BR112021006574A2 - proteínas inibidoras de insetos - Google Patents

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David J. Bowen
Catherine A. Chay
Danqi Chen
Todd A. Ciche
Arlene R. Howe
Jennifer L. LUTKE
Barbara E. Wiggins
Yuanji Zhang
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Abstract

PROTEÍNAS INIBIDORAS DE INSETOS. A presente invenção refere-se a proteínas pesticidas apresentando atividade tóxica contra espécies de pragas de Lepidópteros, e incluem, mas não estão limitadas a, TIC7941, TIC7941PL_1, TIC7941 PL_2, e TIC7941PL_3. Constructos de DNA, os quais contêm uma sequência de ácido nucleico recombinante codificando uma ou mais das proteínas pesticidas reveladas são fornecidos. Plantas transgênicas, células de plantas, semente, e partes de plantas resistentes a infestação por Lepidópteros são fornecidas, as quais contêm sequências de ácido nucleico recombinante codificando as proteínas pesticidas da presente invenção. Métodos para detectar a presença das sequências de ácido nucleico recombinante ou das proteínas da presente invenção em uma amostra biológica, e métodos de controlar pragas de espécies de Lepidópteros usando qualquer uma das proteínas pesticidas TIC7941, TIC7941PL_1, TIC7941PL_2, e TIC7941PL_3 são fornecidos. Métodos e composições para melhorar a atividade inseticida de uma proteína pesticida contra uma espécie de praga de inseto também são descritos. São descritos ainda método e composições para reduzir a expressão de uma proteína pesticida nos tecidos reprodutivos de uma planta transgênica.

Description

UTI Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS INIBIDORAS DE INSETOS".
REFERÊNCIA A REQUERIMENTO RELACIONADO
[0001] Este requerimento reivindica o benefício do requerimento provisório de patente dos Estados Unidos No. 62/795.066, registrado em 22 de janeiro de 2019, o qual é incorporado aqui, a este requeri- mento de patente, por meio de referência em sua totalidade.
INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O arquivo denominado "MONS469WO ST25.txt" contendo uma forma legível por computador da Listagem de Sequências foi cri- ado em 21 de janeiro de 2020. Este arquivo tem 82,7 kilobytes (medi- dos no MS-Windows?º), registrado contemporaneamente por submis- são eletrônica (usando o sistema de arquivamento EFS-Web do Escri- tório de Patentes dos Estados Unidos), e incorporado por meio de re- ferência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A invenção se refere de modo geral ao campo das proteí- nas inibidoras de insetos. São reveladas uma nova classe de proteínas apresentando atividade inibidora de insetos contra pragas de plantas e sementes de colheitas relevantes para a agricultura. Em particular, a classe de proteínas revelada é ativa como inseticida contra pragas de plantas e sementes de colheitas relevantes para a agricultura, particu- larmente pragas de insetos de espécies de Lepidópteros. São propor- cionadas plantas, partes de plantas, e sementes contendo um cons- tructo de polinucleotídeo recombinante codificando uma ou mas das proteínas de toxina reveladas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] A melhora de produção das colheitas de plantas agricola- mente significativas incluindo, entre outras, milho, soja, cana-de- açúcar, arroz, trigo, legumes e verduras, e algodão, tem se tornado cada vez mais importante. Além da necessidade crescente de produ- tos agrícolas para alimentar, vestir e proporcionar energia para uma população humana crescente, efeitos relacionados com o clima e pressão da população crescente para usar terra diferente da terra para práticas agrícolas estão previstos para reduzir a quantidade de terra arável disponível para plantio. Estes fatores levaram a previsões som- brias a respeito da segurança alimentar, particularmente na ausência de maiores aprimoramentos em biotecnologia de plantas e práticas agronômicas. À luz destas pressões, aprimoramentos ambientalmente sustentáveis na tecnologia, em técnicas agrícolas, e manejo de pragas são ferramentas vitais para expandir a produção das colheitas sobre a quantidade limitada de terra arável disponível para plantio.
[0005] Os insetos, particularmente os insetos dentro da ordem de Lepidópteros e Coleópteros, são considerados uma causa importante de dano para as colheitas de campo, deste modo diminuindo as pro- duções das colheitas sobre as áreas infestadas. Espécies de pragas de Lepidópteros as quais impactam negativamente a agricultura inclu- em, mas não estão limitadas a, lagarta militar africana (Spodoptera exempta), lagarta rosca (Agrotis ipsilon), lagarta da espiga de milho (Helicoverpa zea), curuquerê do algodão (Alabama argillacea), traça das crucíferas (Plutella xylostella), lagarta europeia do milho (Ostrinia nubilalis), falsa medideira (Spodoptera frugiperda), falsa medideira re- sistente a Cry1Fa1 (Spodoptera frugiperda), lagarta do velho mundo (OWB, Helicoverpa armigera), lagarta das folhas (Spodoptera erida- nia), falsa medideira da soja (Chrysodeixis includens), lagarta pintada (Earias vittella), broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella), lagarta do botão do tabaco (Heliothis virescens), lagarta desfolhadora do tabaco (Spodoptera litura, também conhecida como cluster caterpil- lar (aglomerado de lagartas)), lagarta do feijão ocidental (Striacosta albicosta), e lagarta do feijão-veludo (Anticarsia gemmatalis).
[0006] Historicamente, a aplicação intensiva de inseticidas quími- cos sintéticos se baseava no agente de controle de praga em agricul- tura. As preocupações com relação ao meio ambiente e à saúde hu- mana, além de problemas de resistência emergente, estimularam a pesquisa e o desenvolvimento de pesticidas biológicos. Este esforço de pesquisa levou à descoberta e ao uso progressivos de várias espé- cies microbianas entomopatogênicas, incluindo bactérias.
[0007] O paradigma do controle biológico mudou quando foi des- coberto o potencial das bactérias entomopatogênicas, especialmente bactérias pertencentes ao gênero Bacillus, e desenvolvido como um agente biológico de controle de pragas. Cepas da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) têm sido usadas como uma fonte para proteínas pes- ticidas, desde que se descobriu que as cepas de Bt apresentam uma alta toxicidade contra insetos específicos. É de conhecimento geral que as cepas de Bt produzem delta-endotoxinas que estão localizadas dentro de corpos de corpos de inclusão cristalina parasporal no início da esporulação e durante a fase estacionária de crescimento (por exemplo, proteínas Cry), e também se sabe que produzem proteína inseticida secretada. Depois de ingestão por um inseto suscetível, as delta-endotoxinas bem como as toxinas secretadas exercem serus efeitos na superfície do epitélio do intestino médio, rompendo a mem- brana celular, levando à ruptura e morte celulares. Genes codificando proteínas inseticidas também têm sido identificados em espécies bac- terianas diferente de Bt, incluindo outros Bacillus e uma diversidade de espécies bacterianas adicionais, tais como Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus sphaericus ("Ls" anteriormente conhecido como Bacillus Sphaericus), Paenibacillus popilliae e Paenibacillus lentimorbus.
[0008] Toxinas inseticidas cristalinas e solúveis secretadas são altamente específicas apra seus hospedeiros e ganharam aceitação mundial como alternativas para inseticidas químicos. Por exemplo,
proteínas de toxina inseticidas têm sido empregadas em várias aplica- ções agrícolas para proteger plantas agricolamente importantes contra infestações por insetos, diminuir a necessidade de aplicações pestici- das químicas, e aumentar as produções. Proteínas de toxina insetici- das são usadas para controlar pragas de plantas de colheitas agrico- lamente relevantes por métodos mecânicos, tais como pulverização para dispersar formulações microbianas contendo várias cepas de bactérias sobre as superfícies das plantas, e usando técnicas de trans- formação genética para produzir plantas transgênicas e sementes ex- pressando proteína de toxina inseticida.
[0009] O uso de plantas transgênicas expressando proteínas de toxinas inseticidas tem sido adaptado globalmente. Por exemplo, em 2016, 23,1 milhões de hectares foram plantados com colheitas trans- gênicas expressando toxinas de Bt e 75,4 milhões de hectares foram plantados com colheitas transgênicas expressando toxinas de Bt empi- lhadas com traços de tolerância a herbicida (ISAAA. 2016. Global Sta- tus of Commercialized Biotech/GM Crops: 2016. ISAAA Brief No. 52. ISAAA: Ithaca, NY). O uso global de colheitas transgênicas protegidas contra insetos e o número limitado de proteínas de toxina inseticidas usadas nestas colheitas tem criado uma pressão de seleção para ale- los de inseto existentes que conferem resistência às proteínas insetici- das utilizadas atualmente.
[0010] O desenvolvimento de resistência em pragas a proteínas de toxina inseticidas cria uma necessidade contínua de descobrir e de- senvolver novas formas de proteínas de toxina inseticidas que sejam úteis para manejar o aumento na resistência dos insetos a colheitas transgênicas expressando proteínas de toxina inseticidas. Novas toxi- nas de proteínas com aprimorada eficácia e as quais apresentam con- trole sobre um espectro mais amplo de espécies de insetos suscetíveis vão reduzir o número de insetos sobreviventes os quais podem desen-
volver alelos de resistência. Além disso, a utilização em uma planta de duas ou mais proteínas de toxina inseticidas transgênicas tóxicas para a mesma praga de inseto e apresentando diferentes modos de ação reduz a probabilidade de resistência em qualquer espécie de inseto alvo único.
[0011] Portanto, os inventores revelam aqui, neste requerimento de patente, uma nova família de toxinas de proteínas de Paenibacillus lentimorbus, junto com proteínas de toxina similares, proteínas varian- tes, e proteínas recombinantes exemplares que apresentam atividade inseticida contra espécies de Lepidópteros alvo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] É revelado aqui, neste requerimento de patente, um novo grupo de proteínas pesticidas com atividade inibidora de insetos (pro- teínas de toxina), referido aqui, neste requerimento de patente, como TIC7941 pertencente à classe de proteínas de toxina TIC7941, as quais é demonstrado que apresentam atividade inibidora contra uma ou mais pragas de plantas de colheita. A proteína TIC7941 e proteínas na classe de proteínas de toxina TIC7941 podem ser usadas isoladas ou em combinação com outras proteínas inseticidas e agentes tóxicos em formulações e in planta, deste modo proporcionando alternativas para as proteínas inseticidas e para os produtos químicos inseticidas atualmente em uso em sistemas agrícolas.
[0013] Em uma modalidade, é revelada neste requerimento uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um frag- mento de promotor heterólogo ligado operacionalmente a um segmen- to polinucleotídico codificando uma proteína pesticida ou fragmento da mesma, em que (a) a proteína pesticida referida compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, de SEQ ID NO: 2, de SEQ ID NO: 6; de SEQ ID NO: 8, de SEQ ID NO: 10, de SEQ ID NO: 12, ou de SEQ ID NO: 14; ou (b) a proteína pesticida referida compreende uma sequência de aminoácidos tendo no mínimo 80% ou, 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 4, com a SEQ ID NO: 2, com a SEQ ID NO: 6; com a SEQ ID NO: 8, com a SEQ ID NO: 10, com a SEQ ID NO: 12, ou com a SEQ ID NO: 14; ou (c) o referido segmento polinucleotídico hibridiza a um polinucleotídeo tendo a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, de SEQ ID NO: 1, de SEQ ID NO: 5; de SEQ ID NO: 7, de SEQ ID NO: 9, de SEQ ID NO: 11, ou de SEQ ID NO: 13; ou (d) o referido segmento polinucleotídico codifi- cando uma proteína pesticida ou fragmento da mesma compreende uma sequência polinucleotídica tendo no mínimo 65%, ou 70%, ou 75%, ou 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, de SEQ ID NO: 1, de SEQ ID NO: 5; de SEQ ID NO: 7, de SEQ ID NO: 9, de SEQ ID NO: 11, ou de SEQ ID NO: 13; ou (e) a referida molécula de ácido nucleico recombinante está em ligação operável com um vetor, e o referido vetor é selecionado entre o grupo que consiste em um plasmídeo, um fagemídeo, um bacmídeo, um cosmídeo, e um cromossoma artificial bacteriano ou de levedura. À molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender uma se- quência que funciona para expressar a proteína pesticida em uma planta; ou é expressa em uma célula de planta para produzir uma quantidade efetiva como pesticida de proteína pesticida.
[0014] Em outra modalidade deste requerimento são células hos- pedeiras compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombi- nante do requerimento, em que a célula hospedeira é selecionada en- tre o grupo que consiste em uma célula bacteriana e uma célula de planta. As células hospedeiras bacterianas contempladas incluem Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseu- domonas, Klebsiella, Pantoec, e Erwinia. Em algumas modalidades, a
7ITI espécie de Bacillus referida é Bacillus cereus ou Bacillus thuringiensis, o Brevibacillus referido é Brevibacillus laterosperous, ou Escherichia é Escherichia coli. As células hospedeiras de planta contempladas inclu- em uma célula de planta dicotiledônea e uma célula de planta monoco- tiledônea. As células de plantas contempladas incluem adicionalmente uma célula de planta de alfalfa, banana, cevada, feijão, brócolis, repo- lho, brassica, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, cítrico, coco, café, milho, trevo, algodão (Gos- Sypium sp.), uma cucúrbita, pepino, abeto (Douglas fir), beringela, eu- calipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, pinheiro Loblolly, mi- lhetos, melões, nozes, aveia, oliveira, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, ervilha d'angola, pinho, batata, álamo, abóbora-menina, pinho radiata, rabanete, colza, arroz, rootstocks, centeio, açafrão, shrub, sorgo, pinheiro do Sul, soja, espi- nafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, giras- sol, milho doce, goma doce, batata doce, switchgrass, chá, tabaco, tomate, triticale, grama, melancia, e trigo.
[0015] Em outra modalidade, a proteína pesticida apresenta ativi- dade contra insetos Lepidópteros, incluindo lagarta do feijão-veludo, broca da cana-de-açúcar, broca do caule de milho menor, lagarta da espiga de milho, lagarta do botão do tabaco, falsa medideira da soja, lagarta militar africana, lagarta das folhas, falsa medideira da soja, .agarta do cartucho da beterraba, lagarta do velho mundo, curuquerê oriental, lagarta rosada do algodão, lagarta rosca, broca do milho do sudoeste, curuquerê do algodão, traça do repolho, lagarta pintada, la- garta desfolhadora do tabaco, lagarta do feijão ocidental, e lagarta eu- ropeia do milho.
[0016] Também são contempladas neste requerimento plantas compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante com- preendendo um fragmento de promotor heterólogo ligado operacio-
nalmente a um segmento polinucleotídico codificando uma proteína pesticida ou fragmento da mesma, em que: (a) a proteína pesticida referida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, de SEQ ID NO: 2, de SEQ ID NO: 12, ou de SEQ ID NO: 14; ou (b) a proteína pesticida referida compreende uma sequência de aminoáci- dos tendo no mínimo 80% ou, 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 4, com a SEQ ID NO: 2, com a SEQ ID NO: 12, ou com a SEQ ID NO: 14; ou (c) o referido segmento polinucleotídico hi- bridiza sob condições de hibridização estringentes ao cumprimento (compliment) da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, de SEQ ID NO: 11, ou de SEQ ID NO: 13; ou (d) a planta referida apresenta uma quantidade detectável da proteína pesticida referida. Em algumas modalidades, a proteína pesticida compreende a SEQ ID NO: 4, à SEQ ID NO: 2, a SEQ ID NO: 12, ou a SEQ ID NO: 14. Em uma moda- lidade, a planta é ou uma planta dicotiledônea ou uma planta monoco- tiledônea. Em outra modalidade, a planta é adicionalmente seleciona- da entre o grupo que consiste em uma alfalfa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, cítrico, coco, café, milho, trevo, al- godão, uma cucúrbita, pepino, abeto (Douglas fir), beringela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, pinheiro Loblolly, milhetos, melões, nozes, aveia, oliveira, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, ervilha d'angola, pinho, batata, álamo, abóbora-menina, pinho radiata, rabanete, colza, arroz, roo- tstocks, centeio, açafrão, shrub, sorgo, pinheiro do Sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, switchgrass, chá, tabaco, tomate, triti- cale, grama, melancia, e trigo.
[0017] Em modalidades adicionais, são reveladas sementes com-
preendendo as moléculas de ácido nucleico recombinante.
[0018] Em outra modalidade, é contemplada uma composição ini- bidora de inseto compreendendo as moléculas de ácido nucleico re- combinante reveladas neste requerimento. A composição inibidora de inseto pode compreender adicionalmente uma sequência de nucleotí- deos codificando no mínimo um outro agente pesticida que seja dife- rente da proteína pesticida referida. Em algumas modalidades, o no mínimo um outro agente pesticida é selecionado entre o grupo que consiste em uma proteína inibidora de insetos, uma molécula de dsR- NA inibidora de insetos, e uma proteína auxiliar. Também é contem- plado que o no mínimo um outro agente pesticida na composição inibi- dora de inseto apresenta atividade contra uma ou mais espécies de pragas das ordens Lepidoptera, Coleoptera, ou Hemiptera. O no míni- mo um outro agente pesticida na composição inibidora de inseto em uma modalidade é selecionado entre o grupo que consiste em uma Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, variantes de Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, quimeras Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry11, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ãe, Cry3, variantes de Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1I201, TIC1415, TIC3131, TIC2160, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-O001, AXMI-O002, AXMI-O30, AXMI-O035, AXMI- 036, AXMI-045, Axmi52, Axmi58, Axmi88, Axmi97, Axmi102, Axmi112, Axmi117, Axmi100, AXMI-115, AXMI-113, e AXMI-O005, AXMI134, AX- MI-150, Axmi171, AXMI-184, axmi196, axmi204, axmi207, axmi209, Axmi205, AXMI218, AXMI220, AXMI221z, AXMI222z, AXMI223z, AX- MI224z e AXMI225z, AXMI238, AXMI270, AXMI279, AXMI3S35, AX- MI3S45, AXMI-R1, e variantes das mesmas, |IP3 e variantes da mesma, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-11, proteína DIG-657, variantes de PHI-4,
variantes de PIP-72, variantes de PIP-45, variantes de PIP-64, varian- tes de PIP-74, variantes de PIP-77, DIG-305, variantes de PIP-47, DIG-17, DIG-90, DIG-79, e DIG-303.
[0019] Também são contemplados produtos de commodity com- preendendo uma quantidade detectável das as moléculas de ácido nu- cleico recombinante revelados neste requerimento. Os produtos de commodity referidos incluem milho commodity ensacado por um mani- pulador de grãos, flocos de milho, bolos de milho, farinha de milho, fu- bá, xarope de milho, óleo de milho, silagem de milho, amido de milho, cereal de milho, e semelhantes, e soja correspondente, arroz, trigo, sorgo, ervilha d'angola, amendoim, fruto, melão, e produtos de com- modity de verduras e legumes incluindo, onde aplicável, sucos, con- centrados, compotas, geleias, marmeladas, e outras formas comestí- veis de semelhantes produtos de commodity contendo uma quantida- de detectável dos referidos polinucleotídeos e ou polipeptídeos deste requerimento, semente de algodão inteira ou processada, óleo de al- godão, fibra de algodão, sementes e partes de plantas processadas para ração ou alimento, fibra, papel, biomassas, e produtos de com- bustíveis tais como combustível derivado de óleo de algodão ou péle- tes derivados de resíduos de descaroçador de algodão, semente de soja inteira ou processada, óleo de soja, proteína de soja, refeição de grãos de soja, farinha de soja, flocos de soja, farelo de soja, leite de soja, queijo de soja, vinho de soja, ração animal compreendendo soja, papel compreendendo soja, creme compreendendo soja, biomassa de soja, e produtos de combustíveis produzidos usando plantas de soja e partes de plantas de soja.
[0020] Também é contemplado neste requerimento um método de produção de semente compreendendo as moléculas de ácido nucleico recombinante reveladas neste requerimento. O método compreende plantar no mínimo uma das sementes compreendendo as moléculas de ácido nucleico recombinante reveladas neste requerimento; cultivar a planta a partir da semente; e colher semente das plantas, em que a semente colhida compreende as moléculas de ácido nucleico recom- binante neste requerimento.
[0021] Em outra modalidade ilustrativa, é proporcionada uma plan- ta resistente a infestação por insetos, em que as células da planta re- ferida compreendem: (a) uma molécula de ácido nucleico recombinan- te codificando uma quantidade efetiva como inseticida de uma proteína pesticida conforme estipulado na SEQ ID NO: 4, na SEQ ID NO: 2, na SEQ ID NO: 12, ou na SEQ ID NO: 14; ou (b) uma quantidade efetiva como inseticida de uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo no mínimo 80% ou, 85%, ou 90%, ou 95%, ou cer- ca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 4, com a SEQ ID NO: 2, com a SEQ ID NO: 12, ou com a SEQ ID NO: 14.
[0022] Também são revelados neste requerimento métodos para controlar uma praga de espécie de Lepidópteros, e controlar infesta- ção por uma praga de espécie de Lepidópteros de uma planta, particu- larmente uma planta de colheita. O método compreende, em uma mo- dalidade, (a) contactar a praga com uma quantidade efetiva como in- seticida de uma proteína pesticida conforme estipulado na SEQ ID NO: 4, na SEQ ID NO: 2, na SEQ ID NO: 12, ou na SEQ ID NO: 14; ou (b) contactar a praga com uma quantidade efetiva como inseticida de uma ou mais proteínas pesticidas compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo no mínimo 80%, 85%, ou 90%, ou 95%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 4, com a SEQ ID NO: 2, com a SEQ ID NO: 12, ou com a SEQ ID NO:
14.
[0023] Além disso é proporcionado aqui, neste requerimento de patente, um método de detectar a presença de uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um segmento polinucleotídico codificando uma proteína pesticida ou fragmento da mesma, em que: (a) a proteína pesticida referida compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4, de SEQ ID NO: 2, de SEQ ID NO: 6; de SEQ ID NO: 8, de SEQ ID NO: 10, de SEQ ID NO: 12, ou de SEQ ID NO: 14; ou (b) a proteína pesticida referida compreende uma sequência de aminoácidos tendo no mínimo 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de ami- noácidos com a SEQ ID NO: 4, com a SEQ ID NO: 2, com a SEQ ID NO: 6; com a SEQ ID NO: 8, com a SEQ ID NO: 10, com a SEQ ID NO: 12, ou com a SEQ ID NO: 14; ou (c) o referido segmento polinu- cleotídico hibridiza a um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleo- tídeos de SEQ ID NO: 3, de SEQ ID NO: 1, de SEQ ID NO: 5; de SEQ ID NO: 7, de SEQ ID NO: 9, de SEQ ID NO: 11, ou de SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade da invenção, o método compreende contactar uma amostra de ácidos nucleicos com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza sob condições de hibridização estringentes com DNA ge- nômico de uma planta compreendendo um segmento polinucleotídico codificando uma proteína pesticida ou fragmento da mesma proporcio- nado aqui, neste requerimento de patente, e não hibridiza sob seme- lhantes condições de hibridização com DNA genômico de uma planta isogênica de outro modo que não compreenda o segmento, em que a sonda é homóloga ou complementar à SEQ ID NO: 3, à SEQ ID NO: 11, ou à SEQ ID NO: 13, ou uma sequência que codifica uma proteína pesticida compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo no mínimo 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 4, com a SEQ ID NO: 2, com a SEQ ID NO: 12, ou com a SEQ ID NO:
14. O método pode compreender adicionalmente (a) submeter a amos- tra e a sonda a condições de hibridização estringentes; e (b) detectar hibridização da sonda com o DNA da amostra.
[0024] Também são proporcionados pela invenção métodos de detectar a presença de uma proteína pesticida ou fragmento da mes- ma em uma amostra compreendendo proteína, em que a proteína pes- ticida referida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, de SEQ ID NO: 2, de SEQ ID NO: 6; de SEQ ID NO: 8, de SEQ ID NO: 10, de SEQ ID NO: 12, ou de SEQ ID NO: 14; ou a proteína pesticida referida compreende uma sequência de aminoácidos tendo no mínimo 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 4, com a SEQ ID NO: 2, com a SEQ ID NO: 6; com a SEQ ID NO: 8, com a SEQ ID NO: 10, com a SEQ ID NO: 12, ou com a SEQ ID NO: 14. Em uma modalidade, o método compreende: (a) contactar uma amostra com um anticorpo imunorreativo; e (b) detectar a presen- ça da proteína. Em algumas modalidades a etapa de detecção com- preende um ELISA, ou um Western blot.
[0025] Também é revelado neste requerimento um método para melhorar a atividade inseticida de uma proteína inseticida nativa contra uma espécie de praga de inseto, compreendendo: manipular uma pro- teína inseticida variante por inserção de um fragmento de DNA codifi- cando um peptídeo de ligação ao receptor do intestino do inseto dentro de uma sequência codificante codificando a proteína inseticida; em que a atividade inseticida da proteína inseticida manipulada é maior do que a atividade inseticida da proteína inseticida nativa para a espécie de praga de inseto referida. Em uma modalidade da invenção, o recep- tor do intestino do inseto pode ser uma proteína semelhante a caderi- na (CADR), uma aminopeptidase-N ancorada a GPI (APN), uma fosfa- tase alcalina ancorada a GPI, um transportador ABC transmembrana, ou uma metaloprotease ADAM. Em outra modalidade da invenção, o fragmento de DNA codificando um peptídeo de ligação ao receptor do intestino do inseto é selecionado entre o grupo que consiste na SEQ ID NO: 15 e na SEQ ID NO: 16 e codifica o peptídeo de ligação ao re- ceptor proporcionado como SEQ ID NO: 17.
[0026] Em uma modalidade da invenção são moléculas de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor heterólogo ligado operacionalmente a um segmento polinucleotídico codificando uma proteína pesticida ou fragmento pesticida da mesma, ligado operacio- nalmente a uma sequência de DNA compreendendo um elemento do sítio alvo de ligação de mRNA especítico do tecido reprodutor, em que o referido elemento do sítio alvo de ligação de mRNA é heterólogo com respeito ao referido segmento polinucleotídico codificando uma proteína pesticida ou fragmento pesticida da mesma. Os elementos do sítio alvo de ligação de mRNA são selecionados entre o grupo que consiste na SEQ ID NO: 18, na SEQ ID NO: 19, na SEQ ID NO: 20, na SEQ ID NO: 21, na SEQ ID NO: 22, e na SEQ ID NO: 23.
[0027] Em ainda outra modalidade da invenção é um método para reduzir a expressão de uma proteína pesticida no tecido reprodutivo de uma planta transgênica, compreendendo expressar na planta transgê- nica referida uma molécula de ácido nucleico recombinante compre- endendo um promotor heterólogo ligado operacionalmente a um seg- mento polinucleotídico codificando uma proteína pesticida ou fragmen- to pesticida da mesma, ligado operacionalmente a uma sequência de DNA compreendendo um elemento do sítio alvo de ligação de MRNA especítico do tecido reprodutor, em que o referido elemento do sítio alvo de ligação de mRNA é heterólogo com respeito ao referido seg- mento polinucleotídico codificando uma proteína pesticida ou fragmen- to pesticida da mesma. Os elementos do sítio alvo de ligação de MRNA são selecionados entre o grupo que consiste na SEQ ID NO: 18, na SEQ ID NO: 19, na SEQ ID NO: 20, na SEQ ID NO: 21, na SEQ ID NO: 22, e na SEQ ID NO: 23. Uma modalidade adicional da inven-
ção é uma molécula de DNA recombinante selecionada entre o grupo que consiste na SEQ ID NO: 25 e na SEQ ID NO: 26.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[0028] A SEQ ID NO: 1 é uma sequência de ácido nucleico codifi- cando uma proteína pesticida TIC7941 obtida a partir da espécie Pae- nibacillus lentimorbus DSC020651.
[0029] A SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos da proteína pesticida TIC7941.
[0030] A SEQ ID NO: 3 é uma sequência codificante sintética codi- ficando uma proteína pesticida TIC7941PL 1 desenhada para expres- são em uma célula de planta.
[0031] A SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7941PL 1 em que um aminoácido alanina adicional é inserido imediatamente depois da metionina de iniciação.
[0032] A SEQ ID NO: 5 é uma sequência de ácido nucleico codifi- cando uma proteína pesticida TIC7941 His, em que uma sequência de ácido nucléico codificando uma etiqueta de Histidina é ligada operaci- onalmente 5' e em quadro à sequência codificante TIC7941.
[0033] A SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos da proteína pesticida TIC7941 His.
[0034] A SEQ ID NO: 7 é uma sequência de ácido nucleico codifi- cando uma proteína pesticida TIC7941 2His, em que uma sequência de ácido nucléico codificando uma etiqueta de Histidina é ligada ope- racionalmente 5' e em quadro.
[0035] A SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos da proteína pesticida TIC7941 2His.
[0036] A SEQ ID NO: 9 é uma sequência de ácido nucleico codifi- cando uma proteína pesticida TIC7941 3His, em que uma sequência de ácido nucléico codificando uma etiqueta de Histidina é ligada ope- racionalmente 5' e em quadro.
[0037] A SEQ ID NO: 10 is a sequência de aminoácidos da proteí- na pesticida TIC7941 3His.
[0038] A SEQ ID NO: 11 é uma sequência codificante sintética co- dificando uma proteína pesticida TIC7941PL 2 desenhada para ex- pressão em uma célula de planta.
[0039] A SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos de TIC7941PL 2 em que um aminoácido alanina adicional é inserido imediatamente depois da metionina de iniciação.
[0040] A SEQ ID NO: 13 é uma sequência codificante sintética co- dificando uma proteína pesticida TIC7941PL 3 desenhada para ex- pressão em uma célula de planta.
[0041] A SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos de TIC7941PL 3 em que um aminoácido alanina adicional é inserido imediatamente depois da metionina de iniciação.
[0042] A SEQ ID NO: 15 é uma sequência codificante sintética (FAWPEPBIN Bac) codificando a sequência de peptídeo de ligação ao receptor FAW ABCc4, FAWPEPBIN, para expressão em bactérias. A sequência sintética é encontrada dentro das posições de nucleotí- deo 2413-2448 de TIC7941 2His e dentro das posições de nucleotí- deo 2410-2445 de TIC7941 3His.
[0043] A SEQ ID NO: 16 é uma sequência codificante sintética (FAWPEPBIN PL) codificando a sequência de peptídeo de ligação ao receptor FAW ABCc4, FAWPEPBIN, para expressão em uma célula de planta. A sequência sintética é encontrada dentro das posições de nu- cleotídeo 2386 a 2421 de TIC7941PL 2 e dentro das posições de nu- cleotídeo 2383 a 2418 de TIC7941PL 3.
[0044] A SEQ ID NO: 17 é a sequência de peptídeo de ligação ao receptor FAW ABCc4 (FAWPEPBIN) codificada pela SEQ ID NO: 15 e pela SEQ ID NO: 16 e está localizada nas posições de aminoácido 805 a 816 de TIC7941 2His, 804-815 de TIC7941 3His, 796-807 de
TIC7941PL 2, e 795 a 806 de TIC7941PL 3.
[0045] A SEQ ID NO: 18 é uma sequência de DNA codificando um sítio alvo de ligação de miRNA Gm.miR395 1.
[0046] A SEQ ID NO: 19 é uma sequência de DNA codificando um sítio alvo de ligação de miRNA Gm.miR395 2.
[0047] A SEQ ID NO: 20 é uma sequência de DNA (SUP-miR395) em que os sítios alvo de ligação de miRNA Gm.miR395 1 e Gm.miR395 2 são ligados usando uma sequência de DNA SP- ART .8a-1.
[0048] A SEQ ID NO: 21 é uma sequência de DNA codificando um sítio alvo de ligação de miRNA Gm.miR4392 1.
[0049] A SEQ ID NO: 22 é uma sequência de DNA codificando um sítio alvo de ligação de miRNA Gm.miR4392 2.
[0050] A SEQ ID NO: 23 é uma sequência de DNA (SUP- MIR4392) em que os sítios alvo de ligação de miRNA Gm.miR4392 1 e Gm.miR4392 2 são ligados usando uma sequência de DNA SP- ART .8a-1.
[0051] A SEQ ID NO: 24 é a sequência de DNA do ligante SP- ART .8a-1.
[0052] A SEQ ID NO: 25 é uma sequência de DNA (TIC7941PL 1- mi395) codificando TIC7941PL 1 ligada operacionalmente a SUP- miR395.
[0053] A SEQ ID NO: 26 é uma sequência de DNA (TIC7941PL 1- mi4392) codificando TIC7941PL 1 ligada operacionalmente a SUP- mMIR4392.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0054] O problema na arte do controle de pragas agrícolas pode ser caracterizado como uma necessidade de novas proteínas de toxi- na que sejam eficazes contra pragas alvo, apresentem amplo espectro de toxicidade contra espécies de pragas alvo, sejam capazes de se-
rem expressas em plantas sem provocar questões agronômicas inde- sejáveis, e proporcionem um modo alternativo de ação comparadas com as toxinas correntes que são usadas commercialmente em plan- tas.
[0055] Novas proteínas pesticidas exemplificadas por TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, e TIC7941PL 3 são reveladas aqui, neste requerimento de patente, e atendem cada uma destas necessi- dades, particularmente contra um amplo espectro de pragas de insetos Lepidópteros, e mais particularmente contra lagarta rosca (Agrotis ipsi- lon), lagarta da espiga de milho (Helicoverpa zea), lagarta europeia do milho (Ostrinia nubilalis), falsa medideira (Spodoptera frugiperda), la- garta das folhas (Spodoptera eridania), falsa medideira da soja (Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (Diatraea gran- diosella).
[0056] Referência neste requerimento a TIC7941, "proteína TIC 7941", "toxina de proteína TIC7941", "proteína de toxina TIC7941", "proteína pesticida TIC7941", "toxinas relacionadas com TIC7941", "proteínas de toxina relacionadas com TIC7941", TIC7941PL 1, "pro- teína TIC7941PL 1", "toxina de proteína TIC7941PL 1", "proteína de toxina TIC7941PL 1", "proteína pesticida TIC7941PL 1", "toxinas rela- cionadas com TIC7941PL 1", "proteínas de toxina relacionadas com TIC7941PL 1-", e semelhantes, se referem a qualquer nova proteína pesticida ou proteína inibidora de insetos, que compreende, que con- siste em, que é substancialmente homóloga a, que é similar a, ou que é derivada a partir de qualquer sequência de proteína pesticida ou pro- teína inibidora de insetos de TIC7941 (SEQ ID NO: 2), de TIC 7941PL 1 (SEQ ID NO: 4), de TIC7941PL 2 (SEQ ID NO: 12), e de TIC7941PL 3 (SEQ ID NO: 14) e segmentos pesticidas ou inibidores de insetos das mesmas, ou combinações dos mesmos, que conferem atividade contra pragas de Lepidópteros, incluindo qualquer proteína apresentando atividade pesticida ou inibidora de insetos se o alinha- mento de semelhante proteína com TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941 PL 2, ou TIC7941PL 3 resultar em identidade de sequência de ami- noácidos de qualquer percentagem de fração a partir de cerca de 80% a cerca de 100% por cento. As proteínas TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, e TIC7941PL 3 incluem tanto a forma direcionada para plastídeo quanto não direcionada para plastídeo das proteínas.
[0057] O termo "segmento" ou "fragmento" é usado neste requeri- mento para descrever sequências de aminoácidos ou de ácido nuclei- co consecutivas que são mais curtas do que a sequência de aminoáci- dos ou de ácido nucleico completa descrevendo uma proteína TIC7941. Um segmento ou fragmento apresentando atividade inibidora de insetos também é revelado neste requerimento se o alinhamento de semelhante segmento ou fragmento, com a seção correspondente da proteína TIC7941 estipulada na SEQ ID NO: 2, ou da proteína TIC 7941PL 1 estipulada na SEQ ID NO: 4, ou da proteína TIC7941PL 2 estipulada na SEQ ID NO: 12, ou da proteína TIC7941PL 3 estipulada na SEQ ID NO: 14 resultar em identidade de sequência de aminoáci- dos de qualquer percentagem de fração a partir de cerca de 80 a cerca de 100 por cento entre o segmento ou fragmento e a seção corres- pondente da proteína TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, ou TIC7941PL 3.
[0058] Em ainda modalidades adicionalmente específicas, um fra- gmento de uma proteína TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, ou TIC7941PL 3 pode ser definido como apresentando atividade pestici- da possuída pela molécula de proteínade partida da qual é derivada. Um fragmento de uma sequência de ácido nucléico codificando uma proteína TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, ou TIC7941PL 3 po- de ser definido como codificando uma proteína apresentando a ativi- dade pesticida possuída pela molécula de proteína codificada pela se-
quência de ácido nucléico de partida da qual é derivada. Um fragmen- to ou variante descrito aqui, neste requerimento de patente, pode compreender adicionalmente um domínio identificado aqui, neste re- querimento de patente, o qual é responsável pela atividade pesticida de uma proteína.
[0059] Em modalidades específicas, são proporcionados fragmen- tos de uma proteína TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, ou TIC 7941PL 3 compreendendo no mínimo cerca de 50, no mínimo cerca de 75, no mínimo cerca de 95, no mínimo cerca de 100, no mínimo cerca de 125, no mínimo cerca de 150, no mínimo cerca de 175, no mínimo cerca de 200, no mínimo cerca de 225, no mínimo cerca de 250, no mínimo cerca de 275, no mínimo cerca de 300, no mínimo cerca de 500, no mínimo cerca de 600, no mínimo cerca de 700, no mínimo cerca de 750, no mínimo cerca de 800, no mínimo cerca de 900, no mínimo cerca de 1000, no mínimo cerca de 1100, no mínimo cerca de 1150, ou no mínimo cerca de 1175 aminoácidos contíguos, ou mais longa, de uma proteína TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941 PL 2, ou TIC7941PL 3 tendo atividade pesticida conforme revelado aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, a in- venção proporciona fragmentos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 12, ou 14, tendo a atividade da sequência de comprimento total. Mé- todos para produzir os fragmentos referidos a partir de uma molécula de partida são de conhecimento geral na arte.
[0060] Referência neste requerimento aos termos "ativo" ou "ativi- dade", "atividade pesticida" ou "pesticida" ou "atividade inseticida", "inibidor de insetos" ou "insecticida" se referem à eficácia de um agen- te tóxico, tal como uma toxina de proteína, para inibir (inibir o cresci- mento, a alimentação, a fecundidade, ou a viabilidade), suprimir (su- primir o crescimento, a alimentação, a fecundidade, ou a viabilidade), controlar (controlar a infestação pela praga, controlar as atividades de alimentação da praga sobre uma colheita em particular contendo uma quantidade eficaz da proteína TIC7941) ou matar (causar a morbidida- de, a mortalidade, ou a fecundidade reduzida de) uma praga. Estes termos se destinam a incluir o resultado de proporcionar uma quanti- dade efetiva como pesticida de uma proteína tóxica para uma praga onde a exposição da praga à proteína tóxica resultar em morbididade, mortalidade, fecundidade reduzida, ou atrofia. Estes termos também incluem a repulsão da praga da planta, de um tecido da planta, de uma parte da planta, de semente, de células de plantas, ou da localização geográfica particular onde a planta pode estar crescendo, em conse- quência de proporcionar uma quantidade efetiva como pesticida da proteína tóxica na ou sobre a planta. Em geral, atividade pesticida se refere à capacidade de uma proteína tóxica para ser efetiva em inibir o crescimento, o desenvolvimento, a viabilidade, o comportamento de alimentação, o comportamento de acasalamento, a fecundidade, ou qualquer redução mensurável nos efeitos adversos causados por a alimentação de um inseto sobre esta proteína, fragmento de proteína, segmento de proteína ou polinucleotídeo de uma praga alvo em parti- cular, incluindo, porém sem limitação, insetos da ordem Lepidoptera. À proteína tóxica pode ser produzida pela planta ou pode ser aplicada à planta ou ao meio ambiente dentro da localização onde a planta está localizada. Os termos "bioatividade", "efetivo", "eficaz" ou variações dos mesmos também são termos intercambiáveis utilizados neste re- querimento para descrever os efeitos da proteínas da presente inven- ção sobre pragas de insetos alvo.
[0061] Uma quantidade eficaz como pesticida de um agente tóxi- co, quando proporcionada na dieta de uma praga alvo, apresenta ati- vidade pesticida quando o agente tóxico entra em contado com a pra- ga. Um agente tóxico pode ser uma proteína pesticida ou um ou mais agentes químicos conhecidos na arte. Agentes químicos pesticidas ou inseticidas e agentes de proteínas pesticidas ou inseticidas podem ser usados isolados ou em combinações uns com os outros. Agentes quí- micos incluem, porém sem limitação, moléculas de dsRNA tendo por alvo genes específicos para supressão em uma praga alvo, organoclo- retos, organofosfatos, carbamatos, piretróides, neonicotinóides, e ria- nóides. Agentes de proteína pesticida ou inseticida incluem as toxinas de proteínas estipuladas neste requerimento, bem como outros agen- tes tóxicos proteináceos incluindo os que têm por alvo Lepidópteros, bem como toxinas de proteínas que são usadas para controlar outras pragas de plantas, tais como proteínas Cry e Cyt disponíveis na arte para uso no controle de espécies de Coleópteros, Hemípteros e Ho- mópteros.
[0062] Pretende-se que referência a uma praga, particularmente uma praga de uma planta de colheita, signifique pragas de insetos de plantas de colheita, particularmente as pragas de insetos Lepidópteros que são controladas pela classe de proteínas de toxina TIC7941. No entanto, referência a uma praga também pode incluir pragas de plan- tas por insetos Coleópteros, Hemípteros e Homópteros, bem como nematódeos e fungos quando agentes tóxicos tendo por alvo estas pragas são co-localizados ou estão presentes junto com a proteína TIC7941 ou uma proteína que seja 80 a cerca de 100 por cento idênti- ca à proteína TIC7941.
[0063] As proteínas TIC7941 são relacionadas por uma função comum e apresentam atividade inseticida para pragas de insetos da espécie de insetos Lepidópteros, incluindo adultos, pupas, larvas, e neonatos.
[0064] Os insetos da ordem Lepidoptera incluem, mas não estão limitados a, lagartas do cartucho, lagartas (cutworms), lagartas-falsas- medideiras (loopers), e heliotinas na Família Noctuidae, por exemplo, falsa medideira (Spodoptera frugiperda), lagarta do cartucho da beter-
raba (Spodoptera exigua), lagarta militar africana (Spodoptera exemp- ta), lagarta das folhas (Spodoptera eridania), lagarta militar bertha (Mamestra configurata), lagarta rosca (Agrotis ipsilon), lagarta plusia do repolho (Trichoplusia ni), lagarta-falsa-medideira da soja (Pseudo- blusia includens), lagarta do feijão-veludo (Anticarsia gemmatalis), la- garta de trevo verde (Hypena scabra), lagarta do botão do tabaco (He- liothis virescens), lagarta rosca (Agrotis subterranea), lagarta do cartu- cho (Pseudaletia unipuncta), lagarta ocidental (Agrotis orthogonia); brocas, casebearers, webworms, lagartas cone (coneworms), lagartas do repolho e skeletonizers da Família Pyralidae, por exemplo, broca de milho europeia (Ostrinia nubilalis), lagarta de laranja de umbigo (Ampyelois transitella), verme da trama da raiz do milho (Crambus cali- ginosellus), verme da trama do relvado (Herpetogramma licarsisalis), mariposa do girassol (Homoeosoma electellum), broca do caule de mi- lho menor (Elasmopalpus lignosellus); besouros rola-bosta, vermes de botão, vermes de semente, e vermes do fruto na Família Tortricidae, por exemplo, mariposa da maçã verde (Cydia pomonella), mariposa da baga de uva (Endopiza viteana), mariposa oriental do fruto (Grapholita molesta), mariposa do botão do girassol (Suleima helianthana); e mui- tos outros Lepidópteros economicamente importantes, por exemplo, traça das crucíferas (Plutella xylostella), lagarta rosada do algodão (Pectinophora gossypiella), e mariposa cigana (Lymantria dispar). Ou- tras pragas de insetos da ordem Lepidoptera incluem, por exemplo, curuquerê do algodão (Alabama argillacea), besouro rola-bosta de ár- vore frutífera (Archips argyrospila), besouro rola-bosta europeu (Ar- chips rosana) e outras espécies de Archips, (Chilo suppressalis, broca do arroz asiático, ou broca do caule do arroz), besouro rola-bosta do arroz (Cnaphalocrocis medinalis), verme da trama da raiz do milho (Crambus caliginosellus), verme da trama da bluegrass (Crambus te- terrellus), broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella), broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis), lagarta espinhosa (Earias insu- lana), lagarta pintada (Earias vittella), curuquerê americana (Helico- verpa armigera), verme da espiga de milho (Helicoverpa zea, também conhecida como verme da vagem da soja e lagarta do algodão), lagar- ta do botão do tabaco (Heliothis virescens), verme da trama do relvado (Herpetogramma licarsisalis), lagarta do feijão ocidental (Striacosta albicosta), mariposa da videira europeia (Lobesia botrana), larva mina- dora das folhas dos cítricos (Phyllocnistis citrella), borboleta branca grande (Pieris brassicae), borboleta branca pequena (Pieris rapae, também conhecida como verme do repolho importado), lagarta do car- tucho da beterraba (Spodoptera exigua), lagarta desfolhadora do taba- co (Spodoptera litura, também conhecida como cluster caterpillar), e traça do tomateiro (Tuta absoluta).
[0065] Referência neste requerimento a uma "molécula de DNA isolada", ou um termo ou expressão equivalente, se destina a indicar que a molécula de DNA é uma molécula que está presente isolada ou em combinação com outras composições, mas não dentro de seu am- biente natural. Por exemplo, elementos de ácido nucléico, tais como uma sequência codificante, uma sequência de íntron, uma uma se- quência lider não traduzida, uma sequência de promotor, uma sequên- cia de terminação transcricional, e semelhantes, que são encontradas naturalmente dentro do DNA do genoma de um organismo não são considerados como sendo "isolados" contanto que o elemento esteja dentro do genoma do organismo e na localização dentro do genoma no qual é encontrado naturalmente. No entanto, cada um deste ele- mentos, e subpartes destes elementos, seria "isolado" dentro do âmbi- to desta divulgação contanto que o elemento não esteja dentro do ge- noma do organismo e na localização dentro do genoma no quel é en- contrado naturalmente. De modo similar, uma sequência de nucleotí- deos codificando uma proteína inseticida ou qualquer variante que ocorre naturalmente daquela proteína seria uma sequência de nucleo- tídeos isolada, contanto que a sequência de nucleotídeos não estives- se dentro do DNA da bactéria da qual a sequência codificando a prote- ína é encontrada naturalmente. Uma sequência de nucleotídeos sinté- tica codificando a sequência de aminoácidos da proteína inseticida que ocorre naturalmente seria considerada como sendo isolada para os fins desta divulgação. Para os fins desta divulgação, qualquer sequên- cia de nucleotídeos transgênica, isto é, a sequência de nucleotídeos do DNA inserido dentro do genoma das células de uma planta ou bac- téria, ou presente em um vetor extracromossômico, seria considerada como sendo uma sequência de nucleotídeos isolada se estiver presen- te dentro do plasmídeo ou estrutura similar usada para transformar as células, dentro do genoma da planta ou bactéria, ou presente em quantidades detectáveis em tecidos, na progênie, em amostras bioló- gicas ou em produtos de commodity derivados da planta ou bactéria.
[0066] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma "molécula de DNA recombinante" é uma molécula de DNA compreen- dendo uma combinação de moléculas de DNA que não ocorreriam na- turalmente juntas sem intervenção humana. Por exemplo, uma molé- cula de DNA recombinante pode ser uma molécula de DNA que con- siste em no mínimo duas moléculas DNA heterólogas uma em relação à outra, uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA que desvia das sequências de DNA que existem na natureza, ou uma molécula de DNA que tenha sido incorporada dentro do DNA de uma célula hospedeira por transformação genética ou edição de gene. De modo similar, uma " uma molécula de proteína recombinante" é uma molécula de proteína compreendendo uma combinação de ami- noácidos que não ocorreriam naturalmente juntos sem intervenção humana. Por exemplo, uma molécula de proteína recombinante pode ser uma molécula de proteína que consiste em no mínimo duas molé-
culas de aminoácido heterólogas uma em relação à outra, uma molé- cula de proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que desvia das sequências de aminoácidos que existem na natureza, ou uma molécula de proteína que é expressa em uma célula hospedeira como um resultado de transformação genética da célula hospedeira ou por edição genética do genoma da célula hospedeira.
[0067] Conforme adicionalmente descrito neste requerimento, um frame de leitura aberta (ORF) codificando TIC7941 (SEQ ID NO: 2) foi descoberto em DNA obtido a partir da cepa DSC020651 de Paenibaci- Ilus lentimorbus. A sequência codificante foi clonada e expressa em células hospedeiras microbianas para produzir proteínas recombinan- tes usadas em bioensaios. Bioensaio usando proteínas de TIC7941 derivadas de células hospedeiras microbianas demonstrou atividade contra as espécies de Lepidópteros lagarta rosca (Agrotis ipsilon), la- garta da espiga de milho (Helicoverpa zea), lagarta europeia do milho (Ostrinia nubilalis), lagarta das folhas (Spodoptera eridania), falsa me- dideira da soja (Chrysodeixis includens), e broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella).
[0068] Sequências sintéticas codificando TIC7941 e variantes de TIC7941 foram desenhadas para expressão em uma célula de planta. A sequência codificante, TIC7941PL 1 (SEQ ID NO: 3) codifica a pro- teína inseticida TIC7941PL 1, a qual é idêntica à sequência de proteí- na TIC7941 com a exceção de um aminoácido alanina adicional inse- rido depois da metionina de iniciação para melhorar a expressão. Quando expressa em milho transgênico, TIC7941PL 1 demonstrou atividade inseticida contra a lagarta rosca (BCW, Agrotis ipsilon), con- tra a lagarta da espiga de milho (CEW, Helicoverpa zea), e contra a broca do milho do sudoeste (SWCB, Diatraea grandiosella) em ensai- os de discos de folhas. Quando expressa em plantas de soja transgê- nicas, TIC7941PL 1 demonstra atividade inseticida contra a lagarta das folhas (SAW, Spodoptera eridania), contra a falsa medideira da soja (SBL, Chrysodeixis includens), e contra Verme da vagem da soja (SPW, Helicoverpa zea) em ensaios de discos de folhas. A sequência codificante TIC7941PL 2 (SEQ ID NO: 11) e a sequência codificante TIC7941PL 3 (SEQ ID NO: 13) codificam as proteínas inseticidas TIC7941PL 2 (SEQ ID NO: 12) e TIC7941PL 3 (SEQ ID NO: 14), res- pectivamente. Contêm um aminoácido alanina adicional inserido de- pois da metionina de iniciação para melhorar a expressão. Tanto TIC7941PL 2 quanto TIC7941PL 3 também contêm um fragmento peptídico de ligação a proteína do transportador ABC transmembrana (ABCcA4) da falsa medideira inserido dentro do loop do domínio 2 de TIC7941. Em TIC7941PL 2 o fragmento de ligação à proteína ABCc4 está localizado nas posições de aminoácido 796 a 807. Em TIC7941 PL 3 o fragmento de ligação à proteína ABCcA4 está localizado nas posições de aminoácido 795-806.
[0069] Paras expressão em células de plantas, a proteína TIC 7941PL 1, TIC7941PL 2, ou TIC7941PL 3 pode ser expressa para residir no citosol ou direcionada para várias organeladas da célula de planta. Por exemplo, o direcionamento de uma proteína para o cloro- plasto pode resultar em um aumento dos níveis de proteína expressa em uma planta transgênica ao mesmo tempo que evitando que ocor- ram fenótipos-off. O direcionamento também pode resultar em um au- mento na eficácia da resistência a pragas no evento transgênico. Um peptídeo alvo ou peptídeo de trânsito é uma cadeia peptídica curta (de 3 a 70 aminoácidos de comprimento) que direciona o transporte de uma proteína para uma região específica na célula, incluindo o núcleo, mitocôndria, retículo endoplasmático (ER), cloroplasto, apoplasto, pe- roxisoma e membrana plasmática. Alguns peptídeos alvo são clivados da proteína por peptidases de sinal depois das proteínas serem trans- portadas. Para direcionamento para o cloroplasto, as proteínas contêm peptídeos de trânsito, os quais têm em torno de 40 a 50 aminoácidos.
Para descrições do uso de peptídeos de trânsito para o cloroplasto, vide as Patentes U.S.
Nos. 5.188.642 e 5.728.925. Muitas proteínas localizadas no cloroplasto são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são direcionadas para o cloroplasto por um peptí- deo de trânsito para o cloroplasto (CTP). Exemplos de semelhantes proteínas do cloroplasto isoladas incluem, porém se limitação, as as- sociadas com a pequena subunidade (SSU) de ribulose-1,5,-bisfosfato carboxilase, ferredoxina, ferredoxina oxidorredutase, o complexo de captação de luz proteína | e proteína Il, tioredoxina F, enolpiruvil shi- kimato fosfato sintase (EPSPS), e peptídeos de trânsito descritos na Patente U.S.
No. 7.193.133. Foi demonstrado in vivo e in vitro que pro- teínas não cloroplasto podem ser direcionadas para o cloroplasto por uso de fusões de proteína com um CTP heterólogo e que o CTP é su- ficiente para direcionar uma proteína para o cloroplasto.
Foi demosn- trado que a incorporação de um peptídeo de trânsito para o cloroplasto adequado, tal como o CTP de Arabidopsis thaliana EPSPS (CTP2) (vi- de, Klee et al., Mol.
Gen.
Genet. 210:437-442, 1987) ou o CTP de Pe- tunia hybrida EPSPS (CTP4) (vide, della-Cioppa et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 83:6873-6877, 1986) têm por alvo sequências de pro- teínas EPSPS heterólogas para cloroplastos em plantas transgênicas (vide as Patentes U.S.
Nos. 5.627.061; 5.633.435; e 5.312.910; e EP 0218571; EP 189707; EP 508909; e EP 924299). Para direcionar a proteína de toxina TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, ou TIC7941 PL 3 para o cloroplasto, uma sequência codificando um peptídeo de trânsito para o cloroplasto é colocada 5º em ligação operável e em quadro para uma sequência codificante sintética codificando a proteína de toxina TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, ou TIC7941PL 3 que tenha sido desenhada para ótima expressão em células de plan- tas.
[0070] É contemplado que sequências de proteínas de toxina adi- cionais relacionadas com TIC7941 podem ser criadas usando a se- quência de aminoácidos de TIC7941 para criar novas proteínas com novas propriedades. As proteínas de toxina TIC7941 podem ser ali- nhadas para combinar diferenças no nível da sequência de aminoáci- dos dentro de novas variantes de sequência de aminoácidos e fazendo modificações apropriadas para a sequência de ácido nucleico recom- binante codificando as variantes.
[0071] Esta divulgação adicionalmente contempla que variantes apirmoradas da classe de proteínas de toxina TIC7941 podem ser ma- nipuladas in planta usando vários métodos de edição genética conhe- cidos na arte. As tecnologias referidas usadas para edição de genoma incluem, mas não estão limitadas a, ZFN (nuclease de dedo de zinco), meganucleases, TALEN (nucleases efetoras semelhantes a ativador de transcrição), e sistemas CRISPR (repetições palindrômicas curtas regu- larmente interespaçadas aglomeradas)/Cas (associados a CRISPR). Es- tes métodos de edição de genoma podem ser usados para alterar a sequência codificante de proteína de toxina transformada dentro de uma célula de planta para uma sequência codificante de toxina dife- rente. Especificamente, através destes métodos, um ou mais códons dentro da sequência codificante de toxina é alterado para produzir uma nova sequência de aminoácidos de proteína. Alternativamente, um fragmento dentro da sequência codificante é substituído ou deletado, ou fragmentos de DNA adicionais são inseridos dentro da sequência codificante, para produzir uma nova sequência codificante de toxina. As nova sequência codificante pode codificar uma proteína de toxina com novas propriedades, tais como aumento da atividade ou do es- pectro contra pragas de insetos, bem como proporcionar atividade contra uma espécie de praga de inseto que tenha desenvolvido resis- tência contra a proteína de toxina do inseto original. A célula de planta compreendendo a sequência codificante toxina de toxina editada ge- neticamente pode ser usada por métodos conhecidos na arte para ge- rar plantas inteiras expressando a nova proteína de toxina.
[0072] Também é contemplado que fragmentos de TIC7941 ou variantes protéicas dos mesmos podem ser formas truncadas em que um ou mais aminoácidos são deletados da extremidade N-terminal, da extremidade C-terminal, do meio da proteína, ou combinações dos mesmos em que os fragmentos e variantes conservam atividade inibi- dora de insetos. Estes fragmentos podem ser variantes de TIC7941 que ocorrem naturalmente ou sintéticas ou variantes de proteínas deri- vads, mas devem reter a atividade inibidora de insetos de no mínimo TIC7941. Um fragmento ou variante descrito aqui, neste requerimento de patente, pode compreender adicionalmente um domínio identificado aqui, neste requerimento de patente, o qual é responsável pela ativi- dade pesticida de uma proteína.
[0073] Proteínas que se assemelham às proteínas na classe de proteínas de toxina TIC7941 podem ser identificadas e comparadas umas com as outras usando vários algoritmos à base de computação conhecidos na arte (vide a Tabela 1). As identidades de sequências de aminoácidos reportadas neste requerimento são um resultado de um alinhamento Clustal W usando estes parâmetros padrão: matriz de pe- so: blosum, penalidade de abertura de intervalo: 10,0, penalidade de extensão de intervalo: 0,05, intervalos hidrofílicos: On, resíduos hidrofí- licos: GPSNDQERK, penalidades de intervalos específicos de resí- duos: On (Thompson, et al (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673- 4680). A percentagem de identidade de aminoácidos é adicionalmente calculada pelo produto de 100% multiplicado por (identidades de ami- noácidos / comprimento da proteína em questão). Outros algoritmos de alinhamento também estão disponíveis na arte e proporcionam re- sultados similares aos obtidos usando um alinhamento Clustal W e são contemplados aqui, neste requerimento de patente.
[0074] Pretende-se que uma proteína apresentando atividade ini- bidora de insetos contra um inseto da espécie dos Lepidópteros seja relacionada com um membro da classe de proteínas de toxina TIC7941 se a proteína for usada em uma query, por exemplo, em um alinhamento Clustal W, e as proteínas da presente invenção conforme estipulado como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10 são identificadas como acertos em semelhante alinhamento no qual a proteína de query apresenta no mínimo 80% até cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da pro- teína de query que é cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, ou qualquer fração da percentagem nesta faixa.
[0075] Além da percentagem de identidade, as proteínas TIC7941 também podem ser relacionadas pela estrutura primária (motivos de aminoácidos conservados), pelo comprimento (cerca de 807 aminoá- cidos), e por outras características. As características das toxinas de proteínas TIC7941 são reportadas na Tabela 1.
Tabela 1. Características selecionadas da classe de proteínas de toxina TIC7941. Tabela 1. -continuação- Proteína No. de Aminoácidos Fortemente Bási- No. de Aminoácidos | No. de Aminoáci- | No. de Aminoá-
[0076] Conforme descrito adicionalmente nos Exemplos, sintética sequências de moléculas de ácido nucléico codificando variantes de TIC7941 foram desenhadas para uso em plantas. Exemplos de se- quências de moléculas de ácido nucleico recombinante que foram de- senhadas para uso em plantas codificando as proteínas TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, e TIC7941PL 3 são apresentadas como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 13, respectivamente. As proteínas TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, e TIC7941PL 3 têm um aminoácido ala- nina adicional imediatamente depois da metionina de iniciação em re- lação à proteína TIC7941. Acredita-se que este redísuo de alanina adicional melhore a expressão da proteína in planta. As proteínas TIC7941PL 2 e TIC7941PL 3 também compreendem o fragmento de ligação ao peptídeo ABCc4 para melhorar a eficácia das proteínas contra falsa medideira (Spodoptera frugiperda).
[0077] Cassetes de expressão e vetores contendo uma sequência de molécula de ácido nucleico recombinante podem ser construídos e introduzidos dentro de células de plantas de milho, soja ou algodão de acordo com métodos e técnicas de transformação conhecidos na arte. Por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium é descrita nas Publicações dos Requerimentos de Patente U.S. Nos. 2009/0138985A1 (soja), 2008/0280361A1 (soja), 2009/0142837A1 (mi- lho), 2008/0282432 (algodão), 2008/0256667 (algodão), 2003/0110531 (trigo), 2001/0042257 A1 (beterraba sacarina), Patente U.S. Nos.
5.750.871 (canola), 7.026.528 (trigo), e 6.365.807 (arroz), e em Aren- cibia et al. (1998) Transgenic Res. 7:213-222 (cana-de-açúcar) todos os quais são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade. Células transformadas podem ser regeneradas em plantas transformadas que expressam proteína TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, ou TIC7941PL 3 e demonstram ativida- de pesticida através de bioensaios realizados na presença de larvas de pragas de Lepidópteros usando discos de folha de planta obtidos a partir das plantas transformadas. As plantas podem ser derivadas a partir das células de plantas por regeneração, técnias de transforma- ção de semente, pólen, ou meristema. Métodos para transformação de plantas são conhecidos na arte.
[0078] Como uma alternativa aos métodos de transformação tradi- cionais, uma sequência de DNA, tal como um transgene, um ou mais cassetes de expressão, etc., pode ser inserida ou integrada em um sítio ou lócus específico dentro do genoma de uma planta ou célula de planta através de integração direcionada ao sítio. Constructo(s) de DNA recombinante e molécula(s) desta divulgação podem, portanto, incluir uma sequência de doador modelo compreendendo no mínimo um transgene, cassete de expressão, ou outra sequência de DNA para inserção dentro do genoma da planta ou célula de planta. O doador modelo para integração direcionada ao sítio pode adicionalmente in- cluir um ou dois braços de homologia flanqueando uma sequência de inserção (isto é, a sequência, transgene, cassete, etc., a ser inserida dentro do genoma da planta). O um ou mais constructos de DNA re- combinante desta divulgação podem compreender adicionalmente um ou mais cassetes de expressão codificando a nuclease específica do sítio e/ou qualquer ou quaisquer proteínas associadas para realizar integração direcionada ao sítio. Este um ou mais cassetes expressan- do nuclease podem estar presentes na mesma molécula ou vetor que o doador modelo (em cis) ou sobre uma molécula ou vetor separado (em trans). Vários métodos para integração direcionada ao sítio são conhecidos na arte envolvendo proteínas diferentes (ou complexos de proteínas e/ou RNA guia) que cortam o DNA genômico para produzir uma quebra de cadeia dupla (DSB) ou corte em um lócus ou sítio ge- nômico desejado. Em resumo, conforme é entendido na arte, durante o processo de repaar a DSB ou o corte introduzido pela enzima nu-
clease, o DNA doador modelo pode se tornar integrado dentro do ge- noma no sítio da DSB ou do corte. A presença do(s) braço(s) de ho- mologia no doador modelo pode promover a adoção e o direcionamen- to da sequência de inserção dentro do genoma da planta durante o processo de reparo através de recombinação homóloga, embora pos- sa ocorrer um evento de inserção através de união de extremidades não homólogas (NHEJ). Exemplos de nucleases específicas do sítio que podem ser usadas incluem nucleases de dedo de zinco, meganu- cleases manipuladas ou nativas, endonucleases TALE, e endonuclea- ses guiadas por RNA (por exemplo, Cas9 ou Cpf1). Para métodos usando nucleases específicas do sítio guiadas por RNA (por exemplo, Cas9 ou Cpf1), o um ou mais constructos de DNA recombinante tam- bém vão compreender uma sequência codificando um ou mais RNAs guias para direcionar a nuclease para o sítio desejado dentro do ge- noma da planta.
[0079] São contempladas composições de moléculas de ácido nu- cleico recombinante que codificam proteínas TIC7941. Por exemplo, proteínas TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, e TIC7941PL 3 po- dem ser expressas com constructos de DNA recombinantes nos quais uma molécula de polinucleotídeo molécula com um ORF codificando a proteína é ligado operacionalmente a elementos de expressão genéti- ca, tais como um promotor e qualquer outro elemento regulador ne- cessário para expressão no sistema para o qual o constructo é desti- nado. Exemplos não limitantes incluem um promotor funcional em planta ligado operacionalmente a uma sequência codificando a proteí- na TIC7941 para expressão da proteína em plantas ou um promotor funcional em Bt ligado operacionalmente a uma sequência codificando a proteína TIC7941 para expressão da proteína em uma bactéria de Bt ou outra espécie de Bacillus. Outros elementos podem ser ligados operacionalmente à sequência codificando a proteína TIC7941 incluin-
do, porém sem limitação, reforçadores, íntrons, líderes não traduzidos, marcadores de imobilização de proteína codificados (HIS-tag), peptí- deos de translocação (isto é, peptídeos de trânsito para plastídeo, pep- tídeos de sinal), sequências polipeptídicas para enzimas de modifica- ção pós-translacional, sítios de ligação ribossômicos, e sítios alvo de RNAi. Exemplos de moléculas de polinucleotídeos recombinantes pro- porcionadas aqui incluem, mas não estão limitados a, um promotor heterólogo ligado operacionalmente a um polinucleotídeo tal como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 13 que codifica os respectivos polipeptídeos ou proteínas tendo a sequência de aminoácidos confor- me estipulado na SEQ ID NO: 4, na SEQ ID NO: 2, na SEQ ID NO: 6, na SEQ ID NO: 8, na SEQ ID NO: 10, na SEQ ID NO: 12, e na SEQ ID NO: 14. Um promotor heterólogo também pode ser ligado operacio- nalmente às sequências codificantes de DNA sintéticas codificando uma TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, ou TIC7941PL 3 direcionada para plastídeo ou uma TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, ou TIC7941PL 3 não direcionada. Os códons de uma molécula de ácido nucleico recombi- nante codificando para as proteínas reveladas aqui, neste requerimen- to de patente, podem ser substituídos por códons sinônimos (o que é conhecido na arte como uma substituição silenciosa).
[0080] Um constructo de DNA recombinante compreendendo uma sequência codificando a proteína TIC7941 pode compreender adicio- nalmente uma região de DNA que codifica para um ou mais agentes inibidores de inseto, os quais podem ser configurados para expressar concomitantemente ou co-expressar com uma sequência de DNA co- dificando uma proteína TIC7941, uma proteína diferente de uma prote- ína TIC7941, uma molécula de dsRNA inibidora de insetos, ou uma proteína auxiliar. Proteínas auxiliares incluem, mas não estão limitadas a, co-fatores, enzimas, parceiros de ligação, ou outros agentes que funcionam auxiliando na eficácia de um agente inibidor de insetos, por exemplo, auxiliando sua expressão, influenciando sua estabilidade em plantas, otimizando a energia livre para oligomerização, aumentando sua toxicidade, e aumentando seu espectro de atividade. Uma proteí- na auxiliar pode facilitar a captação de um ou mais agentes inibidores de insetos, por exemplo, ou potencializar os efeitos tóxicos do agente tóxico.
[0081] Um constructo de DNA recombinante pode ser montado de tal modo a que todas as proteínas ou moléculas de dsRNA sejam ex- pressas a partir de um promotor ou cada proteína ou moléculas de dsRNA esteja sob controle de promotor separado ou alguma combina- ção dos mesmos. As proteínas desta invenção podem ser expressas a partir de um sistema de expressão multi-gene no qual uma ou mais proteínas da classe de proteínas de toxina TIC7941 são expressas a partir de um segmento de nucleotideo comum, o qual também contém outros frames de leitura aberta e promotores, dependendo do tipo de sistema de expressão selecionado. Por exemplo, um sistema de ex- pressão multi-gene bacteriano pode utilizar um único promotor para conduzir a expressão de frames de leitura aberta ligados multiplamen- te / tandem de dentro de um único operon (isto é, expressão policistrô- nica). Em outro exemplo, um sistema de expressão multi-gene vegetal pode utilizar cassetes de expressão multiplamente não ligados ou liga- dos, cada cassete expressando uma proteína diferente ou outro agen- te tal como uma ou mais moléculas de dsRNA.
[0082] Polinucleotídeos recombinantês ou constructos de DNA re- combinantes compreendendo uma sequência codificando a proteína TIC7941 podem ser liberados para células hospedeiras por vetores, por exemplo, um vetor de plasmídeo, baculovírus, cromossoma sintéti- co, vírion, cosmídeo, fagemídeo, fago, ou viral. Os vetores referidos pdoem ser usados para obter expressão estável ou transitória de uma sequência codificando a proteína TIC7941 em uma célula hospedeira, ou expressão subsequente do polipeptídeo codificado. Um polinucleo- tídeo recombinante exógeno ou constructo de DNA recombinante que compreenda uma sequência codificando a proteína TIC7941 e que se- ja introduzido dentro de uma célula hospedeira é referido neste reque- rimento como um "transgene".
[0083] São proporcionadas bactérias transgênicas, células de plantas transgênicas, plantas transgênicas, e partes de plantas trans- gênicas que contenham um polinucleotídeo recombinante que expres- se sequência codificando proteína TIC7941, TIC7941 His, TIC7941 PL 1, TIC7941PL 2, ou TIC7941PL 3 aqui, neste requerimento de patente. O termo "célula bacteriana" ou "bactéria" pode incluir, mas não está limitado a, uma célula de Agrobacterium, uma célula de Baci- Ilus, uma célula de Escherichia, uma célula de Salmonella, uma célula de Pseudomonas, uma célula de Brevibacillus, uma célula de Klebsiel- la, uma célula de Enwinia, ou uma célula de Rhizobium. O termo "célu- la de planta" ou "planta" pode incluir, mas não está limitado a uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. O termo "célula de planta" ou "planta" também pode incluir, mas não está limitado a uma célula de planta ou planta de alfalfa, banana, cevada, feijão, brócolis, repo- lho, brassica, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, cítrico, coco, café, milho, trevo, algodão, uma cucúrbita, pepino, abeto (Douglas fir), beringela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, pinheiro Loblolly, milhetos, melões, no- zes, aveia, oliveira, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, er- vilha, amendoim, pimenta, ervilha d'angola, pinho, batata, álamo, abó- bora-menina, pinho radiata, rabanete, colza, arroz, rootstocks, centeio, açafrão, shrub, sorgo, pinheiro do Sul, soja, espinafre, abóbora, mo- rango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, switchgrass, chá, tabaco, tomate, triticale, grama,
melancia, e trigo. Em algumas modalidades, são proporcionadas plan- tas transgênicas e partes de plantas transgênicas regeneradas a partir de uma célula de planta transgênica. Em algumas modalidades, as plantas transgênicas podem ser obtidas a partir de uma semente transgênica, cortando, quebrando, triturando ou dissociando de modo diverso a parte da planta. Em algumas modalidades, a parte da planta pode ser uma semente, uma cápsula, uma folha, uma flor, um caule, uma raiz, ou qualquer porção da mesma, ou uma porção não regene- rável de uma parte de planta transgênica. Conforme usado neste con- texto, uma porção "não regenerável" de uma parte de planta transgê- nica é uma porção que não pode ser induzida para formar uma planta inteira ou que não pode ser induzida para formar uma planta inteira que seja capaz de reprodução sexual e/ou assexual. Em algumas mo- dalidades, uma porção não regenerável de uma parte da planta é uma porção de uma semente, uma cápsula, uma folha, uma flor, um caule, ou raiz transgênica/o.
[0084] São proporcionados métodos de produção de plantas transgênicas que compreendem quantidades de uma proteína TIC 7941 inibidora de insetos Lepidópteros. As plantas referidas podem ser produzidas introduzindo um polinucleotídeo recombinante que codifi- que quaisquer das proteínas proporcionadas neste requerimento den- tro de uma célula de planta, e selecionando uma planta derivada da célula de planta referida que expresse uma quantidade das proteínas inibidora de insetos Lepidópteros. Plantas podem ser derivadas das células de plantas por regeneração, técnicas de transformação de se- mente, pólen, ou meristema. Métodos para transformação de plantas são conhecidos na arte.
[0085] Produtos de plantas processados, em que o produto pro- cessado compreende uma quantidade detectável de uma proteína TIC7941, um segmento inibidor de inseto ou fragmento do mesmo, ou qualquer porção distinta do mesmo, também são revelados aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, o produto proces- sado é selecionado entre o grupo que consiste em partes de plantas, biomassa vegetal, óleo, refeição, açúcar, ração animal, farinha, flocos, farelo, fibra de algodão, cascas, semente processada, e semente. Em algumas modalidades, o produto processado não é regenerável. O produto de planta pode compreender commodity ou outros produtos de comércio derivados de uma planta transgênica ou parte de planta transgênica, onde a commodity ou outros produtos podem ser monito- rados através do comércio detectando segmentos de nucleotídeos ou RNA expresso ou proteínas que codificam ou compreendem porções distintas de uma proteína TIC7941.
[0086] Plantas expressando uma proteína TIC7941 podem ser cruzadas por criação com eventos transgênicos expressando outras proteínas de toxina e/ou expressando outros traços transgênicos, tais como genes de tolerância a herbicida, genes conferindo traços de pro- dução ou tolerância a estresse, e semelhantes, ou os traços referidos podem ser combinados em um único vetor de modo a que os traços sejam todos ligados.
[0087] Conforme adicionalmente descrito nos Exemplos, a classe de proteínas de toxina TIC7941 e sequências tendo uma substancial percentagem de identidade com um membro da classe de proteínas de toxina TIC7941 podem ser identificadas usando métodos de conhe- cimento dos ordinariamente versados na arte, tais como reação de ca- deia da polimerase (PCR), amplificação térmica e hibridização. Por exemplo, as proteínas na classe de proteínas de toxina TIC7941 po- dem ser usadas para produzir anticorpos que se liguem especifica- mente a proteínas relacionadas, e podem ser usadas para triar para e descobrir outros membros das proteínas que sejam intimamente rela- cionados.
[0088] Além disso, sequências de nucleotídeos codificando as pro- teínas de toxina TIC7941 podem ser usadas como sondas e primers para triagem para identificar outros membros da classe usando méto- dos de amplificação e hibridização isotérmica ou de ciclo térmico. Por exemplo, oligonucleotídeos derivados de sequências conforme estipu- lado na SEQ ID NO: 3, na SEQ ID NO: 11, e na SEQ ID NO: 13 podem ser usados para determinar a presença ou ausência de um transgene TIC7941 em uma amostra de ácdido desoxirribonucléico derivada de um produto de commodity. Dada a sensibilidade de determinados mé- todos de detecção de ácido nucleico que empregam oligonucleotídeos, é previsto quer oligonucleotídeos derivados de sequências conforme estipulado na SEQ ID NO: 3, na SEQ ID NO: 11, e na SEQ ID NO: 13 possam ser usados para detectar um transgene TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, e TIC7941PL 3 em produtos de commodity derivados de fontes reunidas onde somente uma fração do produto de commo- dity é derivada de uma planta transgênica contendo qualquer um dos transgenes. Adicionalmente se reconhece que os oligonucleotídeos referidos podem ser usados para introduzir variação de sequência de nucleotídeos em cada uma das SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 13. Os oligonucleotídeos de "mutagênese" referidos são úteis para identificação de variantes de sequências de aminoácidos da clas- se de proteínas de toxina TIC7941 apresentando uma gama de ativi- dades inibidoras de insetos ou expressão variada em células hospe- deiras de plantas transgênicas.
[0089] Homólogos de sequências de nucleotídeos, por exemplo, proteínas inseticidas codificadas pelas sequências de nucleotídeos que hibridizam a cada uma ou a quaisquer das sequências reveladas neste requerimento sob condições de hibridização estringentes, tam- bém são uma modalidade da presente invenção. A invenção também proporciona um método para detectar uma primeira sequência de nu-
cleotídeos que hibridiza a uma segunda sequência de nucleotídeos, em que a primeira sequência de nucleotídeos (ou sua sequência de complemento reverso) codifica uma proteína pesticida ou fragmento pesticida da mesma e hibridiza à segunda sequência de nucleotídeos. Em tal caso, a segunda sequência de nucleotídeos pode ser qualquer uma das sequências de nucleotídeos apresentadas como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 13 sob condições de hibridização estringentes. Sequências codificantes de nucleotídeos hibridizam umas às outras sob condições de hibridização apropriadas, tais como condições de hibridização estringentes, e as proteínas codi- ficadas por estas sequências de nucleotídeos apresentam reação cru- zada com anti-soro cultivado contra qualquer uma das outras proteí- nas. Condições de hibridização estringentes, conforme definido aqui, neste requerimento de patente, compreendem no mínimo hibridização a 42ºC seguida por duas lavagens por cinco minutos cada em tempe- ratura ambiente com 2X SSC, SDS a 0,1%, seguidas por duas lava- gens por trinta minutos cada a 65ºC em 0,5X SSC, SDS a 0,1%. Lava- gens em temperaturas ainda maiores constituem condições ainda mais estringentes, por exemplo, condições de hibridização de 68ºC, segui- das por lavagem a 68ºC, em 2xSSC contendo SDS a 0,1%.
[0090] Uma pessoa versada na arte vai reconhecer que, devido à redundância do código genético, muitas outras sequências são capa- zes de codificar as proteínas relacionadas referidas, e essa sequên- cias, na medida que funcionem para expressar proteínas pesticidas quer em cepas de Bacillus ou em células de plantas, são modalidades da presente invenção, reconhecendo, logicamente, que muitas das sequências codificantes redundantes referidas não vão hibridizar sob estas condições às sequências codificando TIC7941 de Bacillus ou de Paenibacillus nativas. Este requerimento contempla o uso destas e outros métodos de identificação de conhecimento dos ordinariamente versados na arte para identificar sequências codificando proteína TIC7941 e sequências tendo uma percentagem de identidade subs- tancial com sequências codificando proteína TIC7941.
[0091] Esta divulgação também contempla o uso de métodos mo- leculares conhecidos na arte para manipular e clonar proteínas úteis comercialmente compreendendo quimeras de proteínas de proteínas pesticidas; por exemplo, as quimeras podem ser montadas a partir de segmentos das proteínas relacionadas com TIC7941 para derivar mo- dalidades úteis adicionais incluindo motangem de segmentos de TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, e TIC7941PL 3 com segmen- tos de proteínas diversas dífferentes de TIC7941, TIC7941PL 1, TIC7941PL 2, e TIC7941PL 3; e proteínas relacionadas. As proteínas TIC7941 podem ser submetidas a alinhamento umas com as outras e a outras proteínas pesticidas de Bacillus, Paenibacillus ou diversas (quer ou não estas sejuam intimamente ou distantemente relacionadas filogeneticamente), e segmentos de cada proteína semelhante podem ser identificados que são úteis para substituição entre as proteínas ali- nhadas, resultando na construção de proteínas quiméricas. As proteí- nas quiméricas referidas podem ser submetidas a análise de bioensaio de pragas e caracterizadas para a presença ou ausência de aumento da bioatividade ou expansão do espectro de pragas alvo comparadas com as proteínas de origem, a partir das quais cada segmento referido na quimera foi derivado. A atividade pesticida dos polipeptídeos pode ser adicionalmente manipulada para atividade para uma praga em par- ticular ou para um espectro mais amplo de pragas trocando domínios ou segmentos com outras proteínas ou usando métodos de evolução direcionada conhecidos na arte.
[0092] Além disso, esta divulgação contempla manipular uma pro- teína pesticida variante por inserção de sequências de peptídeos den- tro da proteína pesticida nativa que podem apirmorar a atividade pesti-
cida contra espécies de pragas de insetos específicas. O peptídeo in- serido se liga a um receptor do intestino médio do inseto. A ligação específica da endotoxina aos receptores específicos localizados no intestino médio do inseto é uma etapa no modo de ação pesticida de uma proteína pesticida. No mínimo cinco receptores de proteína dife- rentes foram descritos como estando envolvidos em interações levan- do a mortalidade de insetos: uma proteína semelhante a caderina (CADR), uma aminopeptidase-N (APN) ancorada a glicosilfosfatidil- inositol (GPI), uma fosfatase alcalina (ALP) ancorada a GPI, um trans- portador ABC transmembrana, e uma "A Disentegrin And Metallopro- tease" ou metaloprotease ADAM. Além disso, foi proposto que os gli- colipídeos também são importantes moléculas receptoras de Cry em insetos e nematódeos (Pigott et al. (2007) Role of Receptors in Baci- llus thuringiensis Crystal Toxin Activity. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 71(2): 255-281; Ochoa-Campuzano et al. (2007) An ADAM rmetalloprotease is a Cry3Aa Bacillus thuringiensis toxin recep- tor. Biochemical and Biophysical Research Communication, 362(2): 437-442). O fragmento peptídico, FAWPEPBIN se liga ao transporta- dor ABC transmembrana ABCcA4 da falsa medideira (FAW). A inserção da sequência codificante, FAWPEPBIN Bac (SEQ ID NO: 15), codifi- cando o peptídeo FAWPEPBIN (SEQ ID NO: 17) dentro do loop do domínio 2 de TIC7941 aumentou a atividade pesticida contra FAW em determinadas variantes. Especificamente, a inserção de FAWPEPBIN nas posições de aminoácido 805 a 816 em TIC7941 2His resultou em pouca ou nenhuma atividade contra FAW demonstrada, ao passo que a inserção de FAWPEPBIN nas posições de aminoácido 804 a 815 de TIC7941 3His demonstrou atividade contra FAW.
[0093] Uma sequência de DNA sintética codificando o peptídeo FAWPEPBIN, FAWPEPBIN PL, (SEQ ID NO: 16) foi desenhada para expressão em uma célula de planta. FAWPEPBIN PL é encontrada entre as posições de nucleotídeo 2386 e 2421 da sequência codifican- te sintética TIC7941PL 2 e dentro das posições de nucleotídeo 2383 a 2418 da sequência codificante sintética TIC7941PL 3. O fragmento peptídico FAWPEPBIN está localizado dentro das posições de amino- ácido 796 a 807 de TIC7941PL 2 e 795 a 806 de TIC7941PL 3. Plan- tas de milho foram transformadas com vetores binários compreenden- do cassetes de transgenes usados para a expressão de TIC7941PL 2 e TIC7941PL 3. As plantas expressando TIC7941PL 2 e TIC7941 PL 3 vão ser usadas para avaliar a atividade pesticida das toxinas manipuladas contra FAW.
[0094] Métodos de controlar insetos, em particular infestações por Lepidópteros de plantas de colheitas, com as proteínas TIC7941 tam- bém são revelados neste requerimento. Os métodos referidos podem compreender cultivar uma planta compreendendo uma quantidade, inibidora de inseto ou de Lepidópteros, de uma proteína de toxina TIC7941. Em algumas modalidades, os métodos referidos podem compreender adicionalmente qualquer um ou mais de: (i) aplicar qual- quer composição compreendendo ou codificando uma proteína de to- xina TIC7941 a uma planta ou a uma semente que dê origem a uma planta; e (ii) transformar uma planta ou uma célula de planta que dê origem a uma planta com um polinucleotídeo codificando uma proteína de toxina TIC7941. Em geral, é contemplado que uma proteína de to- xina TIC7941 pode ser proporcionada em uma composição, proporcio- nada em um microorganismo, ou proporcionada em uma planta trans- gênica para conferir atividade inibidora de insetos contra insetos Lepi- dópteros.
[0095] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico recombinante de uma proteína de toxina TIC7941 é o ingrediente ativo como pesticida de uma composição inibidora de inseto preparada cul- tivando Bacillus recombinante ou qualquer outra célula bacteriana re-
combinante transformada para express ar uma proteína de toxina TIC7941 sob condições adequadas para expressar a proteína de toxi- na TIC7941. Uma composição semelhante pode ser preparada por dessecação, liofilização, homogenização, extração, filtração, centrifu- gação, sedimentação, ou concentração de uma cultura de semelhan- tes células recombinantes expressando / produzindo o polipeptídeo recombinante referido. Um processo semelhante pode resultar em um extrato celular de Bacillus ou extrato celular bacteriano entomopatogê- nico diverso, suspensão celular, homogenado celular, lisado celular, sobrenadante celular, filtrado celular, ou pélete celular. Obtendo os polipeptídeos recombinantes produzidos deste modo, uma composição que inclui os polipeptídeos recombinantes pode incluir células bacteri- anas, esporlos bacterianas, e corpos de inclusão parasporais e pode ser formulada para vários usos, inclusive como produtos de pulveriza- dores inibidores de insetos agrícolas ou como formulações inibidoras de insetos em bioensaios de dieta.
[0096] Em uma modalidade, de modo a reduzir a probabilidade de desenvolvimento de resistência, uma composição inibidora de inseto compreendendo uma proteína de toxina TIC7941 pode compreender adicionalmente no mínimo um polipeptídeo adicional que apresente atividade inibidora de insetos contra as mesmas espécies de insetos Lepidópteros, mas o qual seja diferente da proteína de toxina TIC7941. Polipeptídeos adicionais possíveis para uma composição semelhante incluem qualquer proteína inibidora de insetos ou molécula de dsRNA inibidora de insetos de conhecimento de uma pessoa regularmente versada na arte. Um exemplo para o uso de semelhantes sequências de ribonucleotídeos para controlar pragas de insetos é descrito em Baum, et al. (Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2006/0021087 A1). O polipeptídeo adicional referido para o controle de pragas de Lepidópteros pode ser selecionado entre o grupo que con-
siste em uma proteína inibidora de insetos, tal como, mas não limitada a, Cry1A (Patente U.S. No. 5.880.275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1AÃe, Cry1B (Publicação de Patente U.S. No. 10/525,318), Cry1C (Patente U.S. No. 6.033.874), Cry1D, Cry1Da e variantes da mesma, Cry1E, Cry1F, e quimeras Cry1A/F (Patentes U.S. Nos. 7.070.982;
6.962.705; e 6.713.063), Cry1G, Cry1H, Cry1l, Cry1J, Cry1K, Cry1L, quimeras tipo Cry1 tais como, mas não limitadas a, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, e TIC1100 (Publicação do Requerimento de Patente Internacional No. WOZ2016/061391 (A2)), TIC2160 (Publicação do Re- querimento de Patente Internacional No. WOZ2016/061392(A2)), Cry2A, Cry2Ab (Patente U.S. No. 7.064.249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-O001, AXMI- 002, AXMI-030, AXMI-035, e AXMI-045 (Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2013-0310543 A1), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2013-0104259 A1), AXMI-134 (Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2013-0167264 A1), AXMI-150 (Publicação do Reque- rimento de Patente U.S. No. 2010-0160231 A1), AXMI-184 (Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209 (Publicação do Requerimento de Pa- tente U.S. No. 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2014-0245491 A1), AXM|-2212z, AXMI-2227z, AXMI-223z, AXMI-224z7, AXMI-225z (Publicação do Re- querimento de Patente U.S. No. 2014-0196175 A1), AXMI|-238 (Publi- cação do Requerimento de Patente U.S. No. 2014-0033363 A1), AX- MI-270 (Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2014- 0223598 A1), AXMI-345 (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2014-0373195 A1), AXMI-335 (Publicação do Requerimento de Patente Internacional No.
WO2013/134523(A2)), DIG-3 (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2013-0219570 A1), DIG-5 (Publi- cação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2010-0317569 A1), DIG- 11 (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2010-0319093 A1), AfIP-1A e derivados da mesma (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2014-0033361 A1), AfIP-1B e derivados da mesma (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (Publicação do Requerimento de Pa- tente U.S.
No. 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (Publicação do Re- querimento de Patente U.S.
No. 2014-0007292 A1), Pput 1063 (Publi- cação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2014-0007292 A1), DIG- 657 (Publicação do Requerimento de Patente Internacional No.
WOZ2015/195594 A2), Pput 1064 (Publicação do Requerimento de Pa- tente U.S.
No. 2014-0007292 A1), GS-135 e derivados da mesma (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2012-0233726 A1), GS153 e derivados da mesma (Publicação do Requerimento de Paten- te U.S.
No. 2012-0192310 A1), GS154 e derivados da mesma (Publi- cação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2012-0192310 AÍ), GS155 e derivados da mesma (Publicação do Requerimento de Paten- te U.S.
No. 2012-0192310 A1), SEQ ID NO: 2 e derivados da mesma conforme descrito na Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2012-0167259 A1, SEQ ID NO: 2 e derivados da mesma conforme descrito na Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2012- 0047606 A1, SEQ ID NO: 2 e derivados da mesma conforme descrito na Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2011-0154536 A1, SEQ ID NO: 2 e derivados da mesma conforme descrito na Publi- cação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2011-0112013 A1, SEQ ID NO: 2 e 4 e derivados da mesma conforme descrito na Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2010-0192256 A1, SEQ ID NO: 2 e derivados da mesma conforme descrito na Publicação do Reque- rimento de Patente U.S. No. 2010-0077507 A1, SEQ ID NO: 2 e deri- vados da mesma conforme descrito na Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2010-0077508 A1, SEQ ID NO: 2 e derivados da mesma conforme descrito na Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2009-0313721 A1, SEQ ID NO: 2 ou 4 e derivados da mesma conforme descrito na Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2010-0269221 A1, SEQ ID NO: 2 e derivados da mesma conforme descrito na Patente U.S. No. 7.772.465 (B2), CF161 0085 e derivados da mesma conforme descrito na Publicação do Requerimento de Pa- tente Internacional No. WO2014/008054 A2, proteínas tóxicas de Le- pidópteros e seus derivados conforme descrito nas Publicações dos Requerimentos de Patente U.S. Nos. US2008-0172762 A1, US2011- 0055968 A1, e US2012-0117690 A1; SEQ ID NO: 2 e derivados da mesma conforme descrito na US7510878(B2), SEQ ID NO: 2 e deriva- dos da mesma conforme descrito na Patente U.S. No. 7812129(B1), DIG-911 e DIG-180 conforme descrito na Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. No. 2015-0264940A1; e semelhantes.
[0097] Em outras modalidades, a referida composição / formulação pode compreender adicionalmente no mínimo um polipeptídeo adicio- nal que apresente atividade inibidora de insetos para um inseto que não seja inibido por uma proteína inibidora de insetos de outro modo da presente invenção de modo a expandir o espectro de inibição de insetos obtido. Por exemplo, para o controle de pragas por Hemípte- ros, as combinações de proteínas inibidoras de insetos da presente invenção podem ser usadas com proteínas ativas contra Hemípteros tais como TIC1415 (Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2013-0097735 A1), TIC807 (Patente U.S. No. 8609936), TIC834 (Pu- blicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2013-0269060 AÍ),
AXMI-036 (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2010- 0137216 A1), e AXMI-171 (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2013-0055469 A1). Adicionalmente, um polipeptídeo apra o controle de pragas por Coleópteros pode ser selecionado entre o gru- po que consiste em uma proteína inibidora de insetos, tal como, mas não limitada a, Cry3Bb (Patente U.S.
No. 6.501.009), variantes de Cry1C, variantes de Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2013-0167264 A1) AXMI-184 (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2010- 0004176 A1), AXMI-205 (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2014-0298538 A1), AXMI-207 (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220 (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 20140245491A1), AXM|-2212z, AXMI-223z (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2014- 0196175 A1), AXMI-279 (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2014-0223599 A1), AXMI-R1 e variantes da mesma (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (Publica- ção do Requerimento de Patente U.S.
No. 2010-0319092 A1), eHIPs (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2010/0017914), IP3 e variantes da mesma (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2012-0210462 A1), PHl-4 variantes (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2016-0281105 A1), variantes de PIP-72 (Publica- ção do Requerimento de Patente Internacional No.
WO 2016-144688 A1), variantes de PIP-45, variantes de PIP-64, variantes de PIP-74, variantes de PIP-75, e variantes de PIP-77 (Publicação do Requeri- mento de Patente Internacional No.
WO 2016-144686 A1), DIG-305 (WO 2016109214 A1), PIP-47 variantes (Publicação do Requerimento de Patente U.S.
No. 2016-0186204 A1), DIG-17, DIG-90, DIG-79 (Pu- blicação do Requerimento de Patente Internacional No.
WO 2016-
057123 A1), DIG-303 (WO 2016-070079 A1), e -Hexatoxina-Hv1a (Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. US2014-0366227 AI).
[0098] Polipeptídeos adicionais para o controle de pragas de insetos Coleópteros, Lepidópteros, e Hemípteros podem ser encontrados no website de nomenclatura de toxinas de Bacillus thuringiensis mantido por Neil Crickmore (acessível na Internet em www.btnomenclature.info).
[0099] A possibilidade dos insetos desenvolverem resistência a determinados inseticidas tem sido documentada na arte. Uma estraté- gia de manejo da resistência do inseto é empregar colheitas transgêni- cas que expressem dois agentes inibidores de inseto distintos que operem através de modos de ação diferentes. Portanto, quaisquer in- setos com resistência a qualquer um dos agentes inibidores de inseto podem ser controlados pelo outro agente inibidor de inseto. Outra es- tratégia de manejo da resistência do inseto emprega o uso de plantas que não são protegidas para as espécies de pragas de Lepidópteros visadas, para proporcionar um refúgio para as plantas não protegidas referidas. Um exemplo particular [e descrito na Patente U.S. No.
6.551.962, a qual é incorporada por meio de referência em sua totali- dade.
[00100] Outras modalidades, tais como produtos químicos pestici- das aplicados topicamente que são desenhados para controlar pragas que também são controladas pelas proteínas reveladas aqui, neste requerimento de patente, a serem usados com proteínas em tratamen- tos de sementes, pulverização, gotejamento, ou formulações de limpe- za podem ser aplicados diretamente no solo (uma rega do solo), apli- cados a plantas em crescimento expressando as proteínas reveladas aqui, neste requerimento de patente, ou formulados para serem apli- cados a semente contendo um ou mais transgenes codificando uma ou mais das proteínas reveladas. As formulações referidas para uso em tratamentos de sementes podem ser aplicadas com vários adesi- vos e agentes aderentes conhecidos na arte. As formulações referidas podem conter pesticidas que são sinérgicos no modo de ação com as proteínas reveladas, de modo que os pesticidas das formulações agem através de um modo de ação diferente para controlar as mes- mas pragas ou pragas similares que podem ser controladas pelas pro- teínas reveladas, ou que os pesticidas referidos agem controlando pragas dentro de uma gama mais ampla de hospedeiros ou espécies de pragas de plantas que não são controladas de modo eficaz pelas proteínas pesticidas TIC7941 .
[00101] A composição / formulação acima mencionada pode com- preender adicionalmente um veículo agricolamente aceitável, tal como uma isca, um pó, poeira, pélete, grânulo, spray, emulsão, uma sus- pensão coloidal, uma solução aquosa, uma preparação de cristais / esporos de Bacillus, um tratamento de sementes, uma célula de planta recombinante / tecido de planta / semente / planta transformada para expressar uma ou mais das proteínas, ou bactéria transformada para expressar uma ou mais das proteínas. Dependendo do nível de inibi- ção de inseto ou inibição pesticida inerente no polipeptídeo recombi- nante e do nível da formulação a ser aplicada a uma planta ou ensaio de dieta, a composição / formulação pode incluir várias quantidades por peso do polipeptídeo recombinante, por exemplo, a partir de 0,0001% a 0,001% a 0,01% a 1% a 99% por peso do polipeptídeo re- combinante.
[00102] Esta divulgação também contempla composições e méto- dos para reduzir a expressão de uma proteína pesticida nos tecidos reprodutivos de uma planta transgênica através do uso de microRNAs (MIRNAs). miRNAs são componentes essenciais do mecanismo de silenciamento genético em plantas. Em plantas, a produção de miR- NAs é um processo específico do tecido, é firmemente associado com transcrição e emenda, e varia mesmo entre precursores de miRNA. Codificados pelo DNA nuclear nas plantas, os miRNAs funcionam através de pareamento de bases com sequências complementares dentro das moléculas de mRNA (Achkar et al. (2016) miRNA Biogene- sis: A Dynamic Pathway, Trends in Plant Science. 21(12): 1034-1044). Os miRNAs são produzidos a partir de um transcripto de miRNA primá- rio (pri-miRNA). Os pri-miRNAs nascentes são tampados na extremi- dade 5 e poliadenilados na extremidade 3”, e pri-miRNAs contendo Íntrons são emendados ou emendados alternativamente. Os pri- MIRNAs são processados pelo complexo de dicing, o qual contém a RNase nuclear DICER-LIKE 1 (DCL1) e suas proteínas acessórias SERRATE (SE) e HYPONASTIC LEAVES (HYL1) como componentes principais, para produzir dúplices miRNA/MIRNA* maduros de vinte e um (21) nucleotídeos. O dúplex de miRNA/MIRNA* é estabilizado através de 2'-O-metilação do 3-terminal por HUA ENAHANCER 1 (HEN1). HEN1 também contribui para exportar o dúplex miRNA/MIRNA* do núcleo ce- lular e montagem do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Durante o carregamento do de RICS, uma cadeia do dúplex de RNA pequeno é selecionada como a cadeia guia e incorporada na ARGONAUTE 1 (AGO1) para formar um RISC funcional, ao passo que a outra cadeia (a cadeia passageira) é removida e degradada. O car- regamento de miRNAs para proteínas AGO é afetado pelas protube- râncias nos dúplices de miRNA/MIRNA* causadas por incompatibilida- des de pares de bases. AGO1 prefere dúplices com incompatibilidades centrais (Yu et al. (2017) The "how" and "where" of plant microRNAs. New Phytologist, 216: 1002-1017).
[00103] Os miRNAs das plantas regulam genes alvo no nível pós- transcricional através de dois mecanismos principais: clivagem de transcripto e repressão da translação. Nas plantas, a repressão da translação é observada menos frequentemente do que a clivagem de transcripto. Ocorre clivagem de RNA guiada por miRNA em uma posi- ção precisa do MRNA alvo. A clivagem é realizada pelo domínio PIWI das proteínas AGO, o qual forma uma dobra semelhante a H RNase e apresenta atividade de endonuclease. Os fragmentos da clivagem 5º e 3” são em seguida degradados por exonucleases. Fatores conhecidos requeridos para inibição da translação mediada por miRNA incluem a enzima de corte de microtúbulos KATANIN 1 (KTN1), o componente do corpo de processamento (corpo P) de VARICOSE (VCS), a proteí- na de repetição-GW SUO, e a proteína da membrana ER ALTERED MERISTEM PROGRAM 1 (AMP1). Mutações nestes genes interferem seletivamente com repressão guiada por miRNA no nível da proteína, sugerindo que clivagem de transcripto e repressão da translação são dois modos de ação independentes. O mecanismo molecular subja- cente à repressão da translação mediada por miRNA não está bem entendido. Análise in vitro sugere que os miRNAs das plantas podem inibir a iniciação da translação ou impedir o movimento dos ribosso- mas (Yu et al. (2017) The "how" and "where" of plant microRNAs. New Phytologist, 216: 1002-1017).
[00104] Além de clivagem de mRNA e repressão da translação, al- guns miRNAs também acionam a produção de RNAs interferentes cur- tos secundários (siRNAs) a partir de seus transcriptos, e isto é um fe- nômeno disseminado e conservado em plantas (Yu et al. (2017) The "how" and "where" of plant microRNAs. New Phytologist, 216: 1002- 1017). Os miRNAs que acionam tipicamente a produção destes siR- NAs secundários têm vinte e dois (22) nucleotídeos de comprimento, em oposição aos miRNAs de vinte e um (21) nucleotídeos descritos acima. O RNA visado é convertido RNA de cadeia dupla (dsRNA) por RNA polimerase RNA-dependente (RdRp), a qual é em seguida cliva- da em siRNAs por DCL nucleases. Tipicamente, uma cadeia do dúplex preferencialmente se associa com uma proteína AGO para formar um complexo efetor (complexo de silenciamento induzido por RNA, ou RISC), que visa e silencia transcriptos com base na complementarida- de de sequência. Em Arabidopsis, depois de clivagem de RNA, guiada por miRNA mediada por AGO1, do RNA alvo, ou o fragmento de cliva- gem 5 ou 3 é estabilizado por SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3 (SGS3), o qual se associa com RISC por reconhecimento de carac- terísticas do dúplex de miRNA de vinte e dois (22) nucleotídeos /alvo para proteger a clivagem. A RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 6 (RDR6) é recrutada para converter o fragmento da clivagem em dsR- NA, o qual é posteriormente cortado em siRNAs em um fragmento de degradação de intervalo vinte e um (21) nucleotídeos. Em plantas, es- te processo pode ser amplificado através da produção de siRNAs se- cundários depois de transcrição por RNA polimerase RNA-dependente (RAdRp) sobre o RNA alvo primário. (Cuperus et al., (2010) Unique Functionality of 22 nt miRNAs in Triggering RDR6-Dependent siRNA Biogenesis from Target Transcripts in Arabidopsis. Nat Struct Mol Biol, 17(8): 997-1003; Chen et al., (2010) 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in Plants. Proceedings of the National Academy of Sciences, 107: 15269-15274; Yu et al. (2017) The "how" and "where" of plant microRNAs. New Phytologist, 216: 1002-1017).
[00105] — Através de mineiração de dados de miRNAs em vários teci- dos em soja, foram identificados dois miRNAs que foram super- representados em tecidos reprodutivos quando comparados com teci- dos vegetativos; miR395 e miR4392. miR395 é processado dentro de um dúplex de miRNA/MIRNA* de vinte e um (21) nucleotídeos e é ex- presso principalmente no estame da flor da soja. miR4392 é processa- do dentro de um dúplex de miRNA/MIRNA* de vinte e dois (22) nucleo- tídeos e desencadeia a produção de siRNAs secundários a partir de seus transcriptos, amplificando o sinal de supressão. miR4392 é alta- mente enriquecido nas anteras das flores da soja. Ligados com uma proteína ARGO para formar um complexo de silenciamento, os miR- NAs funcionam como guias específicos da sequência, direcionando o complexo de silenciamento para os transcriptos através de pareamen- to de bases entre o miRNA e sítios complementares aqui, neste reque- rimento de patente, referidos como "sítios alvo de ligação de miRNA", dentro da região não traduzida 3 (3” UTR) dos RNAs alvo. Os sítios alvo de ligação de miRNA correspondentes a miR395 (Gm.miR395 1 (SEQ ID NO: 18) e Gm.miR395 2 (SEQ ID NO: 19)) e miR4392 (Gm.miR4392 1 (SEQ ID NO: 21) e Gm.miR4392 2 (SEQ ID NO: 22)) foram ligados operacionalmente usando um espaçador de DNA (SP- ART.8a-1, SEQ ID NO: 24) para construir SUP-miR395 (SEQ ID NO: 20) e SUP-miR4392 (SEQ ID NO: 23), respectivamente. SUP-miR395 e SUP-miR4392 foram por sua vez ligados operacionalmente à se- quência codificante TIC7941PL 1 3º depois do códon de parada pro- duzindo os transgenes, TIC7941PL 1-miR395 (SEQ ID NO: 25) e TIC7941PL 1-miR4392 (SEQ ID NO: 26), respectivamente. A expres- são de TIC7941PL 1-miR395 e TIC7941PL 1-miR4392 não teve ne- nhum efeito sobre a atividade pesticida de TIC7941PL 1. Tanto TIC7941PL 1-miR395 quanto TIC7941PL 1-miR4392 demonstraram atividade pesticida similar contra a lagarta das folhas (SAW, Spodopte- ra eridania), contra a falsa medideira da soja (SBL, Chrysodeixis inclu- dens), e contra o verme da vagem da soja (SPW, Helicoverpa zea) em comparação com TIC7941PL 1 em ensaio de disco de folha. A ligação operacionalmente dos sítios alvo miR395 e miR4392 à sequência codi- ficante TIC7941PL 1 se destina a reduzir as expressão da proteína pesticida TIC7941PL 1 nos tecidos reprodutivos de soja transgênica expressando TIC7941PL 1-miR395 ou TIC7941PL 1-miR4392.
[00106] Em vista do precedente, os peritos na arte vão reconhecer que podem ser feitas modificações nos aspectos específicos, os quais são revelados e ainda obter um resultado semelhante ou similar sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção. Portanto, detalhes es- pecíficos estruturais e funcionais revelados aqui, neste requerimento de patente, não devem ser interpretados como limitantes. Deve ser entendido que toda a divulgação de cada referência citada aqui, neste requerimento de patente, é incorporada dentro da divulgação deste requerimento.
EXEMPLOS Exemplo 1 Descoberta, clonagem, e expressão de TIC7941
[00107] Uma sequência codificando uma nova proteína pesticida de Paenibacillus lentimorbus foi identificada, clonada, confirmada a se- quência, e testada em bioensaio de insetos. A proteína pesticida, TIC7941 isolada a partir da espécie de Paenibacillus lentimorbus DSC020651, representa uma nova proteína semelhante a Vip3C. Se- quências relacionadas distantes de TIC7941 são Vip3Ca1 (em 72,43% de identidade, o corresondente mais próximo conhecido), Vip3Aa1 (64,45% de identidade), e uma proteína semelhante a Vip3B (59% de identidade).
[00108] Uma cópia de comprimento total da região codificante para TIC7941 e uma versão de TIC7941 com etiqueta de His (TIC7941 His) foram sintetizadas por métodos conhecidos na arte e compreendem os códons de iniciação e de terminação translacional de cada sequência codificante. A sequência codificante TIC7941 foi clonada usando mé- todos conhecidos na arte dentro de um vetor de expressão de Bt em li- gação operável com um promotor expressível em Bt. O vetor expressão de Bt compreendia um promotor que está ligado durante o estágio de esporulação do bacilo. Além disso, a sequência codificante TIC7941 His foi clonada dentro de um vetor usado para expressão de proteína em Escherichia coli (E. coli). Para isolamento das proteínas expressas em E. coli, uma etiqueta de Histidina foi ligada operacionalmente às se-
quências codificantes expressas para facilitar purificação de coluna da proteína. As sequências codificantes e suas sequências de proteína respectivas usadas para expressão bacteriana são apresentadas na Tabela 2. Tabela 2. Sequências de toxina codificantes e sequências de pro- teína correspondentes usadas para expressão em Bt e E. coli. [res meimessainho: SEIDNO: |peusto sacas Toxina ficante SEQ ID NO: SEQ ID NO: | pressão Bacteriana FRA Re Exemplo 2 TIC7941 demonstra atividade de Lepidópteroe em bioensaio de insetos
[00109] A proteína pesticida TIC7941 foi expressa em Bt e E. colie avaliada para toxicidade para várias espécies de Lepidópteros, Coleópte- ros, Hemípteros, e Dípteros. Preparações de TIC7941 e TIC7941 His tanto de Bt quanto de E. coli, foram avaliadas contra as espécies de Lepidópteros lagarta rosca (BCW, Agrotis ipsilon), lagarta da espiga de milho (CEW, também conhecida como verme da vagem da soja (SPW), Helicoverpa zea), lagarta europeia do milho (ECB, Ostrinia nu- bilalis), falsa medideira (FAW, Spodoptera frugiperda), lagarta das fo- lhas (SAW, Spodoptera eridania), falsa medideira da soja (SBL, Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (SWCB, Diatraea grandiosella), lagarta do botão do tabaco (TBW, Heliothis virescens), e lagarta do feijão-veludo (VBW, Anticarsia gemmatalis); as espécies de Coleópteros besouro da batata do Colorado (CPB, Leptinotarsa de- cemlineata), e verme da raiz do milho ocidental (WCB, Diabrotica virgi- fera virgifera); e as espécies de Hemípteros inseto de planta mancha- da (TPB, Lygus lineolaris) e inseto de planta manchada do oeste (WTP, Lygus hesperus); e a espécie de Dípteros Mosquito da Febre Amarela (YFM, Aedes aegypti).
[00110] De modo a produzir TIC7941 em hospedeiros de Bt, uma cepa de Bt expressando TIC7941 foi cultivada por vinte e quatro (24) horas e em seguida a cultura foi adicionada à dieta do inseto. A morta- lidade e a atrofia foram avaliadas comparando o crescimento e o de- senvolvimento dos insetos em uma dieta com uma cultura da cepa de Bt expressando TIC7941 a insetos em uma dieta com uma cultura de controle não tratada.
[00111] A cepa de E. coli expressando TIC7941 His foi tratada em uma maneira similar à cepa de Bt e foi proporcionada em uma dieta de inseto depois de purificação de proteína e comparada com o cresci- mento e o desenvolvimento de insetos em uma dieta com uma cultura de controle não tratada. TIC7941 demonstrou atividade pesticida con- tra as espécies de pragas de insetos Lepidópteros lagarta rosca, lagar- ta da espiga de milho, lagarta europeia do milho, lagarta das folhas, falsa medideira da soja e broca do milho do sudoeste. A atividade foi particularmente elevada contra falsa medideira da soja. Exemplo 3 Análise da atividade de TIC7941PL 1 contra pragas de Lepidópte- ros em plantas de milho transformadas de maneira estável
[00112] Um vetor de transformação de planta binário compreen- dendo um cassete de transgene desenhado para expressar proteína pesticida TIC7941PL 1 não direcionada foi clonado usando métodos conhecidos na arte. O vetor resultante foi usado para transformar de modo estável plantas de milho. Os tecidos foram colhidos dos trans- formantes e usados em bioensaio de insetos contra várias pragas de insetos Lepidópteros.
[00113] Uma sequência codificante sintética foi construída para uso em expressão da TIC7941 em plantas, clonada dentro de um vetor de transformação de planta binário, e usada para transformar células de plantas de milho. A sequência sintética foi sintetizada, de acordo com métodos descritos de modo geral na Patente U.S. No. 5.500.365, para evitar algumas sequências de problema contrário, tais como sequên- cias de poliadenilação de plantas ricas em ATTTA e A/T ao mesmo tempo que preservando a sequência de aminoácidos da proteína de Paenibacillus nativa. A sequência codificante sintética (SEQ ID NO: 3) codifica uma proteína TIC7941PL 1 (SEQ ID NO: 4), a qual compre- ende um redísuo de alanina adicional imediatamente depois da metio- nina de iniciação em relação à proteína TIC7941. O vetor de transfor- mação de planta resultante compreendia um primeiro cassete de transgene para expressão da proteína pesticida TIC7941PL 1, o qual compreendia um promotor constitutivo, ligado operacionalmente 5 a uma sequência lider, ligado operacionalmente 5º a um íntron, ligado operacionalmente 5 à sequência codificante sintética codificando uma proteína TIC7941PL 1 não direcionada (SEQ ID NO: 4), a qual foi por Sua vez ligada operacionalmente 5º a uma UTR 3; e um segundo cas- sete de transgene para a seleção de células de plantas transformadas usando seleção de glifosato.
[00114] Células de plantas de milho foram transformadas com o ve- tor de transformação binário conforme descrito acima usando um mé- todo de transformação mediada por Agrobacterium. As células trans- formadas foram induzidas para formar plantas por métodos conheci- dos na arte. Foram realizados bioensaios usando discos de folha de planta análogos aos descritos na Patente U.S. No. 8.344.207. Uma única larva neonatal recém-eclodida com menos de um dia de idade foi colocada sobre cada amostra de disco de folha e deixada para se alimentar por aproximadamente quatro dias. Uma planta de milho não transformada foi usada para obter tecido a ser usado como um tecido a ser usado como um controle negativo. Múltiplos eventos de inserção de cópia única Ro de transformação de cada vetor binário foram avali- ados contra BOW, CEW, FAW, e SWCB.
[00115] Doze eventos Ro transformados foram avaliados usando discos de folha de planta. Uma classificação de danos à folha (LDR) de um, três, ou quatro foi dada para cada evento para cada espécie de praga de inseto avaliada. Uma LDR de um (1) é equivalente a menos de ou igual a trinta por cento de dano. Uma LDR de três (3) é equiva- lente a trinta por cento a menos de ou igual a cinquenta por cento de dano. Uma LDR de quatro (4) é equivalente a mais de cinquenta por cento de dano. As classificações de LDR para cada evento e cada es- pécie de praga de inseto são apresentadas na Tabela 3. Tabela 3. Classificações de danos à folha (LDR) para eventos Ro de milho transformado expressando TIC7941PL 1. geo — sw om Trav Temos
[00116] Conforme pode ser visto na Tabela 3, sete dos doze even- tos Ro transformados avaliados demonstraram resistência a BOW e CEW. Três dos sete eventos também demonstraram resistência a SWCB.
[00117] Os eventos um a seis foram selecionados para análise na geração F1. A Tabela 4 mostra as pontuações de LDR para cada um dos seis eventos avaliados contra as quatro espécies de pragas de insetos. Tabela 4. Classificações de danos à folha (LDR) para eventos F1 de milho transformado expressando TIC7941PL 1. [sem sem Tam ram smos
[00118] Conforme pode ser visto na Tabela 4, todos os seis eventos demonstraram resistência contra BOW, cinco dos seis eventos de- monstraram resistência contra CEW, e dois dos seis eventos demons- traram resistência contra SWCB. Plantas de milho transformadas de modo estável com um cassete de transgene para a expressão de TIC7941 demonstra resistência a espécies de pragas de Lepidópteros tais como BCW, CEW, e SWCB. Exemplo 4 Ensaio da atividade de TIC7941PL 1 contra pragas de Lepidópte- ros em plantas de soja transformadas de maneira estável
[00119] Vetores de transformação de planta binários compreenden- do cassetes de transgenes desenhados para expressar proteína pesti- cida TIC7941PL 1 não direcionada foram clonados usando métodos conhecidos na arte. Os vetores resultantes foram usados para trans- formar de modo estável plantas de soja. Os tecidos foram colhidos dos transformantes e usados em bioensaio de insetos contra várias pragas de insetos Lepidópteros.
[00120] A sequência codificante TIC7941PL 1 sintética desenhada para expressão em planta conforme descrito no Exemplo 3 foi clonada dentro de vetores de transformação de planta binários, e usada para transformar células de plantas de soja. Os vetores binários compreen- dendo uma sequência codificante TIC7941PL 1 não direcionada foram construídos usando métodos conhecidos na arte. Os vetores de trans- formação de plantas resultantes compreendiam um primeiro cassete de transgene para expressão da proteína pesticida TIC7941PL 1 a qual compreendia um promotor expressível de planta, operacional- mente ligado 5º a uma sequência lider, operacionalmente ligada 5º a uma sequência codificante sintética codificando uma proteína TIC7941PL 1 não direcionada (SEQ ID NO: 4), a qual foi por sua vez ligada operacionalmente 5' a uma UTR 3” e; um segundo cassete de transgene para a seleção de células de plantas transformadas usando seleção de espectinomicina. Quatro (4) vetores de transformação biná- rios foram construídos conforme descrito acima. Cada constructo compreendia um cassete de expressão TIC7941PL 1 compreendendo diferentes promotores e 3' UTRs.
[00121] As células de soja transformada foram induzidas para for- mar plantas por métodos conhecidos na arte. Foram realizados bioen- saios usando discos de folha de planta análogos aos descritos na Pa- tente U.S. No. 8.344.207. Uma planta de soja não transformada foi usada para obter tecido a ser usado como um controle negativo. Múlti- plos eventos de transformação de cada vetor binário foram avaliados contra SAW, SBL, SPW, e VBW.
[00122] Eventos Ro, derivados de transformações usando os quatro diferentes constructos binários, foram avaliados usando discos de fo- lha de planta. Uma classificação de dano da folha (LDR) de um a qua- tro foi dada para cada evento para cada espécie de praga de inseto avaliada. Uma LDR de um (1) é equivalente a inferior ou iqual a vinte por cento de dano. Uma LDR de dois (2) é equivalente a vinte por cen- to ou inferior ou igual a trinta e cinco por cento de dano. Uma LDR de três (3) é equivalente a trinta e cinco por cento a inferior ou igual a se- tenta por cento de dano. Uma LDR de quatro (4) é equivalente a acima de setenta por cento de dano. As pontuações de LDR para cada cons- tructo e cada espécie de praga de inseto são apresentadas na Tabela
5. O número de eventos demonstrando a pontuação de LDR (observa- da) em relação à série de eventos avaliados também é proporcionado. Alta penetrância do traço de resistência é definida como uma pontua- ção de LDR de um (1) em que mais de cinquenta por cento (50%) dos eventos demonstram uma LDR de um (1). Tabela 5. Classificações de danos à folha (LDR) e penetrância pa- ra eventos Ro de soja transformada expressando TIC7941PL 1. [constato fam — ss Tem ves
[00123] “Conforme pode ser visto na Tabela 5, eventos de soja Ro expressando TIC7941PL 1 transformada com cada um dos quatro (4) constructos demonstraram alta resistência com alta penetrância para SAW, SBL, e SPW. Plantas de soja transformadas de modo estável expressando TIC7941PL 1 demonstram resistência a espécies de pragas de Lepidópteros, e são altamente eficazes contra SAW, SBL, e SPW. Exemplo 5 Análise da atividade de TIC7941PL 1 contra pragas de Lepidópte- ros em plantas de algodão transformadas de maneira estável
[00124] Vetores de transformação de planta binários compreenden-
do cassetes de transgenes desenhados para expressar tanto proteína pesticida TIC7941PL 1 direcionada para plastídeo quanto não direcio- nada são clonados usando métodos conhecidos na arte. Os vetores resultantes são usados para transformar de modo estável plantas de algodão. Os tecidos são colhidos dos transformantes e usados em bi- oensaio de insetos contra várias pragas de insetos Lepidópteros.
[00125] A sequência codificante sintética desenhada para expres- são em planta conforme descrito no Exemplo 3 é clonada dentro de vetores de transformação de planta binários, e usada para transformar células de plantas de algodão. Vetores binários compreendendo se- quências codificantes TIC7941PL 1 direcionadas e não direcionadas para plastídeos são construídos usando métodos conhecidos na arte. Os vetores de transformação de planta resultantes compreendem um primeiro cassete de transgene para expressão da proteína pesticida TIC7941PL 1, o qual compreende um promotor constitutivo, ligado operacionalmente 5“ a uma sequência lider, ligado operacionalmente 5º a uma sequência codificante sintética codificando uma proteína TIC7941PL 1 direcionada e não direcionada para plastídeo, a qual é por sua vez ligada operacionalmente 5 a uma UTR 3 e; um segundo cassete de transgene para a seleção de células de plantas transfor- madas usando seleção de espectinomicina.
[00126] As células de algodão transformadas são induzidas para formar plantas por métodos conhecidos na arte. São realizados bioen- saios usando discos de folha de planta análogos aos descritosn a Pa- tente U.S. No. 8.344.207. Uma planta de algodão não transformada é usada para obter tecido a ser usado como um controle negativo. Múlti- plos eventos de transformação de cada vetor binário são avaliados contra CBW, FAW, SBL, e TBW, bem como qualquer outra espécie de praga de inseto Lepidóptero que se saiba que provoque dano agronô- mico para as colheitas de algodão.
[00127] Além de discos de folha, outros tecidos também podem ser usados para avaliar a resistência conferida pela expressão de proteína de toxina TIC7941PL 1 em plantas de algodão transgênicas, tais co- mo quadrados e cápsulas. As pontuações das classificações de dano são aplicadas a cada amostra correspondente a cada praga de inseto e comparadas com controles negativos para determinar se a expres- são de TIC7941PL 1 proporciona resistência a uma espécie de praga de inseto em particular. Exemplo 6 Melhorando a atividade pesticida de TIC7941 contra a falsa medi- deira
[00128] Este exemplo ilustra a melhora da atividade pesticida de TIC7941 contra a falsa medideira através da inserção de um peptídeo de ligação ao transportador ABC transmembrana FAW (ABCcA4) dentro da sequência de proteína TIC7941.
[00129] O fragmento peptídico FAWPEPBIN (apresentado como a SEQ ID NO: 17) se liga ao transportador ABC transmembrana FAW ABCc4. FAWPEPBIN Bac (SEQ ID NO: 15) é uma sequência codifi- cante sintética codificando FAWPEPBIN (SEQ ID NO: 17) para ex- pressão do peptídeo FAWPEPBIN em bactérias.
[00130] Proteínas TIC7941 com His-tag manipuladas com o Peptí- deo FAWPEPBIN inserido dentro de diferentes posições no loop do domínio 2 da proteína foram comparadas em bioensaio de insetos. À sequência codificante TIC7941 2His (SEQ ID NO: 7) codifica a proteí- na pesticida TIC7941 2His (SEQ ID NO: 8). A sequência codificante TIC7941 3His (SEQ ID NO: 9) codifica a proteína pesticida TIC 7941 3His (SEQ ID NO: 10). A sequência codificante sintética FAW- PEPBIN Bac é encontrada dentro das posições de nucleotídeo 2413 a 2448 de TIC7941 2His e dentro das posições 2410 a 2445 de TIC7941 3His. A sequência do peptídeo FAWPEPBIN está localizada nas posições de aminoácido 805 a 816 de TIC7941 2His e nas posi- ções de aminoácido 804 a 815 de TIC7941 3His.
[00131] A atividade pesticida das proteínas pesticidas TIC7941 His, TIC7941 2His, e TIC7941 3His foi avaliada contra FAW. Tanto TIC7941 His quanto TIC7941 2His demonstraram pouca ou nenhuma atividade contra FAW. No entanto, TIC7941 3His demonstrou ativida- de pesticida aprimorada contra FAW. Portanto, a inserção da sequên- cia codificante sintética FAWPEPBIN Bac nas posições de aminoáci- do 804 a 815 de TIC7941 3His melhorou a atividade pesticida da pro- teína TIC7941 contra FAW. Exemplo 7 Análise da atividade de TIC7941PL 2 e TIC7941PL 3 contra a fal- sa medideira em plantas de milho transformadas de maneira es- tável
[00132] Vetores de transformação de planta binários compreenden- do cassetes de transgenes desenhados para expressar as proteínas pesticidas TIC7941PL 2 e TIC7941PL 3 são clonados usando méto- dos conhecidos na arte. Os vetores resultantes são usados para trans- formar de modo estável plantas de milho. Os tecidos são colhidos dos transformantes e usados em bioensaio de insetos contra FAW e outras pragas de insetos Lepidópteros.
[00133] Vetores de transformação de planta binários são construí- dos conforme previamente descrito no Exemplo 3. Os vetores binários compreendem um cassete de transgene usado para expressar TIC 7941PL 2 ou TIC7941PL 3. TIC7941PL 2 e TIC7941PL 3 compre- endem o peptídeo de ligação ao receptor ABCc4, FAWPEPBIN. Uma sequência de DNA sintética (FAWPEPBIN PL, SEQ ID NO: 16) usada para expressão em uma célula de planta e codificando o peptídeo de ligação à ABCcA4 do transportador ABC transmembrana da falsa medi- deira, FAWPEPBIN, é inserida dentro da proteína de toxina TIC
7941PL 1. O fragmento de DNA codificando FAWPEPBIN PL é en- contrado dentro das posições de nucleotídeo 2386 a 2421 de TIC 7941PL 2 e dentro de 2383-2418 de TIC7941PL 3. O fragmento de peptídeo FAWPEPBIN está localizado nas posições de aminoácido 796 a 807 de TIC7941PL 2 e 795 a 806 de TIC7941PL 3.
[00134] Células de plantas de milho são transformadas com os ve- tores de transformação binários conforme descrito acima usando um método de transformação mediado por Agrobacterium. As células transformadas são induzidas para formar plantas por métodos conhe- cidos na arte. São realizados bioensaios usando discos de folhas de planta análogos aos descritos na Patente U.S. No. 8.344.207. Uma planta de milho não transformada foi usada para o obter tecido a ser usado como um controle negativo. Múltiplos eventos de inserção de cpopia única Ro de transformação de cada vetor binário são avaliados contra FAW e comparados com TIC7941PL 1 para determinar se a inserção do peptídeo FAWPEPBIN aumenta a atividade inseticida de TIC7941PL 1 contra FAW. Exemplo 8 Redução da expressão de TIC7941PL 1 no tecido reprodutivo de plantas de soja transformadas de modo estável através do uso de sítios alvo de miRNA
[00135] Este exemplo ilustra a redução da expressão de TIC7941 PL 1 nos tecidos reprodutivos de plantas de soja transformadas de modo estável através do uso de sítios de reconhecimento de miRNA ligado operacionalmente.
[00136] Os miRNAs das plantas regulam genes alvo no nível pós- transcricional através de dois mecanismos principais: clivagem de transcripto e repressão da translação. Além disso, alguns miRNAs também acionam a produção de RNAs interferentes curtos secundá- rios (sSiRNAs) a partir de seus transcriptos, amplificando o efeito do
MIiRNA sobre a expressão. Os miRNAs geralmente têm vinte e um (21) nucleotídeos de comprimento, mas os que acionam a produção de SIRNAs secundários, têm vinte e dois (22) nucleotídeos de comprimen- to. Através de mineração de dados de miRNAs em vários tecidos em soja, foram identificados dois miRNAs que estavam super-representa- dos tem tecidos reprodutivos, comparados com tecidos vegetativos; miR395 e miR4392. miR395 é processado em um dúplex de miR- NA/MIRNA* de vinte e um (21) nucleotídeos e é expresso principal- mente no estame da flor da soja. miR4392 é processado dentro de um dúplex de miRNA/MIRNA* de vinte e dois (22) nucleotídeos e desen- cadeia a produção de siRNAs secundários a partir de seus transcrip- tos, amplificando o sinal de supressão. miR4392 é altamente enrique- cido nas anteras das flores da soja. Ligados com uma proteína ARGO para formar um complexo de silenciamento, os miRNAs funcionam como guias específicos da sequência, direcionando o complexo de si- lenciamento para os transcriptos através de pareamento de bases en- tre o mMIRNA e os sítios alvo de ligação de miRNA dentro da região não traduzida 3 (3' UTR) dos RNAs alvo.
[00137] Os sítios alvo correspondentes a miR395 (Gm.miR395 1 (SEQ ID NO: 18) e Gm.miR395 2 (SEQ ID NO: 19)) foram ligados operacionalmente usando o espaçador de DNA (SP-ART.8a-1, SEQ ID NO: 24) para construir SUP-miR395 (SEQ ID NO: 20). Sítios alvo cor- respondentes a miR4392 (Gm.miR4392 1 (SEQ ID NO: 21) e Gm.miR4392 2 (SEQ ID NO: 22)) foram ligados operacionalmente usando o espaçador de DNA (SP-ART.8a-1, SEQ ID NO: 24) para construir SUP-miR4392 (SEQ ID NO: 23). SUP-miR395 e SUP- miR4392 foram ligado operacionalmente à sequência codificante TIC7941PL 1 3º depois do códon de parada produzindo os transge- nes, TIC7941PL 1-miR395 (SEQ ID NO: 25) e TIC7941PL 1-miR4392 (SEQ ID NO: 26), respectivamente.
[00138] Vetores de transformação de planta binários compreenden- do cassetes de transgenes desenhados para expressar TIC7941PL 1- miR395 e TIC7941PL 1-miR4392 não direcionados foram construídos usando métodos conhecidos na arte e foram similares aos descritos no Exemplo 4. Dois constructos foram construídos usando os mesmos elementos promotores, líderes e 3' UTR que o Constructo 3 no Exem- plo 4 e compreendiam as sequências de DNA TIC7941PL 1-miR395 e TIC7941PL 1-miR4392. Múltiplos eventos de transformação de cada vetor binário foram avaliados usando discos de folha contra SAW, SBL, SPW, e VBW conforme descrito no Exemplo 4. O Constructo 3, TIC7941PL 1, serviu como um controle para comparação da atividade inseticida dos constructos compreendendo TIC7941PL 1-miR395 e TIC7941PL 1-miR4392 não direcionados. Tabela 6. Classificações de danos à folha (LDR) e penetrância pa- ra eventos Ro de soja transformada expressando TIC7941PL 1. [cmena Imera sa ls sm vm Constructo | TIC7941 SBL VBC
[00139] “Conforme pode ser visto na Tabela 6, ligando operacional- mente sítios alvo de ligação de miRNA à sequência codificante TIC7941PL 1 não foi afetada a atividade inseticida de TIC7941PL 1. Os dois constructos de sítios alvo de ligação de miRNA demonstraram o mesmo nível de atividade inseticida contra SAW, SBL, SPW, e VBC. Conforme previamente observado no Exemplo 4, TIC7941PL 1 de- monstrou alta resistência com alta penetrância contra SAW, SBL, e SPW.
[00140] Todas as composições reveladas e reivindicadas aqui, nes- te requerimento de patente, podem ser produzidas e executadas sem
7TUTI indevida experimentação, à luz da presente divulgação. Apesar das composições desta invenção terem sido descritas em termos das mo- dalidades ilustrativas precedentes, será evidenta para os peritos na arte que variações, mudanças, modificações, e alterações podem ser aplicadas à composição descrita aqui, neste requerimento de patente, sem se afastar dos verdadeiros conceito, espírito, e âmbito da inven- ção. Mais especificamente, será evidente que determinados agentes que são tanto quimicamente quanto fisiologicamente relacionados po- dem ser substituídos pelos agentes descritos aqui, neste requerimento de patente, enquanto os mesmos resultados ou resultados similares seriam obtidos. Todos os referidos substitutos similares e modificações evidentes para os peritos na arte são considerados como estando den- tro do espírito, do âmbito, e do conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações anexadas.
[00141] Todas as publicações e os documentos de patente publica- dos citados no relatório descritivo são incorporados aqui, a este reque- rimento de patente, por meio de referência na mesma extensão como se cada publicação ou requerimento de patente individual fosse espe- cificamente e individualmente indicado para ser incorporado por meio de referência.

Claims (35)

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de ácido nucleico recombinante compreenden- do um promotor heterólogo ligado operacionalmente a um segmento polinucleotídico codificando uma proteína pesticida ou fragmento pes- ticida da mesma, caracterizada pelo fato de que: a. a proteína pesticida referida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, de SEQ ID NO: 2, de SEQ ID NO: 6; de SEQ ID NO: 8, de SEQ ID NO: 10, de SEQ ID NO: 12, ou de SEQ ID NO: 14; ou b. a proteína pesticida referida compreende uma sequência de aminoácidos tendo no mínimo 80% ou, 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98% ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de ami- noácidos com a SEQ ID NO: 4, com a SEQ ID NO: 2, com a SEQ ID NO: 6; com a SEQ ID NO: 8, com a SEQ ID NO: 10, com a SEQ ID NO: 12, ou com a SEQ ID NO: 14; ou c. o referido segmento polinucleotídico hibridiza sob condi- ções de hibridização estringentes a um polinucleotídeo tendo a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, de SEQ ID NO: 1, de SEQ ID NO: 5; de SEQ ID NO: 7, de SEQ ID NO: 9, de SEQ ID NO: 11, ou de SEQ ID NO: 13.
2. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: a. a referida molécula de ácido nucleico recombinante com- preende uma sequência que funciona para expressar a proteína pesti- cida em uma planta; ou b. a referida molécula de ácido nucleico recombinante é ex- pressa em uma célula de planta para produzir uma quantidade efetiva como pesticida da proteína pesticida ou do fragmento pesticida; ou c. a referida molécula de ácido nucleico recombinante está em ligação operável com um vetor, e o referido vetor é selecionado entre o grupo que consiste em um plasmídeo, um fagemídeo, um bacmídeo, um cosmídeo, e um cromossoma artificial bacteriano ou de levedura.
3. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1, definida como presente dentro de uma célula hos- pedeira, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira referida é selecionada entre o grupo que consiste em uma célula bacteriana e uma célula de planta.
4. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira bacteriana referida é de um gênero de bactérias selecionadas entre o grupo que consiste em: Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibaci- Ilus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea, e Erwinia.
5. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a espécie de Bacillus referida é Bacillus cereus ou Bacillus thuringiensis, o referido Breviba- cillus é Brevibacillus laterosperous, e a referida Escherichia é Escheri- chia coli.
6. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindica- ção 2, caracterizado pelo fato de que a célula de planta referida é uma célula de planta dicotiledônea ou uma célula de planta monocotiledô- nea.
7. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindica- ção 6, caracterizado pelo fato de que a célula de planta referida é se- lecionada entre o grupo que consiste em uma célula de planta de alfal- fa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, man- dioca, mamona, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, cítrico, coco, café, milho, trevo, algodão, uma cucúrbita, pepino, abeto (Dou- dglas fir), beringela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, pinheiro Loblolly, milhetos, melões, nozes, aveia, oliveira, cebola, or-
namental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, ervi- lha d'angola, pinho, batata, álamo, abóbora-menina, pinho radiata, ra- banete, colza, arroz, rootstocks, centeio, açafrão, shrub, sorgo, pinhei- ro do Sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana- de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, switchgrass, chá, tabaco, tomate, triticale, grama, melancia, e trigo.
8. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína referida apresenta atividade contra um inseto Lepidóptero.
9. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o inseto Lepidóptero referido é selecionado entre o grupo que consiste em: lagarta do fei- jão-veludo, broca da cana-de-açúcar, broca do caule de milho menor, lagarta da espiga de milho, lagarta do botão do tabaco, falsa medideira da soja, lagarta militar africana, lagarta das folhas, falsa medideira, la- garta do cartucho da beterraba, curuquerê americana, curuquerê ori- ental, lagarta rosada do algodão, lagarta rosca, broca do milho do su- doeste, curuquerê do algodão, traça do repolho, Lagarta pintada, la- garta desfolhadora do tabaco, lagarta do feijão ocidental e lagarta eu- ropeia do milho.
10. Planta, ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante como de- finida na reivindicação 1.
11. Planta, ou parte da mesma, de acordo com a reivindica- ção 10, caracterizada pelo fato de que a planta referida é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.
12. Planta de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a planta referida é selecionada entre o grupo que consiste em uma alfalfa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, grão de bico,
repolho chinês, cítrico, coco, café, milho, trevo, algodão, uma cucúrbi- ta, pepino, abeto (Douglas fir), beringela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, pinheiro Loblolly, milhetos, melões, nozes, aveia, oliveira, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, ervilha d'angola, pinho, batata, álamo, abóbora- menina, pinho radiata, rabanete, colza, arroz, rootstocks, centeio, aça- frão, shrub, sorgo, pinheiro do Sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, switchgrass, chá, tabaco, tomate, triticale, grama, melan- cia, e trigo.
13. Semente da planta como definida na reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a referida semente compreende a refe- rida molécula de ácido nucleico recombinante.
14. Composição inibidora de inseto, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1.
15. Composição inibidora de inseto de acordo com a reivin- dicação 14, adicionalmente caracterizada pelo fato de que compreen- de uma sequência de nucleotídeos codificando no mínimo um outro agente pesticida que seja diferente da proteína pesticida referida.
16. Composição inibidora de inseto de acordo com a reivin- dicação 15, caracterizada pelo fato de que o no mínimo um outro agente pesticida referido é selecionado entre o grupo que consiste em uma proteína inibidora de insetos, uma molécula de dsRNA inibidora de insetos, e uma proteína auxiliar.
17. Composição inibidora de inseto de acordo com a reivin- dicação 15, caracterizada pelo fato de que o no mínimo um outro agente pesticida referido apresenta atividade contra uma ou mais es- pécies de pragas das ordens Lepidoptera, Coleoptera, ou Hemiptera.
18. Composição inibidora de inseto de acordo com a reivin-
dicação 15, caracterizada pelo fato de que a no mínimo uma outra pro- teína pesticida referida é selecionada entre o grupo que consiste em uma Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry 1A.105, Cry1Ãe, Cry1B, Cry1C, vari- antes de Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, quimeras Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry11, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ãe, Cry3, va- riantes de Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC3131, TIC2160, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-O001, AXMI-002, AXMI-O030, AXMI-035, AXMI-036, AXMI-045, Axmi52, Axmi58, Axmi88, Axmi97, Axmi102, Axmi112, Axmi117, Axmi100, AXMI-115, AXMI-113, e AXMI-005, AX- MI134, AXMI-150, Axmi171, AXMI-184, axmi196, axmi204, axmi207, axmi209, Axmi205, AXMI218, AXMI220, AXMI221z, AXMI222z, AX- MI223z, AXMI224z e AXMI225z, AXMI238, AXMI270, AXMI279, AX- MIS35, AXMIS45, AXMI-R1, e variantes das mesmas, I|IP3 e variantes da mesma, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-11, proteína DIG-657, variantes de PHI-4, variantes de PIP-72, variantes de PIP-45, variantes de PIP- 64, variantes de PIP-74, variantes de PIP-77, DIG-305, variantes de PIP-47, DIG-17, DIG-90, DIG-79, e DIG-303.
19. Composição inibidora de inseto de acordo com a reivin- dicação 14, caracterizada pelo fato de ser definida como compreen- dendo uma célula de planta que expressa a referida molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1.
20. Produto de commodity produzido a partir da planta, ou parte da mesma, como definida na reivindicação 10, caracterizado pe- lo fato de que o referido produto de commodity compreende uma quantidade detectável da referida molécula de ácido nucleico recombi- nante ou de uma proteína pesticida.
21. Produto de commodity de acordo com a reivindicação
20, caracterizado pelo fato de ser selecionado entre o grupo que con- siste em milho commodity ensacado por um manipulador de grãos, flocos de milho, bolos de milho, farinha de milho, fubá, xarope de mi- lho, óleo de milho, silagem de milho, amido de milho, cereal de milho, e semelhantes, e soja correspondente, arroz, trigo, sorgo, ervilha d'angola, amendoim, fruto, melão, e produtos de commodity de verdu- ras e legumes incluindo, onde aplicável, sucos, concentrados, compo- tas, geleias, marmeladas, e outras formas comestíveis de semelhantes produtos de commodity contendo uma quantidade detectável dos refe- ridos polinucleotídeos e ou polipeptídeos deste requerimento, semente de algodão inteira ou processada, óleo de algodão, fibra de algodão, sementes e partes de plantas processadas para ração ou alimento, fibra, papel, biomassas, e produtos de combustíveis tais como com- bustível derivado de óleo de algodão ou péletes derivados de resíduos de descaroçador de algodão, semente de soja inteira ou processada, óleo de soja, proteína de soja, refeição de grãos de soja, farinha de soja, flocos de soja, farelo de soja, leite de soja, queijo de soja, vinho de soja, ração animal compreendendo soja, papel compreendendo so- ja, creme compreendendo soja, biomassa de soja, e produtos de com- bustíveis produzidos usando plantas de soja e partes de plantas de soja.
22. Método de produção de semente, o método caracteri- zado pelo fato de que compreende: a. plantar uma primeira semente como definida na reivindi- cação 13; b. cultivar uma planta ou plantas a partir da semente referi- da;e c. colher semente da referida planta ou plantas, em que a semente colhida referida compreende a referida molécula de ácido nu- cleico recombinante.
23. Planta resistente a infestação por insetos, caracterizada pelo fato de que as células da planta referida compreendem a molécu- la de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1.
24. Método para controlar uma praga de espécie de Lepi- dópteros ou infestação por praga, o método referido caracterizado pelo fato de que compreende: a. contactar a praga com uma quantidade efetiva como pes- ticida de uma proteína pesticida conforme estipulado na SEQ ID NO: 4, na SEQ ID NO: 2, na SEQ ID NO: 6; na SEQ ID NO: 8, na SEQ ID NO: 10, na SEQ ID NO: 12, ou na SEQ ID NO: 14; ou b. contactar a praga com uma quantidade efetiva como pes- ticida de uma ou mais proteínas pesticidas compreendendo uma se- quência de aminoácidos tendo no mínimo 80% ou, 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 4, com a SEQ ID NO: 2, com a SEQ ID NO: 6; com a SEQ ID NO: 8, com a SEQ ID NO: 10, com a SEQ ID NO: 12, ou com a SEQ ID NO: 14.
25. Método de detectar a presença da molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1 em uma amostra compreendendo DNA genômico da planta, caracterizado pelo fato de que compreende: a. contactar a referida amostra com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza sob condições de hibridização estringentes com DNA genômico de uma planta compreendendo a molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1, e não hibridi- za sob semelhantes condições de hibridização com DNA genômico de uma planta isogênica de outro modo que não compreenda a molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1, em que a referida sonda é homóloga ou complementar à SEQ ID NO: 3, à SEQ ID NO: 11, ou à SEQ ID NO: 13, ou uma sequência que codifica uma proteína pesticida compreendendo uma sequência de aminoáci- dos tendo no mínimo 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 4, com a SEQ ID NO: 2, com a SEQ ID NO: 12, ou com a SEQ ID NO: 14; b. submeter a referida amostra e a referida sonda a condi- ções de hibridização estringentes; e c. detectar hibridização da referida sonda de ácido nucleico com o referido DNA genômico da planta da referida amostra.
26. Método de detectar a presença de uma proteína pestici- da, ou fragmento da mesma, em uma amostra compreendendo proteí- na, em que a proteína pesticida referida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, de SEQ ID NO: 2, de SEQ ID NO: 6; de SEQ ID NO: 8, de SEQ ID NO: 10, de SEQ ID NO: 12, ou de SEQ ID NO: 14; ou a proteína pesticida referida compreende uma sequên- cia de aminoácidos tendo no mínimo 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99% ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 4, com a SEQ ID NO: 2, com a SEQ ID NO: 6; com a SEQ ID NO: 8, com a SEQ ID NO: 10, com a SEQ ID NO: 12, ou com a SEQ ID NO: 14; caracterizado pelo fato de que compreende: a. contactar a referida amostra com um anticorpo imunorre- ativo; e b. detectar a presença da proteína pesticida referida, ou fragmento da mesma.
27. Método de acordo com reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção compreende um ELISA, ou um Western blot.
28. Método para melhorar a atividade pesticida de uma pro- teína pesticida nativa contra uma espécie de praga de inseto, caracte-
rizado pelo fato de que compreende: manipular uma proteína pesticida variante por inserção de um fragmento de DNA codificando um peptí- deo de ligação ao receptor do intestino médio do inseto dentro de uma sequência codificante codificando a proteína pesticida; em que a ativi- dade pesticida da proteína pesticida manipulada é maior do que a ati- vidade pesticida da proteína pesticida nativa para a espécie de praga de inseto referida.
29. Método de acordo com reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o receptor do intestino do inseto é selecionado entre o grupo que consiste em uma proteína semelhante a caderina (CADR), uma aminopeptidase-N ancorada a GPI (APN), uma fosfatase alcalina ancorada a GPI, um transportador ABC transmembrana, e uma meta- loprotease ADAM.
30. Método de acordo com reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o fragmento de DNA codificando um peptídeo de liga- ção ao receptor do intestino do inseto é selecionado entre o grupo que consiste na SEQ ID NO: 15 e na SEQ ID NO: 16.
31. Método de acordo com reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de ligação ao receptor do intestino é SEQ ID NO: 17.
32. Molécula de ácido nucleico recombinante caracterizada pelo fato de que compreende um promotor heterólogo ligado operacio- nalmente a um segmento polinucleotídico codificando uma proteína pesticida ou fragmento pesticida da mesma, ligado operacionalmente a uma sequência de DNA compreendendo um elemento do sítio alvo de ligação de mRNA especítico do tecido reprodutor, em que o referido elemento do sítio alvo de ligação de mRNA é heterólogo com respeito ao referido segmento polinucleotídico codificando uma proteína pesti- cida ou fragmento pesticida da mesma.
33. Elemento do sítio alvo de ligação de mRNA de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de ser selecionado en- tre o grupo que consiste na SEQ ID NO: 18, na SEQ ID NO: 19, na SEQ ID NO: 20, na SEQ ID NO: 21, na SEQ ID NO: 22, e na SEQ ID NO: 23.
34. Molécula de DNA recombinante caracterizada pelo fato de ser selecionada entre o grupo que consiste na SEQ ID NO: 25 e na SEQ ID NO: 26.
35. Método para reduzir a expressão de uma proteína pes- ticida no tecido reprodutivo de uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende expressar na planta transgênica referida a molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindi- cação 32.
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