante ou mutação espontânea.

[0078] Para uso na presente invenção, o termo “planta” inclui plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc, sementes, células vegetais e a progênie da mesma. Partes de plantas transgênicas estão dentro do escopo das modalidades e compreendem, por exemplo, células vegetais, protoplastos vegetais, culturas de tecido de célula vegetal a partir das quais as plantas podem ser regeneradas, calo vegetal, nódulos vegetais, e células vegetais que estão intactas em plantas ou parte de plantas como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramificações, frutos, grãos, espigas, sabugos, cascas, talos, raízes, pontas de raiz, anteras, e similares, que se originam de plantas transgênicas ou sua progênie anteriormente transformadas com uma molécula de DNA das modalidades, e consistindo portanto pelo menos em uma parte de células transgênicas. A classe de plantas que pode ser usada nos métodos das modalidades é em geral tão ampla quanto a classe de plantas superiores tratáveis por técnicas de transformação, incluindo plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas.

[0079] Embora as modalidades não dependam de um mecanismo biológico particular para aumentar a resistência de uma planta a uma praga de planta, a expressão das sequências de nucleotídeos das modalidades em uma planta pode resultar na produção das proteínas pesticidas das modalidades e em um aumento na resistência da planta a uma praga de planta. As plantas das modalidades encontram uso na agricultura em métodos para causar impacto sobre pragas de insetos. Certas modalidades fornecem plantas cultivadas transformadas, como, por exemplo, plantas de milho, que encontram uso em métodos para causar impacto sobre insetos-pragas da planta, como, por exemplo, pragas de Lepidópteros.

[0080] Uma “planta ou célula vegetal em estudo” é aquela na qual se obteve uma alteração genética, como uma transformação, quanto a um gene de interesse, ou é uma planta ou célula vegetal que é descendente de uma planta ou célula também alterada e que compreende a alteração. Um “controle” ou “planta de controle” ou “célula vegetal de controle” fornece um ponto de referência para medir alterações no fenótipo da planta ou célula vegetal em estudo.

[0081] Uma planta ou célula vegetal de controle pode compreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula de ocorrência natural, isto é, do mesmo genótipo como o material de partida para a alteração genética que resultou na planta ou célula experimentada; (b) uma planta ou célula vegetal do mesmo genótipo como o material de partida, mas que foi transformada com um construto nulo (isto é., com um construto que não tem efeito conhecido sobre o traço de interesse, como um construto que compreende um gene marcador); (c) uma planta ou célula vegetal que é uma segregante não-transformada entre a progênie de um indivíduo vegetal ou célula vegetal; (d) uma planta ou célula vegetal geneticamente idêntica à planta ou célula vegetal em estudo, mas que não é exposta a condições ou estímulos que poderiam induzir a expressão do gene de interesse; ou (e) a própria planta ou célula vegetal em estudo, sob condições nas quais o gene de interesse não é expresso.

[0082] O versado na técnica reconhecerá prontamente que os avanços no campo da biologia molecular como a mutagênese sítioespecífica ou aleatória, metodologias de reação em cadeia de polimerase, e técnicas de engenharia de proteínas fornecem uma coleção extensa de ferramentas e protocolos adequados ao uso para alterar ou modificar tanto a sequência de aminoácidos como as sequências genéticas subjacentes de proteínas de interesse agrícola.

[0083] Portanto, as proteínas das modalidades podem ser alteradas de várias formas incluindo substituições, deleções, truncamentos e inserções de aminoácidos. Os métodos para tais manipulações são de conhecimento geral na técnica. Por exemplo, variantes de sequências de aminoácidos de proteínas pesticidas podem ser preparadas pela introdução de mutações em um ácido nucleico sintético por exemplo(, molécula de DNA). Métodos para mutagênese e alterações de ácido nucleico são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, alterações planejadas podem ser introduzidas com o uso de uma técnica de mutagênese sítiodirigida mediada por oligonucleotídeo. Consulte, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente US n° 4.873.192; Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York, EUA), e as referências citadas nele.

[0084] As sequências da nucleotídeos mutagenizadas das modalidades podem ser alteradas de modo a modificar cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 ou mais dos aminoácidos presentes na sequência primária do polipeptídeo codificado. Alternativamente, ainda mais alterações a partir da sequência nativa podem ser introduzidas de modo que a proteína codificada pode ter pelo menos cerca de 1% ou 2%, ou cerca de 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, ou ainda cerca de 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ou 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, ou 25%, 30%, 35%, ou 40% ou mais de códons alterados, ou de outro modo modificados em comparação à proteína de ocorrência natural correspondente. Do mesmo modo, a proteína codificada pode ter pelo menos cerca de 1% ou 2%, ou cerca de 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, ou ainda cerca de 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ou 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, ou 25%, 30%, 35%, ou 40% ou mais de códons adicionais comparada com a proteína de ocorrência natural correspondente. Deve-se compreender que as sequências de nucleotídeos mutagenizadas das modalidades destinam-se a abranger peptídeos biologicamente funcionais e equivalentes que têm atividade pesticida, como uma atividade pesticida aprimorada, conforme determinado por propriedades antialimentares contra larvas da broca européia do milho. Essas sequências podem surgir como consequência da redundância de códon e equivalência funcional que são conhecidas por ocorrerem naturalmente dentro de sequências de ácido nucleico e das proteínas assim codificadas.

[0085] O versado na técnica reconhecerá que as adições e/ou substituições de aminoácidos são, em geral, baseadas na similaridade relativa dos substituintes de cadeia lateral de aminoácido, por exemplo, sua hidrofobicidade, carga, tamanho, e similares. Grupos de substituição de aminoácido exemplificadores que levam várias das características supracitadas em consideração são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina, e isoleucina.

[0086] A orientação quanto às substituições de aminoácidos adequada que não afetam a capacidade biológica da proteína de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., EUA), aqui incorporadas a título de referência. Substituições conservativas, como a troca de um aminoácido por outro que tenha propriedades similares, podem ser feitas.

[0087] Portanto, os genes e sequências de nucleotídeos das modalidades incluem tanto as sequências de ocorrência natural como as formas mutantes. De modo semelhante, as proteínas das modalidades abrangem tanto proteínas de ocorrência natural como variações (por exemplo, polipeptídeos truncados) e formas modificadas (por exemplo, mutantes) das mesmas. Essas variantes continuarão a ter a atividade pesticida desejada. As mutações que serão feitas na sequência de nucleotídeos que codifica a variante não colocam a sequência fora da fase de leitura e, em geral, não criam regiões complementares que poderiam produzir uma estrutura de mRNA secundária. Consulte, a publicação de pedido de patente EP n° 75.444.

[0088] Não é esperado que deleções, inserções e substituições das sequências de proteína aqui compreendidas produzam alterações radicais nas características da proteína. Entretanto, quando é difícil prever o efeito exato da substituição, deleção ou inserção com antecedência, o versado na técnica reconhecerá que o efeito será avaliado por testes de triagem de rotina, como ensaio de alimentação de insetos. Consulte, por exemplo, Marrone et al. (1985) J. Econ. Entomol., 78: 290-293 e Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol., 83: 2480- 2485, aqui incorporado por referência.

[0089] As sequências de nucleotídeos e proteínas variantes também abrangem sequências e proteínas derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico, como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais sequências codificadoras diferentes podem ser manipuladas para criar uma nova proteína pesticida que possui as propriedades desejadas. Desta forma, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos com sequências relacionadas compreendendo regiões de sequência que possuem uma identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas homologamente in vitro ou invivo. Por exemplo, com o uso dessa abordagem, as sequências de codificação de comprimento inteiro, motivos de sequência que codificam um domínio de interesse, ou qualquer fragmento de uma sequência de nucleotídeos das modalidades pode ser embaralhado entre as sequências de nucleotídeos das modalidades e porções correspondentes de outras sequências de nucleotídeos Cry conhecidas para obter um novo gene que codifica uma proteína com uma propriedade de interesse aprimorada.

[0090] As propriedades de interesse incluem, mas não se limitam a, atividade pesticida por unidade de proteína pesticida, estabilidade de proteína, e toxicidade para espécies não alvo, particularmente seres humanos, gado, e plantas e micróbios que expressam os polipeptídeos pesticidas das modalidades. As modalidades não estão ligadas a qualquer estratégia de embaralhamento particular, apenas aquela em que pelo menos uma sequência de nucleotídeos das modalidades, ou parte da mesma, está envolvida nessa estratégia de embaralhamento. O embaralhamento pode envolver apenas sequências de nucleotídeos apresentados na presente invenção, ou podem envolver adicionalmente o embaralhamento de outras sequências de nucleotídeos conhecidas na técnica. As estratégias para embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; e patentes US n°s 5.605.793 e 5.837.458.

[0091] As sequências de nucleotídeos das modalidades podem também ser usadas para isolar sequências correspondentes a partir de outros organismos, particularmente outras bactérias, e mais particularmente outras cepas de Bacillus. Desta forma, métodos como PCR, hibridização e similares podem ser usados para identificar essas sequências com base na sua homologia de sequência com as sequências aqui descritas. Sequências que são selecionadas com base em sua identidade de sequência com as sequências inteiras apresentadas na presente invenção, ou com fragmentos das mesmas, são abrangidas pelas modalidades. Essas sequências incluem sequências que são ortólogas das sequências apresentadas. O termo “ortólogos” refere-se a genes derivados partir de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies como resultado de especiação. Genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando suas sequências de nucleotídeos e/ou suas sequências de proteína codificadas compartilham uma identidade substancial conforme definido em outra parte na presente invenção. As funções dos ortólogos são frequentemente altamente conservadas entre as espécie.

[0092] Em uma abordagem de PCR, podem ser definidos iniciadores de oligonucleotídeos para uso em reações de PCR para amplificar as sequências de DNA correspondentes a partir do cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer organismo de interesse. Os métodos para design de iniciadores de PCR e clonagem por PCR são de conhecimento geral na técnica e apresentados em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, EUA), deste ponto em diante no presente documento “Sambrook”. Consulte também Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York, EUA); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York, EUA); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York, EUA). Os métodos conhecidos de PCR incluem, mas não se limitam a, métodos que utilizam iniciadores pareados, iniciadores aninhados, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de genes, iniciadores específicos de vetores, iniciadores parcialmente nãocorrespondentes, e similares.

[0093] Nas técnicas de hibridização, a totalidade ou parte de uma sequência de nucleotídeos conhecida é usada como uma sonda que se hibridiza seletivamente com outras sequências de nucleotídeo correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonado, ou fragmentos de cDNA (isto é, bibliotecas genômicas ou de cDNA) de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo detectável como 32P ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo, as sondas para hibridização podem ser produzidas mediante a marcação de oligonucleotídeos sintéticos com base nas sequências promotoras das modalidades. Métodos para preparação de sondas para hibridização e para construção de cDNA e bibliotecas genômicas são de conhecimento geral na técnica e são apresentados em Sambrook.

[0094] Por exemplo, uma sequência inteira apresentada na presente invenção, ou uma ou mais porções da mesma, pode ser usada como uma sonda capaz de hibridizar-se especificamente com as sequências correspondentes e RNAs mensageiros. Para se obter a hibridização específica sob uma variedade de condições, essas sondas incluem sequências que são únicas para as sequências promotoras das modalidades e geralmente têm pelo menos cerca de 10 ou 20 nucleotídeos de comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar as sequências Cry correspondentes a partir de um organismo selecionado por PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências codificadoras adicionais a partir de um organismo desejado, ou como um teste diagnóstico para determinar a presença de sequências codificadoras em um organismo. Técnicas de hibridização incluem triagem por hibridização de bibliotecas de DNA colocadas em placas de Petri (placas ou colonias; veja, por exemplo, Sambrook).

[0095] A hibridização destas sequências pode ser executada sob condições estringentes. Os termos “condições estringentes” ou “condições estringentes de hibridização” conforme usados na presente invenção referem-se a condições sob as quais uma sonda irá hibridizar-se com sua sequência-alvo em um grau detectavelmente maior que as outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes, 5 vezes, ou 10 vezes em relação aos antecedentes ou valores de fundo). Condições estringentes dependem da sequência e serão diferentes sob circunstâncias diferentes. Pelo controle da estringência das condições de hibridização e/ou lavagem, sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum pareamento errado nas sequências para que graus menores de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Em geral, uma sonda tem menos que cerca de 1000 ou 500 nucleotídeos de comprimento.

[0096] Tipicamente, as condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de 1,5 M de íons de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M da concentração de íons de Na (para outros sais) a um valor de pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, mais de 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores, como formamida. Condições de baixa estringência exemplificadoras incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37°C e uma lavagem em 1X a 2X de SSC (20X SSC = 3,0 M de NaCl/0,3 M de citrato trissódico) a uma temperatura de 50 a 55°C. Condições de estringência moderada exemplificadoras incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C e uma lavagem em 0,5X a 1X de SSC a 55 a 60°C. Condições de alta estringência exemplificadoras incluem hibridização em 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem final em 0,1 vezes de SSC a uma temperatura de 60 a 65°C durante um período de pelo menos 20 minutos. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente menor que cerca de 24 horas, usualmente, de cerca de 4 a cerca de 12 horas.

[0097] A especificidade é tipicamente uma função das lavagens pós-hibridização, sendo que os fatores críticos são a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm(ponto de fusão térmico) pode ser aproximada da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, “% form” é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de base. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza a uma sonda perfeitamente pareada. As lavagens são realizadas tipicamente pelo menos até o equilíbrio ser alcançado e um nível baixo de valores de fundo para a hibridização ser atingido, como durante 2 horas, 1 hora, ou 30 minutos.

[0098] Tm é reduzida por cerca de 1°C para cada 1% de mau emparelhamento; dessa forma, Tm, as condições de hibridização e/ou de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com sequências da identidade desejada. Por exemplo, quando o que se busca são sequências com ≥90% de identidade, a Tm pode ser diminuída para 10°C. Em geral, as condições estringentes são selecionadas para ter uma temperatura cerca de 5°C mais baixa que a Tmpara a sequência específica e seu complemento, a uma força iônica e pH definidos. Entretanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4°C inferior do que a Tm; condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C inferior do que a Tm; condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C inferior do que a Tm.

[0099] Com o uso da equação, da hibridização e das composições de lavagem, e da Tm desejada, os versados na técnica entenderão que variações na estringência de hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de pareamento incorreto resultar em uma Tm menor que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), a concentração de SSC pode ser aumentada para que uma temperatura mais elevada possa ser usada. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York, EUA); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 Greene Publishing e Wiley-Interscience, New York, EUA. Consulte também Sambrook. Portanto, as sequências isoladas que codificam uma proteína Cry das modalidades e hibridizam sob condições estringentes com as sequências Cry apresentadas na presente invenção ou fragmentos da mesma, são abrangidas pelas modalidades.

[0100] Os seguintes termos são usados para descrever a sequência de relações entre dois ou mais ácidos nucleicos ou polinucleotídeos: (a) “sequência de referência”, (b) “janela de comparação”, (c) “identidade de sequência”, (d) “porcentagem de identidade de sequência”, e (e) “identidade substancial”.

(a) Para uso na presente invenção, “sequência de referência” é uma sequência definida usada como uma base para a comparação entre as sequências. Um sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada; Por exemplo, como um segmento de um cDNA de comprimento completo ou sequência de genes ou o cDNA completo ou sequência de genes.
(b) Para uso na presente invenção, “janela de comparação” faz referência a um segmento contíguo e especificado de uma sequência de polinucleotídeos, sendo que a sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para um alinhamento ótimo das duas sequências. Em geral, a janela de comparação tem pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento e, opcionalmente, pode ter 30, 40, 50, 100 ou mais. Os versados na técnica compreendem que para evitar uma alta similaridade a uma sequência de referência devido à inclusão de lacunas na sequência de polinucleotídeo, uma penalidade por lacuna é tipicamente introduzida e é subtraída do número de igualdades.

[0101] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Desta forma, a determinação do percentual de identidade de sequência entre quaisquer duas sequências pode ser feito com o uso de um algoritmo matemático. Alguns exemplos não limitadores destes algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller, (1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; o método de alinhamento “procura por local” de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modificado conforme descrito em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 a 5877.

[0102] Implementações computacionais destes algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação entre sequências para determinar a identidade de sequência. Tais implementações incluem, mas não se limitam a: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível junto à Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA); o programa ALIGN (Versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no Genetics Software Package de GCG Wisconsin, Versão 10 (disponível junto à Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia, EUA). Alinhamentos usando estes programas podem ser feitos com os parâmetros padrão. O programa CLUSTAL é adequadamente descrito em Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. O programa ALIGN tem por base o algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma penalidade por comprimento de lacuna de 12, e uma penalidade por lacuna de 4 podem ser usadas com o programa ALIGN ao comparar sequências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra As buscas de nucleotídeo por BLAST podem ser feitas com o programa BLASTN, pontuação = 100, tamanho da palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína das modalidades. As buscas de proteína por BLAST podem ser feitas com o programa BLASTX, pontuação = 50, tamanho da palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma proteína ou polipeptídeo das modalidades. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST (no BLAST 2.0) pode ser usado, conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usado para executar uma busca repetida que detecta relações distantes entre moléculas. Consulte Altschul et al. (1997) supra. Quando se usa os programas BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para sequências de nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados. Consulte o site da web do National Center for Biotechnology Information pela rede mundial de computadores ncbi.hlm.nih.gov. O alinhamento também pode ser feito manualmente por inspeção.

[0103] Exceto onde especificado em contrário, os valores de identidade/similaridade de sequência fornecidos no presente documento referem-se ao valor obtido com o uso GAP versão 10 com o uso dos seguintes parâmetros: porcentagem de identidade e porcentagem de similaridade para uma sequência de nucleotídeos usando Peso GAP de 50 e Peso de Comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; porcentagem de identidade e porcentagem de similaridade para uma sequência de aminoácidos usando Peso GAP de 8 e Peso de comprimento de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programa equivalente ao mesmo. O termo “programa equivalente” refere-se a qualquer programa para comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem pareamentos de resíduos de nucleotídeo ou aminoácido idênticos e um percentual de identidade de sequência idêntico em comparação ao alinhamento correspondente gerado pelo programa GAP versão 10.

[0104] O GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) supracitados, para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximize o número de igualdade e minimize o número de lacunas. O programa GAP considera todos os alinhamentos e posições de lacuna possíveis e cria o alinhamento com o maior número de bases pareadas e o menor número de lacunas. Ele permite que se forneça uma penalidade por criação de lacuna e uma penalidade por extensão da lacuna em unidades de bases pareadas. O programa GAP deve obter vantagem pelo número de penalidades por criação de lacuna dos pareamentos para cada lacuna que ele insere. Se uma penalidade por extensão da lacuna maior que zero for escolhida, o GAP deve ainda obter uma vantagem para cada lacuna inserida com o comprimento da lacuna vezes a penalidade por extensão da lacuna. Os valores padrão de penalidade por criação de lacuna e os valores de penalidade por extensão da lacuna na versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package para sequências de proteína são 8 e 2, respectivamente. Para sequências de nucleotídeos, a penalidade por criação de lacuna padrão é de 50 e a penalidade por extensão da lacuna padrão é de 3. As penalidades por criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser expressas como um número inteiro selecionado a partir do grupo de números inteiros que consiste em 0 a 200. Desta forma, por exemplo, as penalidades por criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou mais.

[0105] O programa GAP apresenta um membro da família dos melhores alinhamentos. Pode haver muitos membros desta família, mas nenhum outro membro tem uma qualidade melhor. GAP exibe quatro coeficientes de mérito para alinhamentos: Qualidade, Razão, Identidade e Similaridade. A qualidade é a métrica maximizada de modo a alinhar as sequências. A razão é a qualidade dividida pelo número de bases no segmento mais curto. O percentual de identidade é o percentual dos símbolos que de fato pareiam. O percentual de similaridade é o percentual dos símbolos que são similares. Os símbolos que estão através das lacunas são ignorados. Uma similaridade é pontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par de símbolos é maior que ou igual a 0,50, o limiar de similaridade. A matriz de pontuação usada na versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package é BLOSUM62 consulte Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

[0106] (c) Para uso na presente invenção, “identidade de sequência” ou “identidade”, no contexto de duas sequências de ácidos nucleicos ou de polipeptídeos, faz referência aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade de sequência é usada com relação a proteínas, reconhece-se que posições de resíduo que não são idênticas frequentemente diferem em substituições de aminoácido conservativas, quando os resíduos de aminoácido são substituídos por outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou capacidade hidrofóbica) e, portanto, não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando as sequências diferem em substituições conservativas, o percentual de identidade de sequência pode ser ajustado para cima para compensar a natureza conservativa da substituição. Diz-se que sequências que diferem em tais substituições conservativas possuem “similaridade de sequência” ou “similaridade”. Os meios para fazer esse ajuste são bem conhecidos pelos versados na técnica. Isto envolve tipicamente pontuar uma substituição conservativa como um pareamento errado parcial ao invés de total aumentando, assim, a porcentagem de identidade de sequência. Desta forma, por exemplo, quando uma pontuação de 1 é dada a um aminoácido idêntico e uma pontuação zero é dada a uma substituição não-conservativa, uma pontuação entre zero e 1 será dada a uma substituição conservativa. A pontuação das substituições conservativas é calculada, por exemplo, conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA).

[0107] (d) Para uso na presente invenção, “porcentagem de identidade de sequência” significa o valor determinado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, sendo que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais ocorre uma base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido idênticos em ambas as sequências para gerar o número de posições pareadas, dividindose o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado por 100 para obter a porcentagem de identidade de sequência.

[0108] (e)(i) O termo “identidade substancial” de sequências de polinucleotídeos significa que um polinucleotídeo compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% ou mais de identidade de sequência quando comparada a uma sequência de referência com o uso dos programas de alinhamento descritos com o uso de parâmetros padrão. O versado na técnica reconhecerá que esses valores podem ser adequadamente ajustados para determinar a identidade correspondente das proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeos, levando em consideração a degeneração do códon, a similaridade de aminoácidos, o posicionamento do quadro de leitura, e similares. A identidade substancial de sequências de aminoácidos para esses propósitos, normalmente significa uma identidade de sequência de pelo menos 60%, 70%, 80%, ou 90%, ou 95% ou identidade de sequência maior.

[0109] Outra indicação de que as sequências de nucleotídeos são substancialmente idênticas consiste na possibilidade de duas moléculas hibridizarem uma com a outra sob condições estringentes. Em geral, as condições estringentes são selecionadas para ter uma temperatura cerca de 5°C mais baixa que o Tm para a sequência específica, a uma força iônica e pH definidos. Entretanto, as condições estringentes abrangem temperaturas na faixa de cerca de 1°C a cerca de 20°C mais baixas que o Tm, dependendo do grau desejado de estringência, conforme qualificado de outro modo na presente invenção. Os ácidos nucleicos que não se hibridizam um com o outro sob condições estringentes ainda são substancialmente idênticos se os polipeptídeos que codificam forem substancialmente idênticos. Isso pode ocorrer, por exemplo, quando uma cópia de ácido nucleico é criada com o uso da degeneração máxima de códon permitida pelo código genético. Uma indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas se dá quando o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico apresenta uma reação imunológica cruzada com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico.

[0110] (e)(ii) O termo “identidade substancial” no contexto de um peptídeo indica que o peptídeo compreende uma sequência que apresenta pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais identidade de sequência para uma sequência de referência ao longo de uma janela de comparação especificada. O alinhamento ótimo para esses propósitos pode ser conduzido com o uso do algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) supra. Uma indicação de que duas sequências de peptídeos são substancialmente idênticas consiste no fato de um peptídeo ser imunologicamente reativo com anticorpos criados contra o segundo peptídeo. Portanto, um peptídeo é substancialmente idêntico a um segundo peptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por uma substituição conservativa. Os peptídeos que são “substancialmente similares” compartilham sequências conforme observado acima, exceto que as posições de resíduos que não são idênticas podem diferir por alterações de aminoácidos conservativas.

[0111] O uso do termo “construtos de nucleotídeo” na presente invenção não se destina a limitar as modalidades aos construtos de nucleotídeos que compreendem DNA. Os elementos versados na técnica reconhecerão que os construtos de nucleotídeos, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos compostos por ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, podem também ser empregados nos métodos apresentados na presente invenção. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos, e sequências de nucleotídeos das modalidades abrangem adicionalmente todas as formas complementares desses construtos, moléculas, e sequências. Adicionalmente, os construtos de nucleotídeos, moléculas de nucleotídeos, e sequências de nucleotídeos das modalidades abrangem todos os construtos de nucleotídeos, moléculas, e sequência que podem ser empregadas nos métodos das modalidades para transformar plantas incluindo, mas não se limitando a, aquelas que compreendem desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e combinações dos mesmos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem moléculas de ocorrência natural e análogos sintéticos. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos, e sequências de nucleotídeos das modalidades também abrangem todas as formas de construtos de nucleotídeos incluindo, mas não se limitando a, formas de filamento único, formas de filamento duplo, estruturas em gancho, estruturas em alça, e similares.

[0112] Uma modalidade adicional refere-se a um organismo transformado como um organismo selecionado a partir do grupo que consiste em células de plantas e de insetos, bactérias, leveduras, baculovírus, protozoários, nematóides, e algas. O organismo transformado compreende: uma molécula de DNA das modalidades, um cassete de expressão que compreende a dita molécula de DNA ou um vetor que compreende o dito cassete de expressão, que pode ser incorporado de maneira estável ao genoma do organismo transformado.

[0113] As sequências das modalidades são fornecidas em construtos de DNA para expressão no organismo de interesse. O construto incluirá sequências reguladoras 5' e 3' ligadas de maneira funcional a uma sequência das modalidades. O termo “ligado de maneira funcional” conforme usado na presente invenção referese a uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, sendo que a sequência do promotor inicia e media a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. Em geral, a expressão 'ligado de maneira funcional' significa que as sequências de ácidos nucleicos que estão sendo ligadas são contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões codificadoras de proteína, são contíguas e na mesma fase de leitura. O construto pode conter, adicionalmente, pelo menos um gene adicional a ser co-transformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode(m) ser fornecidos em múltiplos construtos de DNA.

[0114] Esse construto de DNA é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção da sequência de toxina Cry para ser destinada a ficar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O construto de DNA pode conter adicionalmente genes marcadores selecionáveis.

[0115] O construto de DNA incluirá na direção 5' a 3' de transcrição: uma região de iniciação transcricional e traducional (isto é, um promotor), uma sequência de das modalidades, e uma região de terminação transcricional e traducional (isto é, região de terminação) funcional no organismo que serve como hospedeiro. A região de iniciação transcricional (isto é, o promotor) pode ser nativa, análoga, estranha ou heteróloga ao organismo hospedeiro e/ou à sequência das modalidades. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou alternativamente uma sequência sintética. O termo “estranho” para uso na presente invenção indica que o promotor não é encontrado no organismo nativo para o qual o promotor é introduzido. Quando o promotor é “estranho” ou “heterólogo” à sequência das modalidades, significa que o promotor não é o promotor nativo ou de ocorrência natural para a sequência ligada de maneira funcional das modalidades. Para uso na presente invenção, um gene quimérico compreende uma sequência codificante operacionalmente ligada a uma região de início de transcrição que é heteróloga à sequência codificante. Quando o promotor é uma sequência nativa ou natural, a expressão da sequência ligada de maneira funcional é alterada com base na expressão de ocorrência natural, o que resulta em uma alteração no fenótipo.

[0116] A região de terminação pode ser nativa à região de iniciação transcricional, pode ser nativa à sequência de DNA de interesse ligada de maneira funcional, pode ser nativa à planta hospedeira ou pode ser derivada de uma outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, à sequência de interesse, à planta hospedeira ou a qualquer combinação dos mesmos).

[0117] Regiões de terminação adequadas estão disponíveis a partir do plasmídeo Tide A. tumefaciens, tal como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Consulte também Guerineau et al.(1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene, 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[0118] Quando apropriado, o ácido nucleico pode ser otimizado para ter uma expressão aumentada no organismo hospedeiro. Portanto, quando o organismo hospedeiro é uma planta, os ácidos nucleicos sintéticos podem ser sintetizados com o uso de códons preferenciais por plantas para uma expressão aprimorada. Consulte, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 9 2:1-11 para uma discussão quanto ao uso de códon preferencial para hospedeiro. Por exemplo, embora as sequências de ácidos nucleicos das modalidades possam ser expressas em espécies de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, as sequências podem ser modificadas para considerar as preferências de códon específicas e as preferências de conteúdo de GC de plantas monocotiledôneas ou plantas dicotiledôneas, visto que tem sido mostrado que essas preferências são diferenciadas (Murray) et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498) Portanto, o códon preferencial para milho para um aminoácido particular pode ser derivado de sequências de genes conhecidas do milho. O uso de códon de milho para 28 genes obtidos de plantas de milho é mencionado na Tabela 4 de Murray et al., supra. Métodos para sintetizar genes preferenciais para plantas estão disponíveis na técnica. Consulte, por exemplo, as patentes US n° 5.380.831, e 5.436.391 e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. v. 17:477- 498, aqui incorporados a título de referência.

[0119] Modificações de sequência adicionais para melhorar a expressão gênica em um hospedeiro celular são conhecidas. Estas incluem a eliminação de sequências que codificam sinais espúrios de poliadenilação, sinais de sítio de emenda éxon-íntron, repetições similares a transpóson e outras sequências bem caracterizadas como essas, que podem ser prejudiciais à expressão gênica. O conteúdo de GC da sequência pode ser ajustado para níveis medidos para um dado hospedeiro celular, conforme calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. O termo “célula hospedeira” para uso na presente invenção, refere-se a uma célula que contém um vetor e destinada a suportar a replicação e/ou expressão do vetor de expressão. As células hospedeiras podem ser células procarióticas como E. coli ou células eucarióticas como células de leveduras, insetos, anfíbios, ou mamíferos ou células vegetais de monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de célula hospedeira de monocotiledônea é uma célula hospedeira do milho. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas secundárias de mRNA em forma de grampo previstas.

[0120] Os cassetes de expressão podem conter ainda sequências líder 5'. Estas sequências líder podem atuar acentuando a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes picornavirus, por exemplo, o líder EMCV (região não codificadora de Encefalomiocardite 5') (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); líderes potivírus, por exemplo, líder TEV (Vírus etch do tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233-238), líder MDMV (Vírus do mosaico anão do milho), proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 90-94); líder não traduzido da proteína de revestimento mRNA do vírus de mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, Editor Cech (Liss, New York, EUA), p. 237-256); e líder de vírus mosqueado clorótico do milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385). Consulte ainda, Della-Cioppa et al.(1987) Plant Physiol. 84: 965-968.

[0121] Ao preparar o cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a fornecer as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme for adequado, na fase de leitura adequada. Para isso, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similares. Para este propósito, a mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, anelamento, resubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidos.

[0122] Inúmeros promotores podem ser usados na prática das modalidades. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferenciais por tecidos, induzíveis ou outros promotores para expressão em organismos hospedeiros. Promotores constitutivos adequados para uso em uma célula hospedeira planta incluem, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados no WO 99/43838 e patente US n° 6.072.050; o promotor de núcleo CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); actina do arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente US n° 5.659.026) e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles discutidos nas patentes US n°s 5.608.149, 5.608.144, 5.604.121, 5.569.597, 5.466.785, 5.399.680, 5.268.463, 5.608.142 e 6.177.611.

[0123] Dependendo do resultado desejado, pode ser benéfico expressar o gene a partir de um promotor induzível. De interesse particular para a regulação da expressão das sequências de nucleotídeos das modalidades em planta são os promotores induzidos por danos. Esses promotores induzidos por dano podem responder ao dano causado pela alimentação de insetos, e incluem o inibidor da proteinase da batata, gene (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 494-498); wun1 e wun2, patente US n° 5.428.148; win1 e win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215: 200- 208); systemin (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76); gene MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2): 141-150); e similares, aqui incorporados por referência.

[0124] Adicionalmente, os promotores induzidos por patógenos podem ser empregados nos métodos e construtos de nucleotídeos das modalidades. Esses promotores induzidos por patógenos incluem aqueles de proteínas relacionadas a patogênese (proteína PR), que são induzidos após a infecção por um patógenos; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Consulte, por exemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116. Consulte, também, WO 99/43819, aqui incorporado a título de referência.

[0125] Outros promotores de interesse são aqueles expressos localmente em, ou próximo a, o sítio de infecção por patógeno. Consulte, por exemplo, Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; e Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972- 14977. Consulte também, Chen et al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:96-968; patente US n°. 5.750.386 (induzível por nematódeo); e as referências citadas no mesmo. De interesse particular é o promotor induzido pelo gene PRms de milho, cuja expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (consulte, por exemplo, Cordero et al.((1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).

[0126] Promotores reguláveis quimicamente podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível quimicamente, em que a aplicação da substância química induz a expressão gênica, ou um promotor reprimível quimicamente, em que a aplicação da substância química reprime a expressão gênica. Promotores induzíveis quimicamente são conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, promotor In2-2 no milho, que é ativado por herbicidas protetores de plantas (safener) compostos por benzenosulfonamida, o promotor GST no milho, que é ativado por compostos hidrofóbicos eletrofílicos que são usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores regulados quimicamente de interesse incluem promotores responsivos a esteróides (consulte, por exemplo, o promotor induzido por glicocorticóide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257) e os promotores induzidos por tetraciclina e repressores por tetraciclina (consulte, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, e as patentes US n° 5.814.618 e 5.789.156), aqui incorporados por referência.

[0127] Os promotores preferenciais para tecido podem ser usados para ter como alvo uma expressão de proteína pesticida aumentada dentro de um tecido vegetal específico. Os promotores preferenciais para tecido incluem aquele discutidos em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157- 168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Esses promotores podem ser modificados, se necessário, para uma expressão fraca.

[0128] Promotores preferenciais de folha são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(20):9586-9590.

[0129] Os promotores preferencias para raiz ou específicos de raiz são conhecidos e podem ser selecionados a partir dos muitos disponíveis na literatura ou isolados de novo a partir de várias espécies compatíveis. Consulte, por exemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gene glutamina sintetase específico de raiz de feijão-soja); Keller e Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de controle específico de raiz no gene GRP 1.8 de feijão francês); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico em raiz da manopina sintase (MAS) gene de Agrobacterium tumefaciens); e Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (clone de DNA de comprimento inteiro que codifica a glutamina sintetase citossólica (GS), que é expressa em raízes e nódulos de raiz de feijão-soja). Consulte também Bogusz et al. (1990) Plant Cel 2(7):633-641, em que são descritos dois promotores específicos de raiz isolados a partir do gene de hemoglobina a partir da não leguminosa fixadora de nitrogênio Parasponia andersonii e a não leguminosa não fixadora de nitrogênio relacionada Trema tomentosa são descritos. Os promotores desses genes foram ligados a um gene repórter βglucuronidase e introduzidos dentro da não leguminosa Nicotiana tabacum e da leguminosa Lotus corniculatus e, em ambos os exemplos, a atividade do promotor específico de raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dos promotores dos genes indutores de raiz altamente expressos rolC e rolD de Agrobacterium rhizogenes (consulte Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Eles concluíram que o reforçador (enhancer) e os determinantes do DNA com preferência por tecido são dissociados naqueles promotores. Teeri et al. (1989) usaram fusão de genes a lacZ para demonstrar que o gene T-DNA de Agrobacterium que codifica octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta da raiz, e que o gene TR2' é específico para raiz na planta intacta e estimulado por ferimentos no tecido foliar, uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene de ação inseticida ou larvicida (consulte EMBO J. 8(2):343-350). O gene TR1' fundido ao nptll (neomicina fosfotransferase II) mostrou características similares. Promotores adicionais preferenciais de raiz incluem o promotor do gene VfENOD-GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772); e o promotor promotor rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Consulte também as patentes US n°s 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; e 5.023.179.

[0130] Os promotores “com preferência por sementes” incluem os promotores “específicos de semente” (aqueles promotores ativos durante o desenvolvimento como os promotores de proteínas armazenadas em sementes) bem como os promotores de “germinação de sementes” (aqueles promotores ativos durante a germinação de sementes). Consulte Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108, aqui incorporados por referência. Esses promotores preferenciais por sementes incluem, mas não se limitam a, Cim1 (mensagem induzida por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDA do milho); e milps (myo-inositol-1-fosfato sintase) (consulte a patente US n° 6.225.529, aqui incorporada por referência). Gamma-zein e Glob-1 são promotres específicos de endosperma. Para dicotiledôneas, os promotores específicos de semente incluem, mas não se limitam a, feijão-soja β-faseolina, napina, β-conglicinina, lecitina de soja, cruciferina e similares. Para monocotiledôneas, os promotores específicos de semente incluem, mas não se limitam a, zeína de 15 kDa do milho, zeína de 22 g kDa, zeína de 27 kDa, gama-zeína, ceráceo, shrunken 1 ('contraído'), shrunken 2, Globulina 1, etc. Consulte também WO 00/12733, em que os promotores preferenciais em sementes dos genes end1 e end2 são apresentados. aqui incorporados a título de referência. Um promotor que tem uma expressão “preferencial” em uma tecido particular é expresso naquele tecido em um grau maior do que em um outro tecido vegetal, pelo menos. Alguns promotores preferencias de tecido mostram expressão quase exclusivamente no tecido particular.

[0131] Quando um baixo nível de expressão é desejado, promotores fracos serão usados. Em geral, o termo “promotor fraco” conforme usado na presente invenção refere-se a um promotor que dirige a expressão de uma sequência codificadora em um nível baixo. Pela expressão em nível baixo, entende-se níveis de cerca de 1/1000 transcritos a cerca de 1/100.000 transcritos a cerca de 1/500.000 transcritos. Alternativamente, é reconhecido que o termo “promotores fracos” também abrange promotores que dirigem a expressão em apenas umas poucas células e não em outras para conferir um nível total baixo de expressão. Quando um promotor dirige a expressão em níveis inaceitavelmente altos, porções da sequência de promotor podem ser deletadas ou modificadas para diminuir os níveis de expressão.

[0132] Esses promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor núcleo do promotor Rsyn7 (WO 99/43838 e patente US n° 6.072.050), o promotor núcleo CaMV 35S, e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, estes apresentados nas patentes US n°s 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e 6.177.611; aqui incorporadas a título de referência.

[0133] Em geral, o cassete de expressão poderá também compreender um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem genes que codificam para resistência a antibióticos, como aqueles que codificam para a neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, como o glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenaxiacetato (2,4-D). Exemplos adicionaisde genes marcadores selecionáveis adequados incluem, mas não se limitam a, genes que codificam a resistência a cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992) metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; e Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171- 176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127- 136); bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481; e patentes US n°s 7.709.702 e 7.462.481); fosfofinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Consulte, em geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley et al. (1980) no The Operon, p.177-220; Hu et al. (1987) Cell 48: 555-566; Brown et al. (1987) Cell 49: 603-612; Figge et al. (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27: 1094- 1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547 a 5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlim, Alemanha); e Gill et al. (1988) Nature 334: 721-724 Estas descrições estão aqui incorporadas a título de referência.

[0134] A lista de genes marcadores selecionáveis acima não se destina a ser limitante. Qualquer gene marcadores selecionável pode ser usado nas modalidades.

[0135] Os métodos das modalidades envolvem introduzir um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. Para uso na presente invenção, “introduzir” destina-se a significar a apresentação de um polinucleotídeo ou polipeptídeo à planta de modo que a sequência obtenha acesso ao interior de uma célula da dita planta. Os métodos das modalidades não dependem de um método particular para introduzir um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptídeo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para introduzir polinucleotídeos ou polipeptídeos em plantas são conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, métodos de transformação estável, métodos de transformação temporária e métodos mediados por vírus.

[0136] Uma “transformação estável” significa que um construto de nucleotídeo introduzido em uma planta integra-se ao genoma da planta, tornando-se capaz de ser herdado pela progênie da mesma. O termo “transformação” significa que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra ao genoma da mesma, ou que um polipeptídeo é introduzido em uma planta.

[0137] Os protocolos para transformação, bem como os protocolos para introdução de sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar conforme o tipo de planta ou célula, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, que é alvo de transformação. Os métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células vegetais e inserção subsequente no genoma da planta incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334), electroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606), transformação mediada por Agrobacterium- (patentes US n°s 5.563.055 e 5.981.840), transferência direta de gene (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722), e aceleração balística de partículas (consulte, por exemplo, as patentes US n°s 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; e 5.932.782; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlim, Alemanha); e McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); e Lecl transformation (WO 00/28058). Para a transformação de batata consulte Tu et al. (1998) Plant Molecular Biology 37: 829-838 e Chong et al. (2000) Transgenic Research 9: 71-78. Procedimentos de transformação adicionais podem ser encontrados em Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (feijão soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (feijão soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (feijão soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (feijão soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); patentes US n°s 5.240.855, 5.322.83 e 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763-764; patente US n° 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York, EUA), p.197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformação mediada por whiskers); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 7450-750 (milho via Agrobacterium tumefaciens); todos os quais estão aqui incorporados, a título de referência.

[0138] Em modalidades específicas, as sequências das modalidades podem ser fornecidas a uma planta com o uso de uma variedade de métodos para transformação temporária. Esses métodos de transformação temporária incluem, mas não se limitam à introdução da toxina proteica Cry ou variantes e fragmentos da mesma diretamente dentro da planta ou a introdução do transcrito da toxina Cry dentro da planta. Estes métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombardeio de partículas. Consulte, por exemplo, Crossway et al.(1986) Mol Gen. Genet. 202: 179-185; Nomura et al. (1986) Plant Sci. 44: 53-58; Hepler et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 2176-2180 e Hush et al. (1994) The Journal of Cell Science 107: 775-784, todos os quais estão aqui incorporados, a título de referência. Alternativamente, o polinucleotídeo da toxina Cry pode ser transformado de modo temporário dentro da planta com o uso de técnicas conhecidas no campo da mesma. Estas técnicas incluem um sistema de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de forma a impossibilitar a liberação subsequente do DNA. Portanto, a transcrição a partir do DNA ligado a partícula pode ocorrer, mas a frequência com a qual o mesmo é liberado para integrar-se ao genoma é grandemente reduzida. Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma #P3143).

[0139] Métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em um local específico no genoma da planta são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a inserção do polinucleotídeo em um local genômico desejado é obtida usando um sistema de recombinação sítio-específico. Vide, por exemplo, os documentos WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, que estão aqui incorporados, a título de referência. Em resumo, o polinucleotídeo das modalidades pode estar contido em um cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos. O cassete de transferência introduzido em uma planta tem, incorporado de maneira estável a seu genoma, um sítio-alvo que é flanqueado por dois sítios de recombinação não-idênticos, os quais correspondem ao sítios do cassete de transferência. Uma recombinase adequada é fornecida e o cassete de transferência é integrado ao sítio alvo. O polinucleotídeo de interesse é, portanto, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma da planta.

[0140] As células que foram transformadas podem ser cultivadas para se tornar plantas de acordo com maneiras convencionais. Consulte, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem, então, ser cultivadas, sejam polinizadas com a mesma linhagem transformada ou com linhagens diferentes, e o híbrido resultante tem expressão constitutiva ou induzida da característica fenotípica desejada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida de maneira estável e herdada e, então, as sementes são coletadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada.

[0141] As sequências de nucleotídeos das modalidades podem ser fornecidas a uma planta colocando a planta em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Em geral, estes métodos envolvem a incorporação de um construto de nucleotídeo de interesse dentro de uma molécula de DNA ou RNA viral. É reconhecido que as proteínas recombinantes das modalidades podem ser sintetizadas inicialmente como parte de uma poliproteína viral, que pode ser posteriormente processada por proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína pesticida desejada. Também é reconhecido que essa poliproteína viral, que compreende pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos de uma proteína pesticida das modalidades, pode ter a atividade pesticida desejada. Essas poliproteínas virais e as sequências de nucleotídeos que as codificam são abrangidas pelas modalidades. Métodos para suprir plantas com construtos de nucleotídeos e produzir as proteínas codificadas nas plantas, que envolvem moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, as patentes US n°s 5.889.191; 5.889.190; 5.866.785; 5.589.367; e 5.316.931; aqui incorporadas a título de referência.

[0142] As modalidades referem-se adicionalmente a um material de propagação vegetal de uma planta transformada das modalidades incluindo, mas não se limitando a, sementes, tubérculos, cormos, bulbos, folhas e mudas de raízes e brotos.

[0143] As modalidades podem ser usadas para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não se limitando a monocotiledôneas e a dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não se limitam a, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea, particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente de alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), painço (por exemplo, painço pérola (Pennisetum glaucum), painço proso (Panicum miliaceum), painço rabo-de-raposa (Setaria italica), painço dedo (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsitum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), côco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), cítricos Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya), cajú (Anacardium occidentale), noz de macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais e coníferas.

[0144] Os vegetais comestíveis incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), vagem (Phaseolus vulgaris), feijão-de-lima (Phaseolus limensis), ervilha (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), melão cantaloupe (C. cantalupensis) e melãoalmiscarado (C. melo). As Plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hortênsia (Hydrangea macrophylla), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narciso (Narcissus spp.), petúnia (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo. Coníferas que podem ser empregadas na prática das modalidades incluem, por exemplo, pinheiros como pinheiro-taeda (Pinus taeda), pinheiro-americano (Pinus elliotii), pinheiro-ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro-torto (Pinus contorta), e pinheiro monterrey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); Western hemlock (Tsuga canadensis); Sitka spruce (Picea glauca); redwood (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros como abeto prata (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do alaska (Chamaecyparis nootkatensis). As plantas das modalidades incluem plantas de cultivo, incluindo, mas não se limitando a: milho, alfalfa, girassol, Brassica spp., feijão-soja, algodão, cártamo, amendoim sorgo, trigo, painço, tabaco, cana-de-açucar, etc.

[0145] Gramas de terreno incluem, mas não se limitam a: poa (Poa annua); azevem (Lolium multiflorum); poa-do-Canadá (Poa compressa); festuca Vermelha (Festuca rubra); agrostide-ténue (Agrostis tenuis); erva-fina (Agrostis palustris); trigo-grama encrespado (Agropyron desertorum); trigo-grama aberto (Agropyron cristatum); festuca dura (Festuca longifolia); capim do campo (Poa pratensis); panasco (Dactylis glomerata); azevem perene (Lolium perenne); festuca vermelha (Festuca rubra); grama gigante (Agrostis alba); poa comum (Poa trivialis); festuca ovelha (Festuca ovina); cevadinha (Bromus inermis); festuca (Festuca arundinacea); capim-timóteo (Phleum pratense); grama velvet (Agrostis canina); grama-chorão (Puccinellia distans); trigo-grama ocidental (Agropyron smithii); capimbermuda (Cynodon spp.); grama-de-santo-agostinho (Stenotaphrum secundatum); grama-esmeralda (Zoysia spp.); grama-forquilha (Paspalum notatum); grama-carpete (Axonopus affinis); grama centopéia (Eremochloa ophiuroides); grama kikuio (Pennisetum clandesinum); grama-rasteira-da-praia (Paspalum vaginatum); grama blue (Bouteloua gracilis); grama buffalo(Buchloe dactyloids); grama aveia(Bouteloua curtipendula).

[0146] Outras plantas de interesse incluem plantas de cereais que fornecem sementes de interesse, plantas de sementes oleaginosas e plantas leguminosas. As sementes de interesse incluem sementes de cereais, como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, painço, etc. Plantas de sementes oleaginosas incluem algodão, feijão-soja, cártamo, girassol, Brassica, milho, alfafa, palma, coco, linho, rícino, oliva, etc. Plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os grãos incluem goma guar, alfarrobeira, feno-grego, feijão-soja, feijões-de-jardim, feijão-fradinho, feijão asiático, feijão-de-lima, feijão-fava, lentilha, grão-de-bico, etc.

[0147] Em certas modalidades as sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser empilhadas com qualquer combinação de sequências de polinucleotídeos de interesse, de modo a criar plantas com um fenótipo desejado. Por exemplo, os polinucleotídeos das modalidades podem ser empilhados com quaisquer outros polinucleotídeos que codificam polipeptídeos tendo atividade pesticida e/ou inseticida, como outras proteínas Bt tóxicas (descritas nas patentes US n°s 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:109), pentin (descrito na patente US n° 5.981.722) e similares. As combinações geradas também podem incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse. Os polinucleotídeos das modalidades podem também ser empilhados com qualquer outro gene ou combinação de genes para produzir plantas com uma variedade desejada de combinações incluindo, mas não se limitando a traços desejáveis para alimentação animal como genes de alto teor de gordura (por exemplo, patente US n° 6.232.529); aminoácidos balanceados (por exemplo, hordothionins (patentes US n°s 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; e 5.703.049); cevada de alto teor de lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106; e WO 98/20122) e proteínas com alto teor de metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359; e Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); digestibilidade aumentada (por exemplo, proteínas de armazenamento modificadas (patente US 6.858.778); e tireodoxinas (patente US n° 7.009.087), as descrições da qual estão aqui incorporadas a título de referência.

[0148] Os polinucleotídeos das modalidades lata podem também ser empilhados com traços desejados para resistência a doença ou herbicida (por exemplo, genes de detoxificação de fumonisina (patente US n° 5.792.931); genes de avirulência e de resitência à doença (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262: 1432; e Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes acetolactato sintase (ALS) que levam a resistência à herbicida como as mutações S4 e/ou Hra; inibidores de glutamina sintase como fosfofinotricina ou basta (por exemplo, gene bar); e resistência a glifosato (gene EPSPS e gene GAT conforme revelado nas patentes US n°s 7.709.702; e 7.462.481 e 7.462.481; e traços desejados para processamento ou produtos de processo como óleo alto (por exemplo, patente US n° 6.232.529); óleos modificados (por exemplo, genes de ácido graxo desaturase (patente US n° 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (por exemplo, ADPG pirofosforilases (AGPase), amido sintases (SS), enzimas de ramificação de amido (SBE) e enzimas de desramificação de amido (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (por exemplo, patente US n° 5.602.321; beta-cetotiolase, polidroxibutirato sintase, e acetoacetil-CoA redutase (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170: 5837-5847) facilitam a expressão de polidroxialcanoatos (PHAs)), as descrições dos mesmos estão aqui incorporados, a título de referência. Pode-se também combinar os polinucleotídeos das modalidades com polinucleotídeos que fornecem traços agronômicos como a macho-esterilidade (por exemplo, consulte a patente n° 5.583.210), resistência de talo, tempo de floração, ou traços de tecnologia de transformação como regulação do ciclo celular ou alteração de genes ('gene targeting') Patent (por exemplo WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), as descrições dos mesmos estão aqui incorporadas a título de referência.

[0149] Essas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método incluindo, mas não se limitando a, plantas com cruzamento de raças por qualquer metodologia convencional ou TOPCROSS® ou transformação genética. Se os traços são empilhados por transformação genética das plantas, as sequências de polinucleotídeo de interesse podem ser combinadas em qualquer momento e em qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica que compreende um ou mais traços desejados pode ser usada como alvo para introduzir traços adicionais por transformação subsequente. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação ou cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências serão introduzidas, as duas sequêncas podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidos no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser dirigida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que suprimirá a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado por qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de expressão excessiva para gerar as combinação de traços desejada na planta. É reconhecido ainda que as sequências de polinucleotídeo podem ser empilhadas em um local genômico desejado com o uso de um sistema de recombinação sítio-específico. Vide, por exemplo, os documentos WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, que estão aqui incorporados, a título de referência.

[0150] As composições das modalidades encontram uso na proteção de plantas, sementes, e produtos de plantas de uma variedade da formas. Por exemplo, as composições podem ser usadas em um método que envolve colocar uma quantidade eficaz da composição pesticida no ambiente da praga, por meio de um procedimento selecionado a partir do grupo que consiste em aspersão, remoção de pó, difusão, ou revestimento de sementes.

[0151] Antes do material de propagação de planta (fruto, tubérculo, bulbo, calo, grãos, semente), mas especialmente a semente, ser vendida como um produto comercial, ela pode ser tratada com revestimentos protetores que compreendem fungicidas, inseticidas, herbicidas, bactericidas, nematicidas, moluscocidas, ou misturas de várias dessas preparações, se desejado, junto com veículos, tensoativos, aplicação de adjuvantes promotores habitualmente empregados na técnica de formulação para fornecer proteção contra danos causados por pragas de bactérias, fungos, ou outras pragas animais. Para tratar as sementes, o revestimento protetor pode ser aplicado às sementes por impregnação dos tubérculos ou grãos com uma formulação líquida ou por revestimento dos mesmos com uma formulação seca ou úmida combinada. Além disso, em casos especiais, são possíveis outros métodos de aplicação a plantas, por exemplo, tratamento direcionado aos botões de flor ou ao fruto.

[0152] A semente de planta das modalidades compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida das modalidades pode ser tratada com um revestimento protetor de semente que compreende um composto de tratamento de semente, como, por exemplo, captano, carboxina, tiram, metalaxil, pirimifós-metil, e outros que são comumente usados no tratamento de sementes. Em uma modalidade, um revestimento protetor de semente que compreende uma composição pesticida das modalidades é usado sozinho ou em combinação com um dos revestimentos protetores de semente habitualmente usados no tratamento de sementes.

[0153] É reconhecido que os genes que codificam as proteínas pesticidas podem ser usados para transformar organismos patogênicos de insetos. Esses organismos incluem baculovírus, fungos, protozoários, bactérias, e nematódeos.

[0154] Um gene que codifica uma proteína pesticida das modalidades pode ser introduzido via um vetor adequado em um hospedeiro microbiano, e o dito hospedeiro aplicado ao ambientes, ou a plantas ou animais. O termo “introduzido” no contexto de inserção de um ácido nucleico dentro de uma célula, significa “transfecção” ou “transformação” ou “transdução” e inclui referência à incorporação de um ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica na qual o ácido nucleico pode ser incorporado ao genoma da célula (por exemplo, DNA de cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou mitocôndria), convertido em um réplicon autônomo ou expresso temporariamente (por exemplo, mRNA transfectado).

[0155] Os hospedeiros microbianos que são conhecidos por ocupar a “fitosfera” (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplano) de um ou mais cultivos de interesse podem ser selecionados. Esses microorganismos são selecionados de modo a serem capazes de, no ambiente específico, competir com sucesso contra os microorganismos de ocorrência natural, proporcionar manutenção e expressão estável dos genes que expressam a proteína pesticida, e desejavelmente, proporcionam proteção otimizada do pesticida contra a degradação e inativação ambiental.

[0156] Esses microorganismos incluem bactérias, algas e fungos. São de particular interesse os microorganismos como bactérias, por exemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, e Alcaligenes, fungos, particularmente leveduras, por exemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, e Aureobasidium. São de interesse particular as espécies bacterianas da fitosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli e Azotobacter vinelandii e espécies de leveduras da fitosfera como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, e Aureobasidium pollulans. De interesse particular são os microrganismos pigmentados.

[0157] Várias maneiras estão disponíveis para introduzir um gene que expressa uma proteína pesticida no microrganismo hospedeiro sob condições que permitem a manutenção estável e expressão do gene. Por exemplo, podem ser construídos cassetes de expressão que incluem os constructos de nucleotídeo de interesse, funcionalmente ligados aos sinais regulatórios transcricional e traducional para expressão dos constructos de nucleotídeo, e uma sequência de nucleotídeo homóloga a uma sequência no organismo hospedeiro, de modo que ocorra integração, e/ou um sistema de replicação que é funcionais no hospedeiro, de modo que ocorra integração ou manutenção estável.

[0158] Os sinais regulatórios transcricionais e traducionais incluem, mas não se limitam a, promotores, sítios de iniciação transcricional, operadores, ativadores, intensificadores, outros elementos reguladores, sítios de ligação ribossômica, um códon de iniciação, sinais de terminação e similares. Consulte, por exemplo, as patentes US n°s 5.039.523 e 4.853.331; EPO 0480762A2; Sambrook; Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EUA); Davis et al., eds. (1980)Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, New York, EUA e as referências citadas no mesmo.

[0159] Células hospedeiras adequadas, em que as células contendo a proteína pesticida serão tratadas para prolongar a atividade das proteínas pesticidas na célula quando a célula tratada é aplicada ao ambiente da(s) praga(s) alvo, podem incluir tanto procariótos como eucariótos, sendo normalmente limitadas àquelas células que não produzem substâncias tóxicas para organismos superiores, como mamíferos. Entretanto, os organismos que produzem substâncias tóxicas a organismos superiores podem ser usados, quando a toxina é instável ou o nível de aplicação é suficientemente baixo para evitar qualquer possibilidade de toxicidade a um hospedeiro mamífero. Como hospedeiros, de interesse particular são os procariótos e eucariótos inferiores, como os fungos. Procariontes ilustrativos, tanto gram-negativo quanto gram-positivo, incluem Enterobacteriaceae, como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella, e Proteus; Bacillaceae; Rhizobiaceae, como Rhizobium; Spirillaceae, como photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, como Pseudomonas e Acetobacter; Azotobacteraceae e Nitrobacteraceae. Dentre eucariotas têm fungi, como Phycomycetes e Ascomycetes, que inclui levedura como Saccharomyces e Schizosaccharomyces; e levedura Basidiomycetes como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, e similares.

[0160] As características de interesse particular para a seleção de uma célula hospedeira, para propósitos de produção de proteína pesticida, incluem a facilidade de introdução do gene da proteína pesticida no hospedeiro, disponibilidade de sistemas de expressão, eficiência de expressão, estabilidade da proteína no hospedeiro, e a presença de capacidades genéticas auxiliares. As características de interesse para uso como microcápsula de pesticida incluem qualidades protetoras, como paredes celulares espessas, pigmentação e empacotamento intracelular ou formação de corpos de inclusão; afinidade com folhas; ausência de toxicidade a mamíferos; atratividade a pragas para ingestão; facilidade de extermínio e correção sem dano à toxina; e similares. Outras considerações incluir facilidade de formulação e manuseio, economia, estabilidade em armazenagem e similares.

[0161] Os organismos hospedeiros de interesse particular incluem leveduras como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp. (como S. cerevisiae), Sporobolomyces spp., organismos do filoplano como Pseudomonas spp. (como P. aeruginosa, P. fluorescens), Erwinia spp., e Flavobacterium spp., e outros desses organismos, incluindo Bt, E. coli, Bacillus subtilis, e similares.

[0162] Os genes que codificam as proteínas pesticidas das modalidades podem ser introduzidos em microrganismos que se multiplicam em plantas (epífitas) para liberar proteínas pesticidas para pragas-alvo potenciais. As epífitas, por exemplo, podem ser bactérias gram-positivas ou gram-negativas.

[0163] Bactérias colonizadoras de raiz, por exemplo, podem ser isoladas a partir da planta de interesse por métodos conhecidos na técnica. Especificamente, uma cepa de Bacillus cereus que coloniza raízes pode ser isolada a partir de raízes de uma planta (consulte, por exemplo, Handelsman et al. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 56:713-718). Os genes que codificam as proteínas pesticidas das modalidades podem ser introduzidos em um Bacillus cereus colonizador de raiz por métodos padrão conhecidos na técnica.

[0164] Os genes que codificam proteínas pesticidas podem ser introduzidos, por exemplo, dentro do Bacillus colonizador de raiz por meio de eletrotransformação. Especificamente, os genes que codificam as proteínas pesticidas podem ser clonados em um vetor ponte (shuttle), por exemplo, pHT3101 (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218. O vetor ponte pHT3101 que contém a sequência codificadora para a proteína pesticida particular pode, por exemplo, ser transformado dentro do Bacillus colonizador de raiz por meio de eletroporação (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218).

[0165] Sistemas de expressão podem ser planejados de modo que as proteínas pesticidas sejam secretadas para fora do citoplasma da bactéria gram-negativa, como E. coli, por exemplo. As vantagens de ter a secreção de proteínas pesticidas são: (1) evasão de efeitos citotóxicos em potencial da proteína pesticida expressada; e (2) aprimoramento na eficiência da purificação da proteína pesticida incluindo, mas não se limitando a, eficiência aumentada na recuperação e purificação da proteína por volume de caldo de célula e tempo e/ou custos diminuídos de recuperação e purificação por unidade de proteína.

[0166] As proteínas pesticidas podem ser produzidas para serem secretadas em E. coli, por exemplo, pela fusão de um peptídeo sinalizador adequado de E. coli com a extremidade amino-terminal da proteína pesticida. Os peptídeos sinalizados reconhecidos por E. coli podem ser encontrados em proteínas já conhecidas para serem secretadas em E. coli, por exemplo, a proteína OmpA (Ghrayeb et al. (1984) EMBO J, 3:2437-2442). A OmpA é uma proteína principal da membrana externa de E. coli e, portanto, seu peptídeo sinalizador é considerado eficiente no processo de translocação. Além disso, o peptídeo sinalizador OmpA não precisa ser modificado antes do processamento como pode ser o caso de outros peptídeos sinalizadores, por exemplo, o peptídeo sinalizador de lipoproteína (Duffaud et al. (1987) Meth. Enzymol. 153: 492).

[0167] As proteínas pesticidas das modalidades podem ser fermentadas em um hospedeiro bacteriano, e as bactérias resultantes são processadas e usadas como uma aspersão microbiana da mesma maneira que as cepas de Bt foram usadas como aspersões inseticidas. No caso de uma proteína pesticida que é secretada a partir de Bacillus, o sinal de secreção é removido ou mutado com o uso de procedimentos conhecidos na técnica. Essas mutações e/ou deleções evitam a secreção da(s) proteína(s) pesticida(s) no meio de crescimento durante o processo de fermentação. As proteínas pesticidas são mantidas dentro da célula, e as células são então processadas para produzir as proteínas pesticidas encapsuladas. Qualquer microorganismo adequado pode ser usado para esse propósito. Pseudomonas tem sido usada para expressar toxinas Bt como proteínas encapsuladas e as células resultantes processadas e pulverizadas como um inseticida (Gaertner et al. (1993), em: Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim).

[0168] Alternativamente, as proteínas pesticidas são produzidas pela introdução de um gene heterólogo dentro de um hospedeiro celular. A expressão de genes heterólogos resulta, direta ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Essas células são então tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente da(s) praga(s) alvo. O produto resultante mantém a toxicidade da toxina. Essas proteínas pesticidas naturalmente encapsuladas podem, então, ser formuladas, de acordo com as técnicas convencionais para aplicação ao ambiente, que abriga uma praga-alvo, por exemplo, o solo, a água e uma folhagem de plantas. Consulte, por exemplo EP0192319, e as referências citadas no mesmo.

[0169] Nas modalidades, um microrganismo transformado (que inclui organismos inteiros, células, esporo(s), proteína(s) pesticida(s), componente(s) pesticida(s), componente(s) com impacto em pragas, mutante(s), células e componentes celulares vivos ou mortos, incluindo misturas de células e componentes celulares vivos ou mortos, e incluindo células e componentes celulares rompidos) ou uma proteína pesticida isolada pode ser formulada com um veículo aceitável em uma composição(ões) pesticida(s) que é, por exemplo, uma suspensão, uma solução, uma emulsão, um talco, um grânulo ou pélete dispersível, um pó molhável, e um concentrado emulsificante, um aerossol ou aspersor, um grânulo impregnado, um adjuvante, uma pasta revestível, um colóide, e também encapsulamentos em, por exemplo, substâncias de polímeros. Essas composições formuladas podem ser preparadas por tais meios convencionais como dissecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação, ou concentração de uma cultura de células que compreende o polipeptídeo.

[0170] Essas composições apresentadas acima podem ser obtidas mediante a adição de um agente ativo de superfície, um veículo inerte, um conservante, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente de encapsulação, um aglutinante, um emulsificante, um corante, um protetor contra UV, um tampão, um agente de fluxo ou fertilizantes, doadores de micronutrientes, ou outras preparações que influenciem o crescimento vegetal. Um ou mais produtos agroquímicos incluindo, mas não se limitando a, herbicidas, inseticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, acaricidas, reguladores do crescimento vegetal, auxiliares de colheita e fertilizantes, podem ser combinados com veículos, tensoativos ou adjuvantes costumeiramente empregados na técnica de formulação, ou outros componentes para facilitar o manuseio e a aplicação do produto para pragas-alvo específicas. Os veículos e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos, e correspondem às substâncias ordinariamente empregadas na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, acentuadores de pegajosidade, aglutinantes ou fertilizantes. Os ingredientes ativos das modalidades são normalmente aplicados sob a forma de composições podem ser aplicadas à área de plantio, à planta ou a semente a ser tratada. Por exemplo, as composições das modalidades podem ser aplicadas ao grão em preparação para ou durante a armazenagem em um depósito de grãos ou silo, etc. A composições das modalidades podem ser aplicadas simultaneamente ou em sucessão com outros compostos. Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo das modalidades ou uma composição agroquímica das modalidades que contém pelo menos uma das proteínas pesticidas produzidas pelas cepas bacterianas das modalidades incluem, mas não se limitam a, aplicação foliar, revestimento de semente, e aplicação no solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.

[0171] Agentes ativos de superfície adequados incluem, mas não se limitam a, compostos aniônicos como um carboxilato de, por exemplo, um metal; um carboxilato de um ácido graxo de cadeia longa; um N-acilsarcossinato; mono ou diésteres de ácido fosfórico com etoxilatos de álcool graxo ou sais de tais ésteres; sulfatos de álcool graxo como dodecil sulfato de sódio, octadecil sulfato de sódio ou cetil sulfato de sódio; sulfatos de álcool graxo etoxilado; sulfatos de alquilfenol etoxilados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; sulfonatos de aril alquila como sulfonatos de alquil-benzeno ou sulfonatos de alquilnaftaleno inferiores, por exemplo, sulfonato de butilnaftaleno; sais de condensados de naftaleno-formaldeído sulfonatados; sais de condensados fenol-formaldeído sulfonatados; sulfonatos mais complexos como os sulfonatos de amida, por exemplo, o produto da condensação sulfonatada de ácido oléico e taurina N-metila; ou os sulfossuccinatos de dialquila, por exemplo, o sulfonato de sódio de succinato de dioctila. Os agentes não iônicos incluem produtos de condensação de ésteres de ácido graxo, álcoois graxos, amidas de ácido graxo, ou fenóis substituídos com alquila ou alquenila graxa com óxido de etileno; ésteres graxos de éteres de álcool polihídrico, por exemplo, ésteres de ácido graxo de sorbitano, produtos de condensação de tais ésteres com óxido de etileno, por exemplo, ésteres de ácido graxo de polióxi etileno sorbitano, copolímeros de bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, glicóis acetilênicos como 2,4,7,9-tetraetil-5-decin4,7-diol, ou glicóis acetilênicos etoxilados. Exemplos de um agente ativo de superfície catiônico incluem, por exemplo, um alifático mono, di ou poliamina como um acetato, naftenato ou oleato; ou amina contendo oxigênio como um óxido de amina de alquilamina de polióxi etileno; uma amina ligada a amido preparada pela condensação de um ácido carboxílico com uma di ou poliamina; ou um sal de amônio quaternário.

[0172] Os exemplos de materiais inertes incluem, mas não se limitam a, minerais inorgânicos como caulim, filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos ou materiais botânicos como cortiça, sabugos de milho pulverizados, cascas de amendoim, cascas de arroz e cascas de noz.

[0173] As composições das modalidades podem estar em uma forma adequada para aplicação direta, ou como um concentrado de composição primária que exige diluição com uma quantidade adequada de água ou outro diluente antes da aplicação. A concentração pesticida variará dependendo da natureza da formulação particular, especificamente, se é um concentrado ou para ser usada diretamente. As composições contêm 1 a 98% de um veículo inerte sólido ou líquido, e 0 a 50% ou 0,1 a 50% de um tensoativo. Essas composições serão administradas na taxa identificada para o produto comercial, por exemplo, cerca de 0,004 kg-2,2 kg (0,01 lb-5,0 lb) por acre quando na forma seca e cerca de 0,0035 cm-0,35 cm (0,01 pts.-10 pts.) por acre quando em forma líquida.

[0174] Em uma modalidade adicional, as composições, assim como os microrganismos transformados e proteínas pesticidas das modalidades, podem ser tratadas antes da formulação para prolongar a atividade pesticida quando aplicadas ao ambiente de uma praga-alvo desde que o pré-tratamento não tenha efeito prejudicial à atividade pesticida. Esse tratamento pode ser por meios químicos e/ou físicos desde que o tratamento não tenha efeito prejudicial que afete as propriedades da(s) composição(ões). Exemplos de reagentes químicos incluem, mas não se limitam a, agentes de halogenação; aldeídos como formaldeído e glutaraldeído; anti-infectivos como cloreto de zefiran; álcoois como isopropanol e etanol; e fixativos histológicos como fixador de Bouin e fixador de Helly (consulte, por exemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman and Co.).

[0175] Em outras modalidades, pode ser vantajoso tratar os polipeptídeos da toxina Cry com uma protease, por exemplo, tripsina, para ativar a proteína antes da aplicação de uma composição proteica pesticida das modalidades ao ambiente da praga-alvo. Os métodos para a ativação da pró-toxina por uma protease serina são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Cooksey (1968) Biochem. J. 6:445-454 e Carroll e Ellar (1989) Biochem. J. 261:99-105, as descrições dos mesmos estão aqui incorporadas, a título de referência. Por exemplo, um protocolo de ativação adequado inclui, mas não se limita a, a combinação de um polipeptídeo a ser ativado, por exemplo um polipeptídeo Cry inovador purificado por exemplo, tendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 2, 4 e 6), e tripsina em uma razão de peso de 1/100 de proteína/tripsina em 20 nM de NaHCO3, pH 8 e digestão da amostra a 36°C durante 3 horas.

[0176] As composições (incluindo os microorganismos transformados e proteínas pesticidas das modalidades) podem ser aplicadas ao ambiente de uma praga de insetos por meio de, por exemplo, aspersão, atomização, polvilhamento, espalhamento, revestimento ou derramamento, introdução no solo ou sobre o mesmo, introdução na água de irrigação, mediante tratamento das sementes ou aplicação ou polvilhamento geral no momento em que a praga começar a aparecer, ou antes do aparecimento das pragas, como medida protetora. Por exemplo, a proteína pesticida e/ou microrganismos transformados das modalidades podem ser misturados com grãos para proteger o mesmo durante a armazenagem. É geralmente importante obter um bom controle de pragas nos estágios iniciais do crescimento vegetal, já que esse é o momento em que a planta pode ser mais gravemente danificada. As composições das modalidades podem conter convenientemente um outro inseticida se isto for necessário. Em uma modalidade, a composição é aplicada diretamente ao solo, no momento do plantio, sob a forma granular de uma composição de um veículo e células mortas de uma cepa de Bacillus ou o micro-organismo transformado das modalidades. Uma outra modalidade consiste em uma forma granular de uma composição que compreende um produto agroquímico, como um herbicida, um inseticida, um fertilizante, um veículo inerte e células mortas de uma cepa de Bacillus ou o micro-organismo transformado das modalidades.

[0177] Os versados na técnica reconhecerão que nem todos os compostos são igualmente eficazes contra todas as pragas. Os compostos das modalidades exibem atividade contra pragas de insetos, podendo incluir importantes efeitos econômicos para a agronomia, florestas, estufas, viveiros, plantas ornamentais, alimentos e fibras, saúde pública e animal, estruturas comercial e doméstica, negócios domésticos, e produtos armazenados. As pragas de insetos incluem insetos selecionados das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera e Lepidoptera.

[0178] Os insetos da ordem Lepidoptera incluem, mas não se limitam a, lagarta-do-cartucho, lagarta-amarela, lagartas, e heliotines na família Noctuidae Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta-rosca); A. Orthogonia Morrison (lagarta-rosca ocidental); A. segetum Denis & Schiffermüller (traça do nabo); A. subterranea Fabricius (lagarta granular); Alabama argillacea Hübner (curuquerê); Anticarsia gemmatalis Hübner (lagarta-dasoja); Athetis mindara Barnes e McDunnough (lagarta de pele rugosa); Earias insulana Boisduval (lagarta rosada); E. Vittella Fabricius (lagarta pintada); Egira (Xylomyges) curialis Grote (minador-dos-citros); Euxoa messoria Harris (mariposa); Helicoverpa armigera Hübner (lagarta americana); H. Zea Boddie (lagarta-da-espiga do milho ou lagarta-da-maçã-do-algodoeiro); Heliothis virescens Fabricius (lagarta do tabaco); Hypena scabra Fabricius (lagarta desfolhadora); Mamestra configurata Walker (lagarta-do-cartucho bertha); M. Brassicae Linnaeus (lagarta do repolho); Melanchra picta Harris (lagarta zebra); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-do-cartucho); Pseudoplusia includens Walker (lagarta falsa-medideira); Richia albicosta Smith (lagarta-rosca ocidental); Spodoptera frugiperda JE Smith (lagarta-do-cartucho); S. exigua Hübner (lagarta-do-cartucho da beterraba); S. litura Fabricius (lagarta-rosca do tabaco, lagarta de cacho); Trichoplusia ni Hubner (larva do repolho); brocas, ecatotecas, larva de teias, lagarta cone e esqueletonizantes das famílias Pyralidae e Crambidae como Achroia grisella Fabricius (mariposa da cera); Amyelois transitella Walker (lagarta laranja); Anagasta kuehniella Zeller (mosca do mediterrâneo); Cadra cautella Walker (traça do cacau); Chilo partellus Swinhoe (broca ponteada); C. Suppressalis Walker (broca do arroz); C. terrenellus Pagenstecher (broca-da-cana-de-açucar); Corcyra cephalonica Stainton (traça do arroz); Crambus caliginosellus Clemens (lagarta da raiz do milho); C. teterrellus Zincken (lagarta das gramíneas); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (lagarta enroladeira); Desmia funeralisHübner (mosca de folha da uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (broca do melão); D. nitidalis Stoll (broca-das-cucurbitácias); Diatraea grandiosella Dyar (broca do milho do sudoeste), D. saccharalis Fabricius (broca-da-cana-deaçucar); Elasmopalpus lignosellus Zeller (lagarta elasmo); Eoreuma loftini Dyar (broca mexicana do arroz); Ephestia elutella Hübner (traça); Galleria mellonella Linnaeus (traça da cera); Hedylepta accepta Butler (enroladeira da cana de açucar); Herpetogramma licarsisalis Walker (traça); Homoeosoma electellum Hulst (traça do girassol); Loxostege sticticalis Linnaeus (traça da baterraba); Maruca testulalis Geyer (lagarta das vagens); Orthaga thyrisalis Walker (traça do chá); Ostrinia nubilalis Hübner (broca européia do milho); Plodia interpunctella Hübner (traça-dos-cereais); Scirpophaga incertulas Walker (broca do colmo); Udea rubigalis Guenée (traça tortricidae de aipo); e traças tortrix, lagartas, traças de sementes, e traças das frutas na família Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (larva cabeça negra do oeste); A. variana Fernald (larva da cabeça negra do leste); Adoxophyes orana Fischer von Rösslerstamm (traça tortrix da fruta); Archips spp. incluindo A. argyrospila Walker (lagarta das frutas) e A. rosana Linnaeus (broca européia de folha); Argyrotaenia spp.; Bonagota salubricola Meyrick (Brazilian apple leafroller); Choristoneura spp.; Cochylis hospes Walsingham (banded sunflower moth); Cydia latiferreana Walsingham (verme do chá); C. Pomonella Linnaeus (traça da maçã); Endopiza viteana Clemens (traça dos cachos); Eupoecilia ambiguella Hübner (vinha); Grapholita molesta Busck (mariposa oriental); Lobesia botrana Denis & Schiffermuller (traça da videira europeia); Platynota flavedana Clemens (enroladeira multicor); P. stultana Walsingham (lagarta enroladeira onívara); Spilonota ocellana Denis & Schiffermuller (traça acama); e Suleima helianthana Riley (traça do girassol).

[0179] Outras pragas agronômicas selecionadas na ordem Lepidoptera incluem, mas não se limitam a, Alsophila pometaria Harris (broca do pessegueiro); Anarsia lineatella Zeller (lagarta mineira); Anisota senatoria J.E. Smith (lagarta do carvalho com listras laranja); Antheraea pernyi GuérinMéneville (bicho-da-seda tasar chinês); Bombyx mori Linnaeus (bicho-da-seda); Bucculatrix thurberiella Busck (minador-dasfolhas); Colias eurytheme Boisduval (broca da alfafa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta da noz); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (bicho-da-seda siberiano), Ennomos subsignaria Hübner (lagarta do olmo); Erannis tiliaria Harris (larva da tília); Erechthias flavistriata Walsingham (larva da cana-de-açucar); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (platipo); Harrisina americana Guérin-Méneville (esqueletonizante da folha da uva); Heliothis subflexa Guenée; Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta de pasto); Hyphantria cunea Drury (larva de teia do outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (lombriga do tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (larva do pinheiro oriental); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (larva do pinheiro ocidental); Leucoma salicis Linnaeus (traça cetim); Lymantria dispar Linnaeus (traça cigana); Malacosoma spp.; Manduca quinquemaculata Haworth (mariposa falcão pintada, larva de chifre do tomate); M. sexta Haworth (larva de chifre do tomate, larva de chifre do fumo; Operophtera brumata Linnaeus (mariposa de inverno); Orgyia spp.; Paleacrita vernata Peck (lagarta da primavera); Papilio cresphontes Cramer (borboleta papilionídea gigante); Phryganidia californica Packard (larva California); Phyllocnistis citrella Stainton (minadora do citrus); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minadora tentiforme); Pieris brassicae Linnaeus (borboleta branca da couve grande); P. rapae Linnaeus (borboleta branca da couve pequena); P. napi Linnaeus (borboleta branca raiada); Platyptilia carduidactyla Riley (traça pluma da alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (traça das crucíferas); Pectinophora gossypiella Saunders (Lagarta-rosada); Pontia protodice Boisduval & Leconte (verme do repolho do sul); Sabulodes aegrotata Guenée (lagarta onívora); Schizura concinna J.E. Smith (red humped caterpillar); Sitotroga cerealella Olivier (traça dos cereais); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (lagarta processionária); Tineola bisselliella Hummel (traça-das-roupas); Tuta absoluta Meyrick (traça-dotomateiro) e Yponomeuta padella Linnaeus (traça arminho).

[0180] De interesse são as larvas e adultos da ordem Coleoptera incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae, e Curculionidae incluindo, mas não se limitando a: Anthonomus grandis Boheman (bicudo-do-algodoeiro); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do caule do girassol); Diaprepes abbreviatus Linnaeus (gorgulho de raiz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha do alho); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (bicheira-da-raiz-norteamericana); Metamasius hemipterus hemipterus Linnaeus (gorgulho da cana indiana); M. hemipterus sericeus Olivier (gorgulho sedoso da cana); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgulho granário); S. oryzae Linnaeus (gorgulo do arroz); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho da semente de girassol vermelho); S. sordidus LeConte (gorgulho de grão de girassol cinza); Sphenophorus maidis Chittenden (caruncho de milho); Rhabdoscelus obscurus Boisduval (gorgulho de cana-de-açucar da Nova Guiné); pulgões, besouro do pepino, crisomelídeos, besouros de folha, besuros da batata e minadoes de folhas da família Chrysomelidae incluindo, mas não se limitando a: Chaetocnema ectypa Horn (besouro-pulga do deserto milho); C. pulicaria Melsheimer (besouro-pulga do milho); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis de videira); Diabrotica barberi Smith & Lawrence (crisomelídeo do milho do Norte); D. undecimpunctata howardi Barber (lagarta da raiz do milho do sudeste); D. virgifera virgifera LeConte (lagarta da raiz do milho ocidental); Leptinotarsa decemlineata Say (besouro da batata do Colorado); Oulema melanopus Linnaeus (besouro-da-folha-do-cereal); Phyllotreta cruciferae Goeze (besouro-pulga do milho); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro de girassol); besouros da família Coccinellidae incluindo, mas não se limitando a: Epilachna varivestis Mulsant (besouro do feijão mexicano); joaninhas e outros besouros da família Scarabaeidae incluindo, mas não se limitando a: Antitrogus parvulus Britton (lagarta da cana); Cyclocephala borealis Arrow (besouro mascarado do norte); C. immaculata Olivier (besouro mascarado do sul); Dermolepida albohirtum Waterhouse (besouro-da-cana); Euetheola humilis rugiceps LeConte (besouro cascudo-preto); Lepidiota frenchi Blackburn (lagarta da cana francesa); Tomarus gibbosus De Geer (besouro da cenoura); T. subtropicus Blatchley (lagarta da cana-de-açúcar); Phyllophaga crinita Burmeister (larva branca); P. latifrons LeConte (besouro de junho); Popillia japonica Newman (besouro japonês); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (joaninha europeia); besouro de carpete da família Dermestidae; brocas da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp. incluindo M. communis Gyllenhal (broca); Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; besouros de cortiça da família Scolytidae; besouros da família Tenebrionidae; besouros da família Cerambycidae como, mas não se limitando, a Migdolus fryanus Westwood (besouro de chifre longo); e besouro da família Buprestidae incluindo, mas não se limitando a Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger (besouro buprestid minador de folha)

[0181] Adultos e imaturos da ordem Diptera são de interesse, incluindo minadores de folha Agromyza parvicornis Loew (minador de folha do milho); pequenas moscas incluindo, mas não se limitando a: Contarinia sorghicola Coquillett (mosca do sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessian); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente do girassol); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosca do trigo); moscas de fruta (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas de fruta); larvas de insetos incluindo, mas não se limitando a: Delia spp. incluindo Delia platura Meigen (larva da semente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (mosca doméstica); Meromyza americana Fitch (larva do caule de trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas dométicas); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas estáveis)); moscas de face, moscas de chifre, moscas varejeiras, Chrysomya spp.; Phormia spp.; e outras pestes de insetos moscoides, moscas de cavalo Tabanus spp.; gastrófilas Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; larvas de gado Hypoderma spp.; moscas de cervídeos Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (carrapatos); e outros Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; borrachudos Prosimulium spp.; Simulium spp.; mosquitos-pólvora mordentes, flebotomíneos, sciarídeos e outros Nematocera.

[0182] São incluídos como insetos de interesse aqueles da ordem Hemiptera como, mas não se limitando a, as seguintes famílias: Adelgidae, Aleyrodidae, Aphididae, Asterolecaniidae, Cercopidae, Cicadellidae, Cicadidae, Cixiidae, Coccidae, Coreidae, Dactylopiidae, Delphacidae, Diaspididae, Eriococcidae, Flatidae, Fulgoridae, Issidae, Lygaeidae, Margarodidae, Membracidae, Miridae, Ortheziidae, Pentatomidae, Phoenicococcidae, Phylloxeridae, Pseudococcidae, Psyllidae, Pyrrhocoridae e Tingidae.

[0183] Membros importantes do ponto de vista agronômico da ordem Hemiptera incluem, mas não se limitam a: Acrosternum hilare Say (percevejo); Acyrthisiphon pisum Harris (pulgão-daervilha); Adelges spp. (adelgídeos); Adelphocoris rapidus Say (percevejo de planta); Anasa tristis De Geer (percevejo de legumes); Aphis craccivora Koch (pulgão de feijão-fradinho); A. fabae Scopoli (pulgão de feijão-preto); A. gossypii Glover (pulgão de melão); A. maidiradicis Forbes (pulgão da raiz de milho); A. pomi De Geer (pulgão da maçã); A. spiraecola Patch (pulgão de arbusto); Aulacaspis tegalensis Zehntner (colchonila da cana-de-açucar); Aulacorthum solani Kaltenbach (pulgão dedal); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata-doce); fole de B. argentifolii & Perring (mosca branda da folha prateada); Blissus leucopterus leucopterus Say (percevejo comum); Blostomatidae spp.; Brevicoryne brassicae Linnaeus (afídeo do repolho); Cacopsylla pyricola Foerster (piolho de pereira); Calocoris norvegicus Gmelin (percevejo capsídeo da batata); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (pulgão do morango); Cimicidae spp.; Coreidae spp.; Corythuca gossypii Fabricius (percevejo do algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (percevejo do tomate); C. notatus Distant (mosca sugadora); Deois flavopicta Stål (cigarrinha); Dialeurodes citri Ashmead (mosca branca do citrus); Diaphnocoris chlorionis Say (percevejo de alfarroba); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (pulgão russo do trigo); Duplachionaspis divergens Green (colchonilha blindada); Dysaphis plantaginea Paaserini (pulgão da rosa da maçã); Dysdercus suturellus Herrich-Schäffer (manchador de algodão); Dysmicoccus boninsis Kuwana (piolho farinhento da cana-deaçúcar); Empoasca fabae Harris (gafanhoto da batata); Eriosoma lanigerum Hausmann (pulgão da maçã); Erythroneoura spp. (gafanhoto da uva); Eumetopina flavipes Muir (cigarrinha laranja da cana-de-açucar); Eurygaster spp.; Euschistus servus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo com uma pinta); Graptostethus spp. (complexo de percevejos de semente); e Hyalopterus pruni Geoffroy (piolho farinhento); Icerya purchasi Maskell (colchonilha do algodão); Labopidicola allii Knight (percevejo da cebola); Laodelphax striatellus Fallen (gafanhoto marrom pequeno); Leptoglossus corculus Say (percevejo da semente de pinho); Leptodictya tabida Herrich-Schaeffer (percevejo da cana-de-açúcar); Lipaphis erysimi Kaltenbach (pulgão do nabo); Lygocoris pabulinus Linnaeus (capsídeo verde comum); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (percevejo maculado); L. Hesperus Knight (percevejo marrom ocidental); L. pratensis Linnaeus (percevejo do prado); L. rugulipennis Poppius (pulgão manchado europeu); Macrosiphum euphorbiae Thomas (pulgão da batata); Macrosteles quadrilineatus Forbes (gafanhoto áster); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Mahanarva fimbriolata Stål (cigarrinha da cana-de-açúcar); Melanaphis sacchari Zehntner (pulgão da cana-de-açúcar); Melanaspis glomerata Green (colchonilha preta); Metopolophium dirhodum Walker (pulgão-degrão rosa); Myzus persicae Sulzer (pulgão da batata-pêssego, pulgão do pêssego verde); Nasonovia ribisnigri Mosley (pulgão da alface); Nephotettix cinticeps Uhler (gafanhoto verde); N. nigropictus Stål (gafanhoto do arroz); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sudeste); Nilaparvata lugens Stål (cigarrinha marrom); Nysius ericae Schilling (percevejo falso); Nysius raphanus Howard (percevejo falso); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (percevejo grande asclépia); Orthops campestris Linnaeus; Pemphigus spp. (pulgão de raiz e pulgões galha); Peregrinus maidis Ashmead (cirgarrinha do milho); Perkinsiella saccharicida Kirkaldy (delfacídeo da cana-de-açúcar); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de noz pecã); Planococcus citri Risso (colchonila do citrus); Plesiocoris rugicollis Fallen (capsídeo da maçã); Poecilocapsus lineatus Fabricius (percevejo de quatro linhas); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga de algodão); Pseudococcus spp. (outros percevejos complexos); Pulvinaria elongata Newstead (colchonilha de algodão); Pyrilla perpusilla Walker (cigarrinha da cana de açúcar); Pyrrhocoridae spp.; Quadraspidiotus perniciosus Comstock (cochonilha de São José); Reduviidae spp.; Rhopalosiphum maidis Fitch (afídeo da folha do milho); R. padi Linnaeus (pulgão da aveia); Saccharicoccus sacchari Cockerell (colchonilha rosada da cana-de-açúcar rosa); Schizaphis graminum Rondani (percevejo verde); Sipha flava Forbes (pulgão amarelo da cana-de-açúcar); Sitobion avenae Fabricius (pulgão inglês de grão); Sogatella furcifera Horvath (cigarrinha de dorso branco); Sogatodes oryzicola Muir (delfacídeo do arroz); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga de marca branca); Therioaphis maculata Buckton (pulgão pintado da alfafa); Tinidae spp.; Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afídeo de plantas cítricas negro); e T. citricida Kirkaldy (afídeo de plantas cítricas castanho); Trialeurodes abutiloneus (mosca branca) e T. vaporariorum Westwood (mosca branca de estufa); Trioza diospyri Ashmead (persimmon psylla); e Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha branca da maçã).

[0184] Também são incluídos adultos e larvas da ordem Acari (ácaros) como Aceria tosichella Keifer (ácaro enrolado do trigo); Panonychus ulmi Koch (ácaro europeu vermelho); Petrobia latens Müller (ácaro marrom do trigo); Steneotarsonemus bancrofti Michael (acarino do caule da cana-de-açúcar); acarinos e acarinos vermelhos da família Tetranychidae, Oligonychus grypus Baker & amp; Pritchard, O. indicus Hirst (acarino da folha de cana-de-açúcar), O. pratensis Banks (acarino de gramínea Banks), O. stickneyi McGregor (acarino da cana-de-açúcar); Tetranychus urticae Koch (ácaro aranha de duas pintas); T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro-aranha do carmim); T. turkestani Ugarov & Nikolski (acarino do morangueiro), ácaros planos da família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano de plantas cítricas); ácaros de ferrugem e de broto na família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes na saúde humana e animal, isto é, ácaros da poeira na família Epidermoptidae, ácaros de folículo na família Demodicidae, ácaros de grão na família Glycyphagidae, carrapatos da ordem Ixodidae. Ixodes scapularis Say (carrapato do cervo); I. holocyclus Neumann (carrapato australiano da paralisia); Dermacentor variabilis Say (carrapato americano do cão); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato estrela solitário); e ácaros que provocam feridas e coceira nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae, e Sarcoptidae.

[0185] Pragas de insetos da ordem Thysanura são de interesse, como a Lepisma saccharina Linnaeus (bichinho-de-prata; traça-doslivros); Thermobia domestica Packard (termóbia).

[0186] Pestes artrópodes adicionais englobadas incluem: aranhas da ordem Araneae como Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik (aranha recusa castanha); e Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva negra); e centopeias da ordem Scutigeromorpha como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia doméstica). Além disso, são de interesse outras pragas da ordem Isoptera, incluindo aquelas da família termitidae como, por exemplo, mas não se limitando a, Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren e Pseudacanthotermes militaris Hagen (cupim da canade-açúcar). Os insetos da ordem Thysanoptera também são de interesse, incluindo, mas não se limitando a, Stenchaetothrips minutus van Deventer (tripes da cana-de-açúcar).

[0187] As pragas de insetos podem ser testadas para verificação da capacidade pesticida das composições das modalidades nos estágios de desenvolvimento iniciais, por exemplo, como larva e outras formas imaturas. Os insetos podem ser criados em total escuridão em cerca de 20°C a cerca de 30°C e de cerca de 30% a cerca de 70% de umidade relativa. Bioensaios podem ser feitos em Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83(6): 2480-2485. Os métodos de criação de larvas de insetos e realização de bioensaios são bem conhecidos dos versados na técnica.

[0188] Uma ampla variedade de técnicas de bioensaio são conhecidas pelo versado na técnica. Os procedimentos gerais incluem a adição do composto ou organismo experimental à fonte de dieta em um recipiente fechado. A atividade pesticida pode ser medida por, mas não se limita a, alterações na mortalidade, perde de peso, atração, repelência e outras alterações comportamentais e físicas após a alimentação e exposição durante um período de tempo adequado. Os bioensaios descritos na presente invenção podem ser usados com qualquer praga de insetos no estágio larval ou adulto.

[0189] Os exemplos a seguir são apresentados a título de ilustração, sem que isso constitua uma limitação.

Experimental Exemplo 1: Bioensaio para Testar a Atividade Pesticida da Toxina de B. Thuringiensis Contra Insetos Selecionados

[0190] Bioensaios foram conduzidos para avaliar os efeitos do peptídeo de toxina inseticida de Bt apresentado na SEQ ID NO: 2, em uma variedade de insetos-praga de lepidópteros conforme apresentado na Tabela 1. Ensaios de alimentação foram conduzidos em uma dieta artificial contendo a proteína inseticida. A proteína inseticida foi aplicada topicamente com o uso de uma dieta artificial específica para lepidópteros. A toxina foi aplicada a uma taxa de 0,3 µg por 25 µL de amostra por cavidade e deixada para secar. A proteína está em 10 mM de tampão de carbonato em pH 10. Uma larva neonata foi colocada em cada cavidade para alimentar-se ad libitum durante 5 dias. Os resultados foram expressos como reações positivas para larvas como atraso no desenvolvimento e/ou mortalidade. Os resultados foram expressos como negativos se as larvas eram similares ao controle negativo que consiste na dieta alimentar para qual somente o tampão acima foi aplicado.

Exemplo 2: Bioensaio para Testar a Atividade Pesticida da Toxina de B. Thuringiensis Contra Insetos Selecionados

[0191] Bioensaios foram conduzidos para avaliar os efeitos do peptídeo de toxina inseticida de Bt apresentado na SEQ ID NO: 4, em uma variedade de insetos-praga de lepidópteros conforme apresentado na Tabela 2. Ensaios de alimentação foram conduzidos em uma dieta artificial contendo a proteína inseticida. A proteína inseticida foi aplicada topicamente com o uso de uma dieta artificial específica para lepidópteros. A toxina foi aplicada a uma taxa de 0,3 µg por 25 µL de amostra por cavidade e deixada para secar. A proteína está em 10 mM de tampão de carbonato em pH 10. Uma larva neonata foi colocada em cada cavidade para alimentar-se ad libitum durante 5 dias. Os resultados foram expressos como reações positivas para larvas como atraso no desenvolvimento e/ou mortalidade. Os resultados foram expressos como negativos se as larvas eram similares ao controle negativo que consiste na dieta alimentar para qual somente o tampão acima foi aplicado.

Exemplo 3: Bioensaio para Testar a Atividade Pesticida da Toxina de B. Thuringiensis Contra Insetos Selecionados

[0192] Bioensaios foram conduzidos para avaliar os efeitos do peptídeo de toxina inseticida de Bt apresentado na SEQ ID NO: 6, em uma variedade de insetos-praga de coleópteros e lepidópteros conforme apresentado na Tabela 3. Ensaios de alimentação foram conduzidos em uma dieta artificial contendo a proteína inseticida. A proteína inseticida foi aplicada topicamente com o uso de uma dieta artificial específica para coleópteros ou específica para lepidópteros. A toxina foi aplicada a uma taxa de 0,3 µg por 25 µL de amostra por cavidade e deixada para secar. A proteína está em 10 mM de tampão de carbonato em pH 10. Uma larva neonata foi colocada em cada cavidade para alimentar-se ad libitum durante 5 dias. Os resultados foram expressos como reações positivas para larvas como atraso no desenvolvimento e/ou mortalidade. Os resultados foram expressos como negativos se as larvas eram similares ao controle negativo que consiste na dieta alimentar para qual somente o tampão acima foi aplicado.

Exemplo 4: Transformação de Milho Mediada por Bombardeamento de Partículas e Regeneração de Plantas Transgênicas

[0193] Embriões maduros de milho a partir de plantas doadores oriundas de casa de vegetação são bombardeados com uma molécula de NA contendo a sequência de nucleotídeos da toxina (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5) ligadas de maneira funcional a um promotor de ubiquitina e o gene marcador selecionável PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70: 25-37), que confere resistência ao herbicida Bialaphos. Alternativamente, o gene marcador selecionável é fornecido em uma molécula de DNA separada. A transformação é feita como descrito a seguir. As fórmulas dos meios são fornecidas abaixo.

Preparação de Tecido Alvo

[0194] As espigas são descascadas e suas superfícies esterilizadas em 30% de alvejante CLOROX™ mais 0,5% de detergente Micro durante 20 minutos, sendo então enxaguadas duas vezes com água estéril. Os embriões imaturos são cortados e colocados com o eixo do embrião para baixo (lado do escutelo para cima), 25 embriões por placa, em meio 560Y durante 4 horas e, então, alinhados dentro da zona alvo de 2,5 cm em preparação para o bombardeio.
Preparação of DNA Um vetor plasmidial que compreende uma sequência de nucleotídeos de toxina (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5) ligado de maneira funcional a um promotor ubiquitina é feito. Por exemplo, um vetor de transformação adequado compreende um promotor UBI1 de Zea mays, um íntron 5' UTR de UBI1 e um íntron UBI1 em combinação com um terminador PinII. O vetor contém adicionalmente um gene marcador selecionável dirigido por um promotor CAMV35S e inclui um terminador CAMV35S. Opcionalmente, o marcador selecionável pode residir em um plasmídeo separado. Uma molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos da toxina assim como um marcador selecionável PAT é precipitada em 1,1 µm (diâmetro médio) de péletes de tungstênio com o uso de um procedimento de precipitação com CaCl2da seguinte forma:
100 µL de partículas de tungstênio preparadas em água
10 µL (1 µg) de DNA em tampão Tris EDTA (1 µg de DNA, no total)
100 µL 2,5 M CaC12
10 µL de espermidina a 0,1 M

[0195] Cada reagente é adicionado sequencialmente à suspensão de partículas de tungstênio mantida no vórtex para vários tubos. A mistura final é submetida a breve sonicação e deixada em incubação sob agitação constante durante 10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos são centrifugados brevemente, o líquido é removido, lavado com 500 ml de etanol 100%, e centrifugados durante 30 segundos. Novamente o líquido é removido, e 105 µl de etanol 100% é adicionado ao pélete de partícula de tungstênio. Para o bombardeio com pistola de partículas, as partículas de tungstênio/DNA são brevemente sonicadas e 10 µl colocados sobre o centro de cada macrocarreador e deixadas secar por cerca de 2 minutos antes do bombardeio.

Tratamento Biobalístico (pistola de partículas)

[0196] As placas de amostra são bombardeadas em nível 4 com uma pistola de bombardeio de partículas n° HE34-1 ou n° #HE34-2. Todas amostras recebem um único bombardeamento a 650 PSI, com um total de dez alíquotas tiradas de cada tubo de partículas/DNA preparadas.

Tratamento Subsequente

[0197] Após o bombardeamento, os embriões são mantidos em meio 560Y durante 2 dias, então transferidos para um meio de seleção 560R contendo 3 mg/litro de Bialaphos, e subcultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10 semanas de seleção, os clones de calos resistentes por seleção são transferidos para o meio 288J para iniciar a regeneração das plantas. Após maturação do embrião somático (2 a 4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para o meio para germinação e são transferidos para a sala de cultura iluminada. Aproximadamente 7 a 10 dias mais tarde, as plântulas em desenvolvimento são transferidas para o meio 272V sem hormônio em tubos durante 7 a 10 dias até as plântulas estarem bem estabelecidas. As plantas são, então, transferidas para elementos de inserção em vasos planos (equivalentes a 6,35 cm (2,5″) contendo solo de plantio, e cultivadas durante 1 semana em uma câmara de crescimento, subsequentemente cultivadas por 1 a 2 semanas adicionais na casa de vegetação e, então, transferidos para vasos Classic 600 (6,05 litros (1,6 galão)) e cultivados até a maturidade. As plantas são monitoradas e pontuadas para verificar a expressão da toxina por ensaios conhecidos na técnica ou conforme descrito acima.

Bombardeio e Meio de Cultura

[0198] O meio de bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/L de sais N6 basais (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de mistura de Vitamina de Eriksson (1000x SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 120,0 g/L de sacarose, 1,0 mg/L de 2,4-D, e 2,88 g/L de L-prolina (trazido para ao volume com dl H2O seguindo ajuste para pH 5,8 com KOH); 2,0 g/L de Gelrite™ (adicionado após trazer para volume com dl H2O); e 8,5 mg/l de nitrato de prata (adicionado depois de esterilizar o meio e resfriar à temperatura ambiente). O meio de seleção (560R) compreende 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA C1416), 1,0 mL/L de Mistura de Vitamina de Eriksson (1000x SIGMA1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 30,0 g/L de sacarose e 2,0 mg/L de 2,4-D (trazido para volume com dl H2O seguindo ajuste para pH 5,8 com KOH); 3 g/L de Gelrite™ (adicionado após trazer para volume com dl H2O); e 0,85 mg/l de nitrato de prata e 3,0 mg/l de bialafos (ambos adicionados depois de esterilização do meio e resfriamento à temperatura ambiente).

[0199] meio de regeneração das plantas (288J) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução estoque de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCl, 0,10 gL de piridoxina HCl e 0,40 g/L de glicina levada até o volume com H2O polida) (Murashige e Skoog, (1962) Physiol. Plant. 15: 473), 100 mg/L mio-inositol, 0,5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarose, e 1,0 mL/L de 0,1 mM de ácido abcísico (levado até volume dI com H2O após ajuste do pH para 5,6); 3 g/L de Gelrite™ (adicionado após trazer para volume com dl H20); e 1,0 mg/L de ácido indoleacético e 3,0 mg/L de Bialaphos (adicionado após esterilização do meio e resfriamento para 60°C).

[0200] Um meio livre de hormônio (272V) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução de estoque de vitaminas MS (0,100 g/L de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCl, 0,10 g/L de piridoxina HCl e 0,40 g/L de glicina trazidos para volume com dl H2O polido), 0,1 g/L de mio-inositol e 40,0 g/L de sacarose (trazidos para volume com dl H2O polido após ajuste de pH para 5,6); e 6 g/L de Bacto-ágar (adicionado após trazer para volume com dl H2O polida), esterilizado e resfriado 60° para C.

Exemplo 5: Transformação de Milho Mediada por Agrobacterium e Regeneração de Plantas Transgênicas

[0201] Para tranformação mediada por Agrobacterium de milho com uma sequência de nucleotídeos de toxina(por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5), pode ser usado o método de Zhao (patente US n° 5.981.840, e a publicação de patente PCT WO98/32326; onde seu conteúdo está aqui incorporado, por referência). Brevemente, embriões imaturos são isolados a partir de milho e os embriões colocados em contato com uma suspensão de Agrobacterium sob condições nas quais as bactérias são capazes de transferir a sequência de nucleotídeos da toxina (SEQ ID n°: 1, 3, ou 5) para pelo menos uma célula de um dos embriões imaturos (etapa 1: etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos são imersos em uma suspensão de Agrobacterium para iniciação da inoculação. Os embriões são cocultivados conjuntamente por um tempo com a Agrobacterium (etapa 2: a etapa de cocultivo). Os embriões imaturos podem ser cultivados em meio sólido após a etapa de infecção. Após este período de co-cultivo, uma etapa de “repouso” opcional é contemplada. Nesta etapa de repouso, os embriões são incubados na presença de pelo menos um antibiótico que sabidamente inibe o crescimento de Agrobacterium sem a adição de um agente seletivo para os transformantes de planta (etapa 3: etapa de repouso). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem um agente seletivo, para eliminação de Agrobacterium e para uma fase de repouso das células infectadas. A seguir, os embriões inoculados são cultivados em um meio contendo um agente seletivo e o calo transformado em crescimento é recuperado (etapa 4: a etapa de seleção). Os embriões imaturos são cultivados sobre meio sólido com um agente seletivo resultando no crescimento seletivo das células transformadas. O calo é então regenerado em plantas (etapa 5: a etapa de regeneração) e de preferência, os calos crescidos em meio seletivo podem ser cultivados em meio sólido para regenerar as plantas.

Exemplo 6: Transformação de Embriões de Feijão-soja

[0202] Embriões de feijão soja são bombardeados com um plasmídeo contendo a sequência de nucleotídeos da toxina da SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5 ligada de maneira funcional a um promotor pinII da seguinte forma. Para induzir os embriões somáticos, cotilédones de 3 a 5 mm de comprimento dissecados a partir de sementes imaturas com superfície esterilizada do cultivar de feijão-soja adequado são cultivados na luz ou no escuro a 26°C em um meio de ágar adequado durante seis a dez semanas. Os embriões somáticos que produzem embriões secundários são então cortados e colocados em um meio líquido adequado. Após seleção repetida de grupos de embriões somáticos que se multiplicaram como embriões em estágios globulares iniciais, as suspensões são mantidas conforme descrito abaixo.

[0203] As culturas em suspensão embriogênicas de feijão-soja podem ser mantidas em 35 mL de meio líquido em um agitador giratório, a 150 rpm, a 26°C com luzes fluorescentes em um cronograma dia/noite de 16:8 horas. As culturas foram subcultivadas a cada duas semanas pela inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de meio líquido.

[0204] As culturas em suspensão embriogênica de grão de soja podem, então, serem transformadas pelo método de bombardeio de partículas por pistola (Klein et al. (1987) Nature (London) 327: 70-73, patente US n° 4,945,050). Um instrumento BiolistiC PDS1000/HE da DuPont (retroajuste de hélio) pode ser usado para estas transformações.

[0205] Um gene marcador selecionável que pode ser usado para facilitar a transformação do feijão-soja é um transgene composto por um promotor 35S do Vírus do Mosáico da Couve-flor (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), o gene de higromicina fosfotransferase do plasmídeo pJR225 (from E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25: 179-188), e a região 3' do gene na nopalina sintase do T-DNA do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. A cassete de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos da toxina (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5) ligado deI maneira funcional ao promotor pinll pode ser isolado como um fragmento de restrição. Este fragmento pode ser então inserido em um único sítio de restrição do vetor transportando o gene marcador.

[0206] É adicionado (em ordem) a 50 µl de um suspensão de partícula de ouro a 1 µm com 60 mg/ml: 5 µl de DNA (1 µg/µl), 20 µl de espermidina (0,1 M) e 50 µl de CaCl2 (2,5 M). A preparação de partículas é então agitada durante três minutos, girada em uma microcentrífuga durante 10 segundos e o sobrenadante é removido. As partículas revestidas com DNA são, então, lavadas uma vez em 400 µl de etanol a 70% e são ressuspensas em 40 µl de etanol anidro. A suspensão de DNA/partícula pode ser sonicada três vezes durante um segundo cada. Cinco microlitros das partículas de ouro revestidas com DNA são, então, colocadas em cada disco macrocarreador.

[0207] Aproximadamente 300 a 400 mg de uma cultura em suspensão com duas semanas de idade são colocados em uma placa de petri de 60 x 15 mm vazia e o líquido residual é removido do tecido com uma pipeta. Para cada experimento de transformação, aproximadamente 5 a 10 placas de tecido são normalmente bombardeadas. A pressão de ruptura da membrana é ajustada para 7,58 mPa (1100 psi), e a câmara é evacuada até um um vácuo de 71,1 (28 polegadas) de mercúrio). O tecido é colocado aproximadamente 8,89 cm (3,5 polegadas) separado da tela de retenção e bombardeado três vezes. Após o bombardeio, o tecido pode ser dividido pela metade e colocado de volta no líquido e cultivado conforme descrito acima.

[0208] Cinco a sete dias após o bombardeio, o meio líquido pode ser trocado por meio fresco, e onze a doze dias após bombardeio com meio fresco contendo 50 mg/ml de higromicina. Este meio seletivo pode ser renovado semanalmente. Sete a oito semanas após o bombardeio, um tecido verde transformado pode ser observado crescendo a partir de grupos embrionários necróticos não-transformados. O tecido verde isolado é removido e inoculado em frascos individuais para gerar novas culturas embrionárias em suspensão transformadas e clonalmente propagadas. Cada nova linhagem pode ser tratada como um evento de transformação independente. Estas suspensões podem então ser subcultivadas e mantidas como grupos de embriões imaturos ou regeneradas em plantas inteiras por maturação e germinação de embriões somáticos individuais.

[0209] Todas as patentes, publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível dos versados na técnica à qual pertence a invenção. Todas as patentes, publicações e pedidos de patentes estão aqui incorporados, a título de referência, na mesma extensão, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

[0210] Embora a invenção anteriormente mencionada tenha sido descrita em detalhes consideráveis por meio de ilustração e exemplos para os propósitos de clareza de entendimento, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das modalidades.

Claims

Molécula de ácido nucleico isolada CARACTERIZADA por compreender uma sequência otimizada de códons da SEQ ID NO:1, ou um complemento de comprimento inteiro da mesma na direção 5’-3’, que foi projetada para expressão em uma planta, que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
Construto de DNA CARACTERIZADO pelo fato de compreender a molécula de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em:
- (a) uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou um complemento de comprimento inteiro da mesma na direção 5’-3’;
- (b) uma molécula de ácido nucleico conforme a SEQ ID NO: 1, que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e
- (c) uma sequência de nucleotídeos conforme a SEQ ID NO: 1 que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2,
e um promotor heterólogo operacionalmente ligado à molécula de ácido nucleico.
Método para obtenção de uma célula hospedeira transgênica CARACTERIZADO por comprender
- a) transformar uma célula hospedeira com o construto de DNA conforme definido na reivindicação 2; e
- b) cultivar a referida célula hospedeira transformada sob condições de crescimento de célula hospedeira.
Célula bacteriana CARACTERIZADA pelo fato de conter o construto de DNA conforme definido na reivindicação 2.
Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato da referida célula hospedeira ser uma célula vegetal.
Método para obtenção de uma planta transgênica CARACTERIZADO pelo fato de compreender
- a) transformar uma célula vegetal com o construto de DNA conforme definido na reivindicação 2;
- b) cultivar a referida célula vegetal transformada sob condições de crescimento de célula vegetal; e
- c) regenerar uma planta transgênica a partir da referida célula vegetal.
Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita planta é selecionada do grupo que consiste em milho, sorgo, trigo, repolho, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, feijão-soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, e semente oleaginosa de canola.
Polipeptídeo isolado com atividade pesticida CARACTERIZADO por ser selecionado do grupo que consiste em:
- (a) um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e
- (b) um polipeptídeo conforme a SEQ ID NO: 2 que é codificado pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1e
em que o polipetídeo isolado é operacionalmente ligado a um peptídeo sinalizador heterólogo.
Composição CARACTERIZADA por compreender o polipeptídeo conforme definido na reivindicação 8.
Composição, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição é selecionada do grupo consistindo em um pó, poeira, pélete, grânulo, aspersão, emulsão, coloide, e solução.
Composição, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de compreender 1% a 99%, em peso, do dito polipeptídeo.
Método para obtenção de uma planta transgênica CARACTERIZADO pelo fato de que compreende
a) transformar uma célula vegetal que tem incorporado de maneira estável em seu genoma um construto de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que tem atividade pesticida, em que a dita sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em:
- (i) uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1 ou um complemento de comprimento inteiro da mesma na direção 5’-3’; e
- (ii) uma molécula de ácido nucleico conforme a SEQ ID NO: 1 que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, sendo que o dito nucleotídeo é operacionalmente ligado ao promotor que direciona a expressão de uma sequência codificante em uma célula vegetal;
b) cultivar a referida célula vegetal transformada sob condições de crescimento de célula vegetal; e c) regenerar uma planta transgênica a partir da referida célula vegetal.
Método para proteger uma planta contra uma praga da broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), que compreende introduzir na dita planta ou célula da mesma pelo menos um vetor de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo pesticida, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em:
- (a) uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou um complemento de comprimento inteiro da mesma na direção 5’-3’;
- (b) uma molécula de ácido nucleico conforme SEQ ID NO: 1 que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e
- (c) uma sequência de nucleotídeos conforme SEQ ID NO: 1 que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 de (b).
Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita planta produz um polipeptídeo pesticida que tem atividade pesticida contra a broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis).