BR112017007735B1 - Cassetes de expressão, proteína inseticida projetada, célula hospedeira, composição inibidora de insetos, bem como métodos para controlar uma praga de lepidópteros - Google Patents

Abstract

PROTEÍNAS VARIANTES DE SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS CRY1DA1 ATIVAS PARA LEPIDOPTERA. A presente invenção refere-se a sequências de aminoácidos de Cry1Da projetadas que exibem atividade inseticida de lepidópteros melhorada e um espectro de lepidópteros melhorado em comparação com a toxina de proteína Cry1Da de ocorrência natural. Sequências de polinucleotídeos previstas para uso na expressão das proteínas melhoradas em plantas também são fornecidas. Modalidades particulares fornecem composições que contêm quantidades inibidoras de insetos das proteínas projetadas, bem como plantas, partes de plantas e sementes recombinantes contendo construtos de polinucleotídeo que codificam uma ou mais das proteínas projetadas melhoradas.

Description

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios US 62/064.994, depositado em 16 de outubro de 2014 e 62/065.017, depositado em 17 de outubro de 2014, que estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] Uma forma legível por computador da Listagem de Sequên cia é depositada em conjunto com o presente documento por meio de envio eletrônico. A Listagem de Sequências está incorporada a título de referência em sua totalidade, está contida no arquivo criado em 13 de outubro de 2015, tendo o nome de arquivo P34223WO00_SEQ_PCT.txt, e que tem 327.235 bytes de tamanho (tal como medido no sistema operacional MS-Windows®).

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A invenção se refere, em geral, ao campo de proteínas inibi- doras de insetos. Uma nova classe de proteínas projetadas que exibem atividade inibidora de inseto contra pragas relevantes para agricultura de plantas e sementes cultivadas é divulgada. Em particular, a classe divulgada de proteínas inibidoras projetadas apresenta atividade inseticida contra a ordem Lepidoptera de pragas de insetos. Plantas, partes de plantas e sementes contendo um construto de polinucleotídeo que codifica uma ou mais das proteínas inibidoras projetadas divulgadas são fornecidas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Helicoverpa zea é uma praga de Lepidópteros significativa de safras agrícolas principais, incluindo milho, algodão e soja. Conhecido como a larva do milho (CEW), a lagarta do algodoeiro (CBW) e a lagarta da soja (SPW), esta espécie de inseto polífago é particularmente difícil de ser controlada com proteínas inseticidas de Bacillus thuringien- sis (Bt) ou outras espécies bacterianas. H. zea é considerado em risco de desenvolvimento de resistência a traços de controle de insetos atuais, dada a sua capacidade para se alimentar em muitas safras diferentes e a ausência atual de uma estratégia de controle de alta dose. Por conseguinte, novos modos de ação (MoA) são necessários para garantir a durabilidade de plantas transgênicas protegidas contra danos de alimentação de H. zea.

[005] A proteína Cry1Da1 é uma proteína ativa para Lepidoptera que foi descrita pela primeira vez por Hofte, et al. "Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a new Lepidoptera-specific crystal protein gene from Bacillus thuringiensis." Nucleic Acids Res. 18 (18) (1990): 5.545. Esta proteína exibe uma excelente atividade inseticida em espécies Spodoptera, incluindo Spodoptera frugiperda (Lagarta do cartucho, FAW), uma praga de várias plantações, incluindo milho, algodão e soja. No entanto, Cry1Da1 exibe atividade baixa a moderada para uma avariedade de outrs principais pragas de lepidópteros, incluindo lagartas (por exemplo, Helicoverpa armigera e H. zea), brocas (por exemplo, Ostrinia nubilalis e Diatraea grandiosella) e lagarta da soja (Pseu- doplusia includens). Devido ao seu estreito espectro inseticida e à sua incapacidade de fornecer proteção de nível comercial contra uma faixa de pragas agrícolas de Lepidoptera importantes, tais como CEW, a proteína inseticida Cry1Da1 tem um valor limitado como um traço de controle de inseto de planta transgênica. Como resultado, nenhuma variedade comercial atual de culturas protegidas contra insetos utiliza Cry1Da1 como um protetor incorporado em planta.

[006] Apesar de seu estreito espectro inseticida, a Cry1Da1 é uma proteína inseticida interessante devido ao fato de que parece que a proteína Cry1Da1 usa um MoA alternativo para controlar determinadas pragas de Lepidoptera. Evidência para isto é proveniente de estudos com múltiplas colônias de insetos resistentes. Por exemplo, as colônias derivadas de campo de Plutella xylostella (traça-das-crucíferas) e Pecti- nophora gossypiella (lagarta-rosada), que são resistentes à intoxicação por Cry1Ac mantêm a plena sensibilidade à proteína Cry1Da1 (Tabash- nik, et al. "Cross-Resistance of Pink Bollworm (Pectinophora gossy- piella) to Bacillus thuringiensis toxins." Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000): 4.582 a 4.584; Tabashnik, et al. "Cross-Resistance to Bacillus thuringiensis Toxin Cry1Ja in a Strain of Diamondback Moth Adapted to Artificial Diet." J. Invert. Pathol. 76: (2000): 81 a 83.). Essas linhas de evidência indicam que a Cry1Da1 reconhece receptores de intestino médio de lepidopta distintos daqueles reconhecidos por proteínas ativas para Lepidoptera atualmente implantadas em culturas transgênicas, incluindo Cry1Ac, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1Fa, Cry2Ae e Cry2Ab2. Em vista deste MOA inovador aparente, a otimização de proteínas do tipo Cry1Da1 para atividade aprimorada contra um espectro mais amplo de espécies de Helicoverpa, mantendo ou aumentando a sua atividade inseticida contra Spodoptera, criaria um protetor incorporado à planta de alto valor para gerenciamento de resistência a insetos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Na presente invenção, foram identificadas várias variantes de sequências de aminoácidos das proteínas-esqueleto TIC844 e Cry1Da que exibem atividade marcadamente aprimorada (em comparação com a toxina nativa de Cry1Da1) contra H. zea, mantendo excelente atividade contra S. frugiperda. As variantes aprimoradas de TIC844 e Cry1Da foram projetadas para serem expressadas em plantas de cultura (por exemplo, milho, soja, algodão, cana de açúcar), e fornecem novas opções para gerenciamento de resistência em planta e de controle de pragas de insetos de Lepidoptera, tendo em vista o modo de ação exclusivo aparente de Cry1Da junto com a melhoria projetada na atividade contra H. zea.

[008] As proteínas tóxicas de Lepidoptera projetadas aqui descri tas (referidas como "proteínas de toxina projetadas", "proteínas tóxicas projetadas" ou "proteínas inseticidas projetadas") são derivadas da toxina inseticida de Bacillus thuringiensis de ocorrência natural Cry1Da1 (SEQ ID NO: 2) ou o homólogo quimérico de Cry1Da1, TIC844 (SEQ ID NO: 14), que compreende a toxina de núcleo de Cry1Da1, mas substitui a protoxina Cry1Ab3 para o domínio de protoxina Cry1Da1 nativa. As proteínas inseticidas projetadas da presente invenção contêm, cada uma, pelo menos uma substituição de aminoácido, uma adição de ami- noácido ou uma deleção de aminoácido em comparação com as proteínas-esqueleto apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14. As proteínas inseticidas projetadas da presente invenção são particularmente tóxicas para insetos das espécies Helicoverpa zea (lagarta-da-espiga-do-milho, lagarta-da-soja, lagarta-do-algodoeiro) e Spodoptera frugiperda (lagarta-do-cartucho). Enquanto a proteínas- esqueleto TIC844 (SEQ ID NO: 14) e Cry1Da1 (SEQ ID NO: 2) exibem baixa toxicidade a H. zea, as proteínas inseticidas projetadas da presente invenção exibem atividade inseticida surpreendente e inespera-damente aprimorada e um espectro inseticida melhorado contra pragas de insetos de Lepidoptera incluindo H. zea.

[009] Em certas modalidades, uma proteína inseticida projetada compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 42, ou um fragmento inibidor de inseto das mesmas é revelada. Em certas modalidades, a proteína inseticida projetada exibe atividade inibidora contra uma espécie de inseto da ordem Lepidoptera. As espécies-alvo de praga de Lepidoptera inibidas pelas proteínas tóxicas de Lepidoptera da presente invenção incluem pelo menos lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), lagarta-da-be- terraba (Spodoptera exigua), lagarta-bertha (Mamestra configurata), lagarta-negra (Agrotis ipsilon), lagarta-da-couve (Trichoplusia ni), lagarta- da-soja (includens Chrysodeixis), lagarta-da-soja (Anticarsia gemmata- lis), percevejo-verde (ophiuche scabra), lagarta-do-tabaco (Heliothis vi- rescens), lagarta-rosca subterrânea (Agrotis subterranea), lagarta-dos- cereais (Pseudaletia unipuncta), lagarta-rosca ocidental (Agrotis ortho- gonia), broca-do-milho Europeia (Ostrinia nubilalis), lagarta-laranja (transitella Amyelois), verme-da-raiz-do-milho (Crambus caliginosellus), verme-da-teia-dos-gramados (licarsisalis Herpetogramma), traça-do-gi- rassol (electellum Homoeosoma), lagarta-elasmo (Elasmopalpus ligno- sellus), mariposa-das-maçãs (Cydia pomonella), traça-da-uva (En- dopiza viteana), traça-oriental (Grapholita molesta), traça-do-botão-do- girassol (Suleima helianthana), traça-da-couve (Plutella xylostella), lagarta-rosada (Pectinophora gossypiella), broca-do-caule-rosa (inferens Sesamia), mariposa-cigana (Lymantria dispar), lagarta-da-folha-do-al- godoeiro (Alabama argillacea), lagarta-das-folhas-das-árvores-frutíferas (Archips argyrospila), tortrícideo dos arbustos (Archips rosana), broca- do-arroz-aiático ou broca-do-colmo-do-arroz (Chilo suppressalis), enro- lador-da-folha (Cnaphalocrocis medinalis), verme-de-teia-da-raiz-do-mi- lho (Crambus caliginosellus), verme-de-teia-de-capim-do-campo (Crambus teterrellus), broca-grande-do-milho (Diatraea grandiosella)), broca- grande-da-cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis), lagarta-espinhosa (Earias insulana), lagarta-da-maçã (Earias vittella), lagarta helicoverpa (Helicoverpa armigera), lagarta-do-milho, lagarta-da-soja ou lagarta-do- algodão (Helicoverpa zea), verme-da-teia-dos-gramados (Herpetogramma licarsisalis), traça-da-uva (Lobesia botrana), lagarta- mineira (Phyllocnistis citrella), borboleta-branca-da-couve (Pieris brassi- cae), borboleta-pequena-da-couve (Pieris rapae), curuquerê-oriental (Spodoptera litura) e traça-do-tomateiro (Tuta absoluta).

[0010] Também é divulgado no presente documento um polinucle- otídeo que codifica uma proteína inseticida projetada ou fragmento pesticida da mesma, em que o polinucleotídeo está operativamente ligado a um promotor heterólogo e a proteína inseticida projetada compreende a sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 42.

[0011] Em outra modalidade, é divulgado aqui um polinucleotídeo que codifica uma proteína inseticida projetada, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que opcionalmente hibri- diza sob condições rigorosas ao complemento inverso da sequência de polinucleotídeo como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 41; ou codifica a proteína inseticida projetada compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32 , SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 42.

[0012] Também é fornecida aqui uma célula hospedeira compreen dendo o polinucleotídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 41, em que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em uma célula hospedeira bacteriana ou uma célula hospedeira vegetal. As células hospedeiras bacterianas contempladas incluem células hospedeiras bacterianas selecionadas do grupo que consiste em Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella e Erwinia, em que a espécie Bacillus é uma Bacillus cereus ou uma Bacillus thuringiensis, a referida Brevibacillus é uma Brevibacillus laterosperous e a referida Escherichia é uma Escherichia coli. Além disso, as células hospedeiras vegetais contempladas incluem monocotiledôneas ou dicotiledôneas.

[0013] Em ainda outra modalidade, é fornecida aqui uma composi ção inibidora de inseto compreendendo uma proteína inseticida projetadas compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 42, ou um fragmento inibidor de inseto da mesma. Considera-se que esta composição inibidora de inseto pode ainda compreender pelo menos um agente inibidor de insetos diferente da proteína inseticida projetada. Os agentes inibidores de insetos contemplados incluem uma proteína inibidora de inseto, uma molécula de dsRNA inibidora de inseto e uma química inibidora de inseto. Considera- se que o pelo menos um outro agente pesticida pode exibir atividade contra uma ou mais espécies de pragas das ordens Lepidoptera, Cole- optera, Hemiptera, Homoptera ou Thysanoptera.

[0014] Também é divulgada aqui uma semente que compreende uma quantidade eficaz inibidora de inseto de uma proteína inseticida projetada compreendendo a sequência de aminoácidos conforme apresentado em qualquer uma das SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 42; ou um polinucleotídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 41.

[0015] Um método para controlar uma praga de Lepidópteros, o mé todo compreendendo colocar a praga de Lepidópteros em contato com uma quantidade inibidora de uma proteína inseticida projetada, também é aqui divulgado em outra modalidade.

[0016] Em ainda outra modalidade, é divulgada aqui uma célula de planta, planta ou parte de planta transgênica compreendendo uma proteína inseticida projetada. Métodos são fornecidos para controlar uma praga de Lepidoptera, que compreende expor a praga à célula de planta, planta ou parte de planta transgênica compreendendo uma proteína inseticida projetada. Os bens de consumo derivados da célula de planta, planta ou parte de planta compreendendo uma proteína inseticida projetada, em que o produto compreende uma quantidade detectá- vel da proteína inseticida projetada também são contemplados. Os bens de consumo contemplados incluem biomassa vegetal, óleo, farelo, ração animal, farinha, flocos, farelo de trigo, fiapos, cascas e sementes processadas.

[0017] Um outro método aqui descrito é um método para produzir uma semente que compreende a proteína inseticida projetada, o método compreendendo: plantar pelo menos uma semente que compreende a proteína inseticida projetada; cultivar plantas a partir da referida semente; e colher sementes das plantas, em que a referida semente colhida compreende a proteína inseticida projetada.

[0018] Ainda outro método divulgado neste pedido é um método para impedir que pragas de lepidópteros se alimentem de uma plantação compreendendo modificar um ou mais resíduos de aminoácido de SEQ ID N: 2 ou SEQ ID NO: 14 através da substituição do um ou mais resíduos de aminoácido para produzir uma SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14 modificado; e disponibilizar uma quantidade inibidora de lepi- dópteros da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14 modificado dentro, na superfície ou nas proximidades de tecidos da referida plantação; em que o resíduo de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14 modificado é selecionado do grupo que consiste em serina na posição 282 substituída por lisina ou valina, tirosina na posição 316 substituída por serina, isoleucina na posição 368 substituída por prolina ou arginina, serina em 374 substituída por arginina, asparagina na posição 375 substituída por histidina e isoleucina na posição 432 substituída por leucina.

[0019] Moléculas de polinucleotídeos recombinantes que codificam as proteínas inseticidas projetadas da presente invenção também são fornecidas. As moléculas de polinucleotídeos recombinantes contempladas compreendem uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 41; e, opcionalmente, uma sequência de polinucleotídeo que codifica um agente inibidor de insetos diferente da proteína inseticida projetada.

[0020] Outro método revelado neste pedido é um método para au mentar a atividade de lepidópteros e melhorar o espectro inibitório de lepidópteros de uma proteína-esqueleto, o método compreendendo a modificação de um ou mais resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14 através substituição do resíduo (ou resíduos) de ami- noácido para produzir uma proteína inseticida projetada, em que o resíduo de aminoácido modificado de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14 é selecionado do grupo que consiste em serina na posição 282 substituída por lisina ou valina, tirosina na posição 316 substituída por serina, iso- leucina na posição 368 substituída por prolina ou arginina, serina em 374 substituída por arginina, asparagina na posição 375 substituída por histidina e isoleucina na posição 432 substituída por leucina. Em certas modalidades deste método, a proteína inseticida projetada tem pelo menos um aumento de oito vezes na letalidade de Helicoverpa zea em relação à proteína-esqueleto.

[0021] Outras modalidades, características e vantagens da inven ção se tornarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, dos exemplos e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0022] A Figura 1 ilustra os valores MIC50 da proteína-esqueleto TIC844 (SEQ ID NO: 14) em comparação com a proteína inseticida projetada TIC844_8 (SEQ ID NO: 26) para duas diferentes colônias de He- licoverpa zea (CEW), Union City e BENZON.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0023] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína Cry1Da1.

[0024] SEQ ID NO: 2 é uma sequência de aminoácidos de uma to xina de proteína Cry1Da1.

[0025] SEQ ID NO: 3 é uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína Cry1Da1_3.

[0026] SEQ ID NO: 4 é uma sequência de aminoácidos de uma to xina de proteína Cry1Da1_3.

[0027] SEQ ID NO: 5 é uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína Cry1Da1_4.

[0028] SEQ ID NO: 6 é uma sequência de aminoácidos de uma to xina de proteína Cry1Da1_4.

[0029] SEQ ID NO: 7 é uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína Cry1Da1_5.

[0030] SEQ ID NO: 8 é uma sequência de aminoácidos de uma to xina de proteína Cry1Da1_5.

[0031] SEQ ID NO: 9 é uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína Cry1Da1_6.

[0032] SEQ ID NO: 10 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína Cry1Da1_6.

[0033] SEQ ID NO: 11 é uma sequência de nucleotídeos que codi fica uma proteína Cry1Da1_7.

[0034] SEQ ID NO: 12 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína Cry1Da1_7.

[0035] SEQ ID NO: 13 é uma sequência de nucleotídeos que codi fica uma proteína TIC844.

[0036] SEQ ID NO: 14 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC844.

[0037] SEQ ID NO: 15 é uma sequência de nucleotídeos que codi fica uma proteína TIC844_2.

[0038] SEQ ID NO: 16 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC844_2.

[0039] SEQ ID NO: 17 é uma sequência de nucleotídeos que codi fica uma proteína TIC844_4.

[0040] SEQ ID NO: 18 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC844_4.

[0041] SEQ ID NO: 19 é uma sequência de nucleotídeos que codi fica uma proteína TIC844_5.

[0042] SEQ ID NO: 20 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC844_5.

[0043] SEQ ID NO: 21 é uma sequência de nucleotídeos que codi fica uma proteína TIC844_6.

[0044] SEQ ID NO: 22 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC844_6.

[0045] SEQ ID NO: 23 é uma sequência de nucleotídeos que codi fica uma proteína TIC844_7.

[0046] SEQ ID NO: 24 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC844_7.

[0047] SEQ ID NO: 25 é uma sequência de nucleotídeos que codi fica uma proteína TIC844_8.

[0048] SEQ ID NO: 26 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC844_8.

[0049] SEQ ID NO: 27 é uma sequência de polinucleotídeos conce bida para uso na expressão de uma proteína Cry1Da1 em plantas.

[0050] SEQ ID NO: 28 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína Cry1Da1.

[0051] SEQ ID NO: 29 é uma sequência de polinucleotídeo conce bida para uso na expressão de uma proteína Cry1Da1_2.nno em plantas.

[0052] SEQ ID NO: 30 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína Cry1Da1_2.nno.

[0053] SEQ ID NO: 31 é uma sequência de polinucleotídeos conce bida para uso na expressão de uma proteína Cry1Da1_3.nno em plantas.

[0054] SEQ ID NO: 32 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína Cry1Da1_3.nno.

[0055] SEQ ID NO: 33 é uma sequência de polinucleotídeos conce bida para uso na expressão de uma proteína Cry1Da1_4.nno em plantas.

[0056] SEQ ID NO: 34 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína Cry1Da1_4.nno.

[0057] SEQ ID NO: 35 é uma sequência de polinucleotídeos conce bida para uso na expressão de uma proteína Cry1Da1_5.nno em plantas.

[0058] SEQ ID NO: 36 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína Cry1Da1_5.nno.

[0059] SEQ ID NO: 37 é uma sequência de polinucleotídeos conce bida para uso na expressão de uma proteína Cry1Da1_6.nno em plantas.

[0060] SEQ ID NO: 38 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína Cry1Da1_6.nno.

[0061] SEQ ID NO: 39 é uma sequência de polinucleotídeos conce bida para uso na expressão de uma proteína Cry1Da1_7.nno em plantas.

[0062] SEQ ID NO: 40 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína Cry1Da1_7.nno.

[0063] SEQ ID NO: 41 é uma sequência de polinucleotídeos conce bida para uso na expressão de uma proteína TIC844_9.nno em plantas.

[0064] SEQ ID NO: 42 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC844_9.nno.

[0065] SEQ ID NO: 43 é uma sequência de polinucleotídeos conce bida para uso na expressão de uma proteína TIC844_11.nno em plantas.

[0066] SEQ ID NO: 44 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC844_11

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0067] Proteínas inseticidas projetadas que exibem níveis surpreen dentemente elevados de atividade tóxica contra espécies de lepidópte- ros e um espectro inseticida mais amplo em comparação com outras proteínas inseticidas contra lepidópteros anteriormente conhecidas são aqui fornecidas. Estas proteínas inseticidas projetadas são derivadas de proteínas-esqueleto inseticidas, que servem como moldes para várias modificações de aminoácidos. Exemplos de tais proteínas-esqueleto inseticidas incluem, sem limitação, Cry1Da1 e TIC844 (um homólogo de Cry1Da1). TIC844 compreende a toxina de núcleo Cry1Da1 (isto é, domínios I, II e III), mas utiliza o domínio de protoxina Cry1Ab3 para garantir uma boa expressão em Bacillus thuringiensis (Bt). A expressão de Cry1Da1 em Bt é pobre quando se usa o domínio de protoxina Cry1Da1 nativa. Contudo, tal como demonstrado neste pedido, a expressão da toxina de núcleo Cry1Da1 é notavelmente melhorada em cepas acrílicas de Bt quando o domínio de protoxina nativa é removido e o segmento de codificação de toxina de núcleo Cry1Da1 é fundido em armação com um segmento que codifica o domínio de protoxina Cry1Ab3. Notavelmente, as proteínas-esqueleto TIC844 (SEQ ID NO: 14) e Cry1Da1 (SEQ ID NO: 2) não apresentam o espectro inibidor de lepidópteros comercialmente útil e atividade inibidora de lepidópteros melhorada observada nas proteínas inseticidas projetadas.

[0068] As proteínas inseticidas projetadas divulgadas neste docu mento são relacionadas por modificações de aminoácido de tal modo que as proteínas modificadas exibam espectro inibidor de lepidópteros melhorado e/ou atividade inibidora de lepidópteros melhorada em comparação com a proteína-esqueleto parental, TIC844 ou Cry1Da1. As frases "mais ativo(a)", "atividade melhorada", "especificidade melhorada", "potência tóxica aumentada", "aumento da toxicidade", "atividade inibidora de lepidópteros melhorada ", "maior atividade inibidora de lepi- dópteros", e "espectro inibidor de lepidópteros melhorado" se referem a uma comparação da atividade de uma proteína inseticida projetada à atividade de uma proteína-esqueleto (TIC844 ou Cry1Da1) contra um inseto lepidóptero, em que a atividade atribuída à proteína inseticida projetada é maior do que a atividade atribuída à proteína-esqueleto. Em certas modalidades, as proteínas inseticidas projetadas aqui fornecidas exibem um espectro inibidor de lepidópteros melhorado e/ou uma atividade inibidora melhorada ou maior de lepidópteros quando comparadas às atividades da proteína-esqueleto TIC844 ou Cry1Da1, em que as espécies de pragas de lepidópteros incluem, sem limitação, Helicoverpa zea e Spodoptera frugiperda.

[0069] Conforme usado aqui, os termos e frases "ativo(a)" ou "ativi dade"; "atividade pesticida" ou "pesticida"; ou "atividade inseticida", "inibidor de inseto", "inseticida" ou "uma quantidade inibidora de inseto", se referem à eficácia de um agente tóxico, tal como uma proteína inseticida, na inibição (inibição do crescimento, alimentação, fecundidade ou viabilidade), na supressão (suprimindo a infestação de pragas, suprimindo as atividades de alimentação de pragas em uma cultura particular contendo uma quantidade eficaz de uma proteína inseticida projetada descrita) ou matando (causando a morbidade, a mortalidade ou a fecundidade reduzida de) uma praga. Do modo similar, uma "quantidade ini- bidora de lepidópteros" se refere a uma quantidade de um agente tóxico, tal como uma proteína inseticida, que resulta em qualquer inibição mensurável de viabilidade de lepidópteros, crescimento de lepidópteros, desenvolvimento de lepidópteros, reprodução de lepidópteros, o comportamento alimentar de lepidópteros, comportamento de acasalamento de lepidópteros e/ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados a uma planta por alimentação lepidópteros. Estes termos pretendem incluir o resultado de fornecimento de uma quantidade eficaz como pesticida de um agente tóxico a uma praga em que a exposição da praga ao agente tóxico resulta em morbidade, mortalidade, fecundidade reduzida ou retardação do crescimento. Estes termos incluem também a repulsão da praga da planta, de um tecido da planta, de uma parte da planta, da semente, de células vegetais, ou da localização geográfica particular onde a planta pode estar sendo cultivada, como resultado do fornecimento de uma quantidade eficaz como pesticida do agente tóxico dentro ou sobre a planta. De um modo geral, atividade pesticida se refere à capacidade de um agente tóxico ser eficaz na inibição do crescimento, desenvolvimento, viabilidade, comportamento de alimentação, comportamento de acasalamento, fecundidade ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados por uma alimentação de insetos nesta proteína, fragmento de proteína, segmento de proteína ou polinucleotídeo de uma praga-alvo particular, incluindo, sem limitação, insetos da ordem Lepidoptera. O agente tóxico pode ser produzido pela planta ou pode ser aplicado à planta ou ao ambiente dentro do local onde a planta é localizada.

[0070] Uma quantidade eficaz como pesticida de um agente tóxico, quando fornecida na dieta de uma praga-alvo, exibe atividade pesticida quando o tóxico é ingerido pela praga. Um agente tóxico pode ser uma proteína pesticida ou um ou mais agentes químicos conhecidos na técnica. Os agentes químicos pesticidas ou inseticidas e os agentes proteicos pesticidas ou inseticidas podem ser usados sozinhos ou em combinações uns com os outros. Os agentes químicos incluem, sem limitação, moléculas de dsRNA direcionadas a genes específicos para a supressão de uma praga-alvo, organocloretos, organofosfatos, carbamatos, pi- retroides, neonicotinoides e rianoides. Agentes de proteínas pesticidas ou inseticidas incluem as proteínas inseticidas projetadas apresentadas neste pedido, bem como outros agentes tóxicos proteicos incluindo aqueles que visam espécies de praga de lepidópteros, assim como toxinas proteicas que são usadas para controlar outras pragas de plantas, tais como proteínas Cry disponíveis na técnica para uso no controle de espécies de espécies de coleópteros, hemípteros e homópteros.

[0071] O termo "segmento" ou "fragmento" é aqui usado para des crever sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos consecutivos que são mais curtas do que a sequência de aminoácido ou de ácido nucleico completa que descreve as proteínas inseticidas projetadas.

[0072] Pretende-se que a referência a uma praga, particularmente uma praga de uma plantação, signifique pragas de insetos de plantações, particularmente as pragas de insetos lepidópteros, que são controladas pelas proteínas inseticidas projetadas divulgadas. No entanto, a referência a uma praga também pode incluir insetos de coleópteros, hemípteranos e homópteros de plantas, bem como nemátodos e fungos, quando os agentes tóxicos que visam estas pragas estão colocalizados ou presentes em conjunto com as proteínas inseticidas projetadas divulgadas.

[0073] As proteínas inseticidas projetadas divulgadas exibem ativi dade inseticida no sentido de pragas de insetos das espécies de insetos lepidópteros, incluindo adultos, larvas, pupas e recém-nascidos. Os insetos da ordem Lepidoptera incluem, sem limitação, lagartas-militar, brocas, verme e heliothines na família Noctuidae, por exemplo, lagarta- do-cartucho (Spodoptera frugiperda), lagarta-da-beterraba (Spodoptera exigua), lagarta-bertha (Mamestra configurata), lagarta-negra (Agrotis ipsilon), lagarta-da-couve (Trichoplusia ni), lagarta-da-soja (Pseudoplu- sia includens), lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis), percevejo-verde (Hypena scabra), lagarta-do-tabaco (Heliothis virescens), lagarta-rosca subterrânea (Agrotis subterranea), lagarta-dos-cereais (Pseudaletia uni- puncta), lagarta-rosca ocidental (Agrotis orthogonia); brocas, traças-da- parede, vermes-de-teia, traças-das-caníferas, traças-do-repolho e traças esqueletizadoras da família Pyralidae, por exemplo, broca-do-milho europeira (Ostrinia nubilalis), lagarta-laranja (Amyelois transitella), la- garta-da-raiz-do-milho (Crambus caliginosellus), verme-da-teia-dos- gramados (Herpetogramma licarsisalis), traça-do-girassol (Homoeo- soma electellum), lagarta-elasmo (Elasmopalpus lignosellus); lagarta- enroladeira, lagarta-da-maçã-do-algodoeiro, traça-da-semente e traça- dos-frutos na família Tortricidae, por exemplo, mariposa-das-maçãs (Cydia pomonella), traça-da-uva (Endopiza viteana), traça oriental (Gra- pholita molesta), traça-do-botão-do-girassol (Suleima helianthana); e muitos outros lepidóptores economicamente es, por exemplo, traça-da- couve (Plutella xylostella), lagarta-rosada (Pectinophora gossypiella) e mariposa-cigano (Lymantria dispar). Outras pragas de insetos da ordem Lepidoptera incluem, por exemplo, Alabama argillacea (lagarta-da-fo- lha-do-algodoeiro), Archips argyrospila (lagarta-das-folhas-das-árvores- frutíferas ), Archips rosana (tortrícideo-dos-arbustos ) e outras espécies de Archips, Chilo suppressalis (broca-do-arroz-asiático ou broca-do- colmo-do-arroz ), Cnaphalocrocis medinalis (enrolador-da-folha ), Crambus caliginosellus (verme-de-teia-da-raiz-do-milho ), Crambus teter- rellus (verme-de-teia-de-capim-do-campo ), Diatraea grandiosella (broca-grande-do-milho), Diatraea saccharalis (broca-grande-da-cana- de-açúcar), Earias insulana lagarta-espinhosa), Earias vittella (lagarta- da-maçã ), Helicoverpa armigera (lagarta helicoverpa), Helicoverpa zea (lagarta-do-milho ou lagarta-do-algodão), Heliothis virescens (lagarta- do-tabaco), Herpetogramma licarsisalis (verme-da-teia-dos-gramados), Lobesia botrana (traça-da-uva), Phyllocnistis citrella (lagarta-mineira), Pieris brassicae (borboleta-branca-da-couve), Pieris rapae (borboleta- pequena-da-couve), Plutella xylostella (traça-da-couve), Spodoptera exigua (lagarta-da-beterraba), Spodoptera litura (curuquerê-oriental) e Tuta absoluta (traça-do-tomateiro).

[0074] Referência neste pedido a uma "molécula de DNA isolada", ou um termo ou frase equivalente, destina-se a significar que a molécula de DNA é uma que esteja presente sozinha ou em combinação com outras composições, mas não dentro do seu ambiente natural. Por exemplo, elementos de ácidos nucleicos, tais como uma sequência de codificação, sequência de íntron, sequência principal não traduzida, sequência do promotor, sequência de terminação da transcrição, e semelhantes, que são encontradas naturalmente no DNA do genoma de um organismo, não são considerados como "isolados" desde que o elemento esteja dentro do genoma do organismo e no local dentro do ge- noma em que se encontra naturalmente. No entanto, cada um destes elementos, e subpartes destes elementos, seriam "isolado", no escopo da presente divulgação, desde que o elemento não esteja dentro do ge- noma do organismo e no local dentro do genoma em que se encontra naturalmente. De modo similar, uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína inseticida ou qualquer variante inseticida de ocorrência natural dessa proteína seria uma sequência de nucleotídeos solada, desde que a sequência de nucleotídeos não esteja dentro do DNA da bactéria da qual a sequência que codifica a proteína é naturalmente encontrada. Uma sequência de nucleotídeos sintéticos que codifica a sequência de aminoácidos de uma proteína inseticida de ocorrência natural seria considerada isolada para os propósitos desta divulgação. Para os fins da presente divulgação, qualquer sequência de nucleotí- deos transgênicos, por exemplo, a sequência de nucleotídeos do DNA inserida no genoma das células de uma planta ou bactéria, ou presente num vetor extracromossômico seria considerada ser uma sequência de nucleotídeos isolada se estiver presente no interior do plasmídeo ou estrutura semelhante utilizada para transformar as células, dentro do ge- noma da planta ou bactéria, ou presente em quantidades detectáveis em tecidos, descendência, as amostras biológicas ou bens de consumo derivados da planta ou bactéria.

[0075] Tal como descrito adicionalmente nos Exemplos, rodadas repetitivas projeto, testes e seleção de mais de duas mil (2.000) variantes de sequência de aminoácidos de TIC844 e Cry1Da1 resultaram na identificação de certos resíduos de aminoácidos que podem ser substituídos, inseridos ou deletados da dada proteína-esqueleto para produzir proteínas inseticidas projetadas que exibem um espectro inibidor de le- pidópteros expandido e/ou atividade inibidora de lepidópteros melhorada (ou seja, mais tóxico; menos proteína inseticida necessária para obter o mesmo nível de mortalidade) quando comparada ao espectro e atividade das proteínas-esqueleto de linha de base, TIC844 ou Cry1Da1. Estas rodadas repetitivas de projeto, teste e seleção também resultaram na identificação de substituições, inserções ou deleções de resíduos de aminoácidos neutros nas proteínas-esqueleto TIC844 e Cry1Da1 que não alteram o espectro ou atividade inibidora de inseto das proteínas. Os resíduos de aminoácidos específicos no esqueleto TIC844 e Cry1Da1 que podem ser modificados para render um espectro inibidor de lepidópteros melhorado e/ou atividade inibidora de lepidóp- teros melhorada em relação a TIC844 ou Cry1Da1 são aqui identificados. Em certas modalidades, a proteína inseticida projetada aqui fornecida pode exibir cerca de oito vezes ou mais da atividade inibidora de lepidópteros contra uma espécie de pragas de lepidópteros do que uma proteína-esqueleto de SEQ ID NO: 14 (TIC844) ou SEQ ID NO: 2 (Cry1Da1).

[0076] O "projeto" nestas rodadas repetitivas inclui identificar resí duos relevantes na proteína-esqueleto a ser modificada para criar uma proteína de teste modificada e clonar e expressar as proteínas de teste modificadas resultantes. A estrutura atômica das proteínas-esqueleto foi usada para guiar e complementar abordagens semialeatórias de seleção de resíduos de aminoácidos para modificar por manipulação. O "teste" nestas rodadas repetitivas inclui comparar as atividades de espécie de lepidópteros de uma proteína de teste modificada a sua proteína-esqueleto parental. A "seleção" nestas rodadas repetitivas inclui identificar proteínas de teste modificadas com atividade melhorada (variantes melhoradas) e os resíduos relevantes que foram projetados para criar essas variantes melhoradas (essas variantes melhoradas são referidas aqui como "proteínas inseticidas projetadas").

[0077] Exemplos de métodos para testar e selecionar proteínas in seticidas modificadas incluem administrar quantidades idênticas de uma proteína de teste modificada e de uma proteína-esqueleto (TIC844 ou Cry1Da1) para uma praga de inseto sob condições de ensaio controladas e medir e comparar a potência das proteínas de esqueleto e de teste modificada. Um outro método para testar e selecionar proteínas inseticidas projetadas inclui determinar as doses de proteína (por exemplo, a concentração de proteína na dieta) de uma proteína de teste modificada e uma proteína-esqueleto (TIC844 ou Cry1Da1) que induzem respostas de populações de insetos equivalentes sob condições de ensaio controladas (ou seja, obtendo-se uma curva de dose-resposta). Um valor de resposta de dose estatisticamente robusto usado para comparação seria a concentração letal mediana (LC50) necessária para matar 50% de uma população de teste ou a concentração de inibição de muda ("MIC50"), a concentração mediana necessária para inibir a muda em 50%).

[0078] Em certas modalidades, as proteínas inseticidas projetadas aqui descritas incluem pelo menos uma modificação de aminoácido das seguintes posições relativas de TIC844 (SEQ ID NO: 14) ou Cry1Da1 (SEQ ID NO: 2): serina na posição 282 substituída por lisina ou valina, tirosina na posição 316 substituída por serina, isoleucina na posição 368 substituído por prolina ou arginina, serina em 374 substituída por argi- nina, asparagina na posição 375 substituída por histidina e isoleucina na posição 432 substituída por leucina. As proteínas inseticidas projetadas também podem incluir, pelo menos, dois, três, quatro ou mais destas substituições ou deleções de aminoácidos dentro da mesma sequência de proteína inseticida projetada.

[0079] As proteínas inseticidas projetadas que incluem essas modi ficações de aminoácidos incluem as proteínas definidas como SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, e SEQ ID NO: 44, e fragmentos inibidores de insetos das mesmas. Cada uma destas proteínas inseticidas projetadas tem uma massa medida de cerca de 132 k-Daltons. As características individuais das proteínas-esqueleto inseticidas TIC844 e Cry1Da1 e as proteínas inseticidas projetadas derivadas das mesmas são relatadas na Tabela 1. TABELA 1. Características de TIC844, Cry1Da1 e das Proteínas Inseticidas projetadas.

[0080] Os fragmentos das proteínas inseticidas projetadas aqui des critas podem ser formas truncadas em que um ou mais aminoácidos são eliminados da extremidade N-terminal, da extremidade C-terminal, do meio da proteína, ou suas combinações sem perda de atividade inibi- dora de inseto. Estes fragmentos devem manter a atividade inibidora de inseto da proteína inseticida projetada parental.

[0081] As proteínas que se assemelham a proteínas inseticidas pro jetadas podem ser identificadas por comparação umas com as outras usando vários algoritmos com base em computadores conhecidos na técnica. Por exemplo, as identidades de sequências de aminoácidos das proteínas relacionadas às proteínas inseticidas projetadas podem ser analisadas usando um alinhamento Clustal W usando estes parâmetros padrão: matriz de peso: blosum, penalidade de abertura de lacuna: 10,0, penalidade de extensão de lacuna: 0,05, lacunas hidrofílicas: Ligado, resíduos hidrofílicos: GPSNDQERK, Penalidades de lacuna de resíduo específico: Ligado (Thompson, Et al (1994) Nucleic Acids Research, 22: 4.673 a 4.680). A percentagem de identidade de aminoácidos é ainda calculada pelo produto de 100% multiplicado por (identidades de ami- noácido/comprimento da proteína em questão). Outros algoritmos de alinhamento estão também disponíveis na técnica e fornecem resultados semelhantes àqueles obtidos usando um alinhamento Clustal W.

[0082] Como descrito adicionalmente nos exemplos deste pedido, sequências sintéticas ou artificiais que codificam as proteínas-esqueleto e as proteínas inseticidas projetadas foram concebidas para uso em plantas. Sequências de nucleotídeos sintéticos exemplificadores que fo-ram concebidas para uso em plantas são apresentadas em SEQ ID NO: 27 (Cry1Da1.nno) SEQ ID NO: 29 (Cry1Da1_2.nno), SEQ ID NO: 31 (Cry1Da1_3.nno), SEQ ID NO: 33 (Cry1Da1_4.nno), SEQ ID NO: 35 (Cry1Da1_5.nno), SEQ ID NO: 37 (Cry1Da1_6.nno), SEQ ID NO: 39 (Cry1Da1_7.nno) , SEQ ID NO: 41 (TIC844_9.nno) e SEQ ID NO: 43 (TIC844_11.nno).

[0083] Os vetores e cassetes de expressão contendo estas sequên cias de nucleotídeos sintéticos ou artificiais foram construídos e introdu-zidos em células de plantas de milho, algodão e soja de acordo com os métodos e conjuntos de procedimentos de transformação conhecidos na técnica. As células transformadas foram regeneradas em plantas transformadas que foram observadas expressando a proteína inseticida projetada ou a proteína-esqueleto. Para testar a atividade pesticida, foram realizados bioensaios na presença de larvas de praga de lepidóp- teros usando discos de folhas de plantas obtidos junto às plantas trans-formadas.

[0084] As composições de moléculas de ácidos nucleicos recombi- nantes que codificam as proteínas inseticidas projetadas são contem-pladas. Por exemplo, uma proteína inseticida projetada pode ser expres-sada com construtos de DNA recombinante, em que uma molécula de polinucleotídeo com uma ORF que codifica a proteína inseticida projetada é ligada de maneira operacional a elementos de expressão genética tal como um promotor e qualquer outro elemento regulador necessário para a expressão no sistema para o qual se destina o construto. Exemplos não limitadores incluem um promotor de planta funcional ligado de maneira operacional à proteína inseticida projetada sintética que codifica sequências para a expressão da proteína inseticida projetada em plantas ou um promotor de Bt funcional ligado de maneira operacional a uma proteína inseticida projetada que codifica a sequência para a expressão da proteína em uma bactéria Bt ou outras espécies de Bacillus . Outros elementos podem ser ligados de maneira operacional à proteína inseticida projetada que codifica sequências incluindo, sem limitação, potenciadores, íntrons, líderes não traduzidos, etiquetas de imobilização de proteína codificada (HIS-tag), peptídeos de transloca- ção (isto é, peptídeos de trânsito de plastídeo, peptídeos de sinal), sequências de polipeptídeo para enzimas de modificação pós-translaci- onal, sítios de ligação ribossômicos e sítios-alvo de RNAi. Moléculas de polinucleotídeos recombinantes exemplificadoras aqui fornecidas incluem, sem limitação, um promotor heterólogo ligado de maneira operacional a um polinucleotídeo como SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:43, que codifica o polipeptídeo ou proteína com a sequência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO:4 (Cry1Da1_3), SEQ ID NO:6 (Cry1Da1_4), SEQ ID NO:8 (Cry1Da1_5), SEQ ID NO:10 (Cry1Da1_6), SEQ ID NO:12 (Cry1Da1_7), SEQ ID NO:16 (TIC844_2), SEQ ID NO:18 (TIC844_4), SEQ ID NO:20 (TIC844_5), SEQ ID NO:22 (TIC844_6), SEQ ID NO:24 (TIC844_7), SEQ ID NO:26 (TIC844_8), SEQ ID NO:32 (Cry1Da1_3.nno), SEQ ID NO:34 (Cry1Da1_4.nno), SEQ ID NO:36 (Cry1Da1_5.nno), SEQ ID NO:38 (Cry1Da1_6.nno), SEQ ID NO:40 (Cry1Da1_7.nno) e SEQ ID NO:44 (TIC844_11.nno). Um promotor heterólogo também pode ser ligado de maneira operacional a sequências de codificação de DNA sintético que codificam uma proteína inseticida projetada alvo de plastídeo e proteína inseticida projetada não alvo. Contempla-se que os códons de uma molécula de ácidos nucleicos recombinantes que codificam uma proteína inseticida projetada divulgada neste documento podem ser substituídos por códons sinônimos (conhecidos na técnica como uma substituição silenciosa).

[0085] Um construto ou molécula de DNA recombinante que com preende uma proteína inseticida projetada que codifica sequência pode compreender adicionalmente uma região de DNA que codifica um ou mais agentes tóxicos que podem ser configurados para coexpressar ou expressar concomitantemente com uma sequência de DNA que codifica uma proteína inseticida projetada, uma proteína diferente de uma proteína inseticida projetada, uma molécula de dsRNA inibidora de inseto ou uma proteína complementar. Proteínas complementares incluem, sem limitação, cofatores, enzimas, parceiros de ligação ou outros agentes que funcionam para ajudar na eficácia de um agente inibidor de insetos, por exemplo, para ajudar em sua expressão, influenciando sua estabilidade em plantas, otimizando energia livre para oligomerização, aumentando sua toxicidade e aumentando seu espectro de atividade. Uma proteína complementar pode facilitar a absorção de um ou mais agentes inibidores de insetos, por exemplo, ou potencializar os efeitos tóxicos do agente tóxico.

[0086] Um construto ou molécula de DNA recombinante pode ser montado de modo que todas as proteínas ou moléculas de dsRNA sejam expressadas de um promotor ou cada proteína ou molécula de dsRNA está sob o controle de promotor separado ou alguma combinação dos mesmos. As proteínas desta invenção podem ser expressadas de um sistema de expressão de múltiplos genes em que uma proteína inseticida projetada é expressada de um segmento de nucleotídeos comuns, que também contém outros quadros de leitura abertos e promotores, dependendo do tipo de sistema de expressão selecionado. Por exemplo, um sistema de expressão de múltiplos genes bacterianos pode utilizar um único promotor para acionar a expressão de quadros de leitura aberto ligados de múltiplas formas/em tandem dentro de um único operon (isto é, a expressão policistrônica). Em outro exemplo, um sistema de expressão de múltiplos genes de plantas pode utilizar cassetes de expressão não ligados de maneira múltipla, cada um expressando uma proteína diferente ou outro agente tóxico, tal como uma ou mais moléculas de dsRNA.

[0087] As moléculas de ácido nucleico recombinantes ou os cons- trutos de DNA recombinante compreendendo uma sequência que codi-ficação proteína inseticida projetada podem ser administradas a células hospedeiras por vetores, por exemplo, plasmídeo, baculovírus, cromos-soma sintético, vírion, cosmídeo, fagomídeo, fago ou vetor viral. Tais vetores podem ser usados para alcançar a expressão estável ou transi-ente de uma sequência codificadora de proteína inseticida projetada numa célula hospedeira, ou expressão subsequente do polipeptídeo codificado. Um polinucleotídeo recombinante exógeno ou construto de DNA recombinante que compreende uma sequência de codificação de sequência de proteína inseticida projetada e que é introduzido numa célula hospedeira também é referido, neste documento, como um "transgene".

[0088] Bactérias transgênicas, células vegetais transgênicas, plan tas transgênicas e partes de plantas transgênicas que contêm um poli- nucleotídeo que codifica qualquer uma ou mais das proteínas inseticidas projetadas são fornecidas neste documento. O termo "célula bacte- riana" ou "bactéria" pode incluir, sem limitação, uma célula de Agrobacterium, de Bacilo, de Escherichia, de Salmonella, de Pseudomonas ou de Rhizobium. O termo "célula vegetal" ou "planta" pode incluir, sem limitação, uma célula dicotiledônea ou uma célula monocotiledônea. Plantas e células vegetais contempladas incluem, sem limitação, alfafa, banana, cevada, feijão, brócolos, couve, brassica, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, grão-de-bico, couve chinesa, cítrico, coco, café, milho, trevo, algodão, abóbora, pepino, abeto-de-Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, Pinus taeda, painço, melões, noz, aveia, azeite, cebola, ornamental, palma, capim, ervilha, amendoim, pimenta, ervilha-da-Angola, pinho, batata, álamo, abóbora, pinheiro radiata, rabanete, colza, arroz, porta-enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana , girassol, milho doce, goma doce, batata-doce, gramínea-do-norte, chá, tabaco, tomate, triticale, relvado, melancia e célula vegetal ou planta de trigo. Em certas modalidades, as plantas transgênicas e partes de plantas transgênicas regeneradas de uma célula vegetal transgênica são fornecidas. Em certas modalidades, as plantas transgênicas podem ser obtidas a partir de uma semente transgênica, por corte, rotura, moagem ou disassociando de outra forma a parte da planta. Em certas modalidades, a parte da planta pode ser uma semente, uma cápsula, uma folha, uma flor, um caule, uma raiz, ou qualquer porção da mesma, ou uma porção não regenerável, de uma parte da planta transgênica. Conforme usado neste contexto, uma porção "não regenerável" de uma parte de planta transgênica é uma porção que não pode ser induzida a formar uma planta inteira ou que não pode ser induzida a formar uma planta inteira capaz de reprodução sexual ou assexual. Em certas modalidades, uma porção não regenerável de uma parte de planta é uma porção de um uma semente, de um casulo, de uma folha, flor, de um caule ou de uma raiz transgênica.

[0089] Métodos de fabricação de plantas transgênicas que compre endem quantidades inibidoras de lepidópteros de proteínas inseticidas projetadas são fornecidos. Tais plantas podem ser produzidas através da introdução de um polinucleotídeo que codifica as proteínas inseticidas modificadas fornecidas neste pedido em uma célula vegetal, e da seleção de uma planta derivada da referida célula vegetal que expressa uma quantidade inibidora de inseto ou lepidópteros da proteína inseticida projetada. Plantas podem ser derivadas a partir de células de plantas por regeneração, sementes, pólen ou técnicas de transformação de meristema. Os métodos para a transformação de plantas são conhecidos na técnica.

[0090] As plantas que expressam as proteínas inseticidas projeta das podem ser cruzadas por meio da reprodução com eventos transgê- nicos expressando outras proteínas inseticidas e/ou expressando outros traços transgênicos tais como outros traços de controle de insetos, genes de tolerância a herbicidas, genes que conferem características de rendimento ou tolerância ao estresse e similares, ou tais traços podem ser combinados em um único vetor para que os traços sejam todos liga-dos.

[0091] Os produtos vegetais processados, em que o produto pro cessado compreende uma quantidade detectável de uma proteína inse-ticida projetada, um segmento inibidor de insetos ou um fragmento da mesma, ou qualquer porção distintiva da mesma, são também revelados neste pedido. Em certas modalidades, o produto processado é selecio-nado do grupo que consiste em partes de planta, biomassa vegetal, óleo, farinha, açúcar, alimentos para animais, farinhas de farelo, flocos, fiapos, cascas, sementes processadas e sementes. Em certas modalidades, o produto processado é não regenerável. O produto vegetal pode compre-ender bens de consumo ou outros produtos de comércio derivados de uma planta transgênica ou de uma parte de planta transgênica, em que o bem de consumo ou outros produtos podem ser rastreados através do comércio através da detecção de segmentos de nucleotídeos ou RNA ou proteínas expressadas que codificam ou compreendem porções distinti-vas de uma proteína inseticida projetada.

[0092] Os métodos de controle de insetos, em particular, infesta ções de lepidópteros de plantações, com as proteínas inseticidas proje-tadas são também revelados neste pedido. Tais métodos podem com-preender o cultivo de uma planta compreendendo uma quantidade ini- bidora de lepidópteros ou inseto da proteína inseticida projetada. Em certas modalidades, tais métodos podem ainda compreender qualquer um ou mais dentre: (i) aplicar qualquer composição compreendendo ou codificando uma proteína inseticida projetada a uma planta ou uma se-mente que dê origem a uma planta; e (ii) transformar uma planta ou uma célula vegetal que dá origem a uma planta com um polinucleotídeo que codifica uma proteína inseticida projetada. Em geral, é contemplado que a proteína inseticida projetada pode ser fornecida numa composição, fornecida num micro-organismo ou fornecida numa planta transgênica para conferir atividade inibidora de inseto contra insetos lepidópteros.

[0093] Em certas modalidades, a proteína inseticida projetada é o ingrediente ativo como inseticida de uma composição inibidora de inseto preparada por cultivo de Bacilo recombinante ou qualquer outra célula bacteriana recombinante transformada para expressar uma proteína in-seticida projetada sob condições adequadas para a expressão. Tal com-posição pode ser preparada por dessecação, liofilização, homogeneiza-ção, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de tais células recombinantes que expressam/produzem a proteína inseticida projetada. Tal processo pode resultar em um extrato de célula de Bacilo ou outro extrato de célula bacteriana entomo- patogênica, suspensão celular, homogenato celular, lisado celular, so- brenadante celular, filtrado celular ou sedimento celular. Através da obtenção da proteína inseticida projetada tal como produzida, uma composição que inclui a proteína inseticida projetada pode incluir células bacterianas, esporos bacterianos e corpos de inclusão parasporais e pode ser formulada para várias utilizações, incluindo como produtos de pulverização inibidores de insetos agrícolas ou como formulações inibi- doras de insetos em bioensaios dietéticos.

[0094] Numa modalidade, a fim de reduzir a probabilidade de de senvolvimento de resistência, uma composição inibidora de inseto ou planta transgênica compreendendo uma proteína inseticida projetada pode compreender ainda pelo menos um agente tóxico adicional que exibe atividade inibidora de inseto contra a mesma espécie de inseto Lepidóptero, mas que é diferente da proteína inseticida projetada. Pos-síveis agentes tóxicos adicionais para tal composição incluem uma pro-teína inibidora de inseto e uma molécula de dsRNA inibidora de inseto. Um exemplo para uso de tais sequências de ribonucleotídeos para controlar as pragas de insetos é descrito em Baum, Et al. (Publicação de Patente US 2006/0021087 A1). Tal polipepitídeo adicional (ou polipepi- tídeos) para o controle de pragas de lepidópteros pode ser selecionado do grupo que consiste em uma proteína inibidora de inseto, tais como, sem limitação, Cry1A (Patente n° US 5.880.275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B (Publicação de Patente n° US 10/525,318), Cry1C (Patente n° US 6.033.874), quimeras Cry1D, Cry1E, Cry1F e Cry1A/F (Patentes n° US 7.070.982; 6.962.705; e 6.713.063), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab (Patente n° US 7.064.249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035, AND AXMI-045 (Publicação de Patente n° US 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI- 100 (Publicação de Patente n° US 2013-0310543 A1 ), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (Publicação de Patente n° US 2013-0104259 A1), AXMI-134 (Publicação de Patente n° US 2013-0167264 A1), AXMI-150 (Publicação de Patente n° US 2010-0160231 A1), AXMI-184 (Publicação de Patente n° US 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI- 207, AXMI-209 (Publicação de Patente n° US 2011-0030096 A1), AXMI- 218, AXMI-220 (Publicação de Patente n° US 2014-0245491 A1), AXMI- 221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (Publicação de Patente n° US 2014-0196175 A1), AXMI-238 (Publicação de Patente n° US 2014-0033363 A1), AXMI-270 (Publicação de Patente n° US 20140223598 A1), AXMI-345 (Publicação de Patente n° US 2014-0373195 A1), DIG-3 (Publicação de Patente n° US 2013-0219570 A1), DIG-5 (Publicação de Patente n° US 2010-0317569 A1), DIG-11 (Publicação de Patente n° US 2010-0319093 A1), AfIP-1A e derivados dos mesmos (Publicação de Patente n° US 2014-0033361 A1), AfIP-1B e derivados dos mesmos (Publicação de Patente n° US 2014-0033361 A1), PIP- 1APIP-1B (Publicação de Patente n° US 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (Publicação de Patente n° US 2014-0007292 A1), AECFG- 592740 (Publicação de Patente n° US 2014-0007292 A1), Pput_1063 (Publicação de Patente n° US 2014-0007292 A1), Pput_1064 (Publicação de Patente n° US 2014-0007292 A1), GS-135 e derivados dos mesmos (Publicação de Patente n° US 2012-0233726 A1), GS153 e derivados dos mesmos (Publicação de Patente n° US 2012-0192310 A1), GS154 e derivados dos mesmos (Publicação de Patente n° US 20120192310 A1), GS155 e derivados dos mesmos (Publicação de Patente n° US 2012-0192310 A1), SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente n° US 2012-0167259 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente n° US 2012-0047606 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente n° US 2011-0154536 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente n° US 2011-0112013 A1, SEQ ID NO:2 e 4 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente n° US 2010-0192256 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente n° 2010-0077507 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente n° 2010-0077508 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente n° 2009-0313721 A1, SEQ ID NO:2 ou 4 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente n° 2010-0269221 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente n° 7.772.465 (B2), CF161_0085 e derivados dos mesmos conforme descrito no documento WO2014/008054 A2, proteínas tóxicas para lepidópteros e seus derivados conforme descrito nas Publicações de Patente n° US US2008- 0172762 A1, US2011-0055968 A1 e US2012-0117690 A1; SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito no documento US7510878(B2), SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Patente n° US 7812129(B1); e similares.

[0095] Noutras modalidades, uma composição inibidora de inseto ou uma planta transgênica pode ainda compreender pelo menos um agente tóxico adicional que exiba atividade inibidora de inseto a uma praga de inseto que não é inibida pelas proteínas inseticidas projetadas da presente invenção (tais como pragas de coleópteros, hemípteros e homópteros), a fim de expandir o espectro de inibição de insetos obtido.

[0096] Tal agente tóxico adicional para o controle de pragas de co- leópteros pode ser selecionado do grupo consistindo em uma proteína inibidora de inseto, tal como, sem limitação, Cry3Bb (Patente n° US 6.501.009), variantes Cry1C, variantes Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (Publicação de Patente n° US 2013-0167264 A1) AXMI- 184 (Publicação de Patente n° US 2010-0004176 A1), AXMI-205 (Publi-cação de Patente n° US 2014-0298538 A1), axmi207 (Publicação de Patente n° US 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220 (Publicação de Patente n° US 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z (Publicação de Patente n° US 2014-0196175 A1), AXMI- 279 (Publicação de Patente n° US 2014-0223599 A1), AXMI-R1 e variantes das mesmas (Publicação de Patente n° US 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (Publicação de Patente n° US 2010-0319092 A1), eHIPs (Publicação de Pedido de Patente n° US 2010 / 0017914), IP3 e variantes das mesmas (Publicação de Patente n° US 2012-0210462 A1), e w-Hexatoxina-Hv1a (Publicação de Pedido de Patente n° US US2014-0366227 A1).

[0097] Tal agente tóxico adicional para o controle de pragas de he- mípteros pode ser selecionado do grupo que consiste em proteínas ativas para hemípteros, tais como, sem limitação, TIC1415 (Publicação Patente n° US 2013-0097735 A1), TIC807 (Patente n° US 8.609.936), TIC834 (Publicação de Patente n° US 2013-0269060 A1), AXMI-036 (Publicação da Patente n° US 2010-0137216 A1) e AXMI-171 (Publicação da Patente n° US 2013-0055469 A1). Polipeptídeos adicionais para o controle de insetos coleópteros, lepidópteros e hemípteros podem ser encontrados na página da web de nomenclatura de toxina de Bacillus thuringiensis mantida por Neil Crickmore (na página btno- menclature.info).

[0098] As sequências de codificação de proteína inseticida proje tada e as sequências que têm uma percentagem substancial de identi-dade com as proteínas inseticidas projetadas podem ser identificadas usando métodos conhecidos pelos versados na técnica tais como reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação térmica e hibridiza- ção. Por exemplo, as proteínas inseticidas projetadas podem ser usadas para produzir anticorpos que se ligam especificamente a proteínas relacionadas e podem ser usadas para pesquisar e encontrar outras proteínas que estão intimamente relacionadas.

[0099] Além disso, as sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas inseticidas projetadas podem ser usadas como sondas e ini-ciadores para rastreio para identificar outros membros da classe usando métodos de hibridização e amplificação isotérmica ou de ciclo térmico. Por exemplo, podem ser usados oligonucleotídeos derivados de se-quências como apresentado na SEQ ID NO: 3 para determinar a presença ou ausência de um transgene inseticida projetado numa amostra de ácido desoxirribonucleico derivada de um bem de consumo. Dada a sensibilidade de certos métodos de detecção de ácido nucleico que em-pregam oligonucleotídeos, prevê-se que os oligonucleotídeos derivados de sequências como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NO: 3 podem ser usados para detectar a respectiva proteína inseticida projetada em produtos de base derivados de fontes reunidas em que apenas uma fração do bem de consumo é derivada de uma planta transgênica contendo qualquer uma das SEQ ID NO: 3.

[00100] Outros recursos e vantagens da invenção estarão evidentes a partir dos Exemplos e das reivindicações.

EXEMPLOS

[00101] Aqueles versados na técnica devem, à luz da presente divul-gação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nos aspectos específicos que são divulgados e ainda obter-se um resultado parecido ou semelhante, sem se desviar do espírito e do escopo da invenção. Assim, detalhes estruturais e funcionais específicos divulgados neste documento não devem ser interpretados como limitadores. Deve ser entendido que a descrição completa de cada referência aqui citada está incorporada à divulgação deste pedido.

EXEMPLO 1 Modelo de Proteínas de Teste Modificadas e Preparação de Amostra para Teste de Bioensaio de Inseto

[00102] Este Exemplo ilustra os métodos empregados para identificar os resíduos de aminoácidos relevantes nas proteínas-esqueleto a serem modificadas para criar proteínas de teste modificadas e a clonagem e a expressão das proteínas de teste modificadas resultantes.

[00103] Foram empregados vários conjuntos de procedimentos de modificação molecular numa abordagem em camadas para construir va-riantes melhoradas de Cry1Da1 tendo um espectro inibidor de lepidóp- teros melhorado e/ou atividade inibidora de lepidópteros melhorada em comparação com as proteínas-esqueleto de Cry1Da1 e TIC844, um ho-mólogo de Cry1Da1. A primeira camada, ou rodada inicial de modelo, foi principalmente impulsionada por hipóteses. A segunda e a terceira camadas foram rodadas acionadas estatisticamente de modelo. Por exemplo, na segunda camada de modelo, as mutações estatisticamente não deletérias foram combinadas com mutações benéficas putativas para produzir mutações duplas que satisfazem critérios estatísticos definidos. Na terceira camada de modelo, todos os dados dos testes anteriores foram analisados usando múltiplos métodos estatísticos. Apenas mutações mostrando melhora estatisticamente significativa em mais de um método estatístico foram selecionadas para o agrupamento final de mutações. As variantes projetadas nesta camada continham uma ou duas mutações mais positivas de variantes previamente confirmadas positivas. Deste modo, o modelo de terceira camada enriqueceu significativamente as variantes ativas em comparação com a primeira e a segunda camadas. Conforme demonstrado nos Exemplos subsequentes, o uso da estratégia de modelo em três camadas identificou mutações simples e sinérgicas que forneceram uma melhora significativa na atividade contra CEW para certas variantes melhoradas em relação a esqueletos de TIC844 e Cry1Da1.

[00104] Os métodos que foram utilizados para criar as proteínas de teste modificadas incluíram, sem limitação, modificações semialeató- rias, modificações dirigidas de variâncias no alinhamento de TIC844/Cry1Da1 com outras proteínas de Bacillus thuringensis (Bt) nativas e modelo assistido por estrutura/função. Exemplos de conjuntos de procedimentos de modificação molecular utilizados incluem o seguinte.

[00105] Ligação ao receptor. A susceptibilidade de pragas de lepi- dópteros, especificamente lagarta-do-milho (CEW, Helicoverpa zea) a variantes melhoradas de Cry1Da1/TIC844 pode ser atribuível a diferentes receptores de intestino alvo. Os modelos que foram utilizados para melhorar a ligação a receptores no intestino, aumentando assim a toxi-cidade, incluíram: (1) mutar todas as posições nas alças apicais do do-mínio II para todos os tipos de aminoácidos; e (2) trocar todas as com-binações possíveis das alças apicais do domínio II com as de outros homólogos de Cry1Da1 (por exemplo, Cry1Db1, Cry1Dc1) e toxinas de três domínios ativos para CEW (por exemplo, Cry1Bb1, Cry1Ja1 e Cry2Ab2).

[00106] Abordagens baseadas em alinhamento. Alinhamento de Cry1Da1 com outros homólogos (por exemplo, Cry1Db1 e Cry1Dc1) para identificar regiões de variabilidade. Como resultado do alinhamento, foram identificadas cento e cinquenta (150) posições e duzentas e noventa e cinco (295) mutações simples exclusivas. Estas posições foram localizadas nos três domínios. As posições dentro de quatro (4) aminoácidos uns dos outros foram agrupadas. Apenas mutações das mesmas sequências parentais foram indicadas para cada grupo de po-sições, resultando em cento e trinta e duas (132) variantes exclusivas.

[00107] Abordagens de mutagênese de superfície. Os polinucleotí- deos que codificam as posições de superfície nos domínios II e III das proteínas-esqueleto foram mutagenizados por uma varredura. Os resí-duos de aminoácidos foram modificados para alanina onde uma alanina não estava já presente na proteína-esqueleto. Nas posições de superfície onde os resíduos nativos eram lisina, foram introduzidas mutações de arginina além das mutações de alanina. A razão para as mutações de lisina para arginina se baseou na observação de que as toxinas ativas de lepidópteros tendem a ter muito pouca lisina e muitas argininas e, por conseguinte, hipotetizou-se que a alteração das posições de superfície de lisina nos domínios II e III para arginina aumentaria a atividade de lepidópteros da proteína de teste modificada.

[00108] Alteração de eventos proteolíticos. O processo proteolítico foi hipotetizado como sendo um aspecto importante da atividade de toxinas de três domínios nos intestinos de insetos lepidópteros. Para testar isto, foram feitos vários conjuntos de mutações para potencialmente alterar qualquer clivagem proteolítica. Os sítios de clivagem potenciais estão localizados no terminal N e entre o domínio III e a protoxina. As posições mutacionais incluíram regiões de alça previstas do terminal N até ao início da hélice 4 e do terminal C do domínio III até ~ 40 aminoá- cidos na protoxina. Geralmente, foi hipotetizado que os resíduos de gli- cina promovem a proteólise através do reconhecimento de sítio proteolítico ou pelo aumento da flexibilidade de proteína, tornando-a assim mais susceptível à clivagem proteolítica. Além disso, a tripsina e a quimotripsina são duas proteases que são amplamente aceitas como proteases viáveis no intestino médio de lepidópteros. Os resíduos de lisina fornecem sítios de reconhecimento para tripsina e resíduos de ti- rosina fornecem sítios de reconhecimento para quimotripsina. Assim, as posições mutacionais selecionadas nos sítios de clivagem potenciais fo-ram mutadas para glicina, lisina ou tirosina.

[00109] Potenciais mutações no ponto quente de outras toxinas ativas para CEW. A atividade e a ausência de dados de atividade contra CEW para um grande conjunto de proteínas (incluindo quimeras, fragmentos e sequências nativas) foram analisadas. As informações obtidas a partir de uma análise estatística destes dados foram utilizadas para identificar potenciais mutações específicas ou posições de mutação que seriam susceptíveis ao aumento da atividade de CEW nas proteínas de teste modificadas resultantes.

[00110] As proteínas de teste modificadas que resultaram das meto-dologias de modificação molecular descritas acima foram clonadas usando métodos conhecidos na técnica em um vetor de expressão de plasmídeo de Bt recombinante a jusante de um promotor de expressão específico de esporulação e transformadas em uma célula hospedeira de Bt acrílica.

EXEMPLO 2 Teste de Proteínas de Teste Modificadas em Bioensaios Dietéticos Contra Pragas de Lepidópteros

[00111] Este Exemplo ilustra o teste das proteínas de teste modificadas criadas a partir dos esforços de projeto descritos no Exemplo 1.

[00112] A partir dos esforços de projeto descritos no Exemplo 1, cerca de duas mil e quinhentos (2.500) cepas de Bt recombinantes foram produzidas que expressaram mais de duas mil trezentas (2.300) proteínas de teste modificadas diferentes. Estas proteínas de teste mo-dificadas foram expressas em Bt e testadas quanto à toxicidade para várias espécies de lepidópteros. Os ensaios de alimentação foram con-duzidos com larvas recém-nascidas (<24 horas pós-eclosão) de várias espécies de lepidópteros, incluindo a lagarta-do-milho (CEW, Helico- verpa zea) e a lagarta-militar (FAW, Spodoptera frugiperda). Os ovos de insetos para o teste de CEW foram obtidos de duas colônias laboratoriais diferentes: Benson Research, Carlisle, PA e Monsanto Company, Union City, TN. Todas as proteínas de teste modificadas expressadas foram testadas em CEW e algumas das proteínas de teste modificadas que demonstraram uma atividade melhorada contra CEW em comparação com as suas proteínas-esqueleto parental foram testadas em FAW, além de realizar bioensaios adicionais para confirmar a atividade de CEW.

[00113] São conhecidos na técnica vários protocolos para bioensaios e para classificar insetos quanto à mortalidade e ao retardo do crescimento. As variações de métodos, tais como aquelas descritas na Publicação de Pedido de Patente n° PCT WO 2012/139004 e na Patente n° US 7.927.598 foram usadas.

EXEMPLO 3 Proteínas de Teste Modificadas Exibindo Atividade de CEW Melho-rada

[00114] Este Exemplo ilustra a constatação de um espectro inibidor de lepidópteros melhorado e/ou atividade inibidora de lepidópteros melhorada ou maior para algumas das proteínas de teste modificadas quando comparadas com as atividades das proteínas TIC844 ou Cry1Da1 esqueleto em múltiplos ciclos de teste.

[00115] As proteínas de testes modificadas criadas a partir dos esforços de projeto descritos no Exemplo 1 e testadas em bioensaio de insetos como descrito no Exemplo 2 foram testadas em ciclos repetitivos em que as atividades de espécies de lepidópteros das proteínas de teste modificadas foram comparadas com as suas respectivas proteínas-es-queleto parentais (isto é, TIC844 ou Cry1Da1). Num primeiro ciclo, tre-zentas e setenta (370) proteínas de teste modificadas diferentes de-monstraram uma toxicidade aumentada contra CEW em relação a TIC844 ou Cry1Da1 em bioensaios dietéticos. Em cada um destes bio- ensaios dietéticos, quantidades idênticas da proteína (proteína de teste modificada ou proteína-esqueleto) foram fornecidas a CEW sob condições de ensaio de dose única controladas. A potência das proteínas de teste modificadas e das proteínas-esqueleto foi determinada medindo e comparando a mortalidade observada e o retardo de crescimento de cada um dos bioensaios de proteína de teste modificadas com a mortalidade observada e o retardo de crescimento dos bioensaios da proteína-esqueleto parental.

[00116] Das trezentas e setenta (370) proteínas de teste modificadas que demonstraram toxicidade aumentada contra CEW quando comparadas com as proteínas-esqueleto em varreduras de ensaio de dose única, cerca de cento e oitenta (180) das mesmas foram posteriormente testadas em bioensaios de FAW para determinar se estas proteínas de teste modificadas mantiveram ou exibiram uma atividade de FAW aumentada em comparação com as proteínas-esqueleto parentais. Cerca de quarenta (40) a cinquenta (50) destas proteínas de teste modificadas exibiram atividade de FAW similar ou melhor do que as suas proteínas- esqueleto parental. Estas proteínas de teste modificadas adicionalmente testadas foram também testadas em bioensaios de CEW adicionais para confirmar a atividade de CEW. Estes ciclos de seleção e de teste de proteínas de teste modificadas que demonstraram atividade melhorada de CEW enquanto mantinham ou melhoravam a atividade de FAW resultaram numa lista final de variantes aprimoradas (referidas aqui como as "proteínas inseticidas projetadas"). A Tabela 2 identifica estas proteínas inseticidas projetadas e as mutações de aminoácidos em cada proteína inseticida projetada. A Tabela 2 também demonstra a atividade das proteínas-esqueleto e das proteínas inseticidas projetadas contra CEW e FAW (a atividade inseticida é demonstrada em LC50 (a concentração de toxina necessária para matar 50% de uma população de insetos durante um período fixo de exposição. Quanto menor um valor de LC50 , maior a toxicidade) e o MIC50 (a concentração necessária para inibir a muda para um instar específico de 50% das larvas durante uma período fixo de exposição). Esta Tabela demonstra que as proteínas inseticidas projetadas apresentaram atividade de CEW melhorada, enquanto mantinham ou melhoraram a atividade de FAW. TABELA 2. Mutações de Aminoácidos e Dados de Atividade para Proteínas-Esqueleto e Proteínas Inseticidas Projetadas. * As mutações de aminoácidos são identificadas usando o código de aminoácidos padrão da IUPAC. Consulte a Comissão Conjunta IUPACIUB para Nomenclatura Bioquímica. Nomenclatura e Simbolismo para Aminoácidos e Peptídeos. Eur. J. Biochem. 138:9 a 37(1984). A primeira abreviatura de sequência de aminoácidos indica o aminoácido original na dada proteína-esqueleto, o número representa a posição do amino- ácido, e a segunda abreviatura de sequência de aminoácidos indica o aminoácido colocado nessa posição na proteína variante melhorada. ** A toxina de núcleo de Cry1Da1 é idêntica à toxina de núcleo de TIC844.

[00117] Demonstrando ainda o espectro inibidor de Lepidópteros aumentado e a atividade inibidora de lepidópteros melhorada das proteí- nas inseticidas projetadas, a letalidade da proteína inseticida projetada TIC844_8 em relação a sua proteína-esqueleto parental é demonstrado na Figura 1. O gráfico de barras da Figura 1 demonstra os valores de MIC50 de TIC844_8 em comparação com a proteína-esqueleto TIC844 para duas colônias de CEW diferentes, Union City e Benzon. Os resul-tados de bioensaio ilustrados na Figura 1 foram calculados a partir de preparações de bioensaio purificado com gradiente de sacarose. A razão pela qual estes bioensaios secundários foram executados com a preparação purificada com gradiente de sacarose das proteínas opostas às preparações de esporo-cristal das proteínas foi para assegurar que a atividade melhorada de TIC844_8 persistia com uma purificação mais extensa. Além disso, a colônia Union City foi testada para confirmar a atividade melhorada observada na colônia Benzon. Conforme demonstrado na Figura 1, as mutações em três resíduos para TIC844_8 (S282V_Y316S_I368P) conferiram uma melhoria de 8 vezes na letali- dade de CEW, em relação a TIC844, para a colônia Union City e uma melhoria de 50 vezes na letalidade de CEW, em relação a TIC844, para a colônia Benzon.

[00118] Demonstrando ainda um espectro de inibição de lepidópte- ros melhorado e uma atividade inibidora de lepidópteros melhorada das proteínas inseticidas projetadas, os perfis de atividade de insetos para TIC844 e TIC844_8 de estudos de bioensaio dietético, conduzidos contra um amplo espectro de espécies de insetos lepidópteros, são apresentados na Tabela 3. Os insetos testados nos estudos de bioensaio apresentados na Tabela 3 incluem o lagarta-negra (BCW, Agrotis ipsi- lon), lagarta-do-milho (CEW, Helicoverpa zea), lagarta-militar (FAW, Spodoptera frugiperda), lagarta-do-sul (SAW, Spodoptera eridiania), la- garta-da-couve (CLW, Trichoplusia ni), broca-europeia-do-milho (BCE, Ostrinia nubilalis), broca-do-milho-do-sudoeste (SWC, Diatraea grandi- osella), lagarta-do-tabaco (TBW, Heliothis virescens), lagarta-da-soja VBC, Anticarsia gemmatalis), lagarta-falsa-medideira (SBL, Chrysodei- xis includes) e broca-de-cana-de-açúcar (SCB, Diatraea saccharalis). Esta Tabela 3 demonstra o espectro inibidor de lepidópteros aumentado de TIC844_8 em comparação com a proteína-esqueleto parental TIC844, especificamente com atividade melhorada contra CEW e VBC. TABELA 3. Espectro de Atividade de Insetos para TIC844 e TIC844_8. * Ativo contra as espécies de insetos indicadas.

[00119] O espectro inibidor de lepidópteros melhorado das proteínas inseticidas projetadas é adicionalmente demonstrado na Tabela 4, que descreve o perfil de atividade de inseto para certas proteínas inseticidas projetadas a partir de estudos de bioensaio dietético. Os insetos testados nos estudos de bioensaio da Tabela 4 incluem a lagarta helicoverpa (CBW, Helicoverpa armigera), curuquerê-oriental (TCW, Spodoptera li- tura), lagarta-da-beterraba (BAW, Spodoptera exigua), lagarta-rosada (PBW, Pectinophora gossypiella), lagarta-rosada-do-caule (PSB, Sesa- mia inferens) e lagarta-pintada (SBW, Earias vitella). Os resultados apresentados na Tabela 4 demonstram o espectro inibidor de lepidóp- teros melhorado das proteínas inseticidas projetadas listadas em com-paração com a proteína Cry1Da1 esqueleto, especificamente com ativi-dade melhorada contra CBW, PBW (resistente a Cry1Ac), PBW (coletado em campo) e SBW. TABELA 4. Comparação de Perfil de Atividade de Insetos para Cry1Da1 e Proteínas Inseticidas projetadas. + Ativo contra as espécies de insetos indicadas.

EXEMPLO 4 Síntese de genes que codificam proteínas-esqueleto e proteínas in-seticidas projetadas para expressão em plantas

[00120] Este Exemplo ilustra a síntese de polinucleotídeos que codificam proteínas-esqueleto e proteínas inseticidas projetadas para expressão em plantas.

[00121] Foram concebidas e sintetizadas sequências de nucleotí- deos que codificam proteínas-esqueleto e proteínas inseticidas projetadas para expressão em plantas de acordo com os métodos geralmente descritos na Patente n° US 5.500.365, evitando certas sequências problemáticas tais como sequências de poliadenilação de plantas ricas em ATTTA e A/T enquanto preserva a sequência de aminoácidos da proteína-esqueleto original ou da proteína inseticida projetada. As sequências de nucleotídeos para estes genes que codificam proteínas-esqueleto e proteínas inseticidas projetadas para expressão em plantas estão listadas abaixo na Tabela 5. TABELA 5. Sequências de Polinucleotídeo Projetadas para Uso em Plantas que Codificam Proteínas-esqueleto e Proteínas Inseticidas projetadas. ** A designação de variante "A2" indica a inserção de um resíduo de alanina na posição de aminoácido 2 em comparação com a sequência nativa para efeitos de clonagem em vetores de expressão de planta.

EXEMPLO 5 Cassetes de expressão para expressão de proteínas inseticidas projetadas em plantas

[00122] Este Exemplo ilustra a construção de cassetes de expressão compreendendo sequências de polinucleotídeo concebidas para uso em plantas que codificam proteínas-esqueleto e proteínas inseticidas projetadas.

[00123] Foi construída uma variedade de cassetes de expressão de plantas com as sequências de polinucleotídeos que codificam proteínas-esqueleto e as proteínas inseticidas projetadas concebidas para ex-pressão de planta apresentada na Tabela 5. Tais cassetes de expressão são úteis para a expressão transitória em protoplastos vegetais ou trans-formação de células vegetais. Os cassetes de expressão típicos foram concebidos em relação à colocação eventual da proteína dentro da célula. Um conjunto de cassetes de expressão foi concebido de forma a permitir que a proteína fosse traduzida e permanecesse no citosol. Outro conjunto de cassetes de expressão foi concebido para ter um peptí- deo de trânsito contíguo com a proteína de toxina para permitir o direcionamento para uma organela da célula, tal como o cloroplasto ou plas- tídeo. Todos os cassetes de expressão foram concebidos para começar na extremidade 5' com um promotor, que pode ser composto de vários elementos promotores, elementos intensificadores, ou outros elementos de expressão conhecidos pelos versados na técnica operacionalmente ligados para reforçar a expressão do transgene. A sequência de promotor foi geralmente seguida contiguamente com uma ou mais sequências líder 3' relativamente para o promotor. Uma sequência de íntron foi geralmente fornecida 3' da sequência líder para melhorar a expressão do transgene. Uma sequência de codificação para a toxina ou peptídeo de trânsito e a sequência que codifica para a toxina foi normalmente loca-lizada em 3' para a configuração do promotor, líder e íntron ligados ope-racionalmente. Uma sequência de 3' UTR era geralmente fornecida 3' da sequência de codificação para facilitar a terminação da transcrição e para fornecer sequências importantes para a poliadenilação do transcrito resultante. Todos os elementos acima descritos estavam operativamente ligados e dispostos sequencialmente, muitas vezes, com sequências complementares previstas na construção do cassete de expressão.

EXEMPLO 6 Vetores de transformação que contêm um cassete de expressão de proteína-esqueleto ou proteína inseticida projetada

[00124] Este Exemplo ilustra a incorporação de proteínas-esqueleto ou proteínas inseticidas projetadas em tecidos vegetais.

[00125] Os métodos para produzir uma planta transgênica que expressa um segmento de ácido nucleico que codifica uma proteína-esqueleto ou uma proteína inseticida projetada podem ser produzidos utilizando variações de métodos bem conhecidos na técnica. Em geral, o método compreende a transformação de uma célula hospedeira adequada com um segmento de DNA que contém um promotor operativamente ligado a uma região de codificação que codifica uma ou mais das proteínas inseticidas projetadas ou proteínas-esqueleto. Tal região de codificação está geralmente ligada operacionalmente a uma região de terminação da transcrição, em que o promotor é capaz de conduzir a transcrição da região de codificação na célula e, assim, fornecer à célula a capacidade de produzir o polipeptídeo in vivo. Os vetores, plasmídeos, cos- mídeos e segmentos de DNA para uso na transformação dessas células compreenderão geralmente operons, genes ou sequências derivadas de genes, nativas ou derivadas sintéticas, e particularmente as que codificam as proteínas inseticidas projetadas descritas. Estes construtos de DNA podem incluir ainda estruturas tais como promotores, intensificadores, po- liligantes, ou outras sequências de genes que podem ter atividade regu-ladora sobre os genes particulares de interesse. A planta transgênica, partes de plantas e células vegetais resultantes são testadas quanto à ex-pressão e bioatividade da proteína codificada.

[00126] Exemplos de métodos que podem ser modificados para a obtenção de plantas transgênicas que expressam proteínas ativas de lepidópteros incluem aqueles que descrevem, por exemplo, proteínas Cry1A (Patente n° US 5.880.275), Cry1B (Pedido de Patente n° US 10/525318), Cry1C (Patente n° US 6.033.874), quimeras Cry1A/F (Pa-tentes n° US 7.070.982, 6.962.705 e 6.713.063) e uma proteína Cry2Ab (Patente n° US 7.064.249).

EXEMPLO 7 Atividade de lepidópteros de proteínas inseticidas projetadas em milho transformado de forma estável

[00127] Este Exemplo ilustra a atividade inibidora exibida pelas proteínas inseticidas projetadas contra pragas de lepidópteros quando expressadas em plantas de milho e fornecidas como uma dieta para a respectiva praga de inseto.

[00128] Plantas de milho transgênicas R0 que expressam proteínas Cry1Da1 e Cry1Da1_7.nno foram produzidas usando vetores contendo os cassetes de expressão descritos no Exemplo 6. Plantas de milho transgênicas F1 foram cultivadas a partir de sementes produzidas por espigas polinizadoras de plantas de germoplasma comercial do tipo sel-vagem não transformadas com pólen de transformantes R0.

[00129] As células transformadas foram induzidas a formar plantas por métodos conhecidos na técnica. Bioensaios usando discos de folhas de plantas foram realizados análogos aos descritos na patente n° US 8.344.207. Uma planta não transformada foi usada para obter tecido para um controle negativo. Múltiplos eventos de transformação de cada vetor binário foram avaliados e os resultados foram tabulados.

[00130] A atividade inseticida de plantas de milho transgênicas ex-pressando proteínas Cry1Da1 e Cry1Da1_7.nno em F1 e R0 é fornecida na Tabela 6, além de atividade contra as plantas de milho transgênicas expressando proteínas Cry1Da1 e Cry1Da1_7.nno em F1 no campo. Especificamente, a Tabela 6 demonstra o perfil de atividade de lepidóp- teros para Cry1Da1_7.nno em comparação com a proteína-esqueleto parental Cry1Da1 quando testado contra CEW, FAW e SWC. Como pode ser visto na Tabela 6, ao contrário de Cry1Da1, Cry1Da1_7.nno demonstra atividade contra CEW e FAW em bioensaio R0 e F1 e testes de campo F1. TABELA 6. Perfil de atividade de insetos para Cry1Da1 e Cry1Da1_7.nno expressado em plantas de milho. + Ativo contra espécies de insetos;- Inativo contra espécies de insetos; NT-não testado

EXEMPLO 8 Atividade de lepidópteros de proteínas inseticidas projetadas em algodão transformado de forma estável

[00131] Este Exemplo ilustra a atividade inibidora exibida pelas proteínas inseticidas projetadas contra pragas de lepidópteros quando expressadas em plantas de algodão e fornecidas como uma dieta para a respectiva praga de inseto.

[00132] Plantas de algodão expressando proteínas Cry1Da1_7.nno e TIC844_11.nno foram produzidas usando vetores contendo os cassetes de expressão descritos no Exemplo 6. As células transformadas foram induzidas a formar plantas por métodos conhecidos na técnica. Tecido de folha de algodão foi usado no bioensaio, conforme descrito no Exemplo 7 e testado contra CBW, FAW, lagarta-do-tabaco (TBW, Heliothis virescens) e SBL. A Tabela 7 mostra a atividade observada contra estas espécies de lepidópteros em algodão de geração R0 transformado de maneira estável. Como pode ser visto na Tabela 7, Cry1Da1_7.nno e TIC844_11.nno demonstraram atividade contra duas ou mais espécies de pragas de lepidópteros em algodão de geração R0 transformado de maneira estável. TABELA 7. Perfil de atividade de bioensaio de Cry1Da1_7.nno e TIC844_11.nno expressado em algodão de geração R0. + Ativo contra espécies de inseto; - Inativo contra espécies de insetos;

[00133] Os eventos transformados selecionados foram usados para produzir plantas R1. As plantas R1 que expressam Cry1Da1_7.nno foram analisadas quanto à resistência a CBW, FAW e SBL. Foram usadas te-cidos de folha, quadrado e de cápsulas no bioensaio, além de testes de campo realizados em estufas. A Tabela 8 mostra a atividade observada nestes testes. Conforme demonstrado na Tabela 8, Cry1Da1_7.nno de-monstrou atividade contra CBW, FAW e SBL em bioensaio e testes de campo. TABELA 8. Perfil de atividade de insetos de Cry1Da1_7.nno expres-sada em algodão de geração R1. + Ativo contra espécies de inseto; - Inativo contra espécies de inseto.

EXEMPLO 9 Atividade de lepidópteros de proteínas inseticidas projetadas em soja transformada de forma estável

[00134] Este Exemplo ilustra a atividade inibidora exibida pelas proteínas inseticidas projetadas contra pragas de lepidópteros quando expressadas em plantas de soja e fornecidas como uma dieta para a respectiva praga de inseto.

[00135] Plantas de soja expressando proteínas Cry1Da1_7.nno, TIC844_9.nno e TIC844_11.nn foram produzidas usando vetores contendo os cassetes de expressão descritos no Exemplo 6. O tecido foliar foi colhido e utilizado no bioensaio como descrito no Exemplo 7 ou, al-ternativamente, tecido liofilizado foi utilizado na dieta de insetos para bioensaio. O bioensaio foi realizado contra várias espécies de lepidóp- teros, incluindo SAW, SBL e lagarta helicoverpa (SPW, Helicoverpa zea). A Tabela 9 mostra a atividade observada contra estas pragas de lepidópteros em soja de geração de R0 transformada de forma estável. Como pode ser visto na Tabela 9, Cry1Da1_7.nno e TIC844_11.nno de-monstraram atividade contra SPW, SAW e SBL. TIC844_9.nno (TIC844 mais uma alanina de bônus para clonagem) não demonstrou atividade contra SPW. TABELA 9. Perfil de atividade de bioensaio de Cry1Da1_7.nno, TIC844_9.nno e TIC844_11 expressado em soja de geração R0. + Ativo contra espécies de insetos- Inativo contra espécies de insetos;

[00136] Os eventos transformados selecionados foram usados para produzir plantas R1. Plantas R1 que expressam Cry1Da1_7.nno foram analisadas quanto à resistência a SAW, SBL, SPW e lagarta-da-soja (VBC, Anticarsia gemmatalis). O tecido foliar foi colhido a partir das plan-tas de geração R1 e usado em um bioensaio de alimentação. A Tabela 10 mostra a atividade observada nestes testes. Conforme demonstrado na Tabela 10, Cry1Da1_7.nno demonstrou atividade contra SPW, SAW e SBL. TABELA 10. Perfil de atividade de bioensaio de Cry1Da1_7.nno ex-pressada em soja de geração R1. + Ativo contra espécies de insetos- Inativo contra espécies de insetos.

[00137] A Tabela 11 mostra os resultados de ensaios de campo con-duzidos em estufas com plantas de soja de geração R1 estavelmente transformadas expressando Cry1Da1_7.nno. Espécies usadas para in-festar plantas nas estufas incluem a lagarta-da-vagem (BLAW, Spodop- tera cosmioides), broca-dos-ponteiros (BSM, Crocidosema aporema), lagarta helicoverpa (SAPW, Helicoverpa gelotopoeon), lagarta-do-giras- sol (SFL, Rachiplusia nu) e VBC. A Tabela 11 mostra a atividade obser-vada nestes testes. Como demonstrado na Tabela 11, Cry1Da1_7.nno demonstrou atividade contra BLAW, SAPW e SFL. TABELA 11. Perfil de atividade de Cry1Da1_7.nno expressado em soja de geração1 R testado em ensaios de campo de estufa. + Ativo contra espécies de insetos;- Inativo contra espécies de insetos. [00138] Todos as composições e métodos divulgados e aqui reivindicados podem ser feitos e executados sem experimentação inde-vida à luz da presente divulgação. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos das modalidades ilus-trativas precedentes, será evidente para os versados na técnica que po-dem ser aplicadas variações, mudanças, modificações e alterações às composições, métodos e nas etapas ou na sequência de etapas dos métodos aqui descritos sem afastar-se do verdadeiro conceito, espírito e escopo da divulgação. Mais especificamente, será aparente que certos agentes que são química e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes aqui descritos enquanto os mesmos ou se-melhantes resultados seriam atingidos. Todos esses substitutos e mo-dificações semelhantes aparentes àqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, âmbito e conceito da in-venção como definido pelas reivindicações anexas.

Claims (9)

1. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência como apresentada em SEQ ID NO:39 ou uma sua sequência degenerada que codifica a mesma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:40.

2. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência como apresentada em SEQ ID NO:39 ou uma sua sequência degenerada que codifica a mesma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:40, em que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor heterólogo.

3. Proteína inseticida projetada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 40.

4. Proteína inseticida projetada, de acordo com a reivindica-ção 3, caracterizada pelo fato de que a proteína inseticida projetada exibe atividade inibidora contra uma espécie de inseto da ordem Lepi- doptera.

5. Proteína inseticida projetada, de acordo com a reivindica-ção 4, caracterizada pelo fato de que o lepidóptero é selecionado do grupo que consiste em um Spodoptera e um Helicoverpa.

6. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compre-ende o polinucleotídeo apresentado em SEQ ID NO: 39, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira bacteriana.

7. Composição inibidora de inseto, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína inseticida projetada compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada em ou SEQ ID NO: 40.

8. Método para controlar uma praga de lepidópteros, carac-terizado pelo fato de que compreende colocar a praga de lepidóptero em contato com uma quantidade inibidora de uma proteína inseticida projetada compreendendo uma sequência de aminoácidos como apre-sentada em SEQ ID NO: 40.

9. Método para controlar uma praga de lepidópteros, carac-terizado pelo fato de que compreende expor a praga a uma célula de planta, planta ou parte de planta transgênica, em que a referida célula de planta, planta ou parte de planta expressa um polinucleotídeo como apresentado em SEQ ID NO: 39.